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特許7587745キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質、細胞、分析用キット、及び分析方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-13
(45)【発行日】2024-11-21
(54)【発明の名称】キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質、細胞、分析用キット、及び分析方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20241114BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241114BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241114BHJP
C07K 14/735 20060101ALI20241114BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241114BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241114BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241114BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/12
C07K19/00
C07K14/735
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12Q1/02
【請求項の数】
23
(21)【出願番号】P 2023503758
(86)(22)【出願日】2022-02-24
(86)【国際出願番号】 JP2022007612
(87)【国際公開番号】W WO2022186041
(87)【国際公開日】2022-09-09
【審査請求日】2023-08-03
(31)【優先権主張番号】P 2021031757
(32)【優先日】2021-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000192903
【氏名又は名称】神奈川県
(73)【特許権者】
【識別番号】597128004
【氏名又は名称】国立医薬品食品衛生研究所長
(73)【特許権者】
【識別番号】597023558
【氏名又は名称】学校法人帝京平成大学
(74)【代理人】
【識別番号】100112874
【弁理士】
【氏名又は名称】渡邊 薫
(72)【発明者】
【氏名】中村 亮介
(72)【発明者】
【氏名】秋山 晴代
(72)【発明者】
【氏名】田所 哲
(72)【発明者】
【氏名】熊坂 謙一
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１１－０１９４６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】J. Biol. Chem.，1993年，Vol.268, No.29，pp.22076-22083
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメインをコードする第一塩基配列と、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの少なくとも細胞膜貫通ドメインをコードする第二塩 基配列と
を含む、キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子。
【請求項2】
前記第一塩基配列は、配列番号７の塩基配列を含む、請求項１に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子。
【請求項3】
前記第二塩基配列は、少なくとも配列番号５の塩基配列を含む、請求項１又は２に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子。
【請求項4】
前記第二塩基配列は、配列番号６の塩基配列をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子。
【請求項5】
前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、当該遺伝子に基づき生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖を細胞膜に発現させるためのシグナル配列をコードする第三塩基配列をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子。
【請求項6】
前記第三塩基配列が、配列番号２の塩基配列を含む、請求項５に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子。
【請求項7】
前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が、配列番号１の塩基配列を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子。
【請求項8】
前記非ヒト動物がげっ歯類の動物である、請求項１～７のいずれか一項に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子。
【請求項9】
ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメインと、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの少なくとも細胞膜貫通ドメインと
を含むキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質。
【請求項10】
前記細胞外ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質。
【請求項11】
前記細胞膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項９又は１０に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質。
【請求項12】
前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞内ドメインをさらに含み、当該細胞内ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質。
【請求項13】
前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質が、配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項９～１２のいずれか一項に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質。
【請求項14】
請求項１～８のいずれか一項に記載されたキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を含むベクター。
【請求項15】
請求項１～８のいずれか一項に記載されたキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子、請求項９～１３のいずれか一項に記載のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質、又は
請求項１４に記載のベクター
を含む、前記非ヒト動物の細胞。
【請求項16】
前記非ヒト動物細胞のＦｃεＲＩのγ鎖の遺伝子をさらに含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項17】
前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子に基づき生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖と前記細胞のＦｃεＲＩのγ鎖とを含む会合体を形成する、請求項１６に記載の細胞。
【請求項18】
前記会合体同士の架橋によって発現が誘導されるレポーター遺伝子をさらに含む、請求項１７に記載の細胞。
【請求項19】
請求項１５～１８のいずれか一項に記載の細胞を含む分析用キット。
【請求項20】
請求項１５～１８のいずれか一項に記載の細胞を用いる分析方法。
【請求項21】
前記分析方法は、前記細胞をインキュベートするインキュベート工程、及び
前記細胞の応答を分析する分析工程
を実行することを含む、請求項２０に記載の分析方法。
【請求項22】
前記インキュベート工程が、前記細胞をインキュベート用材料中でインキュベートすることを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記分析工程が、前記応答に基づき
アレルゲン性の評価、
ＩｇＥについての分析、
アレルギー抑制活性の評価、及び
ドラッグスクリーニング
からなる群から選ばれる少なくとも一つを行うことを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質、細胞、分析用キット、及び分析方法に関する。より特には、本発明は、アレルギーに関連する試験を行うために用いられるキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質、細胞、及びキット、並びにアレルギーに関連する分析方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アレルギー反応に関与するＩｇＥは血清中にごく微量に存在する抗体である。ＩｇＥは、例えばマスト細胞及び好塩基球などの細胞が発現する高親和性ＩｇＥ受容体（本明細書内において、高親和性ＩｇＥ受容体を「ＦｃεＲＩ」ともいう）のα鎖に非常に強固に結合する（Ｋａ=１０10 Ｍ-1）。ＦｃεＲＩは、α鎖１本、β鎖１本、及びγ鎖のホモダイマーを含みうる。これらのサブユニットは、多くの動物種では４量体を形成して初めて細胞膜表面に発現するが、ヒトにおいてはβ鎖を伴わない発現様式も知られている。
【0003】
Ｂ細胞がアレルゲン（抗原）特異的なＩｇＥを産生すると、ＩｇＥは血流に乗り、末梢の免疫細胞、特にはマスト細胞や好塩基球が発現するＦｃεＲＩに結合し、これらの細胞を感作する。ＩｇＥで感作されたこれらの細胞が特異抗原に暴露されると抗原とＩｇＥとが結合する。このとき、抗原1分子にＩｇＥエピトープが複数存在すると、抗原を介して複数のＩｇＥ抗体が結合することになり、それに伴い複数のＦｃεＲＩが「架橋」されることになる。
【0004】
ＦｃεＲＩの架橋を引き金として、例えば受容体の細胞内ドメインに会合するチロシンキナーゼなどの酵素及びアダプター分子の活性化を介して、例えばカルシウムイオンの流入、ヒスタミン等の化学伝達物質の脱顆粒、及び脂質性化学伝達物質の産生昂進などの細胞応答が起こり、即時型のアレルギー応答が惹起される。さらに、ある種の転写因子の活性化を通じ、例えばサイトカイン及びケモカインなどの遺伝子発現が誘導され、これは、より後期の炎症反応へとつながる。
【0005】
アレルギーに関する検査方法がこれまでにいくつか提案されている。例えば、下記特許文献１は、ヒトＩｇＥに親和性のあるＦｃレセプターを細胞膜上に有し、かつ、転写因子が結合し得るエンハンサーの制御下に、プロモーターおよびレポーター遺伝子をこの順に有する細胞を、被験者由来の生体試料の存在下でインキュベートすること；被験物質および前記インキュベート後の細胞を接触させること；ならびに、前記被験物質と接触させた細胞における前記レポーター遺伝子の発現の増大を確認することを含む、前記被験物質が前記被験者に対するアレルゲンであるか否かを検査する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２０１１－１９４６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
アレルギー検査感度のさらなる向上が求められている。当該感度を向上させることができれば、例えば患者ＩｇＥの生物学的意義に基づく評価、微量アレルゲンの検出、及び抗アレルギー物質のハイスループットスクリーニングなど、種々のアレルギーに関する試験のために有用であると考えられる。そこで、本発明は、アレルギー検査の高感度化、特にはＩｇＥ検出手法の高感度化を主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、
ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメインをコードしうる第一塩基配列と、
非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの少なくとも細胞膜貫通ドメインをコードしうる第二塩基配列と
を含む、キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を提供する。
前記第一塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．７の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含んでよい。
前記第二塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．５の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含んでよい。
前記第二塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．６の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列をさらに含みうる。
前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、当該遺伝子に基づき生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖を細胞膜に発現させるためのシグナル配列をコードする第三塩基配列をさらに含みうる。
前記第三塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．２の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含みうる。
前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列と５０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有しうる。
前記非ヒト動物はげっ歯類の動物でありうる。
ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメインをコードしうる第一塩基配列と、
非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの少なくとも細胞膜貫通ドメインをコードしうる第二塩基配列と
を含む、キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を提供する。
前記第一塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．７の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含んでよい。
前記第二塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．５の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含んでよい。
前記第二塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．６の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列をさらに含みうる。
前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、当該遺伝子に基づき生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖を細胞膜に発現させるためのシグナル配列をコードする第三塩基配列をさらに含みうる。
前記第三塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．２の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含みうる。
前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列と５０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有しうる。
前記非ヒト動物はげっ歯類の動物でありうる。
【0009】
また、本発明は、
ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメインと、
非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの少なくとも細胞膜貫通ドメインと
を含むキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質も提供する。
前記細胞外ドメインは、配列ＩＤ Ｎｏ．１４のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
前記細胞膜貫通ドメインは、配列ＩＤ Ｎｏ．１２のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞内ドメインをさらに含み、
当該細胞内ドメインは、配列ＩＤ Ｎｏ．１３のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、配列ＩＤ Ｎｏ．８のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有しうる。
ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメインと、
非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの少なくとも細胞膜貫通ドメインと
を含むキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質も提供する。
前記細胞外ドメインは、配列ＩＤ Ｎｏ．１４のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
前記細胞膜貫通ドメインは、配列ＩＤ Ｎｏ．１２のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞内ドメインをさらに含み、
当該細胞内ドメインは、配列ＩＤ Ｎｏ．１３のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、配列ＩＤ Ｎｏ．８のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有しうる。
【0010】
また、本発明は、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を含むベクターも提供する。
【0011】
また、本発明は、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子、前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質、又は前記ベクターを含む、前記非ヒト動物の細胞も提供する。
前記細胞は、前記非ヒト動物細胞のＦｃεＲＩのγ鎖の遺伝子をさらに含みうる。
前記細胞は、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子に基づき生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖と前記細胞のＦｃεＲＩのγ鎖とを含む会合体を形成しうる。
前記細胞は、前記会合体同士の架橋によって発現が誘導されるレポーター遺伝子をさらに含みうる。
前記細胞は、前記非ヒト動物細胞のＦｃεＲＩのγ鎖の遺伝子をさらに含みうる。
前記細胞は、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子に基づき生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖と前記細胞のＦｃεＲＩのγ鎖とを含む会合体を形成しうる。
前記細胞は、前記会合体同士の架橋によって発現が誘導されるレポーター遺伝子をさらに含みうる。
【0012】
また、本発明は、前記細胞を含む分析用キットも提供する。
【0013】
また、本発明は、前記細胞を用いる分析方法も提供する。
前記分析方法は、
前記細胞をインキュベートするインキュベート工程、及び
前記細胞の応答を分析する分析工程
を実行することを含んでよい。
前記インキュベート工程は、前記細胞をインキュベート用材料中でインキュベートすることを含みうる。
前記分析工程は、前記応答に基づき
アレルゲン性の評価、
アレルギーの有無又はリスクの評価、
ＩｇＥについての分析、
アレルギー抑制活性の評価、及び
ドラッグスクリーニング
からなる群から選ばれる少なくとも一つを行うことを含みうる。
前記分析工程は、Ｉ型アレルギーの有無又はリスクの評価を行うことを含みうる。
前記分析方法は、
前記細胞をインキュベートするインキュベート工程、及び
前記細胞の応答を分析する分析工程
を実行することを含んでよい。
前記インキュベート工程は、前記細胞をインキュベート用材料中でインキュベートすることを含みうる。
前記分析工程は、前記応答に基づき
アレルゲン性の評価、
アレルギーの有無又はリスクの評価、
ＩｇＥについての分析、
アレルギー抑制活性の評価、及び
ドラッグスクリーニング
からなる群から選ばれる少なくとも一つを行うことを含みうる。
前記分析工程は、Ｉ型アレルギーの有無又はリスクの評価を行うことを含みうる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】本発明の細胞を説明するための模式図である。
【図2】本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質を説明するための模式図である。
【図3】本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子及びキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質の構成例を示す図である。
【図4】実施例において用いられたキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す図である。
【図5】配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列である。
【図6】遺伝子挿入のための配列を説明する図である。
【図7】発光強度の測定結果を示す図である。
【図8】フローサイトメーターによる測定結果を示す図である。
【図9】発光強度の測定結果を示す図である。
【図10】発光強度の測定結果を示す図である。
【図11】吸光度の測定結果を示す図である。
【図12】発光強度の測定結果を示す図である。
【図13】発光強度の測定結果を示す図である。
【図14】発光強度の測定結果を示す図である。
【図15】発光強度の測定結果を示す図である。
【図16】発光強度の測定結果を示す図である。
【図17】発光強度の測定結果を示す図である。
【図18】発光強度の測定結果を示す図である。
【図19】実施例において用いられたキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子及び当該遺伝子から発現するキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質の構造及び機能を説明するための模式図である。
【図20】発光強度の測定結果を示す図である。
【図21】発光強度の測定結果を示す図である。
【図22】発光強度の測定結果を示す図である。
【図23】発光強度の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態を示したものであり、本発明の範囲がこれらの実施形態のみに限定されることはない。
【0016】
本発明について、以下の順序で説明を行う。
１．本発明の説明
２．第一の実施形態（キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子）
（１）第一塩基配列
（２）第二塩基配列
（３）第三塩基配列
（４）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子全体
３．第二の実施形態（キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）
（１）細胞外ドメイン
（２）細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン
（３）シグナル配列
（４）キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質
４．第三の実施形態（ベクター）
５．第四の実施形態（細胞）
６．第五の実施形態（分析用キット）
７．第六の実施形態（分析方法）
８．実施例
（１）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の合成
（２）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子のＲＢＬ－ＮＬ４細胞への導入
（３）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が導入された細胞におけるルシフェラーゼ発現
（４）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が導入された細胞へのＩｇＥ結合能の確認
（５）本発明の細胞に適した試験条件の検討
（６）アレルギー患者血清を用いた試験（ピーナッツアレルギー）
（７）本発明の細胞と他の細胞との比較（アレルギー検査、卵アレルギー）
（８）本発明の細胞と他の細胞との比較（アレルギー反応抑制剤の有効性評価）
（９）安定性及び再現精度
１．本発明の説明
２．第一の実施形態（キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子）
（１）第一塩基配列
（２）第二塩基配列
（３）第三塩基配列
（４）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子全体
３．第二の実施形態（キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）
（１）細胞外ドメイン
（２）細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン
（３）シグナル配列
（４）キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質
４．第三の実施形態（ベクター）
５．第四の実施形態（細胞）
６．第五の実施形態（分析用キット）
７．第六の実施形態（分析方法）
８．実施例
（１）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の合成
（２）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子のＲＢＬ－ＮＬ４細胞への導入
（３）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が導入された細胞におけるルシフェラーゼ発現
（４）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が導入された細胞へのＩｇＥ結合能の確認
（５）本発明の細胞に適した試験条件の検討
（６）アレルギー患者血清を用いた試験（ピーナッツアレルギー）
（７）本発明の細胞と他の細胞との比較（アレルギー検査、卵アレルギー）
（８）本発明の細胞と他の細胞との比較（アレルギー反応抑制剤の有効性評価）
（９）安定性及び再現精度
【0017】
１．本発明の説明
【0018】
現在臨床で一般的に用いられているアレルギー試験法は、例えばｉｎ ｖｉｖｏ試験法、ｅｘ ｖｉｖｏ試験法、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験法の３つに分けることができ、それぞれに一長一短がある。ｉｎ ｖｉｖｏ試験法は患者自身にアレルゲンを投与するため、信頼性は最も高いが、患者に負担を強いるという問題がある。ｅｘ ｖｉｖｏ試験法では、患者の好塩基球を体外に取り出し、当該好塩基球に対してアレルゲンが投与されうる。当該ｅｘ ｖｉｖｏ試験法は、好塩基球の活性化（例えばヒスタミンの放出又は細胞表面へのＣＤ２０３ｃ／ＣＤ６３の発現など）を指標とするため、信頼度は高い。しかしながら、当該ｅｘ ｖｉｖｏ試験法では、全血が用いられるため、サンプルの保存が利かないという問題がある。最も頻繁に利用されているｉｎ ｖｉｔｒｏ試験法の一つとして、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ法が挙げられる。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ法は、患者の血清又は血漿を用いて実施することができる。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ法は、簡便であり且つ比較的高感度であるが、偽陽性が非常に多いという問題がある。この問題は、アレルゲン上にＩｇＥエピトープが１カ所しか存在しない場合に起こり得ると考えられる。また、この問題は、アレルゲンとＩｇＥとの結合アフィニティーが低く、ＦｃεＲＩの架橋を維持できないことにも起因すると考えられる。
【0019】
上述したｅｘ ｖｉｖｏ試験法では、患者の好塩基球の活性化が定量されるところ、この方法を若干修正すると、患者血清中のＩｇＥ依存的な好塩基球の活性化を調べることができる。すなわち、当該修正された方法では、まず、健常人から末梢血好塩基球を単離し、単離された好塩基球を酸処理して、結合しているＩｇＥを当該好塩基球から乖離させる。その後、被験者由来の血清中ＩｇＥで当該好塩基球を受動的に感作し、当該感作による抗原特異的な好塩基球の活性化を調べる。しかし、この手法は手間がかかる上、同一の健常人の末梢血が常に利用できるわけではないため、試験の再現性に欠けるという問題がある。
【0020】
このような問題を解決する方法として、例えばラット培養マスト細胞株として知られるＲＢＬ－２Ｈ３細胞にヒトＦｃεＲＩを安定的に発現させた培養細胞株を用い、これをアレルギー患者血清で感作し、特異抗原を添加した際の脱顆粒量を測定する方法が、いくつかのグループにより考案された。この方法は、患者血清中のＩｇＥによりヒトＦｃεＲＩを発現する培養マスト細胞を感作し、抗原によるＦｃεＲＩの架橋を検出できたという意味において画期的ではあった。しかしながら、この方法は、脱顆粒測定の感度が低く、偽陰性が生じる確率の高さが問題になりうる。
【0021】
上記特許文献１に記載の方法により、これらの問題に対処することができる。上記特許文献１に記載の方法では、ヒトＩｇＥに親和性のあるＦｃレセプターを細胞膜上に有し、かつ、転写因子が結合し得るエンハンサーの制御下に、プロモーターおよびレポーター遺伝子をこの順に有する細胞が用いられる。この細胞の例として、上記特許文献１には、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞にヒトＦｃεＲＩを安定的に発現させた培養細胞株であるＲＢＬ－ＳＸ３８細胞に、転写因子Nuclear Factor of Activated T-cells（ＮＦ－ＡＴ）依存的にホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現が誘導されるレポーター遺伝子が導入された細胞株ＲＳ－ＡＴＬ８細胞が開示されている。上記特許文献１に記載の方法では、当該細胞を、例えば１００倍希釈した患者血清などと一晩培養することによりＩｇＥで感作し、当該感作後に、当該細胞を特異抗原と接触させる。当該接触により、ＦｃεＲＩの架橋が誘導される。当該架橋により、前記転写因子を含む細胞内シグナル伝達を経由してルシフェラーゼが発現される。これにより、非常に感度よく抗原又は特異的ＩｇＥを検出することができる。当該方法は、「IgE-Crosslinking-induced Luciferase Expression（EXiLE）法」とも呼ばれている。当該方法は、プロトコルが非常にシンプルであり、大量の検体をスクリーニングするのに適している。さらに、当該方法に関して、例えば卵白アレルギー患者を対象としたＲＯＣ曲線解析では曲線下面積が０．９７を超えるなど、非常に優れた性能を有している。世界中の研究者がこの手法をすでに利用しており、例えば２０１９年８月の時点では、欧米を中心に１６カ国において利用されている。
【0022】
上記特許文献１に記載の方法は、抗原及び特異的ＩｇＥを感度良く検出することができるが、さらなる感度の向上が求められている。さらなる感度の向上は、例えば、患者ＩｇＥの生物学的意義に基づく評価、微量アレルゲンの検出、及び抗アレルギー物質のハイスループットスクリーニングのために有用であると考えられる。
【0023】
本発明者らは、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメインをコードする第一塩基配列と非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの少なくとも細胞膜貫通ドメインをコードする第二塩基配列とを含むキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が、アレルギー検査感度の向上のために極めて有用であることを見出した。例えば、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が導入された当該非ヒト動物の細胞（例えばマスト細胞）は、ヒトのアレルギーに関する試験における使用に適しており、例えばヒトのアレルギーを極めて感度良く検査するために用いられる材料として使用することができる。例えば、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、例えば上記特許文献１に記載された方法において使用されてよく、特には上記特許文献１に記載された方法において用いられる細胞に導入されうる。
【0024】
以下で図１及び２を参照しながら、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を有する細胞の例、及び、当該細胞による抗原又はＩｇＥの検出のメカニズムを説明する。
【0025】
図１に示される細胞１は、非ヒト動物細胞である。細胞１は、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子と、レポーター遺伝子と、を含む。細胞１は、さらに、当該非ヒト動物細胞のＦｃεＲＩγ鎖遺伝子を含む。当該非ヒト動物細胞は、さらに、当該非ヒト動物細胞のＦｃεＲＩβ鎖遺伝子を含んでもよい。
【0026】
細胞１中で、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子、前記ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子、及び前記ＦｃεＲＩγ鎖遺伝子が発現して、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質、ＦｃεＲＩβ鎖タンパク質、及びＦｃεＲＩγ鎖タンパク質が生成される。１つのキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質、１つのＦｃεＲＩβ鎖タンパク質、及び２つのＦｃεＲＩγ鎖タンパク質（ホモダイマー）が会合して形成された４量体であるキメラＦｃεＲＩは、図１に示されるように、細胞１の細胞膜表面に発現する。なお、樹状細胞においては、キメラＦｃεＲＩは１つのα鎖及び２つのγ鎖からなる3量体のコンフォメーションで発現する。
【0027】
当該キメラＦｃεＲＩのより詳細な模式図を図２Ａに示す。図２Ａに示されるとおり、当該キメラＦｃεＲＩは、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質（同図においてｈ＋ｒαと示されている）、ＦｃεＲＩβ鎖タンパク質（同図においてｒβ）、及び、ＦｃεＲＩγ鎖タンパク質のホモダイマー（同図においてｒγ）からなる４量体である。当該α鎖タンパク質は、ヒトＦｃεＲＩα鎖に由来する第一部分（同図においてドットで示される部分）と、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖に由来する第二部分（同図においてグレーで示される部分）とを含む。
なお、図１及び２は、説明のための模式図であり、実際の状態を反映しているものではないことを理解されたい。
なお、図１及び２は、説明のための模式図であり、実際の状態を反映しているものではないことを理解されたい。
【0028】
前記第一部分は、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメインを含む。当該細胞外ドメインは、文字通り、細胞外に露出していてよい。当該細胞外ドメインは、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちのＩｇＥ結合性領域を含む。
例えば図２Ａに示されるように、当該細胞外ドメインは、細胞外に存在し、当該α鎖タンパク質は、当該細胞外ドメインに含まれるＩｇＥ結合性領域を介して、ヒトＩｇＥ（ｈＩｇＥ）と結合することができる。
例えば図２Ａに示されるように、当該細胞外ドメインは、細胞外に存在し、当該α鎖タンパク質は、当該細胞外ドメインに含まれるＩｇＥ結合性領域を介して、ヒトＩｇＥ（ｈＩｇＥ）と結合することができる。
【0029】
前記第二部分は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの少なくとも細胞膜貫通ドメインを含む。また、当該細胞膜貫通ドメインが、非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖との結合に寄与し、例えば当該結合性を発揮する一つ又は複数のアミノ酸残基を含む。当該第二部分は、当該非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞内ドメインをさらに含んでもよい。
例えば、図２Ａに示されるように、前記α鎖タンパク質は、当該細胞膜貫通ドメインのうちの前記一つ又は複数のアミノ酸残基を介して、前記γ鎖タンパク質と結合しうる。また、同図に示されるように、前記α鎖タンパク質は、当該細胞膜貫通ドメインによって、細胞膜に留まる。
例えば、図２Ａに示されるように、前記α鎖タンパク質は、当該細胞膜貫通ドメインのうちの前記一つ又は複数のアミノ酸残基を介して、前記γ鎖タンパク質と結合しうる。また、同図に示されるように、前記α鎖タンパク質は、当該細胞膜貫通ドメインによって、細胞膜に留まる。
【0030】
前記ＦｃεＲＩβ鎖タンパク質は、前記非ヒト動物に内因的に存在する前記ＦｃεＲＩβ鎖遺伝子の発現産物であってよい。
前記ＦｃεＲＩγ鎖タンパク質も、前記非ヒト動物に内因的に存在する前記ＦｃεＲＩγ鎖遺伝子の発現産物であってよい。
前記ＦｃεＲＩγ鎖タンパク質も、前記非ヒト動物に内因的に存在する前記ＦｃεＲＩγ鎖遺伝子の発現産物であってよい。
【0031】
なお、上記で述べたＲＳ－ＡＴＬ８細胞が発現するＦｃεＲＩの模式図が図２Ｂに示されている。ＲＳ－ＡＴＬ８細胞は、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞にヒトＦｃεＲＩを安定発現させたＲＢＬ－ＳＸ３８細胞に、ＮＦ－ＡＴ依存性ホタルルシフェラーゼ発現ベクターが安定導入された細胞である。図２Ｂに示されるとおり、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞において発現するＦｃεＲＩのα鎖及びγ鎖はヒトＦｃεＲＩのものであり（ドットで示される部分）、β鎖は、ラットＦｃεＲＩのものであると思われる（グレーで示される部分）。ＲＳ－ＡＴＬ８細胞において発現するＦｃεＲＩは、そのα鎖がヒトＦｃεＲＩのものであるので、ヒトＩｇＥと結合することができる。
ＲＳ－ＡＴＬ８細胞のＦｃεＲＩのα鎖はその全体がヒトＦｃεＲＩのものであるのに対し、図２Ａにおける本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、細胞外ドメインがヒトＦｃεＲＩのものである一方で、細胞膜貫通ドメインが非ヒト動物のＦｃεＲＩのものである。
ＲＳ－ＡＴＬ８細胞のＦｃεＲＩのα鎖はその全体がヒトＦｃεＲＩのものであるのに対し、図２Ａにおける本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、細胞外ドメインがヒトＦｃεＲＩのものである一方で、細胞膜貫通ドメインが非ヒト動物のＦｃεＲＩのものである。
【0032】
また、上記で述べたＲＢＬ－２Ｈ３細胞が発現するＦｃεＲＩの模式図が図２Ｃに示されている。当該ＦｃεＲＩのα鎖、β鎖、及びγ鎖はいずれもラット由来であり、α鎖はラットＩｇＥに結合する。
【0033】
図１に示されるように、Ｉ型アレルギーは、（１）ＦｃεＲＩとＩｇＥとの結合（感作）、（２）ＩｇＥに対する抗原（アレルゲン）と、ＦｃεＲＩに結合したＩｇＥとの結合（結合）、（３）１つの抗原に結合した複数のＩｇＥ結合ＦｃεＲＩ間の架橋（架橋）、（４）細胞からのヒスタミンやセロトニンなどの生理活性物質の放出（脱顆粒）、（５）生理活性物質による全身性の応答、により生じる。
【0034】
上記（３）の複数のＩｇＥ結合ＦｃεＲＩ間の架橋によって発現が誘導されるレポーター遺伝子の遺伝子発現を確認することで、例えばＩｇＥに結合する抗原（特には特異的な抗原）を検出することができる。
【0035】
２．第一の実施形態（キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子）
【0036】
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の構成例を、図３Ａを参照しながら以下で説明する。図３Ａは、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の構成を説明するための模式図である。図３Ａにおいて、紙面左が当該遺伝子の５’末端であり、紙面右が当該遺伝子の３’末端である。
また、当該模式図の下に図３Ｂが示されており、図３Ｂは、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の発現により生成される本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質の構成例を示す。図３Ｂにおいて、紙面左が当該タンパク質のＮ末端であり、紙面右が当該タンパク質のＣ末端である。
また、当該模式図の下に図３Ｂが示されており、図３Ｂは、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の発現により生成される本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質の構成例を示す。図３Ｂにおいて、紙面左が当該タンパク質のＮ末端であり、紙面右が当該タンパク質のＣ末端である。
【0037】
図３Ａに示されるとおり、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメインをコードする第一塩基配列と、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの少なくとも細胞膜貫通ドメインをコードする第二塩基配列とを含む。前記第二塩基配列は、特には非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインをコードし、当該細胞膜貫通ドメインが、非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖との結合性を発揮しうる。
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子はさらに、当該遺伝子に基づき生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖を細胞膜に発現させるためのシグナル配列をコードする第三塩基配列をさらに含みうる。
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の発現により生成されるキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、図３Ｂに示されるとおり、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメイン１と、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞膜貫通ドメイン２及び細胞内ドメイン３を含みうる。当該細胞外ドメイン１は、ＩｇＥ結合性領域を含みうる。当該細胞膜貫通ドメイン２が、非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖との結合性を発揮し、当該結合性を発揮する一つ又は複数のアミノ酸残基を含みうる。当該キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質はさらに、当該タンパク質を細胞膜に発現させるためのシグナル配列４をさらに含みうる。
以上のとおり、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子に含まれる前記第一塩基配列が前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質に含まれる前記細胞外ドメインに対応する。前記第二塩基配列が前記細胞膜貫通ドメイン及び前記細胞内ドメインに対応する。前記第三塩基配列が、前記シグナル配列に対応する。
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子はさらに、当該遺伝子に基づき生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖を細胞膜に発現させるためのシグナル配列をコードする第三塩基配列をさらに含みうる。
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の発現により生成されるキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、図３Ｂに示されるとおり、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメイン１と、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞膜貫通ドメイン２及び細胞内ドメイン３を含みうる。当該細胞外ドメイン１は、ＩｇＥ結合性領域を含みうる。当該細胞膜貫通ドメイン２が、非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖との結合性を発揮し、当該結合性を発揮する一つ又は複数のアミノ酸残基を含みうる。当該キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質はさらに、当該タンパク質を細胞膜に発現させるためのシグナル配列４をさらに含みうる。
以上のとおり、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子に含まれる前記第一塩基配列が前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質に含まれる前記細胞外ドメインに対応する。前記第二塩基配列が前記細胞膜貫通ドメイン及び前記細胞内ドメインに対応する。前記第三塩基配列が、前記シグナル配列に対応する。
【0038】
前記第一～第三塩基配列は、図３Ａに示されるとおり、５’末端から、前記第三塩基配列、前記第一塩基配列、及び前記第二塩基配列の順に並んでいてよい。
前記細胞外ドメイン、前記細胞膜貫通ドメイン、前記細胞内ドメイン、及び前記シグナル配列は、図３Ｂに示されるとおり、Ｎ末端から、前記シグナル配列、前記細胞外ドメイン、前記細胞膜貫通ドメイン、及び前記細胞内ドメインの順に並んでいてよい。また、これらの領域の間には、１以上のアミノ酸残基が挿入されていてよく又は挿入されていなくてもよい。
前記細胞外ドメイン、前記細胞膜貫通ドメイン、前記細胞内ドメイン、及び前記シグナル配列は、図３Ｂに示されるとおり、Ｎ末端から、前記シグナル配列、前記細胞外ドメイン、前記細胞膜貫通ドメイン、及び前記細胞内ドメインの順に並んでいてよい。また、これらの領域の間には、１以上のアミノ酸残基が挿入されていてよく又は挿入されていなくてもよい。
【0039】
（１）第一塩基配列
【0040】
前記第一塩基配列は、上記のとおり、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメインをコードする。当該細胞外ドメインは、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちのＩｇＥ結合性領域を含む。当該ＩｇＥ結合性領域は、ヒトのＩｇＥに結合する領域であってよい。
【0041】
前記第一塩基配列は、好ましくは、配列ＩＤ Ｎｏ．７の塩基配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む。当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が、ＩｇＥへの結合性のために好ましく、ＩｇＥ結合性領域として機能する。
【0042】
配列ＩＤ Ｎｏ．７は以下のとおりである。配列ＩＤ Ｎｏ．７は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１１０～１８３に対応する塩基配列である。
【0043】
【0044】
より好ましい実施態様において、前記第一塩基配列は、以下の配列ＩＤ Ｎｏ．３の塩基配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含んでよい。当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は、ＩｇＥへの結合性のために好ましく、さらにはＩｇＥ結合性をもたらすための構造の維持のためにも好ましい。当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質における細胞外ドメイン全体を構成してよい。
配列ＩＤ Ｎｏ．３は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６～２０５に対応する塩基配列である。
配列ＩＤ Ｎｏ．３は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６～２０５に対応する塩基配列である。
【0045】
【0046】
また、前記第一塩基配列は、イムノグロブリンドメインとして機能する２つのアミノ酸配列をコードしていてよい。
当該２つのアミノ酸配列のうちの一つは、配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうち、アミノ酸残基番号４４～１０８のアミノ酸配列である。当該アミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、配列ＩＤ Ｎｏ．１のうちの塩基番号１３０～３２４に対応する。
当該２つのアミノ酸配列のうちのもう一つは、配列ＩＤ Ｎｏ．８のアミノ酸配列のうち、アミノ酸残基番号１２１～１９４のアミノ酸配列である。当該アミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、配列ＩＤ Ｎｏ．１のうちの塩基番号３６１～５８２に対応する。
また、イムノグロブリンドメインとして機能するこれら２つのアミノ酸配列の間の領域は、リンカー領域とも呼ばれる。当該リンカー領域は、配列ＩＤ Ｎｏ．８のアミノ酸配列のうち、アミノ酸残基番号１０９～１２０のアミノ酸配列である。当該リンカー領域をコードする塩基配列は、例えば、配列ＩＤ Ｎｏ．１のうちの塩基番号３２５～３６０に対応する。
これらの塩基配列についても、上記で配列ＩＤ Ｎｏ．３について述べたとおりの配列同一性が許容される。
当該２つのアミノ酸配列のうちの一つは、配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうち、アミノ酸残基番号４４～１０８のアミノ酸配列である。当該アミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、配列ＩＤ Ｎｏ．１のうちの塩基番号１３０～３２４に対応する。
当該２つのアミノ酸配列のうちのもう一つは、配列ＩＤ Ｎｏ．８のアミノ酸配列のうち、アミノ酸残基番号１２１～１９４のアミノ酸配列である。当該アミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、配列ＩＤ Ｎｏ．１のうちの塩基番号３６１～５８２に対応する。
また、イムノグロブリンドメインとして機能するこれら２つのアミノ酸配列の間の領域は、リンカー領域とも呼ばれる。当該リンカー領域は、配列ＩＤ Ｎｏ．８のアミノ酸配列のうち、アミノ酸残基番号１０９～１２０のアミノ酸配列である。当該リンカー領域をコードする塩基配列は、例えば、配列ＩＤ Ｎｏ．１のうちの塩基番号３２５～３６０に対応する。
これらの塩基配列についても、上記で配列ＩＤ Ｎｏ．３について述べたとおりの配列同一性が許容される。
【0047】
なお、本明細書内において、塩基配列（又はアミノ酸配列）の「配列同一性」とは、比較すべき２つの塩基配列（又はアミノ酸配列）の塩基（又はアミノ酸残基）ができるだけ多く一致するように両塩基配列（又はアミノ酸配列）を整列させ、一致した塩基数（又は一致したアミノ酸残基数）を全塩基数（又は全アミノ酸残基数）で除したものを百分率で表したものである。前記整列化及び前記百分率の算出は、例えばＢＬＡＳＴ等の周知のアルゴリズムを用いて行なわれてよい。
【0048】
（２）第二塩基配列
【0049】
第二塩基配列は、上記のとおり、少なくとも非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞膜貫通ドメインをコードする。当該細胞膜貫通ドメインが、γ鎖と結合する機能を有する。当該機能を発揮するために、当該細胞膜貫通ドメインは、非ヒト動物ＦｃεＲＩのγ鎖との結合に関与するアミノ酸残基を含んでよい。例えば、後述の細胞膜貫通ドメインに含まれるＡｓｐが、当該結合に関与しうる。
前記非ヒト動物は、例えばげっ歯類の動物であり、好ましくはラット、マウス、又はハムスターであり、より好ましくはラット又はマウスであり、特に好ましくはラットである。
前記非ヒト動物は、例えばげっ歯類の動物であり、好ましくはラット、マウス、又はハムスターであり、より好ましくはラット又はマウスであり、特に好ましくはラットである。
【0050】
また、第二塩基配列は、前記細胞膜貫通ドメインに加えて、当該非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの当該細胞内ドメインを含む領域をさらにコードしてもよい。
【0051】
特に好ましくは、第二塩基配列は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの当該細胞膜貫通ドメイン及び当該細胞内ドメインの両方を含む領域をコードしてよい。そして、当該細胞膜貫通ドメインが、前記非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖と結合する機能を有してよく、当該機能を発揮するための前記Ａｓｐを含んでよい。当該Ａｓｐは、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．１２におけるアミノ酸番号２１９のＡｓｐでありうる。
【0052】
前記第二塩基配列は、好ましくは、
配列ＩＤ Ｎｏ．５の塩基配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、及び
配列ＩＤ Ｎｏ．６の塩基配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列
を含む。このような塩基配列にコードされるアミノ酸配列が、非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖との結合のために好ましい。
配列ＩＤ Ｎｏ．５の塩基配列と前記配列同一性を有する塩基配列は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞膜貫通ドメインに対応する。
配列ＩＤ Ｎｏ．６の塩基配列と前記配列同一性を有する塩基配列は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞内ドメインに対応する。
配列ＩＤ Ｎｏ．５の塩基配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、及び
配列ＩＤ Ｎｏ．６の塩基配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列
を含む。このような塩基配列にコードされるアミノ酸配列が、非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖との結合のために好ましい。
配列ＩＤ Ｎｏ．５の塩基配列と前記配列同一性を有する塩基配列は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞膜貫通ドメインに対応する。
配列ＩＤ Ｎｏ．６の塩基配列と前記配列同一性を有する塩基配列は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞内ドメインに対応する。
【0053】
配列ＩＤ Ｎｏ．５及び配列ＩＤ Ｎｏ．６は以下のとおりである。
配列ＩＤ Ｎｏ．５は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２０６～２２４（細胞膜貫通ドメイン）に対応する塩基配列である。
配列ＩＤ Ｎｏ．６は、当該アミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２２５～２４６（細胞内ドメイン）に対応する塩基配列である。
配列ＩＤ Ｎｏ．５は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２０６～２２４（細胞膜貫通ドメイン）に対応する塩基配列である。
配列ＩＤ Ｎｏ．６は、当該アミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２２５～２４６（細胞内ドメイン）に対応する塩基配列である。
【0054】
【0055】
【0056】
前記第二塩基配列のうち、配列ＩＤ Ｎｏ．５の塩基配列と前記配列同一性を有する前記塩基配列が５’末端側にあり、且つ、配列ＩＤ Ｎｏ．６の塩基配列と前記配列同一性を有する前記塩基配列は３’末端側にある。これら２つの塩基配列の間には、塩基配列は挿入されていなくてよい（すなわち、前者の塩基配列の直後の後者の塩基配列があってよい）が、例えば１５塩基～７５塩基（５アミノ酸残基～２５アミノ酸残基に相当）、特には２１塩基～６０塩基（７アミノ酸残基～２０アミノ酸残基に相当）、より特には３０塩基～４５塩基（１０アミノ酸残基～１５アミノ酸残基に相当）、より特には３６塩基（１２アミノ酸残基に相当）が挿入されていてもよい。
【0057】
前記細胞膜貫通ドメイン及び前記細胞内ドメインの両方を含む領域をコードする前記第二塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．４の塩基配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む。このような塩基配列にコードされるアミノ酸配列が、非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖との結合のために好ましい。
配列ＩＤ Ｎｏ．４は以下のとおりである。配列ＩＤ Ｎｏ．４は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２０６～２４６（細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン）に対応する塩基配列である。
配列ＩＤ Ｎｏ．４は以下のとおりである。配列ＩＤ Ｎｏ．４は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２０６～２４６（細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン）に対応する塩基配列である。
【0058】
【0059】
（３）第三塩基配列
【0060】
第三塩基配列は、上記のとおり、当該遺伝子に基づき生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖を細胞膜に発現させるためのシグナル配列をコードする。例えば、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質の細胞膜貫通（特には１回膜貫通）をもたらすためのシグナル配列をコードしうる。
本発明の一つの実施態様において、当該シグナル配列は、例えば、ヒトのＦｃεＲＩα鎖タンパク質に含まれるシグナル配列であってよく又は非ヒト動物のＦｃεＲＩα鎖タンパク質に含まれるシグナル配列であってもよい。好ましくは、当該シグナル配列は、ヒトのＦｃεＲＩα鎖タンパク質に含まれるシグナル配列である。前記第三塩基配列にコードされた当該シグナル配列によって、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子から生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質が、細胞膜に発現される。
本発明の他の実施態様において、当該シグナル配列は、Ｉｇκに含まれるシグナル配列であってよく、例えばヒトＩｇκ又は非ヒト動物Ｉｇκに含まれるシグナル配列であってもよい。当該シグナル配列によっても、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質が、細胞膜に発現されうる。
本発明の一つの実施態様において、当該シグナル配列は、例えば、ヒトのＦｃεＲＩα鎖タンパク質に含まれるシグナル配列であってよく又は非ヒト動物のＦｃεＲＩα鎖タンパク質に含まれるシグナル配列であってもよい。好ましくは、当該シグナル配列は、ヒトのＦｃεＲＩα鎖タンパク質に含まれるシグナル配列である。前記第三塩基配列にコードされた当該シグナル配列によって、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子から生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質が、細胞膜に発現される。
本発明の他の実施態様において、当該シグナル配列は、Ｉｇκに含まれるシグナル配列であってよく、例えばヒトＩｇκ又は非ヒト動物Ｉｇκに含まれるシグナル配列であってもよい。当該シグナル配列によっても、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質が、細胞膜に発現されうる。
【0061】
前記第三塩基配列は、好ましくは、
配列ＩＤ Ｎｏ．２の塩基配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む。このような塩基配列が、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質の細胞膜への発現にとって好ましい。
配列ＩＤ Ｎｏ．２の塩基配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む。このような塩基配列が、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質の細胞膜への発現にとって好ましい。
【0062】
配列ＩＤ Ｎｏ．２は以下のとおりである。配列ＩＤ Ｎｏ．２は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１～２５（シグナル配列）に対応する塩基配列である。
【0063】
【0064】
（４）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子全体
【0065】
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が、好ましくは、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列と５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらにより好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有する。
【0066】
配列ＩＤ Ｎｏ．１は以下のとおりである。配列ＩＤ Ｎｏ．１は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。
【0067】
【0068】
配列ＩＤ Ｎｏ．１～Ｎｏ．７は、げっ歯類の動物のコドン使用頻度、特にはラットのコドン使用頻度を考慮して最適化されている。そのため、前記非ヒト動物は、好ましくはげっ歯類の動物であり、より好ましくはラット、マウス、又はハムスターであり、特に好ましくはラットである。
【0069】
（製造方法）
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、例えば当技術分野で既知の人工遺伝子合成技術によって製造することができる。例えば化学合成法又は酵素法によって、当該キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を製造することができる。
また、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、制限酵素及び／又はＰＣＲを用いて複数の遺伝子構成要素を結合させることにより製造されてもよく、又は、非ヒト動物細胞（特にはラット細胞）のＦｃεＲＩα鎖遺伝子をゲノム編集することによって製造されてもよい。
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、例えば当技術分野で既知の人工遺伝子合成技術によって製造することができる。例えば化学合成法又は酵素法によって、当該キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を製造することができる。
また、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、制限酵素及び／又はＰＣＲを用いて複数の遺伝子構成要素を結合させることにより製造されてもよく、又は、非ヒト動物細胞（特にはラット細胞）のＦｃεＲＩα鎖遺伝子をゲノム編集することによって製造されてもよい。
【0070】
３．第二の実施形態（キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）
【0071】
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質の構成例が図３Ｂに示されている。当該構成例は、上記「２．第一の実施形態（キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子）」において説明したとおりである。すなわち、当該キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞外ドメインと、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞膜貫通ドメインとを含む。当該キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質はさらに非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの細胞内ドメインを含んでよい。
前記細胞外ドメインは、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちのＩｇＥ結合性領域を含んでよい。また、前記細胞膜貫通ドメインが、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖との結合に寄与しうる。
また、当該キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質はさらに、当該タンパク質を細胞膜に発現させるためのシグナル配列をさらに含みうる。
前記細胞外ドメインは、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちのＩｇＥ結合性領域を含んでよい。また、前記細胞膜貫通ドメインが、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖のうちの非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖との結合に寄与しうる。
また、当該キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質はさらに、当該タンパク質を細胞膜に発現させるためのシグナル配列をさらに含みうる。
【0072】
（１）細胞外ドメイン
【0073】
前記細胞外ドメインは前記ＩｇＥ結合性領域を含み、当該領域は、上記のとおり、ヒトＦｃεＲＩα鎖のうちの、ヒトＩｇＥに結合する領域であってよい。前記細胞外ドメインは、例えば、上記で説明した本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子に含まれる前記第一塩基配列に対応するものであってよい。すなわち、前記細胞外ドメインは、前記第一塩基配列にコードされたアミノ酸配列を有しうる。
【0074】
前記細胞外ドメインは、好ましくは、配列ＩＤ Ｎｏ．１４のアミノ酸配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。このようなアミノ酸配列が、前記ＩｇＥ結合性領域として機能する。
【0075】
配列ＩＤ Ｎｏ．１４は以下のとおりである。配列ＩＤ Ｎｏ．１４は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちのアミノ酸残基番号１１０～１８３に対応する。配列ＩＤ Ｎｏ．１４のアミノ酸配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．７の塩基配列によりコードされたアミノ酸配列でもある。
【0076】
【0077】
より好ましい実施態様において、前記細胞外ドメインは、以下の配列ＩＤ Ｎｏ．１０のアミノ酸配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であってよい。当該アミノ酸配列は、ＩｇＥへの結合性のために好ましく、さらにはＩｇＥ結合性をもたらすための構造の維持のためにも好ましい。当該アミノ酸配列が、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質における細胞外ドメイン全体を構成してよい。
配列ＩＤ Ｎｏ．１０は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６～２０５のアミノ酸配列である。
配列ＩＤ Ｎｏ．１０は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２６～２０５のアミノ酸配列である。
【0078】
【0079】
また、前記細胞外ドメインは、２つのイムノグロブリンドメインを含んでよい。当該２つのイムノグロブリンドメインのうちの一つは、配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうち、アミノ酸残基番号４４～１０８のアミノ酸配列により形成されうる。当該２つのアミノ酸配列のうちのもう一つは、配列ＩＤ Ｎｏ．８のアミノ酸配列のうち、アミノ酸残基番号１２１～１９４のアミノ酸配列により形成されうる。
また、イムノグロブリンドメインとして機能するこれら２つのアミノ酸配列の間の領域は、リンカー領域とも呼ばれる。当該リンカー領域は、配列ＩＤ Ｎｏ．８のアミノ酸配列のうち、アミノ酸残基番号１０９～１２０のアミノ酸配列により形成されうる。
これらのアミノ酸配列についても、上記で配列ＩＤ Ｎｏ．１０について述べたとおりの配列同一性が許容される。
このようなアミノ酸配列が、ＩｇＥへの結合のために適している。
また、イムノグロブリンドメインとして機能するこれら２つのアミノ酸配列の間の領域は、リンカー領域とも呼ばれる。当該リンカー領域は、配列ＩＤ Ｎｏ．８のアミノ酸配列のうち、アミノ酸残基番号１０９～１２０のアミノ酸配列により形成されうる。
これらのアミノ酸配列についても、上記で配列ＩＤ Ｎｏ．１０について述べたとおりの配列同一性が許容される。
このようなアミノ酸配列が、ＩｇＥへの結合のために適している。
【0080】
（２）細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン
【0081】
前記細胞膜貫通ドメインは、前記非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖と結合する機能を有してよい。当該機能を発揮するために、前記細胞膜貫通ドメインは、当該機能を発揮する１つ又は複数のアミノ酸残基を含みうる。例えば、後述の細胞膜貫通ドメインに含まれるＡｓｐが、当該結合に関与しうる。
【0082】
すなわち、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞膜貫通ドメインを少なくとも含んでよい。そして、当該細胞膜貫通ドメインが、前記非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖との結合に機能を発揮する１つ又は複数のアミノ酸残基を含みうる。当該細胞膜貫通ドメインは、そのようなアミノ酸残基としては、例えば前記Ａｓｐを含んでよい。
【0083】
また、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、当該非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞内ドメインをさらに含んでよい。特に好ましくは、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、当該非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの両方を含む。
【0084】
前記細胞膜貫通ドメインは、好ましくは、配列ＩＤ Ｎｏ．１２のアミノ酸配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。
配列ＩＤ Ｎｏ．１２のアミノ酸配列と前記配列同一性を有するアミノ酸配列は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞膜貫通ドメインに対応する。
配列ＩＤ Ｎｏ．１２のアミノ酸配列と前記配列同一性を有するアミノ酸配列は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞膜貫通ドメインに対応する。
【0085】
前記細胞内ドメインは、好ましくは、配列ＩＤ Ｎｏ．１３のアミノ酸配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。このようなアミノ酸配列が、非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖との結合のために好ましい。
配列ＩＤ Ｎｏ．１３のアミノ酸配列と前記配列同一性を有するアミノ酸配列は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞内ドメインに対応する。
配列ＩＤ Ｎｏ．１３のアミノ酸配列と前記配列同一性を有するアミノ酸配列は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞内ドメインに対応する。
【0086】
配列ＩＤ Ｎｏ．１２及び配列ＩＤ Ｎｏ．１３は以下のとおりである。
配列ＩＤ Ｎｏ．１２は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２０６～２２４（細胞膜貫通ドメイン）である。配列ＩＤ Ｎｏ．１２のアミノ酸配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．５の塩基配列によりコードされたアミノ酸配列でもある。
配列ＩＤ Ｎｏ．１３は、当該アミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２２５～２４６（細胞内ドメイン）に対応する塩基配列である。配列ＩＤ Ｎｏ．１３のアミノ酸配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．６の塩基配列によりコードされたアミノ酸配列でもある。
配列ＩＤ Ｎｏ．１２は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２０６～２２４（細胞膜貫通ドメイン）である。配列ＩＤ Ｎｏ．１２のアミノ酸配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．５の塩基配列によりコードされたアミノ酸配列でもある。
配列ＩＤ Ｎｏ．１３は、当該アミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２２５～２４６（細胞内ドメイン）に対応する塩基配列である。配列ＩＤ Ｎｏ．１３のアミノ酸配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．６の塩基配列によりコードされたアミノ酸配列でもある。
【0087】
【0088】
【0089】
非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖への良好な結合性の観点から、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、配列ＩＤ Ｎｏ．１２のアミノ酸配列と配列ＩＤ Ｎｏ．１３のアミノ酸配列との両方を含むものであってよい。
【0090】
配列ＩＤ Ｎｏ．１２のアミノ酸配列と前記配列同一性を有する前記アミノ酸配列がＮ末端側にあり、且つ、配列ＩＤ Ｎｏ．１３のアミノ酸配列と前記配列同一性を有する前記アミノ酸配列はＣ末端側にあってよい。これら２つのアミノ酸配列の間には、アミノ酸残基は挿入されていなくてよい（すなわち、前者のアミノ酸配列の直後の後者のアミノ酸配列があってよい）が、例えば５アミノ酸残基～２５アミノ酸残基、特には７アミノ酸残基～２０アミノ酸残基、より特には１０アミノ酸残基～１５アミノ酸残基、より特には１２アミノ酸残基が挿入されていてもよい。
【0091】
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質が、当該非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの両方を含む場合において、当該タンパク質は、好ましくは、配列ＩＤ Ｎｏ．１１のアミノ酸配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。
配列ＩＤ Ｎｏ．１１のアミノ酸配列と前記配列同一性を有するアミノ酸配列は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに対応する。
配列ＩＤ Ｎｏ．１１は以下のとおりである。
配列ＩＤ Ｎｏ．１１のアミノ酸配列と前記配列同一性を有するアミノ酸配列は、非ヒト動物ＦｃεＲＩα鎖の細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインに対応する。
配列ＩＤ Ｎｏ．１１は以下のとおりである。
【0092】
【0093】
配列ＩＤ Ｎｏ．１１は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号２０６～２４６（細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン）である。配列ＩＤ Ｎｏ．１１のアミノ酸配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．４の塩基配列によりコードされたアミノ酸配列でもある。
【0094】
（３）シグナル配列
【0095】
前記シグナル配列は、上記のとおり、キメラＦｃεＲＩα鎖を細胞膜に発現させるためのシグナル配列である。前記シグナル配列は、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質の、細胞膜への移行を促進する。
【0096】
前記シグナル配列は、好ましくは、配列ＩＤ Ｎｏ．９のアミノ酸配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このようなアミノ酸配列が、キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質の細胞膜への発現にとって好ましい。
【0097】
配列ＩＤ Ｎｏ．９は以下のとおりである。配列ＩＤ Ｎｏ．９は、後述の配列ＩＤ Ｎｏ．８（本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質）のアミノ酸配列のうちアミノ酸残基番号１～２５（シグナル配列）である。また、配列ＩＤ Ｎｏ．９のアミノ酸配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．２の塩基配列によりコードされたアミノ酸配列でもある。
【0098】
【0099】
（４）キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質
【0100】
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、好ましくは、配列ＩＤ Ｎｏ．８のアミノ酸配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９２％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【0101】
配列ＩＤ Ｎｏ．８は以下のとおりである。
【0102】
【0103】
また、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖の細胞内ドメインをさらに含んでもよい。これにより、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質が発現される細胞におけるγ鎖の役割を、当該α鎖タンパク質が果たすことができ、当該細胞においてγ鎖が発現されなくてもよい。
また、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、例えばＬｙｎ又はＳｙｋなどのチロシンキナーゼのキナーゼドメインをさらに含んでもよい。当該キナーゼドメインは、配列ＩＤ Ｎｏ．１３のアミノ酸配列と前記配列同一性を有するアミノ酸配列の下流に挿入されてよい。当該キナーゼドメインによって、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質が発現される細胞におけるシグナル伝達を調節することができ、例えば脱顆粒などのアレルギー応答を制御することができる。
これらの構成要素により、宿主細胞のγ鎖又はチロシンキナーゼに依存せずに細胞内シグナリングを誘導することができるようになる。なお、これらの構成要素が含まれる場合は、当該誘導のために、好ましくは、前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、細胞膜貫通ドメインとして、例えばＣＤ８又はＩＬ２Ｒａの細胞膜貫通ドメインを含みうる。
また、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、例えばＬｙｎ又はＳｙｋなどのチロシンキナーゼのキナーゼドメインをさらに含んでもよい。当該キナーゼドメインは、配列ＩＤ Ｎｏ．１３のアミノ酸配列と前記配列同一性を有するアミノ酸配列の下流に挿入されてよい。当該キナーゼドメインによって、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質が発現される細胞におけるシグナル伝達を調節することができ、例えば脱顆粒などのアレルギー応答を制御することができる。
これらの構成要素により、宿主細胞のγ鎖又はチロシンキナーゼに依存せずに細胞内シグナリングを誘導することができるようになる。なお、これらの構成要素が含まれる場合は、当該誘導のために、好ましくは、前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、細胞膜貫通ドメインとして、例えばＣＤ８又はＩＬ２Ｒａの細胞膜貫通ドメインを含みうる。
【0104】
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を用いて生成されうる。例えば、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を、当該遺伝子に含まれる第二塩基配列がコードする細胞膜貫通ドメインが由来する非ヒト動物の細胞において発現させることによって、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質は生成されうる。例えば、当該遺伝子が導入された細胞の細胞膜に、本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質が発現しうる。
【0105】
４．第三の実施形態（ベクター）
【0106】
本発明は、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を含むベクターも提供する。当該ベクターによって、当該遺伝子を非ヒト動物細胞に導入することができる。当該ベクターは、非ヒト動物細胞への導入に際して、リニアライズされてよく、又は、されなくてもよい。
【0107】
前記ベクターは、例えば当技術分野で既知のプラスミドに前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を挿入することによって製造されてよい。当該プラスミドは、例えば少なくとも一つのクローニングサイトを有し、当該クローニングサイトを利用して、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が当該プラスミドに挿入されうる。
【0108】
プラスミドの種類は、非ヒト動物細胞の種類に応じて当業者により適宜選択されてよく、プラスミドの例として、例えばｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を挙げることができる。
【0109】
本発明のベクターは、例えば、Ｋｏｚａｋ配列を含みうる。当該Ｋｏｚａｋ配列によって、翻訳開始効率を高めることができる。当該Ｋｏｚａｋ配列は、例えば、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の開始コドンと、当該開始コドンの直前（５’端側）の１塩基～６塩基と、当該開始コドンの直後（３’端側）の１塩基～６塩基（特には１塩基）と、から構成されてよい。
【0110】
５．第四の実施形態（細胞）
【0111】
本発明は、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子、前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質、又は前記ベクターを含む、非ヒト動物の細胞も提供する。
【0112】
前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、例えば、前記非ヒト動物の細胞の染色体に組み込まれていてよく、又は、前記非ヒト動物の細胞内に導入されたベクター内に組み込まれていてもよい。安定的な発現のために、好ましくは、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、前記非ヒト動物の細胞の染色体に組み込まれている。
【0113】
本発明の細胞は、好ましくは、前記非ヒト動物細胞のＦｃεＲＩのγ鎖の遺伝子をさらに含む。さらに、本発明の細胞は、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子に基づき生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質と前記細胞のＦｃεＲＩのγ鎖タンパク質とを含む会合体を形成しうる。当該会合体には、当該α鎖１つと当該γ鎖２つとが含まれていてよい。すなわち、当該γ鎖遺伝子の発現産物である非ヒト動物ＦｃεＲＩγ鎖タンパクが、前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質と会合体を形成しうる。当該会合体は、ヒトＩｇＥのＦｃレセプターとして機能し、ヒトＩｇＥを高親和性に結合した複合体を形成する。１つの抗原が複数（例えば２つ）の当該ＩｇＥと結合することにより複数（例えば２つ）の当該複合体が架橋されることでアレルギー反応が起こる。このように、前記非ヒト細胞が前記γ鎖遺伝子をさらに含むことで、前記非ヒト細胞は、アレルギー反応を引き起こすことができ、これは種々のアレルギー検査を実行するために有用である。
【0114】
本発明の細胞は、より好ましくは、前記非ヒト動物細胞のＦｃεＲＩのβ鎖の遺伝子をさらに含む。当該β鎖遺伝子に基づき生成された非ヒト動物ＦｃεＲＩのβ鎖により、前記架橋によるシグナル伝達を増強することができる。
【0115】
前記γ鎖遺伝子及び前記β鎖遺伝子は、前記非ヒト動物に内在されているものであってよく、例えば前記非ヒト動物細胞の染色体内に天然に存在するものであってよい。例えば、ラットのγ鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子の配列情報は、NCBI Reference Sequenceデータベースより入手可能である。例えばラットのγ鎖遺伝子の情報（配列情報を含む）は、ウェブページ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001131001）より入手可能である。また、ラットのβ鎖遺伝子の情報（配列情報を含む）は、ウェブページ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M22923.1）より入手可能である。また、これら遺伝子から発現するタンパク質のアミノ酸配列情報は、uniprotデータベース（https://www.uniprot.org/）より入手することができる。
【0116】
本発明の細胞は、前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子に基づき生成されたキメラＦｃεＲＩα鎖と、前記細胞の非ヒト動物ＦｃεＲＩのβ鎖と、前記細胞の非ヒト動物ＦｃεＲＩのγ鎖とを含む会合体を形成しうる。当該会合体には、当該α鎖１つと、当該β鎖１つと、当該当該γ鎖２つとが含まれていてよい。すなわち、当該会合体は４量体であり、本発明の細胞は、好ましくは、当該４量体を形成するように構成されていてよい。当該４量体によって、前記アレルギー反応に関与するシグナル伝達が増強されうる。これにより、当該細胞を用いたアレルギー検査を、より感度良く実行することができる。
【0117】
本発明の細胞は、より好ましくは、前記会合体同士の架橋によって発現が誘導されるレポーター遺伝子をさらに含む。当該レポーター遺伝子によって、当該細胞を用いたアレルギー検査を感度良く実行することができる。
【0118】
当該レポーター遺伝子は、上記のとおり、前記会合体同士の架橋によって発現が誘導される遺伝子である。このように誘導される遺伝子は、好ましくは、前記架橋によって活性化した転写因子によって発現が誘導されるように構成されうる。当該転写因子は、ＮＦ－ＡＴ、ＮＦ－κＢ、ＡＰ－１、Ｅｌｋ－１、Ｅｇｒ－１、ＧＡＴＡ－１、及びＧＡＴＡ－２からなる群から選ばれるいずれか一つであってよく、好ましくはＮＦ－ＡＴ である。ＮＦ－ＡＴの活性化は、被験物質の中から被験者に対してＩ型アレルギーを誘発する可能性があるアレルゲンを検出するために適している。
【0119】
例えば、当該レポーター遺伝子は、前記活性化転写因子が結合しうるエンハンサーの制御下にあってよい。当該レポーター遺伝子の上流には、プロモーターが配置されていてもよい。例えば、本発明の細胞は、前記エンハンサーと、当該エンハンサーの制御下にあるプロモーター及びレポーター遺伝子を含む。前記エンハンサー、前記プロモーター、及び前記レポーター遺伝子は、例えばこれら３つの要素を含む領域（以下「レポーター遺伝子領域」ともいう）を有するベクター（例えばプラスミド）によって、前記細胞に導入されてよい。当該レポーター遺伝子領域は、前記非ヒト動物細胞の染色体内に導入されてよく、又は、前記非ヒト動物細胞中のベクター内に存在していてもよい。好ましくは、当該レポーター遺伝子領域は、前記非ヒト動物細胞の染色体内に導入されている。これにより、当該レポーター遺伝子の安定的な発現が可能となる。当該レポーター遺伝子領域は、例えば相同組み換えによって、染色体内に導入されうる。
【0120】
前記エンハンサーの配列は、前記転写因子の種類に応じて当業者により適宜選択されてよく、例えば以下表１に示される配列のいずれかであってよい。以下の表１の左列には、エンハンサー配列が記載されている。各エンハンサー配列は括弧で囲まれており、当該括弧の外に記載されている数字は、エンハンサー配列の反復回数の例である。本技術において、レポーター遺伝子に含まれるエンハンサーのエンハンサー配列反復回数は、表１に記載された数に限定されず、例えば１～１５、２～１５、特には２～１０、より特には３～１０のうちのいずれかの数であってよい。表１の右列には、各エンハンサー配列に結合する転写因子が記載されている。
【0121】
【表1】
【0122】
前記プロモーターは、細胞のＲＮＡポリメラーゼを含む複合体が結合する配列を有するものであってよく、例えばＴＡＴＡボックスを有するプロモーターであってよく、好ましくは配列ＴＡＴＡＴＡＡを有するプロモーターであってよい。
【0123】
前記レポーター遺伝子は、例えば、酵素をコードする遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、及び表面抗原（前記非ヒト動物に内在しないもの）をコードする遺伝子のうちのいずれかであってよい。
前記酵素をコードする遺伝子は、例えば、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼのうちのいずれか１つ又はそれ以上であってよい。
前記蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、及びＤｓＲｅｄのうちのいずれか１つ又はそれ以上であってよい。
本発明の非ヒト動物細胞は、同じ又は異なる種類のレポーター遺伝子を１つ又はそれ以上有していてよい。好ましくは、本発明の非ヒト動物細胞は、１、２、３、４、又は５つのレポーター遺伝子を含んでよい。
前記酵素をコードする遺伝子は、例えば、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼのうちのいずれか１つ又はそれ以上であってよい。
前記蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、及びＤｓＲｅｄのうちのいずれか１つ又はそれ以上であってよい。
本発明の非ヒト動物細胞は、同じ又は異なる種類のレポーター遺伝子を１つ又はそれ以上有していてよい。好ましくは、本発明の非ヒト動物細胞は、１、２、３、４、又は５つのレポーター遺伝子を含んでよい。
【0124】
本発明の細胞は、非ヒト動物の細胞であってよい。前記非ヒト動物は、例えばげっ歯類の動物であってよく、好ましくはラット、マウス、又はハムスターであってよく、より好ましくはラットである。
【0125】
本発明の非ヒト動物細胞は、好ましくは前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質と当該非ヒト動物細胞に由来するＦｃεＲＩγ鎖タンパク質とが会合体を形成するように構成されている細胞であり、より好ましくは前記キメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質と当該非ヒト動物細胞に由来するＦｃεＲＩβ鎖タンパク質及びＦｃεＲＩγ鎖タンパク質とが会合体を形成するように構成されている細胞である。このような細胞として、例えば、マスト細胞（肥満細胞）、好塩基球、樹状細胞、好酸球、単球、マクロファージ、及びランゲルハンス細胞を挙げることができる。すなわち、本発明の細胞は、これらの列挙された細胞のうちのいずれか一つであってよく、より好ましくはマスト細胞、好塩基球、又は樹状細胞であり、さらにより好ましくはマスト細胞である。
本発明の非ヒト動物細胞は、好ましくは、ラットのマスト細胞、好塩基球、若しくは樹状細胞、又は、マウスのマスト細胞、好塩基球、若しくは樹状細胞であり、より好ましくは、ラット又はマウスのマスト細胞である。
本発明の非ヒト動物細胞は、好ましくは、ラットのマスト細胞、好塩基球、若しくは樹状細胞、又は、マウスのマスト細胞、好塩基球、若しくは樹状細胞であり、より好ましくは、ラット又はマウスのマスト細胞である。
【0126】
本発明の非ヒト動物細胞は、例えば、動物体内から単離された細胞又は株化した細胞に前記キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を導入することにより得られてよい。本発明において用いられうる当該株化した細胞の例として、ラットマスト細胞株であるＲＢＬ－２Ｈ３細胞（細胞番号：ＪＣＲＢ００２３、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより入手可能、又は、細胞番号：ＣＲＬ－２２５６、ＡＴＣＣ（商標）より入手可能）及びマウスマスト細胞株であるＭＣ／９細胞（ＡＴＣＣ（商標）より入手可能）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【0127】
本発明の非ヒト動物細胞は、例えば、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３２３０で寄託された細胞であってよい。当該細胞は、寄託日を令和２年（２０２０年）６月１７日として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国際寄託された。
【0128】
本発明の非ヒト動物細胞は、例えば、分析方法において用いられてよく、例えば以下「７．第六の実施形態（分析方法）」において説明する分析方法において用いられてよい。
また、本発明の非ヒト動物細胞は、例えば、上記特許文献１に記載の方法における細胞として使用するために適している。すなわち、本発明の非ヒト動物細胞は、上記で述べたEXiLE法において使用されてよい。
また、本発明の非ヒト動物細胞は、例えば、上記特許文献１に記載の方法における細胞として使用するために適している。すなわち、本発明の非ヒト動物細胞は、上記で述べたEXiLE法において使用されてよい。
【0129】
６．第五の実施形態（分析用キット）
【0130】
本発明は、本発明の細胞を含む分析用キットを提供する。前記キットは、例えばアレルギーに関する分析又は診断のために用いられうる。前記キットは、例えばアレルゲン性の評価、アレルギーの有無又はリスクの評価、ＩｇＥについての分析、アレルギー抑制活性の評価、及びドラッグスクリーニングからなる群から選ばれる少なくとも一つの試験を実行するために用いられるキットであってよい。
【0131】
本発明のキットは、レポーター遺伝子の発現検出用材料を含みうる。当該検出用材料は、例えばレポーター遺伝子が酵素を発現する場合、当該酵素の基質を含んでよく、例えばルシフェラーゼの基質を含みうる。
【0132】
本発明のキットは、例えば、本発明の細胞をインキュベートするために用いられるインキュベート材料を含みうる。当該インキュベート用材料は、前記細胞をインキュベートするために用いられる材料を意味してよく、例えば前記細胞がインキュベートされる培地又はバッファーであってよい。当該インキュベート材料は、例えば感作用インキュベートのためのインキュベート材料、細胞応答誘導用インキュベートのためのインキュベート材料であってもよい。また、当該インキュベート材料は、感作及び細胞応答誘導の両方のインキュベート材料であってもよい。
【0133】
前記培地として、例えばＭＥＭ培地を挙げることができるが、これに限定されない。当該培地は、例えばウシ胎児血清などの補助成分を含んでもよい。
前記バッファーとして、例えばＰＢＳを挙げることができるがこれに限定されない。当該ＰＢＳは、例えば細胞洗浄液として用いられうる。
前記バッファーとして、例えばＰＢＳを挙げることができるがこれに限定されない。当該ＰＢＳは、例えば細胞洗浄液として用いられうる。
【0134】
本発明のキットは、細胞感作成分を含みうる。当該成分は、上記で述べた感作用インキュベートのためのインキュベート材料に含まれていてもよく、例えば培地又はバッファー中に含まれていてよい。又は、当該成分は、培地又はバッファーに含まれていない状態で、前記キットに含まれていてもよい。
当該細胞感作成分は、本発明の細胞を感作させることができる成分であってよい。細胞感作成分は、例えばＩｇＥ又はキメラＩｇＥである。当該ＩｇＥは、霊長類のＩｇＥであってよく、例えばヒト又は非ヒト霊長類（特にはサル）のＩｇＥであってよく、好ましくはヒトのＩｇＥである。当該ＩｇＥは、精製又は単離されたＩｇＥであってよく、又は、精製又は単離されていないＩｇＥであってもよい。また、前記キメラＩｇＥ、例えばＦｃ部がヒト化されたキメラＩｇＥであってよい。
当該細胞感作成分は、生体材料であってもよく、例えば全血、血清、血しょう、又は血液に含まれる成分（例えば血液細胞）などであってもよい。
当該細胞感作成分は、本発明の細胞を感作させることができる成分であってよい。細胞感作成分は、例えばＩｇＥ又はキメラＩｇＥである。当該ＩｇＥは、霊長類のＩｇＥであってよく、例えばヒト又は非ヒト霊長類（特にはサル）のＩｇＥであってよく、好ましくはヒトのＩｇＥである。当該ＩｇＥは、精製又は単離されたＩｇＥであってよく、又は、精製又は単離されていないＩｇＥであってもよい。また、前記キメラＩｇＥ、例えばＦｃ部がヒト化されたキメラＩｇＥであってよい。
当該細胞感作成分は、生体材料であってもよく、例えば全血、血清、血しょう、又は血液に含まれる成分（例えば血液細胞）などであってもよい。
【0135】
本発明のキットは、細胞応答誘導成分を含みうる。当該成分は、上記で述べた細胞応答誘導用インキュベートのためのインキュベート材料に含まれていてもよく、例えば培地又はバッファー中に含まれていてよい。又は、当該成分は、培地又はバッファーに含まれていない状態で、前記キットに含まれていてもよい。
前記細胞応答誘導成分は、例えば、前記細胞感作成分に結合して本発明の細胞の応答を誘導する成分であってよく、例えば、前記ＩｇＥ又はキメラＩｇＥに結合する成分であってよい。細胞応答誘導成分は、例えば抗ＩｇＥ抗体であってよく、又は、ＩｇＥ又はキメラＩｇＥと結合する（例えば特異的に結合する）抗原又は抗原候補物質であってよい。
前記細胞応答誘導成分は、当該抗原又は抗原候補物質は、例えば被験者に対してアレルギー反応（特にはＩ型アレルギー反応）を引き起こし得る物質（すなわちアレルゲンとなる可能性のある物質）であってよい。当該物質として、例えば、塵；埃；ふけなどの皮屑；スギ花粉、ヤシャブシ花粉、イネ科花粉、キク科花粉などの花粉；カビなどの真菌；ユスリカやゴキブリなどの昆虫；昆虫や魚介類などが有する刺激性または毒性の物質；大豆、卵、小麦、牛乳、ソバ、落花生、えび、かになどに含まれる物質；ペニシリンなどの薬剤に含まれる物質；排泄物などに含まれる動物の体に由来する物質；小麦粉や木材加工の際に生じる粉塵などの植物性物質；その他の天然または化学合成物質を挙げることができるが、これに限定されない。例えば、被験者が卵白をアレルゲンとするかどうかを検出したい場合には、たとえば、被験物質としてオブアルブミン、オボムコイド、リゾチームなどの卵白中に存在する物質の精製品や卵白抽出物を用いることができる。ＩｇＥとしてキメラＩｇＥを用いる場合は、抗原として例えばニトロフェニル基のような低分子ハプテンを用いることもできる。
前記細胞応答誘導成分は、例えば、前記細胞感作成分に結合して本発明の細胞の応答を誘導する成分であってよく、例えば、前記ＩｇＥ又はキメラＩｇＥに結合する成分であってよい。細胞応答誘導成分は、例えば抗ＩｇＥ抗体であってよく、又は、ＩｇＥ又はキメラＩｇＥと結合する（例えば特異的に結合する）抗原又は抗原候補物質であってよい。
前記細胞応答誘導成分は、当該抗原又は抗原候補物質は、例えば被験者に対してアレルギー反応（特にはＩ型アレルギー反応）を引き起こし得る物質（すなわちアレルゲンとなる可能性のある物質）であってよい。当該物質として、例えば、塵；埃；ふけなどの皮屑；スギ花粉、ヤシャブシ花粉、イネ科花粉、キク科花粉などの花粉；カビなどの真菌；ユスリカやゴキブリなどの昆虫；昆虫や魚介類などが有する刺激性または毒性の物質；大豆、卵、小麦、牛乳、ソバ、落花生、えび、かになどに含まれる物質；ペニシリンなどの薬剤に含まれる物質；排泄物などに含まれる動物の体に由来する物質；小麦粉や木材加工の際に生じる粉塵などの植物性物質；その他の天然または化学合成物質を挙げることができるが、これに限定されない。例えば、被験者が卵白をアレルゲンとするかどうかを検出したい場合には、たとえば、被験物質としてオブアルブミン、オボムコイド、リゾチームなどの卵白中に存在する物質の精製品や卵白抽出物を用いることができる。ＩｇＥとしてキメラＩｇＥを用いる場合は、抗原として例えばニトロフェニル基のような低分子ハプテンを用いることもできる。
【0136】
本発明のキットはさらに、試験において用いられる陽性対照材料及び／又は陰性対照材料を含みうる。陽性対照材料は、例えばカルシウムイオノフォア（例えばイオノマイシンなど）を含みうる。陰性対照材料は、例えば培地であってよい。
また、本発明のキットは、転写因子の活性を抑制する物質を含んでもよく、例えばＮＦ－ＡＴの活性を抑制する物質を含んでもよい。当該物質は、例えばシクロスポリンＡまたはタクロリムスでありうる。なお、本発明のキットが、抗アレルギー活性物質のスクリーニング用キットである場合は、当該物質は、抗アレルギー活性物質の陽性対照として用いられうる。
また、本発明のキットは、転写因子の活性を抑制する物質を含んでもよく、例えばＮＦ－ＡＴの活性を抑制する物質を含んでもよい。当該物質は、例えばシクロスポリンＡまたはタクロリムスでありうる。なお、本発明のキットが、抗アレルギー活性物質のスクリーニング用キットである場合は、当該物質は、抗アレルギー活性物質の陽性対照として用いられうる。
【0137】
本発明のキットはさらに薬剤を含みうる。
当該薬剤は、感作阻害剤であってよく、又は、感作を阻害することが期待される薬剤であってもよい。当該薬剤は、例えば、ＩｇＥ又はキメラＩｇＥに結合する成分であってよく、例えば抗ＩｇＥ抗体又は抗キメラＩｇＥ抗体でありうる。
当該薬剤は、細胞応答阻害剤であってよく、又は、細胞応答を阻害することが期待される薬剤であってもよい。当該薬剤は、例えばＦｃεＲＩの架橋によるシグナル伝達を阻害するシグナル伝達阻害剤であってよい。
当該薬剤は、感作阻害剤であってよく、又は、感作を阻害することが期待される薬剤であってもよい。当該薬剤は、例えば、ＩｇＥ又はキメラＩｇＥに結合する成分であってよく、例えば抗ＩｇＥ抗体又は抗キメラＩｇＥ抗体でありうる。
当該薬剤は、細胞応答阻害剤であってよく、又は、細胞応答を阻害することが期待される薬剤であってもよい。当該薬剤は、例えばＦｃεＲＩの架橋によるシグナル伝達を阻害するシグナル伝達阻害剤であってよい。
【0138】
本発明のキットはさらに、試験のための反応が行われる容器、特には本発明の細胞が保持される空間を有する容器を含みうる。当該容器の例として、例えばウェルプレート（９６ウェルプレートなど）を挙げることができる。
【0139】
７．第六の実施形態（分析方法）
【0140】
本発明は、本発明に従う細胞を用いる分析方法も提供する。当該方法は、アレルギーに関する分析又は診断のために行われうる。当該方法は、当該細胞を用いて、例えばアレルゲン性の評価、アレルギーの有無若しくはリスクの評価、ＩｇＥについての分析、アレルギー抑制活性の評価、又はドラッグスクリーニングを行うことを含みうる。すなわち、本発明の分析方法は、アレルゲン性の評価方法、アレルギーの有無若しくはリスクの評価方法、ＩｇＥの分析方法、アレルギー抑制活性の評価方法、又はドラッグスクリーニング方法として構成されてよい。
【0141】
本発明の方法は、例えば、上記特許文献１に記載された方法を実行するように行われてよく、すなわち、ＥＸｉＬＥ法を実行するように行われてよい。
【0142】
また、本発明の方法は、抗原特異的なＩｇＥのセカンドスクリーニングのために行われうる。例えば、生物学的に意義のあるＩｇＥかどうかの評価、中和抗体のアッセイ、又は交差反応性のアッセイのために、本発明の方法が実行されてよい。
また、本発明の方法は、ドラッグスクリーニング、特にはハイスループットなドラッグスクリーニングのために行われうる。例えば、ＩｇＥとＦｃεＲＩとの結合を阻害する物質の選択又は評価のために、又は、細胞（特にはマスト細胞又は好塩基球など）の細胞内シグナル伝達阻害物質の選択又は評価のために、本発明の方法が行われてよい。
また、本発明の方法は、基礎科学研究のために行われてよい。例えば、メカニズム解析又はバイオマーカー探索のために、本発明の方法が行われてよい。
また、本発明の方法は、ドラッグスクリーニング、特にはハイスループットなドラッグスクリーニングのために行われうる。例えば、ＩｇＥとＦｃεＲＩとの結合を阻害する物質の選択又は評価のために、又は、細胞（特にはマスト細胞又は好塩基球など）の細胞内シグナル伝達阻害物質の選択又は評価のために、本発明の方法が行われてよい。
また、本発明の方法は、基礎科学研究のために行われてよい。例えば、メカニズム解析又はバイオマーカー探索のために、本発明の方法が行われてよい。
【0143】
本発明の方法は、例えば、本発明に従う細胞をインキュベートするインキュベート工程及び／又は前記細胞の応答を分析する分析工程を含みうる。
【0144】
前記インキュベート工程において、例えば本発明に従う細胞がインキュベートされうる。前記インキュベート工程は、後述するとおり、２又はそれ以上のインキュベート工程から構成されてよい。
【0145】
前記インキュベート工程は、例えば、本発明に従う細胞をインキュベート用材料中でインキュベートすることを含みうる。本明細書内において、「インキュベート用材料」は、前記細胞をインキュベートするために用いられる材料を意味し、例えば前記細胞がインキュベートされる培地又はバッファーであってよい。
【0146】
前記分析工程において、本発明に従う細胞の応答が分析されうる。当該分析は、例えば、上記で説明したレポーター遺伝子の発現の分析であってよい。当該レポーター遺伝子の発現は、上記「５．第四の実施形態（細胞）」において説明した前記会合体同士の架橋によって誘導される発現であってよい。レポーター遺伝子の発現分析の具体的な手法は、レポーター遺伝子の種類に応じて当業者により適宜選択されてよい。例えば、レポーター遺伝子が、酵素タンパク質を発現する場合は、分析工程において、当該酵素タンパク質による酵素反応の分析が行われうる。例えば、酵素タンパク質がルシフェラーゼである場合、ルシフェラーゼによる基質分解によって生じる発光が分析されうる。例えば、レポーター遺伝子が蛍光タンパク質を発現する場合は、分析工程において、当該蛍光タンパク質から生じた蛍光の分析が行われうる。
【0147】
また、前記分析は、当該細胞におけるアレルギー応答の分析であってよく、特にはＩ型アレルギー応答の分析であってもよい。当該分析において、例えば脱顆粒などのアレルギー応答が分析されうる。
【0148】
前記分析工程は、前記インキュベート工程の後に実行されてよく、又は、前記インキュベート工程が行われている間に実行されてもよい。例えば、前記分析工程は、２以上のインキュベート工程のうちのいずれか一つのインキュベート工程が行われている間（特には最後のインキュベート工程が行われている間）に実行されてもよい。
【0149】
本発明の一つの実施態様において、前記インキュベート工程は、２つのインキュベート工程を含む。以下これら２つのインキュベート工程を、「第一インキュベート工程」及び「第二インキュベート工程」ともいう。第一インキュベート工程は、本発明に従う細胞に感作をもたらすための処理を行う感作用インキュベート工程であってよい。第二インキュベート工程は、当該処理が行われた細胞における応答を誘導する細胞応答誘導用インキュベート工程であってよい。
【0150】
この実施態様において、前記分析工程は、例えば第一インキュベート工程が行われている間に実行されてよく、第一インキュベート工程と前記第二インキュベート工程との間に実行されてよく、前記第二インキュベート工程が行われている間に実行されてよく、又は、前記第二インキュベート工程の後に実行されてよい。
【0151】
以下、これらの工程についてそれぞれ説明する。
【0152】
（１－１）第一インキュベート工程
【0153】
前記第一インキュベート工程において用いられるインキュベート用材料は、感作用材料又は感作分析用材料であってよい。すなわち、前記第一インキュベート工程は、前記細胞を、感作用材料又は感作分析用材料中でインキュベートすることを含む。当該材料は、例えば培地又はバッファーでありうる。前記培地又は前記バッファーの種類は、例えば分析の目的などに応じて当業者により適宜選択されてよい。例えば、当該培地は、ＭＥＭ培地であってよい。当該材料は、補助成分を含んでよく、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含みうる。当該材料は、補助成分として、例えば１又は２以上の抗生物質を含んでもよい。
【0154】
本明細書内において、「感作用材料」は、前記細胞を感作させるために用いられる材料をいう。当該感作用材料は、前記細胞を感作させることができる成分（本明細書内において「細胞感作成分」ともいう）を含む材料を意味してよい。
前記「細胞感作成分」は、例えばＩｇＥ又はキメラＩｇＥである。当該ＩｇＥ又はキメラＩｇＥは、霊長類のＩｇＥ又はキメラＩｇＥであってよく、例えばヒト又は非ヒト霊長類（特にはサル）のＩｇＥ又はキメラＩｇＥであってよく、好ましくはヒトのＩｇＥ又はキメラＩｇＥである。当該ＩｇＥ又はキメラＩｇＥは、精製又は単離されたＩｇＥ又はキメラＩｇＥであってよく、又は、精製又は単離されていないＩｇＥ又はキメラＩｇＥであってもよい。
前記「細胞を感作させることができる成分を含む材料」は、例えば細胞感作成分を含む培地又はバッファーであってよく、特には当該成分を含む培地である。
本発明の一つの実施態様において、前記感作用材料は、例えば精製又は単離されたＩｇＥを含む材料（特には培地又はバッファー）であってよい。
本発明の他の実施態様において、前記感作用材料は、ＩｇＥを含むことが既知の生体成分（特には霊長類由来生体成分、ヒト又は非ヒト霊長類（サル）に由来する生体成分）を含む材料（培地又はバッファー）であってよく、より具体的には全血、血清、若しくは血しょう、又は血液構成成分（例えば血液細胞）を含む材料（培地又はバッファー）などであってよい。
前記「細胞感作成分」は、例えばＩｇＥ又はキメラＩｇＥである。当該ＩｇＥ又はキメラＩｇＥは、霊長類のＩｇＥ又はキメラＩｇＥであってよく、例えばヒト又は非ヒト霊長類（特にはサル）のＩｇＥ又はキメラＩｇＥであってよく、好ましくはヒトのＩｇＥ又はキメラＩｇＥである。当該ＩｇＥ又はキメラＩｇＥは、精製又は単離されたＩｇＥ又はキメラＩｇＥであってよく、又は、精製又は単離されていないＩｇＥ又はキメラＩｇＥであってもよい。
前記「細胞を感作させることができる成分を含む材料」は、例えば細胞感作成分を含む培地又はバッファーであってよく、特には当該成分を含む培地である。
本発明の一つの実施態様において、前記感作用材料は、例えば精製又は単離されたＩｇＥを含む材料（特には培地又はバッファー）であってよい。
本発明の他の実施態様において、前記感作用材料は、ＩｇＥを含むことが既知の生体成分（特には霊長類由来生体成分、ヒト又は非ヒト霊長類（サル）に由来する生体成分）を含む材料（培地又はバッファー）であってよく、より具体的には全血、血清、若しくは血しょう、又は血液構成成分（例えば血液細胞）を含む材料（培地又はバッファー）などであってよい。
【0155】
本明細書内において、前記「感作分析用材料」は、前記細胞を感作させることができるかに関する分析の対象となる材料をいう。当該感作分析用材料は、前記細胞感作成分を含みうる材料を意味してよい。
前記「細胞感作成分」は、上記で述べたとおりであってよい。
前記「細胞感作成分を含みうる材料」、当該成分を含むかどうかが不明である材料（培地又はバッファー）であってよく、又は、当該成分を含むことが既知であるが当該成分の種類又は含有量が不明である材料であってよい。例えば、当該材料は、本発明の方法を実施した結果、当該成分を含むこと若しくは含まないことが判明する材料、又は、当該成分の含有量及び／若しくは種類が判明する材料であってもよい。
前記「細胞感作成分」は、上記で述べたとおりであってよい。
前記「細胞感作成分を含みうる材料」、当該成分を含むかどうかが不明である材料（培地又はバッファー）であってよく、又は、当該成分を含むことが既知であるが当該成分の種類又は含有量が不明である材料であってよい。例えば、当該材料は、本発明の方法を実施した結果、当該成分を含むこと若しくは含まないことが判明する材料、又は、当該成分の含有量及び／若しくは種類が判明する材料であってもよい。
【0156】
（１－２）第二インキュベート工程
【0157】
前記第二インキュベート工程において用いられるインキュベート用材料は、細胞応答誘導用材料又は細胞応答誘導分析用材料であってよい。すなわち、前記第二インキュベート工程は、前記細胞を、細胞応答誘導用材料又は細胞応答誘導分析用材料中でインキュベートすることを含む。当該材料は、例えば培地又はバッファーでありうる。前記培地又は前記バッファーの種類は、例えば分析の目的などに応じて当業者により適宜選択されてよい。例えば、当該培地は、ＭＥＭ培地であってよい。当該材料は、補助成分を含んでよく、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含みうる。当該材料は、補助成分として、例えば１又は２以上の抗生物質を含んでもよい。
【0158】
本明細書内において、「前記細胞応答誘導用材料」は、細胞の応答を誘導する成分（以下「細胞応答誘導成分」ともいう）、特には感作された細胞の応答を誘導する成分を含む材料であってよい。
「前記細胞応答誘導用材料」は、前記細胞応答誘導成分に加えて、上記で説明した細胞感作成分を含んでよく又は含まなくてもよい。
前記細胞応答誘導成分は、例えば、前記細胞感作成分に結合して本発明の細胞の応答を誘導する成分であってよく、例えば、前記ＩｇＥ又はキメラＩｇＥに結合する成分であってよい。細胞応答誘導成分は、例えば抗ＩｇＥ抗体であってよく、又は、ＩｇＥ又はキメラＩｇＥと結合する（例えば特異的に結合する）抗原又は抗原候補物質であってよい。
「前記細胞応答誘導用材料」は、前記細胞応答誘導成分に加えて、上記で説明した細胞感作成分を含んでよく又は含まなくてもよい。
前記細胞応答誘導成分は、例えば、前記細胞感作成分に結合して本発明の細胞の応答を誘導する成分であってよく、例えば、前記ＩｇＥ又はキメラＩｇＥに結合する成分であってよい。細胞応答誘導成分は、例えば抗ＩｇＥ抗体であってよく、又は、ＩｇＥ又はキメラＩｇＥと結合する（例えば特異的に結合する）抗原又は抗原候補物質であってよい。
【0159】
前記細胞応答誘導成分により誘導される細胞応答は、例えば、上記で説明したレポーター遺伝子の発現であってよい。特には、当該発現は、前記会合体同士の架橋によって誘導される発現であってよい。
また、前記細胞応答は、当該細胞のアレルギー応答であってもよく、特にはＩ型アレルギーに関する細胞応答であってよい。前記細胞応答は、例えば脱顆粒などのアレルギー応答であってよい。
また、前記細胞応答は、当該細胞のアレルギー応答であってもよく、特にはＩ型アレルギーに関する細胞応答であってよい。前記細胞応答は、例えば脱顆粒などのアレルギー応答であってよい。
【0160】
本明細書内において、前記「細胞応答誘導分析用材料」は、細胞応答を誘導することができるかの分析対象となる材料をいう。前記「細胞応答誘導分析用材料」は、例えば、細胞応答誘導成分を含みうる材料を意味してよく、特には感作された細胞の応答を誘導する成分を含みうる材料を意味してよい。
前記「細胞応答誘導成分」は、上記で述べたとおりであってよい。
前記「細胞応答誘導成分を含みうる材料」は、当該成分を含むかどうかが不明である材料（培地又はバッファー）であってよく、又は、当該成分を含むことは既知であるが当該成分の種類及び／又は含有量が不明である材料であってよい。例えば、当該材料は、本発明の方法を実施した結果、当該成分を含むこと若しくは含まないことが判明する材料、又は、当該成分の含有量及び／若しくは種類が判明する材料であってもよい。
前記「細胞応答誘導成分」は、上記で述べたとおりであってよい。
前記「細胞応答誘導成分を含みうる材料」は、当該成分を含むかどうかが不明である材料（培地又はバッファー）であってよく、又は、当該成分を含むことは既知であるが当該成分の種類及び／又は含有量が不明である材料であってよい。例えば、当該材料は、本発明の方法を実施した結果、当該成分を含むこと若しくは含まないことが判明する材料、又は、当該成分の含有量及び／若しくは種類が判明する材料であってもよい。
【0161】
（１－３）分析工程
【0162】
前記分析工程において、前記細胞の応答が分析される。当該応答は、例えば、上記で説明したレポーター遺伝子の発現であってよい。特には、当該発現は、前記会合体同士の架橋によって誘導される発現であってよい。レポーター遺伝子の発現分析の具体的な手法は、レポーター遺伝子の種類に応じて当業者により適宜選択されてよい。例えば、レポーター遺伝子が、酵素タンパク質を発現する場合は、分析工程において酵素反応の分析が行われうる。例えば、酵素タンパク質がルシフェラーゼである場合、ルシフェラーゼによる基質分解によって生じる発光が分析されうる。例えば、レポーター遺伝子が蛍光タンパク質を発現する場合は、分析工程において蛍光分析が行われうる。
【0163】
また、前記応答は、当該細胞のアレルギー応答であってもよく、特にはＩ型アレルギーに関する細胞応答であってよく、例えば細胞内カルシウムイオン濃度上昇や脱顆粒などのアレルギー応答であってよい。これらのアレルギー応答は、蛍光指示薬を用いて測定されてよい。
また、前記応答を分析するために、エバネッセント波を用いて、アレルギー応答に伴う細胞膜の屈折率変化などが測定されてもよい。
また、前記応答を分析するために、エバネッセント波を用いて、アレルギー応答に伴う細胞膜の屈折率変化などが測定されてもよい。
【0164】
（１－４）薬剤の使用
【0165】
本発明の分析方法において、本発明の細胞における応答に影響を及ぼしうる薬剤が用いられてよい。当該薬剤は、例えばアレルギー反応を阻害又は抑制するために用いられる剤であってよく、例えば感作阻害剤又は細胞応答阻害剤であってよい。当該薬剤は、例えば、
前記第一インキュベーション工程の前、
前記第一インキュベーション工程が実行されている間、
前記第一インキュベーション工程と前記第二インキュベーション工程との間、
前記第二インキュベーション工程が実行されている間、又は、
前記第二インキュベーション工程の後
のいずれか１つ又は２つ以上の段階において用いられてよい。
当該薬剤を用いて本発明の方法を実行することにより、例えば当該薬剤のアレルギー反応抑制活性の評価が可能となる。また、種々の薬剤を用いて本発明の方法を実行することにより、ドラッグスクリーニングを行うこともできる。
前記第一インキュベーション工程の前、
前記第一インキュベーション工程が実行されている間、
前記第一インキュベーション工程と前記第二インキュベーション工程との間、
前記第二インキュベーション工程が実行されている間、又は、
前記第二インキュベーション工程の後
のいずれか１つ又は２つ以上の段階において用いられてよい。
当該薬剤を用いて本発明の方法を実行することにより、例えば当該薬剤のアレルギー反応抑制活性の評価が可能となる。また、種々の薬剤を用いて本発明の方法を実行することにより、ドラッグスクリーニングを行うこともできる。
【0166】
当該薬剤は、例えば、上記で述べたインキュベーション材料に含まれた状態で使用されうる。当該薬剤の各工程における使用例は以下のとおりである。
【0167】
例えば、上記（１－１）において述べた前記第一インキュベーション工程において、当該薬剤が、感作用材料又は感作分析用材料に含まれうる。この場合において、当該薬剤は、感作阻害剤であってよく、又は、感作を阻害することが期待される薬剤であってもよい。当該薬剤は、例えば、ＩｇＥ又はキメラＩｇＥに結合する成分であってよく、例えば抗ＩｇＥ抗体又は抗キメラＩｇＥ抗体でありうる。代替的には、当該薬剤は、受容体のダウンレギュレーションを誘導する薬物であってもよい。このように薬剤を使用することで、アレルギー反応（特にはＩ型アレルギー反応）を抑制する作用を有する薬剤をスクリーニングすることができ、または、アレルギー反応抑制剤（特にはＩ型アレルギー反応抑制剤）の抑制作用の評価を行うこともできる。
代替的には、前記第一インキュベーション工程の前に、当該薬剤と、前記感作用材料又は前記感作分析用材料に含まれる細胞感作成分との接触が行われてもよい。当該接触後に、前記感作用材料又は前記感作分析用材料中で前記細胞をインキュベートすることによっても、前記スクリーニング又は前記評価を行うことができる。
代替的には、前記第一インキュベーション工程の前に、当該薬剤と、前記感作用材料又は前記感作分析用材料に含まれる細胞感作成分との接触が行われてもよい。当該接触後に、前記感作用材料又は前記感作分析用材料中で前記細胞をインキュベートすることによっても、前記スクリーニング又は前記評価を行うことができる。
【0168】
また、上記（１－２）において述べた前記第二インキュベーション工程において、当該薬剤が、細胞応答誘導用材料又は細胞応答誘導分析用材料に当該薬剤が含まれうる。この場合において、当該薬剤は、細胞応答阻害剤であってよく、又は、細胞応答を阻害することが期待される薬剤であってもよい。当該薬剤は、例えばＦｃεＲＩの架橋によるシグナル伝達を阻害するシグナル伝達阻害剤であってよい。当該薬剤の例として、例えばシクロスポリン及びタクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤；例えばＧｅｎｉｓｔｅｉｎ、Ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ Ａ、及びＰｉｃｅａｔａｎｎｏｌなどのチロシンキナーゼ阻害剤；例えばＵ７３１２２などのＰＬＣ阻害剤；例えばＷｏｒｔｍａｎｎｉｎなどのＰＩ３－ｋｉｎａｓｅ阻害剤；並びに、例えばＢＡＰＴＡ－ＡＭなどの細胞内カルシウムイオンキレーターを挙げることができるが、これらに限定されない。
このように薬剤を使用することによっても、アレルギー反応（特にはＩ型アレルギー反応）を抑制する作用を有する薬剤をスクリーニングすることができ、または、アレルギー反応抑制剤（特にはＩ型アレルギー反応抑制剤）の抑制作用の評価を行うこともできる。
代替的には、前記第一インキュベーション工程と前記第二インキュベーション工程との間に、当該薬剤と、前記細胞応答誘導用材料又は前記細胞応答誘導分析用材料に含まれる細胞応答誘導成分との接触が行われてもよい。当該接触後に、前記細胞応答誘導用材料又は前記細胞応答誘導分析用材料中で前記細胞をインキュベートすることによっても、前記スクリーニング又は前記評価を行うことができる。
このように薬剤を使用することによっても、アレルギー反応（特にはＩ型アレルギー反応）を抑制する作用を有する薬剤をスクリーニングすることができ、または、アレルギー反応抑制剤（特にはＩ型アレルギー反応抑制剤）の抑制作用の評価を行うこともできる。
代替的には、前記第一インキュベーション工程と前記第二インキュベーション工程との間に、当該薬剤と、前記細胞応答誘導用材料又は前記細胞応答誘導分析用材料に含まれる細胞応答誘導成分との接触が行われてもよい。当該接触後に、前記細胞応答誘導用材料又は前記細胞応答誘導分析用材料中で前記細胞をインキュベートすることによっても、前記スクリーニング又は前記評価を行うことができる。
【0169】
（１－５）アレルゲン性評価の例
【0170】
この例において、前記第二インキュベート工程において用いられる細胞応答誘導成分（特には抗原又は抗原候補物質）が、被験試料として取り扱われ、当該細胞応答誘導成分のアレルゲン性が評価されうる。
【0171】
この例において、前記第一インキュベート工程において、例えば対象（ヒト）から得られたＩｇＥ又はＩｇＥ含有血清を含む感作用材料中で、本発明に従う細胞がインキュベートされる。これにより、当該対象のＩｇＥによって、当該細胞が感作される。
次に、前記第二インキュベート工程において、被験試料である抗原を含む細胞応答誘導用材料中で、前記感作された細胞がインキュベートされる。これにより、当該抗原によって、本発明に従う細胞の細胞膜において、上記で述べたとおりの会合体が形成され、そして、当該会合体の形成によって、例えばレポーター遺伝子が発現しうる。
次に、前記分析工程において、細胞応答が分析される。例えば、分析工程において、当該レポーター遺伝子の発現が分析されうる。当該発現の分析によって、前記抗原の、前記対象に対するアレルゲン性を評価することができる。
次に、前記第二インキュベート工程において、被験試料である抗原を含む細胞応答誘導用材料中で、前記感作された細胞がインキュベートされる。これにより、当該抗原によって、本発明に従う細胞の細胞膜において、上記で述べたとおりの会合体が形成され、そして、当該会合体の形成によって、例えばレポーター遺伝子が発現しうる。
次に、前記分析工程において、細胞応答が分析される。例えば、分析工程において、当該レポーター遺伝子の発現が分析されうる。当該発現の分析によって、前記抗原の、前記対象に対するアレルゲン性を評価することができる。
【0172】
（１－６）アレルギーの有無若しくはリスクの評価
【0173】
この例において、前記第一インキュベート工程において用いられる細胞感作成分（特にはＩｇＥ又はＩｇＥ含有生体成分）が、被験試料として取り扱われ、当該細胞感作成分が由来する対象の、所定の抗原に対するアレルギー（特にはＩ型アレルギー）の有無若しくはリスクが評価されうる。
【0174】
この例において、前記第一インキュベート工程において、例えば対象（ヒト）から得られたＩｇＥ又はＩｇＥ含有生体成分（特にはＩｇＥ含有血清）を含む感作用材料中で、本発明に従う細胞がインキュベートされる。これにより、当該対象のＩｇＥによって、当該細胞が感作される。
次に、前記第二インキュベート工程において、所定の抗原を含む細胞応答誘導用材料中で、前記感作された細胞がインキュベートされる。これにより、当該抗原によって、本発明に従う細胞の細胞膜において、上記で述べたとおりの会合体が形成され、そして、当該会合体の形成によって、例えばレポーター遺伝子が発現しうる。
次に、前記分析工程において、当該レポーター遺伝子の発現が分析される。当該発現の分析によって、前記対象の、前記所定の抗原に対するアレルギーの有無又はリスクを評価することができる。
次に、前記第二インキュベート工程において、所定の抗原を含む細胞応答誘導用材料中で、前記感作された細胞がインキュベートされる。これにより、当該抗原によって、本発明に従う細胞の細胞膜において、上記で述べたとおりの会合体が形成され、そして、当該会合体の形成によって、例えばレポーター遺伝子が発現しうる。
次に、前記分析工程において、当該レポーター遺伝子の発現が分析される。当該発現の分析によって、前記対象の、前記所定の抗原に対するアレルギーの有無又はリスクを評価することができる。
【0175】
（１－７）ＩｇＥについての分析
【0176】
この例において、前記第一インキュベート工程において用いられる細胞感作成分（特にはＩｇＥ又はＩｇＥ含有生体成分）が、被験試料として取り扱われ、当該細胞感作成分自体の分析が行われうる。
【0177】
この例において、前記第一インキュベート工程において、例えば対象（ヒト）から得られたＩｇＥ又はＩｇＥ含有生体成分（特にはＩｇＥ含有血清）を含む感作用材料中で、本発明に従う細胞がインキュベートされる。これにより、当該対象のＩｇＥによって、当該細胞が感作される。
次に、前記第二インキュベート工程において、所定の抗原を含む細胞応答誘導用材料中で、前記感作された細胞がインキュベートされる。これにより、当該抗原によって、本発明に従う細胞の細胞膜において、上記で述べたとおりの会合体が形成され、そして、当該会合体の形成によって、例えばレポーター遺伝子が発現しうる。
次に、前記分析工程において、当該レポーター遺伝子の発現が分析される。当該発現の分析によって、ＩｇＥの評価を行うことができる。
次に、前記第二インキュベート工程において、所定の抗原を含む細胞応答誘導用材料中で、前記感作された細胞がインキュベートされる。これにより、当該抗原によって、本発明に従う細胞の細胞膜において、上記で述べたとおりの会合体が形成され、そして、当該会合体の形成によって、例えばレポーター遺伝子が発現しうる。
次に、前記分析工程において、当該レポーター遺伝子の発現が分析される。当該発現の分析によって、ＩｇＥの評価を行うことができる。
【0178】
（１－８）アレルギー抑制活性の評価方法
【0179】
この例において、薬剤が被験試料として取り扱われ、当該薬剤によるアレルギー反応抑制活性が評価されうる。
【0180】
この例において、前記第一インキュベート工程において、例えばＩｇＥ又はＩｇＥ含有生体成分（特にはＩｇＥ含有血清）を含む感作用材料中で、本発明に従う細胞がインキュベートされる。これにより、当該対象のＩｇＥによって、当該細胞が感作される。
次に、前記第二インキュベート工程において、所定の細胞応答誘導用材料中で、前記感作された細胞がインキュベートされる。これにより、当該抗原によって、本発明に従う細胞の細胞膜において、上記で述べたとおりの会合体が形成され、そして、当該会合体の形成によって、例えばレポーター遺伝子が発現しうる。
ここで、アレルギー抑制活性を有する物質又はアレルギー抑制活性を有すると考えられる物質（薬剤）が、前記感作用材料又は前記細胞応答誘導用材料に含まれている。当該物質が前記感作用材料に含まれる場合、当該物質は感作阻害剤として作用しうる。当該物質が前記細胞応答誘導用材料に含まれる場合、当該物質は細胞応答阻害剤として作用しうる。
次に、前記分析工程において、当該レポーター遺伝子の発現が分析される。当該発現の分析によって、当該物質のアレルギー抑制活性を評価することができる。
次に、前記第二インキュベート工程において、所定の細胞応答誘導用材料中で、前記感作された細胞がインキュベートされる。これにより、当該抗原によって、本発明に従う細胞の細胞膜において、上記で述べたとおりの会合体が形成され、そして、当該会合体の形成によって、例えばレポーター遺伝子が発現しうる。
ここで、アレルギー抑制活性を有する物質又はアレルギー抑制活性を有すると考えられる物質（薬剤）が、前記感作用材料又は前記細胞応答誘導用材料に含まれている。当該物質が前記感作用材料に含まれる場合、当該物質は感作阻害剤として作用しうる。当該物質が前記細胞応答誘導用材料に含まれる場合、当該物質は細胞応答阻害剤として作用しうる。
次に、前記分析工程において、当該レポーター遺伝子の発現が分析される。当該発現の分析によって、当該物質のアレルギー抑制活性を評価することができる。
【0181】
（１－９）ドラッグスクリーニング
【0182】
この例において、種々の薬剤が被験試料として取り扱われ、当該種々の薬剤によるアレルギー反応抑制活性が評価される。そして、より良いアレルギー反応抑制活性を有する薬剤が選択されうる。
【0183】
この例において、前記第一インキュベート工程において、例えばＩｇＥ又はＩｇＥ含有生体成分（特にはＩｇＥ含有血清）を含む感作用材料中で、本発明に従う細胞がインキュベートされる。これにより、当該対象のＩｇＥによって、当該細胞が感作される。
次に、前記第二インキュベート工程において、所定の細胞応答誘導用材料中で、前記感作された細胞がインキュベートされる。これにより、当該抗原によって、本発明に従う細胞の細胞膜において、上記で述べたとおりの会合体が形成され、そして、当該会合体の形成によって、例えばレポーター遺伝子が発現しうる。
ここで、アレルギー抑制活性を有すると考えられる種々の物質のそれぞれが、前記感作用材料又は前記細胞応答誘導用材料に含まれている。当該種々の物質が前記感作用材料に含まれる場合、当該種々の物質は感作阻害剤として作用することが期待される。当該種々の物質が前記細胞応答誘導用材料に含まれる場合、当該種々の物質は細胞応答阻害剤として作用することが期待される。
次に、前記分析工程において、当該種々の物質のそれぞれを用いた場合における、当該レポーター遺伝子の発現が分析される。当該発現の分析によって、当該種々の物質のうちから、より良いアレルギー抑制活性を有する物質が選択されうる。
次に、前記第二インキュベート工程において、所定の細胞応答誘導用材料中で、前記感作された細胞がインキュベートされる。これにより、当該抗原によって、本発明に従う細胞の細胞膜において、上記で述べたとおりの会合体が形成され、そして、当該会合体の形成によって、例えばレポーター遺伝子が発現しうる。
ここで、アレルギー抑制活性を有すると考えられる種々の物質のそれぞれが、前記感作用材料又は前記細胞応答誘導用材料に含まれている。当該種々の物質が前記感作用材料に含まれる場合、当該種々の物質は感作阻害剤として作用することが期待される。当該種々の物質が前記細胞応答誘導用材料に含まれる場合、当該種々の物質は細胞応答阻害剤として作用することが期待される。
次に、前記分析工程において、当該種々の物質のそれぞれを用いた場合における、当該レポーター遺伝子の発現が分析される。当該発現の分析によって、当該種々の物質のうちから、より良いアレルギー抑制活性を有する物質が選択されうる。
【0184】
８．実施例
【0185】
（１）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の合成
【0186】
ヒトＦｃεＲＩα鎖の細胞外ドメインに、ラットＦｃεＲＩα鎖の細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを連結させたキメラ受容体（ヒト－ラットキメラＦｃεＲＩα鎖、Human-Rat chimeric FcεRI α chain）遺伝子を人工遺伝子合成により作成した。当該遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を図４に示す。図４において、上段が塩基配列であり、下段が翻訳後のアミノ酸配列を表す。図４に示される塩基配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列及び配列ＩＤ Ｎｏ．８のアミノ酸配列と同じである。また、図４に示される塩基配列及びアミノ酸配列と、前記キメラ受容体タンパク質の構造及び機能との関係を、図１９に示す。
【0187】
図１９に示されるとおり、図４に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸残基番号１～２５がシグナル配列であり、アミノ酸残基番号２６～２０５が細胞外ドメインであり、アミノ酸残基番号２０６～２２４が細胞膜貫通ドメインであり、且つ、アミノ酸残基番号２２５～２４６が細胞内ドメインである。
【0188】
前記細胞外ドメインを構成するアミノ酸残基番号２６～２０５のアミノ酸配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．１０に示された配列と同じである。前記細胞外ドメインはＩｇＥ結合性領域を含み、当該ＩｇＥ結合性領域は、アミノ酸残基番号１１０～１８３である。アミノ酸残基番号１１０～１８３のアミノ酸配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．１４に示された配列と同じである。図１９に示されるとおり、当該ＩｇＥ結合性領域に含まれるアミノ酸残基のうち、特にはＳ１１０、Ｄ１１１、Ｗ１１２、Ｗ１３５、Ｗ１３８、Ｋ１４２、Ｉ１４４、Ａ１５１、Ｙ１５４、Ｗ１５５、Ｙ１５６、Ｅ１５７、Ｗ１８１、Ｑ１８２、及びＬ１８３が、ＩｇＥとの結合性に関与するアミノ酸である。これらアミノ酸のうち、Ｋ１４２、Ｉ１４４、Ａ１５１、Ｙ１５４、Ｗ１５５、Ｙ１５６、及びＥ１５７が１つ目のＩｇＥ結合性部位を形成し、Ｓ１１０、Ｄ１１１、Ｗ１１２、Ｗ１３５、Ｗ１３８、Ｗ１８１、Ｑ１８２、及びＬ１８３が２つ目のＩｇＥ結合性部位を形成する。
【0189】
また、アミノ酸残基番号４４～１０８及び１２１～１９４がイムノグロブリンドメインである。
【0190】
前記細胞膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、ラットのＦｃεＲＩα鎖に含まれる細胞膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。アミノ酸残基番号２０６～２２４の配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．１２に示された配列と同じである。また、当該細胞膜貫通ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列ＩＤ Ｎｏ．５に示された配列である。図１９に示されるとおり、前記細胞膜貫通ドメインは、γ鎖との結合性を発揮し、荷電アミノ酸であるＤ２１９が、γ鎖結合性に特に関与するアミノ酸である。
【0191】
前記細胞内ドメインのアミノ酸配列は、ラットのＦｃεＲＩα鎖に含まれる細胞内ドメインのアミノ酸配列である。アミノ酸残基番号２２５～２４６の配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．１３に示された配列と同じである。また、当該細胞内ドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列ＩＤ Ｎｏ．６に示された配列である。
【0192】
前記シグナル配列は、ヒトのＦｃεＲＩα鎖に含まれるシグナル配列である。アミノ酸残基番号１～２５の配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．９に示された配列と同じである。また、当該シグナル配列のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列ＩＤ Ｎｏ．２に示された配列である。
【0193】
配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列は、ラットの培養細胞における効率よい遺伝子発現のために、ラットのコドン使用頻度を考慮して最適化されている。また、最適化される前の塩基配列は、図５に示される配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列である。これら２つの塩基配列を比較して、以下に、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列が有する特徴を説明する。
【0194】
配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列のコドン適応指標（Codon Adaptation Index、ＣＡＩ）は、０．７２である。一方、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列のラットに対する前記コドン適応指標は、０．８３である。 コドン適応指標は高いほど好ましく、最高で１であり、好ましくは０．８以上、より好ましくは０．８超であると、細胞中における高い遺伝子発現レベルのために良いと考えられる。
配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列よりもコドン適応指標がより高いため、ラット細胞における発現のためにより適している。
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の塩基配列のコドン適応指標は、例えば０．７以上であり、好ましくは０．８以上であり、より好ましくは０．８超であり、さらにより好ましくは０．８１以上、０．８２以上でありうる。当該コドン適応指標は、例えば１．０以下、０．９９以下、又は０．９５以下であってよい。
コドン適応指標は、リボソーム関連遺伝子などの高発現遺伝子の同義コドン使用頻度の偏りを基にして、これら高発現遺伝子のコドンバイアスと観察対象遺伝子のコドンバイアスの相関から、相対的な発現量を推定するための尺度として用いられうる。コドン適応指標は、例えば、P. M. Sharp and W. H. Li (Nucleic Acids Res. 1987 Feb 11; 15(3): 1281-1295)に記載された方法に従い算出されうる。
配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列よりもコドン適応指標がより高いため、ラット細胞における発現のためにより適している。
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の塩基配列のコドン適応指標は、例えば０．７以上であり、好ましくは０．８以上であり、より好ましくは０．８超であり、さらにより好ましくは０．８１以上、０．８２以上でありうる。当該コドン適応指標は、例えば１．０以下、０．９９以下、又は０．９５以下であってよい。
コドン適応指標は、リボソーム関連遺伝子などの高発現遺伝子の同義コドン使用頻度の偏りを基にして、これら高発現遺伝子のコドンバイアスと観察対象遺伝子のコドンバイアスの相関から、相対的な発現量を推定するための尺度として用いられうる。コドン適応指標は、例えば、P. M. Sharp and W. H. Li (Nucleic Acids Res. 1987 Feb 11; 15(3): 1281-1295)に記載された方法に従い算出されうる。
【0195】
配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列は、使用頻度（最も高いコドンを１００とした場合におけるコドン使用頻度）が９１～１００であるコドンの割合が４７％である。一方、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列は、使用頻度が９１～１００であるコドンの割合が５９％である。
使用頻度が高いコドンの割合が高いほど、細胞中における高い遺伝子発現レベルのために良いと考えられる。
配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列は、使用頻度が９１～１００であるコドンの割合が、配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列よりも高いため、ラット細胞における発現のためにより適している。
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、当該遺伝子が発現される細胞（特には非ヒト動物の細胞）における使用頻度が９１～１００であるコドンの割合が、例えば４０％以上、好ましくは５０％以上であり、より好ましくは５３％以上であり、さらにより好ましくは５５％以上でありうる。当該割合は、例えば１００％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、又は６０％以下でありうる。
使用頻度が高いコドンの割合が高いほど、細胞中における高い遺伝子発現レベルのために良いと考えられる。
配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列は、使用頻度が９１～１００であるコドンの割合が、配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列よりも高いため、ラット細胞における発現のためにより適している。
本発明のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、当該遺伝子が発現される細胞（特には非ヒト動物の細胞）における使用頻度が９１～１００であるコドンの割合が、例えば４０％以上、好ましくは５０％以上であり、より好ましくは５３％以上であり、さらにより好ましくは５５％以上でありうる。当該割合は、例えば１００％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、又は６０％以下でありうる。
【0196】
配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列のＧＣ含量は４５．５３％であるのに対し、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列のＧＣ含量は５１．０５％である。ＧＣ含量がより高いほど、転写産物ｍＲＮＡの半減期が長くなる傾向にあり、高い遺伝子発現レベルのための好ましい。そのため、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列は、配列ＩＤ Ｎｏ．１５よりも、より高い遺伝子発現レベルを達成できると考えられる。
本技術のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子のＧＣ含量は、例えば４０％以上であり、好ましくは４７％以上、より好ましくは５０％以上であってよい。当該ＧＣ含量は、例えば８０％以下、７０％以下、又は６０％以下でありうる。
本技術のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子のＧＣ含量は、例えば４０％以上であり、好ましくは４７％以上、より好ましくは５０％以上であってよい。当該ＧＣ含量は、例えば８０％以下、７０％以下、又は６０％以下でありうる。
【0197】
配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列は制限酵素ＳｃａＩが認識する配列（ＡＧＴＡＣＴ）を２つ含む。一方、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列は前記配列を含まない。
本技術のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、制限酵素配列を含んでもよいが、好ましくは制限酵素配列を含まない。
本技術のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、制限酵素配列を含んでもよいが、好ましくは制限酵素配列を含まない。
【0198】
配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列は、スプライシングに関するシス作用エレメント（ＧＧＴＧＡＴ）を３つ含み、ポリＡシグナルであるシス作用エレメント（ＡＡＴＡＡＡ）を１つ含み、ｍＲＮＡの不安定化に関するシス作用エレメント（ＡＴＴＴＡ）を１つ含み、且つポリＡシグナルであるシスエレメント（ＡＡＡＡＡＡＡ）を１つ含む。一方で、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列はこれらのシスエレメントを含まない。そのため、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列は、例えばスプライス部位として誤認されうる配列、誤ってポリＡが付加されうる配列、及びｍＲＮＡの不安定化をもたらす配列が削除されている。
本技術のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、１又は複数のこれらのシス作用エレメントを含んでもよいが、好ましくはこれらのシス作用エレメントを含まない。
本技術のキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子は、１又は複数のこれらのシス作用エレメントを含んでもよいが、好ましくはこれらのシス作用エレメントを含まない。
【0199】
配列ＩＤ Ｎｏ．１５の塩基配列は、１対の逆向き反復配列を有するが、配列ＩＤ Ｎｏ．１の塩基配列は配列を有さない。そのため、後者では、不要な高次構造の形成が抑制されうる。
【0200】
（２）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子のＲＢＬ－ＮＬ４細胞への導入
【0201】
図６に示されるとおり、配列ＩＤ Ｎｏ．１の５’末端に「制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位（ＧＧＡＴＣＣ）」と「ＫＯＺＡＫ配列を形成するための配列（ＣＡＣＣ）」が追加され且つその３’末端に「制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）」が追加された塩基配列を有する核酸（ＤＮＡ）を人工的に合成した。当該核酸は、前記２つの制限酵素認識部位をマルチクローニングサイト内に有するｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、当該２つの部位を利用して、前記核酸は挿入された。当該核酸が挿入されたベクターが、当技術分野で既知の手法により、大量調製された。その後、前記核酸が挿入されたベクターが、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを用いてリニアライズされた。
【0202】
ＲＢＬ－２Ｈ３細胞（細胞番号：ＪＣＲＢ００２３、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンク）に、ＮＦ－ＡＴ（Nuclear factor activated T-cell）依存性ホタルルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＨＴＳ－ＮＦＡＴ、Ｂｉｏｍｙｘ社）を安定導入した細胞（以下「ＲＢＬ－ＮＬ４細胞」ともいう）を得た。当該ＲＢＬ－ＮＬ４細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて、前記リニアライズされたベクターを導入し、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎによる薬剤選択を行った。その後、限界希釈法でクローニングを行い、キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が導入された７つのクローンを得た。
【0203】
ＲＢＬ－ＮＬ４細胞は、ラットの内在性ＦｃεＲＩのα鎖遺伝子、β鎖遺伝子、及びγ鎖遺伝子を発現する。そのため、前記導入されたキメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が発現することによって、当該遺伝子の発現により生成したキメラＦｃεＲＩα鎖タンパク質が、β鎖及びγ鎖と会合したＦｃεＲＩが、当該細胞の細胞膜上に機能的に発現する。
【0204】
（３）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が導入された細胞におけるルシフェラーゼ発現
【0205】
上記（２）において得られた７つのクローン及びＲＢＬ－ＮＬ４細胞を培養して得られた培養物に対してイオノマイシン、抗ヒトＩｇＥ抗体、又は特異抗原により刺激を与えた場合のルシフェラーゼ発現を確認した。当該確認は具体的には以下のとおりに行われた。
【0206】
各クローン及びＲＢＬ－ＮＬ４細胞が、１０％の非働化ウシ胎児血清を添加したＭＥＭ培地において培養された。当該培地の組成は以下のとおりである。
ＭＥＭ培地（Ｅａｒｌｅ‘ｓ ｓａｌｔｓ（＋）、Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（－）；Ｇｉｂｃｏ １１０９０）
ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ １０４３７－０２８、５６℃で３０分非働化、使用時濃度１０％）
ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Ｇｉｂｃｏ ３５０５０）
ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ４３３３）
ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ １０１３１、使用時濃度５００μｇ／ｍＬ）
ハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ、Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ １０６８７－１０、使用時濃度２００μｇ／ｍＬ）
ペニシリンおよびストレプトマイシンは細菌による感染を防ぐために前記培地に加えられた。ジェネティシン及びハイグロマイシンＢは選択マーカーである。
ＭＥＭ培地（Ｅａｒｌｅ‘ｓ ｓａｌｔｓ（＋）、Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（－）；Ｇｉｂｃｏ １１０９０）
ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ １０４３７－０２８、５６℃で３０分非働化、使用時濃度１０％）
ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Ｇｉｂｃｏ ３５０５０）
ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ４３３３）
ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ １０１３１、使用時濃度５００μｇ／ｍＬ）
ハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ、Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ １０６８７－１０、使用時濃度２００μｇ／ｍＬ）
ペニシリンおよびストレプトマイシンは細菌による感染を防ぐために前記培地に加えられた。ジェネティシン及びハイグロマイシンＢは選択マーカーである。
【0207】
前記培養は、プラスチック製細胞培養フラスコ（Ｔ２５）にて、３７℃、５％二酸化炭素存在下のインキュベータ中で行われた。
【0208】
細胞の継代は以下のとおりに行われた。すなわち、前記フラスコ中の培養上清（浮遊している細胞を含む）をデカントで捨てた後、新しい培地を５ｍＬ加えた。セルスクレイパーを用いて細胞をソフトに剥がし、ピペッティングした後、あらかじめ培地５ｍＬを入れた継代用のフラスコに１／４０量（０．１２５ｍＬ）加えて、３７℃、５％ＣＯ２下で５日間培養した。
なお、後述の各種試験において用いるために大量培養する際には、Ｔ７５フラスコ及び倍量の培地（１０ｍＬ）を用いた。
なお、後述の各種試験において用いるために大量培養する際には、Ｔ７５フラスコ及び倍量の培地（１０ｍＬ）を用いた。
【0209】
前記刺激を与えた場合のルシフェラーゼ発現を確認するための試験の前日に、以下の操作を行った。すなわち、精製ヒトＩｇＥ（ａｂ６５８６６、Ａｂｃａｍ）（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）を前記ＭＥＭ培地に添加した。当該培地を、底面が透明なプラスチック製の白色９６ウェルプレート（製品番号：１６５３０６、Ｔｈｒｅｍｏ社）の各ウェルに入れた。そして、各クローンの細胞を、１ウェルあたり５×１０4細胞／５０μＬとなるように播種し、インキュベータ中で一晩静置して感作した。
また、精製ヒトＩｇＥが添加されていないこと以外は同じように、各クローンの細胞を前記９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、そして、前記インキュベータ内で一晩静置した（すなわち感作されていない細胞も用意した）。
また、精製ヒトＩｇＥが添加されていないこと以外は同じように、各クローンの細胞を前記９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、そして、前記インキュベータ内で一晩静置した（すなわち感作されていない細胞も用意した）。
【0210】
翌日、ＰＢＳにより細胞を複数回洗浄した。感作された細胞を含むウェルに、前記培地で調製された１００ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＥ抗体（製品番号Ａ８０－１０８Ａ、ＢＥＴＨＹＬ社、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）を添加し、そして、当該細胞に、３７℃で３時間刺激を与えた。同様に、感作されていない細胞を含むウェルにも、１００ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＥ抗体を添加し、そして、当該細胞に、３７℃で３時間刺激を与えた。
また、感作されていない細胞を含む別のウェルに２５０μＭのイオノマイシンを添加し、そして、当該細胞に、３７℃で３時間刺激を与えた。
また、感作されていない細胞を含む別のウェルに２５０μＭのイオノマイシンを添加し、そして、当該細胞に、３７℃で３時間刺激を与えた。
【0211】
前記刺激付与後に各ウェル内に、基質液（Ｏｎｅ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を５０μＬ／ウェルずつ加えて５分間反応させた後、ルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて発光強度を測定した。測定結果が図７に示されている。
【0212】
図７において、７つのクローンについての測定結果は、「ＨｕＲａ－１１」、「ＨｕＲａ－１９」、「ＨｕＲａ－２１」、「ＨｕＲａ－２９」、「ＨｕＲａ－３７」、「ＨｕＲａ－３８」、及び「ＨｕＲａ－４０」にそれぞれ示されている。また、ＲＢＬ－ＮＬ４細胞についての測定結果は、「ＮＬ４」に示されている。
【0213】
図７において、黒いドットは測定されたルシフェラーゼ発光強度（単位：ＣＰＳ）を示す（右側の軸：ＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＣＥ（ＣＰＳ））。また、図７において、各棒は、ヒトＩｇＥで感作されていない細胞に抗ヒトＩｇＥ抗体を加えた場合（ｎｏ ＩｇＥ）、感作された細胞に抗ヒトＩｇＥ抗体を加えて刺激を与えた場合（ａＩｇＥ）、及び感作されていない細胞にイオノマイシン刺激を与えた場合（Ｉｏｎｏ）における相対発光強度をそれぞれ示す（左側の軸：Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ））。相対発光強度は、各クローンの無刺激時の発光強度を１とした場合における相対的発光強度であり、ログスケールで示されている。
【0214】
図７に示されるとおり、感作された場合（ａＩｇＥ）及び感作されていない場合（ｎｏ ＩｇＥ）との比較より、いずれのクローンについても、抗ヒトＩｇＥ抗体刺激によって、ルシフェラーゼ発現量が数十倍～１００倍増加した。一方で、キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子を発現していないＲＢＬ－ＮＬ４細胞については、抗ヒトＩｇＥ抗体刺激にはほとんど応答しなかった。よって、キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子の導入により、ヒトＩｇＥの検出能力が付与されたことが分かる。
【0215】
なお、図７に示されるとおり、ＲＢＬ－ＮＬ４細胞をイオノマイシンにより刺激した場合（Ｉｏｎｏ）におけるルシフェラーゼ発現量は、ＲＢＬ－ＮＬ４細胞を抗ヒトＩｇＥ抗体により刺激した２つの場合（ｎｏ ＩｇＥ及びａＩｇＥ）よりも大幅に増加した。イオノマイシンは、ＦｃεＲＩを経由せずに、ＮＦＡＴを活性化する物質である。そのため、ＲＢＬ－ＮＬ４細胞において、ＮＦＡＴの活性化によりルシフェラーゼ発現系は正常に機能していることが確認された。
【0216】
また、上記７つのクローンのうち、ＨｕＲａ－４０が特に、抗体刺激に対する応答性、ＦｃεＲＩ発現量、及び増殖能の点で優れていた。ＨｕＲａ－４０は、寄託日を令和２年（２０２０年）６月１７日として、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３２３０で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国際寄託された。
【0217】
（４）キメラＦｃεＲＩα鎖遺伝子が導入された細胞へのＩｇＥ結合能の確認
【0218】
各クローンについて、細胞表面へのヒトＩｇＥの結合性をフローサイトメトリーにより、以下のとおりに測定した。
【0219】
まず、各クローンについて、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＩｇＥで一晩感作した細胞サンプルと感作していない細胞サンプルを用意した。次に、これら２種の細胞サンプルそれぞれを、氷上で３０分間１μｇ／ｍＬのヒトＩｇＥに接触させて、すべてのＦｃεＲＩをＩｇＥにより占有させた。また、感作していない細胞サンプルの一部については、氷上でのヒトＩｇＥへの接触処理を行わなかった。その後、各サンプルを、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＥ抗体で染色した。このようにして、各クローンについて、以下の３つのサンプルを用意した。
サンプル１：感作なし、氷上でのヒトＩｇＥ接触なし、ＦＩＴＣ染色あり
サンプル２：感作なし、氷上でのヒトＩｇＥ接触あり、ＦＩＴＣ染色あり
サンプル３：感作あり、氷上でのヒトＩｇＥ接触あり、ＦＩＴＣ染色あり
サンプル１：感作なし、氷上でのヒトＩｇＥ接触なし、ＦＩＴＣ染色あり
サンプル２：感作なし、氷上でのヒトＩｇＥ接触あり、ＦＩＴＣ染色あり
サンプル３：感作あり、氷上でのヒトＩｇＥ接触あり、ＦＩＴＣ染色あり
【0220】
また、ＲＢＬ－ＮＬ４細胞（陰性対照）及びＲＳ－ＡＴＬ８細胞（陽性対照）についても、上記３つのサンプルを用意した。
【0221】
以上のとおりに用意されたサンプルについて、ＦＩＴＣの蛍光強度をフローサイトメーターにより測定した。測定結果が図８に示されている。図８に示されるとおり、サンプル１、２、及び３の順に、ＦＩＴＣの蛍光が確認された細胞の数が増え、特に、サンプル３に関して、ＦＩＴＣの蛍光が確認された細胞の数が、サンプル１及び２よりも大幅に増えた。また、陽性対照であるＲＳ－ＡＴＬ８細胞についても、同様の結果が得られた。一方で、陰性対照であるＲＢＬ－ＮＬ４細胞については、このような結果は得られなかった。これらの結果より、各クローンの細胞にＩｇＥが特異的に結合することが確認された。
【0222】
（５）本発明の細胞に適した試験条件の検討
【0223】
（５－１）刺激時間
【0224】
１００倍希釈した健常人血清（コスモバイオ社）を含む１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に懸濁したＨｕＲａ－４０細胞を、９６穴のマイクロプレート（ＩＳＯＰＬＡＴＥ－９６ＴＣ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に５．０×１０４細胞／５０μＬ／ウェルで播種し、ＣＯ２インキュベータ内で一晩感作させた。
【0225】
前記感作された細胞を洗浄した後に、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地で希釈された抗ヒトＩｇＥ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を、５０μＬ／ウェルの量で添加し、１時間、３時間、６時間、又は８時間刺激した。
また、刺激を行わない細胞については、培地を添加した。
また、刺激を行わない細胞については、培地を添加した。
【0226】
前記刺激時間が経過した後に、ＯＮＥ－Ｇｌｏ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の基質液を５０μＬ／ウェルの量で各ウェルに加えて、５分間、室温で遮光しながら反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）で発光強度を測定した。測定結果が図９に示されている。
【0227】
図９に示される相対発光強度（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ （ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ））は、次の式に従って算出した。
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ （ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）＝（抗体刺激したＨｕＲａ－４０細胞の各時間における発光強度－培地の発光強度）／（培地を添加したＨｕＲａ－４０細胞の０時間における発光強度－培地の発光強度）
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ （ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）＝（抗体刺激したＨｕＲａ－４０細胞の各時間における発光強度－培地の発光強度）／（培地を添加したＨｕＲａ－４０細胞の０時間における発光強度－培地の発光強度）
【0228】
図９に示される結果より、刺激時間は、好ましくは１時間以上、より好ましくは１．５時間以上、さらにより好ましくは２時間以上である。また、刺激時間は、好ましくは８時間以下、より好ましくは７時間以下、さらにより好ましくは６時間以下、５時間以下、又は４時間以下であってよい。刺激時間は、例えば１時間～８時間であってよく、より好ましくは２時間～８時間、さらにより好ましくは１．５時間～７時間、２時間～６時間、２時間～５時間、又は２時間～４時間、特に好ましくは３時間～４時間であってよい。
【0229】
（５－２）血清濃度
【0230】
各種濃度で健常人血清（コスモバイオ社）を含む１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に懸濁したＨｕＲａ－４０細胞を、９６穴のマイクロプレート（ＩＳＯＰＬＡＴＥ－９６ＴＣ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に５．０×１０４細胞／５０μＬ／ウェルで播種し、ＣＯ２インキュベータ内で一晩感作させた。用いられた血清濃度は、０体積％、０．０１体積％、０．１体積％、１体積％、又は１０体積％の５種類であった。
【0231】
前記感作された細胞を洗浄した後に、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地で希釈された抗ヒトＩｇＥ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を、５０μＬ／ウェルの量で添加し、３時間刺激した。
また、刺激を行わない細胞については、培地を添加した。
また、刺激を行わない細胞については、培地を添加した。
【0232】
前記刺激時間が経過した後に、上記（５－１）で述べたとおりに、発光強度を測定した。測定結果が図１０に示されている。図１０に示される相対発光強度（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ （ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ））は、次の式に従って算出した。
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ （ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）＝（各種血清濃度におけるＨｕＲａ－４０細胞の発光強度－培地の発光強度）／（血清濃度が０体積％におけるＨｕＲａ－４０細胞の発光強度－培地の発光強度）
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ （ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）＝（各種血清濃度におけるＨｕＲａ－４０細胞の発光強度－培地の発光強度）／（血清濃度が０体積％におけるＨｕＲａ－４０細胞の発光強度－培地の発光強度）
【0233】
図１０に示される結果より、感作のための血清濃度は、好ましくは０．０１体積％以上、より好ましくは０．１体積％以上、さらにより好ましくは０．５体積％以上、０．６体積％以上、０．７体積％以上、０．８体積％以上、又は０．９体積％以上である。また、感作のための血清濃度は、例えば１０体積％以下、好ましくは８体積％以下、より好ましくは７体積％以下、さらにより好ましくは６体積％以下、５体積％以下、４体積％以下、３体積％以下、又は２体積％以下であってよい。血清濃度は、例えば０．１体積％～１０体積％であってよく、より好ましくは０．５体積％～５体積％、さらにより好ましくは０．７体積％～３体積％、特に好ましくは１体積％であってよい。
【0234】
（５－３）細胞障害性
【0235】
ヒト血清によるＨｕＲａ－４０細胞への細胞障害性を、ＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＬＤＨ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ－ＷＳＴ（同仁化学研究所社）を用いて、細胞外に放出されたＬＤＨを指標に評価した。各濃度（０体積％、０．０１体積％、０．１体積％、１体積％、又は１０体積％）のヒト血清を含むＭＥＭ培地で前記細胞を一晩培養して得られた培養物の細胞上清を、９６穴マイクロプレートに５０μＬ／ウェルで播種し、前記キットに含まれるＷｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μＬ／ウェルで各ウェルに加え、遮光しながら室温で３０分間呈色反応を行った。最後に前記キットに含まれるＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２５μＬ／ウェルで各ウェルに加え、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ、Ｂｉｏ Ｒａｄ社）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。測定結果が図１１に示されている。
【0236】
図１１より、血清濃度１％では障害性がないこと、および、１０％では障害性があることがわかる。
【0237】
（５－４）凍結保存
【0238】
ＨｕＲａ－４０細胞の表現型の安定性への－８０℃保存の影響を検討した。－８０℃での凍結前、凍結２ヶ月後、又は凍結４ヶ月後のＨｕＲａ－４０細胞を用意した。これら３種の細胞を、ヒトＩｇＥ（ａｂ６５８６６、Ａｂｃａｍ、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）を含むＭＥＭ培地において一晩感作した。当該感作後、ＰＢＳで３回洗浄した。当該洗浄後、抗ヒトＩｇＥ抗体で３時間刺激した。陽性対照としては、イオノマイシン（２５０ｎＭ）を用いた。前記刺激後、基質液（Ｏｎｅ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し、発光強度を測定した。測定結果が図１２に示されている。
【0239】
図１２に示される結果より、少なくとも４ヶ月間の凍結における受容体特異的な反応の安定性が確認された。なお、８ヶ月間の－８０℃保存後でも、細胞の受容体特異的な応答が起こることも確認できた。
【0240】
（５－５）継代数
【0241】
継代数４（Ｐ４）又は継代数５０（Ｐ５０）のＨｕＲａ－４０細胞に、スギ花粉症患者血清（特異的ＩｇＥ抗体価１００以上）を加え一晩感作した。当該感作後、各細胞は、ＰＢＳで洗浄され、そして、スギ花粉アレルゲンエキスで刺激された。当該刺激後、基質液（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加え発光を測定した。測定結果が図１３に示されている。
【0242】
図１３に示される結果より、スギ花粉エキスに対する応答はＰ４及びＰ５０で大きな差は認められなかった。
【0243】
（６）アレルギー患者血清を用いた試験（ピーナッツアレルギー）
【0244】
（６－１）各種ＲＡＳＴスコアの患者血清を用いた抗原特異的応答
【0245】
１００倍希釈した健常人血清又は各種ＲＡＳＴスコアを有するピーナッツアレルギー患者血清を含む１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に懸濁したＨｕＲａ－４０細胞を、９６穴のマイクロプレート（ＩＳＯＰＬＡＴＥ－９６ＴＣ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に５．０×１０４細胞／５０μＬ／ウェルで播種し、ＣＯ２インキュベータ内で一晩感作させた。
【0246】
前記感作された細胞を洗浄した後に、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地で希釈されたアレルゲンスクラッチエキス（ラッカセイ）を、各種濃度で添加し、３７℃で３時間刺激した。
また、前記感作が行われていない細胞についても、同じ刺激処理を行った。
また、前記感作が行われていない細胞についても、同じ刺激処理を行った。
【0247】
前記刺激時間が経過した後に、ＯＮＥ－Ｇｌｏ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の基質液を５０μＬ／ウェルの量で各ウェルに加えて、５分間、室温で遮光しながら反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）で発光強度を測定した。測定結果が図１４に示されている。
【0248】
図１４に示される結果より、ＨｕＲａ－４０細胞は、抗原特異的に応答することが分かる。
【0249】
（６－２）本発明の細胞と他の細胞との比較
【0250】
ＨｕＲａ－４０細胞による抗原特異的応答を、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞と比較した。また、当該比較において、陰性対照として、ＲＢＬ－ＮＬ４細胞を用いた。
ＲＳ－ＡＴＬ８細胞は、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞にヒトＦｃεＲＩを安定発現させたＲＢＬ－ＳＸ３８細胞に、ＮＦ－ＡＴ依存性ホタルルシフェラーゼ発現ベクター（Ｂｉｏｍｙｘ社）を安定導入した細胞である。
ＲＢＬ－ＮＬ４細胞は、上記のとおり、ＨｕＲａ－４０細胞のホスト細胞であり、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞にＮＦ－ＡＴ依存性ホタルルシフェラーゼ発現ベクター（Ｂｉｏｍｙｘ社）を安定導入した細胞である。
ＲＳ－ＡＴＬ８細胞は、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞にヒトＦｃεＲＩを安定発現させたＲＢＬ－ＳＸ３８細胞に、ＮＦ－ＡＴ依存性ホタルルシフェラーゼ発現ベクター（Ｂｉｏｍｙｘ社）を安定導入した細胞である。
ＲＢＬ－ＮＬ４細胞は、上記のとおり、ＨｕＲａ－４０細胞のホスト細胞であり、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞にＮＦ－ＡＴ依存性ホタルルシフェラーゼ発現ベクター（Ｂｉｏｍｙｘ社）を安定導入した細胞である。
【0251】
前記３種の細胞をそれぞれ、ＲＡＳＴスコア６（＞１００ＵＡ／ｍＬ）のピーナッツアレルギー患者血清（１００倍希釈）を含む１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に懸濁し、９６穴のマイクロプレート（ＩＳＯＰＬＡＴＥ－９６ＴＣ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に５．０×１０４細胞／５０μＬ／ウェルで播種し、ＣＯ２インキュベータ内で一晩感作させた。
【0252】
前記感作された細胞を洗浄した後に、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地で希釈されたアレルゲンスクラッチエキス（ラッカセイ）を、各種濃度（０、０．１、１、１０、１００、又は１０００ｎｇ／ｍＬ）で添加し、３７℃で３時間刺激した。
【0253】
前記刺激時間が経過した後に、ＯＮＥ－Ｇｌｏ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の基質液を５０μＬ／ウェルの量で各ウェルに加えて、５分間、室温で遮光しながら反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）で発光強度を測定した。測定結果が図１５に示されている。
【0254】
図１５に示される結果より、ＨｕＲａ－４０細胞は、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞と比較して、優れた抗原応答を示すことが分かる。また、幅広い抗原濃度にわたって、ＨｕＲａ－４０細胞の応答性は、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞よりも優れていた。
【0255】
（７）本発明の細胞と他の細胞との比較（アレルギー検査、卵アレルギー）
【0256】
ＨｕＲａ－４０細胞による抗原特異的応答を、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞と比較した。また、当該比較において、陰性対照として、ＲＢＬ－ＮＬ４細胞を用いた。
【0257】
前記３種の細胞をそれぞれ、卵アレルギー患者血清（特異的ＩｇＥ抗体価１００以上）又は健常者のプール血清を含む１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に懸濁し、９６穴のマイクロプレート（ＩＳＯＰＬＡＴＥ－９６ＴＣ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に５．０×１０４細胞／５０μＬ／ウェルで播種し、ＣＯ２インキュベータ内で一晩感作させた。
【0258】
前記感作された細胞をＰＢＳで洗浄した後に、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地で希釈された卵白アレルゲンエキスを、各種濃度（０．１、１、１０、１００、又は１０００ｎｇ／ｍＬ）で添加し、３７℃で３時間刺激した。
【0259】
前記刺激時間が経過した後に、ＯＮＥ－Ｇｌｏ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の基質液を５０μＬ／ウェルの量で各ウェルに加えて、５分間、室温で遮光しながら反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）で発光強度を測定した。測定結果が図１６に示されている。
【0260】
図１６に示される結果より、卵アレルギー患者血清を用いた場合は、ＨｕＲａ－４０細胞は、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞と比較して、優れた応答性を示すことが分かる。また、健常者プール血清を用いた場合は、卵白アレルゲンエキスに対する応答は認められなかった。これらの結果より、ＨｕＲａ－４０細胞は、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞よりも、優れた抗原特異的応答性を示すことが分かる。
【0261】
（８）本発明の細胞と他の細胞との比較（アレルギー反応抑制剤の有効性評価）
【0262】
オマリズマブは、気管支喘息、季節性アレルギー性鼻炎、及び慢性蕁麻疹の治療薬である。オマリズマブは、ヒト化抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体であり、ＩｇＥと高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）の結合を阻害することで、好塩基球、肥満細胞等の炎症細胞の活性化を抑制する。ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩの結合を競合的に阻害し、血清中遊離ＩｇＥ濃度を減少させる。なお、すでにＦｃεＲＩと結合したＩｇＥには結合しない。本発明の細胞は、例えばオマリズマブなどのアレルギー反応抑制剤の有効性評価のために用いることができる。以下で、当該有効性評価のために用いることができることを示す実験及びその結果を説明する。
【0263】
ＨｕＲａ－４０細胞及びＲＳ－ＡＴＬ８細胞を用意した。１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に懸濁されたこれら細胞のそれぞれに、各種最終濃度（０、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、又は１００μｇ／ｍＬ）のオマリズマブを添加し、添加の３０分後に、ヒトＩｇＥを５０ｎｇ／ｍＬ加え一晩感作した。
【0264】
前記感作された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後に、ヒトＩｇＥ抗体を添加し、３７℃で３時間刺激した。
【0265】
前記刺激時間が経過した後に、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の基質液を５０μＬ／ウェルの量で各ウェルに加えて、５分間、室温で遮光しながら反応させた。その後、マイクロプレートリーダー（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）で発光強度を測定した。測定結果が図１７に示されている。
【0266】
図１７に示される結果より、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞に関しては、オマリズマブ濃度が０．１μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬへと増加することに伴い発光強度がわずかに低下し、そして１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬへと増加することに伴い発光強度がさらに低下した。さらに、同図から分かるとおり、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞に関しては、オマリズマブの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は１μｇ／ｍＬ超である。一方で、同図から分かるとおり、ＨｕＲａ－４０細胞に関しては、オマリズマブ濃度が０．１μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬへと増加した段階ですでに、発光強度の大幅な低下が観察された。同図から分かるとおり、ＨｕＲａ－４０細胞に関しては、オマリズマブのＩＣ５０は１μｇ／ｍＬ未満である。すなわち、ＨｕＲａ－４０細胞は、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞と比べて、より低い濃度でオマリズマブの作用を検出することができる。そのため、ＨｕＲａ－４０細胞は、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞と比べて、抗アレルギー活性物質のスクリーニングにより適していることが分かり、ＨｕＲａ－４０細胞によって、抗アレルギー活性物質を、より切れ味鋭くスクリーニングすることができることが分かる。
【0267】
また、図１７に示される結果より、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞に関しては、オマリズマブ濃度が最大（１００μｇ／ｍＬ）のとき、０μｇ／ｍＬの場合と比べて、発光強度は１／４程度に低下しただけであった。一方で、ＨｕＲａ－４０細胞に関しては、オマリズマブ濃度１００μｇ／ｍＬにおける発光強度は、０μｇ／ｍＬの場合の１／３０以下へと顕著に低下した。すなわち、ＨｕＲａ－４０細胞は、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞と比べて、バックグラウンドがほとんど残らない。この結果からも、ＨｕＲａ－４０細胞は、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞と比べて、抗アレルギー活性物質のスクリーニングにより適していることが分かり、ＨｕＲａ－４０細胞によって、抗アレルギー活性物質を、より切れ味鋭くスクリーニングすることができることが分かる。
【0268】
以上で説明した試験と同様の試験を、オマリズマブの代わりにシクロスポリンＡを用いて行った。具体的には、最終濃度０～１μｇ／ｍＬのシクロスポリンＡをＲＳ－ＡＴＬ８細胞又はＨｕＲａ－４０細胞に添加して３０分後、ヒトＩｇＥを５０ｎｇ／ｍＬ加え一晩感作した。ＰＢＳで３回洗浄後、抗ヒトＩｇＥ抗体で３時間刺激し、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏを加え発光を測定した。測定結果が図１８に示されている。
【0269】
図１８に示される結果より、ＨｕＲａ－４０細胞では、０．１μｇ／ｍＬのシクロスポリンＡ添加で抑制傾向が認められ、ＲＳ－ＡＴＬ８細胞と同様に、０．５μｇ／ｍＬのシクロスポリンＡ添加によって応答が顕著に抑制された。
【0270】
（９）安定性及び再現精度
【0271】
ＨｕＲａ－４０細胞の凍結保存における表現型の安定性評価試験及び再現精度評価試験を以下のとおりに行った。
【0272】
これらの試験において用いられたルシフェラーゼアッセイは以下のとおりに行われた。
すなわち、ＨｕＲａ－４０細胞懸濁培地に１／１００ｖｏｌ．の患者血清またはＨｕｍａｎ ＩｇＥ（ａｂ６５８６６、Ａｂｃａｍ)(最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ)を加え、５．０×１０４細胞／５０μＬ／ウェルとなるように９６穴プレート（１６５３０６、Ｔｈｅｒｍｏ社）に播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で一晩感作した。当該感作後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、当該洗浄後、培地で調製した卵白アレルゲンエキスまたは抗ヒトIgE抗体（Ａ８０－１０８Ａ、ＢＥＴＨＹＬ社）（最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ)を５０μＬ／ウェルずつ加え、３７℃、ＣＯ２下で３時間刺激した。以下の基質液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ加えて５分間反応させた後、ルミノメーター(ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ社)で発光強度を測定した。
＜基質液＞
Ｏｎｅ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
Ｏｎｅ－Ｇｌｏ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ(Ｐｒｏｍｅｇａ社)
すなわち、ＨｕＲａ－４０細胞懸濁培地に１／１００ｖｏｌ．の患者血清またはＨｕｍａｎ ＩｇＥ（ａｂ６５８６６、Ａｂｃａｍ)(最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ)を加え、５．０×１０４細胞／５０μＬ／ウェルとなるように９６穴プレート（１６５３０６、Ｔｈｅｒｍｏ社）に播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で一晩感作した。当該感作後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、当該洗浄後、培地で調製した卵白アレルゲンエキスまたは抗ヒトIgE抗体（Ａ８０－１０８Ａ、ＢＥＴＨＹＬ社）（最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ)を５０μＬ／ウェルずつ加え、３７℃、ＣＯ２下で３時間刺激した。以下の基質液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ加えて５分間反応させた後、ルミノメーター(ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ社)で発光強度を測定した。
＜基質液＞
Ｏｎｅ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
Ｏｎｅ－Ｇｌｏ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ(Ｐｒｏｍｅｇａ社)
【0273】
（ＨｕＲａ－４０の表現型の安定性の評価１）
凍結前、凍結２ヶ月後、凍結４ヶ月後、凍結６ヶ月後、又は凍結２年５ヶ月後のＨｕＲａ－４０細胞にＨｕｍａｎ ＩｇＥを加え一晩感作した。ＰＢＳで３回洗浄後、抗ヒトＩｇＥ抗体で３時間刺激した。Ｏｎｅ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを加え発光強度を測定した。測定結果が図２０に示されている。
同図に示されるように、ＨｕＲａ－４０細胞の、少なくとも２年５ヶ月間の受容体特異的な反応の安定性が確認された。
凍結前、凍結２ヶ月後、凍結４ヶ月後、凍結６ヶ月後、又は凍結２年５ヶ月後のＨｕＲａ－４０細胞にＨｕｍａｎ ＩｇＥを加え一晩感作した。ＰＢＳで３回洗浄後、抗ヒトＩｇＥ抗体で３時間刺激した。Ｏｎｅ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを加え発光強度を測定した。測定結果が図２０に示されている。
同図に示されるように、ＨｕＲａ－４０細胞の、少なくとも２年５ヶ月間の受容体特異的な反応の安定性が確認された。
【0274】
（ＨｕＲａ－４０の表現型の安定性の評価２）
凍結２ヶ月後又は凍結２年５ヶ月後のＨｕＲａ－４０細胞に卵アレルギー患者血清(特異的ＩｇＥ抗体価１００以上)又は健常者のプール血清を加え一晩感作後、ＰＢＳで洗浄し、卵白アレルゲンエキスで刺激してＯｎｅ－Ｇｌｏ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを加え発光強度を測定した。測定結果が図２１に示されている。
同図に示されるように、ＨｕＲａ－４０細胞の、少なくとも２年５ヶ月間の受容体特異的な反応の安定性が確認された。
凍結２ヶ月後又は凍結２年５ヶ月後のＨｕＲａ－４０細胞に卵アレルギー患者血清(特異的ＩｇＥ抗体価１００以上)又は健常者のプール血清を加え一晩感作後、ＰＢＳで洗浄し、卵白アレルゲンエキスで刺激してＯｎｅ－Ｇｌｏ ＥＸ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを加え発光強度を測定した。測定結果が図２１に示されている。
同図に示されるように、ＨｕＲａ－４０細胞の、少なくとも２年５ヶ月間の受容体特異的な反応の安定性が確認された。
【0275】
（室間再現精度評価）
以下の検討を施設数２（図２２のＡ及びＢに対応する)及び試行回数３（同図のＥＸＰ１、２、３に対応する）で実施した（室間共同試験）。ＨｕＲａ－４０細胞にＨｕｍａｎ ＩｇＥを加え一晩感作した。当該感作後、ＰＢＳで３回洗浄し、当該洗浄後、抗ヒトＩｇＥ抗体で３時間刺激した。ホモジニアス系ルシフェラーゼ基質液（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ）を加え発光強度を測定した。測定結果が図２２に示されている。
同図に示されるように、ＨｕＲａ－４０細胞を用いた試験の再現精度は非常に高かった。
以下の検討を施設数２（図２２のＡ及びＢに対応する)及び試行回数３（同図のＥＸＰ１、２、３に対応する）で実施した（室間共同試験）。ＨｕＲａ－４０細胞にＨｕｍａｎ ＩｇＥを加え一晩感作した。当該感作後、ＰＢＳで３回洗浄し、当該洗浄後、抗ヒトＩｇＥ抗体で３時間刺激した。ホモジニアス系ルシフェラーゼ基質液（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ）を加え発光強度を測定した。測定結果が図２２に示されている。
同図に示されるように、ＨｕＲａ－４０細胞を用いた試験の再現精度は非常に高かった。
【0276】
（室内再現精度評価）
単一試験室による再現精度確認を行った。ＨｕＲａ－４０細胞にＬｏｔの異なるＨｕｍａｎ ＩｇＥ（図２３のＯＬＤ及びＮＥＷに対応する)を加え一晩感作した。当該感作後にＰＢＳで３回洗浄し、当該洗浄後、抗ヒトＩｇＥ抗体で３時間刺激した。ホモジニアス系ルシフェラーゼ基質液（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ）を加え発光強度を測定した。測定結果が図２３に示されている。
同図に示されるように、ＨｕＲａ－４０細胞を用いた試験の再現精度は非常に高かった。
単一試験室による再現精度確認を行った。ＨｕＲａ－４０細胞にＬｏｔの異なるＨｕｍａｎ ＩｇＥ（図２３のＯＬＤ及びＮＥＷに対応する)を加え一晩感作した。当該感作後にＰＢＳで３回洗浄し、当該洗浄後、抗ヒトＩｇＥ抗体で３時間刺激した。ホモジニアス系ルシフェラーゼ基質液（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ）を加え発光強度を測定した。測定結果が図２３に示されている。
同図に示されるように、ＨｕＲａ－４０細胞を用いた試験の再現精度は非常に高かった。
【受託番号】
【0277】
ラット細胞： ＮＩＴＥ ＢＰ－０３２３０
【0278】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】