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▶ グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニムの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-19
(45)【発行日】2024-11-27
(54)【発明の名称】変異型ＰＧＬＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20241120BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241120BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241120BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241120BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241120BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20241120BHJP
C12P 19/00 20060101ALI20241120BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241120BHJP
C12N 15/10 20060101ALN20241120BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/54 ZNA
C12P19/00
C12P21/02 C
C12N15/10 200Z
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2022507790
(86)(22)【出願日】2020-08-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-13
(86)【国際出願番号】 EP2020072102
(87)【国際公開番号】W WO2021028303
(87)【国際公開日】2021-02-18
【審査請求日】2023-07-10
(31)【優先権主張番号】62/884,791
(32)【優先日】2019-08-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/931,265
(32)【優先日】2019-11-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】305060279
【氏名又は名称】グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イーンケン，レイ アン
(72)【発明者】
【氏名】カーピアク，ジョエル
(72)【発明者】
【氏名】ケムラー，シュテファン ヨッヘン
(72)【発明者】
【氏名】コヴァリク，ミカエル トーマス
(72)【発明者】
【氏名】メルビー，ジョエル
(72)【発明者】
【氏名】オーリス，アン
(72)【発明者】
【氏名】ケバット，ジュリアン ローラン
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５００９１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／０６７５２３（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ ９／００－９／９９
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１もしくは２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドであって、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドアミノ酸配列が、アミノ酸Ｘ５７、Ｘ６３、Ｘ９４、Ｘ１０１、Ｘ１７２、Ｘ１７６、Ｘ１９１、Ｘ１９３、Ｘ２３３、Ｘ２３４、Ｘ２５５、Ｘ２８６、Ｘ２９５、Ｘ３０１、Ｘ３１９、Ｘ３９７、Ｘ４０２、Ｘ４２５、Ｘ４３５、Ｘ４４６、Ｘ４６２、Ｘ４７９、Ｘ５２３、Ｘ５３２、Ｘ６０１、Ｘ６０５、Ｘ６０６、Ｘ６１０、Ｘ６４５、Ｘ６７６およびＸ６９５からなる群から選択される少なくとも１つの残基が配列番号１のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸に置換されているという特徴を含み、配列番号１の５７番目のアミノ酸に相当する残基がＲまたはＴに変異しており、配列番号１のアミノ酸Ｘ７７に相当する残基がＲであり、配列番号１のアミノ酸Ｘ３１１に相当する残基がＶであり、かつ、前記ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドが、配列番号１の配列を有する、相当するＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼの少なくとも１．５倍のグリコシル化タンパク質を生産するように糖によるタンパク質のグリコシル化の収量を高めることができる、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項2】
ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸Ｘ７８、Ｘ８４、Ａ１５５、Ｘ２９３、Ｘ３００、Ｘ３０１、Ｘ３０６、Ｘ３０８、Ｘ４６２、Ｘ４６４、Ｘ４７９、Ｘ５２３およびＸ５７０からなる群から選択される少なくとも１つの残基が配列番号１のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸に置換されているという特徴を含む、請求項１に記載のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項3】
アミノ酸配列が、Ｘ７８がＴに変異している；Ｘ８４がＷに変異している；Ｘ１５５がＱに変異している；Ｘ２９３がＣに変異している；Ｘ３００がＬに変異している；Ｘ３０１がＰまたはＧに変異している；Ｘ３０６がＨに変異している；Ｘ３０８がＷに変異している；Ｘ４６２がＷ、ＮまたはＴに変異している；Ｘ４６４がＬに変異している；Ｘ４７９がＭに変異している；Ｘ５２３がＲに変異している；Ｘ５７０がＲまたはＶに変異している；ことからなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、請求項２に記載のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項4】
アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸Ｘ３０１に相当する残基がＰに変異している；配列番号１のアミノ酸Ｘ４６２に相当する残基がＮまたはＷに変異している；および配列番号１のアミノ酸Ｘ４７９に相当する残基がＭに変異していることからなるリストから選択される少なくとも１つの特徴を含む、請求項２～３のいずれか一項に記載のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項5】
配列番号１のＸ３００に相当するアミノ酸がＬに変異している；配列番号１のＸ３０１に相当するアミノ酸がＰに変異している、配列番号１のＸ３０８に相当するアミノ酸がＷに変異している、配列番号１のＸ４６２に相当するアミノ酸がＷに変異している、配列番号１のＸ４７９に相当するアミノ酸がＭに変異している、および配列番号１のＸ５７０に相当するアミノ酸がＲに変異している、という特徴のうち少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを含む、請求項２～４のいずれか一項に記載のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項6】
配列番号１のアミノ酸Ｘ５７、Ｘ４６２およびＸ４７９に相当する残基が、配列番号１のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸で置換される、請求項１～５のいずれか一項に記載のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項7】
全長である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の変異型ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたは請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物または宿主細胞。
【請求項10】
グリコシル化タンパク質を作製するためのプロセスであって、（ａ）請求項９に記載の宿主細胞をタンパク質の生産に好適な条件下で培養する工程；および
（ｂ）前記宿主細胞からグリコシル化タンパク質を単離する工程；
を含む、プロセス。
【請求項11】
タンパク質の、アミノ酸配列Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外の天然アミノ酸である）を含むグリコシル化コンセンサス配列のＮ残基に糖が結合しているグリコシル化タンパク質の生産における、請求項１～７のいずれか一項に記載のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドの使用。
【請求項12】
前記ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドが、配列番号１の配列を有する、相当するＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼの少なくとも１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、７００倍、１０００倍のグリコシル化タンパク質を生産するように糖によるタンパク質のグリコシル化の収量を高めることができる、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、改良されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼならびにタンパク質のグリコシル化および／または糖鎖に結合したキャリアタンパク質の生産におけるそれらの使用に関する。本発明はまた、改良されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。
【背景技術】
【0002】
グリココンジュゲートワクチンは、多くの命を脅かす細菌感染を予防するそれらの能力に関して広く認知されている。グリココンジュゲートワクチンは一般に有効で安全と考えられ、３０年超にわたってヒトにおいて使用されてきた。従来のグリコワクチン生産は、多くの場合、病原性細菌の多糖抗原での免疫原性キャリアタンパク質の化学修飾を含んでいる。しかしながら、最近になって、生産コストを削減し、グリココンジュゲートワクチン製剤の均一性ならびにおそらくは効力および安全性をさらに高めると思われるグリココンジュゲートワクチンを作製するための生物学的プロセスが浮上した。
【0003】
真核細胞では、Ｎ結合型グリコシル化は、いくつかの酵素を含む重要な翻訳後タンパク質修飾機構である。原核細胞では、Ｎ結合型グリコシル化は、ある特定の細菌Ｎ－オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（Ｎ－ＯＳＴｓ）によって触媒される。カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)(C. jejuni)のタンパク質グリコシル化遺伝子群には、膜結合型Ｎ－ＯＳＴ（ＰｇｌＢＣｊ）をコードするｐｇｌＢ遺伝子が含まれる。ＰｇｌＢは大腸菌(Escherichia coli)(E. coli)などの標準的な細菌宿主で発現させることができ、少なくとも１つの表面露出Ｄ／Ｅ－Ｚ１－Ｎ－Ｚ２－Ｓ／Ｔ（Ｚ１およびＺ２≠Ｐ）グリコシル化モチーフを有する共発現ペリプラズムタンパク質をグリコシル化することができる。ＰｇｌＢは、特定のＣ．ジェジュニタンパク質に、また、改変されたグリコシル化部位を含む他生物の免疫原性キャリアタンパク質に細菌多糖抗原を転移することができる。ＰｇｌＢは、オリゴ糖、ならびにある程度まで、グラム陰性菌のＯ－抗原リポ多糖構造およびグラム陽性細菌の莢膜抗原多糖を転移することができる。しかしながら、ＰｇｌＢのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性の効率は、必要とされるコンセンサス配列を含むタンパク質に共有結合される糖の性質によって異なることがある。従って、必要とされるグリコシル化モチーフを含むタンパク質に、Ｃ．ジェジュニで転移されるものとは異なる構造を有する糖の効率的転移を触媒し得る改良されたＰｇｌＢタンパク質の必要がある。
【発明の概要】
【0004】
本開示は、Ｃ．ジェジュニ細胞においてタンパクに転移されないある範囲の糖を転移する場合にＰｇｌＢの効率を向上させるように修飾された、改変されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼを提供する。
【0005】
よって、配列番号１もしくは２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）ポリペプチド、またはその機能的断片が提供され、前記ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸５７、６３、９４、１０１、１７６、１９１、１９３、２３３、２３４、２８６、３０１、３１９、３９７、４０２、４３５、４４６、４６２、４７９、５２３、５３２、６０５、６１０、６４５、６７６および６９５からなる群から選択される少なくとも１つの残基が、配列番号１または２のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸に置換されているという特徴を含む。好ましい実施形態では、このアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも９０％同一である。
【0006】
第２の実施形態では、本発明の変異型ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【0007】
第３の実施形態では、本発明の少なくとも１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼまたは本発明の少なくとも１つのＰｇｌＢ ＯＳＴをコードするポリヌクレオチドを含む組成物または宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞または大腸菌宿主細胞）が提供される。
【0008】
第４の実施形態では、グリコシル化タンパク質を作製するプロセスであって、
（ａ）本発明のＰｇｌＢおよび／または本発明のＰｇｌＢをコードするポリヌクレオチドを含む本発明の宿主細胞を、タンパク質の生産に好適な条件下で培養する工程；ならびに
（ｂ）前記宿主細胞からグリコシル化タンパク質を単離する工程
を含むプロセスが提供される。
（ａ）本発明のＰｇｌＢおよび／または本発明のＰｇｌＢをコードするポリヌクレオチドを含む本発明の宿主細胞を、タンパク質の生産に好適な条件下で培養する工程；ならびに
（ｂ）前記宿主細胞からグリコシル化タンパク質を単離する工程
を含むプロセスが提供される。
【0009】
第５の実施形態では、グリコシル化タンパク質を作製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスであって、
ｉ）以下：
ａ）本発明のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ；
ｂ）アミノ酸配列Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外のいずれの天然アミノ酸であってもよい）を含む少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質；ならびに
ｃ）ＰｇｌＢによって認識される脂質キャリア上の糖鎖
を一緒に混合する工程；
ｉｉ）タンパク質の少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列に糖鎖を転移してグリコシル化タンパク質を得るためにＰｇｌＢの酵素活性に好適な条件下でインキュベートする工程；ならびに
ｉｉｉ）前記グリコシル化タンパク質を単離する工程；
を含むプロセスが提供される。
ｉ）以下：
ａ）本発明のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ；
ｂ）アミノ酸配列Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外のいずれの天然アミノ酸であってもよい）を含む少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質；ならびに
ｃ）ＰｇｌＢによって認識される脂質キャリア上の糖鎖
を一緒に混合する工程；
ｉｉ）タンパク質の少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列に糖鎖を転移してグリコシル化タンパク質を得るためにＰｇｌＢの酵素活性に好適な条件下でインキュベートする工程；ならびに
ｉｉｉ）前記グリコシル化タンパク質を単離する工程；
を含むプロセスが提供される。
【0010】
第６の実施形態では、本発明のプロセスによって作製されるグリコシル化タンパク質が提供される。
【0011】
第７の実施形態では、グリコシル化タンパク質を形成するために、タンパク質のアミノ酸配列Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外のいずれの天然アミノ酸であってもよい）を含むグリコシル化コンセンサス配列のＮ残基に糖が結合しているグリコシル化タンパク質の生産における本発明のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼまたはその機能的断片の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1-1】図１－ＰｇｌＢにおける突然変異は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)血清型８の莢膜糖をタンパク質に転移する際により高いオリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性をもたらす。パネルＡは、肺炎連鎖球菌の莢膜糖をＥＰＡキャリアタンパク質に転移するために、ラウンド１、２、３、４、５、６および７からのＰｇｌＢを用いた場合の生産の併合増加倍率を示したものである。パネルＢは、種々のラウンドの突然変異の後に肺炎連鎖球菌血清型８糖でグリコシル化されたＥＰＡの増加を示すウエスタンブロットおよびクーマシー染色ゲルを示す。パネルＣは、点突然変異ＰｇｌＢＣｊを用いたバイオコンジュゲーション後の肺炎連鎖球菌血清型８糖を含むコンジュゲートの生産増加を示すクーマシー染色ゲルおよび抗肺炎連鎖球菌血清型８抗体をプローブとしたウエスタンブロットを示す。
【図2】図２－変異型ＰｇｌＢはまた、肺炎連鎖球菌血清型２２Ｆのタンパク質への転移の活性を増大させた。パネルＡは、肺炎連鎖球菌血清型２２Ｆの莢膜糖のタンパク質への転移における、ラウンド３、４および５のＰｇｌＢの活性の増大を示すＥＬＩＳＡ結果を示す。パネルＢは、第３、４および５ラウンドのＰｇｌＢからの、血清型２２Ｆ莢膜糖でグリコシル化されたＥＰＡの生産の増大のウエスタンブロット結果を示す。
【図3】図３－変異型ＰｇｌＢは、肺炎連鎖球菌血清型２３Ａおよび３５Ｂのタンパク質への転移の活性を増大させた。パネルＡは、転移を触媒するためにラウンド４、５および７のＰｇｌＢを用いた場合の、肺炎連鎖球菌血清型２３Ａ多糖によるＥＰＡのグリコシル化の増大を示すクーマシーゲルおよびウエスタンブロットの結果を示す。パネルＢは、野生型ＰｇｌＢを用いた場合と比較した、肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂの莢膜糖を転移するためにラウンド３ ＰｇｌＢを用いた場合のＥＰＡのグリコシル化の増大を示す。
【図4】図４－変異型ＰｇｌＢは、肺炎連鎖球菌血清型１９Ａのタンパク質への転移活性を増大させた。次のＰｇｌＢ：レーン１－不活性ＰｇｌＢ、レーン２－Ｙ７７Ｒ、Ｎ３１１ＶおよびＨ４７９Ｍ突然変異を含むＰｇｌＢ、レーン３－ラウンド６ ＰｇｌＢ、レーン４～１０－種々のラウンド７ ＰｇｌＢ突然変異、を用いた場合に肺炎連鎖球菌血清型１９Ａでグリコシル化されたＥＰＡの量に関するクーマシー染色およびウエスタンブロット結果。
【図5-1】図５－肺炎連鎖球菌莢膜多糖反復単位の構造。暗い丸はグルコース残基を示し、明るい丸はガラクトース残基を示し、「ｆ」が付いた明るい丸はガラクトフラノースを示し、暗い四角はＮ－アセチルグルコサミンを示し、明るい四角はＮ－アセチルガラクトサミンを示し、三角はラムノースを示し、上部が暗い水平に分割された菱形はグルクロン酸を示し、楕円はグリセロールを示し、星形はリビトールを示し、暗い四角はＮ－アセチルフコサミンを示し、中間の四角はＮ－アセチルマンノサミンを示し、対角線で分割された四角は４－アミノ－Ｎ－アセチルフコサミンを示し、水平に分割された菱形はガラクツロン酸を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本開示は、Ｄ／Ｅ－Ｚ１－Ｎ－Ｚ２－Ｓ／Ｔ（Ｚ１およびＺ２≠Ｐ）の少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質への糖の付加を触媒し得る高効率のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼを提供する。このような高効率のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＰｇｌＢを改変することによって達成される。例えば、単独または組合せにおいて有利な点突然変異を選択することで、Ｎ－グリコシル化タンパク質の生産の増大がもたらされる。
【0014】
本明細書に記載のＰｇｌＢ ＯＳＴの活性を確認するためのアッセイは当業者に周知であり（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット）、実施例２および３に記載されるアッセイを含む。いくつかの実施形態では、ＰｇｌＢ ＯＳＴは、場合により宿主細胞、場合により異種宿主細胞（すなわち、カンピロバクター細胞ではない宿主細胞）で発現される改変されたＰｇｌＢである。
【0015】
オリゴ糖および多糖は、本明細書に記載のいずれのオリゴ糖または多糖を含んでもよい。
【0016】
キャリアタンパク質は、本明細書に記載のいずれのキャリアタンパク質を含んでもよい。
【0017】
いくつかの実施形態では、ＰｇｌＢ ＯＳＴは、例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上のアミノ酸における修飾（例えば、ＰｇｌＢをコードするポリヌクレオチドにおけるアミノ酸置換またはヌクレオチド置換）、例えば、２～３０、３～２５、４～２０、５～２０、６～２０、７～２０または１０～２０のアミノ酸置換を含む。一実施形態において、置換は、配列番号１の以下の残基：５７；７７；５７および７７；３１１および７７；４６２および４７９（これらの両方の位置の突然変異は相乗作用してＰｇｌＢの活性を増加させる）；５７、７７および３１１；５７および４６２；５７、４６２および４７９；５７、４６２、４７９、７７および３１１；５７、４６２、４７９、３００、３０１、３０８および５７０；５７、４６２、４７９、３００、３０１、３０８、５７０および７７；５７、４６２、４７９、３００、３０１、３０８、５７０、７７および３１１に相当する位置における置換である。
【0018】
一実施形態において、以下の置換は、配列番号１の以下の残基に相当する位置に存在する（ここで、「／」は「または」を表す）：
Ａ５７Ｒ／Ｔ；Ｙ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７ＲおよびＹ７７Ｒ；Ｎ３１１ＶおよびＹ７７Ｒ；Ｙ４６２ＷおよびＨ４７９Ｍ（相乗突然変異）；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ４６２Ｗ／Ｔ／Ｎ；Ａ５７ＲおよびＹ４６２Ｗ；Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／ＮおよびＨ４７９Ｍ（相乗突然変異）；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／ＮおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｗ／Ｔ／ＮおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２ＷおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／ＦおよびＬ５７０Ｒ／Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１ＰおよびＬ５７０Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／ＦおよびＬ５７０Ｒ／Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８ＷおよびＬ５７０Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／ＶおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ、Ｌ５７０ＲおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／ＶおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｌ５７０ＲおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／Ｖ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ、Ｌ５７０Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／Ｖ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｌ５７０Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｌ５７０Ｒ、Ｙ７７Ｒ、Ｓ８０ＤおよびＮ３１１Ｖ。
Ａ５７Ｒ／Ｔ；Ｙ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７ＲおよびＹ７７Ｒ；Ｎ３１１ＶおよびＹ７７Ｒ；Ｙ４６２ＷおよびＨ４７９Ｍ（相乗突然変異）；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ４６２Ｗ／Ｔ／Ｎ；Ａ５７ＲおよびＹ４６２Ｗ；Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／ＮおよびＨ４７９Ｍ（相乗突然変異）；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／ＮおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｗ／Ｔ／ＮおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２ＷおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／ＦおよびＬ５７０Ｒ／Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１ＰおよびＬ５７０Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／ＦおよびＬ５７０Ｒ／Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８ＷおよびＬ５７０Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／ＶおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ、Ｌ５７０ＲおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／ＶおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｌ５７０ＲおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／Ｖ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ、Ｌ５７０Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／Ｖ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｌ５７０Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｌ５７０Ｒ、Ｙ７７Ｒ、Ｓ８０ＤおよびＮ３１１Ｖ。
【0019】
いくつかの実施形態において、改変されたＰｇｌＢの単一の点突然変異が、多糖によるキャリアタンパク質のグリコシル化の効率を高めて、グリコシル化タンパク質の相対的収量の増大をもたらし得る。相対的収量の増大は、特定のアミノ酸置換を含む改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴにより生産されたグリコシル化タンパク質の収量を、そのアミノ酸置換を含まない、相当するＰｇｌＢ ＯＳＴにより生産されるグリコシル化タンパク質の収量で割ることによって求めることができる。一実施形態において、改変されたＰｇｌＢにおける単一の点突然変異の導入は、相対的収量を、その特定の点突然変異がない相当するＰｇｌＢの割合の約１．１倍～約１０倍、約１．２倍～約７倍、約１．３倍～約５倍、約１．５倍～約２．５倍または約１．５倍～約６倍増大させることができる。この単一の点突然変異のプラスの効果は、ＰｇｌＢにおける複数の点突然変異と組み合わせた場合に掛け合わせが可能である。いくつかの実施形態では、改変されたＰｇｌＢは、その点突然変異の組合せが導入されていない相当するＰｇｌＢ（元のＰｇｌＢ）を用いた場合に得られる収量の２倍を超えて、５倍を超えて、１０倍を超えて、５０倍を超えて、１００倍を超えて、２００倍を超えて、５００倍を超えて、７００倍を超えて、１，０００倍を超えて、２，０００倍を超えて、３，０００倍を超えて、４，０００倍を超えて、５，０００倍を超えて、６，０００倍を超えて、７，０００倍を超えて、８，０００倍を超えて、１０，０００倍を超えてグリコシル化タンパク質の相対的収量を増大させる、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸置換を含み得る。
【0020】
いくつかの実施形態では、改変されたＰｇｌＢおよび改変されたＰｇｌＢの非変異形態のタンパク質グリコシル化の収量は、改変されたＰｇｌＢと元のＰｇｌＢの、還元末端にＮ－アセチル糖がない多糖またはオリゴ糖を有するタンパク質のグリコシル化収量を比較することによって比較することができる。例えば、還元末端にグルコースを有する糖、例えば、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)莢膜多糖またはＢ群連鎖球菌莢膜糖、例えば、図５および６に示されるもの。一実施形態において、還元末端にＮ－アセチル糖がない多糖またはオリゴ糖は、肺炎連鎖球菌血清型８の莢膜糖である。
【0021】
いくつかの実施形態では、還元末端にＮ－アセチル糖がない多糖またはオリゴ糖を有するタンパク質の改変されたＰｇｌＢのグリコシル化収量は、非変異型ＰｇｌＢの、還元末端にＮ－アセチル糖がある多糖またはオリゴ糖を有するグリコシル化タンパク質の収量と比較される。例えば、還元末端にグルコースを有する糖、例えば、肺炎連鎖球菌莢膜多糖またはＢ群連鎖球菌莢膜糖、例えば、図５および６に示されるもの。一実施形態において、還元末端にＮ－アセチル糖がない多糖またはオリゴ糖は、肺炎連鎖球菌血清型８の莢膜糖である。
【0022】
いくつかの実施形態では、改変されたＰｇｌＢの、肺炎連鎖球菌血清型８莢膜糖でグリコシル化されたタンパク質のグリコシル化収量は、非変異型ＰｇｌＢの少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．５倍、１．７倍、２倍、２．５倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍、５００倍または１，０００倍増大する。
【0023】
いくつかの実施形態において、改変されたＰｇｌＢは、肺炎連鎖球菌血清型８莢膜糖によるタンパク質のグリコシル化のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ収量を、改変されたＰｇｌＢの非変異形態で達成される収量の約１．２倍～約５，０００倍、約１．５倍～約２，０００倍、約２倍～約１，０００倍、約２倍～約２０倍または約２０倍～約２，０００倍増大させ得る。
【0024】
いくつかの実施形態では、改変されたＰｇｌＢは、約１％～約７０％、約３％～約６５％、約５％～約６０％、約５％～約５５％、約１０％～約５０％、約１５％～約４５％、約２０％～約４０％、または約２５％～約３５％のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化レベルまたはｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化レベルをもたらし得る。いくつかの実施形態では、改変されたＰｇｌＢは、少なくとも１％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、または少なくとも７０％の、キャリアタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化レベルまたはｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化レベルをもたらし得る。
【0025】
改変されたＰｇｌＢは、ＰｇｌＢを有するいずれの生物に由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、改変されたＰｇｌＢは、原核生物に由来する。いくつかの実施形態では、改変されたＰｇｌＢは、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)（Ｃ．ジェジュニ）、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)（Ｃ．コリ）、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)（Ｃ．ラリ）、カンピロバクター・ウプサリエンシス(Campylobacter upsaliensis)（Ｃ．ウプサリエンシス）、カンピロバクター・カーバス(Campylobacter curvus)（Ｃ．カーバス）、カンピロバクター・コンシスス(Campylobacter concisus)（Ｃ．コンシスス）、カンピロバクター・ホミニス(Campylobacter hominis)（Ｃ．ホミニス）、カンピロバクター・グラシリス(Campylobacter gracilis)（Ｃ．グラシリス）、カンピロバクター・ショワエ(Campylobacter showae)（Ｃ．ショワエ）、スルフリモナス・オートトロフィカ(Sulfurimonas autotrophica)（Ｓ．オートトロフィカ）、スルフリモナス・デニトリフィカンス(Sulfurimonas denitrificans)（Ｓ．デニトリフィカンス）、スルフリモナス・デレイアヌム(Sulfurimonas deleyianum)（Ｓ．デレイアヌム）、スルフリクルブム・クジエンス(Sulfuricurvum kujiense)（Ｓ．クジエンス）、ナウチリア・プロフンディコラ(Nautilia profundicola)（Ｎ．プロフンディコラ）、スルフボラム属(Sulfuvorum sp.)ＮＢＣ３７－１、ウォリネラ・サクシノゲネス(Wolinella succinogenes)（Ｗ．サクシノゲネス）、カミニバクター・メディアトランティカス(Caminibacter mediatlanticus)（Ｃ．メディアトランティカス）、ニトラチルプトル属(Nitratiruptor sp.)ＳＢ１５５－２、ヘリコバクター・プロラム(Helicobacter pullorum)（Ｈ．プロラム）、ヘリコバクター・カナデンシス(Helicobacter Canadensis)（Ｈ．カナデンシス）、ヘリコバクター・ウィンガメンシス(Helicobacter winghamensis)（Ｈ．ウィンガメンシス）、デスルフロバクテリウム・サーモリトル(Desulfurobacterium thermolithotr)（Ｄ．サーモリトル）、デスルホミクロビウム・バキュラツム(Desulfomicrobium baculatum)（Ｄ．バキュラツム）、デスルホビブリオ・ブルガリス(Desulfovibrio vulgaris)（Ｄ．ブルガリス）、デスルホビブリオ・アルカリフィルス(Desulfovibrio alkaliphilus)（Ｄ．アルカリフィルス）、デスルホハロビウム・レトバエンス(Desulfohalobium retbaense)（Ｄ．レトバエンス）、デフェリバクター・デスルフリカンス(Deferribacter desulfuricans)（Ｄ．デスルフリカンス）、デスルホビブリオ・サレキシゲネス(Desulfovibrio salexigenes)（Ｄ．サレキシゲネス）、デスルホビブリオ・ピゲル(Desulfovibrio piger)（Ｄ．サレキシゲネス）、デスルホビブリオ・エスペエンシス(Desulfovibrio aespoeensis)（Ｄ．エスペエンシス）、カンド・プニセイスピリラム・マリナム(Cand. Puniceispirillum marinum)、カルディテリビブリオビブリオ・ニトロレデュセンス(Calditerrivibrio nitroreducens)（Ｃ．ニトロレデュセンス）またはメタノテルムス・フェルビデュス(Methanothermus fervidus)（Ｍ．フェルビデュス）に由来する。
【0026】
本明細書で特定される点突然変異は一般に、Ｃ．ジェジュニのＰｇｌＢの配列（例えば、配列番号１のＣ．ジェジュニのＰｇｌＢ）に見出されるものである。本発明のさらなる態様は、配列番号１のＣ．ジェジュニＰｇｌＢについて開示されているものに相当する突然変異を含む、上記に確認される種のいずれかのＰｇｌＢである。
【0027】
いくつかの実施形態では、ＰｇｌＢ ＯＳＴポリペプチドは、改変されたＰｇｌＢ、改変されたＰｇｌＢホモログまたは改変された形態の天然ＰｇｌＢ変異体である。ＰｇｌＢＣｊホモログは天然ＰｇｌＢＣｊホモログおよび非天然ＰｇｌＢＣｊホモログを含み得る。ＰｇｌＢＣｊホモログは、配列番号１のＰｇｌＢＣｊと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を含み得る。配列同一性の程度は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジーアラインメントアルゴリズム、ＣｌｕｓｔａｌＷ プログラムまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用することによって決定され得る。グローバルアラインメントを用いるアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ）が好ましい。
【0028】
いくつかの実施形態では、改変されたＰｇｌＢは、改変されたＰｇｌＢＣｌ、改変されたＰｇｌＢＣｌホモログまたは改変された形態の天然ＰｇｌＢＣｌ変異体である。ＰｇｌＢＣｌホモログは、天然ＰｇｌＢＣｌホモログおよび非天然ＰｇｌＢＣｌホモログを含み得る。ＰｇｌＢＣｌホモログは、配列番号２のＰｇｌＢＣｌと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を含み得る。配列同一性の程度は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジーアラインメントアルゴリズム、ＣｌｕｓｔａｌＷ プログラムまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用することによって決定され得る。グローバルアラインメントを用いるアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ）が好ましい。
【0029】
いくつかの実施形態では、改変されたＰｇｌＢは、ＰｇｌＢ断片、例えば、ＰｇｌＢＣｊ断片を含む。いくつかの実施形態では、ＰｇｌＢ断片は、例えば配列番号１の全長ＰｇｌＢの少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、または少なくとも６５０の連続するアミノ酸を含む。
【0030】
ＰｇｌＢＣｊの修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴは、修飾された野生型Ｎ－ＯＳＴ、例えば、野生型ＰｇｌＢＣｊである。いくつかの実施形態では、野生型ＰｇｌＢＣｊは、配列番号９、またはその天然変異体の野生型ＰｇｌＢＣｊである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴは、修飾された野生型Ｎ－ＯＳＴ、例えば、野生型ＰｇｌＢＣｊである。いくつかの実施形態では、野生型ＰｇｌＢＣｊは、配列番号９、またはその天然変異体の野生型ＰｇｌＢＣｊである。
【0031】
【0032】
いくつかの実施形態では、配列番号１のＸ５７、Ｘ６３、Ｘ９４、Ｘ１０１、Ｘ１７２、Ｘ１７６、Ｘ１９１、Ｘ１９３、Ｘ２３３、Ｘ２３４、Ｘ２５５、Ｘ２８６、Ｘ２９５、Ｘ３０１、Ｘ３１９、Ｘ３９７、Ｘ４０２、Ｘ４２５、Ｘ４３５、Ｘ４４６、Ｘ４６２、Ｘ４７９、Ｘ５２３、Ｘ５３２、Ｘ６０１、Ｘ６０５、Ｘ６０６、Ｘ６１０、Ｘ６４５、Ｘ６７６およびＸ６９５のアミノ酸の１以上、またはそれらの任意の組合せが修飾される。一実施形態において、Ｘ５７、Ｘ３０１、Ｘ３１９、Ｘ４６２、Ｘ４７９およびＸ５２３の１以上、またはそれらの任意の組合せが例えば置換によって修飾される。一実施形態では、Ｘ５７、Ｘ４６２およびＸ４７９の１以上が修飾される。一実施形態では、Ｘ５７が修飾される。一実施形態では、Ｘ４６２およびＸ４７９が修飾される。一実施形態では、Ｘ５７、Ｘ４６２およびＸ４７９が置換される。一実施形態では、Ａ５７Ｒ置換がなされる。一実施形態では、Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２ＷおよびＨ４７９Ｍ置換がなされる。
【0033】
（ａ）ＰｇｌＢＣｌの修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾されたＰｇｌＢ ＯＳＴは、修飾された野生型ＰｇｌＢ ＯＳＴ、例えば、野生型ＰｇｌＢＣｌ（カンピロバクター・ラリのＰｇｌＢ）である。いくつかの実施形態では、野生型ＰｇｌＢＣｊは、配列番号１０の、またはその天然変異体の野生型ＰｇｌＢＣｌである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾されたＰｇｌＢ ＯＳＴは、修飾された野生型ＰｇｌＢ ＯＳＴ、例えば、野生型ＰｇｌＢＣｌ（カンピロバクター・ラリのＰｇｌＢ）である。いくつかの実施形態では、野生型ＰｇｌＢＣｊは、配列番号１０の、またはその天然変異体の野生型ＰｇｌＢＣｌである。
【0034】
【0035】
別の実施形態では、本明細書では、Ｎ３１４Ｖ置換およびＹ７９Ｒ置換を含む改変されたＰｇｌＢＣｌが提供される。さらなる実施形態では、Ａ５９Ｒ突然変異を含む改変されたＰｇｌＢＣｌが提供される。さらなる実施形態では、Ｙ４６８ＷおよびＨ４８５Ｍ突然変異を含む改変されたＰｇｌＢＣｌが提供される。さらなる実施形態では、Ａ５９Ｒ、Ｙ４６８ＷおよびＨ４８５Ｍ置換を含む改変されたＰｇｌＢＣｌが提供される。さらなる実施形態では、Ｎ３１４Ｖ、Ｙ７９Ｒ、Ａ５９Ｒ、Ｙ４６８ＷおよびＨ４８５Ｍ置換を含む改変されたＰｇｌＢＣｌが提供される。
【0036】
カンピロバクター・コリＰｇｌＢ
本発明のさらなる態様は、特に、Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外のいずれの天然アミノ酸であってもよい）グリコシル化コンセンサス配列を含むキャリアタンパク質へのある種の糖の転位に関してより高い活性を有することが判明したカンピロバクター・コリに由来する天然ＰｇｌＢである。Ｃ．コリ株ＥＦＭ３７５６８（配列番号１２）の場合、少なくともフレクスナー赤痢菌(S. flexneri)２ａ、３ａおよび６、ならびに大腸菌Ｏ１８の転移に関して、ＯＳＴ活性が天然Ｃ．ジェジュニＰｇｌＢ（配列番号１）よりも高いことが判明している。
本発明のさらなる態様は、特に、Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外のいずれの天然アミノ酸であってもよい）グリコシル化コンセンサス配列を含むキャリアタンパク質へのある種の糖の転位に関してより高い活性を有することが判明したカンピロバクター・コリに由来する天然ＰｇｌＢである。Ｃ．コリ株ＥＦＭ３７５６８（配列番号１２）の場合、少なくともフレクスナー赤痢菌(S. flexneri)２ａ、３ａおよび６、ならびに大腸菌Ｏ１８の転移に関して、ＯＳＴ活性が天然Ｃ．ジェジュニＰｇｌＢ（配列番号１）よりも高いことが判明している。
【0037】
Ｃ．コリ株ＣＤＧ５７２１８（配列番号１３）由来のＰｇｌＢを、グリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質への大腸菌Ｏ１８糖の転移におけるその活性に関して試験した。このＯＳＴ活性は、Ｃ．ジェジュニのＰｇｌＢと配列番号１３のＰｇｌＢの間で同等であった。
【0038】
Ｃ．コリ株ＥＩＡ９００８５（配列番号１４）由来のＰｇｌＢを、グリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質への大腸菌Ｏ１８糖の転移におけるその活性に関して試験した。このＯＳＴ活性は、Ｃ．ジェジュニのＰｇｌＢのＯＳＴ活性よりもやや大きかった。本発明者らは、ＰｇｌＢについての、グリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質への糖の転移を触媒することに関して、Ｃ．コリのいくつかの株由来の野生型ＰｇｌＢは、Ｃ．ジェジュニ由来のＰｇｌＢと同等であるかより優れていると結論付ける。Ｃ．コリ ＰｇｌＢの３つの株の配列を図７に示すが、株ＥＦＭ３７５６８のＰｇｌＢ配列は、調べたさらに２つのＰｇｌＢのアミノ酸配列からわずかに異なる。Ｃ．コリＥＦＭ３７５６８ ＰｇｌＢは特に良好な結果をもたらした。
【0039】
本発明のさらなる実施形態は、アミノ酸配列Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外のいずれの天然アミノ酸であってもよい）を含むグリコシル化コンセンサス配列のＮ残基に糖が結合しているグリコシル化タンパク質の生産における、カンピロバクター・コリ由来のＰｇｌＢ（ＰｇｌＢＣ．ｃｏｌｉ）オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）またはその機能的断片の使用を提供する。一実施形態において、この使用は、配列番号１２、１３または１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＣ．コリ ＰｇｌＢの使用である。場合により、Ｃ．コリ ＰｇｌＢは、配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【0040】
本発明のさらなる実施形態は、Ｃ．ｃｏｌｉ ＰｇｌＢへの本明細書に記載のアミノ酸置換の導入を開示する。一実施形態において、Ｃ．コリＰｇｌＢは、Ｘ５７、Ｘ６３、Ｘ９４、Ｘ１０１、Ｘ１７２、Ｘ１７６、Ｘ１９１、Ｘ１９３、Ｘ２３３、Ｘ２３４、Ｘ２５５、Ｘ２８６、Ｘ２９５、Ｘ３０１、Ｘ３１９、Ｘ３９７、Ｘ４０２、Ｘ４２６、Ｘ４３６、Ｘ４４７、Ｘ４６３、Ｘ４８０、Ｘ５２４、Ｘ５３３、Ｘ６０２、Ｘ６０６、Ｘ６０７、Ｘ６１１、Ｘ６４６、Ｘ６７７およびＸ６９６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が配列番号１２のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸に置換されているという特徴を含む。一実施形態において、配列番号１２のアミノ酸Ｘ５７、Ｘ４６３およびＸ４８０に相当する残基のいずれか１つに置換を含むＰｇｌＢＣ．ｃｏｌｉオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたは機能的断片が提供され；場合により、前記置換は、Ａ５７Ｒ、Ｙ４６３ＷおよびＨ４８０Ｍのうち少なくとも１つである。一実施形態において、ＰｇｌＢＣ．ｃｏｌｉは、Ｘ５７、Ｘ７７、Ｘ３１１、Ｘ４６２および／またはＸ４８０の残基に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施形態において、アミノ酸置換は、これらの位置の１、２、３、４または５箇所におけるものである。一実施形態において、これらの置換は、Ａ５７Ｒ、Ｙ７７Ｒ、Ｎ３１１Ｖ、Ｙ４６３Ｗおよび／またはＨ４８０Ｍの残基の少なくとも１つのアミノ酸置換である。一実施形態において、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのこれらの突然変異が、場合により配列番号１２の配列を有するＣ．コリＰｇｌＢのアミノ酸配列に導入される。
【0041】
オリゴ糖および多糖
本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴによってタンパク質に連結することができるオリゴ糖は、約２～約１００の単糖単位、例えば、２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００、または４～９０、６～８０、８～７０、１０～６０、１５～５０、２０～４０または２５～４０の単糖単位を有し得る。本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴによってタンパク質に連結することができる多糖は、１００を超える単糖単位、例えば、少なくとも１０１、１１０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００単糖単位以上を有し得る。例えば、１００～５００、１００～３００または１００～２００の単糖単位。
本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴによってタンパク質に連結することができるオリゴ糖は、約２～約１００の単糖単位、例えば、２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００、または４～９０、６～８０、８～７０、１０～６０、１５～５０、２０～４０または２５～４０の単糖単位を有し得る。本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴによってタンパク質に連結することができる多糖は、１００を超える単糖単位、例えば、少なくとも１０１、１１０、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００単糖単位以上を有し得る。例えば、１００～５００、１００～３００または１００～２００の単糖単位。
【0042】
これらのタンパク質またはＰｇｌＢ ＯＳＴは、本明細書に開示されるいずれのＰｇｌＢ ＯＳＴまたはいずれのタンパク質も含み得る。
【0043】
いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖の還元末端の糖は、ペントース、ヘキソース、またはヘプトースである。いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖の還元末端の糖は、アルドペントースまたはケトペントースである。いくつかの実施形態では、ペントースは、Ｄ－アラビノース、Ｄ－リキソース、Ｄ－リボース、Ｄ－キシロース、Ｄ－リブロース、またはＤ－キシルロースである。いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖の還元末端の糖は、アルドヘキソースまたはケトヘキソースである。いくつかの実施形態では、ヘキソースは、例えば、Ｄ－アロース、Ｄ－アルトロース、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｄ－グロース、Ｄ－イドース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－タロース、Ｄ－プシコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－ソルボースまたはＤ－タガトースである。いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖の還元末端の糖は、デオキシまたはジ－デオキシ糖、例えば、例えば、ラムノース、フコース、またはアベクオースである。いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖の還元末端の糖は、アルドヘプトースまたはケトヘプトースである。いくつかの実施形態では、ヘプトースは、マンノヘプトースである。好ましい実施形態では、オリゴ糖または多糖の還元末端の糖は、グルコースである。
【0044】
本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴによってタンパク質のＮ残基に連結することができるオリゴ糖および多糖は、いずれの生物、例えば、原核生物または真核生物に通常見られるものであってもよい。いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、病原生物、例えば、ヒト病原体または動物病原体（例えば、農用動物またはペット）由来のものである。いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、細菌生物由来のものである。いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、大腸菌、赤痢菌(Shigella sonnei)、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)、サルモネラ菌属(Salmonella sp)（例えば、Ｓ.エンテリカ亜種エンテリカ(S. enterica subsp. Enterica)、Ｓ．エンテリカ亜種サラマエ(S. enterica subsp. Salamae)、Ｓ．エンテリカ亜種アリゾナエ(S. enterica subsp. arizonae)、Ｓ．エンテリカ亜種ジアリゾナエ(S. enterica subsp. Diarizonae)、Ｓ．エンテリカ亜種ホウテナエ (S. enterica subsp. Houtenae)、Ｓ．ボンゴリ(S. bongori)、およびＳ．エンテリカ亜種インディカ(S. enterica subsp. Indica)）、シュードモナス属(Pseudomonas sp)（緑膿菌(P. aeruginosa)）、クレブシエラ属(Klebsiella sp.)（例えば、Ｋ．ニューモニエ(K. pneumonia)）、アシネトバクター(Acinetobacter)、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、コレラ菌(Vibrio cholera)、リステリア属(Listeria sp.)、例えば、Ｌ．モノサイトゲネス(L. monocytogenes)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、パラ百日咳菌(Bordetella parapertussis)、鼻疽菌(Burkholderia mallei)および類鼻疽菌(pseudomallei)、野兎病菌(Francisella tularensis)、カンピロバクター属(Campylobacter sp.)（Ｃ．ジェジュニ(C. jejuni)）；クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、大腸菌(E. coli)、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalacticae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)、腸球菌(Enterococcus faecalis)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、淋菌(Neisseria gonorrhoea)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)、森林型熱帯リーシュマニア(Leishmania major)由来のものであり得る。
【0045】
いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、抗原、例えばヒトまたは動物（例えば、農用動物またはペット）において免疫原性があるエピトープを含む。いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、大腸菌のＯ抗原（例えば、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８、Ｏ１９、Ｏ２０、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３、Ｏ２４、Ｏ２５、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９７、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、Ｏ１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４，Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、Ｏ１８７）、フレクスナー赤痢菌Ｏ１Ａ、Ｏ１Ｂ、Ｏ２Ａ、Ｏ３Ａ、Ｏ６、赤痢菌Ｏ抗原、志賀赤痢菌Ｏ１、サルモネラ菌属（Ｓ.エンテリカ亜種エンテリカ、Ｓ．エンテリカ亜種サラマエ、Ｓ．エンテリカ亜種アリゾナエ、Ｓ．エンテリカ亜種ジアリゾナエ、Ｓ．エンテリカ亜種ホウテナエ、Ｓ．ボンゴリ、またはＳ．エンテリカ亜種インディカ抗原、および［４４］に詳細に示されるようなＯ１～６７型、シュードモナス属（緑膿菌Ｏ血清型１～２０［４５］）、クレブシエラ属（例えば、Ｋ．ニューモニエ血清型Ｏ１、Ｏ２（および亜血清型）、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２［４６］）、アシネトバクターＯ抗原（例えば、［４７］に示されるＡ．バウマニ(A. baumannii)Ｏ抗原）、クラミジア・トラコマチスＯ抗原（血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、コレラ菌Ｏ抗原Ｏ１～１５５、リステリア属、特に、Ｌ．モノサイトゲネス１、２、３、４型およびその亜血清型、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１～１５ Ｏ抗原、パラ百日咳菌Ｏ抗原、鼻疽菌および類鼻疽菌Ｏ抗原、野兎病菌、カンピロバクター属（Ｃ．ジェジュニ）；クロストリジウム・ディフィシル（莢膜多糖血清型Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ１、Ｓ４、Ｄ、Ｃｄ－５、K Toma et al. 1988、およびウェルシュ菌(C. perfringens)血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥ）、黄色ブドウ球菌血清型５または血清型８由来の莢膜糖、肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１６Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂ由来の莢膜糖、化膿連鎖球菌（Ｂ群連鎖球菌属血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、またはＶＩＩＩ）由来の莢膜血清型多糖、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ａ群連鎖球菌属莢膜多糖）、髄膜炎菌（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ、Ｙ、Ｘ）、カンジダ・アルビカンス、ヘモフィルス・インフルエンザ、腸球菌莢膜多糖Ｉ～Ｖ型；およびその他の表面多糖構造、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ糖脂質、髄膜炎菌ピリンＯグリカンおよびリポオリゴ糖（ＬＯＳ）、ヘモフィルス・インフルエンザＬＯＳ、森林型熱帯リーシュマニア・リポホスホグリカン、腫瘍関糖鎖抗原（マラリアグリコシルホスファチジルイノシトール、結核菌アラビノマンナンのものを含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、黄色ブドウ球菌またはチフス菌ｓｖ．多糖である。いくつかの実施形態では、多糖は、黄色ブドウ球菌ＣＰ５もしくはＣＰ８またはネズミチフス菌(S. enterica sv. Typhimurium)ＬＴ２多糖である。
【0047】
いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、還元末端にＮ－アセチル糖を含む。いくつかの実施形態では、還元末端にＮ－アセチル糖を含むオリゴ糖または多糖は、例えば、大腸菌のＯ抗原（例えば、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１３、Ｏ１４、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８、Ｏ１９、Ｏ２１、Ｏ２２、Ｏ２３、Ｏ２４、Ｏ２５、Ｏ２６、Ｏ２７、Ｏ２８、Ｏ２９、Ｏ３０、Ｏ３２、Ｏ３３、Ｏ３４、Ｏ３５、Ｏ３６、Ｏ３７、Ｏ３８、Ｏ３９、Ｏ４０、Ｏ４１、Ｏ４２、Ｏ４３、Ｏ４４、Ｏ４５、Ｏ４６、Ｏ４８、Ｏ４９、Ｏ５０、Ｏ５１、Ｏ５２、Ｏ５３、Ｏ５４、Ｏ５５、Ｏ５６、Ｏ５７、Ｏ５８、Ｏ５９、Ｏ６０、Ｏ６１、Ｏ６２、Ｏ６３、Ｏ６４、Ｏ６５、Ｏ６６、Ｏ６８、Ｏ６９、Ｏ７０、Ｏ７１、Ｏ７３、Ｏ７４、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７７、Ｏ７８、Ｏ７９、Ｏ８０、Ｏ８１、Ｏ８２、Ｏ８３、Ｏ８４、Ｏ８５、Ｏ８６、Ｏ８７、Ｏ８８、Ｏ８９、Ｏ９０、Ｏ９１、Ｏ９２、Ｏ９３、Ｏ９５、Ｏ９６、Ｏ９８、Ｏ９９、Ｏ１００、Ｏ１０１、Ｏ１０２、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１０５、Ｏ１０６、Ｏ１０７、Ｏ１０８、Ｏ１０９、Ｏ１１０、Ｏ１１１、Ｏ１１２、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１５、Ｏ１１６、Ｏ１１７、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２０、Ｏ１２１、Ｏ１２３、Ｏ１２４、Ｏ１２５、Ｏ１２６、Ｏ１２７、Ｏ１２８、Ｏ１２９、Ｏ１３０、Ｏ１３１、Ｏ１３２、Ｏ１３３、Ｏ１３４、Ｏ１３５、Ｏ１３６、Ｏ１３７、Ｏ１３８、Ｏ１３９、Ｏ１４０、Ｏ１４１、Ｏ１４２、Ｏ１４３、Ｏ１４４，Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１４７、Ｏ１４８、Ｏ１４９、Ｏ１５０、Ｏ１５１、Ｏ１５２、Ｏ１５３、Ｏ１５４、Ｏ１５５、Ｏ１５６、Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ１５９、Ｏ１６０、Ｏ１６１、Ｏ１６２、Ｏ１６３、Ｏ１６４、Ｏ１６５、Ｏ１６６、Ｏ１６７、Ｏ１６８、Ｏ１６９、Ｏ１７０、Ｏ１７１、Ｏ１７２、Ｏ１７３、Ｏ１７４、Ｏ１７５、Ｏ１７６、Ｏ１７７、Ｏ１７８、Ｏ１７９、Ｏ１８０、Ｏ１８１、Ｏ１８２、Ｏ１８３、Ｏ１８４、Ｏ１８５、Ｏ１８６、Ｏ１８７）、黄色ブドウ球菌（S. Aureus）の莢膜多糖（例えば、ＣＰ５またはＣＰ８）、野兎病菌Ｓｃｈｕ４莢膜多糖、肺炎連鎖球菌莢膜の莢膜多糖（例えば、ＣＰ１、４、５、１２、２５、３８、４４、４５または４６）、髄膜炎菌ピリンＯグリカン、鼻疽菌および類鼻疽菌Ｏ抗原、パラ百日咳菌Ｏ抗原、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１～１５Ｏ抗原、リステリア属Ｏ抗原、特に、リステリア・モノサイトゲネスのＯ抗原１、２、３、４型、シュードモナス属のＯ抗原（緑膿菌Ｏ血清型１～２０）、クレブシエラ属のＯ抗原（例えば、Ｋ．ニューモニエ血清型Ｏ１、Ｏ２（および亜血清型）、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９、Ｏ１０、Ｏ１１、Ｏ１２）、赤痢菌属（例えば、志賀赤痢菌、赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ボイド赤痢菌(S. boydii)）のＯ抗原、アシネトバクターＯ抗原（例えば、Ａ．バウマニＯ抗原、またはリステリア属のＯ抗原）を含み得る。
【0048】
Ｎ－アセチル糖は、糖の１以上の炭素原子にアミノ－アセチル（Ｎ－アセチル）置換基を含み得る。例えば、Ｎ－アセチル糖は、グルコース単位などの単糖単位のＣ２原子にＮ－アセチル置換基を含み得る（Ｎ－アセチルグルコサミン）。
【0049】
いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、還元末端にＮ－アセチル化されていない糖を含む。いくつかの実施形態では、還元末端に非Ｎ－アセチル化糖を含むオリゴ糖または多糖としては、例えば、大腸菌Ｏ２０、サルモネラ属（例えば、Ｓ.エンテリカ亜種エンテリカ、Ｓ．エンテリカ亜種サラマエ、Ｓ．エンテリカ亜種アリゾナエ、Ｓ．エンテリカ亜種ジアリゾナエ、Ｓ．エンテリカ亜種ホウテナエ、Ｓ．ボンゴリ、またはＳ．エンテリカ亜種インディカまたはチフス菌）の抗原、１～６７型のＯ抗原、Ａ群連鎖球菌（化膿連鎖球菌）、Ｂ群連鎖球菌、および肺炎連鎖球菌ＣＰＳ血清型の莢膜多糖（それらの莢膜遺伝子群にｗｃｈＡ、ｗｃｊＧ、またはｗｃｊＨをコードするすなわち、ＣＰ１、４、５、１２、２５、３８、４４、４５、４６を除く全ての血清型）、またはサルモネラ菌ｓｖ．（Ｓ．エンテリカｓｖ．）Ｏ抗原を含み得る。
【0050】
いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、黄色ブドウ球菌ＣＰ５またはＣＰ８またはネズミチフス菌(S. enterica sv. Typhimurium)ＬＴ２多糖、コレラ菌Ｏ抗原（例えば、Ｏ１～１５５）、またはリステリア属Ｏ抗原（例えば、Ｌ．モノサイトゲネス１、２、３、４型）を含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、例えば、黄色ブドウ球菌血清型５、８または緑膿菌Ｏ抗原血清型Ｏ２、Ｏ５、Ｏ１１、Ｏ１６の莢膜多糖など、その還元末端にＤ－Ｎ－アセチルフコサミン（Ｄ－ＦｕｃＮＡｃ）残基を含む。
【0052】
いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、その還元末端に４－アミノ－ｄ－Ｎ－アセチルフコサミン（Ｄ－ＦｕｃＮＡｃ４Ｎ）残基を含み、例えば、血清型１のような肺炎連鎖球菌、赤痢菌Ｏ抗原、またはプレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)Ｏ１７由来のオリゴ糖または多糖が含まれる。
【0053】
いくつかの実施形態では、例えば、緑膿菌Ｏ抗原血清型Ｏ６、Ｏ１、または野兎病菌血清型Ｓｃｈｕ４などのオリゴ糖または多糖は、その還元末端にＤ－Ｎ－アセチルキノサミン（Ｄ－ＱｕｉＮＡｃ）残基を含む。
【0054】
いくつかの実施形態では、例えば、Ｓ．エンテリカＬＴ２などのオリゴ糖または多糖は、その還元末端にガラクトース残基を含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、肺炎連鎖球菌莢膜多糖血清型５、大腸菌Ｏ１、Ｏ２、サカザキ菌(Cronobacter sakazakii)Ｏ５、すなわち、β型でＬ－ラムノースに１－４結合した還元末端Ｄ－ＧｌｃＮＡｃを有する多糖およびオリゴ糖を含む。
【0056】
タンパク質
本発明の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴによってグリコシル化されるタンパク質は、グリコシル化コンセンサス配列Ｄ／Ｅ－Ｚ１－Ｎ－Ｚ２－Ｓ／Ｔ（Ｚ１およびＺ２≠Ｐ）に位置する少なくとも１つのＮ残基を含むタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、キャリアタンパク質である。改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴの活性は、キャリアタンパク質に糖免疫原を共有結合することができる。キャリアタンパク質は、結合した糖免疫原にＴ依存性免疫応答を生じさせるＴ細胞エピトープを提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、バイオ医薬タンパク質であり、本発明の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴはそれに少なくとも１つの糖を付加して、そのバイオ医薬タンパク質の適正なグリコシル化または適正な折り畳みまたは安定性の向上を達成する。一実施形態において、バイオ医薬タンパク質は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の抗原に結合し得る断片である。一実施形態において、バイオ医薬タンパク質は、エリスロポエチン、成長ホルモン、ヒトインスリン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、組織プラスミノーゲン活性化因子、グルカゴン、ゴナドトロピン、コロニー刺激因子、インターフェロンα、βまたはγ、インターロイキン、例えば、インターロイキン２、または腫瘍壊死因子である。
本発明の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴによってグリコシル化されるタンパク質は、グリコシル化コンセンサス配列Ｄ／Ｅ－Ｚ１－Ｎ－Ｚ２－Ｓ／Ｔ（Ｚ１およびＺ２≠Ｐ）に位置する少なくとも１つのＮ残基を含むタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、キャリアタンパク質である。改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴの活性は、キャリアタンパク質に糖免疫原を共有結合することができる。キャリアタンパク質は、結合した糖免疫原にＴ依存性免疫応答を生じさせるＴ細胞エピトープを提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、バイオ医薬タンパク質であり、本発明の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴはそれに少なくとも１つの糖を付加して、そのバイオ医薬タンパク質の適正なグリコシル化または適正な折り畳みまたは安定性の向上を達成する。一実施形態において、バイオ医薬タンパク質は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の抗原に結合し得る断片である。一実施形態において、バイオ医薬タンパク質は、エリスロポエチン、成長ホルモン、ヒトインスリン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、組織プラスミノーゲン活性化因子、グルカゴン、ゴナドトロピン、コロニー刺激因子、インターフェロンα、βまたはγ、インターロイキン、例えば、インターロイキン２、または腫瘍壊死因子である。
【0057】
キャリアタンパク質は、本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴによってオリゴ糖または多糖に連結することができる。
【0058】
キャリアタンパク質は、いずれの天然キャリアタンパク質（ＰｇｌＢ ＯＳＴと同じ生物に由来する）であってもまたはいずれの異種キャリアタンパク質（ＰｇｌＢ ＯＳＴとは異なる生物に由来する）であってもよい。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、免疫原である。キャリアタンパク質は、全長タンパク質またはその断片であり得る。例示的キャリアタンパク質としては、限定されるものではないが、緑膿菌の外毒素Ａ（ＥＰＡ）、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌ＦｉｍＨ、大腸菌ＦｉｍＨＣ、大腸菌熱不安定生腸毒素、大腸菌熱不安定生腸毒素の無毒化変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化変異体、大腸菌ｓａｔタンパク質、大腸菌ｓａｔタンパク質のパッセンジャードメイン、Ｃ．ジェジュニＡｃｒＡ、およびＣ．ジェジュニ天然糖タンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、緑膿菌の外毒素Ａ（ＥＰＡ）である。
【0059】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴによってＮ－グリコシル化されたキャリアタンパク質は修飾され、例えば、そのタンパク質がグリコシル化などに対して毒性が低く、かつ／または感受性が高い方法で修飾される。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、投与するタンパク質、例えば、そのバイオコンジュゲート形態中の免疫原性組成物の低濃度化を可能とする様式でキャリアタンパク質中のグリコシル化部位の数を最大化するように修飾される。よって、特定の実施形態では、本明細書に記載のキャリアタンパク質は、そのキャリアタンパク質に通常伴うものよりも（例えば、その天然(native/natural)、例えば、「野生型」状態のキャリアタンパク質に伴うグリコシル化部位の数に比べて）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるグリコシル化部位を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、グリコシル化部位の導入は、タンパク質の一次構造中のどこかにグリコシル化コンセンサス配列（例えば、（ｉ）コンセンサス配列Ａｓｎ－Ｚ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）（ここで、ＺはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸から独立に選択される）；または（ｉｉ）コンセンサス配列Ｄ／Ｅ－Ｚ１－Ｎ－Ｚ２－Ｓ／Ｔ（ここで、Ｚ１およびＺ２は独立にＰｒｏ以外の任意のアミノ酸から選択される）を挿入することによって達成される。このようなグリコシル化部位の導入は、例えば、タンパク質の一次構造に新たなアミノ酸を付加すること（グリコシル化部位が完全にまたは部分的に付加される）、またはグリコシル化部位を形成するためにタンパク質中の既存のアミノ酸を修飾すること（タンパク質にアミノ酸は付加されないが、タンパク質の選択されたアミノ酸がグリコシル化部位を形成するように変異される）によって達成することができる。当業者は、タンパク質のアミノ酸配列が、当技術分野で公知のアプローチ、例えば、タンパク質をコードする核酸配列の修飾を含む人工的改変アプローチを用いて容易に修飾され得ることを認識するであろう。特定の実施形態において、グリコシル化コンセンサス配列は、キャリアタンパク質の特定の領域に、例えば、タンパク質の表面構造、タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端、および／またはタンパク質の塩基にジスルフィド架橋によって安定化されたループが導入される。特定の実施形態では、古典的な５アミノ酸のグリコシル化コンセンサス配列は、より効率的なグリコシル化のためにリシン残基によって延長してもよく、このように、挿入されたコンセンサス配列は、挿入されるべき、またはアクセプタータンパク質アミノ酸に取って代わる５、６、または７個のアミノ酸をコードし得る。
【0060】
ＰｇｌＢ ＯＳＴは、本明細書に開示されるいずれのＮ－ＯＳＴも含み得る。
【0061】
いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、キャリアタンパク質の単離および／または同定を可能とするアミノ酸配列である「タグ」を含む。例えば、本明細書に記載のキャリアタンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、従って、タグ付けされたキャリアタンパク質を含むコンジュゲートワクチンの精製に有用であり得る。本明細書において使用可能な例示的タグとしては、限定されるものではないが、ヒスチジン（ＨＩＳ）タグ（例えば、ヘキサヒスチジンタグ、または６ＸＨｉｓ－Ｔａｇ）、ＦＬＡＧ－ＴＡＧ、およびＨＡタグが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で使用されるタグは、必要がなくなれば、例えば、タンパク質が精製された後に、例えば化学薬剤または酵素手段によって除去可能である。
【0062】
核酸
別の態様において、本明細書では、本明細書に提供されるように、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリおよびＣ．コリを含む任意のカンピロバクター種に由来する変異型ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドが提供される。
別の態様において、本明細書では、本明細書に提供されるように、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリおよびＣ．コリを含む任意のカンピロバクター種に由来する変異型ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【0063】
いくつかの実施形態では、核酸は、アミノ酸５７、６３、９４、１０１、１７６、１９１、１９３、２３３、２３４、２８６、３０１、３１９、３９７、４０２、４３５、４４６、４６２、４７９、５２３、５３２、６０５、６１０、６４５、６７６、または６９５のうち１以上が修飾された改変されたＰｇｌＢＣｊをコードする。
【0064】
一実施形態において、配列番号１の３１１に相当するアミノ酸が例えばバリン残基によって置換されている（Ｎ３１１Ｖ）ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドが提供される。一実施形態において、この３１１の置換に配列番号１の７７に相当するアミノ酸が例えばアルギニン残基による置換（Ｙ７７Ｒ）が追加される。一実施形態において、ＰｇｌＢ ＯＳＴをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の５７に相当するアミノ酸の例えばアルギニン残基による置換（Ａ５７Ｒ）を有する。この５７の置換は、３１１および７７の置換のいずれかと組み合わせられるか、または独立に置換される。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、Ｎ３１１Ｖ、Ｙ７７ＲおよびＡ５７Ｒ置換を有するＰｇｌＢ ＯＳＴをコードする。
【0065】
一実施形態において、配列番号１の残基４６２または４７９または４６２および４７９における置換、例えば、Ｙ４６２ＷまたはＨ４７９ＭまたはＹ４６２ＷおよびＨ４７９Ｍを含むＰｇｌＢ ＯＳＴをコードするポリヌクレオチドが提供される。これらの突然変異は、場合により配列番号１の残基３１１、７７および／または５７に相当する突然変異、例えば、Ｎ３１１Ｖ、Ｙ７７ＲおよびＡ５７Ｒと組み合わせられる。一実施形態において、５７、４６２および４７９における突然変異、例えば、Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２ＷおよびＨ４７９Ｍを有するＰｇｌＢ ＯＳＴをコードする核酸が提供される。一実施形態において、配列番号１の７７、５７、４６２および４７９に相当する残基における置換、例えば、Ｙ７７Ｒ、Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２ＷおよびＨ４７９Ｍを有するＰｇｌＢ ＯＳＴをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【0066】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上のアミノ酸の修飾（例えば、ＰｇｌＢをコードするポリヌクレオチドにおけるアミノ酸置換、またはヌクレオチド置換）、例えば、２～３０、３～２５、４～２０、５～２０、６～２０、７～２０または１０～２０のアミノ酸置換を含むＰｇｌＢ ＯＳＴをコードする。一実施形態において、置換は、配列番号１の以下の残基：５７；７７；５７および７７；３１１および７７；５７、７７および３１１；５７および４６２；５７、４６２および４７９；５７、４６２、４７９、７７および３１１；５７、４６２、４７９、３００、３０１、３０８および５７０；５７、４６２、４７９、３００、３０１、３０８、５７０および７７；５７、４６２、４７９、３００、３０１、３０８、５７０、７７および３１１をコードする位置におけるものである。
【0067】
一実施形態において、以下の置換は、配列番号１の以下の残基をコードする位置に存在する（ここで、「／」は、「または」を表す）：
Ａ５７Ｒ／Ｔ；Ｙ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７ＲおよびＹ７７Ｒ；Ｎ３１１ＶおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ４６２Ｗ／Ｔ／Ｎ；Ａ５７ＲおよびＹ４６２Ｗ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／ＮおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｗ／Ｔ／ＮおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２ＷおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／ＦおよびＬ５７０Ｒ／Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１ＰおよびＬ５７０Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／ＦおよびＬ５７０Ｒ／Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８ＷおよびＬ５７０Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／ＶおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ、Ｌ５７０ＲおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／ＶおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｌ５７０ＲおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／Ｖ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ、Ｌ５７０Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／Ｖ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｌ５７０Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ。
Ａ５７Ｒ／Ｔ；Ｙ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７ＲおよびＹ７７Ｒ；Ｎ３１１ＶおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ；Ａ５７Ｒ／ＴおよびＹ４６２Ｗ／Ｔ／Ｎ；Ａ５７ＲおよびＹ４６２Ｗ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／ＮおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｗ／Ｔ／ＮおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２ＷおよびＨ４７９Ｍ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／ＦおよびＬ５７０Ｒ／Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１ＰおよびＬ５７０Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／ＦおよびＬ５７０Ｒ／Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８ＷおよびＬ５７０Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／ＶおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ、Ｌ５７０ＲおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／ＶおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｌ５７０ＲおよびＹ７７Ｒ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／Ｖ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ３０１Ｐ、Ｌ５７０Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ／Ｔ、Ｙ４６２Ｐ／Ｃ／Ｗ／Ｔ／Ｎ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ／Ｇ／Ｆ、Ｆ３０８Ｗ／Ｆ、Ｌ５７０Ｒ／Ｖ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ；Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｌ５７０Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ。
【0068】
宿主細胞
別の態様において、本明細書では、本明細書に提供される変異型ＰｇｌＢ ＯＳＴまたは野生型または変異型Ｃ．コリＰｇｌＢ ＯＳＴを含む宿主細胞が提供される。一実施形態において、宿主細胞は異種宿主細胞（例えば、カンピロバクターではない）である。一実施形態において、宿主細胞は大腸菌である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提供される２つ以上の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴ）を含む。
別の態様において、本明細書では、本明細書に提供される変異型ＰｇｌＢ ＯＳＴまたは野生型または変異型Ｃ．コリＰｇｌＢ ＯＳＴを含む宿主細胞が提供される。一実施形態において、宿主細胞は異種宿主細胞（例えば、カンピロバクターではない）である。一実施形態において、宿主細胞は大腸菌である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提供される２つ以上の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴ）を含む。
【0069】
別の態様において、本明細書では、本明細書に提供される核酸（例えば、本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴをコードする）を含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提供される２つ以上の核酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の核酸）を含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バイオコンジュゲート生産またはタンパク質Ｎ－グリコシル化（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）に有用な１以上のさらなる酵素を含む。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲート生産に有用なさらなる酵素のうち少なくとも１つは、組換え酵素である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バイオコンジュゲート生産に有用な２以上のさらなる酵素（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のさらなる酵素）を含む。
【0071】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列および本明細書に提供される改変されたＮ－ＯＳＴを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列、本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴ、および組換えグリコシルトランスフェラーゼを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴは、改変されたＣ．ジェジュニＰｇｌＢである。
【0072】
特定の実施形態では、本明細書に記載のバイオコンジュゲートを生産するために使用される宿主細胞は、異種核酸、例えば、少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含む１以上のタンパク質をコードする異種核酸および／または１以上のタンパク質をコードする異種核酸、例えば、１以上の酵素をコードする遺伝子を含むように改変されている。いくつかの実施形態では、グリコシル化経路（例えば、原核生物および／または真核生物のグリコシル化経路）に関与するタンパク質をコードする異種核酸が本明細書に記載の宿主細胞に導入される。このような核酸は、限定されるものではないが、オリゴサッカリルトランスフェラーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼを含むタンパク質をコードし得る。異種核酸（例えば、少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質をコードする核酸および／またはその他のタンパク質、例えば、グリコシル化に関与するタンパク質をコードする核酸）は、当業者に公知のいずれかの方法、例えば、エレクトロポレーション、熱ショックによる化学的形質転換、自然の形質転換、ファージ形質導入、およびコンジュゲーションを用いて本明細書に記載の宿主細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、異種核酸は、プラスミドを用いて本明細書に記載の宿主細胞に導入され、例えば、異種核酸は、プラスミド（例えば、発現ベクター）によって宿主細胞内で発現される。いくつかの実施形態では、異種核酸は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０５７１０９号に記載されている挿入の方法を用いて本明細書に記載の宿主細胞に導入される。
【0073】
特定の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞にさらなる修飾を導入することができる（例えば、組換え技術を使用）。例えば、グリコシル化経路の潜在的競合または干渉の一部を形成する（例えば、宿主細胞に組換え導入されるグリコシル化に関与する１以上の異種遺伝子と競合または干渉する）タンパク質をコードする宿主細胞核酸（例えば、遺伝子）を、宿主細胞バックグラウンド（ゲノム）において、それらを不活性／非機能的とする（すなわち、欠失／修飾される宿主細胞核酸が機能的タンパク質をコードしない、または何であれタンパク質をコードしない）ように欠失させるまたは修飾することができる。特定の実施形態では、本明細書に提供される宿主細胞のゲノムから核酸が欠失される場合、それらは望ましい配列、例えば、糖タンパク質生産に有用な配列によって置換される。
【0074】
宿主細胞において欠失され得る（および、いくつかの場合では、他の所望の核酸配列で置換され得る）例示的遺伝子としては、ｗａａＬ（例えば、Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021参照）、脂質Ａコア生合成クラスター（ｗａａ）、ガラクトースクラスター（ｇａｌ）、アラビノースクラスター（ａｒａ）、コラン酸クラスター（ｗｃａ）、莢膜多糖クラスター、ヌクレオチドにより活性化される糖生合成に関与する代謝酵素、エンテロバクター共通抗原クラスター（ｗｅｃ）、およびｇｔｒＡＢＳクラスターのようなプロファージＯ抗原修飾クラスターなどの、糖脂質生合成に関与する宿主細胞の遺伝子が挙げられる。
【0075】
本明細書に記載の宿主細胞は、本明細書に記載のＮ－グリコシル化されたキャリアタンパク質を生産することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞によって生産されるＮ－グリコシル化されたキャリアタンパク質は、ワクチンに使用され得る抗原、例えば、ウイルスまたは細菌抗原である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞により生産されるＮ－グリコシル化されたキャリアタンパク質は、本明細書に記載のグリコシル化コンセンサス配列を含むいずれのタンパク質であってもよく、前記タンパク質は、本明細書に記載の宿主細胞によって１以上の有益な特徴を有するように修飾され、例えば、タンパク質はＮ－グリコシル化される。
【0076】
以下の実施例のあるものは、グラム陰性大腸菌宿主細胞において本明細書に記載の方法の適用を記載するが、当業者に公知のいずれの宿主細胞も、古細菌、大腸菌以外の原核生物宿主細胞、および真核生物宿主細胞を含むＮ－グリコシル化キャリアタンパク質を生産するために使用することができる。
【0077】
本明細書に記載の方法に従って使用可能な例示的原核生物宿主細胞としては、限定されるものではないが、エシェリキア属、赤痢菌属、クレブシエラ属、キサントモナス属、サルモネラ属、エルシニア属、ラクトコッカス属、ラクトバチルス属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、放線菌属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、バチルス属、およびクロストリジウム属が挙げられる。
【0078】
特定の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞は、１以上のＤＮＡ配列が導入されたゲノムを含み、このＤＮＡ配列は、タンパク質をコードするか、またはタンパク質のＮ－グリコシル化に関与するオペロン／遺伝子群を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞は、以下の１以上が挿入されたゲノムを含む：改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴをコードするＤＮＡ、グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、少なくとも１つのグリコシル化配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、ｒｆｂ遺伝子群を含むＤＮＡ、莢膜多糖遺伝子群を含むＤＮＡ、および／またはエピメラーゼをコードするＤＮＡ。
【0079】
宿主細胞は本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴもしくはＣ．コリＰｇｌＢ ＯＳＴ、または本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴもしくはＣ．コリＰｇｌＢ ＯＳＴをコードする核酸を含むことができ、それにより、改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴは、原核生物を含むＮ－ＯＳＴを有するいずれの生物に由来するものでもよい。いくつかの実施形態では、ＰｇｌＢ ＯＳＴタンパク質またはＰｇｌＢ ＯＳＴコード核酸はカンピロバクター属に由来する（例えば、Ｃ．ジェジュニ由来のｐｇｌＢ遺伝子）。
【0080】
本明細書に記載の宿主細胞は、当技術分野で公知のグリコシルトランスフェラーゼまたは当技術分野で公知のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／１３８３６１号に記載のグリコシルトランスフェラーゼであり、その開示はその全内容が本明細書の一部として援用される。いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、グラム陽性細菌由来のものであり、例えば、グリコシルトランスフェラーゼは、肺炎連鎖球菌由来、例えば、肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１６Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂ由来（好ましくは血清型８由来）、または化膿連鎖球菌（血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、またはＶＩＩＩ由来Ｂ群連鎖球菌属莢膜血清型多糖）由来のものである。いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、黄色ブドウ球菌由来の莢膜多糖５である。いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、黄色ブドウ球菌由来莢膜多糖８である。いくつかの実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、グラム陰性細菌、例えば、大腸菌またはフレクスナー赤痢菌または赤痢菌由来のものである。
【0081】
本明細書に記載の宿主細胞は、少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス部位を含むタンパク質を含み得るもしくは生産し得るか、または当技術分野で公知の少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含み得る。本明細書に記載の宿主細胞により生産されるタンパク質は、少なくとも１つのＮ－グリコシル化コンセンサス配列、例えば、コンセンサス配列（ｉ）Ａｓｎ－Ｚ－Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）（ここで、ＺはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸から独立に選択される）；または（ｉｉ）Ｄ／Ｅ－Ｚ１－Ｎ－Ｚ２－Ｓ／Ｔ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外の任意のアミノ酸から独立に選択される）のいずれかを含む。よって、宿主細胞は、Ｎ－グリコシル化コンセンサス配列をコードするＤＮＡ配列を含み得る。宿主細胞は、本明細書に記載のこれらを含む当技術分野で公知のいずれのタンパク質も含み得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、緑膿菌の外毒素Ａ（ＥＰＡ）、例えば、少なくとも１つのＮ－グリコシル化コンセンサス配列を含むように修飾されているＥＰＡなどのキャリアタンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、コレラ毒素Ｂであるキャリアタンパク質である。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質はＡｃｒＡである。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質はＨｌＡである。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質はＣｌｆＡである。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質はＣＲＭ１９７である。
【0082】
バイオコンジュゲート
本明細書に記載のバイオコンジュゲートは、宿主細胞内で生じるタンパク質（例えば、本明細書に記載のいずれかのキャリアタンパク質）とオリゴ糖または多糖（例えば、本明細書に記載のいずれかのオリゴ糖または多糖）の間の結合であり、宿主細胞はそのオリゴ糖または多糖をそのタンパク質に機械的に連結する（例えば、Ｎ－結合）。いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、抗原（例えば、本明細書に記載のいずれかの抗原）である。グリココンジュゲートとしては、他の手段によって、例えば、タンパク質と糖抗原の化合的連結によって、生成されるバイオコンジュゲート、ならびに糖抗原（例えば、オリゴ糖および多糖）－タンパク質結合を含み得る。
本明細書に記載のバイオコンジュゲートは、宿主細胞内で生じるタンパク質（例えば、本明細書に記載のいずれかのキャリアタンパク質）とオリゴ糖または多糖（例えば、本明細書に記載のいずれかのオリゴ糖または多糖）の間の結合であり、宿主細胞はそのオリゴ糖または多糖をそのタンパク質に機械的に連結する（例えば、Ｎ－結合）。いくつかの実施形態では、オリゴ糖または多糖は、抗原（例えば、本明細書に記載のいずれかの抗原）である。グリココンジュゲートとしては、他の手段によって、例えば、タンパク質と糖抗原の化合的連結によって、生成されるバイオコンジュゲート、ならびに糖抗原（例えば、オリゴ糖および多糖）－タンパク質結合を含み得る。
【0083】
本明細書に記載の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴまたはＣ．コリＰｇｌＢ ＯＳＴは、Ｎ－グリコシル化されたキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートを生産する宿主細胞を生産するために細胞（例えば、グラム陰性菌細胞）に導入することができる。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の抗原（例えば、オリゴ糖または多糖）でＮ－グリコシル化されたキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質はＥＰＡである。本明細書に記載のバイオコンジュゲートは、例えば、限定されるものではないが、本明細書に記載のいずれのキャリアタンパク質も含み得る。本明細書に記載のバイオコンジュゲートは、例えば、限定されるものではないが、本明細書に記載のいずれのオリゴ糖または多糖も含み得る。
【0084】
一実施形態において、異種によりグリコシル化されたキャリアタンパク質は、肺炎連鎖球菌血清型１２Ｆ－ＥＰＡ、肺炎連鎖球菌血清型８－ＥＰＡ、肺炎連鎖球菌血清型１９Ａ－ＥＰＡ、肺炎連鎖球菌血清型２２Ｆ－ＥＰＡ、肺炎連鎖球菌血清型２３Ａ－ＥＰＡ、または肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂ－ＥＰＡである。一実施形態において、異種によりグリコシル化されたキャリアタンパク質は、キャリアタンパク質、例えば、ＥＰＡ、ＣＲＭ１９７、ＤＴまたはＴＴに結合された肺炎連鎖球菌莢膜糖またはＢ群連鎖球菌莢膜糖である。
【0085】
一実施形態において、異種によりグリコシル化されたキャリアタンパク質は、ＥＰＡ、ＣＲＭ１９７、ＤＴ、ＴＴに結合した黄色ブドウ球菌莢膜多糖５型、またはＣｌｆＡもしくはＨｌａなどのブドウ球菌タンパク質、またはＥＰＡ、ＣＲＭ１９７、ＤＴ、ＴＴに結合した黄色ブドウ球菌莢膜多糖８型、またはＣｌｆＡもしくはＨｌａなどのブドウ球菌タンパク質、または赤痢菌－ＥＰＡである。
【0086】
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＥＰＡおよび本明細書に記載の１以上の異なるオリゴ糖または多糖を含むバイオコンジュゲートが提供される。
【0087】
いくつかの実施形態において、本明細書では、大腸菌Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ１１、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１７、Ｏ１８、Ｏ２０、Ｏ２２、Ｏ２５、Ｏ７３、Ｏ７５、および／またはＯ８３のうち１以上に結合したキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質はＥＰＡである。
【0088】
いくつかの実施形態において、本明細書では、１以上の異なる緑膿菌多糖に結合したキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質はＥＰＡである。
【0089】
いくつかの実施形態において、本明細書では、１以上の異なるＫ．ニューモニエ多糖に結合したキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートが提供される。特定の実施形態において、キャリアタンパク質はＥＰＡである。
【0090】
バイオコンジュゲートを生産するための方法
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴおよびＣ．コリＰｇｌＢは、グリココンジュゲートなどの本明細書に提供されるバイオコンジュゲートを生産するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴおよびＣ．コリＰｇｌＢは、コンジュゲートワクチン、すなわち、オリゴ糖または多糖およびそれに対してワクチンが設計される病原体のタンパク質抗原を含むワクチンを生産するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴおよびＣ．コリＰｇｌＢは、グリココンジュゲートなどの本明細書に提供されるバイオコンジュゲートを生産するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴおよびＣ．コリＰｇｌＢは、コンジュゲートワクチン、すなわち、オリゴ糖または多糖およびそれに対してワクチンが設計される病原体のタンパク質抗原を含むワクチンを生産するために使用され得る。
【0091】
別の態様において、本明細書では、バイオコンジュゲートを生産する方法であって、本明細書に提供される宿主細胞を細胞培養培地で培養することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴまたはＣ．コリＰｇｌＢをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載のキャリアタンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、１以上のＮ－グリコシル化コンセンサス配列を有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。
【0092】
いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートは、Ｎ－グリコシル化キャリアタンパク質である。Ｎ－グリコシル化キャリアタンパク質は、本明細書に記載の任意のオリゴ糖または多糖を含むオリゴ糖または多糖成分を含み得る。Ｎ－グリコシル化キャリアタンパク質は、本明細書に記載のいずれのキャリアタンパク質も含み得る。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートは、天然Ｃ．ジェジュニＮ－グリコシル化ポリペプチド（Ｃ．ジェジュニオリゴ糖または多糖成分およびＣ．ジェジュニキャリアタンパク質を含む）である。いくつかの実施形態では、バイオコンジュゲートは、異種Ｃ．ジェジュニグリコシル化ポリペプチド（Ｃ．ジェジュニではない多糖成分および／またはキャリアタンパク質を含む）である。いくつかの実施形態では、グリコシル化ポリペプチドは、その還元末端にＮ－アセチル糖を有さない。いくつかの実施形態では、グリコシル化ポリペプチドは、その還元末端にグルコースまたはガラクトースを有する。
【0093】
いくつかの実施形態では、本方法は、バイオコンジュゲートを宿主細胞培養物から精製することをさらに含む。Ｎ－グリコシル化キャリアタンパク質などのバイオコンジュゲートを宿主細胞培養物から精製するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Jan-Christer Janson, Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications. Wiley; 3 edition (March 22, 2011)を参照のこと。
【0094】
分析法
種々の方法が、本明細書に記載のバイオコンジュゲートまたはＮ－グリコシル化キャリアタンパク質の構造組成物および糖鎖長を分析するために使用可能である。
種々の方法が、本明細書に記載のバイオコンジュゲートまたはＮ－グリコシル化キャリアタンパク質の構造組成物および糖鎖長を分析するために使用可能である。
【0095】
一実施形態では、グリカンを分析するためにヒドラジノリシスが使用できる。まず、製造者の説明書に従って（Ｌｕｄｇｅｒ Ｌｉｂｅｒａｔｅ Ｈｙｄｒａｎｏｌｙｓｉｓ Ｇｌｙｃａｎ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｋｉｔ、オックスフォードシャー、ＵＫ）、ヒドラジンとのインキュベーションによりそれらのタンパク質キャリアから多糖を遊離させる。求核試薬ヒドラジンは、多糖とキャリアタンパク質の間のグリコシド結合に作用し、結合しているグリカンを遊離させる。この処理中にＮ－アセチル基は失われ、再Ｎ－アセチル化により再構成されなければならない。遊離グリカンは炭素カラムで精製され、次に、還元末端において蛍光団２－アミノベンズアミドで標識される(Bigge JC, Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB. Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid. Anal Biochem. 1995 Sep 20;230(2):229-38)。標識された多糖は、Royle et al. (Royle L, Mattu TS, Hart E, Langridge JI, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM. An analytical and structural database provides a strategy for sequencing O-glycans from microgram quantities of glycoproteins. Anal Biochem. 2002 May 1;304(1):70-90) のＨＰＬＣプロトコールに従ってGlycoSep-Nカラム（GL Sciences）にて分離される。得られる蛍光クロマトグラムは、多糖長および反復単位の数を示す。構造情報は、個々のピークを収集した後にＭＳ／ＭＳ分析を実施することによって集めることができる。これにより、単糖組成および反復単位の配列を確認することができ、さらに多糖組成の不均質性を確認することができる。低分子量の特定のピークはＭＡＬＤＩ－ＭＳ／ＭＳにより分析することができ、その結果はグリカン配列を確認するために使用される。各ピークは、一定数の反復単位からなるポリマーおよびその断片に対応する。従って、クロマトグラムから、ポリマー長分布を測定することが可能である。溶出時間はポリマー長の指標であり、蛍光強度は各ポリマーのモル量と相関する。
【0096】
別の実施形態では、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはキャピラリーゲル電気泳動を用いてグリカンおよびグリココンジュゲートを評価することができる。ここで合成されるＯ抗原グリカンのポリマー長は、直鎖状に組み立てられた反復単位の数によって定義される。これは、典型的なラダー様パターンが、グリカンを構成する反復単位数の違いの結果であることを意味する。従って、ＳＤＳ ＰＡＧＥまたはサイズ別に分離する他の技術では、隣り合う２つのバンドは、反復単位１つ分だけ異なる。こうした離散型差異は、糖タンパク質をグリカンサイズについて分析する場合に利用される。非グリコシル化キャリアタンパク質および異なるポリマー鎖長を有するグリココンジュゲートは、それらの電気泳動移動度に従って分離する。グリココンジュゲート上に存在する第１の検出可能な反復単位数（ｎ１）および平均反復単位数（ｎａｖｅｒａｇｅ）を測定する。これらのパラメーターを用いて、バッチ間の一貫性または多糖安定性を実証することができる。
【0097】
別の実施形態では、完全なグリココンジュゲートのサイズを測定するために、高質量ＭＳ(high mass MS)およびサイズ排除ＨＰＬＣを適用することができる。
【0098】
別の実施形態では、多糖の収量を測定するために、アントロン－硫酸アッセイを使用することができる(Leyva A, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC. Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products: method development and validation. Biologicals. 2008 Mar;36(2):134-41. Epub 2007 Nov 26)。
【0099】
グリコシル化部位利用の変化
特定のタンパク質におけるこの部位の利用が変化することを示すために、グリコシル化部位利用を定量化することができる。そのための方法を以下に示す。
特定のタンパク質におけるこの部位の利用が変化することを示すために、グリコシル化部位利用を定量化することができる。そのための方法を以下に示す。
【0100】
グリコペプチドＬＣ－ＭＳ／ＭＳ：グリココンジュゲートをプロテアーゼで消化し、適切なクロマトグラフィー法（Ｃ１８、親水性相互作用ＨＰＬＣ ＨＩＬＩＣ、ＧｌｙｃｏＳｅｐＮカラム、ＳＥ ＨＰＬＣ、ＡＥ ＨＰＬＣ）によりペプチドを分離し、ＭＳ／ＭＳを用いて異なるペプチドを同定する。この方法は、化学法（スミス分解）または酵素法による事前の糖鎖短縮化を伴ってまたは伴わずに用いることができる。２１５～２８０ｎｍでのＵＶ検出を用いたグリコペプチドピークの定量は、グリコシル化部位利用の相対的測定を可能にする。
【0101】
サイズ排除ＨＰＬＣ：より高いグリコシル化部位の利用は、ＳＥ ＨＰＬＣカラムからのより早い溶出時間に反映される。（ａ）も参照のこと。
【0102】
均質性
グリココンジュゲートの均質性（結合した糖残基の均質性）は、グリカン長および流体力学的半径を測定する方法を用いて評価することができる。
グリココンジュゲートの均質性（結合した糖残基の均質性）は、グリカン長および流体力学的半径を測定する方法を用いて評価することができる。
【0103】
利点
本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴおよびＣ．コリＰｇｌＢならびに本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴまたはＣ．コリＰｇｌＢを使用する本明細書に提供される方法は、グリコシル化タンパク質（例えば、グリココンジュゲート製剤またはコンジュゲートワクチン製剤）の高度に均質な調製物の迅速、高収量、大規模かつ低コストの発酵を可能にするため、特に商業上重要かつ適切である。本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴおよびＣ．コリＰｇｌＢは、コンジュゲートワクチンのような商業上および治療上価値のあるグリコシル化タンパク質の経済的に実施可能な生産を可能にする。加えて、本発明の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴおよびＣ．コリＰｇｌＢは、特にグリカンが野生型ＰｇｌＢによって自然に転移されない場合に、タンパク質のより効率的なＮ－グリコシル化を提供する。例えば、タンパク質のＮ残基に転移させるオリゴ糖が還元末端にＧｌｃＮＡｃ残基を持たない場合、例えば、オリゴ糖の還元末端がグルコース残基である場合である。本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴを用いる生物工学的バイオコンジュゲート生産方法の再現性およびロバスト性は、生産コストの削減に寄与すると期待される。特に生物学的薬剤としてのコンジュゲートワクチンの均一性は、医薬品の臨床的安全性に影響を及ぼすと一般に考えられている。
本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴおよびＣ．コリＰｇｌＢならびに本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴまたはＣ．コリＰｇｌＢを使用する本明細書に提供される方法は、グリコシル化タンパク質（例えば、グリココンジュゲート製剤またはコンジュゲートワクチン製剤）の高度に均質な調製物の迅速、高収量、大規模かつ低コストの発酵を可能にするため、特に商業上重要かつ適切である。本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴおよびＣ．コリＰｇｌＢは、コンジュゲートワクチンのような商業上および治療上価値のあるグリコシル化タンパク質の経済的に実施可能な生産を可能にする。加えて、本発明の改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴおよびＣ．コリＰｇｌＢは、特にグリカンが野生型ＰｇｌＢによって自然に転移されない場合に、タンパク質のより効率的なＮ－グリコシル化を提供する。例えば、タンパク質のＮ残基に転移させるオリゴ糖が還元末端にＧｌｃＮＡｃ残基を持たない場合、例えば、オリゴ糖の還元末端がグルコース残基である場合である。本明細書に提供される改変されたＰｇｌＢ ＯＳＴを用いる生物工学的バイオコンジュゲート生産方法の再現性およびロバスト性は、生産コストの削減に寄与すると期待される。特に生物学的薬剤としてのコンジュゲートワクチンの均一性は、医薬品の臨床的安全性に影響を及ぼすと一般に考えられている。
【0104】
略語および定義
本明細書の目的で、遺伝的にコードされるアミノ酸に使用される略語は慣例のものであり、表１に示す通りである。
本明細書の目的で、遺伝的にコードされるアミノ酸に使用される略語は慣例のものであり、表１に示す通りである。
【0105】
【表1】
【0106】
３文字略語が使用される場合、特に「Ｌ」もしくは「Ｄ」が前に付いていなければ、またはその略号が使用されている内容から省かれている場合には、アミノ酸はα－炭素（Ｃα）についてＬ型またはＤ型のいずれであってもよい。例えば、「Ａｌａ」は、α炭素に関する配置を特定せずにアラニンを表し、「Ｄ－Ａｌａ」および「Ｌ－Ａｌａ」はそれぞれＤ－アラニンおよびＬ－アラニンを表す。１文字略語が使用される場合、大文字は、α－炭素についてＬ型のアミノ酸を表し、小文字は、α－炭素についてＤ型のアミノ酸を表す。例えば、「Ａ」はＬ－アラニンを表し、「ａ」はＤ－アラニンを表す。ペプチド配列が一連の１文字または３文字略語（またはそれらの混合）として表される場合、配列は慣例に従ってＮ→Ｃ方向に示される。
【0107】
本明細書に使用される技術用語および科学用語は、特段の断りがない限り、当業者に共通に理解されている意味を有する。よって、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。全ての米国特許および公開米国特許出願は、本明細書に参照されるこのような特許および特許出願内に開示されている全ての配列を含め、明示的に本明細書の一部として援用される。
【0108】
「酸性アミノ酸または残基」とは、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合に、約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、通常、水素イオンの喪失のために、生理学的ｐＨで負電荷を有する側鎖を持つ。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸としては、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ－Ａｓｐ （Ｄ）が挙げられる。
【0109】
「アミノ酸」または「残基」とは、本明細書に開示されるポリペプチドに関して使用される場合、ある配列の位置の特定の単量体を指す（例えば、Ｐ５は、配列番号２の５番目の位置の「アミノ酸」または「残基」がプロリンであることを示す）。
【0110】
「アミノ酸の違い」または「残基の違い」とは、参照配列と比較した場合の、ポリペプチド配列の特定の位置における残基の変化を指す。特定のアミノ酸またはアミノ酸変化（「残基の違い」）が存在するポリペプチド配列上の位置は、本明細書では「Ｘｎ」、または「ｎの位置」と記載される場合があり、ここで、ｎは、参照配列についての残基の位置を指す。
【0111】
例えば、Ｘ８の位置の残基の違いは、参照配列がセリンを有する場合、Ｘ８の位置における残基のセリン以外の任意の残基への変化を指す。本明細書に開示されるように、酵素は参照配列に対して１以上の残基の違いを含むことができ、ここで、複数の残基の違いは、通常、参照配列に対して変化があった特定の位置のリストによって示される（例えば、「配列番号１と以下の残基の位置で比較した場合の１以上の残基の違い：Ｘ２７、Ｘ３０、Ｘ３５、Ｘ３７、Ｘ５７、Ｘ７５、Ｘ１０３、Ｘ１８５、Ｘ２０７、Ｘ２０８、Ｘ２７１、Ｘ２８６、またはＸ２９６」）。
【0112】
特定の置換突然変異は、参照配列の特定の残基の、異なる特定の残基での置換であり、慣例の表記法「Ｘ（数字）Ｘ’」で表すことができ、ここで、Ｘは、参照配列の残基の１文字識別子であり、「数字は」、参照配列の残基の位置であり、Ｘ’は、改変された配列における残基置換の１文字識別子である。
【0113】
「脂肪族アミノ酸または残基」とは、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸としては、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ－Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。
【0114】
「芳香族アミノ酸または残基」とは、少なくとも１つの芳香族または複素芳香環を含む側鎖を有する親水性または疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸としては、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ－Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。その複素芳香族窒素原子Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）のｐＫａのためにそれは塩基性残基として分類されたり、またはその側鎖が複素芳香環を含むことから芳香族残基として分類されたりすることがあるが、本明細書では、ヒスチジンは親水性残基または「拘束された残基」（下記を参照のこと）として分類される。
【0115】
「塩基性アミノ酸または残基」とは、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合に、約６を超えるｐＫａ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、通常、ヒドロニウムイオンとの会合のために生理学的ｐＨで正電荷を有する側鎖を持つ。遺伝的にコードされる塩基性アミノ酸としては、Ｌ－Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ－Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【0116】
「コドンが最適化される」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを、コードされているタンパク質が対象とする生物内で効率的に発現されるように特定の生物に優先的に使用されているものへ変化させることを指す。遺伝暗号は、ほとんどのアミノ酸が「同義コドン(“synonyms” or “synonymous” codons)」と呼ばれる複数のコドンによって表されているという意味で縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度は無作為ではなく、特定のコドントリプレットに偏っていることは周知である。このコドン使用の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または先祖起源の遺伝子、高発現タンパク質と低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの集合したタンパク質コード領域に関してより高い場合がある。いくつかの実施形態では、ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な生産のためにコドンを最適化することができる。
【0117】
「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、少なくとも２０の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と配列を比較することができ、比較ウインドウ内の配列の位置は、２配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較した場合に２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。比較ウインドウは、２０の連続する残基より長くてもよく、場合により３０、４０、５０、１００、またはそれより長いウインドウを含む。
【0118】
「保存的」アミノ酸置換または突然変異とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指し、よって、通常、ポリペプチド内のアミノ酸の、同じまたは類似のアミノ酸の定義クラス内のアミノ酸での置換を含む。しかしながら、本明細書において使用される場合、いくつかの実施形態では、保存的突然変異が脂肪族残基から脂肪族残基へ、非極性残基から非極性残基へ、極性残基から極性残基へ、酸性残基から酸性残基へ、塩基性残基から塩基性残基へ、芳香族残基から芳香族残基、または拘束残基から拘束残基へ置換可能であれば、保存的突然変異は親水性残基から親水性残基への、疎水性残基から疎水性残基への、ヒドロキシルを含む残基からヒドロキシルを含む残基への、または小型残基から小型残基への置換を含まない。さらに、本明細書において使用される場合、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＩは、別の脂肪族残基または別の非極性残基いずれかに保存的に変位させることができる。以下の表２は、例示的な保存的置換を示す。
【0119】
【表2】
【0120】
「拘束されたアミノ酸または残基」とは、拘束幾何学を有するアミノ酸または残基を指す。ゆえに、拘束された残基としては、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ－Ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、比較的小さなイミダゾール環を有するので拘束幾何学を有する。プロリンも５員環を有するので拘束幾何学を有する。
【0121】
「制御配列」は、本明細書では、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利な全ての成分を含むように定義される。各制御配列は、対象とするポリヌクレオチドに対して天然であっても外来であってもよい。このような制御配列としては、限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。
【0122】
「に相当する」、「を参照する」または「に対する」とは、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列のナンバリングに関して使用される場合、その所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較する場合に、特定の参照配列の残基のナンバリングを指す。言い換えれば、所与のポリマーの残基の数字または残基の位置は、非参照配列の所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数字的な位置ではなく、参照配列に関して示される。例えば、所与のアミノ酸配列、例えば、改変されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、２配列間の残基のマッチを最適化するためにギャップを導入することによって参照配列に対してアラインすることができる。これらの場合、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基のナンバリングは、それがアラインされた参照配列に関して付けられたものである。
【0123】
「システイン」またはＬ－Ｃｙｓ（Ｃ）は、他のＬ－Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニル含有もしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができるという点で特異なものである。「システイン様残基」としては、システインおよびジスルフィド架橋の形成に利用可能なスルフヒドリル部分を含む他のアミノ酸が挙げられる。Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）（および－ＳＨ含有側鎖を有する他のアミノ酸）がペプチド内に還元遊離型－ＳＨまたは酸化ジスルフィド架橋型のいずれで存在することができるかは、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドに正味として疎水性を与えるか親水性を与えるかに影響を及ぼす。Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの標準化コンセンサス尺度(normalized consensus scale)(Eisenberg et al., 1984, 前掲)によれば０．２９の疎水性を示すが、本開示の目的では、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）はその固有の独自のグループに分類されることが理解されるべきである。
【0124】
「欠失」とは、参照ポリペプチドから１以上のアミノ酸を除去することによるポリペプチドの修飾を指す。欠失は、改変されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を保持しつつ、かつ／または改良された特性を保持しつつ、ポリペプチド構成する１以上アミノ酸、２以上のアミノ酸、５以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸、アミノ酸総数の１０％まで、アミノ酸総数の２０％まで、もしくはアミノ酸総数の３０％までの除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とし得る。様々な実施形態において、欠失は連続するセグメントを含んでもよいし、または不連続であってもよい。
【0125】
「に由来する」とは、本明細書において改変された酵素に関して使用される場合、その改変が基にした元の酵素、および／またはそのような酵素をコードする遺伝子を特定する。例えば、配列番号４の改変されたオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号２のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼを変異させることによって得られた。よって、配列番号４の改変されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号２のポリペプチドに由来する。
【0126】
「改変されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ」とは、本明細書において使用される場合、その参照配列への新たなアミノ酸の挿入、その参照配列に存在するアミノ酸の欠失、またはランダム突然変異誘発のプロセスとその後の特定の特性を有する突然変異体の選択もしくはタンパク質配列への特定のアミノ酸変化の意図した導入のいずれかによるその参照配列のアミノ酸の、別のアミノ酸への突然変異によって、体系的に修飾されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ型タンパク質を指す。
【0127】
「断片」とは、本明細書において使用される場合、アミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、残りのアミノ酸配列はその配列の相当する位置と同じであるポリペプチドを指す。断片は、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長またはそれより長い、また、全長ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドの７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、および９９％まで、またはそれを超えるものであり得、例えば、配列番号４のポリペプチドである。
【0128】
「機能的断片」または「生物学的に活性な断片」は、本明細書においては互換的に使用され、アミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失および／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列はそれが比較される配列における相当する位置と同じであり、全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持するポリペプチドを指す。機能的断片は、少なくとも１００、２００、３００、４００または５００の連続するアミノ酸を含む。
【0129】
「異種」ポリヌクレオチドは、実験技術によって宿主細胞に導入されるいずれのポリヌクレオチドも指し、宿主細胞から取り出され、実験改変を受けた後に宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【0130】
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行い、その後、多様な、しかし、より高いストリンジェンシーの洗浄を行う。「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」とは、標的ＤＮＡと、標的ＤＮＡと約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する、または標的ポリヌクレオチドと約９０％を超える同一性を有する相補的核酸との結合を可能とする条件を指す。例示的な中等度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×生理食塩水－リン酸ナトリウム－ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中、４２℃でのハイブリダイゼーションの後、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃での洗浄に相当する条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」とは、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列のための溶液条件下で決定した場合の融点Ｔｍから約１０℃低い条件を指す。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列にのみハイブリダイゼーションを可能とする条件を指す。（すなわち、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中、６５℃でハイブリッドが安定でなければ、それは、本明細書で企図されるような高ストリンジェンシー下で安定であるとは言えない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃に相当する条件でのハイブリダイゼーションとその後の０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄によって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイズに相当するハイブリダイズと０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、６５℃での洗浄である。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに中等度にストリンジェントな条件は、上記に引用した参照文献に記載されている。
【0131】
「親水性アミノ酸または残基」とは、Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142の標準化コンセンサス疎水性尺度(normalized consensus hydrophobicity scale)に従って０より小さい疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸としては、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ－Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ－Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ－Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。「疎水性アミノ酸または残基」とは、Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142に従って０より大きい疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸としては、Ｌ－Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【0132】
「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」とは、ヒドロキシル（－ＯＨ）部分を含むアミノ酸を指す。遺伝的にコードされるヒドロキシル含有アミノ酸としては、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ－Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【0133】
「改良された酵素特性」とは、参照酵素に見られる特性に比べて、特定の目的に関して良好またはより望ましいものとするいずれの酵素特性も指す。本明細書に記載の改変されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドについて、一般に、酵素効率を向上させる特定の突然変異を含まない参照ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素と比較されるが、いくつかの実施形態では、参照ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、別の改良、改変されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼであり得る。改良がなされ得る酵素特性としては、限定されるものではないが、酵素活性（Ｎ－グリコシル化タンパク質の収量に関して表すことができる）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性特性、補酵素要求、阻害剤（例えば、生成物阻害）に対する不応性、立体特異性、および酸副生成物の生産の抑制が挙げられる。
【0134】
「挿入」とは、参照ポリペプチドへの１以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドの修飾を指す。いくつかの実施形態では、改良、改変されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素は、天然ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドへの１以上のアミノ酸の挿入ならびに他の改良されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドへの１以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分への、またはカルボキシまたはアミノ末端へのものであり得る。挿入は、本明細書において使用される場合、当技術分野で公知のような融合タンパク質を含む。挿入はアミノ酸の連続するセグメントであっても、または天然ポリペプチドの１以上のアミノ酸によって分離されていてもよい。
【0135】
「単離されたポリペプチド」とは、自然状態で付随する他の夾雑物、例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語には、それらの天然環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から取り出されたまたは精製されたポリペプチドを包含する。改良されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素は、細胞内に存在していてもよいし、細胞培地に存在していてもよいし、または溶解液もしくは単離された調製物などの様々な形態で調製されてもよい。従って、いくつかの実施形態では、改良されたＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。
【0136】
「非保存的置換」とは、ポリペプチド中のアミノ酸の、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸での置換または突然変異を指す。非保存的置換は、上記に列挙した定義群内ではなく定義群間のアミノ酸を使用し得る。一実施形態では、非保存的突然変異は、（ａ）置換領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンの代わりにプロリン）；（ｂ）電荷もしくは疎水性；または（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす。
【0137】
「非極性アミノ酸」または「非極性残基」とは、生理学的ｐＨでは電荷を有さず、２つの原子によって共有されている電子対が一般にそれら２つの原子のそれぞれによって等しく保有されている（すなわち、その側鎖は非極性である）側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる非極性アミノ酸としては、Ｌ－Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ－Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ－Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ－Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。
【0138】
「配列同一性のパーセンテージ」、「同一性パーセント」、および「同一パーセント」とは、本明細書において、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の比較を指して使用され、比較ウインドウで最適にアラインされた２つの配列を比較することにより決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、参照配列と比較して、２配列の最適なアラインメントのために付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在している位置の数を決定するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基は、マッチした位置の数を得るためにギャップを用いてアラインされる、マッチした位置の数を比較ウインドウの総数で割り、その商に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。最適アラインメントおよび配列同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いて行われる（例えば、ltschul, et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 and Altschul, et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402参照）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Information のウェブサイトに公開されている。
【0139】
概説すると、ＢＬＡＳＴ解析は、まず、データベース配列において同じ長さのワードとアラインした際にいくつかの正の値をとる閾値スコアＴとマッチするまたはそれを満たす長さＷの短いワードをクエリー配列において測定することによってハイスコアリング配列対(high scoring sequence pairs)（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul, et al, 前掲)。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして働く。次に、これらのワードヒットを、累積アラインメントスコアが増え得る限り各配列の両方向に拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（マッチ残基対についてはリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ塩基についてはペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向のワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ離れた場合；１以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積のために累積スコアが０以下となる場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列向け）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Henikoff and Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915参照）。
【0140】
２配列の同一性パーセントを提供する際に、ＢＬＡＳＴと同様に機能する多くの他のアルゴリズムが利用可能である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482の局所的アラインメントアルゴリズムによるか、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443のホモロジーアラインメントアルゴリズムによるか、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法によるか、これらのアルゴリズムのコンピューター実装形態（ＧＣＧウィスコンシンソフトウエアパッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によるか、または目視検査（一般に、Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, et al.編,, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)を参照のこと）によって実施することができる。さらに、配列アラインメントおよび配列同一性パーセントの決定は、ＧＣＧウィスコンシンソフトウエアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、マディソン ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用することができ、提供されているデフォルトパラメーターを使用する。また、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムも同一性の決定に適している。
【0141】
「極性アミノ酸または残基」とは、生理学的ｐＨでは電荷を持たないが、２つの原子によって共有されている電子対がそれらの原子の一方によってより緊密に保持されている側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる極性アミノ酸としては、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ－Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【0142】
「好ましい、最適な、高いコドン使用バイアスコドン」とは、タンパク質コード領域において、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも高い頻度で使用されているコドンを互換的に指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子、共通の機能または起源の遺伝子セット、高発現遺伝子のコドン使用頻度、生物全体の集合したタンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連生物の集合したタンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはそれらの組合せに関して決定することができる。頻度が遺伝子発現のレベルで増大しているコドンが、通常、発現に最適なコドンである。コドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的同義コドン使用頻度）および特定の生物のコドン選好性を決定するためには、多変量解析、例えば、クラスター解析またはコレスポンデンス分析の使用、および遺伝子に使用されているコドンの有効数（GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, John Peden, University of Nottingham; McInerney, J. O, 1998, Bioinformatics 14:372-73; Stenico, et al., 1994, Nucleic Acids Res. 222437-46; Wright, F., 1990, Gene 87:23-29を参照のこと）を含む様々な方法が知られている。増えつつある生物のリストに関してコドン使用表が利用可能である（例えば、Wada, et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118; Nakamura, et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28:292; Duret, et al., 前掲; Henaut and Danchin, “Escherichia coli and Salmonella,” 1996, Neidhardt, et al.編, ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066を参照のこと）。コドン使用を得るためのデータ源は、タンパク質をコードし得る利用可能ないずれかのヌクレオチド配列に頼るものであり得る。これらのデータセットとしては、発現タンパク質をコードすることが実際に知られる核酸配列が含まれる（例えば、完全タンパク質コード配列－ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはゲノム配列の推定コード領域（例えば、Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Chapter 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; Uberbacher, E. C., 1996, Methods Enzymol. 266:259-281; Tiwari, et al.., 1997, Comput. Appl. Biosci. 13:263-270を参照のこと）。
【0143】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」とは、本明細書では、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリストイル化、ユビキチン化など）にかかわらずアミド結合によって共有結合的に連結されている少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表して互換的に使用される。この定義には、Ｄ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸、ならびにＤ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の混合物が含まれる。
【0144】
「参照配列」とは、別の（例えば、変更された）配列が比較される定義された配列を指す。参照配列は、より長い配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってもよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５残基の長さ、少なくとも５０残基の長さ、またはその核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ（１）２配列間で類似している配列（すなわち、完全配列の一部）を含み、かつ（２）２配列間で発散している配列をさらに含み得るので、２つ（またはそれを超える）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、通常、配列類似性の局部的領域を特定および比較するために比較ウインドウで２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行われる。
【0145】
用語「参照配列」は、野生型配列に限定することを意図するものではなく、改変または変更された配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、「参照配列」は、従前に改変または変更されたアミノ酸配列であり得る。例えば、「Ｘ１２の位置にグリシン残基を有する配列番号２に基づく参照配列」とは、Ｘ１２にグリシン残基を有する配列番号２に相当する参照配列を指す（配列番号２の変更されていない形態はＸ１２にアスパラギン酸を有する）。
【0146】
「小型アミノ酸」または「小型基」とは、合計３以下の炭素および／またはヘテロ原子（α－炭素および水素は除く）から構成される側鎖を有するミノ酸または残基を指す。小型アミノ酸または残基は、上記の定義に従って、脂肪族、非極性、極性または酸性小型アミノ酸または残基としてさらに分類できる。遺伝的にコードされる小型アミノ酸としては、Ｌ－Ａｌａ（Ａ）、Ｌ－Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ－Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ－Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ－Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ－Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【0147】
「実質的に同一」とは、少なくとも２０残基の位置の比較ウインドウ、多くの場合は少なくとも３０～５０残基のウインドウで参照配列と比較した場合に、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれを超える配列同一性パーセントを有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、配列同一性のパーセンテージは、参照配列を、比較ウインドウにおいて参照配列の合計２０％未満の欠失または付加を含む配列と比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態において、用語「実質的に同一」とは、２つのポリペプチド配列が、デフォルトギャップウエイトを用いるプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインした際に、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれを超えるもの（例えば、９９パーセントの配列同一性）を有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【0148】
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、そのポリペプチド種が存在する主要な種である（すなわち、その組成物中の他のいずれの個々の高分子種よりもモルまたは重量に基づいて豊富である）組成物を指し、一般に、対象種がモルまたは重量％として少なくとも約５０パーセントの高分子種の存在を含む場合に、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ組成物は、その組成物中に存在するモルまたは重量％として全高分子種の約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上を占める。いくつかの実施形態では、対象種は、実質的に均一（すなわち、慣例の検出方法によって組成物中に夾雑種が検出できない）となるまで精製され、この場合、組成物は実質的に単一の高分子種からなる。溶媒種および元素イオン種は高分子種であるとは見なされない。いくつかの実施形態では、単離された改良型ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【0149】
本発明を以下の段落でさらに開示する。
１．ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）ポリペプチドまたはその機能的断片であって、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、前記ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドアミノ酸配列は、アミノ酸Ｘ５７、Ｘ６３、Ｘ９４、Ｘ１０１、Ｘ１７２、Ｘ１７６、Ｘ１９１、Ｘ１９３、Ｘ２３３、Ｘ２３４、Ｘ２５５、Ｘ２８６、Ｘ２９５、Ｘ３０１、Ｘ３１９、Ｘ３９７、Ｘ４０２、Ｘ４２５、Ｘ４３５、Ｘ４４６、Ｘ４６２、Ｘ４７９、Ｘ５２３、Ｘ５３２、Ｘ６０１、Ｘ６０５、Ｘ６０６、Ｘ６１０、Ｘ６４５、Ｘ６７６およびＸ６９５からなる群から選択される少なくとも１つの残基が配列番号１のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸に置換されているという特徴を含む、ＰｇｌＢ ＯＳＴポリペプチドまたはその機能的断片。
１．ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）ポリペプチドまたはその機能的断片であって、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、前記ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドアミノ酸配列は、アミノ酸Ｘ５７、Ｘ６３、Ｘ９４、Ｘ１０１、Ｘ１７２、Ｘ１７６、Ｘ１９１、Ｘ１９３、Ｘ２３３、Ｘ２３４、Ｘ２５５、Ｘ２８６、Ｘ２９５、Ｘ３０１、Ｘ３１９、Ｘ３９７、Ｘ４０２、Ｘ４２５、Ｘ４３５、Ｘ４４６、Ｘ４６２、Ｘ４７９、Ｘ５２３、Ｘ５３２、Ｘ６０１、Ｘ６０５、Ｘ６０６、Ｘ６１０、Ｘ６４５、Ｘ６７６およびＸ６９５からなる群から選択される少なくとも１つの残基が配列番号１のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸に置換されているという特徴を含む、ＰｇｌＢ ＯＳＴポリペプチドまたはその機能的断片。
【0150】
２．アミノ酸配列が、
Ｘ５７に相当する残基が親水性残基である；
Ｘ６３に相当する残基が極性残基および疎水性残基から選択される；
Ｘ９４に相当する残基が極性残基である；
Ｘ１０１に相当する残基が酸性残基、非極性残基、親水性残基、拘束残基、および芳香族残基から選択される；
Ｘ１７２に相当する残基が酸性残基である；
Ｘ１７６に相当する残基が非極性残基および酸性残基から選択される；
Ｘ１９１に相当する残基が親水性残基および芳香族残基から選択される；
Ｘ１９３に相当する残基が非極性残基、親水性残基、および芳香族残基から選択される；
Ｘ２３３に相当する残基が脂肪族残基である：
Ｘ２３４に相当する残基が小型残基、親水性残基、および芳香族残基から選択される；
Ｘ２５５に相当する残基が親水性残基である；
Ｘ２８６に相当する残基が疎水性残基および極性残基から選択される；
Ｘ２９５に相当する残基が酸性または脂肪族である；
Ｘ３０１に相当する残基が拘束残基、非極性残基および芳香族残基から選択される；
Ｘ３１９に相当する残基が親水性残基および脂肪族残基から選択される；
Ｘ３９７に相当する残基が親水性残基および疎水性残基から選択される；
Ｘ４０２に相当する残基が親水性残基である；
Ｘ４２５に相当する残基が極性残基である；
Ｘ４３５に相当する残基が親水性残基および疎水性残基から選択される；
Ｘ４４６に相当する残基が非極性残基である；
Ｘ４６２に相当する残基が芳香族残基、拘束残基および小型残基から選択される；
Ｘ４７９に相当する残基が疎水性残基である；
Ｘ５２３に相当する残基が塩基性残基である；
Ｘ５３２に相当する残基が親水性残基である；
Ｘ６０１に相当する残基が疎水性残基である；
Ｘ６０５に相当する残基が酸性残基である；
Ｘ６０６に相当する残基が拘束残基である；
Ｘ６１０に相当する残基が親水性残基および疎水性残基から選択される；
Ｘ６４５に相当する残基が脂肪族残基および親水性残基から選択される；
Ｘ６７６に相当する残基が芳香族残基、親水性残基、および非極性残基から選択される；
Ｘ６９５に相当する残基が極性残基および脂肪族残基から選択される、
からなるリストから選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落１のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
Ｘ５７に相当する残基が親水性残基である；
Ｘ６３に相当する残基が極性残基および疎水性残基から選択される；
Ｘ９４に相当する残基が極性残基である；
Ｘ１０１に相当する残基が酸性残基、非極性残基、親水性残基、拘束残基、および芳香族残基から選択される；
Ｘ１７２に相当する残基が酸性残基である；
Ｘ１７６に相当する残基が非極性残基および酸性残基から選択される；
Ｘ１９１に相当する残基が親水性残基および芳香族残基から選択される；
Ｘ１９３に相当する残基が非極性残基、親水性残基、および芳香族残基から選択される；
Ｘ２３３に相当する残基が脂肪族残基である：
Ｘ２３４に相当する残基が小型残基、親水性残基、および芳香族残基から選択される；
Ｘ２５５に相当する残基が親水性残基である；
Ｘ２８６に相当する残基が疎水性残基および極性残基から選択される；
Ｘ２９５に相当する残基が酸性または脂肪族である；
Ｘ３０１に相当する残基が拘束残基、非極性残基および芳香族残基から選択される；
Ｘ３１９に相当する残基が親水性残基および脂肪族残基から選択される；
Ｘ３９７に相当する残基が親水性残基および疎水性残基から選択される；
Ｘ４０２に相当する残基が親水性残基である；
Ｘ４２５に相当する残基が極性残基である；
Ｘ４３５に相当する残基が親水性残基および疎水性残基から選択される；
Ｘ４４６に相当する残基が非極性残基である；
Ｘ４６２に相当する残基が芳香族残基、拘束残基および小型残基から選択される；
Ｘ４７９に相当する残基が疎水性残基である；
Ｘ５２３に相当する残基が塩基性残基である；
Ｘ５３２に相当する残基が親水性残基である；
Ｘ６０１に相当する残基が疎水性残基である；
Ｘ６０５に相当する残基が酸性残基である；
Ｘ６０６に相当する残基が拘束残基である；
Ｘ６１０に相当する残基が親水性残基および疎水性残基から選択される；
Ｘ６４５に相当する残基が脂肪族残基および親水性残基から選択される；
Ｘ６７６に相当する残基が芳香族残基、親水性残基、および非極性残基から選択される；
Ｘ６９５に相当する残基が極性残基および脂肪族残基から選択される、
からなるリストから選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落１のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0151】
３．アミノ酸配列が、残基Ｘ５７がＴおよびＲから選択される；残基Ｘ６３がＬおよびＱから選択される；残基Ｘ９４がＮであり；残基Ｘ１０１がＷ、Ｅ、Ｈ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、およびＧから選択される；残基Ｘ１７２がＥである；残基Ｘ１７６がＥおよびＧから選択される；残基Ｘ１９１がＨ、Ｄ、Ｒ、およびＹから選択される；残基Ｘ１９３がＴ、Ｈ、Ｇ、およびＦから選択される；Ｘ２３３がＶである；残基Ｘ２３４がＨ、Ｃ、およびＷから選択される；残基Ｘ２５５がＨである；残基Ｘ２８６がＡ、Ｑ、およびＬから選択される；残基Ｘ２９５がＥまたはＬである；残基Ｘ３０１がＰ、Ｇ、およびＦから選択される；残基Ｘ３１９がＡ、Ｑ、Ｌ、およびＴから選択される；残基Ｘ３９７がＮ、Ｌ、およびＱから選択される；残基Ｘ４０２がＲおよびＨから選択される；残基Ｘ４２５がＳである；残基Ｘ４３５がＡ、Ｌ、Ｆ、Ｈ、およびＲから選択される；残基Ｘ４４６がＧである；残基Ｘ４６２がＰ、Ｃ、Ｗ、Ｔ、およびＮから選択される；残基Ｘ４７９がＭである；残基Ｘ５２３がＲである；残基Ｘ５３２がＨである；残基Ｘ６０１がＧである；残基Ｘ６０５がＤである；残基Ｘ６０６がＰである；残基Ｘ６１０がＰ、Ｌ、Ｒ、Ｄ、およびＡから選択される；残基Ｘ６４５がＬ、Ｓ、およびＨから選択される；残基Ｘ６７６がＱ、Ｗ、およびＧから選択される；ならびに残基Ｘ６９５がＩおよびＱから選択される、からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落１または２のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0152】
４．アミノ酸配列が、配列番号１の５７番目のアミノ酸に相当する残基がＲに変異している；配列番号１の１０１番目のアミノ酸に相当する残基がＭに変異している；配列番号１の１９１番目のアミノ酸に相当する残基がＨ、Ｄ、ＲまたはＹに（好ましくは、Ｙに）変異している；配列番号１の４６２番目のアミノ酸に相当する残基がＰまたはＷに変異している；配列番号１の４７９番目のアミノ酸に相当する残基がＭに変異している、および配列番号１の６７６番目のアミノ酸に相当する残基がＷに変異している、からなるリストから選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落１～３のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0153】
５．配列番号１の５７番目のアミノ酸に相当する残基がＲまたはＫまたはＴに、好ましくはＲまたはＴに、より好ましくはＲに変異している、段落１～４のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0154】
６．配列番号１の５７番目のアミノ酸に相当する残基がＲに変異している、段落５のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0155】
７．ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドアミノ酸配列が、アミノ酸Ｘ７８、Ｘ８４、Ａ１５５、Ｘ２９３、Ｘ３００、Ｘ３０１、Ｘ３０６、Ｘ３０８、Ｘ４６２、Ｘ４６４、Ｘ４７９、Ｘ５２３およびＸ５７０からなる群から選択される少なくとも１つの残基が配列番号１のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸に置換されているという特徴を含む、段落１～６のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0156】
８．アミノ酸配列が、
Ｘ７８に相当する残基がヒドロキシル含有残基である；
Ｘ８４に相当する残基が芳香族残基である；
Ｘ１５５に相当する残基が極性残基である；
Ｘ２９３に相当する残基が小型残基である；
Ｘ３００に相当する残基が脂肪族残基である；
Ｘ３０１に相当する残基が拘束残基および非極性残基から選択される；
Ｘ３０６に相当する残基が親水性残基である；
Ｘ３０８に相当する残基が芳香族残基である；
Ｘ４６２に相当する残基が芳香族残基および極性残基から選択される；
Ｘ４６４に相当する残基が脂肪族残基である；
Ｘ４７９に相当する残基が疎水性残基である；
Ｘ５２３に相当する残基が塩基性残基である；ならびに
Ｘ５７０に相当する残基が塩基性残基および脂肪族残基から選択される、
からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落７のＰｇｌＢ ＯＳＴポリペプチドまたはその機能的断片。
Ｘ７８に相当する残基がヒドロキシル含有残基である；
Ｘ８４に相当する残基が芳香族残基である；
Ｘ１５５に相当する残基が極性残基である；
Ｘ２９３に相当する残基が小型残基である；
Ｘ３００に相当する残基が脂肪族残基である；
Ｘ３０１に相当する残基が拘束残基および非極性残基から選択される；
Ｘ３０６に相当する残基が親水性残基である；
Ｘ３０８に相当する残基が芳香族残基である；
Ｘ４６２に相当する残基が芳香族残基および極性残基から選択される；
Ｘ４６４に相当する残基が脂肪族残基である；
Ｘ４７９に相当する残基が疎水性残基である；
Ｘ５２３に相当する残基が塩基性残基である；ならびに
Ｘ５７０に相当する残基が塩基性残基および脂肪族残基から選択される、
からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落７のＰｇｌＢ ＯＳＴポリペプチドまたはその機能的断片。
【0157】
９．アミノ酸配列が、Ｘ７８がＴに変異している；Ｘ８４がＷに変異している；Ｘ１５５がＱに変異している；Ｘ２９３がＣに変異している；Ｘ３００がＬに変異している；Ｘ３０１がＰまたはＧに変異している；Ｘ３０６がＨに変異している；Ｘ３０８がＷに変異している；Ｘ４６２がＷ、ＮまたはＴに変異している；Ｘ４６４がＬに変異している；Ｘ４７９がＭに変異している；Ｘ５２３がＲに変異している；Ｘ５７０がＲまたはＶに変異している、からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落７～８のいずれか１つのＰｇｌＢ ＯＳＴポリペプチドまたはその機能的断片。
【0158】
１０．アミノ酸配列が、アミノ酸Ｘ３００がＬに変異している；アミノ酸Ｘ３０１がＰに変異している、アミノ酸Ｘ３０８がＷに変異している、アミノ酸Ｘ４６２がＷに変異している、アミノ酸Ｘ４７９がＭに変異している、およびアミノ酸Ｘ５７０がＲに変異している、からなるリストから選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落７～９のいずれか１つのＰｇｌＢ ＯＳＴ。
【0159】
１１．アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸Ｘ３０１に相当する残基Ｐに変異している；配列番号１のアミノ酸Ｘ４６２に相当する残基がＮまたはＷに変異している、および配列番号１のアミノ酸Ｘ４７９に相当する残基がＭに変異している、からなるリストから選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落７～１０のいずれか１つのＰｇｌＢ ＯＳＴ。
【0160】
１２．アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸Ｘ４７９に相当する残基におけるＭへの突然変異を含む、段落７～１１のいずれか１つのＰｇｌＢ ＯＳＴ。
【0161】
１３．アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸Ｘ４６２に相当する残基における突然変異を含む、段落７～１２のいずれか１つのＰｇｌＢ。
【0162】
１４．アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸Ｘ４６２に相当する残基のＷへの突然変異および配列番号１のアミノ酸Ｘ４７９に相当する残基のＭへの突然変異を含む、段落７～１３のいずれか１つのＰｇｌＢ。
【0163】
１５．配列番号１のＸ３００に相当するアミノ酸がＬに変異している；配列番号１のＸ３０１に相当するアミノ酸がＰに変異している、配列番号１のＸ３０８に相当するアミノ酸がＷに変異している、配列番号１のＸ４６２に相当するアミノ酸がＷに変異している、配列番号１のＸ４７９に相当するアミノ酸がＭに変異している、および配列番号１のＸ５７０に相当するアミノ酸がＲに変異している、という特徴のうち少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを含む、段落７～１４のいずれか１つのＰｇｌＢ ＯＳＴ。
【0164】
１６．アミノ酸Ｘ３００がＬに変異している；アミノ酸Ｘ３０１がＰに変異している、アミノ酸Ｘ３０８がＷに変異している、アミノ酸Ｘ４６２がＷに変異している、アミノ酸Ｘ４７９がＭに変異している、およびアミノ酸Ｘ５７０がＲに変異している、段落１５のＰｇｌＢ ＯＳＴ。
【0165】
１７．アミノ酸配列が、アミノ酸Ｘ１２、Ｘ５１、Ｘ１０４、Ｘ１３０、Ｘ１７６、Ｘ１７７、Ｘ１８６、Ｘ１９１、Ｘ２１８、Ｘ２３４、Ｘ２８６、Ｘ２９５、Ｘ３０６、Ｘ３０８、Ｘ３１９、Ｘ３８２、Ｘ４８２、およびＸ５２３からなる群から選択される少なくとも１つの残基位置において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較して少なくとも１つの残基の違いを含む、段落１～１６のいずれか１つのＰｇｌＢ ＯＳＴ。
【0166】
１８．アミノ酸配列が、
アミノ酸Ｘ１２に相当する残基がヒドロキシル含有残基である；
アミノ酸Ｘ５１に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ１０４に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ１３０に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ１７６に相当する残基が酸性残基である；
アミノ酸Ｘ１７７に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ１８６に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ１９１に相当する残基が芳香族残基である；
アミノ酸Ｘ２１８に相当する残基が小型残基である；
アミノ酸Ｘ２３４に相当する残基が芳香族残基および小型残基から選択される；
アミノ酸Ｘ２８６に相当する残基が極性残基および脂肪族残基から選択される；
アミノ酸Ｘ２９５に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ３０６に相当する残基が親水性残基である；
アミノ酸Ｘ３０８に相当する残基が芳香族残基である；
アミノ酸Ｘ３１９に相当する残基が脂肪族残基および極性残基から選択される；
アミノ酸Ｘ３８２に相当する残基が小型残基である；
アミノ酸Ｘ４８２に相当する残基が塩基性残基である；
アミノ酸Ｘ５２３に相当する残基が塩基性残基である、
から選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落１７のＰｇｌＢ ＯＳＴ。
アミノ酸Ｘ１２に相当する残基がヒドロキシル含有残基である；
アミノ酸Ｘ５１に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ１０４に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ１３０に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ１７６に相当する残基が酸性残基である；
アミノ酸Ｘ１７７に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ１８６に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ１９１に相当する残基が芳香族残基である；
アミノ酸Ｘ２１８に相当する残基が小型残基である；
アミノ酸Ｘ２３４に相当する残基が芳香族残基および小型残基から選択される；
アミノ酸Ｘ２８６に相当する残基が極性残基および脂肪族残基から選択される；
アミノ酸Ｘ２９５に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ３０６に相当する残基が親水性残基である；
アミノ酸Ｘ３０８に相当する残基が芳香族残基である；
アミノ酸Ｘ３１９に相当する残基が脂肪族残基および極性残基から選択される；
アミノ酸Ｘ３８２に相当する残基が小型残基である；
アミノ酸Ｘ４８２に相当する残基が塩基性残基である；
アミノ酸Ｘ５２３に相当する残基が塩基性残基である、
から選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落１７のＰｇｌＢ ＯＳＴ。
【0167】
１９．アミノ酸配列が、残基Ｘ１２がＳである；残基Ｘ５１がＬである；残基Ｘ１０４がＬである；残基Ｘ１３０がＬである；残基Ｘ１７６がＥである；残基Ｘ１７７がＶである；残基Ｘ１８６がＬである；残基Ｘ１９１がＹである；残基Ｘ２１８がＡである；残基Ｘ２３４がＣおよびＷから選択される；残基Ｘ２８６がＱおよびＬから選択される；残基Ｘ２９５がＬまたはＥである；残基Ｘ３０６がＨである；残基Ｘ３０８がＦである；残基Ｘ３１９がＬおよびＱから選択される；残基Ｘ３８２がＳである；残基Ｘ４８２がＲである；ならびに残基Ｘ５２３がＲである、からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落１７または１８のＰｇｌＢ ＯＳＴまたはその機能的断片。
【0168】
２０．アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸Ｘ２１８に相当する残基がＡである、および配列番号１のアミノ酸Ｘ３８２に相当する残基がＳである、からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落１７～１９のいずれか１つのＰｇｌＢ ＯＳＴまたはその機能的断片。
【0169】
２１．アミノ酸配列が以下の特徴：アミノ酸Ｘ１９１がＹである；アミノ酸Ｘ２８６がＱである；アミノ酸Ｘ２９５がＬまたはＥである；アミノ酸Ｘ３８２がＳである；アミノ酸Ｘ４８２がＲである；アミノ酸Ｘ５２３がＲである、を含む、段落１７～２０のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0170】
２２．アミノ酸配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した場合に、アミノ酸Ｘ２１、アミノ酸Ｘ２７、アミノ酸Ｘ４２、アミノ酸Ｘ４４、アミノ酸Ｘ５３、アミノ酸Ｘ８０、アミノ酸Ｘ９７、アミノ酸Ｘ２９７、アミノ酸Ｘ３１７、アミノ酸Ｘ３４１、アミノ酸Ｘ３８３、アミノ酸Ｘ３８８、アミノ酸Ｘ４１０、アミノ酸Ｘ４２１、アミノ酸Ｘ４８０、およびアミノ酸Ｘ４８６から選択される少なくとも１つの残基位置から選択される位置に残基の違いを含む、段落１～２１のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0171】
２３．アミノ酸配列が、
アミノ酸Ｘ２１に相当する残基がヒドロキシル含有残基および脂肪族残基から選択される；
アミノ酸Ｘ２７に相当する残基がヒドロキシル含有残基および疎水性残基から選択される；
アミノ酸Ｘ４２に相当する残基が芳香族残基および小型残基から選択される；
アミノ酸Ｘ４４に相当する残基が疎水性残基および親水性残基から選択される；
アミノ酸Ｘ５２に相当する残基が親水性残基および脂肪族残基から選択される；
アミノ酸Ｘ８０に相当する残基が小型残基である；
アミノ酸Ｘ９７相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ２９７に相当する残基が塩基性残基およびヒドロキシル含有残基から選択される；
アミノ酸Ｘ３１７に相当する残基が小型残基である；
アミノ酸Ｘ３４１に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ４２１に相当する残基が非極性残基である；
アミノ酸Ｘ４８０に相当する残基が親水性残基および疎水性残基から選択される；ならびに
アミノ酸Ｘ４８６に相当する残基が小型残基、親水性残基、および脂肪族残基である、
からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落２２のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
アミノ酸Ｘ２１に相当する残基がヒドロキシル含有残基および脂肪族残基から選択される；
アミノ酸Ｘ２７に相当する残基がヒドロキシル含有残基および疎水性残基から選択される；
アミノ酸Ｘ４２に相当する残基が芳香族残基および小型残基から選択される；
アミノ酸Ｘ４４に相当する残基が疎水性残基および親水性残基から選択される；
アミノ酸Ｘ５２に相当する残基が親水性残基および脂肪族残基から選択される；
アミノ酸Ｘ８０に相当する残基が小型残基である；
アミノ酸Ｘ９７相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ２９７に相当する残基が塩基性残基およびヒドロキシル含有残基から選択される；
アミノ酸Ｘ３１７に相当する残基が小型残基である；
アミノ酸Ｘ３４１に相当する残基が脂肪族残基である；
アミノ酸Ｘ４２１に相当する残基が非極性残基である；
アミノ酸Ｘ４８０に相当する残基が親水性残基および疎水性残基から選択される；ならびに
アミノ酸Ｘ４８６に相当する残基が小型残基、親水性残基、および脂肪族残基である、
からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落２２のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0172】
２４．アミノ酸配列が、アミノ酸Ｘ２１がＳおよびＬから選択される；アミノ酸Ｘ２７がＭ、Ｓ、ＡおよびＷから選択される；アミノ酸Ｘ４２がＷおよびＣから選択される；アミノ酸Ｘ４４がＭおよびＨから選択される；アミノ酸Ｘ５３がＳ、ＩおよびＨから選択される；アミノ酸Ｘ８０がＡおよびＤから選択される；アミノ酸Ｘ９７がＩである；アミノ酸Ｘ２９７がＫ、Ｒ、ＳおよびＹから選択される；アミノ酸Ｘ３１７がＳおよびＡから選択される；アミノ酸Ｘ３４１がＬである；アミノ酸Ｘ３８３がＭである；アミノ酸Ｘ３８８がＭおよびＩから選択される；アミノ酸Ｘ４１０がＩである；アミノ酸Ｘ４２１がＧである；アミノ酸Ｘ４８０がＷ、Ｎ、Ｑ、Ｉ、Ｔ、およびＭから選択される；ならびにアミノ酸Ｘ４８６がＣ、Ｎ、Ｌ、Ｈ、およびＶから選択される、からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、段落２２または２３のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0173】
２５．アミノ酸配列が以下の特徴：Ｘ２９７がＲであることを含む、段落２２～２４のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0174】
２６．アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸Ｘ３００、Ｘ３０１、Ｘ３０８、Ｘ４６２、Ｘ４７９またはＸ５７０に相当する残基に少なくとも１つのさらなる点突然変異を含む、段落１～２５のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0175】
２７．配列番号１のアミノ酸Ｘ４６２に相当する残基がＹからＷに変異している、段落２６のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0176】
２８．配列番号１のアミノ酸Ｘ４７９に相当する残基がＨからＭに変異している、段落２６～２７のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0177】
２９．配列番号１のアミノ酸Ｘ３００に相当する残基がＮからＬに変異している、段落２６～２８のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0178】
３０．配列番号１のアミノ酸Ｘ３０１に相当する残基がＬからＰに変異している、段落２６～２９のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0179】
３１．配列番号１のアミノ酸Ｘ３０８に相当する残基がＦからＷに変異している、段落２６～３０のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0180】
３２．配列番号１のアミノ酸Ｘ５７０に相当する残基がＬからＲに変異している、段落２６～３１のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0181】
３３．配列番号１のアミノ酸Ｘ１９１に相当する残基がＬからＹに変異している、段落２６～３２のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0182】
３４．配列番号１のアミノ酸Ｘ２８６に相当する残基がＹからＱに変異している、段落２６～３３のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0183】
３５．配列番号１のアミノ酸Ｘ２９５に相当する残基がＳからＬまたはＥに変異している、段落２６～３４のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0184】
３６．配列番号１のアミノ酸Ｘ３８２に相当する残基がＡからＳに変異している、段落２６～３５のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0185】
３７．配列番号１のアミノ酸Ｘ４８２に相当する残基がＫからＲに変異している、段落２６～３６のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0186】
３８．配列番号１のアミノ酸Ｘ５２３に相当する残基がＴからＲに変異している、段落２６～３７のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0187】
３９．配列番号１のアミノ酸Ｘ２９７に相当する残基がＥからＲに変異している、段落２６～３８のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼまたはその機能的断片。
【0188】
４０．配列番号１のアミノ酸Ｘ８０に相当する残基がＳからＤに変異している、段落２６～３９のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼまたはその機能的断片。
【0189】
４１．配列番号１のアミノ酸Ｘ１８７に相当する残基がＩからＶに変異している、段落２６～４０のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0190】
４２．配列番号１のアミノ酸Ｘ３５９に相当する残基がＩからＱに変異している、段落２６～４１のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0191】
４３．配列番号１のアミノ酸Ｘ４０６に相当する残基がＮからＩに変異している、段落２６～４２のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0192】
４４．配列番号１のアミノ酸Ｘ７７に相当する残基がＲであり、かつ、配列番号１のアミノ酸Ｘ３１１に相当する残基がＶである、段落１～４３のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0193】
４５．配列番号２、３、４、５、６、７または８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、段落１のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0194】
４６．配列番号１のアミノ酸Ｘ５７、Ｘ４６２およびＸ４７９に相当する残基が、配列番号１のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸で置換されている、場合により、Ａ５７Ｒ、Ｙ４６２ＷおよびＨ４７９Ｍの置換である、段落１～４４のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0195】
４７．配列番号１のアミノ酸Ｘ５７、Ｘ３００、Ｘ３０１、Ｘ３０８、Ｘ４６２、Ｘ４７９およびＸ５７０に相当する残基が、配列番号１のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸で置換されている、場合により、Ａ５７Ｒ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、およびＬ５７０Ｒの置換である、段落１～４６のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドまたはその機能的断片。
【0196】
４８．ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドが全長であり、場合により、７１２、７１３または７１４アミノ酸の長さを有する、段落１～４７のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【0197】
４９．ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼがＣ．ジェジュニ由来である、段落１～４８のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【0198】
５０．ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼがＣ．ラリ由来である、段落１～４８のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【0199】
５１．ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼがＣ．コリ由来である、段落１～４８のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチド。
【0200】
５２．ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼが改変されている、段落１～４９のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドの組成物。
【0201】
５３．配列番号１２のアミノ酸Ｘ５７に相当する残基が、配列番号１２のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸で置換されている、場合により、Ａ５７Ｒの置換である、カンピロバクター・コリ由来ＰｇｌＢ（ＰｇｌＢＣ．ｃｏｌｉ）。
【0202】
５４．配列番号１２のＸ４６３に相当する残基アミノ酸が、配列番号１２のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸で置換されている、場合により、Ｙ４６３Ｗの置換である、段落５３のカンピロバクター・コリ由来ＰｇｌＢ（ＰｇｌＢＣ．ｃｏｌｉ）。
【0203】
５５．配列番号１２のアミノ酸Ｘ４８０に相当する残基が、配列番号１２のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸で置換されている、場合により、Ｈ４８０Ｍの置換である、段落５３または５４のカンピロバクター・コリ由来ＰｇｌＢ（ＰｇｌＢＣ．ｃｏｌｉ）。
【0204】
５６．配列番号１２のアミノ酸Ｘ３１１に相当する残基が、配列番号１２のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸で置換されている、場合により、Ｎ３１１Ｖの置換である、段落５３～５５のいずれか１つのカンピロバクター・コリ由来ＰｇｌＢ（ＰｇｌＢＣ．ｃｏｌｉ）。
【0205】
５７．配列番号１２のアミノ酸Ｘ７７に相当する残基が、配列番号１２のその位置に見られるものとは異なるアミノ酸で置換されている、場合により、Ｙ７７Ｒの置換である、段落５３～５６のいずれか１つのカンピロバクター・コリ由来ＰｇｌＢ（ＰｇｌＢＣ．ｃｏｌｉ）。
【0206】
５８．段落１～５７のいずれか１つに見られるような、変異型ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【0207】
５９．段落１～５７のいずれか１つの少なくとも１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼまたは段落５８のポリヌクレオチドを含む、組成物または宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞または大腸菌宿主細胞）。
【0208】
６０．少なくとも１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼが改変されている、段落５９の組成物または宿主細胞。
【0209】
６１．段落５８の変異型ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼまたは配列番号１２、１３または１４と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＣ．コリ由来ＰｇｌＢをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【0210】
６２．原核生物宿主細胞、場合により、大腸菌宿主細胞である、段落６１の宿主細胞。
【0211】
６３．ＰｇｌＢをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、またはプラスミドから発現される、段落６１または６２に記載の宿主細胞。
【0212】
６４．アミノ酸配列Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外のいずれの天然アミノ酸であってもよい）を含む少なくとも１つのグリコシル化部位を含むタンパク質をコードするさらなるポリヌクレオチドを含む、段落６１、６２または６３の宿主細胞。
【0213】
６５．少なくとも１つのグリコシル化部位を含むタンパク質が、緑膿菌外毒素Ａ（ＥＰＡ）、ＣＲＭ１９７、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌の無毒化溶血素Ａ、クランピング因子Ａ、クランピング因子Ｂ、大腸菌ＦｉｍＨ、大腸菌ＦｉｍＨＣ、大腸菌熱不安定生腸毒素、大腸菌熱不安定生腸毒素の無毒化変異体、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、コレラ毒素、コレラ毒素の無毒化変異体、大腸菌ｓａｔタンパク質、大腸菌ｓａｔタンパク質のパッセンジャードメイン、Ｃ．ジェジュニＡｃｒＡ、およびＣ．ジェジュニ天然糖タンパク質からなる群から選択される、段落６１～６４のいずれか１つの宿主細胞。
【0214】
６６．少なくとも１つのグリコシル化部位を含むタンパク質が緑膿菌のエキソプロテインＡ（ＥＰＡ）である、段落６５の宿主細胞。
【0215】
６７．少なくとも１つのグリコシル化部位を含むタンパク質が、２つ、３つまたは４つのグリコシル化部位を含む、段落６１～６６のいずれか１つの宿主細胞。
【0216】
６８．ウンデカプレニル脂質キャリア上での特定のオリゴ糖のアセンブリに必要なグリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、段落６１～６７のいずれか１つの宿主細胞。
【0217】
６９．特定のオリゴ糖が抗原、例えば、細菌Ｏ抗原または細菌莢膜糖抗原である、段落６１～６８のいずれか１つの宿主細胞。
【0218】
７０．特定のオリゴ糖が、大腸菌Ｏ－抗原、サルモネラ属Ｏ－抗原、シュードモナス種Ｏ－抗原、クレブシエラ属Ｏ－抗原、アシネトバクターＯ抗原、クラミジア・トラコマチス抗原、コレラ菌抗原、リステリア属抗原、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１～１５抗原、パラ百日咳菌抗原、鼻疽菌または類鼻疽菌抗原、野兎病菌抗原、カンピロバクター種抗原；クロストリジウム・ディフィシル抗原、ストレプトコッカス・アガラクティエ抗原、髄膜炎菌抗原、カンジダ・アルビカンス抗原、ヘモフィルス・インフルエンザ抗原、腸球菌抗原、ボレリア・ブルグドルフェリ抗原、黄色ブドウ球菌莢膜糖抗原、ヘモフィルス・インフルエンザ抗原、森林型熱帯リーシュマニア抗原、赤痢菌属、または肺炎連鎖球菌莢膜糖抗原（例えば、血清型ＣＰ１、ＣＰ２、ＣＰ３、ＣＰ４、ＣＰ５、ＣＰ６（ＡおよびＢ）、ＣＰ７（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ＣＰ８、ＣＰ９（Ａ、Ｌ、Ｎ、Ｖ）、ＣＰ１０（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、ＣＰ１１（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）、ＣＰ１２（Ａ、Ｂ、Ｆ）、ＣＰ１３、ＣＰ１４、ＣＰ１５（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、ＣＰ１６（Ａ、Ｆ）、ＣＰ１７（Ａ、Ｆ）、ＣＰ１８（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、ＣＰ１９（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、ＣＰ２０、ＣＰ２１、ＣＰ２２（Ａ、Ｆ）、ＣＰ２３（Ａ、Ｂ、Ｆ）、ＣＰ２４（Ａ、Ｂ、Ｆ）、ＣＰ２５（Ａ、Ｆ）、ＣＰ２６、ＣＰ２７，ＣＰ２８（Ａ、Ｆ）、ＣＰ２９、ＣＰ３１、ＣＰ３２（Ａ、Ｆ）、ＣＰ３３（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）、ＣＰＳ３４、ＣＰ３５（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）、ＣＰ３６、ＣＰ３７、ＣＰ３８、ＣＰ３９、ＣＰ４０、ＣＰ４１（Ａ、Ｆ）、ＣＰ４２、ＣＰ４３、ＣＰ４４、ＣＰ４５、ＣＰ４６、ＣＰ４７（Ａ、Ｆ）、ＣＰＳ４８）を含む、段落６９の宿主細胞。
【0219】
７１．特定のオリゴ糖が、オリゴ糖の還元末端がＧｌｃＮＡｃでない残基を含む、段落６１～７０のいずれか１つの宿主細胞。
【0220】
７２．特定のオリゴ糖が、還元末端にグルコース残基を含む、段落６１～７１のいずれか１つの宿主細胞。
【0221】
７３．グリコシル化タンパク質を作製するためのプロセスであって、
（ａ）段落６１～７２のいずれか１つの宿主細胞をタンパク質の生産に好適な条件下で培養する工程；および
（ｂ）グリコシル化タンパク質を宿主細胞から単離する工程
を含む、プロセス。
（ａ）段落６１～７２のいずれか１つの宿主細胞をタンパク質の生産に好適な条件下で培養する工程；および
（ｂ）グリコシル化タンパク質を宿主細胞から単離する工程
を含む、プロセス。
【0222】
７４．グリコシル化タンパク質を作製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスであって、
ｉ）以下：
ａ）段落１～５７のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ；
ｂ）アミノ酸配列Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外のいずれの天然アミノ酸であってもよい）を含む少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質；ならびに
ｃ）ＰｇｌＢによって認識される脂質キャリア上の糖鎖
を一緒に混合する工程；
ｉｉ）タンパク質の少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列に糖鎖を転移してグリコシル化タンパク質を得るためにＰｇｌＢの酵素活性に好適な条件下でインキュベートする工程；ならびに
ｉｉｉ）前記グリコシル化タンパク質を単離する工程
を含む、プロセス。
ｉ）以下：
ａ）段落１～５７のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼ；
ｂ）アミノ酸配列Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外のいずれの天然アミノ酸であってもよい）を含む少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質；ならびに
ｃ）ＰｇｌＢによって認識される脂質キャリア上の糖鎖
を一緒に混合する工程；
ｉｉ）タンパク質の少なくとも１つのグリコシル化コンセンサス配列に糖鎖を転移してグリコシル化タンパク質を得るためにＰｇｌＢの酵素活性に好適な条件下でインキュベートする工程；ならびに
ｉｉｉ）前記グリコシル化タンパク質を単離する工程
を含む、プロセス。
【0223】
７５．段落７３または７４のプロセスによって作製される、グリコシル化タンパク質。
【0224】
７６．タンパク質の、アミノ酸配列Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外のいずれの天然アミノ酸であってもよい）を含むグリコシル化コンセンサス配列のＮ残基に糖が結合しているグリコシル化タンパク質の生産における、段落１～５７のいずれか１つのＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼまたはその機能的断片の使用。
【0225】
７７．グリコシル化配列のＮ残基に共有結合されている糖の糖残基がＮ－アセチル糖、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミンではない、段落７６の使用。
【0226】
７８．糖のグルコース残基がグリコシル化配列のＮ残基に共有結合されている、段落７６または７７のＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼの使用。
【0227】
７９．糖が細菌抗原、場合により、細菌莢膜多糖抗原または細菌Ｏ－抗原である、段落７６～７８のいずれか１つの使用。
【0228】
８０．糖がグラム陽性菌莢膜多糖抗原である、段落７６～７９のいずれか１つの使用。
【0229】
８１．糖が大腸菌Ｏ抗原、サルモネラ属抗原、シュードモナス属抗原、クレブシエラ属抗原、アシネトバクターＯ抗原、クラミジア・トラコマチス抗原、コレラ菌抗原、リステリア属抗原、レジオネラ・ニューモフィラ血清型１～１５抗原、百日咳菌抗原、パラ百日咳菌抗原、鼻疽菌または類鼻疽菌抗原、野兎病菌抗原、カンピロバクター属抗原、クロストリジウム・ディフィシル抗原、化膿連鎖球菌抗原、ストレプトコッカス・アガラクティエ抗原、腸球菌抗原、ボレリア・ブルグドルフェリ抗原、髄膜炎菌抗原、ヘモフィルス・インフルエンザ抗原、森林型熱帯リーシュマニア抗原、赤痢菌属抗原、黄色ブドウ球菌抗原、サルモネラ・エンテリカ抗原または肺炎連鎖球菌抗原である、段落７６～８０のいずれか１つの使用。
【0230】
８２．糖が肺炎連鎖球菌莢膜糖抗原である、段落８１の使用。
【0231】
８３．肺炎連鎖球菌莢膜糖抗原が血清型１、４、１９Ａ、２２Ｆ、２３Ａ、３５Ｂまたは８、好ましくは、血清型８由来である、段落８２の使用。
【0232】
８４．タンパク質が、少なくとも１つ、２つまたは３つのグリコシル化コンセンサス配列を含むキャリアタンパク質である、段落７６～８３のいずれか１つの使用。
【0233】
８５．キャリアタンパク質が緑膿菌エキソプロテインＡ（ＥＰＡ）、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ニューモリシンである、段落８４の使用。
【0234】
８６．ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼまたはその機能的断片が、配列番号１の配列を有する、相当するＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼの少なくとも１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、７００倍、１０００倍のグリコシル化タンパク質を生産するように糖によるタンパク質のグリコシル化の収量を高めることができる、段落７６～８５のいずれか１つの使用。
【0235】
８７．ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼまたはその機能的断片が、タンパク質の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を糖でグリコシル化することができ、この糖のグルコース残基はグリコシル化コンセンサス配列のＮ残基に共有結合される、段落７６～８６のいずれか１つの使用。
【0236】
８８．タンパク質の、アミノ酸配列Ａｓｐ／Ｇｌｕ－Ｚ１－Ａｓｎ－Ｚ２－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰｒｏ以外のいずれの天然アミノ酸であってもよい）を含むグリコシル化コンセンサス配列のＮ残基に糖が結合しているグリコシル化タンパク質の生産における、カンピロバクター・コリ由来のＰｇｌＢ（ＰｇｌＢＣ．ｃｏｌｉ）オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＳＴ）またはその機能的断片の使用。
【0237】
８９．ＰｇｌＢＣ．ｃｏｌｉが、配列番号１２、１３または１４、場合により、配列番号１２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、段落８８の使用。
【0238】
９０．糖がフレクスナー赤痢菌２ａ、３ａおよび６、ならびに大腸菌Ｏ１８からなる群から選択される、段落８８または８９の使用。
【実施例】
【0239】
以下、本開示の種々の特徴および実施形態を代表例で説明するが、これらは例示を意図するものであって、限定するものではない。
【0240】
実施例１
ＰｇｌＢ変異体の活性を評価するために使用されるプラスミドおよび系統
ＰｇｌＢ変異体の活性を、ＷＯ１４／０５７１０９Ａ１に記載されるように遺伝子の欠失がある大腸菌Ｗ３１１０の誘導体で試験した。ＷＯ２０１４０５７１０９Ａ１に詳説される方法に基づいて、莢膜多糖をコードする遺伝子座を大腸菌染色体に安定に組み込んだ。ＰｇｌＢ、キャリアタンパク質、補助的生合成酵素および調節タンパク質を含むその他の必要な要素は、プラスミドｐＥＸＴ２１（Ｓｐｅｃ耐性、ＩＰＴＧ誘導性）、ｐＥＸＴ２２（Ｋａｎ耐性、ＩＰＴＧ誘導性）、ｐＥＣ４１５（Ｋａｎ耐性、アラビノース誘導性）またはｐＬＡＦＲ（ｔｅｔ耐性、構成的）またはそれらの誘導体から個々に発現させた。
ＰｇｌＢ変異体の活性を評価するために使用されるプラスミドおよび系統
ＰｇｌＢ変異体の活性を、ＷＯ１４／０５７１０９Ａ１に記載されるように遺伝子の欠失がある大腸菌Ｗ３１１０の誘導体で試験した。ＷＯ２０１４０５７１０９Ａ１に詳説される方法に基づいて、莢膜多糖をコードする遺伝子座を大腸菌染色体に安定に組み込んだ。ＰｇｌＢ、キャリアタンパク質、補助的生合成酵素および調節タンパク質を含むその他の必要な要素は、プラスミドｐＥＸＴ２１（Ｓｐｅｃ耐性、ＩＰＴＧ誘導性）、ｐＥＸＴ２２（Ｋａｎ耐性、ＩＰＴＧ誘導性）、ｐＥＣ４１５（Ｋａｎ耐性、アラビノース誘導性）またはｐＬＡＦＲ（ｔｅｔ耐性、構成的）またはそれらの誘導体から個々に発現させた。
【0241】
【0242】
実施例２
小規模培養からのＥＬＩＳＡによるグリコシル化の検出
ＰｇｌＢの変異体を、Ｄ／Ｅ－Ｚ１－Ｎ－Ｚ２－Ｓ／Ｔグリコシル化部位（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰではない）を含む緑膿菌由来オキソプロテインＡ（ＥＰＡ）のグリコシル化を触媒するそれらの能力に関して、肺炎連鎖球菌血清型８のそれに相当する多糖を用いて試験した。よって、大腸菌宿主細胞を、肺炎連鎖球菌血清型８莢膜多糖の構築に必要なグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子、変異体ＰｇｌＢ遺伝子およびグリコシル化部位を含むＥＰＡをコードするプラスミドで形質転換させた。遺伝子の発現をＩＰＴＧおよびアラビノースを用いて誘導し、大腸菌宿主細胞を一晩増殖させて、以下のようにグリコシルトランスフェラーゼ、ＰｇｌＢおよびＥＰＡの発現ならびにＥＰＡのグリコシル化を可能とした。
小規模培養からのＥＬＩＳＡによるグリコシル化の検出
ＰｇｌＢの変異体を、Ｄ／Ｅ－Ｚ１－Ｎ－Ｚ２－Ｓ／Ｔグリコシル化部位（ここで、Ｚ１およびＺ２はＰではない）を含む緑膿菌由来オキソプロテインＡ（ＥＰＡ）のグリコシル化を触媒するそれらの能力に関して、肺炎連鎖球菌血清型８のそれに相当する多糖を用いて試験した。よって、大腸菌宿主細胞を、肺炎連鎖球菌血清型８莢膜多糖の構築に必要なグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子、変異体ＰｇｌＢ遺伝子およびグリコシル化部位を含むＥＰＡをコードするプラスミドで形質転換させた。遺伝子の発現をＩＰＴＧおよびアラビノースを用いて誘導し、大腸菌宿主細胞を一晩増殖させて、以下のようにグリコシルトランスフェラーゼ、ＰｇｌＢおよびＥＰＡの発現ならびにＥＰＡのグリコシル化を可能とした。
【0243】
９６ディープウェルプレートのウェルを１ｍｌのＴＢ培地で満たし、各ウェルに宿主細胞大腸菌の単一のコロニーを植え込み、３７℃で一晩インキュベートした。各ウェルのサンプルを用いて、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および適当な抗生物質を添加した１ｍｌのＴＢを含む９６ディープウェルプレートの主培養に植え込み、ＯＤ６００が１．３～１．５に達するまで増殖させた。細胞を１ｍＭ ＩＰＴＧおよび０．１％アラビノースとともに一晩３７℃でインキュベートした。
【0244】
ペリプラズム抽出液は、プレートを遠心分離し、上清を除去し、０．２ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１７５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡを加えた後、４℃で振盪して細胞を懸濁させることによって作製した。１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌポリミキシンＢを各ウェルに加え、細胞を１時間４℃でインキュベートした。プレートを遠心分離し、上清を除去した。
【0245】
ペリプラズム抽出液からグリコシル化タンパク質を単離するために、ＩＭＡＣ樹脂の２５％スラリー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中）１２０μｌ、１０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌを９６ウェルフィルタープレート（Ａｃｒｏｐｒｅｐ Ａｄｖａｎｃｅ）の各ウェルに加え、Ｎｕｎｃ ＥＬＩＳＡプレートの上部に置いた。プレートを遠心分離し、フロースルーを廃棄した。１５０μｌのペリプラズム抽出液および３７．５ｍｌの５×結合バッファー（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭイミダゾール、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を各ウェルに加えた。これらのサンプルを３０分間室温でインキュベートした。プレートを遠心分離し、フロースルーを廃棄し、さらに３回の洗浄工程を行った。最後に、グリコシル化タンパク質を３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５００ｍＭイミダゾール、２００ｍＭ ＮａＣｌで溶出させ、ＥＬＩＳＡアッセイでの使用準備をした。
【0246】
サンドイッチＥＬＩＳＡは、グリコシル化タンパク質の糖部分を認識する抗体（例えば、肺炎連鎖球菌血清型８に対するモノクローナル抗体）をＰＢＳで希釈したもので９６ウェルプレートのウェルをコーティングすることによって行った。プレートを一晩４℃でインキュベートしてコーティングを可能とした。次に、プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで洗浄した。その後、５％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳＴ中）を用いて室温で２時間プレートをブロッキングした。このプレートをＰＢＳＴで洗浄した。このサンプルを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈し、コーティングしたウェル中で、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈した検出抗体、例えば、抗Ｈｉｓタグ－セイヨウワサビペルオキシダーゼを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄した後、ＥＬＩＳＡ用、超高感度３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン液体基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。数分後、２Ｍ硫酸を加えて反応を停止させた。４５０ｎｍのＯＤを読み取ることによって結果を得た。
【0247】
結果
出発点として、すでにＮ３１１Ｖの突然変異を含むＰｇｌＢに突然変異を生じさせた。第１ラウンドの変異体世代では、ＰｇｌＢのＯＳＴ活性をさらに増加させた突然変異としてＹ７７Ｒを同定した（図１参照）。Ｎ３１１ＶおよびＹ７７Ｒに突然変異を含むＰｇｌＢを突然変異させ、有望な変異体を選択し、配列決定し、上記のようにＯＳＴ活性を分析した。各変異体のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性の増加倍率を計算し、結果を表３に示す。
出発点として、すでにＮ３１１Ｖの突然変異を含むＰｇｌＢに突然変異を生じさせた。第１ラウンドの変異体世代では、ＰｇｌＢのＯＳＴ活性をさらに増加させた突然変異としてＹ７７Ｒを同定した（図１参照）。Ｎ３１１ＶおよびＹ７７Ｒに突然変異を含むＰｇｌＢを突然変異させ、有望な変異体を選択し、配列決定し、上記のようにＯＳＴ活性を分析した。各変異体のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ活性の増加倍率を計算し、結果を表３に示す。
【0248】
【表3】
【0249】
突然変異５７Ｔ、５７Ｒ、６３Ｌ、６３Ｑ、９４Ｎ、１０１Ｗ、１０１Ｅ、１０１Ｈ、１０１Ｐ、１０１Ｒ、１０１Ｍ、１０１Ｇ、１７２Ｅ、１７６Ｅ、１７６Ｇ、１９１Ｈ、１９１Ｄ、１０１Ｒ、１０１Ｙ、１９３Ｔ、１９３Ｈ、１９３Ｇ、１９３Ｆ、２３３Ｖ、２３４Ｈ、２３４Ｃ、２３４Ｗ、２５５Ｈ、２８６Ａ、２８６Ｑ、２８６Ｌ、３０１Ｐ、３０１Ｇ、３０１Ｆ、３１９Ａ、３１９Ｑ、３１９Ｌ、３１９Ｔ、３９７Ｎ、３９７Ｌ、３９７Ｑ、４０２Ｒ、４０２Ｈ、４２５Ｓ、４３５Ａ、４３５Ｌ、４３５Ｆ、４３５Ｈ、４３５Ｒ、４４６Ｇ、４６２Ｐ、４６２Ｃ、４６２Ｗ、４６２Ｔ、４６２Ｎ、４７９Ｍ、５２３Ｒ、５３２Ｈ、６０１Ｇ、６０５Ｄ、６０６Ｐ、６１０Ｐ、６１０Ｌ、６１０Ｒ、６１０Ｄ、６１０Ａ、６４５Ｌ、６４５Ｓ、６４５Ｈ、６７６Ｑ、６７６Ｗ、６７６Ｇ、６９５Ｉおよび６９５Ｑは、キャリアタンパク質への肺炎連鎖球菌血清型８糖の付加の触媒作用を増加させることができたいくつかのＰｇｌＢ変異体に見られる突然変異として示されたものである。これらのうち、Ａ５７Ｒ突然変異を、ＯＳＴ活性のその高い増加、有望な変異体のその出現頻度およびＰｇｌＢ構造におけるその位置のために、さらなるラウンドへ進める有望な突然変異として選択した。
【0250】
残基４６２および４７９が相乗作用して両残基が変位している場合にＯＳＴ活性により高倍率の増加をもたらす能力を、個々の結果を示す下表に示す。
【0251】
【0252】
さらなるラウンドの実験において、有利なＡ５７Ｒ突然変異をＹ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ突然変異に追加した。さらなる突然変異としてＡ５７Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ突然変異をＰｇｌＢに追加した。これらの新たな突然変異を、ＥＰＡに付加する糖として肺炎連鎖球菌ＰＳ８を用いたＥＬＩＳＡにより、ＰｇｌＢ活性が増加するかどうかについて試験した。結果を以下の表４に示す。
【0253】
【表4】
【0254】
このラウンドから、５２の別個のＰｇｌＢ変異体において、ＯＳＴ活性の増加倍率が最大１５倍、または８～１２倍となる４６２Ｗと４７９Ｍの組合せが見出され、これらの突然変異は、存在する唯一の新しい突然変異であった。これらの突然変異は、糖の還元末端にグルコース残基を含む糖でタンパク質をグリコシル化するためのＰｇｌＢの効率を向上させるために重要であると考えられる。
【0255】
また、突然変異Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８ＷおよびＬ５７０Ｒも、キャリアタンパク質への肺炎連鎖球菌血清型８糖の付加の触媒を増加させることができた、いくつかのＰｇｌＢ変異体に出現した突然変異として示された。
【0256】
Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９ＭおよびＬ５７０Ｒを、ＯＳＴ活性を増加するそれらの能力、効率的なＰｇｌＢ変異体におけるそれらの出現頻度およびＰｇｌＢの分子構造におけるそれらの位置について、突然変異／選択のさらなるラウンドに進む有望な突然変異として選択した。これらの残基をＹ７７Ｒ、Ｎ３１１ＶおよびＡ５７Ｒ突然変異に追加し、さらなる点突然変異を、タンパク質に肺炎連鎖球菌血清型８糖を付加するためのＰｇｌＢの活性を向上させるそれらの能力に関して試験した。結果を下表５に示す。
【0257】
【表5】
【0258】
このラウンドから、以下の突然変異：Ｙ７７Ｒ、Ｎ３１１Ｖ、Ａ５７Ｒ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ５７０Ｒ、Ｌ１９１Ｙ、Ｙ２８６Ｑ、Ｓ２９５Ｌ、Ａ３８２Ｓ、Ｋ４８２ＲおよびＴ５２３Ｒを含む参照ＰｇｌＢをもたらした、従前に試験した突然変異に、Ｌ１９１Ｙ、Ｙ２８６Ｑ、Ｓ２９５Ｌ、Ａ３８２Ｓ、Ｋ４８２ＲおよびＴ５２３Ｒ突然変異を追加した。次のラウンドで、Ｙ７７Ｒ、Ｎ３１１Ｖ、Ａ５７Ｒ、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９Ｍ、Ｌ５７０Ｒ、Ｌ１９１Ｙ、Ｙ２８６Ｑ、Ｓ２９５Ｌ、Ａ３８２Ｓ、Ｋ４８２ＲおよびＴ５２３Ｒを含むＰｇｌＢの効率をさらに増加させるそれらの能力に関してさらなる突然変異を試験し、結果を下表６に示す。
【0259】
【表6】
【0260】
このラウンドから、Ｅ２９７Ｒを、この突然変異が存在した場合に生じた活性の増大およびこの突然変異の出現頻度のために選択した。また、Ｓ８０Ｄ突然変異も、より高レベルのＯＳＴ活性を伴う変異体のその出現頻度により、有望な残基として選択した。
【0261】
進化の概要
この試験の経過中、グリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質に肺炎連鎖球菌血清型８糖を付加することに関するＰｇｌＢの活性は３桁を超えるまでに増強した（図１）。Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ突然変異をすでに含むＰｇｌＢ酵素のＰｇｌＢへのＡ５７Ｒの導入は、ＰｇｌＢ活性に２４倍の増加をもたらした。Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９ＭおよびＬ７５０Ｒのさらなる付加は、活性に３６０倍の累積増加をもたらした。Ｌ１９１Ｙ、Ｙ２８６Ｑ、Ｓ２９５Ｌ、Ａ３８２Ｓ、Ｋ４８２ＲおよびＴ５２３Ｒのさらなる組み込みは、２５２０倍の活性の累積増加をもたらし、Ｅ２９７Ｒ突然変異のさらなる包含は、活性に累積５０４０倍の増加をもたらした。さらなるラウンドの進化ではＰｇｌＢ活性の増加は小さかったが、ラウンド１～３で最大の活性増加が達成された（図１参照）。
この試験の経過中、グリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質に肺炎連鎖球菌血清型８糖を付加することに関するＰｇｌＢの活性は３桁を超えるまでに増強した（図１）。Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖ突然変異をすでに含むＰｇｌＢ酵素のＰｇｌＢへのＡ５７Ｒの導入は、ＰｇｌＢ活性に２４倍の増加をもたらした。Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９ＭおよびＬ７５０Ｒのさらなる付加は、活性に３６０倍の累積増加をもたらした。Ｌ１９１Ｙ、Ｙ２８６Ｑ、Ｓ２９５Ｌ、Ａ３８２Ｓ、Ｋ４８２ＲおよびＴ５２３Ｒのさらなる組み込みは、２５２０倍の活性の累積増加をもたらし、Ｅ２９７Ｒ突然変異のさらなる包含は、活性に累積５０４０倍の増加をもたらした。さらなるラウンドの進化ではＰｇｌＢ活性の増加は小さかったが、ラウンド１～３で最大の活性増加が達成された（図１参照）。
【0262】
実施例３
振盪フラスコ容量でのＰｇｌＢ活性の測定
いくつかの変異型ＰｇｌＢ酵素を、３つのグリコシル化コンセンサス配列を含むＥＰＡタンパク質を肺炎連鎖球菌血清型８糖でグリコシル化する際の活性の増加を確認するために、大規模アッセイに使用した。
振盪フラスコ容量でのＰｇｌＢ活性の測定
いくつかの変異型ＰｇｌＢ酵素を、３つのグリコシル化コンセンサス配列を含むＥＰＡタンパク質を肺炎連鎖球菌血清型８糖でグリコシル化する際の活性の増加を確認するために、大規模アッセイに使用した。
【0263】
エレクトロコンピテント大腸菌株を、エレクトロポレーションによって、必要なプラスミド形質転換させた。これらの細胞を１時間回復させ、適当な抗生物質および２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む寒天プレートに播種した。これらのプレートを一晩インキュベートした。プレートから得られた細胞を、適当な抗生物質および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＴＢ培地に植え込み、一晩インキュベートすることによって前培養物を作製した。
【0264】
適当な抗生物質および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＴＢ培地に、ＯＤ６００ｎｍが０．１となるように前培養物を希釈することによって主培養を開始した。この培養物をＯＤ６００ｎｍが０．８～１．０となるまで増殖させた後、適当な誘導剤（例えば、ＩＰＴＧのアラビノース）を用いて細胞を誘導した。その後、細胞を一晩インキュベートした。
【0265】
ペリプラズム抽出液を以下のプロセスによって作製した。この培養物を遠心分離して大腸菌をペレットとした。上清を廃棄し、ペレットを３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％スクロースに再懸濁させた。リゾチームを終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、細胞をリゾチームとともに２５分間４℃で振盪しながらインキュベートした。遠心分離の後に、ペリプラズム抽出液を保持した。
【0266】
１ｍｌのペリプラズム抽出液を、０．２５ｍｌの１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭイミダゾール、２．５Ｍ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ ＭｇＣｌ２と混合した。０．２ｍｌの５０％スラリーまたは予め平衡化したＮｉＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、サンプルを２０分間室温で振盪しながらインキュベートした。ＩＭＡＣ樹脂を遠心分離し、上清を廃棄した。０．５ｍｌの３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌを０．１％ｎ－ドデシル－Ｂ－マルトースとともに加え、この樹脂を遠心分離し、上清を廃棄した。この樹脂をさらに３回、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。０．２ｍｌの溶出バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＣｌ）をこの樹脂に加え、５分間室温でインキュベートした。溶出液を回収し、さらなる分析のために使用した。
【0267】
グリコシル化の量をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法によって評価した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにサンプルを流した後、これらのタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。この膜を１０％ミルクで少なくとも１０分間ブロッキングした。ブロッキングの後、膜を第１の抗体（例えば、肺炎連鎖球菌血清型８に対するマウスＭａｂ）とともに、１％ミルクを含むＰＢＳ－Ｔ中で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、膜を、１％ミルクを含むＰＢＳ－Ｔ中で、第２の抗体－ＨＲＰコンジュゲート（抗マウスＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰ）とともに１時間インキュベートした。この膜をＰＢＳ－Ｔで洗浄し、ＢｉｏＦＸ ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰメンブランサブストレートを用いて現像した。
【0268】
結果
図１は、肺炎連鎖球菌血清型８莢膜糖でグリコシル化されたＥＰＡのレベルの上昇が見られたゲルを示す。ＯＳＴ活性の最も重要な増加はラウンド１～３で達成され、その後のラウンドで達成された活性の増加倍率は小さかった。振盪フラスコ規模で、１，０００倍を優に超える収量の増大を達成した。
図１は、肺炎連鎖球菌血清型８莢膜糖でグリコシル化されたＥＰＡのレベルの上昇が見られたゲルを示す。ＯＳＴ活性の最も重要な増加はラウンド１～３で達成され、その後のラウンドで達成された活性の増加倍率は小さかった。振盪フラスコ規模で、１，０００倍を優に超える収量の増大を達成した。
【0269】
実施例４
変異型ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼはさらなる糖によるグリコシル化の触媒において高い効率を示す
各ラウンドから得られた修飾されたＰｇｌＢ ＯＳＴがさらなるバイオコンジュゲートのより高い収量をもたらし得るかどうか検討するために、種々の糖をＥＰＡタンパク質に結合させるさらなる実験を行った。
変異型ＰｇｌＢオリゴサッカリルトランスフェラーゼはさらなる糖によるグリコシル化の触媒において高い効率を示す
各ラウンドから得られた修飾されたＰｇｌＢ ＯＳＴがさらなるバイオコンジュゲートのより高い収量をもたらし得るかどうか検討するために、種々の糖をＥＰＡタンパク質に結合させるさらなる実験を行った。
【0270】
実施例２および３のプロトコールを使用して、修飾されたＥＰＡに共有結合された肺炎連鎖球菌血清型２２Ｆのバイオコンジュゲートを作製した。ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット法の結果は、実施例２のラウンド３、４および５から生成された修飾されたＰｇｌＢを用いて、肺炎連鎖球菌血清型２２Ｆ－ＥＰＡコンジュゲートの良好な収量が達成できたことを示す。Ａ５７Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖに突然変異を有するラウンド３のＰｇｌＢを用いた場合の収量は、ラウンド４から得られた、Ｎ３００Ｌ、Ｌ３０１Ｐ、Ｆ３０８Ｗ、Ｙ４６２Ｗ、Ｈ４７９ＭおよびＬ５７０Ｒにさらなる点突然変異を含むＰｇｌＢを用いることによってさらに向上する。収量は、Ｌ１９１Ｙ、Ｙ２８６Ｑ、Ｓ２９５ＬおよびＡ３８２Ｓにさらなる突然変異を含むラウンド５のＰｇｌＢを用いることによってさらに向上する。
【0271】
これらの変異型ＰｇｌＢ ＯＳＴはまた、図３Ａに示されるように、タンパク質への肺炎連鎖球菌血清型２３Ａ糖の付加の触媒においても効率的であった。これらの変異型ＰｇｌＢ ＯＳＴはまた、図３Ｂに示されるように、タンパク質への肺炎連鎖球菌血清型３５Ｂの付加の触媒においても効率的であった。Ａ５７Ｒ、Ｙ７７ＲおよびＮ３１１Ｖの置換の包含は、図３Ｂに示される活性の向上をもたらした。
【0272】
これらの変異型ＰｇｌＢ ＯＳＴはまた、図４に示されるように、タンパク質への肺炎連鎖球菌血清型１９Ａの付加の触媒においても効率的であった。
【0273】
配列表
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図5-5】
【図5-6】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図6-5】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【配列表】