特許 7588887 標的リガンド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-15

(45)【発行日】2024-11-25

(54)【発明の名称】標的リガンド

(51)【国際特許分類】

   C07H 15/04 20060101AFI20241118BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20241118BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20241118BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241118BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20241118BHJP

【ＦＩ】

C07H15/04 D CSP

A61K31/713

A61K47/54

A61K48/00

A61P3/06

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2023054421

(22)【出願日】2023-03-29

(62)【分割の表示】P 2022578882の分割

【原出願日】2021-09-30

(65)【公開番号】P2023121159

(43)【公開日】2023-08-30

【審査請求日】2023-03-29

(31)【優先権主張番号】202011061038.1

(32)【優先日】2020-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202110397429.9

(32)【優先日】2021-04-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202110008013.3

(32)【優先日】2021-01-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522492783

【氏名又は名称】納▲タイ▼得（青島）生物医薬有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＯＰＥＰＴＩＤＥ （ＱＩＮＧＤＡＯ） ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ＃２１， Ｑｉｎｇｄａｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃｉａｎ Ｐａｒｋ Ｎｏ．１７１ Ｊｉｎｓｈｕｉ Ｒｏａｄ， Ｌｉｃａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｑｉｎｇｄａｏ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６６１９９ （ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】劉兆貴

(72)【発明者】

【氏名】陳平

(72)【発明者】

【氏名】張捷▲ティン▼

(72)【発明者】

【氏名】王▲ルイ▼

(72)【発明者】

【氏名】徐娟

(72)【発明者】

【氏名】付中国

(72)【発明者】

【氏名】張海霖

(72)【発明者】

【氏名】陳璞

【審査官】中村 政彦

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５２４７３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５２１０４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５１２１５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５１３７７０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｈ １５／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ａ６１Ｋ ３１／００

Ａ６１Ｋ ４７／００

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

化合物であって、

【化1】

ＴＯ２６とのうちのいずれか１つの構造を有することを特徴とする、化合物。

【請求項2】

化合物であって、請求項１に記載の化合物の水酸基の保護基を脱離させることで得られ、

【化2】

ＧａｌＮＡＣ標的ヘッド１０４３と、

【化3】

ＧａｌＮＡＣ標的ヘッド１０４６と、

【化4】

ＧａｌＮＡＣ標的ヘッド１０４８とのうちの１つの構造を有することを特徴とする、化合物。

【請求項3】

請求項１～２のいずれか一項に記載の化合物の、ｓｉＲＮＡコンジュゲートの製造への使用。

【請求項4】

前記化合物は、標的リガンドとしてｓｉＲＮＡに連結されることを特徴とする
請求項３に記載の使用。

【請求項5】

前記ｓｉＲＮＡコンジュゲートにおけるｓｉＲＮＡは、センス鎖と、アンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖は、前記センス鎖と相補的に対合する相補性領域を含み、ここで、前記センス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４の各鎖のヌクレオチド配列と５ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択され、前記アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８の各鎖のヌクレオチド配列と５ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択されることを特徴とする
請求項４に記載の使用。

【請求項6】

前記ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含み。
前記修飾されたヌクレオチドは、
５'－ホスホロチオエート化ヌクレオチド、５－メチル化シトシンヌクレオチド、２'－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２'－Ｏ－２－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２'－フルオロ修飾ヌクレオチド、３'－窒素置換修飾ヌクレオチド、２'－デオキシ－２'－フルオロ修飾ヌクレオチド、２'－デオキシ修飾ヌクレオチド、固定化ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２'－アミノ修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ポリペプチドヌクレオチド、ホスホルアミデート、及び非天然塩基を含むヌクレオチドのうちの少なくとも1つから選択されることを特徴とする
請求項５に記載の使用。

【請求項7】

前記ｓｉＲＮＡは、前記標的リガンドに共有結合的に連結され、前記標的リガンドは、前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖に連結され、前記標的リガンドは、チオリン酸エステル結合を介して前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖の５'末端に連結されることを特徴とする、
請求項６に記載の使用。

【請求項8】

ｓｉＲＮＡコンジュゲートの製造方法であって、請求項１～２のいずれか一項に記載の化合物を標的リガンドとしてｓｉＲＮＡに共有結合的に連結することを含むことを特徴とする、ｓｉＲＮＡコンジュゲートの製造方法。

【請求項9】

前記化合物は、まず中間体を形成してからｓｉＲＮＡに共有結合的に連結され、前記中間体は、

【化5】

ＴＰ－２３と、

【化6】

ＴＰ－２５と、

【化7】

ＴＰ－２６とのうちの１つの構造から選ばれることを特徴とする
請求項８に記載の方法。

【請求項10】

ｓｉＲＮＡコンジュゲートを製造する中間体であって、

【化8】

ＴＰ－２３と、

【化9】

ＴＰ－２５と、

【化10】

ＴＰ－２６とのうちの１つの構造から選ばれることを特徴とする、ｓｉＲＮＡコンジュゲートを製造する中間体。

【請求項11】

請求項１～２のいずれか一項に記載の化合物及び／又は請求項１０に記載の中間体の、薬物又はキットの製造への使用であって、前記薬物又はキットは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するために用いられることを特徴とする、使用。

【請求項12】

前記薬物又はキットは、脂質異常症の予防及び／又は治療に用いられることを特徴とする
請求項１１に記載の使用。

【請求項13】

前記脂質異常症は、高脂血症と高トリグリセリド血症を含むことを特徴とする
請求項１２に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、分割出願であり、親出願は、ＰＴＣ出願が中国国家段階に入った出願であり、親出願の出願番号が２０２１８００２２９０２３であり、ＰＴＣ国際出願日が２０２１年０９月３０日であり、中国国家段階に入った日付が２０２２年１０月１８日であり、親出願の発明名称が「アンギオポエチン様３のｓｉＲＮＡ及びその用途」である。

【0002】

本開示は、遺伝子工学技術分野に関し、具体的には、本開示は、標的リガンドとすることができる新たな化合物に関する。

【背景技術】

【0003】

高脂血症は、脂質異常症とも呼ばれ、脂肪代謝又は運転異常により血漿脂質が正常値よりも高くなる全身性疾患である。脂質異常症の臨床症状としては、大きく分けて、（１）脂質の皮内沈着による黄色腫、（２）脂質の血管内皮沈着によるアテローム性動脈硬化症、冠動脈性心疾患、末梢血管疾患などが挙げられる。調査によれば、成人での総血中コレステロール（ＴＣ）又はトリグリセリド（ＴＧ）の上昇は約１０％から２０％程度、また小児でも約１０％もの高脂血症が見られる。従来の脂質異常症の治療薬としては、スタチン類、コレステロール吸収阻害剤、樹脂類、プロベナゾール類、フィブラート類、ニコチン酸及びその誘導体が主流であった。

【0004】

アンギオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３、ＮＭ＿０１４４９５．４）は、主に肝臓細胞で発現される分泌タンパク質である。アンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）は、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ及びトリグリセリド代謝の重要な調節因子であり、様々な潜在的な作用ノードを有することが研究によって示されており、ＡＮＧＰＴＬ３の機能喪失型突然変異は、ＬＤＬ－Ｃ、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ及びトリグリセリド（ＴＧ）の低下をもたらし、ＧＷＡＳに基づく心血管疾患のリスクを低下させ、既知の遺伝子欠損の有害表現型がない。従って、ＡＮＧＰＴＬ３活性の阻害は、脂質異常症の予防又は治療に有効である。

【0005】

従来技術では、ＡＮＧＰＴＬ３抗体を用いてその活性を阻害することが多い。

【0006】

出願番号がＣＮ２０１２８００３８９０８．０である中国特許には、ヒトアンジオポエチン様タンパク質３（ｈＡＮＧＰＴＬ３）に特異的に結合し、その少なくとも1つの活性を阻害または干渉する、完全ヒト化抗体又はヒト抗体の抗原結合断片が開示されている。このヒト抗ｈＡＮＧＰＴＬ３抗体は、ＡＮＧＰＴＬ３に関わる疾患又は障害、例えば、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症などを含む高脂血症、高リポタンパク血症及び脂質異常症などの治療に有用である。

【0007】

出願番号がＣＮ２０１７８００２６１４７．Ｘである中国特許には、ＨｅＦＨ及びＨｏＦＨを含む家族性高コレステロール血症を患っている患者を治療するための方法が開示されている。ＡＮＧＰＴＬ３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を他の薬物と組み合わせて投与することによって、患者の少なくとも1つの脂質パラメーターを低下させる。高トリグリセリド血症、カイロミクロン血症などを含む高コレステロール血症及び高脂血症、高リポタンパク血症及び脂質異常症の治療に有用である。

【0008】

ｓｉＲＮＡ薬物は、抗体と比較して標的候補が豊富であり、開発サイクルが短く、臨床開発の成功率が高いなどの利点を有する。このため、慢性疾患用薬の点では、より優位性がある。しかしながら、ｓｉＲＮＡ薬物自体の欠点（例えば、安定性の欠如、膜貫通の困難性など）は、その臨床用途を制限する。ｓｉＲＮＡの構造改変又はコンジュゲートの構築は、いずれも、ｓｉＲＮＡの成薬確率をある程度まで改善し得る。コンジュゲートを構築する構成分子の探索は、脂質異常症のためのｓｉＲＮＡ薬物の開発の必須ルートであり、解決すべき課題でもある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本開示は、関連技術における技術的課題の１つを少なくともある程度解決することを目的とする。そのために、本開示の１つの目的は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡを提供することであり、本開示の発明者らは、適切な特異的な低分子干渉ＲＮＡ配列を設計し、それを標的リガンドに結合させてｓｉＲＮＡコンジュゲートを形成することにより、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とし、細胞中のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を分解することにより、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現量を低下させ、それにより、本開示によるｓｉＲＮＡは、脂質異常症の予防及び／又は治療に有用である。

【課題を解決するための手段】

【0010】

そのために、本開示の一態様は、ｓｉＲＮＡを提供する。本開示の実施例によれば、前記ｓｉＲＮＡは、センス鎖と、アンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖は、前記センス鎖と相補的に対合する相補性領域を含み、ここで、前記センス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４の各鎖のヌクレオチド配列と５ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択され、前記アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８の各鎖のヌクレオチド配列と５ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択される。

【0011】

本開示の発明者らは、適切な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）配列を設計することにより、肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３の合成を特異的に減少させるとともに、脱標的効果を回避する。ｓｉＲＮＡは、サイレンシング複合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）を形成し、標的遺伝子（ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子）のｍＲＮＡの配列と相補的に対合し、標的遺伝子のｍＲＮＡを分解して標的遺伝子の発現を阻害し、更にＬＤＬ－Ｃ、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ及びトリグリセリド（ＴＧ）のレベルを低下させる。

【0012】

本開示の実施例によるｓｉＲＮＡは、以下の付加的な技術的特徴の少なくとも１つを更に有してもよい。

【0013】

本開示は、ｓｉＲＮＡを更に提供する。前記ｓｉＲＮＡは、

【0014】

（１）アンギオポエチン様タンパク質３遺伝子配列の６０－８０位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、好ましくは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６５から選択されるものと、

【0015】

（２）アンギオポエチン様タンパク質３遺伝子配列の１０７－１３３位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、好ましくは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１から選択され、又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２から選択されるものと、

【0016】

（３）アンギオポエチン様タンパク質３遺伝子配列の１６３－１８７位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、好ましくは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３から選択されるものと、

【0017】

（４）アンギオポエチン様タンパク質３遺伝子配列の３０４－３８８位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができ、好ましくは、アンギオポエチン様タンパク質３遺伝子配列の３０４－３５９位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、より好ましくは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８１から選択され、

【0018】

又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８３から選択され、

【0019】

又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５から選択され、

【0020】

又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８６から選択され、

【0021】

又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８９から選択され、

【0022】

又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９０から選択されるものと、

【0023】

（５）アンギオポエチン様タンパク質３遺伝子配列の４３０－４５９位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、好ましくは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７から選択され、

【0024】

又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９８から選択されるものと、

【0025】

（６）アンギオポエチン様タンパク質３遺伝子配列の１３６０－１４３０位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができ、好ましくは、アンギオポエチン様タンパク質３遺伝子配列の１３９７－１４３０位のヌクレオチドを特異的に標的とすることができるものであって、より好ましくは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９９から選択され、

【0026】

又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５０から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０４から選択され、

【0027】

又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５１から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０５から選択され、

【0028】

又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５２から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０６から選択され、

【0029】

又は、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５４から選択され、アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０８から選択されるものとのいずれかの群のいずれか一対のｓｉＲＮＡから選ばれる。

【0030】

本開示の実施例によれば、前記ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含み、

【0031】

任意選択的に、前記修飾されたヌクレオチドは、

【0032】

５'－ホスホロチオエート化ヌクレオチド、５－メチル化シトシンヌクレオチド、２'－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２'－Ｏ－２－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２'－フルオロ修飾ヌクレオチド、３'－窒素置換修飾ヌクレオチド、２'－デオキシ－２'－フルオロ修飾ヌクレオチド、２'－デオキシ修飾ヌクレオチド、固定化ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２'－アミノ修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ポリペプチドヌクレオチド、ホスホルアミデート、及び非天然塩基を含むヌクレオチドのうちの少なくとも1つから選択される。

【0033】

本開示の実施例によれば、前記相補性領域の長さは、少なくとも１７ｂｐであり、

【0034】

任意選択的に、前記相補性領域の長さは、１８－２１ｂｐであり、

【0035】

任意選択的に、前記相補性領域の長さは、１９ｂｐである。

【0036】

本開示の実施例によれば、前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、２５ｂｐ以下であり、

【0037】

任意選択的に、前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、１８－２５ｂｐであり、

【0038】

任意選択的に、前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、２１ｂｐである。

【0039】

本開示の実施例によれば、前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の塩基は、１対１で相補的に対合してもよく、数個の塩基ずれているが、少なくとも１７ｂｐの相補性領域を有してもよい。

【0040】

本開示の別の態様は、ｓｉＲＮＡコンジュゲートを提供する。前記ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、前述したｓｉＲＮＡと標的リガンドを含み、ここで、前記ｓｉＲＮＡは、標的リガンドに共有結合的に連結され、

【0041】

好ましくは、前記標的リガンドは、前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖に連結され、

【0042】

より好ましくは、前記標的リガンドは、チオリン酸エステル結合を介して前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖の５'末端に連結される。

【0043】

本開示の実施例によれば、前記標的リガンドは、少なくとも１つのＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む。

【0044】

本開示の実施例によれば、前記標的リガンドは、ＧａｌＮＡＣ標的ヘッド化合物である。

【0045】

本開示の実施例によれば、前記ＧａｌＮＡＣ標的ヘッド化合物は、１０４３、１０４６、１０４８であり、その構造は、下記式に示すとおりである。

【0046】

本開示の実施例によれば、前記標的リガンドは、前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖に連結される。

【0047】

本開示の別の態様は、医薬組成物を提供する。本開示の実施例によれば、前記医薬組成物は、前記ｓｉＲＮＡ及び／又は前記ｓｉＲＮＡコンジュゲートを含み、任意選択的に、前記医薬組成物は、薬学的に許容される添加物を更に含む。

【0048】

これにより、本開示の実施例による医薬組成物は、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３の合成を阻害し、それによりＬＤＬ－Ｃ、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ及びトリグリセリド(ＴＧ)のレベルを低下させて、高脂血症及び高トリグリセリド血症の予防及び/又は治療に使用することができる。

【0049】

本開示のまた１つの態様は、化合物を提供する。

【0050】

【0051】

ＴＯ２６とのうちのいずれか１つの構造を有する。

【0052】

【0053】

【0054】

本発明のまた１つの態様は、前記化合物の、ｓｉＲＮＡコンジュゲートの製造への用途を提供する。

【0055】

【0056】

本開示のまた１つの態様は、前記化合物及び／又は中間体の、薬物又はキットの製造への用途を提供し、前記薬物又はキットは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するために用いられる。

【0057】

好ましくは、前記薬物又はキットは、脂質異常症の予防及び／又は治療に用いられ、さらに好ましくは、前記脂質異常症は、高脂血症と高トリグリセリド血症を含む。

【0058】

本開示のまた１つの態様は、キットを提供する。本開示の実施例によれば、前記キットは、前記ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｉＲＮＡコンジュゲートを含む。

【0059】

これにより、本開示の実施例によるキットは、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害し、それによりＬＤＬ－Ｃ、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ及びトリグリセリド（ＴＧ）のレベルを低下させて、高脂血症及び高トリグリセリド血症の予防及び/又は治療に使用することができる。

【0060】

本開示のまた１つの態様は、被験体のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。前記方法は、被験体に前記ｓｉＲＮＡ及び／又は前記ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与し、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害することを含む。

【0061】

本開示のまた１つの態様は、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本開示の実施例によれば、前記方法は、前記ｓｉＲＮＡ及び／又は前記ｓｉＲＮＡコンジュゲートを用いて前記細胞をトランスフェクトし、前記細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害することを含む。

【0062】

本開示の実施例による細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する方法は、ｓｉＲＮＡを利用してサイレンシング複合体を形成し、標的遺伝子であるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡの配列と相補的に対合し、標的遺伝子のｍＲＮＡを分解して標的遺伝子の発現を阻害し、更にＬＤＬ－Ｃ、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ及びトリグリセリド（ＴＧ）のレベルを低下させる。

【0063】

本開示の実施例によれば、前記細胞は、哺乳動物に由来し、

【0064】

任意選択的に、前記細胞は、ヒトに由来し、

【0065】

任意選択的に、前記細胞は、肝臓細胞である。

【0066】

本開示によるｓｉＲＮＡを利用して、ヒトの肝臓細胞においてサイレンシング複合体を形成し、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡの配列と相補的に対合し、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡを分解してその発現を阻害し、更にＬＤＬ－Ｃ、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ及びトリグリセリド（ＴＧ）のレベルを低下させる。

【0067】

本開示のまた１つの態様は、前記ｓｉＲＮＡ及び／又は前記ｓｉＲＮＡコンジュゲートの、薬物又はキットの製造への用途を提供する。本開示の実施例によれば、前記薬物又はキットは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するために用いられる。

【0068】

本開示によるｓｉＲＮＡを利用して薬物又はキットを製造し、前記薬物又はキットは、そのうちのｓｉＲＮＡによって細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現レベルを低下させることによって、脂質異常症の予防及び／又は治療を行う。

【0069】

本開示の実施例によれば、前記薬物又はキットは、脂質異常症の予防及び／又は治療に用いられ、

【0070】

任意選択的に、前記脂質異常症は、高脂血症と高トリグリセリド血症を含み、

【0071】

任意選択的に、前記薬物又はキットは、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の阻害に用いられる。

【0072】

本開示のまた１つの態様は、脂質異常症の予防及び／又は治療のための方法を提供する。本開示の実施例によれば、前記方法は、被験体に前記ｓｉＲＮＡ及び／又は前記ｓｉＲＮＡコンジュゲートを投与することを含む。

【0073】

本開示の実施例によれば、前記脂質異常症は、高脂血症と高トリグリセリド血症を含む。

【0074】

本開示の付加的な態様と利点は、以下の記述において部分的に与えられ、その一部が以下の説明から明らかとなるか又は本開示の実践によって理解される。

【0075】

本発明の有益な効果は以下のとおりである。

【0076】

本発明による標的リガンドとｓｉＲＮＡとがコンジュゲートを形成した後に、コンジュゲートは、細胞モデルとマウスモデルの両方でＡＮＧＰＴＬ３の発現を低減でき、対照群に比べ50%以上の発現量の低減が可能であり、最高９０％ほど低減でき、良好な臨床応用の見通しがある。

【0077】

【図面の簡単な説明】

【0078】

本開示の上記及び／又は付加的な態様と利点は、以下の図面を参照しながら記述される実施例の記述から明らかであり、容易に理解される。ここで、

【0079】

【図1】表２における一部のｓｉＲＮＡが０．１ ｎＭの濃度でＨｅｐ ３Ｂ細胞をトランスフェクトした後、リアルタイム定量ＰＣＲを利用して検出された細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（図面においてＡＮＬ３と略称される）の発現量の結果を示す。

【0080】

【図2】表２における一部のｓｉＲＮＡが１０ ｎＭの濃度でＨｅｐ ３Ｂ細胞をトランスフェクトした後、リアルタイム定量ＰＣＲを利用して検出された細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（図面においてＡＮＬ３と略称される）の発現量の結果を示す。

【0081】

【図3】実施例３で合成されたＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを示す。

【0082】

【図4】実施例４における各コンジュゲートの活性試験結果（ＥＣ_５０値）を示す。

【0083】

【発明を実施するための形態】

【0084】

以下、本開示の実施例を詳しく記述する。以下に記述された実施例は、例示的なものであり、本開示の解釈のみに用いられるが、本開示を限定するものと理解されるべきではない。

【0085】

「薬学的に許容される担体」は、当技術分野において公知のものであり、哺乳動物への本開示の化合物の投与に適した薬学的に許容される材料、組成物、又は担体を含む。前記担体は、ホスト物質を担持するか、又はホスト物質をある器官もしくは体の一部から別の器官もしくは体の別の一部に移すことに関与する液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入材料を含む。各担体は、製剤中の他の成分と適合性があり、患者に有害でないという意味で「許容される」でなければならない。薬学的に許容される担体として有用な材料の幾つかの例は、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン類、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体、トラガカント粉末、麦芽、ゼラチン、タルク、カカオ脂及び坐剤ワックスなどの賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びダイズ油などの油、プロピレングリコールなどのグリコール類、グリセロール、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどの多価アルコール類、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類、寒天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、発熱物質を含まない水、リンゲル溶液、エタノール、リン酸緩衝剤、並びに医薬製剤に使用される他の無毒性適合性物質を含む。

【0086】

組成物において、湿潤剤、乳化剤、及び潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、及び香料、防腐剤、及び抗酸化剤が存在してもよい。

【0087】

本開示の医薬組成物は、経口、経鼻、局所、頬側、舌下、直腸及び／又は非経口投与に適したものを含む。製剤は、単位剤形で好都合に存在してもよく、且つ薬学分野で周知の任意の方法によって調製されてもよい。単一剤形を調製するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的には、治療の役割を果たす化合物の量である。一般的には、１００分の１を単位として、この量は、約１％から約９９％、好ましくは約５％から約７０％、最も好ましくは約１０から約３０％の活性成分である。

【0088】

用語「治療」は、所望の薬理学的及び/又は生理学的効果を得ることを指すために使用される。前記効果は、疾患又はその症状の完全又は部分的予防の観点から予防的であってもよく、及び／又は疾患の部分的又は完全な治癒に起因する有害作用の観点から治療的であってもよい。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトの疾患をカバーし、この疾患は、（ａ）疾患にかかりやすいが、疾患がまだ確定的に診断されていない個体における疾患又は状態の発症の予防、（ｂ）疾患の阻害、例えば、疾患の進行の遅延、又は（ｃ）疾患の軽減、例えば、疾患に関連する症状の軽減を含む。本明細書で使用される「治療」は、個体における疾患を治療、治癒、緩解、改善、軽減又は阻害するために、薬物又は化合物を個体に投与する任意の使用をカバーし、本明細書に記載の化合物を含む薬物を、それを必要とする個体に投与することを含むが、これらに限定されない。

【0089】

本開示は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡを提供する。本開示の実施例によれば、前記ｓｉＲＮＡは、センス鎖と、アンチセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖は、前記センス鎖と相補的に対合する相補性領域を含み、ここで、前記センス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４の各鎖のヌクレオチド配列と５ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択され、前記アンチセンス鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８の各鎖のヌクレオチド配列と５ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列から選択される。

【0090】

本開示の実施例によれば、前記センス鎖は、表２に示すＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４を含むのに加えて、表２に示すセンス鎖と１、２、３、４、５ヌクレオチドだけ異なる連続したヌクレオチド配列を更に含む。

【0091】

本開示の実施例によれば、前記アンチセンス鎖は、表２に示すＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８を含むのに加えて、表２に示すアンチセンス鎖と１、２、３、４、５ヌクレオチドだけ異なる連続したヌクレオチド配列を更に含む。

【0092】

本開示の実施例によれば、前記ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含み、

【0093】

前記修飾されたヌクレオチドは、

【0094】

５'－ホスホロチオエート化ヌクレオチド、５－メチル化シトシンヌクレオチド、２'－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２'－Ｏ－２－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２'－フルオロ修飾ヌクレオチド、３'－窒素置換修飾ヌクレオチド、２'－デオキシ－２'－フルオロ修飾ヌクレオチド、２'－デオキシ修飾ヌクレオチド、固定化ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２'－アミノ修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ポリペプチドヌクレオチド、ホスホルアミデート、及び非天然塩基を含むヌクレオチドのうちの少なくとも1つから選択される

【0095】

本開示の実施例によれば、前記相補性領域の長さは、１８－２１ｂｐであり、例えば、１９ｂｐである。

【0096】

本開示の実施例によれば、前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、１８－２５ｂｐであり、例えば、２１ｂｐである。

【0097】

本開示の具体的な実施例によれば、前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖の長さは、２１ｂｐであり、前記センス鎖とアンチセンス鎖における塩基は、１対１で相補的に対合し、又は、前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖とアンチセンス鎖において、１９個の連続した相補的な塩基を有し、即ち、前記相補性領域の長さは、１９ｂｐである。

【0098】

本開示の実施例によれば、前記ｓｉＲＮＡを用いて肝臓細胞をトランスフェクトし、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する。

【0099】

アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子標的に対して、本開示の発明者らは、適切な特異的な低分子干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）配列を設計し、ｓｉＲＮＡを合成し、トランスフェクト試薬を用いてｓｉＲＮＡを細胞内に導入してサイレンシング複合体(ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅ ｓｉｌｉｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ)を形成し、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列を特異的に認識して標的結合し、５'末端から１０－１１位のクリップ間でｍＲＮＡを切断することにより、転写後遺伝子サイレンシングを起こさせ、アンジオポエチン様３分泌タンパク質の発現を調節する。

【0100】

本開示の実施例によれば、前記ｓｉＲＮＡは、標的リガンドに共有結合的に連結される。

【0101】

本開示の実施例によれば、前記標的リガンドは、少なくとも１つのＮ－アセチル－ガラクトサミンを含む。

【0102】

本開示の実施例によれば、前記標的リガンドは、前記ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖に連結される。

【0103】

以下、本開示の実施例を詳しく記述する。以下に記述された実施例は例示的なものであり、本開示を解釈するためのものだけであり、本開示を限定するものと理解されるべきではない。実施例における具体的な技術や条件は明記されていないものは、当該技術分野における文献に記載の技術や条件に従って、あるいは、生成物仕様に従って、行われる。使用する試薬又は機器のうち、メーカーが明記されていないものは、いずれも市販で入手可能な通常のものである。

【0104】

本実施例の一部の合成ルートは、ＣＮ２０２１１０３９７４２９．９、ＣＮ２０２１１０００８０１３．３を参照してもよい。本出願の実施例は、ソースの導入により上記の２つの特許出願に組み込まれる。

【0105】

実施例１ インビトロ細胞モデル（Ｈｅｐ ３Ｂ細胞）による低分子干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）の活性の試験

【0106】

１）懸濁トランスフェクト試薬の調合：ｓｉＲＮＡ母液の濃度は、５０μＭであり、ＤＥＰＣ水で希釈して１０μＭ ｓｉＲＮＡシステムを得て、５０μＬ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで希釈して０．２μＭ ｓｉＲＮＡシステムを得て、３－５回ブローイングして均一に混合した（最終濃度１０ｎＭ）。５０μＬ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで０．５ｕＬ ０．２μＭのＳｉＲＮＡを希釈して０．００２μＭのｓｉＲＮＡシステムを得て、３－５回ブローイングして均一に混合した（最終濃度０．１ｎＭ）。５０μＬ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで希釈して２μＬ ＲＮＡｉＭＡＸを得て、３－５回ブローイングして均一に混合した。トランスフェクト試薬と低分子干渉核酸希釈液をそれぞれ混合し、３－５回ブローイングして均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ静置した。

【0107】

２）細胞の処理：Ｈｅｐ３Ｂ細胞株コンフルエンス率＞７０％が顕微鏡で観察され、細胞をプレーティングし、２ｘ１０^５細胞／ウェルで１２ウェルプレートにプレーティングし、各ウェルに１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地９００μＬを添加し、トランスフェクト複合体を１２ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した。

【0108】

３）２４ｈ後に、細胞の総ＲＮＡを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）によって細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列の発現状況を検出し、ここで、内部標準遺伝子ＰＰＩＢ、ＡＮＧＰＴＬ３の増幅に用いられるＰＣＲプライマーを表１に示す

【0109】

【0110】

上記方法を利用して表２における、１５４対のｓｉＲＮＡによってそれぞれ０．１ ｎＭと１０ ｎＭの濃度でＨｅｐ ３Ｂ細胞をトランスフェクトした後、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（ＮＭ＿０１４４９５．４）の発現に対する阻害率の結果を得る。

【0111】

【0112】

実施例２、ＧａｌＮＡｃ結合標的ヘッドの合成

【0113】

一、ＧａｌＮＡｃ標的ヘッド１０４３の合成

【0114】

以下の方法に応じて、ＴＯ－２３及びＴＰ－２３（１０４３標的ヘッド結合ｓｉＲＮＡの前駆体）のジアステレオ異性体を合成した。

【0115】

【0116】

（１）Ｎ_２雰囲気で、ＧＣ－１（１２ｇ、２５．８９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解し、氷水浴で０－５℃に降温し、ＨＢＴＵ（１１．７８ ｇ、３１ ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（１０ｇ，７７．６７ｍｍｏｌ）を添加し、１０分間撹拌した。

【0117】

（２）続いて、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－１，４－ブタンジアミン（４．８７ ｇ、２５．８９ ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃まで昇温し、１６時間撹拌して反応させ、ＴＬＣにより原料が実質的に消失したことを確認した。

【0118】

（３）飽和塩化アンモニウム溶液(１００ｍＬ)を添加してクエンチし、分液し、ＤＣＭ（１００ｍＬ×２）で抽出した。

【0119】

（４）有機相を合わせて飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過して濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製（ＤＣＭ ／ ＭｅＯＨ ＝ ２０ ／ １）により、白色の固形化合物ＧＮ－１７－０１（１５ ｇ、収率９１％）を得た。

【0120】

【0121】

（１）ＧＮ－１７－０１（１５ｇ、２３．６７ ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５０ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（５０ｍＬ）を添加し、２５℃で１時間撹拌し、ＴＬＣにより原料が実質的に消失したことを確認し、濃縮した。

【0122】

（２）余分なＴＦＡをアセトニトリル(１００ｍＬ×３)とＴＦＡとの共沸により除去して、フォーム状固体ＧＮ－１７（ＴＦＡ塩、１２．６ｇ）を得た。

【0123】

【0124】

（１）Ｎ_２雰囲気で、ＮＣ－４（２．６ｇ、４．７ ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解し、氷水浴で０－５℃まで降温し、ＨＡＴＵ（５．６ｇ、１４．８３ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（４．８５ｇ、３７．６ ｍｍｏｌ）を添加し、２０分間撹拌した。

【0125】

（２）続いて、ＧＮ－１７（８．４５ｇ、１５．５ ｍｍｏｌ）を添加し、２５℃まで昇温し、４時間撹拌して反応させた。ＴＬＣ検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。

【0126】

（３）飽和塩化アンモニウム溶液（５０ｍＬ）を添加してクエンチし、分液し、ＤＣＭ（１００ｍＬ×２）で抽出した。

【0127】

（４）有機相を合わせて飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥した。

【0128】

（５）濾過、濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製（ＤＣＭ ／ ＭｅＯＨ ＝ １０ ／ １）により、白色の固形物ＴＯ－２３－０１（６．３ｇ、収率６３．１％）を得た。

【0129】

【0130】

（１）ＴＯ－２３－０１（６．３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１００ｍＬ）溶液に１０％Ｐｄ／Ｃ（６００ｍｇ）とＰｄ（ＯＨ）_２／Ｃ（６００ｍｇ）を添加し、Ｈ_２で３回置換し、２５℃で３時間撹拌して反応させ、ＴＬＣ（ＤＣＭ ／ ＭｅＯＨ ＝ ８ ／ １）検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。

【0131】

（２）濾過、濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製（ＤＣＭ ／ ＭｅＯＨ ／ ＴＥＡ ＝ １０ ／ １／ ０．１）により、白色の固形物ＴＯ－２３（４．５ｇ、収率７５％）を得た。

【0132】

^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ７．８８－７．８１ （ｍ， ９Ｈ）， ７．１４ （ｓ， １Ｈ）， ５．２１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．９５ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．２， ３．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．０７－３．９７ （ｍ， ９Ｈ）， ３．８８ （ｄｔ， Ｊ ＝ １１．０， ９．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．７７－３．７１ （ｍ， ３Ｈ）， ３．６３－３．５０ （ｍ， ２４Ｈ）， ３．４９－３．４１ （ｍ， ８Ｈ）， ３．３８－３．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０８－２．９８ （ｍ， １２Ｈ）， ２．３５－ ２．２５ （ｍ， １４Ｈ）， ２．１０ （ｓ， ９Ｈ）， ２．００ （ｓ， ９Ｈ）， １．８９ （ｓ， ９Ｈ）， １．７８ （ｓ， ９Ｈ）， １．４０－１．３３ （ｓ， １２Ｈ）．

【0133】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［１／２Ｍ ＋ Ｈ］^＋理論値は、１０００．５であり、実測値は、１０００．３である。

【0134】

【0135】

（１）Ｎ_２雰囲気で、ＴＯ－２３（２．３ｇ、１．１５ ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（０．８６ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）を添加し、

【0136】

シリンジを利用して２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．４６ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）溶液を徐々に滴加した。２５℃で１時間反応させた。ＴＬＣ検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。

【0137】

（２）飽和ＮａＨＣＯ_３（２０ｍＬ）を添加しクエンチし、分液し、有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３（２０ｍＬ）溶液、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過、濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製（シリカカラムを１．５％ＴＥＡ／ＤＣＭによって予め塩基性化しており、ＤＣＭ ／ ＭｅＯＨ ／ ＴＥＡ ＝ １５ ／ １／ ０．１である）により、白色の固形物ＴＰ－２３（１．８ｇ、収率７１．１％）を得た。

【0138】

^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ７．９１－７．７９ （ｍ， ９Ｈ）， ７．１５ （ｓ， １Ｈ）， ５．２１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．９５ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．２， ３．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．０６－３．９７ （ｍ， ９Ｈ）， ３．８８ （ｄｔ， Ｊ ＝ １１．１， ８．９ Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．７８－３．６６ （ｍ， ６Ｈ）， ３．６３－３．４１ （ｍ， ３６Ｈ）， ３．０７－２．９８ （ｍ， １２Ｈ）， ２．７６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３５－２．２４ （ｍ， １４Ｈ）， ２．１０ （ｓ， ９Ｈ）， ２．００ （ｓ， ９Ｈ）， １．８９ （ｓ， ９Ｈ）， １．７８ （ｓ， ９Ｈ）， １．４０－１．３３ （ｍ， １２Ｈ）， １．１３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．７， ４．１ Ｈｚ， １２Ｈ）、

【0139】

^３１Ｐ ＮＭＲ （１６２ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ １４７．８１、

【0140】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［１／２Ｍ ＋ Ｎａ］ ^＋理論値は、１１２２．５であり、実測値は、１１２２．４である。

【0141】

二、ＧａｌＮＡｃ標的ヘッド１０４６の合成

【0142】

以下の方法に応じて、ＴＯ２５及びＴＰ－２５（１０４６標的ヘッド結合ｓｉＲＮＡの前駆体）のジアステレオ異性体を合成した。

【0143】

【0144】

（１）Ｎ_２雰囲気で、１０００ｍＬ三口フラスコに、乾燥ＴＨＦ（３００ ｍＬ）を添加し、氷浴で０－５℃に降温して撹拌し、６０％ ＮａＨ（１４ｇ、３５４．８ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、続いて、２－クロロエチルオキシエタノール（４０ｇ、３２２．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２００ｍＬ）を徐々に滴加し、３０分間保温して反応させ、更に、反応フラスコにベンジルブロミド（６０．３ｇ、３５４．８ｍｍｏｌ）を滴加し、２５℃まで昇温して１６時間撹拌し、ＴＬＣ検出によれば、原料が実質的に消費されたことを確認した。

【0145】

（２）飽和塩化アンモニウム溶液（１５０ｍＬ）を徐々に滴加してクエンチし、分液し、水相をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×２）で抽出し、有機相を合わせて飽和食塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物に対して、シリカカラムクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル ／ ＥｔＯＡｃ ＝ ５／１）を行うことで、淡黄色油状化合物ＮＣ－６－０１（５３ｇ、収率７８％）を得た。

【0146】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［Ｍ ＋ Ｈ］ ^＋ 理論値は、２１５．１であり、実測値は、２１５．１である。

【0147】

【0148】

（１）エチレンジアミン（１９６ｇ、３．２６ｍｏｌ）を２０００ｍＬ三口フラスコに入れ、アセトニトリル（１０００ｍＬ）、炭酸カリウム（９０ｇ、０．６５ ｍｏｌ）及びヨウ化ナトリウム（６０．６ｇ、０．３３ｍｏｌ）を添加して撹拌した。続いて、ＮＣ－６－０１（７０ｇ、０．３３ｍｏｌ）のアセトニトリル（１００ｍＬ）溶液を反応フラスコに徐々に滴加し、６０℃まで昇温し、１６時間撹拌し、ＴＬＣ検出によれば、原料が実質的に消費されたことを確認した。

【0149】

（２）反応を中止し、濃縮し、精製水（３００ｍＬ）を添加し、濃塩酸でｐＨを４－５に調整し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ×３）で三回抽出し、水相に水酸化ナトリウム固形物を添加してｐＨを１３－１４に調整し、ＤＣＭ（２００ｍＬ×３）によって三回抽出し、有機相を合わせて飽和食塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過、濃縮して淡黄色油状物ＮＣ－６－０２（６９．５ｇ、８７％）を得た。

【0150】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［Ｍ ＋ Ｈ］ ^＋ 理論値は、２３９．２であり、時速値は、２３９．１である。

【0151】

【0152】

（１）ＮＣ－６－０２（６９．５ｇ、０．２９ｍｏｌ）とブロモ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（１８７ｇ、０．９６ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（７００ｍＬ）と精製水（３５０ｍＬ）に添加し、撹拌し、氷水浴で５℃以下に降温し、炭酸カリウム（３２２ｇ、２．３４ｍｏｌ）を添加した。２５℃で１４時間撹拌して反応させ、ＴＬＣ検出によれば、原料が完全に転化したことを確認した。

【0153】

（２）反応液に精製水（３００ｍＬ）を添加し、静置分層して有機相を分取し、水相をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ×２）によって二回抽出し、有機相を合わせて、飽和食塩水（５００ｍＬ）を添加して洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過、濃縮して淡黄色油状物ＮＣ－６－０３ （２０１ｇ）を得た。

【0154】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［Ｍ ＋ Ｈ］ ^＋ 理論値は、５８１．４であり、実測値は、５８１．３である。

【0155】

【0156】

（１）ＮＣ－６－０３（２３ｇ、３９．６ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（２００ｍＬ）に溶解し、濃塩酸（４０ｍＬ）を添加し、６０℃まで昇温して２時間反応させ、ＴＬＣ検出によれば、原料が実質的に消費されたことを確認した。

【0157】

（２）濃縮し、１，４－ジオキサン（２００ｍＬ）を再添加して濃縮し、白色の固形物粗生成物を得て、粗生成物を酢酸エチル（２００ｍＬ）に添加し、２時間パルプ化し、吸引ろかし、ケーキを収集し、５０℃で真空乾燥により白色固形化合物ＮＣ－６（２２．６ｇ、９６．９％）を得た。

【0158】

（３）ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［Ｍ ＋ Ｈ］ ^＋ 理論値は、４１３．２であり、実測値は、４１３．１である。

【0159】

【0160】

（１）Ｎ_２雰囲気で、ＮＣ－６（１．５ｇ、３．６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４．５ｇ、１２．０ ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（４．７５ｇ、３６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に添加し、３０分間撹拌し、続いて、ＧＮ－１７（６．４ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（４．７５ｇ、３６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液を滴加し、２５℃で１６時間撹拌し、ＬＣＭＳ検出によれば、原料が実質的に消費されたことを確認した。

【0161】

（２）ＤＣＭ（１００ｍＬ）を添加して希釈し、反応液に１ Ｎ塩酸溶液（８０ｍＬ×２）を添加して洗浄し、有機相を合わせて、飽和炭酸水素ナトリウム（１００ｍＬ）で洗浄し、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィーによる精製（ＤＣＭ ／ ＭｅＯＨ ＝ ７ ／ １）により、白色の固形化合物ＴＯ－２５－０１（４．３ｇ、収率６０％）を得た。

【0162】

（３）ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［Ｍ／２ ＋ Ｈ］ ^＋ 理論値は、９８０．０であり、実測値は、９７９．９である。

【0163】

【0164】

（１）ＴＯ－２５－０１（４．３ｇ、２．２ｍｍｏｌ）をメタノール（８０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム炭素（１．０ｇ）を添加し、Ｈ_２で三回置換し、２５℃で２時間撹拌し、ＬＣＭＳ検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。

【0165】

（２）ろ過、濃縮し、ＤＣＭ（２０ ｍＬ）を添加して溶解し、ＭＴＢＥ（３００ ｍＬ）に徐々に滴加し、３０分間撹拌して結晶化し、吸引濾過し、白色の固形化合物ＴＯ－２５（３．７ｇ、収率９０％）を得た。

【0166】

^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ８．４８ （ｄ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．８５ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．７， ６．８ Ｈｚ， ６Ｈ）， ５．２１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．９５ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．２， ３．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．０８－３．８３ （ｍ， １４Ｈ）， ３．７５ （ｐ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ， ５Ｈ）， ３．６８－３．２６ （ｍ， ２８Ｈ）， ３．２１－２．９５ （ｍ， １４Ｈ）， ２．３０ （ｑ， Ｊ ＝ ７．９， ６．７ Ｈｚ， ６Ｈ）， １．９４－１．７８ （ｍ，， ３６Ｈ）， １．４１－１．３８ （ｍ， １２Ｈ）、

【0167】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［１／２Ｍ ＋ Ｈ］ ^＋ 理論値は、９３４．９であり、実測値は、９３４．８である。

【0168】

【0169】

（１）Ｎ_２雰囲気で、ＴＯ－２５（７００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（０．３１ｍＬ、１．９ｍｍｏｌ）を添加し、シリンジを利用して２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１９ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）溶液を徐々に滴加し、２５℃で３０分間反応させ、ＴＬＣ検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。

【0170】

（２）飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍＬ）を添加してクエンチし、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、分液し、有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍＬ）溶液、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水ＮａＳＯ_４で乾燥し、ろ過、濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製（シリカカラムを１．５％ＴＥＡ／ＤＣＭによって予め塩基性化しており、ＤＣＭ ／ ＭｅＯＨ ／ ＴＥＡ ＝ １５ ／ １／ ０．１である）により、白色の固形物ＴＰ－２５（４０５ｍｇ、収率５３％）を得た。

【0171】

^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ８．１２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．９８－７．７５ （ｍ， ７Ｈ）， ５．２１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．９６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．２， ３．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．５４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．０２ （ｑ， Ｊ ＝ ５．３， ４．５ Ｈｚ， ９Ｈ）， ３．９５－３．８３ （ｍ， ３Ｈ）， ３．８２－３．５０ （ｍ， ２３Ｈ）， ３．４０－３．２６ （ｍ， ４Ｈ）， ３．１２－２．９４ （ｍ， ２７Ｈ）， ２．７６－２．５９ （ｍ， ７Ｈ）， ２．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ５Ｈ）， ２．１１－１．７８ （ｍ， ３８Ｈ）， １．３８ （ｓ， １２Ｈ）， １．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １２Ｈ）、

【0172】

^３１Ｐ ＮＭＲ （１６２ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ １４７．９７、

【0173】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［１／２Ｍ ＋ Ｎａ］ ^＋ の理論値は、１０５７．０であり、実測値は、１０５７．４である。

【0174】

三、ＧａｌＮＡｃ標的ヘッド１０４８の合成

【0175】

以下の方法に応じて、ＴＯ２６及びＴＰ－２６（１０４８標的ヘッド結合ｓｉＲＮＡのの前駆体）のジアステレオ異性体を合成した。

【0176】

【0177】

（１）Ｎ_２雰囲気で、ＧＣ－２（２０．１ｇ、３９．７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解し、ＣＤＩ（７．０９ｇ、７３．７ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、２５℃で３時間撹拌し、続いて、Ｎ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン（７．０ｇ、４３．７ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１２．０５ｇ、１１９．１ｍｍｏｌ）を反応液に添加し、１６時間反応させ、ＬＣＭＳ検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。

【0178】

（２）飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２００ｍＬ）を添加してクエンチし、分液し、水相をＤＣＭ（１００ｍＬ×３）で抽出し、有機相を合わせて、飽和塩化アンモニウム溶液（２００ｍＬ）、飽和塩化ナトリウム溶液（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄し、油状生成物を濃縮して白色の固形化合物ＧＮ－１８－０１（２４．４３ｇ、収率９５．１％）を得た。

【0179】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［Ｍ ＋ Ｈ］ ^＋ 理論値は、６５０．３であり、実測値は、６５０．５である。

【0180】

【0181】

（１）ＧＮ－１８－０１（４５．５２ｇ、７０ｍｍｏｌ）をＨＣｌ ／ ＥｔＯＡｃ溶液（２Ｎ、５００ｍＬ）に少しずつ添加し、２５℃で２時間撹拌し、ＬＣＭＳ検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。

【0182】

（２）溶媒を注ぎ出し、固形物を濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２００ｍＬ）でパルプ化して精製し、ろ過し、ろ過ケーキを４０℃で真空乾燥して白色の固形物ＧＮ－１８（４９．６ｇ）を得た。

【0183】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［Ｍ ＋ Ｈ］ ^＋ 理論値は、５５０．３であり、実測値は、５５０．５である。

【0184】

【0185】

（１）Ｎ_２雰囲気で、ＮＣ－６（１．５ｇ、３．６ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（６．２ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（４．７５ｇ、３６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に添加して３０分間撹拌し、続いて、ＧＮ－１８（６．６ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（４．７５ｇ、３６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５０ｍＬ）溶液を滴加し、２５℃で１６時間撹拌し、ＬＣＭＳ検出によれば、原料が実質的に消費されたことを確認した。

【0186】

（２）ＤＣＭ（１００ｍＬ）を添加して希釈し、反応液に１Ｎ塩酸溶液（８０ｍＬ×２）を添加して洗浄し、有機相を合わせて、飽和炭酸水素ナトリウム（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物に対して、シリカカラムクロマトグラフィーによる精製（ＤＣＭ ／ ＭｅＯＨ ＝ ７ ／ １）を行うことで、白色の固形化合物ＴＯ－２６－０１（４．７ｇ、収率６５％）を得た。

【0187】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［Ｍ／２ ＋ Ｈ］ ^＋ 理論値は、１００４．０であり、実測値は、１００４．２である。

【0188】

【0189】

（１）ＴＯ－２６－０１（４．０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）をメタノール（８０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム炭素（１．０ｇ）を添加し、Ｈ_２で三回置換し、２５℃で２時間撹拌し、ＬＣＭＳ検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。

【0190】

（２）ろ過、濃縮し、ＤＣＭ（２０ ｍＬ）を添加して溶解し、ＭＴＢＥ（２００ ｍＬ）に徐々に滴加し、３０分間撹拌して結晶化し、吸引濾過し、白色の固形化合物ＴＯ－２６（３．５ｇ、収率９１％）を得た。

【0191】

^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ８．５４ （ｓ， １Ｈ）， ８．１４ （ｓ， ２Ｈ）， ７．９５－７．９２ （ｍ， ３Ｈ）， ７．８４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ５．２１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．９７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．２， ３．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．５４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．１３－３．６６ （ｍ， ２１Ｈ）， ３．６０－３．４４ （ｍ， ３７Ｈ）， ３．１４ （ｄ， Ｊ ＝ １３．８ Ｈｚ， １５Ｈ）， ２．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ６Ｈ）， ２．１０ （ｓ， ９Ｈ）， ２．００ （ｓ， ９Ｈ）， １．８９ （ｓ， ９Ｈ）， １．７７ （ｓ， ９Ｈ）．

【0192】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ ［１／２Ｍ ＋ Ｈ］ ^＋ 理論値は、９５８．９であり、実測値は、９５９．１である。

【0193】

【0194】

（１）Ｎ_２雰囲気で、ＴＯ－２６（９００ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（１２ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（０．３９ｍＬ、０．４４ｍｍｏｌ）を添加し、シリンジを利用して２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２７７ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）溶液を徐々に滴加し、２５℃で３０分間反応させ、ＴＬＣ検出によれば、原料が実質的に消失したことを確認した。

【0195】

（２）飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍＬ）を添加してクエンチし、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、分液し、有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３（１０ｍＬ）溶液、飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水ＮａＳＯ_４で乾燥し、ろ過、濃縮して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製（シリカカラムを１．５％ＴＥＡ／ＤＣＭによって予め塩基性化しており、ＤＣＭ ／ ＭｅＯＨ ／ ＴＥＡ ＝ １５ ／ １／ ０．１である）により、白色の固形物ＴＰ－２６（６００ｍｇ、収率６０％）を得た。

【0196】

^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） ^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ ８．１５ （ｓ， ２Ｈ）， ７．９４－７．８１ （ｍ， ７Ｈ）， ５．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ３．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．９７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．２， ３．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．５５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， ３Ｈ）， ４．０３ （ｓ， ８Ｈ）， ３．８８ （ｄｔ， Ｊ ＝ １１．２， ８．９ Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．８１－ ３．６７ （ｍ， ７Ｈ）， ３．６４ － ３．４６ （ｍ， ３０Ｈ）， ３．１１ （ｄ， Ｊ ＝ １３．１ Ｈｚ， １９Ｈ）， ２．７６ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．６５ － ２．５４ （ｍ， ７Ｈ）， ２．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ７Ｈ）， ２．１１ （ｓ， ９Ｈ）， ２．００ （ｓ， ９Ｈ）， １．８９ （ｓ， ９Ｈ）， １．７７ （ｓ， ９Ｈ）， １．１３ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８， １２Ｈ）．

【0197】

^３１Ｐ ＮＭＲ （１６２ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ １４７．８９、

【0198】

ＭＳ （ＥＳＩ）： ｍ／ｚ １／２［Ｍ－ｉ－Ｐｒ_２Ｎ］ 理論値は、１００７．９であり、実測値は、１００８．２である。

【0199】

実施例３、インビトロでの結合ＧａｌＮＡｃ標的ヘッド結合（修飾）ｓｉＲＮＡコンジュゲートの構築

【0200】

以下のＲＮＡｉ剤二本鎖のアンチセンス鎖とセンス鎖のオリゴヌクレオチド配列部分、及び標的リガンドとＲＮＡとの連結は、いずれも、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２０１２， ７７， ４５６６-４５７７，Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ．， ８１， ｅ１０７に記載のホスホロアミダイトカップリング技術によるオリゴヌクレオチド合成用固相での合成に従う。標的リガンド１０４６、１０４８、１０４３はいずれも、チオリン酸エステル結合を介してｓｉＲＮＡセンス鎖の５'末端に連結される。

【0201】

１０４８である。

【0202】

【0203】

核酸配列において、Ａｏは、アデニンヌクレオチドを表し、Ｕｏは、ウリジンヌクレオチドを表し、Ｇｏは、グアノシンヌクレオチドを表し、Ｃｏは、シトシンヌクレオチドを表し、直接隣接するヌクレオチドの間に符号がなく、通常のリン酸エステル結合で連結されていることを示す。

【0204】

ＤＮＡ：Ａ Ｇ Ｃ Ｔ （Ａは、２'－デオキシアデニンヌクレオチドを表し、Ｔは、２'－デオキシシチミジンヌクレオチドを表し、Ｇは、２'－デオキシグアノシンヌクレオチドを表し、Ｃは、２'－デオキシシトシンヌクレオチドを表す）。

【0205】

２'－Ｆ：ａＦ ｇＦ ｃＦ ｕＦ （ａＦは、２'－フルオロアデニンヌクレオチドを表し、ｕＦは、２'－フルオロウリジンヌクレオチドを表し、ｇＦは、２'－フルオログアノシンヌクレオチドを表し、ｃＦは、２'－フルオログアノシンヌクレオチドを表す）。

【0206】

２'－ＯＭｅ：ａＭ ｇＭ ｃＭ ｕＭ（ａＭは、２'－Ｏ－メチルアデニンヌクレオチドを表し、ｕＭは、２'－Ｏ－メチルウリジンヌクレオチドを表し、ｇＭは、２'－Ｏ－メチルグアノシンヌクレオチドを表し、ｃＭは、２'－Ｏ－メチルシトシンヌクレオチドを表す）。

【0207】

＊：は、チオリン酸エステル結合で連結されることを表す。

【0208】

配列におけるｙ、ｚは、標的ヘッドの位置を表す。

【0209】

実施例４：インビトロ細胞モデル（Ｈｅｐ ３Ｂ細胞）によるコンジュゲートの活性の試験

【0210】

ヒト肝臓癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞（中国科学院上海細胞バンク）を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳ）において培養し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で培養した（ｉｌ６０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。トランスフェクト実験の当日に、０．２５％ Ｔｒｙｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳ）を用いて細胞を消化し、計数し、４５０μＬ／ウェル、５万／ウェルの密度で２４ウェルプレートに接種した。続いて、ｌｉｐｏｆｅｃｔｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）トランスフェクト方式で、被験試料を添加した。ＲＮＡｉＭＡＸ試薬マニュアルにおける標準フローに応じてトランスフェクトを行い、ｓｉＲＮＡの最終濃度は、１０ｎＭ／１ｎＭ／ ０．５ｎＭ／０．２５ｎＭ／０．１ｎＭ／０．０５ｎＭ／０．０１ｎＭであった。トランスフェクト群について、ｓｉＮＣを陰性対照とし、その配列は、以下のとおりである。

【0211】

センス鎖（ｓｅｎｓｅ）：５'－ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵＴＴ－３'

【0212】

アンチセンス鎖（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）：５'－ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡＴＴ－３'。

【0213】

２４ｈ後、細胞の総ＲＮＡを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）により、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列の発現状況を検出し、ここで、内部標準遺伝子ＰＰＩＢ 、ＡＮＧＰＴＬ３の増幅に用いられるＰＣＲプライマーは、表１に示すとおりである。

【0214】

各コンジュゲートの活性試験結果（ＥＣ_５０値）は、図４に示すとおりである。

【0215】

ＥＣ_５０値は、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍの非線形回帰によって算出され、半分のターゲットｍＲＮＡ（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現量を阻害する時のコンジュゲートの使用量を表す。

【0216】

結果から分かるように、選択されたコンジュゲートは、インビトロでの活性試験の実験において、ＡＮＧＰＴＬ３の相対的表現レベルを良好に低下させた結果が示された。

【0217】

実施例５：ＡＡＶ－ｈＡＮＧＰＴＬ３マウスモデルの構築及び投与試験

【0218】

実験動物の基本情報：

【0219】

実験動物は、済南朋悦実験動物繁殖有限公司から購入され、ＳＰＦ級動物である。投与前に、上記マウスの体重を測定し、状態を観察した。体重が均一であり、状態に異常がない動物を選択して後続の実験を行った。

【0220】

【0221】

モデル構築及び投与：各マウスに、２．５＊１０＾１１力価のウイルス溶液を、尾静脈を介して注射し、１００ｕＬとする。7日後、実験動物をランダムにグループ化し、各被験体に対して５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。投与してから７２時間の後に、頚椎脱臼によって動物を犠牲し、肝組織を採取し、ＲＮＡの抽出と定量を行った。

【0222】

各コンジュゲートの結果は、表３に示される。

【0223】

【0224】

本明細書の記載において、「一実施例」、「いくつかの実施例」、「例」、「具体的な例」、又は「いくつかの例」などの用語に関する記載は、その実施例又は例に関連して記載される具体的な特徴、構造、材料、又は特性が、本開示の少なくとも1つの実施例又は例に含まれることを意味する。本明細書において、上記用語の概略的な記述は、必ずしも同じ実施例又は例に向けられるものではない。そして、説明された具体的な特徴、構造、材料又は特性は、いずれか１つ又は複数の実施例又は例において、適切な方法で組み合わされ得る。なお、当業者は、互いに矛盾しない限り、本明細書に記載された異なる実施例又は例及び異なる実施例又は例の特徴を結合して組み合わせることができる。

【0225】

以上において、本開示の実施例を示して記述したが、理解できるように、上記実施例は、例示的なものであり、本開示を限定するものと理解されるべきではない。当業者であれば、本開示の範囲内に上記実施例に対して変更、修正、置き換え及び変形を行うことができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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