(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-13
(45)【発行日】2024-11-21
(54)【発明の名称】細胞を培養するための溶解性マイクロキャリア及び関連する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/02 20060101AFI20241114BHJP
C12N 5/07 20100101ALI20241114BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20241114BHJP
【ＦＩ】
C12N1/02
C12N5/07
C12M1/00 A
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2021573204
(86)(22)【出願日】2020-06-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-18
(86)【国際出願番号】 US2020035693
(87)【国際公開番号】W WO2020251799
(87)【国際公開日】2020-12-17
【審査請求日】2023-06-02
(31)【優先権主張番号】62/861,084
(32)【優先日】2019-06-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】397068274
【氏名又は名称】コーニング インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100073184
【弁理士】
【氏名又は名称】柳田 征史
(74)【代理人】
【識別番号】100175042
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 秀明
(72)【発明者】
【氏名】エルヴィ，マルシャル
(72)【発明者】
【氏名】ホアン，リエピン
(72)【発明者】
【氏名】ポン，ジンリン
(72)【発明者】
【氏名】ラッセル，ライアン ローレン
(72)【発明者】
【氏名】シベック，ジェフリー ジョゼフ
(72)【発明者】
【氏名】ジョウ，ユエ
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５２０６６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２３０８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５０９０８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５０１０２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／２００８８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／２０９８６５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１０／０５９７７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／０９３５９８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／００３０８０５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Biotechnology Journal，2018年11月12日，Vol. 14, 1800461，p. 1-12，doi: 10.1002/biot.201800461
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００
Ｃ１２Ｎ ５／００
Ｃ１２Ｍ １／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
溶解性基質から培養細胞を採取する方法であって、該方法が、前記基質を（ｉ）キレート化剤、又は（ｉｉ）キレート化剤及び酵素に曝露することによって前記基質を消化することにより、前記基質から前記培養細胞を分離するステップであって、前記キレート化剤が１ｍＭ以下の濃度のＥＤＴＡであり、前記分離によって採取溶液がもたらされる、ステップ；及び
前記分離するステップの後に、採取溶液の成分の一連の洗浄及び／又は遠心分離サイクルを実行するステップ
を含み、
前記基質が、ペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物と、該ポリガラクツロン酸化合物の表面上の接着ポリマーとを含む、
方法。
【請求項2】
前記酵素が、ペクチン分解酵素及びペクチナーゼからなる群より選択される非タンパク質分解酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
消化後、前記接着ポリマーの少なくとも一部が可溶性になる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記採取溶液にプロテアーゼを加えることによって前記接着ポリマーの不溶性部分を除去するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、その内容が依拠され、その全体がここに参照することによって本願に援用される、２０１９年６月１３日出願の米国仮特許出願第６２／８６１，０８４号の米国法典第３５編特許法１２０条に基づく優先権の利益を主張する。
【0002】
本出願は、その内容が依拠され、その全体がここに参照することによって本願に援用される、同一出願人による米国特許出願第１４／８９９，３９４号及び同第１５／５７９，７３９号、並びに米国特許第８，４０４４，８５号及び同第８，４２６，１７６号に関連するものである。
【技術分野】
【0003】
本開示は、概して、可消化性の基質、より詳細には、例えば、タンパク質、細胞、及びウイルスの単離のために、また診断用途及び細胞培養のために使用することができる消化可能なマイクロキャリア、並びに、可消化基質を使用する方法、より詳細には、可消化性の基質から細胞、タンパク質、及びウイルスを培養及び回収する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
マイクロキャリアは、治療用途の制御されたバイオリアクタにおける効率的な細胞スケールアップを可能にする。接着細胞が高いコンフルエンスに達し、したがって細胞間接触阻害によって細胞増殖が制限されうる平坦な表面での細胞培養とは対照的に、高い表面積／体積の比率を有する球形のマイクロキャリアは、効率的な細胞培養のスケールアップ又は増殖のための魅力的なプラットフォームを提供し、採取した細胞又は馴化培地のいずれかを所望の製品にすることができる。
【0005】
細胞培養に対する義務は、適切な酸素化及び細胞への栄養素の供給である。関連する課題には、増殖している細胞に損傷を与えるのに十分な流体力学的応力を導入することなく、必要な酸素及び栄養素を提供するためのマイクロキャリアの撹拌が含まれる。従来、撹拌はインペラを使用して行われる。
【0006】
さらなる課題は、細胞又は馴化培地からマイクロキャリアを分離することを包含する。酵素処理は、例えば、接着細胞を採取するために使用することができるが、酵素の添加は細胞に損傷を与える可能性がある。例えば、タンパク質分解酵素は、細胞表面の受容体を非選択的に除去する可能性がある。
【0007】
マイクロキャリアからの効果的な細胞回収には、多くの場合、濃縮酵素の使用、処理時間の延長、及び連続的な遠心分離／濾過サイクルが必要であり、これらは、細胞の健康状態及び回収率に悪影響を与える可能性がある。さらには、マイクロキャリアの消化に由来する可能性のある副産物、及びそのような副産物が細胞の健康状態及び回収率に及ぼしうる影響についての課題が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
上記を考慮すれば、規定された消化副産物を有するマイクロキャリアを含む細胞増殖表面、並びに、消化副産物を制御しつつ、細胞を効果的に培養し、増殖表面から採取する方法を提供することは、有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本開示の実施形態によれば、細胞培養物品は、細胞培養物品を含む。該物品は、二価カチオンで架橋されたポリガラクツロン酸化合物を有する基質を含み、該ポリガラクツロン酸化合物は、ペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択される。基質は、消化試薬によって、ガラクツロン酸モノマー及び二価カチオンを含む成分へと可消化性である。
【0010】
他の実施形態では、溶解性基質から培養細胞を採取する方法が提供される。該方法は、基質を（ｉ）キレート化剤、（ｉｉ）酵素、又は（ｉｉｉ）キレート化剤及び酵素に曝露することによって基質を消化することにより、基質から培養細胞を分離するステップであって、分離によって採取溶液がもたらされる、ステップ；並びに、分離後に、採取溶液の成分の一連の洗浄及び／又は遠心分離サイクルを実行するステップを含む。基質は、ペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物と、該ポリガラクツロン酸化合物の表面上の接着ポリマーとを含む。
【0011】
本開示の主題の追加の特徴及び利点は、以下の詳細な説明に記載され、一部には、その説明から当業者に容易に明らかとなり、あるいは、以下の詳細な説明、特許請求の範囲、並びに添付の図面を含めた本明細書に記載される本開示の主題を実施することによって認識されよう。
【0012】
前述の概要及び後述する詳細な説明はいずれも、本開示の主題の実施形態を提示しており、特許請求されている本開示の主題の性質及び特徴を理解するための概観又は枠組みを提供することを意図しているものと理解されたい。添付の図面は、本開示の主題のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれて、その一部を構成する。図面は、本開示の主題のさまざまな実施形態を示しており、その説明とともに、本開示の主題の原理及び動作を説明する役割を担う。加えて、図面及び説明は、単に例示を目的としたものであり、いかなる方法でも特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【0013】
本開示の特定の実施形態の以下の詳細な説明は、同様の構造が同様の参照番号で示されている以下の図面と併せて読む場合に最もよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】一実施形態による、外部架橋したＰＧＡマイクロキャリア上のｈＭＳＣ細胞を示す位相差画像
【図2】さらなる実施形態による、外部架橋したＰＧＡマイクロキャリア上のｈＭＳＣ細胞を示す位相差画像
【図3】さらに別の実施形態による、外部架橋したＰＧＡマイクロキャリア上のｈＭＳＣ細胞を示す位相差画像
【図4】一実施形態による、ゼラチンでコーティングしたＰＧＡマイクロキャリア上のＭＲＣ５細胞及びベロ細胞を示す位相差画像
【図5】ゼラチンでコーティングしたデキストランマイクロキャリア上、及びゼラチンでコーティングした外部架橋マイクロキャリア上のベロ細胞の倍数増殖のグラフ
【図6】ゼラチンでコーティングしたデキストランマイクロキャリア上、及びゼラチンでコーティングした外部架橋マイクロキャリア上のＭＲＣ５細胞の倍数増殖のグラフ
【図7】ゼラチンでコーティングした消化性マイクロキャリア上、及びＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社のＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩ表面を備えたマイクロキャリア上のｈＭＳＣ細胞の倍数増殖のグラフ
【図8】一実施形態に従って作製された単分散ＰＧＡビーズを示す位相差画像
【図9】一実施形態による、外部架橋したＰＧＡマイクロキャリア上のＭＲＣ５細胞を示す位相差画像
【図10】乳化及び内部ゲル化乳化及び内部ゲル化によって得られる広いサイズ分布を示す比較マイクロキャリアを示す位相差画像
【図11】ＶＮグラフト化ＰＧＡマイクロキャリア上に播種した後の無血清培地中のｈＭＳＣ細胞の位相差画像
【図12】サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用した、ＰＧＡ及び消化試薬の吸光度のグラフ
【図13】ＳＥＣを使用した、ペクチナーゼ及びＥＤＴＡによるＰＧＡポリマー消化の吸光度のグラフ
【図14】水中でのＰＧＡ消化の質量分析のグラフ
【図15】ＳＥＣを使用した、ＰＧＡマイクロキャリア消化のグラフ
【図16】１つ以上の実施形態による、細胞懸濁液を洗浄及び遠心分離する方法のフロー図
【図17A】希釈されていないサンプルからのＰＧＡ及び消化成分のＵＶ－ＶＩＳスペクトルのグラフ
【図17B】希釈されたサンプルからのＰＧＡ及び消化成分のＵＶ－ＶＩＳスペクトルのグラフ
【図17C】異なる波長でのＰＧＡ及び消化成分の光学密度のグラフ
【図18】溶解性マイクロキャリアのＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩ染色の画像
【図20】溶解性マイクロキャリアの抗ＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩ抗体染色の画像
【図21】消化溶液中の可溶性ＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩのドットブロット分析の画像
【図22A】採取溶液のさまざまな希釈に基づいた、ベロ細胞の濃度のグラフ
【図22B】ペクチナーゼのさまざまな希釈に基づいた、ベロ細胞の濃度のグラフ
【図22C】ＥＤＴＡのさまざまな希釈に基づいた、ベロ細胞の濃度のグラフ
【発明を実施するための形態】
【0015】
これより、幾つかの実施形態が添付の図面に示される、本開示の主題のさまざまな実施形態をより詳細に参照する。同じ又は類似した部分についての言及には、図面全体を通して同じ参照番号が用いられる。
【0016】
細胞の接着及び増殖を促進する細胞培養物品が開示される。幾つかの実施形態によれば、開示される細胞培養物品は、プロテアーゼを使用することなしに、細胞の採取を可能にする。例となる細胞培養物品は、ビーズ又はマイクロビーズ（集合的に「マイクロキャリア」）とも呼ばれる、マイクロキャリアである。
【0017】
実施形態では、細胞培養物品は、ペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、又はそれらの塩を含有するゲルを含む、滑らかかつ透明（又は半透明）のビーズである。細胞培養物品は、球状又は実質的に球状であってよく、外部ゲル化によって形成される。細胞培養物品のカルシウム含有量は、細胞への損傷を軽減する穏やかな条件下での迅速な細胞採取をもたらすように調整することができる。足場依存性細胞の接着を促進する分子は、化学的結合又は物理的吸着によって細胞培養物品の表面に接着されうる。
【0018】
ここに開示される外部ゲル化経路とは対照的に、マイクロキャリアは、乳化及び内部ゲル化を介して形成されうる。この内部ゲル化プロセスでは、油相（連続相または分散媒体とも呼ばれる）内で乳化される、水相に分散した不溶性カルシウム塩を含むポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）水溶液のゲル化によって、ビーズが形成される。
【0019】
内部ゲル化の場合、架橋は、塩から可溶性の二価金属イオン（例えば、Ｃａ２＋又はＭｇ２＋）を放出する、油溶性酸の添加によって開始される。しかしながら、このような方法では、エマルションを安定化させるためには、かなりの量の界面活性剤と同様に、大量の油相が必要とされる。植物油は連続相として使用することができるが、この分散媒体中で調製されたビーズはすすぎが困難である。
【0020】
内部ゲル化プロセスのさらなる欠点は、金属イオン源（塩）の一部が、インタクトのまま残り、マイクロキャリアの不均一性として現れ、これにより、表面粗さと透明性を損なう可能性があることである。さらには、このような残された金属塩は、マイクロキャリアの使用中に経時的に放出される可能性がある（これは、細胞培養にとって有害でありうる）か、又は細胞採取中のマイクロキャリアの消化を阻害する可能性がある。
【0021】
本開示の外部ゲル化法は、望ましくない内包物（第２の相）及び表面欠陥がなく、非タンパク質分解性の細胞の分離及び採取を支援する、高透明性のＰＧＡマイクロキャリアを調製するための安価で環境に優しい合成経路を提供する。本明細書で定義されるように、透明なマイクロキャリアは、３９０～７００ｎｍの可視スペクトルにわたって、少なくとも９０％の透過率、すなわち、９０、９２、９４、９６、９８、９９、又は１００％の透過率（前述の値のいずれかの間の範囲を含む）を示す。
【0022】
加えて、実施形態では、マイクロキャリアの均一なサイズ分布を提供することができる。均一なサイズ分布は、使用中の上清からのマイクロキャリアのより迅速かつクリーンな分離を確保する。これにより、培地の交換及び最終産生物の分離がより予測可能で、より信頼性が高く、より安価になりうる。実施形態では、マイクロキャリアのサイズは、さまざまな範囲に正確に調整することができる。これにより、ビーズの材料特性を変更することなく、さまざまなバイオプロセスのニーズに一致するようにビーズの沈降速度をカスタマイズすることができる。
【0023】
幾つかの実施形態によれば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びペクチナーゼを使用して溶解させることができる、カルシウム架橋ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）マイクロキャリアが提供される。このようなＰＧＡポリマー及びマイクロキャリア、並びに解離剤、及び副産物の特徴付けが本明細書で論じられ、その後の細胞増殖に対するこのような成分の影響が決定される。これに基づいて、効率的なＰＧＡマイクロキャリアと、該ＰＧＡマイクロキャリアを使用して細胞を培養及び採取する方法を決定した。
【0024】
ＰＧＡマイクロキャリア消化の副産物（例えば、ガラクツロン酸モノマー、カルシウム、ＥＤＴＡ、及びペクチナーゼ）を、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、及び誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して特徴付けした。ＵＶ－Ｖｉｓ分光法を使用して、これらの可溶性成分が、一連の洗浄及び／又は遠心分離サイクルを含む本明細書に開示される方法によって除去することができることを確認した。
【0025】
また、以下で説明するように、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩペプチドに対する抗体を使用して、溶解後のマイクロキャリア上の「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩコーティングの位置を分析することによって、本開示のＰＧＡマイクロキャリア用の「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩの大部分がビーズ消化後に可溶性になることが示される。幾つかの実施形態では、少ない残留量の「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩが放出された細胞に結合したままである場合、このレベルは、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）を採取溶液に加えることによって低減することができる。
【0026】
２Ｄ培養における細胞増殖に対する消化液成分、ペクチナーゼ、及びＥＤＴＡの影響を、既知の濃度のペクチナーゼ及びＥＤＴＡを細胞に戻すことによって分析し、細胞増殖への影響が最小であった濃度を特定した。幾つかの実施形態によれば、方法は、ＥＤＴＡの濃度が１ｍＭ以下に維持され、かつペクチナーゼが３０Ｕ／ｍＬ以下に維持されるステップを含む。加えて、これらの成分は、細胞を継代又は凍結保存する前に、洗浄及び／又は遠心分離又は濾過によって除去することができる。
【0027】
したがって、本明細書に開示される実施形態によれば、消化副産物を低減又は除去したマイクロキャリアが提供される。加えて、本明細書の物品及び方法による副産物を知る又は制御することにより、施術者は、ＰＧＡマイクロキャリアの使用、並びに生物学的及び／又は治療的意味についての知識及び信頼を高めることができる。
【0028】
幾つかの実施形態はマイクロキャリアを対象としているが、基質はさまざまな形態をとることができ、マイクロキャリア又はビーズに限定されない。幾つかの実施形態では、基質は、充填床バイオリアクタでの使用に適した形態をとることができ、例えば、円筒形、長方形、三角形、又は円盤の形状を有する発泡足場であってもよい。したがって、実施形態によれば、細胞培養のための溶解可能な発泡足場が提供される。溶解可能な発泡足場は、ペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択される、イオノトロピック架橋されたポリガラクツロン酸化合物を含む。幾つかの実施形態では、足場は、表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーを含みうる。
【0029】
ＰＧＡポリマー
ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）、又はペクチン酸は、熟した果物及び一部の野菜に見られるペクチン分解の水溶性生体高分子である。食品業界では増粘剤として最もよく知られているが、製薬業界及びバイオテクノロジー業界における薬物、タンパク質、細胞送達用のマトリクス、又は結合剤としても使用することができる。ポリマーの粘度は、分子量、エステル化度、濃度、ｐＨ、及び溶液中の対イオンの存在に依存する。ＰＧＡポリマーは、糖含量に依存しないゲルを生成し、ｐＨの変化に対してほとんど感度を示さず、また、ゲル化を制御するために、定義された量のカルシウム又は他の二価カチオンを必要とする。ＰＧＡポリマーのマイクロキャリアは、例えば、ＰＧＡの溶液を塩化カルシウム浴に滴下することによって（これは、球状ビーズとしての液滴の迅速なゲル化をもたらす）、作製することができる。過剰な塩化カルシウムは、マイクロキャリアが「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ又は変性コラーゲンなどの細胞接着促進基質でコーティングされる前に、一連の洗浄サイクルを通じてマイクロキャリアから除去される。
ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）、又はペクチン酸は、熟した果物及び一部の野菜に見られるペクチン分解の水溶性生体高分子である。食品業界では増粘剤として最もよく知られているが、製薬業界及びバイオテクノロジー業界における薬物、タンパク質、細胞送達用のマトリクス、又は結合剤としても使用することができる。ポリマーの粘度は、分子量、エステル化度、濃度、ｐＨ、及び溶液中の対イオンの存在に依存する。ＰＧＡポリマーは、糖含量に依存しないゲルを生成し、ｐＨの変化に対してほとんど感度を示さず、また、ゲル化を制御するために、定義された量のカルシウム又は他の二価カチオンを必要とする。ＰＧＡポリマーのマイクロキャリアは、例えば、ＰＧＡの溶液を塩化カルシウム浴に滴下することによって（これは、球状ビーズとしての液滴の迅速なゲル化をもたらす）、作製することができる。過剰な塩化カルシウムは、マイクロキャリアが「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ又は変性コラーゲンなどの細胞接着促進基質でコーティングされる前に、一連の洗浄サイクルを通じてマイクロキャリアから除去される。
【0030】
ＰＧＡマイクロキャリアは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用してカルシウムイオンを除去することにより、不安定化する可能性がある。モノマー単位間の連結を加水分解し、したがって、ＰＧＡポリマーの分子量を低下させ、その溶解度を増加させる酵素ペクチナーゼを使用して、ＰＧＡポリマーをさらに分解することができる。概して、ペクチナーゼは植物細胞壁の軟化を促進するため、果実の成熟に関連している；そのため、ペクチナーゼには、直接的なヒト用食品成分として使用するために、ＦＤＡから一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）通知が発行されている。
【0031】
マイクロキャリアは、少なくとも１つのイオノトロピック架橋された多糖を使用して作製することができる。例には、ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）としても知られるペクチン酸又はそれらの塩、若しくはペクチニン酸としても知られる部分的にエステル化されたペクチン酸（ＰＥ ＰＧＡ）又はそれらの塩が含まれる。
【0032】
ペクチン酸は、ある特定のペクチンエステルの加水分解によって形成することができる。ペクチンは細胞壁多糖類であり、自然界では植物において構造的な役割を有する。ペクチンの主な供給源には、柑橘類の皮（例えば、レモン及びライムの皮）並びにリンゴの皮が含まれる。ペクチンは、１，２－結合Ｌ－ラムノースによってランダムに中断された、１，４－結合アルファ－Ｄ－ガラクツロネート骨格に基づいている、主として直線状のポリマーである。平均分子量は約５０，０００～約２００，０００ダルトンの範囲である。
【0033】
ペクチンのポリガラクツロン酸鎖は、例えばメチル基などで部分的にエステル化されていてもよく、遊離酸基は、ナトリウム、カリウム、又はアンモニウムイオンなどの一価のイオンで部分的に又は完全に中和されていてもよい。メタノールで部分的にエステル化されたポリガラクツロン酸はペクチン酸と呼ばれ、その塩はペクチネートと呼ばれる。高メトキシル（ＨＭ）ペクチンのメチル化度（ＤＭ）は、例えば６０～７５モル％であってよく、低メトキシル（ＬＭ）ペクチンのメチル化度は１～４０モル％でありうる。
【0034】
ペクチン酸が選択される実施形態では、エステル化度は、４０モル％以下（例えば、１、５、１０、２０、３０又は４０モル％（前述の値のいずれかの間の範囲を含む））でありうる。エステル化度が高いと、イオノトロピック架橋によるビーズ形成の効果がなくなる。理論に縛られるわけでないが、望ましい程度のイオノトロピック架橋を得るためには、最小量の遊離カルボン酸基（エステル化されていない）が必要とされると考えられる。
【0035】
実施形態では、マイクロキャリアビーズは、２０モル％以下（例えば、０、５、１０、１５、又は２０モル％）のメトキシル基を含むポリガラクツロン酸などのＬＭペクチンを使用して形成した。このようなポリガラクツロン酸は、ペクチン酸のようにメチルエステル含有量を有しないか、又は無視できる程度に有しうる。本明細書で用いられる場合、メチルエステル含有量を有しないか、又は無視できる程度に有するペクチニン酸、及び低メトキシル（ＬＭ）ペクチンは、集合的にＰＧＡと呼ばれる。
【0036】
実施形態では、マイクロキャリアビーズは、ペクチン酸とペクチニン酸との混合物を使用して形成した。純粋なペクチン酸及び／又はペクチニン酸を使用してもよい。適合性のあるポリマーとのブレンドも使用することができる。例えば、ペクチン酸又はペクチニン酸を、デキストラン、置換セルロース誘導体、アルギン酸、デンプン、グリコーゲン、アラビノキシラン、アガロースなどの多糖類と混合することができる。ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカン、又はエラスチン、フィブリン、シルクフィブロイン、コラーゲン及びそれらの誘導体などのさまざまなタンパク質も使用することができる。他の水溶性の合成ポリマーもまた、ペクチン酸及び／又はペクチニン酸とブレンドすることができる。非限定的な例には、ポリアルキレングリコール、ポリ（ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート）、ポリ（メタ）アクリルアミド及び誘導体、ポリ（Ｎ－ビニル－２－ピロリドン）、ポリビニルアルコールなどが含まれる。適合性のあるポリマーは、それらの含有がマイクロキャリアの消化を損なわないことを条件として、アニオン性、中性、又はカチオン性でありうる。
【0037】
外部イオノトロピックゲル化
拡散硬化（diffusion setting）とも呼ばれる外部ゲル化は、イオン性溶液への親水コロイド（ＰＧＡ）溶液の導入を包含し、ゲル化は、親水コロイド溶液へのイオンの拡散を介して生じる。実施形態では、負に帯電した多糖類水溶液を、カルシウム、マグネシウム、又はバリウムなどの二価カチオンの溶液に滴下して分注し、ＰＧＡポリマーの架橋を誘導した。架橋はイオン架橋であり、こでは、共有結合架橋とは対照的に、架橋ポリマーのその後の消化を可能にする。
拡散硬化（diffusion setting）とも呼ばれる外部ゲル化は、イオン性溶液への親水コロイド（ＰＧＡ）溶液の導入を包含し、ゲル化は、親水コロイド溶液へのイオンの拡散を介して生じる。実施形態では、負に帯電した多糖類水溶液を、カルシウム、マグネシウム、又はバリウムなどの二価カチオンの溶液に滴下して分注し、ＰＧＡポリマーの架橋を誘導した。架橋はイオン架橋であり、こでは、共有結合架橋とは対照的に、架橋ポリマーのその後の消化を可能にする。
【0038】
実施形態によれば、親水コロイド溶液中のＰＧＡ濃度は、０．５～５質量％の範囲、例えば、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、又は５質量％（前述の値のいずれかの間の範囲を含む）であった。
【0039】
親水コロイド（ＰＧＡ）溶液の液滴を形成するための例となる方法は、シリンジによる滴下又は押し出し；ノズルから液滴を引き寄せる同軸の空気流によってビーズの形成が行われる、ジェットブレイクアップ又は粉砕；静電界を使用して液滴をノズルからゲル化浴に引き込む、静電ビーズの生成；磁気駆動振動；ジェットを均一な円筒形のセグメントへと切断する回転切削工具によってビーズの形成が行われる、ジェット切断；並びに、回転ディスク噴霧化を含んでいた。
【0040】
ＰＧＡ溶液の液滴は、球状であるか、又は実質的に球状であってよく、１０～５００マイクロメートルの範囲、例えば、１０、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５２、３００、３５０、４００、４５０、又は５００マイクロメートル（前述の値のいずれかの間の範囲を含む）の平均直径を有する。
【0041】
ゲル化浴は、二価金属塩の水溶液を含みうる。実施形態では、ゲル化浴中の塩（例えば、塩化カルシウム）濃度は、少なくとも１％（ｗ／ｖ）、例えば、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、又は２０％（前述の値のいずれかの間の範囲を含む）である。カルシウム含有量が低すぎると、架橋密度が低すぎることに起因して、ビーズは不十分な安定性を示す。
【0042】
水溶液は、エタノールなどのアルコールを含みうる。アルコールの水に体する比率（ｖ／ｖ）は、０／１００から８０／２０の範囲であってよく、例えば、０／１００、１０／９０、２０／８０、３０／７０、４０／６０、５０／５０、６０／４０、７０／３０、及び８０／２０である。
【0043】
実施形態では、ある程度の共有結合による架橋が起こりうるが、不可逆的であるこのような架橋のレベルは、ビーズの消化率を維持するために、例えば、約１０モル％未満～２０モル％など、十分に低くなければならない。
【0044】
マイクロキャリアビーズは、球状であるか、又は実質的に球状であってよく、１０～５００マイクロメートルの範囲、例えば、１０、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００マイクロメートル（前述の値のいずれかの間の範囲を含む）の平均直径を有する。実施形態では、相対標準偏差とも呼ばれるマイクロキャリアビーズの変動係数（ＣＶ）は、２０％未満、例えば、２、５、１０、又は１５％（前述のいずれかの間の範囲を含む）である。実施形態では、サイズの範囲Δｄ５－ｄ９５（ｄ９５とｄ５との差、ここで、ｄ５は、マイクロキャリア母集団の５％の直径より大きいマイクロキャリア直径であり、ｄ９５は、マイクロキャリア母集団の９５％の直径より大きいマイクロキャリア直径である）は、２５マイクロメートル未満、例えば、１０、１５、又は２０マイクロメートル（前述のいずれかの間の範囲を含む）である。実施形態では、サイズの範囲Δｄ１０－ｄ９０（ｄ９０とｄ１０との差、ここで、ｄ１０は、マイクロキャリア母集団の１０％の直径より大きいマイクロキャリア直径であり、ｄ９０は、マイクロキャリア母集団の９０％の直径より大きいマイクロキャリア直径である）は、２０マイクロメートル未満、例えば、５、１０、又は１５マイクロメートル（前述のいずれかの間の範囲を含む）である。実施形態では、ｄ５からｄ９５までの曲率半径の範囲（マイクロキャリア母集団の５％の直径より大きいマイクロキャリア直径の曲率半径と、マイクロキャリア母集団の９５％の直径より大きいマイクロキャリア直径の曲率半径との差）は、１０ｃｍ－１未満、例えば、２、５、又は８ｃｍ－１（前述のいずれかの間の範囲を含む）である。
【0045】
ビーズサイズの制御
実施形態では、マイクロキャリアビーズは、特定の狭いサイズ範囲内で製造することができる。すなわち、それらのサイズを制御することができる。マイクロキャリアビーズのサイズの制御は、幾つかの理由で重要である。小さいマイクロキャリアから大きいマイクロキャリアまでの範囲の広いサイズ分布が存在する場合には、より小さいサイズを有するマイクロキャリアは、より大きいサイズを有するマイクロキャリアよりもはるかに長く浮遊状態にある。プロセスにおける正確な沈降時間は、はるかに長くなるか（小さいビーズが存在するため）、又は規定するのが困難になる。使用中、上清がマイクロキャリアから除去されることを確保するために、より多くの時間が必要とされる。
実施形態では、マイクロキャリアビーズは、特定の狭いサイズ範囲内で製造することができる。すなわち、それらのサイズを制御することができる。マイクロキャリアビーズのサイズの制御は、幾つかの理由で重要である。小さいマイクロキャリアから大きいマイクロキャリアまでの範囲の広いサイズ分布が存在する場合には、より小さいサイズを有するマイクロキャリアは、より大きいサイズを有するマイクロキャリアよりもはるかに長く浮遊状態にある。プロセスにおける正確な沈降時間は、はるかに長くなるか（小さいビーズが存在するため）、又は規定するのが困難になる。使用中、上清がマイクロキャリアから除去されることを確保するために、より多くの時間が必要とされる。
【0046】
狭いサイズ分布は、ビーズを一定の速度で沈降可能にし、これは、培地交換又は培養産物の分離中に上清からマイクロキャリアをより予測可能に分離できるようにする。マイクロキャリアのサイズをさまざまな範囲に微調整して、沈降速度を制御することができる。これにより、さまざまなプロセスのニーズに合わせて、沈降速度をカスタマイズすることができる。サイズ制御されたマイクロキャリアは均一な表面積を有しており、マイクロキャリアごとに細胞を播種するために利用可能な面積と同じ面積を提供する。これにより、細胞の播種に利用可能な表面積の計算が容易になる。加えて、細胞は、同時に又は同様の時間にコンフルエンスに達する。本明細書で用いられる場合、「コンフルエンス」又は「コンフルエント」という用語は、実質的にすべての利用可能な増殖表面が使用されるように、すべての細胞が他の細胞と接触している増殖表面上に細胞がコヒーレント層を形成することを示すために用いられる。例えば、「コンフルエント」とは、「すべての細胞が、他の細胞とその周辺全体で接触しており、覆われずに残されている利用可能な基質がない」状態と定義されている（R.I. Freshney, Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Techniques, Second Edition, Wiley-Liss, Inc. New York, N.Y., 1987, p. 363）。従来のように、細胞に覆われる増殖表面の量は、コンフルエンスの割合と呼ばれる。例えば、増殖表面の約半分が細胞で覆われている状況は、本明細書では５０％のコンフルエンス、あるいは代替的に、半分のコンフルエンスと呼ばれる。サイズ制御されたマイクロキャリアは、同じ撹拌条件で懸濁させることができる。これにより、剪断力を細かく制御して、マイクロキャリアの良好な懸濁のバランスをとることができ、細胞への損傷が少なくなる条件を可能にすることができる。サイズ制御されたマイクロキャリアのさまざまな群に対して明確に規定された沈降時間は、連続的な細胞培養中の分離を容易にし、さまざまな時間に供給されたビーズ上での不均一な細胞増殖を防ぐのに役立てることができる。例えば、細胞は、最初に２５０μｍサイズのサイズ制御されたマイクロキャリア上に播種することができる。細胞が半分のコンフルエンスに達した後、３５０μｍサイズのサイズ制御されたマイクロキャリアを、ビーズからビーズへの移動のためにバイオリアクタに加えることができる。２５０μｍのマイクロキャリアのコンフルエンスの時点で、このサイズのマイクロキャリアは、独自の沈降速度によって又は濾過によって除去することができる。３５０μｍのサイズかつ半分のコンフルエントを有するビーズのみがバイオリアクタ内に残される。次に、新しい２５０μｍのマイクロキャリアを加えることができる。３５０μｍのマイクロキャリアがコンフルエンスに達した後、それらを収集し、新しい３５０μｍのマイクロキャリアを加えることができる。このプロセスにより、コンフルエンスに達したときに、すべてのビーズが確実に除去されるようにすることができる。対照的に、同じサイズのマイクロキャリアがビーズからビーズへの移動と連続的な細胞培養を行うために使用される場合、以前の供給に由来するビーズ上の細胞は、後の供給に由来するビーズ上の細胞よりもはるかに長くバイオリアクタ内に留まり、過剰なコンフルエンスの結果として、細胞の品質を低下させる可能性がある。
【0047】
実施形態では、振動カプセル化装置を使用して、製造中に溶解性マイクロキャリアをサイズ制御した。サイズ制御されたビーズは、規定された穴寸法、流量、及び振動数でノズルを通過させることによって形成した。得られたビーズのサイズは、変動係数が１０％未満の狭い範囲に制御されていた。
【0048】
ビーズの消化
マイクロキャリアの消化、細胞の採取、又はその両方に適した非タンパク質分解酵素には、ペクチン質を加水分解する関連酵素の異種グループである、ペクチン分解酵素又はペクチナーゼが含まれる。
マイクロキャリアの消化、細胞の採取、又はその両方に適した非タンパク質分解酵素には、ペクチン質を加水分解する関連酵素の異種グループである、ペクチン分解酵素又はペクチナーゼが含まれる。
【0049】
細胞採取は、細胞を含んだマイクロキャリアを、ペクチナーゼ分解酵素又はペクチナーゼと二価カチオンキレート化剤との混合物を含む溶液と接触させることを包含する。
【0050】
培養細胞を採取するための例となる方法は、本明細書に開示されるマイクロキャリアの表面上で細胞を培養するステップ、及び培養細胞をペクチナーゼとキレート剤との混合物と接触させて細胞をマイクロキャリアから分離するステップを含む。
【0051】
ペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ）は、複雑なペクチン分子をガラクツロン酸のより短い分子へと分解する酵素である。ペクチナーゼは、ポリガラクツロン酸からのペクチンオリゴ糖（ＰＯＳ）の遊離を触媒する。ペクチナーゼは、菌類、酵母、細菌、原生動物、昆虫、線虫類、及び植物から産生される。市販されるペクチナーゼの供給源は、概して、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）の選択された株から産生されるペクチン分解酵素調製物であるＮｏｖｏｚｙｍｅ Ｐｅｃｔｉｎｅｘ（商標）ＵＬＴＲＡ ＳＰＬなどの多酵素である。Ｎｏｖｏｚｙｍｅ Ｐｅｃｔｉｎｅｘ（商標）ＵＬＴＲＡ ＳＰＬは、主に、ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ ３．２．１．１５）、ペクチントランスエリミナーゼ（ＥＣ４．２．２．２）、及びペクチンエステラーゼ（ＥＣ：３．１．１．１１）を含む。ＥＣ指定は、酵素が触媒する化学反応に基づく酵素についての酵素委員会の分類スキームである。ペクチナーゼはペクチンを加水分解することが知られている。それらはメチルエステル化ペクチン又は脱エステル化ペクチンを攻撃することができる。
【0052】
消化溶液中のペクチン分解酵素の濃度は、１～２００Ｕ、例えば、１、２、５、１０、２０、５０、１００、１５０、又は２００Ｕ（前述のいずれかの間の範囲を含む）でありうる。
【0053】
例となるキレート化剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＴＧＡ）、クエン酸、酒石酸などが含まれる。消化溶液中のキレート化剤の濃度は、１～２００ｍＭ、例えば、１０、２０、５０、１００、１５０、又は２００ｍＭでありうる。細胞毒性の副作用を防ぐために、消化溶液中のキレート化剤の濃度は、１０ｍＭ以下、例えば、１、２、５、又は１０ｍＭ（前述のいずれかの間の範囲を含む）でありうる。
【0054】
実施形態では、ペクチン分解酵素及びキレート化剤を含む消化溶液の総体積は、マイクロキャリアの体積の１０倍未満、例えば、マイクロキャリアの体積の１、２、４、５、又は１０倍（前述の値のいずれかの間の範囲を含む）である。
【0055】
消化時間、温度、及び添加されるペクチン分解酵素の量に応じて、ビーズの消化の程度を選択又は事前に決定することができる。ビーズが完全に消化される前に、細胞がマイクロキャリア表面から分離することが観察されている。したがって、ビーズの完全な消化の有無にかかわらず、細胞を採取することが可能である。細胞が部分的に消化されたマイクロキャリアから採取される実施形態では、残ったマイクロキャリアからの細胞の分離は、濾過、デカンテーション、遠心分離、及び同様の処理のうちの１つ以上によって行うことができる。
【0056】
ビーズは、カルシウム含有量が湿ったビーズの２ｇ／ｌ未満、例えば、２、１．５、１、０．８、又は０．５ｇ／ｌ未満の場合、容易に消化される。採取段階におけるビーズのカルシウム含有量が１ｇ／ｌを超える場合には、より多くの量及び／又は濃度のペクチン分解酵素及び二価カチオンキレート化剤を使用することができる。完全な消化にかかる時間は、１時間未満、例えば、１０、１５、３０、又は４５分でありうる。本明細書で用いられる場合、「完全な消化」という用語は、「注射液中の粒子状物質（Particulate Matter in Injections）」と題された米国薬局方及び国民医薬品集セクション７８８（ＵＳＰ＜７８８＞）に記載されている粒子計数法に準拠するマイクロキャリア粒子数を与えるマイクロキャリアの消化を指す。ＵＳＰ＜７８８＞に示されるように、試験される単位中に存在する粒子の平均数が１０μｍ以上では１ｍＬあたり２５粒子を超えず、２５μｍ以上では１ｍＬあたり３粒子を超えない場合、調製は試験に準拠する。実施形態では、マイクロキャリアの消化後に１０μｍ以上のサイズを有する粒子のマイクロキャリア粒子数は、１０粒子未満、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９（前述のいずれかの間の範囲を含む）である。実施形態では、マイクロキャリアの消化後に２５μｍ以上のサイズを有する粒子のマイクロキャリア粒子数は、１粒子未満、例えば、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、又は０．９（前述のいずれかの間の範囲を含む）である。
【0057】
本明細書で定義されるように、「湿ったビーズ」の体積は、デカンテーション又は遠心分離後のビーズ床の体積である。ビーズ床は、膨潤したビーズと間隙水（すなわち、膨潤したビーズ間に存在する水）を含む。測定によれば、湿ったビーズは、７０体積％の膨潤したビーズと３０体積％の間隙水を含む。膨潤したビーズは、１％ＰＧＡ溶液では９９％の水、２％ＰＧＡ溶液では９８％の水、３％ＰＧＡ溶液では９７％の水などを含む。
【0058】
例として、３％（ｗ／ｖ）ＰＧＡゾルから調製されたマイクロビーズは、平衡状態で約１．４８ｇ／ｌのカルシウムイオンを含んでいる。１０分未満でのマイクロビーズの完全な消化は、５倍の体積の消化溶液（ビーズの体積と比較して）を使用した、少なくとも１０ｍＭのＥＤＴＡ及び少なくとも５０Ｕの酵素への曝露によって生じる。
【0059】
細胞接着
ＰＧＡビーズは、ヒドロゲルの性質及び負電荷に起因して、特定の処理なしでは細胞接着を容易に支援しない。足場依存性細胞の接着を促進するために、マイクロビーズにコーティング又は他の表面処理を施すことができる。例として、ＰＧＡビーズは、細胞接着を促進する部分、例えばＲＧＤ配列を含むものなどのペプチドで官能化することができる。
ＰＧＡビーズは、ヒドロゲルの性質及び負電荷に起因して、特定の処理なしでは細胞接着を容易に支援しない。足場依存性細胞の接着を促進するために、マイクロビーズにコーティング又は他の表面処理を施すことができる。例として、ＰＧＡビーズは、細胞接着を促進する部分、例えばＲＧＤ配列を含むものなどのペプチドで官能化することができる。
【0060】
さらなる候補ペプチドには、インテグリンファミリーのタンパク質によって潜在的に認識される、又は細胞接着を維持することができる細胞分子との相互作用をもたらすアミノ酸配列を含むものが含まれる。例には、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型及びＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン（ゼラチン）、及び同様のペプチド、並びにそれらの混合物が含まれる。さらなる例となるペプチドは、それぞれ、次の配列を有するＢＳＰ及びビトロネクチン（ＶＮ）ペプチドである：Ａｃ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｍｅｔ－Ｐｒｏ－ＮＨ２（配列番号１）、及びＡｃ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｔｙｒ－ＮＨ２（配列番号２）。
【0061】
実施形態では、マイクロビーズは、細胞接着を促進する組換えタンパク質で表面が官能化されており、これは、グラフトするか、又はコーティングとして施すことができる。例となる組換えタンパク質には、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）及び「ＰｒｏＮｅｃｔｉｎ」ｐｌｕｓという商品名で販売されているフィブロネクチン様の操作されたタンパク質が含まれるが、足場依存性細胞の接着を促進する他の組換えタンパク質を使用することもできる。
【実施例】
【0062】
実施例１。３％カルシウムで架橋した１％ＰＧＡマイクロビーズ。
【0063】
マイクロビーズは、ポリガラクツロン酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａカタログ番号＃Ｐ３８５０）を８０～８５℃で一定の撹拌下で水中に溶解することにより、ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）の１質量％溶液から調製した。溶液を真空下で２０マイクロメートルのポリプロピレンフィルタを使用して濾過し、懸濁液中の粒子を排除した。
【0064】
ゲル化浴は、マグネチックスターラーを使用して撹拌された、４００ｍｌの３％ｗ／ｖの塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液を使用して別のビーカーで生成した。
【0065】
液滴は、３０ゲージの針を備えたシリンジを使用してゲル化浴に２５ｍｌのＰＧＡ溶液を添加することによって生成した。約２バールのシリンジ圧力を印加した。
【0066】
ビーズを塩化カルシウム浴中で１２０分間硬化させた後、水で４回洗浄した。ビーズ内のカルシウム含有量を、実施例９に記載されるように決定した。４回のすすぎの後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．５～０．６ｇ／ｌであった。
【0067】
ビーズは、コーティング前に、４℃で滅菌容器内の滅菌水中で保存した。ビーズは、観察可能な表面欠陥がなく、非常に透明であった。
【0068】
５ｍＭ ＥＤＴＡ／５０Ｕペクチナーゼと２５℃で接触させると、ビーズは５分以内に完全に溶解した。
【0069】
実施例２。１２％カルシウムで架橋した１％ＰＧＡマイクロキャリア
３％ｗ／ｖ塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液を１２％ｗ／ｖ塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液に置き換えたことを除き、実施例１からの手順を繰り返した。４回のすすぎの後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．５～０．６ｇ／ｌであった。ビーズは、観察可能な表面欠陥がなく、非常に透明であった。
３％ｗ／ｖ塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液を１２％ｗ／ｖ塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液に置き換えたことを除き、実施例１からの手順を繰り返した。４回のすすぎの後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．５～０．６ｇ／ｌであった。ビーズは、観察可能な表面欠陥がなく、非常に透明であった。
【0070】
５ｍＭ ＥＤＴＡ／５０Ｕペクチナーゼと２５℃で接触させると、ビーズは５分以内に完全に溶解した。
【0071】
実施例３。３％カルシウムで架橋した１．５％ＰＧＡマイクロキャリア
ポリガラクツロン酸の１．５質量％溶液及び４バールの圧力を使用したことを除き、実施例１からの手順を繰り返した。
ポリガラクツロン酸の１．５質量％溶液及び４バールの圧力を使用したことを除き、実施例１からの手順を繰り返した。
【0072】
４回のすすぎの後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．７～０．８ｇ／ｌであった。ビーズは、観察可能な表面欠陥がなく、非常に透明であった。
【0073】
実施例４。１２％カルシウムで架橋した１．５％ＰＧＡマイクロキャリア
３％ｗ／ｖ塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液の代わりに１２％ｗ／ｖ塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液を使用したことを除き、実施例３からの手順を繰り返した。
３％ｗ／ｖ塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液の代わりに１２％ｗ／ｖ塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液を使用したことを除き、実施例３からの手順を繰り返した。
【0074】
４回のすすぎの後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．７～０．８ｇ／ｌであった。
【0075】
実施例５－ａ。３％カルシウムで架橋した２％ＰＧＡマイクロキャリア
ポリガラクツロン酸の２質量％溶液及び５バールの圧力を使用したことを除き、実施例１からの手順を繰り返した。ＰＧＡ溶液を３０℃に予熱し、２５℃で維持されたゲル化浴中に３０℃で噴射した。
ポリガラクツロン酸の２質量％溶液及び５バールの圧力を使用したことを除き、実施例１からの手順を繰り返した。ＰＧＡ溶液を３０℃に予熱し、２５℃で維持されたゲル化浴中に３０℃で噴射した。
【0076】
４回のすすぎの後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．９～１．０ｇ／ｌであった。ビーズは、観察可能な表面欠陥がなく、非常に透明であった。
【0077】
実施例５－ｂ。３％カルシウムで架橋した３％ＰＧＡマイクロキャリア
ポリガラクツロン酸の３質量％溶液及び６バールの圧力を使用したことを除き、実施例１からの手順を繰り返した。ＰＧＡ溶液を４０℃に予熱し、２５℃で維持されたゲル化浴中に４０℃で噴射した。
ポリガラクツロン酸の３質量％溶液及び６バールの圧力を使用したことを除き、実施例１からの手順を繰り返した。ＰＧＡ溶液を４０℃に予熱し、２５℃で維持されたゲル化浴中に４０℃で噴射した。
【0078】
４回のすすぎの後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの１．４８ｇ／ｌであった。ビーズは、観察可能な表面欠陥がなく、非常に透明であった。
【0079】
５ｍＭ ＥＤＴＡ／５０Ｕペクチナーゼと２５℃で接触させると、ビーズは１０分以内に完全に溶解した。
【0080】
実施例６。１２％カルシウムで架橋した２％ＰＧＡマイクロキャリア
１２％ｗ／ｖ塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液を使用したことを除き、実施例５－ａからの手順を繰り返した。
１２％ｗ／ｖ塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５ｖ／ｖ）溶液を使用したことを除き、実施例５－ａからの手順を繰り返した。
【0081】
４回のすすぎの後、カルシウム濃度は、湿ったビーズの約０．９～１．０ｇ／ｌであった。
【0082】
実施例７。グルタルアルデヒドで架橋された０．１％ゼラチンでコーティングしたＰＧＡビーズ。
【0083】
最初に０．５ｇ（タイプＡ）のブタ皮膚（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ１８９０）を２０ｍｌの水に浸し、次に４８０ｍｌの加熱水（６０℃～８０℃）を加えることによって、０．１％ブタ皮膚ゼラチン溶液を調製した。
【0084】
実施例１～６に従って調製された１０ミリリットルのＰＧＡビーズを遠心分離によって収集し、これに１０ｍＬのブタゼラチン溶液を加えた。得られた混合物を穏やかに振とうし、２５℃で６０分間インキュベートした。上清を除去し、ビーズを水で１回洗浄した。
【0085】
ゼラチンコーティングを架橋するために、２５％ストック溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃ５８８２）から調製した１００ｍｌの０．０５％グルタルアルデヒド溶液をビーズ床に加え、穏やかに振とうしつつ、２３℃で１時間インキュベートした。続いて、ビーズを水で３回すすぎ、滅菌容器内で、４℃で保存した。
【0086】
実施例８。「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ－ＳＣ合成共重合体表面を有するＰＧＡビーズ
実施例１に従って調製した約９ｍｌの膨潤したビーズを、５０ｍｌのプラスチック遠心用チューブに入れた。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ－ＳＣ表面を形成するために、接着促進ペプチドの０．２５ｍｇ／ｍｌ水溶液３６ｍｌをビーズに添加した。チューブを穏やかに振とうし、４０℃で３０分間静置し、合成共重合体でビーズを官能化させた。冷却後、官能化ビーズを脱イオン水で３回洗浄した。ビーズは滅菌容器に入れて４℃の水中で保存した。
実施例１に従って調製した約９ｍｌの膨潤したビーズを、５０ｍｌのプラスチック遠心用チューブに入れた。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ－ＳＣ表面を形成するために、接着促進ペプチドの０．２５ｍｇ／ｍｌ水溶液３６ｍｌをビーズに添加した。チューブを穏やかに振とうし、４０℃で３０分間静置し、合成共重合体でビーズを官能化させた。冷却後、官能化ビーズを脱イオン水で３回洗浄した。ビーズは滅菌容器に入れて４℃の水中で保存した。
【0087】
実施例９。カルシウム滴定
カルシウム含有量を定量化するために、１ｍｌのＰＧＡビーズを１０ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡ／５０Ｕペクチナーゼ溶液と組み合わせることによって消化させた。懸濁液を激しく振とうし、消化が完了するまで穏やかに振とうしつつ、２５℃で１時間放置した。
カルシウム含有量を定量化するために、１ｍｌのＰＧＡビーズを１０ｍｌの５ｍＭ ＥＤＴＡ／５０Ｕペクチナーゼ溶液と組み合わせることによって消化させた。懸濁液を激しく振とうし、消化が完了するまで穏やかに振とうしつつ、２５℃で１時間放置した。
【0088】
ビーズのカルシウム含有量は、誘導結合プラズマ発光分析（Ａｘｉａｌ ＩＣＰ－ＯＥＳ、Ｖａｒｉａｎ７２０ ＥＳツール）で定量化した。分析するサンプルは、消化したビーズを含む溶液１００μｌを９．９ｍｌの１％ＨＮＯ３で希釈することによって調製した。較正曲線は、各サンプルで行ったようにＨＮＯ３で希釈した１ｇ／ｌの標準水溶液から調製された、既知のカルシウム濃度の溶液を使用して作成した。
【0089】
実施例１０－ａ。ペプチド共重合体でコーティングしたマイクロキャリアを用いたｈＭＳＣの静的培養
実施例２に従って調製され、実施例８に従って「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ－ＳＣ共重合体表面を備えたビーズを、７０％エタノール／水で清浄化し、リン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）で２回、次にＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＸＦ完全培地（ＭＣ－ＸＦ）ですすいだ。骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）培養は、２４ウェルＵＬＡプレート内のＭＣ－ＸＦで、静的条件下で行った。細胞を１００ｋ細胞／ウェルで播種した。５０Ｕペクチナーゼ／５ｍＭ ＥＤＴＡで５分間処理することにより、マイクロキャリアから細胞を採取した。播種２日後の細胞形態を図１に示す。播種４日後の細胞形態を図２に示す。
実施例２に従って調製され、実施例８に従って「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ－ＳＣ共重合体表面を備えたビーズを、７０％エタノール／水で清浄化し、リン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）で２回、次にＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＸＦ完全培地（ＭＣ－ＸＦ）ですすいだ。骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）培養は、２４ウェルＵＬＡプレート内のＭＣ－ＸＦで、静的条件下で行った。細胞を１００ｋ細胞／ウェルで播種した。５０Ｕペクチナーゼ／５ｍＭ ＥＤＴＡで５分間処理することにより、マイクロキャリアから細胞を採取した。播種２日後の細胞形態を図１に示す。播種４日後の細胞形態を図２に示す。
【0090】
実施例１０－ｂ。ゼラチンでコーティングしたマイクロキャリアを用いたｈＭＳＣの静的培養
ビーズを実施例４に従って調製し、実施例７に従ってゼラチンでコーティングした。図３は、２４ウェルプレート内に１００ｋ細胞／ウェルで播種して２日後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の接着及び増殖の例となる位相差顕微鏡画像を示している。
ビーズを実施例４に従って調製し、実施例７に従ってゼラチンでコーティングした。図３は、２４ウェルプレート内に１００ｋ細胞／ウェルで播種して２日後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の接着及び増殖の例となる位相差顕微鏡画像を示している。
【0091】
実施例１１。ゼラチンでコーティングしたＰＧＡマイクロキャリアでのベロ細胞の増殖
実施例２に従って調製し、実施例７に従ってコーティングした、ゼラチンコーティングした外部架橋１％ＰＧＡマイクロキャリア上で連続的に撹拌しつつ、ベロ細胞を培養した。
実施例２に従って調製し、実施例７に従ってコーティングした、ゼラチンコーティングした外部架橋１％ＰＧＡマイクロキャリア上で連続的に撹拌しつつ、ベロ細胞を培養した。
【0092】
ビーズを最初に７０％エタノール／水で清浄化し、リン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）で２回、次に（ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ＋５ｍｌペニシリンストレプトマイシン＋５ｍｌのＧｌｕｔａｍａｘ（商標）培地）ですすいだ。
【0093】
細胞培養は、培養培地として１０％ＦＢＳ＋５ｍｌペニシリンストレプトマイシン＋５ｍｌの「Ｇｌｕｔａｍａｘ」培地を添加したＩＭＤＭを使用して、Ｃｏｒｎｉｎｇ ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の使い捨てスピナーフラスコ内で行った。フラスコに、２時間撹拌せずに１Ｍのベロ（ｐ５）を播種し、続いて連続的に撹拌した。継代数の指定（ｐ＃、この例では「ｐ５」）は、細胞を産生するために用いられる増殖及び採取サイクルの数（＃）（すなわち、細胞が培養において有していた分裂数）を示している。
【0094】
５日目の細胞採取は、１０ｍＬの５０Ｕ／ｍｌペクチナーゼ、５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して行った。
【0095】
【0096】
実施例１２。ゼラチンでコーティングしたＰＧＡマイクロキャリアでのＭＲＣ５細胞の増殖
実施例２に従って調製し、実施例７に従ってコーティングした、ゼラチンコーティングした外部架橋１％ＰＧＡマイクロキャリア上で断続的に撹拌しつつ、ヒト胎児肺線維芽（ＭＲＣ５）細胞を培養した。
実施例２に従って調製し、実施例７に従ってコーティングした、ゼラチンコーティングした外部架橋１％ＰＧＡマイクロキャリア上で断続的に撹拌しつつ、ヒト胎児肺線維芽（ＭＲＣ５）細胞を培養した。
【0097】
ビーズを最初に７０％エタノール／水で清浄化し、リン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）で２回、次に（ＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳ＋５ｍｌペニシリンストレプトマイシン＋５ｍｌの「Ｇｌｕｔａｍａｘ」培地）ですすいだ。
【0098】
細胞培養は、培養培地として１０％ＦＢＳ＋５ｍｌペニシリンストレプトマイシン＋５ｍｌの「Ｇｌｕｔａｍａｘ」培地を添加したＩＭＤＭを使用して、Ｃｏｒｎｉｎｇ ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の使い捨てスピナーフラスコ内で実施した。一晩撹拌せずに、フラスコに１ＭのＭＲＣ５細胞（ｐ４）を播種し、続いて断続的に撹拌した（２時間あたり１／４時間）。
【0099】
５日目の細胞採取は、１０ｍＬの５０Ｕ／ｍｌペクチナーゼ、５ｍＭ ＥＤＴＡを使用して行った。
【0100】
【0101】
図４の顕微鏡写真は、ベロ細胞及びＭＲＣ５細胞がＰＧＡマイクロキャリアに接着し、コンフルエンスに達することができたことを示している。
【0102】
実施例１３。ペプチド共重合体でコーティングしたマイクロキャリア上でのｈＭＳＣ細胞の増殖
ｈＭＳＣ細胞は、実施例１に記載されているように調製し、実施例８に従って「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ－ＳＣ共重合体表面を備えた、外部架橋したＰＧＡビーズ上で連続的に撹拌しつつ、培養した。
ｈＭＳＣ細胞は、実施例１に記載されているように調製し、実施例８に従って「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ－ＳＣ共重合体表面を備えた、外部架橋したＰＧＡビーズ上で連続的に撹拌しつつ、培養した。
【0103】
ビーズを最初に７０％エタノール／水で清浄化し、リン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）で２回、次に、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」－ＸＦ完全培地（ＭＣ－ＸＦ）ですすいだ。細胞を１Ｍ細胞／フラスコで播種し、ＭＣ－ＸＦを使用してＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の使い捨てスピナーフラスコ内で細胞培養を行った。
【0104】
１０ｍｌの５０Ｕペクチナーゼ／５ｍＭ ＥＤＴＡで５分間処理することにより、７日目にマイクロキャリアから細胞を採取した。倍数増殖データを図７に示す。
【0105】
実施例１４。ペプチド共重合体でコーティングしたマイクロキャリア上でのｈＭＳＣ細胞の増殖
実施例５－ａに記載されるように調製し、実施例８に記載されるようにＣｏｒｎｉｎｇ ＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩ合成ペプチド共重合体表面を備えた、２％ＰＧＡ溶液から調製した外部架橋ＰＧＡビーズを使用したことを除き、実施例１３に記載されているような連続的な撹拌下でのｈＭＳＣ細胞の増殖を繰り返した。倍数増殖データを図７に示す。
実施例５－ａに記載されるように調製し、実施例８に記載されるようにＣｏｒｎｉｎｇ ＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩ合成ペプチド共重合体表面を備えた、２％ＰＧＡ溶液から調製した外部架橋ＰＧＡビーズを使用したことを除き、実施例１３に記載されているような連続的な撹拌下でのｈＭＳＣ細胞の増殖を繰り返した。倍数増殖データを図７に示す。
【0106】
実施例１５。ゼラチンでコーティングしたマイクロキャリア上でのｈＭＳＣ細胞の増殖
ｈＭＳＣ細胞は、実施例１に記載されるように調製し、実施例７に記載されるようにゼラチンでコーティングした外部架橋ＰＧＡビーズ上で連続的に撹拌しつつ、培養した。
ｈＭＳＣ細胞は、実施例１に記載されるように調製し、実施例７に記載されるようにゼラチンでコーティングした外部架橋ＰＧＡビーズ上で連続的に撹拌しつつ、培養した。
【0107】
ビーズを最初に７０％エタノール／水で清浄化し、リン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）で２回、次に、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」－ＸＦ完全培地（ＭＣ－ＸＦ）ですすいだ。細胞を１Ｍ細胞／フラスコで播種し、ＭＣ－ＸＦを使用してＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社の使い捨てスピナーフラスコ内で細胞培養を行った。
【0108】
１０ｍｌの５０Ｕペクチナーゼ／５ｍＭ ＥＤＴＡで５分間処理することにより、７日目にマイクロキャリアから細胞を採取した。倍数増殖データを図７に示す。
【0109】
実施例１６。ゼラチンでコーティングしたマイクロキャリア上でのｈＭＳＣ細胞の増殖
実施例５－ａに記載されるように調製し、実施例７に記載されるようにゼラチンでコーティングした外部架橋ゼラチンコーティングＰＧＡビーズを使用したことを除き、実施例１５に記載されるように連続的な撹拌条件下でのｈＭＳＣ細胞の増殖を繰り返した。倍数増殖データを図７に示す。
実施例５－ａに記載されるように調製し、実施例７に記載されるようにゼラチンでコーティングした外部架橋ゼラチンコーティングＰＧＡビーズを使用したことを除き、実施例１５に記載されるように連続的な撹拌条件下でのｈＭＳＣ細胞の増殖を繰り返した。倍数増殖データを図７に示す。
【0110】
実施例１７。ＰＧＡマイクロキャリアの化学的安定性
マイクロキャリアビーズの化学的安定性は、１ｍｌの膨潤したビーズと５ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）（１Ｘ）を含むプラスチックの遠心用チューブに加えることによって評価した。チューブを３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後のビーズの体積は、最初の体積に匹敵しており、ビーズがリン酸緩衝液に溶解しないことを示した。
マイクロキャリアビーズの化学的安定性は、１ｍｌの膨潤したビーズと５ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）（１Ｘ）を含むプラスチックの遠心用チューブに加えることによって評価した。チューブを３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後のビーズの体積は、最初の体積に匹敵しており、ビーズがリン酸緩衝液に溶解しないことを示した。
【0111】
実施例１８。
【0112】
単分散マイクロキャリアビーズは、電磁駆動の層流ジェットノズルシステム（スイス国チューリッヒ所在のＮｉｓｃｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＡＧ社）を使用して、１．５質量％ＰＧＡ溶液から生成した。システムは、１００μｍのノズルを具備している。周波数は２．５ｋＨｚに設定し、振幅は１００％に設定した。約３ｐｓｉ（約２０．６８ｋＰａ）の圧力を印加することによって生成される溶液の流量は、約１００ｍｌ／時であった。
【0113】
ノズルは、ゲル化浴（５０：５０ｖ／ｖの水／エタノール中、４質量％のＣａＣｌ２溶液）の表面から約７．５ｃｍ上に配置した。浴を連続的に撹拌した（１７０ｒｐｍ）。
【0114】
得られたマイクロビーズは、２４０±１５μｍの平均直径を有しており、これは６．２５％の変動係数（ＣＶ）に対応する。この狭いサイズ分布が図９に示されている（倍率：４Ｘ）。
【0115】
１００ｍｌの代わりに５０ｍｌの０．０５％グルタルアルデヒド溶液を使用したことを除き、ビーズを、実施例７に記載されるようにゼラチンコーティングし、該ゼラチンコーティングを架橋した。
【0116】
実施例１０－ｃ。ゼラチンでコーティングしたマイクロキャリアを用いたＭＲＣ５の静的培養
ヒト胎児肺線維芽（ＭＲＣ５）細胞を、実施例１８に従って調製し、ゼラチンでコーティングしたマイクロビーズ上で、静的条件で培養した。培養培地として１０％ＦＢＳを添加したＩＭＤＭを使用して、細胞を２４ウェルＵＬＡプレートに１００ｋ細胞／ウェルで播種した。播種１日後の細胞形態が、図１０の位相差顕微鏡画像に示されている。
ヒト胎児肺線維芽（ＭＲＣ５）細胞を、実施例１８に従って調製し、ゼラチンでコーティングしたマイクロビーズ上で、静的条件で培養した。培養培地として１０％ＦＢＳを添加したＩＭＤＭを使用して、細胞を２４ウェルＵＬＡプレートに１００ｋ細胞／ウェルで播種した。播種１日後の細胞形態が、図１０の位相差顕微鏡画像に示されている。
【0117】
実施例１９。ＰＧＡマイクロキャリアへのビトロネクチンペプチドのグラフト
実施例１８に従って調製した約３ｍｌの膨潤したビーズを、１５ｍｌのプラスチック遠心用チューブに入れた。２００ｍＭのＮ－エチル－Ｎ’－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び５０ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む水溶液を１２ミリリットル加えた。チューブを２３℃で３０分間穏やかに撹拌し、ＰＧＡビーズ内のカルボン酸基を活性化した。活性化されたマイクロキャリアを遠心分離によって収集し、１０ｍｌの脱イオン水で３回すすいだ。
実施例１８に従って調製した約３ｍｌの膨潤したビーズを、１５ｍｌのプラスチック遠心用チューブに入れた。２００ｍＭのＮ－エチル－Ｎ’－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び５０ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む水溶液を１２ミリリットル加えた。チューブを２３℃で３０分間穏やかに撹拌し、ＰＧＡビーズ内のカルボン酸基を活性化した。活性化されたマイクロキャリアを遠心分離によって収集し、１０ｍｌの脱イオン水で３回すすいだ。
【0118】
すすいだマイクロキャリアを、４９ｍｇのビトロネクチンペプチド（Ａｃ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｍｅｔ－Ｐｒｏ－ＮＨ２；カタログ番号：３４１５８７、Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ社から入手可能）を含む、１２ｍｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）に再懸濁した。懸濁したマイクロキャリアを穏やかに撹拌しつつ、３０分間反応させた。
【0119】
ペプチドがコンジュゲートしたマイクロキャリアを遠心分離によって収集し、１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４で３回洗浄した。過剰の活性エステルは、１２ｍｌの１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．４）で６０分間ブロッキングすることによって失活させた。
【0120】
ペプチドでグラフト化し、ブロックしたマイクロキャリアを収集し、ＰＢＳで３回すすいだ。過剰なＰＢＳを除去した後、マイクロキャリアをエタノール／水（７０／３０ｖ／ｖ）で２回すすぎ、細胞培養の前に滅菌容器内に４℃で保存した。
【0121】
実施例１０－ｄ。ＶＮグラフト化マイクロキャリアを使用したｈＭＳＣの静的培養
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ ２６３７、ｐ３）を、実施例１９に従って調製されたＶＮグラフト化マイクロキャリアビーズ上で、静的条件で培養した。細胞を、２４ウェルＵＬＡプレートに５０ｋ細胞／ウェルで播種した。図１２は、播種から２４時間後の無血清培地（Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ ＸＦ）中のｈＭＳＣ細胞を示す位相差画像である。
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ ２６３７、ｐ３）を、実施例１９に従って調製されたＶＮグラフト化マイクロキャリアビーズ上で、静的条件で培養した。細胞を、２４ウェルＵＬＡプレートに５０ｋ細胞／ウェルで播種した。図１２は、播種から２４時間後の無血清培地（Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ ＸＦ）中のｈＭＳＣ細胞を示す位相差画像である。
【0122】
実施例１０ａ～１０ｄからのデータは、完全に合成されたマイクロキャリア及びゼラチンでコーティングしたマイクロキャリアがそれぞれ、ｈＭＳＣの接着及び増殖を支援することを示している。
【0123】
実施例２０。外部ゲル化を使用した異なるサイズの溶解性マイクロキャリアの生成
ポリガラクツロン酸ナトリウム塩を２％、水に溶解した。外部ゲル化は、ＮＩＳＣＯ単一ノズル振動カプセル化システムを使用して処理した。エタノール及び水の１：１（ｖ／ｖ）混合に溶解した４％ＣａＣｌ２に、ビーズを滴下した。目標サイズ範囲のため、表Ｉに従って、さまざまなサイズのノズル、流量、及び振動周波数を使用した。
ポリガラクツロン酸ナトリウム塩を２％、水に溶解した。外部ゲル化は、ＮＩＳＣＯ単一ノズル振動カプセル化システムを使用して処理した。エタノール及び水の１：１（ｖ／ｖ）混合に溶解した４％ＣａＣｌ２に、ビーズを滴下した。目標サイズ範囲のため、表Ｉに従って、さまざまなサイズのノズル、流量、及び振動周波数を使用した。
【0124】
【表1】
【0125】
実施例２１。沈降時間の測定及び分析
沈降速度を評価するため、異なるサイズのマイクロキャリアの実施形態を、３つの市販のマイクロキャリア：Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）－１（米国ペンシルベニア州ピッツバーグ所在のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販される架橋デキストランをベースとしたマイクロキャリア）、ＳｏｌｏＨｉｌｌ（登録商標）Ｐ１０２－１５２１（米国ニューヨーク州ポートワシントン所在のＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から市販されるプラスチック架橋ポリスチレンマイクロキャリア）、及びＨｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩ（米国ニューヨーク州ポートワシントン所在のＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から市販される変性ポリスチレンマイクロキャリア）と比較した。これら３種類の市販のマイクロキャリアは、ヒドロゲルから固体プラスチックまでの範囲であり、１．０２から１．０９までの範囲の密度を有する。以下により詳細に説明するように、光学密度（ＯＤ）を測定し、懸濁液中のビーズの濃度の決定に使用した。マイクロキャリアは、不明瞭化に起因して可視光を遮断しうる。概して、低いＯＤは、懸濁液中の低濃度のマイクロキャリアと相関している。
沈降速度を評価するため、異なるサイズのマイクロキャリアの実施形態を、３つの市販のマイクロキャリア：Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）－１（米国ペンシルベニア州ピッツバーグ所在のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販される架橋デキストランをベースとしたマイクロキャリア）、ＳｏｌｏＨｉｌｌ（登録商標）Ｐ１０２－１５２１（米国ニューヨーク州ポートワシントン所在のＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から市販されるプラスチック架橋ポリスチレンマイクロキャリア）、及びＨｉｌｌｅｘ（登録商標）ＩＩ（米国ニューヨーク州ポートワシントン所在のＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から市販される変性ポリスチレンマイクロキャリア）と比較した。これら３種類の市販のマイクロキャリアは、ヒドロゲルから固体プラスチックまでの範囲であり、１．０２から１．０９までの範囲の密度を有する。以下により詳細に説明するように、光学密度（ＯＤ）を測定し、懸濁液中のビーズの濃度の決定に使用した。マイクロキャリアは、不明瞭化に起因して可視光を遮断しうる。概して、低いＯＤは、懸濁液中の低濃度のマイクロキャリアと相関している。
【0126】
ＯＤを測定する方法は、さまざまな段階でビーズをキュベット内で沈降させることを包含する。用いられる光路では、キュベットの底部が閉じられうる。マイクロキャリアビーズが溶液から沈降する期間にわたり、ＯＤが変化しうる。概して、測定の開始時には、マイクロキャリアビーズは溶液中に完全に懸濁され、光は最高レベルで遮断される。マイクロキャリアビーズが沈降し始めると、マイクロキャリアビーズが同じ方向に移動するため、懸濁液の上部が透明になり始めるが、光路内のマイクロキャリアビーズの濃度は比較的変化しないままである。マイクロキャリアビーズが光路の上限を下回って沈降し始めると、ＯＤは低下する。マイクロキャリアビーズが光路のほぼ中央に到達すると、ＯＤは半分に低下する。マイクロキャリアビーズが光路のほぼ中央に到達する時間は、ｔｍで表される。全懸濁液の高さ及び光路の位置が固定されている場合は、ビーズの沈降が速くなるほど、ビーズは小さくなる。沈降速度（本明細書ではｖｍで表される）は、マイクロキャリアが懸濁液の上部から光路の中央までの距離（本明細書ではｌｍで表される）を移動する時間（本明細書ではｔｍで表される）によって推定することができる。
これは、式（１）で表すことができる：
これは、式（１）で表すことができる：
【0127】
【数1】
【0128】
不均一なサイズを有するマイクロキャリアビーズの母集団では、異なるサイズのマイクロキャリアビーズに対して異なる沈降速度が予想される。そのため、沈降速度ｖｍは、母集団の媒体沈降速度を表す。
【0129】
光路は幅（本明細書ではｌｗで表される）を有しており、マイクロキャリアビーズが幅ｌｗを移動する時間（本明細書ではｔｗで表される）が存在する。マイクロキャリアビーズの母集団が均一な沈降速度を有する（すなわち、マイクロキャリアビーズが均一なサイズ分布を有する）場合には、式（２）に示されるように、光路の幅ｌｗと沈降速度ｖｍを使用してｔｗを推定することができる：
【0130】
【数2】
【0131】
マイクロキャリアビーズの母集団が異なる沈降速度の分布を有している（すなわち、マイクロキャリアビーズが不均一なサイズ分布を有している）場合には、最も速く沈降するマイクロキャリアビーズは、最も遅く沈降するマイクロキャリアビーズよりも早く光路に到達する。最も速く沈降するマイクロキャリアビーズが光路を通過するとき、ＯＤの低下が観察されるが、最も遅い沈降のマイクロキャリアビーズが光路を通過するまで、ＯＤの完全な低下は観察されない。異なる沈降速度の分布を有するマイクロキャリアビーズの母集団は、均一な沈降速度を有するマイクロキャリアビーズの母集団よりも長いｔｗを示すであろう。したがって、ｔｗが短いほど、マイクロキャリアビーズの母集団の沈降速度がより均一になり、マイクロキャリアの母集団のサイズ分布がより均一になる。上記は、ＯＤの変化の始点及び終点を決定することができると仮定しているが、このような始点及び終点を定義するのは難しい場合があるものと理解されたい。したがって、ＯＤの変化の傾きを使用して、マイクロキャリアビーズの母集団の沈降速度の変動の大きさを表すことができる。
【0132】
実際には、沈降プロセスを完了するために、すべてのビーズが上清から完全に分離するのを待つことが好ましい。したがって、ＯＤの完全な低下を観察するための時間（本明細書ではｔで表される）は、最終的な沈降時間の推定には、より適切である。最終的な沈降時間は、マイクロキャリアビーズの母集団の平均沈降時間と、マイクロキャリアビーズの母集団の沈降時間の変動の両方を使用して決定することができる。定量測定では、最終的な沈降時間は、ｔｍ及びｔｗを使用するか、又はＯＤの変化の傾きを使用して決定することができる。
【0133】
本実験では、３種類の市販のマイクロキャリアを再水和し、ＤＰＢＳ溶液に懸濁した。３つの異なるサイズ（２５０μｍ、３５０μｍ、及び４５０μｍ）を有する溶解性マイクロキャリア（ＤＭＣ）を、実験１に記載されるように形成した。約０．５ｍｌの充填されたマイクロキャリアを各キュベットに加えた。次に、ＤＰＢＳを、総量が３．５ｍｌになるようにキュベットに充填した。測定の直前に、マイクロキャリアを１０回上下にピペッティングすることによって懸濁させた。ＯＤを上記の方法に従って測定し、４００ｎｍの波長で測定した。他の可視波長も選択することができる。ＯＤの測定を２．０秒ごとに行った。さまざまなタイプのマイクロキャリアが、さまざまな材料から形成され、さまざまな光学屈折率を有し、さまざまなサイズであり、かつさまざまな光学的透明度を有しているため、異なるサンプルを比較できるように、初期のＯＤを使用して各サンプルの測定値を正規化した。
【0134】
３つのサイズのＤＭＣを、３つの市販のマイクロキャリアと比較した。結果は、直径３５０μｍのＤＭＣは２５０μｍのＤＭＣの２倍の速さで沈降し、直径４５０μｍのＤＭＣは２５０μｍのＤＭＣの３倍の速さで沈降することを示していた。ＤＭＣのサイズを変更することにより、沈降速度を、異なる材料でできた、異なる密度を有する３つの市販のビーズの媒体沈降速度と一致させることができた。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－１及び「ＳｏｌｏＨｉｌｌ」Ｐ１０２－１５２１マイクロキャリアと比較して、２５０μｍ及び３５０μｍのサイズを有するＤＭＣは、同等の媒体沈降速度を示したが、はるかに短いｔｗ及びＯＤの変化のより急な勾配を示した。実施例２１により詳細に論じられるように、より短いｔｗ及びＯＤの変化のより急な勾配は、市販のマイクロキャリアと比較してより一貫した沈降速度を提供する、市販のマイクロキャリアよりも小さいサイズ分布の結果である。沈降時間ｔを比較すると、２５０μｍ及び３５０μｍのサイズを有するＤＭＣは、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－１及び「ＳｏｌｏＨｉｌｌ」Ｐ１０２－１５２１マイクロキャリアよりも速く沈降し、これは、ＤＭＣが、市販のマイクロキャリアと比較して、沈降を完了するのにはるかに短い時間しか必要としないことを示唆している。
【0135】
実施例２１。マイクロキャリアのサイズ分布及び曲率半径の分析
実施例２０において２５０μｍの目標サイズを有するマイクロキャリアに従って形成された溶解性マイクロキャリア（ＤＭＣ）のサイズ分布及び曲率半径を、３つの市販のマイクロキャリア：「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－１、「ＳｏｌｏＨｉｌｌ」Ｐ１０２－１５２１、及び「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３（米国ペンシルベニア州ピッツバーグのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されている架橋デキストランをベースとしたマイクロキャリア）と比較した。マイクロキャリアのサイズは、光学顕微鏡でキャプチャした画像を分析するための既知の光学顕微鏡技術及びソフトウェアを使用して決定した。次に、決定したマイクロキャリアサイズから、式（３）を使用して曲率半径を計算した：
実施例２０において２５０μｍの目標サイズを有するマイクロキャリアに従って形成された溶解性マイクロキャリア（ＤＭＣ）のサイズ分布及び曲率半径を、３つの市販のマイクロキャリア：「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－１、「ＳｏｌｏＨｉｌｌ」Ｐ１０２－１５２１、及び「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３（米国ペンシルベニア州ピッツバーグのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されている架橋デキストランをベースとしたマイクロキャリア）と比較した。マイクロキャリアのサイズは、光学顕微鏡でキャプチャした画像を分析するための既知の光学顕微鏡技術及びソフトウェアを使用して決定した。次に、決定したマイクロキャリアサイズから、式（３）を使用して曲率半径を計算した：
【0136】
【数3】
【0137】
式中、Ｋは、マイクロキャリアの曲率半径であり、Ｒは、マイクロキャリアの半径である。各タイプのマイクロキャリアについて、表ＩＩは、サイズ範囲ｄ５－ｄ９５（ここで、ｄ５は、マイクロキャリア母集団の５％の直径より大きいマイクロキャリア直径であり、ｄ９５は、マイクロキャリア母集団の９５％の直径より大きいマイクロキャリア直径である）、サイズ範囲ｄ１０－ｄ９０（ここで、ｄ１０は、マイクロキャリア母集団の１０％の直径より大きいマイクロキャリア直径であり、ｄ９０は、マイクロキャリア母集団の９５％の直径より大きいマイクロキャリア直径である）、サイズの範囲Δｄ５－ｄ９５（ｄ９５とｄ５との差）、ｄ５－ｄ９５の変動係数、サイズの範囲Δｄ１０－ｄ９０（ｄ９０とｄ１０との差）、及びｄ１０－ｄ９０の変動係数を示している。
【0138】
【表2】
【0139】
各タイプのマイクロキャリアについて、表ＩＩＩは、平均マイクロキャリア直径（ｄ）、平均曲率半径（Ｋ）、ｄ５における曲率半径、ｄ９５における曲率半径、及びｄ５からｄ９５までの曲率半径の範囲（ｄ５の曲率半径とｄ９５の曲率半径との差）を示している。
【0140】
【表3】
【0141】
表ＩＩ及びＩＩＩのデータは、本明細書に開示されるＤＭＣが、３つの市販のマイクロキャリアよりも均一なサイズ分布及びより均一な曲率半径を有することを示している。前述のように、均一なサイズ分布は、ビーズを一定の速度で沈降可能にし、これは、培地交換又は培養産物の分離中に上清からマイクロキャリアをより予測可能に分離できるようにする。均一なサイズ分布及び均一な曲率半径は、マイクロキャリアごとに細胞を播種するのに利用可能な同じ表面積を提供し、細胞が同じ時間又は同様の時間にコンフルエンスに到達することができるようにする。
【0142】
実施例２２。マイクロキャリア粒子数の分析
実施例２０に記載されたマイクロキャリアに従って形成された溶解性マイクロキャリア（ＤＭＣ）から生じるデブリ粒子数を、２つの市販のマイクロキャリア：「ＳｏｌｏＨｉｌｌ」Ｐ１０２－１５２１及び「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３と比較した。粒子数を１ｍＬあたり２粒子未満に低減するために、撹拌する前に、各タイプのマイクロキャリアを洗浄する複数のステップを行った。各タイプのマイクロキャリアについて、約１０００ｃｍ２の量のマイクロキャリアを、別々のＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）１２５ｍＬの使い捨てスピナーフラスコ（米国ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．から市販される）に入れ、約１００ｍＬのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に懸濁した。２つの使い捨てスピナーフラスコにＤＭＣを充填した。マイクロキャリアを、室温で約６０ｒｐｍの速度で合計６日間、連続的に撹拌した。使い捨てスピナーフラスコの一方のＤＭＣを、本明細書に記載される方法に従って溶解し、他方の使い捨てスピナーフラスコのＤＭＣは溶解しなかった。撹拌が完了した後、マイクロキャリアをＤＰＢＳから分離し、ＤＰＢＳ中の粒子数を、「注射液中の粒子状物質（Particulate Matter in Injections）」と題された米国薬局方及び国民医薬品集セクション７８８（ＵＳＰ＜７８８＞）に記載されている光遮蔽粒子計数法を使用して、ＨＩＡＣ ９７０３＋粒子カウンタ（米国インディアナ州インディアナポリス所在のＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販される）で測定した。ＵＳＰ＜７８８＞に示されるように、試験される単位中に存在する粒子の平均数が、１０μｍ以上では１ｍＬあたり２５粒子を超えず、２５μｍ以上では１ｍＬあたり３粒子を超えない場合、調製は試験に準拠する。表ＩＶは、非溶解性ＤＭＣ及び溶解性ＤＭＣを含む各マイクロキャリアについて、１ｍＬのＤＰＢＳあたり２５μｍ以上のサイズを有する残留粒子の数を示している。表Ｖは、非溶解性ＤＭＣ及び溶解性ＤＭＣを含む各マイクロキャリアについて、１ｍＬのＤＰＢＳあたり１０μｍ以上のサイズを有する残留粒子の数を示している。
実施例２０に記載されたマイクロキャリアに従って形成された溶解性マイクロキャリア（ＤＭＣ）から生じるデブリ粒子数を、２つの市販のマイクロキャリア：「ＳｏｌｏＨｉｌｌ」Ｐ１０２－１５２１及び「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３と比較した。粒子数を１ｍＬあたり２粒子未満に低減するために、撹拌する前に、各タイプのマイクロキャリアを洗浄する複数のステップを行った。各タイプのマイクロキャリアについて、約１０００ｃｍ２の量のマイクロキャリアを、別々のＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）１２５ｍＬの使い捨てスピナーフラスコ（米国ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．から市販される）に入れ、約１００ｍＬのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に懸濁した。２つの使い捨てスピナーフラスコにＤＭＣを充填した。マイクロキャリアを、室温で約６０ｒｐｍの速度で合計６日間、連続的に撹拌した。使い捨てスピナーフラスコの一方のＤＭＣを、本明細書に記載される方法に従って溶解し、他方の使い捨てスピナーフラスコのＤＭＣは溶解しなかった。撹拌が完了した後、マイクロキャリアをＤＰＢＳから分離し、ＤＰＢＳ中の粒子数を、「注射液中の粒子状物質（Particulate Matter in Injections）」と題された米国薬局方及び国民医薬品集セクション７８８（ＵＳＰ＜７８８＞）に記載されている光遮蔽粒子計数法を使用して、ＨＩＡＣ ９７０３＋粒子カウンタ（米国インディアナ州インディアナポリス所在のＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から市販される）で測定した。ＵＳＰ＜７８８＞に示されるように、試験される単位中に存在する粒子の平均数が、１０μｍ以上では１ｍＬあたり２５粒子を超えず、２５μｍ以上では１ｍＬあたり３粒子を超えない場合、調製は試験に準拠する。表ＩＶは、非溶解性ＤＭＣ及び溶解性ＤＭＣを含む各マイクロキャリアについて、１ｍＬのＤＰＢＳあたり２５μｍ以上のサイズを有する残留粒子の数を示している。表Ｖは、非溶解性ＤＭＣ及び溶解性ＤＭＣを含む各マイクロキャリアについて、１ｍＬのＤＰＢＳあたり１０μｍ以上のサイズを有する残留粒子の数を示している。
【0143】
【表4】
【0144】
【表5】
【0145】
表ＩＶ及びＶに示されるように、ＤＭＣが溶解性及び非溶解性の両方である場合、使い捨てスピナーフラスコで撹拌した後には、他の２つの市販のマイクロキャリアを撹拌した後よりも少ないＤＭＣ粒子が残っていた。これは、１０μｍを超えるサイズを有する粒子及び２５μｍを超えるサイズを有する粒子についても当てはまった。
【0146】
比較例１
非消化性「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３基質をＰＧＡマイクロキャリアの代わりに使用したことを除き、ベロ細胞の培養を実施例１１に記載されるように繰り返した。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３ビーズの表面から細胞を分離するためにトリプシンを必要とした。倍数増殖データが図５に要約されている。消化性マイクロキャリアを使用して得られた増殖は、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３での増殖と同等である。
非消化性「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３基質をＰＧＡマイクロキャリアの代わりに使用したことを除き、ベロ細胞の培養を実施例１１に記載されるように繰り返した。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３ビーズの表面から細胞を分離するためにトリプシンを必要とした。倍数増殖データが図５に要約されている。消化性マイクロキャリアを使用して得られた増殖は、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３での増殖と同等である。
【0147】
比較例２
非消化性「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３基質をＰＧＡマイクロキャリアの代わりに使用したことを除き、ＭＲＣ５細胞の培養を実施例１２に記載されるように繰り返した。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」ビーズの表面から細胞を分離するためにトリプシンを必要とした。倍数増殖データが図６に要約されている。消化性マイクロキャリアを使用して得られた増殖は、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３での増殖と同等である。
非消化性「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３基質をＰＧＡマイクロキャリアの代わりに使用したことを除き、ＭＲＣ５細胞の培養を実施例１２に記載されるように繰り返した。「Ｃｙｔｏｄｅｘ」ビーズの表面から細胞を分離するためにトリプシンを必要とした。倍数増殖データが図６に要約されている。消化性マイクロキャリアを使用して得られた増殖は、「Ｃｙｔｏｄｅｘ」－３での増殖と同等である。
【0148】
比較例３
図１１は、国際公開第２０１４／２０９８６５号の実施例１による内部ゲル化によって形成されたビーズの位相差顕微鏡画像である。このビーズは、２３１±５４μｍの平均直径を有しており、これは、２３％の変動係数（ＣＶ）に対応する。
図１１は、国際公開第２０１４／２０９８６５号の実施例１による内部ゲル化によって形成されたビーズの位相差顕微鏡画像である。このビーズは、２３１±５４μｍの平均直径を有しており、これは、２３％の変動係数（ＣＶ）に対応する。
【0149】
開示される方法は、望ましくない内包物及び表面欠陥がなく、非タンパク質分解細胞の分離及び採取を支援する、高透明性のＰＧＡマイクロキャリアを調製するための安価で環境に優しい経路を提供する。
【0150】
ＰＧＡ消化由来の副産物の特徴付け
溶解性マイクロキャリア消化の組成を示すために、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して、ＰＧＡポリマー消化副産物を、それらの分子量によって分離した。図１２は、各個別の試薬の結果（左）と、ＰＧＡ及び塩のピークをより適切に分離するためのデータのクローズアップ（右）を示している。図１２に示されるように、各個別の試薬を対照として実施し、相対的な溶出プロファイル及び保持時間を決定した。このことから、２１４ｎｍでの高い吸光度に起因して、ペクチナーゼ及びＥＤＴＡの強いピークを観察した。ＰＧＡピークの保持時間は２．１分と最も短く、これは分子量が最も高いことを示唆しており、ペクチナーゼは、２．２～３．０分の間に、複数の酵素成分の混合物と一致する複数のピークを示した。低分子量のＰＧＡピークとペクチナーゼのピークとの間には幾つかの重複が存在しており、ＰＧＡ由来のより大きい消化断片の検出を妨げている可能性がある。同様に、ＥＤＴＡは、分子量が２９２．１７ダルトンと比較的低いことに起因して、３．９１分にピークを有していた；これにより、それぞれ１９４．１４ダルトンと３７０．２６ダルトンの予想分子量を有するＰＧＡモノマー及びダイマーのピークの表示も隠されている可能性がある。
溶解性マイクロキャリア消化の組成を示すために、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して、ＰＧＡポリマー消化副産物を、それらの分子量によって分離した。図１２は、各個別の試薬の結果（左）と、ＰＧＡ及び塩のピークをより適切に分離するためのデータのクローズアップ（右）を示している。図１２に示されるように、各個別の試薬を対照として実施し、相対的な溶出プロファイル及び保持時間を決定した。このことから、２１４ｎｍでの高い吸光度に起因して、ペクチナーゼ及びＥＤＴＡの強いピークを観察した。ＰＧＡピークの保持時間は２．１分と最も短く、これは分子量が最も高いことを示唆しており、ペクチナーゼは、２．２～３．０分の間に、複数の酵素成分の混合物と一致する複数のピークを示した。低分子量のＰＧＡピークとペクチナーゼのピークとの間には幾つかの重複が存在しており、ＰＧＡ由来のより大きい消化断片の検出を妨げている可能性がある。同様に、ＥＤＴＡは、分子量が２９２．１７ダルトンと比較的低いことに起因して、３．９１分にピークを有していた；これにより、それぞれ１９４．１４ダルトンと３７０．２６ダルトンの予想分子量を有するＰＧＡモノマー及びダイマーのピークの表示も隠されている可能性がある。
【0151】
ＰＧＡの小分子消化副産物をより良好に示すために、ペクチナーゼによるＰＧＡポリマーの消化の分析を最初に行った。ＰＧＡポリマー及びペクチナーゼの溶液を、ＥＤＴＡなしで混合した。図１３に示されるように、新しい周期的なピークが低分子量で生成しており、これは、それぞれが１つの残基によって分離された、消化されたガラクツロン酸オリゴマーの長さが異なる結果である可能性が最も高い。消化時間が長くなると、新しい低分子量のピークが強くなり、ＰＧＡオリゴマーが継続的に消化されて低分子量のオリゴマーになったことを示唆している。長時間経過すると、周期的なピークが消え、４．１７分に強い低分子量のピークが生じた。この保持時間は、その分子量がＥＤＴＡの分子量よりも低く、ガラクツロン酸モノマーである可能性が高いことを示唆している。ＳＥＣの移動相（例えば、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水又はＤＰＢＳ）が、質量分析を使用した各ピークの分子量及び同一性の決定を妨げたため、エレクトロスプレーイオン化質量分析を使用して別の消化溶液を分析した。結果を図１４に示す。消化時間の増加に伴って、増強したピーク（ｍ／ｚ＝１９３）が観察され（図１４）、ＰＧＡポリマーがモノマーへと完全に消化されるというＳＥＣのデータを裏付けている。質量分析（ＭＳ）データは、１５分未満でのモノマーピークの急速な増加を支持するが、１５～６０分ではほとんど変化しなかった。対照的に、ＳＥＣ分析では、１０分後にモノマーピークの最大の増加を示した。理論に縛られることは望まないが、これは２つの潜在的な説明を示唆している：（１）消化が急速に起こり、ＭＳ対ＳＥＣの異なる分析で用いられる異なるサンプル導入方法により、実時間に多少のずれが導入された可能性がある、及び（２）ＭＳピーク強度は、ＳＥＣの吸光度ほどサンプル濃度に定量的に反応しない可能性がある。
【0152】
次に、ＰＧＡポリマーの分解副産物をＰＧＡマイクロキャリアの分解副産物と比較した。ＥＤＴＡのみを添加した場合、マイクロキャリアはＰＧＡポリマーへと解離した。図１５に示されるように、ＰＧＡは約２．１０分でピークに達し、ＥＤＴＡは３．９１分及び４．０３分でピークに達する。ペクチナーゼとＥＤＴＡの両方を添加した場合、マイクロキャリアの解離とＰＧＡポリマーの消化が同時に起こった。追加のペクチナーゼピークは２．２～３．０分の間に示され、３．５分後に複数の周期的なピークが示され、これらは消化時間の増加とともに弱まり、また、ＰＧＡモノマーに対応する４．１７分の単一の強いピークが示されている（図１５）。ＰＧＡポリマー由来のＳＥＣデータとは異なり、ＰＧＡオリゴマーのピークはＥＤＴＡピークから隠されることに起因して、３．８５～４．１０分の間で分離できなかった。
【0153】
カルシウム及びＥＤＴＡの濃度
ＰＧＡマイクロキャリアの溶解を促進するために、ＥＤＴＡを添加して、カルシウムイオンを隔離及び捕捉し、それによってポリマーネットワーク及びビーズ構造を不安定にすることができる。したがって、ビーズの溶解時に放出されるカルシウムイオンの予想量と放出されたカルシウムイオンを隔離するために必要なＥＤＴＡの量をよりよく理解するために、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）をＳＥＣと組み合わせる。以下の「方法」のセクションで説明するように、サンプルを両方の分析で同様に調製した。ＩＣＰ－ＭＳで測定したカルシウム含有量は９０～１１０ｍｇ／Ｌであり、又は消化溶液中のカルシウムイオンは約２．２５～２．７５ｍＭであった（データは示さず）。ＳＥＣデータは、４ｍＭのＥＤＴＡを含む消化溶液で３．９１分にＥＤＴＡピークが約６０％減少することを示した（データは示さず）。これは、放出されたカルシウム量のＩＣＰ－ＭＳの結果とよく一致している。このデータは、溶解したマイクロキャリアから放出されたカルシウムのほとんどがＥＤＴＡに結合しており、ＥＤＴＡが４ｍＭで過剰であることを示唆している。既存の消化プロトコルでは、ビーズの迅速な消化を確実にするために、１０ｍＭのＥＤＴＡが推奨されうることに留意されたい。しかしながら、この開示の実施形態によれば、上記のデータによって証明されるように、はるかに低いＥＤＴＡ濃度をビーズの溶解に使用することができる。
ＰＧＡマイクロキャリアの溶解を促進するために、ＥＤＴＡを添加して、カルシウムイオンを隔離及び捕捉し、それによってポリマーネットワーク及びビーズ構造を不安定にすることができる。したがって、ビーズの溶解時に放出されるカルシウムイオンの予想量と放出されたカルシウムイオンを隔離するために必要なＥＤＴＡの量をよりよく理解するために、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）をＳＥＣと組み合わせる。以下の「方法」のセクションで説明するように、サンプルを両方の分析で同様に調製した。ＩＣＰ－ＭＳで測定したカルシウム含有量は９０～１１０ｍｇ／Ｌであり、又は消化溶液中のカルシウムイオンは約２．２５～２．７５ｍＭであった（データは示さず）。ＳＥＣデータは、４ｍＭのＥＤＴＡを含む消化溶液で３．９１分にＥＤＴＡピークが約６０％減少することを示した（データは示さず）。これは、放出されたカルシウム量のＩＣＰ－ＭＳの結果とよく一致している。このデータは、溶解したマイクロキャリアから放出されたカルシウムのほとんどがＥＤＴＡに結合しており、ＥＤＴＡが４ｍＭで過剰であることを示唆している。既存の消化プロトコルでは、ビーズの迅速な消化を確実にするために、１０ｍＭのＥＤＴＡが推奨されうることに留意されたい。しかしながら、この開示の実施形態によれば、上記のデータによって証明されるように、はるかに低いＥＤＴＡ濃度をビーズの溶解に使用することができる。
【0154】
回収された細胞からの可溶性消化成分の除去
溶解性マイクロキャリア消化産物は、小さいＰＧＡオリゴマー（モノマー）、ＥＤＴＡ、カルシウム、及びペクチナーゼを含む。これらの成分を細胞からどのように分離することができるかを示すために、本開示の方法の幾つかの実施形態に従って、回収後、一連の洗浄及び遠心分離サイクルを使用した。「方法」のセクションにおいて説明され、図１６に示されているように、遠心分離によって、溶解したマイクロキャリアから細胞を回収し、各洗浄サイクルからの上清の７５％をＵＶ－ＶＩＳ分光法で分析した。個々の消化溶液試薬のＵＶ－ＶＩＳスペクトルを図１７Ａに示す。４つの異なる波長での光学密度（ＯＤ）を使用して、異なる成分の特徴的なスペクトルを表した：２１５ｎｍ（通常、一般的な有機物に使用）；２６０ｎｍ（通常、ＤＮＡに使用）；２８０ｎｍ（通常、タンパク質に使用）；及び、可視色での４００ｎｍ。２１５ｎｍでのＯＤは、過飽和に起因して、希釈されていないサンプルでは不正確であった；したがって、１：１０希釈を定量比較に使用した（図１７Ｂ）。図１７Ｃに示されるように、各試薬は、選択した４つの波長でのＯＤの独自の組合せを有していた；これらのＯＤ間の比率を使用して、消化溶液中の各試薬を特定し、図１７Ｄに示されるように、それらの濃度をさらに定量化した。実験サンプルの各波長におけるＯＤ値は、個々の消化試薬及びＰＧＡの付加的なＯＤと一致した。
溶解性マイクロキャリア消化産物は、小さいＰＧＡオリゴマー（モノマー）、ＥＤＴＡ、カルシウム、及びペクチナーゼを含む。これらの成分を細胞からどのように分離することができるかを示すために、本開示の方法の幾つかの実施形態に従って、回収後、一連の洗浄及び遠心分離サイクルを使用した。「方法」のセクションにおいて説明され、図１６に示されているように、遠心分離によって、溶解したマイクロキャリアから細胞を回収し、各洗浄サイクルからの上清の７５％をＵＶ－ＶＩＳ分光法で分析した。個々の消化溶液試薬のＵＶ－ＶＩＳスペクトルを図１７Ａに示す。４つの異なる波長での光学密度（ＯＤ）を使用して、異なる成分の特徴的なスペクトルを表した：２１５ｎｍ（通常、一般的な有機物に使用）；２６０ｎｍ（通常、ＤＮＡに使用）；２８０ｎｍ（通常、タンパク質に使用）；及び、可視色での４００ｎｍ。２１５ｎｍでのＯＤは、過飽和に起因して、希釈されていないサンプルでは不正確であった；したがって、１：１０希釈を定量比較に使用した（図１７Ｂ）。図１７Ｃに示されるように、各試薬は、選択した４つの波長でのＯＤの独自の組合せを有していた；これらのＯＤ間の比率を使用して、消化溶液中の各試薬を特定し、図１７Ｄに示されるように、それらの濃度をさらに定量化した。実験サンプルの各波長におけるＯＤ値は、個々の消化試薬及びＰＧＡの付加的なＯＤと一致した。
【0155】
さらには、各洗浄／遠心分離サイクルでのＯＤの低下は、理論上の７５％培地低減モデルと一致し、消化試薬及びマイクロキャリア副産物の除去が類似した希釈スキームに従っており、実施形態による一連の洗浄サイクルを通じて低減することができることを示している。これらの結果に基づいて、副産物がタンパク質（ペクチナーゼ）及び水溶性の小分子（ＰＧＡオリゴマー、ＥＤＴＡ）であることを考慮すると、タンジェンシャルフロー濾過又は他の一般的に用いられる細胞精製方法は、これらの副産物を除去することが可能であろう。
【0156】
ＰＧＡマイクロキャリアの溶解の可溶性副産物は、洗浄によって低減又は除去する必要がある。しかしながら、接着基質である「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ（細胞外マトリクスタンパク質（ＥＣＭ）からの合成ペプチドである、ビトロネクチン）、又は変性コラーゲンの最終結末は、以前は不明であった。したがって、細胞上の残留ペプチドを、細胞密度の関数として抗「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ抗体を使用して測定した。簡単に説明すると、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、細胞濃度を、ウェルあたり１５×１０３、３０×１０３、及び６０×１０３個の細胞に増加させて、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ（Ｓ２）溶解性マイクロキャリア（ＤＭＣ）に播種した。変性コラーゲン（ＤＣ）ＤＭＣに、陰性対照として１ウェルあたり６０×１０３個の細胞を播種した。細胞を５日間増殖させ、その後、ペクチナーゼ及びＥＤＴＡの消化溶液とともに採取した。消化された細胞懸濁液を、方法に記載されているように抗「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ抗体で免疫染色した。播種されていないＤＭＣにも同じ方法を使用して染色した。
【0157】
図１８に示されるように、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ染色は、陰性対照の変性コラーゲンビーズ（ＮＤＣ）と比較した場合、播種されていない「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ ＤＭＣ（ＮＳＭ）で明らかであった。同様に、ＤＣ ＤＭＣ（ＤＣ６０）から採取した細胞では、低いバックグラウンド蛍光が観察された。対照的に、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ免疫検出に対応する蛍光は、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ ＤＭＣ（Ｓ２ １５、３０、及び６０）から採取した細胞で観察された。全体的な蛍光シグナルは細胞密度とともに増加した；しかしながら、細胞ごとに検出される「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩの量は、分光光度計を使用して測定した定量的蛍光強度に基づいて、さまざまな条件にわたって同様であった（図１９）。さらには、蛍光強度を「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ ＤＭＣの全蛍光に正規化した場合（図１９の下方のグラフ）、採取した細胞と結合した「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩの量は、消化前にマイクロキャリア上に存在する全「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩの１～６％であった。
【0158】
幾つかの実施形態によれば、マイクロキャリアを消化する方法は、マイクロキャリアの消化中に標準的な細胞培養プロテアーゼを含み、細胞－ＥＣＭネットワークの破壊を促進し、単一細胞懸濁液を促進することができる。ペクチナーゼ／ＥＤＴＡ消化溶液にトリプシンを添加すると、採取した細胞と結合している「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩの量が減少するかどうかを決定するために、幾つかの採取条件を比較した：ペクチナーゼ／ＥＤＴＡ（ＮＳＭ ＰＥ）、トリプシン単独（ＮＳＭ トリプシン）、トリプシン／ペクチナーゼ／ＥＤＴＡ（ＮＳＭ ＴＰＥ）、及び最初に細胞がビーズから分離し始めるまではトリプシン、次にペクチナーゼ／ＥＤＴＡ（ＮＳＭ Ｔ＋ＰＥ）。次に、以前に行ったように、条件を抗「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ抗体で免疫染色し、図２０に示すように、蛍光顕微鏡を使用してサンプルを視覚化した。細胞採取プロセス中にトリプシンを使用すると、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩに対応する蛍光強度が大幅に低下した。さらには、トリプシンとそれに続くペクチナーゼ／ＥＤＴＡ溶液による前処理では、トリプシン／ペクチナーゼ／ＥＤＴＡの並行処理と比較して、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩのシグナルが少なくなった。
【0159】
さらには、図１６に示されるように、モック消化溶液を一連の遠心分離及び洗浄サイクルに曝露して、ＤＭＣ消化溶液で可溶性ＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩペプチドを検出できるかどうかを決定した。各洗浄サイクルからのサンプルの抗「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ抗体のドットブロット分析に基づいて、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩを、元の消化溶液、洗浄１、及び洗浄２で検出した（図２１）。微量の「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩが洗浄３で検出され、これは、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩの段階希釈に基づき、検出限界で、約１００ｐｇ（２０ｎｇ／ｍＬの５μＬブロット）と見なした。これらの結果により、マイクロキャリア希釈の可溶性副産物は洗浄によって除去又は低減することができ、少量の「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ（＜６％）のみが、回収された細胞と結合していることが確認される。
【0160】
消化成分が細胞増殖に与える影響
消化副産物と試薬がその後の細胞増殖に与える影響を実証するために、変性コラーゲンＤＭＣ上のベロ細胞を回収してペレット化し、消化溶液を完全に除去し、次いで、回収した消化溶液の希釈液（１：５～１：１００）を含む新鮮な培地でＴ７５フラスコに再播種した。細胞の接着及び増殖を数日間モニタした。図２２Ａに示されるように、ベロ細胞の増殖は、低希釈（１：５～１：１０）の採取溶液の存在によって大きな影響を受け、１：４０希釈までは増殖の軽度の阻害が観察された。これらの結果は、細胞増殖を阻害する成分が消化溶液中に存在していることを示唆している。ＤＭＣ上でのベロ細胞の再播種に対するペクチナーゼ及びＥＤＴＡの影響をさらに調査するため、ペクチナーゼ（１０～１００Ｕ／ｍＬの最終濃度）又はＥＤＴＡ（１～５ｍＭの最終濃度）を、溶解性マイクロキャリアを含む使い捨てスピナーフラスコにスパイクした。次に、ベロ細胞を１０，０００細胞／ｃｍ２で各スピナーフラスコに加えた。３日目に細胞を回収し、定量した。
消化副産物と試薬がその後の細胞増殖に与える影響を実証するために、変性コラーゲンＤＭＣ上のベロ細胞を回収してペレット化し、消化溶液を完全に除去し、次いで、回収した消化溶液の希釈液（１：５～１：１００）を含む新鮮な培地でＴ７５フラスコに再播種した。細胞の接着及び増殖を数日間モニタした。図２２Ａに示されるように、ベロ細胞の増殖は、低希釈（１：５～１：１０）の採取溶液の存在によって大きな影響を受け、１：４０希釈までは増殖の軽度の阻害が観察された。これらの結果は、細胞増殖を阻害する成分が消化溶液中に存在していることを示唆している。ＤＭＣ上でのベロ細胞の再播種に対するペクチナーゼ及びＥＤＴＡの影響をさらに調査するため、ペクチナーゼ（１０～１００Ｕ／ｍＬの最終濃度）又はＥＤＴＡ（１～５ｍＭの最終濃度）を、溶解性マイクロキャリアを含む使い捨てスピナーフラスコにスパイクした。次に、ベロ細胞を１０，０００細胞／ｃｍ２で各スピナーフラスコに加えた。３日目に細胞を回収し、定量した。
【0161】
図２２Ｂに示されるように、細胞培養培地にペクチナーゼが≧４０Ｕ／ｍＬの濃度で存在すると、結果的に細胞収量が減少し、細胞濃度は、最高で３０Ｕ／ｍＬまでのペクチナーゼ濃度では最小限の影響しか受けなかった（１０％未満の減少）。したがって、幾つかの実施形態によれば、消化溶液を、１：３を超えて希釈して、ペクチナーゼに起因する細胞増殖の阻害を最小限に抑えることができる。同様に、ＥＤＴＡは細胞増殖に大きい影響を及ぼし、≧２ｍＭの濃度は、ＤＭＣの完全性に影響を及ぼし、これはＤＭＣの溶解をもたらした（図２２Ｃ）。したがって、ＥＤＴＡの影響を最小限に抑えるために、幾つかの実施形態によれば、最終濃度は１ｍＭ未満でありうる。
【0162】
さらには、細胞の再播種中に塩化カルシウムを添加してもＥＤＴＡを中和することはできず、細胞を播種する前にＥＤＴＡを含む細胞懸濁液で塩化カルシウムを事前に平衡化しても、影響はごくわずかであった（データは示さず）。これらの結果に基づき、再播種する前に、遠心分離、濾過、又は灌流によって細胞からマイクロキャリア消化溶液を除去するか、又は低濃度のペクチナーゼ及びＥＤＴＡ（例えば、３０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼ、１ｍＭのＥＤＴＡ）でマイクロキャリアの溶解を最適化することが推奨されよう。
【0163】
したがって、この開示の実施形態によれば、上記によって示されるように、マイクロキャリアの溶解から生じる可溶性成分には、以下のものが含まれる：ＰＧＡモノマー／オリゴマー、カルシウム、ＥＤＴＡ、ペクチナーゼ、及び表面コーティング。これらは、一連の洗浄／遠心分離サイクルを通じて、回収された細胞から低減又は除去することができる。また、少量（１～６％）の残留ＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩコーティングが、回収された細胞と結合したままであり、これはビーズ消化中にプロテアーゼ（例えば、トリプシン）を使用することによってさらに低減することができる。さらには、マイクロキャリアの消化に用いられる残留ペクチナーゼ及びＥＤＴＡは、その後の細胞増殖に悪影響を与える可能性があるため、方法は、細胞継代又は長期保存の前に、遠心分離、濾過、又は灌流によってこれらの成分を除去又は大幅に低減することができる。
【0164】
方法
サイズ排除クロマトグラフィでは、溶解したマイクロキャリアを次のように調製した：１ｍＬの濃縮消化溶液（４００Ｕ／ｍＬのペクチナーゼ±４０ｍＭのＥＤＴＡ）を、８ｍＬのダルベッコの修正緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で希釈した、１ｍＬの充填量の水和したＤＭＣビーズ（又は、同程度の量のＰＧＡ材料を含む、１ｍＬの１．７５％ＰＧＡ溶液）に加えた。ＵＰＬＣ－ＰＤＡ Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈクラス機器を、次の設定で使用した：カラム＝４．６×１５０ｍｍ、ＢＥＨ １２５ ＳＥＣ（１．７μｍ）；カラム温度＝３０℃；流量＝０．４ｍｌ／分；移動相＝２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ５）；及び、注入＝１０μｌ。
サイズ排除クロマトグラフィでは、溶解したマイクロキャリアを次のように調製した：１ｍＬの濃縮消化溶液（４００Ｕ／ｍＬのペクチナーゼ±４０ｍＭのＥＤＴＡ）を、８ｍＬのダルベッコの修正緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で希釈した、１ｍＬの充填量の水和したＤＭＣビーズ（又は、同程度の量のＰＧＡ材料を含む、１ｍＬの１．７５％ＰＧＡ溶液）に加えた。ＵＰＬＣ－ＰＤＡ Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈクラス機器を、次の設定で使用した：カラム＝４．６×１５０ｍｍ、ＢＥＨ １２５ ＳＥＣ（１．７μｍ）；カラム温度＝３０℃；流量＝０．４ｍｌ／分；移動相＝２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ５）；及び、注入＝１０μｌ。
【0165】
質量分析では、サンプルをＳＥＣのときと同じように調製し、アセトニトリル／水混合液（１：９ｖ／ｖ）で希釈して、１：１０，０００の最終希釈を得た。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル及び水は、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）－質量分析（ＭＳ）実験を、Ａｇｉｌｅｎｔ６５６０イオンモビリティ四重極飛行時間型システムを使用して実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ社のイオンモビリティシステムは、フロントファンネル、トラッピングファンネル、ドリフトチューブ、及びヘキサポールを介してＱ－ＴＯＦ質量分析計に結合するリアファンネルで構成される。サンプルは、すべてのＥＳＩ－ＭＳ実験で、５μＬ／分の流量でＤｕａｌ ＡＪＳ（Ａｇｉｌｅｎｔジェットストリーム）イオン化源に直接注入した。動作条件は以下の通りであった：ガス温度：３００℃、乾燥ガス：７Ｌ／分、ネブライザ圧力：３５ｐｓｉ（約２４１ｋＰａ）、シースガス温度：２７５℃、シースガス流量：１２Ｌ／分、ＶＣａｐ：３５００Ｖ、及びノズル電圧：２０００Ｖ。データ取得は、５０～１７００ｍ／ｚの質量範囲で収集した。得られた質量スペクトルはすべて、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｂ．０８．００バージョンを介して蓄積及び処理した。
【0166】
誘導結合プラズマ質量分析法では、サンプルは、ＳＥＣについて行ったように調製し、クラス１，０００クリーンルーム内に配置されたＡｇｉｌｅｎｔ ７７００ｓ四重極誘導結合プラズマ質量分析計（Ｑ－ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して分析した。サンプルは、内部標準として使用したインジウムを添加した、高純度の１％ＨＮＯ３溶液を用いて希釈した。カルシウムは、反応モード（水素）でのみ測定した。ナトリウムは、ガスなしモード（アルゴンのみ）及び衝突モード（ヘリウム）で測定した。インジウムは３つのモードのすべてで測定した。必要に応じて、測定した濃度を較正曲線の線形範囲内に保つために、追加の希釈を行った。２回の測定の平均濃度を報告した。
【0167】
溶解性マイクロキャリアの副産物のクリアランス試験では、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）（ＲｏｏｓｔｅｒＢｉｏ社、カタログ番号ＭＳＣ－００１、細胞１００万個）を、１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３５－０７４－ＣＶ）と２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号２５－００５）を添加した５０ｍＬのＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号１５－０１８－ＣＭ）を含む、１２５ｍＬの使い捨てスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３１５２）内の２００ｃｍ２の「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ溶解性マイクロキャリア（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号４９８８）上で培養した。細胞を含まない二重のスピナーフラスコをモック対照として使用した。断続的な撹拌下で（３０ｒｐｍで５分間、０ｒｐｍで６時間の３サイクル；Ｗｈｅａｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ－Ｓｔｉｒ Ｐｌａｔｆｏｒｍカタログ番号Ｗ９００７０１－Ａ）マイクロキャリアに付着した細胞；３５ｒｐｍでの連続撹拌と、３日目及び５日目の半量培地交換を使用して、７日目まで細胞増殖を促進した。
【0168】
溶解したマイクロキャリアから細胞を採取するために、各スピナーフラスコの内容物を５０ｍＬのコニカルチューブに移し、ビーズを沈降させた。上清を除去し、培養物を２０ｍＬのＤＰＢＳで２回洗浄した。１×ＴｒｙｐＬＥと１：１で混合したＤＰＢＳ中の５０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼ（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｐ２６１１）／５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４６－０３４－ＣＩ）からなる消化溶液を、最終濃度が１０ｃｍ２／ｍＬになるように添加した。マイクロキャリア消化を、１０分後に顕微鏡で確認した。次に、チューブを２５９×ｇで５分間、遠心分離した。遠心分離後、上清の７５％を除去し、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（Ｌａｘｃｏ ＵＶ－ｖｉｓ、モデル番号：Ａｌｐｈａ－１１０６）で測定した。サンプルの吸光度は、希釈せずに測定するか、又は３０００μｌのＤＰＢＳ中に１００μｌ（３０×希釈）、又は３００μｌ（１０×希釈）を加えて希釈し、検出限界内で正確に測定できることを確保した。ＤＰＢＳは、希釈培地とベースラインの両方に使用した。すべてのサンプルを、２００ｎｍから５００ｎｍまでスキャンした。次に、同量のＤＰＢＳを使用して、残りの液体（モックサンプル）又は細胞ペレットを再懸濁し、再度遠心分離した。このプロセスを、合計４回のＤＰＢＳ洗浄／遠心分離ステップについて繰り返した。
【0169】
ＤＭＣ溶解後のｈＭＳＣの免疫染色では、ヒト間葉系幹細胞を、ＵＬＡ６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３４７１）の１ウェルあたり１０ｍｇの溶解性マイクロキャリアに播種し、所望の細胞密度（１５，０００～６０，０００細胞／ウェル）が達成されるまで、細胞をマイクロキャリアに接着させ、増殖させた。細胞を採取するために、マイクロキャリアを１５ｍＬのチューブに移し、使用済み培養培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した。洗浄液を廃棄し、５０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む採取溶液を各懸濁液に添加した。完全なビーズ消化が１０分後に観察された。トリプシン、ペクチナーゼ、及びＥＤＴＡを使用する細胞採取では、０．１２５％のトリプシン、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼからなる混合物２ｍＬを添加した；一方、トリプシンとのインキュベーションとそれに続くペクチナーゼ及びＥＤＴＡを用いた処理では、１ｍＬのトリプシン０．２５％を添加し、５分間インキュベートし、次に、１ｍＬの５ｍＭ ＥＤＴＡ及び５０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼをさらに５分間、反応に加えた。放出された細胞を３００×ｇで２分間ペレット化し、１ｍＬのＤＰＢＳに再懸濁した。
【0170】
細胞の固定及び免疫染色のため、細胞ペレットを５００μＬの４％ホルムアルデヒドに再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。細胞をペレット化し、ＤＰＢＳで洗浄し、２５０μｌの一次抗体溶液（ＤＰＢＳ中の抗ＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩポリクローナル抗体、１：１０００希釈）に再懸濁した。一次抗体を室温で４５分間、インキュベートした。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで洗浄し、２５０μＬの二次抗体溶液（ＤＰＢＳ中の抗ウサギＡｌｅｘａ ４８８ １：５００）に、室温、暗所で４５分間再懸濁した。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳで２回洗浄し、次に、４８８ｎｍでの蛍光顕微鏡検査のために２００μＬのＤＰＢＳに再懸濁した。あるいは、１００μＬの染色細胞（又はビーズ）を９６ウェルプレートに移し、分光光度計を使用して蛍光強度を定量した。播種されていないＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩ及び変性コラーゲンビーズを顕微鏡用の同じプロトコルを使用して染色し、次いで、残りのビーズを蛍光測定のために２ｍＬのペクチナーゼ／ＥＤＴＡ採取溶液に溶解した。
【0171】
可溶性「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩを検出するためのドットブロット分析では、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ溶解性マイクロキャリア（２５０ｍｇ）を標準プロトコルに従って水中で水和した。水を除去し、ＤＰＢＳ中、１００Ｕ／ｍＬのペクチナーゼ及び１０ｍＭのＥＤＴＡを含む３０ｍＬの消化溶液に交換した。１０分後、溶解したビーズ溶液を１２５×ｇで１０分間回転させた。上清を廃棄し、２ｍＬだけを残した。この残りの溶液を希釈し、１２ｍＬのＤＰＢＳと混合した（洗浄１）。第２の遠心分離サイクルの後、上清を除去して１ｍＬのみを残し、１３ｍＬのＤＰＢＳを加えた（洗浄２）。このシーケンスをさらに２回繰り返した。
【0172】
各洗浄液のサンプルを収集し、等量のＳＤＳ－ＰＡＧＥランニングバッファと混合し、５μＬをニトロセルロース膜上に点在させた。同様に、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩペプチドの段階希釈液を、対照として、濃度の比較のためにブロットした。ブロットしたサンプルを乾燥させた後、膜を、ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎバッファ中の５％粉乳で３０分間飽和させ、洗浄し、抗「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ抗体（ＴＢＳ Ｔｗｅｅｎで１：１０００希釈）とともに２時間インキュベートし、洗浄し、ペルオキシダーゼと結合した抗ウサギ二次抗体とともに１時間インキュベートした。最終的な洗浄の後、ＥＣＬ基質を使用して、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩペプチドを可視化した。
【0173】
消化溶液試薬の存在下でのベロ細胞の増殖のために、ベロ細胞を１２５ｍＬの使い捨てスピナーフラスコ内で、１ｃｍ２あたり１０，０００細胞で３～５日間、変性コラーゲンＤＭＣに播種した。細胞を採取し、培養物を遠心分離して採取溶液を完全に除去した。細胞を、採取溶液の希釈液（１：２から１：１００希釈まで）を含む培養培地のＴ－７５フラスコに再播種した。細胞をＴフラスコで５～６日間培養した。細胞の画像を毎日キャプチャした。接着した細胞は、ＶｉＣｅｌｌ自動セルカウンタを使用して培養期間の終わりに定量化した。
【0174】
マイクロキャリアでの細胞増殖に対するペクチナーゼ及びＥＤＴＡの効果を決定するために、ペクチナーゼ（１０～１００Ｕ／ｍＬの最終濃度）又はＥＤＴＡ（１～５ｍＭの最終濃度）を各スピナーフラスコにスパイクした後、細胞を添加した（１０，０００細胞／ｃｍ２）。細胞接着及び細胞増殖段階の間、細胞を連続的に混合した。ＤＭＣの画像を毎日キャプチャした。３日目又は５日目に細胞を採取し、定量した。
【0175】
例示的な実装形態
以下は、開示された主題の実装形態のさまざまな態様の説明である。各態様は、開示された主題のさまざまな特徴、特性、又は利点のうちの１つ以上を含みうる。実装形態は、開示された主題の幾つかの態様を説明することを意図しており、すべての可能な実装形態の包括的又は網羅的な説明と見なされるべきではない。
以下は、開示された主題の実装形態のさまざまな態様の説明である。各態様は、開示された主題のさまざまな特徴、特性、又は利点のうちの１つ以上を含みうる。実装形態は、開示された主題の幾つかの態様を説明することを意図しており、すべての可能な実装形態の包括的又は網羅的な説明と見なされるべきではない。
【0176】
態様１は、二価カチオンで架橋されたポリガラクツロン酸化合物を含む基質であって、該ポリガラクツロン酸化合物がペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択される、基質を含み、該基質が、消化試薬によって、ガラクツロン酸モノマーと二価カチオンとを含む成分へと可消化性である、細胞培養物品を対象とする。
【0177】
態様２は、基質が球状又は実質的に球状である、態様１に記載の物品を対象とする。
【0178】
態様３は、基質が１０～５００マイクロメートルの直径を含む、態様２に記載の物品を対象とする。
【0179】
態様４は、二価カチオン濃度が基質の０．５～２ｇ／ｌの範囲である、態様１から３のいずれかに記載の物品を対象とする。
【0180】
態様５は、二価カチオンが、カルシウム、マグネシウム、及びバリウムからなる群より選択される、態様４に記載の物品を対象とする。
【0181】
態様６は、基質の表面上に接着ポリマーをさらに含む、態様１から５のいずれかに記載の物品を対象とする。
【0182】
態様７は、接着ポリマーがポリペプチドを含む、態様６に記載の物品を対象とする。
【0183】
態様８は、接着ポリマーが基質の表面にグラフト又はコーティングされる、態様６又は態様７に記載の物品を対象とする。
【0184】
態様９は、ポリガラクツロン酸化合物がイオノトロピック架橋されている、態様１から８のいずれかに記載の物品を対象とする。
【0185】
態様１０は、消化試薬がＥＤＴＡ及び酵素のうちの少なくとも１つを含む、態様１から９のいずれかに記載の物品を対象とする。
【0186】
態様１１は、酵素がペクチナーゼである、態様１０に記載の物品を対象とする。
【0187】
態様１２は、基質が消化されると、接着ポリマーの少なくとも一部が可溶性になる、態様６～８のいずれかに記載の物品を対象とする。
【0188】
態様１３は、接着ポリマーの可溶性になる部分が、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である、態様１２に記載の物品を対象とする。
【0189】
態様１４は、細胞を培養する方法であって、細胞を態様１から１３のいずれかに記載の細胞培養物品を有する細胞培養培地と接触させるステップ、及び培地中で細胞を培養するステップを含む、方法を対象とする。
【0190】
態様１５は、培養細胞を採取する方法であって、態様１から１３のいずれかに記載の細胞培養物品の表面上で細胞を培養するステップ；及び、培養細胞をペクチナーゼとキレート剤との混合物と接触させて、細胞培養物品から細胞を分離するステップを含む方法を対象とする。
【0191】
態様１６は、キレート剤がＥＤＴＡを含む、態様１５に記載の方法を対象とする。
【0192】
態様１７は、溶解性基質から培養細胞を採取する方法を対象とし、該方法は、基質を（ｉ）キレート化剤、（ｉｉ）酵素、又は（ｉｉｉ）キレート化剤及び酵素に曝露することによって基質を消化することにより、基質から培養細胞を分離するステップであって、分離によって採取溶液がもたらされる、ステップ；並びに、分離後に採取溶液の成分の一連の洗浄及び／又は遠心分離サイクルを実行するステップであって、基質が、ペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物と、該ポリガラクツロン酸化合物の表面上の接着ポリマーとを含む、ステップを含む。
【0193】
態様１８は、酵素が非タンパク質分解酵素を含む、態様１７に記載の方法を対象とする。
【0194】
態様１９は、非タンパク質分解酵素がペクチン分解酵素及びペクチナーゼからなる群より選択される、態様１８に記載の方法を対象とする。
【0195】
態様２０は、溶解性基質を消化するステップが、溶解性基質を、約１Ｕ／ｍＬから約２００Ｕ／ｍＬの間の酵素、又は約１Ｕ／ｍＬから約５０Ｕ／ｍＬの間、又は約１Ｕ／ｍＬから約３０Ｕ／ｍＬの間、又は約３０Ｕ／ｍＬ未満の酵素に曝露することを含む、態様１７から１９のいずれかに記載の方法を対象とする。
【0196】
態様２１は、溶解可能な発泡足場をキレート化剤に、約１０ｍＭ未満、約９ｍＭ未満、約８ｍＭ未満、約７ｍＭ未満、約６ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、又は約１ｍＭ以下の濃度で曝露するステップを含む、態様１７から２０のいずれかに記載の方法を対象とする。
【0197】
態様２２は、キレート化剤がＥＤＴＡである、態様１７から２１のいずれかに記載の方法を対象とする。
【0198】
態様２３は、消化後、接着ポリマーの少なくとも一部が可溶性になる、態様１７から２２のいずれかに記載の方法を対象とする。
【0199】
態様２４は、接着ポリマーの可溶性になる部分が、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である、態様２３に記載の方法を対象とする。
【0200】
態様２５は、採取溶液にプロテアーゼを加えることによって接着ポリマーの不溶性部分を除去するステップをさらに含む、態様２３又は態様２４に記載の方法を対象とする。
【0201】
態様２６は、プロテアーゼがトリプシンである、態様２５に記載の方法を対象とする。
【0202】
本明細書で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、ある１つの（ａ）「二価カチオン」への言及は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、そのような「二価カチオン」を２つ以上有する例を含む。
【0203】
「含む（include,includes）」という用語は、包括的であり、排他的ではないことを意味するが、これらに限定されない。
【0204】
「任意選択的な」又は「任意選択的に」とは、後に説明する事象、状況、又は構成要素が発生してもしなくてもよく、その説明にはその事象、状況、又は構成要素が発生する場合と発生しない場合とが含まれることを意味する。
【0205】
本明細書では、範囲は、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表現することができる。このような範囲が表現される場合、例は、その１つの特定の値から及び／又は他方の特定の値までを含む。同様に、例えば先行詞「約」の使用によって、値が近似値として表される場合、その特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。さらには、範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、及び他の端点とは独立してのいずれにおいても重要であることが理解されよう。
【0206】
特に明記しない限り、本明細書に記載の任意の方法は、その工程が特定の順序で実行されることを必要とすると解釈されることは、決して意図していない。したがって、方法クレームがその工程が従うべき順序を実際に列挙していないか、又は工程が特定の順序に限定されるべきであることが特許請求の範囲又は明細書に具体的に述べられていない場合には、いかなる特定の順序も、推測されることは、決して意図していない。いずれか１つの請求項で列挙された単一又は複数の特徴又は態様は、任意の他の請求項で列挙された他の列挙された特徴又は態様と組み合わせるか、又は並べ替えることができる。
【0207】
本明細書での列挙は、特定の方法で機能するように「構成」又は「適合」されている構成要素を指すことにも留意されたい。この点で、このような構成要素は、特定の特性を具体化するか、又は特定の方法で機能するように「構成」又は「適合」され、このような列挙は、意図された使用の列挙ではなく構造的列挙である。より具体的には、構成要素が「構成」又は「適合」される方法への本明細書での言及は、構成要素の既存の物理的状態を示し、したがって、その構成要素の構造的特徴の明確な列挙として解釈されるべきである。
【0208】
特定の実施形態のさまざまな特徴、要素、又は工程は、「含む」という移行句を使用して開示されうるが、「～からなる」又は「～から実質的になる」という移行句を使用して説明されうるものを含む代替的な実施形態態が暗示されることが理解されるべきである。したがって、例えば、ペクチン酸及び水を含む親水コロイド溶液の黙示的な代替実施形態は、親水コロイド溶液がペクチン酸及び水からなる実施形態と、親水コロイド溶液が本質的にペクチン酸及び水からなる実施形態とを含む。
【0209】
本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明にかかる技術に対してさまざまな修正及び変形がなされうることは、当業者にとって明白であろう。本発明にかかる技術の精神及び本質を組み込んだ開示された実施形態の修正、組合せ、部分組合せ、及び変形は、当業者に想起されうることから、本発明にかかる技術は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内のあらゆるものを含むと解釈されるべきである。
【0210】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【0211】
実施形態１
細胞培養物品において、該物品が、
二価カチオンで架橋されたポリガラクツロン酸化合物を含む基質であって、該ポリガラクツロン酸化合物が、ペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択される、基質
を含み、
前記基質が、消化試薬によって、ガラクツロン酸モノマー及び前記二価カチオンを含む成分へと可消化性である、
物品。
細胞培養物品において、該物品が、
二価カチオンで架橋されたポリガラクツロン酸化合物を含む基質であって、該ポリガラクツロン酸化合物が、ペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択される、基質
を含み、
前記基質が、消化試薬によって、ガラクツロン酸モノマー及び前記二価カチオンを含む成分へと可消化性である、
物品。
【0212】
実施形態２
前記基質が球状であるか、又は実質的に球状である、実施形態１に記載の物品。
前記基質が球状であるか、又は実質的に球状である、実施形態１に記載の物品。
【0213】
実施形態３
前記基質が、１０～５００マイクロメートルの直径を含む、実施形態２に記載の物品。
前記基質が、１０～５００マイクロメートルの直径を含む、実施形態２に記載の物品。
【0214】
実施形態４
前記二価カチオン濃度が、前記基質の０．５～２ｇ／ｌの範囲である、実施形態１から３のいずれかに記載の物品。
前記二価カチオン濃度が、前記基質の０．５～２ｇ／ｌの範囲である、実施形態１から３のいずれかに記載の物品。
【0215】
実施形態５
前記二価カチオンが、カルシウム、マグネシウム、及びバリウムからなる群より選択される、実施形態４に記載の物品。
前記二価カチオンが、カルシウム、マグネシウム、及びバリウムからなる群より選択される、実施形態４に記載の物品。
【0216】
実施形態６
前記基質の前記表面上に接着ポリマーをさらに含む、実施形態１から５のいずれかに記載の物品。
前記基質の前記表面上に接着ポリマーをさらに含む、実施形態１から５のいずれかに記載の物品。
【0217】
実施形態７
前記接着ポリマーがポリペプチドを含む、実施形態６に記載の物品。
前記接着ポリマーがポリペプチドを含む、実施形態６に記載の物品。
【0218】
実施形態８
前記接着ポリマーが、前記基質の前記表面にグラフト又はコーティングされる、実施形態６又は７に記載の物品。
前記接着ポリマーが、前記基質の前記表面にグラフト又はコーティングされる、実施形態６又は７に記載の物品。
【0219】
実施形態９
前記ポリガラクツロン酸化合物がイオノトロピック架橋されている、実施形態１から８のいずれかに記載の物品。
前記ポリガラクツロン酸化合物がイオノトロピック架橋されている、実施形態１から８のいずれかに記載の物品。
【0220】
実施形態１０
前記消化試薬が、ＥＤＴＡ及び酵素のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１から９のいずれかに記載の物品。
前記消化試薬が、ＥＤＴＡ及び酵素のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１から９のいずれかに記載の物品。
【0221】
実施形態１１
前記酵素がペクチナーゼである、実施形態１０に記載の物品。
前記酵素がペクチナーゼである、実施形態１０に記載の物品。
【0222】
実施形態１２
前記基質が消化されると、前記接着ポリマーの少なくとも一部が可溶性になる、実施形態６から８のいずれかに記載の物品。
前記基質が消化されると、前記接着ポリマーの少なくとも一部が可溶性になる、実施形態６から８のいずれかに記載の物品。
【0223】
実施形態１３
前記接着ポリマーの前記可溶性になる部分が、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である、実施形態１２に記載の物品。
前記接着ポリマーの前記可溶性になる部分が、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である、実施形態１２に記載の物品。
【0224】
実施形態１４
細胞を培養する方法であって、細胞を実施形態１から１３のいずれかに記載の細胞培養物品を有する細胞培養培地と接触させるステップ、及び前記培地中で前記細胞を培養するステップを含む、方法。
細胞を培養する方法であって、細胞を実施形態１から１３のいずれかに記載の細胞培養物品を有する細胞培養培地と接触させるステップ、及び前記培地中で前記細胞を培養するステップを含む、方法。
【0225】
実施形態１５
培養細胞を採取する方法において、該方法が、
実施形態１から１３のいずれかに記載の細胞培養物品の前記表面上で細胞を培養するステップ；及び
前記培養細胞をペクチナーゼとキレート剤との混合物と接触させて、前記細胞培養物品から前記細胞を分離するステップ
を含む、方法。
培養細胞を採取する方法において、該方法が、
実施形態１から１３のいずれかに記載の細胞培養物品の前記表面上で細胞を培養するステップ；及び
前記培養細胞をペクチナーゼとキレート剤との混合物と接触させて、前記細胞培養物品から前記細胞を分離するステップ
を含む、方法。
【0226】
実施形態１６
前記キレート剤がＥＤＴＡを含む、実施形態１５に記載の方法。
前記キレート剤がＥＤＴＡを含む、実施形態１５に記載の方法。
【0227】
実施形態１７
溶解性基質から培養細胞を採取する方法において、該方法が、
前記基質を（ｉ）キレート化剤、（ｉｉ）酵素、又は（ｉｉｉ）キレート化剤及び酵素に曝露することによって前記基質を消化することにより、前記基質から前記培養細胞を分離するステップであって、前記分離によって採取溶液がもたらされる、ステップ；及び
前記分離するステップの後に、採取溶液の成分の一連の洗浄及び／又は遠心分離サイクルを実行するステップ
を含み、
前記基質が、ペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物と、該ポリガラクツロン酸化合物の前記表面上の接着ポリマーとを含む、
方法。
溶解性基質から培養細胞を採取する方法において、該方法が、
前記基質を（ｉ）キレート化剤、（ｉｉ）酵素、又は（ｉｉｉ）キレート化剤及び酵素に曝露することによって前記基質を消化することにより、前記基質から前記培養細胞を分離するステップであって、前記分離によって採取溶液がもたらされる、ステップ；及び
前記分離するステップの後に、採取溶液の成分の一連の洗浄及び／又は遠心分離サイクルを実行するステップ
を含み、
前記基質が、ペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物と、該ポリガラクツロン酸化合物の前記表面上の接着ポリマーとを含む、
方法。
【0228】
実施形態１８
前記酵素が非タンパク質分解酵素を含む、実施形態１７に記載の方法。
前記酵素が非タンパク質分解酵素を含む、実施形態１７に記載の方法。
【0229】
実施形態１９
前記非タンパク質分解酵素が、ペクチン分解酵素及びペクチナーゼからなる群より選択される、実施形態１８に記載の方法。
前記非タンパク質分解酵素が、ペクチン分解酵素及びペクチナーゼからなる群より選択される、実施形態１８に記載の方法。
【0230】
実施形態２０
前記溶解性基質を消化するステップが、前記溶解性基質を、約１Ｕ／ｍＬから約２００Ｕ／ｍＬの間の前記酵素、又は約１Ｕ／ｍＬから約５０Ｕ／ｍＬの間、又は約１Ｕ／ｍＬから約３０Ｕ／ｍＬの間、又は約３０Ｕ／ｍＬ未満の前記酵素に曝露することを含む、実施形態１７から１９のいずれかに記載の方法。
前記溶解性基質を消化するステップが、前記溶解性基質を、約１Ｕ／ｍＬから約２００Ｕ／ｍＬの間の前記酵素、又は約１Ｕ／ｍＬから約５０Ｕ／ｍＬの間、又は約１Ｕ／ｍＬから約３０Ｕ／ｍＬの間、又は約３０Ｕ／ｍＬ未満の前記酵素に曝露することを含む、実施形態１７から１９のいずれかに記載の方法。
【0231】
実施形態２１
前記溶解可能な発泡足場を前記キレート化剤に、約１０ｍＭ未満、約９ｍＭ未満、約８ｍＭ未満、約７ｍＭ未満、約６ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、又は約１ｍＭ以下の濃度での濃度で曝露するステップを含む、実施形態１７から２０のいずれかに記載の方法。
前記溶解可能な発泡足場を前記キレート化剤に、約１０ｍＭ未満、約９ｍＭ未満、約８ｍＭ未満、約７ｍＭ未満、約６ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３ｍＭ未満、約２ｍＭ未満、又は約１ｍＭ以下の濃度での濃度で曝露するステップを含む、実施形態１７から２０のいずれかに記載の方法。
【0232】
実施形態２２
前記キレート化剤がＥＤＴＡである、実施形態１７から２１のいずれかに記載の方法。
前記キレート化剤がＥＤＴＡである、実施形態１７から２１のいずれかに記載の方法。
【0233】
実施形態２３
消化後、前記接着ポリマーの少なくとも一部が可溶性になる、実施形態１７から２２のいずれかに記載の方法。
消化後、前記接着ポリマーの少なくとも一部が可溶性になる、実施形態１７から２２のいずれかに記載の方法。
【0234】
実施形態２４
前記接着ポリマーの前記可溶性になる部分が、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である、実施形態２３に記載の方法。
前記接着ポリマーの前記可溶性になる部分が、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である、実施形態２３に記載の方法。
【0235】
実施形態２５
前記採取溶液にプロテアーゼを加えることによって、前記接着ポリマーの不溶性部分を除去するステップをさらに含む、実施形態２３又は２４に記載の方法。
前記採取溶液にプロテアーゼを加えることによって、前記接着ポリマーの不溶性部分を除去するステップをさらに含む、実施形態２３又は２４に記載の方法。
【0236】
実施形態２６
前記プロテアーゼがトリプシンである、実施形態２５に記載の方法。
前記プロテアーゼがトリプシンである、実施形態２５に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図22C】