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特許7592164ＤＮＡコード化化合物ライブラリー及び化合物のスクリーニング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-21
(45)【発行日】2024-11-29
(54)【発明の名称】ＤＮＡコード化化合物ライブラリー及び化合物のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C07H 21/04 20060101AFI20241122BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20241122BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20241122BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20241122BHJP
【ＦＩ】
C07H21/04 B
C12Q1/6876 Z
C40B40/06
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2023532256
(86)(22)【出願日】2021-11-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-05
(86)【国際出願番号】 CN2021132846
(87)【国際公開番号】W WO2022111536
(87)【国際公開日】2022-06-02
【審査請求日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】202011353377.7
(32)【優先日】2020-11-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】519448016
【氏名又は名称】成都先導薬物開発股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＨＩＴＧＥＮ ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ６， Ｎｏ．８， Ｈｕｉｇｕ １ｓｔ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ， Ｔｉａｎｆｕ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏ－Ｔｏｗｎ， Ｓｈｕａｎｇｌｉｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｃｈｅｎｇｄｕ， Ｓｉｃｈｕａｎ ６１０２００ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】100232862
【弁理士】
【氏名又は名称】王 雪
(72)【発明者】
【氏名】李進
(72)【発明者】
【氏名】劉観賽
(72)【発明者】
【氏名】羅華東
(72)【発明者】
【氏名】陳柳
(72)【発明者】
【氏名】朱俊揚
(72)【発明者】
【氏名】馬慧勇
(72)【発明者】
【氏名】宋超
(72)【発明者】
【氏名】万金橋
【審査官】齋藤 光介
(56)【参考文献】
【文献】特表２００７－５２４６６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】CLARK, M. A. et al，Design, synthesis and selection of DNA-encoded small-molecule libraries，NATURE CHEMICAL BIOLOGY，2009年，Vol.5, Num.9，pp.647-654
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ４０Ｂ ５０／００－５０／１８
Ｃ１２Ｑ １／００－ １／７０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の式ＩＩで表される構造を有することを特徴とする、ＤＮＡコード化化合物。【化1】
（式中、Ｚ１は、その３’末端でＬ１に結合したオリゴヌクレオチドであり、Ｚ２は、その５’末端でＬ２に結合したオリゴヌクレオチドであるか、又はＺ１は、その５’末端でＬ１に結合したオリゴヌクレオチドであり、Ｚ２は、その３’末端でＬ２に結合したオリゴヌクレオチドであり、
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して
【化2】
Ｘは、窒素原子、
【化3】
Ｌは、－Ｓ１－Ｓ２－Ｓ３－の構造を有し、
Ｓ１及びＳ３は、それぞれ独立して
【化4】
Ｓ２は、
【化5】
Ｍは、生物学的標的と共にスクリーニングを行うために使用される、ＤＮＡコード化化合物ライブラリーにおける小分子部分である。）
【請求項2】
Ｚ１とＺ２は、相補又は部分的に相補して二本鎖を形成し、Ｚ１及びＺ２の長さは、それぞれ１０個以上の塩基であり、かつ１０個以上の塩基対相補領域を有することを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡコード化化合物。
【請求項3】
Ｚ１及びＺ２は、いずれもＰＣＲプライマー配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡコード化化合物。
【請求項4】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡコード化化合物からなることを特徴とする、ＤＮＡコード化化合物ライブラリー。
【請求項5】
前記ＤＮＡコード化化合物ライブラリーは、少なくとも１０２種の異なるＤＮＡコード化化合物を含むことを特徴とする、請求項４に記載のＤＮＡコード化化合物ライブラリー。
【請求項6】
下記の式ＩＩＩで表される構造を有することを特徴とする、ＤＮＡコード化化合物ライブラリーを合成するための開始断片化合物。【化6】
（式中、
Ｚ１は、その３’末端でＬ１に結合したオリゴヌクレオチドであり、Ｚ２は、その５’末端でＬ２に結合したオリゴヌクレオチドであるか、又はＺ１は、その５’末端でＬ１に結合したオリゴヌクレオチドであり、Ｚ２は、その３’末端でＬ２に結合したオリゴヌクレオチドであり、
Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して
【化7】
Ｘは、窒素原子、
【化8】
Ｌは、－Ｓ１－Ｓ２－Ｓ３－の構造を有し、
Ｓ１及びＳ３は、それぞれ独立して
【化9】
Ｓ２は、
【化10】
Ｒは、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基から選択される。）
【請求項7】
Ｚ１とＺ２は、相補又は部分的に相補して二本鎖を形成し、Ｚ１及びＺ２の長さは、それぞれ５～１５個の塩基であることを特徴とする、請求項６に記載の開始断片化合物。
【請求項8】
前記開始断片化合物は、【化11】
【化12】
【請求項9】
化合物ライブラリーとタンパク質標的とをインキュベートした後、操作して共有結合架橋を行うステップａと、タンパク質－ＤＮＡコード化化合物共有結合架橋複合体と未架橋のＤＮＡコード化化合物とを分離するステップｂと、
回収したタンパク質－ＤＮＡコード化化合物共有結合架橋複合体に対してＰＣＲ増幅及びＤＮＡ配列決定を行い、ＤＮＡ配列情報を読み取り、化合物構造情報を得るステップｃと、
を含むことを特徴とする、請求項４又は５に記載のＤＮＡコード化化合物ライブラリーのスクリーニング方法。
【請求項10】
前記ステップａにおいて、共有結合架橋は、光照射、加熱、通電又は直接インキュベーションにより行われることを特徴とする、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項11】
前記ステップｂにおける分離方法は、タンパク質を固定化し、溶出液で洗浄して未固定物質を除去することであることを特徴とする、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項12】
磁気ビーズを用いてタンパク質を固定することを特徴とする、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＤＮＡコード化化合物、並びにその化合物ライブラリーの合成及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
医薬品開発、特に新薬開発において、生物学的標的に対するハイスループットスクリーニングは、リード化合物を迅速に得るための主な手段の一つである。しかし、単一分子に基づく従来のハイスループットスクリーニングでは、所要時間が長く、設備投資が巨額で、ライブラリー化合物の数が限られており（数百万）、かつ化合物ライブラリーの構築に数十年も必要であることから、リード化合物の発見効率と可能性が制限されている。近年登場しているＤＮＡコード化化合物ライブラリー技術（ＷＯ２００５０５８４７９、ＷＯ２０１８１６６５３２、ＣＮ１０３８８２５３２）には、コンビナトリアルケミストリー及び分子生物学技術が組み込まれ、分子レベルでそれぞれの化合物に１つのＤＮＡタグを付け、極めて短い時間内で数十億の化合物ライブラリーを合成することができ、次世代の化合物ライブラリースクリーニング技術の傾向となっており、製薬業界で幅広く応用され始め、多くの積極的な効果を生み出している（Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，４７，１２４７－１２５５）。
【0003】
従来のＤＮＡコード化化合物ライブラリーを用いて薬物をスクリーニングする際に、まず、化合物ライブラリーを標的と共にインキュベートし、そして、溶出により標的に結合した化合物を他の化合物から分離し、さらに、タンパク質変性の条件下で標的に結合した化合物を遊離させ、ＱＰＣＲ増幅、ＤＮＡ配列決定、データ分析を行い、標的タンパク質に結合した化合物の化学構造を得る（図１）。しかし、ＤＮＡコード化化合物スクリーニングは親和スクリーニングであり、薬物分子と標的との間の相互作用力の大きさに依存し、標的に対して親和性を有する分子を見つけることができるが、応用には制限が存在する。主に、スクリーニング過程において溶出する必要があり、低親和性（μｍｏｌ－ｍｍｏｌ）の分子は溶出過程中で標的から分離しやすいことで、信号がエンリッチメントすることができなく無視される場合がある。その結果、ＤＮＡコード化化合物ライブラリーのスクリーニング効果、特に、小分子断片の混合スクリーニング過程におけるスクリーニング結果が制限される。
【0004】
上記の技術的問題を解決するために、本発明は、ＤＮＡコード化化合物、化合物ライブラリー及びスクリーニング方法を提供する。本発明のＤＮＡコード化化合物ライブラリーを用いて標的とインキュベートし、さらに共有結合架橋により化合物と標的との結合を強化することができ、従来のＤＮＡコード化化合物ライブラリー親和スクリーニングと比較して、化合物、特に低親和性化合物のスクリーニング信号での区別度を向上させることができる。
【発明の概要】
【0005】
本発明によれば、式Ｉで表される一般式を有するＤＮＡコード化化合物が提供される。
式中、Ｘは、原子又は分子骨格であり、
Ａ１は、リンカー及びオリゴヌクレオチドを含む部分であり、
Ａ２は、リンカー及びオリゴヌクレオチドを含む部分であり、Ａ１及びＡ２におけるオリゴヌクレオチド部分は、相補又は部分的に相補して二本鎖を形成し、
Ｌは、エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基を１つ又は複数含む結合部分であり、
Ｍは、１つ又は複数の構造単位を含む機能部分である。
さらに、Ｘは、炭素原子、窒素原子、環状又は非環状骨格構造である。
Ａ１は、リンカー及びオリゴヌクレオチドを含む部分であり、
Ａ２は、リンカー及びオリゴヌクレオチドを含む部分であり、Ａ１及びＡ２におけるオリゴヌクレオチド部分は、相補又は部分的に相補して二本鎖を形成し、
Ｌは、エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基を１つ又は複数含む結合部分であり、
Ｍは、１つ又は複数の構造単位を含む機能部分である。
さらに、Ｘは、炭素原子、窒素原子、環状又は非環状骨格構造である。
【0006】
さらに、前記式Ｉで表される一般式は、式ＩＩで表される構造を有する。
式中、Ｚ１は、その３'末端でＬ１に結合したオリゴヌクレオチドであり、Ｚ２は、その５'末端でＬ２に結合したオリゴヌクレオチドであるか、又はＺ１は、その５'末端でＬ１に結合したオリゴヌクレオチドであり、Ｚ２は、その３'末端でＬ２に結合したオリゴヌクレオチドであり、
Ｌ１は、Ｚ１の３'末端又は５'末端と結合を形成可能な官能基を含むリンカーであり、
Ｌ２は、Ｚ２の５'末端又は３'末端と結合を形成可能な官能基を含むリンカーである。
さらに具体的には、Ｚ１とＺ２は、相補又は部分的に相補して二本鎖を形成し、Ｚ１及びＺ２の長さは、それぞれ１０個以上の塩基であり、かつ１０個以上の塩基対相補領域を有する。
さらに具体的には、Ｚ１及びＺ２は、いずれもＰＣＲプライマー配列を含む。
さらに具体的には、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して二官能性アルキレン鎖又は二官能性オリゴマーグリコール鎖から選択され、前記官能基は、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基から選択される。
Ｌ１は、Ｚ１の３'末端又は５'末端と結合を形成可能な官能基を含むリンカーであり、
Ｌ２は、Ｚ２の５'末端又は３'末端と結合を形成可能な官能基を含むリンカーである。
さらに具体的には、Ｚ１とＺ２は、相補又は部分的に相補して二本鎖を形成し、Ｚ１及びＺ２の長さは、それぞれ１０個以上の塩基であり、かつ１０個以上の塩基対相補領域を有する。
さらに具体的には、Ｚ１及びＺ２は、いずれもＰＣＲプライマー配列を含む。
さらに具体的には、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して二官能性アルキレン鎖又は二官能性オリゴマーグリコール鎖から選択され、前記官能基は、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基から選択される。
【0007】
さらに具体的には、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して
から選択される。ここで、ｎは１～１０の整数である。好ましくは、ｎは２～６である。より好ましくは、ｎは３である。
【0008】
さらに具体的には、Ｌは、感光性基、感電性基又はタンパク質と共有結合架橋可能な他の基を含む。
【0009】
さらに具体的には、Ｌは、アクリジニル基、アリールアジド基、ベンゾフェノン基、スルホニルフルオリド基、α，β－不飽和酸基、α，β－不飽和ケトン基、α，β－不飽和エステル基、α，β－不飽和スルホニル基、α－アシルハライド基、エポキシ基、アルデヒド基、シアノ基、ボロン酸基を含む。
【0010】
さらに具体的には、Ｌは、－Ｓ１－Ｓ２－Ｓ３－の構造を有する。
ここで、Ｓ１及びＳ３は、１つ又は複数の官能基を有する環状若しくは非環状の炭素原子又はヘテロ原子からなるリンカーであり、前記官能基は、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アジド基、アルキニル基、ハロゲン化物から選択される。
Ｓ２は、エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基を１つ又は複数含むリンカーである。
ここで、Ｓ１及びＳ３は、１つ又は複数の官能基を有する環状若しくは非環状の炭素原子又はヘテロ原子からなるリンカーであり、前記官能基は、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アジド基、アルキニル基、ハロゲン化物から選択される。
Ｓ２は、エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基を１つ又は複数含むリンカーである。
【0011】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｓ１はＸに結合し、Ｓ３はＭに結合する。本発明の別の実施形態において、Ｓ３はＸに結合し、Ｓ１はＭに結合する。
【0012】
さらに具体的には、Ｓ１、Ｓ３は、それぞれ独立して
から選択される１種若しくは複数種の組み合わせであるか、又は存在しない。ここで、ｍは１～２０の整数である。前記Ｓ１又はＳ３が存在しないとは、それと結合した２つの部分が共有結合で直接結合することを指す。好ましくは、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である。
【0013】
さらに具体的には、Ｓ２におけるエンジニアリングにより共有結合架橋可能な基は、リンカーに直接結合し、
の構造を有する。ここで、Ｒ１は、炭素原子又は窒素原子であり、Ｒ２は、水素、炭素原子若しくはヘテロ原子を含むアルカン又は芳香族炭化水素である。
【0014】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Ｓ２は、
から選択され、Ｒ１は、炭素原子又は窒素原子であり、Ｒ２は、水素、炭素原子若しくはヘテロ原子を含むアルカン又は芳香族炭化水素である。
【0015】
本発明の好ましい実施形態において、Ｓ２は、
から選択される。
【0016】
さらに具体的には、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基と機能部分Ｍとの間の距離は、３０個の原子以下である。好ましくは、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基と機能部分Ｍとの間の距離は、２０個の原子以下である。より好ましくは、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基と機能部分Ｍとの間の距離は、１５個の原子以下である。
【0017】
さらに具体的には、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基と機能部分Ｍとの間の距離は、３個の原子を超える。好ましくは、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基と機能部分Ｍとの間の距離は、４個の原子を超える。より好ましくは、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基と機能部分Ｍとの間の距離は、５個の原子を超える。
【0018】
さらに具体的には、前記Ｘは、
から選択される。ここで、ｑは１～１０の整数である。前記構造式における酸素原子は、それぞれＬ１又はＬ２に結合する。
【0019】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、式Ｉで表されるＤＮＡコード化化合物は、
から選択される１種若しくは複数種の組み合わせであるか、又は存在しない。ここで、ｍは１～２０の整数である。前記Ｓ１又はＳ３が存在しないとは、それと結合した２つの部分は、共有結合で直接結合することを指す。好ましくは、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である。
Ｍは、１つ又は複数の構造単位を含む機能部分である。
Ｍは、１つ又は複数の構造単位を含む機能部分である。
【0020】
本発明によれば、前記ＤＮＡコード化化合物からなるＤＮＡコード化化合物ライブラリーがさらに提供される。
【0021】
さらに、前記ＤＮＡコード化化合物ライブラリーは、少なくとも１０種の異なるＤＮＡコード化化合物を含む。更さらに、前記ＤＮＡコード化化合物ライブラリーは、少なくとも１０２種の異なるＤＮＡコード化化合物を含む。本発明のいくつかの実施形態において、前記異なるＤＮＡコード化化合物とは、オリゴヌクレオチド部分及び機能部分のみが異なるＤＮＡコード化化合物を指す。
【0022】
本発明によれば、式ＩＩＩで表される構造を有する、ＤＮＡコード化化合物ライブラリーを合成するための開始断片化合物がさらに提供される。
式中、Ｘは、原子又は分子骨格であり、
Ｚ１は、その３'末端でＬ１に結合したオリゴヌクレオチドであり、Ｚ２は、その５'末端でＬ２に結合したオリゴヌクレオチドであるか、又はＺ１は、その５'末端でＬ１に結合したオリゴヌクレオチドであり、Ｚ２は、その３'末端でＬ２に結合したオリゴヌクレオチドである。
Ｌ１は、Ｚ１の３'末端又は５'末端と結合を形成可能な官能基を含むリンカーであり、
Ｌ２は、Ｚ２の５'末端又は３'末端と結合を形成可能な官能基を含むリンカーであり、
Ｌは、エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基を１つ又は複数含む結合部分であり、
Ｒは、機能部分に結合した反応基である。
Ｚ１は、その３'末端でＬ１に結合したオリゴヌクレオチドであり、Ｚ２は、その５'末端でＬ２に結合したオリゴヌクレオチドであるか、又はＺ１は、その５'末端でＬ１に結合したオリゴヌクレオチドであり、Ｚ２は、その３'末端でＬ２に結合したオリゴヌクレオチドである。
Ｌ１は、Ｚ１の３'末端又は５'末端と結合を形成可能な官能基を含むリンカーであり、
Ｌ２は、Ｚ２の５'末端又は３'末端と結合を形成可能な官能基を含むリンカーであり、
Ｌは、エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基を１つ又は複数含む結合部分であり、
Ｒは、機能部分に結合した反応基である。
【0023】
さらに、Ｘは、炭素原子、窒素原子、環状又は非環状骨格構造である。
【0024】
さらに、Ｚ１とＺ２は、相補又は部分的に相補して二本鎖を形成し、Ｚ１及びＺ２の長さは、それぞれ５～１５個の塩基である。
【0025】
さらに、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して二官能性アルキレン鎖又は二官能性オリゴマーグリコール鎖から選択され、前記官能基は、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基から選択される。
さらに、Ｌは、感光性基、感電性基、又はタンパク質と共有結合架橋可能な他の基を含み、Ｒは、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基から選択される。
さらに、Ｘは、
から選択される。ここで、ｑは１～１０の整数であり、前記構造式における酸素原子は、それぞれＬ１又はＬ２に結合する。
さらに、Ｌは、感光性基、感電性基、又はタンパク質と共有結合架橋可能な他の基を含み、Ｒは、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基から選択される。
さらに、Ｘは、
【0026】
さらに、Ｌ１及びＬ２は、それぞれ独立して
から選択される。ここで、ｎは１～１０の整数であり、好ましくは、ｎは２～６である。より好ましくは、ｎは３である。
【0027】
さらに、Ｌは、－Ｓ１－Ｓ２－Ｓ３－の構造を有し、Ｓ１及びＳ３は、１つ又は複数の官能基を有する環状若しくは非環状炭素原子又はヘテロ原子からなるリンカーであり、前記官能基は、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アジド基、アルキニル基、ハロゲン化物から選択される。Ｓ２は、エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基を１つ又は複数含むリンカーである。
【0028】
さらに具体的には、Ｓ１及びＳ３は、それぞれ独立して
から選択される１種若しくは複数種の組み合わせであるか、又は存在しない。ここで、ｍは１～２０の整数である。前記Ｓ１又はＳ３が存在しないとは、それと結合した２つの部分は共有結合で直接結合することを指す。好ましくは、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である。
【0029】
さらに具体的には、Ｓ２におけるエンジニアリングにより共有結合架橋可能な基は、リンカーに直接結合し、
の構造を有する。ここで、Ｒ１は、炭素原子又は窒素原子であり、Ｒ２は、水素、炭素原子若しくはヘテロ原子を含むアルカン又は芳香族炭化水素である。
【0030】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Ｓ２は、
から選択される。ここで、Ｒ１は、炭素原子又は窒素原子であり、Ｒ２は、水素、炭素原子若しくはヘテロ原子を含むアルカン又は芳香族炭化水素である。
【0031】
本発明の好ましい実施形態において、Ｓ２は、
【0032】
さらに具体的には、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基とＲとの間の距離は、３０個の原子以下である。好ましくは、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基とＲとの間の距離は、２０個の原子以下である。より好ましくは、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基とＲとの間の距離は、１５個の原子以下である。
【0033】
さらに具体的には、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基とＲとの間の距離は、３個の原子を超える。好ましくは、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基とＲとの間の距離は、４個の原子を超える。より好ましくは、前記エンジニアリングにより共有結合架橋可能な基とＲとの間の距離は、５個の原子を超える。
【0034】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、式ＩＩＩで表されるＤＮＡコード化化合物ライブラリーの開始断片化合物は、
から選択される１種若しくは複数種の組み合わせであるか、又は存在しない。ここで、ｍは１～２０の整数である。前記Ｓ１又はＳ３が存在しないとは、それと結合した２つの部分は共有結合で直接結合することを指す。好ましくは、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である。
Ｒは、機能部分に結合した反応基である。好ましくは、Ｒは、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基から選択される。
Ｒは、機能部分に結合した反応基である。好ましくは、Ｒは、リン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基から選択される。
【0035】
さらに具体的には、前記開始断片化合物は、以下の構造を有する。
から選択される。ここで、Ｒ１は、炭素原子又は窒素原子であり、Ｒ２は、水素、炭素原子若しくはヘテロ原子を含むアルカン又は芳香族炭化水素である。
【0036】
本発明によれば、
化合物ライブラリーとタンパク質標とをインキュベートした後、操作して共有結合架橋を行うステップａと、
タンパク質－ＤＮＡコード化化合物共有結合架橋複合体と未架橋のＤＮＡコード化化合物とを分離するステップｂと、
回収したタンパク質－ＤＮＡコード化化合物共有結合架橋複合体に対してＰＣＲ増幅及びＤＮＡ配列決定を行い、ＤＮＡ配列情報を読み取り、化合物構造情報を得るステップｃと、
を含む前記ＤＮＡコード化化合物ライブラリーのスクリーニング方法がさらに提供される。
化合物ライブラリーとタンパク質標とをインキュベートした後、操作して共有結合架橋を行うステップａと、
タンパク質－ＤＮＡコード化化合物共有結合架橋複合体と未架橋のＤＮＡコード化化合物とを分離するステップｂと、
回収したタンパク質－ＤＮＡコード化化合物共有結合架橋複合体に対してＰＣＲ増幅及びＤＮＡ配列決定を行い、ＤＮＡ配列情報を読み取り、化合物構造情報を得るステップｃと、
を含む前記ＤＮＡコード化化合物ライブラリーのスクリーニング方法がさらに提供される。
【0037】
さらに、前記ステップａにおいて、共有結合架橋は、光照射、加熱、通電又は直接インキュベーションにより行われる。
【0038】
さらに、前記ステップｂにおける分離方法方は、タンパク質を固定化し、溶出液で洗浄して未固定物質を除去することである。
【0039】
さらに、磁気ビーズを用いてタンパク質を固定する。
【0040】
本発明のＤＮＡコード化化合物ライブラリーを用いてスクリーニングし、共有結合架橋により化合物と標的との結合を増強し、化合物（特に、低親和性化合物及び断片化合物）のスクリーニング信号の区別度を向上させることができる。
【0041】
本発明における「機能部分」とは、ＤＮＡコード化化合物ライブラリーにおける小分子部分を指し、コンビナトリアルケミストリー又は非コンビナトリアルケミストリー手段により多様な分子構造を構築し、生物学的標的と共にスクリーニングを行うために使用される。本発明に記載の炭素原子は、当業者の理解に応じて自由に選択することができ、例えば、二価置換の場合では「ＣＨ２」であり、三価置換の場合では「ＣＨ」である。
【0042】
本発明に記載の「分子骨格」、「骨格構造」は、当業者の理解に応じて自由に対応する置換数を選択することができ、例えば、二価置換では２つの置換部位があり、三価置換の場合では３つの置換部位がある。
【0043】
本発明に記載の「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなど及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されず、当業者が当該技術分野の技術常識と常套手段に基づいて配列情報を読み取れればよい。
【0044】
本発明のＤＮＡコード化化合物ライブラリーは、様々な生物学的標的のスクリーニングに適用される。当業者が必要に応じて本発明の異なるＤＮＡコード化化合物ライブラリーを選択することができる。
【0045】
本発明のＤＮＡコード化化合物／ライブラリーにおけるエンジニアリングにより共有結合架橋可能な基は、リンカーに直接結合することによって、共有結合架橋基の非特異的な共有結合が大幅に減少する。
【0046】
本発明の内容に基づいて、当該技術分野の技術常識と常套手段により、当業者がＤＮＡコード化化合物及びコード化化合物ライブラリーの開始断片化合物におけるペアリングして結合するのに適した官能基を選択することができる。
【0047】
本発明の上記内容に基づいて、当該技術分野の技術常識と常套手段により、本発明の技術的思想から逸脱しない限り、様々な修正、置換又は変更をすることができる。
【0048】
以下、実施例及び具体的な実施形態により本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明の範囲は、以下の実施例に限定されない。本発明の上記内容に基づいて実現される技術は、いずれも本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】従来のＤＮＡコード化化合物ライブラリーのスクリーニングプロセスである。
【図2】実施例１で合成して得られた４種類のＤＮＡコード化化合物の例である。
【図3】実施例１でＫｄ値が測定された４種類の化合物の例であり、ＣＡＩＸ標的に対するＫｄ値は順次大きくなり、つまり、親和性は順に減少し、ここで、Ｒ１部分は蛍光基であり、Ｋｄ値の測定に使用される。
【図4】ＤＮＡコード化化合物のスクリーニングプロセスである。
【図5】実施例１におけるＤＮＡコード化化合物のスクリーニング回収率の結果である。
【図6】実施例２におけるＤＮＡコード化化合物ライブラリーのスクリーニング信号の結果である。
【図7】実施例３で構築されたＤＮＡコード化化合物ライブラリーの構造模式図である。
【図8】実施例３におけるＤＮＡコード化化合物ライブラリーのスクリーニング信号の結果である。
【発明を実施するための形態】
【0050】
以下、具体的な実施例により本発明の技術的手段を完全で明確に説明する。以下の実施例は、本発明の一部の実施例であり、全ての実施例ではない。本発明で使用される原料及び設備は、いずれも既知の製品であり、市販品購入により入手される。
【0051】
本発明におけるＤＮＡ－ＮＨ２又は
式中、Ａはアデニン、Ｔはチミン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンである。
Ｆｍｏｃ：フルオレニルメトキシカルボニル；ＤＭＴ－ＭＭ：２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン；ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド；ＨＡＴＵ：２－（７－ベンゾトリアゾールオキシド）－Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート。
Ｆｍｏｃ：フルオレニルメトキシカルボニル；ＤＭＴ－ＭＭ：２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン；ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド；ＨＡＴＵ：２－（７－ベンゾトリアゾールオキシド）－Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート。
【0052】
実施例１：ＤＮＡコード化化合物の合成及びスクリーニング
ステップ１：ＤＮＡコード化化合物の合成
ステップ１：ＤＮＡコード化化合物の合成
【0053】
（１）ＤＮＡ－ＮＨ２を２５０ｍＭのｐＨ＝９．４ホウ酸緩衝液に溶解して１ｍＭの溶液に調製し、それぞれ予め－２０℃冷蔵庫で５分間冷却した化合物１（５０当量、２００ｍＭのＤＭＡ溶液）、ＨＡＴＵ（５０当量、４００ｍＭのＤＭＡ溶液）及びＤＩＰＥＡ（１００当量、４００ｍＭのＤＭＡ溶液）を混合した後、４℃冷蔵庫中で５分間保存した。前記混合物に調製したＤＮＡ－ＮＨ２溶液を入れ、さらに反応液を渦巻き振盪により十分に均一に混合し、反応液を室温条件で１２時間静置した。
反応終了後、エタノール沈殿を行い、溶液中に総体積の１０％の５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えた後、引き続き総体積の３倍の無水エタノールを加え、均一に振盪した後、反応液をドライアイス中で２時間凍結し、その後、１２０００ｒｐｍの回転速度下で０．５時間遠心分離し、上清を捨て、残りの沈殿を脱イオン水で溶解し、化合物２の粗製品を取得し、粗製品を精製せずにそのまま次の反応に使用した。
反応終了後、エタノール沈殿を行い、溶液中に総体積の１０％の５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えた後、引き続き総体積の３倍の無水エタノールを加え、均一に振盪した後、反応液をドライアイス中で２時間凍結し、その後、１２０００ｒｐｍの回転速度下で０．５時間遠心分離し、上清を捨て、残りの沈殿を脱イオン水で溶解し、化合物２の粗製品を取得し、粗製品を精製せずにそのまま次の反応に使用した。
【0054】
（２）得られた上記の化合物２の粗製品を純水で溶解して１ｍＭの溶液に調製し、この溶液に総体積の１０％のピペリジンを加え、渦巻き振盪により十分に均一に混合した後、反応液を室温で１－３時間反応させた。
反応終了後に、エタノール沈殿を行い、溶液に総体積の１０％の５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えた後、引く続き総体積の３倍の無水エタノールを加え、均一に振盪した後、反応液をドライアイス中で２時間凍結し、その後、１２０００ｒｐｍの回転速度で０．５時間時間遠心分離し、上清を捨て、残りの沈殿を脱イオン水で溶解し、化合物３の粗製品を取得し、粗製品を精製せずにそのまま次の反応に使用した。
反応終了後に、エタノール沈殿を行い、溶液に総体積の１０％の５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えた後、引く続き総体積の３倍の無水エタノールを加え、均一に振盪した後、反応液をドライアイス中で２時間凍結し、その後、１２０００ｒｐｍの回転速度で０．５時間時間遠心分離し、上清を捨て、残りの沈殿を脱イオン水で溶解し、化合物３の粗製品を取得し、粗製品を精製せずにそのまま次の反応に使用した。
【0055】
（３）得られた上記の化合物３を２５０ｍＭのｐＨ＝９．４ホウ酸緩衝液に溶解して１ｍＭの溶液に調製し、順にカルボン酸化合物４（１００当量、１００ｍＭのＤＭＡ溶液）及びＤＭＴ－ＭＭ溶液（１００当量、１００ｍＭの脱イオン水溶液）を加え、渦巻き振盪により十分に均一に混合した後、反応液を室温条件下で１２－１６時間静置した。
反応終了後に、エタノール沈殿を行い、溶液中に総体積の１０％の５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えた後、引き続き総体積の３倍の無水エタノールを加え、均一に振盪した後、反応液をドライアイス中で２時間凍結し、その後、１２０００ｒｐｍの回転速度で０．５時間遠心分離し、上清を捨て、残りの沈殿を脱イオン水溶解し、化合物５の粗製品を取得し、粗製品を分取クロマトグラフィーにより精製して純粋な化合物５を得た。
反応終了後に、エタノール沈殿を行い、溶液中に総体積の１０％の５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えた後、引き続き総体積の３倍の無水エタノールを加え、均一に振盪した後、反応液をドライアイス中で２時間凍結し、その後、１２０００ｒｐｍの回転速度で０．５時間遠心分離し、上清を捨て、残りの沈殿を脱イオン水溶解し、化合物５の粗製品を取得し、粗製品を分取クロマトグラフィーにより精製して純粋な化合物５を得た。
【0056】
（４）得られた上記の１００ｎｍｏｌの化合物５を純水に溶解して１ｍＭの溶液（１００ｕＬ）に調製し、プライマー１（１６６．６ｎｍｏｌ、１．６７当量、２ｍＭの水溶液、８３．３ｕＬ）、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ緩衝液（６６．６ｕＬ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（９．６ｕＬ、１３．９７ｕｇ／ｕＬ）及び脱イオン水（４０７ｕＬ）を加え、渦巻き振盪した後、２０℃で１６時間反応させた。
【0057】
反応終了後に、エタノール沈殿を行い、溶液中に総体積の１０％の５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えた後、引き続き総体積の３倍の無水エタノールを加え、均一に振盪した後、反応液をドライアイス中で２時間凍結させ、その後、１２０００ｒｐｍの回転速度で０．５時間遠心分離し、上清を捨て、残りの沈殿を脱イオン水で溶解し、粗製品を得た。
【0058】
上記の粗製品を純水に溶解して１ｍＭの溶液（１００ｕＬ）に調製し、結合したＤＮＡ断片１－ＤＮＡ断片２－ＤＮＡ断片３－プライマー２－プライマーＩＤ（１００ｎｍｏｌ、１当量、２ｍＭの水溶液、５０ｕＬ）、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ緩衝液（８０ｕＬ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（４．３１ｕＬ，１３．９７ｕｇ／ｕＬ）及び脱イオン水（１６５ｕＬ）を加え、反応混合物を渦巻き振盪した後、２０℃で１６時間反応させた。
【0059】
反応終了後に、エタノール沈殿を行い、溶液中に総体積の１０％の５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えた後、引き続き総体積の３倍の無水エタノールを加え、均一に振盪した後、反応液をドライアイス中で２時間凍結し、その後、１２０００ｒｐｍの回転速度で０．５時間遠心分離し、上清を捨て、残りの沈殿を脱イオン水で溶解し、化合物６を得た。
【0060】
上記の合成方法により４種類の化合物６（化合物６－１、化合物６－２、化合物６－３、化合物６－４）を合成した。具体的な構造を図２に示す。
【0061】
ステップ２：ＤＮＡコード化化合物スクリーニング
１．５ｍＬ遠沈管中で最終濃度が０．２ｎＭのＤＮＡコード化化合物及び１００ｐｍｏｌの標的タンパク質を総体積が１００μＬスクリーニング緩衝液（スクリーニング緩衝液の成分：１２．５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．３ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）に加えた。また、ブランク対照群（標的タンパク質を添加しない）を用意した。標的タンパク質群及びブランク対照群は、それぞれ２群であった。反応物が入った遠沈管を回転ミキサーに置き、２０ｒｐｍ、２５℃で６０ｍｉｎインキュベートした。インキュベートしたサンプル（標的群及びブランク対照群のそれぞれ１群）を３６５ｎｍのＵＶ条件下で氷上で１０ｍｉｎ光照射して光架橋反応を行った。もう１群のサンプル（標的群及びブランク対照群のそれぞれ１群）を３６５ｎｍでのＵＶ光照射せずに、氷上に１０ｍｉｎ静置した。
１．５ｍＬ遠沈管中で最終濃度が０．２ｎＭのＤＮＡコード化化合物及び１００ｐｍｏｌの標的タンパク質を総体積が１００μＬスクリーニング緩衝液（スクリーニング緩衝液の成分：１２．５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．３ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）に加えた。また、ブランク対照群（標的タンパク質を添加しない）を用意した。標的タンパク質群及びブランク対照群は、それぞれ２群であった。反応物が入った遠沈管を回転ミキサーに置き、２０ｒｐｍ、２５℃で６０ｍｉｎインキュベートした。インキュベートしたサンプル（標的群及びブランク対照群のそれぞれ１群）を３６５ｎｍのＵＶ条件下で氷上で１０ｍｉｎ光照射して光架橋反応を行った。もう１群のサンプル（標的群及びブランク対照群のそれぞれ１群）を３６５ｎｍでのＵＶ光照射せずに、氷上に１０ｍｉｎ静置した。
【0062】
２５０μＬスクリーニング緩衝液で３回平衡した後の２５μＬのＮｉチャージ磁気ビーズ（beads）を、ＵＶ光照射した又は光照射しなかったサンプルに加え、遠沈管を回転ミキサーに置き、２０ｒｐｍ、２５℃で３０ｍｉｎインキュベートし、標的タンパク質タグと特異的磁気ビーズとの親和作用により、マグネットスタンドにより標的タンパク質及び標的タンパク質にＤＮＡコード化化合物が結合した複合体を溶液から分離し、上清を収集して保存した。
【0063】
５００μＬスクリーニング緩衝液で分離後の磁気ビーズを再懸濁させ、回転ミキサーを用いて２０ｒｐｍ、２５℃で１ｍｉｎ洗浄し、非特異的に結合したＤＮＡコード化化合物を除去し、マグネットスタンドで磁気ビーズと上清を分離し、５回繰り返した。
１００μＬ溶出緩衝液（１２．５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄後の磁気ビーズを再懸濁させ、金属浴中で９５℃に加熱して１０ｍｉｎ溶出し、マグネットスタンドで磁気ビーズと溶出したＤＮＡコード化化合物を分離した。ビーズ上に結合したのは、光架橋により得られたＤＮＡコード化化合物サンプルであった。溶出上清は、親和作用により得られたＤＮＡコード化化合物サンプルであった。
１００μＬ溶出緩衝液（１２．５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄後の磁気ビーズを再懸濁させ、金属浴中で９５℃に加熱して１０ｍｉｎ溶出し、マグネットスタンドで磁気ビーズと溶出したＤＮＡコード化化合物を分離した。ビーズ上に結合したのは、光架橋により得られたＤＮＡコード化化合物サンプルであった。溶出上清は、親和作用により得られたＤＮＡコード化化合物サンプルであった。
【0064】
希釈緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて溶出上清及びビーズを２０倍希釈し、ＤＮＡコード化化合物を１００倍希釈し、上記のサンプル、プライマー、脱イオン水及びｑＰＣＲ ｍｉｘ（ＡＢＩ、Ａ２５７７８）を２０ｕＬの反応液に調製し、９５℃、１０ｍｉｎ予備変性、３５サイクル（９５℃、１０ｓ変性；５５℃、１０ｓアニーリング；７２℃、１０ｓ延伸）の条件でｑＰＣＲ検出を行った。延伸ステップに信号収集を設置した。ｑＰＣＲ反応終了後に分析し、アボガドロ定数によりサンプル分子コピー数の計算及びサンプル間の分子コピー数の違いの分析を行った。
【0065】
上記のスクリーニング試験結果を図５に示す。試験結果から分かるように、従来のＤＮＡコード化化合物ライブラリースクリーニング条件下（非光照射条件）で、ＤＮＡ回収率比の範囲は０．５１－１．６７であり、スクリーニング信号には明らかな区別度がない。本発明のＤＮＡコード化化合物及びスクリーニング方法では、ＤＮＡ回収率比の範囲は２．２７－１５１．９２であり、スクリーニング信号の区別度は顕著に向上し、回収率比は化合物の活性（図３）と正の相関がある。
【0066】
実施例２：ＤＮＡコード化化合物ライブラリーの合成及びホスファターゼ標的によるスクリーニング
【0067】
実施例１で製造された出発ＤＮＡ（化合物３）を原料とし、ＷＯ２００５０５８４７９に記載のＤＮＡコード化化合物ライブラリー構築方法により、９６２個の化合物を含む以下の構造を有するＤＮＡコード化化合物ライブラリーを構築した。
上記の化合物ライブラリーをステップでスクリーニングした。
【0068】
（１）１．５ｍＬ遠沈管中で最終濃度が５．６５ｎＭのＤＮＡコード化化合物ライブラリー及び２５０ｐｍｏｌの標的タンパク質を総体積が１００μＬのスクリーニング緩衝液（スクリーニング緩衝液の成分：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．３ｍｇ／ｍＬのｓｓＤＮＡ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）に加え、また、ブランク対照群（標的タンパク質を添加しない）を用意した。標的タンパク質群及びブランク対照群をそれぞれ２群を用意した。反応物が入った遠沈管を回転ミキサーに置き、２０ｒｐｍ、２５℃で６０ｍｉｎインキュベートした。インキュベートした後のサンプル（標的群及びブランク対照群のそれぞれ１群）を３６５ｎｍのＵＶ条件下で氷上で１０ｍｉｎ光照射して光架橋反応を行った。もう１群のサンプル（標的群及びブランク対照群のそれぞれ１群）に対して３６５ｎｍのＵＶ光照射を行わず、氷上に１０ｍｉｎ静置した。
【0069】
（2）２００μＬスクリーニング緩衝液で３回平衡した後の２０μＬのＮｉチャージ磁気ビーズを、ＵＶ光照射した又は光照射しなかったサンプルに加え、遠沈管を回転ミキサーに置き、２０ｒｐｍ、２５℃で３０ｍｉｎインキュベートし、標的タンパク質タグと特異的磁気ビーズとの親和作用により、マグネットスタンドにより標的タンパク質及び標的タンパク質にＤＮＡコード化化合物が結合した複合体を溶液から分離し、上清を収集して保存した。
【0070】
（3）５００μＬスクリーニング緩衝液で分離後の磁気ビーズを再懸濁させ、回転ミキサーを用いて２０ｒｐｍ、２５℃で１ｍｉｎ洗浄し、非特異的に結合したＤＮＡコード化化合物を除去し、マグネットスタンドで磁気ビーズと上清を分離し、５回繰り返した。
【0071】
（４）５５μＬ溶出緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄後の磁気ビーズを再懸濁させ、金属浴中で９５℃に加熱して１０ｍｉｎ溶出し、マグネットスタンドで磁気ビーズと溶出したＤＮＡコード化化合物を分離した。ビーズ上に結合したのは、光架橋により得られたＤＮＡコード化化合物サンプルであった。溶出上清は、親和作用により得られたＤＮＡコード化化合物サンプルであった。
【0072】
（５）希釈緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて溶出上清及びビーズを２０倍希釈し、ＤＮＡコード化化合物を１００倍希釈し、上記のサンプル、プライマー、脱イオン水及びｑＰＣＲ ｍｉｘ（ＡＢＩ、Ａ２５７７８）を２０ｕＬの反応液に調製し、９５℃、１０ｍｉｎ予備変性、３５サイクル（９５℃、１０ｓ変性；５５℃、１０ｓアニーリング；７２℃、１０ｓ延伸）の条件でｑＰＣＲ検出を行った。延伸ステップに信号収集を設置した。ｑＰＣＲ反応終了後に分析し、アボガドロ定数によりサンプル分子コピー数の計算及びサンプル間の分子コピー数の違いの分析を行った。
【0073】
上記の化合物ライブラリー及びスクリーニング方法により得られた試験結果を図６に示す。図６において、縦座標Ｓ３／Ｓ４溶出は従来のＤＮＡコード化化合物ライブラリースクリーニング信号の結果であり、縦座標の数値はＤＮＡ回収率比である。結果から分かるように、全ての化合物のＤＮＡ回収率比は０－２であり、明らかな信号区別度がない。図６において、横座標Ｓ１／Ｓ３ビーズは本発明のＤＮＡコード化化合物ライブラリースクリーニング信号の結果であり、縦座標の数値はＤＮＡ回収率比である。結果から分かるように、化合物のＤＮＡ回収率比は０－６０であり、明らかな信号区別度がある。
【0074】
実施例３：ＤＮＡコード化化合物ライブラリーの合成及びキナーゼ標的のスクリーニング
実施例１及びＷＯ２００５０５８４７９に記載のＤＮＡコード化化合物ライブラリーの構築方法により、図７に示される７４１７個の化合物を含むＤＮＡコード化化合物ライブラリーを構築した。ここで、Ｌは、異なる長さのリンカーである。
実施例２のスクリーニング方法により、上記の化合物ライブラリーを用いてキナーゼ標的ＰＡＫ４をスクリーニングした。スクリーニングの各群を表１に示す。表１において、「＋」は対応する条件があることを意味し、「－」は対応する条件がないことを意味する。
実施例１及びＷＯ２００５０５８４７９に記載のＤＮＡコード化化合物ライブラリーの構築方法により、図７に示される７４１７個の化合物を含むＤＮＡコード化化合物ライブラリーを構築した。ここで、Ｌは、異なる長さのリンカーである。
実施例２のスクリーニング方法により、上記の化合物ライブラリーを用いてキナーゼ標的ＰＡＫ４をスクリーニングした。スクリーニングの各群を表１に示す。表１において、「＋」は対応する条件があることを意味し、「－」は対応する条件がないことを意味する。
【0075】
表１：スクリーニングの各群の状況
【0076】
スクリーニング信号の結果を図８に示す。図８において、横縦座標は、それぞれ異なるスクリーニング群のスクリーニング信号エンリッチメント（ｓｉｇｎａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）状況（分子エンリッチメント状況）を示し、数値は、エンリッチメント程度を示す。図１から図４は、本発明の化合物ライブラリー及びスクリーニング方法によりより良好な信号エンリッチメント状況を得ることができることを示す。また、図１は、分子がタンパク質以外の材料（例えば、磁気ビーズなど）にエンリッチメントすることがないことを示す。図２は、光照射による共有結合架橋では分子のエンリッチメント程度が非光照射条件下でのエンリッチメント程度よりも遥かに高いことを示す。図３は、競合分子によって分子の信号強度が低下することを示し、正しい標的ポケットに作用することを示している。図４は、分子がひどい非特異的結合を発生しないことを示す。
【0077】
試験結果から分かるように、本発明のＤＮＡコード化化合物／ライブラリー及びスクリーニング方法により、化合物と標的との結合を増強させ、化合物、特に低親和性化合物のスクリーニング信号での区別度を向上させ、積極的な効果を奏することができる。
【0078】
以上より、本発明によれば、ＤＮＡコード化化合物、化合物ライブラリーの合成及びスクリーニング方法が提供される。本発明のＤＮＡコード化化合物ライブラリーを標的と共にインキュベートしたうえ、共有結合架橋により化合物と標的との結合を増強でき、従来のＤＮＡコード化化合物ライブラリー親和スクリーニングと比較して、化合物、特に低親和性化合物のスクリーニング信号での区別度を向上させることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
