特許 7590785 ヒト化抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-19

(45)【発行日】2024-11-27

(54)【発明の名称】ヒト化抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/24 20060101AFI20241120BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241120BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241120BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241120BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241120BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241120BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241120BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20241120BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 31/06 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 5/16 20060101ALI20241120BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241120BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241120BHJP

【ＦＩ】

C07K16/24

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K16/46

C12P21/08

A61P11/06

A61P17/00

A61P37/08

A61P19/02

A61P17/02

A61P11/00

A61P7/06

A61P37/06

A61P1/04

A61P27/02

A61P31/06

A61P13/12

A61P9/00

A61P29/00

A61P5/16

A61K47/68

A61K39/395 Y

A61K39/395 D

A61K39/395 U

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2022580486

(86)(22)【出願日】2021-02-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-26

(86)【国際出願番号】 CN2021077649

(87)【国際公開番号】W WO2022121118

(87)【国際公開日】2022-06-16

【審査請求日】2022-12-26

(31)【優先権主張番号】202011445635.4

(32)【優先日】2020-12-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522500387

【氏名又は名称】南京融捷康生物科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＣＯＲＥ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ０７， １６ Ｔｒｅｅ－Ｈｏｕｓｅ， Ｔａｎｍｉ Ｒｄ．， Ｊｉａｎｇｂｅｉ Ｎｅｗ Ａｒｅａ Ｎａｎｊｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１００００， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002871

【氏名又は名称】弁理士法人坂本国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】蘇 志鵬

(72)【発明者】

【氏名】張 雲

(72)【発明者】

【氏名】孟 巾果

(72)【発明者】

【氏名】王 樂飛

(72)【発明者】

【氏名】姚 堯

【審査官】千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１１１６９００６６（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５３５０９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５２５７４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５３３７１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／１５８７２８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の組み合わせの１つを含むヒト化抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体：
ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ１、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ２、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ３、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ４；
ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ１、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ２、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ３、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ４；
ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ２、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ３、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ４；
ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ１、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ２、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ３、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ４；
ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ１、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ２、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ３、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ４；又は
ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ１、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ２、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ３、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＦＲ４。

【請求項2】

ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号３に示され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１２に示され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１８に示され、ＦＲ１のアミノ酸配列は配列番号２に示され、ＦＲ２のアミノ酸配列は配列番号１１に示され、ＦＲ３のアミノ酸配列は配列番号１５に示され、ＦＲ４のアミノ酸配列は配列番号２１に示されることを特徴とする、請求項１に記載のヒト化抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体を含むことを特徴とする、融合タンパク質。

【請求項4】

請求項１又は２に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体を含むことを特徴とする、二重特異性抗体。

【請求項5】

抗ＩＬ－５単一ドメイン抗体を更に含む、請求項４に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

前記二重特異性抗体が配列番号２４で示される、請求項５に記載の二重特異性抗体。

【請求項7】

請求項４～６のいずれかに記載の二重特異性抗体をコードし、配列番号２３で示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子。

【請求項8】

請求項１又は２に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体、請求項３に記載の融合タンパク質、又は請求項４～６のいずれかに記載の二重特異性抗体の、疾患を治療するためのＩＬ－４Ｒαを標的とする薬物の調製における使用。

【請求項9】

前記疾患は喘息、アレルギー性皮膚炎、湿疹、関節炎、疱疹、慢性特発性蕁麻疹、硬皮症、肥厚性瘢痕、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、特発性肺線維症、川崎病、鎌状赤血球症、グレーブス病、シェーグレン症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ぶどう膜炎、結核、及び腎疾患から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の使用。

【請求項10】

請求項１又は２に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体、請求項３に記載の融合タンパク質、又は請求項４～６のいずれかに記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含むことを特徴とする、疾患を治療するための薬物。

【請求項11】

請求項１又は２に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体をコードすることを特徴とする、単離された核酸分子。

【請求項12】

請求項１１に記載の核酸分子を含むベクター又は組換え細胞。

【請求項13】

組換え細胞を培養し、培養産物から前記単一ドメイン抗体を単離精製して得るステップを含み、前記組換え細胞は請求項１１に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクターを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体を調製する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体の技術分野に関し、特に、ヒト化抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

人体の２型炎症反応は２型ヘルパーＴ細胞（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ２，ＴＨ２）によって起こされる。このような２型炎症反応は統一的な特徴を持つため、アレルギー性疾患と呼ばれ、例えば、喘息やその他の様々な炎症性疾患がある。従来の炎症抑制方法では、一般に、疾患の苦痛を抑えるために広スペクトルの免疫抑制剤を使用するか、又はＴＨ２細胞の下流産物、例えばＩｇＥを特異的に標的とする標的薬を使用して疾患を治療していた。従来の治療方法に比べて、ＴＨ２細胞から分泌される２型サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３）を標的とする治療方法は、既に様々な免疫性疾患の治療において大きな潜在力を示し、患者はより良い治療効果が得られる。喘息患者におけるＩＬ－４、ＩＬ－５又はＩＬ－１３を標的とした治療方法では期待外れの臨床結果がいくつか出た後、研究者は個人化された方法を用い、その結果、「アレルギー」表現型を示す喘息の亜型において治療効果を得ていた。最近、治療効果はより広範な喘息患者にも広がっている。このことから、シグナル伝達経路における重要な上流ドライバーが適切に阻害されたならば、２型炎症は重症喘息患者に密接に関連していることが分かる。また、ＩＬ－４及びＩＬ－１３を同時に抑制することは、通常喘息と併発する疾患、例えばアトピー性皮膚炎及び鼻ポリープ等の慢性副鼻腔炎において治療効果を示しており、重要な「ドライバー経路」を標的とすることは多くのアレルギー性疾患において治療効果が得られるという仮説が支持されている。

【0003】

アレルギー性疾患は世界的に蔓延してきており、疫学的研究により、食物アレルギー、鼻結膜炎、アトピー性皮膚炎及び喘息の罹患率は上昇してきている。アレルギーは、遺伝的要因と環境要因の複雑な相互作用によって発生する無害な抗原（アレルゲン）に対する全身性の２型炎症反応である。該反応は最終的に免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の産生と様々な炎症性免疫反応の増加につながる。重症度は軽度の危害から生命を脅かす危険性のあるものまで、患者によって異なることがあり、単一又は複数の臓器系及び組織が関係している。アレルギー性疾患は、その独特の臓器・組織症状によって全く異なるように見えることがあり、通常は異なる医学専門分野の臨床医により治療を行っている。しかし、多くアレルギー性疾患が同時に又は進行的に発症する（即ち「トピー性行進」）傾向から、これらの疾患には共通の潜在的なドライバーを持つ可能性が示唆されている。これらの考えに沿って、２型ヘルパーＴ細胞媒介性の２型炎症反応は喘息とアトピー性皮膚炎（肺と皮膚でそれぞれ異なる組織特異的な表現を示している流行性の高い２つの慢性疾患）の両方においても重要であることが以前から知られていた。

【0004】

２型経路モジュレーターを用いた初期の臨床研究はやや期待外れであったが、アレルギー性喘息患者の臨床データ（バイオマーカーによって同定される）から、インターロイキン５（ＩＬ－５）及び共受容体を有する姉妹サイトカインＩＬ－４とＩＬ－１３（図１）という３つの特定の２型サイトカインの重要な役割が裏付けられた。ＩＬ－５特異的ヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）メポリズマブ（グラクソ・スミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）社開発）を用いた治療は、喘息及び鼻ポリープを伴う慢性副鼻腔炎（ＣＳｗＮＰ）患者の一部に有効性を示した。また、完全ヒト化ＩＬ－４受容体サブユニットα（ＩＬ－４Ｒα）阻害抗体（ｄｕｐｉｌｕｍａｂ，Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ｓａｎｏｆｉ社開発）を用いてＩＬ－４及びＩＬ－１３のシグナル伝達を同時に阻害することは、アトピー性皮膚炎、ＣＳｗＮＰ及び喘息という３つのアレルギー性疾患において治療効果が確認された。これらの最新の臨床データにより、重要な中心である「ドライバー」を標的とすることは、様々な臓器特異的臨床所見を特徴とするアレルギー性疾患に対する実質的な治療効果が期待できるという興味深い可能性が示唆されている。今こそ、アレルギー性疾患を定義・分類し、一般的な免疫経路に応じて治療方法を調整すべき時期が来ている。

【0005】

２型炎症が支配的になることはアレルギー性疾患の重要なドライバーである。抗原の型と環境要因及び潜在的な遺伝要因が相まって、様々なサイトカインの放出に影響を与えることにより、固有の免疫細胞及びリンパ系細胞は２型炎症プロセスを誘発又は広めることになる。環境刺激のあるバリア界面では、例えばＩＬ－２５、ＩＬ－３３及び胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）のような上皮由来のサイトカインは２型免疫反応を開始したり、又は既存の２型炎症を増幅したりすることができる。これらの上流メディエーターは自然細胞による２型サイトカインの産生を刺激するとともに、ＣＤ４＋ＴＨ２細胞へのナイーブＴ細胞の分極にも寄与する。ＴＨリンパ球サブセットは、特定のサイトカインに関連する免疫応答及び各サブセットに固有の炎症メディエーターによって分類され、例えば、ＴＨ１細胞はインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）を産生し、ＴＨ２細胞はＩＬ－４、ＩＬ－５及びＩＬ－１３を産生し、ＴＨ９細胞はＩＬ－９を産生し、ＴＨ１７細胞はＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２１及びＩＬ２２を産生し、ＴＨ２２細胞はＩＬ－２２を産生し、調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）はＩＬ－１０を産生することができる。その他の作用では、ＴＨ２細胞がＢ細胞の増殖を誘導して次に抗体型切り替えの段階を経ることにより、循環ＩｇＥは高レベルになる。したがって、ＩｇＥはＴＨ２細胞活性化の重要な下流バイオマーカーである。ＩｇＥは好塩基球及び肥満細胞に見られる高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）に結合し、これらの細胞におけるＩｇＥの架橋は細胞の活性化及び様々な炎症メディエーターの脱顆粒につながる。これらの炎症性メディエーターにはヒスタミン、プロスタグランジン及びその他の炎症誘発性サイトカイン（例えばＩＬ－４、ＩＬ－５及びＩＬ－１３）が含まれるため、２型反応が増幅される。下気道では、このような２型炎症性環境は、好酸球の増加、粘液の産生及び平滑筋の収縮を起こす。これらのプロセスは寄生虫感染を排除するための重要な防御的免疫機能であるが、無害な抗原又はアレルゲンに対して病理学的役割を有するため、アレルギーを起こす。

【0006】

従来から定義されたアレルギー性疾患（喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎及び結膜炎を含む）に加え、様々な原因不明の疾患にも２型の臨床的特徴（最も顕著なのは好酸球増加症及び／又は高血清ＩｇＥレベル）が見られ、このような疾患としては、慢性特発性蕁麻疹、ＣＳｗＮＰ及び好酸球性食道炎が含まれる。

【0007】

一部のアレルギー性疾患（例えばアレルギー性鼻炎）には抗ヒスタミン薬と特異的免疫療法の併用がよく効くのに対し、より重度のアレルギー性疾患（例えばアトピー性皮膚炎及び喘息）には非特異的免疫抑制が主な治療手段であるが、どちらでも、異常な炎症反応が進行して疾患症状が伝播する。広範囲に作用する免疫抑制剤を全身的に使用して（例えばコルチコステロイド、シクロスポリンＡ、メトトレキセート、アザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチルを経口もしくは静脈注射によって投与する）炎症を軽減することは、重症の症状を緩和するのに有効である。これらの薬剤の免疫抑制活性は転写因子等の下流メディエーターを標的とすることで生じる。例えば、コルチコステロイドはグルココルチコイド受容体に結合し、炎症を推進する核因子－κＢ（ＮＦ－κＢ）等の重要な転写因子の発現を抑制する。シクロスポリンＡはカルシニューリン阻害剤であり、Ｔ細胞の活性化と増殖に必要なＩＬ－２の産生を防止することができる（活性化Ｔ細胞の転写因子核因子（ＮＦＡＴ）による）。但し、シクロスポリンＡとコルチコステロイドの広範な作用機序により、全身的な免疫抑制療法は多面発現効果をもたらすことがあるため、例えば、体液貯留、耐糖能異常、高血圧、筋力低下、胃腸耐性不良、潜在的な骨損失、視床下部－下垂体－副腎軸の抑制及び感染に対する感受性の増加など、毒性を起こしている。局所投与（即ち吸入薬、局所的な点滴、鼻内噴霧又はクリーム）はこれらの免疫抑制剤の副作用を軽減することができるが、局所的な免疫抑制はこれらの疾患のより重症な形態を治療するのに不十分である。したがって、より特異的な治療方法の必要性はなお多大である。

【0008】

炎症を抑えるために暴力的な手段を用いても、どの免疫経路が病気を引き起こし、伝達しているのかについての知見は得られない。例えば、広範に作用する薬物シクロスポリンＡは乾癬とアトピー性皮膚炎の治療に有効である。一方、乾癬とアトピー性皮膚炎において、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を特異的に標的とすることの臨床効果が異なるため、この２つの皮膚疾患は異なる駆動経路を有することが分かる。ＴＮＦ阻害剤は乾癬の治療薬として承認されているが、アトピー性皮膚炎（２型炎症駆動疾患の１つ）における持続的な有効性はまだ証明されていない。

【0009】

オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ（Ｘｏｌａｉｒ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））は２型炎症の最終メディエーター及び肥満細胞と好塩基球脱顆粒の有効なトリガーＩｇＥを標的とすることで、アレルギー性疾患においてより特異的な免疫抑制を誘導する。このＩｇＥ特異的ヒト化モノクローナル抗体は喘息の規制承認を受けた初めてのモノクローナル抗体治療法であるが、アトピー性皮膚炎に対しては効果がない。オマリズマブは遊離血清ＩｇＥのレベルを低下させ、そして上記新規の抗炎症メカニズムによって、増悪を軽減できる効果を示したが、１秒間の強制呼気量（ＦＥＶ１）、即ち、肺機能の測定における強制呼気量はほとんど改善されていない。オマリズマブは合併症ＣＳｗＮＰの症状も改善でき、抗ヒスタミン薬に抵抗性の慢性特発性蕁麻疹の治療薬としても承認されている。ピボタル試験では、オマリズマブは掻痒及び疾患活動エンドポイントの面に有意な改善を示した。一方、アトピー性皮膚炎では、血清遊離ＩｇＥレベルの低下は良好な臨床応答を得るのに不十分である。オマリズマブで中度アトピー性皮膚炎患者を１６週間治療した結果、疾患エンドポイント（湿疹面積、重症度指数（ＥＡＳＩ）、及び研究者による総合評価）は改善されなかった。また、治療を受けた患者の掻痒スコアはプラセボ群に比べて若干悪化している。これらの結果から、２型炎症駆動の疾患においても、疾患調節因子は一律でＴＨ２経路の最終産物ＩｇＥとなるわけではないことが分かる。

【0010】

様々なアレルギー性疾患において最適な治療効果を得るためには、下流メディエーターではなく、２型炎症経路の重要な上流ドライバーを標的とすることが必要となり得る。この目的のために、３つの重要な２型サイトカインであるＩＬ－４、ＩＬ－５及びＩＬ－１３はアレルギー性炎症疾患の共通結節の候補として有望である。

【0011】

ＩＬ－４はＴＨ２型反応を駆動する重要な分化因子である。ＩＬ－４はＴＨ２サブセットへのＴ細胞の分化を引き起こし、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＴＡＲＣ及び好酸球ケモカイン等の２型関連サイトカイン及びケモカインの産生を誘導する。Ｂ細胞では、ＩＬ－４はＩｇＥへのアイソタイプ切り替えを誘導する。インビトロで、ＩＬ－４は２型ヘルパーＴ細胞へのＴＨナイーブＴ細胞の分化を促進する。インビボで、ＩＬ－４の欠乏により、寄生虫感染に対する２型サイトカインの産生が阻害される。一方、ＩＬ－４はＩＦＮγ産生、マクロファージ細胞の活性化に関連するＴＨ１型応答を負に調節し、それによって、２型応答に対する免疫学的極性化が維持される。

【0012】

ＩＬ－４とＩＬ－１３は２型免疫の有効なメディエーターであり、それらの受容体発現パターンに関連する機能は重複しつつ異なっている。ＩＬ－４とＩＬ－１３のアミノ酸相同性は２５％しかないが、これらのサイトカインは共通の受容体部分ＩＬ－４Ｒαを共有し、該受容体は独特の補助鎖に結合してシグナル伝達を誘導する。ＩＬ－４Ｒαは造血細胞及び非造血細胞のいずれにも発現しているが、異なる細胞種における補助鎖の発現の差異から、それらの機能的差異が明らかになっている（図１）。１型受容体はＩＬ－４Ｒαと共通のγ鎖からなり、後者は造血細胞のみに存在する。２型受容体複合体はＩＬ－４ＲαとＩＬ－１３Ｒα１からなり、後者は、例えば、ケラチノサイト、毛包、表皮皮脂腺と汗腺、鼻及び気管支上皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞等の多くの非造血細胞に存在する。ＩＬ－４は１型及び２型受容体複合体を介してシグナル伝達するが、ＩＬ－１３は２型受容体複合体のみを介してシグナル伝達する。これは、ＩＬ－１３がそれ自身の主要な結合鎖（ＩＬ－１３Ｒα１）に結合するのに対して、ＩＬ－４が主にＩＬ－４Ｒαに結合するためである。

【0013】

なお、２つのサイトカインは異なる効力とシグナル伝達動態を有する。ＩＬ－４とＩＬ－４Ｒαの高結合はγ鎖又はＩＬ－１３Ｒα１の結合の親和性（ＫＤ）に依存しないが、ＩＬ－４Ｒαの存在はＩＬ－１３とＩＬ－１３Ｒα１の結合の親和性を高める（ＫＤは１０ｍＭから３０ｐＭになる）。また、ＩＬ－４の２型受容体は活性化された細胞内シグナル伝達に関与する時間経過がＩＬ－１３よりも速い。寄生虫感染とアレルギーのマウスモデルにおいて、サイトカインノックアウトと過剰発現の表現型によってＩＬ－４とＩＬ－１３の生理学的差異を分析したが、これらの表現型を慎重に検査すると、ＩＬ－４はＴＨ２細胞分化、Ｂ細胞成長、アイソタイプクラス切り替え（特にＩｇＥ）の開始及び好酸球動員の中心となる媒介であるという仮説が支持されている。ＩＬ－１３はこれらの炎症誘発プロセスにおいてある程度の重複性を有するが、ＩＬ－１３は杯細胞過形成及び平滑筋収縮の媒介において他の役割も有し、それは２型受容体複合体の独特の発現パターン及び局所的なサイトカイン産生に関連している可能性がある。

【0014】

ＩＬ－４とＩＬ－１３のどちらもＢ細胞に対する活性によってＩｇＥ産生を媒介する。マウスのＩＬ－４又はＩＬ－１３をノックアウトすると、アレルゲンチャレンジに対するＩｇＥ産生に重大な欠陥が生じる。ＩＬ－４はアイソタイプ切り替えとＢ細胞成長を開始・促進できるが、ＩＬ－１３も活性化ヒトＢ細胞に結合できる証拠があり、これによりＩＬ－１３がＩｇＥ産生の持続に寄与することが示唆されるとともに、遺伝子ノックアウトマウスで観察された表現型は解釈されている。

【0015】

ＩＬ－４、ＩＬ－５及びＩＬ－１３は２型炎症組織及び血液好酸球の増加を促進できる。ＩＬ－５は効果的な好酸球サイトカインであり、骨髄の成長と分化、生存と動員、及び骨髄から血液への移行に関与している。ＩＬ－５はサイトカイン特異的サブユニット受容体ＩＬ－５Ｒαに結合し、後者は共有のシグナルサブユニットβ鎖と複合体を形成する。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＳＣＦ）とＩＬ－３もβ鎖シグナル伝達を必要とする。ＩＬ－５Ｒαは好酸球及び好酸球前駆細胞に高度に発現し、好塩基球にも存在する。ＩＬ－５がない場合（遺伝子ノックアウトの場合又はＩＬ－５特異的抗体による治療後）、アレルゲンチャレンジに対する血液及び組織の好酸球応答は抑止される。

【0016】

２型上流サイトカインの産生は、上皮由来サイトカインＩＬ－２５、ＩＬ－３３及びＴＳＬＰによって発現を促進することができ、組織損傷やアレルゲン曝露後にバリア界面で放出することがある。これらの上皮由来サイトカインの様々な自然細胞種（例えば、２型自然リンパ系細胞と肥満細胞）に対する活性は、ＩＬ－４、ＩＬ－５及びＩＬ－１３の産生を誘導することができ、ＴＨ２型応答を促進することもできる。特に、ＩＬ－３３は「ａｌａｒｍｉｎ」（細胞又は組織損傷のシグナル）として機能すると、ナイーブＴ細胞をＴＨ２細胞に分極させ、既存の２型反応を増幅することができる。ＩＬ－３３はまた、ＩＬ－２５とともに自然リンパ系細胞における高レベルの２型サイトカイン、特にＩＬ－５とＩＬ－１３の産生を誘導する。ＴＳＬＰは、好塩基球、単核球及びナチュラルキラーＴ細胞におけるサイトカインの産生を促進し、また樹枝状細胞を活性化してＴＨ２細胞をプライミング及び活性化する。

【0017】

以上より、ＩＬ－４、ＩＬ－５及びＩＬ－１３は多面発現効果を有し、２型免疫反応を調整し、２型及びＴＨ２経路活性化マーカーを駆動する上で異なる役割、即ち、ＩｇＥ産生や好酸球増加の役割を果たしている。前臨床データから、喘息とアトピー性皮膚炎の両方とも２型炎症のこれらのメディエーターによって駆動されることを証明する強力な証拠が示されている。ＩＬ－４、ＩＬ－５及びＩＬ－１３の３種類の２型サイトカインを全て過剰発現させたトランスジェニックマウスは、高血清ＩｇＥレベル、皮膚及び肺への広範な細胞浸潤（好酸球とリンパ球を含む）、皮膚肥厚及び気道上皮肥大という誇張の２型反応を特徴とする喘息様の肺疾患とアトピー性皮膚炎様の皮膚疾患を自発的に発症した。さらなる研究により、ＩＬ－４とＩＬ－１３はそれぞれ独立に、類似した病態を引き起こすのに十分であることが示される。これらの前臨床データは、ＩＬ－４とＩＬ－１３が重要な近位疾患ドライバーであることを示唆している。

【0018】

また、ヒト化抗体は、主に非ヒトモノクローナル抗体を遺伝子クローニング及びＤＮＡ組換え技術で改変、再発現した抗体をいい、そのアミノ酸配列の大部分はヒト由来の配列に置き換えられ、親モノクローナル抗体の親和性と特異性が実質的に保持されるとともに、異種性が低減され、ヒトでの使用に有利である。しかし現在のところ、ＩＬ－４Ｒαを標的とするラクダ科単一ドメイン抗体のヒト化抗体は欠如している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0019】

本発明の目的はヒト化抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体及びその使用を提供することである。本発明で提供される抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体はヒト化によって改変されており、親和性及び腫瘍細胞増殖阻害効果が保持されるとともに、免疫副作用が効果的に低減される。

【課題を解決するための手段】

【0020】

本発明は下記のように実現される。

【0021】

一態様において、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む相補性決定領域とＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含むフレームワーク領域とを有するヒト化抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体を提供する。

【0022】

ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号３に示され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１２に示され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１８に示される。

【0023】

ＦＲ１のアミノ酸配列は配列番号２に示され、ＦＲ２のアミノ酸配列は配列番号４～１１のいずれかから選択され、ＦＲ３のアミノ酸は配列番号１３～１７のいずれかから選択され、ＦＲ４のアミノ酸配列は配列番号２０又は２１に示される。

【0024】

本発明の発明者は配列番号２２のラクダ由来抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体を基に、適切な位置で科学的且つ合理的にヒト化によって改変することで、親和性及び腫瘍細胞増殖阻害効果が保持され、免疫副作用が効果的に低減されたヒト化抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体を得た。

【0025】

上記各相補性決定領域と各フレームワークは、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序で連結されて本発明の単一ドメイン抗体の一次配列構造を形成する。

【0026】

代替的実施形態において、ＦＲ２のアミノ酸配列は配列番号１１に示され、ＦＲ３のアミノ酸配列は配列番号１５に示され、ＦＲ４のアミノ酸配列は配列番号２１に示される。

【0027】

他のヒト化単一ドメイン抗体に比べて、該実施形態の単一ドメイン抗体はより高い親和性とより低い免疫副作用を有し、より優れた技術的効果を示している。

【0028】

さらなる態様において、本発明は、上記に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体を含む、融合タンパク質を提供する。

【0029】

本発明で提供される単一ドメイン抗体は、異なる目的を達成するために他の任意のタンパク質又は物質と融合することができ、例えば、検出を容易にする目的で蛍光タンパク質、酵素又は放射性元素等に結合し、又は例えば、より良い治療の目的でＩＬ－４Ｒαの媒介に関連する疾患を治療する薬物分子と融合する。該単一ドメイン抗体と融合するタンパク質の種類は、実際のニーズ又は目的に応じて当業者により合理的に選択でき、得られた融合タンパク質は全て、単一ドメイン抗体と融合する物質の種類にかかわらず、本発明の保護範囲に属する。

【0030】

さらなる態様において、本発明は、上記に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体を含む二重特異性抗体を提供する。

【0031】

本発明で提供される単一ドメイン抗体の配列又はその構造に基づき、当業者であれば、それを他の特異性抗体と融合して２つ以上の抗原に特異的に結合可能な二重特異性抗体又は多重特異性抗体を得ることに容易に想到でき、これは当業者であれば容易に実現できることである。したがって、融合する抗体にかかわらず、上記のように得られた二重特異性抗体は全て本発明の保護範囲に属する。

【0032】

さらなる態様において、本発明は、上記に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体、上記に記載の融合タンパク質、又は上記に記載の二重特異性抗体の、疾患を治療するためのＩＬ－４Ｒαを標的とする薬物の調製における使用を提供する。

【0033】

本発明で提供される単一ドメイン抗体、融合タンパク質及び二重特異性抗体は、ＩＬ－４Ｒαを治療標的とするいかなる疾患にも適用可能であり、喘息、アレルギー性皮膚炎、湿疹、関節炎、疱疹、慢性特発性蕁麻疹、硬皮症、肥厚性瘢痕、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、特発性肺線維症、川崎病、鎌状赤血球症、グレーブス病、シェーグレン症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ぶどう膜炎、結核、及び腎疾患を含むが、これらに限定されない。

【0034】

さらなる態様において、本発明は、上記に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体、上記に記載の融合タンパク質、又は上記に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、疾患を治療するための薬物を提供する。

【0035】

上記薬学的に許容可能な賦形剤とは、例えば、希釈剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、吸収促進剤、界面活性剤、崩壊剤、吸着担体、潤滑剤等の薬学分野の薬学的賦形剤である。また、風味剤、甘味剤等の他の賦形剤を加えてもよい。つまり、前記賦形剤は希釈剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、吸収促進剤、界面活性剤、崩壊剤、吸着担体、潤滑剤、風味剤、甘味剤のうちの１種又は２種以上であり、当業者は必要に応じて合理的に選択することができる。

【0036】

さらなる態様において、本発明は、上記に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体をコードする単離された核酸分子を提供する。

【0037】

説明すべきことは、本発明の開示内容に基づき、当業者は本分野の一般的な技術により上記単一ドメイン抗体及び融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を容易に得ることができ、また、コードの縮重のため、該ポリ核酸分子は可変であり、その具体的な塩基配列は様々な可能性が存在し、よって、ポリ核酸分子の変化に関わらず、本発明の単一ドメイン抗体又は融合タンパク質をコードできれば、該核酸分子は本発明の保護範囲に属する点である。

【0038】

さらなる態様において、本発明は、上記に記載の核酸分子を含むベクター又は組換え細胞を提供する。

【0039】

さらなる態様において、本発明は、上記に記載の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体を調製する方法を提供し、該方法は、組換え細胞を培養し、培養産物から前記単一ドメイン抗体を単離精製して得るステップを含み、前記組換え細胞は上記に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む。

【0040】

説明すべきことは、本発明の単一ドメイン抗体、融合タンパク質及び抗体の調製は化学合成法によって実現されてもよいし、遺伝子工学技術又はその他の方法により実現されてもよい点である。本発明に記載の単一ドメイン抗体、融合タンパク質又は抗体は全て、その調製方法にかかわらず、本発明の保護範囲内にある。

【0041】

本発明の実施例の技術的解決手段をより明瞭に説明するために、以下において、実施例に用いられる図面について簡単に説明する。以下の図面はただ本発明の一部の実施例を示すため、範囲を限定するものと見なしてはならなく、当業者であれば、創造的な労力を要することなく、これらの図面に基づいて他の関連図面に想到し得ることを理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】ＩＬ４／ＩＬ－１３及びＩＬ－５シグナル伝達経路の模式図である。

【図2】ヒト化後の抗ＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体４Ｅ９のいくつかのクローンの配列の比較結果である。

【図3】異なるヒト化４Ｅ９抗体クローンがＩＬ－４により誘導されるＴＦ－１増殖を中和する実験結果である。

【図4】好ましいヒト化４Ｅ９抗体クローンがＩＬ－１３により誘導されるＴＦ－１増殖を中和する実験結果である。

【図5】ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－５二重特異性抗体４Ｅ９Ｖ１０－２Ｂ３Ｖ２がＩＬ－４ＲαとＩＬ－４の結合を阻害する実験結果（ＥＬＩＳＡ）である。

【図6】ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－５二重特異性抗体４Ｅ９Ｖ１０－２Ｂ３Ｖ２がＩＬ－５ＲとＩＬ－５の結合を阻害する実験結果（ＥＬＩＳＡ）である。

【図7】ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－５二重特異性抗体４Ｅ９Ｖ１０－２Ｂ３Ｖ２がＩＬ－４により誘導されるＴＦ－１増殖を中和する実験結果である。

【図8】ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－５二重特異性抗体４Ｅ９Ｖ１０－２Ｂ３Ｖ２がＩＬ－１３により誘導されるＴＦ－１増殖を中和する実験結果である。

【図9】ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－５二重特異性抗体４Ｅ９Ｖ１０－２Ｂ３Ｖ２がＩＬ－５により誘導されるＴＦ－１増殖を中和する実験結果である。

【発明を実施するための形態】

【0043】

本発明の実施例の目的、技術的解決手段及び利点をより明確にするために、以下に本発明の実施例における技術的解決手段を明確に、完全に説明する。実施例に具体的な条件が明記されていない場合、通常の条件又はメーカーが推奨する条件に従って実行する。製造者の記載がない試薬又は装置は全て、市販で入手できる一般的な製品である。

【実施例】

【0044】

以下において、本発明の特徴及び性能を実施例によりさらに詳しく説明する。
［実施例１］ヒト化による改変
配列番号２２の抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体４Ｅ９（４Ｅ９－Ｖ０と名づける）を基にヒト化による改変を行った。

【0045】

ヒト化して改変されたヒト化単一ドメイン抗体（それぞれ４Ｅ９ Ｖ１～Ｖ１４と名づける）の配列を表１に示し、部分ヒト化抗体配列の比較結果を図２に示す。

【0046】

【表1】

【0047】

［実施例２］ＩＬ－４又はＩＬ－１３により誘導されるＴＦ１細胞増殖のヒト化単一ドメイン抗体による中和の測定
（１）回復後に３～４代継代したＴＦ－１細胞を１００００個／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。

【0048】

（２）異なるＴａｂ、表１内のヒト化単一ドメイン抗体を１０μｇ／ｍＬの溶液として製剤化し、５倍段階希釈した。

【0049】

（３）段階希釈したＴａｂ抗体（中国特許出願番号ＣＮ２０２０１０５７６２００．７、発明の名称「抗ＩＬ－４Ｒαの単一ドメイン抗体、並びにその使用及び薬物」に記載された方法を参考にして取得される）及びヒト化単一ドメイン抗体とＥＣ８０濃度のＩＬ－４又はＩＬ１３（中国特許出願番号ＣＮ２０２０１０５７６２００．７、発明の名称「抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体、並びにその使用及び薬物」に記載された方法を参考にして取得される）とを１：１で混合し、混合液を調製した。ＥＣ８０の定義として、ＥＣ８０は即ち８０％最大効果濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ８０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ，ＥＣ８０）であり、最大効果の８０％を引き出すことができる濃度を意味する。

【0050】

（４）前工程の混合液を細胞培養溶液と等量で細胞培養ウェルに加えた。

【0051】

（５）７２ｈインキュベーションした後、発光細胞生存率アッセイで細胞生存率を測定した。

【0052】

（６）測定結果に基づいて、異なるヒト化単一ドメイン抗体がＩＬ－４又はＩＬ１３により誘導されるＴＦ－１細胞増殖を中和するＥＣ５０濃度を計算した。ＥＣ５０は即ち半数最大効果濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ，ＥＣ５０）であり、最大効果の５０％を引き出すことができる濃度を意味する。結果を表２、表３及び図３、図４に示す。

【0053】

【表2】

【0054】

【表3】

【0055】

結果として、全てのヒト化抗体配列の中で、細胞増殖効果に対する中和能力が最も高いのは４Ｅ９－Ｖ１０抗体であり、そのＥＣ５０は０．２７ｎＭであり、最も効果が低いのは４Ｅ９－Ｖ１であり、ある程度の中和効果を持つのは４Ｅ９－Ｖ６、４Ｅ９－Ｖ８、４Ｅ９－Ｖ１２及び４Ｅ９－Ｖ１３であることが示される。

【0056】

［実施例３］示差走査法によるヒト化単一ドメイン抗体の熱安定性の測定
実験方法
（１）８連チューブ又は９６ウェルＰＣＲプレートに０．１ｍｇ／ｍＬの上記ヒト化単一ドメイン抗体溶液を４５μＬ加え、次いで５μＬの１００×Ｓｙｐｒｏ ｏｒａｎｇｅ色素を加え、この時最終色素濃度は５×となった。各試料を３回繰り返し、１×ＰＢＳをブランクとして使用した。
（２）実験タイプはＭｅｌｔ ｃｕｒｖｅであり、レポーター基はＲＯＸであり、クエンチャー基はＮｏｎｅであり、昇温プログラムは２５℃５ｍｉｎであり、走査範囲は２５～９５℃であり、昇温速度は１％（約１℃／ｍｉｎ）であった。
（３）融解曲線の一次導関数の最大値に対応する温度は該タンパク質に対応する変性温度（Ｔｍ値）となった。

【0057】

実験結果を表４に示す。

【表4】

【0058】

結果として、全てのヒト化単一ドメイン抗体の中で、４Ｅ９－Ｖ１３の熱安定性は最も高く、４Ｅ９－Ｖ３の熱安定性は最も低くて検出されず、４Ｅ９－Ｖ１０の熱安定性は全ての抗体の中で３位であることが示される。

【0059】

［実施例４］ヒト化単一ドメイン抗体の親和性測定
ＳＤ緩衝液の調製
ウシ血清アルブミンとＴｗｅｅｎ２０の質量分率（又は体積分率）がそれぞれ０．１％と０．０２％になるように、適量のウシ血清アルブミンとＴｗｅｅｎ２０を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。ＳＤ緩衝液を用いてＩＬ－４Ｒα結合分子（上述した部分ヒト化単一ドメイン抗体）を１０μｇ／ｍＬの濃度に調製した。

【0060】

抗原作業溶液の調製
ＳＤ緩衝液で抗原を２００ｎＭに調製後、２倍段階希釈し、５つの濃度勾配を設け、それに加えて、ＳＤ緩衝液のブランク対照を設定した。

【0061】

再生液の調製
濃度０．１Ｍのグリシンストック溶液を適量取り、脱イオン水で１０倍に希釈して均一に混合し、再生液を得た。

【0062】

実験手順
Ｏｃｔｅｔ ９６及び専用のコンピュータソフトウェアＤａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｏｎを起動し、７５％エタノールをレンズクリーニングペーパーに適量付けて収集プローブの底面と側面をクリーニングし、機器を１５ｍｉｎ以上ウォームアップした。Ｓｅｎｓｏｒのプリウェットについて、実験開始前にＳｅｎｓｏｒをＳＤ緩衝液に１０分以上浸して使用に備え、次いでベースライン→抗体→ベースライン→抗原結合→抗原解離→センサ再生の手順で実験操作を行うように機器プログラムを設定した。実験結果を表５に示す。

【0063】

【表5】

【0064】

ＫＤは親和性定数であり、単位はモル（Ｍ）である。
Ｋａは結合速度定数であり、単位はモル時間の逆数（１／Ｍｓ）である。
Ｋｄは解離速度定数であり、単位は時間の逆数である。
Ｒ^２はフィット度合、つまり実測曲線とフィット曲線がどれだけ一致しているかを示すものである。Ｒ^２が１に近いほど、フィット値が実測値に近くなる。本システムでは、Ｒ^２は少なくとも０．９５よりも大きいものとする。
Ｘ^２はシステムで測定した値を反映する統計的パラメータである。Ｘ^２は３よりも小さいものとし、Ｘ^２が小さいほど測定値の信頼性が高くなる。
その他の誤差値は対応するパラメータの誤差値であり、対応するパラメータより１桁（１０倍）小さいか、それより小さいものとする。

【0065】

結果として、４Ｅ９－Ｖ６と４Ｅ９－Ｖ１０はＫＤ値が最も低く、抗原親和性が最も高いことが示される。

【0066】

上記結果並びに細胞の抗体機能測定結果及び理化学分析の結果に基づき、全てのヒト化配列の中で、４Ｅ９－Ｖ１０は総合効果が最も高いヒト化単一ドメイン抗体であり、この総合効果は発明者には予想し得なかったものであった。以下の実施例では４Ｅ９－Ｖ１０を用いて試験した。

【0067】

［実施例５］抗ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－５タンパク質の二重特異性単一ドメイン抗体のＦｃ融合抗体の真核生物発現ベクターの構築
（１）コドン最適化されたヒト化抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体（４Ｅ９Ｖ１０）の遺伝子配列（配列番号２３の１～３４５位）及びヒト化抗ＩＬ－５単一ドメイン抗体（２Ｂ３Ｖ２と名づける）の遺伝子配列（配列番号２３の１０６９～１４３４位）を合成し、配列合成の方式によって、それぞれベクターＲＪＫ－Ｖ４－３（中国特許出願番号ＣＮ２０２０１０５７６２００．７、発明の名称「抗ＩＬ－４Ｒαの単一ドメイン抗体、並びにその使用及び薬物」に記載の方法を参考にして取得される）に導入した。

【0068】

（２）構築された組換え真核生物発現ベクターをＤＨ５α大腸菌に形質転換し、培養してプラスミドを大量に抽出し、内毒素を除去した。

【0069】

（３）大量に抽出したプラスミドを配列決定して同定した。

【0070】

（４）同定された抗ＩＬ－４Ｒα抗体配列を、抗ＩＬ－５抗体配列を含む真核生物発現ベクターにサブクローニングした。具体的な操作としては、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで抗ＩＬ－４Ｒα抗体配列をそれが位置する真核生物発現ベクターから切断し、同じ制限酵素粘着末端を有する抗ＩＬ－５抗体配列を含む真核生物発現ベクターにライゲートして、形質転換し、そして配列決定により同定した。配列決定したクローンに対してプラスミドを大量に抽出し、内毒素を除去した。さらに、抽出したプラスミドを配列決定して同定した。同定された組換えベクターを、後続の真核細胞トランスフェクション発現のために調製した。抗ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－５タンパク質の二重特異性単一ドメイン抗体の真核生物発現ベクターを得た。抗ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－５タンパク質の二重特異性単一ドメイン抗体（アミノ酸配列は配列番号２４に示され、対応する遺伝子配列は配列番号２３である）を４Ｅ９Ｖ１０－２Ｂ３Ｖ２と名づけ、４Ｅ９Ｖ１０－Ｆｃ領域－２Ｂ３Ｖ２の３つの部分を含む。４Ｅ９Ｖ１０はアミノ末端（配列番号２４における１～１１５位）にあり、Ｆｃ領域は配列番号２４における１１６～３５６位であり、２Ｂ３Ｖ２はカルボキシ末端（配列番号２４における３５７～４７８位）にある。

【0071】

［実施例６］
抗ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－５タンパク質二重特異性単一ドメイン抗体を懸濁ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞中、中国特許出願番号ＣＮ２０２０１０５７６２００．７、発明の名称「抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体、並びにその使用及び薬物」に記載されたアッセイ方法で発現させた。

【0072】

［実施例７］
抗ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－５タンパク質二重特異性単一ドメイン抗体を懸濁２９３Ｆ細胞中、中国特許出願番号ＣＮ２０２０１０５７６２００．７、発明の名称「抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体、並びにその使用及び薬物」に記載されたアッセイ方法で発現させた。

【0073】

［実施例８］
抗ＩＬ－４Ｒα／ＩＬ－５タンパク質二重特異性単一ドメイン抗体を中国特許出願番号ＣＮ２０２０１０５７６２００．７、発明の名称「抗ＩＬ－４Ｒα単一ドメイン抗体、並びにその使用及び薬物」に記載されたアッセイ方法で精製した。

【0074】

［実施例９］ 二重特異性単一ドメイン抗体を用いた受容体リガンド結合阻害の測定
（１）受容体タンパク質（ＩＬ－４Ｒα又はＩＬ－５Ｒ）をタンパク質希釈液で１μｇ／ｍＬに希釈し、４℃で一晩コーティングした。

【0075】

（２）プレートを洗浄し、５％脱脂乳を用いて３７℃で封鎖した。

【0076】

（３）ビオチンに結合するリガンドタンパク質（ＩＬ－４又はＩＬ－５）をＥＣ８０濃度の２倍に希釈し、抗体を開始濃度の２倍に希釈し、５倍段階希釈した。リガンドタンパク質と希釈した抗体（ｄｕｐｉｌｕｍａｂ、４Ｅ９Ｖ１０－２Ｂ３Ｖ２、４Ｅ９－Ｖ０又は２Ｂ３（配列番号２５））及びｈＩｇＧをそれぞれ１：１で新しい調剤プレートに移して均一に混合した。

【0077】

（４）プレートを洗浄し、希釈したリガンドタンパク質／抗体混合物をＥＬＩＳＡプレートに移して、デュプリケートで３７℃でインキュベートした。

【0078】

（５）プレートを洗浄し、希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ［ＨＲＰ］を加え、３７℃でインキュベートした。

【0079】

（６）プレートを洗浄し、単一成分ＴＭＢを加え、室温且つ暗所で発色させた。

【0080】

（７）停止液を加え、直ちに４５０ｎｍの波長で異なるウェル試料の値をマイクロプレートリーダーで読み取り、ＯＤ４５０と記した。ＥＣ５０をプロットすることによって計算した。４Ｅ９－Ｖ０、ＩＬ－５に対する非ヒト化単一ドメイン抗体２Ｂ３、ｄｕｐｉｌｕｍａｂ、ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ、ｈＩｇＧを対照とし、結果をそれぞれ表６と表７、図５と図６に示す。

【0081】

【表6】

【0082】

【表7】

【0083】

結果として、ヒト化二重特異性抗体は、非ヒト化抗体に比べると、ＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒα又はＩＬ－５／ＩＬ－５Ｒ受容体リガンド結合を阻害する阻害効果が劣らず、僅かな優位性があったことが示される。また、ヒト化二重特異性抗体は、対応する市販薬に比べると、阻害能力はほぼ同等であり、同様に僅かな優位性がある。

【0084】

［実施例１０］ＩＬ－４又はＩＬ－１３により誘導されるＴＦ１細胞増殖の二重特異性単一ドメイン抗体による中和の測定
測定方法は実施例２を参照する。

【0085】

測定結果を表８、表９及び図７、８に示す。

【0086】

【表8】

【0087】

【表9】

【0088】

結果として、ヒト化二重特異性抗体は、非ヒト化抗体に比べると、ＩＬ－４により誘導されるＴＦ－１細胞増殖を中和する阻害効果が劣らず、僅かな優位性があったことが示される。また、ヒト化二重特異性抗体は、対応する市販薬に比べると、阻害能力はほぼ同等である。

【0089】

［実施例１１］ヒト組換えＩＬ－５タンパク質により誘導されるＴＦ１細胞増殖及びツール抗体（Ｔａｂ）による増殖中和の測定
Ａ．ヒト組換えＩＬ－５タンパク質により誘導されるＴＦ１細胞増殖の測定
（１）回復後に３～４代継代したＴＦ－１細胞を１００００個／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。
（２）ヒトＩＬ－５タンパク質を最大濃度５００ｎｇ／ｍＬの溶液として製剤化し、５倍段階希釈した。
（３）段階希釈したＩＬ－５タンパク質溶液を細胞培養溶液と等量で細胞培養ウェルに加えた。
（４）７２ｈインキュベーションした後、発光細胞生存率アッセイで細胞生存率を測定した。
（５）測定結果に基づいて、ＩＬ－５がＴＦ－１細胞増殖を誘導するＥＣ８０濃度を計算した。計算結果は２．９６ｎｇ／ｍＬであった。

【0090】

Ｂ．ヒトＩＬ－５により誘導されるＴＦ１細胞増殖のＴａｂによる中和の測定
（１）回復後に３～４代継代したＴＦ－１細胞を１００００個／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。
（２）Ｔａｂを１０μｇ／ｍＬの溶液として製剤化し、５倍段階希釈した。
（３）段階希釈したＴａｂと増殖実験で得られたＥＣ８０濃度のＩＬ－５を１：１で混合し、混合液を調製した。
（４）混合液を細胞培養溶液と等量で細胞培養ウェルに加えた。
（５）７２ｈインキュベーションした後、発光細胞生存率アッセイで細胞生存率を測定した。
（６）測定結果に基づいて、ＴａｂがＩＬ－５により誘導されるＴＦ－１細胞増殖を中和するＥＣ５０濃度を計算した。

【0091】

［実施例１２］ＩＬ－５により誘導されるＴＦ１細胞増殖のヒト化二重特異性単一ドメイン抗体による中和の測定
（１）回復後に３～４代継代したＴＦ－１細胞を１００００個／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。
（２）Ｔａｂ及び前記ヒト化二重特異性単一ドメイン抗体を１０μｇ／ｍＬの溶液として製剤化し、５倍段階希釈した。
（３）段階希釈したＴａｂ、ヒト化抗体をそれぞれ実施例１３－Ａで得られたＥＣ８０濃度のＩＬ－５タンパク質と１：１で混合し、混合液を調製した。
（４）混合液を細胞培養溶液と等量で細胞培養ウェルに加えた。
（５）７２ｈインキュベーションした後、発光細胞生存率アッセイで細胞生存率を測定した。
（６）測定結果に基づいて、異なる単一ドメイン抗体がＩＬ－５により誘導されるＴＦ－１細胞増殖を中和するＥＣ５０濃度を計算した。実験結果を表１０と図９に示す。

【0092】

【表10】

【0093】

結果として、ヒト化二重特異性抗体は、非ヒト化抗体に比べると、ＩＬ－５により誘導されるＴＦ－１細胞増殖を中和する阻害効果が劣らず、僅かな優位性があったことが示される。また、ヒト化二重特異性抗体は、対応する市販薬に比べると、阻害能力はほぼ同等である。

【0094】

［実施例１３］
ヒト化二重特異性抗体の親和性動態測定を、実施例４に示される測定方法で行った。測定結果を表１１に示す。

【0095】

【表11】

【0096】

結果として、ＩＬ４Ｒα及びＩＬ－５を標的とする二重特異性抗体の親和性はそれぞれ２つの抗原と共に測定した。対応する親和性はいずれも１ｎＭ以下であった。

【0097】

以上、本発明の基本原理、主な特徴及び本発明の利点を示して説明した。本発明は上記実施例に限定されるものではなく、上記実施例及び明細書の記載は本発明の原理を説明するためのものに過ぎず、本発明の精神と範囲を逸脱しない限り、本発明に様々な変形及び改良を行うことができ、これら変形や改良は全て本発明の保護範囲内にあることが当業者に自明である。本発明の保護範囲は添付した特許請求の範囲及びその同等物によって定義される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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