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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-21
(45)【発行日】2024-11-29
(54)【発明の名称】抗クローディン１８．２抗体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241122BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20241122BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241122BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241122BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241122BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241122BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241122BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241122BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241122BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241122BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20241122BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C07K16/46
C12N15/13 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K39/395 L
A61P35/00
A61P35/02
G01N33/574 A
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2021557129
(86)(22)【出願日】2020-03-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-08
(86)【国際出願番号】 CN2020082369
(87)【国際公開番号】W WO2020200196
(87)【国際公開日】2020-10-08
【審査請求日】2023-03-15
(31)【優先権主張番号】201910257853.6
(32)【優先日】2019-04-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】510166892
【氏名又は名称】ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＨＥＮＧＲＵＩ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．
(73)【特許権者】
【識別番号】508209602
【氏名又は名称】シャンハイ ヘンルイ ファーマスーティカル カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100119530
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 和幸
(72)【発明者】
【氏名】ヤン ヤン
(72)【発明者】
【氏名】グォ フー
(72)【発明者】
【氏名】タオ ウェイカン
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５１３１４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５２８０７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／００６８８２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５１７４７６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ （ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗クローディン１８．２抗体であって、前記重鎖可変領域が、それぞれ配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号：１８、配列番号：１９及び配列番号：２０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
抗クローディン１８．２抗体。
【請求項2】
マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗クローディン１８．２抗体。
【請求項3】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１又は２に記載の抗クローディン１８．２抗体であって、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：５に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：５に対して少なくとも９０％の同一性を有し、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：６に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：６に対して少なくとも９０％の同一性を有し；又は、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：３１に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：３１に対して少なくとも９０％の同一性を有し、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：２８に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：２８に対して少なくとも９０％の同一性を有する、
抗クローディン１８．２抗体。
【請求項4】
ヒト抗体に由来するフレームワーク領域又はそのフレームワーク領域バリアントを含むヒト化抗体であり、前記フレームワーク領域バリアントが、ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域及び／又は重鎖フレームワーク領域に１～１０個の復帰変異を有する、請求項３に記載の抗クローディン１８．２抗体。
【請求項5】
請求項４に記載の抗クローディン１８．２抗体であって、前記フレームワーク領域バリアントが、前記軽鎖可変領域に含まれる４Ｌ及び２２Ｓからなる群より選択される１個又は複数個の復帰変異、並びに／若しくは、前記重鎖可変領域に含まれる３８Ｋ、４０Ｒ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９Ｌ、７１Ｌ及び７３Ｋからなる群より選択される１個又は複数個の復帰変異から選択される変異を含む、
抗クローディン１８．２抗体。
【請求項6】
以下に示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域：配列番号：５に示される重鎖可変領域配列及び配列番号：６に示される軽鎖可変領域配列；又は、
配列番号：３１、３２、３３若しくは３４に示される重鎖可変領域配列及び配列番号：２８、２９若しくは３０に示される軽鎖可変領域配列
を含む、請求項５に記載の抗クローディン１８．２抗体。
【請求項7】
請求項６に記載の抗クローディン１８．２抗体であって、前記抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合性フラグメントが、以下に示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域：
配列番号：３１に示される重鎖可変領域配列及び配列番号：２９に示される軽鎖可変領域配列
を含む、抗クローディン１８．２抗体。
【請求項8】
重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体であって、前記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４定常領域並びにこれらのバリアントからなる群より選択され、
前記軽鎖定常領域が、ヒト抗体κ鎖及びλ鎖定常領域並びにこれらのバリアントからなる群より選択される、
抗クローディン１８．２抗体。
【請求項9】
請求項８に記載の抗クローディン１８．２抗体であって、前記抗クローディン１８．２抗体が、配列番号：７に示される重鎖定常領域及び配列番号：８に示される軽鎖定常領域を含む、
抗クローディン１８．２抗体。
【請求項10】
配列番号：３７に示される重鎖及び配列番号：３８に示される軽鎖；又は、配列番号：４９、５０、５１若しくは５２に示される重鎖及び配列番号：４６、４７若しくは４８に示される軽鎖
を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体。
【請求項11】
配列番号：４９に示される重鎖及び配列番号：４７に示される軽鎖を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体をコードする、１個の核酸分子。
【請求項13】
請求項１２に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項14】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体を細胞傷害薬にコンジュゲート化することによって形成された、抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項15】
治療有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体又は請求項１４に記載の抗体－薬物コンジュゲートと、１種又は複数種の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、バッファー又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項16】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体を、被試験サンプルと接触させるステップを含む、クローディン１８．２のイムノアッセイ又は検出のための方法。
【請求項17】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗クローディン１８．２抗体を含む、キット。
【請求項18】
クローディン１８．２に関連する疾患の処置のための請求項１５に記載の医薬組成物であって、前記疾患が、腫瘍である、医薬組成物。
【請求項19】
前記疾患が、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、グリオーマ、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽腔がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝臓がん、肝細胞腫瘍、肝細胞がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、胃腸がん、腸がん、結腸がん、大腸がん、腎臓がん、淡明細胞型腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、メラノーマ、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、クルケンベルグ腫瘍、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんからなる群より選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項20】
前記リンパ腫が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群より選択され；前記肺がんが、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんからなる群より選択され；
前記白血病が、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄性白血病からなる群より選択される、
請求項１９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、その全体を参照により本明細書に組み込む、２０１９年４月１日に出願された中国特許出願第２０１９１０２５７８５３．６号の優先権を主張する。
【0002】
本開示は、抗体薬の分野に関する。特に、本開示は、クローディン１８．２抗体及びその用途に関する。
【背景技術】
【0003】
本明細書中の記載は、本開示に関する背景情報を提供するにすぎず、必ずしも従来技術を構成するとは限らない。
【0004】
クローィン１８（ＣＬＤＮ１８）は、ヒトクローディン１８遺伝子によってコードされるタンパク質であり、細胞内にあるタイトジャンクションタンパク質ファミリーに属する。クローディン１８は、細胞の層間での分子の流れを制御することができる。
【0005】
クローディン１８タンパク質は、４つの膜貫通領域及び２つの細胞外ループを構造内に含み、Ｎ末端及びＣ末端が細胞質の内部に存在するものである。クローディン１８は、クローディン１８．１及びクローディン１８．２という、２種のスプライシングバリアントを有する。これら２つの配列は、第１の細胞外ループ内にある８個のアミノ酸のみが異なる。クローディン１８．１は、クローディン１８．２とは異なる様式で発現及び分配される。クローディン１８．１は、正常な肺細胞内に選択的に発現するが、これに対してクローディン１８．２の発現は、正常な細胞内では非常に限定的であるが、様々な腫瘍（胃がん、肺がん、膵臓がん等）では、異所的に活性化され、過剰発現することが非常に多い。クローディン１８．２は、胃がん及び他の種類のがんを対象とする潜在的な治療標的として想定されている。この標的の発見により、胃がんを処置するための新たな選択肢も提供される。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、抗クローディン１８．２抗体を提供する。
【0007】
一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
ｉ）重鎖可変領域が、配列番号：３に示される重鎖可変領域中のものと同じＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列及びＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号：４に示される軽鎖可変領域中のものと同じＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含むか；又は、
ｉｉ）重鎖可変領域が、配列番号：５に示される重鎖可変領域中のものと同じＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列及びＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号：６に示される軽鎖可変領域中のものと同じＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む。一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域が、それぞれ配列番号：９、配列番号：１０及び配列番号：１１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、それぞれ番号：１２、配列番号：１３及び配列番号：１４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むか；又は、
ｉｖ）重鎖可変領域が、それぞれ配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、それぞれ番号：１８、配列番号：１９及び配列番号：２０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
ｉ）重鎖可変領域が、配列番号：３に示される重鎖可変領域中のものと同じＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列及びＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号：４に示される軽鎖可変領域中のものと同じＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含むか；又は、
ｉｉ）重鎖可変領域が、配列番号：５に示される重鎖可変領域中のものと同じＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列及びＨＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号：６に示される軽鎖可変領域中のものと同じＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含む。一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
ｉｉｉ）重鎖可変領域が、それぞれ配列番号：９、配列番号：１０及び配列番号：１１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、それぞれ番号：１２、配列番号：１３及び配列番号：１４に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むか；又は、
ｉｖ）重鎖可変領域が、それぞれ配列番号：１５、配列番号：１６及び配列番号：１７に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域が、それぞれ番号：１８、配列番号：１９及び配列番号：２０に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
【0008】
ｉ）、ｉｉ）、ａ）、ｂ）等の項目番号は、列記された技術的解決法又は要素をより明確にして、容易に識別されるものにするためのものにすぎず、いかなる点においても下記の技術的解決法又は要素を限定するものではないことは、当業者ならば理解すべきである。同じ項目番号が使用されている場合、これにより、次の技術的解決法又は要素が同じものであることが意味されるわけではない。
【0009】
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、抗クローディン１８．２抗体は、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。
【0010】
一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
（ｖ）重鎖可変領域が、配列番号：３若しくは２４に示される重鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：４若しくは２１に示される軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有するか；又は、
（ｖｉ）重鎖可変領域が、配列番号：５若しくは３１に示される重鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：６若しくは２８に示される軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する。
（ｖ）重鎖可変領域が、配列番号：３若しくは２４に示される重鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：４若しくは２１に示される軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有するか；又は、
（ｖｉ）重鎖可変領域が、配列番号：５若しくは３１に示される重鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有し、軽鎖可変領域が、配列番号：６若しくは２８に示される軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する。
【0011】
一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
（１）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：３に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：３に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：４に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：４に対して少なくとも９０％の同一性を有し；
（２）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：２４に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：２４に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：２１に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：２１に対して少なくとも９０％の同一性を有し；
（３）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：５に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：５に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：６に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：６に対して少なくとも９０％の同一性を有し；又は、
（４）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：３１に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：３１に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：２８に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：２８に対して少なくとも９０％の同一性を有する。
（１）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：３に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：３に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：４に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：４に対して少なくとも９０％の同一性を有し；
（２）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：２４に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：２４に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：２１に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：２１に対して少なくとも９０％の同一性を有し；
（３）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：５に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：５に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：６に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：６に対して少なくとも９０％の同一性を有し；又は、
（４）重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：３１に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：３１に対して少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：２８に示されるとおりであるか、若しくは配列番号：２８に対して少なくとも９０％の同一性を有する。
【0012】
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、抗クローディン１８．２抗体は、ヒト化抗体であり、ヒト化抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域又はそのフレームワーク領域バリアントに由来するフレームワーク領域を含み、フレームワーク領域バリアントは、ヒト抗体軽鎖フレームワーク領域及び／又は重鎖フレームワーク領域のそれぞれに最大１０個の復帰変異を有する。
【0013】
一部の実施形態において、ヒト抗体重鎖フレームワーク領域は、アミノ酸配列番号：２４に示される重鎖可変領域のフレームワーク領域と同じであり、若しくはヒト抗体軽鎖可変領域は、アミノ酸配列番号：２１に示される軽鎖可変領域のフレームワーク領域と同じであり；又は、ヒト抗体重鎖フレームワーク領域は、アミノ酸配列番号：３１に示される重鎖可変領域のフレームワーク領域と同じであり、若しくはヒト抗体軽鎖可変領域は、アミノ酸配列番号：２８に示される軽鎖可変領域のフレームワーク領域と同じである。
【0014】
一部の実施形態において、好ましくは、フレームワーク領域バリアントは、下記（ａ）又は（ｂ）から選択される変異を含む：
（ａ）軽鎖可変領域に含まれる２２Ｓ、８５Ｉ若しくは８７Ｈのうちの１個又は複数個のアミノ酸復帰変異、並びに／若しくは、重鎖可変領域に含まれる４８Ｉ、８２Ｔ及び６９Ｍからなる群より選択される１個又は複数個の復帰変異；又は、
（ｂ）軽鎖可変領域に含まれる４Ｌ及び２２Ｓからなる群より選択される１個又は複数個のアミノ酸復帰変異、並びに／若しくは、重鎖可変領域に含まれる３８Ｋ、４０Ｒ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９、７１Ｌ及び７３Ｋからなる群より選択される１個又は複数個の復帰変異。
（ａ）軽鎖可変領域に含まれる２２Ｓ、８５Ｉ若しくは８７Ｈのうちの１個又は複数個のアミノ酸復帰変異、並びに／若しくは、重鎖可変領域に含まれる４８Ｉ、８２Ｔ及び６９Ｍからなる群より選択される１個又は複数個の復帰変異；又は、
（ｂ）軽鎖可変領域に含まれる４Ｌ及び２２Ｓからなる群より選択される１個又は複数個のアミノ酸復帰変異、並びに／若しくは、重鎖可変領域に含まれる３８Ｋ、４０Ｒ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、６９、７１Ｌ及び７３Ｋからなる群より選択される１個又は複数個の復帰変異。
【0015】
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、フレームワーク領域バリアントは、下記（ａ－１）又は（ｂ－１）から選択される変異を含む：
（ａ－１）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸復帰変異２２Ｓ、８５Ｉ及び８７Ｈ、並びに重鎖可変領域に含まれるアミノ酸復帰変異４８Ｉ及び８２Ｔ；又は、
（ｂ－１）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸復帰変異４Ｌ。
（ａ－１）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸復帰変異２２Ｓ、８５Ｉ及び８７Ｈ、並びに重鎖可変領域に含まれるアミノ酸復帰変異４８Ｉ及び８２Ｔ；又は、
（ｂ－１）軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸復帰変異４Ｌ。
【0016】
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、
（ｖｉｉ）重鎖可変領域配列が、配列番号：３示されたとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：４に示されるとおりであり；又は、
（ｖｉｉｉ）重鎖可変領域配列が、配列番号：２４、２５、２６若しくは２７に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：２１、２２若しくは２３に示されるとおりであり；又は、
（ｉｘ）重鎖可変領域配列が、配列番号：５に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：６に示されるとおりであり；又は、
（ｘ）重鎖可変領域配列が、配列番号：３１、３２、３３若しくは３４に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：２８、２９若しくは３０に示されるとおりである。
（ｖｉｉ）重鎖可変領域配列が、配列番号：３示されたとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：４に示されるとおりであり；又は、
（ｖｉｉｉ）重鎖可変領域配列が、配列番号：２４、２５、２６若しくは２７に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：２１、２２若しくは２３に示されるとおりであり；又は、
（ｉｘ）重鎖可変領域配列が、配列番号：５に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：６に示されるとおりであり；又は、
（ｘ）重鎖可変領域配列が、配列番号：３１、３２、３３若しくは３４に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列が、配列番号：２８、２９若しくは３０に示されるとおりである。
【0017】
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合性フラグメントは、以下に示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む：
（ｘｉ）配列番号：３１に示される重鎖可変領域配列及び配列番号：２９に示される軽鎖可変領域配列；又は、
（ｘｉｉ）配列番号：２６に示される重鎖可変領域配列及び配列番号：２３に示される軽鎖可変領域配列。
（ｘｉ）配列番号：３１に示される重鎖可変領域配列及び配列番号：２９に示される軽鎖可変領域配列；又は、
（ｘｉｉ）配列番号：２６に示される重鎖可変領域配列及び配列番号：２３に示される軽鎖可変領域配列。
【0018】
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、以下の表に示される軽鎖可変領域と重鎖可変領域との組合せであってもよい。
【0019】
【表1】
【0020】
【表2】
【0021】
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、抗体は、抗体定常領域をさらに含む。一部の特定の実施形態において、抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４定常領域並びにこれらのバリアントからなる群より選択され、抗体の軽鎖定常領域は、ヒト抗体κ、λ鎖定常領域及びこれらのバリアントからなる群より選択される。一部の特定の実施形態において、抗体は、配列番号：７に示される重鎖定常領域配列及び配列番号：８に示される軽鎖定常領域配列。一部の特定の実施形態において、抗体は、配列番号：３５若しくは４２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する重鎖、及び配列番号：３６若しくは３９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する軽鎖；又は、
配列番号：３７若しくは４９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する重鎖、及び／若しくは配列番号：３８若しくは４６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する軽鎖
を含む。
配列番号：３７若しくは４９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する重鎖、及び／若しくは配列番号：３８若しくは４６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する軽鎖
を含む。
【0022】
一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、
（ｃ）配列番号：３５に示される重鎖及び／若しくは配列番号：３６に示される軽鎖；
（ｄ）配列番号：４２、４３、４４若しくは４５に示される重鎖、及び／若しくは配列番号：３９、４０若しくは４１に示される軽鎖；
（ｅ）配列番号：３７に示される重鎖及び／若しくは配列番号：３８に示される軽鎖；又は、
（ｆ）配列番号：４９、５０、５１若しくは５２に示される重鎖、及び／若しくは配列番号：４６、４７若しくは４８に示される軽鎖
を含む。
（ｃ）配列番号：３５に示される重鎖及び／若しくは配列番号：３６に示される軽鎖；
（ｄ）配列番号：４２、４３、４４若しくは４５に示される重鎖、及び／若しくは配列番号：３９、４０若しくは４１に示される軽鎖；
（ｅ）配列番号：３７に示される重鎖及び／若しくは配列番号：３８に示される軽鎖；又は、
（ｆ）配列番号：４９、５０、５１若しくは５２に示される重鎖、及び／若しくは配列番号：４６、４７若しくは４８に示される軽鎖
を含む。
【0023】
上記抗クローディン１８．２抗体の一部の実施形態において、抗体は、上記抗クローディン１８．２抗体又はその抗原結合性フラグメントと競合して、ヒトクローディン１８．２に結合する。
【0024】
一部の実施形態において、上記抗クローディン１８．２抗体は、
アミノ酸配列番号：４４に示される重鎖及び配列番号：４１に示される軽鎖；又は、
アミノ酸配列番号：４９に示される重鎖及び配列番号：４７に示される軽鎖
を含む。
アミノ酸配列番号：４４に示される重鎖及び配列番号：４１に示される軽鎖；又は、
アミノ酸配列番号：４９に示される重鎖及び配列番号：４７に示される軽鎖
を含む。
【0025】
本開示の別の態様は、上記抗クローディン１８．２抗体をコードする核酸分子も提供する。
【0026】
本開示の別の態様は、上記核酸分子を含む発現ベクターも提供する。
【0027】
本開示の別の態様は、上記核酸分子又は上記発現ベクターを含む、宿主細胞であって、好ましくは、細菌細胞、真菌細胞、昆虫動物細胞又はほ乳類細胞である、宿主細胞も提供する。
【0028】
本開示の別の態様は、上記抗クローディン１８．２抗体を細胞傷害薬にコンジュゲート化することによって形成された、抗体－薬物コンジュゲートも提供する。
【0029】
本開示の別の態様は、細胞傷害薬に共有結合した上記抗クローディン１８．２抗体を含み、又はからなる、抗体－薬物コンジュゲートも提供する。
【0030】
一部の実施形態において、本開示は、上記抗クローディン１８．２抗体を調製するための方法を提供する。
【0031】
一部の実施形態において、本開示は、上記抗クローディン１８．２抗体－薬物コンジュゲートを調製するための方法を提供する。
【0032】
一部の実施形態において、本開示は、治療有効量の上記抗クローディン１８．２抗体又は上記核酸分子又は上記抗体－薬物コンジュゲートと、１種又は複数種の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、バッファー又は賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【0033】
一部の実施形態において、本開示は、上記抗クローディン１８．２抗体を、被試験サンプルと接触させるステップを含む、クローディン１８．２のイムノアッセイ又は検出のための方法を提供する。
【0034】
一部の実施形態において、本開示は、ヒトクローディン１８．２のイムノアッセイ用の試薬の調製のための、上記抗クローディン１８．２抗体の使用を提供する。
【0035】
一部の実施形態において、本開示は、クローディン１８．２のイムノアッセイ又は検出に使用するための、上記抗クローディン１８．２抗体を提供する。
【0036】
一部の実施形態において、本開示は、上記抗クローディン１８．２抗体を含む、キットを提供する。
【0037】
一部の実施形態において、本開示は、がん又は腫瘍を処置する医薬の調製のための、上記抗クローディン１８．２抗体又は上記核酸分子又は上記抗体－薬物コンジュゲート又は上記医薬組成物の使用であって、がん又は腫瘍が、好ましくは、クローディン１８．２陽性のがん又は悪性腫瘍であり、より好ましくは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、グリオーマ、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽腔がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝臓がん、肝細胞腫瘍、肝細胞がん、肝胆がん（ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓がん、胃がん、胃腸がん、腸がん、結腸がん、大腸がん、腎臓がん、淡明細胞型腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、メラノーマ、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんであり；リンパ腫が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群より選択され；肺がんが、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんからなる群より選択され；白血病が、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄性白血病からなる群より選択される、使用を提供する。
【0038】
一部の実施形態において、本開示は、治療有効量の上記抗クローディン１８．２抗体又は上記核酸分子又は上記抗体－薬物コンジュゲート又は上記医薬組成物を対象に投与することを含む、クローディン１８．２に関連する疾患を処置する方法であって、疾患が、好ましくは、がん又は腫瘍であり、より好ましくは、クローディン１８．２陽性のがん又は悪性腫瘍であり、より好ましくは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、グリオーマ、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽腔がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝臓がん、肝細胞腫瘍、肝細胞がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、胃腸がん、腸がん、結腸がん、大腸がん、腎臓がん、淡明細胞型腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、メラノーマ、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんからなる群より選択される、方法を提供する。より好ましくは、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群より選択され；肺がんは、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんからなる群より選択され；白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄性白血病からなる群より選択される。
【0039】
一部の実施形態において、治療有効量は、組成物の単位用量に含まれる上記抗クローディン１８．２抗体又は上記抗体－薬物コンジュゲート０．１ｍｇ～３０００ｍｇ又は１ｍｇ～１０００ｍｇを指す。
【0040】
一部の実施形態において、本開示は、クローディン１８．２に関連する疾患の処置に使用するための、上記抗クローディン１８．２抗体又は上記核酸分子又は上記抗体－薬物コンジュゲート又は上記医薬組成物であって、疾患が、好ましくは、がん又は腫瘍であり、より好ましくは、クローディン１８．２陽性のがん又は悪性腫瘍であり、より好ましくは、頭頸部扁平上皮がん、頭頸部がん、脳がん、グリオーマ、多形性膠芽腫、神経芽細胞腫、中枢神経系がん、神経内分泌腫瘍、咽頭がん、鼻咽腔がん、食道がん、甲状腺がん、悪性胸膜中皮腫、肺がん、乳がん、肝臓がん、肝細胞腫瘍、肝細胞がん、肝胆がん、膵臓がん、胃がん、胃腸がん、腸がん、結腸がん、大腸がん、腎臓がん、淡明細胞型腎細胞がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、皮膚がん、メラノーマ、白血病、リンパ腫、骨がん、軟骨肉腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、扁平上皮がん、ユーイング肉腫、全身性軽鎖アミロイドーシス及びメルケル細胞がんからなる群より選択される、上記抗クローディン１８．２抗体又は上記核酸分子又は上記抗体－薬物コンジュゲート又は上記医薬組成物を提供する。より好ましくは、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びリンパ形質細胞性リンパ腫からなる群より選択され；肺がんは、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんからなる群より選択され；白血病は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性白血病、リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び骨髄性白血病からなる群より選択される。
【0041】
一部の実施形態において、がんは、胃がん、食道がん、肺がん又は膵臓がんである。
【0042】
一部の実施形態において、抗体又は抗体－薬物コンジュゲートは、上記のように、上記クローディン１８．２が高発現、中発現及び低発現しているがんに治療効果を及ぼすことができる。
【0043】
本開示において提供されたクローディン１８．２抗体及び抗体－薬物コンジュゲートは、細胞表面抗原に対する優れたアフィニティ、好ましいエンドサイトーシス効率、有力な腫瘍阻害効率、及びより広範な薬学的応用範囲を有し、医薬として臨床で使用するのに適している。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【発明を実施するための形態】
【0045】
用語
本開示をより容易に理解するために、下記において、特定の専門用語及び科学技術用語が厳密に規定されている。そうではないと本明細書において明示的に規定されていない限り、本明細書において使用されている他のすべての専門用語及び科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
本開示をより容易に理解するために、下記において、特定の専門用語及び科学技術用語が厳密に規定されている。そうではないと本明細書において明示的に規定されていない限り、本明細書において使用されている他のすべての専門用語及び科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【0046】
本開示において使用されているアミノ酸に関する３文字のコード及び１文字のコードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）で説明されている。
【0047】
「細胞傷害薬」という用語は、細胞の機能を阻害若しくは阻止し、及び／又は細胞死又は細胞破壊を起こす物質を指す。細胞傷害薬は、毒素及び化学療法薬等、細胞を死滅させるために使用することができる、化合物を含む。
【0048】
「毒素」という用語は、細胞の成長又は増殖を可能にする、任意の物質を指すが、このような物質は、細菌、真菌、植物又は動物に由来の低分子毒素及びその誘導体であってよく、エキサテカン等のカンプトテシン誘導体、マイタンシノイド及びＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４等のマイタンシノイド誘導体（ＣＮ１０１５７３３８４）、オーリスタチンＦ（Ｏｒｌｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）（ＡＦ）及びＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、３０２４等のオーリスタチンＦ誘導体（ＷＯ２０１６／１２７７９０Ａ１、化合物７）、ジフテリア毒素、外毒素、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン、α－サルシン、アレウチテス・フォルディ（Ａｌｅｕｔｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）毒性タンパク質、ジアンチン毒性タンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）毒性タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・カランティア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。
【0049】
「化学療法薬」という用語は、腫瘍の処置のために使用することができる、化合物である。このような規定は、がんの増殖を促進し得るホルモン作用を調節、低減、遮断又は阻害することが可能であり、一般には、全身的な方式又は全身療法の方式におけるものである、抗ホルモン剤も含む。化学療法薬自体がホルモンであってもよい。化学療法薬の例には、チオテパ等のアルキル化剤；シクロスファミド（シトキサン（商標））；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン等のアルキルスルホネート；ベナオドーパ（ｂｅｎａｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含むアジリジン及びメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミノキシド（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｏｘｉｄｅ）等のニトロゲンマスタード；メルファラン、ノブエンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラムスチン；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン等のニトロソ尿素；クラリスロマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、クロモマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキシ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン等の抗生物質；ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、５－ＦＵ等の代謝拮抗物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート等の葉酸アナログ；フルダラビン、６－メルカプトプテリン、チオメトプテリン、チオグアノプテリン（ｔｈｉｏｇｕａｎｏｐｔｅｒｉｎ）等のメトトレキサートアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６－アズリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フルオロウリジン、５－ＦＵ等のピリミジンアナログ；カルステロン、ドロモスタノロングプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗アドレナリン剤；フォリン酸等の葉酸サプリメント；グルクロン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；コルチシン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォミチン（ｅｌｆｏｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセテート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ピントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；アルテルナリア・テナース（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓ）ケト酸；トリイミンキノン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンブラスチンアミド；ダカルバジン；マンニトールマスタード；ミトブロニトール；ジブロモニシキギアルコール（ｄｉｂｒｏｍｏ ｅｕｏｎｙｍｕｓ ａｌｃｏｈｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、フランス）等のタキサン；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチン等の白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イフォスフェート（ｉｆｏｓｐｈａｔｅ）；ミトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノルビシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸エスペラミシン；カペシタビン；並びに、上記物質のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体が挙げられる。上記規定は、腫瘍に対するホルモンの効果を調節又は阻害することができる、抗ホルモン剤も含む。例えば、抗エストロゲンは、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシルタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；並びに、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド及びゴセレリン等の抗アンドロゲン；並びに、上記物質のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を含む。
【0050】
本明細書において使用されているとき、「抗体」は、免疫グロブリンを指し、完全な抗体は、鎖間ジスルフィド結合によって２本の同一の軽鎖に連結された２本の同一の重鎖によって形成された、４本のペプチド鎖からなる構造である。免疫グロブリン重鎖定常領域は、異なるアミノ酸の組成及び配置を示すため、異なる抗原性を示す。したがって、免疫グロブリンは、５種類に分類することができ、又は、免疫グロブリンアイソタイプ、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと呼ばれることもあり、対応する重鎖は、それぞれμ、δ、γ、α及びεである。ヒンジ領域のアミノ酸組成、並びに重鎖ジスルフィド結合の化造及び場所に応じて、同じ種類のＩｇは、異なるサブタイプにさらに分類することができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、異なる定常領域に基づいて、κ鎖又はλ鎖に分類することができる。５種類のＩｇのそれぞれが、κ鎖又はλ鎖を有し得る。
【0051】
抗体重鎖及び軽鎖のＮ末端に隣接する約１１０個のアミノ酸配列は可変性が高く、可変領域（Ｆｖ領域）として知られており；Ｃ末端に近いアミノ酸配列の残り部分は比較的安定であり、定常領域として知られている。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、比較的保存的な配列を有する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても公知である。各軽鎖可変領域（ＶＬ）及び各重鎖可変領域（ＶＨ）は、３つのＣＤＲ領域及び４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端までの順番は、次のとおりである：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。
【0052】
本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を含む。
【0053】
本明細書において使用されているとき、「マウス抗体」という用語は、当技術分野における知識及び技能に従って調製された、抗ヒトクローディン１８．２モノクローナル抗体を指す。その調製においては、クローディン１８．２又はそのエピトープを抗原として試験対象に注射し、その後、所望の配列又は機能的特徴を有する抗体を発現させるハイブリドーマを単離する。本開示の好ましい一実施形態において、マウスクローディン１８．２抗体又はその抗原結合性フラグメントは、マウスκ鎖、λ鎖又はこれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含み、又は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はこれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含む。
【0054】
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域と、ヒト抗体の定常領域とを融合させることによって得られた抗体であり、このような抗体は、マウス抗体によって誘導される免疫反応を緩和することができる。キメラ抗体を樹立するために、最初に、特異的マウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを樹立し、マウスハイブリドーマから可変領域遺伝子をクローニングする。その後には、必要に応じて、ヒト抗体から定常領域遺伝子をクローニング化する。マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子に連結して、キメラ遺伝子を形成するが、このキメラ遺伝子は、続いて、発現ベクターに挿入することができる。最後に、キメラ抗体分子を、真核生物系又は原核生物系中で発現させる。本開示の好ましい一実施形態において、キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ鎖、λ鎖又はこれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含む。クローディン１８．２キメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はこれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含み、又は、アミノ酸変異（Ｌ２３４Ａ変異及び／又はＬ２３５Ａ変異及び／又はＳ２２８Ｐ変異等）があるＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む。
【0055】
ＣＤＲグラフト化抗体としても知られる「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体可変領域フレームワークへの非ヒトＣＤＲ配列のグラフト化によって生成された抗体、すなわち、異なる種類のヒト生殖細胞系列抗体フレームワーク配列において生成された抗体を指す。ヒト化抗体は、多数の異種タンパク質成分を有するキメラ抗体によって誘導される、異種反応を回避することができる。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を収載した公開ＤＮＡデータベース又は公開されている参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖可変領域及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能）で確認することもできるし、さらには、Ｋａｂａｔ，ＥＡら １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版で確認することもできる。免疫原性の低下によって起きる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域中のフレームワーク配列には、活性を維持するように最小限の逆変異（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は復帰変異を発生させてもよい。本開示のヒト化抗体は、酵母ディスプレイによってＣＤＲアフィニティ成熟が実施された、ヒト化抗体も指す。
【0056】
本開示の一実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ヒト若しくはマウスκ鎖、λ鎖若しくはこれらのバリアントに由来する軽鎖定常領域をさらに含み、又は、ヒト若しくはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４若しくはこれらのバリアントに由来する重鎖定常領域をさらに含み；好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４に由来する重鎖定常領域を含み、又は、アミノ酸変異（Ｌ２３４Ａ変異及び／又はＬ２３５Ａ変異及び／又はＳ２２８Ｐ変異等）があるＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４バリアントを含む。
【0057】
本明細書において記載されているとき、ヒト抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域の「バリアント」は、抗体可変領域の構造及び機能の変更がない、従来技術において開示された重鎖又は軽鎖定常領域バリアントを指す。例示的なバリアントには、重鎖定常領域に対する部位特異的な改変及びアミノ酸置換によって得られた、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域バリアントが挙げられる。特異的置換は例えば、ＹＴＥ変異、Ｌ２３４Ａ及び／若しくはＬ２３５Ａ変異、Ｓ２２８Ｐ変異、並びに／又は、ノブ・イントゥ・ホール構造（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）（これにより、抗体重鎖は、ノブ型Ｆｃとホール型Ｆｃとの組合せを有する。）を生じさせる変異である。これらの変異は、抗体可変領域の機能を変更することなく、新たな特性を抗体に付与することが実証されている。
【0058】
「ヒト抗体（ＨｕＭＡｂ）」、「ヒトに由来する抗体」、「完全ヒト抗体」及び「完全ヒト型抗体」は、互換的に使用されており、ヒトに由来する抗体であってもよいし、又は、抗原刺激に反応して特異的なヒト抗体を生成することが当技術分野において知られた任意の方法によって「改変」された遺伝子組換え生物から得られた抗体であってもよい。一部の技術においては、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の要素が、胚性幹細胞株に由来する細胞株に導入されるが、この場合、内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座の破壊が目的とされている。トランスジェニック生物は、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することが可能であり、トランスジェニック生物を使用して、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生することができる。ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖が、１種以上のヒトＤＮＡ供給源に由来するヌクレオチド配列によってコードされるような抗体であってもよい。完全ヒト抗体は、遺伝子若しくは染色体トランスフェクション法及びファージディスプレイ技術によって構築することもできるし、又は、インビトロで活性化されたＢ細胞から構築することもできるが、これらはすべて、当技術分野において公知である。
【0059】
「完全長抗体」、「完全抗体」、「全抗体」及び「完全な抗体」という用語は、本明細書においては互換的に使用されており、下記に規定された抗原結合性フラグメントとは区別される、実質的に完全な形態の抗体を指す。前述の用語は厳密には、軽鎖及び重鎖中に定常領域を含む抗体を指す。本開示の「抗体」は、「完全長抗体」及びその抗原結合性フラグメントを含む。
【0060】
一部の実施形態において、本開示の完全長抗体は、以下の表の軽鎖と重鎖との組合せに示されているように、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域とを連結し、重鎖可変領域と重鎖定常領域とを連結することによって形成された、完全長抗体を含む。当業者は、実際の必要性に応じて、様々な抗体供給源から、ヒト抗体由来の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域等の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域を選択することができる。
【0061】
「抗原結合性フラグメント」又は「機能的フラグメント」という用語は、抗原（例えば、クローディン１８．２）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１種以上のフラグメントを指す。完全長抗体のフラグメントを使用して、抗原結合機能を獲得できることが示されてきた。抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に含まれる結合性フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域中のジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂフラグメントによって形成された二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のアームのうちの１つに属するＶＨ及びＶＬドメインから構成されるＦｖフラグメント；（ｖ）鎖間ジスルフィド結合を介してＶＨ及びＶＬによって形成された抗原結合性フラグメントである、ｄｓＦｖ；並びに、（ｖｉ）ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ及びＦａｂ等のフラグメントを含有する二重特異性抗体、二特異性抗体及び多特異性抗体が挙げられる。さらに、ＦｖフラグメントのＶＬドメイン及びＶＨドメインは、ＶＬドメインとＶＨドメインとの対合によって形成された一価分子である単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる。例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２６；及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ８５：５８７９～５８８３を参照されたい。）を生成するように、合成リンカーによって連結されている。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に含まれる。このような抗体フラグメントは、当技術分野において知られた慣用的な技法を用いて得られるが、インタクト抗体の場合と同じ方法を用いることにより、機能的フラグメントについてスクリーニングされる。抗原結合性部分は、組換えＤＮＡ技術又はインタクト免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的破壊によって生成することができる。抗体は、異なるアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体の形態であり得る。
【0062】
Ｆａｂは、パパインと同じ活性を有する酵素によってＩｇＧ抗体分子を処理することによって得られた抗原結合活性を有する、抗体フラグメントである。
【0063】
Ｆ（ａｂ’）２は、ペプシンと同じ活性を有する酵素によってＩｇＧを消化することによって得られた抗原結合活性を有する、抗体フラグメントである。
【0064】
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２を切断することによって得られた抗原結合活性を有する、抗体フラグメントである。
【0065】
さらに、Ｆａｂ’は、Ｆａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、ベクターを宿主に導入することによって、生成することができる。
【0066】
「一本鎖抗体」、「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって抗体軽鎖可変ドメイン（又は領域；ＶＬ）に連結された抗体重鎖可変ドメイン（又は領域；ＶＨ）を含む、分子を指す。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨの一般構造を有する。本開示において使用され得る他のリンカーは、限定されるわけではないが、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４～６４４８；Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５～７３１；Ｃｈｏｉら（２００１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４～１０６；Ｈｕら（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５～３０６１；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１～５６及びＲｏｏｖｅｒｓら（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ等の文献によって説明されている。
【0067】
二重特異性抗体は、ｓｃＦｖ又はＦａｂがダイマー化された抗体フラグメントであり、二価抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。これらの２種の抗原は、二価抗原結合活性が同じであってもよいし、又は異なってもよい。
【0068】
二特異性抗体及び多特異性抗体は、２個以上の抗原又は抗原決定基に結合することができる抗体を指す。
【0069】
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬのそれぞれの中にある１個のアミノ酸残基を、システイン残基によって置換し、次いで、置換されたポリペプチドを、２個のシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結することによって得られる。システイン残基によって置換すべきアミノ酸残基は、公知の方法（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、６９７（１９９４））による抗体の三次元構造予測に基づいて選択することができる。
【0070】
「アミノ酸の差異」又は「アミノ酸変異」という用語は、元々のタンパク質又はポリペプチドに比較した、タンパク質バリアント又はポリペプチドバリアント中におけるアミノ酸の変化又は変異を指し、元々のタンパク質又はポリペプチドを基準にした１つ、２つ又は３つ以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を含む。
【0071】
「抗体フレームワーク」又は「ＦＲ領域」という用語は、この可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のための足場として機能する、ＶＬ又はＶＨである可変ドメインの一部を指す。本質的には、「抗体フレームワーク」又は「ＦＲ領域」は、ＣＤＲを有さない可変ドメインである。
【0072】
「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」又は「超可変領域」という用語は、抗原結合の主因となる抗体可変ドメイン中に存在する６つの超可変領域のうちの１つを指す。一般に、各重鎖可変領域中には３種のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、各軽鎖可変領域中には３種のＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲのアミノ酸配列境界は、様々な周知のスキームのいずれかによって決定することが可能であり、「Ｋａｂａｔ」式ナンバリング基準（Ｋａｂａｔら（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤを参照されたい。）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」式ナンバリング基準（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、（１９９７）ＪＭＢ ２７３：９２７～９４８を参照されたい。）及びＩｍｍｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ナンバリング基準（Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７、１３２～１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，ＭＰ等、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７、５５～７７（２００３））等が挙げられる。例えば、古典的なフォーマットに関しては、Ｋａｂａｔ式基準に従った場合、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、３１～３５番（ＨＣＤＲ１）、５０～６５番（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２番（ＨＣＤＲ３）として付番されており；軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、２４～３４番（ＬＣＤＲ１）、５０～５６番（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７番（ＬＣＤＲ３）として付番されている。Ｃｈｏｔｈｉａ式基準に従った場合、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸残基は、２６～３２番（ＨＣＤＲ１）、５２～５６番（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２番（ＨＣＤＲ３）；ＶＬ中のアミノ酸残基は、２６～３２番（ＬＣＤＲ１）、５０～５２番（ＬＣＤＲ２）及び９１～９６番（ＬＣＤＲ３）として付番されている。Ｋａｂａｔ式とＣｈｏｔｈｉａ式との両方を組み合わせて、ＣＤＲを規定することにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨ中のアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬ中のアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）とから構成される。ＩＭＧＴ基準に従った場合、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸残基は、２６～３５番（ＣＤＲ１）、５１～５７番（ＣＤＲ２）及び９３～１０２番（ＣＤＲ３）として概ね付番されており、ＶＬ中のＣＤＲアミノ酸残基は、２７～３２番（ＣＤＲ１）、５０～５２番（ＣＤＲ２）及び８９～９７番（ＣＤＲ３）として概ね付番されている。ＩＭＧＴ式基準に従った場合、抗体のＣＤＲ領域は、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎ Ｐｒｏｇｒａｍによって決定することができる。
【0073】
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリン又は抗体が結合する抗原上の部位（例えば、クローディン１８．２分子上にある特定の部位）を指す。エピトープは、一般的に、一意な三次構造の少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個の隣接する又は隣接しないアミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６）を参照されたい。
【0074】
「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、「選択的結合」又は「特異的結合」という用語は、抗原上にある所定のエピトープへの抗体の結合を指す。一般的に、抗体は、約１０－８Ｍ未満、例えば、約１０－９Ｍ未満、１０－１０Ｍ未満、１０－１１Ｍ未満、１０－１２Ｍ未満又はより低いアフィニティ（ＫＤ）によって結合する。
【0075】
「ＫＤ」という用語は、特定の抗体と抗原との相互作用に関する解離平衡定数を指す。一般に、本開示の抗体は、約１０－７Ｍ未満、例えば、約１０－８Ｍ未満又は１０－９Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）により、クローディン１８．２又はそのエピトープに結合し、例えば、細胞表面抗原に対する本開示の抗体のアフィニティは、ＦＡＣＳ法によるＫＤ値の測定によって判定された。
【0076】
同じエピトープに関して競合する抗原結合性タンパク質との関連において「競合」という用語が使用されている場合、この「競合」という用語は、競合が抗原結合性タンパク質間で起きることを意味するが、このような競合は、被試験抗原結合性タンパク質（例えば、抗体又はその機能的フラグメント）が、共通抗原（例えば、クローディン１８．２抗原又はそのフラグメント）への参照用抗原結合性タンパク質（例えば、リガンド又は参照用抗体）の特異的結合を阻止又は阻害（例えば、低減）する、アッセイによって判定される。ある抗原結合性タンパク質が別の抗原結合性タンパク質と競合するかどうかを判定するためには、数多くの種類の競合的結合アッセイが利用可能である。これらのアッセイは、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、競合サンドイッチアッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉら、１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２～２５３を参照されたい。）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄら、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４～３６１９を参照されたい。）、固相調節標識アッセイ、固相調節標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。）；Ｉ－１２５標識を用いる固相調節標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌら、１９８８、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７～１５を参照されたい。）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇら、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６～５５２を参照されたい。）；及び調節標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、１９９０、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７～８２）である。一般的に、アッセイは、無標識の試験用抗原結合性タンパク質と、標識された参照用抗原結合性タンパク質との両方を担持した固体表面又は細胞に結合することができる、精製された抗原の使用を伴う。競合的阻害は、試験用抗原結合性タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を測定することによって決定される。通常、試験用抗原結合性タンパク質は、過剰に存在する。競合アッセイ（抗原結合性タンパク質と競合する）によって同定される抗原結合性タンパク質は、参照用抗原結合性タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合性タンパク質；及び、参照用抗原結合性タンパク質が結合するエピトープに十分に近いものであるエピトープに結合する抗原結合性タンパク質を含み、これらの２種のエピトープが互いに対して空間的に干渉して、結合を妨害する。競合的結合を判定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書中の実施例において提供されている。一般的に、競合する抗原結合性タンパク質が過剰に存在する場合、これにより、共通抗原への参照用抗原結合性タンパク質の特異的結合の少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％又は７５％以上を阻害（例えば、低減）する。場合によっては、前述の結合は、少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％又は９７％以上阻害される。
【0077】
本明細書において使用されているとき、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、一本鎖であってもよいし、又は二本鎖であってもよく、好ましくは、二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ｍＲＮＡ若しくは修飾ｍＲＮＡである。核酸は、別の核酸配列との間に機能的関係があるように配置されている場合、「機能可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に機能可能に連結されている。
【0078】
アミノ酸配列の「同一性」は、最大の配列同一性の百分率を与えるようにアミノ酸配列がアラインメントされた（必要に応じてギャップも導入する）ときの、第１の配列と第２の配列との間で同一であるアミノ酸残基の百分率を指し、いかなる保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）も、配列同一性の一部として考えない。アミノ酸配列同一性の百分率を決定するために、アラインメントは、当技術分野の範囲に含まれる様々な方法によって達成することが可能であり、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントの測定に適したパラメータを決定することができる。
【0079】
「発現ベクター」という用語は、自身が連結している別の核酸の輸送を可能にする、核酸分子を指す。一実施形態において、ベクターは「プラスミド」であるが、「プラスミド」は、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションすることもできる、円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の実施形態において、ベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされていてもよい、ウイルスベクターである。本明細書において開示されたベクターは、このベクターが導入された宿主細胞（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーマル型ほ乳類ベクター）内で自己複製することでき、又は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るが、これにより、宿主ゲノム（例えば、非エピソーマル型ほ乳類ベクター）と一緒に複製される。
【0080】
抗体及び抗原結合性フラグメントを生成及び精製するための方法は、当技術分野、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第５～８章及び第１５章において周知である。例えば、マウスは、ヒトクローディン１８．２又はそのフラグメントによって免疫化することが可能であり、得られた抗体は後で、当技術分野において周知の慣用的な方法によって復元、精製及びアミノ酸配列のシーケンシングを行うことができる。抗原結合性フラグメントは、慣用的な方法によって調製することもできる。本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントは、非ヒト抗体に由来するＣＤＲ領域に１つ以上のヒトフレームワーク領域を組み込むように改変されている。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ経由でＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）から得ることもできるし、又は、ＭＯＥソフトウェアを使用して、ＩＭＧＴヒト抗体可変生殖細胞系列遺伝子データベースに突き合わせてアラインメントすることにより、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ、２００１、ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１から得ることもできる。
【0081】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、細菌細胞、微生物細胞、植物細胞又は動物細胞を含み得る。トランスフォーメーションしやすい細菌には、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株又はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株等の腸内細菌のメンバー；バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）。適切な微生物には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。適切な動物宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、２９３細胞及びＮＳ０細胞が挙げられる。
【0082】
本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントは、慣用的な方法によって調製及び精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、発現ベクター内に組み換えることもできる。組換え免疫グロブリンの発現ベクターは、宿主細胞内に安定的にトランスフェクションすることができる。より推奨される一従来技術として、ほ乳類発現系により、抗体を、特に、Ｆｃ領域に属する高度に保存されたＮ末端位をグリコシル化することができる。安定なクローンは、ヒトクローディン１８．２に特異的に結合する抗体を発現させることによって、得られる。陽性クローンをバイオリアクター内で増やして、抗体を産生することもできる。抗体が分泌された培地は、慣用的な技法によって精製することができる。例えば、精製は、バッファーによって調整されたプロテインＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムによって実施することができる。非特異的結合性成分は、洗い流される。結合した抗体を、ｐＨの勾配によって溶出させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって抗体フラグメントを検出し、次いで貯留した。抗体は、一般的な技法を用いてろ過及び濃縮することができる。可溶性の混合物及びマルチマーは、サイズ排除又はイオン交換等の一般的な技法によって効果的に取り除くことができる。次いで、得られた生成物は、例えば－７０℃で直ちに凍結され、又は凍結乾燥されてもよい。
【0083】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官又は生体液に対して用いられているときの「投与」、「投薬」又は「処置」は、外因性医薬、治療剤、診断薬又は組成物を、動物、人間、対象、細胞、組織、器官又は生体液と接触させることを指す。「投与」、「投薬」又は「処置」は、例えば、治療法、薬物動態に関する方法、診断法、研究方法及び実験方法を指し得る。細胞の処置は、試薬を細胞と接触させることと、試薬を流体と接触させた後、細胞と接触させることとを包含する。「投与」、「投薬」又は「処置」は、試薬、診断薬、結合作用のある化合物（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）又は別の細胞によって、例えば細胞をインビトロ又はエクスビボで処置することも意味する。ヒト、獣医学的対象又は研究対象に適用された場合の「処置」は、治療処置、予防的又は予防措置、研究及び診断の適用を指す。
【0084】
「処置する」は、本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントのいずれかを含む組成物等の治療剤を、それに対して治療剤が治療活性を有することが知られている１種以上の疾患症状のある患者に、内用方式又は外用方式で投与することを意味する。一般的に、治療剤は、処置すべき患者又は集団の１種以上の疾患症状を緩和するのに効果的な量で与えられ、これによって、臨床的に測定できる任意の度合いまでこのような症状の後退を誘導し、又はこのような症状の進行を阻害する。何らかの特定の疾患症状を緩和するのに効果的な治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の疾患状態、年齢及び体重、並びに、望ましい反応を患者に誘発させる薬物の能力等の様々な因子に応じて変化し得る。疾患症状が緩和されたかどうかは、その症状の重症度又は進行状況を評価するために医師又は他の熟練の医療従事者によって一般的に使用されている任意の臨床測定によって、評価することができる。本開示の一実施形態（例えば、処置方法又は製造物）は、あらゆる患者にあるターゲットとする疾患症状を緩和するのに有効ではないこともあるが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン－ホイットニーのＵ検定、クラスカル－ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール－タプストラ検定及びウィルコクソン検定等の当技術分野において知られた任意の統計学的な検定によって判定されたときに、統計学的に有意な数の患者にあるターゲットとする疾患症状を緩和するはずである。
【0085】
「保存的修飾（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」又は「保存的置換又は保存的置きかえ」は、タンパク質の生物活性を変化させることなく高頻度で変更を起こすことができるように、類似の特性（例えば、電荷、側鎖のサイズ、疎水性／親水性、骨格の立体構造及び剛直性等）を有する他のアミノ酸によって、タンパク質中のアミノ酸を置換することを指す。当業者ならば、一般に、ポリペプチドの必須でない領域における単一のアミノ酸置換が、生物活性を実質的に変化させないことを知っている（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、２２４頁、第４版を参照されたい。）。さらに、構造的に又は機能的に類似するアミノ酸による置換は、生物活性を乱す可能性が低い。例示的な保存的置換は、以下の表の「例示的なアミノ酸の保存的置換」に記載されている。
【0086】
【表3】
【0087】
「有効量」又は「有効用量」は、何らかの１種以上の有益な又は望ましい結果を得るために必要な医薬、化合物又は医薬組成物の量を指す。予防的な用途に関しては、有益な又は望ましい結果は、状態の生化学的徴候、組織学的徴候及び行動上の徴候、状態の合併症、並びに、状態の発症中における中間的な病理学的表現型を含む、疾患の危険性の排除若しくは低減、重症度の低下又は発症の遅延を含む。治療的な用途に関しては、有益な又は望ましい結果は、本開示の標的抗原に関連する様々な状態の罹患率の低下若しくはこのような状態の１種以上の症状の改善、前述の状態を処置するために必要な他の作用物質の投薬量の低減、別の作用物質の有効性の向上、及び／又は、患者における本開示の標的抗原に関連する状態の進行の遅延等の臨床結果を含む。
【0088】
「外因性」は、状況に応じて生物、細胞又は人間の外部で生成された物質を指す。
【0089】
「内因性」は、状況に応じて細胞、生物又は人体で生成された物質を指す。
【0090】
「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド配列間の配列類似性を指す。比較すべき２つの配列の両方に含まれるある位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれに含まれるある位置がアデニンによって占有されている場合、これらの分子は、前述の位置のところが相同である。２つの配列間の同一性の百分率は、比較すべき位置の数で割った後で１００をかけた、２つの配列に共有される一致している位置又は相同な位置の数の関数である。例えば、２つの配列が最適にアラインメントされた場合、２つの配列中にある１０の位置のうちの６つが一致している又は相同であるとき、これらの２つの配列は、６０％相同であり；２つの配列中にある１００の位置のうちの９５が一致している又は相同であるとき、これらの２つの配列は、９５％相同である。一般に、２つの配列がアラインメントされた場合、比較は、最大の同一性の百分率を与えるように実施される。例えば、比較は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって実施することが可能であり、ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、アルゴリズムのパラメータは、各参照配列の全長にわたって各配列間で最大の一致を与えるように選択される。次の参考文献は、配列分析のために頻繁に使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに言及している：ＢＬＡＳＴ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ）：Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ＳＦら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６～２７２；Ｍａｄｄｅｎ，ＴＬら、（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１～１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９～６５６。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴから入手可能なもの等、他の慣用的なＢＬＡＳＴアルゴリズムも当業者に周知である。
【0091】
本明細書において使用されているとき、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は互換的に使用されてており、このような呼称はすべて、子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、継代数にかかわらず、初代被検細胞及びこの細胞由来の培養物を含む。すべての子孫は、意図的な変異又は意図的でない変異のため、ＤＮＡ含量が正確に同一ではないこともあり得ることも、理解すべきである。最初にトランスフォーメーションされた細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物活性を有する、変異のある子孫も含まれる。はっきりと異なる呼称が意図されている場合、そのことは、文脈から明確に理解されよう。
【0092】
「単離される」は、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、又は、細胞破片及び増殖培地等の他の物質等の他の生体分子を実質的に不含である分子を指す。前述の物質が実験又は治療における本明細書に記載の化合物の使用に有意に干渉する量で存在しない限り、一般には、「単離される」という用語は、前述の物質が完全に存在せず、又は水、バッファー若しくは塩が存在しないことを意味するように意図されていない。
【0093】
「任意選択による」又は「任意選択により」は、後に続く事象又は状況が発生し得るが、必ずしも発生するとは限らないことを意味するが、その記載は、事象又は状況が発生する場合又は発生しない場合が含まれる。
【0094】
「医薬組成物」は、本開示による１種以上の化合物又はその生理学的に／薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと、生理学的に／薬学的に許容されるキャリア及び賦形剤等の他の化学成分とを含む、混合物を指す。医薬組成物は、生物への投与を容易にして、有効成分の吸収を促進することにより、生物学的効果を発揮することを目的とする。
【0095】
「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、抗体又は抗原結合性フラグメントの送達を目的とした製剤中への使用に適した、任意の不活性物質を指す。キャリアは、粘着防止剤、粘着剤、コーティング剤、崩壊剤、充填剤又は希釈剤、保存料（抗酸化剤、抗菌剤又は抗真菌剤等）、甘味料、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤及びバッファー等であってよい。適切な薬学的に許容されるキャリアの例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコール）デキストロース、植物油（オリーブオイル等）、生理食塩水、バッファー、緩衝生理食塩水、並びに、ショ糖、ポリオール、ソルビトール及び塩化ナトリウム等の等張剤が挙げられる。
【0096】
さらに、本開示は、有効成分として本開示の抗クローディン１８．２抗体又はその抗体結合性フラグメントを含む、標的抗原（クローディン１８．２等）に対して陽性の細胞に関連する疾患を処置するための作用物質を含む。
【0097】
本開示におけるクローディン１８．２関連疾患には、その疾患がクローディン１８．２に関連する限り、特に制限はない。例えば、本開示の分子によって誘導される治療反応は、（１）ヒトクローディン１８．２への本開示の分子の結合により、クローディン１８．２の受容体／リガンドへのクローディン１８．２の結合を阻止すること、又は、（２）クローディン１８．２を過剰発現した腫瘍細胞を死滅させることを含む。したがって、本開示の分子は、治療用途に適した調製物及び製剤に含まれる場合、腫瘍又はがん、好ましくはメラノーマ、結腸がん、乳がん、肺がん、胃がん、腸がん、腎臓がん、非小細胞肺がん、膀胱がん等を有する人物にとって非常に有用である。
【0098】
さらに、本開示は、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）の免疫検出又は測定のための方法と、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）の免疫検出又は測定のための試薬と、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）を発現した細胞の免疫検出又は測定のための方法と、標的抗原（例えば、ヒトクローディン１８．２）を特異的に認識し、細胞外アミノ酸配列又はその三次構造に結合する、本開示の抗体又は抗体フラグメントを有効成分として含む、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）に対して陽性の細胞に関連する疾患を診断するための診断薬とにも関する。
【0099】
本開示において、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）の量を検出又は測定するための方法は、任意の公知の方法であってよい。このような方法には、例えば、イムノアッセイ法又は免疫検出法が挙げられる。
【0100】
イムノアッセイ法又は免疫検出法は、標識された抗原又は抗体によって、抗体又は抗原の量を検出又は測定する方法である。イムノアッセイ又は免疫検出法の例には、放射性物質標識免疫抗体方法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法、ウエスタンブロッティング及び物理化学的方法等が挙げられる。
【0101】
クローディン１８．２陽性細胞に関連する上記疾患は、本開示の抗体又は抗体フラグメントを使用してクローディン１８．２を発現した細胞を検出又は測定することによって、診断することができる。
【0102】
ポリペプチドを発現した細胞は、公知の免疫検出法、好ましくは免疫沈降、蛍光細胞染色及び免疫組織染色（ｉｍｍｕｎｏｔｉｓｓｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）等によって検出することができる。さらに、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳ系（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）による蛍光抗体染色法等の方法を使用することもできる。
【0103】
本開示においては、組織、細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液又は培地等、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）について検出又は測定すべきサンプルには、そのサンプルが、標的抗原（例えば、クローディン１８．２）を発現した細胞を含み得る限り、特に制限はない。
【0104】
必要とされる診断法に応じて、本開示のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを含む診断薬は、抗原－抗体反応を実施するための試薬又は抗原－抗体反応を検出するための試薬を含むこともできる。抗原－抗体反応を実施するための試薬には、バッファー及び塩等が挙げられる。検出のための試薬には、イムノアッセイ法又は免疫検出法において一般的に使用される試薬、例えば、モノクローナル抗体、その抗体フラグメント又はそのコンジュゲートを認識する標識された二次抗体、及び標識に対応する基質が挙げられる。
【0105】
本開示の１つ以上の実施形態の詳細が上記明細書には記載されている。本開示の実施及び試験においては、本明細書に記載されたものに類似する又は同一の任意の方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に説明する。本明細書及び特許請求の範囲を通して、本開示に関する他の特徴、目的及び利点が明らかになろう。本明細書及び特許請求の範囲においては、そうではないと文脈により明確に示されていない限り、単数形は、複数の態様も含む。そうではないと本明細書において明示的に規定されていない限り、本明細書において使用されているすべての専門用語及び科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書において引用されたすべての特許及び刊行物は、参照により組み込む。下記の例は、本開示の好ましい実施形態をより完全に説明するために提供されている。これらの例は、いかなる点においても本開示の範囲を限定するものとして解されるべきでなく、本開示の範囲は、特許請求の範囲によって規定される。
【実施例】
【0106】
（実施例１）
クローディン１８．２を高発現する細胞株の構築
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬を使用して、ｐＣＤＨ－ｈクローディン１８．２レンチウイルス発現ベクタープラスミドと、ｐＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＭＶ－ｄＲ８．９１レンチウイルスシステムパッケージングベクターとをウイルスパッケージング細胞２９３Ｔにトランスフェクションした。ウイルスを含有する培地の上清を収集し、ろ過し、超高速で遠心分離した。濃縮されたウイルスを使用して、ヒト胃印環細胞がん細胞株ＮＵＧＣ４を感染させ、ピューロマイシンによって２～３週間スクリーニングした後、ＦＡＣＳシングルセルソーティングによってソーティングした。
クローディン１８．２を高発現する細胞株の構築
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬を使用して、ｐＣＤＨ－ｈクローディン１８．２レンチウイルス発現ベクタープラスミドと、ｐＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＭＶ－ｄＲ８．９１レンチウイルスシステムパッケージングベクターとをウイルスパッケージング細胞２９３Ｔにトランスフェクションした。ウイルスを含有する培地の上清を収集し、ろ過し、超高速で遠心分離した。濃縮されたウイルスを使用して、ヒト胃印環細胞がん細胞株ＮＵＧＣ４を感染させ、ピューロマイシンによって２～３週間スクリーニングした後、ＦＡＣＳシングルセルソーティングによってソーティングした。
【0107】
クローディン１８．２の発現レベルを、腫瘍ＩＨＣスコアに応じて判定した。クローディン１８．２の発現レベルがＩＨＣスコア３の腫瘍のものと同等の細胞は、高発現細胞として考えられており、クローディン１８．２の発現レベルがＩＨＣスコア２の腫瘍のものと同等の細胞は、中発現細胞として考えられている。レンチウイルスを感染させたＮＵＧＣ４細胞の表面上におけるクローディン１８．２の発現を、ＦＡＣＳ検出によって検出し、クローディン１８．２の発現が最も多いＮＵＧＣ４／ｈクローディン１８．２モノクローナル細胞株を選択した。同時に、野生型ＮＵＧＣ４細胞の表面上におけるクローディン１８．２の発現を、ＦＡＣＳによって検出し、クローディン１８．２が中発現したＮＵＧＣ４クローン細胞株を選択した。野生型ＮＵＧＣ４は、クローディン１８．２が低発現した細胞だった。
【0108】
選択したモノクローナル細胞株を増加及び培養し、凍結させ、後続のアッセイのために貯蔵した。
クローディン１８．２配列Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＰ＿００１００２０２６：（配列番号：１）
ＭＡＶＴＡＣＱＧＬＧＦＶＶＳＬＩＧＩＡＧＩＩＡＡＴＣＭＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＡＩＧＬＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳＧＩＭＦＩＶＳＧＬＣＡＩＡＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＡＰＥＥＴＮＹＫＡＶＳＹＨＡＳＧＨＳＶＡＹＫＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＫＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＥＶＱＳＹＰＳＫＨＤＹＶ。
クローディン１８．２ＤＮＡ配列：（配列番号：２）
１ ＡＧＡＡＴＴＧＣＧＣ ＴＧＴＣＣＡＣＴＴＧ ＴＣＧＴＧＴＧＧＣＴ ＣＴＧＴＧＴＣＧＡＣ ＡＣＴＧＴＧＣＧＣＣ ＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧ
６１ ＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧ ＴＣＡＧＧＧＣＴＴＧ ＧＧＧＴＴＣＧＴＧＧ ＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴ ＴＧＧＧＡＴＴＧＣＧ ＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧ
１２１ ＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧ ＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧ ＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣ ＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣ ＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧ
１８１ ＴＴＴＴＣＡＡＣＴＡ ＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧ ＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴ ＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡ ＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣ ＴＴＣＡＣＣＧＡＧＴ
２４１ ＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡ ＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧ ＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣ ＣＡＧＣＣＡＴＧＣＴ ＧＣＡＧＧＣＡＧＴＧ ＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡ
３０１ ＴＧＡＴＣＧＴＡＧＧ ＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧ ＧＧＴＧＣＣＡＴＴＧ ＧＣＣＴＣＣＴＧＧＴ ＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴ ＧＣＣＣＴＧＡＡＡＴ
３６１ ＧＣＡＴＣＣＧＣＡＴ ＴＧＧＣＡＧＣＡＴＧ ＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧ ＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡ ＣＡＴＧＡＣＡＣＴＧ ＡＣＣＴＣＣＧＧＧＡ
４２１ ＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ ＴＧＴＣＴＣＡＧＧＴ ＣＴＴＴＧＴＧＣＡＡ ＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴ ＧＴＣＴＧＴＧＴＴＴ ＧＣＣＡＡＣＡＴＧＣ
４８１ ＴＧＧＴＧＡＣＴＡＡ ＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧ ＴＣＣＡＣＡＧＣＴＡ ＡＣＡＴＧＴＡＣＡＣ ＣＧＧＣＡＴＧＧＧＴ ＧＧＧＡＴＧＧＴＧＣ
５４１ ＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡ ＧＡＣＣＡＧＧＴＡＣ ＡＣＡＴＴＴＧＧＴＧ ＣＧＧＣＴＣＴＧＴＴ ＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧ ＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧ
６０１ ＧＣＣＴＣＡＣＡＣＴ ＡＡＴＴＧＧＧＧＧＴ ＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴ ＧＣＡＴＣＧＣＣＴＧ ＣＣＧＧＧＧＣＣＴＧ ＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧ
６６１ ＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡ ＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴ ＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧ ＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡ ＣＡＧＴＧＴＴＧＣＣ ＴＡＣＡＡＧＣＣＴＧ
７２１ ＧＡＧＧＣＴＴＣＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴ ＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴ ＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡ ＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧ ＡＴＡＴＡＣＧＡＴＧ
７８１ ＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧ ＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣ ＧＡＧＧＴＡＣＡＡＴ ＣＴＴＡＴＣＣＴＴＣ ＣＡＡＧＣＡＣＧＡＣ ＴＡＴＧＴＧＴＡＡＴ
８４１ ＧＣＴＣＴＡＡＧＡＣ ＣＴＣＴＣＡＧＣＡＣ ＧＧＧＣＧＧＡＡＧＡ ＡＡＣＴＣＣＣＧＧＡ ＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣ ＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧ
９０１ ＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴ ＣＴＡＧＡＴＴＴＣＴ ＴＣＴＴＧＣＴＴＴＴ ＧＡＣＴＣＡＣＡＧＣ ＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧ ＡＡＡＡＧＣＣＴＣＧ
９６１ ＡＴＴＴＣＡＴＣＴＴ ＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣ ＡＡＡＴＧＧＴＣＴＴ ＡＧＣＣＴＣＡＧＴＣ ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡ ＡＡＴＡＴＴＣＣＡＣ
１０２１ ＣＡＴＡＡＡＡＣＡＧ ＣＴＧＡＧＴＴＡＴＴ ＴＡＴＧＡＡＴＴＡＧ ＡＧＧＣＴＡＴＡＧＣ ＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣ ＡＡＴＣＣＴＣＴＡＴ
１０８１ ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴ ＡＡＡＴＡＴＡＡＣＴ ＴＴＣＴＡＣＴＣＴＧ ＡＴＧＡＧＡＧＡＡＴ ＧＴＧＧＴＴＴＴＡＡ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ
１１４１ ＡＣＡＴＴＴＴＧＡＴ ＧＡＴＴＴＡＧＡＣＡ ＧＡＣＴＣＣＣＣＣＴ ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡ ＧＴＣＡＡＴＡＡＡＣ ＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡ
１２０１ ＴＣＴＡＴＴＴＣＣＣ ＡＧＣＴＴＡＴＣＣＣ ＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴ ＴＴＴＧＡＡＡＧＧＡ ＡＡＧＡＧＴＡＧＡＣ ＣＣＡＡＡＧＡＴＧＴ
１２６１ ＴＡＴＴＴＴＣＴＧＣ ＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴ ＴＴＧＴＣＴＣＣＣＣ ＡＣＣＣＣＣＡＡＣＴ ＴＧＧＣＴＡＧＴＡＡ ＴＡＡＡＣＡＣＴＴＡ
１３２１ ＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡ ＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡ ＧＡＡＡＧＡＴＡＴＴ ＴＧＴＡＡＴＣＴＣＴ ＣＣＡＧＣＣＣＡＴＧ ＡＴＣＴＣＧＧＴＴＴ
１３８１ ＴＣＴＴＡＣＡＣＴＧ ＴＧＡＴＣＴＴＡＡＡ ＡＧＴＴＡＣＣＡＡＡ ＣＣＡＡＡＧＴＣＡＴ ＴＴＴＣＡＧＴＴＴＧ ＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡ
１４４１ ＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣ ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣ ＡＴＣＴＴＣＴＴＡＴ ＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡ ＣＣＡＴＴＣＴＡＧＧ ＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡ
１５０１ ＧＣＴＣＴＣＣＡＣＴ ＧＧＡＧＴＣＣＴＣＴ ＴＴＣＴＧＴＣＧＣＧ ＧＧＴＣＡＧＡＡＡＴ ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＡ ＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡ
１５６１ ＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴ ＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡ ＧＴＣＣＴＡＡＡＴＡ ＴＡＧＴＴＡＡＡＡＴ ＡＡＡＴＡＡＴＧＴＴ ＴＴＡＧＴＡＡＡＡＴ
１６２１ ＧＡＴＡＣＡＣＴＡＴ ＣＴＣＴＧＴＧＡＡＡ ＴＡＧＣＣＴＣＡＣＣ ＣＣＴＡＣＡＴＧＴＧ ＧＡＴＡＧＡＡＧＧＡ ＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡ
１６８１ ＴＡＡＴＴＧＣＴＴＴ ＧＡＣＡＴＴＧＴＣＴ ＡＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＴＧＴＡＡＡＧＴＣ ＡＴＧＣＴＴＡＡＧＴ ＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡ
１７４１ ＴＧＡＡＡＡＧＣＴＣ ＡＣＴＧＡＴＣＣＴＡ ＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣ ＴＴＴＧＡＧＧＴＣＴ ＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴ ＧＡＴＴＧＴＡＣＡＴ
１８０１ ＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴ ＧＴＡＡＧＣＣＡＴＧ ＴＡＡＡＡＡＧＴＡＡ ＡＴＡＡＴＧＴＣＴＧ ＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧ ＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧ
１８６１ ＴＡＡＴＣＣＴＡＧＣ ＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧ ＡＡＧＧＡＴＣＡＣＴ ＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡ ＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣ
１９２１ ＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣ ＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡ ＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴ ＣＴＡＣＡＡＡＡＴＡ ＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡ ＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡ
１９８１ ＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧ ＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧ ＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣ ＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧ ＧＡＧＧＡＴＣＡＣＴ
２０４１ ＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧ ＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧ ＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧ ＣＣＡＴＧＡＴＣＡＣ ＡＣＣＡＣＴＧＣＡＣ ＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧ
２１０１ ＴＧＡＣＡＴＡＧＣＧ ＡＧＡＴＣＣＴＧＴＣ ＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡ ＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴ ＡＡＴＧＧＡＡＣＡＣ ＡＧＣＡＡＧＴＣＣＴ
２１６１ ＡＧＧＡＡＧＴＡＧＧ ＴＴＡＡＡＡＣＴＡＡ ＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧ ＡＡＴＴＡＡＡＴＧＴ
２２２１ ＡＡＴＧＴＴＴＣＣＡ ＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴ ＡＴＣＣＡＣＡＴＴＴ ＧＣＡＴＧＧＴＴＡＣ ＡＡＧＣＣＡＣＴＧＣ ＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧ
２２８１ ＴＡＧＣＡＣＴＴＴＣ ＣＴＧＧＣＡＣＴＧＴ ＧＧＴＣＧＧＴＴＴＴ ＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴ ＧＣＴＴＴＧＴＴＴＡ ＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴ
２３４１ ＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣ ＡＧＧＣＴＧＧＣＣＴ ＣＡＡＡＣＴＣＣＴＧ ＣＡＣＴＣＡＡＧＣＡ ＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣ ＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣ
２４０１ ＣＡＡＧＴＡＧＣＴＧ ＧＡＡＴＴＡＣＡＧＧ ＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴ ＣＡＣＡＡＣＴＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧ ＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴ
２４６１ ＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧ ＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣ ＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣ ＴＡＧＡＧＴＧＧＴＴ ＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧ ＡＴＧＴＴＴＧＧＧＣ
２５２１ ＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡ ＧＣＴＣＴＴＴＧＣＡ ＡＣＣＡＣＡＣＡＣＣ ＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣ ＴＴＡＣＡＴＣＡＣＴ ＧＣＣＣＴＴＴＴＧＡ
２５８１ ＧＣＡＧＡＡＡＧＴＣ ＴＡＡＡＴＴＣＣＴＴ ＣＣＡＡＧＡＣＡＧＴ ＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴ ＣＣＣＡＧＴＡＣＣＡ ＡＡＧＣＣＡＧＡＴＡ
２６４１ ＧＧＣＣＣＣＣＴＡＧ ＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧ ＴＡＡＧＡＧＣＡＧＴ ＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣ ＴＡＣＣＣＡＣＡＧＣ ＡＧＣＡＴＴＧＧＴＧ
２７０１ ＣＡＧＧＧＧＡＡＣＴ ＴＧＧＣＣＡＴＴＡＧ ＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴ ＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧ ＴＣＣＴＣＡＣＡＴＣ ＡＡＴＡＧＴＡＣＡＴ
２７６１ ＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡ ＣＣＴＣＣＡＡＧＧＧ ＧＡＴＴＧＧＴＧＡＡ ＴＡＣＴＣＡＴＡＡＧ ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧ ＣＴＧＡＡＣＡＧＡＣ
２８２１ ＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧ ＧＡＡＡＧＡＡＣＧＧ ＡＴＴＡＴＧＣＣＣＣ ＡＴＴＡＡＡＴＡＡＣ ＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴ ＣＡＡＧＡＧＴＣＡＧ
２８８１ ＡＧＣＡＧＴＧＡＧＣ ＴＣＡＧＡＧＧＣＣＣ ＴＴＣＴＣＡＣＴＧＡ ＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡ ＴＴＴＡＡＡＣＣＡＡ ＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡ
２９４１ ＧＴＡＴＴＴＧＴＧＧ ＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣ ＣＴＣＡＧＴＴＴＧＧ ＧＴＡＡＡＧＧＡＴＧ ＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧ ＴＣＡＡＣＴＡＡＡＧ
３００１ ＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡ ＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧ ＡＧＧＧＴＴＧＡＧＣ ＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣ ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧ ＴＴＡＡＧＴＧＣＴＣ
３０６１ ＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧ ＡＧＴＴＧＡＡＧＡＧ ＣＡＴＣＣＡＴＴＴＧ ＡＧＴＴＧＡＡＧＧＣ ＣＡＣＡＧＧＧＣＡＣ ＡＡＴＧＡＧＣＴＣＴ
３１２１ ＣＣＣＴＴＣＴＡＣＣ ＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴ ＣＣＣＴＧＧＴＣＡＧ ＧＴＣＴＣＡＧＧＴＡ ＧＴＧＣＧＧＴＧＴＧ ＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧ
３１８１ ＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴ ＡＧＣＧＣＡＴＴＣＴ ＣＴＡＴＣＣＡＡＣＡ ＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴ ＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣ ＣＡＴＡＴＡＧＴＴＡ
３２４１ ＧＡＴＴＧＴＧＣＴＴ ＴＧＴＡＡＴＴＴＴＧ ＴＴＧＴＴＧＴＴＧＣ ＴＣＴＡＴＣＴＴＡＴ ＴＧＴＡＴＡＴＧＣＡ ＴＴＧＡＧＴＡＴＴＡ
３３０１ ＡＣＣＴＧＡＡＴＧＴ ＴＴＴＧＴＴＡＣＴＴ ＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡ ＡＡＣＡＣＴＧＴＴＡ ＴＣＣＴＡＣＡＧＴＴ。
クローディン１８．２配列Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＰ＿００１００２０２６：（配列番号：１）
ＭＡＶＴＡＣＱＧＬＧＦＶＶＳＬＩＧＩＡＧＩＩＡＡＴＣＭＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＡＩＧＬＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳＧＩＭＦＩＶＳＧＬＣＡＩＡＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＡＰＥＥＴＮＹＫＡＶＳＹＨＡＳＧＨＳＶＡＹＫＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＫＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＥＶＱＳＹＰＳＫＨＤＹＶ。
クローディン１８．２ＤＮＡ配列：（配列番号：２）
１ ＡＧＡＡＴＴＧＣＧＣ ＴＧＴＣＣＡＣＴＴＧ ＴＣＧＴＧＴＧＧＣＴ ＣＴＧＴＧＴＣＧＡＣ ＡＣＴＧＴＧＣＧＣＣ ＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧ
６１ ＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧ ＴＣＡＧＧＧＣＴＴＧ ＧＧＧＴＴＣＧＴＧＧ ＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴ ＴＧＧＧＡＴＴＧＣＧ ＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧ
１２１ ＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧ ＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧ ＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣ ＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＣＣ ＧＴＡＡＣＡＧＣＴＧ
１８１ ＴＴＴＴＣＡＡＣＴＡ ＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧ ＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴ ＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡ ＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣ ＴＴＣＡＣＣＧＡＧＴ
２４１ ＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡ ＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧ ＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣ ＣＡＧＣＣＡＴＧＣＴ ＧＣＡＧＧＣＡＧＴＧ ＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡ
３０１ ＴＧＡＴＣＧＴＡＧＧ ＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧ ＧＧＴＧＣＣＡＴＴＧ ＧＣＣＴＣＣＴＧＧＴ ＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴ ＧＣＣＣＴＧＡＡＡＴ
３６１ ＧＣＡＴＣＣＧＣＡＴ ＴＧＧＣＡＧＣＡＴＧ ＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧ ＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡ ＣＡＴＧＡＣＡＣＴＧ ＡＣＣＴＣＣＧＧＧＡ
４２１ ＴＣＡＴＧＴＴＣＡＴ ＴＧＴＣＴＣＡＧＧＴ ＣＴＴＴＧＴＧＣＡＡ ＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴ ＧＴＣＴＧＴＧＴＴＴ ＧＣＣＡＡＣＡＴＧＣ
４８１ ＴＧＧＴＧＡＣＴＡＡ ＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧ ＴＣＣＡＣＡＧＣＴＡ ＡＣＡＴＧＴＡＣＡＣ ＣＧＧＣＡＴＧＧＧＴ ＧＧＧＡＴＧＧＴＧＣ
５４１ ＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡ ＧＡＣＣＡＧＧＴＡＣ ＡＣＡＴＴＴＧＧＴＧ ＣＧＧＣＴＣＴＧＴＴ ＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧ ＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧ
６０１ ＧＣＣＴＣＡＣＡＣＴ ＡＡＴＴＧＧＧＧＧＴ ＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴ ＧＣＡＴＣＧＣＣＴＧ ＣＣＧＧＧＧＣＣＴＧ ＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧ
６６１ ＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡ ＣＡＡＡＧＣＣＧＴＴ ＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧ ＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡ ＣＡＧＴＧＴＴＧＣＣ ＴＡＣＡＡＧＣＣＴＧ
７２１ ＧＡＧＧＣＴＴＣＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴ ＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴ ＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡ ＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧ ＡＴＡＴＡＣＧＡＴＧ
７８１ ＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧ ＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣ ＧＡＧＧＴＡＣＡＡＴ ＣＴＴＡＴＣＣＴＴＣ ＣＡＡＧＣＡＣＧＡＣ ＴＡＴＧＴＧＴＡＡＴ
８４１ ＧＣＴＣＴＡＡＧＡＣ ＣＴＣＴＣＡＧＣＡＣ ＧＧＧＣＧＧＡＡＧＡ ＡＡＣＴＣＣＣＧＧＡ ＧＡＧＣＴＣＡＣＣＣ ＡＡＡＡＡＡＣＡＡＧ
９０１ ＧＡＧＡＴＣＣＣＡＴ ＣＴＡＧＡＴＴＴＣＴ ＴＣＴＴＧＣＴＴＴＴ ＧＡＣＴＣＡＣＡＧＣ ＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧ ＡＡＡＡＧＣＣＴＣＧ
９６１ ＡＴＴＴＣＡＴＣＴＴ ＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣ ＡＡＡＴＧＧＴＣＴＴ ＡＧＣＣＴＣＡＧＴＣ ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡ ＡＡＴＡＴＴＣＣＡＣ
１０２１ ＣＡＴＡＡＡＡＣＡＧ ＣＴＧＡＧＴＴＡＴＴ ＴＡＴＧＡＡＴＴＡＧ ＡＧＧＣＴＡＴＡＧＣ ＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣ ＡＡＴＣＣＴＣＴＡＴ
１０８１ ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴ ＡＡＡＴＡＴＡＡＣＴ ＴＴＣＴＡＣＴＣＴＧ ＡＴＧＡＧＡＧＡＡＴ ＧＴＧＧＴＴＴＴＡＡ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ
１１４１ ＡＣＡＴＴＴＴＧＡＴ ＧＡＴＴＴＡＧＡＣＡ ＧＡＣＴＣＣＣＣＣＴ ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡ ＧＴＣＡＡＴＡＡＡＣ ＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡ
１２０１ ＴＣＴＡＴＴＴＣＣＣ ＡＧＣＴＴＡＴＣＣＣ ＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴ ＴＴＴＧＡＡＡＧＧＡ ＡＡＧＡＧＴＡＧＡＣ ＣＣＡＡＡＧＡＴＧＴ
１２６１ ＴＡＴＴＴＴＣＴＧＣ ＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴ ＴＴＧＴＣＴＣＣＣＣ ＡＣＣＣＣＣＡＡＣＴ ＴＧＧＣＴＡＧＴＡＡ ＴＡＡＡＣＡＣＴＴＡ
１３２１ ＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡ ＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡ ＧＡＡＡＧＡＴＡＴＴ ＴＧＴＡＡＴＣＴＣＴ ＣＣＡＧＣＣＣＡＴＧ ＡＴＣＴＣＧＧＴＴＴ
１３８１ ＴＣＴＴＡＣＡＣＴＧ ＴＧＡＴＣＴＴＡＡＡ ＡＧＴＴＡＣＣＡＡＡ ＣＣＡＡＡＧＴＣＡＴ ＴＴＴＣＡＧＴＴＴＧ ＡＧＧＣＡＡＣＣＡＡ
１４４１ ＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣ ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣ ＡＴＣＴＴＣＴＴＡＴ ＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡ ＣＣＡＴＴＣＴＡＧＧ ＡＧＴＴＴＣＣＴＧＡ
１５０１ ＧＣＴＣＴＣＣＡＣＴ ＧＧＡＧＴＣＣＴＣＴ ＴＴＣＴＧＴＣＧＣＧ ＧＧＴＣＡＧＡＡＡＴ ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＡ ＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡ
１５６１ ＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴ ＴＴＴＡＡＴＴＴＡＡ ＧＴＣＣＴＡＡＡＴＡ ＴＡＧＴＴＡＡＡＡＴ ＡＡＡＴＡＡＴＧＴＴ ＴＴＡＧＴＡＡＡＡＴ
１６２１ ＧＡＴＡＣＡＣＴＡＴ ＣＴＣＴＧＴＧＡＡＡ ＴＡＧＣＣＴＣＡＣＣ ＣＣＴＡＣＡＴＧＴＧ ＧＡＴＡＧＡＡＧＧＡ ＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡ
１６８１ ＴＡＡＴＴＧＣＴＴＴ ＧＡＣＡＴＴＧＴＣＴ ＡＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＴＧＴＡＡＡＧＴＣ ＡＴＧＣＴＴＡＡＧＴ ＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡ
１７４１ ＴＧＡＡＡＡＧＣＴＣ ＡＣＴＧＡＴＣＣＴＡ ＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣ ＴＴＴＧＡＧＧＴＣＴ ＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴ ＧＡＴＴＧＴＡＣＡＴ
１８０１ ＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴ ＧＴＡＡＧＣＣＡＴＧ ＴＡＡＡＡＡＧＴＡＡ ＡＴＡＡＴＧＴＣＴＧ ＧＧＣＡＣＡＧＴＧＧ ＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧ
１８６１ ＴＡＡＴＣＣＴＡＧＣ ＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧ ＡＡＧＧＡＴＣＡＣＴ ＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡ ＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣ
１９２１ ＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣ ＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡ ＡＧＣＣＣＴＧＴＣＴ ＣＴＡＣＡＡＡＡＴＡ ＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡ ＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡ
１９８１ ＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧ ＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧ ＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣ ＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧ ＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧ ＧＡＧＧＡＴＣＡＣＴ
２０４１ ＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧ ＧＡＧＧＴＴＧＧＧＧ ＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧ ＣＣＡＴＧＡＴＣＡＣ ＡＣＣＡＣＴＧＣＡＣ ＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧ
２１０１ ＴＧＡＣＡＴＡＧＣＧ ＡＧＡＴＣＣＴＧＴＣ ＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡ ＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴ ＡＡＴＧＧＡＡＣＡＣ ＡＧＣＡＡＧＴＣＣＴ
２１６１ ＡＧＧＡＡＧＴＡＧＧ ＴＴＡＡＡＡＣＴＡＡ ＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧ ＡＡＴＴＡＡＡＴＧＴ
２２２１ ＡＡＴＧＴＴＴＣＣＡ ＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴ ＡＴＣＣＡＣＡＴＴＴ ＧＣＡＴＧＧＴＴＡＣ ＡＡＧＣＣＡＣＴＧＣ ＣＡＧＴＴＡＧＣＡＧ
２２８１ ＴＡＧＣＡＣＴＴＴＣ ＣＴＧＧＣＡＣＴＧＴ ＧＧＴＣＧＧＴＴＴＴ ＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴ ＧＣＴＴＴＧＴＴＴＡ ＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴ
２３４１ ＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣ ＡＧＧＣＴＧＧＣＣＴ ＣＡＡＡＣＴＣＣＴＧ ＣＡＣＴＣＡＡＧＣＡ ＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣ ＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣ
２４０１ ＣＡＡＧＴＡＧＣＴＧ ＧＡＡＴＴＡＣＡＧＧ ＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴ ＣＡＣＡＡＣＴＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＴＣＡＧ ＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴ
２４６１ ＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧ ＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣ ＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣ ＴＡＧＡＧＴＧＧＴＴ ＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧ ＡＴＧＴＴＴＧＧＧＣ
２５２１ ＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡ ＧＣＴＣＴＴＴＧＣＡ ＡＣＣＡＣＡＣＡＣＣ ＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣ ＴＴＡＣＡＴＣＡＣＴ ＧＣＣＣＴＴＴＴＧＡ
２５８１ ＧＣＡＧＡＡＡＧＴＣ ＴＡＡＡＴＴＣＣＴＴ ＣＣＡＡＧＡＣＡＧＴ ＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴ ＣＣＣＡＧＴＡＣＣＡ ＡＡＧＣＣＡＧＡＴＡ
２６４１ ＧＧＣＣＣＣＣＴＡＧ ＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧ ＴＡＡＧＡＧＣＡＧＴ ＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣ ＴＡＣＣＣＡＣＡＧＣ ＡＧＣＡＴＴＧＧＴＧ
２７０１ ＣＡＧＧＧＧＡＡＣＴ ＴＧＧＣＣＡＴＴＡＧ ＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴ ＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧ ＴＣＣＴＣＡＣＡＴＣ ＡＡＴＡＧＴＡＣＡＴ
２７６１ ＡＴＧＡＡＡＧＴＧＡ ＣＣＴＣＣＡＡＧＧＧ ＧＡＴＴＧＧＴＧＡＡ ＴＡＣＴＣＡＴＡＡＧ ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧ ＣＴＧＡＡＣＡＧＡＣ
２８２１ ＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧ ＧＡＡＡＧＡＡＣＧＧ ＡＴＴＡＴＧＣＣＣＣ ＡＴＴＡＡＡＴＡＡＣ ＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴ ＣＡＡＧＡＧＴＣＡＧ
２８８１ ＡＧＣＡＧＴＧＡＧＣ ＴＣＡＧＡＧＧＣＣＣ ＴＴＣＴＣＡＣＴＧＡ ＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡ ＴＴＴＡＡＡＣＣＡＡ ＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡ
２９４１ ＧＴＡＴＴＴＧＴＧＧ ＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣ ＣＴＣＡＧＴＴＴＧＧ ＧＴＡＡＡＧＧＡＴＧ ＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧ ＴＣＡＡＣＴＡＡＡＧ
３００１ ＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡ ＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧ ＡＧＧＧＴＴＧＡＧＣ ＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣ ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧ ＴＴＡＡＧＴＧＣＴＣ
３０６１ ＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧ ＡＧＴＴＧＡＡＧＡＧ ＣＡＴＣＣＡＴＴＴＧ ＡＧＴＴＧＡＡＧＧＣ ＣＡＣＡＧＧＧＣＡＣ ＡＡＴＧＡＧＣＴＣＴ
３１２１ ＣＣＣＴＴＣＴＡＣＣ ＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴ ＣＣＣＴＧＧＴＣＡＧ ＧＴＣＴＣＡＧＧＴＡ ＧＴＧＣＧＧＴＧＴＧ ＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧ
３１８１ ＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴ ＡＧＣＧＣＡＴＴＣＴ ＣＴＡＴＣＣＡＡＣＡ ＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴ ＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣ ＣＡＴＡＴＡＧＴＴＡ
３２４１ ＧＡＴＴＧＴＧＣＴＴ ＴＧＴＡＡＴＴＴＴＧ ＴＴＧＴＴＧＴＴＧＣ ＴＣＴＡＴＣＴＴＡＴ ＴＧＴＡＴＡＴＧＣＡ ＴＴＧＡＧＴＡＴＴＡ
３３０１ ＡＣＣＴＧＡＡＴＧＴ ＴＴＴＧＴＴＡＣＴＴ ＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡ ＡＡＣＡＣＴＧＴＴＡ ＴＣＣＴＡＣＡＧＴＴ。
【0109】
（実施例２）
抗ヒトクローディン１８．２モノクローナル抗体の産生
１ 免疫化
マウスを免疫化することによって、抗ヒトクローディン１８．２モノクローナル抗体を産生した。
抗ヒトクローディン１８．２モノクローナル抗体の産生
１ 免疫化
マウスを免疫化することによって、抗ヒトクローディン１８．２モノクローナル抗体を産生した。
【0110】
６～８週齢の雌のＳＪＬ白色マウスを、実験（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．、動物生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（北京）２０１２－０００１）のために使用した。給餌環境：ＳＰＦレベル。購入後、マウスは、２０～２５℃の温度、４０～６０％の湿度において、１２／１２時間の明暗サイクルで１週間、実験環境の中で飼育した。次いで、環境に順応したマウスを、下記のスキームに従って免疫化した。免疫抗原は、ｈｕクローディン１８．２－ＨＥＫ２９３細胞（ヒトクローディン１８．２プラスミドを安定的にトランスフェクションしたＨＥＫ－２９３細胞株）だった。
【0111】
免疫化プロトコル：細胞による一次免疫化の前に、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ２６８４）を、０．１ｍｌ／マウスでマウスに腹腔内（ＩＰ）注射し；３０分後、各マウスには、０．１ｍｌの生理食塩水によって１×１０８／ｍｌの濃度に希釈された細胞液を腹腔内（ＩＰ）注射した。ピペッティングによって細胞を均一に分散させた後、０日目、１４日目、２８日目、４２日目及び５６日目に細胞に接種した。２１日目、３５日目、４９日目及び６３日目に血液サンプルを収集し；マウス血清中における抗体価をＥＬＩＳＡ法によって判定した。４～５回の免疫化の後、プラトーに達する高い血清抗体価を有するマウスを、脾細胞との融合のために選択した。脾細胞との融合の３日前には、ブースター免疫化のために、１×１０７個の細胞を腹腔内（ＩＰ）注射した。
【0112】
２．脾細胞との融合
ＰＥＧ媒介式の融合手順を用いることにより、脾臓リンパ球を骨髄腫Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８２８７（商標））と融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を得た。ハイブリドーマ細胞を、０．５×１０６～１×１０６／ｍｌの密度で完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）に再懸濁させ、１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で３～４日間インキュベートし、１００μｌ／ｗｅｌｌのＨＡＴ完全培地を添加したら、クローンが形成されるまでさらに３～４日間維持した。上清を取り除き、２００μｌ／ｗｅｌｌのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴ及び１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）を加え、３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ検出に供した。
ＰＥＧ媒介式の融合手順を用いることにより、脾臓リンパ球を骨髄腫Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８２８７（商標））と融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を得た。ハイブリドーマ細胞を、０．５×１０６～１×１０６／ｍｌの密度で完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）に再懸濁させ、１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、３７℃及び５％ＣＯ２で３～４日間インキュベートし、１００μｌ／ｗｅｌｌのＨＡＴ完全培地を添加したら、クローンが形成されるまでさらに３～４日間維持した。上清を取り除き、２００μｌ／ｗｅｌｌのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴ及び１×ＯＰＩを含むＩＭＤＭ培地）を加え、３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ検出に供した。
【0113】
３ ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
ハイブリドーマ細胞の増殖密度に応じて、結合ＥＬＩＳＡ法（ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ）によって培養上清を検出した。ｈｕクローディン１８．２－ＨＥＫ２９３細胞への強直な結合能力を有するが、ＨＥＫ２９３細胞には結合しない細胞を選択した後、遅滞なく増やし、冷凍保存し；単一の細胞クローンが得られるまでサブクローニングを２～３回実施した。
ハイブリドーマ細胞の増殖密度に応じて、結合ＥＬＩＳＡ法（ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ）によって培養上清を検出した。ｈｕクローディン１８．２－ＨＥＫ２９３細胞への強直な結合能力を有するが、ＨＥＫ２９３細胞には結合しない細胞を選択した後、遅滞なく増やし、冷凍保存し；単一の細胞クローンが得られるまでサブクローニングを２～３回実施した。
【0114】
各サブクローニング後の細胞も、細胞結合アッセイによって試験した。上記アッセイによるスクリーニングによって、ハイブリドーマクローンを得た。無血清細胞培養法によって、抗体をさらに調製した。抗体は、精製の例に従って精製し、試験例において使用した。
【0115】
（実施例３）
マウス抗体のヒト化
インビトロ活性が高いモノクローナルハイブリドーマ細胞株ｍＡｂ１９０１及びｍＡｂ１９０２を選択し；モノクローナル抗体配列をクローニングした後、ヒト化し、組換え発現させ、活性について評価した。
マウス抗体のヒト化
インビトロ活性が高いモノクローナルハイブリドーマ細胞株ｍＡｂ１９０１及びｍＡｂ１９０２を選択し；モノクローナル抗体配列をクローニングした後、ヒト化し、組換え発現させ、活性について評価した。
【0116】
ハイブリドーマから配列をクローニングする手順は、次のとおりだった。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集した。キットの取扱説明書に従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６－０１８）によってＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号２６８０Ａ）によって逆転写した。逆転写から得られたｃＤＮＡは、マウスＩｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６ Ｒｅｖ．Ｂ０５０３）を使用してＰＣＲによって増幅し、増幅された生成物は、シーケンシングのために、ある会社に送付した。得られたＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列は、配列番号：３～６に示されている。
ｍＡｂ１９０１マウス重鎖可変領域（配列番号：３）
ＥＶＱＬＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＧＩＨＷＶＲＱＡＰＥＭＧＬＥＷＩＡＹＩＳＲＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＧＹＤＴＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。
ｍＡｂ１９０１マウス軽鎖可変領域（配列番号：４）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＨＣＱＮＤＬＹＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。
ｍＡｂ１９０２マウス重鎖可変領域（配列番号：５）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＬＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＰＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＬＫＴＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ。
ｍＡｂ１９０２マウス軽鎖可変領域（配列番号：６）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＹＣＱＮＡＹＴＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ。
ｍＡｂ１９０１マウス重鎖可変領域（配列番号：３）
ＥＶＱＬＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＧＩＨＷＶＲＱＡＰＥＭＧＬＥＷＩＡＹＩＳＲＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＧＹＤＴＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。
ｍＡｂ１９０１マウス軽鎖可変領域（配列番号：４）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＨＣＱＮＤＬＹＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。
ｍＡｂ１９０２マウス重鎖可変領域（配列番号：５）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＬＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＰＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＬＫＴＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ。
ｍＡｂ１９０２マウス軽鎖可変領域（配列番号：６）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＹＣＱＮＡＹＴＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ。
【0117】
キメラ抗体ｃｈ１９０１及びｃｈ１９０２を形成するように、上記マウス重鎖及び軽鎖可変領域、それぞれ下記のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒトκ軽鎖定常領域に連結した。
【0118】
定常領域は、以下の配列から選択した：
ヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常領域（配列番号：７）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
ヒトκ軽鎖定常領域：（配列番号：８）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
ヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常領域（配列番号：７）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
ヒトκ軽鎖定常領域：（配列番号：８）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
【0119】
当技術分野の多数の文献で開示されているようにして、マウスモノクローナル抗体をヒト化した。簡単に説明すると、親（マウス抗体）定常ドメインをヒト定常ドメインによって置きかえ、マウス抗体とヒト抗体との相同性に基づいて、ヒト生殖細胞系列抗体配列を選択して、ＣＤＲグラフト化を実施した。本発明においては、好ましい活性を有する候補分子をヒト化のために選択したが、その結果は、以下のとおりである。
【0120】
１．マウス抗体のＣＤＲ領域
表４中のＶＨ／ＶＬ ＣＤＲアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ式ナンバリング基準に従って決定し、注釈を付けた。
マウス抗体のＣＤＲ配列は、表４に示されている。
表４中のＶＨ／ＶＬ ＣＤＲアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ式ナンバリング基準に従って決定し、注釈を付けた。
マウス抗体のＣＤＲ配列は、表４に示されている。
【0121】
【表4】
【0122】
２．ヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列の選択
得られたマウス抗体ＶＨ／ＶＬＣＤＲの典型的構造に基づいて、重鎖及び軽鎖可変領域配列を抗体生殖細胞系列データベースと比較して、相同性が高いヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。ヒト生殖細胞系列軽鎖フレームワーク領域は、ヒトκ軽鎖遺伝子に由来した。
得られたマウス抗体ＶＨ／ＶＬＣＤＲの典型的構造に基づいて、重鎖及び軽鎖可変領域配列を抗体生殖細胞系列データベースと比較して、相同性が高いヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。ヒト生殖細胞系列軽鎖フレームワーク領域は、ヒトκ軽鎖遺伝子に由来した。
【0123】
２．１ ｍＡｂ１９０１のヒト化及び復帰変異の設計
ｍＡｂ１９０１マウス抗体のヒト化に適したヒト抗体生殖細胞系列を選択した。マウス抗体ｍＡｂ１９０１のＣＤＲ領域を、選択したヒト化テンプレートにグラフト化して、ヒト化可変領域を得た。配列番号：２４に示されるヒト化重鎖可変領域配列及び配列番号：２１に示される軽鎖可変領域配列を、ＩｇＧ定常領域と合わせて、インタクト抗体を形成する。同時に、ヒト化抗体のＶ領域中のＦＲ領域を復帰変異させたが、例示的な復帰変異及び組合せは、以下のとおりである。
ｍＡｂ１９０１マウス抗体のヒト化に適したヒト抗体生殖細胞系列を選択した。マウス抗体ｍＡｂ１９０１のＣＤＲ領域を、選択したヒト化テンプレートにグラフト化して、ヒト化可変領域を得た。配列番号：２４に示されるヒト化重鎖可変領域配列及び配列番号：２１に示される軽鎖可変領域配列を、ＩｇＧ定常領域と合わせて、インタクト抗体を形成する。同時に、ヒト化抗体のＶ領域中のＦＲ領域を復帰変異させたが、例示的な復帰変異及び組合せは、以下のとおりである。
【0124】
【表5】
【0125】
【表6】
【0126】
上記表に示された対応する重鎖可変領域を、配列番号：７に示されるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に連結して、完全長抗体の重鎖を形成することもできるし、軽鎖可変領域を、配列番号：８に示されるヒトκ軽鎖定常領域に連結して、完全長抗体の軽鎖を形成することもできる。他の実施形態において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を他の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域に別々に連結して、完全長抗体を形成することもできる。
【0127】
２．２ ｍＡｂ１９０２のヒト化及び復帰変異の設計
ｍＡｂ１９０２マウス抗体のヒト化に適したヒト抗体生殖細胞系列を選択した。マウス抗体ｍＡｂ１９０２のＣＤＲ領域を、選択したヒト化テンプレートにグラフト化して、ヒト化可変領域を得た。ヒト化重鎖可変領域配列は、配列番号：３１に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列は、配列番号：２８に示されるとおりであるが；次いで、ＩｇＧ定常領域によって組み換えて、インタクト抗体を形成した。同時に、ヒト化抗体のＶ領域中のＦＲ領域を復帰変異させたが、例示的な復帰変異の方法及び組合せは、以下のとおりである。
ｍＡｂ１９０２マウス抗体のヒト化に適したヒト抗体生殖細胞系列を選択した。マウス抗体ｍＡｂ１９０２のＣＤＲ領域を、選択したヒト化テンプレートにグラフト化して、ヒト化可変領域を得た。ヒト化重鎖可変領域配列は、配列番号：３１に示されるとおりであり、軽鎖可変領域配列は、配列番号：２８に示されるとおりであるが；次いで、ＩｇＧ定常領域によって組み換えて、インタクト抗体を形成した。同時に、ヒト化抗体のＶ領域中のＦＲ領域を復帰変異させたが、例示的な復帰変異の方法及び組合せは、以下のとおりである。
【0128】
【表7】
【0129】
【表8】
【0130】
上記表に示された対応する重鎖可変領域を、配列番号：７に示されるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に連結して、完全長抗体の重鎖を形成することもできるし、軽鎖可変領域を配列番号：８に示されるヒトκ軽鎖定常領域に連結して、完全長抗体の軽鎖を形成することもできる。
【0131】
一例として、抗体の完全長配列は、以下のとおりである：
キメラ抗体ｃｈ１９０１：
ｃｈ１９０１重鎖：（配列番号：３５）
ＥＶＱＬＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＧＩＨＷＶＲＱＡＰＥＭＧＬＥＷＩＡＹＩＳＲＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＧＹＤＴＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ；
ｃｈ１９０１軽鎖（配列番号：３６）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＨＣＱＮＤＬＹＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ；
キメラ抗体ｃｈ１９０２：
ｃｈ１９０２重鎖（配列番号：３７）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＬＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＰＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＬＫＴＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ；
ｃｈ１９０２軽鎖（配列番号：３８）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＹＣＱＮＡＹＴＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
キメラ抗体ｃｈ１９０１：
ｃｈ１９０１重鎖：（配列番号：３５）
ＥＶＱＬＭＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＧＩＨＷＶＲＱＡＰＥＭＧＬＥＷＩＡＹＩＳＲＧＳＳＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＭＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＧＹＤＴＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ；
ｃｈ１９０１軽鎖（配列番号：３６）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＨＣＱＮＤＬＹＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ；
キメラ抗体ｃｈ１９０２：
ｃｈ１９０２重鎖（配列番号：３７）
ＥＶＱＬＱＥＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＬＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＰＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＬＫＴＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ；
ｃｈ１９０２軽鎖（配列番号：３８）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＩＹＹＣＱＮＡＹＴＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
【0132】
【表9】
【0133】
完全長抗体の軽鎖配列及び重鎖配列は、以下のとおりである。
【0134】
【表10-1】
【表10-2】
【表10-3】
【0135】
【表11】
【0136】
完全長抗体の軽鎖配列及び重鎖配列は、以下のとおりである。
【0137】
【表12-1】
【0138】
本開示のポジティブコントロール抗体は、ＩＭＡＢ－３６２（ＷＯ２０１６１６６１２２から入手可能）だった。
ＩＭＡＢ－３６２重鎖（配列番号：５３）
１ ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥ ＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＳＹＷＩＮＷＶＫＱＲ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮ
５１ ＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹ ＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬ ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹ ＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤ ＳＡＶＹＹＣＴＲＳＷ
１０１ ＲＧＮＳＦＤＹＷＧＱ ＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳ ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ ＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴ ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ
１５１ ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ ＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ
２０１ ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴ ＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳ ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ
２５１ ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ
３０１ ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ
３５１ ＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴ ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
４０１ ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ ＳＬＳＬＳＰＧＫ。
ＩＭＡＢ－３６２軽鎖（配列番号：５４）
１ ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳ ＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴ ＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬ ＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰ
５１ ＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲ ＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴ ＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡ ＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹ
１０１ ＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬ ＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳ ＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱ ＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣ ＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡ
１５１ ＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬ ＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴ ＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳ ＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡ ＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣ
２０１ ＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰ ＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
ＩＭＡＢ－３６２重鎖（配列番号：５３）
１ ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥ ＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＳＹＷＩＮＷＶＫＱＲ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＮ
５１ ＩＹＰＳＤＳＹＴＮＹ ＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬ ＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹ ＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤ ＳＡＶＹＹＣＴＲＳＷ
１０１ ＲＧＮＳＦＤＹＷＧＱ ＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳ ＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡ ＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴ ＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹ
１５１ ＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ ＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴ ＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ ＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰ ＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩ
２０１ ＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴ ＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳ ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤ
２５１ ＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶ ＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶ ＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴ ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴ
３０１ ＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬ ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰ ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡ ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹ
３５１ ＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴ ＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶ ＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶ ＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮ ＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤ
４０１ ＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱ ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨ ＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ ＳＬＳＬＳＰＧＫ。
ＩＭＡＢ－３６２軽鎖（配列番号：５４）
１ ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳ ＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴ ＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬ ＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴ ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰ
５１ ＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲ ＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴ ＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡ ＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹ
１０１ ＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬ ＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳ ＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱ ＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣ ＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡ
１５１ ＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬ ＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴ ＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳ ＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡ ＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣ
２０１ ＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰ ＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
【0139】
慣用的な遺伝子クローニング及び組換え発現方法によって上記抗体をクローニングし、発現させ、精製した。
【0140】
インビトロ生物学的評価
試験例１：細胞レベルにおけるＥＬＩＳＡ結合アッセイ
細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイを用いて、クローディン１８．２抗体の結合特性を検出した。クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞を、細胞増殖密度が９０％に到達するまで９６ウェル細胞プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９９）内で培養し、４％パラホルムアルデヒドを加えて、細胞を１時間固定した。ＰＢＳＴバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ）によってプレートを３回洗浄した後、ＰＢＳによって希釈された２００μｌ／ｗｅｌｌの５％スキムミルク（Ｂｒｉｇｈｔ脱脂粉乳）をブロッキング溶液として加えることによってブロッキングし、３７℃のインキュベーター内で２．５時間又は４℃で終夜（１６～１８時間）インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング溶液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴバッファーによって３回洗浄し、サンプル希釈剤（１％スキムミルクを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ）によって希釈された５０μｌ／ｗｅｌｌの試験用抗体を加え、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーションの完了後、プレートをＰＢＳＴによって５回洗浄し、サンプル希釈剤によって希釈された１００μｌ／ｗｅｌｌのＨＲＰ標識ヤギ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－００３）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴによって６回洗浄した後、５０μｌ／ｗｅｌｌのＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、カタログ番号５２－００－０３）を加え、室温で１０～１５分間インキュベートし、５０μｌ／ｗｅｌｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を停止させた。ＭＤ Ｖｅｒｓａ Ｍａｘ（商標）マイクロプレートリーダーによって、吸光度の値を４５０ｎｍで読み取り、クローディン１８．２に結合したクローディン１８．２抗体を示すＥＣ５０値を計算した（その結果は、以下の表に示されている。）。
試験例１：細胞レベルにおけるＥＬＩＳＡ結合アッセイ
細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイを用いて、クローディン１８．２抗体の結合特性を検出した。クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞を、細胞増殖密度が９０％に到達するまで９６ウェル細胞プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９９）内で培養し、４％パラホルムアルデヒドを加えて、細胞を１時間固定した。ＰＢＳＴバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ）によってプレートを３回洗浄した後、ＰＢＳによって希釈された２００μｌ／ｗｅｌｌの５％スキムミルク（Ｂｒｉｇｈｔ脱脂粉乳）をブロッキング溶液として加えることによってブロッキングし、３７℃のインキュベーター内で２．５時間又は４℃で終夜（１６～１８時間）インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング溶液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴバッファーによって３回洗浄し、サンプル希釈剤（１％スキムミルクを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ）によって希釈された５０μｌ／ｗｅｌｌの試験用抗体を加え、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーションの完了後、プレートをＰＢＳＴによって５回洗浄し、サンプル希釈剤によって希釈された１００μｌ／ｗｅｌｌのＨＲＰ標識ヤギ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－０３５－００３）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴによって６回洗浄した後、５０μｌ／ｗｅｌｌのＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、カタログ番号５２－００－０３）を加え、室温で１０～１５分間インキュベートし、５０μｌ／ｗｅｌｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を停止させた。ＭＤ Ｖｅｒｓａ Ｍａｘ（商標）マイクロプレートリーダーによって、吸光度の値を４５０ｎｍで読み取り、クローディン１８．２に結合したクローディン１８．２抗体を示すＥＣ５０値を計算した（その結果は、以下の表に示されている。）。
【0141】
【表13】
【0142】
【表14-1】
【0143】
【表14-2】
【0144】
試験例２：細胞レベルにおける抗体の結合アッセイ
クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞と、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４４１７－１００タブ）、ｐＨ７．４）中のＦＡＣＳバッファー（２％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９１４１）とを用いて、１×１０６／ｍｌの細胞懸濁液を調製し、１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７９５）に加えた。遠心分離して、上清を取り除いた後、ＦＡＣＳバッファーによって希釈された様々な濃度の試験用クローディン１８．２抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、４℃冷蔵庫内の暗所で１時間インキュベートした。３００ｇで遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーによって３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８によってコーティングされた作用濃度の抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ－１１０１３）を加え、４℃の冷蔵庫内の暗所で４０分間インキュベートした。３００ｇで遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーによって３回洗浄した後、幾何平均蛍光強度をＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターによって測定し、クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞に結合したクローディン１８．２抗体を示すＥＣ５０値を計算した。その結果は、図１に示されている。
クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞と、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４４１７－１００タブ）、ｐＨ７．４）中のＦＡＣＳバッファー（２％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９１４１）とを用いて、１×１０６／ｍｌの細胞懸濁液を調製し、１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７９５）に加えた。遠心分離して、上清を取り除いた後、ＦＡＣＳバッファーによって希釈された様々な濃度の試験用クローディン１８．２抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、４℃冷蔵庫内の暗所で１時間インキュベートした。３００ｇで遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーによって３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８によってコーティングされた作用濃度の抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ－１１０１３）を加え、４℃の冷蔵庫内の暗所で４０分間インキュベートした。３００ｇで遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーによって３回洗浄した後、幾何平均蛍光強度をＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターによって測定し、クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞に結合したクローディン１８．２抗体を示すＥＣ５０値を計算した。その結果は、図１に示されている。
【0145】
試験例３：抗体のエンドサイトーシスアッセイ
５μｇ／ｍｌの最終濃度になるように、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８ＮＨＳエステル（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、４６４０３）によってあらかじめ標識された試験用クローディン１８．２抗体を、クローディン１８．２を安定的に発現した１×１０６／ｍｌのＮＵＧＣ４細胞に加え、氷の上に置き、暗所で１時間インキュベーションし、遠心分離し、あらかじめ冷却されたＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清、ｐＨ７．４）によって３回洗浄し、上清を取り除いた後、あらかじめ加温された完全培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに入れた。０時間後、０．５時間後、１時間後、２時間後及び４時間後のそれぞれで細胞を取り出し、暗所において氷の上に置いた。すべてのサンプルを収集し、低温において３００ｇで遠心分離した後、溶出バッファー（０．０５Ｍグリシン、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ１．７）を加え、室温で７分間インキュベートした。サンプルを３００ｇで遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーによって１回洗浄し、幾何平均蛍光強度をＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターによって測定し、クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞に対するクローディン１８．２抗体のエンドサイトーシス効率を計算した。その結果により（図２を参照れたい。）、ヒト化抗体が好ましいエンドサイトーシス効率を有することが示されている。
５μｇ／ｍｌの最終濃度になるように、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８ＮＨＳエステル（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、４６４０３）によってあらかじめ標識された試験用クローディン１８．２抗体を、クローディン１８．２を安定的に発現した１×１０６／ｍｌのＮＵＧＣ４細胞に加え、氷の上に置き、暗所で１時間インキュベーションし、遠心分離し、あらかじめ冷却されたＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の２％ウシ胎仔血清、ｐＨ７．４）によって３回洗浄し、上清を取り除いた後、あらかじめ加温された完全培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに入れた。０時間後、０．５時間後、１時間後、２時間後及び４時間後のそれぞれで細胞を取り出し、暗所において氷の上に置いた。すべてのサンプルを収集し、低温において３００ｇで遠心分離した後、溶出バッファー（０．０５Ｍグリシン、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ１．７）を加え、室温で７分間インキュベートした。サンプルを３００ｇで遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーによって１回洗浄し、幾何平均蛍光強度をＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターによって測定し、クローディン１８．２を安定的に発現したＮＵＧＣ４細胞に対するクローディン１８．２抗体のエンドサイトーシス効率を計算した。その結果により（図２を参照れたい。）、ヒト化抗体が好ましいエンドサイトーシス効率を有することが示されている。
【0146】
試験例４：フローサイトメトリーに基づいた抗体のアフィニティの測定
試験当日には、ウェル１個当たり１×１０５～２×１０５個の細胞になるように、ＨＥＫ２９３／ｈクローディン１８．２細胞を収集して、丸底９６ウェルプレートに入れた。５μｇ／ｍｌの初期濃度、２倍勾配希釈（１２の濃度点）でクローディン１８．２抗体を加え、４℃で１時間インキュベートした。ポジティブコントロールは、ＩＭＡＢ３６２であり、抗体を含まないウェルは、ネガティブコントロールとして設定した。遠心分離によって抗体を取り除いた後、１００μｌ／ｗｅｌｌのＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（２００×）を加え、暗所において４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳによって２回洗浄し、フローサイトメトリー検出用に調製した。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを始動させ、予備加熱し、新たなアッセイを、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアによって確立した。ＨＥＫ２９３／ｈクローディン１８．２ネガティブコントロールサンプルを検出し、ＦＳＣ電圧及びＳＳＣ電圧を適切な値に調整し、保存した。Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＦＩＴＣ－５ ＭＥＳＦキットの取扱説明書に従って、ブランクサンプルＢ及び標準曲線１をそれぞれ検出した。ＦＩＴＣ電圧を適切な値に調整し、保存した。保存した電圧下で、丸底９６ウェルプレート内のサンプルを検出し、データを記録した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して、実験データを分析し、これによって、Ｇｅｏ Ｍｅａｎ値を得たら、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＦＩＴＣ－５ＭＥＳＦキットの取扱説明書に従って、ＭＥＳＦ－Ｇｅｏ Ｍｅａｎ標準曲線を当てはめた。ＨＥＫ２９３／ｈクローディン１８．２細胞に結合したクローディン１８．２抗体のモル濃度及び遊離抗体の濃度を、ＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体の濃度蛍光値に基づいて計算し、抗体のＢｍａｘ及び解離定数ＫＤを、スキャッチャードプロット法を用いることによって計算した。その結果は、表１５に示されている。
試験当日には、ウェル１個当たり１×１０５～２×１０５個の細胞になるように、ＨＥＫ２９３／ｈクローディン１８．２細胞を収集して、丸底９６ウェルプレートに入れた。５μｇ／ｍｌの初期濃度、２倍勾配希釈（１２の濃度点）でクローディン１８．２抗体を加え、４℃で１時間インキュベートした。ポジティブコントロールは、ＩＭＡＢ３６２であり、抗体を含まないウェルは、ネガティブコントロールとして設定した。遠心分離によって抗体を取り除いた後、１００μｌ／ｗｅｌｌのＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（２００×）を加え、暗所において４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳによって２回洗浄し、フローサイトメトリー検出用に調製した。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを始動させ、予備加熱し、新たなアッセイを、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアによって確立した。ＨＥＫ２９３／ｈクローディン１８．２ネガティブコントロールサンプルを検出し、ＦＳＣ電圧及びＳＳＣ電圧を適切な値に調整し、保存した。Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＦＩＴＣ－５ ＭＥＳＦキットの取扱説明書に従って、ブランクサンプルＢ及び標準曲線１をそれぞれ検出した。ＦＩＴＣ電圧を適切な値に調整し、保存した。保存した電圧下で、丸底９６ウェルプレート内のサンプルを検出し、データを記録した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して、実験データを分析し、これによって、Ｇｅｏ Ｍｅａｎ値を得たら、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＦＩＴＣ－５ＭＥＳＦキットの取扱説明書に従って、ＭＥＳＦ－Ｇｅｏ Ｍｅａｎ標準曲線を当てはめた。ＨＥＫ２９３／ｈクローディン１８．２細胞に結合したクローディン１８．２抗体のモル濃度及び遊離抗体の濃度を、ＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体の濃度蛍光値に基づいて計算し、抗体のＢｍａｘ及び解離定数ＫＤを、スキャッチャードプロット法を用いることによって計算した。その結果は、表１５に示されている。
【0147】
【表15】
【0148】
試験例５：抗体のＡＤＣＣ効果の評価
様々なＮＵＧＣ４細胞（クローディン１８．２の高発現、中発現及び低発現）を消化し、１０００ｒｐｍで遠心分離し、再懸濁させて、カウントした。１０％ＦＢＳ（ニュージーランド産Ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ＩｇＧウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ、１９２１００５ＰＪ）を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８３５－０３０）に、細胞を３×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させた。２５μｌの細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０３）の各ウェルに７５００細胞／ｗｅｌｌで加えた。抗体を上記フェノールレッド不含培地に希釈して、３倍抗体希釈溶液を調製し、２５μｌ／ｗｅｌｌの抗体を細胞プレートに加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で０．５時間インキュベートした。
様々なＮＵＧＣ４細胞（クローディン１８．２の高発現、中発現及び低発現）を消化し、１０００ｒｐｍで遠心分離し、再懸濁させて、カウントした。１０％ＦＢＳ（ニュージーランド産Ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ＩｇＧウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ、１９２１００５ＰＪ）を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８３５－０３０）に、細胞を３×１０５細胞／ｍｌで再懸濁させた。２５μｌの細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０３）の各ウェルに７５００細胞／ｗｅｌｌで加えた。抗体を上記フェノールレッド不含培地に希釈して、３倍抗体希釈溶液を調製し、２５μｌ／ｗｅｌｌの抗体を細胞プレートに加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で０．５時間インキュベートした。
【0149】
（ＦｃｒＲ３Ａ－Ｖ１５８－ＮＦＡＴ－ＲＥ－Ｊｕｒｋａｔ細胞）エフェクター細胞を収集し、１０００ｒｐｍで遠心分離し、再懸濁させて、カウントした。１０％ＦＢＳ（ニュージーランド産Ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ＩｇＧウシ胎児血清）を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０に、細胞を３×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させ、２５μｌの細胞をアッセイプレート（７．５×１０４細胞／ｗｅｌｌ）に加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６時間インキュベートした。
【0150】
７５μｌ／ｗｅｌｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６１０）をアッセイプレートの各ウェルに加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＶＩＴＯＲ３）によって化学発光を検出した。
【0151】
その結果により（表１６及び図３Ａ～図３Ｃを参照されたい。）、抗体ｈ１９０１－１１とｈ１９０２－５は両方とも、低レベル、中レベル及び高レベルのクローディン１８．２を発現したＮＵＧＣ４細胞内で、非常に強いＡＤＣＣ活性を示すことが示されている。
【0152】
【表16】
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】