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特許7591219誘導多能性幹細胞の製造方法及びキット

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-20

(45)【発行日】2024-11-28

(54)【発明の名称】誘導多能性幹細胞の製造方法及びキット

(51)【国際特許分類】

C12N 5/10 20060101AFI20241121BHJP

C12N 5/02 20060101ALI20241121BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

C12N5/02

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2021514245

(86)(22)【出願日】2020-04-17

(86)【国際出願番号】 JP2020016924

(87)【国際公開番号】W WO2020213725

(87)【国際公開日】2020-10-22

【審査請求日】2023-04-11

(31)【優先権主張番号】P 2019078907

(32)【優先日】2019-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、脳科学研究戦略推進プログラム、「キメラ形成能を持つマーモセットＥＳ細胞を用いた新たな遺伝子改変技術の開発とマーモセットゲノム情報基盤の確立」に係る委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】598121341

【氏名又は名称】慶應義塾

(73)【特許権者】

【識別番号】899000057

【氏名又は名称】学校法人日本大学

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田洋孝

(74)【代理人】

【識別番号】100188592

【弁理士】

【氏名又は名称】山口洋

(72)【発明者】

【氏名】岡野栄之

(72)【発明者】

【氏名】塩澤誠司

(72)【発明者】

【氏名】吉松祥

(72)【発明者】

【氏名】枝村一弥

(72)【発明者】

【氏名】井口青空

【審査官】山本匡子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／１７６２３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】VERMILYEA, S.C. et al.，Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Neurons from Adult Common Marmoset Fibroblasts，STEM CELLS AND DEVELOPMENT，2017年，Vol.26, No.17，p.1225-1235

【文献】YU J. et al.，Human Induced pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences，SCIENCE，2009年05月08日，Vol.324，p.797-801，DOI:10.1126/science.1172482

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１／００－５／２８

Ｃ１２Ｑ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳動物の体細胞に初期化因子を導入し、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む神経幹細胞培養培地で培養して誘導神経幹細胞様細胞を得る工程と、
前記誘導神経幹細胞様細胞をＥＳ細胞培養培地で培養して誘導多能性幹細胞を得る工程と、を含み、
前記初期化因子が、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー、Ｐ５３機能阻害物質、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧを含む、誘導多能性幹細胞の製造方法。

【請求項2】

前記体細胞が成体由来である、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。

【請求項3】

前記ＥＳ細胞培養培地が、ｂＦＧＦを含む、請求項１又は２に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。

【請求項4】

前記哺乳動物が、多能性誘導耐性動物であり、
前記多能性誘導耐性動物は、マーモセット、イヌ、ブタ又はフェレットである、請求項１～３のいずれか一項に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。

【請求項5】

前記多能性誘導耐性動物は、イヌである、請求項４に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。

【請求項6】

ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー、Ｐ５３機能阻害物質、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧを含む初期化因子と、
ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む神経幹細胞培養培地と、を含む、多能性誘導耐性動物の体細胞から誘導多能性幹細胞を製造するためのキット。

【請求項7】

ｂＦＧＦを含むＥＳ細胞培養培地を更に含む、請求項６に記載のキット。

【請求項8】

前記体細胞が成体由来である、請求項６又は７に記載のキット。

【請求項9】

前記多能性誘導耐性動物は、マーモセット、イヌ、ブタ又はフェレットである、請求項６～８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項10】

前記多能性誘導耐性動物は、イヌである、請求項９に記載のキット。

【請求項11】

請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法により誘導多能性幹細胞を製造する工程と、
前記誘導多能性幹細胞を分化させて体細胞を得る工程と、を含む、体細胞の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、誘導多能性幹細胞の製造方法及びキットに関する。本願は、２０１９年４月１７日に日本に出願された特願２０１９－０７８９０７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

ヒト、マウスの体細胞からｉＰＳ細胞を樹立する技術は、改良と簡便化が進み、ｉＰＳ細胞を樹立する効率は従来よりも向上している。一方、特に成体の体細胞からｉＰＳ細胞を樹立することが困難な動物（多能性誘導耐性動物）が存在する。多能性誘導耐性動物としては、イヌ、ブタ、マーモセット、ネコ、ウシ、ウマ等が知られている。

【0003】

例えば、イヌ胎児由来線維芽細胞において初期化因子を持続的に発現させることにより、イヌｉＰＳ細胞を樹立することができる（例えば、非特許文献１を参照）。また、センダイウイルスを用いることにより、イヌ胎児由来線維芽細胞からイヌｉＰＳ細胞を樹立することができる（例えば、非特許文献２を参照）。また、ブタ胎児由来線維芽細胞において初期化因子を持続的に発現させることによりブタｉＰＳ細胞を樹立することができる（例えば、非特許文献３を参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Nishimura T et al., Feeder‐independent canine induced pluripotent stem cells maintained under serum‐free conditions. Mol. Reprod. Dev., vol. 84, 329-339, 2017.

【文献】Tsukamoto M et al., Generation of Footprint-Free Canine Induced Pluripotent Stem Cells Using Auto-Erasable Sendai Virus Vector. Stem Cells Dev., 27, 1577-1586, 2018.

【文献】Du X et al., Barriers for Deriving Transgene-Free Pig iPS Cells with Episomal Vectors. Stem Cells, vol.33, 3228-3238, 2015.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、哺乳動物の体細胞から、ｉＰＳ細胞を樹立する新たな技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、以下の態様を含む。
［１］哺乳動物の体細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養して誘導神経幹細胞様細胞を得る工程と、前記誘導神経幹細胞様細胞を増殖用培地で培養して誘導多能性幹細胞を得る工程と、を含み、前記初期化因子が、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法。
［２］前記初期化因子が、更に、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される一種以上を含む、［１］に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
［３］前記体細胞が成体由来である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記神経幹細胞培養培地が、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記増殖用培地が、ｂＦＧＦを含む、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法により製造された、誘導多能性幹細胞。
［７］ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む初期化因子と、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む神経幹細胞培養培地と、を含む、多能性誘導耐性動物の体細胞から誘導多能性幹細胞を製造するためのキット。
［８］前記初期化因子が、前記初期化因子が、更に、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される一種以上を含む、［７］に記載のキット。
［９］ｂＦＧＦを含む増殖用培地を更に含む、［７］又は［８］に記載のキット。

【発明の効果】

【0007】

本発明によれば、哺乳動物の体細胞から、ｉＰＳ細胞を樹立する新たな技術を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】初期化因子を発現させるためのＥＰ－Ａベクターセットを模式的に表す図である。

【図2】初期化因子を発現させるためのＥＰ－Ｂベクターセットを模式的に表す図である。

【図3】（ａ）、（ｂ）は実験例１における細胞の写真である。（ａ）は、ＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で４日間培養した細胞を明視野で撮影した写真である。（ｂ）は、ＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で４日間培養した細胞のＥＧＦＰの蛍光を撮影した写真である。

【図4】（ａ）、（ｂ）は実験例１における細胞の写真である。（ａ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で３０日間培養した細胞の写真である。図４（ｂ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で３０日間培養した細胞の写真である。

【図5】マーモセット体細胞からｉＰＳ細胞を樹立するための工程を表す図である。

【図6】（ａ）～（ｄ）は実験例２におけるｉＮＳＬ細胞の写真である。（ａ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｂ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ｂベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｃ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｄ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ｂベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。

【図7】実験例２における、マーモセット胚性線維芽細胞を用いた場合のコロニー形成能を算出した結果を示すグラフである。

【図8】（ａ）、（ｂ）は実験例２におけるアルカリフォスファターゼ染色した結果を示す図である。（ａ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ａベクターセットに導入し、神経幹細胞培養培地で培養して得られたコロニーをアルカリフォスファターゼ染色した結果を示す図である。（ｂ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ｂベクターセットに導入し、神経幹細胞培養培地で培養して得られたコロニーをアルカリフォスファターゼ染色した結果を示す図である。

【図9】実験例３における、ｉＮＳＬ細胞とｉＰＳ細胞の写真である。（ａ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｂ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｃ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０２Ｍ）にＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｄ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０２Ｍ）にＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。

【図10】実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図11】実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞をアルカリフォスファターゼ染色に供した結果を示す図である。

【図12】実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図13】実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図14】実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図15】実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞における、発現ベクターの有無を解析した結果を示す図である。

【図16】実験例４における、マーモセットｉＰＳ細胞から分化させた三胚葉における、マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図17】実験例４における、ＫＳＲ培地で培養したマーモセットｉＰＳ細胞が発現するＡＦＰの発現を解析した結果を示す図である。

【図18】実験例４における、ＦＢＳを含む培地で培養したマーモセットｉＰＳ細胞が発現するＡＦＰの発現を解析した結果を示す図である。

【図19】実験例４における、マーモセットｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマを解析した結果を示す図である。

【図20】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞の写真である。

【図21】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞のコロニー形成能を示す図である。

【図22】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞の、アルカリフォスファターゼ染色の結果を示す図である。

【図23】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来の、マーモセットｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。

【図24】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞の、アルカリフォスファターゼ染色の結果を示す図である。

【図25】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図26】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図27】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図28】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図29】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図30】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞から分化した三胚葉における、マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図31】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞から分化した三胚葉における、マーカーの発現を解析した結果を示す図である。

【図32】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマを解析した結果を示す図である。

【図33】実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞にベクターが残存するか解析した結果を示す図である。

【図34】実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞の写真である。

【図35】実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞において残存するベクターを解析した結果を示す図である。

【図36】実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞の、内在性の、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＫＦ４、ＺＦＰ４２の発現を解析した結果を示す図である。

【図37】実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞の、ＤＰＰＡ５及びＴＥＲＴの発現を解析した結果を示す図である。

【図38】実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞の、内在性及び外来性の、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８の発現を解析した結果を示す図である。

【図39】実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞におけるＰＡＸ６の発現を解析した結果を示す図である。

【図40】実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞における、ＳＯＸ１とＺＦＰ５２１の発現を解析した結果を示す図である。

【図41】実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞における、ＴとＳＯＸ１７の発現を解析した結果を示す図である。

【図42】実験例６における、神経分化アッセイのスケジュールである。

【図43】実験例６における、得られた誘導神経幹細胞から分化した細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色及び抗βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎ抗体により免疫染色した結果を示す図である。

【図44】実験例６における、神経細胞に分化した細胞のうち、βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎの発現が認められた細胞の割合を示すグラフである。

【図45】実験例７における、クラスタリング解析の結果を示す図である。

【図46】実験例７における、遺伝子発現量を解析した結果を示す図である。

【図47】実験例７における、主成分分析の結果を示す図である。

【図48】実験例８における、イヌｉＰＳ細胞が形成したコロニーの写真である。

【図49】実験例８における、イヌｉＰＳ細胞における、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの発現を解析した結果を示す図である。

【図50】実験例８における、イヌｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマの写真である。

【図51】実験例８における、イヌｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマ内の、骨、軟骨、神経細胞、網膜、皮脂腺、毛包上皮、腺組織を解析した結果を示す図である。

【図52】実験例８における、イヌｉＰＳ細胞においてベクターが残存しているか否かを解析した結果を示す図である。

【図53】実験例９における、ブタｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。

【図54】実験例９における、ブタｉＮＳＬ細胞及びブタｉＰＳ細胞における、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの発現を解析した結果を示す図である。

【図55】実験例１０における、フェレットｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。

【図56】実験例１０における、フェレットｉＮＳＬ細胞及びフェレットｉＰＳ細胞における、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの発現を解析した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

［遺伝子名及びタンパク質名の表記］
本明細書では、ヒト遺伝子及びヒトタンパク質、多能性誘導耐性動物の遺伝子及びタンパク質は、大文字のアルファベットで表すものとする。しかしながら、場合により、ヒト遺伝子、その他の種の遺伝子を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。また、ヒトタンパク質、その他の種のタンパク質を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。

【0010】

本明細書において、例えば「ＳＯＸ２」との表記は、ＳＯＸ２タンパク質及びそれをコードする核酸の双方を意味する。また、例えば「初期化因子」との表記は、初期化タンパク質及びそれをコードする核酸の双方を意味する。また、例えば「ＳＯＸファミリー」との表記は、ＳＯＸタンパク質及びそれをコードする核酸の双方を意味する。

【0011】

［細胞名の表記］
本明細書では、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）を、ｉＰＳ細胞、ｉＰＳＣという場合がある。また、誘導神経幹細胞様細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｋｅｃｅｌｌ）を、ｉＮＳＬ細胞、ｉＮＳＬＣという場合がある。

【0012】

［製造方法］
１実施形態において、本発明は、哺乳動物の体細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養して誘導神経幹細胞様細胞を得る工程（ａ）と、誘導神経幹細胞様細胞を増殖用培地で培養して誘導多能性幹細胞を得る工程（ｂ）と、を含み、初期化因子が、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法を提供する。本実施形態において、哺乳動物は、多能性誘導耐性動物であってもよい。

【0013】

本明細書において、多能性誘導耐性動物とは、該動物の成体の体細胞において、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリーの初期化因子を組み合わせて発現させても、ｉＰＳ細胞を樹立することができない哺乳動物のことを指す。

【0014】

多能性誘導耐動物としては、例えば、サル、ブタ、フェレット、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、ウサギ等が挙げられるが、これらに限定されない。サルとしては、例えば、マーモセットが挙げられる。

【0015】

本実施形態において、ｉＰＳ細胞を作製するための材料として用いる多能性誘導耐動物の体細胞としては、例えば、胎児由来の体細胞、成体由来の体細胞を挙げることができる。体細胞としては、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、免疫細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞、膵臓細胞、それらの前駆細胞等が挙げられる。上述の体細胞は、未分化な細胞、分化した細胞であってもよい。

【0016】

マーモセット、イヌ、ブタ、フェレットは、代表的な多能性誘導耐性動物である。実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、マーモセット、イヌ、ブタ及びフェレットの成体の体細胞から、一過的に初期化因子を細胞内に発現させることにより、初期化因子を発現する発現コンストラクトを細胞内に有しないｉＰＳ細胞を樹立することができる。

【0017】

本実施形態において、哺乳動物の体細胞に対して、初期化因子と共に、ＥＢＮＡ－１をコードする核酸を有する、非エピソーマルベクターを導入することが好ましい。

【0018】

（初期化因子）
本実施形態において、初期化因子は、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む。

【0019】

ＯＣＴファミリーとしては、例えば、ＯＣＴ３／４、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴ６等が挙げられる。ＯＣＴファミリーとしては、ＯＣＴ３／４が好ましい。

【0020】

ＳＯＸファミリーとしては、例えば、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１７等が挙げられる。

【0021】

ＫＬＦファミリーとしては、例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５等が挙げられる。

【0022】

ＭＹＣファミリーとしては、Ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、Ｌ－ＭＹＣ等が挙げられる。

【0023】

ＬＩＮ２８ファミリーとしては、ＬＩＮ２８、ＬＩＮ２８Ｂ等が挙げられる。

【0024】

ＮＡＮＯＧは、ホメオドメインを有する転写因子である。ＮＡＮＯＧを、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８と共に体細胞に発現させると、ｉＰＳ細胞を樹立することができる（例えば、Yu J et al., Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）。

【0025】

本明細書において、Ｐ５３機能阻害物質とは、Ｐ５３タンパク質の機能を抑制する物質又はＰ５３遺伝子の発現を抑制する物質であれば、どのようなものであってもよい（例えば、国際公開第２００９／１５７５９３号）。

【0026】

Ｐ５３タンパク質の機能を抑制する物質としては、Ｐ５３のドミナントネガティブ変異体、Ｐ５３タンパク質の機能を阻害する化学物質、抗Ｐ５３アンタゴニスト抗体、Ｐ５３応答エレメントのコンセンサス配列を含むデコイ核酸、Ｐ５３経路の阻害物質等が挙げられる。

【0027】

Ｐ５３遺伝子の発現を抑制する物質としては、Ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。

【0028】

Ｐ５３のドミナントネガティブ変異体としては、マウスＰ５３の１４－３０１位（ヒトＰ５３では１１－３０４位に対応）のアミノ酸を欠失させたＰ５３ＤＤが好ましい（例えば、Bowman, T., Genes & Development, 10, 826-835 (1996)を参照）。

【0029】

初期化因子は、更に、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される一種以上を含んでもよい。
初期化因子は、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー、Ｐ５３機能阻害物質、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧを含むことが好ましい。

【0030】

ＫＤＭファミリーは、ＬｙｓｉｎｅＤｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ活性を有し、ヒストンＨ３のＫ９を脱メチル化する。ＫＤＭファミリーとして、ＫＤＭ１、ＫＤＭ２、ＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５、ＫＤＭ６が知られている。ＫＤＭ４Ｄ又はＫＤＭ４Ａの強制発現は、ヒストンＨ３の９番目のリジン残基を脱メチル化し、体細胞の初期化を促進する（例えば、Matoba et al., Cell, 159, 884-895 (2014）; Chung YG et al., Cell Stem Cell, 17, 758-766 (2015)を参照）。

【0031】

初期化因子として用いられるＫＤＭファミリーとしては、特に限定されず、ＫＤＭ１、ＫＤＭ２、ＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５、ＫＤＭ６が挙げられる。ＫＤＭファミリーとしては、ＫＤＭ４Ａ、ＫＤＭ４Ｄが好ましい。

【0032】

ＧＬＩＳファミリー（ＧＬＩＳｉｍｉｌａｒファミリー）は、Ｚｉｎｃフィンガー型転写因子である。ＧＬＩＳファミリーとして、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ２、ＧＬＩＳ３が知られている。ＧＬＩＳ１の強制発現は、ｉＰＳ細胞の形成を促進する（例えば、Maekawa et al., Nature, 474, 225-229 (2011)を参照）。また、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ２、ＧＬＩＳ３は幹細胞において多様な役割を果たす（例えば、Scoville DW et al., Stem Cell Investig, 4:80 (2017)を参照。）。

【0033】

初期化因子として用いられるＧＬＩＳファミリーとしては、特に限定されず、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ２、ＧＬＩＳ３が挙げられる。ＧＬＩＳファミリーとしては、ＧＬＩＳ１が好ましい。

【0034】

初期化因子は、ＥＳＲＲファミリーを含んでもよい。

【0035】

ＥＳＲＲファミリー（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒファミリー）は、核内受容体である。ＥＳＲＲファミリーとして、ＥＳＲＲＡ、ＥＳＲＲＢ、ＥＳＲＲＧが知られている。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２と共に、ＥＳＲＲＢ又はＥＳＲＲＧを強制発現させると、体細胞を初期化させることができる（例えば、Feng B et al., Nat. Cell. Biol., vol. 11, 197-203 (2009)を参照）。

【0036】

初期化因子として用いられるＥＳＲＲファミリーとしては、特に限定されず、ＥＳＲＲＢ、ＥＳＲＲＧが挙げられる。

【0037】

初期化因子の組み合わせとしては、国際公開２０１５／０５６８０４号に記載されているように、表１に例示する組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。

【0038】

【表1】

【0039】

初期化因子は、多能性誘導耐性体細胞を初期化する活性を有する限り変異を有していてもよい。初期化因子が変異を有する場合、初期化因子は、表１に例示されるＮＣＢＩアクセッション番号により特定されるタンパク質又はｍＲＮＡに対して、８０％以上の配列同一性を有することが好ましく、９０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９５％以上の配列同一性を有することが更に好ましい。

【0040】

ここで、アミノ酸配列の配列同一性は、対象のアミノ酸配列（対象アミノ酸配列）が、基準となるアミノ酸配列（基準アミノ酸配列）に対して一致している割合を示す値である。基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸の数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致したアミノ酸の数／対象アミノ酸配列の総アミノ酸数×１００ …（１）

【0041】

同様に、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の数を算出し、下記式（２）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基の数／対象塩基配列の総塩基数×１００ …（２）

【0042】

本実施形態において、初期化因子が由来する動物種は、初期化因子を導入する体細胞が由来する動物種に対して、同一であってもよいし、異なっていてもよい。当業者であれば、所望の動物種の初期化因子のアミノ酸配列又はｍＲＮＡ配列をデータベースから取得することができる。

【0043】

初期化因子は、表２に例示されるＮＣＢＩアクセッション番号によって特定されるｍＲＮＡ、それらｍＲＮＡがコードするタンパク質、それらｍＲＮＡを転写する遺伝子であってもよい（例えば、特許５０９８０２８号公報、特許６３８１４４２号公報、国際公開２０１５／０３０１１１号、国際公開２０１５／０５６８０４号を参照。）。表１に示されるアクセッション番号はヒトのｃＤＮＡ配列である。

【0044】

【表2】

【0045】

本実施形態の初期化因子は、タンパク質の形態で導入してもよいし、そのタンパク質をコードするｍＲＮＡや発現ベクター等の核酸の形態で導入してもよい。

【0046】

実施例において後述するように、初期化因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びｍＰ５３ＤＤを含むことが好ましい。
また、実施例において後述するように、初期化因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ｍＰ５３ＤＤ、ＫＬＦ２、ＫＤＭ４Ｄ、ＧＬＩＳ１及びＮＡＮＯＧを含むことが好ましい。

【0047】

（工程（ａ））
本工程では、哺乳動物の体細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養することにより、誘導神経幹細胞様細胞を得る。ここで、哺乳動物は、多能性誘導耐性動物であってもよい。

【0048】

初期化因子がタンパク質又はＲＮＡである場合には、初期化因子を細胞に取り込ませる方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等の定法を用いることができる。

【0049】

初期化因子がタンパク質である場合には、初期化因子を細胞に取り込ませる方法として、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。

【0050】

タンパク質導入試薬としては、例えば、ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｌａｎｔｉｓ）、Ｐｒｏ－ＤｅｌｉｖｅｒＩＮ（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ａｂ－ＤｅｌｉｖｅｒＩＮ（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＵＬＳｉｎＫｉｔ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳＡＳ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｆｅｃｔｉｎ（ＴａｒｇｅｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｕｓｅ－ＩｔＰ（ＮＩＰＰＯＮＧｅｎｅｔｉｃｓ）等のカチオン性脂質型導入試薬；Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅｍｏｔｉｆ）、ＸｆｅｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＪＢＳＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＪｅｎａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｃｅｌｌｖａｄｅｒ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の膜透過性ペプチド型導入試薬；Ｐｒｏｆｅｃｔ－１（ＴａｒｇｅｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ）等の脂質型導入試薬；ＧｅｎｏｍＯＮＥＴＭ－Ｎｅｏ（ＦＤ）（ＣｏｓｍｏＢｉｏ）等のＨＶＪエンベロープ型導入試薬等の公知の試薬を用いることができる。

【0051】

ｍＲＮＡを導入する試薬としては、例えば、ＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＴａＫａＲａ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ^ＴＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｘｆｅｃｔ^ＴＭＲＮＡＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）等の公知の試薬を用いることができる。

【0052】

初期化因子は、初期化因子をコードするＤＮＡとプロモーターを連結した発現コンストラクトであってもよい。プロモーターとしては、対象細胞において活性を有するものであってもよいし、薬剤などにより活性を誘導可能な発現誘導型プロモーターであってもよい。

【0053】

プロモーターとしては、例えば、ほぼ全ての細胞において強いプロモーター活性を有する、サイトメガロウイルス・プロモーター（ＣＭＶプロモーター）やＣＭＶｅａｒｌｙｅｎｈａｎｃｅｒ／ｃｈｉｃｋｅｎｂｅｔａａｃｔｉｎ（ＣＡＧプロモーター）等であってもよいし、組織特異的なプロモーター活性を有するプロモーター等であってもよい。

【0054】

発現誘導型プロモーターとしては、例えば、ドキシサイクリン誘導型プロモーター、キュメート（Ｃｕｍａｔｅ）誘導型プロモーター、熱ショックプロモーター、光誘導プロモーター等が挙げられるがこれに限定されない。また、ｌｏｘＰサイトで挟まれたタンパク質翻訳ストップコドンやポリアデニン配列によって、Ｃｒｅ組換え酵素作用時に発現が誘導されるシステムでもよい。

【0055】

上述の発現コンストラクトは、例えば、トランスポゾンベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター等に組み込まれたものであってもよい。

【0056】

ベクターとしては、ベクターがゲノムに組み込まれないもの、又は、一時的にゲノムに組み込まれるが、人為的な操作によってゲノムから除去することのできるベクターが好ましい。

【0057】

例えば、上記のコンストラクトがトランスポゾンベクターに組み込まれている場合、細胞に導入してトランスポザーゼを作用させることにより、容易に細胞の染色体中に組み込むことができる。また、トランスポザーゼを作用させることにより、染色体中に組み込まれた上記のコンストラクトを、染色体から切り出し、痕跡を残さずに除去することもできる。トランスポゾンは、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、ＴｏｌＩＩ、ｍａｒｉｎｅｒ等であってもよい。

【0058】

あるいは、上記のコンストラクトの両端にｌｏｘＰ配列を配置しておき、ｉＰＳ細胞を樹立した後で、Ｃｒｅ組換え酵素を作用させ、ｌｏｘＰ配列に挟まれた配列を除去してもよい。

【0059】

ベクターとしては、エピソーマルベクターが好ましい。エピソーマルベクターとしては、例えば、ＥＢＶ、ＳＶ４０等に由来する、哺乳動物細胞内で自律複製するために必要な配列を含むベクターが挙げられる。

【0060】

哺乳動物細胞内で自律複製するために必要な配列としては、哺乳動物細胞内で機能する複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。

【0061】

具体的には、ＥＢＶ由来のベクターについては、複製開始点ｏｒｉＰとＥＢＮＡ－１遺伝子が挙げられる。ＳＶ４０のベクターについては、複製開始点ｏｒｉとＳＶ４０ｌａｒｇｅＴａｎｔｉｇｅｎ遺伝子が挙げられる。

【0062】

ベクターを細胞に導入する方法としては、例えば、リポフェクション法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法、ウイルスベクター法等が挙げられる。

【0063】

エレクトロポレーション法を実施する装置としては、例えばＮＥＰＡ２１（ネッパジーン社）、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ロンザ社）、Ｎｅｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフック社）、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌ（バイオラッド社）、ＥＣＭ８３９（ＢＴＸＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ社）等を使用することができる。

【0064】

ベクターを細胞に導入する方法として、トランスフェクション用試薬を使用してもよい。トランスフェクション用試薬としては、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフック社）、ＳｔｅｍＦｅｃｔ（ＳＴＥＭＧＥＮ社）、ＦｕＧＥＮＥ６／ＨＤ（プロメガ社）、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフック社）、ｊｅｔＰＲＩＭＥＫｉｔ（ポリプラストランスフェクション社）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（オズバイオサイエンス社）、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ３０００（オズバイオサイエンス社）、リン酸カルシウム法用試薬等を使用可能である。

【0065】

続いて、工程（ａ）において、初期化因子を導入した多能性誘導耐性動物の体細胞を、神経幹細胞培養培地で培養する。神経幹細胞培養培地は、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含むことが好ましい。

【0066】

神経幹細胞培養培地は、更に、分化抑制因子として、ＬｅｕｋｅｍｉａＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＦａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）、成長因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含んでもよい。

【0067】

ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ－４１５２８６、ＳＢ－２１６７、ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－Ｍｏｎｏｘｉｍｅ、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ等が挙げられるが、これらの中でも特にＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅが好ましい。また、ＧＳＫ阻害剤の培地への添加濃度としては、例えば、０．１～１０μＭ、好ましくは１～３μＭが挙げられる。

【0068】

ＴＧＦ－β阻害剤としては、例えば、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、ＬＹ－３６４９４、ＳＪＮ－２５１１等が挙げられる。これらの中でも、Ａ８３－０１が好ましい。また、ＴＧＦ－β阻害剤の培地への添加濃度としては、例えば、０．１～１０μＭ、好ましくは０．５～１μＭが挙げられる。

【0069】

ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ｒａｆ、ＭＯＳ、ｐ２１ｒａｓ、ＧＲＢ２、ＳＯＳ、ＪＮＫ、ｃ－ｊｕｎ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫＫ、ＰＡＫ、ＲＡＣ、ｐ３８等のＭＡＰキナーゼ経路の構成因子を阻害するものであってもよい。

【0070】

ＭＡＰキナーゼ阻害剤としては、例えば、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２、ＶＸ－７４５、ＳＢ２０２１９０、アニソマイシン、ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０、Ｕ０１２６、ＡＧ１２６、アピゲニン、ＨＳＰ２５キナーゼ阻害剤、５－ヨードツベルシジン、ＭＡＰキナーゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、コントロールＭＡＰキナーゼオリゴヌクレオチド、ＭＡＰキナーゼカスケード阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤セット１、ＭＡＰキナーゼ阻害剤セット２、ＭＥＫ阻害剤セット、オロモウシン（Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）、イソオロモウシン、Ｎ９イソプロピルオロモウシン、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０２４７４、ＳＢ２０２１９０塩酸塩、ＳＢ２０２４７４二塩酸塩、ＳＢ２０３５８０スルホン、Ｉｏｔｏ－ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２２００２５、ＳＣ６８３７６、ＳＫＦ－８６００２、チルホスチン（Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ１２６、Ｕ０１２４、Ｕ０１２５、ＺＭ３３６３７２等が挙げられる（例えば、特許第６２１８２２９号公報を参照。）。これらの中でも、ＰＤ０３２５９０１が好ましい。また、ＭＡＰキナーゼ阻害剤の培地への添加濃度としては、例えば、０．０１～１０μＭ、好ましくは０．０３～１μＭが挙げられる。

【0071】

（工程（ｂ））
本工程では、工程（ａ）で得られた誘導神経幹細胞様細胞を増殖用培地で培養して誘導多能性幹細胞を得る。

【0072】

実施例において後述するように、工程（ａ）で得られた誘導神経幹細胞様細胞を、増殖用培地で培養することにより、誘導多能性幹細胞を得ることができる。増殖用培地としては、ＥＳ細胞を培養するための公知の培地を用いることができるが、これに限定されず、ＥＳ細胞の培養に適した培地であればどのようなものであってもよい。実施例において後述するように、増殖用培地は、ｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）を含んでいてもよい。

【0073】

実施例において後述するように、増殖用培地は、２０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔｓｅｒｕｍｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び４～１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦを含む、ダルベッコ改変イーグル培地であってもよい。

【0074】

［誘導多能性幹細胞］
１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された誘導多能性幹細胞を提供する。

【0075】

実施例において後述するように、本実施形態のｉＰＳ細胞は、多能性幹細胞マーカーである、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＺＦＰ４２、ＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ４を内在的に発現する。また、本実施形態のｉＰＳ細胞は、内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化することができる。また、本実施形態のｉＰＳ細胞はテラトーマを形成し、分化した腺上皮、血管、軟骨、脂肪細胞、神経細胞に分化することができる。

【0076】

本実施形態のｉＰＳ細胞は、上述した初期化因子を体細胞内で発現させることにより製造されている。このため、初期化因子をコードする遺伝子が導入されている場合がある。

【0077】

しかしながら、例えばエピソーマルベクター等を用いて遺伝子が導入され、培養の途中で当該遺伝子が除去された場合、初期化因子を検出することは不可能である。

【0078】

本実施形態のｉＰＳ細胞と、例えば、ＥＳ細胞とは、遺伝子発現パターン等に相違が存在する可能性がある。しかしながら、そのような相違が存在するか否かは定かではなく、また、そのような相違を特定して、遺伝子発現パターン等により本実施形態のｉＰＳ細胞を特定するためには、著しく多くの試行錯誤を重ねることが必要であり、実質的に不可能である。したがって、本実施形態のｉＰＳ細胞は、上述した製造方法により製造されたことにより特定することが実際的であるといえる。

【0079】

上述した初期化因子に加えて、工程（ａ）において、公知のｉＰＳ細胞の樹立効率を改善することのできる効率改善物質を多能性誘導耐性動物の体細胞に接触させることにより、ｉＰＳ細胞を樹立する効率を改善してもよい。

【0080】

国際公開２０１５／０５６８０４号に記載されているように、iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（商標）(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human)(Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling活性化剤（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、ES細胞特異的miRNA（例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08)、miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10)、miR-291-3p, miR-294およびmiR-295(以上、Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009))）、3’-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1) acitvator（例、PS48 (Cell Stem Cell, 7: 651-655 (2010)) など）、神経ペプチドY（WO 2010/147395）、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）（WO 2010/068955）等が挙げられるが、それらに限定されない。

【0081】

上述の工程（ａ）、工程（ｂ）において、体細胞、ｉＮＳＬ細胞、ｉＰＳ細胞を、低酸素条件下で培養することにより、ｉＰＳ細胞の樹立効率を改善してもよい。例えば、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度としては、１８％以下の条件を挙げることができる。

【0082】

［キット］
１実施形態において、本発明は、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む初期化因子と、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む神経幹細胞培養培地と、を含む、多能性誘導耐性動物の体細胞から誘導多能性幹細胞を製造するためのキットを提供する。

【0083】

例えば、本実施形態のキットに付属した初期化因子を多能性誘導耐性動物の体細胞に導入した後、本実施形態のキットに付属した神経幹細胞培養培地で培養することにより、ｉＰＳ細胞を製造することができる。上述したＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤は、製造方法において上述した阻害剤であってもよい。

【0084】

上述のキットは、ｂＦＧＦを含む増殖用培地を更に含んでもよい。増殖用培地としては、ＥＳ細胞を培養することのできる培地であれば、どのようなものであってもよく、公知の培地であってもよい。

【0085】

本実施形態のキットを用いることにより、多能性誘導耐性動物の体細胞であっても、容易に誘導多能性幹細胞を製造することができる。

【0086】

本実施形態のキットに付属した初期化因子は、更に、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される一種以上を含んでもよい。
初期化因子は、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー、Ｐ５３機能阻害物質、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧを含むことが好ましい。

【0087】

上述した初期化因子は、製造方法において上述した、タンパク質又はタンパク質をコードする核酸であってもよい。

【0088】

本実施形態のキットに付属したＰ５３機能阻害物質は、製造方法において上述したように、Ｐ５３タンパク質の機能を抑制する物質又はＰ５３遺伝子の発現を抑制する物質であれば、どのようなものであってもよい。

【0089】

本実施形態のキットは、初期化因子を発現させるための発現コンストラクト及びＥＢＮＡ－１をコードする核酸を有する非エピソーマルベクターを含んでもよい。発現コンストラクトとしては、製造方法において上述した、プロモーターの下流に初期化因子をコードする遺伝子断片を連結したものが挙げられる。

【実施例】

【0090】

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0091】

なお、実施例の図１～５６中、Ｅ０１Ｆ、Ｅ０２Ｍは、マーモセットの胚性線維芽細胞の株名を意味し、Ｉ５０６１Ｆ、ＣＭ４２１Ｆは、成体マーモセットの線維芽細胞の株名を意味する。また、これらの株名の記載は、ｉＰＳ細胞、ｉＮＳＬ細胞が由来する細胞を意味する場合がある。また、ＥＰ－ＡはＥＰ－Ａベクターセットを意味し、ＥＰ－ＢはＥＰ－Ｂベクターセットを意味する。また、ＥＰ－Ａ、ＥＰ－Ｂの記載は、細胞に導入したベクターセットを意味する場合がある。

【0092】

［実験例１］
（初期化因子の導入と増殖用培地での培養）
マーモセットの体細胞に初期化因子を導入した後、得られた細胞を、神経幹細胞培養培地で培養せずに、直接、増殖用培地（ＥＳ細胞培養培地）で培養した。

【0093】

まず、次に述べるベクターに挿入された初期化遺伝子発現コンストラクトを準備した。初期化遺伝子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ｍＰ５３ＤＤ、ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＤＭ４Ｄ、ＧＬＩＳ１である。

【0094】

ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＤＭ４Ｄ、ＧＬＩＳ１はヒトの遺伝子である。ｍＰ５３ＤＤタンパク質は、マウスのＰ５３タンパク質のＣ末端が欠失したドミナントネガティブ体である（Okita K et al., An Efficient Non-viral Method to Generate Integration-Free Human iPS Cells from Cord Blood and Peripheral Blood Cells, Stem Cells, vol.31, 458-466, 2013）。

【0095】

マーモセット体細胞に導入した発現コンストラクトを図１、２に示す。発現コンストラクトは、次に述べるような構造を有している。

【0096】

ＯＣＴ４を発現するｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４は、ＣＡＧプロモーターの下流にＯＣＴ４遺伝子のＯＲＦを有し、更に、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－ＢａｒｒＶｉｒｕｓ）プロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子（ＥＢＶＮｕｃｌｅａｒＡｎｔｉｇｅｎ１）のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。

【0097】

ＳＯＸ２とＫＬＦ４を発現するｐＣＥ－ｈＳＫは、ＣＡＧプロモーターの下流に、ＳＯＸ２のＯＲＦと、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列と、ＫＬＦ４のＯＲＦとを有し、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。

【0098】

Ｌ－ＭＹＣとＬＩＮ２８を発現するｐＣＥ－ｈＵＬは、ＣＡＧプロモーターの下流に、Ｌ－ＭＹＣのＯＲＦと、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列と、ＬＩＮ２８のＯＲＦとを有し、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。

【0099】

ｍＰ５３ＤＤを発現するｐＣＥ－ｍＰ５３ＤＤは、ＣＡＧプロモーターの下流に、ｍＰ５３ＤＤのＯＲＦと、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。

【0100】

ＥＧＦＰを発現するｐＣＸＬＥ－ＥＧＦＰは、ＣＡＧプロモーターの下流にＥＧＦＰのＯＲＦを有し、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。

【0101】

ＥＢＮＡ１を発現するｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１は、ＣＡＧプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦを有している。

【0102】

ＫＬＦ２とＮＡＮＯＧを発現するｐＣＥ－Ｋ２Ｎは、ＣＡＧプロモーターの下流に、ＫＬＦ２のＯＲＦと、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列と、ＮＡＮＯＧのＯＲＦとを有し、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。

【0103】

ＫＤＭ４ＤとＧＬＩＳ１を発現するｐＣＥ－ＫｄＧＩは、ＣＡＧプロモーターの下流に、ＫＤＭ４ＤのＯＲＦと、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列と、ＧＬＩＳ１のＯＲＦとを有し、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。

【0104】

ＥＰ－Ａベクターセットは、ｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ｈＳＫ、ｐＣＥ－ｈＵＬ、ｐＣＥ－ｍＰ５３ＤＤ、ｐＣＸＬＥ－ＥＧＦＰ、ｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１からなる。

【0105】

ＥＰ－Ｂベクターセットは、ｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ｈＳＫ、ｐＣＥ－ｈＵＬ、ｐＣＥ－ｍＰ５３ＤＤ、ｐＣＸＬＥ－ＥＧＦＰ、ｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１、ｐＣＥ－Ｋ２Ｎ、ｐＣＥ－ＫｄＧＩからなる。

【0106】

増殖用培地としては、２０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔｓｅｒｕｍｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び４～１０ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦを含む、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）を用いた。増殖用培地の組成を下記表３に示す。

【0107】

【表3】

【0108】

マーモセットの胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養せずに、直接、増殖用培地で培養した。結果を図３に示す。

【0109】

図３（ａ）は、ＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で４日間培養した細胞を明視野で撮影した写真である。図３（ｂ）は、ＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で４日間培養した細胞のＥＧＦＰの蛍光を撮影した写真である。

【0110】

その結果、マーモセット細胞にＥＰ－Ａベクターセットが導入され、マーカーであるＥＧＦＰを発現していることが確認された。

【0111】

マーモセットの胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ、Ｅ０２Ｍ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、３０日間、得られた細胞をＥＳ細胞培養用培地で培養した。結果を図４に示す。図４（ａ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で３０日間培養した細胞の写真である。図４（ｂ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で３０日間培養した細胞の写真である。

【0112】

その結果、ＥＰ－Ａベクターセットを導入したマーモセット細胞を、神経幹細胞培養培地で培養せずに、直接、ＥＳ細胞培養用培地で培養しても、細胞のコロニー、細胞塊は確認できなかった。この結果から、マーモセット細胞に初期化因子を発現させた後に、ＥＳ細胞培養用培地で培養しても、マーモセットｉＰＳ細胞は形成されないことが明らかになった。

【0113】

［実験例２］
（初期化因子の導入と神経幹細胞培養培地での培養）
マーモセット胚性線維芽細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、マーモセット細胞を脱分化させた。

【0114】

マーモセット体細胞からｉＰＳ細胞を樹立するための工程を図５に示す。まず、エレクトロポレーションにより、マーモセット体細胞へ初期化因子発現コンストラクトを導入した。続いて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地を用いて、得られた細胞を培養した。

【0115】

続いて、フィーダー細胞としてＭＥＦを用いて、得られた細胞を培養した。続いて、得られた細胞を神経幹細胞培養培地で培養した。

【0116】

神経幹細胞培養培地としては、ＭＡＰキナーゼ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）、ＧＳＫ３β阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）及びＴＧＦβ阻害剤（Ａ８３－０１）を含む培地を用いた。神経幹細胞培養培地の組成を下記表４に示す。

【0117】

【表4】

【0118】

表４中、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地は、ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓＦ－１２を１：１で混合した培地である。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製である。

【0119】

マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ、Ｅ０２Ｍ）に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養した。結果を図６に示す。

【0120】

図６（ａ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図６（ｂ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ｂベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図６（ｃ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図６（ｄ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。

【0121】

その結果、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入したマーモセット細胞はいずれも、コロニーを形成することが明らかになった。

【0122】

更に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入したマーモセット細胞の、コロニー形成能を算出した。結果を図７に示す。図７は、マーモセット胚性線維芽細胞を用いた場合のコロニー形成能を算出した結果を示すグラフである。

【0123】

また、上述のコロニーをアルカリフォスファターゼ染色に供した。結果を図８に示す。図８（ａ）は、Ｅ０１ＦをＥＰ－Ａベクターセットに導入し、神経幹細胞培養培地で培養して得られたコロニーをアルカリフォスファターゼ染色した結果を示す図である。図８（ｂ）は、Ｅ０１ＦをＥＰ－Ｂベクターセットに導入し、神経幹細胞培養培地で培養して得られたコロニーをアルカリフォスファターゼ染色した結果を示す図である。

【0124】

その結果、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入したマーモセット細胞のコロニーは、アルカリフォスファターゼ染色により染色されることが明らかになった。

【0125】

この結果から、これらのコロニーは、脱分化して、未分化の状態にあることが示唆された。以後、これらのコロニーを形成する細胞を、誘導神経幹細胞様細胞、ｉＮＳＬＣ（ｉｎｄｕｃｅｄＮｅｕｒａｌＳｔｅｍＣｅｌｌＬＩＫＥＣｅｌｌ）、ｉＮＳＬ細胞と呼ぶことがある。

【0126】

［実験例３］
（マーモセットｉＰＳ細胞の樹立）
マーモセット胚性線維芽細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地（ＥＳ細胞培養培地）で培養し、マーモセットｉＰＳ細胞を樹立した。神経幹細胞培養培地、増殖用培地は、実験例１、２と同一の培地を用いた。

【0127】

マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ、Ｅ０２Ｍ）に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入した。続いて、得られた細胞を神経幹細胞培養培地で培養した後に、増殖用培地で培養した。

【0128】

結果を図９に示す。図９（ａ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図９（ｂ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図９（ｃ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０２Ｍ）にＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図９（ｄ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０２Ｍ）にＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。

【0129】

その結果、マーモセット胚性線維芽細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地で培養すると、ＥＳ細胞が形成するコロニーと形状が類似したコロニーが観察された。

【0130】

続いて、マーモセットＥＳ細胞（Ｎｏ．４０ＥＳＣ）、上述のマーモセットｉＰＳ細胞（Ｅ０１Ｆ由来の、Ａ－２－２、Ａ－２－６、Ａ－２－７、Ｅ０２Ｍ由来の、Ｂ－０－６、Ｂ－０－７、Ｂ－０－１１）のコロニーについて、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、抗ＴＲＡ－１－６０抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体を用いた免疫染色に供した。ＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ４は、ＥＳ細胞において発現する遺伝子である。結果を図１０に示す。

【0131】

図１０は、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、これらのマーモセットｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様に、ＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ４を発現することが明らかになった。

【0132】

続いて、上述したマーモセットｉＰＳ細胞のコロニーを、アルカリフォスファターゼ染色に供した。結果を図１１に示す。図１１は、マーモセットｉＰＳ細胞をアルカリフォスファターゼ染色に供した結果を示す図である。その結果、これらのコロニーは、未分化細胞と同様に、アルカリフォスファターゼ染色により染色されることが明らかになった。

【0133】

続いて、上述したマーモセットｉＰＳ細胞のコロニーを、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、抗ＯＣＴ４抗体、抗ＮＡＮＯＧ抗体を用いた免疫染色に供した。結果を図１２に示す。図１２は、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、ＥＳ細胞と同様に、これらマーモセットｉＰＳ細胞のコロニーは、ＯＣＴ４とＮＡＮＯＧを発現することが明らかになった。

【0134】

続いて、上述したマーモセットｉＰＳ細胞、マーモセットＥＳ細胞（Ｎｏ．４０、ＤＳＹ１２７）、マーモセット胚性線維芽細胞について、内在性のＯＣＴ４、内在性のＮＡＮＯＧ、内在性のＳＯＸ２、内在性のＫＬＦ４遺伝子の発現、ＺＦＰ４２遺伝子（Ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎ４２）、ＤＰＰＡ遺伝子（ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙＡｓｓｏｃｉａｔｅｄ２）、ＴＥＲＴ遺伝子（ＴｅｌｏｍｅｒａｓｅＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図１３、図１４に示す。

【0135】

図１３、図１４は、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、マーモセットｉＰＳ細胞は、マーモセットＥＳ細胞と同様に、内在的に、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＤＲＰＡ５、ＺＦＰ４２、ＴＥＲＴ遺伝子を発現することが明らかになった。

【0136】

続いて、マーモセットｉＰＳ細胞に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットに含まれるベクターが残存しているか否かをＰＣＲ法により解析した。結果を図１５に示す。図１５は、マーモセットｉＰＳ細胞における、発現ベクターの有無を解析した結果を示す図である。

【0137】

その結果、Ｅ０１ＦＡ－２－２ｉＰＳＣ、Ｅ０１ＦＡ－２－３ｉＰＳＣ、Ｅ０１ＦＡ－２－５ｉＰＳＣ、Ｅ０１ＦＡ－２－６ｉＰＳＣ、Ｅ０１ＦＡ－２－７ｉＰＳＣ、Ｅ０２ＭＢ－０－６ｉＰＳＣ、Ｅ０２ＭＢ－０－７ｉＰＳＣについては、細胞内にＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットが残存していないことが明らかになった。

【0138】

以上の結果から、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入したマーモセット細胞を、神経幹細胞培養培地で培養した後に、増殖用培地で培養すると、ベクターセットを失っても、ＥＳ細胞のマーカー遺伝子が発現することが明らかになった。

【0139】

［実験例４］
（マーモセットｉＰＳ細胞の多能性）
実験例３で得られたマーモセットｉＰＳ細胞を、内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化させて、各胚葉のマーカー遺伝子の発現を解析し、マーモセットｉＰＳ細胞の多能性を検証した。

【0140】

まず、マーモセットｉＰＳ細胞（Ａ－２－２、Ａ－２－６、Ａ－２－７、Ｂ－０－７）を、浮遊培養して、各胚葉に分化させた。

【0141】

続いて、内胚葉についてはＡｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）、中胚葉についてはα－Ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ（αＳＭＡ）、外肺葉についてはＭｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ２（ＭＡＰ２）、βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎの発現を、各タンパク質に対する抗体を用いて解析した。また、同時に、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色も行った。結果を図１６に示す。

【0142】

図１６は、マーモセットｉＰＳ細胞から分化させた三胚葉における、マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、マーモセットｉＰＳ細胞から形成された各胚葉は、各胚葉に特徴的なマーカー遺伝子を発現していることが明らかになった。

【0143】

また、マーモセットｉＰＳ細胞から形成された胚様体を、ＫｎｏｃｋＯｕｔＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ培地（ＫＳＲ培地）又はウシ胎児血清を１０％含む培地を用いて、２週間又は４週間培養した後の、ＡＦＰの発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図１７、１８に示す。

【0144】

図１７は、ＫＳＲ培地で培養したマーモセットｉＰＳ細胞が発現するＡＦＰの発現を解析した結果を示す図である。図１８は、ＦＢＳを含む培地で培養したマーモセットｉＰＳ細胞におけるＡＦＰの発現を解析した結果を示す図である。

【0145】

図１７、１８中、ＥＢは胚様体を示し、２ｗは２週間後を示し、４ｗは４週間後を示す。その結果、マーモセットｉＰＳ細胞から形成された胚様体は、ＡＦＰを発現することが明らかになった。

【0146】

さらに、得られたマーモセットｉＰＳ細胞（Ａ－２－２、Ａ－２－７、Ｂ－０－７）を免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）の精巣に注入し、２～３か月後に、精巣内に形成されたテラトーマを摘出し、内胚葉、中胚葉、外胚葉から分化した組織を観察した。

【0147】

より具体的には、内胚葉から分化した腺上皮、中胚葉から分化した血管、軟骨、脂肪細胞については、ヘマトキシリン－エオシン染色（ＨＥ染色）により観察し、外胚葉から分化した神経細胞については、ＨＥ染色、ニューロフィラメント２００ｋＤａに対する抗体による免疫染色により観察した。結果を図１９に示す。

【0148】

図１９は、マーモセットｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマを解析した結果を示す図である。その結果、テラトーマには、分化した腺上皮、血管、軟骨、脂肪細胞、神経細胞が形成されることが明らかになった。

【0149】

［実験例５］
（成体マーモセット細胞からのｉＰＳ細胞の樹立）
成体のマーモセットの線維芽細胞に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、ｉＮＳＬ細胞を樹立した。さらに、得られたｉＮＳＬ細胞を増殖用培地で培養することにより、ｉＰＳ細胞を樹立した。

【0150】

成体マーモセットの線維芽細胞（Ｉ５０６１Ｆ、ＣＭ４２１Ｆ）を用いて、上述した方法により、マーモセットｉＮＳＬ細胞を樹立した。結果を図２０に示す。図２０は、成体マーモセットの線維芽細胞由来の、ｉＮＳＬ細胞の写真である。

【0151】

その結果、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞は、細胞塊及びコロニーを形成することが明らかになった。

【0152】

続いて、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞の、コロニー形成能を算出した。結果を図２１に示す。図２１は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞のコロニー形成能を示す図である。

【0153】

図２１中、「＋ＶＰＡ」は、２日間、ヒストン脱アセチル化阻害剤（ＶａｌｐｒｏｉｃＡｃｉｄ）を加えたことを示す。その結果、成体マーモセットの線維芽細胞から、再現性良くｉＮＳＬ細胞を樹立できることが明らかになった。

【0154】

続いて、上述のｉＮＳＬ細胞について、アルカリフォスファターゼ染色を行った。結果を図２２に示す。図２２は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞の、アルカリフォスファターゼ染色の結果を示す図である。

【0155】

その結果、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞は、アルカリフォスファターゼを発現することが明らかになった。すなわち、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞は未分化性を有していることが明らかになった。

【0156】

続いて、実験例３と同様に、上述のｉＮＳＬ細胞を増殖用培地で培養してマーモセットｉＰＳ細胞を得た。結果を図２３に示す。図２３は、成体マーモセットの線維芽細胞由来の、マーモセットｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。その結果、増殖用培地で培養されたマーモセットｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞のコロニーと類似したコロニーを形成することが明らかになった。

【0157】

続いて、得られたマーモセットｉＰＳ細胞を、アルカリフォスファターゼ染色に供した。結果を図２４に示す。図２４は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞の、アルカリフォスファターゼ染色の結果を示す図である。その結果、樹立したマーモセットｉＰＳ細胞は、未分化であることが示唆された。

【0158】

続いて、得られたマーモセットｉＰＳ細胞を、抗ＴＲＡ－１－６０抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体を用いて免疫染色した。同時に、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いて染色を行った。結果を図２５に示す。

【0159】

図２５は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、得られたマーモセットｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様に、ＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ４を発現することが明らかになった。

【0160】

続いて、得られたマーモセットｉＰＳ細胞について、内在性の、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８遺伝子の発現、ＺＦＰ４２遺伝子、ＤＰＰＡ遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子の発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図２６～２９に示す。

【0161】

図２６～２９は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、得られたマーモセットｉＰＳ細胞は、マーモセットＥＳ細胞と同様に、上述の遺伝子を発現することが明らかになった。

【0162】

続いて、得られたマーモセットｉＰＳ細胞を、実験例４と同様の方法により、内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化させて、各胚葉のマーカー遺伝子の発現を解析した。

【0163】

続いて、内胚葉についてはＡＦＰ、中胚葉についてはαＳＭＡ、外肺葉についてはＭＡＰ２、βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎの発現を、各タンパク質に対する抗体を用いて解析した。また、同時に、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色も行った。結果を図３０、３１に示す。

【0164】

図３０、図３１は、成体マーモセット線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞から分化した三胚葉における、マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、得られたマーモセットｉＰＳ細胞から分化して形成された各胚葉は、各胚葉に特徴的なマーカー遺伝子を発現していることが明らかになった。

【0165】

さらに、得られたマーモセットｉＰＳ細胞から、実験例４と同様に、テラトーマを作製し、内胚葉、中胚葉、外胚葉から分化した組織を観察した。内胚葉から分化した腺上皮、中胚葉から分化した血管については、ＨＥ染色により観察し、外胚葉から分化した神経細胞については、ＨＥ染色、ニューロフィラメント２００ｋＤａに対する抗体による免疫染色により観察した。結果を図３２に示す。

【0166】

図３２は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマを解析した結果を示す図である。その結果、テラトーマには、分化した腺上皮、血管、神経細胞が形成されることが明らかになった。

【0167】

また、得られたマーモセットｉＰＳ細胞について、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットに含まれるベクターが残存しているか否かをＰＣＲ法により解析した。結果を図３３に示す。

【0168】

図３３は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞にベクターが残存するか解析した結果を示す図である。その結果、得られたマーモセットｉＰＳ細胞には、ベクターが残存していないことが明らかになった。

【0169】

［実験例６］
（ｉＮＳＬ細胞の遺伝子発現パターンの解析）
マーモセットの胚性線維芽細胞又は成体マーモセットの線維芽細胞に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、誘導神経幹細胞様細胞（ｉＮＳＬ細胞）を得た。得られたｉＮＳＬ細胞の、遺伝子発現パターン及び神経細胞への分化能を解析した。

【0170】

まず、マーモセットの胚性線維芽細胞に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養した。結果を図３４に示す。図３４は、マーモセットｉＮＳＬ細胞の写真である。その結果、ｉＮＳＬ細胞が得られたことが確認された。

【0171】

続いて、得られたｉＮＳＬ細胞に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットが残存しているか否かをＰＣＲ法により解析した。結果を図３５に示す。図３５は、ｉＮＳＬ細胞において残存するベクターを解析した結果を示す図である。

【0172】

その結果、ベクターセットの導入後に、１０回継代したｉＮＳＬ細胞には、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットが残存していることが明らかになった。

【0173】

続いて、得られたｉＮＳＬ細胞の遺伝子発現パターンをｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図３６、図３７に示す。図３６は、ｉＮＳＬ細胞の、内在性の、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＫＦ４、ＺＦＰ４２の発現を解析した結果を示す図である。図３７は、ｉＮＳＬ細胞の、ＤＰＰＡ５及びＴＥＲＴの発現を解析した結果を示す図である。

【0174】

その結果、得られたｉＮＳＬ細胞は、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴを内在的に発現するが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＺＦＰ４２、ＤＰＰＡ５を内在的に発現していないことが明らかになった。

【0175】

続いて、得られたｉＮＳＬ細胞の、内在性遺伝子発現と、外来性（ベクターセットによる遺伝子発現）遺伝子発現を合わせた遺伝子発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。図３８は、ｉＮＳＬ細胞の、内在性及び外来性の、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８の発現を解析した結果を示す図である。

【0176】

その結果、内在性遺伝子発現と、外来性遺伝子発現を合わせた遺伝子発現量では、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８は発現しているが、ＮＡＮＯＧは発現していないことが明らかになった。

【0177】

続いて、得られたｉＮＳＬ細胞について、神経幹細胞のマーカーであるＰＡＸ６（Ｐａｉｒｅｄｂｏｘ６）、ＳＯＸ１（Ｓｒｙ－ｔｙｐｅＨＭＧｂｏｘ１）、ＺＦＰ５２１（ＺｉｎｃＦｉｎｇｅｒＰｒｏｔｅｉｎ５２１）の発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図３９、図４０に示す。

【0178】

図３９は、ｉＮＳＬ細胞におけるＰＡＸ６の発現を解析した結果を示す図である。図４０は、ｉＮＳＬ細胞における、ＳＯＸ１とＺＦＰ５２１の発現を解析した結果を示す図である。その結果、マーモセットＥＳ細胞にはＰＡＸ６は発現しないが、得られた誘導神経幹細胞はＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＦＰ５２１を発現することが明らかになった。

【0179】

続いて、得られた誘導神経幹細胞について、中胚葉マーカーであるＴ（ＴＢＸＴ）、内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７（Ｓｒｙ－ｔｙｐｅＨＭＧｂｏｘ１７）の発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図４１に示す。

【0180】

図４１は、ｉＮＳＬ細胞における、ＴとＳＯＸ１７の発現を解析した結果を示す図である。その結果、Ｔ及びＳＯＸ１７は、マーモセットＥＳ細胞においては発現するが、得られた誘導神経幹細胞においては発現しないことが確認された。

【0181】

続いて、マーモセットＥＳ細胞、マーモセットｉＰＳ細胞、マーモセット誘導神経幹細胞について、ｕｎｂｉａｓｅｄｎｅｕｒｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｓｓａｙにより、神経幹細胞への分化能を解析した。図４２は、神経分化アッセイのスケジュールである。具体的には、浮遊培養を７日間行った後、接着培養を７日間行った。結果を図４３、図４４に示す。

【0182】

図４３は、得られた誘導神経幹細胞から分化した細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色及び抗βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎ抗体により免疫染色した結果を示す図である。その結果、得られた誘導神経幹細胞から分化した細胞は、神経細胞に分化していることが明らかになった。

【0183】

図４４は、神経細胞に分化した細胞のうち、βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎの発現が認められた細胞の割合を示すグラフである。その結果、マーモセットＥＳ細胞、マーモセットｉＰＳ細胞から分化した細胞はβＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎを発現しないが、マーモセット誘導神経幹細胞から分化した細胞はβＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎを発現することが明らかになった。

【0184】

以上の結果から、マーモセットの成体の線維芽細胞にＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養して得られたｉＮＳＬ細胞は、神経幹細胞の形質を獲得することが明らかになった。

【0185】

また、ｉＮＳＬ細胞を、増殖用培地へ移さずに神経幹細胞培養培地で培養し続けると、ｉＮＳＬ細胞はベクターを保持し続けているにもかかわらず、神経幹細胞の形質を保持し、ＥＳ細胞の形質を獲得しないことが明らかになった。

【0186】

この結果から、多能性誘導耐性動物の成体の体細胞から直接にｉＰＳ細胞を作製することはできないが、一度、神経幹細胞へ脱分化させた後に、さらにｉＰＳ細胞に脱分化させることは可能であることが明らかになった。

【0187】

［実験例７］
（マーモセットｉＰＳ細胞とｉＮＳＬ細胞の遺伝子プロファイリング）
マーモセットの、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ｉＮＳＬ細胞の遺伝子発現プロファイルについてクラスタリング解析を行った。

【0188】

マーモセットの、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ｉＮＳＬ細胞について、網羅的遺伝子発現プロファイルに基づいて、クラスタリング解析を行った。結果を図４５に示す。その結果、マーモセットｉＰＳ細胞はマーモセットＥＳ細胞と類似性が高く、マーモセットｉＮＳＬ細胞はマーモセット線維芽細胞と類似性が高いことが明らかになった。

【0189】

続いて、各クラスターの類似性を反映している４０遺伝子について、各細胞における発現量を解析した。結果を図４６に示す。その結果、マーモセットｉＰＳ細胞とマーモセット誘導神経幹細胞とで、発現量に特徴がある遺伝子を抽出することができた。

【0190】

各細胞の遺伝子発現プロファイルについて、主成分分析を行った。結果を図４７に示す。その結果、各細胞は、線維芽細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞、並びに、誘導神経幹細胞のグループに分けられることが明らかになった。

【0191】

［実験例８］
（イヌｉＰＳ細胞の樹立）
イヌの線維芽細胞に、ＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、イヌｉＰＳ細胞を樹立した。

【0192】

結果を図４８に示す。図４８は、イヌｉＰＳ細胞が形成したコロニーの写真である。その結果、イヌｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞が形成するコロニーと類似したコロニーを形成することが明らかになった。

【0193】

得られたイヌｉＰＳ細胞について、ＥＳ細胞のマーカーの発現を解析した。結果を図４９に示す。図４９は、イヌｉＰＳ細胞における、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの発現をＲＴ－ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。

【0194】

その結果、イヌｉＰＳ細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧを発現することが明らかになった。すなわち、イヌｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と類似した形質を有することが示唆された。