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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-15
(45)【発行日】2024-11-25
(54)【発明の名称】プロテオグリカンの製造方法
(51)【国際特許分類】
C08B 37/00 20060101AFI20241118BHJP
A61K 135/00 20060101ALN20241118BHJP
A61P 29/00 20060101ALN20241118BHJP
A61P 43/00 20060101ALN20241118BHJP
A61P 19/04 20060101ALN20241118BHJP
A61Q 19/08 20060101ALN20241118BHJP
A61K 8/73 20060101ALN20241118BHJP
A61K 38/39 20060101ALN20241118BHJP
A61K 36/185 20060101ALN20241118BHJP
A61K 8/9789 20170101ALN20241118BHJP
【ＦＩ】
C08B37/00 Q
A61K135:00
A61P29/00
A61P43/00 105
A61P19/04
A61Q19/08
A61K8/73
A61K38/39
A61K36/185
A61K8/9789
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2023556358
(86)(22)【出願日】2022-10-19
(86)【国際出願番号】 JP2022038901
(87)【国際公開番号】W WO2023074491
(87)【国際公開日】2023-05-04
【審査請求日】2024-04-10
(31)【優先権主張番号】P 2021178577
(32)【優先日】2021-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000119472
【氏名又は名称】一丸ファルコス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110003557
【氏名又は名称】弁理士法人レクシード・テック
(72)【発明者】
【氏名】高橋 達治
(72)【発明者】
【氏名】岡本 知也
(72)【発明者】
【氏名】子安 伶奈
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 賢一
【審査官】三木 寛
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－１６８２６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－１７２７１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０２０／１７５６１８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０２１－０１６３３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０２０－１１０１４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Ghosh KANIKA, et al.，Chemical structure of the arabinogalactan protein from gum ghatti and its interaction with bovine se，Carbohydrate Polymers，2015年，Vol.117，p.370-376
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０８Ｂ ３７／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
溶媒を水としてガティガムを溶解する工程、精密濾過膜を用いて、当該溶解する工程で得られる溶解液の分子量分画を行う工程、
を含み、
前記精密濾過膜は、公称孔径０．１～１０μｍであり、
プルラン換算での分子量は、２０万～５０万であり、
プルラン換算でのピークトップの分子量は、３０万～４０万である、ガティガム由来のプロテオグリカンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【クロスリファレンス】
【0001】
本出願は、日本国において、２０２１年１１月１日に出願された特願２０２１－１７８５７７号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容はすべて参照によりそのまま本明細書に援用される。
【技術分野】
【0002】
本発明は、例えば、植物からプロテオグリカンを抽出する工程などを含む植物由来のプロテオグリカンの製造方法、に関する。
【背景技術】
【0003】
プロテオグリカン（以下「ＰＧ」と称する場合がある。）は、１本のコアタンパク質にコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸等のグリコサミノグリカンが数本から数十本、共有結合した糖タンパク質であり、細胞外マトリックスの一つとして皮膚や軟骨など体内に広く分布している。軟骨中のＰＧは、コラーゲンやヒアルロン酸と共に凝集体を形成しており、代表的な軟骨型ＰＧは、アグリカンと称される。アグリカンはコアタンパク質に大量のグリコサミノグリカン糖鎖が結合すると共に、そのＮ末端側には、ヒアルロン酸およびリンクタンパク質の結合領域を有する。
【0004】
グリコサミノグリカンは分岐をもたない長い直鎖構造を持ち、多数の硫酸基とカルボシキル基を持つため負に荷電しており、その電気的反発力のために伸びた形状をとる。また、糖の持つ水親和性により、多量の水を保持し、弾力や衝撃への耐性といった軟骨特有の機能を担っている。さらに、ＰＧには抗炎症作用、ヒアルロン酸合成促進作用、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）様作用等多くの生理機能を有することが明らかとなり、食品や化粧品への応用に期待が寄せられている。動物由来のプロテオグリカンとしては、例えば、サケ鼻軟骨、イカ頭部軟骨を由来としたものが知られている。
【0005】
しかし、動物由来のプロテオグリカンは軟骨に微量に存在する物質であるため、製造コストが高いという問題があった。また、化粧品市場や食品市場においては、動物由来成分よりも植物由来成分の方がイメージに優れるため、動物性プロテオグリカンも植物由来成分で代替することが求められていた（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２０１９－１７２７１８号公報
【文献】ＷＯ２０１８／０６２５５４公報
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ８９（４）： ４９８－５０７ （２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、このような状況下においてなされたものであってその目的とするところは、植物から優れた生理作用を有する植物由来のプロテオグリカンを製造する方法を提供することなど、である。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記課題を解決するために、本発明者らは、ガディガムから、アラビノガラクタン－プロテインを所定量含む植物由来のプロテオグリカンを効率的及び所定の純度で製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
（１）溶媒を水としてシクンシ科の植物の部位を溶解する工程、
当該溶解する工程で得られる溶解液の分子量分画を行う工程、を含む分子量が１万より大きく５００万以下の植物由来のプロテオグリカンの製造方法。
（２）分子量が５万より大きく１００万以下の植物由来のプロテオグリカンを製造する、（１）記載の方法。当該分子量の下限は、より好ましくは１０００、更に好ましくは２０万、更に好ましくは３０万、である。当該分子量の上限は、より好ましくは５０万、更に好ましくは４０万、である。
（３）公称孔径０．１～２５０μｍ（より好ましくは０．１～１０μｍ）の精密濾過膜を用いる、（１）又は（２）記載の方法。
（１）溶媒を水としてシクンシ科の植物の部位を溶解する工程、
当該溶解する工程で得られる溶解液の分子量分画を行う工程、を含む分子量が１万より大きく５００万以下の植物由来のプロテオグリカンの製造方法。
（２）分子量が５万より大きく１００万以下の植物由来のプロテオグリカンを製造する、（１）記載の方法。当該分子量の下限は、より好ましくは１０００、更に好ましくは２０万、更に好ましくは３０万、である。当該分子量の上限は、より好ましくは５０万、更に好ましくは４０万、である。
（３）公称孔径０．１～２５０μｍ（より好ましくは０．１～１０μｍ）の精密濾過膜を用いる、（１）又は（２）記載の方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明の植物由来のプロテオグリカンの製造方法は、植物から優れた生理作用を有する植物由来のプロテオグリカンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】製造例１の組成物をＨＰＬＣで分析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明を実施形態に即して説明する。
【0014】
（由来する）
本願の明細書等中、「由来する」なる語句は、以下（１）から（３）を包含することを意図して用いられる。
（１）精製されていること、
（２）単離されていること、及び／又は
（３）改変［これは、低分子化処理、及び高分子化処理（重合）を包含する］若しくは修飾されていること
本願の明細書等中、「由来する」なる語句は、以下（１）から（３）を包含することを意図して用いられる。
（１）精製されていること、
（２）単離されていること、及び／又は
（３）改変［これは、低分子化処理、及び高分子化処理（重合）を包含する］若しくは修飾されていること
【0015】
（植物由来のプロテオグリカン）
本発明における「植物由来のプロテオグリカン」は、シクンシ科の植物の部位（ガティガムなどの樹液も含む）から抽出等の工程を経て得られるものである。本発明者は、当該植物の部位を用いることで、高純度及び／又は高効率でアラビノガラクタン－プロテイン（ＡＧＰ）が含有された組成物を製造できると考え、本発明を発明した。
本発明における「植物由来のプロテオグリカン」は、シクンシ科の植物の部位（ガティガムなどの樹液も含む）から抽出等の工程を経て得られるものである。本発明者は、当該植物の部位を用いることで、高純度及び／又は高効率でアラビノガラクタン－プロテイン（ＡＧＰ）が含有された組成物を製造できると考え、本発明を発明した。
【0016】
シクンシ科（Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｓ ｉｎｄｉｃａ Ｌ．）の植物は、中国南部や東南アジアなどに分布し、薬用や観賞用に栽培されている常緑のつる性木本植物である。生育初期には低木状だが、その後、他物に絡みつきながら１０ｍくらい伸長する。
【0017】
ガティノキは、主にインド中部の森林に自生し、滑らかな白色の樹皮が特徴的な落葉喬木である。
【0018】
ガティガムは、シクンシ科ガティノキ（Ａｎｏｇｅｉｓｓｕｓ ｌａｔｉｆｏｌｉａ Ｗａｌｌｉｃｈ）の幹の裂傷から分泌される樹液が乾燥固化したもので、別名Ｉｎｄｉａｎ Ｇｕｍとも呼ばれる。ガティガムの主成分は、アラビノース、ガラクトース、マンノース、キシロース、及びグルクロン酸を構成糖とする水溶性多糖類で、天然には主にＣａ、Ｍｇ、Ｋ塩として存在する。ガティガムは、通常、室温、又はそれ以上の温度条件下で、３０質量％程度まで水に溶解する。ガティガムは、約３％のタンパク質を含み、アラビアガムと同様に「多糖タンパク質複合体」を形成する（特許文献２）。
【0019】
本発明における「植物由来のプロテオグリカン」は、アラビノガラクタン－プロテイン（ＡＧＰ）も含む。アラビノガラクタン－プロテイン（ＡＧＰ）は植物組織に普遍的に分布しているプロテオグリカンで、主に細胞壁（細胞外マトリックス）に局在している。ＡＧＰは一般的にはヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に富むコアタンパク質に、ガラクトース（Ｇａｌ）とＬ－アラビノース（Ｌ－Ａｒａ）に富むアラビノガラクタン（ＡＧ）糖鎖が結合している。コアタンパク質の種類も多く、糖鎖の構造も複雑で多様性に富んでいる（非特許文献１）。
【0020】
本発明で使用する溶媒は、例えば、酢酸、水、クエン酸、アルカリ溶液、界面活性剤溶液などを適宜選択できる。
【0021】
プロテオグリカン抽出液を粉末セルロース及び／又は吸油マットなどを用いることにより、混入する脂質成分などを簡便に吸着除去することも可能である。例えば、粉末セルロースとしてはセルロースファイバー（日本製紙（株）；ＫＣフロックＷ－５０（Ｓ）、ＫＣフロックＷ－５０、ＫＣフロックＷ－１００、ＫＣフロックＷ－１００Ｇ、ＫＣフロックＷ－２００、ＫＣフロックＷ－２００Ｇ、ＫＣフロックＷ－２５０、ＫＣフロックＷ－３００Ｇ、ＫＣフロックＷ－４００Ｇ、ＮＰファイバーＷ－１００Ｆ、ＮＰファイバーＷ－３００Ｆ、ＮＰファイバーＷ－１０ＭＧ２、ＮＰファイバーＷ－０６ＭＧ、ＫＣフロックＷ－５０ＧＫ、ＫＣフロックＷ－１００ＧＫ、レッテンマイヤー社製；ＶＩＴＡＣＥＬ－Ｌ１０、ＶＩＴＡＣＥＬ－Ｌ２０、ＶＩＴＡＣＥＬ－Ｌ６００－３０、ＶＩＴＡＣＥＬ－Ｌ９０、ＡＲＢＯＣＥＬ－ＢＭＷ４０、ＶＩＴＡＣＥＬ－Ｌ５００）などが挙げられる。吸油マットとしては、主にポリプロピレンを原料とする繊維不織布が好ましい。その例として、例えば前田工繊（株）製；油吸着シートＳＰ－１３００Ｎ（ＤＸ）、油吸着シートＳＰ－１１００Ｎ、日本製紙クレシア（株）製；オイル吸着マットＰＰ－１００シリーズ、田中産業（株）；ルックリンＡ－５０、ルックリンＢ－５０、その他、ポリオレフィンとポリエステルを原料とする繊維不織布として、日本製紙クレシア（株）製；パワフルＥＣＯシリーズ、主にコットンを原料とする吸油マットとして、大王製紙（株）；プロワイプ・コットンオイルマットなどが挙げられる。
【0022】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、各種成分の添加量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。
【実施例】
【0023】
（製造例１：ガティガム由来のプロテオグリカンを含有する組成物の製造）
以下のように、当該組成物を製造した。
以下のように、当該組成物を製造した。
【0024】
１．溶解工程
ガティガム（２．５ｋｇ）を、２０倍の精製水（５０ｋｇ）に、溶解させた。
ガティガム（２．５ｋｇ）を、２０倍の精製水（５０ｋｇ）に、溶解させた。
【0025】
２．限外ろ過工程
孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターを通して得られた濾過液に精製水を加えて、限外ろ過工程で用いる溶液を作製した。当該作製した溶液に対して、限外ろ過を行い、分子量５万以下の溶液を除去して、分子量５万超の溶液（３９ｋｇ）を回収した。
孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターを通して得られた濾過液に精製水を加えて、限外ろ過工程で用いる溶液を作製した。当該作製した溶液に対して、限外ろ過を行い、分子量５万以下の溶液を除去して、分子量５万超の溶液（３９ｋｇ）を回収した。
【0026】
３．濾過工程
２．の工程により回収した分子量５万超の溶液（３９ｋｇ）を、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターに通し、当該通った濾過液を回収した。
２．の工程により回収した分子量５万超の溶液（３９ｋｇ）を、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターに通し、当該通った濾過液を回収した。
【0027】
４．凍結乾燥
３．の工程より得られた濾過液凍結乾燥により、乾燥物（ガティガム由来のプロテオグリカンを含有する組成物１．４ｋｇ）を得た。
３．の工程より得られた濾過液凍結乾燥により、乾燥物（ガティガム由来のプロテオグリカンを含有する組成物１．４ｋｇ）を得た。
【0028】
なお、この乾燥物だが、２０℃の水１００ｍＬに対して１０ｇ溶解する。この溶解によりできた溶液は透明であった。
【0029】
（製造例１の組成物の分析）
製造例１の組成物の以下分析等を行った。
（１）ＡＧＰ定性分析
（２）糖組成分析
（３）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによるタンパク質含有量の定量
（４）アミノ酸自動分析装置を用いてのアミノ酸の分析
（５）ＨＰＬＣ分析
製造例１の組成物の以下分析等を行った。
（１）ＡＧＰ定性分析
（２）糖組成分析
（３）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによるタンパク質含有量の定量
（４）アミノ酸自動分析装置を用いてのアミノ酸の分析
（５）ＨＰＬＣ分析
【0030】
（１）ＡＧＰ定性分析
製造例１の組成物に、アラビノガラクタン―プロテイン（ＡＧＰ）が含有されているかを確認した。ＡＧＰに特異的に結合するヤリブ試薬（Ｂｉｏｓｕｐｐｌｉｅｓ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、１００－２）を用いて、ヤリブ沈殿により当該確認を行った。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液ではＡＧＰ－ヤリブ試薬複合体として沈殿する性質を利用した。製造例１の組成物を０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液に溶解させた。ヤリブ試薬も０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液に溶解させた。調整した溶液を等量混合し、４℃で一晩静置した。当該静置後、当該溶液の沈殿を見たところ、赤色の沈殿を確認した。当該確認より、製造例１の組成物に、アラビノガラクタン―プロテイン（ＡＧＰ）が含有されていることを確認した。この確認により、製造例１の組成物が植物由来のプロテオグリカンを含有していることを確認した。
製造例１の組成物に、アラビノガラクタン―プロテイン（ＡＧＰ）が含有されているかを確認した。ＡＧＰに特異的に結合するヤリブ試薬（Ｂｉｏｓｕｐｐｌｉｅｓ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、１００－２）を用いて、ヤリブ沈殿により当該確認を行った。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液ではＡＧＰ－ヤリブ試薬複合体として沈殿する性質を利用した。製造例１の組成物を０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液に溶解させた。ヤリブ試薬も０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液に溶解させた。調整した溶液を等量混合し、４℃で一晩静置した。当該静置後、当該溶液の沈殿を見たところ、赤色の沈殿を確認した。当該確認より、製造例１の組成物に、アラビノガラクタン―プロテイン（ＡＧＰ）が含有されていることを確認した。この確認により、製造例１の組成物が植物由来のプロテオグリカンを含有していることを確認した。
【0031】
（２）糖組成分析
糖組成分析を行ったが、製造例１の組成物には、糖が約８３％含有されていた。
糖組成分析を行ったが、製造例１の組成物には、糖が約８３％含有されていた。
【0032】
製造例１の組成物における、糖及びタンパク質の含有量の内訳は以下の通りであった。
・アラビノース（３９．３％）、ガラクトース（３３．６％）、グルクロン酸（４．５％）、マンノース（２．５％）、キシロース（１．６％）、ラムノース（１％）、タンパク質（２％）、その他（１５．５％）
・アラビノース（３９．３％）、ガラクトース（３３．６％）、グルクロン酸（４．５％）、マンノース（２．５％）、キシロース（１．６％）、ラムノース（１％）、タンパク質（２％）、その他（１５．５％）
【0033】
（３）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによるタンパク質含有量の定量
ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによるタンパク質含有量の定量にて、当該組成物に約２％のタンパク質を含有されていることを確認した。
ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙによるタンパク質含有量の定量にて、当該組成物に約２％のタンパク質を含有されていることを確認した。
【0034】
（４）アミノ酸自動分析装置を用いてのアミノ酸の分析
アミノ酸の分析にて、当該組成物中のタンパク質において、約０．５％のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）が含まれことを確認した。ヒドロキシプロリンは、植物性プロテオグリカンの糖鎖の結合点である。
アミノ酸の分析にて、当該組成物中のタンパク質において、約０．５％のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）が含まれことを確認した。ヒドロキシプロリンは、植物性プロテオグリカンの糖鎖の結合点である。
【0035】
（５）ＨＰＬＣ分析
製造例１の組成物のＨＰＬＣ分析を行った。製造例１の組成物（乾燥物）で得た品約１ｇを精密に量り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて正確に１０ｍＬとしたものを試料溶液とした。各試料を０．４５μｍメンブレンフィルターに通した後、以下の操作条件でＨＰＬＣを行い以下検量線から分子量を求めた。
製造例１の組成物のＨＰＬＣ分析を行った。製造例１の組成物（乾燥物）で得た品約１ｇを精密に量り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて正確に１０ｍＬとしたものを試料溶液とした。各試料を０．４５μｍメンブレンフィルターに通した後、以下の操作条件でＨＰＬＣを行い以下検量線から分子量を求めた。
【0036】
また、分子量マーカーとして、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ－８２（昭和電工社製）を用いて作成した検量線からピークトップの分子量を求めた。なお、分子量５０００～８０００００の範囲の検量線（標準プルラン）を作成した。
【0037】
操作条件
分析計：ＨＰＬＣ分析装置
検出器：示差屈折率検出器（ＲＩＤ－１０Ａ 島津製作所製）
カラム：ゲルろ過カラム（東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０μＬ
移動相：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
分析計：ＨＰＬＣ分析装置
検出器：示差屈折率検出器（ＲＩＤ－１０Ａ 島津製作所製）
カラム：ゲルろ過カラム（東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０μＬ
移動相：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
【0038】
【0039】
［試験例１］ヒト表皮角化細胞増殖試験
ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫ（成人表皮角化細胞、クラボウ、ＫＫ－４１０９）を、３×１０３個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した９６ウェルプレートに播種し、増殖添加剤を添加した表皮角化細胞増殖基本培地（ＫＢＭ培地、クラボウ）にて、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該ヒト表皮角化細胞を培養した。その後、増殖添加剤としてＦＧＦ及びＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出物）を除いた表皮角化細胞増殖基本培地へ置換し、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、３日間培養した。３日間の培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８を用いて、各群（試料１から試料５の群）のヒト表皮角化細胞数を測定した。当該測定は、各群（試料１から試料５の群）において５サンプルずつ行った。以下表１では、各群において５サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表１の「＊＊」は、試料１の群の値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫ（成人表皮角化細胞、クラボウ、ＫＫ－４１０９）を、３×１０３個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した９６ウェルプレートに播種し、増殖添加剤を添加した表皮角化細胞増殖基本培地（ＫＢＭ培地、クラボウ）にて、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該ヒト表皮角化細胞を培養した。その後、増殖添加剤としてＦＧＦ及びＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出物）を除いた表皮角化細胞増殖基本培地へ置換し、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、３日間培養した。３日間の培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８を用いて、各群（試料１から試料５の群）のヒト表皮角化細胞数を測定した。当該測定は、各群（試料１から試料５の群）において５サンプルずつ行った。以下表１では、各群において５サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表１の「＊＊」は、試料１の群の値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
【0040】
・試料１の群：コントロールとして、所定量の精製水を添加。
・試料２の群：最終濃度２００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料４の群：最終濃度２００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料５の群：最終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料２の群：最終濃度２００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料４の群：最終濃度２００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料５の群：最終濃度４００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
【0041】
なお、市販のアラビアゴム含有組成物として、アラビアゴム（富士フイルム和光純薬、０１６－０００２５、ＣＡＳ ＲＮＴＭ：９０００－０１－５）を用いた。
【0042】
【表1】
【0043】
表１に示す結果より、製造例１で得られた組成物を添加した群（試料２及び３の群）では、市販のアラビアゴム含有組成物の添加群（試料４及び５の群）と比較して、ヒト表皮角化細胞増殖能が高いことが確認できた。
【0044】
［試験例２］ヒト線維芽細胞増殖試験
製造例１で得られた組成物についてのヒト線維芽細胞増殖能の有無を評価した。５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地が各ウェルに存在した９６ウェルプレートを準備した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに４×１０３個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した９６ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地から０．２５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地へ置換して、置換後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、３日間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。３日間の培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて、各群（試料１から試料５の群）の正常ヒト皮膚線維芽細胞数を測定した。当該測定は、各群（試料１から試料７の群）において５サンプルずつ行った。以下表２では、各群において５サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表２の「＊＊」は、試料１の群の値と比べての Ｔｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。表２の「（††）」は、試料７の値と比べてのＴｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
製造例１で得られた組成物についてのヒト線維芽細胞増殖能の有無を評価した。５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地が各ウェルに存在した９６ウェルプレートを準備した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに４×１０３個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した９６ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地から０．２５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地へ置換して、置換後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、３日間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。３日間の培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて、各群（試料１から試料５の群）の正常ヒト皮膚線維芽細胞数を測定した。当該測定は、各群（試料１から試料７の群）において５サンプルずつ行った。以下表２では、各群において５サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表２の「＊＊」は、試料１の群の値と比べての Ｔｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。表２の「（††）」は、試料７の値と比べてのＴｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
【0045】
・試料１の群：コントロールとして、所定量の精製水を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料４の群：最終濃度１０００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料５の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料６の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料７の群：最終濃度１０００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料４の群：最終濃度１０００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料５の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料６の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
・試料７の群：最終濃度１０００μｇ／ｍＬとなるように、市販のアラビアゴム含有組成物を添加。
【0046】
なお、市販のアラビアゴム含有組成物として、アラビアゴム（富士フイルム和光純薬、０１６－０００２５、ＣＡＳ ＲＮＴＭ：９０００－０１－５）を用いた。
【0047】
【表2】
【0048】
表２に示す結果より、製造例１で得られた組成物を添加した群（試料２及び３の群）では、市販のアラビアゴム含有組成物の添加群（試料４及び５の群）と比較して、ヒト線維芽細胞増殖能が高いことが確認できた。また、試料７の群に比べ、試料４の群では、ヒト線維芽細胞増殖能が有意に高いことが確認できた。
【0049】
［試験例３］１型コラーゲン産生促進活性（ＥＬＩＳＡによる検出）
製造例１で得られた組成物についての１型コラーゲン産生促進活性の有無をＥＬＩＳＡにより評価した。
５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地が各ウェルに存在した２４ウェルプレートを準備した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに２×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した２４ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、コンフルエントになるまで当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地から０．２５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地へ置換して、置換後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、１日間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。当該培養後の細胞培養上清に対して、ＰＩＰ ＥＩＡ ＫＩＴ（タカラバイオ）を用いて、各群の１型コラーゲンの産生量（ｎｇ／ｍＬ）を評価した。当該測定は、各群（試料１から試料３の群）において３サンプルずつ行った。以下表４では、各群において３サンプルの平均値を算出した結果を示す。表３の「＊＊」は、試料１の群の平均値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
製造例１で得られた組成物についての１型コラーゲン産生促進活性の有無をＥＬＩＳＡにより評価した。
５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地が各ウェルに存在した２４ウェルプレートを準備した。正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに２×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した２４ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、コンフルエントになるまで当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔｒａｃｅ製）を含むＤＭＥＭ培地から０．２５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地へ置換して、置換後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、１日間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。当該培養後の細胞培養上清に対して、ＰＩＰ ＥＩＡ ＫＩＴ（タカラバイオ）を用いて、各群の１型コラーゲンの産生量（ｎｇ／ｍＬ）を評価した。当該測定は、各群（試料１から試料３の群）において３サンプルずつ行った。以下表４では、各群において３サンプルの平均値を算出した結果を示す。表３の「＊＊」は、試料１の群の平均値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
【0050】
・試料１の群：コントロールとして、所定量の精製水を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
【0051】
以下表３で示すように、製造例１で得られた組成物を投与することにより、１型コラーゲン産生促進活性が向上されることが確認できた。
【0052】
【表3】
【0053】
［試験例４］１型コラーゲン遺伝子発現（ｑＲＴ－ＰＣＲによる検出）
製造例１で得られた組成物についての１型コラーゲン遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより評価した。
正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに２×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した２４ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、コンフルエントになるまで当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、ＤＭＥＭ培地から試験用ＤＭＥＭ培地（試験例２と異なり血清を含有しない培地）へ置換してさらに２４時間培養した。培養後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコルに従って、当該培養した細胞を回収し、ｍＲＮＡを精製した。精製したｍＲＮＡはＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）のプロトコルに従って逆転写反応を行い、反応生成物に対してＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ ＩＩ （ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）を使用してＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ－ＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行い、付属のソフトウェアを用いて目的遺伝子の発現量を定量化した。当該測定は、各群（試料１から試料３の群）において３サンプルずつ行った。以下表４では、各群において３サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表４の「＊＊」は、試料１の群の値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
製造例１で得られた組成物についての１型コラーゲン遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより評価した。
正常ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ）を、各ウェルに２×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数となるように、当該準備した２４ウェルプレートに播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、コンフルエントになるまで当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。その後、ＤＭＥＭ培地から試験用ＤＭＥＭ培地（試験例２と異なり血清を含有しない培地）へ置換してさらに２４時間培養した。培養後、以下試料を各ウェルに投与し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２４時間、当該正常ヒト皮膚線維芽細胞を培養した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコルに従って、当該培養した細胞を回収し、ｍＲＮＡを精製した。精製したｍＲＮＡはＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）のプロトコルに従って逆転写反応を行い、反応生成物に対してＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ ＩＩ （ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）を使用してＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ－ＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６システム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行い、付属のソフトウェアを用いて目的遺伝子の発現量を定量化した。当該測定は、各群（試料１から試料３の群）において３サンプルずつ行った。以下表４では、各群において３サンプルの平均値を算出した結果を用いて、試料１の群の平均値の値を１００としたときの相対値を示す。表４の「＊＊」は、試料１の群の値と比べてのＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによる有意差（ｐ＜０．０５）、を示す。
【0054】
・試料１の群：コントロールとして、所定量の精製水を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料２の群：最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
・試料３の群：最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように、製造例１で得られた組成物を添加。
【0055】
以下表４で示すように、製造例１で得られた組成物を投与することにより、試験例３だけでなくこの試験例４でも１型コラーゲン産生促進活性が向上されることが確認できた。
【表4】
【0056】
［実験５］ヒトモニター試験による肌状態改善作用の評価
２０２１年１２月から２０２２年１月の期間で、３０歳以上の健康な男女１２名（平均年齢４９．８歳）を被験者として、このモニター試験を行った。なお、以下表５で示すローションでは、製造例１で得られた組成物を最終濃度１質量％となるように、３０％１，３－ブチレングリコールに溶解した溶液（表５では、製造例１で得られた組成物の溶液と記載）を用いた。
２０２１年１２月から２０２２年１月の期間で、３０歳以上の健康な男女１２名（平均年齢４９．８歳）を被験者として、このモニター試験を行った。なお、以下表５で示すローションでは、製造例１で得られた組成物を最終濃度１質量％となるように、３０％１，３－ブチレングリコールに溶解した溶液（表５では、製造例１で得られた組成物の溶液と記載）を用いた。
【0057】
（試験方法）
表５で示す組成のローション（表５ローション）を被験者の顔の左半分に所定間隔にて塗布し、表６に示すローション（表６ローション）を被験者の顔の右半分に所定間隔にて塗布した。この所定間隔は、１日２回ずつ（朝晩）４週間である。４週間後には、被験者１人あたり、表５ローションが２４ｇ及び表６ローションが２４ｇの量が塗布された。そして、これらのローションの塗布前の０日と、ローションを塗布してから４週間目に、測定（シワの有無の測定など）を行った。
表５で示す組成のローション（表５ローション）を被験者の顔の左半分に所定間隔にて塗布し、表６に示すローション（表６ローション）を被験者の顔の右半分に所定間隔にて塗布した。この所定間隔は、１日２回ずつ（朝晩）４週間である。４週間後には、被験者１人あたり、表５ローションが２４ｇ及び表６ローションが２４ｇの量が塗布された。そして、これらのローションの塗布前の０日と、ローションを塗布してから４週間目に、測定（シワの有無の測定など）を行った。
【0058】
【表5】
【0059】
【表6】
【0060】
（シワの有無の測定）
ＡＮＴＥＲＡ ３ＤＴＭ（ミラベックス）を用いて、被験者１２名の目尻のシワの有無の測定及びほうれい線の有無の測定を行った。以下、「目尻のシワの測定」及び「ほうれい線のシワの測定」において、当該１２名の平均値（当該水分分布の測定の平均値）を記載する。
ＡＮＴＥＲＡ ３ＤＴＭ（ミラベックス）を用いて、被験者１２名の目尻のシワの有無の測定及びほうれい線の有無の測定を行った。以下、「目尻のシワの測定」及び「ほうれい線のシワの測定」において、当該１２名の平均値（当該水分分布の測定の平均値）を記載する。
【0061】
（目尻のシワの測定）
表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１０３．９９であったが、表５ローション塗布群は９６．５９（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０５（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１０３．９９であったが、表５ローション塗布群は９６．５９（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０５（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
【0062】
（ほうれい線のシワの測定）
表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は９９．６９であったが、表５ローション塗布群は９８．１０（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０５（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は９９．６９であったが、表５ローション塗布群は９８．１０（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０５（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
【0063】
（シミの有無の測定）
半顔（下眼瞼部から頬全体の部位）のシミの個数を測定することによってシミの有無の測定を行った。当該測定は、ＶＩＳＩＡＴＭＥｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＶＩＳＩＡ－Ｅｖｏ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１０３．７８であったが、表５ローション塗布群は９７．７９であった。
半顔（下眼瞼部から頬全体の部位）のシミの個数を測定することによってシミの有無の測定を行った。当該測定は、ＶＩＳＩＡＴＭＥｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＶＩＳＩＡ－Ｅｖｏ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１０３．７８であったが、表５ローション塗布群は９７．７９であった。
【0064】
（ポルフィリンの有無の測定）
半顔（下眼瞼部から頬全体の部位）のシミの個数を測定することによって、ポルフィリンの有無の促成行った。当該測定は、ＶＩＳＩＡＴＭＥｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＶＩＳＩＡ－Ｅｖｏ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１００．０３であったが、表５ローション塗布群は８３．９６（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０１（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
半顔（下眼瞼部から頬全体の部位）のシミの個数を測定することによって、ポルフィリンの有無の促成行った。当該測定は、ＶＩＳＩＡＴＭＥｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＶＩＳＩＡ－Ｅｖｏ、Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は１００．０３であったが、表５ローション塗布群は８３．９６（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０１（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
【0065】
（真皮コラーゲン密度の測定）
鼻翼側部においてのＤｅｒｍａＬａｂ（登録商標）Ｃｏｍｂｏを用いて、真皮コラーゲン密度の測定を行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は９４．０７であったが、表５ローション塗布群は９７．２２（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０１（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
鼻翼側部においてのＤｅｒｍａＬａｂ（登録商標）Ｃｏｍｂｏを用いて、真皮コラーゲン密度の測定を行った。表５ローション塗布群及び表６ローション塗布群の０日（当該塗布前）の値を１００とした場合、当該４週間後において、表６ローション塗布群は９４．０７であったが、表５ローション塗布群は９７．２２（０日の表５ローション塗布群の値と比べｐ＜０．０１（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定））であった。
【図1】