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▶ エスアンドイー、バイオ、カンパニー、リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-20
(45)【発行日】2024-11-28
(54)【発明の名称】三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20241121BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20241121BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241121BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20241121BHJP
C12M 3/00 20060101ALN20241121BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
C12N5/0735
C12N5/10
C12N5/074
C12M3/00 Z
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2023551944
(86)(22)【出願日】2021-10-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-16
(86)【国際出願番号】 KR2021015122
(87)【国際公開番号】W WO2022097984
(87)【国際公開日】2022-05-12
【審査請求日】2023-05-08
(31)【優先権主張番号】10-2020-0146489
(32)【優先日】2020-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】523170644
【氏名又は名称】エスアンドイー、バイオ、カンパニー、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｓ＆Ｅ ＢＩＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100188651
【弁理士】
【氏名又は名称】遠藤 広介
(72)【発明者】
【氏名】キム、ウンヒ
(72)【発明者】
【氏名】シン、ウンキョン
(72)【発明者】
【氏名】スン、ジヒ
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】韓国登録特許第１０－１９９１０３８（ＫＲ，Ｂ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１９／０１４４８３０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５２７７０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第１０－２０２０－０１１３８３８（ＫＲ，Ａ）
【文献】KUROSAWA, H.，Methods for Inducing Embryoid Body Formation: In Vitro Differentiation System of Embryonic Stem Cells，JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING，2007年05月01日，103(5)，389-398
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに幹細胞を２００～６００細胞／ウェルの密度で分注し、該マイクロウェルで幹細胞を三次元（３Ｄ、３ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）静的培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を含む三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項2】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞、万能幹細胞、誘導万能幹細胞および胚幹細胞からなる群から選択されたいずれか一つ以上である、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項3】
前記（ａ）段階の三次元培養は、１～１０日間培養するものである、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項4】
前記（ｂ）段階の細胞外小胞を分離する段階は、物理的分離または化学的分離によるものである、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項5】
前記（ｂ）段階の細胞外小胞を分離する段階以前に遠心分離した後、フィルターで濾過する段階をさらに含む、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項6】
前記（ｂ）段階の細胞外小胞を分離する段階は、タンジェンシャルフローろ過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）方法で分離するものである、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項7】
前記細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞に比べてｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－２１０およびｍｉＲ－３０１ｂからなる群から選択された１種以上を高発現するものである、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項8】
前記細胞外小胞は、二次元培養した間葉系幹細胞由来の細胞外小胞に比べてｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１４６ａおよびｍｉＲ－１４６ｂからなる群から選択された１種以上を高発現するものである、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項9】
前記細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞に比べてインテグリン１／２およびＶＥＧＦ／Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）からなる群から選択された１種以上を高発現するものである、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項10】
前記細胞外小胞は、二次元培養した間葉系幹細胞由来の細胞外小胞に比べてインテグリン１／２およびＶＥＧＦ／Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）からなる群から選択された１種以上を高発現するものである、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）製造方法。
【請求項11】
前記三次元スフェロイド型細胞凝集体は、平均直径が６５～１３３μｍである、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項12】
前記マイクロウェルは、ＴＭＳＰＭＡ（３－（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート）、ＨＥＡ（ヒドロキシエチル アクリレート）、ＧＭＡ（グリシジル メタクリレート）、ＥＧＤＭＡ（ジエチレングリコール ジメタクリレート）、ＴＨＦＡ（テトラヒドロフルフリル アクリレート）、ＨＭＡＡ（ヒドロキシメチル アクリルアミド）、ＰＥＡ（フェニル エポキシアクリレート）、ＨＯＦＨＡ（６－ヒドロキシ－２，２，３，３，４，４，５，５－オクタフルオロ）、ＥＯＰＴ（ポリエトキシ化（４）ペンタエリスリトールテトラアクリレート）、ＨＰＡ（ヒドロキシプロピル アクリレート）、ＢＭＡ（ブチルメタクリレート）、ＰＥＴＩＡ（ペンタエリスリトール トリアクリレート）、ＨＤＤＡ（ヘキサン ジオール ジアクリレート）、ＥＧＰＥＡ（エチレングリコール フェニルエーテルアクリレート）、ＢＭ（ベンジルメタクリレート）、ＨＰＰＡ（ヒドロキシフェノキシプロピル アクリレート）、ＢＨＰＥＡ（２－（４－ベンゾイル－３－ヒドロキシフェノキシ）エチルアクリレート）、ＨＥＭＡ（ヒドロキシエチル メタクリレート）、ＨＰＭＡ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）およびＭＰＣ（２－メタクリロイルオキシエチル ホスホリルコリン ポリマー）からなる群から選択されたいずれかでコーティングされたものである、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項13】
三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）は、ドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が減少したことを特徴とする、請求項１に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の製造方法により製造された三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）。
【請求項15】
前記三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）は、ドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が減少したことを特徴とする、請求項１４に記載の三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）。
【請求項16】
直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに間葉系幹細胞を２００～６００細胞／ウェルの密度で分注し、該マイクロウェルで間葉系幹細胞を三次元（３Ｄ、３ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）静的培養し、製造した三次元スフェロイド型細胞凝集体を含む細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造用組成物。
【請求項17】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに幹細胞を２００～６００細胞／ウェルの密度で分注し、該マイクロウェルで幹細胞を三次元（３Ｄ、３ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）静的培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を含む、細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）のドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を減少させる方法。
【請求項18】
（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに幹細胞を２００～６００細胞／ウェルの密度で分注し、該マイクロウェルで幹細胞を三次元（３Ｄ、３ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）静的培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を含む、ドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が減少した細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特定構造のマイクロウェルを用いて三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造し、これより治療の効能が向上された細胞外小胞を製造する方法および該製造方法により製造された細胞外小胞に関するものである。
【背景技術】
【0002】
多様な疾患において、幹細胞、特に、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）を用いた治療法と肯定的な臨床結果が報告されてきた。幹細胞治療剤の治療効能のほとんどは、幹細胞の傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果により周辺皮膚細胞の再生と血管再生能力が増進されたと報告されている。細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ）が主な傍分泌効果の効能因子として知られている。最近、幹細胞から分泌される細胞外小胞の分泌による物質が、多様な幹細胞の治療効果の媒介であることが注目を集めている。細胞外小胞は、３０～５，０００ｎｍの大きさを持っており、大きさ別にエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、微小小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）、アポトーシス小体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｏｄｙ）などに分類され、種類と由来によってエクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、プロスタトソーム（ｐｒｏｓｔａｔｏｓｏｍｅ）などと呼ばれる。
【0003】
しかし、未だ幹細胞に由来する細胞外小胞を使用するための大量生産および取得方法などが確立されていない。従来の二次元細胞外小胞の生産法の場合、動物血清（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ｓｅｒｕｍ）を用いたり、幹細胞からの細胞外小胞の分泌が制限的であったりと大量生産が困難であったため、臨床応用に可能な細胞外小胞を大量生産できる新たな生産法が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
そこで、本発明者は、三次元スフェロイド型細胞凝集体またはこれより由来する細胞外小胞を製造するため、大量生産が可能であり、且つ、培養時間を短縮できる方法を研究し、その結果、マイクロウェルを用いた静的培養により三次元スフェロイド型細胞凝集体（３Ｄ－静的－スフェロイド）を製造し、これを用いて細胞外小胞を製造すると、治療効能物質が向上した細胞外小胞が製造されることを確認したことによって本発明を完成するに至った。
【0005】
したがって、本発明の目的は、マイクロウェルを通じて三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造し、効能因子のレベルが向上した細胞外小胞を製造する方法を提供し、このような製造方法により製造される細胞外小胞を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
前記目的を達成するため、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに間葉系幹細胞を三次元（３Ｄ、３ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階を含む、三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）製造方法を提供する。
【0007】
また、本発明は、前記製造方法により製造された細胞外小胞を提供する。
【0008】
また、本発明は、直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに間葉系幹細胞を三次元（３Ｄ、３ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、製造した三次元スフェロイド型細胞凝集体を含む、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造用組成物を提供する。
【0009】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を含む、細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）のドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を減少させる方法を提供する。
【0010】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を含む、ドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が減少した細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【0011】
本発明の細胞外小胞の製造方法を用いることで、効能が増進された細胞外小胞を大量生産することが可能であり、製造された細胞外小胞は、多様な効能因子を既存の細胞外小胞に比べて高い水準で含み、ドナーバリエーションなしに均一な特性を示し、医療業界で多様な目的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】３Ｄスフェロイド型細胞凝集体を製造し、これより細胞外小胞を分離する過程を図式化して示す図である。
【図2-A】３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイド培養液が入ったマイクロウェルを観察した図である。
【図2-B】３Ｄ－静的－スフェロイド培養液が入ったマイクロウェルを観察した図である。
【図2-C】３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドとマイクロウェルを用いて製造した３Ｄ－静的－スフェロイドの培養期間による凝集体の面積変化を示す図である。
【図3】３Ｄ－静的－スフェロイドと３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドのサイズ分布（ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を比較した図である。
【図4】３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの形態を電子顕微鏡で観察した図である。
【図5】３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの濃度およびサイズ分布を確認するためのＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）結果を示す図である。
【図6】３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの発現マーカーを確認するため、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図7】３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶおよび２Ｄ－ＥＶ由来の細胞当たりのＥＶ生産量を比較した図である。
【図8】２Ｄ－ＥＶに比べて３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高く発現するｍｉＲＮＡおよびタンパク質を示す図である。
【図9】３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶに比べて３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高く発現するｍｉＲＮＡおよびタンパク質を示す図である。
【図10】２Ｄ培養ＷＪ－ＭＳＣ、３Ｄ培養ＷＪ－ＭＳＣ、２Ｄ－ＥＶおよび３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶでｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎおよび血管新生、神経再生関連ｍｉＲＮＡ発現量の差を確認した結果を示す図である。
【図11】３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶまたは２Ｄ－ＥＶを血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）または神経幹細胞であるｐＮＳＣｓ（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）に処理した後、ｍＲＮＡの発現変化を確認した図である。
【図12】脳卒中のラットモデルを対象に３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理濃度による梗塞部位の面積変化を示す図である。
【図13】脳卒中のラットモデルを対象にラダー歩行試験を行い、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理濃度による神経学的行動回復能を測定した図である。
【図14】ＣＦＳＥで標識した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが処理された細胞を共焦点顕微鏡で観察した図である。
【図15】ＣＦＳＥで標識した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶによりｍｉＲ－２７ａ－３ｐが細胞に伝達されることを確認した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0013】
本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を含む三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造方法を提供する。
【0014】
本発明において、前記細胞は、細胞外小胞の分離可能な細胞であれば、制限なく使用することができ、自然界生物のオブジェクトから分離した細胞であってもよい。また、前記細胞は、ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む任意の類型の動物、植物に由来するものであってもよく、多様な種類の免疫細胞、腫瘍細胞、幹細胞であってもよく、好ましくは、前記幹細胞は、間葉系幹細胞、万能幹細胞、誘導万能幹細胞または胚幹細胞であってもよい。
【0015】
本発明において、前記三次元培養は、試験管内で立体配置の状態で培養されることを意味し、二次元培養とは異なり、三次元培養時、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）であらゆる方向に成長できるようにし、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の細胞環境により類似した環境を作ることができる。
【0016】
本発明において、前記（ａ）段階の三次元培養は、本発明が属する技術分野に知られた全ての三次元細胞培養技術によって行うことができ、例えば、マイクロウェルアレイ培養、多孔性微粒子培養、ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ培養、ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｌａｔｅ培養、ｍｅｍｂｒａｎｅベースｃｅｌｌ－ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ培養、ｔｈｅｒｍａｌ ｌｉｆｔｉｎｇ培養、遠心分離培養、ｓｅｍｉｓｏｌｉｄ ｍｅｄｉｕｍ培養などを用いた細胞培養であってもよい。好ましくは、前記三次元培養は、動的（ｄｙｎａｍｉｃ）培養または静的（ｓｔａｔｉｃ）培養であってもよく、より好ましくは、静的（ｓｔａｔｉｃ）培養であってもよい。本発明において、（ａ）段階の三次元培養を静的（ｓｔａｔｉｃ）培養する場合、振とう培養に必要な装置を必要としないため、培養をさらに容易にすることができ、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準）製造所で大量培養を可能にすることができる。
【0017】
本発明において、前記（ａ）段階における三次元培養は、１～１０日間培養するものであってもよく、好ましくは、２～４日間培養するものであってもよい。特に、本発明において、前記（ａ）段階における培養を２～４日間培養する場合、三次元スフェロイド型細胞凝集体内に存在する細胞の生存率が高いレベルで維持され、既存の三次元スフェロイド型細胞凝集体の製造過程に比べて培養時間が相対的に短く、迅速に三次元スフェロイド型細胞凝集体およびこれより由来する細胞外小胞を製造することができる。
【0018】
本発明において、前記（ａ）段階における三次元培養は、マイクロウェルに間葉系幹細胞を１００～１０００細胞／ウェルの密度に分注し、培養するものであってもよく、好ましくは、２００～６００細胞／ウェルの密度に分注し、培養するものであってもよい。
【0019】
本発明において、前記（ｂ）段階の細胞外小胞を分離する段階は、物理的分離または化学的分離によるものであってもよい。前記物理的分離は、細胞または細胞凝集体を含む試料の押出しであってもよく、化学的分離は、細胞または細胞凝集体から細胞外小胞を分離することができる化学物質を処理するものであってもよい。例えば、本発明の分離する段階は、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍－解凍、電気穿孔、化学物質処理、機械的分解および外部的に細胞に力を加えた物理的刺激の処理からなる群から選択された方法を用いて行うことができ、イオンまたは親和性クロマトグラフィー方法でイオンと特定バイオマーカーとの結合を通じて分離する物理化学的方法や、ポリマーおよび試薬を通じて細胞を破壊し、細胞外小胞のみ結合させて分離する、ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ＥＶ ｃａｐｔｕｒｅまたはｅｘｏｓｏｍｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ、ＥｘｏＣＡＳ－２試薬または方法であってもよく、好ましくは、タンジェンシャルフローろ過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）方法により分離するものであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0020】
本発明において、ＭｉｃｒｏＲＮＡは、ＲＮＡの一種であって、「ｍｉｒ」を前につけて、後ろに「－」と数字を付して命名される。このとき、数字はしばしば命名された順番を表したりすることもあるが、例えば、ｍｉｒ－１２３は、ｍｉｒ－１５６よりも先に命名されたもので、より先に発見されたものと予想される。「ｍｉｒ－」は、ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡを示し、大文字が含まれた「ｍｉＲ」は、ｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡを意味する。１つまたは２つの配列を除き、ほぼ同一配列のｍｉｃｒｏＲＮＡは、小文字を加えて命名する。例えば、ｍｉＲ－１２１ａとｍｉＲ－１２１ｂは、それぞれのｐｒｅｃｕｒｓｏｒであるｍｉｒ－１２１ａとｍｉｒ－１２１ｂで生成され、配列も非常に類似する。Ｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡは同じであるが、ゲノム上の別の部位に位置するｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡは、さらに「－」と数字を付して命名する。一例として、ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡであるｍｉｒ－１２１－１とｍｉｒ－１２１－２は、同じｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ－１２１）になるが、ゲノム上の別の部位に位置する。種によってｍｉｃｒｏＲＮＡの命名は前方に表記する。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｏａｒ－ｍｉＲ－１２３は、羊（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）ｍｉｃｒｏＲＮＡである。「ｖ」は、ｖｉｒａｌ（ｍｉＲＮＡ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ａ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ）、「ｄ」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｉｃｒｏＲＮＡを意味する。２つのｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡが同一のｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡの互いに異なるａｒｍｓ（３’ａｒｍまたは５’ａｒｍ）に由来する場合、「－３ｐ」または「－５ｐ」を後方に追加して命名する。（以前は、上記のような区分を「ｓ」（ｓｅｎｓｅ）と「ａｓ」（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）と表記した）。ｍｉＲ－１４２－３ｐは、３’ａｒｍに由来するものであり、ｍｉＲ－１４２－５ｐは、５’ａｒｍに由来するものである。ＭｉｃｒｏＲＮＡの命名法は一般的に上記のような基準に基づくが、例外の場合もある。
【0021】
本発明において、前記細胞外小胞は、治療効能を示す多様な物質を公知の細胞外小胞と比較して高発現するものであってもよく、前記治療効能を示す多様な物質は、血管新生、神経新生、細胞保護、免疫調節、若返り、血管／ＢＢＢ透過安定、抗癌効果または標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）に効果を示す物質であってもよい。好ましくは、前記細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞に比べてｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－２１０およびｍｉＲ－３０１ｂからなる群から選択された１種以上、および／またはインテグリン１／２、およびＶＥＧＦ／Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）からなる群から選択された１種以上を高発現するものであってもよく、二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞に比べてｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－１４６ｂからなる群から選択された１種以上、インテグリン１／２、およびＶＥＧＦ／Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）からなる群から選択された１種以上を高発現するものであってもよい。より好ましくは、本発明の細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞に比べてｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－２１０およびｍｉＲ－３０１ｂ；および／またはインテグリン１／２、およびＶＥＧＦ／Ｒ２を高発現するものであってもよく、二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞に比べてｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１４６ａおよびｍｉＲ－１４６ｂ；および／またはインテグリン１／２、およびＶＥＧＦ／Ｒ２を高発現するものであってもよい。
【0022】
また、前記細胞外小胞は、細胞に処理時、細胞内に混入して内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）するものであってもよく、細胞内に混入して内在化することがある。これにより臨床的に有意な物質が細胞に効果的に送達され、細胞内で高発現するものであってもよい。
【0023】
本発明において、「間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞」は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体から分離した細胞外小胞であれば、制限なく含むものであってもよく、好ましくは、韓国登録特許（出願番号１０－２０１６－００５３０２６、幹細胞に由来の細胞外小胞体の生産方法）に開示された細胞外小胞であってもよい。
【0024】
本発明における「二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞」は、幹細胞を通常の二次元培養方法に従って培養し、通常の細胞外小胞の分離方法によって分離された細胞外小胞であれば、制限なく含むことができる。本発明の実施例では、前記通常の二次元培養方法をセルスタック（Ｃｅｌｌ ｓｔａｃｋ）で３日間培養した幹細胞をＰＢＳ洗浄し、無血清培地に交換し、さらに２日間培養する方法で実施して評価した。
【0025】
本発明において、前記三次元スフェロイド型細胞凝集体は、平均直径が６５～１３３μｍであってもよく、好ましくは、９９．２０±１１．４７μｍ、より好ましくは、１５４個の前記三次元スフェロイド型細胞凝集体のサイズ分布を測定した結果、平均直径が９９．２０μｍ、変動係数（ＣＶ）が１１．６％であってもよい。本発明の(次元)スフェロイド型細胞凝集体は、サイズ分布の尖度が「間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体」に比べて高いものであってもよい。したがって、前記三次元スフェロイド型細胞凝集体の大きさは、「間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体」と比較して大きさが小さく、相対的に均一なサイズ分布を有するものであってもよい。
【0026】
本発明において、前記マイクロウェルは、ＴＭＳＰＭＡ（３－（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート（３－（Ｔｒｉｍｅｔｏｘｙｓｉｌｙ）ｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ＨＥＡ（ヒドロキシエチル アクリレート（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ））、ＧＭＡ（グリシジル メタクリレート（Ｇｌｙｃｉｄｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ＥＧＤＭＡ（ジエチレングリコール ジメタクリレート（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｄｉｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ＴＨＦＡ（テトラヒドロフルフリル アクリレート（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒｆｕｒｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ））、ＨＭＡＡ（ヒドロキシメチル アクリルアミド（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｕｌ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ））、ＰＥＡ（フェニル エポキシアクリレート（Ｐｈｅｎｙｌ ｅｐｏｘｙａｃｒｙｌａｔｅ））、ＨＯＦＨＡ（６－ヒドロキシ－２，２，３，３，４，４，５，５－オクタフルオロ（６－Ｈｙｄｒｏｘｙ－２、２，３，３，４，４，５，５－ｏｃｔａｆｌｕｏｒｏ））、ＥＯＰＴ（ポリエトキシ化（４）ペンタエリスリトールテトラアクリレート（Ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ（４）ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌｔｅｔｒａａｃｒｙｌａｔｅ））、ＨＰＡ（ヒドロキシプロピル アクリレート（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ））、ＢＭＡ（ブチルメタクリレート（Ｂｕｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｌａｔｅ））、ＰＥＴＩＡ（ペンタエリスリトール トリアクリレート（Ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ｔｒｉａｃｒｙｌａｔｅ））、ＨＤＤＡ（ヘキサン ジオール ジアクリレート（Ｈｅｘａｎ ｄｉｏｌ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ）、ＥＧＰＥＡ（エチレングリコール フェニルエーテルアクリレート（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｒａｃｒｙｌａｔｅ））、ＢＭ（ベンジルメタクリレート（Ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ＨＰＰＡ（ヒドロキシフェノキシプロピル アクリレート（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ））、ＢＨＰＥＡ（２－（４－ベンゾイル－３－ヒドロキシフェノキシ）エチルアクリレート（２－（４－Ｂｅｎｚｏｙｌ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ））、ＨＥＭＡ（ヒドロキシエチル メタクリレート（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））、ＨＰＭＡ（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（Ｎ－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ））およびＭＰＣ（２－メタクリロイルオキシエチル ホスホリルコリン ポリマー（２－Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ））からなる群から選択されたいずれかでコーティングされたものであってもよく、好ましくは、ＭＰＣ（２－メタクリロイルオキシエチル ホスホリルコリン ポリマー（２－Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ））でコーティングされたものであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0027】
本発明の前記マイクロウェルは、直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍである構造を有するものであってもよく、前記構造により培養される間葉系幹細胞が培養時間経過後にも高い水準で生存率を維持するものであってもよい。
【0028】
本発明の前記「三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）製造方法」により細胞外小胞を製造すると、静的培養による製造上の利点に加えて、治療効能物質が向上した細胞外小胞を迅速かつ効率的に大量生産することができる。特に、本発明の細胞外小胞の製造方法は、ＧＭＰ適用に適しているという特徴がある。
【0029】
また、本発明は、前記製造方法により製造された細胞外小胞を提供する。
【0030】
本発明において、前記細胞外小胞は、治療効能物質を公知の細胞外小胞と比較して高発現するものであってもよい。好ましくは、前記細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞に比べて、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－２１０およびｍｉＲ－３０１ｂからなる群から選択された１種以上、および／またはインテグリン１／２、およびＶＥＧＦ／Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）からなる群から選択された１種以上を高発現するものであってもよく、二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞に比べて、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－１４６ｂからなる群から選択された１種以上、インテグリン１／２、およびＶＥＧＦ／Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）からなる群から選択された１種以上を高発現するものであってもよい。より好ましくは、本発明の細胞外小胞は、間葉系幹細胞を三次元動的培養したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞に比べて、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－２１０およびｍｉＲ－３０１ｂ；および／またはインテグリン１／２、およびＶＥＧＦ／Ｒ２を高発現するものであってもよく、二次元培養した間葉系幹細胞に由来の細胞外小胞に比べて、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１４６ａおよびｍｉＲ－１４６ｂ；および／またはインテグリン１／２、およびＶＥＧＦ／Ｒ２を高発現するものであってもよい。
【0031】
本発明において、前記細胞外小胞は、平均粒子径が１７２．５～１９２．５ｎｍであり、モード径が９６．１～１１６．１ｎｍのものであってもよい。
【0032】
また、本発明の製造方法により製造される三次元スフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞は、特に、ドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が減少したことを特徴とすることができる。
【0033】
本発明において、前記細胞外小胞は、脳梗塞が発生した個体に処理した際、脳梗塞部位を減少させるものであってもよく、神経学的行動回復を誘導するものであってもよい。好ましくは、前記細胞外小胞は、既存の公知の方法により製造された細胞外小胞と比較して、少ない量で前記脳梗塞部位の減少効果および神経学的行動回復の誘導を示すものであってもよい。
【0034】
また、本発明は、直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに間葉系幹細胞を三次元培養し、製造した三次元スフェロイド型細胞凝集体を含む細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の製造用組成物を提供する。
【0035】
本発明において、前記組成物は、細胞外小胞を製造するのに必要な成分であれば、制限なく含むもことができる。
【0036】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を含む細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）のドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を減少させる方法を提供する。
【0037】
また、本発明は、（ａ）直径が２００～８００μｍであり、深さが１００～１０００μｍであるマイクロウェルに幹細胞を三次元（３Ｄ、３ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）培養し、三次元スフェロイド型細胞凝集体を製造する段階；および（ｂ）前記三次元スフェロイド型細胞凝集体から細胞外小胞を分離する段階；を含むドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が減少した細胞凝集体に由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を製造する方法を提供する。
【0038】
本発明の方法によれば、取得される細胞凝集体に由来の細胞外小胞間ドナーによるｍｉＲＮＡの組成の差異を減少させ、均一な特性を有する細胞外小胞を製造することができる。より具体的には、本発明において、ドナーバリエーションの減少とは、ドナーによって生産されるｍｉＲＮＡの組成が異に示される差を減少させ、ドナーと無関係に一貫性のあるｍｉＲＮＡプロファイルを示すようにするものであり、より好ましくは、２Ｄ－ＥＶと比較し、血管新生効果または神経再生効果を示すことができるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１０、ｍｉＲ－１３２をより多く均一に含んだり、血管新生や神経再生に関連するｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１９９ａ、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－２６ａ、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１２５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－９２ａ等を各ドナーの由来とは無関係に均一な程度に発現するものであってもよい。
【0039】
重複する内容は、本明細書の複雑性を考慮して省略するものとし、本明細書において特に断りのない用語は、本発明が属する技術分野で通常に使用される意味を有するものである。
【0040】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が以下の実施例により限定されるものではない。
【発明を実施するための形態】
【0041】
ウェスタンブロット
細胞および細胞外小胞を放射線免疫沈降アッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ、ＲＩＰＡ）緩衝剤（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のＮａ－ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）およびタンパク質分解酵素阻害剤）に溶解させた。計２０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に移した。その次に、ニトロセルロース膜をヒストンＨ２Ａ．Ｚ、ヒストンＨ３、ラミンＡ／Ｃ、フロチリン－１（１：１，０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ビバリー、ＭＡ、ＵＳＡ）またはカルレティキュリン（１：１，０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に対する一次抗体と共に４℃で一晩培養した。Ｔｒｉｓ－緩衝生理食塩水－Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、ニトロセルロース膜を西洋わさびペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）－結合二次抗体（１：１，０００、抗－ウサギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ビバリー、ＭＡ、ＵＳＡ）と共に２時間培養した。タンパク質をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の化学発光基質を用いて検出した。標識タンパク質をＸ－線フィルム（Ａｇｆａ、Ｍｏｒｔｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を通じて視覚化した。
細胞および細胞外小胞を放射線免疫沈降アッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ、ＲＩＰＡ）緩衝剤（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％のＮａ－ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％のｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＳＤＳ）およびタンパク質分解酵素阻害剤）に溶解させた。計２０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に移した。その次に、ニトロセルロース膜をヒストンＨ２Ａ．Ｚ、ヒストンＨ３、ラミンＡ／Ｃ、フロチリン－１（１：１，０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ビバリー、ＭＡ、ＵＳＡ）またはカルレティキュリン（１：１，０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に対する一次抗体と共に４℃で一晩培養した。Ｔｒｉｓ－緩衝生理食塩水－Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、ニトロセルロース膜を西洋わさびペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）－結合二次抗体（１：１，０００、抗－ウサギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ビバリー、ＭＡ、ＵＳＡ）と共に２時間培養した。タンパク質をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の化学発光基質を用いて検出した。標識タンパク質をＸ－線フィルム（Ａｇｆａ、Ｍｏｒｔｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を通じて視覚化した。
【0042】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、個々のメーカーのマニュアルに従って商用キットで行った。次のようなＥＬＩＳＡキットを使用した：ゲンタマイシン（５１１１ＧＥＮ、ＥｕｒｏＰｒｏｘｉｍａ、Ａｒｎｈｅｍ、Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ）、ウシアルブミン（８１００、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）、Ｈｓｐ７０（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ＣＤ６３、ＣＤ９およびＣＤ８１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ．（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、カルレティキュリン（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）およびシトクロムＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）。全てのキットには、標準タンパク質が含まれている；したがって、タンパク質および細胞外小胞の量は、各キットの標準曲線に基づいて決定される。
ＥＬＩＳＡは、個々のメーカーのマニュアルに従って商用キットで行った。次のようなＥＬＩＳＡキットを使用した：ゲンタマイシン（５１１１ＧＥＮ、ＥｕｒｏＰｒｏｘｉｍａ、Ａｒｎｈｅｍ、Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ）、ウシアルブミン（８１００、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）、Ｈｓｐ７０（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ＣＤ６３、ＣＤ９およびＣＤ８１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ．（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、カルレティキュリン（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）およびシトクロムＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）。全てのキットには、標準タンパク質が含まれている；したがって、タンパク質および細胞外小胞の量は、各キットの標準曲線に基づいて決定される。
【0043】
ｑＰＣＲ
ＥＶでＴｒｉｚｏｌＴＭを用いてメーカーの指針に従ってＲＮＡを抽出し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）でＲＮＡを定量した。ＲＮＡは、逆転写反応 （ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）過程を経て、ｃＤＮＡで作り、それぞれのｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡに適したＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用いてメーカーのマニュアルに従ってＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを進めた。
ＥＶでＴｒｉｚｏｌＴＭを用いてメーカーの指針に従ってＲＮＡを抽出し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）でＲＮＡを定量した。ＲＮＡは、逆転写反応 （ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）過程を経て、ｃＤＮＡで作り、それぞれのｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡに適したＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用いてメーカーのマニュアルに従ってＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを進めた。
【0044】
ＥＶラベリングおよび細胞による吸収
精製されたＥＶをメーカーの指針に従って、ＣＦＳＥ（５－（ａｎｄ－６）－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｄｉａｃｅｔａｔｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ）ラベリング染料（ｃ－１１５７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。１時間１００．０００ｇの条件で超遠心分離し、過剰な染料を除去した。標識されたＥＶ（０．４μｇ／ｍｌ）をヒトＮＳＣ細胞株（ＲｅＮｃｅｌｌｓ）に処理し、２４時間培養した。処理後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、通常の免疫細胞化学プロトコルを用いて染色した。細胞をマウス抗－ＳＭＡ（１：１００、Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ）抗体と共に４℃で一晩培養した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体であるＤｙＬｉｇｈｔ標識された抗マウスＩｇＧ（１：２００、５９４ｎｍ、Ａｂｃａｍ）抗体と共に培養した。１．５μｇ／ｍＬ４’－６’ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄＴＭを用いて核染色した後、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞をイメージ化した。
精製されたＥＶをメーカーの指針に従って、ＣＦＳＥ（５－（ａｎｄ－６）－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｄｉａｃｅｔａｔｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ）ラベリング染料（ｃ－１１５７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。１時間１００．０００ｇの条件で超遠心分離し、過剰な染料を除去した。標識されたＥＶ（０．４μｇ／ｍｌ）をヒトＮＳＣ細胞株（ＲｅＮｃｅｌｌｓ）に処理し、２４時間培養した。処理後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、通常の免疫細胞化学プロトコルを用いて染色した。細胞をマウス抗－ＳＭＡ（１：１００、Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ）抗体と共に４℃で一晩培養した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体であるＤｙＬｉｇｈｔ標識された抗マウスＩｇＧ（１：２００、５９４ｎｍ、Ａｂｃａｍ）抗体と共に培養した。１．５μｇ／ｍＬ４’－６’ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄＴＭを用いて核染色した後、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞をイメージ化した。
【0045】
実施例１．間葉系幹細胞の三次元培養を通じた細胞外小胞の分離
１．１ 間葉系幹細胞の準備
５継代培養（ｐａｓｓａｇｅ ５）段階のヒト臍帯由来の間葉系幹細胞（以下、ＷＪ－ＭＳＣ、Ｓａｍｓｕｎｇ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｅｎｔｅｒ、ソウル、韓国）を分譲を受け、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。成長培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）および５０ μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含有するα－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（α－ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用した。６継代培養（ｐａｓｓａｇｅ ６）段階のＷＪ－ＭＳＣを３Ｄスフェロイド型細胞凝集体の作製に使用した。
１．１ 間葉系幹細胞の準備
５継代培養（ｐａｓｓａｇｅ ５）段階のヒト臍帯由来の間葉系幹細胞（以下、ＷＪ－ＭＳＣ、Ｓａｍｓｕｎｇ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｅｎｔｅｒ、ソウル、韓国）を分譲を受け、３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養した。成長培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）および５０ μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含有するα－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（α－ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用した。６継代培養（ｐａｓｓａｇｅ ６）段階のＷＪ－ＭＳＣを３Ｄスフェロイド型細胞凝集体の作製に使用した。
【0046】
１．２ ３Ｄスフェロイド型細胞凝集体培養液の作製
前記実施例１．１にて作製したＷＪ－ＭＳＣをＰＢＳに洗浄し、トリプシン （ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）処理し、ＣＯ２培養器で５分間反応させた。その後、新たな無血清培地を入れ、トリプシンを中和させ、細胞を回収し、遠心分離機を用いて細胞ペレットを取得した。その次に、新しい無血清培地を入れ、細胞懸濁液を製造し、細胞を計数した。細胞計数後、ＭＰＣ（２－Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ）でコーティングされた直径と深さがそれぞれ５００μｍ×２００μｍであるマイクロウェルを含むマイクロアレイに６０ｍｌの細胞懸濁液を４００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度になるように、均一に分注し、静的な状態を維持し、自発的スフェロイド型細胞凝集体の形成を誘導し、計４日間３７℃のＣＯ２培養器で培養し、３Ｄスフェロイド型細胞凝集体培養液（以下、３Ｄ－静的－スフェロイド培養液）を製造した。
前記実施例１．１にて作製したＷＪ－ＭＳＣをＰＢＳに洗浄し、トリプシン （ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＧＩＢＣＯ、ＮＹ、ＵＳＡ）処理し、ＣＯ２培養器で５分間反応させた。その後、新たな無血清培地を入れ、トリプシンを中和させ、細胞を回収し、遠心分離機を用いて細胞ペレットを取得した。その次に、新しい無血清培地を入れ、細胞懸濁液を製造し、細胞を計数した。細胞計数後、ＭＰＣ（２－Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ）でコーティングされた直径と深さがそれぞれ５００μｍ×２００μｍであるマイクロウェルを含むマイクロアレイに６０ｍｌの細胞懸濁液を４００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度になるように、均一に分注し、静的な状態を維持し、自発的スフェロイド型細胞凝集体の形成を誘導し、計４日間３７℃のＣＯ２培養器で培養し、３Ｄスフェロイド型細胞凝集体培養液（以下、３Ｄ－静的－スフェロイド培養液）を製造した。
【0047】
１．３ ３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の分離
実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液を回収し、細胞・残屑を除去するため、２，５００ｇで１０分間遠心分離し、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。その後、３Ｄ－静的－スフェロイド培養液をタンジェンシャルフローろ過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）システムを用いて３００ｋＤａのｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ、ＮＹ、ＵＳＡ）を経て、タンパク質を除去し、細胞外小胞を１次分離し、生理食塩水でもう一度精製し、純度の高い本発明の３Ｄ－静的－スフェロイド由来の細胞外小胞（以下、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ）を取得した。
実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液を回収し、細胞・残屑を除去するため、２，５００ｇで１０分間遠心分離し、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。その後、３Ｄ－静的－スフェロイド培養液をタンジェンシャルフローろ過（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）システムを用いて３００ｋＤａのｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ、ＮＹ、ＵＳＡ）を経て、タンパク質を除去し、細胞外小胞を１次分離し、生理食塩水でもう一度精製し、純度の高い本発明の３Ｄ－静的－スフェロイド由来の細胞外小胞（以下、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ）を取得した。
【0048】
前記実施例１．１～１．３の過程を図式化して図１に示した。
【0049】
実施例２．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体の特性の分析
前記実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液内に存在する３Ｄスフェロイド型細胞凝集体（以下、３Ｄ－静的－スフェロイド）の特性を分析した。実験群として、実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液を用いており、比較群として、登録特許（出願番号１０－２０１６－００５３０２６、幹細胞由来の細胞外小胞体の生産方法）に開示された動的３Ｄ細胞培養方法に従って、５日間間葉系幹細胞を培養し、製造した３Ｄ間葉系幹細胞スフェロイド型細胞凝集体（以下、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイド）培養液を使用した。光学顕微鏡で、それぞれの培養液が入ったマイクロウェルを観察し、これを図２のＡ、Ｂに示し、培養初期と比較して培養後、スフェロイド型細胞凝集体の面積変化を図２のＣに示した。
前記実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液内に存在する３Ｄスフェロイド型細胞凝集体（以下、３Ｄ－静的－スフェロイド）の特性を分析した。実験群として、実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイド培養液を用いており、比較群として、登録特許（出願番号１０－２０１６－００５３０２６、幹細胞由来の細胞外小胞体の生産方法）に開示された動的３Ｄ細胞培養方法に従って、５日間間葉系幹細胞を培養し、製造した３Ｄ間葉系幹細胞スフェロイド型細胞凝集体（以下、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイド）培養液を使用した。光学顕微鏡で、それぞれの培養液が入ったマイクロウェルを観察し、これを図２のＡ、Ｂに示し、培養初期と比較して培養後、スフェロイド型細胞凝集体の面積変化を図２のＣに示した。
【0050】
図２に示すように、実験群である３Ｄ－静的－スフェロイドと比較群である３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドの面積を比較した結果、３Ｄ－静的－スフェロイドは、培養初期のスフェロイドに対して７０％程度の面積を維持した。しかし、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドでは、細胞残屑（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）が発生し、培養初期のスフェロイドに対して５０％程度の面積に減少し、３Ｄ－静的－スフェロイドと３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドの面積減少率の差は、ｐ≦０．５として統計的に有意な結果がみられた（ｐ＝０．０１９７５３）。
【0051】
実施例３．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体の大きさの分析
実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイドと実施例３にて製造した３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドのサイズ分布（ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を測定し、測定されたサイズ分布のデータを土台に、変動係数、歪度（ｓｋｅｗｎｅｓｓ）、尖度（ｋｕｒｔｏｓｉｓ）を分析した。
実施例１．２にて製造した３Ｄ－静的－スフェロイドと実施例３にて製造した３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドのサイズ分布（ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を測定し、測定されたサイズ分布のデータを土台に、変動係数、歪度（ｓｋｅｗｎｅｓｓ）、尖度（ｋｕｒｔｏｓｉｓ）を分析した。
【0052】
歪度は、中央値の推移から分布が傾いた方向と程度を知ることができるパラメータであり、１に近いほど右側に長く裾をひく分布を示し、－１に近いほど左側に長く裾を引いた分布を示す。正規分布の場合の歪度は、０である。
【0053】
尖度は、資料分布の尖り具合を示すパラメータであって、値が正の数の場合、中央部分に相対的に多数のデータポイントが集積していることを意味し、負の数の場合、中央部分に相対的に少数のデータポイントが集積していることを意味する。正規分布の場合、尖度は０である。
【0054】
測定したサイズ分布データを図３に示し、これを分析した結果を表１に示した。
【0055】
【表1】
【0056】
図３および表１に示すように、３Ｄ－静的－スフェロイドの平均の大きさが９９．２０ｕｍ、変動係数（ＣＶ）が１１．６％であることが確認された。これとは対照的に、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドは、平均の大きさが１４８．６６ｕｍ、変動係数（ＣＶ）が１４．１％であることを確認した。測定した変動係数を比較検定するため、Ｆｅｌｔｚ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ’ｓ（１９９６）ａｓｙｍｐｔｏｔｉｃ ｔｅｓｔを実施した結果、ｐ ｖａｌｕｅ値が０．０１７６５６０４として算出され、Ｋｒｉｓｈｎａｍｏｏｒｔｈｙ ａｎｄ Ｌｅｅ’ｓ（２０１４）ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉｇｎｅｄ－ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｒａｔｉｏ ｔｅｓｔを実施した結果、ｐ ｖａｌｕｅ値が０．０１８５３９６９として算出された。したがって、二つのテスト全部において３Ｄ－静的－スフェロイドと３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドのサイズ分布が統計的に有意な程度に相異する様相を示すことを確認した。３Ｄ－静的－スフェロイドと３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドのサイズ分布を比較した結果、３Ｄ－静的－スフェロイドのサイズ分布の尖度値が相対的に大きいことが確認され、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドのサイズ分布は、中央値に多く集中した様相を示すことが確認された。このような結果から、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドの製造方法により３Ｄスフェロイドを製造すると、大きさが相対的に一定した３Ｄスフェロイドの製造が可能であることが確認された。
【0057】
実施例４．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の形態の分析
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの形態を観察するため、電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＴＥＭ）を用いて撮影した。具体的に、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを０．１Ｍホスフェート緩衝液（ＰＢ）に溶解された１％のＯｓＯ４で２時間固定させた。ＥＭグリッドを細胞外小胞の液滴上にフォルムバール（ｆｏｒｍｖａｒ）側面を下に向けて１分間吸着させた。その後、濾紙でブロッティングし、１５秒間２％のウラニルアセテートと反応させた。過量のウラニルアセテートを除去し、ＥＭグリッドをＴＥＭ（ＪＥＭ－１０１１、ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）を用いて観察し、観察画像を図４に示した。
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの形態を観察するため、電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＴＥＭ）を用いて撮影した。具体的に、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを０．１Ｍホスフェート緩衝液（ＰＢ）に溶解された１％のＯｓＯ４で２時間固定させた。ＥＭグリッドを細胞外小胞の液滴上にフォルムバール（ｆｏｒｍｖａｒ）側面を下に向けて１分間吸着させた。その後、濾紙でブロッティングし、１５秒間２％のウラニルアセテートと反応させた。過量のウラニルアセテートを除去し、ＥＭグリッドをＴＥＭ（ＪＥＭ－１０１１、ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）を用いて観察し、観察画像を図４に示した。
【0058】
図４に示すように、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、典型的な細胞外小胞の形態である丸い形状であることが確認された。
【0059】
実施例５．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の濃度および大きさの分析
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの濃度およびサイズ分布を確認するため、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いたＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。最適な分析のため、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）のないホスフェート緩衝液（ＰＢＳ）に予め希釈した。平均の大きさおよび濃度（ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍＬ）は、３個の記録を統合して計算しており、結果を図５に示した。
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの濃度およびサイズ分布を確認するため、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いたＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。最適な分析のため、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）のないホスフェート緩衝液（ＰＢＳ）に予め希釈した。平均の大きさおよび濃度（ｐａｒｔｉｃｌｅ／ｍＬ）は、３個の記録を統合して計算しており、結果を図５に示した。
【0060】
図５に示すように、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの平均粒子直径は、１８２．５ｎｍであり、モード径は、１０６．１ｎｍであることが確認された。
【0061】
実施例６．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の発現マーカー分析
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの発現マーカーを確認するための実験を行った。対照群として細胞ライセート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）と分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）を使用した。細胞ライセートは、３Ｄ－静的－スフェロイドをＰＢＳ洗浄し、トリプシンを処理した後、細胞を回収し、回収された細胞を遠心分離機を用いて細胞ペレットを取得する方法により準備した。分泌物は、前記細胞ペレットを取得した後、上澄み液である培養培地で実施例１．３の工程を通じてＥＶを分離し、残った培養分泌物を得る方式により用意した。マーカー分析は、ＥＬＩＳＡを用いて細胞外小胞特異的な陽性マーカーＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＨＳＰ７０を定量し、特定汚染タンパク質マーカーであるカルレティキュリン、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ、シトクロムＣ、アルブミン、抗生剤を定量した。また、ウェスタンブロットを用いて細胞外小胞の特定汚染タンパク質マーカーであるヒストンＨ２Ａ．Ｚ、ヒストンＨ３、ラミンＡ／Ｃ、カルレティキュリンを定量し、細胞外小胞陽性マーカーであるフロチリン－１を定量した。ＥＬＩＳＡ分析の結果およびウェスタンブロットの結果を図６に示した。
実施例１．３にて分離した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの発現マーカーを確認するための実験を行った。対照群として細胞ライセート（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）と分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）を使用した。細胞ライセートは、３Ｄ－静的－スフェロイドをＰＢＳ洗浄し、トリプシンを処理した後、細胞を回収し、回収された細胞を遠心分離機を用いて細胞ペレットを取得する方法により準備した。分泌物は、前記細胞ペレットを取得した後、上澄み液である培養培地で実施例１．３の工程を通じてＥＶを分離し、残った培養分泌物を得る方式により用意した。マーカー分析は、ＥＬＩＳＡを用いて細胞外小胞特異的な陽性マーカーＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＨＳＰ７０を定量し、特定汚染タンパク質マーカーであるカルレティキュリン、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ、シトクロムＣ、アルブミン、抗生剤を定量した。また、ウェスタンブロットを用いて細胞外小胞の特定汚染タンパク質マーカーであるヒストンＨ２Ａ．Ｚ、ヒストンＨ３、ラミンＡ／Ｃ、カルレティキュリンを定量し、細胞外小胞陽性マーカーであるフロチリン－１を定量した。ＥＬＩＳＡ分析の結果およびウェスタンブロットの結果を図６に示した。
【0062】
図６に示すように、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、細胞外小胞特異的陽性マーカーであるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＨＳＰ７０が全部発現され、細胞ライセートおよび分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）から高く発現される汚染タンパク質マーカーであるカルレティキュリン、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ、ヒストンＨ３、シトクロムＣ、アルブミン（ＢＳＡ、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、ラミンＡ／Ｃおよび抗生剤がほぼ発現されないことが確認された。特に、細胞ライセートから非常に低く発現される細胞外小胞陽性マーカーフロチリン－１が３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで相対的に高く発現することが確認された。
【0063】
実施例７．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の生産量の分析
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、実施例２の３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドから分離した細胞外小胞（３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶ）および通常の２Ｄ培養方法で培養した幹細胞から分離した細胞外小胞（２Ｄ－ＥＶ）の生産量を比較するための実験を実施した。２Ｄ－ＥＶは、次のような工程により用意した。セルスタック（Ｃｅｌｌ ｓｔａｃｋ）において３日間培養した幹細胞をＰＢＳ洗浄し、無血清培地に交換し、さらに２日間培養する。培養培地を回収し、遠心分離および０．２μｍフィルターを用いて細胞残屑を連続して除去する。その後、培養培地をＴＦＦシステムを用いてｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅを経て、タンパク質を除去し、ＥＶを１次分離し、生理食塩水でもう一度精製し、純度の高い２Ｄ－ＥＶを取得した。用意した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶおよび２Ｄ－ＥＶに由来の細胞当たりの生産量を比較し、これを表２および図７に示した。
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、実施例２の３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドから分離した細胞外小胞（３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶ）および通常の２Ｄ培養方法で培養した幹細胞から分離した細胞外小胞（２Ｄ－ＥＶ）の生産量を比較するための実験を実施した。２Ｄ－ＥＶは、次のような工程により用意した。セルスタック（Ｃｅｌｌ ｓｔａｃｋ）において３日間培養した幹細胞をＰＢＳ洗浄し、無血清培地に交換し、さらに２日間培養する。培養培地を回収し、遠心分離および０．２μｍフィルターを用いて細胞残屑を連続して除去する。その後、培養培地をＴＦＦシステムを用いてｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅを経て、タンパク質を除去し、ＥＶを１次分離し、生理食塩水でもう一度精製し、純度の高い２Ｄ－ＥＶを取得した。用意した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶおよび２Ｄ－ＥＶに由来の細胞当たりの生産量を比較し、これを表２および図７に示した。
【0064】
【表2】
【0065】
実施例８．３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞の発現マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分析
８．１ ３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで発現が増加したｍｉＲＮＡの確認
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、実施例２の３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドから分離した細胞外小胞である３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶおよび実施例７にて製造した２Ｄ－ＥＶの特性の差異を確認するため、ｍｉＲＮＡｓの発現およびタンパク質の発現をｑＰＣＲを通じて測定し、２Ｄ－ＥＶと比較して３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高く発現するｍｉＲＮＡおよびタンパク質を図８に示し、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶと比較して３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高く発現するｍｉＲＮＡおよびタンパク質を図９に示した。
８．１ ３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで発現が増加したｍｉＲＮＡの確認
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ、実施例２の３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドから分離した細胞外小胞である３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶおよび実施例７にて製造した２Ｄ－ＥＶの特性の差異を確認するため、ｍｉＲＮＡｓの発現およびタンパク質の発現をｑＰＣＲを通じて測定し、２Ｄ－ＥＶと比較して３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高く発現するｍｉＲＮＡおよびタンパク質を図８に示し、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶと比較して３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高く発現するｍｉＲＮＡおよびタンパク質を図９に示した。
【0066】
図８に示すように、２Ｄ－ＥＶと比較して、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、血管新生／神経新生（ａｎｇｉｏ／ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）および免疫調節に効能を示すｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１４６ｂ、ｍｉＲ－１４６ａを高く発現し、血管新生／神経新生（ａｎｇｉｏ／ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）に効能を示すタンパク質であるインテグリン１／２およびＶＥＧＦ／Ｒ２（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ／Ｒ２）を高く発現することが確認された。
【0067】
図９に示すように、３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶと比較し、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、血管新生／神経新生（ａｎｇｉｏ／ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）および免疫調節に効能を示すｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１４６ａ、血管新生／神経新生（ａｎｇｉｏ／ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）に効能を示すｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１８４およびｍｉＲ－２１０および抗腫瘍効能を示すｍｉＲ－３０１ｂを高く発現し、血管新生／神経新生（ａｎｇｉｏ／ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）に効能を示すタンパク質であるインテグリン１／２およびＶＥＧＦ／Ｒ２を高く発現することが確認された。
【0068】
このような結果から実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、２Ｄ－ＥＶまたは３Ｄ－動的－ＰＥＧスフェロイドＥＶと比較し、ｍｉＲＮＡとタンパク質発現が相異する新たな細胞外小胞であり、特に、血管新生／神経新生（ａｎｇｉｏ／ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）、免疫調節、若返り（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ）または抗腫瘍に関連したｍｉＲＮＡを高く発現し、臨床的に有用に使用しうる細胞外小胞であることが確認された。
【0069】
８．２ ドナーによるｍｉＲＮＡ発現差の分析
幹細胞治療剤は、ドナーによって成分が異に示されるドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の問題があるとして知られている。本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが、ドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の問題なくより一貫性のあるｍｉＲＮＡプロファイルを示すかを確認するための実験を行った。各ドナーの試料は、Ｓａｍｓｕｎｇ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｅｎｔｅｒ（ソウル、韓国）から分譲を受けて使用した。実施例１．１の２Ｄ培養されたＷＪ－ＭＳＣと３Ｄ培養されたＷＪ－ＭＳＣ、実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶのドナー別にｍｉＲＮＡプロファイルを比較した。ｍｉＲＮＡ は、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ方法によりｍｉＲＮＡプロファイリングし、その結果を図１０に示した。
幹細胞治療剤は、ドナーによって成分が異に示されるドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の問題があるとして知られている。本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが、ドナーバリエーション（ｄｏｎｏｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の問題なくより一貫性のあるｍｉＲＮＡプロファイルを示すかを確認するための実験を行った。各ドナーの試料は、Ｓａｍｓｕｎｇ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｅｎｔｅｒ（ソウル、韓国）から分譲を受けて使用した。実施例１．１の２Ｄ培養されたＷＪ－ＭＳＣと３Ｄ培養されたＷＪ－ＭＳＣ、実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶのドナー別にｍｉＲＮＡプロファイルを比較した。ｍｉＲＮＡ は、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ方法によりｍｉＲＮＡプロファイリングし、その結果を図１０に示した。
【0070】
図１０に示すように、２Ｄ培養されたＷＪ－ＭＳＣ、２Ｄ－ＥＶでは、ドナーによって生産されるｍｉＲＮＡの組成に大きな差があるのに対し、３Ｄ培養ＷＪ－ＭＳＣ、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶでは、ドナーによる差が減ることを確認した。特に、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、ドナーによる差がなく、一貫性のあるｍｉＲＮＡプロファイルを示すと同時に特に、２Ｄ－ＥＶと比較し、血管新生効果または神経再生効果を示すことができるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－２７ａ－３ｐ（１．５倍）、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ（２．３倍）、ｍｉＲ－２１０（２．６倍）、ｍｉＲ－１３２（２．６倍）がより多く均一に含まれていることが確認された。また、その他の血管新生や神経再生に関連したｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１９９ａ、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－２６ａ、ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１２５ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－９２ａも各ドナー間で均一な発現程度を示すことが確認された。
【0071】
このような結果は、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶがドナーによる治療有効成分の差を減らし、より優れた治療効果を示すことができることを示す結果である。
【0072】
実施例９．細胞に３Ｄスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞処理時、発現ｍＲＮＡの分析
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶと通常の２Ｄ培養方法で培養した幹細胞から分離した細胞外小胞である２Ｄ－ＥＶを血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）または神経幹細胞であるｐＮＳＣｓ（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）に処理した後、ｍＲＮＡの発現変化をｑＰＣＲを通じて確認し、ｑＰＣＲ結果を図１１に示した。
実施例１の製造方法により製造した細胞外小胞である３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶと通常の２Ｄ培養方法で培養した幹細胞から分離した細胞外小胞である２Ｄ－ＥＶを血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）または神経幹細胞であるｐＮＳＣｓ（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）に処理した後、ｍＲＮＡの発現変化をｑＰＣＲを通じて確認し、ｑＰＣＲ結果を図１１に示した。
【0073】
図１１に示すように、２Ｄ－ＥＶを処理した細胞に比べて３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理した血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）は、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、Ｈｉｆ－１ａ（Ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １－ａｌｐｈａ）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の発現が増加し、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理したｐＮＳＣｓは、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ、ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の発現が増加したことが確認された。特に、対照群と比較し、２Ｄ－ＥＶを処理したｐＮＳＣｓの場合、ＮＧＦおよびＨＧＦの発現が減少したが、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理したｐＮＳＣｓは、ＮＧＦおよびＨＧＦの発現が増加する効果を示したところ、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶと２Ｄ－ＥＶは、正常においても異なる効果を示すことが確認された。
【0074】
ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびＨｉｆ－１ａは、血管新生／神経新生関連タンパク質であり、ＦＧＦは、細胞の増殖、生存、分化に関連した生物学的機能を調節するタンパク質に該当する因子であって、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦ、Ｈｉｆ－１ａおよびＦＧＦの発現増加効果が相対的に高い３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが臨床的に適用するに優れた細胞外小胞であることを確認した。
【0075】
実施例１０．脳卒中ラットモデルに対する３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの効果
１０．１ 脳卒中ラットモデルの製造
脳卒中ラットモデルを製造するために、管腔内縫合法（ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使って、一過性中大脳動脈閉塞（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ、ｔＭＣＡｏ）を誘導した。具体的に、雄のスプラグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）ラッド（８週齢、２７０～３００ｇ）を使用しており、１．５％イソフルラン、７０％Ｎ２Ｏおよび３０％Ｏ２で麻酔させ、手術中、加熱パッドを用いて３７．０～３７．５℃に体温を維持した。丸いチップ付き４－０外科用単一フィラメントナイロン縫合糸を、左総頚動脈（ｌｅｆｔ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ）から、中大脳動脈（ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ）の起始部（ｏｒｉｇｉｎ）が閉塞するまで、内頚動脈（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ）内腔へ前進させた。チップが総頚動脈の内腔が閉塞するまで縫合糸を引っ張り（ｗｉｔｈｄｒａｗ）、中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡｏ）し、９０分後に再灌流を行った。頭蓋内動脈（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ａｒｔｅｒｙ）の破裂により引き起こされた出血性形質転換（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）またはくも膜下出血（ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）が発生したラットおよび中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡｏ）後、観察可能な神経学的欠陥がみられないラッドは分析から除外した。
１０．１ 脳卒中ラットモデルの製造
脳卒中ラットモデルを製造するために、管腔内縫合法（ｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使って、一過性中大脳動脈閉塞（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ、ｔＭＣＡｏ）を誘導した。具体的に、雄のスプラグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）ラッド（８週齢、２７０～３００ｇ）を使用しており、１．５％イソフルラン、７０％Ｎ２Ｏおよび３０％Ｏ２で麻酔させ、手術中、加熱パッドを用いて３７．０～３７．５℃に体温を維持した。丸いチップ付き４－０外科用単一フィラメントナイロン縫合糸を、左総頚動脈（ｌｅｆｔ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ）から、中大脳動脈（ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ）の起始部（ｏｒｉｇｉｎ）が閉塞するまで、内頚動脈（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ）内腔へ前進させた。チップが総頚動脈の内腔が閉塞するまで縫合糸を引っ張り（ｗｉｔｈｄｒａｗ）、中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡｏ）し、９０分後に再灌流を行った。頭蓋内動脈（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ａｒｔｅｒｙ）の破裂により引き起こされた出血性形質転換（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）またはくも膜下出血（ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）が発生したラットおよび中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡｏ）後、観察可能な神経学的欠陥がみられないラッドは分析から除外した。
【0076】
１０．２ 脳卒中ラットモデルに対する３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの脳梗塞部位の減少効果の検証
実施例１０．１にて製造した脳卒中ラットモデルを対象に、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの処理濃度を３×１０８、３０×１０８ＥＶｓ／ｒａｔとそれぞれ異に処理し、処理４週間後、ＭＲＩを撮影し、梗塞（ｉｎｆａｒｃｔ）が起こった部位の変化を測定した。対照群としては、ＰＢＳ処理群を用いており、測定した梗塞部位の変化を図１２に示した。
実施例１０．１にて製造した脳卒中ラットモデルを対象に、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの処理濃度を３×１０８、３０×１０８ＥＶｓ／ｒａｔとそれぞれ異に処理し、処理４週間後、ＭＲＩを撮影し、梗塞（ｉｎｆａｒｃｔ）が起こった部位の変化を測定した。対照群としては、ＰＢＳ処理群を用いており、測定した梗塞部位の変化を図１２に示した。
【0077】
図１２に示すように、対照群と比較し、３×１０８ＥＶｓ／ｒａｔ以上の濃度で処理した全ての実験群において、有意に梗塞部が減少したことが確認された。
【0078】
このような結果は、既存に知られた３Ｄ方式で製造したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞は、３０×１０８ＥＶｓ／ｒａｔの濃度以上で処理した場合に有意な程度の脳梗塞部位の減少効果を示すことを考慮すると、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、少ない量でも効果的に脳梗塞部位を減少させる効果を示すものであることが確認された。
【0079】
１０．３ 脳卒中ラットモデルに対する３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの神経学的行動回復能の検証
実施例１０．１にて製造した脳卒中ラットモデルを対象に、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの処理濃度を３×１０８、３０×１０８ＥＶｓ／ｒａｔとそれぞれ異にして処理し、ラダー歩行試験（ｌａｄｄｅｒ ｗａｌｋｉｎｇ ｔｅｓｔ）を行い、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの神経学的行動回復能を検証した。対照群としてＰＢＳ処理群を用いており、比較群として３×１０８ｃｅｌｌ／ｒａｔ濃度のヒト臍帯由来の間葉系幹細胞を使用した。
実施例１０．１にて製造した脳卒中ラットモデルを対象に、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの処理濃度を３×１０８、３０×１０８ＥＶｓ／ｒａｔとそれぞれ異にして処理し、ラダー歩行試験（ｌａｄｄｅｒ ｗａｌｋｉｎｇ ｔｅｓｔ）を行い、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの神経学的行動回復能を検証した。対照群としてＰＢＳ処理群を用いており、比較群として３×１０８ｃｅｌｌ／ｒａｔ濃度のヒト臍帯由来の間葉系幹細胞を使用した。
【0080】
具体的な、ラダー歩行試験方法は、次の通りである。中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡｏ）前と中大脳動脈閉塞後、４、７、１４および２８日目に実験条件を知らない一人の観察者によりラダー歩行試験を行った。実験のためのはしご装置は、動物が横切って歩く金属の水平はしごと透明な側壁からなる。足を踏み外す回数（フットフォールト）と総歩行回数を測定し、フットフォールトの割合（％ ｏｆ ｆｏｏｔ ｆａｕｌｔ）を算定し、算定したフットフォールトの割合を図１３に示した。
【0081】
図１３に示すように、中大脳動脈閉塞４日後に測定したラダー歩行試験の結果、３×１０８、３０×１０８ＥＶｓ／ｒａｔ濃度の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理群でのみ有意にフットフォールトの割合が対照群に比べて減少したことを確認し、特に、３０×１０８ＥＶｓ／ｒａｔ濃度の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理群は、全ての区間でフットフォールトの割合が減少したことが確認された。
【0082】
このような結果から間葉系幹細胞と比較し、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが神経学的行動回復を速やかに誘導することが確認された。このような結果は、既存に知られた３Ｄ方式で製造したスフェロイド型細胞凝集体に由来の細胞外小胞は、３０×１０８ＥＶｓ／ｒａｔの濃度以上で処理した場合に有意な程度の神経学的行動回復効果が示されるという事実と比較し、本発明の３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶは、少ない量でも効果的に神経学的行動回復を誘導することを示す結果である。
【0083】
実施例１１．３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの細胞混入能およびｍｉＲＮＡ伝達能の評価
１１．１ ３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの細胞混入能の評価
３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの細胞混入能を評価するため、ＣＦＳＥで標識した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶをヒトＮＳＣ細胞株（ＲｅＮｃｅｌｌｓ）に処理し、２４時間培養し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でこれを確認し、これを図１４に示した。
図１４に示すように、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを細胞に処理すると、細胞に混入して内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されることが確認された。
１１．１ ３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの細胞混入能の評価
３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶの細胞混入能を評価するため、ＣＦＳＥで標識した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶをヒトＮＳＣ細胞株（ＲｅＮｃｅｌｌｓ）に処理し、２４時間培養し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でこれを確認し、これを図１４に示した。
図１４に示すように、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを細胞に処理すると、細胞に混入して内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されることが確認された。
【0084】
１１．２ ３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶ処理によるｍｉＲＮＡ発現の評価
実施例１１．１にてＣＦＳＥで標識した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが処理されたヒトＮＳＣ細胞株（ＲｅＮｃｅｌｌｓ）において、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐの発現をＲＴ－ｑＰＣＲを用いて測定した。対照群として標識した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが処理されないヒトＮＳＣ細胞株（ＲｅＮｃｅｌｌｓ）を用いており、結果を図１５に示した。
実施例１１．１にてＣＦＳＥで標識した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが処理されたヒトＮＳＣ細胞株（ＲｅＮｃｅｌｌｓ）において、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐの発現をＲＴ－ｑＰＣＲを用いて測定した。対照群として標識した３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶが処理されないヒトＮＳＣ細胞株（ＲｅＮｃｅｌｌｓ）を用いており、結果を図１５に示した。
【0085】
図１５に示すように、対照群に比べて３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを処理した細胞において有意にｍｉＲ－２７ａ－３ｐの発現が増加したことが確認された。
【0086】
これを通じて、３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶを細胞に処理すると、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐのような３Ｄ－静的－スフェロイドＥＶで高発現する臨床的に有意に物質が細胞に効果的に伝達されることを確認した。
【0087】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に説明したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施形態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものではないことが明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義されると言われる。
【図1】
【図2-A】
【図2-B】
【図2-C】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
