特許 7588466 パルボウイルスの生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-14

(45)【発行日】2024-11-22

(54)【発明の名称】パルボウイルスの生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/00 20060101AFI20241115BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALI20241115BHJP

【ＦＩ】

C12N7/00

C12Q1/70

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2020008613

(22)【出願日】2020-01-22

(65)【公開番号】P2021114907

(43)【公開日】2021-08-10

【審査請求日】2022-10-18

(73)【特許権者】

【識別番号】507365204

【氏名又は名称】旭化成メディカル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】柳田 恒一郎

(72)【発明者】

【氏名】粥川 太貴

【審査官】田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１４／０８０６７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５２３９９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／１２８６８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許第０５６８８６７６（ＵＳ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５２３１７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５１９２２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５１８１６４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１）パルボウイルス含有液を、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心に適用する工程と、
２）パルボウイルスを含む画分を回収する工程を含み、
パルボウイルスがマウス微小ウイルスであり、 前記密度勾配超遠心における密度勾配が、段階的（ステップグラジエント）密度勾配であり、
前記密度勾配液が、４０％以下のスクロース溶液層及び５０％以上のスクロース溶液層を少なくとも含む段階的密度勾配液であり、
前記密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）が１，５００，０００～７，０００，０００（ｈ×ｇ）である、単分散化されたパルボウイルスを製造する方法。

【請求項2】

パルボウイルス含有液が、パルボウイルスに感染した細胞の培養上清及び／又は当該細胞の破砕物である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

単分散化されたパルボウイルスを３５ｎｍの孔径を持つ膜で濾過した場合の対数除去率ＬＲＶが１．０未満である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記密度勾配液が、４０％スクロース溶液層及び６０％スクロース溶液層を含む段階的密度勾配液である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記密度勾配液が、１５％スクロース溶液層、３０％スクロース溶液層、４５％スクロース溶液層、及び６０％スクロース溶液層を含む段階的密度勾配液である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記パルボウイルスを含む画分の溶媒を交換する工程をさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

パルボウイルスの回収率が５０％以上である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記密度勾配液が、６０％以上のスクロース溶液層及び３０％を超え、６０％未満のスクロース溶液層を少なくとも含む段階的密度勾配液である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

パルボウイルス含有液を有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心に適用し、単分散化されたパルボウイルスを取得する工程と、
前記単分散化されたパルボウイルスをタンパク質含有溶液に添加する工程と、
前記タンパク質含有液をウイルス除去膜で濾過する工程と、
濾過前後の前記タンパク質含有液におけるウイルス量を定量する工程を含む、
を含み、
パルボウイルスがマウス微小ウイルスであり、
前記密度勾配超遠心における密度勾配が、段階的（ステップグラジエント）密度勾配であり、
前記密度勾配液が、４０％以下のスクロース溶液層及び５０％以上のスクロース溶液層を少なくとも含む段階的密度勾配液であり、
前記密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）が１，５００，０００～７，０００，０００（ｈ×ｇ）である、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を評価する方法。

【請求項10】

前記密度勾配液が、６０％以上のスクロース溶液層及び３０％を超え、６０％未満のスクロース溶液層を少なくとも含む段階的密度勾配液である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ウイルス量が、プラーク法又はＴＤＩＤ５０法によって測定されるウイルス力価である、請求項９又は１０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、単分散化されたパルボウイルスの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ウイルスはヒトを含め多くの動植物や微生物に感染して増幅する。ウイルスにはゲノムとしてＤＮＡを有するものとＲＮＡを有するものが存在し、それぞれに異なる増幅機構を有する。ウイルスはそれ単独で増えることはできず、動物、植物又は微生物の細胞に感染して、その細胞の機能を利用して自らを複製することができる。

【0003】

主なウイルスの一つにパルボウイルスがある。パルボウイルス科のウイルスは、いずれも４～６ｋｂ一本鎖ＤＮＡを持つウイルスであり、ウイルス粒子の直径は１８～２２ｎｍで、生二十面体をしており、エンベロープを持たず、エーテル、クロロホルム、熱等に耐性を有する（非特許文献１）。

【0004】

パルボウイルス科のウイルスは、パルボウイルス亜科とデンソウイルス亜科に分けられる。パルボウイルス亜科のウイルスは、複数の属に分類される。遺伝子治療に利用されるアデノ随伴ウイルスなどからなるディペンドウイルス属、ヒトに感染しリンゴ病を引き起こすＢ１９などからなるエリスロウイルス属、そしてイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）などからなるパルボウイルス属などがある。

【0005】

パルボウイルスは製薬業界において重要視されるウイルスである。遺伝子組換え製剤（バイオ医薬品）や抗体医薬などの生物由来の医薬品は、製剤がウイルスに汚染されていないこと（ウイルス安全性）を保証するために、製造工程のウイルスクリアランス（除去性能）を評価しバリデーションする必要がある。バイオ医薬品等のウイルス安全性に関する研究文献においても、細胞・組織加工製品に混入する可能性のあるウイルスとして、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）が挙げられている（非特許文献２）。

【0006】

そのため、医薬品製造の各工程前の段階の中間製造品にＭＶＭを添加して、工程前後のウイルス量を定量することにより、個々の工程のウイルスクリアランスの測定が行われる。その際、１０⁷単位又は１０⁸単位以上のウイルスを準備することが必要な場合がある。さらに、実際には一つの試験について同一条件を複数回繰り返す必要があるため、１０⁷単位又は１０⁸単位の何倍ものウイルスの準備が必要となる。このように、バイオ医薬品のウイルスクリアランス試験を行うためには、大量のウイルス溶液が必要とされる。

【0007】

パルボウイルスを生産する方法としては、宿主細胞を培養し、ウイルスを感染させて培養し、回収したウイルスを精製する方法が知られている。マウス微小ウイルスの宿主細胞としては、Ａ９細胞や３２４Ｋ細胞（シミアンウイルス４０で形質転換されたヒト線維芽細胞、ＮＢ３２４Ｋと表記される場合もある）が知られている（特許文献１～３、非特許文献３）。培養上清に１０⁸ ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ以上の高感染価のマウス微小ウイルスを生産させる方法も知られている（特許文献２、４）。

【0008】

回収したウイルスは、力価が十分高ければ、濃縮などの精製を必要とせずに、低速遠心や除菌膜濾過（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）のみでウイルスクリアランス試験に使用することができる（特許文献２、特許文献４）。また、濃縮・精製を行ってウイルスの感染価を高めたり不純物濃度を下げたりする方法も知られている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】米国特許出願公開第２０１２／００８８２２８号明細書

【文献】国際公開第２０１７／０７７８０４Ａ１号公報

【文献】国際公開第２０１１／１３０１１９Ａ２号公報

【文献】国際公開第２０１４／０８０６７６Ａ１号公報

【非特許文献】

【0010】

【文献】Ｔ．Ｗ． Ｔｉｎｓｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｆ． Ｌｏｎｇｗｏｒｔｈ． （１９７３） Ｊ． ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．（２０）， ７１－５． ｐｐ．７－１５．”Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ”

【文献】Ｔ． Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ．ａｌ． （２０１３） Ｂｕｌｌ． Ｎａｔｌ． Ｉｎｓｔ． Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉ． １３１． ｐｐ．７－１５．

【文献】Ｓｕｓａｎｎｅ Ｉ． Ｌａｎｇ ｅｔ． ａｌ． （２００５） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ，Ｖｏｌ．７９．，Ｎｏ．１． ｐｐ． ２８９－２９８

【文献】ウイルス実験学各論、丸善出版、国立衛生研究所学友会編． ｐｐ２２－２３

【文献】Ｍ．Ｓ．Ｃｏｌｌｅｔｔ ｅｔ． ａｌ． （１９８３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ｐｐ．８４２－８５４．

【文献】Ｂ－Ｗ． Ｋｏｎｇ ｅｔ．ａｌ． （２００８） Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ４４： ９７－９９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明が解決しようとする課題は、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を正確に評価することのできるパルボウイルスを製造する方法を提供すること等にある。また、別の課題は、会合状態にあるパルボウイルスを単分散化する方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0012】

生物製剤の製造におけるウイルス除去工程として、粒子サイズのふるい効果に基づいた分離機構（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を有する膜分離工程を導入する場合、ウイルス除去膜のパルボウイルスのクリアンス能力を評価することになる。本発明者らは、使用するウイルスによっては会合状態で存在し、そのような会合状態にあるウイルスをウイルスクリアランス試験において使用すると、本来ウイルス除去膜を通るはずのウイルスがウイルス除去膜に捕捉されてしまい、ウイルス除去性能を過剰評価（過大評価）してしまうリスクがあるという問題点を見出した。これは、ウイルスが会合状態で存在するとウイルスの実質的なサイズが一分子のサイズよりも大きくなるためである。

【0013】

本発明者らは上記問題点を初めて見出し、当該問題点への気づきをきっかけに鋭意検討を行った結果、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心にウイルスを適用することにより単分散化されたウイルスを取得することを可能とした。そしてウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能評価試験において当該単分散化されたウイルスを使用することにより、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能の評価を従来よりも正確にすることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0014】

従来公知のパルボウイルスの生産方法や精製方法は、パルボウイルスの感染価を高くすることや不純物濃度を低くすることに目的が置かれており、ウイルス粒子の分散状態に関して全く着目しておらず、単分散状態にあるウイルスの取得方法は全く知られていない。また、実際にウイルス分散性に関し、パルボウイルス懸濁液を０．１μｍ膜で濾過して、通過するかどうかを確認することで検証されているケースもある（特許文献１）。しかし、パルボウイルスの一分子（ｏｎｅ ｖｉｒｉｏｎ）の大きさは１８～２２ｎｍであり（非特許文献１）、二分子が会合した３６～４４ｎｍサイズの会合体や、三分子又は四分子が会合した凝集体でも０．１μｍ膜を通過する。そのため、０．１μｍ膜による濾過を用いた検証はパルボウイルスの凝集状態の確認には不十分であり、凝集状態が確認できているとは言えない。０．１μｍ膜で濾過したウイルス懸濁液をウイルスクリアランス試験に使用した場合、これらの会合体を含んでいる可能性が否定できず、サイズ分離膜の評価で過大評価をしてしまうリスクがある。

【0015】

すなわち、本発明としては以下が挙げられる。
［１］１）パルボウイルス含有液を、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心に適用する工程と、２）パルボウイルスを含む画分を回収する工程を含む、単分散化されたパルボウイルスを製造する方法。
［２－１］パルボウイルス含有液が、パルボウイルスの培養液である、前記［１］に記載の方法。
［２－２］パルボウイルスの培養液が、パルボウイルスの感染細胞を培養した培養上清及び／又は感染細胞破砕物である、前記［２－１］に記載の方法。
［３］単分散化されたパルボウイルスを３５ｎｍの孔径を持つ膜で濾過した場合の対数除去率ＬＲＶが１．０未満である、前記［１］～［２－２］のいずれかに記載の方法。
なお、上記［１］～［２－２］のように引用するが範囲で示され、その範囲内に〔２－１〕等の枝番号を有する項が配置されている場合には、〔２－１〕等の枝番号を有する項も引用されることを意味する。以下においても同様である。
［４］前記密度勾配超遠心における密度勾配が、段階的（ステップグラジエント）密度勾配である、前記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記密度勾配液がスクロースを含む、前記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記有機物媒体含有液が、４０％以下のスクロース溶液層及び４０％を超えるスクロース溶液層を少なくとも含む段階的密度勾配液である前記［５］に記載の方法。
［７］前記有機物媒体含有液が、４０％スクロース溶液層及び６０％スクロース溶液層を含む段階的密度勾配液である、前記［４］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記有機物媒体含有液が、１５％スクロース溶液層、３０％スクロース溶液層、４５％スクロース溶液層、及び６０％スクロース溶液層を含む段階的密度勾配液である、前記［４］～［６］のいずれかに記載の方法。
［９］前記密度勾配が、連続的密度勾配である、前記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［１０－１］前記密度勾配液が、段階的（ステップグラジエント）に重層した溶液を１２～２４時間静置することによって準備される連続的密度勾配液である、前記［９］に記載の方法。
［１０－２］前記密度勾配液が、段階的（ステップグラジエント）に重層した溶液を１４～１８時間静置することによって準備される連続的密度勾配液である、前記［９］に記載の方法。
［１１］前記段階的に重層した溶液が、４０％以下のスクロース溶液層及び４０％を超えるスクロース溶液層を少なくとも含む溶液である、前記［９］～［１０－２］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記段階的に重層した溶液が、１５％スクロース溶液層、３０％スクロース溶液層、４５％スクロース溶液層、及び６０％スクロース溶液層を含む、前記［９］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３－１］前記密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）が２０，０００～３００，０００（ｈ×ｇ）である、前記［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１３－２］前記密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）が１９７４１００（ｈ×ｇ）である、前記［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３－３］前記密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）が１０３９００（ｇ）× １９（ｈ）である、前記［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記パルボウイルスを含む画分の溶媒を交換する工程をさらに含む、前記［１］～［１３－３］のいずれかに記載の方法。
［１５］パルボウイルスの回収率が５０％以上である、前記［１］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］パルボウイルスがマウス微小ウイルスである、前記［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７－１］単分散化されたパルボウイルスをタンパク質含有溶液に添加する工程を含む、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を評価する方法。
［１７－２］前記［１］～［１６］のいずれかに記載の方法により単分散化されたパルボウイルスをタンパク質含有溶液に添加する工程を含む、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を評価する方法。
［１８］パルボウイルス含有液を有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心に適用し、単分散化されたパルボウイルスを取得する工程、及び
前記単分散化されたパルボウイルス含有液をタンパク質含有溶液に添加する工程
を含む、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を評価する方法。
［１９］前記単分散化されたパルボウイルス含有液が添加されたタンパク質含有溶液をウイルス除去膜に供する工程をさらに含む、前記［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］ウイルスの除去又は不活化を評価する工程をさらに含む、前記［１７－１］～［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］前記［１］から［１５］に記載の特徴を有する、前記［１７－１］～［２０］のいずれかに記載の方法。

【発明の効果】

【0016】

本発明により、単分散化されたパルボウイルスを製造することが可能となる。これにより、パルボウイルスを用いたウイルス除去膜のウイルスクリアランス試験において、ウイルス除去膜のウイルス分離性能を過大評価することなく、従来よりも正確に評価することが可能となる。ウイルス除去膜のウイルスクリアランスを正確に評価できることは、生物製剤の安全性担保をより正しく行うことができる点で有利である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明を実施するための形態（以下、「実施形態」と言うことがある）について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施できる。また、以下に示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための方法等を例示するものであって、これらの例示に限定されるものではない。

【0018】

一つの実施形態において、パルボウイルスは、アデノ随伴ウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、又はマウス微小ウイルス（ＭＶＭ）が例示される。好ましいパルボウイルスの例として、マウス微小ウイルスが例示される。マウス微小ウイルスは、パルボウイルス科、その中のパルボウイルス亜科におけるパルボウイルス属に属するウイルスである。マウス微小ウイルスはＭＶＭ（Ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ）又はＭＭＶ（Ｍｉｃｅ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ）と呼ばれることもある。

【0019】

一つの実施形態において、単分散化の対象とされるパルボウイルスは、会合状態にあればよい。パルボウイルスを感染させた宿主細胞を培地で培養した結果得られる、パルボウイルスの培養液も、パルボウイルス含有液の一つとして例示される。パルボウイルスは、宿主細胞に感染した状態で存在していてもよいし、パルボウイルス含有液（例えばパルボウイルスの培養液）中に遊離した状態で存在していてもよい。パルボウイルス含有液は、宿主細胞にパルボウイルスを感染させて培養することにより得られた培養物の培養上清及び／又は感染した細胞の破砕物（以下、単に「感染細胞破砕物」ともいう）であってもよい。「培養上清」としては、感染培養後の培地が例示される。「感染細胞破砕物」としては、感染培養後の細胞を凍結融解やホモジェナイズによって破砕した、いわゆるライゼートが例示される。

【0020】

凍結融解やホモジェナイズは、細胞と培養上清を一緒にして行うこともできるし、培養上清を分離した後に、適切な液体（新鮮培地、ＰＢＳなどの緩衝液など）を細胞に加えて行うこともできる。
凍結融解による細胞破壊は周知の方法である（非特許文献４、非特許文献６）。凍結と融解を交互に３～６回繰り返せばよい。通常は５回の凍結融解で十分に細胞は破壊され、内部のウイルスを回収することができる。また、細胞のホモジェナイズもすでに汎用的な方法であり、既知の方法（非特許文献４等）で細胞を破壊すれば、内部のウイルスを回収できる。あるいは、純水を加えて行う浸透圧により細胞破壊することによっても、細胞内部のウイルスを抽出することができる（非特許文献６）。

【0021】

パルボウイルス含有液に含まれる不純物量を減らし、精製効率を上げる観点から、不純物の少ない培養上清から精製することが好ましい。さらに、不純物量をより少なくするために、培地は血清を含まない無血清培地であることが好ましい。

【0022】

一つの実施形態において、培養液は、パルボウイルスが感染した宿主細胞を培養可能なものであれば特に限定されないが、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ培地、又はＦ－１２培地を含む液が例示される。

【0023】

一つの実施形態において、パルボウイルス含有液は、パルボウイルスを含有する液であれば特に限定されないが、溶液、懸濁液、又はゲル状液が例示され、溶液が好ましい態様として例示される。溶液の例として、パルボウイルスの培養液が挙げられる。

【0024】

一つの実施形態において、パルボウイルス含有液のｐＨとしては、パルボウイルスを培養できるｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨの下限値として５以上、６以上、７以上が例示される。ｐＨの上限値としては、１０以下、９以下、８以下が例示される。

【0025】

一つの実施形態において、パルボウイルス含有液の血清含有量としては、０％、３％、５％、１０％が例示される。

【0026】

一つの実施形態において、パルボウイルス含有液が含有する血清としては、ＦＢＳ（牛胎児血清）、ＦＣＳ（仔牛血清）が例示される。

【0027】

一つの実施形態において、パルボウイルス含有液中のウイルス濃度としては、密度勾配超遠心により単分散化されたウイルスを取得できるウイルス濃度であれば特に限定されないが、上限として１０¹²単位／ｍＬ以下、１０¹¹単位／ｍＬ以下、１０¹⁰単位／ｍＬ以下、又は１０⁹単位／ｍＬ以下が例示される。下限として、１０⁶単位／ｍＬ以上、１０⁷単位／ｍＬ以上、又は１０⁸単位／ｍＬ以上が例示される。

【0028】

一つの実施形態において、密度勾配超遠心に使用される有機性の密度勾配液の溶質としては、密度勾配超遠心により単分散化されたパルボウイルスを取得できる有機性の密度勾配液であれば特に限定されないが、スクロース（ショ糖）又はイオジキサノールが例示され、スクロース（ショ糖）が好ましい態様として例示される。

【0029】

一つの実施形態において、有機性の密度勾配液の溶媒としては、前記有機性の密度勾配液の溶質を溶解できる液体であれば特に限定されないが、ＴＮＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ－ＥＤＴＡ緩衝液）、ＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液）、又はＰＢＳ緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）であることが例示され、ＴＮＥ緩衝液であることが好ましい。

【0030】

一つの実施形態において、有機性の密度勾配液のｐＨとしては、密度勾配超遠心により単分散化されたウイルスを限定できるｐＨであれば特に限定されないが、ｐＨの下限値として５．０以上、５．５以上、６．０以上、６．５以上、７．０以上が例示される。ｐＨの上限値としては、９．０以下、８．５以下、８．０以下、７．５以下が例示される。

【0031】

一つの実施形態において、単分散化された状態（単に「単分散化」ともいう）とは、ウイルスが会合（凝集）していない状態をいう。具体的には、本実施形態における単分散化とは、ウイルスを３５ｎｍの孔径を持つ膜で濾過した際に、対数除去率（Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｖａｌｕｅ：ＬＲＶ）が１．０未満になることが例示される。会合状態とは、パルボウイルス同士が結合し、３５ｎｍの孔径を持つ膜で濾過した際のＬＲＶが１．０以上になる状態が例示される。会合状態は凝集状態と呼ばれることもある。単分散化したウイルスのサイズは、そのウイルスとして通常認識されているウイルスサイズとなる。そのため、ウイルスの単分散化は、ウイルスが会合することによってウイルスサイズが大きくなった結果、ウイルス除去膜のウイルスクリアランスが過大評価されるのを防ぐことができる。

【0032】

ＬＲＶは以下の通り算出することができる。
ＬＲＶ＝｛濾過前のウイルス感染価（ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ］）｝－｛濾過後のウイルス感染価（ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ］）｝

【0033】

感染価は、ウイルスの量（濃度）を表記する単位である。感染価の測定方法には、最小感染単位を決定する終末点（Ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）方式と、ウイルスによって形成される局所病巣算定方式がある。終末点方式としては、ウイルスを段階希釈して、一定数以上の培養細胞に接種し、一定期間培養して、感染の陽性／陰性を判定することで、５０％感染陽性となる希釈倍率を求める、５０％感染終末点（ＴＣＩＤ₅₀： Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ５０）法が一般的である。局所病巣算定方式としては、宿主細胞の単層培養上にウイルスを接種し、ウイルス吸着を行わせたあと、寒天を含む培地を重層して固まらせ、接種したウイルスの数だけ形成されるプラークを測定する、プラーク法がある。プラーク法を行った場合は、前述のＬＲＶの算出式の感染価の単位は、ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ］の代わりにｌｏｇ₁₀［ｐｆｕ／ｍＬ］となる。ｐｆｕはｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（プラーク形成単位）の略である。

【0034】

一つの実施形態において、パルボウイルス含有液としては、パルボウイルスが単分散状態で存在することができる液であれば特に限定されないが、溶液、懸濁液、又はゲル状液が例示され、溶液が好ましい態様として例示される。当該溶液としては、ＰＢＳ緩衝液、ＴＮＥ緩衝液、又はＴＥ緩衝液が例示される。

【0035】

一つの実施形態において、パルボウイルス含有液のｐＨとしては、パルボウイルスが単分散状態で存在することができる液であれば特に限定されないが、ｐＨの下限値として５以上、６以上、７以上が例示される。ｐＨの上限値としては、１０以下、９以下、８以下が例示される。

【0036】

一つの実施形態において、パルボウイルス含有液の組成は、有機性の密度勾配液を含有する、ｐＨ７～８の範囲のＰＢＳ緩衝液が例示される。

【0037】

一つの実施形態において、パルボウイルスは例えば以下の通り製造することができる。
まず、パルボウイルスの（非感染の）宿主細胞を培養する。宿主細胞としては、パルボウイルスが感染して増幅する細胞であれば特に限定されないが、マウス線維芽細胞Ａ９、シミアンウイルス４０形質転換ヒト線維芽細胞（３２４Ｋ細胞、ＮＢ３２４Ｋ細胞等）、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などを使用することができる。

【0038】

一つの実施形態において、宿主細胞の培養方法としては、培養フラスコを用いる方法、マイクロキャリアに固定して攪拌培養する方法、ローラーボトルを用いる方法、又はバイオリアクターを用いる方法が例示される。

【0039】

一つの実施形態において、培養フラスコは、市販の、例えばファルコン社製の組織培養用フラスコや、マルチウェルプレートが例示される。

【0040】

一つの実施形態において、マイクロキャリアは、市販の、例えばＧＥヘルスケア社製のＣｙｔｏｄｅｘ、Ｃｙｔｏｐｏｒｅが例示される。

【0041】

一つの実施形態において、ローラーボトルは、市販の、例えばＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社製のＣＥＬＬＭＡＳＴＥＲ細胞培養ローラーボトルが例示される。

【0042】

いずれの培養方法においても、培養温度は、哺乳類動物細胞培養に汎用的に適用される３３℃～３９℃が例示され、特に３７℃が好ましい。培地のｐＨは、哺乳類動物細胞培養に汎用的に適用される７～８が好ましい。培地の濃度は、宿主細胞と等張圧となる（浸透圧が等しくなる）濃度が好ましい。

【0043】

一つの実施形態において、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＣＤ培地、ＳＦＭ培地、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＭＦ培地、Ｖｉｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｌａｔｆｏｒｍ 培地（ＳＦＭ４Ｍｅｇａ Ｖｉｒ培地、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｘｐｒｅｓｓ培地、ＣＤＭ４Ａｖｉａｎ培地）等が例示される。これらの培地は、ギブコ社、サーモフィッシャー社、ＧＥヘルスケア社等から入手することができる。

【0044】

パルボウイルス含有液中のパルボウイルス以外の不純物量をより少なくするために、培地は血清を含まない無血清培地であることが望ましい。ウイルスの効率的な増幅は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの血清を含む培地で培養することにより達成することができる。また、特許文献２に記載の方法などにより、回収する２４時間以上前に、培養培地を、血清含有培地から無血清培地に交換しておくことで、血清由来の不純物を含まない培地中にウイルスを生産させて回収することができる。次工程の密度勾配超遠心の前に、パルボウイルス含有液中に存在する細胞の破片などの大きな粒子系の夾雑物を除去するために、低速遠心と除菌膜濾過を行うこともできる。低速遠心は、ウイルスが沈殿しないが細胞の破片が沈殿する重力加速度を選択して実施することができる。例えば３，０００ｒｐｍ×２０分の遠心分離や、１２，０００ｇ×３０分の遠心分離（非特許文献５）が行われるが、これらの条件に限定されない。また、除菌膜濾過は、孔径０．４５μｍ、０．２２μｍ又は０．１μｍの膜を使用することができる。これらの孔径を有する膜として、サーモフィッシャー社製ボトルトップフィルター（０．４５μｍ）、サーモフィッシャー社製ボトルトップフィルター（０．２２μｍ）、Ｍｅｒｃｋ社製マイレクス（０．２２μｍ、０．４５μｍ）、Ｍｅｒｃｋ社製ステリベクス（０．２２μｍ、０．４５μｍ）、又はザルトリウス社製ミニザルト（０．２μｍ）等が挙げられる。

【0045】

続いて、培養した非感染状態の宿主細胞にパルボウイルスのシードを感染させる。シードウイルスは、ＡＴＣＣなどから購入したウイルスを、本願明細書に記載する方法等で増やした後にクライオチューブ等に小分けし、－８０℃で凍結保存しておいたものを使用できる。購入するシードウイルスの例として、ウイルスがＰＰＶならばＶＲ－７４２（ＡＴＣＣ）、ＭＶＭならばＶＲ－１３４６（ＡＴＣＣ）が例示される。

【0046】

続いて、培養上清を回収する。培養上清を回収するまでの培養時間は、ウイルスが十分に増幅する時間をかける。培養上清中及び細胞内のウイルス量を毎日測定し、最も好ましい時間を設定すればよい。細胞内のウイルス量を測定するには、培養上清を除去したあとに、細胞を３～５回の凍結融解で破砕して感染価を測定すればよい。ウイルス感染から、回収までの培養時間としては５日～１４日が例示される。

【0047】

パルボウイルスが十分に増幅するのに十分な時間培養した培養上清中にはパルボウイルスが含まれている。しかしながら、パルボウイルスが培養上清中に放出されずに感染宿主細胞内にとどまっている場合、感染宿主細胞を培養容器ごと３～５回凍結融解することで細胞を破砕し、細胞外に出てきたウイルスを回収することができる。凍結融解は、培養器材に培地が入った状態のまま行うこともでき、また、培地をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）やＴＮＥ（トリス緩衝液＋ＮａＣｌ＋ＥＤＴＡ）などの緩衝液に交換して行うこともできる。以上の方法で、パルボウイルス含有液を得ることができる。

【0048】

続いて、前記得られたパルボウイルス含有液を密度勾配超遠心に適用する。密度勾配超遠心は、汎用的に使用されている超遠心の一つの方法である。超遠心とは、通常の遠心機よりも大きな重力で遠心することにより、通常の遠心では沈殿しないウイルスのような微粒子をも沈殿させることができる。このとき、遠心チューブ内の液体密度がウイルスよりも高いと、ウイルスは底面まで沈殿せず、その液体の上で沈降が止まる。遠心チューブ内にウイルスより密度が高い液体と密度が低い液体とを重層しておくと、ウイルスは密度の低い液体は通過して沈降するが、ウイルスより密度の高い液体内へは沈降できない。このように、密度勾配がかかった状態で超遠心することで、含まれる物質が密度によって異なる位置にとどまるようになる。この方法を密度勾配超遠心という。

【0049】

超遠心でかける力は、地球の重力ｇに対して何倍の力かという指標であらわされる。その指標として、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｏｒｃｅの略でＲＣＦ（相対遠心力）を表記する。

【0050】

一つの実施形態において、密度勾配超遠心は、例えば以下の通り実施することができる。
最初に、濃度の異なる有機性の密度勾配液を準備する。それを、超遠心チューブに、密度の大きい溶液の上に軽い溶液が層をなすように重層する。このとき、軽い液を先に添加し、その下方にシリンジやピペットなどで重い液を注入してもよいし、重い液を先に添加し、その上部に軽い液を乗せてもよい。次に、重層された有機性の密度勾配液の上に、パルボウイルス含有液を重層する。その後、超遠心機にかける。超遠心により、最後に重層したパルボウイルス含有液中の成分が、密度に応じて、有機性の密度勾配液の中で層状に分離した状態になる。超遠心機からチューブを取り出して、チューブの上層から下層にかけて液を分画採取する。分画採取の方法は、上面から一定量ずつピペットで吸い出す方法と、チューブ側面に注射器の針をさして、所定の部分だけを吸い出す方法と、チューブ底面に針で穴をあけて、下層液から順番に一定量ずつ分画する方法がある。

【0051】

一つの実施形態において、パルボウイルス含有液は、使用するローターのサイズに応じ適宜濃縮することができる。濃縮方法としては、ＣｓＣｌ₂を用いた塩析沈殿、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿、限外濾過膜による濾過、又は超遠心による沈殿等、公知の方法を使用することができる。濃縮率を自由に設定できる観点又は溶媒交換が容易である観点から、超遠心による沈殿が好ましい方法として例示される。

【0052】

例えばパルボウイルスを超遠心により濃縮する場合、相体遠心力（ｇ）と遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）としては、上限としては１，２００，０００（ｈ×ｇ）以下、７００，０００（ｈ×ｇ）以下、３００，０００（ｈ×ｇ）以下が例示される。下限としては２０，０００（ｈ×ｇ）以上、１０，００００（ｈ×ｇ）以上、２００，０００（ｈ×ｇ）以上が例示される。

【0053】

超遠心の条件の一例として、超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）で、Ｔｙｐｅ４５ Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で２９，４００ｒｐｍ、２時間超遠心する方法が例示される。

【0054】

次に、沈殿させたパルボウイルスを、適切な溶媒に再懸濁することで、濃縮されたパルボウイルス含有液を得ることができる。

【0055】

再懸濁する溶媒は、汎用的に使われるＴＮＥ緩衝液などのトリス緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、ＤＭＥＭ培地（無血清）などの細胞培養培地などが利用できる。好ましくは、ＴＮＥ緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、細胞培養用培地、より好ましくはＴＮＥ緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、ＤＭＥＭ培地（無血清）がよく、最も好ましくはＴＮＥ緩衝液である。再懸濁した際のパルボウイルスの状態は、分散状態にあっても、凝集状態にあってもよい。

【0056】

密度勾配超遠心における有機性の密度勾配液の溶質としては、スクロース（ショ糖）又はイオジキサノールが例示される。溶質の好ましい例として、スクロースが例示される。

【0057】

スクロースを溶質とした場合、密度勾配超遠心用の遠心チューブに、濃度の異なるスクロース溶液を重層する。スクロース溶液の溶媒は、ＴＥ緩衝液（トリス緩衝液－ＥＤＴＡ）などが使用できる。

【0058】

パルボウイルスは超遠心にかけた際に、４０％スクロース層は通過する。５０％スクロース溶液と４０％スクロース溶液を重層し、その上部にパルボウイルス懸濁液（濃縮液）を重層して超遠心すると、パルボウイルスは４０％スクロース層と５０％スクロース層の界面から回収できる。

【0059】

６０％スクロース層と４０％スクロース層を重層したときも、パルボウイルスは超遠心後に、それら２層の界面から回収することができる。

【0060】

重層の濃度はこれらに限られたものではなく、６０％、４５％、３０％、１５％のスクロース溶液を重層して、その上にパルボウイルス懸濁液（濃縮液）を重層して密度勾配超遠心を行うと、パルボウイルスは４５％層から回収できる。

【0061】

６０％、５０％、４０％、３０％のスクロース溶液を重層して、その上にパルボウイルス懸濁液（濃縮液）を重層して密度勾配超遠心を行うと、パルボウイルスは５０％層と４０％層の界面から回収できる。

【0062】

これらの密度勾配超遠心の相対遠心力（ｇ）×遠心時間（ｈ）は、パルボウイルスが自身の比重と平衡する溶液の位置まで落ちてくるのに十分な程度行えばよく、相体遠心力（ｇ）と遠心時間（ｈ）の積（ｈ×ｇ）としては、１，５００，０００（ｈ×ｇ）以上行えばよい。より好ましくは１，８００，０００（ｈ×ｇ）以上７，０００，０００（ｈ×ｇ）以下であり、最も好ましくは１，９７４，１００（ｈ×ｇ）である。一例として、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ＋のスイングローターＳＷ－２８を使用して２４，０００ｒｐｍで超遠心する場合、相対遠心力は１０３，９００ｇであるため、１９時間超遠心を行うことで、マウス微小ウイルスは目的の位置から回収できる。

【0063】

なお、密度勾配溶液の重層は、重い層を分注した上に軽い層を乗せていく方法でも、軽い層を先に分注して重い層を下に注入する方法でも実施できる。そして、これらの超遠心は、ウイルスの失活を防ぐために通常４℃で行うのが業界の標準である。

【0064】

また、スクロース溶液を重層した直後に、ウイルス懸濁液を上に重層して密度勾配超遠心に適用することができるが、スクロース溶液を重層したのちに８～２４時間静置しておくと、それぞれのスクロース層の界面が拡散によりなじんで、濃度を連続的な勾配にすることができる。この方法でも密度勾配超遠心後にウイルスが回収できる位置は同じになる。

【0065】

重層後に静置しない場合は、密度勾配は段階的であり、「段階的（ステップグラジエント）密度勾配超遠心」となるが、静置させることで、「連続的密度勾配超遠心」となる。

【0066】

連続的密度勾配超遠心は、段階的密度勾配超遠心よりも、回収したい物質（パルボウイルス）と、除去したい不純物との分離がより細かく厳密に行えるようになる。超遠心の種類は目的に応じて使いわけることができる。

【0067】

重層後の静置は１℃～３０℃で行うのが好ましく、より好ましくは２℃～１０℃、最も好ましくは４℃で行う。静置時間は、短すぎると連続的にならず、長すぎると互いの濃度が拡散によって混ざり合いすぎて勾配が保たれなくなる。静置時間としては１２～２４時間が好ましく、より好ましくは１４～１８時間であり、最も好ましくは１６時間である。

【0068】

パルボウイルスが密度勾配超遠心後にどの位置から回収できるかは、密度勾配超遠心後の遠心チューブ内の溶液を上から順に適当な体積（例えば１ｍＬ）ずつ分画採取し、感染性をアッセイすればよい。

【0069】

上記の密度勾配超遠心は、２回以上繰り返してより精製度を高めてもよい。このとき１回目と２回目でパルボウイルスを回収できる溶媒濃度は等しい。また、１回目と２回目で、重層する濃度組成を変えてもよい。例えば、１回目はスクロース濃度６０％、５０％、４０％、３０％と重層して、５０％と４０％の界面画分を回収し、２回目は６０％と４０％の２層で密度勾配超遠心を行い、両層の界面を回収することができる。またその逆でもよい。

【0070】

スクロース密度勾配超遠心において、パルボウイルスが回収される位置（スクロース濃度）は常に一定（４０％と５０％の間）であるため、目的や作業性に応じて重層方法を変更すればよい。

【0071】

不純物濃度をより低下させたい場合は、４０％と５０％の界面にウイルスを回収するとよい。不純物濃度がすでに十分低いなどの理由で、気にしなくてよい場合は、４０％と６０％のように濃度差の開いた界面にウイルスを回収するとよい。

【0072】

有機性の密度勾配液の溶質がイオジキサノールの場合も、同様に２層以上の濃度に重層し、パルボウイルスが平衡化する界面の位置からウイルスを回収すればよい。

【0073】

本実施形態の方法で有機性の密度勾配液を用いて密度勾配超遠心されたパルボウイルスは、密度勾配超遠心前に凝集状態であったとしても、単分散状態で回収することができる。

【0074】

有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心により得られたマパルボウイルス含有液は、さらに溶媒交換することもできる。溶媒交換の方法としては、半透膜を用いた透析や、限外濾過膜による溶媒交換、限外濾過膜と遠心分離を組み合わせた方法、脱塩カラムによる溶媒交換法などを行えばよい。

【0075】

有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心により得られたパルボウイルス含有液中で、パルボウイルスが凝集していないかどうかを確認するためには、孔径が８０ｎｍ～３０ｎｍのフィルターで濾過して、濾過前後のウイルス量を感染価などで測定すればよい。

【0076】

濾過膜の孔径は、好ましくは７５ｎｍ～３５ｎｍであり、より好ましくは４０ｎｍ～３０ｎｍ、最も好ましくは３５ｎｍの孔径の膜である。

【0077】

パルボウイルス含有液から、密度勾配超遠心により得られたパルボウイルスの回収率は、感染価×体積の式で得られる絶対感染価の回収率で求めることができる。本明細書で使用する場合、「絶対感染価」とは感染価に体積をかけた値を意味する。

【0078】

例えば、マウスレトロウイルス含有液の感染価が、１０⁹ ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ×１０００ｍＬの場合、精製原料の絶対感染価は１０¹² ＴＣＩＤ₅₀となる。これに対して密度勾配超遠心により得られたマウス微小ウイルス含有液が１０¹¹ ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ×１０ｍＬであれば、精製品の絶対感染価も１０¹² ＴＣＩＤ₅₀であるため、回収率は１００％となる。

【0079】

本実施形態の方法で得られる単分散化されたパルボウイルス含有液は、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心の前後で３０％以上の回収率であり、より好ましくは５０％以上である。このように回収率が高い理由は、本実施形態が提供する、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心工程が、複雑ではなく、比較的短時間であるため、経時的なウイルスの失活を回避できるためである。

【0080】

本実施形態において、単分散化されたパルボウイルス含有液を用いてウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能を評価することにより、従来過大評価されていたウイルスクリアランス性能をより正確に評価することができる。単分散化されたパルボウイルスは、本願明細書に記載の方法により製造したものを使用することができるし、それ以外の方法で製造された単分散化されたパルボウイルスであっても、単分散化されたウイルスであれば特に限定されない。

【0081】

本実施形態において、ウイルス除去膜は、ウイルスを除去可能な膜であれば特に限定されないが、パルボウイルス用のウイルス除去膜であることが好ましい。パルボウイルス用のウイルス除去膜としては、例えばＭＶＭに対するＬＲＶが４以上である濾過膜が例示される。ＭＶＭに対するＬＲＶが４以上である濾過膜とは、使用する濾過膜に対し、ＭＶＭを含む溶液を５０Ｌ／ｍ²負荷した場合におけるＬＲＶが４以上となる膜である。ＭＶＭを含む溶液としては、１ｍｇ／ｍＬのヒト免疫グロブリン溶液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）にＭＶＭ濃度を１０⁶ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬとしたものが用いられる。また、パルボウイルス用のウイルス除去膜としては、その平均孔径がパルボウイルスの大きさ前後以下であれば特に限定されないが、５～２４ｎｍの範囲が例示され、１４～２２ｎｍの範囲が好ましく、１８～２０ｎｍの範囲がより好ましい例として挙げられる。パルボウイルス除去用ウイルス除去膜としては、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ ＢｉｏＥＸ、Ｐｅｇａｓｕｓ ＳＶ４、Ｖｉｒｏｓａｒｔ ＣＰＶ又はＶｉｒｅｓｏｌｖｅ Ｐｒｏが例示され、特に、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ １５Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ ＢｉｏＥＸ、Ｕｌｔｉｐｏｒｅ ＶＦ－ＤＶ２０、Ｐｅｇａｓｕｓ Ｐｒｉｍｅ、Ｐｅｇａｓｕｓ ＳＶ４、又はＶｉｒｅｓｏｌｖｅ Ｐｒｏ、Ｖｉｒｏｓａｒｔ ＣＰＶ、Ｖｉｒｏｓａｒｔ ＨＦが例示される。

【0082】

本実施形態において、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能の評価は、以下の通り行うことができる。生物製剤等の実生産工程をスケールダウンした条件で行うことが好ましい。

【0083】

まず生物製剤の中間製品等のタンパク質を含有する溶液に、単分散化されたパルボウイルス含有液を添加する。タンパク質としては、血漿分画製剤のグロブリン、アルブミン、血液凝固第７因子（Ｆ－ＶＩＩ）、血液凝固第８因子（Ｆ－ＶＩＩＩ）、遺伝子組み換えタンパク質、モノクローナル抗体、トロンモジュリン製剤、腫瘍壊死因子、タンパク質性のワクチン、培地、培地添加剤、又はタンパク質分解酵素が例示されるがこれらに限定されるものではない。

【0084】

パルボウイルスを含有する液体を添加後、タンパク質含有溶液中のパルボウイルスが単分散状態であることは、プレフィルターで濾過を行うことにより確認することができる。プレフィルターの孔径としては、７５ｎｍ～２５ｎｍが例示されるが、より好ましくは４０～３０ｎｍであり、最も好ましくは３５ｎｍである。プレフィルターによるパルボウイルスの対数除去率ＬＲＶを測定する。ＬＲＶが１．０未満であることを確認する。

【0085】

続いてウイルス除去膜に供する、プレフィルター後のタンパク質含有溶液の一部を２本サンプリングしておく。１本は速やかに冷凍保管し、もう１本は濾過完了まで濾過条件と同じ環境下に静置して対照品とする。

【0086】

次に、単分散化されたパルボウイルスをウイルス除去膜に供する。単分散化されたパルボウイルスをウイルス除去膜に供することとしては、パルボウイルスを除去することができれば特に限定されないが、単分散化されたパルボウイルスをウイルス除去膜で濾過を行うことが例示される。濾過時の送液方法は、加圧濾過、低速ポンプ濾過が例示される。濾過時の膜間差圧は、使用するフィルターの耐圧性以内で行うことがきる。例えば、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎの場合は７０～１００ｋＰａ、Ｐｌａｎｏｖａ ＢｉｏＥＸの場合は、１９６～３４３ｋＰａで行うことができる。所定の量の濾過が完了したあと、濾液の一部を採取する。

【0087】

直ちにウイルス除去率の測定を行わない場合は、サンプリングした濾液と、濾過前にサンプリングした対照品を凍結保管しておき、後日、濾過前溶液のサンプリング品と共に解凍してウイルス力価測定を行うことができる。直ちにウイルス除去率の測定を行う場合は、最初に凍結した濾過前溶液のサンプリング品を解凍して、濾過後溶液、対照品とともにウイルス力価測定を行う。

【0088】

ウイルス力価測定は、プラーク法又はＴＣＩＤ５０法等、既知の方法で行う。濾過前溶液と、対照品とのウイルス力価を比較し、濾過中の力価の低下がないことを確認する。合否判定については測定ばらつき等のリスクに応じて事前に定めておけばよい。
濾過前後の溶液のウイルス力価の対数値の差から、対数除去率を求める。例えば、濾過前溶液のウイルス力価が１０^6.0 ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬで、濾過後溶液のウイルス力価が１０^2.0 ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬの場合、対数除去率は４．０となる。

【実施例】

【0089】

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。実施例において示される試験方法は以下の通りである。

【0090】

〔実施例１〕
マウス微小ウイルスの宿主細胞として形質転換ヒト繊維芽細胞（以下「宿主細胞」と呼ぶ）を用い、１０％牛胎児血清を添加したＤＭＥＭ（以下、「１０％血清培地」と呼ぶ）で、３７℃、５％ＣＯ₂環境下にて、７５ｃｍ²底面積、容量１５ｍＬの組織培養用フラスコ（以下、「フラスコ」と呼ぶ）を用いて継代培養した。フラスコから宿主細胞をはがして、新しいフラスコに１．５×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／１５ｍｌ／ｆｌａｓｋの密度で２．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（以下、「２．５％血清培地」と呼ぶ）に植え付けて、マウス微小ウイルスをＭＯＩ＝０．０１で感染させた。４日後に培地を、血清を含まない培地（以下「無血清培地」と呼ぶ）に交換し、さらに３日間培養した。

【0091】

マウス微小ウイルスを含む培養上清を回収して、３，０００ｒｐｍ、２０分間遠心して沈殿した細胞の破片を除去し、上清を０．４５μｍフィルター（ナルゲン社製）による濾過で簡易精製して、培養上清を得た。

【0092】

この簡易精製した培養上清を超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）で、Ｔｙｐｅ４５ Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で２９，４００ｒｐｍ、２時間超遠心して、マウス微小ウイルスを沈殿させた。上清を除去し、沈殿したマウス微小ウイルスペレットに６ｍＬのＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４／１００ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して再懸濁し、濃縮されたマウス微小ウイルスを含むＴＮＥ緩衝液（以下「濃縮ＭＶＭ培養液」と呼ぶ）を得た。

【0093】

この濃縮ＭＶＭ培養液のマウス微小ウイルス感染価を測定した。感染価の測定は、９６－ｗｅｌｌプレートを用いて、宿主細胞を２×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ分注後に、１０倍段階希釈した検体を４ｗｅｌｌずつ添加して、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法によりＴＣＩＤ₅₀／ｍＬを算出した。

【0094】

次に、表１の（１）又は（２）の重層条件のスクロース密度勾配溶液（スクロース／ＴＮＥ緩衝液）を作成し、それぞれの最上面に、上記の濃縮ＭＶＭ培養液を重層した。

【0095】

【表1】

（上記重層条件における各要素の並び順は、遠心チューブの下方から上方への順序を示す。）

【0096】

超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）でスイングローターＳＷ－２８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用して２４，０００ｒｐｍ（１０３，９００ｇ）、１９時間、密度勾配超遠心を行った。超遠心後の溶液を、上から３ｍＬずつマイクロピペットで分画採取し（全部で１２画分）、ウイルスの感染価を前述の方法で測定した。

【0097】

マウス微小ウイルス感染価のピークとなった、連続する２画分（１画分３ｍＬ×２＝６ｍＬ）を、マウス微小ウイルス含有液としてプールした。このマウス微小ウイルス含有液を、１％ヒトグロブリン水溶液（０．１Ｍ ＮａＣｌ）に添加して、孔径３５ｎｍの分離膜であるＰｌａｎｏｖａ ３５Ｎフィルター（旭化成メディカル社製）で濾過した。濾過条件は、４９ｋＰａ、１０Ｌ／ｍ²とした。

【0098】

スクロース密度勾配超遠心のマウス微小ウイルス回収率は、条件（１）、（２）ともに１００％以上であった（表２）。
濾過前後のマウス微小ウイルス感染価を測定し、下記式に基づいて対数除去率ＬＲＶを算出した（表３）。
ＬＲＶ＝｛濾過前のマウス微小ウイルス感染価（ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ］）｝－｛濾過後のマウス微小ウイルス感染価（ｌｏｇ₁₀［ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ］）｝
スクロース密度勾配超遠心後のマウス微小ウイルスでは対数除去率が１未満であり、単分散状態であった（表３）。

【0099】

【表2】

条件：表１の条件番号に対応。
ＭＶＭ：Ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ（マウス微小ウイルス）
回収率＝１００×（密度勾配超遠心後のＭＶＭの感染価×体積）／（密度勾配超遠心前のＭＶＭ培養液の感染価×体積）

【0100】

【表3】

【0101】

〔実施例２〕
上記実施例１と同様の方法で濃縮ＭＶＭ培養液を得た。
次に、表３の重層条件のスクロース密度勾配溶液（スクロース／ＴＮＥ緩衝液）を作成し、４℃で１６時間静置したのちに、それぞれの最上面に、上記の濃縮ＭＶＭ培養液を重層した。

【0102】

【表4】

（上記重層条件における各要素の並び順は、遠心チューブの下方から上方への順序を示す。）
超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ）でスイングローターＳＷ－２８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用して２４，０００ｒｐｍ（１０３，９００ｇ）、１９時間、密度勾配超遠心を行った。超遠心後の溶液を、上から１ｍＬずつマイクロピペットで分画採取し（全部で１２画分）、ウイルスの感染価を前述の方法で測定した。
マウス微小ウイルス感染価のピークとなった、連続する３画分（１画分３ｍＬ×３＝９ｍＬ）を、マウス微小ウイルス含有液としてプールした。

【0103】

スクロース密度勾配超遠心のマウス微小ウイルス回収率は、６０％であった（表５）。

【0104】

【表5】

条件：表４の条件番号に対応。

【0105】

このマウス微小ウイルス含有液を、実施例１と同様の方法により、Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎ（旭化成メディカル社製）フィルターで濾過し、対数除去率ＬＲＶを算出した（表６）。

【0106】

【表6】

【0107】

スクロース密度勾配超遠心後のマウス微小ウイルスでは対数除去率が１未満であり、単分散状態であった（表６）。

【0108】

〔比較例１〕
実施例１と同様の方法で、培養上清からマウス微小ウイルスを含む培養上清を３バッチ回収した。それぞれを、３，０００ｒｐｍ、２０分間遠心して沈殿した細胞の破片を除去し、上清を０．４５μｍフィルター（ナルゲン社製）で濾過した。

【0109】

これらを、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心工程を経ずに、実施例１と同様の方法により、Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎフィルターで濾過し、対数除去率ＬＲＶを算出した。

【0110】

〔比較例２〕
実施例１と同様の方法で、濃縮ＭＶＭ培養液を得た。これを、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心工程を経ずに、実施例１と同様の方法により、Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎフィルターで濾過し、対数除去率ＬＲＶを算出した。

【0111】

〔比較例３〕
実施例１と同様の方法で、濃縮ＭＶＭ培養液を得た。ただし、超遠心で得たウイルスペレットの再懸濁に、ＴＮＥ緩衝液ではなく、ＰＢＳ（－）緩衝液を使用した。これを、有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心工程を経ずに、実施例１と同様の方法により、Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎフィルターで濾過し、対数除去率ＬＲＶを算出した。

【0112】

結果を表７に示す。

【0113】

【表7】

【0114】

有機性の密度勾配液を用いた密度勾配超遠心を行っていないマウス微小ウイルスは、比較例１、比較例３、比較例３いずれも３５ｎｍフィルターの対数除去率が１以上であり、凝集状態であった。これは、本来Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎを通過するはずのマウス微小ウイルスがＰｌａｎｏｖａ ３５Ｎで捕捉されてしまうことを意味しており、比較例１～３のウイルスを使用してウイルス除去膜の性能を評価した場合、ウイルス除去膜のウイルスクリアランス性能が過大評価されることが示唆された。