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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-18
(45)【発行日】2024-11-26
(54)【発明の名称】ペプチド及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/10 20060101AFI20241119BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20241119BHJP
【ＦＩ】
A61K38/10 ZNA
A61P3/04
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2020217311
(22)【出願日】2020-12-25
(65)【公開番号】P2022102523
(43)【公開日】2022-07-07
【審査請求日】2023-08-02
(73)【特許権者】
【識別番号】598041566
【氏名又は名称】学校法人北里研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(72)【発明者】
【氏名】七里 眞義
(72)【発明者】
【氏名】小寺 義男
【審査官】池上 文緒
(56)【参考文献】
【文献】特表２００４－５１６２２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】上野 浩晶 他，食欲制御物質と肥満症，日本内科学会雑誌，2015年，104巻, 4号，Pages 717-722
【文献】Database Uniprot [online], Accessin No.Q6UWP8, SBSN_HUMAN，<https://rest.uniprot.org/unisave/Q6UWP8?format=txt&versions=125>,2020-Dec-02 uploaded, [retrieved on 2024-June-14]
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／１０
Ａ６１Ｐ ３／０４
Ｃ０７Ｋ ７／０４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする、抗肥満薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチド及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
血液中には膨大な量の高分子量タンパク質が存在する。このため、従来の質量分析技術だけでは、血液中に存在する生理活性ペプチドを同定することは不可能であった。過去２０年間、ヒトの生理活性ペプチドはほとんど発見されていない。
【0003】
発明者らは、以前に、従来困難とされていた血漿中のペプチドーム解析技術を開発し、ヒト血漿中に存在する大量の小分子量ペプチドの構造決定に成功した（非特許文献１、２を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Kawashima Y., et al., High-yield peptide-extraction method for the discovery of subnanomolar biomarkers from small serum samples, J Proteome Res, 9 (4), 1694-1705, 2010.
【文献】Saito T., et al., Establishment and application of a high-quality comparative analysis strategy for the discovery and small-scale validation of low-abundance biomarker peptides in serum based on an optimized novel peptide extraction method, J Electrophoresis, 57, 1, 1-9, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、ヒト血液中に存在する新規の生理活性ペプチドを提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、抗肥満薬；血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞におけるＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現誘導剤；炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法；炎症性疾患又は腫瘍の治療剤；動脈硬化促進剤及び動脈硬化治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は以下の態様を含む。
［１］（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、を有効成分とする、抗肥満薬。
［２］（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、を有効成分とする、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞におけるＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現誘導剤。
［３］（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、の受容体を同定する工程と、被験物質をスクリーニングし、前記受容体の阻害薬を同定する工程と、を含み、前記阻害薬が、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤である、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法。
［４］（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、及び、被験物質の存在下で、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞を培養し、前記細胞における炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現量を測定する工程を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少することが、前記被験物質が炎症性疾患又は腫瘍の治療剤であることを示す、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法。
［５］（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片を有効成分とする、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤。
［６］（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、を有効成分とする、動脈硬化促進剤。
［７］（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、の受容体を同定する工程と、被験物質をスクリーニングし、前記受容体の阻害薬を同定する工程と、を含み、前記阻害薬が、動脈硬化治療剤である、動脈硬化治療剤のスクリーニング方法。
［８］（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、及び、被験物質の存在下で、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞を培養し、前記細胞における炎症性サイトカイン又は動脈硬化促進因子の発現量を測定する工程を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少することが、前記被験物質が動脈硬化治療剤であることを示す、動脈硬化治療剤のスクリーニング方法。
［９］（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片を有効成分とする、動脈硬化治療剤。
［１］（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、を有効成分とする、抗肥満薬。
［２］（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、を有効成分とする、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞におけるＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現誘導剤。
［３］（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、の受容体を同定する工程と、被験物質をスクリーニングし、前記受容体の阻害薬を同定する工程と、を含み、前記阻害薬が、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤である、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法。
［４］（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、及び、被験物質の存在下で、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞を培養し、前記細胞における炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現量を測定する工程を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少することが、前記被験物質が炎症性疾患又は腫瘍の治療剤であることを示す、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法。
［５］（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片を有効成分とする、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤。
［６］（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、を有効成分とする、動脈硬化促進剤。
［７］（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、の受容体を同定する工程と、被験物質をスクリーニングし、前記受容体の阻害薬を同定する工程と、を含み、前記阻害薬が、動脈硬化治療剤である、動脈硬化治療剤のスクリーニング方法。
［８］（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、及び、被験物質の存在下で、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞を培養し、前記細胞における炎症性サイトカイン又は動脈硬化促進因子の発現量を測定する工程を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少することが、前記被験物質が動脈硬化治療剤であることを示す、動脈硬化治療剤のスクリーニング方法。
［９］（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片を有効成分とする、動脈硬化治療剤。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、ヒト血液中に存在する新規の生理活性ペプチドを提供することができる。より具体的には、抗肥満薬；血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、マクロファージ細胞におけるＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現誘導剤；炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法；炎症性疾患又は腫瘍の治療剤；動脈硬化促進剤及び動脈硬化治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２の結果を示すグラフである。（ｃ）～（ｆ）は、実験例２の結果を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図2】（ａ）及び（ｂ）は、実験例３の結果を示すグラフである。
【図3】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。（ｃ）～（ｅ）は、実験例４における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図4】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５の結果を示すグラフである。
【図5】（ａ）～（ｆ）は、実験例６の結果を示すグラフである。
【図6】（ａ）～（ｅ），（ａ’）～（ｅ’），（ａ’’）～（ｅ’’）は、実験例８における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図7】（ａ）～（ｆ）は、実験例９の結果を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図8】（ａ）～（ｃ）は、実験例１０の結果を示すグラフである。
【図9】（ａ）～（ｃ）は、実験例１１の結果を示すグラフである。
【図10】（ａ）～（ｄ）は、実験例１２の結果を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図11】（ａ）～（ｄ）は、実験例１３の結果を示す顕微鏡写真である。
【図12】（ａ）～（ｄ）は、実験例１４の結果を示す肉眼的組織標本である。（ｅ）～（ｌ）は、実験例１４の結果を示す顕微鏡写真である。
【図13】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１４の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
［抗肥満薬］
１実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、を有効成分とする、抗肥満薬を提供する。
１実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、を有効成分とする、抗肥満薬を提供する。
【0010】
実施例において後述するように、発明者らは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ヒトスプラバシンのアミノ酸配列における第２７９～２９５番目のアミノ酸からなるペプチド、以下「ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］」という場合がある。）、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ヒトプロアンジオテンシノーゲンのアミノ酸配列における第４４８～４６２番目のアミノ酸からなるペプチド、以下「ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］」という場合がある。）が、マウスを用いた実験において、強力な摂食抑制活性を有することを明らかにした。
【0011】
これらのペプチドは、国際的に２型糖尿病の第２選択薬となったＧＬＰ－１作動薬の摂食抑制効果を遙かに凌駕する強力な摂食抑制作用を有する。このため、国際的に長く求められてきた抗肥満薬として、２型糖尿病等の治療に用いることができる。
【0012】
また、これらのペプチドは、本来ヒトの血液中に存在するものであるため、ヒトに投与しても安全である。
【0013】
本実施形態の活性を有している限り、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）、ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）のペプチドは、１～３個のアミノ酸の、欠失、置換若しくは付加を有していてもよい。また、これらのペプチドは、薬学的に許容される塩であってもよく、溶媒和物であってもよい。塩としては、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、酢酸塩、塩酸塩等が挙げられる。溶媒和物としては、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
【0014】
［炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現誘導剤］
１実施形態において、本発明は、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、を有効成分とする、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞におけるＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現誘導剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、を有効成分とする、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞におけるＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現誘導剤を提供する。
【0015】
実施例において後述するように、発明者らは、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ヒトスプラバシンのアミノ酸配列における第２２５～２３７番目のアミノ酸からなるペプチド、以下「ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］」という場合がある。）、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ヒトスプラバシンのアミノ酸配列における第２４３～２５９番目のアミノ酸からなるペプチド、以下「ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］」という場合がある。）を、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させると、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じて、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子、血管新生促進因子の発現を誘導することを明らかにした。
【0016】
したがって、これらのペプチドは、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞において、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現誘導剤として、研究用試薬等に用いることができる。
【0017】
本実施形態の活性を有している限り、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）のペプチドは、１～３個のアミノ酸の、欠失、置換若しくは付加を有していてもよい。また、これらのペプチドは、薬学的に許容される塩であってもよく、溶媒和物であってもよい。塩としては、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、酢酸塩、塩酸塩等が挙げられる。溶媒和物としては、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
【0018】
［炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、の受容体を同定する工程と、被験物質をスクリーニングし、前記受容体の阻害薬を同定する工程と、を含み、前記阻害薬が、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤である、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、の受容体を同定する工程と、被験物質をスクリーニングし、前記受容体の阻害薬を同定する工程と、を含み、前記阻害薬が、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤である、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【0019】
実施例において後述するように、発明者らは、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）及びＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）が、血管平滑筋細胞に結合することを明らかにした。したがって、これらのペプチドには受容体が存在する。
【0020】
上記のＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）及びこれらの変異ペプチドの受容体の阻害剤は、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子が原因となる疾患、すなわち、リウマチ関節炎、ＣＯＶＩＤ－１９重症肺炎等のサイトカインストーム等の炎症性疾患；腫瘍等の治療剤となる。
【0021】
したがって、１実施形態において、本発明は、上記のペプチドの受容体を同定する工程と、被験物質をスクリーニングし、前記受容体の阻害薬を同定する工程と、を含み、前記阻害薬が、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤である、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【0022】
被験物質としては特に限定されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ、抗体ライブラリ等が挙げられる。
【0023】
受容体の同定は、例えば、次のようにして行うことができる。まず、血管平滑筋細胞の膜タンパク質を抽出し、リポソームと混合することにより、膜タンパク質が埋め込まれたリポソームを作製する。続いてリポソームにメンブランを通過させ、例えば直径２００ｎｍ以下のものを回収する。これを膜タンパク質ライブラリとして上記のペプチドと結合性を示すリポソームを回収し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、バンドの切り出し、トリプシン消化－液体クロマトグラフィー（ＬＣ）－質量分析（ＭＳ）／ＭＳ等により受容体タンパク質を同定することができる。
【0024】
受容体の阻害薬としては、受容体と上記ペプチドとの結合を阻害する物質、受容体と上記ペプチドが結合した後のシグナル伝達を阻害する物質等が挙げられる。
【0025】
受容体と上記ペプチドとの結合を阻害する物質としては、デコイ受容体、上記ペプチドの断片ペプチド、上記ペプチドに対する抗体又はその断片等が挙げられる。デコイ受容体としては、可溶化した受容体が挙げられ、より具体的には受容体と抗体定常領域との融合タンパク質等が挙げられる。
【0026】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、及び、被験物質の存在下で、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞を培養し、前記細胞における炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現量を測定する工程を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少することが、前記被験物質が炎症性疾患又は腫瘍の治療剤であることを示す、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、及び、被験物質の存在下で、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞を培養し、前記細胞における炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現量を測定する工程を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少することが、前記被験物質が炎症性疾患又は腫瘍の治療剤であることを示す、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【0027】
実施例において後述するように、発明者らは、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）及びＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）が、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に作用して、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子、血管新生促進因子の発現を誘導することを明らかにした。したがって、これらの因子の発現誘導を抑制する被験物質は、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤となる。
【0028】
すなわち、本発明は、上記のＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）又はこれらの変異ペプチド、及び、被験物質の存在下で、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞を培養し、前記細胞における炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現量を測定する工程を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少することが、前記被験物質が炎症性疾患又は腫瘍の治療剤であることを示す、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法を提供する。第２実施形態の方法によっても、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤をスクリーニングすることができる。
【0029】
被験物質としては上述したものと同様である。炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子としては、例えば、Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ａ（ＶＥＧＦａ）、ｄｉｃｋｋｏｐｆ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＤＫＫ１）、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｕＰＡＲ）、ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ－ＣＳＦ）、ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １（ＶＣＡＭ１）、ｃｙｓｔａｔｉｎ Ｃ、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ（ＯＰＮ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６（ＩＬ－６）、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ等が挙げられる。
【0030】
［炎症性疾患又は腫瘍の治療剤］
１実施形態において、本発明は、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片を有効成分とする、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片を有効成分とする、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤を提供する。
【0031】
実施例において後述するように、発明者らは、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）及びＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）が、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に作用して、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子、血管新生促進因子の発現を誘導することを明らかにした。
【0032】
したがって、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）又はこれらの変異ペプチドに対する抗体又はその断片は、これらのペプチドがその受容体に結合することを抑制し、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞において、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現誘導を抑制する。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。このような抗体又はその断片は、炎症性疾患又は腫瘍の治療剤として用いることができる。
【0033】
抗体はヒト型抗体であることが好ましい。ヒト型抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、可変領域が非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域の少なくとも一部がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、ヒト化抗体とは、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域のみが非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域及びフレームワーク領域がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、完全ヒト抗体とは、相補性決定領域を含めて全体がヒト由来の抗体を意味する。
【0034】
抗体又はその断片が、ヒト型抗体又はその断片であれば、ヒトに投与しても免疫原性が低いため、アナフィラキシーショック等の副作用を抑制することができる。
【0035】
［動脈硬化促進剤］
１実施形態において、本発明は、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、を有効成分とする、動脈硬化促進剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、を有効成分とする、動脈硬化促進剤を提供する。
【0036】
実施例において後述するように、発明者らは、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ヒトグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）のアミノ酸配列における第２２～５１番目のアミノ酸からなるペプチド、以下「ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］」という場合がある。）を、アテローム性動脈硬化症の疾患モデルマウスである、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に、動脈硬化が有意に促進されることを明らかにした。
【0037】
したがって、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）は、動脈硬化促進剤として、研究用試薬等に用いることができる。本実施形態の活性を有している限り、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）のペプチドは、１～３個のアミノ酸の、欠失、置換若しくは付加を有していてもよい。また、これらのペプチドは、薬学的に許容される塩であってもよく、溶媒和物であってもよい。塩としては、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、酢酸塩、塩酸塩等が挙げられる。溶媒和物としては、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
【0038】
［動脈硬化治療剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、の受容体を同定する工程と、被験物質をスクリーニングし、前記受容体の阻害薬を同定する工程と、を含み、前記阻害薬が、動脈硬化治療剤である、動脈硬化治療剤のスクリーニング方法を提供する。
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、の受容体を同定する工程と、被験物質をスクリーニングし、前記受容体の阻害薬を同定する工程と、を含み、前記阻害薬が、動脈硬化治療剤である、動脈硬化治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【0039】
実施例において後述するように、発明者らは、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）を、アテローム性動脈硬化症の疾患モデルマウスである、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与すると、動脈硬化が有意に促進されることを明らかにした。したがって、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）又はその変異ペプチドの受容体の阻害剤は、動脈硬化治療剤となる。
【0040】
すなわち、本発明は、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）の受容体を同定する工程と、被験物質をスクリーニングし、前記受容体の阻害薬を同定する工程と、を含み、前記阻害薬が、動脈硬化治療剤である、動脈硬化治療剤のスクリーニング方法を提供する。被験物質、受容体の同定、受容体の阻害薬については上述したものと同様である。
【0041】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、及び、被験物質の存在下で、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞を培養し、前記細胞における炎症性サイトカイン又は動脈硬化促進因子の発現量を測定する工程を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少することが、前記被験物質が動脈硬化治療剤であることを示す、動脈硬化治療剤のスクリーニング方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、及び、被験物質の存在下で、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞を培養し、前記細胞における炎症性サイトカイン又は動脈硬化促進因子の発現量を測定する工程を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少することが、前記被験物質が動脈硬化治療剤であることを示す、動脈硬化治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【0042】
実施例において後述するように、発明者らは、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）が、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に作用して、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、動脈硬化促進因子の発現を誘導することを明らかにした。したがって、これらの因子の発現誘導を抑制する被験物質は、動脈硬化の治療剤となる。
【0043】
すなわち、本発明は、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）又はその変異ペプチド、及び、被験物質の存在下で、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞を培養し、前記細胞における炎症性サイトカイン又は動脈硬化促進因子の発現量を測定する工程を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下と比較して有意に減少することが、前記被験物質が動脈硬化の治療剤であることを示す、動脈硬化の治療剤のスクリーニング方法を提供する。第２実施形態の方法によっても、動脈硬化の治療剤をスクリーニングすることができる。
【0044】
被験物質としては上述したものと同様である。炎症性サイトカイン、ケモカイン、動脈硬化促進因子としては、例えば、アンジオポエチン２（Ａｎｇｐｔ２）、アンジオポエチン３（Ａｎｇｐｔ３）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、ＣＸＣＬ１６、ＰＣＳＫ９、フェツインＡ、ｃｙｓｔａｔｉｎＣ、Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＤＬＲ）、ＭＭＰ－３、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＶＣＡＭ１）、ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＩＣＡＭ１）、Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ等が挙げられる。
【0045】
［動脈硬化治療剤］
１実施形態において、本発明は、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片を有効成分とする、動脈硬化治療剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片を有効成分とする、動脈硬化治療剤を提供する。
【0046】
実施例において後述するように、発明者らは、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）に対する抗体を、アテローム性動脈硬化症の疾患モデルマウスである、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に、動脈硬化が有意に抑制されることを明らかにした。
【0047】
したがって、上記の抗体又はその断片は動脈硬化治療剤として用いることができる。抗体はヒト型抗体であることが好ましい。抗体断片、ヒト型抗体については上述したものと同様である。
【0048】
［その他の実施形態］
（２型糖尿病の治療方法）
１実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む２型糖尿病の治療方法を提供する。本実施形態の治療方法は、患者の摂食又は飲水を抑制させる方法であるということもできる。
（２型糖尿病の治療方法）
１実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む２型糖尿病の治療方法を提供する。本実施形態の治療方法は、患者の摂食又は飲水を抑制させる方法であるということもできる。
【0049】
１実施形態において、本発明は、２型糖尿病の治療に用いられる、（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、を提供する。
【0050】
１実施形態において、本発明は、２型糖尿病の治療薬を製造するための、（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ哺乳動物に投与した場合に摂食又は飲水を抑制させる活性を有するペプチド、の使用を提供する。
【0051】
（炎症性疾患又は腫瘍の治療方法）
１実施形態において、本発明は、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、炎症性疾患又は腫瘍の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、炎症性疾患又は腫瘍の治療方法を提供する。
【0052】
炎症性疾患としては、リウマチ関節炎、ＣＯＶＩＤ－１９重症肺炎等のサイトカインストーム等が挙げられる。腫瘍は、血管新生を伴う腫瘍であれば特に限定されない。
【0053】
１実施形態において、本発明は、炎症性疾患又は腫瘍の治療に用いられる、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片を提供する。
【0054】
１実施形態において、本発明は、炎症性疾患又は腫瘍の治療薬を製造するための、（ｖ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｖｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞に接触させた場合に、ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現を誘導する活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片の使用を提供する。
【0055】
（動脈硬化の治療方法）
１実施形態において、本発明は、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、動脈硬化の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、動脈硬化の治療方法を提供する。
【0056】
１実施形態において、本発明は、動脈硬化の治療に用いられる、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片を提供する。
【0057】
１実施形態において、本発明は、動脈硬化の治療薬を製造するための、（ｉｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、又は、（ｘ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＡｐｏＥ－／－マウスに投与した場合に動脈硬化を促進させる活性を有するペプチド、に対する抗体又はその断片の使用を提供する。
【実施例】
【0058】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0059】
［実験例１］
発明者らが開発した、改良したｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ法（非特許文献２を参照。）により、ヒト血漿中に存在する多数のペプチドを同定した。その中で、配列番号１～５にアミノ酸配列を示すペプチドに着目し、以下の実験を行った。
発明者らが開発した、改良したｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ法（非特許文献２を参照。）により、ヒト血漿中に存在する多数のペプチドを同定した。その中で、配列番号１～５にアミノ酸配列を示すペプチドに着目し、以下の実験を行った。
【0060】
＜Ｉ．ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３），ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４），ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）の検討＞
［実験例２］
（ペプチドの血管平滑筋細胞への結合の検討）
ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）の血管平滑筋細胞への結合を検討した。
［実験例２］
（ペプチドの血管平滑筋細胞への結合の検討）
ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）の血管平滑筋細胞への結合を検討した。
【0061】
まず、各ペプチドを化学合成した。各ペプチドのＮ末端には５－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）標識を行った。続いて、各ペプチドを、ヒト血管平滑筋細胞株であるＨＡｏＳＭＣの培地に、終濃度１μＭとなるように添加し、プレートリーダー及び共焦点顕微鏡で、細胞表面への結合の有無を評価した。
【0062】
図１（ａ）は、プレートリーダーでＦＡＭの蛍光を検出することにより、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）の血管平滑筋細胞への結合を測定した結果を示すグラフである。
【0063】
図１（ｂ）は、プレートリーダーでＦＡＭの蛍光を検出することにより、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）の血管平滑筋細胞への結合を測定した結果を示すグラフである。
【0064】
その結果、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）及びＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）は、それぞれ細胞の培地への添加後３０分以内に蛍光強度が急上昇し、その後結合が維持されることが明らかとなった。一方、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）は、血管平滑筋細胞に対する結合を示さないことが明らかとなった。
【0065】
図１（ｃ）～（ｆ）は、撮影した共焦点顕微鏡写真である。図１（ｃ）はペプチドを添加しなかった対照であり、図１（ｄ）はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）を培地に添加した結果であり、図１（ｅ）はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を培地に添加した結果であり、図１（ｆ）はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）を培地に添加した結果である。その結果、図１（ｄ）及び（ｅ）では、ＦＡＭの蛍光が観察されたが、図１（ｆ）では蛍光が観察されなかった。
【0066】
以上の結果から、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）及びＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）は血管平滑筋細胞に結合し、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）は血管平滑筋細胞に結合しないことが明らかとなった。
【0067】
［実験例３］
（ペプチドの機能の検討）
ヒト血管平滑筋細胞株であるＨＡｏＳＭＣをコンフルエントになるまで培養後、無血清培地で１６時間更に培養した。その後、培地に、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）又はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を終濃度０．１μＭとなるように添加し、２４時間培養した。続いて、市販のキット（製品名「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ ＸＬ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙｓ」、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて、培養上清中に発現するサイトカイン、ケモカイン、細胞増殖性因子、細胞死関連因子の分泌量を評価した。
（ペプチドの機能の検討）
ヒト血管平滑筋細胞株であるＨＡｏＳＭＣをコンフルエントになるまで培養後、無血清培地で１６時間更に培養した。その後、培地に、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）又はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を終濃度０．１μＭとなるように添加し、２４時間培養した。続いて、市販のキット（製品名「Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ ＸＬ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙｓ」、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて、培養上清中に発現するサイトカイン、ケモカイン、細胞増殖性因子、細胞死関連因子の分泌量を評価した。
【0068】
図２（ａ）は、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）を培地に添加した結果である。図２（ａ）中の表に、分泌量が増加した上位５因子について、分泌量の増加の相対値を示す。図２（ｂ）は、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を培地に添加した結果である。図２（ｂ）中の表に、分泌量が増加した上位５因子について、分泌量の増加の相対値を示す。
【0069】
その結果、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）は、ＶＥＧＦａ、ＤＫＫ１、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ｕＰＡＲ、ｃｙｓｔａｔｉｎＣをはじめとする、強力なサイトカイン、ケモカイン、増殖性因子、血管新生促進因子、アポトーシス制御性因子の分泌を顕著に促進したことが明らかとなった。
【0070】
また、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）は、ＨＧＦ、ＶＥＧＦａ、ＤＫＫ１、ＯＰＮ、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６（ＩＬ－６）等の分泌を促進したことが明らかとなった。
【0071】
以上の結果から、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）及びＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）は、血管平滑筋細胞に対する強力な炎症惹起性、細胞増殖促進性、動脈硬化促進性作用等を有することが明らかとなった。
【0072】
［実験例４］
（ペプチドによるシグナル伝達機構の検討）
ヒト血管平滑筋細胞株であるＨＡｏＳＭＣの培地に、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）又はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を添加し、ＩκＢ－αの分解及びＮＦ－κＢ ｐ６５の局在を検討した。ＩκＢ－αの分解はウエスタンブロッティングにより検討した。ＮＦ－κＢ ｐ６５の局在は、免疫染色により検討した。
（ペプチドによるシグナル伝達機構の検討）
ヒト血管平滑筋細胞株であるＨＡｏＳＭＣの培地に、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）又はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を添加し、ＩκＢ－αの分解及びＮＦ－κＢ ｐ６５の局在を検討した。ＩκＢ－αの分解はウエスタンブロッティングにより検討した。ＮＦ－κＢ ｐ６５の局在は、免疫染色により検討した。
【0073】
図３（ａ）は、ＨＡｏＳＭＣの培地にＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）を添加後、０，５，１０，１５，３０，６０分後のＩκＢ－αの存在をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す写真である。また、ローディングコントロールとしてβ－アクチンを検出した結果も示す。
【0074】
図３（ｂ）は、ＨＡｏＳＭＣの培地にＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を添加後、０，５，１０，１５，３０，６０分後のＩκＢ－αの存在をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す写真である。また、ローディングコントロールとしてβ－アクチンを検出した結果も示す。
【0075】
図３（ｃ）～（ｅ）は、免疫染色によりＮＦ－κＢ ｐ６５を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図３（ｃ）は、ＨＡｏＳＭＣの培地にペプチドを添加した直後（０分後）の写真である。図３（ｂ）は、ＨＡｏＳＭＣの培地にＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）を添加してから１２０分後の写真である。図３（ｃ）は、ＨＡｏＳＭＣの培地にＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を添加してから１２０分後の写真である。図３（ｂ）及び（ｃ）中、矢頭は細胞核内のＮＦ－κＢ ｐ６５の免疫活性を示す。
【0076】
その結果、いずれのペプチドを添加した場合においても、ＩκＢ－αが崩壊し、ＮＦ－κＢ ｐ６５が核内移行したことが明らかとなった。
【0077】
以上の結果から、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）及びＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）が、ＮＦ－κＢ活性化促進作用を示すことが明らかになった。このことから、実験例３で示された、種々のサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、血管新生制御因子等の誘導には、ＮＦ－κＢの活性化が関与していると考えられた。
【0078】
［実験例５］
（ペプチドによるシグナル伝達機構の検討）
ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）及びＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）による、種々のサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、血管新生制御因子等の誘導にＮＦ－κＢが直接介在しているかどうかを明らかにするため、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２（ＣＡＳ番号：１３３４０７－８２－６）による、ＶＥＧＦの発現抑制作用を評価した。
（ペプチドによるシグナル伝達機構の検討）
ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）及びＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）による、種々のサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、血管新生制御因子等の誘導にＮＦ－κＢが直接介在しているかどうかを明らかにするため、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２（ＣＡＳ番号：１３３４０７－８２－６）による、ＶＥＧＦの発現抑制作用を評価した。
【0079】
ヒト血管平滑筋細胞株であるＨＡｏＳＭＣをコンフルエントになるまで培養後、無血清培地で１６時間更に培養した。その後、培地に、ＭＧ１３２を終濃度１００ｎＭとなるように添加して３０分間前処理した。続いて、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）又はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を終濃度０．１μＭとなるように添加し、８時間培養した。続いて、定量的ＲＴ－ＰＣＲによりＶＥＧＦ遺伝子の発現を評価した。
【0080】
図４（ａ）は、ＨＡｏＳＭＣの培地にＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）を添加した場合の定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。図４（ｂ）は、ＨＡｏＳＭＣの培地にＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を添加した場合の定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【0081】
図４（ａ）及び（ｂ）中、「－」はＭＧ１３２、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）又はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を培地に添加しなかったことを示し、「＋」はＭＧ１３２、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）又はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）を培地に添加したことを示す。また、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【0082】
その結果、ＭＧ１３２で前処理することにより、ＶＥＧＦ遺伝子の発現が有意に抑制されたことが明らかとなった。この結果は、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）及びＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）による、種々のサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、血管新生制御因子等の誘導にＮＦ－κＢが直接介在していることを示す。
【0083】
［実験例６］
（ペプチドのマウスへの投与）
ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）をマウスに投与し、その機能を検討した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス成体、クレア社）を、２２～２５℃、１２時間毎の明暗周期、自由摂食、自由飲水下で飼育した。餌としては、通常食であるＣＥ２を与えた。少なくとも７日間、生理食塩水の腹腔内投与に慣らした後、暗期の始まる３０分前にＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）を腹腔内投与し、自由行動下、摂食・飲水・行動量モニタリングシステム（製品名「ＡＣＴＩＭＯ－１００Ｍ」、シンファクトリー社）を用いて、暗期における摂食量、飲水量、活動量を経時的にモニターした。ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）の投与量は、１０ｐｍｏｌ／マウス、又は、１００ｐｍｏｌ／マウスであった。
（ペプチドのマウスへの投与）
ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）をマウスに投与し、その機能を検討した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス成体、クレア社）を、２２～２５℃、１２時間毎の明暗周期、自由摂食、自由飲水下で飼育した。餌としては、通常食であるＣＥ２を与えた。少なくとも７日間、生理食塩水の腹腔内投与に慣らした後、暗期の始まる３０分前にＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）を腹腔内投与し、自由行動下、摂食・飲水・行動量モニタリングシステム（製品名「ＡＣＴＩＭＯ－１００Ｍ」、シンファクトリー社）を用いて、暗期における摂食量、飲水量、活動量を経時的にモニターした。ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）の投与量は、１０ｐｍｏｌ／マウス、又は、１００ｐｍｏｌ／マウスであった。
【0084】
図５（ａ）～（ｆ）は、摂食量、飲水量、活動量のモニター結果を示すグラフである。図５（ａ）～（ｃ）はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）を１０ｐｍｏｌ／マウス投与した結果であり、図５（ｄ）～（ｆ）はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）を１００ｐｍｏｌ／マウス投与した結果である。
【0085】
また、図５（ａ）及び（ｄ）の縦軸は摂食量（ｇ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図５（ｂ）及び（ｅ）の縦軸は飲水量（ｍＬ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図５（ｃ）及び（ｆ）の縦軸は活動量（カウント）を示し、横軸は時間（分）を示す。図５（ａ）～（ｆ）中、「ｖｅｈｉｃｌｅ」はペプチドを含まない精製水のみを投与したことを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【0086】
その結果、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）をわずか１０ｐｍｏｌ／マウス投与しただけで、摂食量、飲水量の有意な減少が認められた。この結果は、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）が強力な内因性摂食・飲水制御性因子であることを示す。
【0087】
［実験例７］
（ヒト各種主要臓器におけるペプチド発現の解析）
ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）をそれぞれウサギに免疫し、各ペプチドに対する特異的ポリクローナル抗体を作製した。
（ヒト各種主要臓器におけるペプチド発現の解析）
ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）をそれぞれウサギに免疫し、各ペプチドに対する特異的ポリクローナル抗体を作製した。
【0088】
続いて、各ポリクローナル抗体で、市販のヒト組織アレイ（カタログ番号「ＭＮＯ３４１」、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ社）を免疫染色し、ヒト各種主要臓器におけるペプチド発現を解析した。結果を下記表１に示す。表１中、「－」は発現が認められなかったことを示し、「＋」及び「＋＋」は発現が認められたことを示す。また、「＋＋」は、「＋」よりも発現レベルが高かったことを示す。
【0089】
【表1】
【0090】
その結果、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）は、各種組織で普遍的に発現するペプチドではなく、肝臓及び膵臓に特異的に発現することが明らかとなった。これに対し、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）及びＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）は、多くの組織で普遍的に発現するペプチドであることが明らかとなった。
【0091】
［実験例８］
（ヒト各種細胞株におけるペプチド発現の解析）
ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）に対する特異的ポリクローナル抗体を用いて、ヒト各種培養細胞におけるペプチド発現を免疫染色により解析した。
（ヒト各種細胞株におけるペプチド発現の解析）
ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）、ＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号１）に対する特異的ポリクローナル抗体を用いて、ヒト各種培養細胞におけるペプチド発現を免疫染色により解析した。
【0092】
図６（ａ）～（ｅ），（ａ’）～（ｅ’），（ａ’’）～（ｅ’’）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図６（ａ）～（ｅ）はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２２５－２３７］（配列番号３）に対する抗体による染色結果を示し、（ａ’）～（ｅ’）はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２４３－２５９］（配列番号４）に対する抗体による染色結果を示し、（ａ’’）～（ｅ’’）はＳＢＳＮ＿ＨＵＭＡＮ［２７９－２９５］（配列番号４）に対する抗体による染色結果を示す。いずれも抗体の希釈倍率は１０００倍である。
【0093】
また、図６（ａ），（ａ’），（ａ’’）はヒト血管平滑筋細胞株であるＨＡｏＳＭＣの染色結果であり、図６（ｂ），（ｂ’），（ｂ’’）はヒト単球ＴＨＰ－１由来マクロファージ細胞の染色結果であり、図６（ｃ），（ｃ’），（ｃ’’）は健常ヒトマクロファージ細胞の染色結果であり、図６（ｄ），（ｄ’），（ｄ’’）はヒト表皮角化細胞株であるＨａＣａＴの染色結果であり、図６（ｅ），（ｅ’），（ｅ’’）はヒト肝臓癌細胞株であるＨｅｐＧ２の染色結果である。また、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）により核を染色した。
【0094】
その結果、３種類のペプチドはいずれも癌細胞及びマクロファージ細胞において発現していることが明らかになった。
【0095】
＜ＩＩ．ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）の検討＞
［実験例９］
（ペプチドのマクロファージ細胞への結合の検討）
ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）のマクロファージ細胞への結合を検討した。まず、ペプチドを化学合成した。ペプチドのＮ末端には５－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）標識を行った。続いて、ペプチドを、ヒト単球細胞株であるＴＨＰ１細胞の培地に、終濃度１μＭとなるように添加して６０分間インキュベートした後に、共焦点顕微鏡で細胞表面への結合の有無を評価した。
［実験例９］
（ペプチドのマクロファージ細胞への結合の検討）
ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）のマクロファージ細胞への結合を検討した。まず、ペプチドを化学合成した。ペプチドのＮ末端には５－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）標識を行った。続いて、ペプチドを、ヒト単球細胞株であるＴＨＰ１細胞の培地に、終濃度１μＭとなるように添加して６０分間インキュベートした後に、共焦点顕微鏡で細胞表面への結合の有無を評価した。
【0096】
また、比較のために、終濃度１０μＭのβ－カソモルフィン５又は終濃度１０μＭのβ－カソモルフィン７で３０分間前処理した試料も用意した。β－カソモルフィン５及びβ－カソモルフィン７は、ＡＴＰ合成酵素β鎖のリガンドであることが知られている。また、同時にＡＴＰ合成酵素α鎖及びβ鎖の免疫染色も行った。
【0097】
【0098】
図７（ｂ）及び（ｅ）はＦＡＭ標識ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］投与前に、ＡＴＰ合成酵素α鎖に対する部分的な阻害作用を示すと考えられるβ－カソモルフィン５で前処理した結果であり、図７（ｃ）及び（ｆ）はＡＴＰ合成酵素α鎖に対して競合的阻害作用を示すと考えられるβ－カソモルフィン７で前処理した結果であり、図７（ａ）及び（ｄ）は前処理していない結果である。
【0099】
図７（ａ）～（ｆ）中、最も左の写真はＡＴＰ合成酵素α鎖（図７（ａ）～（ｃ））又はＡＴＰ合成酵素β鎖（図７（ｄ）～（ｆ））を染色した結果であり、左から２番目の写真はＦＡＭ標識ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）の細胞への結合による蛍光を検出した結果であり、左から３番目の写真はＤＡＰＩで核を染色した結果であり、最も右の写真は、左から１～３番目の写真を合成した写真である。
【0100】
その結果、ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）は、摂食抑制因子や血管新生抑制因子が結合して作用することで知られるＡＴＰ合成酵素α鎖及びβ鎖と共局在することが明らかとなった。また、ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）の細胞表面ＡＴＰ合成酵素α鎖及びβ鎖に対する結合は、β－カソモルフィン５、β－カソモルフィン７により競合的に阻害されることが明らかとなった。
【0101】
［実験例１０］
（ペプチドのマウスへの投与１）
ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）をマウスに投与し、その機能を検討した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス成体、クレア社）を、２２～２５℃、１２時間毎の明暗周期、自由摂食、自由飲水下で飼育した。餌としては、通常食であるＣＥ２を与えた。少なくとも７日間、生理食塩水の腹腔内投与に慣らした後、暗期の始まる３０分前にＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）を腹腔内投与し、自由行動下、摂食・飲水・行動量モニタリングシステム（製品名「ＡＣＴＩＭＯ－１００Ｍ」、シンファクトリー社）を用いて、暗期における摂食量、飲水量、活動量を経時的にモニターした。ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）の投与量は、１００ｐｍｏｌ／マウスであった。
（ペプチドのマウスへの投与１）
ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）をマウスに投与し、その機能を検討した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス成体、クレア社）を、２２～２５℃、１２時間毎の明暗周期、自由摂食、自由飲水下で飼育した。餌としては、通常食であるＣＥ２を与えた。少なくとも７日間、生理食塩水の腹腔内投与に慣らした後、暗期の始まる３０分前にＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）を腹腔内投与し、自由行動下、摂食・飲水・行動量モニタリングシステム（製品名「ＡＣＴＩＭＯ－１００Ｍ」、シンファクトリー社）を用いて、暗期における摂食量、飲水量、活動量を経時的にモニターした。ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）の投与量は、１００ｐｍｏｌ／マウスであった。
【0102】
図８（ａ）～（ｃ）は、摂食量、飲水量、活動量のモニター結果を示すグラフである。図８（ａ）の縦軸は摂食量（ｇ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図８（ｂ）の縦軸は飲水量（ｍＬ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図８（ｃ）の縦軸は活動量（カウント）を示し、横軸は時間（分）を示す。図８（ａ）～（ｃ）中、「ｖｅｈｉｃｌｅ」はペプチドを含まない精製水のみを投与したことを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【0103】
その結果、ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）をわずか１００ｐｍｏｌ／マウス投与しただけで、摂食量、飲水量の有意な減少が認められた。この結果は、ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）が強力な末梢性摂食・飲水抑制因子であることを示す。
【0104】
［実験例１１］
（ペプチドのマウスへの投与２）
ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）をマウスに投与し、その機能を検討した。実験例１０では腹腔内投与したのに対し、本実験例では脳室内投与した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス成体、クレア社）を、２２～２５℃、１２時間毎の明暗周期、自由摂食、自由飲水下で飼育した。餌としては、通常食であるＣＥ２を与えた。移植した脳室内カテーテルを通じてＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）を脳室内投与し、自由行動下、摂食・飲水・行動量モニタリングシステム（製品名「ＡＣＴＩＭＯ－１００Ｍ」、シンファクトリー社）を用いて、暗期における摂食量、飲水量、活動量を経時的にモニターした。ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）の投与量は、１ｐｍｏｌ／マウスであった。
（ペプチドのマウスへの投与２）
ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）をマウスに投与し、その機能を検討した。実験例１０では腹腔内投与したのに対し、本実験例では脳室内投与した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オス成体、クレア社）を、２２～２５℃、１２時間毎の明暗周期、自由摂食、自由飲水下で飼育した。餌としては、通常食であるＣＥ２を与えた。移植した脳室内カテーテルを通じてＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）を脳室内投与し、自由行動下、摂食・飲水・行動量モニタリングシステム（製品名「ＡＣＴＩＭＯ－１００Ｍ」、シンファクトリー社）を用いて、暗期における摂食量、飲水量、活動量を経時的にモニターした。ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）の投与量は、１ｐｍｏｌ／マウスであった。
【0105】
図９（ａ）～（ｃ）は、摂食量、飲水量、活動量のモニター結果を示すグラフである。図９（ａ）の縦軸は摂食量（ｇ）を示し、横軸は時間（時間）を示す。図９（ｂ）の縦軸は飲水量（ｍＬ）を示し、横軸は時間（時間）を示す。図９（ｃ）の縦軸は活動量（カウント）を示し、横軸は時間（時間）を示す。図９（ａ）～（ｃ）中、「ｖｅｈｉｃｌｅ」はペプチドを含まない精製水を投与したことを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
【0106】
その結果、ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）をわずか１ｐｍｏｌ／マウス投与しただけで、摂食量、飲水量の有意な減少が認められた。この結果は、ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）が強力な中枢性摂食・飲水抑制因子であることを更に支持するものである。また、ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ［４４８－４６２］（配列番号２）は、非常に低濃度で効果を奏することから、経口投与によって摂食量、飲水量の減少効果を奏する可能性がある。
【0107】
＜ＩＩＩ．ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）の検討＞
［実験例１２］
（ペプチドの細胞への結合の検討）
ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）の血管内皮細胞及びマクロファージ細胞への結合を検討した。まず、ペプチドを化学合成した。ペプチドのＮ末端には５－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）標識を行った。続いて、ペプチドをヒト大動脈内皮細胞株であるＨＡｏＥＣの培地に、終濃度１μＭとなるように添加して３０分間インキュベートした後に、共焦点顕微鏡で細胞表面への結合の有無を評価した。また、ＤＡＰＩで核を染色した。
［実験例１２］
（ペプチドの細胞への結合の検討）
ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）の血管内皮細胞及びマクロファージ細胞への結合を検討した。まず、ペプチドを化学合成した。ペプチドのＮ末端には５－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）標識を行った。続いて、ペプチドをヒト大動脈内皮細胞株であるＨＡｏＥＣの培地に、終濃度１μＭとなるように添加して３０分間インキュベートした後に、共焦点顕微鏡で細胞表面への結合の有無を評価した。また、ＤＡＰＩで核を染色した。
【0108】
図１０（ａ）及び（ｂ）は撮影した共焦点顕微鏡写真である。図１０（ａ）はペプチドを反応させなかった結果であり、図１０（ｂ）はペプチドを反応させた結果である。その結果、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）が血管内皮細胞に結合することが明らかとなった。
【0109】
続いて、ＦＡＭ標識したＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）を、ヒト単球細胞株であるＴＨＰ１細胞由来のマクロファージ細胞の培地に、終濃度１μＭとなるように添加して５分間インキュベートした後に、共焦点顕微鏡で細胞表面への結合の有無を評価した。また、ＤＡＰＩで核を染色した。
【0110】
図１０（ｃ）及び（ｄ）は撮影した共焦点顕微鏡写真である。図１０（ｃ）はペプチドを反応させなかった結果であり、図１０（ｄ）はペプチドを反応させた結果である。その結果、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）がマクロファージ細胞に結合することが明らかとなった。
【0111】
［実験例１３］
（ペプチドによるシグナル伝達機構の検討）
ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）を、ヒト大動脈内皮細胞及びヒトマクロファージ細胞に接触させて、ＮＦ－κＢ ｐ６５の核への移行を検討した。
（ペプチドによるシグナル伝達機構の検討）
ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）を、ヒト大動脈内皮細胞及びヒトマクロファージ細胞に接触させて、ＮＦ－κＢ ｐ６５の核への移行を検討した。
【0112】
ペプチドをヒト大動脈内皮細胞株であるＨＡｏＥＣ、又は、ヒト単球細胞株であるＴＨＰ１細胞由来のマクロファージ細胞の培地に、終濃度１μＭとなるように添加して６０分間インキュベートした後に、免疫染色によりＮＦ－κＢ ｐ６５を染色した。
【0113】
図１１（ａ）及び（ｂ）は、大動脈内皮細胞の結果を示す写真である。図１１（ａ）はペプチドを添加しなかった結果であり、図１１（ｂ）はＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）を添加した結果である。その結果、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）を大動脈内皮細胞の培地に添加すると、ＮＦ－κＢが核に移行することが明らかとなった。
【0114】
また、図１１（ｃ）及び（ｄ）は、マクロファージ細胞の結果を示す写真である。図１１（ｃ）はペプチドを添加しなかった結果であり、図１１（ｄ）はＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）を添加した結果である。その結果、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）をマクロファージ細胞の培地に添加すると、ＮＦ－κＢが核に移行することが明らかとなった。
【0115】
［実験例１４］
（動脈硬化に対する影響の検討）
ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）が動脈硬化に与える影響を検討した。アテローム性動脈硬化症の疾患モデルマウスである、ＡｐｏＥ－／－マウス（１７週齢）に、浸透圧ポンプを用いてＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）又は生理食塩水を４週間投与し、動脈硬化の進行を評価した。また、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）に対するポリクローナル抗体を投与した影響も検討した。ポリクローナル抗体は、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）をウサギに免疫して作製した。
（動脈硬化に対する影響の検討）
ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）が動脈硬化に与える影響を検討した。アテローム性動脈硬化症の疾患モデルマウスである、ＡｐｏＥ－／－マウス（１７週齢）に、浸透圧ポンプを用いてＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）又は生理食塩水を４週間投与し、動脈硬化の進行を評価した。また、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）に対するポリクローナル抗体を投与した影響も検討した。ポリクローナル抗体は、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）をウサギに免疫して作製した。
【0116】
図１２（ａ）～（ｄ）は、検討結果を示す肉眼的組織標本であり、（ｅ）～（ｌ）は、顕微鏡写真である。図１２（ａ），（ｅ），（ｉ）は生理食塩水のみを投与した結果である。また、図１２（ｂ），（ｃ），（ｆ），（ｇ），（ｊ），（ｋ）は０．６ｎＭ／ｋｇ／時間の投与量でＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）を投与した結果である。また、図１２（ｃ），（ｄ），（ｇ），（ｈ），（ｋ），（ｌ）は、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）に対する抗体を１．４μｇ／ｋｇ／時間で投与した結果である。
【0117】
図１２（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）は大動脈の表面をオイルレッドＯ染色した結果である。また、図１２（ｅ），（ｆ），（ｇ），（ｈ）は大動脈根の断面をオイルレッドＯ染色した結果である。また、図１２（ｉ），（ｊ），（ｋ），（ｌ）は抗ＭＯＭＡ－２抗体で染色した結果である。抗ＭＯＭＡ－２抗体は、単球及びマクロファージ細胞に結合する抗体である。
【0118】
その結果、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）の投与により動脈硬化の進行が促進され、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）に対する抗体の投与により、これを抑制することができることが明らかとなった。
【0119】
続いて、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）を４週間投与したＡｐｏＥ－／－マウス、並びに、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）及びＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）に対する抗体を４週間投与したＡｐｏＥ－／－マウスの血清中のサイトカイン及びケモカインを市販の抗体アレイ（製品名「Ｍｏｕｓｅ ＸＬ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｋｉｔ」、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて定量した。
【0120】
図１３（ａ）はＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）を投与したマウスの血清中のサイトカイン及びケモカインの存在量の相対値を示す。図１３（ｂ）はＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）及びＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）に対する抗体を投与したマウスの血清中のサイトカイン及びケモカインの存在量の相対値を示す。
【0121】
その結果、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）の投与により、アンジオポエチン２（Ａｎｇｐｔ２）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、ＣＸＣＬ１６、ＰＣＳＫ９、フェツインＡ、ＭＭＰ－３等の炎症性サイトカイン及び動脈硬化促進因子の血清中レベルが上昇したことが明らかとなった。
【0122】
一方、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）に対する抗体を投与することにより、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１、フェツインＡ、ＰＣＳＫ９、ＣＸＣＬ１６、ＳＡＰ等の血清中レベルが減少したことが明らかとなった。
【0123】
以上の結果は、ＧＩＰ＿ＨＵＭＡＮ［２２－５１］（配列番号５）が、炎症性サイトカイン、ケモカイン及び動脈硬化促進因子の内因性誘導因子であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【0124】
本発明によれば、ヒト血液中に存在する新規の生理活性ペプチドを提供することができる。より具体的には、抗肥満薬；血管平滑筋細胞、血管内皮細胞又はマクロファージ細胞におけるＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化を通じた、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞増殖因子又は血管新生促進因子の発現誘導剤；炎症性疾患又は腫瘍の治療剤のスクリーニング方法；炎症性疾患又は腫瘍の治療剤；動脈硬化促進剤及び動脈硬化治療剤を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】