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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-19
(45)【発行日】2024-11-27
(54)【発明の名称】抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/40 20060101AFI20241120BHJP
C07K 16/12 20060101ALI20241120BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241120BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241120BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241120BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241120BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241120BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241120BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241120BHJP
【ＦＩ】
C07K16/40 ZNA
C07K16/12
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/13
C12P21/08
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2021526467
(86)(22)【出願日】2019-10-01
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-01
(86)【国際出願番号】 CN2019109791
(87)【国際公開番号】W WO2020125135
(87)【国際公開日】2020-06-25
【審査請求日】2021-05-12
【審判番号】
【審判請求日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】201811566184.2
(32)【優先日】2018-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】521204910
【氏名又は名称】ファポン バイオテック インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＦＡＰＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002066
【氏名又は名称】弁理士法人筒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ツァイ，ペン
(72)【発明者】
【氏名】フー，ジーチアン
(72)【発明者】
【氏名】メン，ユアン
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ドンメイ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ハオ
(72)【発明者】
【氏名】リアン，ビー
(72)【発明者】
【氏名】ヨウ，フイ
(72)【発明者】
【氏名】マー，チウヤン
(72)【発明者】
【氏名】リー，ウェイジー
【合議体】
【審判長】上條 肇
【審判官】深草 亜子
【審判官】福井 悟
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０７８２８７５５（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０８５４６７４９（ＣＮ，Ａ）
【文献】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９４，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．５，ｐｐ．５０６－５０９
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12N1/00-7/08
C07K1/00-19/00
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの抗原結合ドメインを含む分離された結合タンパク質であって、前記抗原結合ドメインは、下記アミノ酸配列から選ばれる６つの相補性決定領域を含み、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１は、Ｓ－Ｖ－Ｘ１－Ｔ－Ｆ－Ｘ２－Ｔ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｙであり、ここで、Ｘ１はＤ、Ｅ又はＮであり、Ｘ２はＳ又はＴであり、Ｘ３はＩであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２は、Ｇ－Ｘ１－Ｎ－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｘ２－Ｐ－Ｖ－Ｆ－Ｘ３－Ｅ－Ｋであり、ここで、Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＮ又はＧＧであり、Ｘ３はＮであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３は、Ｔ－Ｒ－Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｒ－Ｒ－Ｇ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｄ－Ｙであり、ここで、Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３はＦであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１は、Ｒ－Ｘ１－Ｓ－Ｑ－Ｄ－Ｉ－Ｘ２－Ｎ－Ｙ－Ｘ３－Ｎであり、ここで、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＮ又はＱであり、Ｘ３はＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２は、Ｉ－Ｙ－Ｘ１－Ｔ－Ｓ－Ｒ－Ｌ－Ｘ２－Ｓ－Ｇ－Ｘ３－Ｐであり、ここで、Ｘ１はＹであり、Ｘ２はＱ、Ｈ又はＮであり、Ｘ３はＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３は、Ｑ－Ｄ－Ｄ－Ｔ－Ｘ１－Ｐ－Ｘ２－Ｔ－Ｘ３－Ｇであり、ここで、Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３はＦであり、
前記６つの相補性決定領域の突然変異部位は、下記の突然変異の組み合わせから選ばれるいずれか１種であり、
前記結合タンパク質は、配列が順に配列番号１～４に示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４、並びに／又は、配列が順に配列番号５～８に示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含む、ことを特徴とする結合タンパク質。
【請求項2】
前記結合タンパク質はＦ(ａｂ’)2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体の最小認識単位のうちの１つであることを特徴とする請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項3】
前記結合タンパク質は、さらに抗体定常領域配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の結合タンパク質。
【請求項4】
前記定常領域配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれるいずれか１つの定常領域の配列である、ことを特徴とする請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項5】
前記定常領域はウシ、ウマ、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ラクダ、ロバ、シカ、テン、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、シャモ又はヒトの物種に由来する、ことを特徴とする請求項３に記載の結合タンパク質。
【請求項6】
前記定常領域はマウスに由来し、軽鎖定常領域配列は配列番号９に示され、
重鎖定常領域配列は配列番号１０に示されることを特徴とする請求項５に記載の結合タンパク質。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質をコードすることを特徴とする分離された核酸。
【請求項8】
請求項７に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項9】
請求項７に記載の核酸又は請求項８に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項10】
培地において請求項９に記載の宿主細胞を培養し、産生された結合タンパク質を培地から又は培養された宿主細胞から回収するステップを含むことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質の生産方法。
【請求項11】
ＰＣＲにおける請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質の使用。
【請求項12】
請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質、請求項１０に記載の分離された核酸又は請求項１１に記載のベクターの１種又は複数種を含むことを特徴とするキット。
【請求項13】
請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質と、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼとを含む組成物。
【請求項14】
さらに４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、プライマー、プローブ、ＭｇＣｌ２、または鋳型としての核酸を含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質又は請求項１３又は１４に記載の組成物を用いてホットスタートＰＣＲを行うことを含む核酸増幅方法。
【請求項16】
前記ホットスタートＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ及びリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選ばれる請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
核酸を増幅させるための、請求項１～６のいずれか１項に記載の結合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本願は２０１８年１２月２０日に中国国家知識産権局に提出された出願番号が２０１８１１５６６１８４.２で、発明の名称が「抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗体及びその用途」である中国特許出願の優先権を主張し、その全内容は引用によりに組み込まれる。
本願は２０１８年１２月２０日に中国国家知識産権局に提出された出願番号が２０１８１１５６６１８４.２で、発明の名称が「抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗体及びその用途」である中国特許出願の優先権を主張し、その全内容は引用によりに組み込まれる。
【0002】
本開示は生物工学及び医療技術分野に関し、特に抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗体及びその用途に関する。
【背景技術】
【0003】
Ｒａｎｄａｌｌ Ｋ．Ｓａｉｋｉらが１９８８年にテルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）に対する分離・精製でＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを得た。Ｔａｑポリメラーゼは活性を失わずに９０℃以上の高温に耐えられ、これは高温環境を必要とするＰＣＲ反応にとって特に重要である。したがって、ＴａｑポリメラーゼはこれまでにＰＣＲ反応によく使用される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中のＤＮＡポリメラーゼに取って代わっている。ＰＣＲ反応でＴａｑポリメラーゼを用いる場合、サイクルごとに酵素を加える必要がないため、ＰＣＲ技術は実行しやすく、コストが大幅に低下し、幅広く用いられるようになり、臨床的にも利用される。しかしＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは使用中にいくつかの欠点がある。即ち、常温で一定の酵素特性を有するため、ＰＣＲ増幅プロセスでの非特異的な増幅及びプライマー二量体の形成を招いて、長期安定性に問題がある。
【0004】
よって、ＰＣＲ技術の利用拡大とＰＣＲ増幅の品質要件の向上に伴い、新たな方法と技術が次々と開発され、中でもホットスタート酵素技術が登場して以来、通常のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの酵素特性が確実に改善されている。現在よく用いられる方法として、抗体修飾によるホットスタート酵素、化学修飾によるホットスタート酵素があり、このうち抗体修飾によるホットスタート酵素の方が一般的に用いられる。
【0005】
抗体修飾によるホットスタート酵素は、特異性Ｔａｑ酵素が用いられたモノクローナル抗体であり、特異性Ｔａｑ酵素のモノクローナル抗体がＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと結合すると抗原抗体複合体が形成され、室温でＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの活性を効果的にブロックして、低温ではポリメラーゼ活性を発揮しないようにし、高温では、当該複合体が解離し、活性を有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを放出してから、ＰＣＲ増幅反応が行われるため、プライマー二量体の形成が効果的に避けられ、非特異的産物の増幅が緩和されるとともに、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの長期安定性が改善される。
【0006】
抗体修飾によるホットスタート酵素に使用される特異性Ｔａｑ酵素の抗体にはさらなる開発の余地がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本開示はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗原結合ドメインを含む分離された新規結合タンパク質に関し、当該結合タンパク質の製造、用途などについて研究する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
前記抗原結合ドメインは、下記アミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含むか、又は下記アミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し且つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに対してＫD≦８.５６８×１０-9mol/Lの親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１は、Ｓ－Ｖ－Ｘ１－Ｔ－Ｆ－Ｘ２－Ｔ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｙであり、ただし、 Ｘ１はＤ、Ｅ又はＮであり、Ｘ２はＳ又はＴであり、Ｘ３はＩ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２は、Ｇ－Ｘ１－Ｎ－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｘ２－Ｐ－Ｖ－Ｆ－Ｘ３－Ｅ－Ｋであり、ただし、 Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＮ又はＧＧであり、Ｘ３はＤ、Ｅ又はＮであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３は、Ｔ－Ｒ－Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｒ－Ｒ－Ｇ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｄ－Ｙであり、ただし、 Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３はＦ又はＰであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１は、Ｒ－Ｘ１－Ｓ－Ｑ－Ｄ－Ｉ－Ｘ２－Ｎ－Ｙ－Ｘ３－Ｎであり、ただし、 Ｘ１はＡ又はＧであり、Ｘ２はＮ又はＱであり、Ｘ３はＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２は、Ｉ－Ｙ－Ｘ１－Ｔ－Ｓ－Ｒ－Ｌ－Ｘ２－Ｓ－Ｇ－Ｘ３－Ｐであり、ただし、 Ｘ１はＹ又はＦであり、Ｘ２はＱ、Ｈ又はＮであり、Ｘ３はＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３は、Ｑ－Ｄ－Ｄ－Ｔ－Ｘ１－Ｐ－Ｘ２－Ｔ－Ｘ３－Ｇであり、ただし、 Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３はＷ又はＦである。
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１は、Ｓ－Ｖ－Ｘ１－Ｔ－Ｆ－Ｘ２－Ｔ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｙであり、ただし、 Ｘ１はＤ、Ｅ又はＮであり、Ｘ２はＳ又はＴであり、Ｘ３はＩ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２は、Ｇ－Ｘ１－Ｎ－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｘ２－Ｐ－Ｖ－Ｆ－Ｘ３－Ｅ－Ｋであり、ただし、 Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＮ又はＧＧであり、Ｘ３はＤ、Ｅ又はＮであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３は、Ｔ－Ｒ－Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｒ－Ｒ－Ｇ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｄ－Ｙであり、ただし、 Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３はＦ又はＰであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１は、Ｒ－Ｘ１－Ｓ－Ｑ－Ｄ－Ｉ－Ｘ２－Ｎ－Ｙ－Ｘ３－Ｎであり、ただし、 Ｘ１はＡ又はＧであり、Ｘ２はＮ又はＱであり、Ｘ３はＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２は、Ｉ－Ｙ－Ｘ１－Ｔ－Ｓ－Ｒ－Ｌ－Ｘ２－Ｓ－Ｇ－Ｘ３－Ｐであり、ただし、 Ｘ１はＹ又はＦであり、Ｘ２はＱ、Ｈ又はＮであり、Ｘ３はＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３は、Ｑ－Ｄ－Ｄ－Ｔ－Ｘ１－Ｐ－Ｘ２－Ｔ－Ｘ３－Ｇであり、ただし、 Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３はＷ又はＦである。
【0009】
１つの大きな利点は、前記結合タンパク質は活性が強く、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに対して非常に高い親和性を有することである。
【0010】
１つ又は複数の実施形態では、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ３はＩであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ３はＮであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ３はＦであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ１はＡであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ１はＹであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ３はＦである。
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ３はＩであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ３はＮであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ３はＦであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ１はＡであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ１はＹであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ３はＦである。
【0011】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＳである。
【0012】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＥであり、Ｘ２はＳである。
【0013】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＳである。
【0014】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＴである。
【0015】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＥであり、Ｘ２はＴである。
【0016】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＴである。
【0017】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＮである。
【0018】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＧＧである。
【0019】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＮである。
【0020】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＧＧである。
【0021】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＮである。
【0022】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＧＧである。
【0023】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＩである。
【0024】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＶである。
【0025】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＬである。
【0026】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＩである。
【0027】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＶである。
【0028】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＬである。
【0029】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＩである。
【0030】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＶである。
【0031】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＬである。
【0032】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＩである。
【0033】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＶである。
【0034】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＬである。
【0035】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＩである。
【0036】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＶである。
【0037】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＬである。
【0038】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＩである。
【0039】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＶである。
【0040】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＬである。
【0041】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＨであり、Ｘ３はＩである。
【0042】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＨであり、Ｘ３はＶである。
【0043】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＨであり、Ｘ３はＬである。
【0044】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＩである。
【0045】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＶである。
【0046】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＬである。
【0047】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＩである。
【0048】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＶである。
【0049】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＬである。
【0050】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＩである。
【0051】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＶである。
【0052】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＬである。
【0053】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＩである。
【0054】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＶである。
【0055】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＬである。
【0056】
１つ又は複数の実施形態では、各相補性決定領域の突然変異部位は、下記の突然変異の組み合わせから選ばれるいずれか１種である。
【0057】
【0058】
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質は少なくとも３つのＣＤＲを含み、又は、前記結合タンパク質は少なくとも６つのＣＤＲを含む。
【0059】
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質は可変領域及び定常領域を含む完全な抗体である。
【0060】
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質はナノボディ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体の最小認識単位のうちの１つである。
【0061】
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質は配列が順に配列番号１～４に示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４、及び／又は、配列が順に配列番号５～８に示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質はさらに抗体定常領域配列を含む。
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質はさらに抗体定常領域配列を含む。
【0062】
１つ又は複数の実施形態では、前記定常領域配列はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれるいずれか１つの定常領域の配列である。
【0063】
１つ又は複数の実施形態では、前記定常領域はウシ、ウマ、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ラクダ、ロバ、シカ、テン、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、シャモ又はヒトの物種に由来する。
【0064】
１つ又は複数の実施形態では、前記定常領域はマウスに由来し、
軽鎖定常領域配列は配列番号９に示され、
重鎖定常領域配列は配列番号１０に示される。
軽鎖定常領域配列は配列番号９に示され、
重鎖定常領域配列は配列番号１０に示される。
【0065】
本開示はさらに、前記結合タンパク質をコードする分離された核酸を提供する。
【0066】
本開示はさらに、前記核酸を含むベクターを提供する。
【0067】
本開示の発現ベクターは形質転換宿主細胞に用いられる。このような形質転換細胞は本開示に含まれており、本開示の核酸断片及びベクターを増殖させるために用いられ、もしくは本開示のポリペプチドの培養細胞又は細胞株の組換え製造に用いられてもよい。
【0068】
本開示はさらに、培地において前記宿主細胞を培養し、産生された結合タンパク質を培地から又は培養された宿主細胞から回収するステップを含む前記結合タンパク質の生産方法を提供する。
本開示はさらに、ＰＣＲにおける前記結合タンパク質の使用を提供する。
本開示はさらに、ＰＣＲにおける前記結合タンパク質の使用を提供する。
【0069】
本開示はさらに、前記キットは前記結合タンパク質、前記分離された核酸又は前記ベクターの１種又は複数種を含むことを特徴とするキットを提供する。
【0070】
本開示はさらに、本開示に記載の結合タンパク質とＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとを含む組成物を提供する。
【0071】
１つ又は複数の実施形態では、前記組成物はさらに４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。
【0072】
１つ又は複数の実施形態では、前記組成物はさらにプライマー及び／又はプローブを含む。
【0073】
１つ又は複数の実施形態では、前記組成物はさらにＭｇＣｌ2を含む。
【0074】
１つ又は複数の実施形態では、前記組成物はさらに鋳型としての核酸を含む。
【0075】
本開示はさらに、本開示に記載の結合タンパク質又は本開示に記載の組成物を用いてホットスタートＰＣＲを行うことを含む核酸増幅方法を提供する。
【0076】
１つ又は複数の実施形態では、ホットスタートＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ及びリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選ばれる。
【0077】
本開示はさらに、試料中のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの検出方法であって、
ａ）抗体／抗原結合反応を行わせるのに十分な条件で、前記試料中のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを本開示の結合タンパク質に接触させて免疫複合体を形成するステップと、
ｂ）前記免疫複合体の存在を検出し、前記複合体が存在することは前記試料に前記Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが存在することを示すステップと、を含む方法を提供する。
ａ）抗体／抗原結合反応を行わせるのに十分な条件で、前記試料中のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを本開示の結合タンパク質に接触させて免疫複合体を形成するステップと、
ｂ）前記免疫複合体の存在を検出し、前記複合体が存在することは前記試料に前記Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが存在することを示すステップと、を含む方法を提供する。
【0078】
１つ又は複数の実施形態では、前記免疫複合体はさらに前記結合タンパク質に結合する第２抗体を含む。
【0079】
１つ又は複数の実施形態では、ステップａ）で、前記免疫複合体はさらに前記Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに結合する第２抗体を含む。
【0080】
本開示はさらに、核酸を増幅させるための本明細書に記載の結合タンパク質の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0081】
次に、本開示の特定の実施形態又は従来技術に係る技術案を一層明瞭に説明するために、特定の実施形態又は従来技術の説明で用いる図面を簡単に説明し、言うまでもないが、次に記載される図面は本開示のいくつかの実施形態であり、当業者が新規性のある作業をしなくても、これらの図面から他の図面を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【0082】
本開示は本開示のいくつかの実施形態に関する次の説明及び言及される実施例の詳細な内容から理解しやすくなるだろう。
【0083】
本開示のさらなる説明を行う前に理解されたいのは、実施形態と言っても様々な形態があるため、本開示は特定の実施形態に限定されないことである。さらに理解されたいのは、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明するためのもので、本開示の範囲は特許請求の範囲によって限定されるため、前記用語は限定させるために使用するものではない。
【0084】
本明細書で特に定義がない限り、本開示で使用される科学用語及び技術用語は当業者が理解する通常の意味を有する。用語の意味及び範囲は明瞭にすべきであり、ただし不明瞭になる恐れがある場合は、本明細書に記載の定義は辞書又は外部の定義より優先する。本願で、特に説明がない限り、「又は」は「及び／又は」の意味で使用される。また、用語「含む」及びその他形態は非限定的に使用される。
【0085】
一般に、本明細書に記載の細胞と組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学とタンパク質－核酸化学及びハイブリダイゼーションで用いられる命名法及び関連の技術は本分野で周知され、一般的に用いられるものである。特に説明がない限り、本開示の方法及び技術は一般に本分野で周知され、しかも一般的な及びより具体的な参照文献に記載の通常の方法に従って行われ、前記参照文献は本明細書の全体に組み込まれ、検討される。酵素反応及び精製技術はメーカーの取扱説明書、本分野で通常の実施形態又は本明細書の記載に従って行われる。本明細書の説明で言及される分析化学、有機合成化学、医学及び製薬化学で用いられる命名法、その実験手順及び技術は本分野で周知され、一般的に利用されるものである。
【0086】
本開示を理解しやすいように選択された用語は、次の定義を有する。
【0087】
用語「アミノ酸」は天然に存在する又は天然には存在しないカルボキシルα－アミノ酸を表す。用語「アミノ酸」は本願で用いられる場合、天然に存在するアミノ酸及び天然には存在しないアミノ酸を含む。天然に存在するアミノ酸はアラニン（３文字略号はＡ１ａ、１文字略号はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、ｃ）、グルタミン（Ｇ１ｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇ１ｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇ１ｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉ１ｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、バリン（Ｖａ１、Ｖ）を含む。天然には存在しないアミノ酸はα－アミノアジピン酸、アミノ酪酸、シトルリン、ホモシトルリン、ホモロイシン、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、ピリジルアラニン、サルコシンなどを含み、これらに限定されない。
【0088】
用語「分離された結合タンパク質」とは、誘導起源又は由来のため、天然の状態において付随する天然結合成分と結合されないタンパク質、同じ種からの他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質、異なる種の細胞によって発現されたタンパク質、又は自然界に存在しないタンパク質である。したがって、化学合成されたタンパク質又は天然由来細胞と異なる細胞系において合成されたタンパク質は、その天然結合成分と「分離された」ものである。また、分離、例えば本分野で周知されるタンパク質精製技術により、天然結合成分を実質的に含まないタンパク質であってもよい。
【0089】
用語「抗原結合ドメインを含む分離された結合タンパク質」とは一般にＣＤＲ領域を含むあらゆるタンパク質／タンパク質断片をいう。用語「抗体」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体の抗原化合物結合断片を含み、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、抗体の最小認識単位、及びこれらの抗体と断片の一本鎖誘導体を含む。抗体のタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれる。また、用語「抗体」は天然に存在する抗体及び天然には存在しない抗体を含み、例えばキメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）、二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、及び関連の合成アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）を含む。用語「抗体」は「免疫グロブリン」と入れ替えて使用する。
【0090】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインをいう。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」とも呼ばれる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」とも呼ばれる。これらのドメインは一般に抗体の最も可変的な部分で、しかも抗原結合部位を含む。軽鎖又は重鎖可変領域は、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とこれらを分断したフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）とから構成される。抗体のフレームワーク領域、即ち構成要素である軽鎖と重鎖の組み合わせのフレームワーク領域は、ＣＤＲを位置決め及び整列する役割を果たし、前記ＣＤＲは主に抗原に結合するように機能する。
【0091】
本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」、「骨格領域」、又は「ＦＲ」は抗体可変ドメインにおけるＣＤＲとして定義された領域を除いた領域を意味する。各抗体可変ドメインのフレームワーク領域はさらにＣＤＲによって分断された隣接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分けられる。
【0092】
一般には、重鎖及び軽鎖の可変領域ＶＬ／ＶＨは、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４に示す順番でＣＤＲとＦＲが組み合わせて接続されたものであってもよい。
【0093】
本明細書で使用される場合、ポリペプチド又は核酸に関連する用語「精製された」又は「分離された」とはポリペプチド又は核酸が天然の環境にない又は天然の状態ではないことをいう。したがって、用語「分離された」はその由来環境、例えば、天然に存在する場合は、天然環境から取り出されたポリペプチド又は核酸を含む。例えば、分離されたポリペプチドは通常、一般的にそれと結合もしくは混合している又は溶液中の少なくとも特定のタンパク質もしくはその他細胞成分を含まない。分離されたポリペプチドは細胞溶解物に含まれる天然に産生した前記ポリペプチド、精製された又は部分的に精製された前記ポリペプチド、組換えポリペプチド、細胞によって発現又は分泌された前記ポリペプチド、及び異種宿主細胞もしくは培養物における前記ポリペプチドを含む。核酸に関連して使用される場合、用語「分離された」又は「精製された」とは、例えば前記核酸がその天然のゲノムにないことをいう（例えば、ベクターにおいて、発現カセットとしてプロモーターに接続され、又は人工的に異種宿主細胞に導入されている）。
【0094】
本明細書で使用される用語「二重特異性抗体」又は「二機能性抗体」とは、２対の異なる重鎖／軽鎖及び２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド結合タンパク質をいう。二重特異性結合タンパク質は、融合ハイブリドーマ又はＦａｂ’断片接続など様々な方法より生成されてもよい。
【0095】
本明細書で使用される用語「配列同一性」とは少なくとも２種の異なる配列間の類似性をいう。このパーセンテージ同一性は、例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズム、又はＭｅｙｅｒｓらのアルゴリズムなどの標準的なアルゴリズムにより決定されてもよい。１つ又は複数の実施形態では、パラメータセットはＢｌｏｓｕｍ ６２スコアリング行列及びギャップペナルティ１２、ギャップ伸張ペナルティ４、フレームシフトギャップペナルティ５であってもよい。
【0096】
１つ又は複数の実施形態では、２種のアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセンテージ同一性はＭｅｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７）のアルゴリズムより決定されてもよく、当該アルゴリズムは既にＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２.０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重み付き残差表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４が用いられる。パーセンテージ同一性は一般に長さが近い配列の比較により計算される。
【0097】
本明細書で使用される用語「親和性」とはタンパク質又は抗体に結合する抗原結合ドメインと抗原又はエピトープの結合強度をいう。親和性はＫＤ値で示してもよく、ＫＤ値が小さい方は親和性が高い。
【0098】
本開示は抗原結合ドメインを含む分離された結合タンパク質を提供し、前記抗原結合ドメインは、下記アミノ酸配列から選ばれる少なくとも１つの相補性決定領域を含むか、又は下記アミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも８０％の配列同一性を有し且つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに対してＫD≦８.５６８×１０-9mol/Lの親和性を有し、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１は、Ｓ－Ｖ－Ｘ１－Ｔ－Ｆ－Ｘ２－Ｔ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｙであり、ただし、Ｘ１はＤ、Ｅ又はＮであり、Ｘ２はＳ又はＴであり、Ｘ３はＩ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２は、Ｇ－Ｘ１－Ｎ－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｘ２－Ｐ－Ｖ－Ｆ－Ｘ３－Ｅ－Ｋであり、ただし、Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＮ又はＧＧであり、Ｘ３はＤ、Ｅ又はＮであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３は、Ｔ－Ｒ－Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｒ－Ｒ－Ｇ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｄ－Ｙであり、ただし、Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３はＦ又はＰであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１は、Ｒ－Ｘ１－Ｓ－Ｑ－Ｄ－Ｉ－Ｘ２－Ｎ－Ｙ－Ｘ３－Ｎであり、ただし、Ｘ１はＡ又はＧであり、Ｘ２はＮ又はＱであり、Ｘ３はＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２は、Ｉ－Ｙ－Ｘ１－Ｔ－Ｓ－Ｒ－Ｌ－Ｘ２－Ｓ－Ｇ－Ｘ３－Ｐであり、ただし、Ｘ１はＹ又はＦであり、Ｘ２はＱ、Ｈ又はＮであり、Ｘ３はＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３は、Ｑ－Ｄ－Ｄ－Ｔ－Ｘ１－Ｐ－Ｘ２－Ｔ－Ｘ３－Ｇであり、ただし、Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３はＷ又はＦである。
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１は、Ｓ－Ｖ－Ｘ１－Ｔ－Ｆ－Ｘ２－Ｔ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｙであり、ただし、Ｘ１はＤ、Ｅ又はＮであり、Ｘ２はＳ又はＴであり、Ｘ３はＩ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２は、Ｇ－Ｘ１－Ｎ－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｘ２－Ｐ－Ｖ－Ｆ－Ｘ３－Ｅ－Ｋであり、ただし、Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＮ又はＧＧであり、Ｘ３はＤ、Ｅ又はＮであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３は、Ｔ－Ｒ－Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｒ－Ｒ－Ｇ－Ｙ－Ｙ－Ｘ３－Ｄ－Ｙであり、ただし、Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３はＦ又はＰであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１は、Ｒ－Ｘ１－Ｓ－Ｑ－Ｄ－Ｉ－Ｘ２－Ｎ－Ｙ－Ｘ３－Ｎであり、ただし、Ｘ１はＡ又はＧであり、Ｘ２はＮ又はＱであり、Ｘ３はＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２は、Ｉ－Ｙ－Ｘ１－Ｔ－Ｓ－Ｒ－Ｌ－Ｘ２－Ｓ－Ｇ－Ｘ３－Ｐであり、ただし、Ｘ１はＹ又はＦであり、Ｘ２はＱ、Ｈ又はＮであり、Ｘ３はＩ、Ｖ又はＬであり、
相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３は、Ｑ－Ｄ－Ｄ－Ｔ－Ｘ１－Ｐ－Ｘ２－Ｔ－Ｘ３－Ｇであり、ただし、Ｘ１はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ２はＩ、Ｖ又はＬであり、Ｘ３はＷ又はＦである。
【0099】
本分野で周知されるように、抗体の結合特異性及び親和性はいずれも主にＣＤＲ配列により決定され、成熟した技術、公知の各種従来技術により非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を容易に変更して生物学的活性が近い変異体を得られる。したがって、本開示には当該結合タンパク質の「機能的誘導体」が含まれる。「機能的誘導体」とはアミノ酸が置き換えられた変異体を言い、機能的誘導体には検出可能な結合タンパク質活性が、好ましくはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに結合できる抗体の活性が保持されている。「機能的誘導体」は「変異体」及び「断片」を含んでもよく、本開示に記載の結合タンパク質と完全に同じＣＤＲ配列を有するため、生物学的活性が近い。
【0100】
１つ又は複数の実施形態では、前記抗原結合ドメインは下記アミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し且つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに対してＫＤ≦８.５６８×１０-9mol/L、例えば８.５６８×１０-9mol/L、５.１２６×１０-9mol/L、３.０１８×１０-9mol/L、２.１９６×１０-10mol/L、３.８３９×１０-10mol/L、４.０７５×１０-10mol/L、６.７７２×１０-10mol/L、８.４９９×１０-10mol/L、９.８７０×１０-10mol/L、３.１４５×１０-11mol/L、５.０６７×１０-11mol/L、６.６４３×１０-11mol/L、もしくは１.３２８×１０-11mol/L≦ＫＤ≦８.５６８×１０-9mol/L、もしくは１.３２８×１０-11mol/L≦ＫＤ≦９.８７０×１０-10mol/L、又はＫＤ≦５.１２６×１０-9mol/L、３.０１８×１０-9mol/L、２.１９６×１０-10mol/L、３.８３９×１０-10mol/L、４.０７５×１０-10mol/L、６.７７２×１０-10mol/L、８.４９９×１０-10mol/L、９.８７０×１０-10mol/L、３.１４５×１０-11mol/L、５.０６７×１０-11mol/Lもしくは６.６４３×１０-11mol/Lの親和性を有する。
【0101】
ただし、親和性は本開示の明細書の方法に従って測定される。
【0102】
１つ又は複数の実施形態では、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ３はＩであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ３はＮであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ３はＦであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ１はＡであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ１はＹであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ３はＦである。
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ３はＩであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ３はＮであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ３はＦであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ１はＡであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ１はＹであり、
前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ３はＦである。
【0103】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＳである。
【0104】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＥであり、Ｘ２はＳである。
【0105】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＳである。
【0106】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＴである。
【0107】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＥであり、Ｘ２はＴである。
【0108】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ１で、Ｘ１はＮであり、Ｘ２はＴである。
【0109】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＮである。
【0110】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＧＧである。
【0111】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＮである。
【0112】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＧＧである。
【0113】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＮである。
【0114】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ２で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＧＧである。
【0115】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＩである。
【0116】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＶである。
【0117】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＬである。
【0118】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＩである。
【0119】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＶである。
【0120】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＬである。
【0121】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＩである。
【0122】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＶである。
【0123】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＨ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＬである。
【0124】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＩである。
【0125】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＶである。
【0126】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＬである。
【0127】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＩである。
【0128】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＶである。
【0129】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ１で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＬである。
【0130】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＩである。
【0131】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＶである。
【0132】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＬである。
【0133】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＨであり、Ｘ３はＩである。
【0134】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＨであり、Ｘ３はＶである。
【0135】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＨであり、Ｘ３はＬである。
【0136】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＩである。
【0137】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＶである。
【0138】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ２で、Ｘ２はＮであり、Ｘ３はＬである。
【0139】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＩである。
【0140】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＶである。
【0141】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＩであり、Ｘ２はＬである。
【0142】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＩである。
【0143】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＶである。
【0144】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＶであり、Ｘ２はＬである。
【0145】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＩである。
【0146】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＶである。
【0147】
１つ又は複数の実施形態では、前記相補性決定領域ＣＤＲ－ＶＬ３で、Ｘ１はＬであり、Ｘ２はＬである。
【0148】
１つ又は複数の実施形態では、各相補性決定領域の突然変異部位は、下記の突然変異の組み合わせから選ばれるいずれか１種である。
【0149】
１つ又は複数の実施形態では、本開示に記載の結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域で出するＸ１はそれぞれ互いに独立して、本開示で限定されたアミノ酸を表し、本開示に記載の結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域で出現するＸ２はそれぞれ互いに独立して、本開示で限定されたアミノ酸を表し、本開示に記載の結合タンパク質の６つのＣＤＲ領域で出現するＸ３はそれぞれ互いに独立して、本開示で限定されたアミノ酸を表す。
【0150】
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質は少なくとも３つのＣＤＲを含み、又は、前記結合タンパク質は少なくとも６つのＣＤＲを含む。
【0151】
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質は可変領域及び定常領域を含む完全な抗体である。
【0152】
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質はナノボディ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体及び抗体の最小認識単位のうちの１つである。
【0153】
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質は配列が順に配列番号１～４に示される軽鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３及びＦＲ－Ｌ４、及び／又は、配列が順に配列番号５～８に示される重鎖フレームワーク領域ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３及びＦＲ－Ｈ４を含む。
【0154】
１つ又は複数の実施形態では、前記結合タンパク質はさらに抗体定常領域配列を含む。
【0155】
１つ又は複数の実施形態では、前記定常領域配列はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれるいずれか１つの定常領域の配列である。
【0156】
１つ又は複数の実施形態では、前記定常領域はウシ、ウマ、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ラクダ、ロバ、シカ、テン、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、シャモ又はヒトの物種に由来する。
【0157】
１つ又は複数の実施形態では、前記定常領域はマウスに由来し、
軽鎖定常領域配列は配列番号９に示され、
重鎖定常領域配列は配列番号１０に示される。
軽鎖定常領域配列は配列番号９に示され、
重鎖定常領域配列は配列番号１０に示される。
【0158】
本開示はさらに、前記結合タンパク質をコードする分離された核酸を提供する。
【0159】
本明細書では、核酸は保存的に置換されたその変異体（例えば縮重コドンの置換）及び相補的配列を含む。用語「核酸」は「ポリヌクレオチド」と同じ意味で、遺伝子、ｃＤＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子及びそれらの断片、例えばオリゴヌクレオチドを含む。
【0160】
本開示はさらに、前記核酸を含むベクターを提供する。
【0161】
ここで、核酸配列は少なくとも１種の調節配列に操作可能に接続される。「操作可能に接続される」とはコード配列はコード配列を発現できるように調節配列に接続されることをいう。調節配列は適切な宿主細胞において目的タンパク質の発現を指示するよう選ばれ、プロモーター、エンハンサー及びその他発現制御要素を含む。
【0162】
本明細書では、ベクターとは本開示の核酸又はその断片を含み、遺伝情報を持ち且つ遺伝情報を細胞に送達する分子又は試薬をもいう。典型的なベクターにはプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、ミニ染色体を含む。ベクターはクローニングベクター（遺伝情報を細胞に移すために用いられ、前記細胞を増殖させ且つ前記遺伝情報が存在し又は存在しない前記細胞を選択できるベクター）又は発現ベクター（前記ベクターの遺伝情報が細胞で発現できるように必要な遺伝的要素を含むベクター）であってもよい。したがって、クローニングベクターは選択マーカーと、前記クローニングベクターによって指定された細胞種にマッチする複製起点とを含み、発現ベクターは所定の標的細胞における発現を影響するのに必要な調節要素を含む。
【0163】
本開示の核酸又はその断片を適切なベクターに挿入して本開示の核酸断片を持つクローニングベクター又は発現ベクターを形成できる。このような新たなベクターも本開示に含まれる。前記ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ミニ染色体、ウイルスを含み、又は特定の細胞内においてのみ一過性発現される裸ＤＮＡを含む。本開示のクローニングベクター及び発現ベクターは自発的に複製されるため、後に高レベル発現又は高レベル複製をクローニングするために高コピー数が提供される。発現ベクターは本開示の核酸断片の発現を駆動させるプロモーターを含み、前記ペプチド発現産物を膜に分泌させ又は組み込ませるシグナルペプチドを所望によりコードする核酸配列、本開示の核酸断片、及び所望によりターミネーターをコードする核酸配列を含んでもよい。生産菌株又は細胞株において発現ベクターを操作し、ベクターを宿主細胞に導入する時、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよいし、宿主細胞ゲノムに組み込まれなくてもよい。ベクターは一般に複製部位、及び形質転換細胞において表現型の選択を提供するマーカー配列を持つ。
【0164】
本開示の発現ベクターは形質転換宿主細胞に用いられる。このような形質転換細胞は本開示に含まれており、本開示の核酸断片及びベクターを増殖させるために用いられ、もしくは本開示のポリペプチドの組換え製造に用いられる培養細胞又は細胞株であってもよい。本開示の形質転換細胞は例えば細菌（大腸菌、バシラス属など）の微生物を含む。さらに宿主細胞は多細胞生物、例えば真菌、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物に由来する細胞、好ましくは哺乳動物に由来する細胞、例えばＣＨＯ細胞を含む。前記形質転換細胞は本開示の核酸断片を複製できる。本開示のペプチドの組み合わせの組換え製造時は、前記発現産物が培地に分泌され又は前記形質転換細胞の表面に取り込まれる。
【0165】
本開示はさらに、培地において前記宿主細胞を培養し、産生された結合タンパク質を培地から又は培養された宿主細胞から回収するステップを含む前記結合タンパク質の生産方法を提供する。
【0166】
前記方法は例えば次のとおりである。少なくとも結合タンパク質の一部をコードする核酸ベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、適切な条件下で当該宿主細胞を培養して当該結合タンパク質を発現させる。１つ又は複数の発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトしてもよく、当該発現ベクターは単独で又は組み合わせて少なくとも結合タンパク質の一部をコードするＤＮＡを含んでもよい。通常のタンパク質及びペプチド精製技術を利用して培地又は細胞溶解物から結合タンパク質を分離でき、前記技術は硫酸アンモニウム沈殿法、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなど）及び／又は電気泳動を含む。
【0167】
所望のコード及び制御配列を含む適切なベクターの構築は本分野で周知される標準的なライゲーション及び制限技術を用いて行われてもよい。分離されたプラスミド、ＤＮＡ配列又は合成されたオリゴヌクレオチドを切断、テーリング及び再ライゲーションして所望の形態を得る。本開示の変異体は任意の方法でコード配列に突然変異を導入することで得られてもよく、これらの突然変異は欠失、挿入、置換などを含む。
【0168】
本開示はさらに、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのエピトープと反応する抗体を提供し、前記抗体はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む。当該抗体は完全な結合タンパク質、又はその断片、誘導体を含む。結合タンパク質全体又はその一部を含む抗体が好ましい。
【0169】
本開示はさらに、ＰＣＲにおける前記結合タンパク質の使用を提供する。
【0170】
本開示はさらに、前記キットは前記結合タンパク質、前記分離された核酸又は前記ベクターの１つ又は複数を含むことを特徴とするキットを提供する。
【0171】
本開示はさらに、本開示に記載の結合タンパク質とＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼとを含む組成物を提供する。
【0172】
１つ又は複数の実施形態では、前記組成物はさらに４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む。
【0173】
１つ又は複数の実施形態では、前記組成物はさらにプライマー及び／又はプローブを含む。
【0174】
１つ又は複数の実施形態では、前記組成物さらにＭｇＣｌ２を含む。
【0175】
１つ又は複数の実施形態では、前記組成物はさらに鋳型としての核酸を含む。
【0176】
本開示はさらに、本開示に記載の結合タンパク質又は本開示に記載の組成物を用いてホットスタートＰＣＲを行うことを含む核酸増幅方法を提供する。
【0177】
１つ又は複数の実施形態では、ホットスタートＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ及びリアルタイム定量ＰＣＲからなる群から選ばれる。
【0178】
本明細書で使用される用語「ホットスタートＰＣＲ（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ ＰＣＲ）」とは、サンプル温度が少なくとも所定の温度を超える時だけＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼがその役割を果たすＰＣＲであり、これによって反応の特異性が高められ、核酸の非特異的な増幅が避けられる。
【0179】
本開示はさらに、試料中のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの検出方法であって、
ａ）抗体／抗原結合反応を行わせるのに十分な条件で、前記試料中のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを本開示の結合タンパク質に接触させて免疫複合体を形成するステップと、
ｂ）前記免疫複合体の存在を検出し、前記複合体が存在することは前記試料に前記Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが存在することを示すステップと、を含む方法を提供する。
ａ）抗体／抗原結合反応を行わせるのに十分な条件で、前記試料中のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを本開示の結合タンパク質に接触させて免疫複合体を形成するステップと、
ｂ）前記免疫複合体の存在を検出し、前記複合体が存在することは前記試料に前記Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが存在することを示すステップと、を含む方法を提供する。
【0180】
１つ又は複数の実施形態では、前記免疫複合体はさらに前記結合タンパク質に結合する第２抗体を含み、
１つ又は複数の実施形態では、ステップａ）で、前記免疫複合体はさらに前記Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに結合する第２抗体を含む。
１つ又は複数の実施形態では、ステップａ）で、前記免疫複合体はさらに前記Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに結合する第２抗体を含む。
【0181】
本開示はさらに、核酸を増幅させるための本明細書に記載の結合タンパク質の使用を提供する。
【0182】
次に本開示を例示的に説明するためにいくつかの例が示されるが、本開示の範囲はこれに限定されない。
【0183】
（実施例１）
本実施例で制限酵素、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒ ＤＮＡポリメラーゼは株式会社Ｔａｋａｒａから購入した。ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ－ＲＮＡ抽出キットは株式会社ＴＯＹＯＢＯから購入した。ＳＭＡＲＴＥＲＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔキットは株式会社Ｔａｋａｒａから購入した。ｐＭＤ－１８Ｔベクターは株式会社Ｔａｋａｒａから購入した。プラスミド抽出キットは天根生化科技有限公司から購入した。プライマー合成及び遺伝子配列決定は株式会社Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが実施した。Ａｎｔｉ－ＴＡＱ ２Ｃ７モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株は既存のハイブリドーマ細胞株であり、使用に備えて蘇生させておく。
本実施例で制限酵素、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒ ＤＮＡポリメラーゼは株式会社Ｔａｋａｒａから購入した。ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ－ＲＮＡ抽出キットは株式会社ＴＯＹＯＢＯから購入した。ＳＭＡＲＴＥＲＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔキットは株式会社Ｔａｋａｒａから購入した。ｐＭＤ－１８Ｔベクターは株式会社Ｔａｋａｒａから購入した。プラスミド抽出キットは天根生化科技有限公司から購入した。プライマー合成及び遺伝子配列決定は株式会社Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが実施した。Ａｎｔｉ－ＴＡＱ ２Ｃ７モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株は既存のハイブリドーマ細胞株であり、使用に備えて蘇生させておく。
【0184】
１.プライマー
重鎖及び軽鎖５’増幅ＲＡＣＥプライマー：
ＳＭＡＲＴＥＲ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチド：
５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＸＸＸＸＸ－３’、
５’－ＲＡＣＥ ＣＤＳプライマー（５’－ＣＤＳ）：５’－（Ｔ）２５ＶＮ－３’（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ、Ｖ＝Ａ、Ｇ又はＣ）、
ユニバーサルプライマーＡミックス（ＵＰＭ）：５’－ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’、
ネスト化されたユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）：５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’、
ｍＩｇ－ＫＲ：５’－ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴ－３’、
ｍＩｇ－ＨＲ：５’－ＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣ－３’。
重鎖及び軽鎖５’増幅ＲＡＣＥプライマー：
ＳＭＡＲＴＥＲ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチド：
５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＸＸＸＸＸ－３’、
５’－ＲＡＣＥ ＣＤＳプライマー（５’－ＣＤＳ）：５’－（Ｔ）２５ＶＮ－３’（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ、Ｖ＝Ａ、Ｇ又はＣ）、
ユニバーサルプライマーＡミックス（ＵＰＭ）：５’－ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’、
ネスト化されたユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）：５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’、
ｍＩｇ－ＫＲ：５’－ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴ－３’、
ｍＩｇ－ＨＲ：５’－ＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣ－３’。
【0185】
２.抗体可変領域の遺伝子クローニング及び配列決定
Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ２Ｃ７クローニング抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株からＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴＥＲTMＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔキット及びキット中のＳＭＡＲＴＥＲ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチド、５’－ＣＤＳプライマーを用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成し、第１鎖ｃＤＮＡ産物を得てこれをＰＣＲ増幅鋳型とした。軽鎖遺伝子はユニバーサルプライマーＡミックス（ＵＰＭ）、ネスト化されたユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）及びｍＫＲプライマーで増幅させ、重鎖遺伝子はユニバーサルプライマーＡミックス（ＵＰＭ）、ネスト化されたユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）及びｍＨＲプライマーで増幅させた。このうち軽鎖のプライマーペアによる増幅で約０.７ＫＢの目的バンドを、重鎖のプライマーペアによる増幅で約１.４ＫＢの目的バンドを得た。アガロースゲル電気泳動により精製及び回収し、ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて産物のＡテーリング反応を行った後ｐＭＤ－１８Ｔベクターに挿入し、ＤＨ５α形質転換受容性細胞に形質転換し、コロニーが認められたらそれぞれ重鎖及び軽鎖遺伝子をそれぞれクローニングし、各４つのクローンに対し株式会社Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより配列決定を行った。
Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ２Ｃ７クローニング抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株からＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴＥＲTMＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔキット及びキット中のＳＭＡＲＴＥＲ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチド、５’－ＣＤＳプライマーを用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成し、第１鎖ｃＤＮＡ産物を得てこれをＰＣＲ増幅鋳型とした。軽鎖遺伝子はユニバーサルプライマーＡミックス（ＵＰＭ）、ネスト化されたユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）及びｍＫＲプライマーで増幅させ、重鎖遺伝子はユニバーサルプライマーＡミックス（ＵＰＭ）、ネスト化されたユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）及びｍＨＲプライマーで増幅させた。このうち軽鎖のプライマーペアによる増幅で約０.７ＫＢの目的バンドを、重鎖のプライマーペアによる増幅で約１.４ＫＢの目的バンドを得た。アガロースゲル電気泳動により精製及び回収し、ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて産物のＡテーリング反応を行った後ｐＭＤ－１８Ｔベクターに挿入し、ＤＨ５α形質転換受容性細胞に形質転換し、コロニーが認められたらそれぞれ重鎖及び軽鎖遺伝子をそれぞれクローニングし、各４つのクローンに対し株式会社Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより配列決定を行った。
【0186】
３.Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ２Ｃ７抗体の可変領域遺伝子の配列分析
上記のように配列決定した遺伝子配列をＩＭＧＴ抗体データベースに入力して分析し、ソフトウェアＶＮＴＩ１１.５において分析したところ、重鎖及び軽鎖プライマーペアで増幅させた遺伝子がいずれも正しいことが判明し、このうち軽鎖で増幅させた遺伝子断片において、ＶＬ遺伝子配列が３７８ｂｐで、ＶｋＩＩ遺伝子ファミリーに属し、その前方に５７ｂｐのリーダーペプチド配列があり、重鎖プライマーペアで増幅させた遺伝子断片において、ＶＨ遺伝子配列が４１７ｂｐで、ＶＨ１遺伝子ファミリーに属し、その前方に５７ｂｐのリーダーペプチド配列がある。
上記のように配列決定した遺伝子配列をＩＭＧＴ抗体データベースに入力して分析し、ソフトウェアＶＮＴＩ１１.５において分析したところ、重鎖及び軽鎖プライマーペアで増幅させた遺伝子がいずれも正しいことが判明し、このうち軽鎖で増幅させた遺伝子断片において、ＶＬ遺伝子配列が３７８ｂｐで、ＶｋＩＩ遺伝子ファミリーに属し、その前方に５７ｂｐのリーダーペプチド配列があり、重鎖プライマーペアで増幅させた遺伝子断片において、ＶＨ遺伝子配列が４１７ｂｐで、ＶＨ１遺伝子ファミリーに属し、その前方に５７ｂｐのリーダーペプチド配列がある。
【0187】
４.組換え抗体発現プラスミドの構築
ｐｃＤＮＡTM３.４ ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターは構築された組換え抗体真核発現ベクターであり、当該発現ベクターには既にＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩなどのポリクローナル酵素切断部位が導入され、ｐｃＤＮＡ ３.４Ａ発現ベクターと命名され、以下３.４Ａ発現ベクターと略称する。前記ｐＭＤ－１８Ｔの抗体可変領域の遺伝子配列決定結果に基づいて、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ ２Ｃ７抗体のＶＬ及びＶＨ遺伝子特異的なプライマーを設計し、両端にはそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ酵素切断部位及び保護塩基があり、プライマーは以下のとおりである。
ｐｃＤＮＡTM３.４ ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターは構築された組換え抗体真核発現ベクターであり、当該発現ベクターには既にＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩなどのポリクローナル酵素切断部位が導入され、ｐｃＤＮＡ ３.４Ａ発現ベクターと命名され、以下３.４Ａ発現ベクターと略称する。前記ｐＭＤ－１８Ｔの抗体可変領域の遺伝子配列決定結果に基づいて、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ ２Ｃ７抗体のＶＬ及びＶＨ遺伝子特異的なプライマーを設計し、両端にはそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ酵素切断部位及び保護塩基があり、プライマーは以下のとおりである。
【0188】
Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ２Ｃ７－ＨＦ：５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＡＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣ－３’、
Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ２Ｃ７－ＨＲ：
５’－ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣ－３’、
Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ２Ｃ７－ＬＦ：５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣ－３’、
Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ２Ｃ７－ＬＲ：
５’－ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡ－３’。
Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ２Ｃ７－ＨＲ：
５’－ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣ－３’、
Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ２Ｃ７－ＬＦ：５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣ－３’、
Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ２Ｃ７－ＬＲ：
５’－ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡ－３’。
【0189】
ＰＣＲ増幅により０.７５ＫＢの軽鎖遺伝子断片及び１.４２ＫＢの重鎖遺伝子断片を得た。重鎖及び軽鎖遺伝子断片はそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩでダブルダイジェストし、３.４ＡベクターはＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩでダブルダイジェストし、断片及びベクターを精製及び回収した後、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子をそれぞれ３.４Ａ発現ベクターに接続させて、重鎖及び軽鎖の組換え発現プラスミドをそれぞれ得た。
【0190】
５.安定型細胞株スクリーニング
５.１ 組換え抗体発現プラスミドによるＣＨＯ細胞一過性トランスフェクション、発現プラスミド活性決定
超純水でプラスミドを４００ng/mlに希釈し、ＣＨＯ細胞を１.４３×１０7cells/mlに調整して遠心分離管に入れ、１００μLのプラスミドと７００μlの細胞を混合した後、エレクトロポレーションカップに移し、エレクトロポレーションを行い、３日目、５日目、７日目にサンプルを採取してカウントし、７日目に回収して検出した。
５.１ 組換え抗体発現プラスミドによるＣＨＯ細胞一過性トランスフェクション、発現プラスミド活性決定
超純水でプラスミドを４００ng/mlに希釈し、ＣＨＯ細胞を１.４３×１０7cells/mlに調整して遠心分離管に入れ、１００μLのプラスミドと７００μlの細胞を混合した後、エレクトロポレーションカップに移し、エレクトロポレーションを行い、３日目、５日目、７日目にサンプルを採取してカウントし、７日目に回収して検出した。
【0191】
コーティング溶液でＴａｑ酵素を所定の濃度に希釈し、１ウェル当たり１００μLで、４℃で一晩保持させた。翌日に、洗浄液で２回洗浄し、軽く叩いて乾燥させた。ブロッキング液（２０％ＢＳＡ＋８０％ＰＢＳ）を１ウェル当たり１２０μL加え、３７℃で１時間保持させて、軽く叩いて乾燥させた。希釈後の細胞上清を１００μL/ウェル加え、３７℃で３０分間（一部の上清は１時間）保持させた。洗浄液で５回洗浄し、軽く叩いて乾燥させた。ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを１ウェル当たり１００μL加え、３７℃で３０分間保持させた。洗浄液で５回洗浄し、軽く叩いて乾燥させた。発色液Ａ液を（５０μL/ウェル）、そして発色液Ｂ液を（５０μL/ウェル）加え、１０分間保持させた。停止液を５０μL/ウェル加えた。マイクロプレートリーダーにおいて４５０nm（６３０nm参照）でＯＤ値を読み取った。結果では細胞上清を１０００倍希釈した後、反応ＯＤが依然として１.０を超えており、細胞上清を加えないウェルは反応ＯＤが０.１未満であることから、プラスミドの一過性トランスフェクション後に産生された抗体はＴａｑ酵素に活性があることが示された。
【0192】
５.２ 組換え抗体発現プラスミド線形化
次の試薬を用意する。バッファー５０μl、ＤＮＡ １００μg/管、Ｐｕｖ I酵素１０μl、滅菌水で５００μlに補足、３７℃水浴で一晩消化。まず等体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール２５：２４：１（下層）、次に等体積のクロロホルム（水相）で抽出し、０.１倍の体積の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍の体積のエタノール（水相）を用いて氷上で沈殿させ、７０％エタノールで沈殿をすすぎ、有機溶媒を除去し、エタノールが完全に揮発したら適量の滅菌水で再溶解し、最後に濃度を測定した。
次の試薬を用意する。バッファー５０μl、ＤＮＡ １００μg/管、Ｐｕｖ I酵素１０μl、滅菌水で５００μlに補足、３７℃水浴で一晩消化。まず等体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール２５：２４：１（下層）、次に等体積のクロロホルム（水相）で抽出し、０.１倍の体積の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍の体積のエタノール（水相）を用いて氷上で沈殿させ、７０％エタノールで沈殿をすすぎ、有機溶媒を除去し、エタノールが完全に揮発したら適量の滅菌水で再溶解し、最後に濃度を測定した。
【0193】
５.３ 組換え抗体発現プラスミドの安定トランスフェクション、安定型細胞株の加圧スクリーニング
超純水でプラスミドを４００ng/mlに希釈し、ＣＨＯ細胞を１.４３×１０7cells/mlに調整して遠心分離管に入れ、１００μlのプラスミドと７００μlの細胞を混合した後、エレクトロポレーションカップに移し、エレクトロポレーションを行い、翌日にカウントした。２５μmol/LのＭＳＸを含む９６ウェルで約２５日加圧培養した。
超純水でプラスミドを４００ng/mlに希釈し、ＣＨＯ細胞を１.４３×１０7cells/mlに調整して遠心分離管に入れ、１００μlのプラスミドと７００μlの細胞を混合した後、エレクトロポレーションカップに移し、エレクトロポレーションを行い、翌日にカウントした。２５μmol/LのＭＳＸを含む９６ウェルで約２５日加圧培養した。
【0194】
顕微鏡下で観察し、細胞が認められたクローニングウェルをマークし、コンフルエンスを記録した。培養上清を取得し、サンプルを検出した。抗体濃度、相対濃度が高い方の細胞株を選択して２４ウェルプレートに移し、約３日後６ウェルプレートに移した。３日後に菌種を保存しバッチ培養し、細胞密度を０.５×１０6cells/mlに調整し、２.２mlを取得してバッチ培養し、細胞密度が０.３×１０6cells/mlになると、２mlを取得して菌種を保存した。６ウェルプレートで上清を７日間バッチ培養して検出し、抗体濃度と細胞直径が小さい方の細胞株を選択してＴＰＰに移し、菌種を保存して継代させた。
【0195】
６.組換え抗体の生産
６.１ 細胞拡大培養
蘇生後、まず１２５ml振盪フラスコで細胞を培養し、接種体積は３０mlで、培地を１００％ダイナミス培地とし、毎分１２０回転、温度３７℃及び二酸化炭素８％の振盪機に入れた。７２時間培養した後、５０万cells/mlの接種密度で接種して拡大培養し、拡大培養体積は生産量に応じて計算し、培地を１００％ダイナミス培地とした。その後、７２時間ごとに１回拡大培養した。細胞量が生産ニーズを満たすと、接種密度を約５０万cells/mlに正確に制限して生産した。
６.１ 細胞拡大培養
蘇生後、まず１２５ml振盪フラスコで細胞を培養し、接種体積は３０mlで、培地を１００％ダイナミス培地とし、毎分１２０回転、温度３７℃及び二酸化炭素８％の振盪機に入れた。７２時間培養した後、５０万cells/mlの接種密度で接種して拡大培養し、拡大培養体積は生産量に応じて計算し、培地を１００％ダイナミス培地とした。その後、７２時間ごとに１回拡大培養した。細胞量が生産ニーズを満たすと、接種密度を約５０万cells/mlに正確に制限して生産した。
【0196】
６.２ 振盪フラスコによる生産及び精製
振盪フラスコのパラメータ：毎分１２０回転で、温度が３７℃で、二酸化炭素は８％であった。原料の流加補足：振盪フラスコで７２時間培養すると毎日原料を補足し、ＨｙＣｌｏｎｅTMＣｅｌｌ ＢｏｏｓｔTMＦｅｅｄ ７ａは毎日初期培養体積の３％を流加し、Ｆｅｅｄ ７ｂは毎日初期培養体積の千分の１の割合で流加し、補足は１２日目まで続いた（１２日目の補足）。６日目にグルコースを３g/L補足した。１３日目に回収した。ｐｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いてアフィニティー精製を行った。４μｇの精製抗体に対し還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、４μｇの外来対照抗体を対照とし、電気泳動図は図１に示される。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、２つのバンドが示され、一方はＭｒが５０ＫＤ（重鎖）で、配列は配列番号１１に示され、他方はＭｒが２８ＫＤ（軽鎖）で、配列は配列番号１２に示される。
振盪フラスコのパラメータ：毎分１２０回転で、温度が３７℃で、二酸化炭素は８％であった。原料の流加補足：振盪フラスコで７２時間培養すると毎日原料を補足し、ＨｙＣｌｏｎｅTMＣｅｌｌ ＢｏｏｓｔTMＦｅｅｄ ７ａは毎日初期培養体積の３％を流加し、Ｆｅｅｄ ７ｂは毎日初期培養体積の千分の１の割合で流加し、補足は１２日目まで続いた（１２日目の補足）。６日目にグルコースを３g/L補足した。１３日目に回収した。ｐｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いてアフィニティー精製を行った。４μｇの精製抗体に対し還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、４μｇの外来対照抗体を対照とし、電気泳動図は図１に示される。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、２つのバンドが示され、一方はＭｒが５０ＫＤ（重鎖）で、配列は配列番号１１に示され、他方はＭｒが２８ＫＤ（軽鎖）で、配列は配列番号１２に示される。
【0197】
（実施例２）
実施例１で得たサンプル１の抗体（配列が配列番号１１に示される重鎖及び配列番号１２に示される軽鎖を有する）はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに結合する能力を有するが、親和性と抗体活性は好ましくないため、出願人が当該抗体の軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲに突然変異を行った。
実施例１で得たサンプル１の抗体（配列が配列番号１１に示される重鎖及び配列番号１２に示される軽鎖を有する）はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに結合する能力を有するが、親和性と抗体活性は好ましくないため、出願人が当該抗体の軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲに突然変異を行った。
【0198】
分析したところ、重鎖の相補性決定領域（ＷＴ）は次のとおりである。
ＣＤＲ－ＶＨ１はＳ－Ｖ－Ｄ（Ｘ１）－Ｔ－Ｆ－Ｓ（Ｘ２）－Ｔ－Ｙ－Ｙ－Ｌ（Ｘ３）－Ｙであり、
ＣＤＲ－ＶＨ２はＧ－Ｖ（Ｘ１）－Ｎ－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｎ（Ｘ２）－Ｐ－Ｖ－Ｆ－Ｄ（Ｘ３）－Ｅ－Ｋであり、
ＣＤＲ－ＶＨ３はＴ－Ｒ－Ｓ－Ｉ（Ｘ１）－Ｌ（Ｘ２）－Ｒ－Ｒ－Ｇ－Ｙ－Ｙ－Ｐ（Ｘ３）－Ｄ－Ｙである。
ＣＤＲ－ＶＨ１はＳ－Ｖ－Ｄ（Ｘ１）－Ｔ－Ｆ－Ｓ（Ｘ２）－Ｔ－Ｙ－Ｙ－Ｌ（Ｘ３）－Ｙであり、
ＣＤＲ－ＶＨ２はＧ－Ｖ（Ｘ１）－Ｎ－Ｐ－Ｔ－Ｓ－Ｎ（Ｘ２）－Ｐ－Ｖ－Ｆ－Ｄ（Ｘ３）－Ｅ－Ｋであり、
ＣＤＲ－ＶＨ３はＴ－Ｒ－Ｓ－Ｉ（Ｘ１）－Ｌ（Ｘ２）－Ｒ－Ｒ－Ｇ－Ｙ－Ｙ－Ｐ（Ｘ３）－Ｄ－Ｙである。
【0199】
軽鎖の相補性決定領域は次のとおりである。
ＣＤＲ－ＶＬ１はＲ－Ｇ（Ｘ１）－Ｓ－Ｑ－Ｄ－Ｉ－Ｑ（Ｘ２）－Ｎ－Ｙ－Ｖ（Ｘ３）－Ｎであり、
ＣＤＲ－ＶＬ２はＩ－Ｙ－Ｆ（Ｘ１）－Ｔ－Ｓ－Ｒ－Ｌ－Ｑ（Ｘ２）－Ｓ－Ｇ－Ｉ（Ｘ３）－Ｐであり、
ＣＤＲ－ＶＬ３はＱ－Ｄ－Ｄ－Ｔ－Ｉ（Ｘ１）－Ｐ－Ｖ（Ｘ２）－Ｔ－Ｗ（Ｘ３）－Ｇであり、
ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はいずれも突然変異部位である。
ＣＤＲ－ＶＬ１はＲ－Ｇ（Ｘ１）－Ｓ－Ｑ－Ｄ－Ｉ－Ｑ（Ｘ２）－Ｎ－Ｙ－Ｖ（Ｘ３）－Ｎであり、
ＣＤＲ－ＶＬ２はＩ－Ｙ－Ｆ（Ｘ１）－Ｔ－Ｓ－Ｒ－Ｌ－Ｑ（Ｘ２）－Ｓ－Ｇ－Ｉ（Ｘ３）－Ｐであり、
ＣＤＲ－ＶＬ３はＱ－Ｄ－Ｄ－Ｔ－Ｉ（Ｘ１）－Ｐ－Ｖ（Ｘ２）－Ｔ－Ｗ（Ｘ３）－Ｇであり、
ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３はいずれも突然変異部位である。
【0200】
【0201】
突然変異後、抗体の活性を検出し、コーティング溶液でＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを所定の濃度に希釈し、１ウェル当たり１００μLで、４℃で一晩保持させた。翌日に、洗浄液で２回洗浄し、軽く叩いて乾燥させた。ブロッキング液（２０％ＢＳＡ＋８０％ＰＢＳ）を１ウェル当たり１２０μL加え、３７℃で１時間保持させて、軽く叩いて乾燥させた。希釈後のＴａｑモノクローナル抗体を１００μL/ウェル加え、３７℃で３０分間（一部の上清は１時間）保持させた。洗浄液で５回洗浄し、軽く叩いて乾燥させた。ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを１ウェル当たり１００μL加え、３７℃で３０分間保持させた。洗浄液で５回洗浄し、軽く叩いて乾燥させた。発色液Ａ液を（５０μL/ウェル）、そして発色液Ｂ液を（５０μL/ウェル）加え、１０分間保持させた。停止液を５０μL/ウェル加えた。マイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍ（６３０ｎｍ参照）でＯＤ値を読み取った。
【0202】
一部の結果は次のとおりである。
【0203】
親和性分析：
ＡＭＣセンサにおいて、ＰＢＳＴで前記抗体を１０μg/mlに希釈し、ＰＢＳＴでＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを１０００nmol/ml、５００nmol/ml、２５０nmol/ml、１２５nmol/ml、６２.５nmol/ml、３１.３nmol/ml、１５.６nmol/ml、０nmol/mlのとおりに勾配希釈した。
ＡＭＣセンサにおいて、ＰＢＳＴで前記抗体を１０μg/mlに希釈し、ＰＢＳＴでＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを１０００nmol/ml、５００nmol/ml、２５０nmol/ml、１２５nmol/ml、６２.５nmol/ml、３１.３nmol/ml、１５.６nmol/ml、０nmol/mlのとおりに勾配希釈した。
【0204】
実行プロセス：バッファー１（ＰＢＳＴ）で６０秒平衡化、抗体溶液で３００秒抗体固化、バッファー２（ＰＢＳＴ）で１８０秒インキュベート、抗原溶液で４２０秒結合、バッファー２で１２００秒解離後、ｐＨ１.６９の１０ｍＭのＧＬＹ溶液及びバッファー３でセンサを蘇生させ、データを出力した。ＫＤは平衡解離定数、即ち親和性を表し、Ｋｏｎは結合速度、Ｋｄｉｓは解離速度を表す。
【0205】
【0206】
表２及び表３から分かるように、突然変異１は活性が最も高く親和性が最も優れるため、力価が高い突然変異部位をスクリーニングするために突然変異１をフレームワーク配列に利用し（スクリーニング後、抗体活性が突然変異１に近いことを保証し、抗体活性は±１０％であった）、一部の結果は次のとおりである。
【0207】
【0208】
親和性分析の方法は上記と同じで、結果は表５に示される。
【0209】
【0210】
表５から分かるように、表４に示す突然変異部位は抗体の親和性に大きな影響がない。
【0211】
前記結果を検証するために、ＷＴをフレームワーク配列として前記実験を繰り返し、突然変異部位の親和性検証を行った。一部の結果は次のとおりである。
【0212】
【0213】
【0214】
表６及び表７を分析したところ、表６に示す突然変異部位も抗体の親和性に大きな影響がない。
【0215】
本開示のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは抗体修飾後、７０℃以下で酵素の活性をブロックされ、７０℃以上で解離し、９５℃では１～３分間だけで完全に解離し、酵素の活性成分が放出される。
【0216】
同等な条件下で、抗体修飾がある及び抗体修飾のないＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに特異性検出を行い、結果を図２のＰＣＲ電気泳動図に示し、このうち１はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（抗体修飾なし）、２及び４は突然変異１抗体で修飾されたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、３及び５はＷＴ抗体で修飾されたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであった。結果を分析して分かるように、抗体修飾のあるＴＡＱ酵素の方が増幅特異性は明らかに高められた。各レーンに出現する非特異的なバンドを分析したところ、突然変異１抗体で修飾されたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＷＴ抗体で修飾されたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼより特異性がわずか優れていることが分かった。本開示では表４の突然変異の組み合わせについて抗体とＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの結合安定性、迅速な活性化及び対応ｐＨ範囲を検出したところ、いずれも効果が良好であったことから、本開示に係る抗Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ抗体は分子検出に関する用途が期待できることが示される。
【0217】
なお、上記の各実施例は限定を加えず本開示の技術案を説明するものである。前記各実施例を用いて本開示を詳細に説明しているが、当業者が理解したように、なおも前記各実施例に記載の技術案に修正を行い、又はその一部の又は全ての技術特徴に同等な置き換えを行うことができる。かかる修正又は置き換えより技術案の趣旨が本開示の各実施例の技術案の範囲から逸脱することはない。
【産業上の利用可能性】
【0218】
本開示に係る結合タンパク質はＴａｑ酵素に特異的に結合して抗体－酵素複合体を形成するため、室温でＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの活性を効果的にブロックでき、高温では、当該複合体が解離し、活性を有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを放出して、ＰＣＲ増幅反応が行われる。プライマー二量体の形成が効果的に避けられ、非特異的産物の増幅が緩和されるとともに、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの長期安定性が改善される。本開示の結合タンパク質は様々なホットスタートＰＣＲに幅広く利用できる。
【図1】
【図2】
【配列表】