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特許7590437ペプチド及び／又はその塩を含む飲食品組成物、その製造方法、２型コラーゲン加水分解物の使用、骨吸収抑制用組成物並びにチキンエキスの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-18
(45)【発行日】2024-11-26
(54)【発明の名称】ペプチド及び／又はその塩を含む飲食品組成物、その製造方法、２型コラーゲン加水分解物の使用、骨吸収抑制用組成物並びにチキンエキスの使用
(51)【国際特許分類】
A23L 33/18 20160101AFI20241119BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20241119BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20241119BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20241119BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20241119BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241119BHJP
C07K 7/00 20060101ALN20241119BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20241119BHJP
【ＦＩ】
A23L33/18 ZNA
A23L2/00 F
A23L2/52
A61K38/05
A61K38/08
A61P19/10
A61P29/00
C07K7/00
C07K7/06
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2022538740
(86)(22)【出願日】2020-06-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-06
(86)【国際出願番号】 JP2020025216
(87)【国際公開番号】W WO2021131105
(87)【国際公開日】2021-07-01
【審査請求日】2023-02-22
(31)【優先権主張番号】10201913621W
(32)【優先日】2019-12-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG
(73)【特許権者】
【識別番号】309007911
【氏名又は名称】サントリーホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】中尾 嘉宏
(72)【発明者】
【氏名】シャンメイ ヨン
(72)【発明者】
【氏名】シャージャン リン
(72)【発明者】
【氏名】シム エリック キアン－シウン
【審査官】吉岡 沙織
(56)【参考文献】
【文献】特開２００３－０４８８５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００７／０２９３４２７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０３６０９９３５（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２００３－１９２６１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１７９５１１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Journal of Functional Foods，2018年，Vol.51，pp.130-141
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｌ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＦＳＴＡ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物、及び、
カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むチキンエキスを含み、
前記カルノシン、アンセリン及びそれらの塩のカルノシン及びアンセリン換算の合計重量と、前記ペプチド及び／又はその塩のペプチド換算の重量との重量比（カルノシン及びアンセリンの合計／ペプチド）が、１，０００，０００／１～１／１５，０００であり、
炎症を抑制するために使用される飲食品組成物。
【請求項2】
前記カルノシン、アンセリン及びそれらの塩のカルノシン及びアンセリン換算の合計重量と、前記ペプチド及び／又はその塩のペプチド換算の重量との重量比（カルノシン及びアンセリンの合計／ペプチド）が、１，０００，０００／１～１００／１である請求項１に記載の飲食品組成物。
【請求項3】
マクロファージ炎症タンパク質－１（ＭＩＰ－１）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、及びＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種のサイトカインの産生を抑制する請求項１又は２に記載の飲食品組成物。
【請求項4】
炎症性の状態又は疾患の予防又は改善のために使用される請求項１～３のいずれか一項に記載の飲食品組成物。
【請求項5】
破骨細胞の骨吸収活性を抑制するために使用される請求項１～４のいずれか一項に記載の飲食品組成物。
【請求項6】
骨量減少に関連する状態又は疾患の予防又は改善のために使用される請求項１～５のいずれか一項に記載の飲食品組成物。
【請求項7】
前記骨量減少に関連する状態又は疾患が、骨粗しょう症又は骨減少症である請求項６に記載の飲食品組成物。
【請求項8】
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物由来のＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を配合する工程、及び、
カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むチキンエキスを配合する工程を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の飲食品組成物の製造方法。
【請求項9】
抗炎症用組成物を製造するための、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の使用であって、
前記組成物が、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むチキンエキスを含み、
前記組成物における前記カルノシン、アンセリン及びそれらの塩のカルノシン及びアンセリン換算の合計重量と、前記ペプチド及び／又はその塩のペプチド換算の重量との重量比（カルノシン及びアンセリンの合計／ペプチド）が、１，０００，０００／１～１／１５，０００である、使用。
【請求項10】
骨吸収抑制用組成物を製造するための、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩の使用であって、
前記組成物が、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むチキンエキスを含み、
前記組成物における前記カルノシン、アンセリン及びそれらの塩のカルノシン及びアンセリン換算の合計重量と、前記ペプチド及び／又はその塩のペプチド換算の重量との重量比（カルノシン及びアンセリンの合計／ペプチド）が、１，０００，０００／１～１／１５，０００である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチド及び／又はその塩を含む飲食品組成物及びその製造方法に関する。本発明は、また、抗炎症用組成物を製造するためのペプチド及び／又はその塩を含む２型コラーゲン加水分解物に関する。本発明は、また、骨吸収抑制用組成物を製造するためのペプチド及び／又はその塩の使用に関する。本発明は、また、骨吸収抑制用組成物に関する。本発明は、また、骨吸収抑制用組成物を製造するためのチキンエキスの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
コラーゲンは、ゼラチンとして、食品分野で従来から広く用いられている。動物性蛋白質であるコラーゲンは、真皮や結合組織などの主成分であることから、近年、医療分野や美容分野の面からも注目を集めている。一般に、高分子量のコラーゲンを経口で摂取しても、摂取したコラーゲンを体内で効率的に利用することが難しいとされる。近年は、体内での摂取に適するよう、高分子のコラーゲンを加水分解して低分子量化したコラーゲンペプチドが開発され、コラーゲンペプチド入りの飲食品も開発されている。
【0003】
炎症は、細胞損傷によりヒスタミン及びキニンなどが放出され、血管拡張、毛細管透過性増大、及び炎症部位へのマクロファージの集結が起こり、それによって、感染部位の血流量増加、浮腫、兔疫細胞及び抗体の移動、痛症、発熱などが起こる現象である。
【0004】
近年、効果的な炎症緩和のために、炎症関連タンパク質の発現を抑制することができる成分に係わる研究が進められている。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）とステロイド性抗炎症薬（ＳＡＩＤ）とを始めとした、多様なメカニズムの炎症抑制用薬物が開発されているが、それらは副作用の懸念がある。そのため、より安全であり、抗炎症作用を有する成分に対する要求が依然として存在する。
【0005】
例えば、特許文献１では、抗炎症活性を有するテロメラーゼ由来のペプチドを活性成分として含む抗炎症組成物が開示されている。
【0006】
骨粗しょう症は低骨量により骨の脆弱性が増加し、骨折の危険性が増大する疾患である。通常、骨では古い骨が破骨細胞により吸収され、骨芽細胞が新しい骨を作り出す骨リモデリングが行われているが、骨粗しょう症はこの骨リモデリングのバランスが崩れることにより発症する。
【0007】
骨粗鬆症の治療には、女性ホルモン薬、ビスホスホネート薬などが使用され、食品素材においては、大豆イソフラボン、ビタミンＫ、カルシウム等に骨代謝や骨密度改善作用が報告されている。しかし、費用負担や副作用への不安から、１年以内に４５％もの患者が処方通り服薬するのをやめてしまうともいわれている。そのため、経口摂取により、安全かつ簡便に骨代謝を改善し、骨密度を高める成分が求められている。
【0008】
例えば、特許文献２では、バチルス属微生物の菌体及び／又は培養物を有効成分とする骨代謝又は骨密度改善剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】特表２０１５－５２５７６８号公報
【文献】特開２０１７－２２６６４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、ペプチドを含む新規な飲食品組成物を提供することを目的とする。
また本発明は、抗炎症作用を有する飲食品組成物を提供することを目的とする。
また本発明は、骨吸収抑制作用を有する飲食品組成物を提供することを目的とする。
また本発明は、新規な骨吸収抑制用組成物を提供することを目的とする。
また本発明は、抗炎症作用を有する飲食品組成物を提供することを目的とする。
また本発明は、骨吸収抑制作用を有する飲食品組成物を提供することを目的とする。
また本発明は、新規な骨吸収抑制用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を含む組成物が、骨吸収抑制作用を有することを見出した。
また、本発明者らは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物が、抗炎症活性を有することを見出した。
本発明者らは、また、チキンエキスが骨吸収抑制作用を有することを見出した。
また、本発明者らは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物が、抗炎症活性を有することを見出した。
本発明者らは、また、チキンエキスが骨吸収抑制作用を有することを見出した。
【0012】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
〔１〕Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を含む飲食品組成物。
〔２〕上記ペプチド及び／又はその塩が、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物由来のペプチド及び／又はその塩である上記〔１〕に記載の飲食品組成物。
〔３〕トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含む上記〔１〕又は〔２〕に記載の飲食品組成物。
〔４〕更に動物抽出物及び／又は植物抽出物を含む上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔５〕上記動物抽出物が、チキンエキスである上記〔４〕に記載の飲食品組成物。
〔６〕カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む上記〔５〕に記載の飲食品組成物。
〔７〕上記カルノシン、アンセリン及びそれらの塩のカルノシン及びアンセリン換算の合計重量と、上記ペプチド及び／又はその塩のペプチド換算の重量との重量比（カルノシン及びアンセリンの合計／ペプチド）が、１，０００，０００／１～１００／１である上記〔６〕に記載の飲食品組成物。
〔８〕炎症を抑制するために使用される上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔９〕マクロファージ炎症タンパク質－１（ＭＩＰ－１）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、及びＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種のサイトカインの産生を抑制する上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔１０〕炎症性の状態又は疾患の予防又は改善のために使用される上記〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔１１〕破骨細胞の骨吸収活性を抑制するために使用される上記〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔１２〕骨量減少に関連する状態又は疾患の予防又は改善のために使用される上記〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔１３〕上記骨量減少に関連する状態又は疾患が、骨粗しょう症又は骨減少症である上記〔１２〕に記載の飲食品組成物。
〔１４〕Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を配合する工程を含む、飲食品組成物の製造方法。
〔１５〕上記工程が、上記ペプチド及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を配合する工程である上記〔１４〕に記載の製造方法。
〔１６〕更に動物抽出物及び／又は植物抽出物を配合する工程を含む上記〔１４〕又は〔１５〕に記載の製造方法。
〔１７〕上記動物抽出物が、チキンエキスである上記〔１６〕に記載の製造方法。
〔１８〕上記チキンエキスが、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む上記〔１７〕に記載の製造方法。
〔１９〕抗炎症用組成物を製造するための、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の使用。
〔２０〕骨吸収抑制用組成物を製造するための、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩の使用。
〔２１〕チキンエキスを有効成分として含む骨吸収抑制用組成物。
〔２２〕カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む上記〔２１〕に記載の骨吸収抑制用組成物。
〔２３〕骨吸収抑制用組成物を製造するための、チキンエキスの使用。
〔１〕Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を含む飲食品組成物。
〔２〕上記ペプチド及び／又はその塩が、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物由来のペプチド及び／又はその塩である上記〔１〕に記載の飲食品組成物。
〔３〕トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含む上記〔１〕又は〔２〕に記載の飲食品組成物。
〔４〕更に動物抽出物及び／又は植物抽出物を含む上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔５〕上記動物抽出物が、チキンエキスである上記〔４〕に記載の飲食品組成物。
〔６〕カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む上記〔５〕に記載の飲食品組成物。
〔７〕上記カルノシン、アンセリン及びそれらの塩のカルノシン及びアンセリン換算の合計重量と、上記ペプチド及び／又はその塩のペプチド換算の重量との重量比（カルノシン及びアンセリンの合計／ペプチド）が、１，０００，０００／１～１００／１である上記〔６〕に記載の飲食品組成物。
〔８〕炎症を抑制するために使用される上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔９〕マクロファージ炎症タンパク質－１（ＭＩＰ－１）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、及びＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）からなる群から選ばれる少なくとも１種のサイトカインの産生を抑制する上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔１０〕炎症性の状態又は疾患の予防又は改善のために使用される上記〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔１１〕破骨細胞の骨吸収活性を抑制するために使用される上記〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔１２〕骨量減少に関連する状態又は疾患の予防又は改善のために使用される上記〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の飲食品組成物。
〔１３〕上記骨量減少に関連する状態又は疾患が、骨粗しょう症又は骨減少症である上記〔１２〕に記載の飲食品組成物。
〔１４〕Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を配合する工程を含む、飲食品組成物の製造方法。
〔１５〕上記工程が、上記ペプチド及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を配合する工程である上記〔１４〕に記載の製造方法。
〔１６〕更に動物抽出物及び／又は植物抽出物を配合する工程を含む上記〔１４〕又は〔１５〕に記載の製造方法。
〔１７〕上記動物抽出物が、チキンエキスである上記〔１６〕に記載の製造方法。
〔１８〕上記チキンエキスが、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む上記〔１７〕に記載の製造方法。
〔１９〕抗炎症用組成物を製造するための、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の使用。
〔２０〕骨吸収抑制用組成物を製造するための、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩の使用。
〔２１〕チキンエキスを有効成分として含む骨吸収抑制用組成物。
〔２２〕カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む上記〔２１〕に記載の骨吸収抑制用組成物。
〔２３〕骨吸収抑制用組成物を製造するための、チキンエキスの使用。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、ペプチド及び／又はその塩を含む新規な飲食品組成物を提供することができる。本発明の飲食品組成物は、炎症及び関節痛を抑制するために使用することができる。また、本発明の飲食品組成物は、骨吸収活性を抑制するために使用することができる。また、本発明によれば、チキンエキスを有効成分として含む新規な骨吸収抑制用組成物を提供することができる。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩並びにチキンエキスは、飲食品等として摂取可能であり、安全性が高いという利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図6】図６は、炎症マーカーＭＣＰ－１の産生抑制に対するトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（ＨＣＩＩ）とチキンエキス（ＣＥ）の効果、ＨＣＩＩとＣＥの組み合わせの相乗効果、及びペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの相乗効果を示すグラフである。
【図7-1】図７－１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、炎症マーカーＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９の産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥの組み合わせの相乗効果、及びペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの相乗効果を示すグラフである。
【図7-2】図７－２（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、炎症マーカーＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳの産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥの組み合わせの相乗効果、及びペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの相乗効果を示すグラフである。
【図9】図９は、骨吸収活性の抑制に対する、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（ＨＣＩＩ）、及びトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（ＨＣＩＩ）を分画した７つの画分のうち複数の画分とその組み合わせ（具体的にはＰ１～Ｐ５の各画分、画分Ｐ６と画分Ｐ７の組み合わせ、画分Ｐ１と画分Ｐ２の組み合わせ、画分Ｐ３と画分Ｐ４の組み合わせ、及び画分Ｐ１～Ｐ７の組み合わせ）のそれぞれの効果を示すグラフである。
【図10】図１０は、骨吸収活性の抑制に対する、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（ＨＣＩＩ）、ＨＣＩＩの画分Ｐ１及び画分Ｐ２の組み合わせ、並びに配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＧＰＥＧＡＰＧＫＤ）のそれぞれの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明の一態様によれば、本発明の飲食品組成物は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩（以下では、「Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」を「Ｐｅｐ１」又は「ＧＰＥＧＡＰＧＫＤ」と記載することがある）を含む。
【0016】
＜ペプチド＞
Ｐｅｐ１は、動植物のタンパク質等を加水分解して得られるペプチドであってもよいし、人工的に合成したものでもよい。Ｐｅｐ１は、好ましくは２型コラーゲン加水分解物由来のペプチドであり、より好ましくはトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物由来のペプチドである。
Ｐｅｐ１は、精製されたものを使用してもよく、Ｐｅｐ１を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の形態で組成物に含有させてもよい。好ましい態様においては、本発明の飲食品組成物は、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含む。本発明の飲食品組成物は、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含むと、抗炎症作用、骨吸収抑制作用がより高くなる。
Ｐｅｐ１は、動植物のタンパク質等を加水分解して得られるペプチドであってもよいし、人工的に合成したものでもよい。Ｐｅｐ１は、好ましくは２型コラーゲン加水分解物由来のペプチドであり、より好ましくはトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物由来のペプチドである。
Ｐｅｐ１は、精製されたものを使用してもよく、Ｐｅｐ１を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の形態で組成物に含有させてもよい。好ましい態様においては、本発明の飲食品組成物は、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含む。本発明の飲食品組成物は、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含むと、抗炎症作用、骨吸収抑制作用がより高くなる。
【0017】
Ｐｅｐ１は、無機酸又は有機酸との塩や無機塩基又は有機塩基との塩の形態として、本発明の飲食品組成物に含むことができる。酸や塩基としては、塩の用途に応じて選択できるが、飲食品への用途を考慮すると、以下に挙げる飲食品に許容される塩が好ましい。上記無機酸塩としては、例えば、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等を挙げることができる。有機酸塩としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、又はフマル酸等のジカルボン酸との塩、酢酸、プロピオン酸、又は酪酸等のモノカルボン酸との塩等を挙げる事ができる。無機塩基としては、例えば、ナトリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウムの水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩、及びアンモニア等を挙げる事ができる。有機塩基との塩としては、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンの様なモノ－、ジ－又はトリ－アルキルアミン塩、モノ－、ジ－又はトリ－ヒドロキシアルキルアミン塩、グアニジン塩、Ｎ－メチルグルコサミン塩等を挙げる事ができる。
【0018】
＜トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物＞
本発明の飲食品組成物は、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含むことが好ましい。
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（以下では、「トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物」を「ＨＣＩＩ」と記載することがある）は、２型コラーゲンを酵素等で加水分解することで得ることができる。２型コラーゲンは、トリ軟骨から公知の方法で抽出することができる。また、本発明で用いられるトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、本分野で用いられる通常の技術を用いて軟骨から調製することができる。
例えば、トリ軟骨を酵素処理することにより２型コラーゲン加水分解物を得ることができる。具体的に、（１）トリ軟骨を液体中にて加熱する前処理工程、及び（２）前処理工程後のトリ軟骨を酵素処理する工程により、２型コラーゲン加水分解物を調製することができる。なお、上記工程（２）で用いられる酵素は、本分野で通常用いられる酵素であればよく、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ、パパイン、ブロメライン、アクチニジン、フィシン、カテプシン、ペプシン、キモシン、トリプシン、プロテアーゼ、スブチリシン、アミノペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、及びこれらの酵素を混合した酵素製剤等を用いることができる。ただし、２型コラーゲン加水分解物の調製方法は酵素処理方法に限定されるものではない。
本発明の飲食品組成物は、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含むことが好ましい。
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（以下では、「トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物」を「ＨＣＩＩ」と記載することがある）は、２型コラーゲンを酵素等で加水分解することで得ることができる。２型コラーゲンは、トリ軟骨から公知の方法で抽出することができる。また、本発明で用いられるトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、本分野で用いられる通常の技術を用いて軟骨から調製することができる。
例えば、トリ軟骨を酵素処理することにより２型コラーゲン加水分解物を得ることができる。具体的に、（１）トリ軟骨を液体中にて加熱する前処理工程、及び（２）前処理工程後のトリ軟骨を酵素処理する工程により、２型コラーゲン加水分解物を調製することができる。なお、上記工程（２）で用いられる酵素は、本分野で通常用いられる酵素であればよく、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ、パパイン、ブロメライン、アクチニジン、フィシン、カテプシン、ペプシン、キモシン、トリプシン、プロテアーゼ、スブチリシン、アミノペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、及びこれらの酵素を混合した酵素製剤等を用いることができる。ただし、２型コラーゲン加水分解物の調製方法は酵素処理方法に限定されるものではない。
【0019】
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物には、トリ軟骨を加水分解して得られる溶液を使用してもよく、その濃縮物若しくは乾燥粉末又はこれらの精製物を使用してもよい。トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の精製物としては、例えばトリ軟骨を加水分解して得られる溶液を限外ろ過や膜処理、分液操作又は樹脂等による分画処理に供して精製度を上げたものが用いられる。Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の精製度を上げた後、凍結乾燥や噴霧乾燥等によって粉末化しても良い。
【0020】
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、通常Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むペプチド混合物であり、２型コラーゲン由来のコラーゲンペプチドということもできる。
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、重量平均分子量が１００～２０，０００であることが好ましく、２，０００～８，０００であることがより好ましく、３，０００～７，０００であることが更に好ましい。分子量及び重量平均分子量は、ユーロフィンＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ法で測定することができる。
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、重量平均分子量が１００～２０，０００であることが好ましく、２，０００～８，０００であることがより好ましく、３，０００～７，０００であることが更に好ましい。分子量及び重量平均分子量は、ユーロフィンＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ法で測定することができる。
【0021】
一態様において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を、ゲル濾過法等の方法により分子量の大きさに応じて分画し、得られるＰｅｐ１を含む画分、又はＰｅｐ１を含む画分とこれ以外の画分の１又は２以上を組み合わせて本発明の飲食品組成物に使用することができる。
本態様の飲食品組成物に用いるトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を分画した画分としては、分子量が３１００未満であって、重量平均分子量が１２００～１４００の画分（画分１）、及び分子量が２６００未満であって、重量平均分子量が９５０～１１５０の画分（画分２）が好ましい。本態様の飲食品組成物は、画分１と画分２の組み合わせを含有することが好ましい。Ｐｅｐ１は、通常、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物由来の画分１及び画分２に含まれる。
本態様の飲食品組成物に用いるトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を分画した画分としては、分子量が３１００未満であって、重量平均分子量が１２００～１４００の画分（画分１）、及び分子量が２６００未満であって、重量平均分子量が９５０～１１５０の画分（画分２）が好ましい。本態様の飲食品組成物は、画分１と画分２の組み合わせを含有することが好ましい。Ｐｅｐ１は、通常、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物由来の画分１及び画分２に含まれる。
【0022】
本発明の飲食品組成物は、更に動物抽出物及び／又は植物抽出物を含むことが好ましい。
動物抽出物としては、例えば、牛、豚、羊、ヤギ等の哺乳類、トリ（鶏）、ウズラ、アヒル、ガチョウ等の鳥類、貝類、昆虫類、魚類、軟体動物類、甲殻類等の抽出物が挙げられる。植物抽出物としては、例えば、茶、果汁の抽出物及びその濃縮物、野菜抽出物及びその濃縮物、大豆及びナッツ抽出物等が挙げられる。
上記動物抽出物及び植物抽出物のうち、動物抽出物が好ましく、鳥類の抽出物がより好ましく、家禽の抽出物が更に好ましく、チキンエキスが特に好ましい。本発明の飲食品組成物は、チキンエキスを含有すると、炎症抑制効果がより高くなる。
動物抽出物としては、例えば、牛、豚、羊、ヤギ等の哺乳類、トリ（鶏）、ウズラ、アヒル、ガチョウ等の鳥類、貝類、昆虫類、魚類、軟体動物類、甲殻類等の抽出物が挙げられる。植物抽出物としては、例えば、茶、果汁の抽出物及びその濃縮物、野菜抽出物及びその濃縮物、大豆及びナッツ抽出物等が挙げられる。
上記動物抽出物及び植物抽出物のうち、動物抽出物が好ましく、鳥類の抽出物がより好ましく、家禽の抽出物が更に好ましく、チキンエキスが特に好ましい。本発明の飲食品組成物は、チキンエキスを含有すると、炎症抑制効果がより高くなる。
【0023】
＜チキンエキス＞
本発明で用いられるチキンエキス（以下ではＣＥと記載することがある）としては、トリ肉を原料として用い、液体中で加熱することにより得られる抽出物等を用いることができ、市販品を用いてもよい。原料に骨、軟骨、脚等が含まれていてもよいが、トリ頭部及び内蔵を含まないことが好ましい。
本発明で用いられるチキンエキス（以下ではＣＥと記載することがある）としては、トリ肉を原料として用い、液体中で加熱することにより得られる抽出物等を用いることができ、市販品を用いてもよい。原料に骨、軟骨、脚等が含まれていてもよいが、トリ頭部及び内蔵を含まないことが好ましい。
【0024】
上記チキンエキス（ＣＥ）の市販品としては、例えば、「ＢＥＣ Ｂｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（サントリー食品アジア社製）」や、「ＳｃｏｔｃｈＴＭ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（Ｓｃｏｔｃｈ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ（タイ）製）」、「Ｑｕａｋｅｒ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｆｏｏｄｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（台湾）製）」、「Ｃｈｉｃｋｅｎ ｓｔｏｃｋ ａｎｄ ｂｒｏｔｈ ｏｆ ＳＷＡＮＳＯＮＴＭ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ｓｏｕｐ Ｃｏｍｐａｎｙ（ＮＹＳＥ：ＣＰＢ）製）」、「Ｄｒｉｐ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｅｓｓｅｎｃｅ（Ｅｕ Ｙａｎ Ｓａｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（シンガポール）製）」、「Ｂｏｎｅｄ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｔｏｎｉｃ（Ｅｕ Ｙａｎ Ｓａｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（シンガポール）製）」、「Ｂｏｉｌｅｄ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（Ｌａｏ Ｘｉｅ Ｚｈｅｎ（台湾）製）」等が挙げられる。いずれの市販品を用いてもよいが、なかでもＢＥＣ Ｂｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎを用いることが好ましい。
【0025】
本発明で用いられるチキンエキスを熱水抽出により製造する場合、本分野で用いられている通常の方法により製造することができる。例えば、１００℃以上、好ましくは１２５℃以上の液体を用いた常圧抽出及び／又は加圧抽出を行い、得られた抽出物を膜処理やろ過することにより、チキンエキスを製造することができる。具体的には、（３）トリ肉を液体中にて加熱することにより、含有される水溶性タンパク質を除去する前処理工程、及び（４）上記前処理後に液体を交換し、再度加熱する工程により得られる抽出物が挙げられる。なお、工程（３）及び工程（４）における加熱処理は、原料であるトリ肉の焦げを防止するため、溶媒中で行うのが好ましい。溶媒としては、水、エタノール、又はこれらの混合物等を用いるのが好ましい。
チキンエキスは、上記のような方法で得られる抽出液、その希釈液、濃縮物又は乾燥粉末、及び、これらの精製物を含む。精製物としては、例えばチキンエキスの抽出液を限外ろ過や膜処理、分液操作又は樹脂等による分画処理に供して精製度を上げたものが用いられる。チキンエキスの精製度を上げた後、凍結乾燥や噴霧乾燥等によって粉末化しても良い。
チキンエキスは、上記のような方法で得られる抽出液、その希釈液、濃縮物又は乾燥粉末、及び、これらの精製物を含む。精製物としては、例えばチキンエキスの抽出液を限外ろ過や膜処理、分液操作又は樹脂等による分画処理に供して精製度を上げたものが用いられる。チキンエキスの精製度を上げた後、凍結乾燥や噴霧乾燥等によって粉末化しても良い。
【0026】
本発明で用いられるチキンエキスは、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むことが好ましい。カルノシンは、βアラニンとヒスチジンのジペプチドでβアラニル・ヒスチジンとなったものである。アンセリンは、ヒスチジン部分がメチル化されβアラニル・１メチルヒスチジンとなったものである。
カルノシンの塩及びアンセリンの塩としては、例えば、上述したＰｅｐ１の塩と同じものが挙げられる。
カルノシンの塩及びアンセリンの塩としては、例えば、上述したＰｅｐ１の塩と同じものが挙げられる。
【0027】
本発明の飲食品組成物がカルノシン及び／又はその塩を含む場合、カルノシン及び／又はその塩の含有量は、例えば、該組成物中にカルノシン換算で、０．００００１重量％以上が好ましく、０．０００１重量％以上がより好ましく、また、１０重量％以下が好ましく、１重量％以下がより好ましい。一態様において、カルノシンの含有量は、例えば、該組成物中に０．００００１～１０重量％が好ましく、０．０００１～１重量％がより好ましい。
【0028】
本発明の飲食品組成物がアンセリン及び／又はその塩を含む場合、アンセリン及び／又はその塩の含有量は、例えば、該組成物中にアンセリン換算で、０．００００１重量％以上が好ましく、０．０００１重量％以上がより好ましく、また、１０重量％以下が好ましく、１重量％以下がより好ましい。一態様において、アンセリンの含有量は、例えば、該組成物中に０．００００１～１０重量％が好ましく、０．０００１～１重量％がより好ましい。
【0029】
カルノシン及びアンセリンは、例えばＨＰＬＣで定量することができる。本発明の飲食品組成物は、カルノシン及びアンセリンを含むことがより好ましい。
【0030】
上記カルノシン、アンセリン及びそれらの塩のカルノシン及びアンセリン換算の合計重量と、Ｐｅｐ１及び／又はそれらの塩のペプチド換算の重量との重量比（カルノシン及びアンセリンの合計／Ｐｅｐ１）が、１，０００，０００／１～１／１５，０００であることが好ましい。上記重量比は、より好ましくは、１，０００，０００／１～１００／１、更に好ましくは１００，０００／１～１，０００／１である。
【0031】
上記トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（固形分換算）と、上記カルノシン、アンセリン及びそれらの塩のカルノシン及びアンセリン換算の合計との重量比（ＨＣＩＩ／カルノシン及びアンセリンの合計）は、２０／１～１／５であることが好ましい。上記重量比は、より好ましくは、１５／１～１／３である。
【0032】
本発明の飲食品組成物に含まれる各成分の含有量は特に限定されず、該組成物の形態等に応じて設定することができる。
一態様において、本発明の飲食品組成物中のＰｅｐ１及び／又はその塩の含有量は、Ｐｅｐ１換算で、０．００００１重量％以上が好ましく、０．０００１重量％以上がより好ましく、また、１重量％以下が好ましく、０．１重量％以下がより好ましい。一態様において、Ｐｅｐ１及び／又はその塩の含有量は、該組成物中に０．００００１～１重量％が好ましく、０．０００１～０．１重量％がより好ましい。
一態様において、本発明の飲食品組成物中のＰｅｐ１及び／又はその塩の含有量は、Ｐｅｐ１換算で、０．００００１重量％以上が好ましく、０．０００１重量％以上がより好ましく、また、１重量％以下が好ましく、０．１重量％以下がより好ましい。一態様において、Ｐｅｐ１及び／又はその塩の含有量は、該組成物中に０．００００１～１重量％が好ましく、０．０００１～０．１重量％がより好ましい。
【0033】
一態様において、本発明の飲食品組成物中のトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（固形分換算）の含有量は、０．１重量％以上が好ましく、０．５重量％以上がより好ましく、また、９９重量％以下が好ましく、９０重量％以下がより好ましい。一態様において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（固形分換算）の含有量は、該組成物中に０．１～９９重量％が好ましく、０．５～９０重量％がより好ましい。
本明細書において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の含有量には、Ｐｅｐ１が含まれる。
本明細書において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の含有量には、Ｐｅｐ１が含まれる。
【0034】
一態様において、本発明の飲食品組成物中のチキンエキス（固形分換算）の含有量は、０．１重量％以上が好ましく、０．５重量％以上がより好ましく、また、９９重量％以下が好ましく、９０重量％以下がより好ましい。一態様において、チキンエキス（固形分換算）の含有量は、該組成物中に０．１～９９重量％が好ましく、０．５～９０重量％がより好ましい。
【0035】
飲食品組成物としては、一般的な飲食品、機能性食品、保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等が挙げられる。飲食品の形態としては特に限定されず、例えば、固形状の食品であってもよいし、液状の食品であってもよい。好ましくは飲料である。
【0036】
本発明の飲食品組成物は、飲食品への添加物として許容されている各種の希釈剤、酸味料、酸化防止剤、安定剤、保存料、香料、乳化剤、色素類、調味料、ｐＨ調整剤、栄養強化剤等が添加されていてもよい。
【0037】
本発明の飲食品組成物は、非治療的用途に用いることが好ましい。非治療的とは、医療行為、すなわち人間の手術、治療又は診断を含まない概念である。
【0038】
＜抗炎症用組成物＞
一態様において、本発明の飲食品組成物は、炎症を抑制するために用いることができる。本発明の飲食品組成物は、抗炎症用組成物であってよく、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を有効成分として含む抗炎症用組成物であってよい。
一態様において、本発明の飲食品組成物は、炎症を抑制するために用いることができる。本発明の飲食品組成物は、抗炎症用組成物であってよく、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を有効成分として含む抗炎症用組成物であってよい。
【0039】
本発明において目的とする抗炎症効果を得るためには、上述の飲食品組成物と同様に、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物及び任意で含有するチキンエキスを、飲食品組成物に配合する。Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物及びチキンエキスは、そのまま使用してもよく、また本発明の効果を損なわない限り、上述したようにその濃縮物、乾燥粉末又は精製度を高めたものを配合してもよい。添加物等は、上述したものと同様のものを用いることができる。
【0040】
本発明の飲食品組成物の摂取量は特に限定されない。一態様として、抗炎症効果を得ることを目的として本発明の飲食品組成物を摂取する場合、摂取量は、炎症の抑制効果が得られるような量であればよく、対象の体重等に応じて適宜設定すればよい。
【0041】
一態様において、本発明の飲食品組成物を、ヒト（成人）を対象に摂取させる場合、Ｐｅｐ１及び／又はその塩の摂取量は、Ｐｅｐ１換算で、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上、また、好ましくは２００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下である。一態様において、Ｐｅｐ１及び／又はその塩の摂取量は、ヒト（成人）であれば、Ｐｅｐ１換算で、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．００１～２００ｍｇ、より好ましくは０．０１～１００ｍｇである。
【0042】
一態様において、本発明の飲食品組成物を、ヒト（成人）を対象に摂取させる場合、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（固形分換算）の摂取量は、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは０．１ｍｇ以上、また、好ましくは４０００ｍｇ以下、より好ましくは３０００ｍｇ以下である。一態様において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の摂取量は、ヒト（成人）であれば、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．０１～４０００ｍｇ、より好ましくは０．１～３０００ｍｇである。
本明細書において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の摂取量には、Ｐｅｐ１及び／又はその塩が含まれる。
本明細書において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の摂取量には、Ｐｅｐ１及び／又はその塩が含まれる。
【0043】
一態様において、本発明の飲食品組成物を、ヒト（成人）を対象に摂取させる場合、チキンエキス（固形分換算）の摂取量は、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、また、好ましくは１５０００ｍｇ以下、より好ましくは１３０００ｍｇ以下である。一態様において、チキンエキス（固形分換算）の摂取量は、ヒト（成人）であれば、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．１～１５０００ｍｇ、より好ましくは１～１３０００ｍｇである。チキンエキスの摂取量には、カルノシン、アンセリン及びそれらの塩が含まれる。
【0044】
一態様において、本発明の飲食品組成物をヒト（成人）に摂取させる場合、カルノシン、アンセリン及びそれらの塩の総摂取量は、カルノシン及びアンセリン換算で、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上、また、好ましくは５００ｍｇ以下、より好ましくは４００ｍｇ以下である。一態様において、カルノシン及びアンセリンをヒト（成人）に摂取させる場合、カルノシン、アンセリン及びそれらの塩の総摂取量は、カルノシン及びアンセリン換算で、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．００１～５００ｍｇ、より好ましくは０．０１～４００ｍｇである。
【0045】
一態様において、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物及びチキンエキスの上記量を、１日１回以上、例えば、１日１回又は数回（例えば２～３回）に分けて、摂取させることが好ましい。一態様においては、上記量のＰｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物及び上記量のチキンエキスを、ヒトに摂取させることが好ましい。一態様において、本発明の組成物は、ヒトに、１日当たり体重６０ｋｇあたり、上記量のＰｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物及び上記量のチキンエキスを摂取させるために使用することができる。
【0046】
一態様において、抗炎症効果を得ることを目的として、本発明の飲食品組成物を摂取させる場合、上記量のＰｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物及び上記量のチキンエキスを摂取させることが好ましい。
【0047】
本発明の飲食品組成物は、マクロファージ炎症タンパク質－１（ＭＩＰ－１）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、及びＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）等のサイトカイン産生を抑制する。本発明の飲食品組成物は、中でも、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、及びＲＡＮＴＥＳの産生を抑制する作用が高い。
上記のサイトカイン産生を抑制することで、生体の炎症を抑制することができる。
上記のサイトカイン産生を抑制することで、生体の炎症を抑制することができる。
【0048】
本発明の飲食品組成物は、炎症性の状態又は疾患の予防又は改善のために使用することができる。炎症性の状態又は疾患とは、炎症に起因する状態又は疾患、又は炎症を伴う状態又は疾患が挙げられる。このような状態又は疾患としては、関節炎、関節リウマチ等の膠原病、炎症性大腸炎、変形性関節症、腱炎、坐骨神経痛、椎間板ヘルニア、狭窄症、脊髄症、腰痛、椎間関節痛、手根管症候群、足根管症候群、腰椎術後疼痛症候群、エイズ、動脈硬化、喘息、関節炎、糖尿病、肝炎、脳卒中、認知症、筋消耗、ウイルス感染、光老化を含めた皮膚老化、がん、老化、アレルギー疾患、パーキンソン病、脳梗塞、白内障、てんかん、脊髄損傷、未熟児網膜症、腎障害、消化性潰瘍、膵炎、潰瘍性大腸炎、心筋梗塞、成人呼吸窮迫症候群、肺気腫、血管炎、浮腫、糖尿病合併症、紫外線障害、高山病、ポルフィリン血症、熱傷、凍傷、接触性皮膚炎、ショック、多臓器不全、ＤＩＣ、疲労、サルコぺニア（筋力低下）、ミトコンドリア機能障害、アルツハイマー病、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、及び全身性エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ）等が挙げられる。本発明の飲食品組成物は、これらの疾患の予防又は改善のために、好ましく使用される。中でも変形性関節症、関節リウマチ、及び乾癬性関節炎等の予防又は改善のために、好ましく使用される。
本明細書において、状態又は疾患の予防は、発症を防止すること、発症を遅延させること、発症率を低下させること、発症のリスクを軽減すること等を包含する。状態又は疾患の改善は、対象を状態又は疾患から回復させること、状態又は疾患の症状を軽減すること、状態又は疾患の症状を好転させること、状態又は疾患の進行を遅延させること、防止すること等を包含する。
本明細書において、状態又は疾患の予防は、発症を防止すること、発症を遅延させること、発症率を低下させること、発症のリスクを軽減すること等を包含する。状態又は疾患の改善は、対象を状態又は疾患から回復させること、状態又は疾患の症状を軽減すること、状態又は疾患の症状を好転させること、状態又は疾患の進行を遅延させること、防止すること等を包含する。
【0049】
本発明の飲食品組成物を摂取させる対象（投与対象ということもできる）は、特に限定されない。好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
一態様において、投与対象として、炎症の抑制を必要とする又は希望する対象等が挙げられる。このような対象として、例えば、炎症の予防又は改善を必要とする又は希望する対象、上記の炎症性の状態又は疾患の予防又は改善を必要とする又は希望する対象が挙げられる。一態様において、本発明における投与対象として、中高年者が挙げられる。本発明の飲食品組成物は、例えば、炎症の抑制により予防又は改善が期待できる状態の予防等を目的として、健常者に対して使用することもできる。
一態様において、投与対象として、炎症の抑制を必要とする又は希望する対象等が挙げられる。このような対象として、例えば、炎症の予防又は改善を必要とする又は希望する対象、上記の炎症性の状態又は疾患の予防又は改善を必要とする又は希望する対象が挙げられる。一態様において、本発明における投与対象として、中高年者が挙げられる。本発明の飲食品組成物は、例えば、炎症の抑制により予防又は改善が期待できる状態の予防等を目的として、健常者に対して使用することもできる。
【0050】
本発明の飲食品組成物には、炎症を抑制することにより発揮される機能の表示が付されていてもよい。このような表示は機能性表示ともいい、その表示内容は特に限定されない。このような表示として、例えば、「関節の痛みを緩和する」、「関節の痛みを軽減する」、「膝の調子を整える」、「膝を健康に保つ」、「関節の健康を改善する」、「関節の動きを改善する」等、又は、これらと同視できる表示又は機能性表示が挙げられる。
本発明の一態様において、本発明の飲食品組成物は、上記の表示が付された飲食品であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために本発明の飲食品組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、飲食品組成物自体に付されてもよいし、飲食品組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
本発明の一態様において、本発明の飲食品組成物は、上記の表示が付された飲食品であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために本発明の飲食品組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、飲食品組成物自体に付されてもよいし、飲食品組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
【0051】
＜骨吸収抑制用組成物＞
別の一態様において、本発明の飲食品組成物は、破骨細胞の骨吸収活性を抑制するために用いることができる。本発明の飲食品組成物は、骨吸収抑制用組成物として使用することができる。本発明は、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を有効成分として含む骨吸収抑制用組成物も含包する。
別の一態様において、本発明の飲食品組成物は、破骨細胞の骨吸収活性を抑制するために用いることができる。本発明の飲食品組成物は、骨吸収抑制用組成物として使用することができる。本発明は、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を有効成分として含む骨吸収抑制用組成物も含包する。
【0052】
本発明において目的とする骨吸収抑制効果を得るためには、上述の抗炎症用組成物と同様に、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を、飲食品組成物に配合する。Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、そのまま使用してもよく、また本発明の効果を損なわない限り、上述したようにその濃縮物、乾燥粉末又は精製度を高めたものを配合してもよい。添加物等は、上述したものと同様のものを用いることができる。
【0053】
本発明の飲食品組成物を、骨吸収活性を抑制するために用いる場合、摂取量は特に限定されない。本発明の飲食品組成物の摂取量は、骨吸収活性の抑制効果が得られるような量であればよく、対象の体重等に応じて適宜設定すればよい。
【0054】
本発明の飲食品組成物を、骨吸収活性の抑制を目的としてヒト（成人）を対象に摂取させる場合、Ｐｅｐ１及び／又はその塩、並びにトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の摂取量や摂取回数は、上述の抗炎症用組成物と同じ量、回数を設定することができる。一態様においては、上記量のＰｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を、ヒトに摂取させることが好ましい。一態様において、本発明の飲食品組成物は、ヒト（体重６０ｋｇ）に、１日当たり上記量のＰｅｐ１を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を摂取させるために使用することができる。
【0055】
一態様において、骨吸収抑制効果を得ることを目的として、本発明の飲食品組成物を摂取させる場合、上記量のＰｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を摂取させることが好ましい。
【0056】
本発明の飲食品組成物は、破骨細胞の骨吸収活性を抑制する。破骨細胞の骨吸収活性を抑制することで、骨量減少を抑制又は改善することができる。骨量減少の抑制は、骨量を維持すること、骨量減少の進行を遅延又は停止することを含む。骨量減少の改善は、骨量を回復させること、骨量を増やすこと、骨量減少の程度を軽減すること等を含む。
【0057】
本発明の飲食品組成物は、骨量減少に関連する状態又は疾患の予防又は改善のために使用することができる。このような状態又は疾患としては、骨粗しょう症、骨減少症等が挙げられる。本発明の飲食品組成物は、これらの疾患の予防又は改善のために、好ましく使用される。
【0058】
一態様において、投与対象として、骨吸収活性の抑制を必要とする又は希望する対象等が挙げられる。このような対象として、例えば、骨量減少に関連する状態又は疾患の予防又は改善を必要とする又は希望する対象が挙げられる。一態様において、本発明における投与対象として、中高年者が挙げられる。本発明の組成物は、例えば、骨吸収活性の抑制により予防又は改善が期待できる、骨量減少に関連する状態の予防等を目的として、健常者に対して使用することもできる。
【0059】
本発明の飲食品組成物には、骨吸収活性を抑制することにより発揮される効果を示す機能性表示が付されていてもよい。このような表示として、例えば、「骨密度を高める」、「骨量を補う」、「骨の健康を維持する」、「骨量減少を防止する」等、又は、これらと同視できる表示又は機能性表示が挙げられる。
本発明の一態様において、本発明の飲食品組成物は、上記の表示が付された飲食品であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために本発明の飲食品組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、飲食品組成物自体に付されてもよいし、飲食品組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
本発明の一態様において、本発明の飲食品組成物は、上記の表示が付された飲食品であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために本発明の飲食品組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、飲食品組成物自体に付されてもよいし、飲食品組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
【0060】
＜製造方法＞
本発明はまた、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｐｅｐ１）及び／又はその塩を配合する工程を含む、飲食品組成物の製造方法に関する。
上記配合する工程において、Ｐｅｐ１及び／又はその塩は、それ単独で飲食品組成物に配合することができるが、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を配合して飲食品組成物を製造することが好ましい。この場合、例えば、トリ軟骨の２型コラーゲンを酵素等で加水分解して得られた加水分解物をそのまま飲食品組成物に配合することができる。また、本発明の効果を損なわない限り、上述したようにその濃縮物、乾燥粉末又は精製度を高めたものを配合してもよい。
本発明はまた、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｐｅｐ１）及び／又はその塩を配合する工程を含む、飲食品組成物の製造方法に関する。
上記配合する工程において、Ｐｅｐ１及び／又はその塩は、それ単独で飲食品組成物に配合することができるが、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を配合して飲食品組成物を製造することが好ましい。この場合、例えば、トリ軟骨の２型コラーゲンを酵素等で加水分解して得られた加水分解物をそのまま飲食品組成物に配合することができる。また、本発明の効果を損なわない限り、上述したようにその濃縮物、乾燥粉末又は精製度を高めたものを配合してもよい。
【0061】
本発明の製造方法において、更に動物抽出物及び／又は植物抽出物を配合する工程を含むことが好ましい。
本発明の製造方法では、原料の配合順は特に限定されない。例えば、Ｐｅｐ１及び／又はその塩、又はＰｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を先に容器等に投入して、次いで動物抽出物及び／又は植物抽出物を加えてもよい。また、動物抽出物及び／又は植物抽出物を先に容器等に投入しておき、その後Ｐｅｐ１及び／又はその塩、又はＰｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を加えてもよい。
上記動物抽出物及び植物抽出物のうち、抽出物は動物抽出物が好ましく、鳥類の抽出物がより好ましく、家禽の抽出物が更に好ましく、チキンエキスであることが特に好ましい。
本発明の製造方法において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の好ましい態様は、上記と同じである。またチキンエキスの好ましい態様は、上記と同じである。
本発明の製造方法において、チキンエキスがカルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むことが好ましい。
本発明の製造方法では、原料の配合順は特に限定されない。例えば、Ｐｅｐ１及び／又はその塩、又はＰｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を先に容器等に投入して、次いで動物抽出物及び／又は植物抽出物を加えてもよい。また、動物抽出物及び／又は植物抽出物を先に容器等に投入しておき、その後Ｐｅｐ１及び／又はその塩、又はＰｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を加えてもよい。
上記動物抽出物及び植物抽出物のうち、抽出物は動物抽出物が好ましく、鳥類の抽出物がより好ましく、家禽の抽出物が更に好ましく、チキンエキスであることが特に好ましい。
本発明の製造方法において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の好ましい態様は、上記と同じである。またチキンエキスの好ましい態様は、上記と同じである。
本発明の製造方法において、チキンエキスがカルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むことが好ましい。
【0062】
本発明の製造方法では、チキンエキスは、市販品や熱水抽出して製造したものをそのままＰｅｐ１及び／又はその塩、又は、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物に配合することができる。チキンエキスが濃縮物、乾燥粉末又はこれらの精製物の形態である場合は、水、エタノール又はその混合物等の液体で希釈、溶解等してからＰｅｐ１及び／又はその塩、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物等に配合してもよい。Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物が濃縮物、乾燥粉末又はこれらの精製物の形態である場合も同様に、上記の液体で希釈、溶解等してから配合に用いることができる。または、予め希釈、溶解等せずに原料を配合し、その後、液体を添加して希釈、溶解等してもよい。
【0063】
本発明の製造方法で製造する飲食品組成物には、Ｐｅｐ１及び／又はその塩、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物及びチキンエキスの他に、上述したものと同じ添加物を配合することができる。
【0064】
本発明はまた、抗炎症用組成物を製造するための、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｐｅｐ１）及び／又はその塩を含む２型コラーゲン加水分解物の使用に関する。
上記抗炎症用組成物としては、上述したＰｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含む飲食品組成物と同様の組成物が挙げられる。チキンエキスやその他の添加物は、上述したものと同じものを使用することができる。
上記抗炎症用組成物としては、上述したＰｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含む飲食品組成物と同様の組成物が挙げられる。チキンエキスやその他の添加物は、上述したものと同じものを使用することができる。
【0065】
本発明はまた、骨吸収抑制用組成物を製造するための、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｐｅｐ１）及び／又はその塩の使用に関する。
上記骨吸収抑制用組成物としては、上述したＰｅｐ１及び／又はその塩を含む飲食品組成物と同様の組成物が挙げられる。Ｐｅｐ１及び／又はその塩は、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の形態で使用することができる。その他の添加物は、上述したものと同じものを使用することができる。
上記骨吸収抑制用組成物としては、上述したＰｅｐ１及び／又はその塩を含む飲食品組成物と同様の組成物が挙げられる。Ｐｅｐ１及び／又はその塩は、Ｐｅｐ１及び／又はその塩を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の形態で使用することができる。その他の添加物は、上述したものと同じものを使用することができる。
【0066】
本発明はまた、チキンエキスを有効成分として含む骨吸収抑制用組成物に関する。
本発明の骨吸収抑制用組成物は、破骨細胞の骨吸収を抑制する効果を有する。
本発明の組成物は、チキンエキスを有効成分として含むことにより、骨吸収抑制効果を発揮することができる。
本発明の骨吸収抑制用組成物は、破骨細胞の骨吸収を抑制する効果を有する。
本発明の組成物は、チキンエキスを有効成分として含むことにより、骨吸収抑制効果を発揮することができる。
【0067】
チキンエキス及びその好ましい態様は、上記と同じである。組成物には、所望により上述した添加物を使用してもよい。本発明の骨吸収抑制用組成物には、上述のトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物が更に含まれていてもよい。
【0068】
一態様において、本発明の骨吸収抑制用組成物中のチキンエキス（固形分換算）の含有量は、例えば、０．１重量％以上が好ましく、０．５重量％以上がより好ましく、また、９９重量％以下が好ましく、９０重量％以下がより好ましい。一態様において、チキンエキス（固形分換算）の含有量は、例えば、該組成物中に０．１～９９重量％が好ましく、０．５～９０重量％がより好ましい。
【0069】
本発明の骨吸収抑制用組成物は、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むことが好ましい。一態様において、本発明の組成物中のカルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の含有量は、カルノシン換算で、例えば、０．００００１重量％以上が好ましく、０．０００１重量％以上がより好ましく、また、１０重量％以下が好ましく、１重量％以下がより好ましい。一態様において、カルノシンの含有量は、例えば、該組成物中に０．００００１～１０重量％が好ましく、０．０００１～１重量％がより好ましい。
【0070】
一態様において、本発明の骨吸収抑制用組成物中のアンセリン及び／又はその塩の含有量は、アンセリン換算で、例えば、０．００００１重量％以上が好ましく、０．０００１重量％以上がより好ましく、また、１０重量％以下が好ましく、１重量％以下がより好ましい。一態様において、アンセリンの含有量は、例えば、該組成物中に０．００００１～１０重量％が好ましく、０．０００１～１重量％がより好ましい。
【0071】
本発明の骨吸収抑制用組成物の摂取量は特に限定されない。本発明の組成物の摂取量は、成熟した破骨細胞の骨吸収抑制効果が得られるような量であればよく、対象の体重等に応じて適宜設定すればよい。
【0072】
一態様において、本発明の骨吸収抑制用組成物を、ヒト（成人）を対象に摂取させる場合、チキンエキス（固形分換算）の摂取量は、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、また、好ましくは１５０００ｍｇ以下、より好ましくは１３０００ｍｇ以下である。一態様において、チキンエキス（固形分換算）の摂取量は、ヒト（成人）であれば、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．１～１５０００ｍｇ、より好ましくは１～１３０００ｍｇである。チキンエキスの摂取量には、カルノシン及びアンセリンが含まれる。
【0073】
一態様において、本発明の骨吸収抑制用組成物を、ヒト（成人）を対象に摂取させる場合、カルノシン、アンセリン及びそれらの塩の総摂取量は、カルノシン及びアンセリン換算で、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上、また、好ましくは５００ｍｇ以下、より好ましくは４００ｍｇ以下である。一態様において、カルノシン、アンセリン及びそれらの塩の総摂取量は、カルノシン及びアンセリン換算で、ヒト（成人）であれば、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．００１～５００ｍｇ、より好ましくは０．０１～４００ｍｇである。
【0074】
一態様において、上記量のチキンエキスを、１日１回以上、例えば、１日１回又は数回（例えば２～３回）に分けて、摂取させることが好ましい。一態様においては、上記量のチキンエキスを、ヒトに摂取させることが好ましい。一態様において、本発明の組成物は、ヒト（体重６０ｋｇ）に、１日当たり上記量のチキンエキスを摂取させるために使用することができる。骨吸収抑制用組成物の好ましい投与対象は、上記と同じである。
【0075】
本発明はまた、骨吸収抑制用組成物を製造するための、チキンエキスの使用に関する。
上記骨吸収抑制用組成物としては、上述したチキンエキスを含む飲食品組成物と同様の組成物が挙げられる。また、チキンエキスやその他の添加物は、上述したものと同じものを使用することができる。
上記骨吸収抑制用組成物としては、上述したチキンエキスを含む飲食品組成物と同様の組成物が挙げられる。また、チキンエキスやその他の添加物は、上述したものと同じものを使用することができる。
【実施例】
【0076】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【0077】
１．炎症抑制効果
下記の実施例及び比較例で使用した原料、試薬等を以下に示す。
＜トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の調製＞
図１に、ＨＣＩＩ調製方法を簡略に説明したフローを示す。先ず、凍結トリ軟骨を４０℃の水で解凍し、４０℃の水で洗浄を行った（１時間）。次に、洗浄水を廃棄し、新たな水をトリ軟骨の３倍量となるように１２００Ｌポットに入れた。水を酵素処理に最適な温度まで昇温し、ここに洗浄後のトリ軟骨を浸漬させ、数時間酵素処理を行った。酵素処理を行った後に、トリ軟骨の入ったポットを９０℃以上まで昇温し、３０分間９０℃以上で保持し、先の酵素処理で用いた酵素を不活化させた。得られた混合物（液体及び酵素処理後のトリ軟骨）をろ過した。得られた液体を濃縮した。最後に、得られた濃縮液を２００℃で噴霧乾燥させ、ＨＣＩＩ粉末を調製した。
下記の実施例及び比較例で使用した原料、試薬等を以下に示す。
＜トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の調製＞
図１に、ＨＣＩＩ調製方法を簡略に説明したフローを示す。先ず、凍結トリ軟骨を４０℃の水で解凍し、４０℃の水で洗浄を行った（１時間）。次に、洗浄水を廃棄し、新たな水をトリ軟骨の３倍量となるように１２００Ｌポットに入れた。水を酵素処理に最適な温度まで昇温し、ここに洗浄後のトリ軟骨を浸漬させ、数時間酵素処理を行った。酵素処理を行った後に、トリ軟骨の入ったポットを９０℃以上まで昇温し、３０分間９０℃以上で保持し、先の酵素処理で用いた酵素を不活化させた。得られた混合物（液体及び酵素処理後のトリ軟骨）をろ過した。得られた液体を濃縮した。最後に、得られた濃縮液を２００℃で噴霧乾燥させ、ＨＣＩＩ粉末を調製した。
【0078】
＜ＨＣＩＩ粉末の分子量の測定＞
得られたＨＣＩＩの分子量分布をユーロフィンＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ法により測定した。得られたＨＣＩＩの分子量分布を下記表１に示す。本分野で用いられている通常の方法で算出されたＨＣＩＩの重量平均分子量は、４５８２であった。
得られたＨＣＩＩの分子量分布をユーロフィンＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ法により測定した。得られたＨＣＩＩの分子量分布を下記表１に示す。本分野で用いられている通常の方法で算出されたＨＣＩＩの重量平均分子量は、４５８２であった。
【0079】
【表1】
【0080】
＜ＨＣＩＩの画分の分画とペプチドの同定＞
（ＨＣＩＩ分画及び生物活性同定のための材料及び方法）
（材料）
ギ酸は東京化成工業株式会社から購入した。超純水はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ浄水システムから入手した。合成ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社から入手した。
（ＨＣＩＩ分画及び生物活性同定のための材料及び方法）
（材料）
ギ酸は東京化成工業株式会社から購入した。超純水はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ浄水システムから入手した。合成ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社から入手した。
【0081】
（分取ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ））
ＨＣＩＩの分画は、分取ＶＥＲＩＴＹ２７１ＨＰＬＣシステム（Ｇｉｌｓｏｎ社製）を使用して実施した。ＨＣＩＩを超純水に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）溶液を調製した。１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ガードカラム（ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ ＰＲＥＰ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃ１２ １５×２１．２ｍｍ ＩＤ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製））に取り付けられた分取ＧＰＣカラム（ＢｉｏＳｅｐ ５μｍ ＳＥＣ－ｓ２０００ １４５Å ＬＣカラム３００×２１．２ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製））にアリコート（１０００μＬ）を注入し、５ｍＬ／ｍｉｎの速度で３０分間、溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））でイソクラティック溶離した。クロマトグラムは２１４ｎｍで観察した。
ＧＸシリーズのフラクションコレクター（Ｇｉｌｓｏｎ社製）を使用して、８分から２８分の間、０．５分ごとに画分を収集し、結果として得られた４０の個々の画分は、その後、Ｐ１からＰ７の７つの画分にプールされた（Ｐ１：８．５－１２．０分、Ｐ２：１２．０－１３．５分、Ｐ３：１３．５－１４．５分、Ｐ４：１４．５－１６．０分、Ｐ５：１６．０－１７．５分、Ｐ６：１７．５－１９．０分、Ｐ７：１９．０－２７．５分）。プールした画分を凍結乾燥機（ＳｃａｎＶａｃ社製）で蒸発乾固し、乾燥したサンプルをさらに使用するまで－２０℃で保存した。
ＨＣＩＩの分画は、分取ＶＥＲＩＴＹ２７１ＨＰＬＣシステム（Ｇｉｌｓｏｎ社製）を使用して実施した。ＨＣＩＩを超純水に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）溶液を調製した。１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ガードカラム（ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ ＰＲＥＰ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃ１２ １５×２１．２ｍｍ ＩＤ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製））に取り付けられた分取ＧＰＣカラム（ＢｉｏＳｅｐ ５μｍ ＳＥＣ－ｓ２０００ １４５Å ＬＣカラム３００×２１．２ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製））にアリコート（１０００μＬ）を注入し、５ｍＬ／ｍｉｎの速度で３０分間、溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））でイソクラティック溶離した。クロマトグラムは２１４ｎｍで観察した。
ＧＸシリーズのフラクションコレクター（Ｇｉｌｓｏｎ社製）を使用して、８分から２８分の間、０．５分ごとに画分を収集し、結果として得られた４０の個々の画分は、その後、Ｐ１からＰ７の７つの画分にプールされた（Ｐ１：８．５－１２．０分、Ｐ２：１２．０－１３．５分、Ｐ３：１３．５－１４．５分、Ｐ４：１４．５－１６．０分、Ｐ５：１６．０－１７．５分、Ｐ６：１７．５－１９．０分、Ｐ７：１９．０－２７．５分）。プールした画分を凍結乾燥機（ＳｃａｎＶａｃ社製）で蒸発乾固し、乾燥したサンプルをさらに使用するまで－２０℃で保存した。
【0082】
上記で得られた各画分の分子量を表２に示す。表２において、「Ｍｗ」及び「Ｍｐ」は、それぞれ、重量平均分子量及びピーク分子量を示す。表２に示すように、画分１（Ｐ１）及び画分２（Ｐ２）は、それぞれ、平均分子量が１３５９（Ｐ１）及び１０９２（Ｐ２）の分子で構成されていた。
ＨＣＩＩ画分の分子量は、下記の条件でＨＰＬＣゲル濾過法により測定した。
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
流速：１ｍＬ／分
移動相：ｐＨ６．８のアイソクラティック０．１ｍＭリン酸ナトリウムバッファー
実行時間：２０分
カラム：ＢｉｏｓｅｐＴＭ ５μｍ ＳＥＣ－ｓ２０００ １４５Å ＬＣカラム３００×７．８ｍｍ
ＨＣＩＩ画分の分子量は、下記の条件でＨＰＬＣゲル濾過法により測定した。
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
流速：１ｍＬ／分
移動相：ｐＨ６．８のアイソクラティック０．１ｍＭリン酸ナトリウムバッファー
実行時間：２０分
カラム：ＢｉｏｓｅｐＴＭ ５μｍ ＳＥＣ－ｓ２０００ １４５Å ＬＣカラム３００×７．８ｍｍ
【0083】
【表2】
【0084】
（ＧＰＥＧＡＰＧＫＤを含むペプチドのｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ検索）
画分Ｐ１～Ｐ７を、Ｄｕｏ Ｓｐｒａｙ Ｔｕｒｂｏ Ｖイオンソース及びガス発生器（Ｐｅａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＨＰＬＣ１２９０シリーズと連結したＴｒｉｐｌｅＴＯＦ５６００（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社）でＬＣ－ＭＳ分析した。そして、主要成分をＵＨＰＬＣ Ｇｕａｒｄ Ｚｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ ２．１×５ｍｍ １．８μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で分離し、溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））及び溶離液Ｂ（アセトニトリル：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））を用いて、下記のリニアグラジエントで溶出した：０－０．５分：溶離液Ａ１００％；０．５－７．５分：溶離液Ａ１００－６５％；７．５－１０．０分：溶離液Ａ６５－０％；１０．０－１３．０分：溶離液Ａ０％；１３．０－１３．１分：溶離液Ａ０－１００％；１３．１－１５．０分：溶離液Ａ１００％。実験は、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＩＤＡ）法のポジションモードで行い、ＭＳの衝突エネルギー（ＣＥ）及びクラスター解除ポテンシャル（ＤＰ）は、それぞれ１０．０Ｖ及び８０Ｖとして最適化した。ＰｅａｋＶｉｅｗ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）で分析を行った。続いて、質量分析データを分析し、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＫＢｆａｓｔａファイルに添付されたＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を使用して、ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓをキーワードとして検索した。更に、対象の候補リストでデータを処理し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社から購入したペプチドで確認した。
画分Ｐ１～Ｐ７を、Ｄｕｏ Ｓｐｒａｙ Ｔｕｒｂｏ Ｖイオンソース及びガス発生器（Ｐｅａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＨＰＬＣ１２９０シリーズと連結したＴｒｉｐｌｅＴＯＦ５６００（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社）でＬＣ－ＭＳ分析した。そして、主要成分をＵＨＰＬＣ Ｇｕａｒｄ Ｚｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ ２．１×５ｍｍ １．８μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で分離し、溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））及び溶離液Ｂ（アセトニトリル：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））を用いて、下記のリニアグラジエントで溶出した：０－０．５分：溶離液Ａ１００％；０．５－７．５分：溶離液Ａ１００－６５％；７．５－１０．０分：溶離液Ａ６５－０％；１０．０－１３．０分：溶離液Ａ０％；１３．０－１３．１分：溶離液Ａ０－１００％；１３．１－１５．０分：溶離液Ａ１００％。実験は、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＩＤＡ）法のポジションモードで行い、ＭＳの衝突エネルギー（ＣＥ）及びクラスター解除ポテンシャル（ＤＰ）は、それぞれ１０．０Ｖ及び８０Ｖとして最適化した。ＰｅａｋＶｉｅｗ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）で分析を行った。続いて、質量分析データを分析し、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＫＢｆａｓｔａファイルに添付されたＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を使用して、ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓをキーワードとして検索した。更に、対象の候補リストでデータを処理し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社から購入したペプチドで確認した。
【0085】
（ＬＣ－ＭＳ分析によるペプチドマーカーの検出及び定量）
ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤの検出及び定量は、ＬＣ－ＭＳで行った。ＬＣ－ＭＳ分析は、Ｄｕｏ Ｓｐｒａｙ Ｔｕｒｂｏ Ｖイオンソース及びガス発生器（Ｐｅａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＨＰＬＣ１２９０シリーズと連結したＴｒｉｐｌｅＴＯＦ５６００（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）で行った。質量分析計では、エレクトロスプレーイオン化と多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を、単位質量分解能における陽イオンモードで使用する。パラメータは下記の通りである。衝突エネルギー拡散（ＣＥＳ）：１０；イオン放出遅延（ＩＲＤ）：６７；イオン放出幅（ＩＲＷ）：２５；イオン源ガス：４０；カーテンガス（ＣＵＲ）：３０；温度：５００．０；イオンスプレー電圧フローティング（ＩＳＶＦ）：５５００）。クラスター解除ポテンシャル（ＤＰ）及び衝突エネルギー（ＣＥ）等のＭＳ化合物依存パラメータ設定は、各ペプチドに合わせて最適化した。Ａｎａｌｙｓｔ１．５．２（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて、機器制御、データ取得、及びデータ処理を行った。
ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤの検出及び定量は、ＬＣ－ＭＳで行った。ＬＣ－ＭＳ分析は、Ｄｕｏ Ｓｐｒａｙ Ｔｕｒｂｏ Ｖイオンソース及びガス発生器（Ｐｅａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＨＰＬＣ１２９０シリーズと連結したＴｒｉｐｌｅＴＯＦ５６００（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）で行った。質量分析計では、エレクトロスプレーイオン化と多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を、単位質量分解能における陽イオンモードで使用する。パラメータは下記の通りである。衝突エネルギー拡散（ＣＥＳ）：１０；イオン放出遅延（ＩＲＤ）：６７；イオン放出幅（ＩＲＷ）：２５；イオン源ガス：４０；カーテンガス（ＣＵＲ）：３０；温度：５００．０；イオンスプレー電圧フローティング（ＩＳＶＦ）：５５００）。クラスター解除ポテンシャル（ＤＰ）及び衝突エネルギー（ＣＥ）等のＭＳ化合物依存パラメータ設定は、各ペプチドに合わせて最適化した。Ａｎａｌｙｓｔ１．５．２（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて、機器制御、データ取得、及びデータ処理を行った。
【0086】
ＧＰＥＧＡＰＧＫＤを超純水で再構成し、ＳｅＱｕａｎｔ ＺＩＲ－ＨＩＬＩＣ Ｇｕａｒｄ Ｆｉｔｔｉｎｇ ＰＥＥＫ被覆１４×１ｍｍカラム（Ｍｅｒｃｋ社）を含むＺＩＣ－ＨＩＬＩＣ ３．５μｍ １００Å ２．１×５０ｍｍカラム（Ｍｅｒｃｋ）に注入し、下記のリニアグラジエントを用いて溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））及び溶離液Ｂ（アセトニトリル：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））で溶出した：０－０．５分：溶離液Ａ１０％；０．５－５．５分：溶離液Ａ１０－４５％；５．５－１０分：溶離液Ａ４５－７０％；１０－１２分：溶離液Ａ７０－８０％；１２－１３．５分：溶離液Ａ８０－１０％；１３．５－１５分：溶離液Ａ１０％。注入量は１０μＬ、流量は３００μＬ／ｍｉｎ、溶離液のＵＶ吸光度は２１４ｎｍでモニターした。ＭＳの衝突エネルギー（ＣＥ）及びクラスター解除ポテンシャル（ＤＰ）は、それぞれ２０Ｖ及び８５Ｖとして最適化した。ＧＰＥＧＡＰＧＫＤは、ｍ／ｚ４１４．２／６４１．３ＴｈでＱ１／Ｑ３イオン遷移を使用して、定量イオン及び確認イオンとして保持時間７．１分で検出した。１５．２５、３１．５、６２．５、１２５、及び２５０ｎｇ／ｍＬの標準ＧＰＥＧＡＰＧＫＤにより、検量線を作成した。作業溶液として、ＨＣＩＩの５００μｇ／ｍＬ溶液を再構成した。ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）により、ＨＣＩＩ及びそのＧＰＣ分画中のＧＰＥＧＡＰＧＫＤの定量を行った。
Ｐｅｐ１は、ＨＣＩＩの画分Ｐ１及び画分Ｐ２含まれ、Ｐｅｐ１の含有量は、ＨＣＩＩ（１ｇ）に対して５３．７±０．００７μｇ／ｇであった。
Ｐｅｐ１は、ＨＣＩＩの画分Ｐ１及び画分Ｐ２含まれ、Ｐｅｐ１の含有量は、ＨＣＩＩ（１ｇ）に対して５３．７±０．００７μｇ／ｇであった。
【0087】
＜カルノシン及びアンセリンの定量＞
チキンエキス中のカルノシン及びアンセリンの定量は下記の条件でＨＰＬＣにより行った。
カルノシンの標準原液は、カルノシン粉末を脱イオン水に添加して溶解し、カルノシン濃度２．５０ｍｇ／ｍｌで調製した。アンセリンの標準原液は、Ｌ－アンセリン硝酸塩粉末を脱イオン水に添加して溶解し、Ｌーアンセリン濃度３．９６ｍｇ／ｍｌで調製した。
Ｌ－アンセリンの重量は、下記の式を用いて計算した。
Ｌ－アンセリン（ｇ）＝０．７９２×Ｌ－アンセリン硝酸塩（ｇ）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
装置：紫外検出器付き高速液体クロマトグラフシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社製））
カラム：Ｚｏｒｂａｘ ３００－ＳＣＸ ４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
移動相：５０ｍＭリン酸二水素カリウム
流速：１．０ｍＬ／分
フローチャネル：チャネルＡ（５０ｍＭリン酸二水素カリウム）、チャネルＢ（アセトニトリル）、チャネルＤ（脱イオン水）
ＵＶ検出波長：２１０ｎｍ
サンプル注入量：１０μＬ
チキンエキス中のカルノシン及びアンセリンの定量は下記の条件でＨＰＬＣにより行った。
カルノシンの標準原液は、カルノシン粉末を脱イオン水に添加して溶解し、カルノシン濃度２．５０ｍｇ／ｍｌで調製した。アンセリンの標準原液は、Ｌ－アンセリン硝酸塩粉末を脱イオン水に添加して溶解し、Ｌーアンセリン濃度３．９６ｍｇ／ｍｌで調製した。
Ｌ－アンセリンの重量は、下記の式を用いて計算した。
Ｌ－アンセリン（ｇ）＝０．７９２×Ｌ－アンセリン硝酸塩（ｇ）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
装置：紫外検出器付き高速液体クロマトグラフシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社製））
カラム：Ｚｏｒｂａｘ ３００－ＳＣＸ ４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
移動相：５０ｍＭリン酸二水素カリウム
流速：１．０ｍＬ／分
フローチャネル：チャネルＡ（５０ｍＭリン酸二水素カリウム）、チャネルＢ（アセトニトリル）、チャネルＤ（脱イオン水）
ＵＶ検出波長：２１０ｎｍ
サンプル注入量：１０μＬ
【0088】
＜抗炎症活性の評価方法＞
実施例１～３では、下記の方法で炎症マーカーの産生抑制効果を評価した。
（原料及び試薬）
チキンエキス（ＣＥ）：Ｂｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（サントリー食品アジア社、１ｍｌ中のカルノシンの含有量：０．９４ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ中のアンセリンの含有量：１．９ｍｇ／ｍｌ）
軟骨細胞培地（ＣＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、軟骨細胞増殖サプリメント（ＣＧＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）：ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製
ＩＬ－１β：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製
ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）被覆９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）
実施例１～３では、下記の方法で炎症マーカーの産生抑制効果を評価した。
（原料及び試薬）
チキンエキス（ＣＥ）：Ｂｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（サントリー食品アジア社、１ｍｌ中のカルノシンの含有量：０．９４ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ中のアンセリンの含有量：１．９ｍｇ／ｍｌ）
軟骨細胞培地（ＣＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、軟骨細胞増殖サプリメント（ＣＧＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）：ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製
ＩＬ－１β：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製
ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）被覆９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）
【0089】
＜細胞培養及び前処理＞
ヒト軟骨細胞（ＨＣ－ａ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）は、ヒト関節軟骨から分離され、５％ＦＢＳ、１％ＣＧＳ、１％Ｐ／Ｓを添加したＣＭで保存した。ＰＬＬ被覆９６ウェルプレートに細胞を細胞密度４０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバー内で、３７℃で一晩培養した。軟骨細胞をＰＢＳで１回洗浄し、様々な濃度のＨＣＩＩ、チキンエキス（ＣＥ）、ＨＣＩＩとＣＥの組み合わせ、ＨＣＩＩから分画した画分、又はＧＰＥＧＡＰＧＫＤで２４時間前処理し、さらに２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１βを添加して２４時間処理を行った。細胞を１１００ｇで５分間遠心分離し、上清をサイトカイン分析に使用した。対比のため、ＨＣＩＩ、ＣＥ、ＨＣＩＩから分画した画分及びＧＰＥＧＡＰＧＫＤで前処理せずに、ＩＬ－１βで処理した細胞（ＩＬ－１β処理細胞）を調整した。
ヒト軟骨細胞（ＨＣ－ａ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）は、ヒト関節軟骨から分離され、５％ＦＢＳ、１％ＣＧＳ、１％Ｐ／Ｓを添加したＣＭで保存した。ＰＬＬ被覆９６ウェルプレートに細胞を細胞密度４０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバー内で、３７℃で一晩培養した。軟骨細胞をＰＢＳで１回洗浄し、様々な濃度のＨＣＩＩ、チキンエキス（ＣＥ）、ＨＣＩＩとＣＥの組み合わせ、ＨＣＩＩから分画した画分、又はＧＰＥＧＡＰＧＫＤで２４時間前処理し、さらに２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１βを添加して２４時間処理を行った。細胞を１１００ｇで５分間遠心分離し、上清をサイトカイン分析に使用した。対比のため、ＨＣＩＩ、ＣＥ、ＨＣＩＩから分画した画分及びＧＰＥＧＡＰＧＫＤで前処理せずに、ＩＬ－１βで処理した細胞（ＩＬ－１β処理細胞）を調整した。
【0090】
＜多重サイトカイン分析＞
Ｐｒｏ－Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を使用して、培地中のサイトカインを分析した。多重分析は以下の２７個である：ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、エオタキシン（ＣＣＬ１１）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１；ＣＣＬ２）、マクロファージ炎症性タンパク質－１α（ＭＩＰ－１α；ＣＣＬ３）、ＭＩＰ－１β（ＣＣＬ４）、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）（ＣＣＬ５）、ＴＮＦ－α及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）。製造元の指示に従って多重分析を実行し、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＰＯＮＥＮＴ ｆｏｒ ＭＡＧＰＩＸプラットフォームで実行した。データ処理にはＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒバージョン６．０を使用した。サイトカインとケモカインの濃度は、標準曲線を参照して計算された。マルチプレックスキットの感度は５ｐｇ／ｍＬ未満であった。
Ｐｒｏ－Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を使用して、培地中のサイトカインを分析した。多重分析は以下の２７個である：ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、エオタキシン（ＣＣＬ１１）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１；ＣＣＬ２）、マクロファージ炎症性タンパク質－１α（ＭＩＰ－１α；ＣＣＬ３）、ＭＩＰ－１β（ＣＣＬ４）、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）（ＣＣＬ５）、ＴＮＦ－α及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）。製造元の指示に従って多重分析を実行し、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＰＯＮＥＮＴ ｆｏｒ ＭＡＧＰＩＸプラットフォームで実行した。データ処理にはＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒバージョン６．０を使用した。サイトカインとケモカインの濃度は、標準曲線を参照して計算された。マルチプレックスキットの感度は５ｐｇ／ｍＬ未満であった。
【0091】
＜統計分析＞
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ社）を使用して、統計分析を実施した。すべての結果は、平均±標準偏差として表される。統計分析は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続く事後テューキーの多重比較検定によって実行された。Ｐ値がｐ＜０．０５の場合、データは有意であると見なされる。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ社）を使用して、統計分析を実施した。すべての結果は、平均±標準偏差として表される。統計分析は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続く事後テューキーの多重比較検定によって実行された。Ｐ値がｐ＜０．０５の場合、データは有意であると見なされる。
【0092】
＜実施例１及び比較例１、２＞
ヒト軟骨細胞によって生成される炎症マーカーＭＩＰ－１βに対するＨＣＩＩとチキンエキス（ＣＥ）の効果を評価するために、４つの異なる条件を比較した：処理前の細胞（未処理コントロール）、ＩＬ－１β処理細胞（比較例１）、ＩＬ－１β＋ＨＣＩＩ処理細胞（実施例１）及びＩＬ－１β＋ＣＥ処理細胞（比較例２）。ＨＣＩＩ処理細胞、ＣＥ処理細胞は、前処理にＨＣＩＩ又はＣＥを使用したものである。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ又は２．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＥの濃度は１．２５ｍｇ／ｍｌ又は６．２５ｍｇ／ｍｌとした。
図２に示すように、ＩＬ－１β２５ｎｇ／ｍＬはヒト軟骨細胞に炎症を誘発し、未処理細胞（コントロール）と比較してＭＩＰ－１βのレベルを大幅に増加させた。細胞をＨＣＩＩ及びＣＥで前処理すると、ＩＬ－１βによって誘導されるＭＩＰ－１βのレベルが低下した。ＭＩＰ－１βの産生抑制に対するＨＣＩＩ及びＣＥの用量依存効果もあった。図２中、データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
ヒト軟骨細胞によって生成される炎症マーカーＭＩＰ－１βに対するＨＣＩＩとチキンエキス（ＣＥ）の効果を評価するために、４つの異なる条件を比較した：処理前の細胞（未処理コントロール）、ＩＬ－１β処理細胞（比較例１）、ＩＬ－１β＋ＨＣＩＩ処理細胞（実施例１）及びＩＬ－１β＋ＣＥ処理細胞（比較例２）。ＨＣＩＩ処理細胞、ＣＥ処理細胞は、前処理にＨＣＩＩ又はＣＥを使用したものである。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ又は２．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＥの濃度は１．２５ｍｇ／ｍｌ又は６．２５ｍｇ／ｍｌとした。
図２に示すように、ＩＬ－１β２５ｎｇ／ｍＬはヒト軟骨細胞に炎症を誘発し、未処理細胞（コントロール）と比較してＭＩＰ－１βのレベルを大幅に増加させた。細胞をＨＣＩＩ及びＣＥで前処理すると、ＩＬ－１βによって誘導されるＭＩＰ－１βのレベルが低下した。ＭＩＰ－１βの産生抑制に対するＨＣＩＩ及びＣＥの用量依存効果もあった。図２中、データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
【0093】
＜実施例２＞ＨＣＩＩとＣＥの組み合わせの相乗効果
炎症マーカーＭＩＰ－１βの産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥの組み合わせによる相乗効果を評価するために、ＨＣＩＩ単独、ＣＥ単独、ＨＣＩＩとＣＥとを組み合わせた条件で前処理を行った。前処理の際のＨＣＩＩの濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＥの濃度は１．２５ｍｇ／ｍｌとした。
図３に示すように、ＨＣＩＩ０．５ｍｇ／ｍＬとＣＥ１．２５ｍｇ／ｍＬの組み合わせは、ＨＣＩＩ又はＣＥ単独での処理と比較して、炎症を軽減する相乗効果をもたらした。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
炎症マーカーＭＩＰ－１βの産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥの組み合わせによる相乗効果を評価するために、ＨＣＩＩ単独、ＣＥ単独、ＨＣＩＩとＣＥとを組み合わせた条件で前処理を行った。前処理の際のＨＣＩＩの濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＥの濃度は１．２５ｍｇ／ｍｌとした。
図３に示すように、ＨＣＩＩ０．５ｍｇ／ｍＬとＣＥ１．２５ｍｇ／ｍＬの組み合わせは、ＨＣＩＩ又はＣＥ単独での処理と比較して、炎症を軽減する相乗効果をもたらした。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
【0094】
＜実施例３＞炎症マーカーの調節に対するＨＣＩＩからの分離画分の効果
ＨＣＩＩから分離された７つの画分のうち、Ｐ１及びＰ２を使用した。実施例１と同様に、細胞を、ＩＬ－１β及びＨＣＩＩ並びにＰ１又はＰ２（ＨＣＩＩ、Ｐ１、及びＰ２の濃度はそれぞれ５ｍｇ／ｍＬ）で前処理を行い、効果を比較した。
結果を図４に示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
ＨＣＩＩから分離された７つの画分のうち、Ｐ１及びＰ２を使用した。実施例１と同様に、細胞を、ＩＬ－１β及びＨＣＩＩ並びにＰ１又はＰ２（ＨＣＩＩ、Ｐ１、及びＰ２の濃度はそれぞれ５ｍｇ／ｍＬ）で前処理を行い、効果を比較した。
結果を図４に示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
【0095】
＜実施例４及び比較例３＞
炎症マーカーであるＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９及びＩＬ－１２に対するＨＣＩＩの影響を評価するために、下記の３つの異なる条件を比較した：処理前の細胞（未処理のコントロール）、ＩＬ－１β処理細胞（比較例３）、及びＩＬ－１β＋ＨＣＩＩ処理細胞（実施例４）。ＨＣＩＩ処理細胞はＨＣＩＩで前処理を行ったものである。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ又は２．５ｍｇ／ｍｌであった。
図５に示すように、ＩＬ－１β２５ｎｇ／ｍＬはヒト軟骨細胞に炎症を誘発し、未処理細胞（コントロール）と比較しＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９又はＩＬ－１２のレベルを大幅に増加させた。細胞をＨＣＩＩで前処理すると、ＩＬ－１βによって誘導されるＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９及びＩＬ－１２のレベルが低下した。ＩＬ－９及びＩＬ－１２の産生抑制に対するＨＣＩＩの用量依存効果もあった。図５中、データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
炎症マーカーであるＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９及びＩＬ－１２に対するＨＣＩＩの影響を評価するために、下記の３つの異なる条件を比較した：処理前の細胞（未処理のコントロール）、ＩＬ－１β処理細胞（比較例３）、及びＩＬ－１β＋ＨＣＩＩ処理細胞（実施例４）。ＨＣＩＩ処理細胞はＨＣＩＩで前処理を行ったものである。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ又は２．５ｍｇ／ｍｌであった。
図５に示すように、ＩＬ－１β２５ｎｇ／ｍＬはヒト軟骨細胞に炎症を誘発し、未処理細胞（コントロール）と比較しＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９又はＩＬ－１２のレベルを大幅に増加させた。細胞をＨＣＩＩで前処理すると、ＩＬ－１βによって誘導されるＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９及びＩＬ－１２のレベルが低下した。ＩＬ－９及びＩＬ－１２の産生抑制に対するＨＣＩＩの用量依存効果もあった。図５中、データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
【0096】
＜実施例５＞炎症マーカーＭＣＰ－１の産生抑制に対するＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの相乗効果
炎症マーカーＭＣＰ－１の産生抑制に対するＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの相乗効果を評価するために、実施例１と同様に、ＩＬ－１β及びＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの条件で前処理を行った。前処理において、ＧＰＥＧＡＰＧＫＤの濃度は２．５ｍｇ／ｍｌであり、ＣＥの濃度は６．２５ｍｇ／ｍｌであった。
結果を図６に示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
炎症マーカーＭＣＰ－１の産生抑制に対するＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの相乗効果を評価するために、実施例１と同様に、ＩＬ－１β及びＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの条件で前処理を行った。前処理において、ＧＰＥＧＡＰＧＫＤの濃度は２．５ｍｇ／ｍｌであり、ＣＥの濃度は６．２５ｍｇ／ｍｌであった。
結果を図６に示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
【0097】
＜実施例６＞炎症マーカーの産生抑制に対するＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの相乗効果
炎症マーカーであるＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β及びＲＡＮＴＥＳの産生抑制に対するＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの相乗効果を評価するために、実施例１と同様に、ＩＬ－１β及びＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの条件で前処理を行った。前処理において、ＧＰＥＧＡＰＧＫＤの濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍｌであり、ＣＥの濃度は６．２５ｍｇ／ｍｌであった。
図７－１（ａ）、図７－１（ｂ）、図７－１（ｃ）、図７－２（ｄ）、図７－２（ｅ）、及び図７－２（ｆ）に結果を示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
炎症マーカーであるＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β及びＲＡＮＴＥＳの産生抑制に対するＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの相乗効果を評価するために、実施例１と同様に、ＩＬ－１β及びＧＰＥＧＡＰＧＫＤとＣＥの組み合わせの条件で前処理を行った。前処理において、ＧＰＥＧＡＰＧＫＤの濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍｌであり、ＣＥの濃度は６．２５ｍｇ／ｍｌであった。
図７－１（ａ）、図７－１（ｂ）、図７－１（ｃ）、図７－２（ｄ）、図７－２（ｅ）、及び図７－２（ｆ）に結果を示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
【0098】
２．骨吸収抑制効果（トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物）
下記の実施例で使用した原料、試薬等を以下に示す。
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、上記「１．炎症抑制効果」についての実施例等で調製、使用したものと同じものを用いた。
ＯｓｔｅｏＬｙｓｅアッセイキット（ヒトコラーゲン）、破骨細胞前駆体（ＯＣＰ）、ＯＣＰ基礎培地を含むＯＣＰ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ、及びＯＣＰ増殖培地ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓキットを、Ｌｏｎｚａ社から購入した。
ＯＣＰ増殖培地ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓキットは、ウシ胎児血清、Ｌ－グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、マクロファージコロニー刺激因子、及び可溶性ＲＡＮＫリガンドを含み、Ｌｏｎｚａ社から入手した。
また、ＯｓｔｅｏＬｙｓｅアッセイキット（ヒトコラーゲン）は、９６ウェルＯｓｔｅｏＬｙｓｅプレート、フルオロフォア放出試薬、及び９６ウェルアッセイプレート（黒）を含む。
下記の実施例で使用した原料、試薬等を以下に示す。
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、上記「１．炎症抑制効果」についての実施例等で調製、使用したものと同じものを用いた。
ＯｓｔｅｏＬｙｓｅアッセイキット（ヒトコラーゲン）、破骨細胞前駆体（ＯＣＰ）、ＯＣＰ基礎培地を含むＯＣＰ Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ、及びＯＣＰ増殖培地ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓキットを、Ｌｏｎｚａ社から購入した。
ＯＣＰ増殖培地ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓキットは、ウシ胎児血清、Ｌ－グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、マクロファージコロニー刺激因子、及び可溶性ＲＡＮＫリガンドを含み、Ｌｏｎｚａ社から入手した。
また、ＯｓｔｅｏＬｙｓｅアッセイキット（ヒトコラーゲン）は、９６ウェルＯｓｔｅｏＬｙｓｅプレート、フルオロフォア放出試薬、及び９６ウェルアッセイプレート（黒）を含む。
【0099】
下記の実施例において、骨吸収抑制効果は下記の方法で評価した。
＜細胞培養及び処理＞
ヒト初代破骨細胞前駆体（ＯＣＰ、Ｃａｔ．＃２Ｔ－１１０）を解凍し、ＯｓｔｅｏＬｙｓｅアッセイキット（Ｃａｔ．＃ＰＡ－１５００）による９６ウェルＯｓｔｅｏＬｙｓｅプレートに１００００細胞／ウェルで播種した。ヒト初代破骨細胞前駆体を、ＦＢＳ（１０％）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＯＣＰ基礎培地（Ｃａｔ．＃ＰＴ－８２０１）で保存した。ヒト初代破骨細胞前駆体の分化培地を完成させるため、ＲＡＮＫリガンド及びＭ－ＣＳＦをそれぞれ６６ｎｇ／ｍｌ及び３３ｎｇ／ｍｌの量で増殖培地に添加した。前駆細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバー内で、３７℃で７日間培養し、機能的に成熟した破骨細胞に完全に分化させた。細胞の形態を顕微鏡で調べ、前駆体が完全に成熟破骨細胞に分化していることを確認した。未分化細胞をポジティブコントロールとして、ＲＡＮＫリガンドが存在しない増殖培地で保存した。７日目に、ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤ５０ｍｇ／ｍｌ、ＨＣＩＩ１０ｍｇ／ｍｌ、及びＨＣＩＩから２つの濃度（５ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌ）で分離された異なる画分を新鮮な分化培地に添加した。細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバー内で、３７℃で更に３日間培養した。
＜細胞培養及び処理＞
ヒト初代破骨細胞前駆体（ＯＣＰ、Ｃａｔ．＃２Ｔ－１１０）を解凍し、ＯｓｔｅｏＬｙｓｅアッセイキット（Ｃａｔ．＃ＰＡ－１５００）による９６ウェルＯｓｔｅｏＬｙｓｅプレートに１００００細胞／ウェルで播種した。ヒト初代破骨細胞前駆体を、ＦＢＳ（１０％）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＯＣＰ基礎培地（Ｃａｔ．＃ＰＴ－８２０１）で保存した。ヒト初代破骨細胞前駆体の分化培地を完成させるため、ＲＡＮＫリガンド及びＭ－ＣＳＦをそれぞれ６６ｎｇ／ｍｌ及び３３ｎｇ／ｍｌの量で増殖培地に添加した。前駆細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバー内で、３７℃で７日間培養し、機能的に成熟した破骨細胞に完全に分化させた。細胞の形態を顕微鏡で調べ、前駆体が完全に成熟破骨細胞に分化していることを確認した。未分化細胞をポジティブコントロールとして、ＲＡＮＫリガンドが存在しない増殖培地で保存した。７日目に、ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤ５０ｍｇ／ｍｌ、ＨＣＩＩ１０ｍｇ／ｍｌ、及びＨＣＩＩから２つの濃度（５ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌ）で分離された異なる画分を新鮮な分化培地に添加した。細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバー内で、３７℃で更に３日間培養した。
【0100】
＜骨吸収抑分析＞
製造元の指示に従って骨吸収抑分析を実行した。本分析では、破骨細胞の吸収窩に放出されるマトリックスメタロプロテイナーゼの放出を直接測定した。フルオロフォアで誘導体化されたヒト骨基質（ユウロピウム共役コラーゲン）でＯｓｔｅｏＬｙｓｅ細胞培養プレートを被覆し、Ｅｕ標識コラーゲン断片に反映される破骨細胞の吸収活性をマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ Ｐｒｏ）で測定した。フルオロフォア放出試薬を９６ウェルプレートに２００ｕＬ／ウェルで添加し、１０μｌの細胞培養上清を移してフルオロフォア放出試薬と混合した。４００μ秒の初期遅延の後、４００μ秒間に渡り、励起波長３４０ｎｍ及び発光波長６１５ｎｍで蛍光を測定した。細胞処理から２４時間後、４８時間後、及び７２時間後の上清をサンプリングして、経時変化を調べた。
製造元の指示に従って骨吸収抑分析を実行した。本分析では、破骨細胞の吸収窩に放出されるマトリックスメタロプロテイナーゼの放出を直接測定した。フルオロフォアで誘導体化されたヒト骨基質（ユウロピウム共役コラーゲン）でＯｓｔｅｏＬｙｓｅ細胞培養プレートを被覆し、Ｅｕ標識コラーゲン断片に反映される破骨細胞の吸収活性をマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ Ｐｒｏ）で測定した。フルオロフォア放出試薬を９６ウェルプレートに２００ｕＬ／ウェルで添加し、１０μｌの細胞培養上清を移してフルオロフォア放出試薬と混合した。４００μ秒の初期遅延の後、４００μ秒間に渡り、励起波長３４０ｎｍ及び発光波長６１５ｎｍで蛍光を測定した。細胞処理から２４時間後、４８時間後、及び７２時間後の上清をサンプリングして、経時変化を調べた。
【0101】
＜統計分析＞
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ社）を使用して統計分析を実施した。全ての結果は、平均値±標準偏差値として示す。統計分析は対応のないｔ検定で実施し、値がｐ＜０．０５の場合、データは有意であると見なした。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ社）を使用して統計分析を実施した。全ての結果は、平均値±標準偏差値として示す。統計分析は対応のないｔ検定で実施し、値がｐ＜０．０５の場合、データは有意であると見なした。
【0102】
＜実施例７＞ＨＣＩＩによる骨吸収活性の抑制
成熟破骨細胞の骨吸収活性に対するＨＣＩＩの影響を評価するために、４つの異なる条件を比較した：未分化細胞（ポジティブコントロール）、処理前の分化した破骨細胞（未処理のコントロール）、及びＨＣＩＩ処理破骨細胞（ＨＣＩＩ６ｍｇ／ｍｌ）。
図８に示すように、成熟破骨細胞を、ＨＣＩＩ６ｍｇ／ｍｌの量で７２時間処理した。未処理のコントロールと比較して、ＨＣＩＩは６ｍｇ／ｍＬの使用量で骨吸収を大幅に低下させた。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１の未処理のコントロールに対する有意差を示す。
成熟破骨細胞の骨吸収活性に対するＨＣＩＩの影響を評価するために、４つの異なる条件を比較した：未分化細胞（ポジティブコントロール）、処理前の分化した破骨細胞（未処理のコントロール）、及びＨＣＩＩ処理破骨細胞（ＨＣＩＩ６ｍｇ／ｍｌ）。
図８に示すように、成熟破骨細胞を、ＨＣＩＩ６ｍｇ／ｍｌの量で７２時間処理した。未処理のコントロールと比較して、ＨＣＩＩは６ｍｇ／ｍＬの使用量で骨吸収を大幅に低下させた。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１の未処理のコントロールに対する有意差を示す。
【0103】
＜実施例８＞７つの異なるＨＣＩＩ画分による骨吸収活性の抑制
ＨＣＩＩを精製し、７つの画分（Ｐ１～Ｐ７）に分離して、骨吸収活性の減少におけるＨＣＩＩの有効性に寄与する生理活性物質を調べた。各画分は、５ｍｇ／ｍＬ添加した。細胞をＨＣＩＩ５ｍｇ／ｍＬで７２時間処理すると、骨吸収活性が大幅に減少した（図９）。ＨＣＩＩと同等の量で単独で処理した場合、どの画分も効果的ではなかった。しかし、画分１と画分２（Ｐ１＋Ｐ２）を組み合わせて処理した場合、未処理のコントロールと比較して、骨吸収活性の大幅な減少で示されるように、相乗効果があった。
データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１の未処理のコントロールに対する有意差を示す。
ＨＣＩＩを精製し、７つの画分（Ｐ１～Ｐ７）に分離して、骨吸収活性の減少におけるＨＣＩＩの有効性に寄与する生理活性物質を調べた。各画分は、５ｍｇ／ｍＬ添加した。細胞をＨＣＩＩ５ｍｇ／ｍＬで７２時間処理すると、骨吸収活性が大幅に減少した（図９）。ＨＣＩＩと同等の量で単独で処理した場合、どの画分も効果的ではなかった。しかし、画分１と画分２（Ｐ１＋Ｐ２）を組み合わせて処理した場合、未処理のコントロールと比較して、骨吸収活性の大幅な減少で示されるように、相乗効果があった。
データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１の未処理のコントロールに対する有意差を示す。
【0104】
＜実施例９＞ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤによる骨吸収活性の抑制
画分１と画分２を組み合わせた画分（Ｐ１＋Ｐ２）に、ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤが含まれていることを確認し、その有効性を検証した。細胞を５ｍｇ／ｍＬのＨＣＩＩ、５ｍｇ／ｍｌの画分（Ｐ１＋Ｐ２）又は５０ｍｇ／ｍｌのペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤで７２時間処理した。実施例４と同様に、未処理のコントロールと比較して、ＨＣＩＩとＰ１＋Ｐ２は、５ｍｇ／ｍＬの使用量で破骨細胞の骨吸収活性を妨げた。ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤは、ＨＣＩＩ又は画分Ｐ１＋画分Ｐ２の量の１０倍量で骨吸収における大幅な減少を示した（図１０）。
データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１の未処理のコントロールに対する有意差を示す。
画分１と画分２を組み合わせた画分（Ｐ１＋Ｐ２）に、ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤが含まれていることを確認し、その有効性を検証した。細胞を５ｍｇ／ｍＬのＨＣＩＩ、５ｍｇ／ｍｌの画分（Ｐ１＋Ｐ２）又は５０ｍｇ／ｍｌのペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤで７２時間処理した。実施例４と同様に、未処理のコントロールと比較して、ＨＣＩＩとＰ１＋Ｐ２は、５ｍｇ／ｍＬの使用量で破骨細胞の骨吸収活性を妨げた。ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤは、ＨＣＩＩ又は画分Ｐ１＋画分Ｐ２の量の１０倍量で骨吸収における大幅な減少を示した（図１０）。
データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１の未処理のコントロールに対する有意差を示す。
【0105】
ＨＣＩＩは、用量依存的に成熟破骨細胞の骨吸収活性を抑制した。画分１と画分２の組み合わせは、未処理の細胞と比較した場合、骨吸収活性を大幅に妨げた。画分１及び画分２を組み合わせた画分に見られるペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤも、骨吸収を低下させた。したがって、ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤは、ＨＣＩＩによる骨吸収活性の阻害に部分的に寄与する生理活性物質の１つである可能性がある。
【0106】
３．骨吸収抑制効果（チキンエキス）
＜実施例１０＞チキンエキスによる骨吸収活性の抑制
ＨＣＩＩの代わりに、チキンエキスを７．５ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ用いる以外は、実施例７と同様に、成熟破骨細胞の骨吸収活性の抑制について調べた。
細胞をＣＥで処理した場合、未処理のコントロールと比較して、７．５ｍｇ／ｍｌと１５ｍｇ／ｍｌの両方において骨吸収の大幅な減少が示された（図１１）。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１の未処理のコントロール対照に対する有意差を示す。
＜実施例１０＞チキンエキスによる骨吸収活性の抑制
ＨＣＩＩの代わりに、チキンエキスを７．５ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ用いる以外は、実施例７と同様に、成熟破骨細胞の骨吸収活性の抑制について調べた。
細胞をＣＥで処理した場合、未処理のコントロールと比較して、７．５ｍｇ／ｍｌと１５ｍｇ／ｍｌの両方において骨吸収の大幅な減少が示された（図１１）。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１の未処理のコントロール対照に対する有意差を示す。
【0107】
＜実施例１１＞膝痛及び骨量に対するＨＣＩＩ及びＣＥの効果を調べるためのランダム化二重盲検４アームパイロット試験
本パイロット試験は、単一施設、二重盲検、ランダム化、プラセボ対照試験として実施した。
本パイロット試験は、単一施設、二重盲検、ランダム化、プラセボ対照試験として実施した。
【0108】
（被験者の登録とランダム化）
表３にまとめる選択基準及び除外基準を用いて、４５歳～７５歳の合計１６０人の被験者を選択した。被験者をランダムに下記の４群に分けた：「プラセボ」、「グルコサミン」、「ＨＣＩＩ」、及び「ＨＣＩＩとＣＥ」。各群には４０人の被験者が含まれた。
表３にまとめる選択基準及び除外基準を用いて、４５歳～７５歳の合計１６０人の被験者を選択した。被験者をランダムに下記の４群に分けた：「プラセボ」、「グルコサミン」、「ＨＣＩＩ」、及び「ＨＣＩＩとＣＥ」。各群には４０人の被験者が含まれた。
【0109】
【表3】
【0110】
（試験製品）
「プラセボ」群は、マルトデキストリン６．８ｇ及びキサンタンガム７ｍｇを摂取した。
「グルコサミン」群は、グルコサミン塩酸塩１．５ｇを摂取した。グルコサミン塩酸塩は陽性対照として用いた。
「ＨＣＩＩ」群は、２型コラーゲン加水分解物（ＨＣＩＩ）の天然の基質と、低分子量コンドロイチン硫酸と、ヒアルロン酸（ＨＡ）とからなるトリ胸肋軟骨加水分解抽出物である、ＢＲＡＮＤコラーゲン加水分解物（サントリー食品アジア社製）を摂取した。この製品には、ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤを含むＨＣＩＩが含まれる。容量６８ｍＬの各ボトルに２ｇのＨＣＩＩが含まれ、ＨＣＩＩ（６６．５％）と、解重合したコンドロイチン硫酸（１８％）と、ＨＡ（１１％）とからなる天然組成物を提供する。残り４．５％は、胸肋軟骨の成分のうち、特性のないものが占める。
「ＨＣＩＩとＣＥ」群は、ボトル６８ｍＬに含まれるＢｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（ＢＥＣ）７０ｇ（乾燥重量：５～６ｇ）及びＨＣＩＩ２ｇの混合物を摂取した。試験品は、全て、ガラス瓶詰めの液体製品として調製され、等カロリー、同一の外観、及び同等の風味と食感を有した。参加者は、１日１回、午前中、食後に試験製品を摂取した。
試験結果に影響がないと見なされる場合、併用薬又はサプリメントを継続して摂取することが許可された。痛み止め又は鎮痛剤は、処方箋の下で救急薬として許可された。「鎮痛剤の併用」欄の記録に基づいて鎮痛剤による治療日数カバー比率（ＰＤＣ）を算出し、ｖｉｓｉｔ間の総日数に対する鎮痛剤の治療日数カバー率と定義した。試験期間中、ホルモン療法（成長ホルモン、プロゲステロン、エストロゲン、テストステロン）、カルシウム、ビタミンＤ、又は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、オメガ３、オメガ６、グルコサミン、又はコンドロイチンを豊富に含むサプリメント等、関節、骨、及び筋肉の健康をサポートする治療や栄養補助食品は全て禁止された。
「プラセボ」群は、マルトデキストリン６．８ｇ及びキサンタンガム７ｍｇを摂取した。
「グルコサミン」群は、グルコサミン塩酸塩１．５ｇを摂取した。グルコサミン塩酸塩は陽性対照として用いた。
「ＨＣＩＩ」群は、２型コラーゲン加水分解物（ＨＣＩＩ）の天然の基質と、低分子量コンドロイチン硫酸と、ヒアルロン酸（ＨＡ）とからなるトリ胸肋軟骨加水分解抽出物である、ＢＲＡＮＤコラーゲン加水分解物（サントリー食品アジア社製）を摂取した。この製品には、ペプチドＧＰＥＧＡＰＧＫＤを含むＨＣＩＩが含まれる。容量６８ｍＬの各ボトルに２ｇのＨＣＩＩが含まれ、ＨＣＩＩ（６６．５％）と、解重合したコンドロイチン硫酸（１８％）と、ＨＡ（１１％）とからなる天然組成物を提供する。残り４．５％は、胸肋軟骨の成分のうち、特性のないものが占める。
「ＨＣＩＩとＣＥ」群は、ボトル６８ｍＬに含まれるＢｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（ＢＥＣ）７０ｇ（乾燥重量：５～６ｇ）及びＨＣＩＩ２ｇの混合物を摂取した。試験品は、全て、ガラス瓶詰めの液体製品として調製され、等カロリー、同一の外観、及び同等の風味と食感を有した。参加者は、１日１回、午前中、食後に試験製品を摂取した。
試験結果に影響がないと見なされる場合、併用薬又はサプリメントを継続して摂取することが許可された。痛み止め又は鎮痛剤は、処方箋の下で救急薬として許可された。「鎮痛剤の併用」欄の記録に基づいて鎮痛剤による治療日数カバー比率（ＰＤＣ）を算出し、ｖｉｓｉｔ間の総日数に対する鎮痛剤の治療日数カバー率と定義した。試験期間中、ホルモン療法（成長ホルモン、プロゲステロン、エストロゲン、テストステロン）、カルシウム、ビタミンＤ、又は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、オメガ３、オメガ６、グルコサミン、又はコンドロイチンを豊富に含むサプリメント等、関節、骨、及び筋肉の健康をサポートする治療や栄養補助食品は全て禁止された。
【0111】
（手順）
本試験では、最初にスクリーニングｖｉｓｉｔ（ベースラインｖｉｓｉｔの２８日前）を行い、その後、ベースラインｖｉｓｉｔ（ベースラインｖｉｓｉｔは０日目であるが、スクリーニングｖｉｓｉｔとベースラインｖｉｓｉｔは同日でもよい）、そして３回のフォローアップｖｉｓｉｔ（８週目、１６週目、２４週目）を行った。０日目の２８日前から０日目にかけて被験者をスクリーニングして、試験への適格性を判断した。ベースラインｖｉｓｉｔの翌日から１６８日間（２４週間）連続して被験物質を摂取した。１６８日間（２４週間）連続して、被験者は１日１本、午前中（食後）に摂取した。摂取コンプライアンスを日誌カードに記録した。
膝痛における視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）は、摂取後０日目、７日目、及び１４日目にスコア化した。
骨量評価はベースライン時（第０日）と第２４週目のみに行った。
試験期間中、被験者はトレーニングスケジュールに従って、自宅で週２回、１回３０分のレジスタンストレーニング（強制ではない）を行うことが推奨された。トレーニングは日誌カードに記録し、ｖｉｓｉｔ前１週間の食事内容を食事アンケートにより記録した。
本試験では、最初にスクリーニングｖｉｓｉｔ（ベースラインｖｉｓｉｔの２８日前）を行い、その後、ベースラインｖｉｓｉｔ（ベースラインｖｉｓｉｔは０日目であるが、スクリーニングｖｉｓｉｔとベースラインｖｉｓｉｔは同日でもよい）、そして３回のフォローアップｖｉｓｉｔ（８週目、１６週目、２４週目）を行った。０日目の２８日前から０日目にかけて被験者をスクリーニングして、試験への適格性を判断した。ベースラインｖｉｓｉｔの翌日から１６８日間（２４週間）連続して被験物質を摂取した。１６８日間（２４週間）連続して、被験者は１日１本、午前中（食後）に摂取した。摂取コンプライアンスを日誌カードに記録した。
膝痛における視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）は、摂取後０日目、７日目、及び１４日目にスコア化した。
骨量評価はベースライン時（第０日）と第２４週目のみに行った。
試験期間中、被験者はトレーニングスケジュールに従って、自宅で週２回、１回３０分のレジスタンストレーニング（強制ではない）を行うことが推奨された。トレーニングは日誌カードに記録し、ｖｉｓｉｔ前１週間の食事内容を食事アンケートにより記録した。
【0112】
（処理コンプライアンス）
試験製品の摂取に関するコンプライアンスは、未使用薬の回収と被験者による毎日の摂取記録によって確認した。コンプライアンスは、ｖｉｓｉｔ間の日数に対して、割り付けられた用量のうち実際に摂取した用量の割合によって定義した。摂取率が７０％であれば、準拠していると見なした。
試験製品の摂取に関するコンプライアンスは、未使用薬の回収と被験者による毎日の摂取記録によって確認した。コンプライアンスは、ｖｉｓｉｔ間の日数に対して、割り付けられた用量のうち実際に摂取した用量の割合によって定義した。摂取率が７０％であれば、準拠していると見なした。
【0113】
（運動プログラム）
ベースラインｖｉｓｉｔ時に配布されたトレーニングマニュアルに従って、全被験者に週２回、各３０分間の自宅でのレジスタンストレーニングを奨励した。トレーニングプログラムのコンプライアンスを日誌カードに記録し、以下の式で算出した。
ベースラインｖｉｓｉｔ時に配布されたトレーニングマニュアルに従って、全被験者に週２回、各３０分間の自宅でのレジスタンストレーニングを奨励した。トレーニングプログラムのコンプライアンスを日誌カードに記録し、以下の式で算出した。
【0114】
【数1】
【0115】
コンプライアンス率が≧５０％であれば、準拠していると見なした。
【0116】
（膝痛における視覚的アナログスケール（ＶＡＳ））
視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）は、０～１００ｍｍでスコア化した。０は無痛を示し、１００はこれまでで最大の痛みを示す。摂取後０日目、７日目、及び１４日目において、対象者は、感じた痛みの程度を特定するよう求められた。痛みの程度は、スケールで直線を引き、実線に沿った位置を示すことで表した。
視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）は、０～１００ｍｍでスコア化した。０は無痛を示し、１００はこれまでで最大の痛みを示す。摂取後０日目、７日目、及び１４日目において、対象者は、感じた痛みの程度を特定するよう求められた。痛みの程度は、スケールで直線を引き、実線に沿った位置を示すことで表した。
【0117】
（骨量評価）
ベースライン時（０日目）と２４週目に二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）を実施し、左股関節の骨量（ＢＭ）を評価した。
ベースライン時（０日目）と２４週目に二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）を実施し、左股関節の骨量（ＢＭ）を評価した。
【0118】
（忍容性と安全性）
試験期間中、自発的に報告された有害事象を記録した。バイタルサインをｖｉｓｉｔ毎に確認した。治験薬の安全性を評価するため、試験期間中のｖｉｓｉｔ毎に、全参加者の血清及び尿を測定した。
試験期間中、自発的に報告された有害事象を記録した。バイタルサインをｖｉｓｉｔ毎に確認した。治験薬の安全性を評価するため、試験期間中のｖｉｓｉｔ毎に、全参加者の血清及び尿を測定した。
【0119】
（統計分析）
先験的な統計解析計画に従って、ｐｅｒ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ統計解析を行った。摂取コンプライアンス率≧７０％のランダム化された被験者をｐｅｒ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ解析の対象とした。安全性パラメータの解析は、試験製品を２８本以上摂取した被験者を対象に実施した。二分変数はパーセンテージで報告し、連続変数は平均値とＳＤで報告した。カテゴリー変数の比較にはカイ二乗検定を使用し、連続変数の群間差の比較にはクラスカル・ウォリス検定を使用した。
連続的な主要及び副次評価項目に関し、試験群間の変化の平均差の検定で使用する混合効果モデルを用いて、ｖｉｓｉｔ毎の摂取の相互作用を固定効果因子として反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。結果は全て、対応するｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意であると見なした。ｖｉｓｉｔ毎の摂取の相互作用項が有意であった場合、処理群間の事後ペアワイズ比較を行い、調整後のｐ値を報告した。評価項目に影響を及ぼすと予想される変数は、因子としてモデルに含めた。関節の健康に関する分析では性別とｖｉｓｉｔ毎の性別の相互作用項を因子として含めた。骨の健康に関する分析では性別とレジスタンストレーニングのコンプライアンスとそれぞれの相互作用項を因子として含めた。
更に、レジスタンストレーニングの実施回数が全トレーニング期間の１０パーセンタイル未満の被験者については、サブグループ解析を行った。分析は、独立した統計学者によって、ＳＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ９．４（米国ノースカロライナ州ケーリー）を使用して行われた。
先験的な統計解析計画に従って、ｐｅｒ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ統計解析を行った。摂取コンプライアンス率≧７０％のランダム化された被験者をｐｅｒ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ解析の対象とした。安全性パラメータの解析は、試験製品を２８本以上摂取した被験者を対象に実施した。二分変数はパーセンテージで報告し、連続変数は平均値とＳＤで報告した。カテゴリー変数の比較にはカイ二乗検定を使用し、連続変数の群間差の比較にはクラスカル・ウォリス検定を使用した。
連続的な主要及び副次評価項目に関し、試験群間の変化の平均差の検定で使用する混合効果モデルを用いて、ｖｉｓｉｔ毎の摂取の相互作用を固定効果因子として反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。結果は全て、対応するｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意であると見なした。ｖｉｓｉｔ毎の摂取の相互作用項が有意であった場合、処理群間の事後ペアワイズ比較を行い、調整後のｐ値を報告した。評価項目に影響を及ぼすと予想される変数は、因子としてモデルに含めた。関節の健康に関する分析では性別とｖｉｓｉｔ毎の性別の相互作用項を因子として含めた。骨の健康に関する分析では性別とレジスタンストレーニングのコンプライアンスとそれぞれの相互作用項を因子として含めた。
更に、レジスタンストレーニングの実施回数が全トレーニング期間の１０パーセンタイル未満の被験者については、サブグループ解析を行った。分析は、独立した統計学者によって、ＳＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ９．４（米国ノースカロライナ州ケーリー）を使用して行われた。
【0120】
＜結果＞
（ベースライン特性と処理コンプライアンス）
合計１６０名の被験者が登録され、１５１名の被験者が試験を完了し、統計解析の対象となった（ＰＰ）。９名の被験者が途中で脱落したが、群間において脱落者数に有意差はなかった。なお、脱落者は試験製品又はプラセボの摂取による副作用とは無関係であった。有害事象は認められなかった。血清生化学マーカーと尿検査で臨床的に有意な変化は認められなかった。
全体的に、４つの全ての群間で、コンプライアンス率における統計的な差はなかった（表４）。データの均一性を評価するために、全てのパラメータを４つのアーム間で比較した。ベースライン時の試験群間に統計的に有意な差はなかった（表４）。
（ベースライン特性と処理コンプライアンス）
合計１６０名の被験者が登録され、１５１名の被験者が試験を完了し、統計解析の対象となった（ＰＰ）。９名の被験者が途中で脱落したが、群間において脱落者数に有意差はなかった。なお、脱落者は試験製品又はプラセボの摂取による副作用とは無関係であった。有害事象は認められなかった。血清生化学マーカーと尿検査で臨床的に有意な変化は認められなかった。
全体的に、４つの全ての群間で、コンプライアンス率における統計的な差はなかった（表４）。データの均一性を評価するために、全てのパラメータを４つのアーム間で比較した。ベースライン時の試験群間に統計的に有意な差はなかった（表４）。
【0121】
【表4】
【0122】
（ＶＡＳ膝痛スコアにおける変化）
１４日間摂取した後、ＨＣＩＩ群とプラセボ群のペアワイズ比較では、ＶＡＳ疼痛スコアで測定したところ、ＨＣＩＩ群はプラセボ群より疼痛が少ない（ｐ＝０．０２１）という統計的有意差が認められた。０日目の疼痛スコアと比較すると、ＨＣＩＩ群ではベースラインから７日目で－１１．１％、１４日目で－２５％であった（図１２（ａ）、表５）。実際、プラセボ群では１４日間で痛みが増加する傾向が見られ、０日目からの疼痛スコアは７日目に３３．３％、１４日目に１３．３％増加した。
更に、レジスタンストレーニングの実施回数が全期間のうち１０パーセンタイル未満であった被験者のサブグループ解析では、プラセボ群はＨＣＩＩ群に比べ、１４日目にベースラインから２００％、０日目から８．７％と大幅に疼痛スコアが増加した（図１２（ｂ）、表６）。
表５及び表６において、「Ｐ値（＄）」は群間のｐ値、「（ａ）」「（ｋ）」はｐ値の決定に用いた方法（（ａ）＝１元配置分散分析、（ｋ）＝クラスカル・ウォリス検定）、「＊」は統計的有意性、「９５％Ｃ．Ｉ．」は９５％信頼区間を意味する。
後述の図１２（ａ）、図１２（ｂ）及び図１３において、各データの括弧内の２つの数値は、「平均－標準偏差」「平均＋標準偏差」である。
１４日間摂取した後、ＨＣＩＩ群とプラセボ群のペアワイズ比較では、ＶＡＳ疼痛スコアで測定したところ、ＨＣＩＩ群はプラセボ群より疼痛が少ない（ｐ＝０．０２１）という統計的有意差が認められた。０日目の疼痛スコアと比較すると、ＨＣＩＩ群ではベースラインから７日目で－１１．１％、１４日目で－２５％であった（図１２（ａ）、表５）。実際、プラセボ群では１４日間で痛みが増加する傾向が見られ、０日目からの疼痛スコアは７日目に３３．３％、１４日目に１３．３％増加した。
更に、レジスタンストレーニングの実施回数が全期間のうち１０パーセンタイル未満であった被験者のサブグループ解析では、プラセボ群はＨＣＩＩ群に比べ、１４日目にベースラインから２００％、０日目から８．７％と大幅に疼痛スコアが増加した（図１２（ｂ）、表６）。
表５及び表６において、「Ｐ値（＄）」は群間のｐ値、「（ａ）」「（ｋ）」はｐ値の決定に用いた方法（（ａ）＝１元配置分散分析、（ｋ）＝クラスカル・ウォリス検定）、「＊」は統計的有意性、「９５％Ｃ．Ｉ．」は９５％信頼区間を意味する。
後述の図１２（ａ）、図１２（ｂ）及び図１３において、各データの括弧内の２つの数値は、「平均－標準偏差」「平均＋標準偏差」である。
【0123】
【表5】
【0124】
【表6】
【0125】
（骨量の変化）
２４週間の摂取後、いずれの２群間においても骨量の変化に有意差はなかった。しかし、レジスタンストレーニングの実施回数が全期間のうち１０パーセンタイル以下であった被験者のサブグループ解析では、２４週目（摂取期間：ｐ＝０．００９）において、ＨＣＩＩ＋ＣＥ併用摂取群はプラセボ摂取群と比較して、０日目から左股関節の骨量が７．４％と大幅に増加した（ｐ＝０．０１）（図１３、表７参照）。
表７において、「Ｐ値（＄）」は群間のｐ値、「（ａ）」はｐ値の決定方法（（ａ）＝１元配置分散分析）、「＊」は統計的有意性、「９５％Ｃ．Ｉ．」は９５％信頼区間を意味する。
２４週間の摂取後、いずれの２群間においても骨量の変化に有意差はなかった。しかし、レジスタンストレーニングの実施回数が全期間のうち１０パーセンタイル以下であった被験者のサブグループ解析では、２４週目（摂取期間：ｐ＝０．００９）において、ＨＣＩＩ＋ＣＥ併用摂取群はプラセボ摂取群と比較して、０日目から左股関節の骨量が７．４％と大幅に増加した（ｐ＝０．０１）（図１３、表７参照）。
表７において、「Ｐ値（＄）」は群間のｐ値、「（ａ）」はｐ値の決定方法（（ａ）＝１元配置分散分析）、「＊」は統計的有意性、「９５％Ｃ．Ｉ．」は９５％信頼区間を意味する。
【0126】
【表7】
【0127】
（結論）
以上より、ＨＣＩＩは変形性関節症の疼痛に悩む患者に対して、忍容性が高く、迅速かつ有意な症状緩和をもたらすことがわかった。ＨＣＩＩ２ｇの摂取により、プラセボと比較して、わずか１４日間で膝関節痛が大幅に減少した。一方、ＨＣＩＩとＣＥの組み合わせは、最小限のレジスタンストレーニングを行った被験者において、左股関節の骨量を大幅に増加させた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、その作用機序は、基礎疾患の経過の改善、特に骨吸収の抑制と局所的な疼痛感覚をもたらす炎症の抑制であることが示唆される。ＨＣＩＩ及びＨＣＩＩとＣＥの組み合わせは、ＯＡ症状の管理において、現在の医学的及び食事療法の選択肢を、安全かつ有効に補完し得ると考えられる。
以上より、ＨＣＩＩは変形性関節症の疼痛に悩む患者に対して、忍容性が高く、迅速かつ有意な症状緩和をもたらすことがわかった。ＨＣＩＩ２ｇの摂取により、プラセボと比較して、わずか１４日間で膝関節痛が大幅に減少した。一方、ＨＣＩＩとＣＥの組み合わせは、最小限のレジスタンストレーニングを行った被験者において、左股関節の骨量を大幅に増加させた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、その作用機序は、基礎疾患の経過の改善、特に骨吸収の抑制と局所的な疼痛感覚をもたらす炎症の抑制であることが示唆される。ＨＣＩＩ及びＨＣＩＩとＣＥの組み合わせは、ＯＡ症状の管理において、現在の医学的及び食事療法の選択肢を、安全かつ有効に補完し得ると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【0128】
本発明は、ペプチド及び／又はその塩を含む新規な飲食品組成物を提供する。本発明の飲食品組成物は、炎症及び関節痛を抑制するために使用することができる。また、本発明の飲食品組成物は、骨吸収活性を抑制するために使用することができる。また、本発明は、チキンエキスを有効成分として含む新規な骨吸収抑制用組成物を提供する。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド及び／又はその塩並びにチキンエキスは、飲食品等として摂取可能であり、安全性が高いという利点も有する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】