特許 7590791 ＷＡＲＳ中和抗体及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-19

(45)【発行日】2024-11-27

(54)【発明の名称】ＷＡＲＳ中和抗体及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/40 20060101AFI20241120BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241120BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241120BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241120BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241120BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241120BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241120BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241120BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20241120BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241120BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241120BHJP

   A61K 31/7036 20060101ALN20241120BHJP

【ＦＩ】

C07K16/40 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

G01N33/53 D

A61K39/395 N

A61P29/00

A61K31/7036

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2023527238

(86)(22)【出願日】2021-10-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-21

(86)【国際出願番号】 KR2021014301

(87)【国際公開番号】W WO2022092644

(87)【国際公開日】2022-05-05

【審査請求日】2023-05-16

(31)【優先権主張番号】10-2020-0140371

(32)【優先日】2020-10-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2021-0136547

(32)【優先日】2021-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】523159878

【氏名又は名称】ミリムジーン カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ジン，ミリム

(72)【発明者】

【氏名】チェ，ユン ヒ

【審査官】田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】韓国公開特許第１０－２０２１－００１０２３６（ＫＲ，Ａ）

【文献】特表２０２０－５０４７５９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列表の配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列表の配列番号４の重鎖ＣＤＲ２、及び配列表の配列番号５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列表の配列番号６の軽鎖ＣＤＲ１、配列表の配列番号７の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列表の配列番号８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含むＷＡＲＳに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

配列表の配列番号１の重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列表の配列番号２の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＷＡＲＳ）に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

前記抗体又はその抗原結合断片は、配列表の配列番号２１のＣＬ配列、配列表の配列番号２２のＣＨ１配列、配列表の配列番号２３のヒンジ配列、配列表の配列番号２４のＣＨ２配列、及び配列表の配列番号２５のＣＨ３配列で構成された群から選ばれる１以上の配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

前記断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｄＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びテトラマーからなる群から選ばれる断片又は前記断片とＦｃの結合形態であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

請求項１の抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。

【請求項6】

請求項５のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項7】

請求項６のベクターで形質転換された細胞。

【請求項8】

請求項７の細胞を、ポリヌクレオチドが発現される条件下で培養し、ポリペプチドを回収する段階を含む、ＷＡＲＳに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法。

【請求項9】

請求項１の抗体又はその抗原結合断片を試料と接触させる段階を含む、ＷＡＲＳの特異的検出方法。

【請求項10】

請求項１の抗体又はその抗原結合断片を含む、ＷＡＲＳの特異的検出用組成物。

【請求項11】

請求項１の抗体又はその抗原結合断片を含む感染疾患の診断用組成物。

【請求項12】

前記感染疾患は、感染性炎症疾患であることを特徴とする、請求項１１に記載の診断用組成物。

【請求項13】

前記感染性炎症疾患は、敗血症又は敗血症性ショックであることを特徴とする、請求項１２に記載の診断用組成物。

【請求項14】

請求項１の抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター又は前記ベクターで形質転換された細胞を含む感染疾患の治療用薬剤学的組成物。

【請求項15】

前記感染疾患は、感染性炎症疾患であることを特徴とする、請求項１４に記載の感染疾患の治療用薬剤学的組成物。

【請求項16】

前記感染性炎症疾患は、敗血症又は敗血症性ショックであることを特徴とする、請求項１５に記載の感染疾患の治療用薬剤学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＷＡＲＳタンパク質に特異的に結合する抗体及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＡＲＳ）は、アミノ酸を特異的にｔＲＮＡに結合させる反応を媒介する酵素であって、タンパク質の生成に中枢的な役割を担う。近年、これらのＡＲＳは、本質的な機能以外にも、細胞死滅（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、血管形成（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、炎症反応などの多様な生命現象に関与していることが知られている。特に、ヒトトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素１（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ １、ＷＡＲＳ１）の一般的な機能は、タンパク質の合成のためにトリプトファンを認知するｔＲＮＡと連結するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素であるが、最近の関心事は、感染に対する宿主防御メカニズムにおけるＷＡＲＳ１の役割である。本発明者等は、以前に、感染してから数分以内に、単核球がデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成なしで既存に存在するＷＡＲＳ１を細胞外空間に直ぐ分泌することを報告した（Ｙｏｕｎｇ Ｈａ Ａｈｎ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ａｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｄｅｆｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２：１６１９１（２０１６））。

【0003】

ＴＬＲ４とＴＬＲ２の内因性リガンドとして機能することによって、分泌されたＷＡＲＳ１は、大食細胞を活性化し、先天的な免疫活性化を誘導する。また、ＷＡＲＳ１は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＭＩＰ－１α、ＩＬ－８及びＩＦＮ－γを含む前炎症性サイトカイン及びケモカインの生産を開始し、好中球の浸潤を誘発する。その後、ＷＡＲＳ１遺伝子の発現がＩＦＮ－γによって活性化され、ＷＡＲＳ１の持続的な分泌を維持する。このような発見と一致するように、ＷＡＲＳ１は、敗血症患者の血液で高度に高くなるが、無菌性慢性炎症障害ではそうではなく、グラム陽性及び陰性細菌、ウイルス及びカビなどの病原体の類型とは関係なく分泌されることを確認した。

【0004】

前記細菌、ウイルス及び／又はカビによる感染性炎症疾患の治療のために、これに対する抗体を開発する戦略が考えられるが、ＷＡＲＳ１を含む各ＡＲＳは、タンパク質の構造上、類似する点が多いので、免疫反応で得られる抗体は、他のＡＲＳにも交差反応を示すように、高感度の抗体が生成されない場合が多い。

【0005】

したがって、他のＡＲＳに対する交差反応がなく、ＷＡＲＳ１にのみ特異的に結合し、これを効果的に中和できる抗体の開発が切実な状況である。

【0006】

上記のような背景技術として説明した各事項は、本発明の背景に対する理解を増進するためのものに過ぎなく、この技術分野で通常の知識を有する者に既に知られている従来技術に該当するものと認めてはならない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明者等は、敗血症などの感染疾患の患者において、その発現量が著しく増加するＷＡＲＳに特異的に結合する抗体又はその断片を発掘するために鋭意努力した。その結果、ＷＡＲＳに特異的に結合し、他のＡＲＳ類との交差反応性がなく、ＷＡＲＳ検出及び発現抑制能力に優れた抗体を発掘することによって、本発明を完成するに至った。

【0008】

したがって、本発明の目的は、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＷＡＲＳ）に特異的に結合する抗体又はその断片を提供することにある。

【0009】

本発明の他の目的は、前記抗体又はその断片を暗号化するポリヌクレオチドを提供することにある。

【0010】

本発明の更に他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。

【0011】

本発明の更に他の目的は、前記ベクターで形質転換された細胞を提供することにある。

【0012】

本発明の更に他の目的は、前記細胞を、ポリヌクレオチドが発現される条件下で培養し、ポリペプチドを回収する段階を含む、ＷＡＲＳに特異的に結合する抗体又はその断片の製造方法を提供することにある。

【0013】

本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を試料と接触させる段階を含む、ＷＡＲＳの特異的検出方法を提供することにある。

【0014】

本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を含む、ＷＡＲＳの特異的検出用組成物を提供することにある。

【0015】

本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を含む感染疾患の診断用組成物を提供することにある。

【0016】

本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を含む感染疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することにある。

【0017】

本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞、及び追加的な抗生剤を含む感染疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することにある。

【0018】

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本発明の一様態によると、本発明は、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＷＡＲＳ）に特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。

【0020】

本発明者等は、敗血症などの感染疾患の患者において、その発現量が著しく増加するＷＡＲＳに特異的に結合する抗体又はその断片を発掘するために努力した結果、ＷＡＲＳに特異的に結合し、他のＡＲＳ類との交差反応性がなく、ＷＡＲＳ検出及び活性抑制能力に優れた抗体を発掘した。

【0021】

本明細書において、「ＷＡＲＳ」という用語は、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）を意味し、トリプトファンｔＲＮＡ連結酵素（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ－ｔＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ）、ＴｒｐＲＳ、ＷＲＳなどとしても知られている。ＷＡＲＳは、アミノ酸トリプトファンとｔＲＮＡのアミノアシレーション（Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ）反応を媒介する酵素である。ＷＡＲＳは、ヒトではＷＡＲＳ遺伝子によって暗号化され、タンパク質のアミノ酸配列とｍＲＮＡ塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）ＮＰ＿００４１７５．２（タンパク質）、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４１８４．３（ｍＲＮＡ塩基配列）などとして公知となっている。ＷＡＲＳは、細胞質型（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｏｒｍ）（ＷＡＲＳ１又はＴｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ １、Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）とミトコンドリア型（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｏｒｍ）（ＷＡＲＳ２又はＴｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ２、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ）の二つのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）を有する。

【0022】

本発明の好ましい具現例によると、本発明のＷＡＲＳはＷＡＲＳ１である。

【0023】

本明細書において、「抗体」という用語は、当業界の用語であり、本明細書で相互交換的に使用可能であり、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を意味する。本明細書で使用されたこの用語は、全体の抗体及び任意の断片（すなわち、「抗原－結合部分」）又はその単一鎖を含む。本発明の一具現例によると、「抗体」は、二硫化物結合によって相互連結された少なくとも２個の重鎖（Ｈ）及び２個の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質又はその抗原結合部分を言う。本発明の他の具現例によると、「抗体」は、単一可変領域（ドメイン）、例えば、ＶＨドメインを含む単一鎖抗体を言う。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域からなる。一般に、重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含み、各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、一つのドメイン、すなわち、ＣＬを含む。

【0024】

ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名された、超可変領域にさらに細分化可能であり、これは、フレームワーク領域（ＦＲ）と命名された、さらに保存された各領域の間に位置する。各ＶＨ及びＶＬは、３個のＣＤＲ及び４個のＦＲからなり、これらは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の順にアミノ－末端からカーボキシ－末端に配列される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体システムの第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、免疫グロブリンと宿主組織又は因子の結合を媒介することができる。

【0025】

本明細書において、「Ｆｃ」という用語は、免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）上に位置したＦｃ受容体又は古典的補体システムの第１成分（Ｃ１ｑ）との結合を含む、免疫グロブリンと宿主組織又は因子の結合を媒介する抗体重鎖のＣ－末端領域を言う。よって、Ｆｃは、第１定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１又はＣＬ）を除いた抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体のアイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の二つの重鎖の第２（ＣＨ２）及び第３（ＣＨ３）定常ドメインから由来した二つの同一のタンパク質断片を含み、ＩｇＭ及びＩｇＥ Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖で３個の重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２－４）を含む。本明細書に提示されたＦｃは、任意のアロタイプ変異体を含む自生配列Ｆｃ又はＦｃ変異体（例えば、非－自然発生Ｆｃ）であり得る。また、Ｆｃは、「Ｆｃ融合タンパク質」（例えば、抗体又は免疫接合体）とも言う「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」などのＦｃ－含有タンパク質ポリペプチドであり得る。

【0026】

抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＹ）、又は任意のサブクラス（例えば、ヒトにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、又はマウスにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３など）を有することができる。免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１は、いくつかのアミノ酸が互いに異なるいくつかのアロタイプで存在する。本明細書に開示された抗体は、通常知られているアイソタイプ、類型、サブクラス及びアロタイプのうちいずれか一つから由来し得る。特定の具体例において、本明細書に提示された抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラス、又はこれらの任意のハイブリッドに属する。特定の具体例において、抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４又はＩｇＧ２／ＩｇＧ４サブクラスに属する。

【0027】

抗体の例としては、自然発生又は非－自然発生抗体；単一クローン又は多クローン抗体；キメラ又はヒト化抗体；ヒト又は非－ヒト抗体；完全合成抗体；単一鎖抗体；単一特異的抗体；及び多重特異的抗体（二重又は三重特異的抗体を含む）を含む。

【0028】

本明細書において、「中和抗体」という用語は、病原体や感染性粒子が身体に浸透したときに生物学的に及ぼす影響を中和し、細胞を防御する抗体を意味する。中和抗体は、ウイルス、バクテリア、カビ及び微生物毒素に対する後天免疫系の免疫反応の一部である。中和抗体は、感染性粒子の表面構造に特化された形態で生成されながら結合し、感染性抗原が宿主細胞と相互作用することを防止することによって免疫を達成する。

【0029】

本明細書において、「断片」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保有した抗体の一つ以上の断片又は前記「抗原に特異的に結合する能力を保有した抗体の一つ以上の断片」と他の分子（同一又は他の抗体の一部分（Ｆｃなど）を含む）が結合された全ての形態を含む意味で解釈される。断片の例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインで構成された１価断片（Ｆａｂ断片）；ヒンジ領域で二硫化物ブリッジによって連結された２個のＦａｂ断片を含む２価断片（Ｆ（ａｂ’）２断片）；ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されたＦｄ断片；抗体の一つのアーム（ａｒｍ）のＶＬ及びＶＨドメイン、及び二硫化物－連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）で構成されたＦｖ断片；ＶＨドメインで構成されたｄＡｂ断片；及び分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）又はリンカーによって選択的につながり得る二つ以上の分離されたＣＤＲの組み合わせを含む。また、ＶＬとＶＨ領域は、ペアをなして１価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を形成した単一タンパク質鎖をなすようにリンカーによってつながり得る。このような単一鎖抗体も抗体の断片に含まれる。また、前記抗体又は抗体の断片は、２個の重鎖分子及び２個の軽鎖分子を含むテトラマー抗体；抗体軽鎖モノマー；抗体重鎖モノマー；抗体軽鎖ダイマー；抗体重鎖ダイマー；イントラボディー；１価抗体；ラクダ抗体；及び単一－ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。

【0030】

本発明の好ましい具現例によると、本発明の抗体の断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｄＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びテトラマーからなる群から選ばれる断片又は前記断片とＦｃの結合形態である。

【0031】

本発明の好ましい具現例によると、本発明の抗体又はその断片は、配列リストの第３配列の重鎖ＣＤＲ１、配列リストの第４配列の重鎖ＣＤＲ２、及び配列リストの第５配列の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

【0032】

本発明の好ましい具現例によると、本発明の抗体又はその断片は、配列リストの第６配列の軽鎖ＣＤＲ１、配列リストの第７配列の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列リストの第８配列の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0033】

本発明の好ましい具現例によると、本発明の前記ＣＤＲ配列で構成された各抗体（その断片を含む）は、ＷＡＲＳに特異的に結合し、ＡＲＳファミリーを含む他のタンパク質との交差反応性がないものである。

【0034】

本発明の好ましい具現例によると、本発明の抗体又はその断片は、配列リストの第１配列の重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列リストの第２配列の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0035】

本発明の好ましい具現例によると、本発明の抗体又はその断片は、配列リストの第２１配列のＣＬ配列、配列リストの第２２配列のＣＨ１配列、配列リストの第２３配列のヒンジ（Ｈｉｎｇｅ）配列、配列リストの第２４配列のＣＨ２配列、及び配列リストの第２５配列のＣＨ３配列で構成された群から選ばれる１以上の配列を含む。

【0036】

本発明の好ましい具現例によると、本発明の抗体又はその断片は、配列リストの第２１配列のＣＬ配列、配列リストの第２２配列のＣＨ１配列、配列リストの第２３配列のヒンジ配列、配列リストの第２４配列のＣＨ２配列、及び配列リストの第２５配列のＣＨ３配列を全て含む。

【0037】

本発明の他の様態によると、本発明は、前記抗体又はその断片を暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター又は前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。

【0038】

本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含む。本発明のポリヌクレオチド又は核酸分子は、単離されたり又は組み換えられたものであってもよく、単一鎖及び二重鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡのみならず、対応する相補性配列を含む。「単離された核酸」は、天然生成起源から単離された核酸の場合、核酸が単離された個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、このような手順から生成された核酸が単離された核酸分子であると理解され得る。単離された核酸分子は、別途の断片の形態又はさらに大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を示す。核酸は、他の核酸配列との機能的な関係で配置されるときに「作動可能に連結」される。例えば、プレ配列又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態であるプレタンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、ポリペプチド配列の転写に影響を与える場合にコーディング配列に作動可能に連結され、又は、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されるときにコーディング配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結された」は、連結される各ＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダーの場合、隣接しながら同一のリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接して位置する必要はない。連結は、便利な制限酵素部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを通常の方法によって使用する。

【0039】

本明細書において、「ベクター」という用語は、前記ポリヌクレオチド（核酸）配列を複製できる細胞への導入のためにポリヌクレオチド配列を挿入できる伝達体を意味する。ポリヌクレオチド配列は、外因性（Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であり得る。ベクターとしては、プラスミド、コスミドベクター及びウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスベクターなど）を挙げることができるが、これに制限されない。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。

【0040】

本明細書において、「発現ベクター」という用語は、転写される遺伝子産物のうち少なくとも一部分をコーディングするヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。一部の場合は、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターは、多様な調節配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する調節配列と共に、ベクター及び発現ベクターには、更に他の機能を提供する核酸配列も含まれ得る。

【0041】

本明細書において、「細胞」という用語は、真核細胞及び原核細胞を含み、前記ベクターを複製できたり、ベクターによってコーディングされる遺伝子を発現できる任意の形質転換可能な細胞を意味する。細胞は、前記ベクターによって形質感染（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）、形質導入（Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）又は形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）されてもよく、これは、外因性のポリヌクレオチド（核酸分子）が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。本明細書において、「形質転換」という用語は、前記形質感染（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）及び形質導入（Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）を含む意味で使用される。

【0042】

本発明の（宿主）細胞としては、これに制限されないが、好ましくは、バクテリア細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞、より好ましくは、昆虫細胞の場合はＳｆ９、哺乳動物細胞の場合は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、ＲＰＥ－１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ－７細胞、Ｃ８Ｄ１ａ細胞、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＥＳ１３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＭＣＦ－７細胞、ＨＣ７０細胞、ＨＣＣ１４２８細胞、ＢＴ－５４９細胞、ＰＣ３細胞、ＬＮＣａＰ細胞、Ｃａｐａｎ－１細胞、Ｐａｎｃ－１細胞、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞、ＳＷ４８０細胞、ＨＣＴ１６６細胞、ＬｏＶｏ細胞、Ａ１７２細胞、ＭＫＮ－４５細胞、ＭＫＮ－７４細胞、Ｋａｔｏ－ＩＩＩ細胞、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞、ＨＴ－１４４細胞、ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｃ６細胞、ＨＴ－２２細胞、ＰＣ－１２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などを用いることができる。

【0043】

本発明の（宿主）細胞は、好ましくは、胚性幹細胞を除外した細胞である。

【0044】

本発明の好ましい具現例によると、本発明の宿主細胞は、単離又は分離された宿主細胞である。

【0045】

本発明の更に他の様態によると、本発明は、前記細胞を、ポリヌクレオチドが発現される条件下で培養し、ポリペプチドを回収する段階を含む、ＷＡＲＳに特異的に結合する抗体又はその断片を製造する方法を提供する。

【0046】

本発明の製造方法の内容のうち、抗体又はその断片、ヌクレオチド、ベクター、細胞などに対しては、上述した通りである。前記製造方法のポリペプチドは、本発明の抗体又はその断片（抗原結合断片）であったり、これを含むことができる。

【0047】

本発明の好ましい具現例によると、本発明は、（ａ）前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター（組換え発現ベクター）で宿主細胞を形質転換する段階；（ｂ）形質転換された宿主細胞を培養し、抗体又はその断片を生産する段階；及び（ｃ）宿主細胞で生産された抗体又はその断片を収得する段階；を含む。

【0048】

本発明の更に他の様態によると、本発明は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を試料と接触させる段階を含む、ＷＡＲＳの特異的検出方法を提供する。

【0049】

本発明の更に他の様態によると、本発明は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を含む、ＷＡＲＳの特異的検出用組成物を提供する。

【0050】

本発明の抗体又はその断片は、ＷＡＲＳと特異的に結合するので、例えば、特定の細胞、組織、又は血清内のＷＡＲＳタンパク質の発現を検出して定量するための診断分析に有用である。

【0051】

本明細書において、「試料」という用語は、被検体（例えば、感染疾患又は感染合併症の有無を診断しようとする被検体）から採取された細胞や組織、血液、全血、血清、血漿、脳脊髄液などであってもよい。前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を用いてタンパク質を検出する方法としては、ウェスタンブロット、免疫ブロット、ドットブロット、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫検定法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、競争的結合分析、免疫沈澱などがあるが、これに制限されない。

【0052】

本発明の更に他の様態によると、本発明は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を含む感染疾患の診断用組成物を提供する。

【0053】

本発明の更に他の様態によると、本発明は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を含む感染疾患の診断キットを提供する。

【0054】

本発明の更に他の様態によると、本発明は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を含む感染疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

【0055】

本発明の更に他の様態によると、本発明は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を含むＷＡＲＳ過剰発現による疾患の治療用薬剤学的組成物を提供する。

【0056】

本発明の診断用組成物又は薬剤学的組成物の内容のうち、抗体又はその断片、ヌクレオチド、ベクター、細胞などに対しては、上述した通りである。

【0057】

本発明が予防、改善又は治療しようとする疾患は、制限されないが、好ましくは、ＷＡＲＳの発現又は活性と関連した全ての疾患を含む。

【0058】

前記ＷＡＲＳの発現又は活性と関連した疾患は、制限されないが、好ましくは感染疾患を含む。

【0059】

ＷＡＲＳは、バクテリア、ウイルス又はカビ（Ｆｕｎｇｉ）などによる感染で発現レベルが感染初期から急速に増加し、感染合併症として肺炎や敗血症などの症状が現れる場合、正常人対照群より著しく増加すると報告されたことがある。さらに、敗血症患者の場合、ＷＡＲＳ発現レベルは敗血症の重症度及び予後と高い相関関係を有しており、ＷＡＲＳは、感染性炎症でのみ増加するので、感染性炎症疾患と非感染性炎症疾患を迅速且つ正確に区分することができ、新しい感染疾患及び感染合併症での診断マーカーとしての価値が非常に高い。特に、バクテリア又はカビ（Ｆｕｎｇｉ）感染による敗血症又は敗血症性ショック患者の血清では、ＷＡＲＳの量が健康な正常人対照群の血清に比べて著しく増加し、グラム－陰性菌バクテリア、グラム－陽性菌バクテリア及びカビ感染による敗血症患者のそれぞれにおいてＷＡＲＳの増加傾向に統計学的に有意な差がないので、グラム－陰性菌バクテリア、グラム－陽性菌バクテリア又はカビ感染による敗血症の診断にＷＡＲＳが全て有用に使用され得る。また、ＷＡＲＳのレベルは、敗血症患者より敗血症性ショック患者でさらに増加し、ＷＡＲＳの発現レベルが敗血症重症度とも関連している。すなわち、ＷＡＲＳの発現レベルが高いほど、敗血症の症状が深刻であると判断することができる（韓国公開特許第１０－２０１７－００２７３１３）。すなわち、本発明のＷＡＲＳ特異的抗体を用いると、生物学的試料のうちＷＡＲＳの発現程度を高い正確度で検出することによって、感染疾患又は感染合併症を診断するのに有用な情報を提供し、その予後を予測することができる。

【0060】

本発明に係る抗体又はその断片は、分析キット又は診断キットとして提供されてもよく、前記キットは、当業界に抗体又は特定の結合ドメインを有するペプチドを構成品として提供する分析キットとして知られたものであれば、その種類が特に制限されないが、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫分析法、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ又はタンパク質チップ用キットなどを含む。

【0061】

本発明の感染疾患としては、肺炎、肺結核、結核、敗血症（Ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症性ショック（Ｓｅｐｔｉｃ Ｓｈｏｃｋ）、サルモネラ症（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、食中毒、腸チフス、尿路感染、膀胱炎、腎盂腎炎、尿道炎、前立腺炎、上気道感染、中耳炎、後天性免疫欠乏症（ＡＩＤＳ）ウイルス及びコロナウイルスなどのウイルス性感染疾患などがあるが、これに制限されない。

【0062】

前記コロナウイルスは、重症急性呼吸器症侯群ウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症侯群ウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＣＯＶＩＤ－１９（ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ １９）の原因となった新型コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、伝染性気管支炎ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＩＢＶ）、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥ）、豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）、牛コロナウイルス（ＢＣｏＶ）、猫／犬コロナウイルス（ＦＣｏＶ／ＣＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）などを含むが、これに制限されない。

【0063】

本発明の好ましい具現例によると、前記感染疾患は感染性炎症疾患である。

【0064】

感染性炎症疾患は、炎症を伴う感染疾患であって、感染の原因病原体（ウイルス、細菌、カビなど）の増殖を抑制したり、炎症を調節することによって所期の治療効果を達成することができる。

【0065】

本発明の好ましい具現例によると、前記感染性炎症疾患は、敗血症又は敗血症性ショックである。

【0066】

前記敗血症は、初期敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック及び敗血症に伴う多臓器機能障害症侯群（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｏｒｇａｎ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＭＯＤＳ）、播種性血管内凝固症侯群（ＤＩＣ）、急性呼吸窮迫症侯群（ＡＲＤＳ）又は急性腎不全（ＡＫＩ）の発病を含むが、これに制限されない。

【0067】

本発明の組成物は、ＷＡＲＳを高い敏感度で検出できるだけでなく、感染によって増加したＷＡＲＳの量を有意に低下させることができ、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－８、ＩＬ－６、ＭＩＰ－１α、ＴＮＦ－αなど）の発現量を低下させ、診断と治療を同時に達成できるという長所を有する。

【0068】

本明細書において、「サイトカイン」という用語は、免疫細胞から分泌されるタンパク質免疫調節剤を意味し、ケモカイン（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）を含む意味で使用される。

【0069】

前記サイトカインは、ＩＬ－８、ＩＬ－６、ＭＩＰ－１α、ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１０などを含む。

【0070】

本発明の好ましい具現例によると、前記薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含む。

【0071】

本発明の好ましい具現例によると、本発明の薬剤学的組成物は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞、及び追加的な抗生剤を含む。

【0072】

前記抗生剤は、好ましくは、ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、ストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、テトラサイクリン（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、エリスロマイシン（Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、バンコマイシン（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、ペニシリン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、スペクチノマイシン（Ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、スルファジアジン（Ｓｕｌｆａｃｉａｚｉｎｅ）、及びトリメトプリム（Ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）を含むが、これに制限されない。

【0073】

本発明の一実施例によると、抗生剤の投与後に本発明のＷＡＲＳ特異的抗体を１回以上投与したり、抗生剤と組み合わせて投与したり、前記抗体の投与後に抗生剤を投与する方式などによって感染疾患を保有した個体の生存率を増加させることができる。

【0074】

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。本発明の薬剤学的組成物は、前記各成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適合した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

【0075】

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与することができ、好ましくは、非経口投与、例えば、静脈内注入、経皮投与、皮下注入、筋肉内注入、硝子体内注入（Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、網膜下注入（Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脈絡膜上腔注入（Ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、点眼投与（Ｅｙｅ Ｄｒｏｐ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、脳室内注入（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、髄腔内注入（Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、羊膜内注入（Ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、動脈内注入（Ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、関節腔内注入（Ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、心臓内注入（Ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、陰茎海綿体内注入（Ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｕｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脳内注入（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脳槽内注入（Ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、冠動脈内注入（Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、頭蓋内注入（Ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、硬膜内注入（Ｉｎｔｒａｄｕｒａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、硬膜外注入（Ｅｐｉｄｕｒａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、海馬内注入（Ｉｎｔｒａｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、鼻腔内注入（Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、骨腔内注入（Ｉｎｔｒａｏｓｓｅｏｕｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腹腔内注入（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸腔内注入（Ｉｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脊髓内注入（Ｉｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸郭内注入（Ｉｎｔｒａｔｈｏｒａｃｉｃ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸腺内注入（Ｉｎｔｒａｔｈｙｍｉｃ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、子宮内注入（Ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、膣内注入（Ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、心室内注入（Ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、膀胱内注入（Ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、結膜下注入（Ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腫瘍内注入（Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、局所注入及び腹腔注入（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などで投与することができる。

【0076】

本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの各要因によって多様であり、普通に熟練した医者であれば、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。

【0077】

本発明の組成物は、診断又は予防、改善、治療を目的とする対象に薬剤学的に有効な量で投与され得る。前記「薬剤学的に有効な量」とは、陰性対照群に比べてそれ以上の反応を示す量を言う。本発明の抗体又はその断片の総有効量は、単一投与量（Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｓｅ）で患者に投与されてもよく、多重投与量（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与されてもよい。本発明の抗体又はその断片の人体に対する１日投与量は、一般に０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇである。しかし、本発明の抗体又はその断片の用量は、薬剤学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率などの多様な要因を考慮した上で患者に対する有効投与量が決定されるので、このような点を考慮するとき、当分野で通常の知識を有する者であれば、本発明の抗体又はその断片に対して本発明の特定の用途による適切な有効投与量を決定することができる。

【0078】

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位用量の形態で製造されたり、又は多用量容器内に入り込ませて製造され得る。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であったり、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

【0079】

本発明の更に他の様態によると、本発明は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞の治療用途（ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ）を提供する。

【0080】

本発明の更に他の様態によると、本発明は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞の有効量を対象（Ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む、疾患の治療方法を提供する。

【0081】

本発明において、「対象」という用語は、本発明の組成物を投与する必要がある個体を意味し、哺乳類、鳥類、逝虫類、両生類、魚類などの投与対象に制限がない。

【0082】

本発明の好ましい具現例によると、本発明の治療方法は、抗生剤を投与する段階をさらに含む。

【0083】

本発明の好ましい具現例によると、本発明の治療方法は、前記抗体又はその断片、ポリヌクレオチド、ベクター又は細胞を抗生剤と同時に、抗生剤の投与前、又は抗生剤の投与後に１回以上投与する段階を含む。

【0084】

前記抗生剤は、好ましくは、ゲンタマイシン、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、バンコマイシン、ペニシリン、スペクチノマイシン、クロラムフェニコール、スルファジアジン、及びトリメトプリムを含むが、これに制限されない。

【0085】

本発明の一実施例によると、抗生剤の投与後に本発明のＷＡＲＳ特異的抗体を１回以上投与したり、抗生剤と組み合わせて投与したり、前記抗体の投与後に抗生剤を投与する方式などによって感染疾患を保有した個体の生存率を増加させることができる。

【発明の効果】

【0086】

本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ｉ）本発明は、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ－ｔＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＷＡＲＳ）に特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。
（ｉｉ）本発明の抗体又はその断片は、ＷＡＲＳに特異的に結合する能力に非常に優れるので、他のＡＲＳ類との交差反応性がなく、ＷＡＲＳ検出及び活性抑制能力に優れることによって、感染疾患の診断及び／又は治療用途に効果的に使用され得る。

【図面の簡単な説明】

【0087】

【図1a】ＧＫＢ１０１をＩｇＧ抗体に変換するために使用したベクターの模式図である。図１ａは重鎖ベクターを示し、図１ｂは軽鎖ベクターを示す。

【図1b】図１ａの欄を参照。

【図2a】ＧＫＢ１０１のターゲット結合力を測定した結果を示す図である。図２ａは、ＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用してヒト及びマウスのＷＡＲＳ１に対するＧＫＢ１０１の結合力を測定した結果を示し、図２ｂは、ＥＬＩＳＡによる吸光度の測定結果を示す。

【図2b】図２ａの欄を参照。

【図3a】ＧＫＢ１０１を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ上での中和能検証結果を示す図である。図３ａは、ＴＮＦ－αの分泌を、図３ｂは、ｍＣＸＣＬ２（ヒトＩＬ－８の同族体）の分泌を減少させた結果を示す。

【図3b】図３ａの欄を参照。

【図4a】ＷＡＲＳ１特異的抗体が、バクテリア感染したネズミの生存率に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。図４ａは、ネズミの腹腔にＣＳ（Ｃｅｃａｌ Ｓｌｕｒｒｙ）を注入し、重症敗血症を誘発したネズミにＰＢＳ又はＧＫＢ１０１を注射した後で生存率を分析した結果を示す。図４ｂ及び図４ｃは、ＧＫＢ１０１の投与によってＷＡＲＳ１の濃度が減少することを確認した結果を示す（図４ｂ：プラズマ、図４ｃ：腹腔液）。図４ｄ乃至図４ｇは、ＧＫＢ１０１の投与によって腹腔液内に分泌されたＩＬ－８（図４ｅ）、ＩＬ－６（図４ｆ）、ＭＩＰ－１α（図４ｄ）、ＴＮＦ－α（図４ｇ）の濃度が減少することを確認した結果を示す。図４ｈ乃至図４ｋは、ＧＫＢ１０１の投与によってＡＬＴ（図４ｈ）、ＡＳＴ（図４ｉ）、ＢＵＮ（図４ｊ）、クレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）（図４ｋ）の濃度が相対的に減少することを確認した結果を示す（円は正常群；四角はＰＢＳ群；三角はＧＫＢ１０１群を示す）。

【図4b】図４ａの欄を参照。

【図4c】図４ａの欄を参照。

【図4d】図４ａの欄を参照。

【図4e】図４ａの欄を参照。

【図4f】図４ａの欄を参照。

【図4g】図４ａの欄を参照。

【図4h】図４ａの欄を参照。

【図4i】図４ａの欄を参照。

【図4j】図４ａの欄を参照。

【図4k】図４ａの欄を参照。

【図5a】ＷＡＲＳ１特異的抗体が、バクテリア感染したネズミの生存率に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。図５ａは、ネズミの腹腔にＣＳ（Ｃｅｃａｌ ｓｌｕｒｒｙ）を注入し、重症敗血症を誘発したネズミにアイソタイプＩｇＧ又はＧＫＢ１０１を注射した後で生存率を分析した結果を示す。図５ｂ及び図５ｃは、ＧＫＢ１０１の投与によってＷＡＲＳ１の濃度が減少することを確認した結果を示す（図５ｂ：プラズマ、図５ｃ：腹腔液）。図５ｄ乃至図５ｇは、ＧＫＢ１０１の投与によって腹腔液内に分泌されたＩＬ－８（図５ｅ）、ＩＬ－６（図５ｆ）、ＭＩＰ－１α（図５ｄ）、ＴＮＦ－α（図５ｇ）の濃度が減少することを確認した結果を示す。図５ｉ乃至図５ｋは、ＧＫＢ１０１の投与によってＡＬＴ（図５ｈ）、ＡＳＴ（図５ｉ）、ＢＵＮ（図５ｊ）、クレアチニン（図５ｋ）の濃度が相対的に減少することを確認した結果を示す。

【図5b】図５ａの欄を参照。

【図5c】図５ａの欄を参照。

【図5d】図５ａの欄を参照。

【図5e】図５ａの欄を参照。

【図5f】図５ａの欄を参照。

【図5g】図５ａの欄を参照。

【図5h】図５ａの欄を参照。

【図5i】図５ａの欄を参照。

【図5j】図５ａの欄を参照。

【図5k】図５ａの欄を参照。

【図6a】重症敗血症のマウスモデルを用いてＧＫＢ１０１と抗生剤の併用効果を検証した結果を示す図である。図６ａは、ゲンタマイシンとＧＫＢ１０１の注入スケジュールを示し、図６ｂは、ゲンタマイシンとＧＫＢ１０１の注入後の時間による生存率グラフを示す。

【図6b】図６ａの欄を参照。

【図7a】マーモセットのエンドトキセミアモデル（Ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ ｍｏｄｅｌ）を用いたＧＫＢ１０１の効能を検証した結果を示す図である。図７ａは、ＰＢＳとＧＫＢ１０１の注入スケジュールを示し、図７ｂ乃至図７ｅは、ＬＰＳ誘導後のＰＢＳ又はＧＫＢ１０１投与群の時間による体温（図７ｂ）、体重（図７ｃ）、血液内のＷＢＣ（図７ｄ）及び好中球（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）（図７ｅ）の変化を示す。図７ｆは、ＧＫＢ１０１の投与によるプラズマ内のＷＡＲＳ１のレベルを示し、図７ｇは、ＴＮＦ－αのレベルを測定した結果を示す。

【図7b】図７ａの欄を参照。

【図7c】図７ａの欄を参照。

【図7d】図７ａの欄を参照。

【図7e】図７ａの欄を参照。

【図7f】図７ａの欄を参照。

【図7g】図７ａの欄を参照。

【発明を実施するための形態】

【0088】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものに過ぎなく、本発明の要旨に従って、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。

【実施例】

【0089】

実施例１．ｓｃＦｖ抗体のＩｇＧ１抗体への転換
ＷＡＲＳ１（配列リストの第２６配列）に対して特異的に結合するｓｃＦｖ抗体として、重鎖ＣＤＲ１（配列リストの第３配列）、重鎖ＣＤＲ２（配列リストの第４配列）、及び重鎖ＣＤＲ３（配列リストの第５配列）を含む重鎖可変領域（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ、配列リストの第１配列）と、軽鎖ＣＤＲ１（配列リストの第６配列）、軽鎖ＣＤＲ２（配列リストの第７配列）、及び軽鎖ＣＤＲ３（配列リストの第８配列）を含む配列リストの第２配列の軽鎖可変領域（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とを含むｓｃＦｖ抗体を選別した。選別されたｓｃＦｖ抗体は、重鎖ベクター（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖｅｃｔｏｒ）（図１ａ）と軽鎖ベクター（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖｅｃｔｏｒ）（図１ｂ）に挿入し、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡベクターをクローニングした。まず、ｓｃＦｖを暗号化するポリヌクレオチドをＰＣＲで増幅した。前記ｓｃＦｖのＣＤＲ領域の遺伝子を増幅するのに使用したプライマーの塩基配列は、次の通りである：
フォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）（ｇｔｇｇｃｃａｃａｇｃｇｇｃｃｇａｔｇｔｃｃａｃｔｃｇｇａａｇｔａｃａｇｔｔｇｇｔｃｇａａａｇｔｇｇｃ、配列リストの第９配列）、
リバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）（ｇａａｇａｃｃｇａｔｇｇｇｃｃｃｔｔｇｇｔｇｃｔａｇｃｃｇａｔｇａｇａｃｇｇｔｃａｃｔａａａｇｔｇｃｃ、配列リストの第１０配列）。

【0090】

ｓｃＦｖのＶＬ領域の遺伝子を増幅するのに使用したプライマーの塩基配列は、次の通りである：
フォワード（ｇｃｃａｃａｇｃｇｇｃｃｇａｔｇｔｃｃａｃｔｃｇｇａｃａｔｔｃａａａｔｇａｃｇｃａｇａｇｔｃｃｃｔｃ、配列リストの第１１配列）、
リバース（ｇａａｇａｃａｇａｔｇｇｔｇｃａｇｃｃａｃａｇａｔｃｔｔｔｔａａｔｔｔｃｃａｃｔｔｔａｇｔｔｃｃｃｔｇｃｃ、配列リストの第１２配列）。

【0091】

前記ｓｃＦｖ抗体を用いた単一クローン抗体（以下、ＧＫＢ１０１と命名する）の製造のために使用したＩｇＧ変換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）方法は、次の通りである：

【0092】

ＧＫＢ１０１のＩｇＧ変換のための重鎖と軽鎖は、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を発現する親ベクターであるｐＯｐｔｉＶＥＣとｐｃＤＮＡ ３．３でそれぞれ遺伝子を増幅した（図１ａ及び図１ｂ）。前記ＣＨ（ＶＨ３－２３）とＣＬ領域の遺伝子を増幅するのに使用したプライマー塩基配列は、次の通りである：
ＣＨフォワード（ｇｇｃａｃｔｔｔａｇｔｇａｃｃｇｔｃｔｃａｔｃｇｇｃｔａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃ、配列リストの第１３配列）、
ＣＨリバース（ｇｃｃａｃｔｔｔｃｇａｃｃａａｃｔｇｔａｃｔｔｃｃｇａｇｔｇｇａｃａｔｃｇｇｃｃｇｃｔｇｔｇｇｃｃａｃ、配列リストの第１４配列）、
ＣＬフォワード（ｇｇｃａｇｇｇａａｃｔａａａｇｔｇｇａａａｔｔａａａａｇａｔｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃ、配列リストの第１５配列）、
ＣＬリバース（ｇａｇｇｇａｃｔｃｔｇｃｇｔｃａｔｔｔｇａａｔｇｔｃｃｇａｇｔｇｇａｃａｔｃｇｇｃｃｇｃｔｇｔｇｇｃ、配列リストの第１６配列）。

【0093】

ＧＫＢ１０１のＩｇＧ変換のためのＦａｂ２（ＶＨ－１－６９）は、ＰＣＲを通じて増幅させ、挿入（Ｉｎｓｅｒｔ）としては、ＶＨ１－６９＿Ｆｏｒｗａｒｄ（ｇｔｇｇｃｃａｃａｇｃｇｇｃｃｇａｔｇｔｃｃａｃｔｃｇｃａａｇｔｔｃａｇｃｔｇｇｔｃｃａｇａｇｃｇｇｃ、配列リストの第１７配列）、ＶＨ１－６９＿Ｒｅｖｅｒｓｅ（ｇａａｇａｃｃｇａｔｇｇｇｃｃｃｔｔｇｇｔｇｃｔａｇｃｃｇａｔｇａｇａｃｇｇｔａａｃｃａｇａｇｔａｃｃｃ、配列リストの第１８配列）を、ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）としては、ＣＨ１－６９＿Ｆｏｒｗａｒｄ（ｇｃｃｇｃｔｃｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇａａｃｔｔｇｃｇａｇｔｇｇａｃａｔｃｇｇｃｃｇｃｔｇｔｇｇｃｃａｃｃ、配列リストの第１９配列）、ＣＨ１－６９＿Ｒｅｖｅｒｓｅ（ｇｇｇｔａｃｔｃｔｇｇｔｔａｃｃｇｔｃｔｃａｔｃｇｇｃｔａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃ、配列リストの第２０配列）を用いた。

【0094】

それぞれのベクターテンプレート（Ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｍｐｌａｔｅ）（ｐｃＤＮＡ３．３－Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ＿ＣＬ、ｐＯｐｔｉＶＥＣ－Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ＿ＣＨ）と挿入テンプレート（Ｉｎｓｅｒｔ ｔｅｍｐｌａｔｅ）（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ ｐｈａｇｅ ｖｅｃｔｏｒ）は、前記プライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌ）を用いて９５℃／３ｍｉｎ；９５℃／３０ｓｅｃ、６０℃／３０ｓｅｃ、７２℃／３０ｓｅｃ、３０ｃｙｃｌｅｓ；７２℃／５ｍｉｎの条件でＰＣＲを行い、ＧＫＢ１０１変換のためのＧＫＢ１０１のＶＨ、ＶＬ、ハーセプチン発現ベクターのＣＨ、ＣＬ及びＶＨ １－６９遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物は、ＤｐｎＩ制限酵素を用いてＩｇＧ生産に使用されるベクターに挿入した。前記製造された、ｓｃＦｖの可変領域を含むＩｇＧの軽鎖と重鎖を暗号化するＤＮＡを含むベクターは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に共同で形質転換させ、軽鎖と重鎖が細胞内で共に発現されるようにした。

【0095】

実施例２．一過性トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）及びカラムを用いた分離精製
一時的発現システムを通じたタンパク質の精製のために、ＥｘｐｉＨＥＫ２９３（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）細胞株とＦｒｅｅｓｔｙｐｅ２９３発現培地（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉａ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用した。トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）と、ＧＫＢ１０１の重鎖と軽鎖が１：１の比率のプラスミドＤＮＡを用いた。トランスフェクション後、細胞は、約５日間振盪培養し、細胞培養薬は、遠心分離を通じて上清液のみを回収し、これをタンパク質の分離及び精製過程に用いた。回収した上清液は、Ｈｉｔｒａｐ ＭａｂｓｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にローディングした後、ＰＢＳで洗浄しながら非特異的結合を除去し、１００ｍＭのクエン酸バッファー（Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ３．０）＋５０ｍＭのＮａＣｌを用いてカラムに特異的に結合するタンパク質を一次分離した。ＦＰＬＣで得た溶出液（Ｅｌｕｔｅ）は、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にローディングし、高純度のＧＫＢ１０１を得た。一時的発現システムの最適化コンディションを通じて得たＧＫＢ１０１の最終収得率は、５００ｍｌの細胞培養液を基準にして合計３７ｍｇで、内毒素は０．００２ＥＵ／ｇのレベルであった。

【0096】

前記過程を通じて製造されたＧＫＢ１０１抗体の配列は、次の通りである：

【表1】

【0097】

実施例３．ＧＫＢ１０１のターゲット結合力測定
１）ＳＰＲ：Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＧＥ Ｂｉｏａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いて結合力を測定した。バッファーとしては、ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ＧＫＢ１０１又は緩衝液の連続希釈液を３０μｌ／ｍｉｎの流速で１分～１０分間注入し、分析物によって２０分間洗浄した。

【0098】

２）ＥＬＩＳＡ：ＧＫＢ１０１を１μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）にコーティングした後、１％のＢＳＡが含まれているＰＢＳで常温で１時間にわたってブロッキングした。組換えＷＡＲＳ１タンパク質を濃度依存的に希釈し、コーティングされた各ウェルに入れてから常温で１時間にわたって反応させた後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。各ウェルに抗ＷＡＲＳ１抗体（Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ）を入れてから常温で１時間にわたって反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。ＨＲＰが付いている２次抗体で（ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、ｃｅｌｌ－ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）１時間にわたって反応させた後、ＰＢＳＴで洗浄した。ＴＭＢ基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（ＢＤ）で発色した後、４９０ｎｍで吸光度を測定した（ＶｅｒｓａＭａｘ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）。

【0099】

３）免疫ブロット（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）：ＷＡＲＳ１ヒト及びマウス組換えタンパク質の各２０ｎｇと、ＬＰＳで２４時間刺激を与えたヒト単核球細胞株ＴＨＰ－１とマウス大食細胞株Ｊ７７４．１Ａの細胞培養上清液の各３０μｇを８％のＳＤＳ－ＰＡＧＥにローディングした後、ＰＶＤＦメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移動した。メンブレンは、ＧＫＢ１０１ １μｇ／ｍｌで１時間にわたって反応させた後、ＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。２次抗体（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＨＲＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、１時間にわたって反応させた後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。その後、ＥＣＬ（Ｗｅｓｔ^（Ｒ） ｂｒｉｇｈｔ ＥＣＬ、Ａｄｖａｎｔａ）を用いて発色させた（ＬＡＳ－４０００、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）。

【0100】

４）結果：組換えＷＡＲＳ１タンパク質に対するＧＫＢ１０１の結合力を測定・比較した結果、ＥＬＩＳＡとＳＰＲの全てでヒトＷＡＲＳ１に強い結合力を示し、ヒトの組換えタンパク質に対しては約０．２ｎＭのレベル、マウス組換えタンパク質では約３．７６ｎＭの高い結合力をそれぞれ示した（図２ａ）。また、免疫ブロット実験において、組換えタンパク質だけでなく、ヒト単核球及びマウス大食細胞株の培養上清液内のＷＡＲＳ１をＧＫＢ１０１を通じて効果的に検出することができた（図２ｂ）。

【0101】

実施例４．ＷＡＲＳ１特異的抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ上での中和能検証
ＷＡＲＳ１特異的抗体であるＧＫＢ１０１がｉｎ ｖｉｔｒｏで中和能を有するかどうかを調査するために、マウス大食細胞株Ｊ７７４．１Ａを用いて実験を進行した。マウス大食細胞の培養液としては、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）の高グルコース（ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を使用した。１日前に、４８ウェル細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ）に１ウェル当たり８×１０^４の数の細胞を敷いた後、細胞は、抗原－抗体混合物を細胞に処理する２時間前にプレーンＤＭＥＭに敷いた。組換えタンパク質ＷＡＲＳ１ ２００ｎＭとＧＫＢ１０１を濃度別に混ぜてから、３７℃のインキュベーターで２時間にわたって混合した後、各細胞が敷かれているウェルに混合物をそれぞれ追加的に入れた。約１５時間後、培養液を遠心分離しながら上清液を取得し、これを用いてＣＸＣＬ２（Ｒ＆Ｄ）及びＴＮＦ－α（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を測定した。ＥＬＩＳＡは、各製造社の方法論に従って進行した。

【0102】

マウスの大食細胞において、ＧＫＢ１０１は、２００ｎＭのＷＡＲＳ１に対してモル数比率依存的に、ＴＮＦ－αの分泌が１：２．５と１：５で有意に減少した（図３ａ）。ｍＣＸＣＬ２（ｍｏｕｓｅ ＩＬ－８ ｈｏｍｏｌｏｇ）において１：５と１：２．５で減少する傾向を示し、１：２．５で統計的に有意な差を示した（図３ｂ）。全ての結果は、ＡＮＯＶＡ統計プログラムを使用して分析した。

【0103】

実施例５．ＷＡＲＳ１特異的抗体が、バクテリア感染したネズミの生存率に及ぼす影響
マウスにＣＳを注入し、重症敗血症を誘発した後、ＰＢＳ又はＧＫＢ１０１は、ＣＳを腹腔に注入してから４時間又は２０時間に２．５ｍｇ／ｋｇでそれぞれｉ.ｖで２回ずつ注入し、６０時間まで生存分析を実施した。

【0104】

ＷＡＲＳ１及びサイトカイン分析：ＧＫＢ１０１のＷＡＲＳ１の中和能を確認するために５時間、１１時間、１８時間及び２０時間にわたって腹腔液及び血液を採取し、これを用いてＷＡＲＳ１（ｉｎ ｈｏｕｓｅ）及びＴＮＦ－α（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＭＩＰ－１α（Ｒ＆Ｄ）、ｍＩＬ－６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ｍＣＸＣＬ２（ＩＬ－８ ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｒ＆Ｄ）をＥＬＩＳＡで測定した。ＷＡＲＳ１を除外したサイトカインＥＬＳＩＡは、各製造社の方法論に従って進行した。ＷＡＲＳ１の測定は、次の通りである：ＧＫＢ１０１を１μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェル（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）にコーティングした後、１％のＢＳＡが含まれているＰＢＳで常温で１時間にわたってブロッキングした。プラズマ、腹腔液サンプル及び組換えマウス組換えタンパク質を希釈したスタンダードをそれぞれブロッキングしたウェルに入れ、常温で１時間にわたって反応させた後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。各ウェルに抗ＷＡＲＳ１抗体（Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ）を入れてから常温で１時間にわたって反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。ＨＲＰが付いている２次抗体で（ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、ｃｅｌｌ-ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）１時間にわたって反応させた後、ＰＢＳＴで洗浄した。ＴＭＢ基質（ＢＤ）で発色した後、４９０ｎｍで吸光度を測定した（ＶｅｒｓａＭａｘ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）。

【0105】

血液を用いた生化学的検査：血液の一部をクロットアクティベーター（ｃｌｏｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）が入っているバキュテナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）に注入し、１０分乃至１５分間常温に放置して凝固させた。その後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得た血清で血液生化学分析機（７１８０ Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｊａｐａｎ）を使用してＡＳＴ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＡＬＴ（ａｌａｎｉｎ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＢＵＮ（ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）、及びクレアチニンを測定した。

【0106】

ＧＫＢ１０１がネズミの生存率に及ぼす影響を確認するために、図４ａの実験概要によってネズミを用いた動物実験を進行し、生存分析を実施した。ネズミの腹腔にＣＳ（Ｃｅｃａｌ ｓｌｕｒｒｙ）を注入し、重症敗血症を誘発したネズミにＰＢＳ又はＧＫＢ１０１を４時間及び２０時間にそれぞれｉ.ｖで注射した。感染後、６０時間までネズミの生存率を示した。その結果、ＣＳ＋ＰＢＳ（重症敗血症の誘発後にＰＢＳ注射）は、生存率が２９時間に５０％で、４１時間に２０％であったが、ＣＳ＋ＧＫＢ１０１（重症敗血症の誘発後にＧＫＢ１０１注射）は、生存率が２９時間に８０％、４１時間には５０％であって、生存率がＰＢＳより増加した。腹腔液（図４ｃ）及びプラズマ（図４ｂ）において、ＷＡＲＳ１の濃度がＧＫＢ１０１によって１１時間又は１８時間に有意に減少し、腹腔液内に分泌されたＩＬ－８（図４ｅ）、ＩＬ－６（図４ｆ）、ＭＩＰ－１α（図４ｄ）、ＴＮＦ－α（図４ｇ）も、１１時間又は１８時間に有意に減少することが確認された。ＡＬＴ（図４ｈ）、ＡＳＴ（図４ｉ）、ＢＵＮ（図４ｊ）、クレアチニン（図４ｋ）で相対的に減少した傾向を示し、ＡＬＴ、ＢＵＮの１１時間の場合、ＰＢＳに比べてＧＫＢ１０１注入群で有意に減少する傾向を示した。全ての結果は、ＡＮＯＶＡ統計プログラムを使用して分析した（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。

【0107】

実施例６．ＷＡＲＳ１特異的抗体が、バクテリア感染したネズミの生存率に及ぼす影響２
マウスにＣＳを注入し、重症敗血症を誘発した後、アイソタイプＩｇＧ又はＧＫＢ１０１は、４時間、８時間及び１２時間にそれぞれ５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇで、全てのマウス当たり１０ｍｇ／ｋｇでそれぞれｉ．ｐで３回注入し、７２時間まで生存分析を実施した。

【0108】

ＷＡＲＳ１及びサイトカイン分析：ＧＫＢ１０１のＷＡＲＳ１の中和能を確認するために腹腔に注入した後、２時間後である６時間、１０時間及び１４時間に腹腔液及び血液を採取し、これを用いてＷＡＲＳ１（ｉｎ ｈｏｕｓｅ）及びＴＮＦ－α（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＭＩＰ－１α（Ｒ＆Ｄ）、ｍＩＬ－６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ｍＣＸＣＬ２（ＩＬ－８ ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｒ＆Ｄ）をＥＬＩＳＡで測定した。ＷＡＲＳ１を除外したサイトカインＥＬＳＩＡは、各製造社の方法論に従って進行した。ＷＡＲＳ１の測定は、次の通りである：ＧＫＢ１０１を１μｇ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）にコーティングした後、１％のＢＳＡが含まれているＰＢＳで常温で１時間にわたってブロッキングした。プラズマ、腹腔液サンプル及び組換えマウス組換えタンパク質を希釈したスタンダードをそれぞれブロッキングしたウェルに入れてから、常温で１時間にわたって反応させた後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。各ウェルに抗ＷＡＲＳ１抗体（Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ）を入れてから常温で１時間にわたって反応させた後、ＰＢＳＴで４回洗浄した。ＨＲＰが付いている２次抗体で（ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、ｃｅｌｌ－ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）１時間にわたって反応させた後、ＰＢＳＴで洗浄した。ＴＭＢ基質（ＢＤ）で発色した後、４９０ｎｍで吸光度を測定した（ＶｅｒｓａＭａｘ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）。

【0109】

ＧＫＢ１０１がネズミの生存率に及ぼす影響を確認するために、図５ａの実験概要によってネズミを用いた動物実験を進行し、生存分析を実施した。ネズミの腹腔にＣＳ（Ｃｅｃａｌ ｓｌｕｒｒｙ）を注入し、重症敗血症を誘発したネズミにアイソタイプＩｇＧ又はＧＫＢ１０１を４時間、８時間及び１２時間にそれぞれｉ．ｐで注射した。感染後、７２時間までネズミの生存率を示した。その結果、ＣＳ＋アイソタイプＩｇＧ（重症敗血症の誘発後、アイソタイプＩｇＧ注射）は、生存率が２８時間に２０％で、３６時間に１０％であったが、ＣＳ＋ＧＫＢ１０１（重症敗血症の誘発後、ＧＫＢ１０１注射）は、生存率が２８時間に８０％、３６時間には７０％であって、生存率がアイソタイプＩｇＧより著しく増加した（図５ａ）。腹腔液（図５ｃ）及びプラズマ（図５ｂ）において、ＷＡＲＳ１の濃度がＧＫＢ１０１によって６時間、１０時間及び１４時間に減少し、腹腔液内に分泌されたＩＬ－８（図５ｅ）、ＩＬ－６（図５ｆ）、ＭＩＰ－１α（図５ｄ）、ＴＮＦ－α（図５ｇ）も、ＧＫＢ１０１の注入後に減少する傾向を示し、特に、１４時間にＩＬ－８、ＭＩＰ－１α、ＴＮＦ－αで有意に減少した。ＡＬＴ（図５ｈ）、ＡＳＴ（図５ｉ）、ＢＵＮ（図５ｊ）、クレアチニン（図５ｋ）で相対的に減少した傾向を示し、ＡＬＴ、ＢＵＮの１４時間の場合、アイソタイプＩｇＧに比べてＧＫＢ１０１注入群で有意に減少する傾向を示した。全ての結果は、ＡＮＯＶＡ統計プログラムを使用して分析した（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。

【0110】

実施例７．ＷＡＲＳ１特異的抗体及び抗生剤が、バクテリア感染したネズミの生存率に及ぼす影響
ＣＳを注入し、重症敗血症を誘発したマウスに抗生剤（ゲンタマイシン）を投与した後、アイソタイプＩｇＧ又はＧＫＢ１０１は、４時間、８時間又は２０時間にそれぞれ５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇで、全てのマウス当たり１０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖで注入し、７２時間まで生存分析を実施した。

【0111】

ＣＳ誘発マウスにおいて、ＧＫＢ１０１の抗生剤併用効果による生存率を分析した結果、ＧＫＢ１０１投与群では、２４時間には８０％で、７２時間には７０％であって、アイソタイプＩｇＧ投与群との間で有意な生存率の差を示した。全ての結果は、ＡＮＯＶＡ統計プログラムを使用して分析した（図６）。

【0112】

実施例８．マーモセットのエンドトキセミアモデルを用いたＧＫＢ１０１の効能検証
マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）は、五松先端医療産業振興財団の実験動物センター（忠北、大韓民国）から入手した。全ての一般的なマーモセットは、ステンレススチールケージで飼育された。ＳＰＦ動物施設において、１２時間の夜明けと１２時間の夕暮れの条件の温度２７±２℃、湿度３０％乃至７０％で、一般的なマーモセットは、標準マーモセット食餌（非ヒト霊長類－維持管理、＃０６３９；Ａｌｔｒｏｍｉｎ、Ｌａｇｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と水を任意に提供した。全てのプロトコルは、五松先端医療産業振興財団の実験動物センターの動物保護委員会の承認を受けた。ＬＰＳをマーモセットに注入した後、エンドトキセミアを誘発した後、ＰＢＳ又はＧＫＢ１０１を０．２時間及び２時間に２回、合計２ｍｇ／ｋｇでｉ.ｖ注入してから２４時間にわたって観察した。

【0113】

マーモセットのエンドトキセミアモデルでの血中免疫細胞の数を確認した結果、抗ＷＡＲＳ１抗体を投与した群では、１２時間にＷＢＣと好中球が有意に増加した（＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１）。また、血液でＧＫＢ１０１投与がＷＡＲＳ１、サイトカイン及びケモカインの発現に及ぼす影響を比較した結果、血液タンパク質内の抗ＷＡＲＳ１抗体であるＧＫＢ１０１を投与した実験群では、ＷＡＲＳ１が０．５時間、１時間、２時間、４時間及び８時間に有意に減少し（＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）、ＴＮＦ－αは１時間及び２時間に有意に減少した（２時間、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）。全ての結果は、ＡＮＯＶＡ統計プログラムを使用して分析した（図７）。

【0114】

前記実施例の各結果によると、ＧＫＢ１０１がＷＡＲＳ１にシングルｎＭ以下の強い結合力を有しており、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ上でＷＡＲＳ１によって発現されるサイトカインの発現を減少させる中和能を有している。以上説明したように、本発明の組成物は、感染に対して初期過炎症を誘発する最上位物質であるＷＡＲＳ１を特異的に検出し、これを標的に抑制する抗体医薬品としての開発目的で使用され得る、産業上の利用可能性が高いものと期待される。

【0115】

以上、本発明の各実施例に対して説明したが、該当の技術分野で通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載の本発明の思想から逸脱しない範囲内で、構成要素の付加、変更、削除又は追加などによって本発明を多様に修正及び変更可能であり、これも本発明の権利範囲内に含まれると言えるだろう。

【図1a】

【図1b】

【図2a】

【図2b】

【図3a】

【図3b】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図4e】

【図4f】

【図4g】

【図4h】

【図4i】

【図4j】

【図4k】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図5e】

【図5f】

【図5g】

【図5h】

【図5i】

【図 】

【図5j】

【図5k】

【図6a】

【図6b】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図7d】

【図7e】

【図7f】

【図7g】

【配列表】

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