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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-22
(45)【発行日】2024-12-02
(54)【発明の名称】ナノ粒子に自己組織化するポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20241125BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241125BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20241125BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20241125BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241125BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20241125BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241125BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241125BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20241125BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20241125BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20241125BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00 ZNA
C12N15/11 Z
C12N15/88 Z
A61K9/51
A61K31/7088
A61K31/713
A61K31/7105
A61K48/00
A61K47/42
A61K47/69
C12N15/113 Z
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021505980
(86)(22)【出願日】2019-08-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-02
(86)【国際出願番号】 EP2019071143
(87)【国際公開番号】W WO2020030654
(87)【国際公開日】2020-02-13
【審査請求日】2022-07-27
(31)【優先権主張番号】18187862.0
(32)【優先日】2018-08-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】506110634
【氏名又は名称】イーティーエイチ・チューリッヒ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】エドワードソン， トーマス ジョージ ワット
(72)【発明者】
【氏名】ヒルバート， ドナルド
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１３８５２５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】HEINZE, K. et al.，Protein Nanocontainers from Nonviral Origin: Testing the Mechanics of Artificial and Natural Protein Cages by AFM，The Journal of Physical Chemistry B，2016年，Vol. 120，P. 5945-5952，https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.6b01464
【文献】LILAVIVAT, S. et al.，In Vivo Encapsulation of Nucleic Acids Using an Engineered Nonviral Protein Capsid，Journal of the American Chemical Society，2012年，Vol. 134, No. 132，P. 13152-13155，https://doi.org/10.1021/ja302743g
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸配列Ｉを含むポリペプチドであって、前記アミノ酸配列Ｉが、配列番号２～５、ならびに配列番号１０～１６、３７、および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列である、ポリペプチド。
【請求項2】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項3】
請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つ含むナノ粒子。
【請求項4】
請求項３に記載のナノ粒子と、前記ナノ粒子にカプセル化されている１つ以上のカーゴ分子と、を含む、複合体。
【請求項5】
前記１つ以上のカーゴ分子が、１つ以上のオリゴヌクレオチドであり、好ましくは前記１つ以上のオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および抗ｍｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである、請求項４に記載の複合体。
【請求項6】
前記ナノ粒子にカプセル化された前記１つ以上のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡｓｅ加水分解を受けにくい、請求項４または５に記載の複合体。
【請求項7】
細胞をトランスフェクションするためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、前記細胞を請求項４～６のいずれかに記載の複合体と接触させる段階を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ナノ粒子に自己組織化するポリペプチドの分野に関する。特に、本発明は、アミノ酸配列Ｉ（配列番号１）を含むポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸配列、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含むナノ粒子、該ナノ粒子および１つ以上の負電荷のカーゴ分子を含む複合体、ならびに細胞を該複合体でトランスフェクションするための方法に関する。
【0002】
関連技術
オリゴヌクレオチド（ＯＮ）は、多くの潜在的な臨床用途を有する分子医学の分野であるが、それらの次善の薬物動態特性は、薬物開発を実質的に妨げている（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００９，８，１２９－１３８）。特に、ＯＮはかなり大きく、高電荷の実体であり、拡散によって細胞に進入しないため、ＯＮの細胞内送達は依然として重要な障害である（Ｌｕｎｄｉｎ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ｔｈｅ Ｐａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｔ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１５，２６，４７５－４８５）。インビボ用途でのさらなる懸念には、生物学的血清中に存在するヌクレアーゼに対する感受性が含まれ、急速な分解、ならびに尿中排泄および所望されないオフターゲット効果、ならびに細胞内および細胞外免疫応答の活性化をもたらす。
オリゴヌクレオチド（ＯＮ）は、多くの潜在的な臨床用途を有する分子医学の分野であるが、それらの次善の薬物動態特性は、薬物開発を実質的に妨げている（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００９，８，１２９－１３８）。特に、ＯＮはかなり大きく、高電荷の実体であり、拡散によって細胞に進入しないため、ＯＮの細胞内送達は依然として重要な障害である（Ｌｕｎｄｉｎ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ｔｈｅ Ｐａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｔ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１５，２６，４７５－４８５）。インビボ用途でのさらなる懸念には、生物学的血清中に存在するヌクレアーゼに対する感受性が含まれ、急速な分解、ならびに尿中排泄および所望されないオフターゲット効果、ならびに細胞内および細胞外免疫応答の活性化をもたらす。
【0003】
これらの欠点を克服するために、バクテリオファージＰ２２に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）（Ｑａｚｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．２０１６，１３，１１９１－１１９６）またはＱウイルス様粒子（ＶＬＰ）機能性ナノ粒子などのオリゴヌクレオチド送達システムの使用が提唱された（Ｆａｎｇ，Ｐ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１７，４５，３５１９）。しかしながら、所望の治療カーゴを担持するウイルス様粒子の作成は、複雑で、費用がかかり、かつ依然として安全性の懸念を伴う。
【0004】
オリゴヌクレオチド送達ベクターとして広範な材料が提唱されているが、単純、効果的、安全、かつ非毒性の送達の解決策が依然として探し求められている（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｋｎｏｃｋｉｎｇ ｄｏｗｎ ｂａｒｒｉｅｒｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００９，８，１２９－１３８）。最近、高度に秩序化され、かつ対称的なケージ様ナノ構造に自己組織化することができるコンピュータ設計されたタンパク質の開発が説明されている（Ｋｉｎｇ，Ｎ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３６，１１７１－１１７４、米国第９，６３０，９９４（Ｂ２）号）。さらに、ヒト細胞から小胞内へのそれら自体の放出を指示するエンベロープタンパク質ナノケージ（ＥＰＮ）に関して、このような自己組織化タンパク質ナノケージの設計が最近説明されている。Ｎ末端ｐ６ＧａｇペプチドおよびＣ末端ＰＨドメインに融合されるとき、ＥＰＮ形成をサポートする設計された対称的な自己組織化足場のうちの１つは、Ｏ３－３３と名付けられた（Ｋｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，ｏｐ．ｃｉｔ．；Ｊ．Ｖｏｔｔｅｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，５４０，２９２－２９５）。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、ナノ粒子に自己組織化することができるだけでなく、該ナノ粒子が、高い結合親和性をもつオリゴヌクレオチドなどの負に帯電した高分子をカプセル化し、インビトロおよびインビボで該高分子を送達することができる、設計された非天然の新規ポリペプチドを提供する。さらに、本発明の好ましいナノ粒子は、哺乳動物細胞によって効率的に取り込まれ、それらのカーゴを放出し、例えば、ＲＮＡ干渉およびノックダウン遺伝子発現を誘導できることが見出された。したがって、設計された非天然の新規ポリペプチドは、先行技術の送達ビヒクルの所望されない特性を最小化または回避しながら、カーゴ送達、特に核酸送達を可能にするナノ粒子をもたらすように設計された。
【0006】
重要なことに、本発明のナノ粒子は、容易に高収率で作成および精製され、任意の高分子、特に任意のオリゴヌクレオチドを該ナノ粒子にインビトロでパッケージングすることを可能にする。さらに、したがって、本発明のナノ粒子は、例えば、遺伝的干渉などの様々な異なる用途で遺伝子発現を調節するための治療ＯＮなどの、多種多様な該カーゴを細胞内に送達するのに有用な一般的プラットフォームを提供する。したがって、それらの有用性は、バイオテクノロジーの用途および治療用途を包含する。さらに、本発明のナノ粒子は、典型的には均一なサイズを有し、特にインビボで安全であり、耐容性が良好であり、さらに典型的には生分解性である。加えて、設計された非天然の新規ポリペプチドは、典型的かつ好ましくは、測定可能であり経済的であり、遺伝的および翻訳後（化学的）修飾の両方を可能にする組換え発現によって容易に作成することができる。本発明のナノ粒子の特性を調整することにより、さらに、ナノ粒子は、細胞に進入するだけでなく、細胞質内のカーゴを条件付きで放出し、例えば、記載の遺伝子発現を制御することができる。
【0007】
したがって、本発明者らによって開発された非天然の新規ポリペプチドは、自己組織化してナノ粒子になり、これは、カーゴ、好ましくは、ＯＮなどの負に帯電した高分子をカプセル化および送達することができる。
【0008】
したがって、第１の態様では、本発明は、以下からなるアミノ酸配列Ｉを含むポリペプチドを提供する。
ＭＸ１３ＱＡＩＧＩＬＥＬＸ１ＳＩＡＡＧＭＥＬＧＤＡＭＬＫＳＡＸ１４ＶＸ１５ＬＬＶＳＫＴＩＳＸ２ＧＫＦＬＬＭＬＧＧＤＩＸ８ＡＩＸ９Ｘ１２ＡＩＸ１０ＴＧＴＸ１１ＱＡＧＸ３ＬＬＶＤＳＬＶＬＡＸ１６ＩＨＰＳＶＬＰＡＩＸ１７ＧＸ１８ＮＸ１９ＶＸ２０Ｘ７Ｘ２１ＱＡＶＧＩＶＥＴＸ４ＳＶＡＡＣＩＳＡＡＤＸ２２ＡＶＸ２３ＧＳＸ２４ＶＴＬＶＲＶＨＭＡＸ５ＧＩＧＧＫＣＹＭＶＶＡＧＤＶＳＤＶＡＬＡＶＴＶＡＳＳＳＡＧＡＹＧＸ６ＬＶＹＡＳＬＩＰＸ２５ＰＨＸ２６ＡＭＷＸ２７ＱＭＶＸ２８ＧＸ２９Ｅ（配列番号１）
Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３個が互いに独立して正に帯電したアミノ酸であることを条件として、Ｘ１～Ｘ２９のいずれかは、互いに独立してアミノ酸のものであり、任意選択で、配列番号１のＸ１～Ｘ２９で示される以外の位置の最大５個のアミノ酸は、任意のアミノ酸によって交換される。
ＭＸ１３ＱＡＩＧＩＬＥＬＸ１ＳＩＡＡＧＭＥＬＧＤＡＭＬＫＳＡＸ１４ＶＸ１５ＬＬＶＳＫＴＩＳＸ２ＧＫＦＬＬＭＬＧＧＤＩＸ８ＡＩＸ９Ｘ１２ＡＩＸ１０ＴＧＴＸ１１ＱＡＧＸ３ＬＬＶＤＳＬＶＬＡＸ１６ＩＨＰＳＶＬＰＡＩＸ１７ＧＸ１８ＮＸ１９ＶＸ２０Ｘ７Ｘ２１ＱＡＶＧＩＶＥＴＸ４ＳＶＡＡＣＩＳＡＡＤＸ２２ＡＶＸ２３ＧＳＸ２４ＶＴＬＶＲＶＨＭＡＸ５ＧＩＧＧＫＣＹＭＶＶＡＧＤＶＳＤＶＡＬＡＶＴＶＡＳＳＳＡＧＡＹＧＸ６ＬＶＹＡＳＬＩＰＸ２５ＰＨＸ２６ＡＭＷＸ２７ＱＭＶＸ２８ＧＸ２９Ｅ（配列番号１）
Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３個が互いに独立して正に帯電したアミノ酸であることを条件として、Ｘ１～Ｘ２９のいずれかは、互いに独立してアミノ酸のものであり、任意選択で、配列番号１のＸ１～Ｘ２９で示される以外の位置の最大５個のアミノ酸は、任意のアミノ酸によって交換される。
【0009】
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【0010】
さらなる態様において、本発明は、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含むナノ粒子を提供する。
【0011】
さらなる態様において、本発明は、本発明のナノ粒子および１つ以上のカーゴ分子を含む複合体を提供し、該１つ以上のカーゴ分子は、該ナノ粒子にカプセル化される。
【0012】
さらなる態様において、本発明は、該細胞を本発明の複合体と接触させる段階を含む、細胞をトランスフェクションするための方法を提供する。
【0013】
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを該ナノ粒子に自己組織化する段階を含む、本発明のナノ粒子を製造するための方法を提供する。
【0014】
さらなる態様において、本発明は、本発明のナノ粒子を１つ以上の負に帯電した高分子と混合する段階を含む、本発明の複合体を製造するための方法を提供する。
【0015】
さらなる態様において、本発明は、細胞をトランスフェクションするための本発明の複合体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】（ａ）１つの三量体がリボン状で示されている、４回対称軸および２回対称軸からのＯＰケージの表面モデル。Ｘ線回折データから作成されたモデル。（ｂ）アルギニン挿入位置が黒球として示されている、１つの三量体の側面図。（ｃ）アルギニン位置が黒球として示されている、三量体の内腔表面。（ｄ）ＯＰのネガティブ染色透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）。
【図2】（ａ）Ａｔｔｏ４８８蛍光により可視化されるＯＰとＡｔｔｏ４８８標識ｓｓＤＮＡの電気泳動移動度シフトアッセイ。（ｂ）ＳＥＣで精製されたＯＰ：核酸複合体の吸光度スペクトル。（Ｃ）ｋｏｎを決定するための［ＯＰ］対ＯＰの添加時にＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡカーゴの蛍光消光から得られる、Ｋｏｂｓ値のプロット。（ｄ）非標識競合ＤＮＡの添加により誘導されたＯＰケージから放出されたＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡの蛍光回復のプロット。
【図3】（ａ）フローサイトメトリーにより決定される（ｎ＝３）、ＯＰ有り無し下におけるＡｔｔｏ４８８－ＤＮＡの細胞内取り込み。（ｂ）Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡまたはＯＰ：Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡ（Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡカーゴとＯＰ）で処理されたＨｅＬａ細胞の共焦点蛍光顕微鏡。Ｈｏｅｃｈｓｔとは核染色を指す。（ｃ）異なる細胞株にわたる細胞取り込みのフローサイトメトリー分析。２００ｎＭのＡｔｔｏ４８８－ＤＮＡまたはＯＰ：Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡで１８時間処理した後の７つの異なる細胞型の蛍光強度の中央値。蛍光強度の中央値は１０，０００個の細胞から得られた。ＭＣＦ－７－乳がん、ＨｅｐＧ２－肝臓がん、Ａ４３１－皮膚がん、ＨＴ－２９－結腸がん、ＣＨＯ－Ｋ１－ハムスター卵巣（非がん性）、Ｖｅｒｏ－アフリカミドリザル腎臓（非がん性）。
【図4】（ａ）フローサイトメトリーにより決定されるＧＦＰノックダウン（ｎ＝４）。ＯＰ：スクランブルとは、ＧＦＰ ｍＲＮＡ、または任意の他の内因性配列を標的としないスクランブルｓｉＲＮＡを指し、Ｈｉｓ６なしとは、Ｈｉｓ６タグのないＯＰケージにパッケージングされるｓｉＲＮＡを指す。（ｂ）ＯＰからのｄｓＤＮＡカーゴのｔＲＮＡ誘導性放出の経時的な未変性ＡＧＥ分析。Ａｔｔｏ４８８蛍光によって可視化される。（ｃ）異なる細胞株にわたる細胞取り込みのフローサイトメトリー分析。Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡまたはＯＰ：Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡの２００ｎＭで１８時間処理した後の、７つの異なる細胞型の蛍光強度の中央値。蛍光強度の中央値は１０，０００個の細胞から得られた。
【図5】静電ポテンシャル面。内面および外面の両方を示す、Ｏ３－３３およびＯＰの結晶構造からの三量体サブユニットのクーロン表面比較。
【図6】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。粗細胞溶解物由来のタンパク質およびＮｉ－ＮＴＡから単離された生成物の両方が示される。ＯＰの移動度が低いのは、分子量の違いではなく、追加の正に帯電したアミノ酸によるものである。サイズ排除クロマトグラフィー後、ＯＰの上の微かなバンドが除去される。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで可視化されたゲル。Ｎｉ－ＮＴＡ後のＯＰタンパク質の典型的な収率は、１００ｍｇ／Ｌ Ｅ．ｃｏｌｉ培養液である。
【図7】Ｏ３－３３およびＯＰのＳＥＣ。本発明のＯ３－３３および正に帯電したケージ状ナノ粒子であるＯＰのサイズ排除クロマトグラフィー。Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーからの粗混合物および精製アセンブリの分析トレースの両方が示される。点線は２６０ｎｍ（核酸）での吸光度に相当し、実線は２８０ｎｍ（タンパク質）での吸光度に相当する。ＴＥＭ分析に基づくと、ＯＰ（Ｎｉ－ＮＴＡ）の１２～１４ｍＬのピークには、代替の４次アセンブリではなく、完全に組織化されたケージの二量体、三量体、および高次の凝集体が含まれる。ＯＰ（Ｎｉ－ＮＴＡ）の２２ｍＬでのピークには、Ｅ．ｃｏｌｉでのタンパク質発現中に搭載され、ＳＥＣによって簡単に除去された核酸断片が含まれる。１６ｍＬでの主要ピークは、収集され、さらに特性が明らかにされたタンパク質の溶出画分を示す。ＯＰのＳＥＣが代表的であり、ＯＴＲ１０１～ＯＴＲ５０３は約１６ｍＬの同等の溶出量を示す。
【図8】Ｏ３－３３およびＯＰのＤＬＳおよびＡＧＥ（ａ）原型（Ｏ３－３３）および正に帯電した（ＯＰ）ケージ変異型の動的光散乱（ＤＬＳ）。（ｂ）未変性アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）（３％）；レーン１：Ｏ３－３３、レーン２：ＯＰ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色。ＳＥＣ、ＤＬＳ、ＴＥＭ、およびＸ線回折データを考えると、Ｏ３－３３と比較してＯＰの移動度が低下しているのは、サイズの変化ではなく、正電荷の増加によるものである。（ｃ）ＯＰ変異型の３％ＡＧＥ。タンパク質はＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色。移動度の違いは、サイズの変化ではなく、全体的な電荷によるものである。スミアリングは、ケージの分解ではなく、大量のタンパク質が搭載されたことに起因する。レーン１：Ｏ３－３３。レーン２：ＯＴＲ１０１。レーン３：ＯＴＲ２０１。レーン４：ＯＴＲ２０２。レーン５：ＯＴＲ２０３。レーン６：ＯＴＲ３０１。レーン７：ＯＴＲ３０２。レーン８：ＯＴＲ４０１。レーン９：ＯＴＲ４０２。レーン１０：ＯＴＲ５０１。レーン１１：ＯＴＲ５０２。レーン１２：ＯＴＲ５０３。レーン１３：ＯＰ。すべてのタンパク質は同等の電気泳動移動度を有し、ＳＥＣおよびＴＥＭの両方により粒子のサイズが同じであることが示されているため、正に帯電したアルギニン残基の数が増えると、わずかな偏差が生じる。まとめると、これらの特性評価アプローチは、すべての変異型の構造がＯＰと同じであるという仮説を裏付けている。
【図9】透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像。ＯＰおよびＯ３－３３のスケールバーは、１００ｎｍであり、ＯＴＲ５０１では２００ｎｍである。ネガティブ染色された透過型電子顕微鏡画像は、ＯＰおよびＯＴＲ１０１～ＯＴＲ５０３で得られた。本明細書に示されるＳＥＣは、ＯＰおよびすべての変異型ＯＴＲ１０１～ＯＴＲ５０３の代表である。これらの画像は、変異型のキャプシドの均一な分布およびＯＰと一致する形態を示唆している。
【図10】Ｏ３－３３およびＯＰとｓｓＤＮＡのＥＭＳＡ。ＯＰまたはＯ３－３３の当量が増加する、Ａｔｔｏ４８８標識ｓｓＤＮＡの電気泳動移動度シフトアッセイ。レーン１～７：Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡ＋ＯＰ、レーン８：Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡ、レーン９～１５：Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡ＋Ｏ３－３３。Ａｔｔｏ４８８蛍光によって可視化されたゲル。
【図11】ｄｓＤＮＡおよびｄｓＲＮＡを用いたＯＰのＥＭＳＡ。ＯＰケージのモル当量が増加し、どちらも長さ２１ｂｐを有する（ａ）ｄｓＤＮＡおよび（ｂ）ｄｓＲＮＡの電気泳動移動度シフト。０．５当量のＯＰでの遊離核酸の微かなバンドは、電気泳動中の非平衡状態によるものであり、全核酸のごく一部を表している。キャプシドあたり１４４個のアルギニン残基があるため、１４４ヌクレオチドのみをカプセル化すると、電荷的中性が達成され、これはキャプシドあたり３．６二重鎖（２１ ｂｐ）に相当する。本発明で観察される２つの二重鎖の最大負荷容量は、ＲＮＡ－ＲＮＡ電荷反発、球状容器によって課せられる物理的制約、および好ましい結合相互作用に寄与するために接触可能なアルギニン残基の要件の観点から合理的に説明できる。ＧｅｌＲｅｄで核酸を染色。
【図12】核酸カプセル化のＳＥＣ。ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはｄｓＲＮＡ（すべて長さ２１ｎｔ）のいずれかのケージあたり５当量でインキュベーション後、ＯＰと比較した空のＯＰケージのサイズ排除クロマトグラフィー。点線は２６０ｎｍ（核酸）での吸光度に相当し、実線は２８０ｎｍ（タンパク質）での吸光度に相当する。核酸を介した凝集は観察されない。すべての複合体は、空のＯＰケージと同じ保持容量を示すが、Ａ２６０／Ａ２８０比が増加し、オリゴヌクレオチドの内在化を示す。
【図13】動態測定。ＯＰケージ内のｓｓＤＮＡの１：１カプセル化動態を決定するための代表的なデータセット。ＥＭＳＡ（図１０）に見られるバンド強度から明らかなように、ＯＰによるＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡのカプセル化は、本明細書に示される時間分解結合アッセイに利用されたフルオロフォアの消光をもたらす。Ａｔｔｏ４８８フルオロフォアは４８８ｎｍで励起し、発光は５１５ｎｍで測定した。各実験（ａ～ｅ）では、Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡの濃度は１０ｎＭであり、ｔ＝０で追加されたＯＰの濃度はプロットに示す。（ｆ）正規化せずに、これら５つの濃度点の単一の指数フィット（ａ～ｅに表示）の比較。
【図14】ヌクレアーゼアッセイ。（ａ）示されたヌクレアーゼ（Ｂｚａｓｅ＝Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）で処理された遊離核酸（Ｒ＝ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤ＝ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤ＝ｄｓＤＮＡ）、および（ｂ）ＯＰケージにあらかじめパッケージングされた同じ核酸（これも示されたヌクレアーゼで処理された）を示す未変性アガロースゲル。レーンＭには、参照用に３００ｎｔのｓｓＲＮＡが含まれる。サンプルをヌクレアーゼとともにＰＢＳ中３７℃で１８時間インキュベーションした。ＤＮＡサンプルのＢｅｎｚｏｎａｓｅの場合、および一本鎖ＤＮＡのＤＮａｓｅＩでは、消化がいくらか不完全である（ａ、上部ゲルレーン８、１１、および１２）。それにもかかわらず、カプセル化されたサンプルと完全に消化されたサンプルとを比較すると、ＯＰは大きなヌクレアーゼであるＢｅｎｚｏｎａｓｅおよびＤＮａｓｅＩからカーゴを保護でき、小さなＲＮａｓｅＡはケージに入ってＲＮＡカーゴを消化できることがはっきりと明らかになる。
【図15】（ａ）２４時間および（ｂ）４８時間のインキュベーション後のＨｅＬａ細胞における種々の濃度でのＯＰおよびリポフェクタミン２０００の細胞毒性。対照：ＰＢＳまたは１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００界面活性剤（ｎ＝３）。
【図16】蛍光顕微鏡によるＧＦＰノックダウンの定性的評価。ＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰ発現のノックダウン。生細胞蛍光顕微鏡からの相対的なＧＦＰ含有量の観点から示される。本発明で見られる傾向は、定量的フローサイトメトリー分析とよく一致している（図４ａ）。サンプル名は各パネル対の上に表示され、左が明視野、右がＧＦＰ蛍光（４７０ｎｍでＬＥＤ励起、発光フィルター５３５／５０ｎｍ）である。各サンプルのｓｉＲＮＡ濃度は、１００ｎＭであり、画像はｓｉＲＮＡサンプルの添加４６時間後に得られた。スケールバーは１００μｍである。
【図17】より高いＤＮＡ対ＯＰ比での反応動態。Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡとＯＰの比率が高くなると、ＯＰケージあたり２分子のｓｓＤＮＡの搭載と一致する２つの効果が観察される。第１に、消光の増加が観察され、これは、（ａ）～（ｃ）のエンドポイントから明らかである。これは、ＯＰの小さな空洞内で有効濃度が高いフルオロフォアの自己消光によるものである可能性が最も高い。第２の効果は、単一から二重の指数関数的減衰への遷移であり、２つの異なる結合事象が明らかになる。（ｂ）および（ｃ）の場合、単一の指数フィットは実線で示され、二重の指数フィットは破線で示される。
【図18】Ｈｉｓ６タグのないＯＰの特性評価。（ａ）ＯＰ（レーン１）およびＯＰ－Ｈｉｓ６なし（レーン２）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ比較。（ｂ）ＯＰ－Ｈｉｓ６なしのＳＥＣは、ＯＰと同様の保持容量（１６ｍＬ）を示す。（ｃ）ＯＰ－Ｈｉｓ６なしのネガティブ染色ＴＥＭは、ＯＰと一致しているように見える。（ｄ）レーン１：ＯＰおよびレーン２：ＯＰ－Ｈｉｓなしの未変性ＡＧＥ。タンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで可視化したゲル。（ｅ）ＯＰ（レーン２）およびＯＰ－Ｈｉｓ６なし（レーン３）において１：１のモル比でｓｉＲＮＡカプセル化を示す未変性ＡＧＥ。レーン１は遊離ｓｉＲＮＡの対照である。核酸についてはＧｅｌＲｅｄで可視化。（ｆ）５当量のｓｉＲＮＡでインキュベーション後のＯＰ－Ｈｉｓ６なしのＳＥＣは、空のケージ（１６ｍＬ）と同じ保持容量を示すが、Ａ２６０／Ａ２８０比が増加し、オリゴヌクレオチドの内在化を示す。１９～２１ｍＬのピークは、過剰なＲＮＡに相当する。
【図19】ｔＲＮＡのカプセル化。１．２当量のＯＰケージの存在下でｔＲＮＡの完全な結合を示す未変性アガロースゲル分析。レーン１－ｔＲＮＡ、レーン２－ｔＲＮＡ＋ＯＰ。ＧｅｌＲｅｄで染色。
【図20】オリゴヌクレオチドとＯ３－３３のＥＭＳＡ。（ａ）核酸はＧｅｌＲｅｄ、および（ｂ）タンパク質はＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色した同じ未変性アガロースゲル。矢印：複合体（ナノ粒子とｓｓＤＮＡ）。未標識のｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、およびｄｓＲＮＡは、２当量のＯ３－３３でインキュベーション後に分析された。タンパク質ケージとオリゴヌクレオチドの間に相互作用はない。
【図21】異なるＤＮＡ配列の搭載。（ａ）ＤＮＡはＧｅｌＲｅｄ、および（ｂ）タンパク質はＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色した同じ未変性アガロースゲル（３％未変性ＡＧＥ）。下矢印：ｓｓＤＮＡ、上矢印：複合体（ナノ粒子とｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ）。各サンプルは、ｓｓＤＮＡとキャプシドの比率が２：１であり、オリゴヌクレオチドは１８～２６ｎｔの範囲であり、ランダム配列を含む（以下の表２に提供される）。レーン１－１８ｎｔ ｓｓＤＮＡ１、レーン２－２６ｎｔ ｓｓＤＮＡ、レーン３－ＯＰ、レーン４～１２－ＯＰ＋２当量の各種ｓｓＤＮＡ。
【図22】血清安定性。（ａ）ＲＮＡはＧｅｌＲｅｄ、および（ｂ）タンパク質はＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色した同じ未変性アガロースゲル。下矢印：ｄｓＲＮＡ、上矢印：複合体（ナノ粒子とｄｓＲＮＡ）、中矢印：ＢＳＡ。ｄｓＲＮＡを搭載したＯＰケージと血清タンパク質との明らかな相互作用はなく、ＲＮＡカーゴの置換または分解もない。レーン１－ｄｓＲＮＡ、レーン２－ＯＰ：ｄｓＲＮＡ、レーン３～７－３７℃で０．５、１、２、４、および７時間１０％ＦＢＳでインキュベーション後のＯＰ：ｄｓＲＮＡ、レーン８－１０％ＦＢＳのみ。
【図23】小角Ｘ線散乱。（ａ）ＯＰ、ＯＰ：ｄｓＤＮＡおよびＯＰ：ｄｓＲＮＡの１次元散乱曲線。実験データは点で示され、距離分布を作成するために使用される適合は灰色の線で示される。（ｂ）ＡＵＴＯＧＮＯＭ２－３を使用して上記のデータから計算されたＯＰ、ＯＰ：ｄｓＤＮＡ、およびＯＰ：ｄｓＲＮＡのペア距離分布関数。破線は、ＤＬＳ実験（図８ａ）から得られた粒径に対応し、距離でのテーリングが１４ｎｍを超えるのは、各タンパク質ケージ間の一時的な分子間相互作用によるものである。オリゴヌクレオチドと複合体を形成しても、タンパク質ケージの外径に変化はなく、密度は中空球のような粒子から充填球に推移する。両現象は、ＯＰの空洞内のオリゴヌクレオチドの内部移行と一致する。
【図24】Ｏ３－３３およびＯＰの円二色性スペクトル。実線は平均値であり、エラーバーは各タンパク質の３回の測定からの標準偏差を示す。
【図25】本発明のナノ粒子および複合体の調製および利用に関する概要。
【図26】電気泳動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により調べられたナノ粒子（ＮＰ）へのｓｓＤＮＡ搭載。（ａ）ＵＶ透過照明によるＡｔｔｏ４８８－吸光度で可視化された２％未変性ゲル。レーン１：Ｏ３－３３。レーン２：ＯＴＲ１０１。レーン３：ＯＴＲ２０１。レーン４：ＯＴＲ２０２。レーン５：ＯＴＲ２０３。レーン６：ＯＴＲ３０１。レーン７：ＯＴＲ３０２。レーン８：ＯＴＲ４０１。レーン９：ＯＴＲ４０２。レーン１０：ＯＴＲ５０１。レーン１１：ＯＴＲ５０２。レーン１２：ＯＴＲ５０３。レーン１３：ＯＰ。レーン１４：Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡ。幅広のバンドは、ＤＮＡバッチの不純物から生じる。（ｂ）タンパク質はＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで可視化された。
【図27】ｓｓＤＮＡカプセル化による蛍光消光。（ａ）１０ｎＭ Ａｔｔｏ－４８８ｓｓＤＮＡにおける５０ｎＭ濃度タンパク質でのすべての変異型の蛍光減衰。これは、この減衰速度がアルギニンの数および位置に依存することを示す。（ｂ）（ａ）の遅い変異型の拡大図。ここでは、Ｏ３－３３、ＯＴＲ１０１、ＯＴＲ２０１、ＯＴＲ２０２、およびＯＴＲ２０３がｓｓＤＮＡに結合していないことが明確に視認できる。
【図28】ナノ粒子（ＮＰ）へのｄｓＤＮＡ搭載のインビトロ研究。（ａ）ｈｐＤＮＡのＡｔｔｏ－４８８吸光度によって可視化された未変性ＡＧＥ。（ｂ）タンパク質の可視化のため、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色後の同じゲル。レーン１：ｈｐＤＮＡ。レーン２：ＯＴＲ３０１。レーン３：ＯＴＲ３０２。レーン４：ＯＴＲ４０１。レーン５：ＯＴＲ４０２。レーン６：ＯＴＲ５０１。レーン７：ＯＴＲ５０２。レーン８：ＯＴＲ５０３。レーン９：ＯＰ。
【図29】フローサイトメトリーで測定したＧＦＰノックダウン（ｎ＝３）。
【図30】ＥＬＩＳＡで測定したマウスのＯＰケージの免疫原性。ＯＰ特異的ＩｇＧ１（ａ）、ＩｇＧ２ａ（ｂ）、およびＩｇＧ２ｂ（ｃ）抗体価は、矢印で示されるように、ＯＰで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清で測定された。各点は、４匹のマウスの平均ＩｇＧ力価である。
【図31】ＥＬＩＳＡで測定したマウスにおけるＯＰケージの免疫原性の経時変化。ＯＰ特異的ＩｇＧ１（ａ）、ＩｇＧ２ａ（ｂ）、およびＩｇＧ２ｂ（ｃ）抗体価は、矢印で示されるように、ＯＰで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清で測定された。各点は、４匹のマウスの平均ＩｇＧ力価である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【0018】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈が他の意味に解する場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）／含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）／含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、要素、述べられた整数、段階、またはそれらの群の包含を意味するが、任意の他の要素、述べられた整数、段階、またはそれらの群の排除を意味しないと理解されるべきである。
【0019】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【0020】
数値に関連して使用される場合、「約」または「おおよそ」という用語は、示された数値よりも０～１０％小さい下限を有し、示された数値よりも０～１０％大きい上限を有する範囲内の数値を包含することを意味する。「約」または「おおよそ」という用語は、好ましくは±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±３％または最も好ましくは±０％（それぞれ所与の数値を参照）を意味する。本発明の各実施形態では、「約」は、削除される場合がある。本明細書に開示される値の全ての範囲は、範囲を定義する値を含む該範囲内にあるあらゆる全ての値を指し、含むものとする。
【0021】
第１の態様において、本発明は、以下からなるアミノ酸配列Ｉを含むポリペプチドに関する。
ＭＸ１３ＱＡＩＧＩＬＥＬＸ１ＳＩＡＡＧＭＥＬＧＤＡＭＬＫＳＡＸ１４ＶＸ１５ＬＬＶＳＫＴＩＳＸ２ＧＫＦＬＬＭＬＧＧＤＩＸ８ＡＩＸ９Ｘ１２ＡＩＸ１０ＴＧＴＸ１１ＱＡＧＸ３ＬＬＶＤＳＬＶＬＡＸ１６ＩＨＰＳＶＬＰＡＩＸ１７ＧＸ１８ＮＸ１９ＶＸ２０Ｘ７Ｘ２１ＱＡＶＧＩＶＥＴＸ４ＳＶＡＡＣＩＳＡＡＤＸ２２ＡＶＸ２３ＧＳＸ２４ＶＴＬＶＲＶＨＭＡＸ５ＧＩＧＧＫＣＹＭＶＶＡＧＤＶＳＤＶＡＬＡＶＴＶＡＳＳＳＡＧＡＹＧＸ６ＬＶＹＡＳＬＩＰＸ２５ＰＨＸ２６ＡＭＷＸ２７ＱＭＶＸ２８ＧＸ２９Ｅ（配列番号１）
Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３個が互いに独立して正に帯電したアミノ酸であることを条件として、Ｘ１～Ｘ２９のいずれかは、互いに独立してアミノ酸のものであり、任意選択で、配列番号１のＸ１～Ｘ２９で示される以外の位置の最大５個のアミノ酸は、任意のアミノ酸によって交換される。
ＭＸ１３ＱＡＩＧＩＬＥＬＸ１ＳＩＡＡＧＭＥＬＧＤＡＭＬＫＳＡＸ１４ＶＸ１５ＬＬＶＳＫＴＩＳＸ２ＧＫＦＬＬＭＬＧＧＤＩＸ８ＡＩＸ９Ｘ１２ＡＩＸ１０ＴＧＴＸ１１ＱＡＧＸ３ＬＬＶＤＳＬＶＬＡＸ１６ＩＨＰＳＶＬＰＡＩＸ１７ＧＸ１８ＮＸ１９ＶＸ２０Ｘ７Ｘ２１ＱＡＶＧＩＶＥＴＸ４ＳＶＡＡＣＩＳＡＡＤＸ２２ＡＶＸ２３ＧＳＸ２４ＶＴＬＶＲＶＨＭＡＸ５ＧＩＧＧＫＣＹＭＶＶＡＧＤＶＳＤＶＡＬＡＶＴＶＡＳＳＳＡＧＡＹＧＸ６ＬＶＹＡＳＬＩＰＸ２５ＰＨＸ２６ＡＭＷＸ２７ＱＭＶＸ２８ＧＸ２９Ｅ（配列番号１）
Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３個が互いに独立して正に帯電したアミノ酸であることを条件として、Ｘ１～Ｘ２９のいずれかは、互いに独立してアミノ酸のものであり、任意選択で、配列番号１のＸ１～Ｘ２９で示される以外の位置の最大５個のアミノ酸は、任意のアミノ酸によって交換される。
【0022】
好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１からなるアミノ酸配列を含み、Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３個が互いに独立して正に帯電したアミノ酸であることを条件として、Ｘ１～Ｘ２９のいずれかが、互いに独立して、アミノ酸のものである。
【0023】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、サイズ、長さ、二次および三次構造、サブユニット数、または翻訳後修飾に関係なく、アミノ酸の任意のペプチド結合で結合したポリマーを指す。したがって、「ポリペプチド」という用語は、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、「アミノ酸配列」という用語を包含すると理解されるべきである。本発明によるポリペプチドは、開放線状ペプチド鎖または環状ペプチドであり、代替的または追加的に、本発明のペプチドは、脂質化、グリコシル化およびリン酸化などの少なくとも１つの化学修飾を含み得る。本明細書で理解されるように、ペプチド、特に本発明のペプチドは、単離されるか、または好ましくは、化学合成、ＲＮＡ翻訳、および／または組換えプロセスによって作成され得る。
【0024】
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、官能基アミン（－ＮＨ２）およびカルボン酸（－ＣＯＯＨ）およびその両性イオンを、典型的かつ好ましくは、各アミノ酸に特異的な側鎖とともに含む有機化合物を指す。「アミノ酸」という用語は、典型的かつ好ましくは、タンパク質原性アミノ酸（ＲＮＡ翻訳によって産生される）、非タンパク質原性アミノ酸（他の代謝メカニズム、例えば翻訳後修飾によって産生される）、標準または基準アミノ酸（遺伝暗号のコドンによって直接コードされている）および非標準または非基準アミノ酸（遺伝暗号によって直接コードされていない）などの天然に存在するアミノ酸を含む。天然に存在するアミノ酸には、非真核生物および真核生物のアミノ酸が含まれる。本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、化学的に合成される非天然アミノ酸も含む。さらに、この用語は、アルファ－（α－）、ベータ－（β－）、ガンマ－（γ－）およびデルタ－（δ－）などのアミノ酸、ならびにこれらの任意比率の混合物、および該当する場合は、アミノ酸の任意の異性体、すなわちそのＤ－およびＬ－立体異性体（あるいは（Ｒ）および（Ｓ）の命名法によって呼ばれる）、ならびにこれらの任意比率、好ましくはラセミ比が１：１の混合物を包含する。本発明のアミノ酸は、典型的かつ好ましくはＬ配置である。「Ｄ－立体異性体」、「Ｌ－立体異性体」、「Ｄ－アミノ酸」または「Ｌ－アミノ酸」という用語は、アミノ酸のキラルアルファ炭素を指す。アミノ酸は、修飾および／または結合した化合物、および残基、例えば、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、またはその両方などのペプチド合成に使用される残基を含み得る。
【0025】
「Ｘｎ～Ｘｍ」および「Ｘｎ～ｍ」という用語は、配列番号１の特定のアミノ酸の位置を示すため、本明細書で互換的に使用される。
【0026】
任意選択で、配列番号１のＸ１～２９で示される以外の位置にある最大５個のアミノ酸を任意のアミノ酸で交換することができる。本明細書で互換的に使用される「アミノ酸交換」または「任意のアミノ酸によって交換される」という用語は、１つのアミノ酸の欠失による交換、または１つ以上のアミノ酸、より好ましくは、１つ、２つまたは３つのアミノ酸による単一のアミノ酸の置換（付加）を指す。最も好ましくは、「アミノ酸交換」という用語は、単一のアミノ酸の欠失、または単一のアミノ酸の１つ、２つ、または３つのアミノ酸による置換を指す。好ましい実施形態では、該アミノ酸交換は置換である。別の好ましい実施形態において、該アミノ酸交換は、保存的アミノ酸置換である。
【0027】
「保存的置換」という用語は、所与のアミノ酸を類似の生化学的特性を有する異なるアミノ酸と交換するアミノ酸置換である。保存的置換には、等配電子置換およびアミノ酸の荷電、極性、芳香族、脂肪族または疎水性の性質が維持される置換が含まれ、好ましくはそれらを指す。保存的置換とは、本発明のポリペプチドがナノ粒子、好ましくは本発明のケージ状ナノ粒子に自己組織化する能力を維持する置換を指す。
【0028】
本明細書で使用される「正に帯電した」という用語は、正に帯電した基を有する分子を含み、好ましくはそれを指す。より好ましくは、該正に帯電した分子は、中性または生理学的ｐＨで正に帯電した基を有する。
【0029】
本発明の好ましい実施形態において、任意選択で、配列番号１のＸ１～２９で示される以外の位置にある最大４アミノ酸、より好ましくは最大３アミノ酸、さらにより好ましくは最大２アミノ酸、最も好ましくは１アミノ酸が、任意のアミノ酸と交換される。
【0030】
好ましい実施形態では、該ポリペプチドは、約５００アミノ酸以下、好ましくは約４００アミノ酸以下、より好ましくは３００アミノ酸以下、さらにより好ましくは２５０アミノ酸以下、さらにより好ましくは２００アミノ酸以下、さらにより好ましくは１８８～２３０アミノ酸、最も好ましくは１９２アミノ酸の長さを有する。
【0031】
別の好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。
【0032】
別の好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１からなるアミノ酸配列からなる。別の好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、配列番号１からなるアミノ酸配列からなり、任意選択で、配列番号１のＸ１～２９で示される以外の位置にある最大５個のアミノ酸が、任意のアミノ酸によって交換される。
【0033】
別の好ましい実施形態において、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、互いに独立して、アルギニンまたはアルギニンの保存的置換である。別の好ましい実施形態において、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、互いに独立して、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチン、チアリジンおよびヒスチジンからなる群から選択される。
【0034】
別の好ましい実施形態において、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、互いに独立して、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチン、およびチアリジンからなる群から選択される。
【0035】
別のより好ましい実施形態において、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、独立して、それぞれヒスチジン、アルギニン、またはリジンである。別のより好ましい実施形態において、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、独立して、それぞれアルギニンまたはリジンである。別のより好ましい実施形態において、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、独立して、それぞれアルギニンである。別のより好ましい実施形態において、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、独立して、それぞれアルギニンである。一実施形態では、該正に帯電したアミノ酸のＸ１～Ｘ６はそれぞれアルギニンである。一実施形態では、該正に帯電したアミノ酸Ｘ１～Ｘ６はそれぞれリジンである。
【0036】
好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、Ｃ末端またはＮ末端、好ましくはアミノ酸配列ＩのＣ末端に結合し、配列Ｉにおいて、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、独立してアルギニンまたはリジンである。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、Ｃ末端またはＮ末端、好ましくはアミノ酸配列ＩのＣ末端に結合し、配列Ｉにおいて、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、アルギニンである。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなる該ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、Ｃ末端またはＮ末端、好ましくはアミノ酸配列ＩのＣ末端に結合し、配列Ｉにおいて、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、リジンである。
【0037】
好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３～９の連続するヒスチジンからなる該ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、Ｃ末端またはＮ末端、好ましくはアミノ酸配列ＩのＣ末端に結合し、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、独立してアルギニンまたはリジンである。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３～９の連続するヒスチジンからなる該ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、Ｃ末端またはＮ末端、好ましくはアミノ酸配列ＩのＣ末端に結合し、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、アルギニンである。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３～９の連続するヒスチジンからなる該ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、Ｃ末端またはＮ末端、好ましくはアミノ酸配列ＩのＣ末端に結合し、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、リジンである。
【0038】
Ｘ７は、システイン、その保存的置換、または正に帯電したアミノ酸である。
【0039】
好ましい実施形態において、システインの該保存的置換は、メチオニン、ホモシステイン、セレノシステイン、セリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、ホモセリン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、ｓ－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－システイン、ホスホセリン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、スレオニン、およびホスホスレオニンからなる群から選択される。好ましい実施形態において、システインの該保存的置換は、ホモシステイン、セレノシステイン、セリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、ホモセリン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、ｓ－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－システイン、ホスホセリン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、スレオニン、およびホスホスレオニンからなる群から選択される。より好ましくは、システインの該保存的置換は、ホモシステイン、セレノシステイン、およびセリンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、システインの該保存的置換は、ホモシステインまたはセレノシステインである。
【0040】
別の好ましい実施形態において、Ｘ７は、ホモシステイン、セレノシステイン、システイン、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチンおよびチアリジンからなる群から選択される。
【0041】
別の好ましい実施形態において、Ｘ７は、ホモシステイン、セレノシステイン、セリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、ホモセリン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、ｓ－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－システイン、ホスホセリン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、スレオニン、およびホスホスレオニン、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチンおよびチアリジンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、該Ｘ７は、アルギニン、リジン、セリン、ホモシステイン、またはシステインから選択される。別のさらに好ましい実施形態において、該Ｘ７は、アルギニン、リジン、ホモシステイン、またはシステインから選択される。
【0042】
Ｘ７がシステインまたはシステインの保存的置換である場合、ジスルフィド形成（例えば、システアミン、１－（３－メルカプトプロピル）グアニジンなど）を介して、本発明のポリペプチドに正に帯電した基を付加するために使用できる。
【0043】
一実施形態では、Ｘ１～Ｘ６のうちの該少なくとも３つは、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、該Ｘ７は、アルギニン、リジン、セリン、ホモシステインまたはシステインから選択される。
【0044】
配列番号１からなるアミノ酸配列Ｉにおいて、該アミノ酸Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つは、互いに独立して正に帯電したアミノ酸である。好ましい実施形態では、該アミノ酸Ｘ１～Ｘ６の少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも５つ、さらにより好ましくは６つ、すなわち、各々が、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である。
【0045】
好ましい実施形態では、該アミノ酸Ｘ１～Ｘ６の少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは６つ、すなわち、各々が、互いに独立して、該正に帯電したアミノ酸であり、正に帯電したアミノ酸はアルギニンまたはリジンである。好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６の該アミノ酸の少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは、各々が、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸であり、該正に帯電したアミノ酸はアルギニンである。好ましい実施形態では、該アミノ酸Ｘ１～Ｘ６の少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは６つが、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸であり、該正に帯電したアミノ酸はリジンである。
【0046】
好ましい実施形態では、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１～Ｘ３である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ５である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ６である。
【0047】
別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ５である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ６である。
【0048】
別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ１である。
【0049】
別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ１である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ２である。
【0050】
別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ５、Ｘ６、およびＸ１である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ５、Ｘ６、およびＸ２である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ５、Ｘ６、およびＸ３である。
【0051】
別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ５である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ４、およびＸ６である。
【0052】
別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ５である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ３～Ｘ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６である。
【0053】
別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１～５である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１～４およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１～３、Ｘ５およびＸ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４～Ｘ６である。別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つが、Ｘ１、およびＸ３～６である。別の好ましい実施形態において、正に帯電したアミノ酸が互いに独立している該Ｘ１からＸ６のうちの少なくとも３つは、Ｘ２～Ｘ６である。
【0054】
別の好ましい実施形態において、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つは、Ｘ１～Ｘ６であり、互いに独立して正に帯電したアミノ酸である。
【0055】
より好ましくは、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つは、Ｘ１～Ｘ６、またはＸ４～Ｘ６、またはＸ１、Ｘ２およびＸ５、またはＸ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５、またはＸ１、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６、またはＸ１およびＸ４～Ｘ６、またはＸ１～Ｘ３およびＸ６、またはＸ１～Ｘ５である。より好ましくは、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つは、Ｘ１～Ｘ６、またはＸ４～Ｘ６、またはＸ１、Ｘ２およびＸ５、またはＸ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５、またはＸ１、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６、またはＸ１およびＸ４～Ｘ６、またはＸ１～Ｘ３およびＸ６、またはＸ１～Ｘ５である。
【0056】
好ましい実施形態では、Ｘ４～Ｘ６は、互いに独立してリジンまたはアルギニンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１、およびＸ３～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１～３、Ｘ５およびＸ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１～５は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンである。
【0057】
好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３～９の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、Ｃ末端またはＮ末端、好ましくはアミノ酸配列ＩのＣ末端に結合し、Ｘ１～Ｘ６のそれぞれは、独立してアルギニンまたはリジンである。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３～９の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、Ｃ末端またはＮ末端、好ましくはアミノ酸配列ＩのＣ末端に結合し、Ｘ１～Ｘ６のそれぞれは、アルギニンである。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３～９の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、Ｃ末端またはＮ末端、好ましくはアミノ酸配列ＩのＣ末端に結合し、Ｘ１～Ｘ６のそれぞれは、リジンである。
【0058】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択される。
【0059】
本発明者らは、Ｘ８～Ｘ１２の位置のアミノ酸が、本発明のポリペプチドによる自己組織化を介して形成されるナノ粒子の孔径を規定することを見出した。Ｘ８～Ｘ１２の位置のより大きなアミノ酸が孔径を縮小する一方、これらの位置のより小さなアミノ酸は、ナノ粒子の孔径を増大させた。
【0060】
したがって、好ましい実施形態では、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。別の好ましい実施形態において、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含む該ナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。別の好ましい実施形態において、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子にインビトロで搭載され、該ナノ粒子からインビボで放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。別の好ましい実施形態において、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、好ましくは細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡ、最も好ましくはｓｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0061】
別の好ましい実施形態において、少なくとも本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。別の好ましい実施形態において、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。別の好ましい実施形態において、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子にインビトロで搭載され、該ナノ粒子からインビボで放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。別の好ましい実施形態において、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、好ましくは細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡ、最も好ましくはｓｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0062】
好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－１－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から独立して選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から独立して選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは、細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは、細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡ、最も好ましくはｓｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0063】
好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－１－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－１－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－１－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から独立して選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から独立して選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは、細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは、細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡ、最も好ましくはｓｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0064】
好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択され、６個の該ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－１－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択され、６個の該ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から独立して選択され、６個の該ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から独立して選択され、６個の該ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは、細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、６個の該ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、６個の該ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは、細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡ、最も好ましくはｓｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0065】
さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、該孔径が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは、細胞の細胞質内に放出され得るように、該孔径が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、該孔径が選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、少なくとも１つの本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは、細胞の細胞質内に放出され得るように、該孔径が選択される。好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡ、最も好ましくはｓｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0066】
好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択され、６個の該ポリペプチドを含むナノ粒子は、３～４ｎｍのサイズを有する６個の細孔を含み、カーゴは、分解することなく、該ナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得る。好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－１－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択され、６個の該ポリペプチドを含むナノ粒子は、３～４ｎｍのサイズを有する６個の細孔を含み、カーゴは、該ナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは細胞の細胞質内に、両場合とも分解することなく放出され得る。さらに好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、６個の本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍのサイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得る。さらに好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、６個の本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍの孔サイズをもつ６個の細孔を含み、カーゴが、該ナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは、細胞の細胞質内に、両場合とも分解することなく放出され得る。さらに好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、６個の本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍの孔サイズをもつ６個の細孔を含み、カーゴが、該ナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは、細胞の細胞質内に、両場合とも分解することなく放出され得る。好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡ、最も好ましくはｓｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0067】
さらに好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、該ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に付着し、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択され、６個の本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍの孔サイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、該ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に付着し、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－１－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択され、６個の本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍの孔サイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にあるアミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、該ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に付着し、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、６個の本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍの孔サイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、該ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に付着し、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、６個の本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍの孔サイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にあるアミノ酸が選択される。さらに好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、該ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に付着し、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、６個の該本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍの孔サイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に搭載され、該ナノ粒子から放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択され、さらに好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、該ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に付着し、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択され、６個の該本発明ポリペプチドを含むナノ粒子が、３～４ｎｍの孔サイズを有する６個の細孔を含み、カーゴが、分解することなく、該ポリペプチドを含むナノ粒子に細胞外で搭載され、該ナノ粒子から細胞内に、より好ましくは細胞の細胞質内に放出され得るように、本発明ポリペプチドのＸ８～Ｘ１２の位置にある該アミノ酸が選択される。好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡ、最も好ましくはｓｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。より好ましくは、該３つ以上の連続するヒスチジンは、３～９個のｈｉｓタグである。
【0068】
好ましい実施形態では、該Ｘ８は、グリシンまたはその保存的置換である。好ましくは、グリシンの該保存的置換は、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択される。より好ましくは、グリシンの該保存的置換は、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、該Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択される。好ましい実施形態では、該Ｘ８はグリシンである。
【0069】
別の好ましい実施形態において、該Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはその保存的置換である。好ましくは、グルタミンの該保存的置換は、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチルアスパラギンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、該Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンである。
【0070】
別の好ましい実施形態において、該Ｘ９およびＸ１２は両方ともグルタミンである。別の好ましい実施形態において、該Ｘ９およびＸ１２は両方ともアスパラギンである。別の好ましい実施形態において、該Ｘ９またはＸ１２はグルタミンである。別の好ましい実施形態において、該Ｘ９はグルタミンである。別の好ましい実施形態において、該Ｘ１２はグルタミンである。
【0071】
別の好ましい実施形態において、該Ｘ１０は、グルタメートまたはその保存的置換である。好ましくは、グルタメートの該保存的置換は、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態において、該Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートである。別のさらに好ましい実施形態では、該Ｘ１０はグルタメートである。
【0072】
別の好ましい実施形態において、該Ｘ１１は、セリンまたはその保存的置換からなる群から選択される。好ましくは、セリンの該保存的置換は、システイン、メチオニン、ホモシステイン、セレノシステイン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、ホモセリン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、ｓ－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－システイン、ホスホセリン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、スレオニン、およびホスホスレオニンからなる群から選択される。より好ましくは、セリンの該保存的置換は、システイン、ホモシステイン、セレノシステイン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、ホモセリン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、ｓ－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－システイン、ホスホセリン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、スレオニン、およびホスホスレオニンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、セリンの該保存的置換は、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、ホモセリン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、ｓ－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－システイン、ホスホセリン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、スレオニン、およびホスホスレオニンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、セリンの該保存的置換は、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロスレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から選択される。
【0073】
さらに好ましい実施形態では、該Ｘ１１は、セリン、ホモセリン、およびスレオニンからなる群から選択される。別のさらに好ましい実施形態では、該Ｘ１１はセリンである。
【0074】
好ましい実施形態では、該Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２Ｓ、４Ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチル－アスパラギンからなる群から選択され、Ｘ１０は、グルタメート、アスパルテート、２ｓ，４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択され、Ｘ１１は、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロスレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロスレオニンからなる群から選択される。
【0075】
さらに好ましい実施形態では、該Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択される。
【0076】
さらに好ましい実施形態では、該Ｘ８はグリシンであり、Ｘ９およびＸ１２はグルタミンであり、Ｘ１０はグルタメートであり、Ｘ１１はセリンである。
【0077】
好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択される。
【0078】
さらに好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、グルタメート、アスパルテート、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択される。
【0079】
さらに好ましい実施形態では、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、セリン、グリシン、グルタミン、およびグルタメートからなる群から選択される。
【0080】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１～６の少なくとも３つは、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなるグループから選択される。別の好ましい実施形態において、Ｘ１～６は、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなるグループから選択される。
【0081】
好ましくは、
さらに好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、配列Ｉにおいて、Ｘ１～６は、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択される。さらに好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３～９の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、配列Ｉにおいて、Ｘ１～６は、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択される。
さらに好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、配列Ｉにおいて、Ｘ１～６は、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択される。さらに好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３～９の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、配列Ｉにおいて、Ｘ１～６は、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、ｎ－メチル－アスパラギン、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸、３－メチル－アスパラギン酸、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から独立して選択される。
【0082】
別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、配列Ｉにおいて、Ｘ１～６の少なくとも３つは、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３～９個の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、配列Ｉにおいて、Ｘ１～６の少なくとも３つは、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択される。
【0083】
別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、配列Ｉにおいて、Ｘ１～６は、独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３～９個の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、配列Ｉにおいて、Ｘ１～６は、独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、Ｘ１～６の少なくとも３つは、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ８はグリシンであり、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンであり、Ｘ１０はグルタメートであり、Ｘ１１はセリンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１～６はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８はグリシンであり、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立してグルタミンであり、Ｘ１０はグルタメートであり、Ｘ１１はセリンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１～６はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８はグリシンであり、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立してグルタミンであり、Ｘ１０はグルタメートであり、Ｘ１１はセリンである。
【0084】
一実施形態では、該Ｘ１～６の少なくとも３つは、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、該Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８はグリシンであり、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンであり、Ｘ１０はグルタメートであり、Ｘ１１はセリンであり、該ポリペプチドは、２つ以上の連続して連結されたヒスチジンを含むアミノ酸配列であるポリヒスチジンを含み、好ましくは、該ポリヒスチジンはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグであり、より好ましくはＨｉｓ６タグである。ヒスチジンタグは、本明細書では、２つ以上の連続して連結されたヒスチジン（Ｈｉｓタグ）からなるアミノ酸配列として定義される。Ｈｉｓ６タグ（Ｈｉｓ６）は、本明細書では、６つの連続して連結されたヒスチジンからなるアミノ酸配列として定義される。
【0085】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１～Ｘ６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８はグリシンであり、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンであり、Ｘ１０はグルタメートであり、Ｘ１１はセリンであり、該ポリペプチドは、２つ以上の連続して連結されたヒスチジンを含むアミノ酸配列であるポリヒスチジンを含み、好ましくは、該ポリヒスチジンはヒスチジン（Ｈｉｓ）タグであり、より好ましくはＨｉｓ６タグである。
【0086】
別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、配列Ｉにおいて、Ｘ１～６はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８はグリシンであり、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンであり、Ｘ１０はグルタメートであり、Ｘ１１はセリンである。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドを含む該ナノ粒子または該複合体は、エンドソーム脱出が可能である。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続したヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、本発明の該ポリペプチドを含む該ナノ粒子または該複合体は、エンドソーム脱出が可能である。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続したヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、該Ｈｉｓタグは、Ｃ末端またはＮ末端に付着し、本発明の該ポリペプチドを含む該ナノ粒子または該複合体は、エンドソーム脱出が可能である。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、ここで、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、配列Ｉにおいて、Ｘ１～６はリジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジン、またはシステインから選択され、Ｘ８はグリシンであり、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンであり、Ｘ１０はグルタメートであり、Ｘ１１はセリンであり、本発明の該ポリペプチドを含む該ナノ粒子または該複合体は、エンドソーム脱出が可能である。
【0087】
本発明のポリペプチドは、自己組織化によりナノ粒子を形成する場合、Ｘ１３～Ｘ２９のアミノ酸は、ナノ粒子の外表面に露出するため、ケージ状ナノ粒子に自己組織化する能力を依然保持しながら、最も変異に耐えやすい。
【0088】
したがって、好ましい実施形態では、ナノ粒子の外表面に露出するアミノ酸Ｘ１３～Ｘ２９は、任意のアミノ酸である。
【0089】
好ましい実施形態では、Ｘ１３、Ｘ１７およびＸ１９は、互いに独立して、セリンまたはその保存的置換である。好ましくは、セリンの該保存的置換は、システイン、メチオニン、ホモシステイン、セレノシステイン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、ホモセリン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、ｓ－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－システイン、ホスホセリン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、スレオニン、およびホスホスレオニンからなる群から選択される。より好ましくは、セリンの該保存的置換は、システイン、ホモシステイン、セレノシステイン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、ホモセリン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、ｓ－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－システイン、ホスホセリン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、スレオニン、およびホスホスレオニンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、セリンの該保存的置換は、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、ホモセリン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、ｓ－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－システイン、ホスホセリン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、スレオニン、およびホスホスレオニンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、セリンの該保存的置換は、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロスレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から選択される。
【0090】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１３、Ｘ１７およびＸ１９は、互いに独立して、セリン、ホモセリン、およびスレオニンからなる群から選択され。別の好ましい実施形態において、Ｘ１３、Ｘ１７およびＸ１９は、互いに独立して、セリンである。
【0091】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１４、Ｘ１６、およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンまたはその保存的置換である。好ましくは、アスパラギンの該保存的置換は、グルタミン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチルアスパラギンからなる群から選択される。
【0092】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１４、Ｘ１６、およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１４、Ｘ１６およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンまたはグルタミンである。
【0093】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、アスパルテート、グルタメートまたはそれらの保存的置換である。好ましくは、アスパルテートまたはグルタメートの該保存的置換は、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択される。
【0094】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１５およびＸ２０は、互いに独立して、アスパルテートである。別の好ましい実施形態において、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、グルタメートである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、アスパルテートまたはグルタメートである。別の好ましい実施形態において、Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択される。
【0095】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、ロイシンまたはその保存的置換である。好ましくは、ロイシンの該保存的置換は、グリシン、アラニン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択される。
【0096】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、ロイシンである。好ましい実施形態では、該Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択される。好ましい実施形態では、該Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択される。
【0097】
別の好ましい実施形態において、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、正に帯電したアミノ酸である。
【0098】
別の好ましい実施形態において、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニン、リジン、またはそれらの保存的置換である。好ましくは、アルギニンまたはロイシンの該保存的置換は、ヒスチジン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチンおよびチアリジンからなる群から選択される。より好ましくは、アルギニンまたはロイシンの該保存的置換は、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチンおよびチアリジンからなる群から選択される。
【0099】
別の好ましい実施形態において、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニンまたはリジンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、リジンである。
【0100】
別の好ましい実施形態において、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立してアルギニンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ２３はリジンである。別の好ましい実施形態において、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチンおよびチアリジンからなる群から選択される。
【0101】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１３、Ｘ１７およびＸ１９は、互いに独立して、セリンであり、Ｘ１４、Ｘ１６およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンであり、Ｘ１５およびＸ２０は、互いに独立して、アスパルテートであり、Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、ロイシンであり、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、グルタメートであり、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニンであり、Ｘ２３はリジンである。
【0102】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１３、Ｘ１７およびＸ１９は、互いに独立して、セリン、ホモセリン、およびスレオニンからなる群から選択され、Ｘ１４、Ｘ１６およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、アスパルテートまたはグルタメートであり、該Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニンまたはリジンである。
【0103】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１３、Ｘ１７、およびＸ１９は、互いに独立して、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から選択され、
Ｘ１４、Ｘ１６、およびＸ２４は、互いに独立して、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチル－アスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－１ｌグルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択され、
Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチンおよびチアリジンからなる群から選択される。
Ｘ１４、Ｘ１６、およびＸ２４は、互いに独立して、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチル－アスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－１ｌグルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択され、
Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチンおよびチアリジンからなる群から選択される。
【0104】
別の好ましい実施形態において、Ｘ８は、グリシンまたはその保存的置換であり、好ましくは、グリシンの該保存的置換は、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択され、
Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはその保存的置換であり、好ましくは、グルタミンの該保存的置換は、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチルアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ１０はグルタメートまたはその保存的置換であり、好ましくは、グルタメートの該保存的置換は、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ１１はセリンまたはその保存的置換であり、好ましくは、セリンの該保存的置換は、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロスレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から選択され、
より好ましくは、Ｘ８はグリシンであり、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立してグルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０はグルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１はセリンである。
Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはその保存的置換であり、好ましくは、グルタミンの該保存的置換は、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチルアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ１０はグルタメートまたはその保存的置換であり、好ましくは、グルタメートの該保存的置換は、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ１１はセリンまたはその保存的置換であり、好ましくは、セリンの該保存的置換は、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロスレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から選択され、
より好ましくは、Ｘ８はグリシンであり、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立してグルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０はグルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１はセリンである。
【0105】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１３、Ｘ１７、およびＸ１９は、互いに独立して、セリンまたはその保存的置換であり、好ましくは、セリンの該保存的置換は、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロスレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から選択され、
Ｘ１４、Ｘ１６、およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギン、グルタミン、またはそれらの保存的置換であり、好ましくは、アスパラギンまたはグルタミンの該保存的置換は、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチル－アスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、アスパルテートまたはグルタメートまたはそれらの保存的置換であり、好ましくは、アスパルテートまたはグルタメートの該保存的置換は、２ｓ，４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチル－アスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、ロイシンまたはその保存的置換であり、好ましくは、ロイシンの該保存的置換は、グリシン、アラニン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択され、
Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニン、リジンまたはそれらの保存的置換であり、好ましくは、アルギニンまたはロイシンの該保存的置換は、ヒスチジン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチン、およびチアリジンからなる群から選択される。
Ｘ１４、Ｘ１６、およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギン、グルタミン、またはそれらの保存的置換であり、好ましくは、アスパラギンまたはグルタミンの該保存的置換は、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチル－アスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、アスパルテートまたはグルタメートまたはそれらの保存的置換であり、好ましくは、アスパルテートまたはグルタメートの該保存的置換は、２ｓ，４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチル－アスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、ロイシンまたはその保存的置換であり、好ましくは、ロイシンの該保存的置換は、グリシン、アラニン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択され、
Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニン、リジンまたはそれらの保存的置換であり、好ましくは、アルギニンまたはロイシンの該保存的置換は、ヒスチジン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチン、およびチアリジンからなる群から選択される。
【0106】
別の好ましい実施形態において、該Ｘ１～Ｘ６のうちの少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、互いに独立して、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチン、およびチアリジンからなる群から選択され、
Ｘ７は、システイン、その保存的置換、または正に荷電したアミノ酸であり、好ましくは、Ｘ７は、ホモシステイン、システイン、セレノシステイン、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチン、チアリジンおよびセリンからなる群から選択され、
Ｘ８は、グリシン、またはアラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択されるグリシンの保存的置換であり、
Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミン、またはアスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ，４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチル－アスパラギンからなる群から選択されるグルタミンの保存的置換であり、
Ｘ１０は、グルタメート、またはアスパルテート、２ｓ，４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択されるグルタメートの保存的置換であり、
Ｘ１１は、セリン、またはホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロスレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から選択されるセリンの保存的置換であり、
Ｘ１３、Ｘ１７、およびＸ１９は、互いに独立して、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から選択され、
Ｘ１４、Ｘ１６、およびＸ２４は、互いに独立して、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－１－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチル－アスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択され、
Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチンおよびチアリジンからなる群から選択される。
Ｘ７は、システイン、その保存的置換、または正に荷電したアミノ酸であり、好ましくは、Ｘ７は、ホモシステイン、システイン、セレノシステイン、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチン、チアリジンおよびセリンからなる群から選択され、
Ｘ８は、グリシン、またはアラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択されるグリシンの保存的置換であり、
Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミン、またはアスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－ｌ－グルタミン、（２ｓ，４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチル－アスパラギンからなる群から選択されるグルタミンの保存的置換であり、
Ｘ１０は、グルタメート、またはアスパルテート、２ｓ，４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択されるグルタメートの保存的置換であり、
Ｘ１１は、セリン、またはホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロスレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から選択されるセリンの保存的置換であり、
Ｘ１３、Ｘ１７、およびＸ１９は、互いに独立して、セリン、ホモセリン、スレオニン、４－ヒドロキシ－ｌ－スレオニン、６－ヒドロキシ－ｌ－ノルロイシン、４，５－ジヒドロキシ－イソロイシン、３－ヒドロキシ－ｌ－バリン、ヒドロキシノルバリン、２－アミノ－５－ヒドロキシペンタン酸、アロ－スレオニン、３，３－ジヒドロキシ－アラニン、４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン、（２ｓ、３ｒ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、ベータ－ヒドロキシロイシン、およびアロ－スレオニンからなる群から選択され、
Ｘ１４、Ｘ１６、およびＸ２４は、互いに独立して、グルタミン、アスパラギン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン、３－メチル－１－グルタミン、（２ｓ、４ｓ）－２，５－ジアミノ－４－ヒドロキシ－５－オキソペンタン酸、およびｎ－メチル－アスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、グルタメート、アスパルテート、２ｓ、４ｒ－４－メチルグルタメート、（３ｓ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、（３ｒ）－３－メチル－ｌ－グルタミン酸、５－ｏ－メチル－グルタミン酸、４－ヒドロキシ－グルタミン酸、６－カルボキシリジン、ベータ－ヒドロキシアスパラギン酸、２－アミノ－プロパン二酸、３，３－ジメチルアスパラギン酸、２－アミノアジピン酸および３－メチルアスパラギン酸からなる群から選択され、
Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、ホモロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン２－アミノ酪酸、ジエチルアラニン、ノルロイシン、およびノルバリンからなる群から選択され、
Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニン、５－メチル－アルギニン、ｃ－ガンマ－ヒドロキシアルギニン、２－アミノ－４－グアニジノ酪酸、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、カナバニン、ホモアルギニン、リジン、ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロパン酸、（２ｓ）－２，８－ジアミノオクタン酸、オルニチンおよびチアリジンからなる群から選択される。
【0107】
別の好ましい実施形態において、該Ｘ１～Ｘ６の少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、互いに独立して、アルギニンまたはリジンであり、Ｘ７は、ホモシステイン、システイン、アルギニン、およびリジンからなる群から選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１、Ｘ１３、Ｘ１７、およびＸ１９は、互いに独立して、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、Ｘ１４、Ｘ１６、およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６、およびＸ２８は、互いに独立して、アスパルテートまたはグルタメートであり、Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、ロイシン、グリシン、アラニン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立してアルギニンまたはリジンである。
【0108】
別の好ましい実施形態において、該Ｘ１～Ｘ６の少なくとも３つの正に帯電したアミノ酸は、互いに独立して、アルギニンまたはリジンであり、Ｘ７は、ホモシステイン、システイン、アルギニン、およびリジンからなる群から選択され、Ｘ８はグリシンであり、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１はセリンであり、Ｘ１３、Ｘ１７、およびＸ１９は、互いに独立して、セリンであり、Ｘ１４、Ｘ１６、およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンであり、Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６、およびＸ２８は、互いに独立して、アスパルテートまたはグルタメートであり、Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、ロイシンであり、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立してアルギニンまたはリジンである。
【0109】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１～６の少なくとも３つは、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、ロイシンであり、Ｘ１５およびＸ２０は、互いに独立して、アスパルテートであり、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、グルタメートであり、Ｘ１４、Ｘ１６およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンであり、Ｘ１３、Ｘ１７およびＸ１９は、互いに独立して、セリンであり、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立してアルギニンであり、Ｘ２３はリジンである。
【0110】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１～６の少なくとも３つは、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、Ｘ１３、Ｘ１７およびＸ１９は、互いに独立して、セリン、ホモセリン、およびスレオニンからなる群から選択され、Ｘ１４、Ｘ１６およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、アスパルテートまたはグルタメートであり、該Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５、およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニンまたはリジンである。
【0111】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１～６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、Ｘ１３、Ｘ１７およびＸ１９は、互いに独立して、セリン、ホモセリン、およびスレオニンからなる群から選択され、Ｘ１４、Ｘ１６およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、アスパルテートまたはグルタメートであり、該Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５、およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニンまたはリジンである。
【0112】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１～６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、Ｘ１３、Ｘ１７およびＸ１９は、互いに独立して、セリンであり、Ｘ１４、Ｘ１６およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンであり、Ｘ１５およびＸ２０は、互いに独立して、アスパルテートであり、Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、ロイシンであり、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、グルタメートであり、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２５およびＸ２７は、互いに独立してアルギニンであり、Ｘ２３はリジンである。
【0113】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１～６の少なくとも３つまたは少なくとも４つは、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、Ｘ１３、Ｘ１７およびＸ１９は、互いに独立して、セリン、ホモセリン、およびスレオニンからなる群から選択され、Ｘ１４、Ｘ１６およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、アスパルテートまたはグルタメートであり、該Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５、およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニンまたはリジンであり、該ポリペプチドは、２つ以上連続して連結するヒスチジンを含むアミノ酸配列であるポリヒスチジンを含み、好ましくは、該ポリヒスチジンは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグであり、より好ましくはＨｉｓ６タグである。
【0114】
別の好ましい実施形態において、Ｘ１～６は、互いに独立して、リジンまたはアルギニンであり、Ｘ７は、アルギニン、リジンまたはシステインから選択され、Ｘ８は、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ９およびＸ１２は、互いに独立して、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０は、グルタメートまたはアスパルテートであり、Ｘ１１は、セリン、スレオニン、およびホモセリンからなる群から選択され、Ｘ１３、Ｘ１７およびＸ１９は、互いに独立して、セリン、ホモセリン、およびスレオニンからなる群から選択され、Ｘ１４、Ｘ１６およびＸ２４は、互いに独立して、アスパラギンまたはグルタミンであり、Ｘ１５、Ｘ２０、Ｘ２６およびＸ２８は、互いに独立して、アスパルテートまたはグルタメートであり、該Ｘ１８およびＸ２９は、互いに独立して、グリシン、アラニン、ロイシン、およびバリンからなる群から選択され、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５、およびＸ２７は、互いに独立して、アルギニンまたはリジンであり、該ポリペプチドは、２つ以上連続して連結するヒスチジンを含むアミノ酸配列であるポリヒスチジンを含み、好ましくは、該ポリヒスチジンは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグであり、より好ましくはＨｉｓ６タグである。
【0115】
好ましい実施形態では、該アミノ酸配列Ｉは、配列番号２～５および配列番号１０～１６からなる群から選択される配列である。好ましい実施形態では、本発明の該ポリペプチドは、配列番号２～５および配列番号１０～１６からなる群から選択される配列からなる。
【0116】
好ましい実施形態では、該アミノ酸配列Ｉは、配列番号２～５および配列番号１０～１６、３７および３８からなる群から選択される配列である。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号２～５および配列番号１０～１６、３７および３８からなる群から選択される配列からなる。
【0117】
好ましい実施形態では、該アミノ酸配列Ｉは配列番号２である。好ましい実施形態では、該アミノ酸配列Ｉは配列番号３である。別の好ましい実施形態において、該アミノ酸配列Ｉは配列番号４である。別の好ましい実施形態において、該アミノ酸配列Ｉは配列番号５である。別の好ましい実施形態において、該アミノ酸配列Ｉは配列番号１０である。別の好ましい実施形態において、該アミノ酸配列Ｉは配列番号１１である。別の好ましい実施形態において、該アミノ酸配列Ｉは配列番号１２である。別の好ましい実施形態において、該アミノ酸配列Ｉは配列番号１３である。好ましい実施形態では、該アミノ酸配列Ｉは配列番号１４である。別の好ましい実施形態において、該アミノ酸配列Ｉは配列番号１５である。別の好ましい実施形態において、該アミノ酸配列Ｉは配列番号１６である。別の好ましい実施形態において、該アミノ酸配列Ｉは配列番号３７である。別の好ましい実施形態において、該アミノ酸配列Ｉは配列番号３８である。
【0118】
好ましい実施形態では、本発明の該ポリペプチドは、配列番号２からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号３からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号４からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号５からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号１０からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号１１からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号１２からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号１３からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号１４からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号１５からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号１６からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号３７からなる群から選択される配列からなる。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号３８からなる群から選択される配列からなる。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号３からなる群から選択される配列からなり、本発明の該ポリペプチドは、３つ以上の連続したヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着している。別の好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、配列番号３からなる群から選択される配列からなり、ここで、本発明の該ポリペプチドは、３～９個の連続するヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着している。好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、追加のタグ、すなわち、ペプチドまたは非ペプチドタグ、好ましくはペプチドタグ（すなわち、機能的アミノ酸配列）を含む。好ましい実施形態では、該タグは、本発明のポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に位置する。
【0119】
好ましい実施形態では、該タグは非ペプチドタグ、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは、該ＰＥＧは、アミノ酸のセリンまたはシステインを介して該アミノ酸配列１に結合する。本発明のポリペプチドに結合したＰＥＧは、安定性および免疫原性を増大させる。
【0120】
別の好ましい実施形態において、該タグは、ポリヒスチジン、Ｈｉｓタグ（すなわち、２つ以上連続して連結されたヒスチジンからなるアミノ酸配列）、分解タグ、標的化タグ、細胞浸透タグ、およびエンドソーム脱出タグからなる群から選択される。
【0121】
好ましい実施形態では、本発明の該ポリペプチドは、ポリヒスチジンを含む。好ましい実施形態では、該ポリヒスチジンは、２つ以上のヒスチジンを含むアミノ酸配列である。別の好ましい実施形態において、該ポリヒスチジンは、２つ以上連続して連結されたヒスチジンを含むアミノ酸配列である。別の好ましい実施形態において、該ポリヒスチジンは、３つ以上連続して連結されたヒスチジンを含むアミノ酸配列である。別の好ましい実施形態において、該ポリヒスチジンは、３～９個の連続して連結されたヒスチジンを含むアミノ酸配列である。別の好ましい実施形態において、該ポリヒスチジンは、３つ、６つ、または９つの連続して連結されたヒスチジンを含むアミノ酸配列である。
【0122】
好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、連続的に連結されたヒスチジン（Ｈｉｓタグ）からなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含む。好ましくは、該Ｈｉｓタグは、３つ以上の連続したヒスチジンからなる。好ましくは、該Ｈｉｓタグは、３～９個の連続したヒスチジンからなる。好ましくは、該Ｈｉｓタグは、３つ、６つ、または９つの連続したヒスチジンからなる。好ましくは、該Ｈｉｓタグは、３つの連続するヒスチジンからなる。好ましくは、該Ｈｉｓタグは、９つの連続したヒスチジンからなる。好ましくは、該Ｈｉｓタグは、６つの連続したヒスチジン（すなわち、Ｈｉｓ６タグ）からなる。好ましい実施形態では、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着している。好ましい実施形態では、該Ｈｉｓ６タグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくは、Ｃ末端に付着している。好ましくは、該Ｈｉｓタグは、３つ以上の連続したヒスチジンからなり、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に結合している。好ましくは、該Ｈｉｓタグは３～９個の連続したヒスチジンからなり、該Ｈｉｓタグはアミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端に付着している。好ましくは、該Ｈｉｓタグは３～９個の連続したヒスチジンからなり、該Ｈｉｓタグはアミノ酸配列ＩのＣ末端に付着している。好ましくは、該Ｈｉｓタグは３、６または９個の連続したヒスチジンからなり、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着している。好ましくは、該Ｈｉｓタグは３つの連続するヒスチジン（すなわち、Ｈｉｓ３タグ）からなり、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着している。好ましくは、該Ｈｉｓタグは９つの連続するヒスチジン（すなわち、Ｈｉｓ９タグ）からなり、該Ｈｉｓタグはアミノ酸配列ＩのＣ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端に付着している。
【0123】
好ましい実施形態では、該Ｈｉｓタグ、好ましくは該Ｈｉｓ６タグは、ハロゲン化、好ましくはフッ素化ヒスチジンを含む。好ましい実施形態では、該Ｈｉｓタグはフルオロフォアを含む。好ましい実施形態では、本発明の該ポリペプチドは、フルオロフォアを含む。
【0124】
好ましい実施形態において、本発明の該ポリペプチドは、分解タグを含む。好ましくは、該分解タグは、哺乳動物細胞において機能性である。好ましい実施形態では、該分解タグは、オルニチンデカルボキシラーゼ（ｃＯＤＣ）のＣ末端配列、好ましくは配列番号１７のＣ末端配列、または少なくとも２つの連続して連結されたユビキチンを含むかまたはそれからなる（ポリ）ユビキチンである。別の好ましい実施形態において、該分解タグは、配列番号１７のｃＯＤＣ（ＥＦＰＰＥＶＥＥＱＤＤＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＭＤＲＨＰＡＡＣＡＳＡＲＩＮＶ）からなる。別の好ましい実施形態において、該分解タグは、少なくとも２つの連続して連結されたユビキチンを含む。より好ましくは、該分解タグは、少なくとも２つの連続して連結されたユビキチンからなる。
【0125】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ペプチド標的化タグまたは非ペプチド標的化タグである標的化タグを含む。好ましいペプチド標的化タグは、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１８，１８（１）：７４－８６）で言及されている。該標的化タグは、好ましくは、がん標的に結合し、したがって、本明細書では、がん標的化タグとして言及される。該がん標的は、特定の腫瘍細胞および腫瘍抗原で発現レベルが増加した受容体を含む。好ましい実施形態では、該がん標的化タグは、がん標的に結合するペプチドリガンド、ペプチド模倣体、または抗体である。好ましくは、該がん標的化タグは葉酸である。例えば、葉酸は、ペプチド結合を介して本発明のポリペプチドに結合することができる。
【0126】
さらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、エンドソーム脱出ペプチドまたは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。エンドソーム脱出ペプチドは、例えば、二量体化されジスルフィド結合したＴＡＴまたはチオール基である。本明細書で使用される「細胞透過性ペプチド」またはＣＰＰという用語は、カーゴを細胞に送達するために原形質膜を透過する能力を有するペプチドの群を指す。好ましくは、本発明のポリペプチドで使用される該ＣＰＰは、親水性またはカチオン性ペプチドである。別の実施形態において、該ＣＰＰは、両親媒性、アニオン性または疎水性ペプチドから選択される。１，６００超のＣＰＰのデータベースは、Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．（Ａｇｒａｗａｌ Ｐ，Ｂｈａｌｌａ Ｓ，Ｕｓｍａｎｉ ＳＳ，Ｓｉｎｇｈ Ｓ，ＣＨａｕｄｈａｒｙ Ｋ，Ｒａｇｈａｖａ ＧＰＳ，ｅｔ ａｌ．ＣＰＰｓｉｔｅ ２．０：ａ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１６，４４：Ｄ１０９８－Ｄ１０３）によって説明されている。
【0127】
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドに含まれる該追加のタグは、光開裂性結合などの放出可能な結合を介して、または可逆的結合を介して接続される。
【0128】
本発明の該ポリペプチドは、ナノ粒子、好ましくはケージ状ナノ粒子に自己組織化することができる。さらに、配列番号１の該変異タンパク質は、ナノ粒子、好ましくはケージ状ナノ粒子に自己組織化することもできる。
【0129】
さらなる態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸に関する。
【0130】
さらなる態様において、本発明は、本発明による少なくとも１つのポリペプチドを含むナノ粒子に関する。
【0131】
好ましい実施形態では、本発明ナノ粒子の該少なくとも１つのポリペプチドは各々、少なくとも３つの連続して連結されたヒスチジンからなるヒスチジンタグを含み、該ヒスチジンタグの各々は、該少なくとも１つのポリペプチドのＣ末端またはＮ末端、好ましくは、Ｃ末端に付着している。
【0132】
好ましい実施形態では、本発明ナノ粒子の該少なくとも１つのポリペプチドは各々、少なくとも３つの連続して連結されたヒスチジンからなるヒスチジンタグを含み、該ヒスチジンタグの各々は、該少なくとも１つのポリペプチドのＣ末端またはＮ末端、好ましくは、Ｃ末端に付着し、該ナノ粒子は、ナノ粒子が分解することなく、カーゴとともに積み降ろし可能である。好ましい実施形態では、本発明ナノ粒子の該少なくとも１つのポリペプチドは各々、少なくとも３つの連続して連結されたヒスチジンからなるヒスチジンタグを含み、該ヒスチジンタグの各々は、該少なくとも１つのポリペプチドのＣ末端またはＮ末端、好ましくは、Ｃ末端に付着し、該ナノ粒子は、インビボおよびインビトロで、ナノ粒子が分解することなく、カーゴとともに積み降ろし可能である。好ましい実施形態では、本発明ナノ粒子の該少なくとも１つのポリペプチドは各々、少なくとも３つの連続して連結されたヒスチジンからなるヒスチジンタグを含み、該ヒスチジンタグの各々は、該少なくとも１つのポリペプチドのＣ末端またはＮ末端、好ましくは、Ｃ末端に付着し、該ナノ粒子は、ナノ粒子が分解することなく、インビトロでカーゴとともに搭載可能であり、インビボでカーゴとともに荷降ろし可能である。好ましい実施形態では、本発明ナノ粒子の該少なくとも１つのポリペプチドは各々、少なくとも３つの連続して連結されたヒスチジンからなるヒスチジンタグを含み、該ヒスチジンタグの各々は、該少なくとも１つのポリペプチドのＣ末端またはＮ末端、好ましくは、Ｃ末端に付着し、該ナノ粒子は、エンドソーム脱出が可能であり、ナノ粒子が分解することなく、カーゴとともに積み降ろし可能である。好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡ、最も好ましくはｓｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0133】
好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子に含まれる本発明の該ポリペプチドは、配列番号３からなる群から選択される配列からなり、本発明の該ポリペプチドは、３個以上の連続したヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、該ナノ粒子は、該ナノ粒子が分解することなく、カーゴとともに積み降ろし可能である。好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子に含まれる本発明の該ポリペプチドは、配列番号３からなる群から選択される配列からなり、本発明の該ポリペプチドは、３個以上の連続したヒスチジンからなるヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含み、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着し、該ナノ粒子は、該ナノ粒子が分解することなく、インビトロでカーゴとともに搭載可能であり、インビボでカーゴとともに荷降ろし可能である。好ましい実施形態では、本発明の該ナノ粒子は、組成物、好ましくは、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に含まれる。
【0134】
本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、分子をカプセル化することができるナノメートルサイズの範囲（すなわち、約１ｎｍ～約１０００ナノメートル）の粒子を指す。該ナノ粒子は、自己組織化してナノ粒子を形成する、連結分子の規則的に配列された表面を有する。
【0135】
本発明の該ナノ粒子は、正に帯電した空洞を有する。したがって、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）などのカーゴをカプセル化することができる。さらに、該ナノ粒子は、細胞に進入し、条件付きでカーゴを細胞内に、好ましくは細胞質に放出することができる。したがって、ナノ粒子は、例えば、ワクチン接種または免疫系刺激のために、アンチセンスＯＮを介して遺伝子発現を制御するために、細胞内にＯＮを送達するために使用することができる。
【0136】
好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は、カーゴをカプセル化することができ、好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡであり、最も好ましくはｓｉＲＮＡであり、該カプセル化カーゴを細胞に送達することができる。好ましくは、該カーゴは細胞内に送達される。好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は、カーゴをカプセル化することができ、好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡであり、最も好ましくはｓｉＲＮＡであり、該カプセル化カーゴを細胞内に放出することができる。好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は、カーゴを細胞外でカプセル化することができ、該カプセル化カーゴとともに細胞に進入することができ、該カーゴを細胞内に放出することができる。好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は、カーゴを細胞外にカプセル化することができ、該カプセル化されたカーゴとともに細胞に入ることができ、そして該カーゴを該細胞の細胞質に放出することができる。好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、インビトロでカーゴをカプセル化することができ、インビボに、好ましくは細胞内に、より好ましくは細胞の細胞質内に、該カーゴを放出することができる。好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は、インビトロでカーゴをカプセル化することができ、該カプセル化カーゴとともに細胞に進入することができ、インビボに、好ましくは細胞内に、より好ましくは該細胞の細胞質内に、該カーゴを放出することができる。好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡ、最も好ましくはｓｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0137】
好ましい実施形態では、本発明の該ナノ粒子は、該ナノ粒子が分解することなく、カーゴとともに積み降ろし可能である。好ましい実施形態では、本発明の該ナノ粒子は、該ナノ粒子が分解することなく、カーゴを細胞外で搭載可能であり、細胞内で荷降ろし可能である。好ましい実施形態では、本発明の該ナノ粒子は、該ナノ粒子が分解することなく、カーゴの積み降ろしを可能にする。好ましい実施形態では、本発明の該ナノ粒子は、該ナノ粒子が分解することなく、細胞外でのカーゴの搭載および細胞内での該カーゴの荷降ろしを可能にする。好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡ、最も好ましくはｓｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0138】
好ましい実施形態では、本発明の該ナノ粒子は、該ナノ粒子が分解することなく、インビボおよびインビトロでカーゴとともに搭載可能であり、インビボおよびインビトロで荷降ろし可能である。好ましい実施形態では、本発明の該ナノ粒子は、該ナノ粒子が分解することなく、インビトロで搭載可能であり、インビボで荷降ろし可能である。
【0139】
さらなる実施形態において、該ナノ粒子は、少なくとも１つのサブユニットを含み、該サブユニットは、本発明による少なくとも１つのポリペプチドを含む。本明細書で使用される「サブユニット」という用語は、本発明のナノ粒子を組み立て、形成する構成単位を指す。サブユニットは、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含む。好ましくは、該サブユニットは、本発明の３つのポリペプチド、好ましくは本発明の正確に３つのペプチドを含む。より好ましくは、該サブユニットは、本発明の３つのポリペプチドからなる。別の好ましい実施形態において、該サブユニットは、本発明の３つの同一ペプチド、好ましくは、本発明の正確に３つの同一ペプチドを含む。より好ましくは、該サブユニットは、本発明の３つの同一ポリペプチドからなる。別のより好ましい実施形態では、該サブユニットは、本発明の３つのポリペプチドを含むか、またはより好ましくは、それらからなり、該サブユニットは、Ｃ３対称性を有する。
【0140】
好ましい実施形態では、該ナノ粒子は、本発明の正確に２４個のポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、該ナノ粒子は正確に８つのサブユニットを含む。別の好ましい実施形態において、該ナノ粒子は、八面体構造（八面体点群対称性）を有する。本発明の好ましい実施形態では、ナノ粒子は、複数のサブユニット、好ましくは各々が本発明の３つのポリペプチドを含む８つのサブユニットの四次構造を有する。
【0141】
好ましい実施形態では、本発明の該ナノ粒子は、中心空洞（本明細書では空洞、内部空洞または管腔としても言及される）を含む。中心空洞を含む該ナノ粒子は、本明細書では「ケージ状ナノ粒子」または「ケージ」としても言及される。好ましい実施形態では、該ケージ状ナノ粒子は、（ｉ）外部足場および（ｉｉ）中心空洞を含む。好ましくは、該外部足場は、該中心空洞の周りを取り囲む、すなわち、該空洞の周りで組み立てられる。該空洞は、空であるか、またはカーゴを含むことができる。
【0142】
本発明のナノ粒子は、正に帯電した内部を有する。本発明のケージ状ナノ粒子は、空洞表面で正に帯電している。該正電荷は、アルギニンまたはリジンなどの複数の正に帯電したアミノ酸に起因する。したがって、本発明のナノ粒子は、負に帯電した高分子をカプセル化するための非常に強い親和性を有する。
【0143】
好ましい実施形態では、該空洞は、約６．５ｎｍ～約８ｎｍの直径を有する。好ましい実施形態では、該ケージ状ナノ粒子は多孔質構造を有し、すなわち、該ナノ粒子は細孔を含む。好ましくは、ケージ状ナノ粒子の外部足場は、該ナノ粒子の空洞に接続された細孔を含む。細孔は、本明細書では、ナノ粒子およびナノ粒子の外部足場における開口部または間隙として、それぞれ定義される。
【0144】
ナノ粒子へのカーゴの搭載（すなわちカプセル化）および荷降ろし（すなわち放出）は、細孔を介して機能する。搭載またはカプセル化という用語は、ナノ粒子の空洞、足場、および多孔質構造を含む、ナノ粒子へのカーゴの取り込みに関する。荷降ろし（または放出）という用語は、部分的または完全に、好ましくは完全に、別のカーゴによるカーゴの遊離または転置／交換に関する。好ましくは、荷降ろしは、競合条件下で、すなわち、荷降ろしされるカーゴと荷積みされる別のカーゴが互いに競合する条件下で行われる。
【0145】
好ましい実施形態では、該ケージ状ナノ粒子は、６つの細孔を含む。好ましくは、該ケージ状ナノ粒子は、空洞に接続した６つの細孔を含む。好ましくは、該外部足場は、ナノ粒子の空洞に接続した６つの細孔を含む。
【0146】
別の好ましい実施形態において、該細孔は、約３ｎｍ～約４ｎｍの直径を有する。別の好ましい実施形態において、該ナノ粒子は、３～４ｎｍの直径を有する６つの細孔を含む。
【0147】
別の好ましい実施形態において、該ナノ粒子は、最大約５０ｎｍの外径を有する。非常に好ましい実施形態では、該ナノ粒子は、約１３ｎｍの外径を有する。
【0148】
別のさらに好ましい実施形態では、ナノ粒子は、約３～４ｎｍの直径を有する６つの細孔を含み、該内部空洞は、約８ｎｍの直径を有し、ナノ粒子の該外径は、約１３ｎｍである。
【0149】
好ましい実施形態において、本発明の該ナノ粒子は、ナノ粒子が分解することなく、カーゴをカプセル化および放出することができ、好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0150】
ナノ粒子の多量体性により、機能性部分、例えばペプチドタグまたはＰＥＧなどの化学基による本発明ポリペプチドの修飾は、ナノ粒子表面上にこの官能部分の多価提示を提供する。
【0151】
好ましい実施形態では、ナノ粒子、特にケージ状ナノ粒子は、官能部分（本明細書では部分とも呼ばれる）を含む。好ましくは、該部分は、ナノ粒子の外面に位置する。より好ましくは、該追加の部分は、ナノ粒子、好ましくはナノ粒子の外面に付着している。
【0152】
好ましい実施形態では、該部分は、共有結合または非共有結合によって、好ましくは共有結合によって、ナノ粒子またはその外面に付着している。共有結合には、ペプチド結合またはジスルフィド結合が含まれ、好ましくはこれらである。
【0153】
別の好ましい実施形態において、ナノ粒子に付着した該部分は、本発明のポリペプチドのペプチドタグまたは非ペプチドタグである。
【0154】
別の好ましい実施形態において、該部分は、ポリヒスチジン、Ｈｉｓタグ（すなわち、２つ以上の連続して連結されたヒスチジンからなるアミノ酸配列）、分解タグ、標的化タグ、細胞透過タグ、およびエンドソーム脱出タグからなる群から選択される。
【0155】
該標的化タグは、好ましくは、がん標的に結合する、すなわち、該標的化タグは、がん標的化タグである。該がん標的は、特定の腫瘍細胞および腫瘍抗原内／上で発現レベルが増加した受容体を含む。好ましい実施形態では、該がん標的化タグは、がん標的に結合するペプチドリガンド、ペプチド模倣体、または抗体である。該がん標的化タグは、好ましくは葉酸である。
【0156】
好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、ナノ粒子の外面に少なくとも７２個のヒスチジル残基を示す。さらに好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、ナノ粒子の外面に少なくとも７２～２１６個のヒスチジル残基を示す。
【0157】
好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、ナノ粒子の外面に少なくとも７２個のヒスチジル残基を示し、該ヒスチジル残基は、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に結合し、該ナノ粒子は、インビボおよびインビトロで分解することなく、カーゴとともに積み降ろしされ得る。好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、ナノ粒子の外面に少なくとも７２個のヒスチジル残基を示し、該ヒスチジル残基は、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に結合している。さらに好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は、ナノ粒子の外面上に少なくとも７２～２１６個のヒスチジル残基を示し、該ヒスチジル残基は、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に結合している。
【0158】
好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、ナノ粒子の外面上に少なくとも９６個のヒスチジル残基、好ましくは１４４個のヒスチジル残基を示す。さらに好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、その外面に３～５０、好ましくは２４個のヒスチジンに富むアミノ酸配列を示し、該ヒスチジンに富むアミノ酸配列のそれぞれは、独立して、本発明ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合し、該ヒスチジンに富むアミノ酸配列のそれぞれは、少なくとも５つ、好ましくは６つのヒスチジン残基を含む。好ましくは、該ヒスチジンに富むアミノ酸配列は、３０アミノ酸以下、好ましくは２５アミノ酸以下、より好ましくは２０アミノ酸以下、さらにより好ましくは１５アミノ酸以下、さらにより好ましくは１０アミノ酸以下、さらにより好ましくは５または６アミノ酸の長さを有する。
【0159】
さらに好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、その外面に少なくとも７２、好ましくは少なくとも９６、より好ましくは少なくとも１２０、さらにより好ましくは少なくとも１４４のヒスチジル残基を示す。さらに好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、その外面に約１４４個のヒスチジル残基を示す。
【0160】
より好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、その外面に２４個のＨｉｓタグを示し、該Ｈｉｓタグのそれぞれは、３つ以上の連続して連結されたヒスチジンからなる。さらに好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、その外面に２４個のＨｉｓタグを示し、該Ｈｉｓタグのそれぞれは、３～９個の連続して連結されたヒスチジンからなる。より好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、その外面に２４個のＨｉｓタグを示し、該Ｈｉｓタグのそれぞれは、３つ以上の連続して連結されたヒスチジンからなり、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくは、Ｃ末端に付着している。さらに好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は、その外面に２４個のＨｉｓタグを示し、該Ｈｉｓタグのそれぞれは、３～９個の連続して連結されたヒスチジンからなり、該Ｈｉｓタグは、アミノ酸配列ＩのＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端に付着している。
【0161】
別の好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は、その外面に３～５０、好ましくは２４のＨｉｓ６タグを示し、該Ｈｉｓ６タグのそれぞれは、６つの連続して連結されたヒスチジンからなる。好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、その外面に３～５０、好ましくは、Ｈｉｓ６タグを含む２４個のアミノ酸配列（本明細書では、６つ連続して連結するヒスチジン、すなわちホモ－ヘキサ－ヒスチジンからなる配列として定義される）を示し、配列を含む該Ｈｉｓ６タグのそれぞれは、独立して、本発明ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付着している。好ましくは、配列を含む該Ｈｉｓ６タグは、３０アミノ酸以下、好ましくは２５以下、より好ましくは２０以下、さらにより好ましくは１５以下、さらにより好ましくは１０以下の長さを有する。好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、その外面に３～５０、好ましくは２４個のＨｉｓ６タグを示し、該Ｈｉｓ６タグのそれぞれは、独立して、本発明ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付着している。
【0162】
これらのヒスチジンに富むペプチドは、おそらくエンドソーム脱出特性により、標的細胞の細胞質への送達に重要である。ヒスチジン残基は、合成ペプチドおよび一部のウイルスのエンドソーム脱出に重要な役割を果たすことができると報告されている。ただし、ヒスチジンに富む機能性ペプチドの複数のコピーを提示するための多量体タンパク質アセンブリの使用は実証されておらず、タンパク質ナノ粒子の細胞質送達への新規アプローチを表す。
【0163】
好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子は、産生後に遺伝的（ペプチドの直接融合のため）または化学的に修飾される。
【0164】
本発明のナノ粒子は、ごくわずかな細胞毒性しか示さない。デヒドロゲナーゼ活性を定量化するため、ＷＳＴ－８を使用して２４時間にわたってＨｅＬａ細胞で、インビトロ細胞毒性を測定した（以下の材料および方法、細胞毒性を参照）。本発明のナノ粒子は、生存率を最大で約９５％に低下させた。生存率の低下は、１２μｇ／ｍＬ～１９３μｇ／ｍＬタンパク質（４００ｎＭケージ）の濃度で、約０％～約５％の間であった。比較すると、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００は、同じアッセイ条件下で、１９倍低い質量濃度（１０μｇ／ｍＬ）で細胞生存率を約３５～４５％に低下させた。
【0165】
さらなる態様では、本発明は、本発明のナノ粒子および１つ以上のカーゴ分子を含む複合体に関する。
【0166】
好ましい実施形態では、該複合体は、本発明のケージ状ナノ粒子と、ケージ状ナノ粒子の空洞にカプセル化された１つ以上のカーゴ分子とを含む。
【0167】
好ましい実施形態において、本発明の該複合体は、生物において免疫応答を誘導することができる。好ましくは、該生物は、動物、より好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくはマウスまたはヒト、最も好ましくはヒトである。
【0168】
本発明の複合体の該カーゴ分子は、好ましくは高分子である。さらに好ましい実施形態では、該高分子は負に帯電している。
【0169】
本明細書で使用される「負に帯電した」という用語は、負に帯電した基を有する分子を含み、好ましくはそれを指す。より好ましくは、該負に帯電した分子は、中性または生理学的ｐＨで負に帯電した基を有する。
【0170】
アルギニン残基に起因する、本発明ナノ粒子の正に強く帯電した内部により、ナノ粒子は、ＯＮなどの負に帯電した高分子をカプセル化するための強い親和性を有する。本発明の複合体による細胞の処理は、複合体の細胞内送達、およびその負に帯電した機能性高分子の放出をもたらす。したがって、本発明の複合体は、細胞への進入、エンドソーム脱出、および負に帯電した高分子の細胞内放出が可能である。例えば、ＯＮを含む複合体は、細胞質送達およびＯＮの放出により、所望の遺伝子の選択的ノックダウンを提供した。
【0171】
本発明の複合体はさらに細胞に進入することができ、また、ＯＮなどの負に帯電した高分子を細胞内に、好ましくは細胞質に放出することもできる。したがって、本発明の複合体は、ＯＮなどの負に帯電した高分子に対して条件付きで安定である。ケージの正に強く帯電した内部は、ＯＮなどの負に帯電した高分子をカプセル化するための強力な推進力を提供し、室温で標準緩衝液で数週間安定な複合体を提供する。
【0172】
カプセル化は、高濃度の競合ゲスト分子の存在下で可逆的であるが、本発明の複合体は細胞外で安定している。細胞の細胞質に見られるような高濃度の負に帯電した競合物質、例えば核酸の存在下では、ＯＮなどの負に帯電した高分子が徐々に放出され、その生体機能を実行することができる。ＯＮなどの負に帯電した高分子の競合物質が誘導する位置特異的放出のこの概念は独特であり、タンパク質ケージ内部のアルギニン残基の数および位置を変更することによって改変される可能性がある。したがって、好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、カーゴを可逆的にカプセル化および放出することができる。さらに好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、ナノ粒子が分解することなく、カーゴを可逆的にカプセル化および放出することができる。さらに好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、ナノ粒子が分解することなく、カーゴをカプセル化および放出することができる。該カーゴは、好ましくは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである。
【0173】
さらなる実施形態において、本発明のナノ粒子は、細胞外でカーゴをカプセル化することができ、好ましくは、該カーゴは、負に帯電した高分子であり、より好ましくはＲＮＡ、さらにより好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡであり、該カーゴをカプセル化する該ナノ粒子は、該カーゴを細胞内に放出することができる。
【0174】
好ましい実施形態では、該１つ以上の負に帯電した高分子の各々は、約３．５ｎｍ以下の直径を有する。さらに好ましい実施形態では、該１つ以上の負に帯電した高分子のそれぞれは、約２ｎｍ以下の直径を有する。好ましい実施形態では、該１つ以上の負に帯電した高分子のそれぞれは、約２ｎｍの直径および約８ｎｍの長さを有する。好ましくは、該高分子は、好ましくは約２ｎｍの直径および約８ｎｍの長さを有するモノマーの直鎖である。
【0175】
好ましい実施形態では、該負に帯電した高分子は、核酸またはポリペプチドである。
【0176】
別の好ましい実施形態において、該カーゴ分子はオリゴヌクレオチド（ＯＮ）である。
【0177】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド結合によって互いに連結された２つ以上のヌクレオチドを含む化合物を指す。オリゴヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドまたはそれらの混合物であり、好ましくは、一本鎖もしくは二本鎖（ａ）の未修飾、すなわち天然に存在するＲＮＡもしくはＤＮＡ、（ｂ）修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または（ｃ）ロックされた核酸（ＬＮＡ）もしくはペプチド核酸（ＰＮＡ）などのＲＮＡもしくはＤＮＡ模倣体から選択される。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、（ａ）一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、（ｂ）一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、（ｃ）一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、（ｄ）一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ならびに（ｅ）一本鎖または二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域および高次構造である。さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、合成、ゲノムまたは組換えである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（ａ）少なくとも１つの修飾ヌクレオチドもしくは少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ、または（ｂ）安定性もしくは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡもしくはＲＮＡを指す。
【0178】
本明細書で使用される「修飾ＲＮＡ」または「修飾ＤＮＡ」という用語は、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドベースのオリゴヌクレオチドと比較して、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合および／または少なくとも１つの糖修飾および／または少なくとも１つの塩基修飾を有する、上記で定義されたオリゴヌクレオチドを指す。修飾されたヌクレオシド間結合は、ＲＮＡおよびＤＮＡでは天然に存在しないホスホジエステルの修飾型の存在を示す。当業者に知られており、本発明と適合性があるヌクレオシド間結合修飾の例は、特に、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｈ－ホスホネート、メチルホスホネートおよびメチルホスホノチオエートであり、それらを含む。糖修飾は、二環糖、テトラヒドロピラン、モルホリノ、２’－修飾糖、３’－修飾糖、４’－修飾糖、５’－修飾糖、および４’－置換糖など、ＲＮＡおよびＤＮＡで天然に存在するリボシル部分（すなわち、フラノシル部分）の修飾型の存在を示す。適切な糖修飾の例は、当業者に知られており、２’－Ｏ－アルキルまたは２’－Ｏ－（置換）アルキル、例えば２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－（２－シアノエチル）、２’－Ｏ－（２－メトキシ）エチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－（２－チオメチル）エチル、２’－Ｏ－（ハロアルコキシ）メチル、例えば２’－Ｏ－（２－クロロエトキシ）メチル（ＭＣＥＭ）、２’－Ｏ－（２，２－ジクロロエトキシ）メチル（ＤＣＥＭ）。２’－Ｏ－アルコキシカルボニル、例えば、２’－Ｏ－［２－（メトキシカルボニル）エチル］（ＭＯＣＥ）、２’－Ｏ－［２－（Ｎ－メチルカルバモイル）エチル］（ＭＣＥ）、２’－Ｏ－［２－（Ｎ、Ｎ－ジメチルカルバモイル）エチル］（ＤＭＣＥ）、特に２’－Ｏ－メチル修飾または２’－Ｏ－（２－メトキシ）エチル（２’－ＭＯＥ）などの２’－Ｏ－修飾ＲＮＡヌクレオチド残基が含まれるが、これらに限定されない。別の重要な修飾には、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、キシロ－ＬＮＡ、アルファ－Ｌ－ＬＮＡ、ベータ－Ｄ－ＬＮＡ、ｃＥｔ（２’－Ｏ，４’－Ｃ拘束エチル）ＬＮＡ、ｃＭＯＥｔ（２’－Ｏ，４’－Ｃ拘束メトキシエチル）ＬＮＡ、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、フッ素化ＨＮＡ（Ｆ－ＨＮＡ）、ピラノシル－ＲＮＡ（ｐ－ＲＮＡ）、３’－デオキシピラノシル－ＤＮＡ（ｐ－ＤＮＡ）で見られるような架橋もしくは二環の核酸（ＢＮＡ）、または、モルホリノ（ＰＭＯ）、カチオン性モルホリノ（ＰＭＯＰｌｕｓ）もしくはＰＭＯ－Ｘなどの他の修飾された糖部分が含まれ、すべて当業者に知られている。本明細書で使用される「塩基修飾」という用語は、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡで天然に存在する塩基（すなわち、ピリミジンまたはプリン塩基）の修飾を指す。塩基修飾は、当業者に知られており、ヒポキサンチン、シュードウラシル、シュードチミン、２－チオピリミジン（例えば、２－チオウラシル、２－チオチミン）、２，６－ジアミノプリン、５－置換ピリミジン（例えば、５－ハロウラシル、５－メチルウラシル、５－メチルシトシン）７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、７－アザ－２，６－ジアミノプリン、８－アザ－７－デアザグアニン、８－アザ－７－デアザアデニン、または８－アザ－７－デアザ－２，６－ジアミノプリンなどの天然のプリンおよびピリミジン塩基（例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、およびチミン）の修飾型が含まれるが、これらに限定されない。該オリゴヌクレオチドが、２つ以上の、同じまたは異なる、ヌクレオシド間結合修飾、糖修飾、および／または塩基修飾を含むこともまた、本発明に包含される。したがって、本発明で言及されるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの任意の組み合わせおよび上記のそれらの修飾からなり得る。
【0179】
より好ましくは、該１つ以上の負に帯電した高分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および抗ｍｉＲＮＡからなる群から選択される１つ以上のオリゴリボヌクレオチドである。さらに好ましいのは、細胞、好ましくは樹状細胞におけるＩＦＮ－アルファ産生を刺激することができるオリゴヌクレオチドである。
【0180】
好ましい実施形態では、該１つ以上の負に帯電した高分子は、１つ以上のＯＮであり、該１つ以上のＯＮのヌクレオチドの総数は、約３００以下である。別の好ましい実施形態において、該１つ以上のＯＮのヌクレオチドの総数は、約１０～約３００、好ましくは約２０～約３００、より好ましくは約４０～約３００、さらにより好ましくは約５０～約３００であり、さらにより好ましくは約１００～約３００、さらにより好ましくは約２００～約３００である。
【0181】
別の好ましい実施形態において、該１つ以上のＯＮのヌクレオチドの総数は、約１０～約３００、好ましくは約１０～約２００、より好ましくは約１０～約５０、さらにより好ましくは約１０～約４０、さらにより好ましくは約１０～約３０である。
【0182】
別の好ましい実施形態において、該１つ以上のＯＮのヌクレオチドの総数は、約１０～約３００、好ましくは約２０～約２００、より好ましくは約４０～約１００である。
【0183】
好ましい実施形態では、該１つ以上のＯＮのヌクレオチドの総数は約３００以下であり、該ＯＮはＲＮＡ、好ましくはｓｓＲＮＡである。
【0184】
さらに好ましい実施形態では、該１つ以上のＯＮは、一本鎖ＯＮ（ｓｓＯＮ）、好ましくはｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡであり、該ｓｓＯＮは、共同で約４０ｎｔ以上、好ましくは約４０～約３００ｎｔ、より好ましくは約４０～約２００ｎｔ、さらにより好ましくは約４０～約１００ｎｔ、さらにより好ましくは約４０ｎｔの長さを有する。別の好ましい実施形態において、該１つ以上のＯＮは、二本鎖ＯＮ（ｄｓＯＮ）、好ましくはｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡであり、該ｄｓＯＮは、共同で、約４０ｂｐ以上、好ましくは約４０～約３００ｂｐ、より好ましくは約４０～約２００ｂｐ、さらにより好ましくは約４０～約１００ｂｐ、さらにより好ましくは約４０ｂｐの長さを有する。
【0185】
好ましい実施形態において、該１つ以上の高分子は、１つ以上のオリゴヌクレオチドであり、該１つ以上のオリゴヌクレオチドは、該ナノ粒子にカプセル化され、ＤＮＡｓｅ加水分解を受けにくい。したがって、好ましい意味では、「カプセル化された」という用語は、カプセル化された状態の１つ以上のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡｓｅ加水分解を受けにくいことを示す。より好ましくは、「カプセル化された」という用語は、カプセル化された状態の１つ以上のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡｓｅ加水分解を受けにくいことを示し、ＤＮＡｓｅがＤＮＡｓｅＩまたはＢｅｎｚｏｎａｓｅである。さらにより好ましくは、「カプセル化された」という用語は、カプセル化された状態の１つ以上のオリゴヌクレオチドがＢｅｎｚｏｎａｓｅ加水分解を受けにくいことを示す。
【0186】
該負に帯電した高分子は、好ましくは、非共有結合によってナノ粒子内にカプセル化される。該非共有結合は、好ましくは静電結合である。
【0187】
アジュバントなどの他の任意の試薬をナノ粒子内に含めることができる。
【0188】
さらに好ましい実施形態では、該負に帯電した高分子は、会合速度定数ｋｏｎが（６．６±０．６）×１０５Ｍ－１ｓ－１であるナノ粒子に結合するＯＮである（図２ｃ）。結合動態は、蛍光消光および蛍光定量を測定することによって決定される。データは、単一の指数関数的減衰に適合した（ＯＮ濃度に対してプロットした速度定数（ｋｏｂｓ）、線形適合）。
【0189】
さらに好ましい実施形態では、該負に帯電した高分子は、ナノ粒子から解離するＯＮであり、解離定数Ｋｄが（２．４±０．３）ｘ１０－１０Ｍであり、解離速度定数Ｋｏｆｆが（１．６±０．１）ｘ１０－４秒－１である。オフレートを決定するため、１００倍過剰の非標識ＤＮＡを使用して、カプセル化されたＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡカーゴの徐放を誘導した（図２ｄ）。データを単一の指数関数的減衰に適合させ、解離速度定数ｋ ｏｆｆが（１．６±０．１）ｘ１０－４ｓ－１であった。会合および解離速度定数を使用して、（２．４±０．３）ｘ１０－１０Ｍの平衡解離定数Ｋｄを算出した。
【0190】
好ましい実施形態において、複合体に含まれる負に帯電した高分子は、核酸、好ましくはＯＮであり、本発明の複合体の該ナノ粒子は、該核酸、好ましくは該ＯＮをヌクレアーゼによる分解から保護することができる。好ましい実施形態において、該ヌクレアーゼは、１４ｋＤ超、好ましくは２０ｋＤ超、より好ましくは３０ｋＤ超、さらにより好ましくは４０ｋＤ超、さらにより好ましくは５０ｋＤ超、さらにより好ましくは６０ｋＤ以上の分子量を有する。好ましい実施形態では、該ヌクレアーゼは、１４ｋＤ超の分子量を有する。好ましい実施形態において、該ヌクレアーゼは、６０ｋＤ以上の分子量を有する。
【0191】
好ましい実施形態において、本発明の複合体またはナノ粒子は、裸の、すなわち遊離のＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡを用いた対照と比較して、約３０倍増加した細胞取り込みを示す。
【0192】
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを該ナノ粒子に自己組織化する段階を含む、本発明ナノ粒子を製造するための方法を提供する。
【0193】
好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子を製造するための方法は、（ｉ）本発明のポリペプチドを製造する段階、および（ｉｉ）本発明のポリペプチドを該ナノ粒子に自己組織化する段階を含む。本発明のナノ粒子を製造するためのポリペプチドは、好ましくは、組換え発現によって産生される。好ましい実施形態では、該ポリペプチドは、細菌細胞、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞で組換え発現する。発現すると、本発明のポリペプチドは、単離することができる明確に定義されたナノ粒子に自己組織化する。
【0194】
好ましい実施形態では、ナノ粒子を製造するための方法は、ナノ粒子を単離する段階をさらに含む。該単離段階は、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー、より好ましくは固定化金属アフィニティークロマトグラフィーである。好ましい実施形態では、該単離工程は、ニッケル、コバルト、または銅を含む支持体を使用するアフィニティークロマトグラフィーである。最も好ましくは、該単離工程は、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーである。
【0195】
本発明のナノ粒子の正に帯電した内部により、本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞に由来する核酸の混入が可能である。これらの不要なカーゴは、高いイオン強度で除去して静電相互作用を弱め、ＲＮａｓｅＡで混入ＲＮＡを消化することができる。
【0196】
したがって、好ましい実施形態では、ナノ粒子を製造するための方法は、ナノ粒子を高イオン強度緩衝液および／またはＲＮａｓｅで処理する段階をさらに含む。好ましい実施形態において、該高イオン強度緩衝液は、０～２Ｍのイオン強度を有する。さらに好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子を製造するための該方法は、（ｉ）組換え体発現を介して本発明のポリペプチドを産生する段階、（ｉｉ）０～２Ｍのイオン強度を有し、ＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅを含む緩衝液中で発現したポリペプチドを処理し、本発明のポリペプチドを該ナノ粒子に自己組織化する段階を含む。好ましくは、該緩衝液の０～２Ｍの該高イオン強度は、ＮａＣｌの添加によって調節される。好ましくは、該高イオン強度緩衝液は、ＲＮａｓｅおよび／またはＤＮアーゼに加えて、リン酸ナトリウム緩衝液、ＮａＣｌ、イミダゾール、および任意選択でリゾチームを含む。該緩衝液は、例えば、約５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、約１０００ｍＭ ＮａＣｌ、およびイミダゾールを含み、リゾチーム、ＤＮａｓｅＩおよびＲＮａｓｅＡが補充されている。該高イオン強度緩衝液は、少なくとも２０ｍＭのイミダゾールを含む。
【0197】
さらなる態様において、本発明は、本発明のナノ粒子を１つ以上の負に帯電した高分子と混合する段階を含む、本発明の複合体を製造するための方法を提供する。好ましい実施形態では、該混合の段階は、水性緩衝液中で、好ましくは室温で行われる。
【0198】
さらなる態様において、本発明は、該細胞を本発明の複合体と接触させる段階を含む、該細胞をトランスフェクションするための方法を提供する。
【0199】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、負に帯電した高分子、好ましくは核酸、より好ましくはＯＮを細胞に導入するプロセスを指す。好ましくは、細胞をトランスフェクションするための該方法は、インビトロのプロセスである。
【0200】
好ましい実施形態では、該細胞は真核細胞である。より好ましくは、該細胞は動物細胞であり、さらにより好ましくは哺乳動物細胞である。
【0201】
さらなる態様において、本発明は、細胞をトランスフェクションするための本発明の複合体の使用に関する。
【実施例】
【0202】
実施例１－材料および方法
材料および計装
分子クローニングに使用されるすべての酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（アメリカ）から購入した。すべての合成オリゴヌクレオチドは、ＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈＡＧ（スイス）から購入した。プラスミドミニプレップおよびＤＮＡ精製キットは、ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ（アメリカ）から購入した。イソプロピル－ベータ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ（イギリス）から購入した。リゾチームは、ＰａｎＲｅａｃＡｘｏｎ Ｌａｂ ＡＧ（スイス）から購入した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質の単離には、Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ）のＮｉ－ＮＴＡアガロースを使用した。ＤＮａｓｅＩは、Ｒｏｃｈｅ（スイス）から、ＲＮａｓｅ ＡはＭｅｒｃｋ（ドイツ）からであった。ベンゾナーゼは、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（アメリカ）から購入した。ＧｅｌＲｅｄは、Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．（アメリカ）から購入した。プラスミドｐＥＴ２９ｂ（＋）－Ｏ３－３３２は、ＤａｖｉｄＢａｋｅｒ教授から快く提供された。
材料および計装
分子クローニングに使用されるすべての酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（アメリカ）から購入した。すべての合成オリゴヌクレオチドは、ＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈＡＧ（スイス）から購入した。プラスミドミニプレップおよびＤＮＡ精製キットは、ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ（アメリカ）から購入した。イソプロピル－ベータ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ（イギリス）から購入した。リゾチームは、ＰａｎＲｅａｃＡｘｏｎ Ｌａｂ ＡＧ（スイス）から購入した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質の単離には、Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ）のＮｉ－ＮＴＡアガロースを使用した。ＤＮａｓｅＩは、Ｒｏｃｈｅ（スイス）から、ＲＮａｓｅ ＡはＭｅｒｃｋ（ドイツ）からであった。ベンゾナーゼは、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（アメリカ）から購入した。ＧｅｌＲｅｄは、Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｉｎｃ．（アメリカ）から購入した。プラスミドｐＥＴ２９ｂ（＋）－Ｏ３－３３２は、ＤａｖｉｄＢａｋｅｒ教授から快く提供された。
【0203】
ＤＮＡおよびタンパク質の定量は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．（アメリカ）のＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ分光光度計を使用して実施した。すべてのサイズ排除クロマトグラフィーは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（アメリカ）のＮＧＣ（商標）中圧クロマトグラフィーシステムで実施した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（アメリカ）のＰｈａｓｔＧｅｌシステムで実行および展開した。アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）および変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は、Ｍｉｎｉ－Ｓｕｂ（登録商標）セルＧＴおよびＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮシステムでそれぞれ実行し、両方ともＢｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（アメリカ）からであった。Ｃａｎｏｎ（日本）のＥＯＳ１１００Ｄを使用してゲル画像を撮った。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像は、ＦＥＩ（アメリカ）のＭｏｒｇａｇｎｉ２６８で得た。蛍光顕微鏡画像は、Ｎｉｋｏｎ（日本）のＥｃｌｉｐｓｅ－Ｔｉ倒立顕微鏡で取得した。共焦点蛍光顕微鏡画像は、Ｌｅｉｃａ（ドイツ）のＳＰ８－ＡＯＢＳで取得した。フローサイトメトリーは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（アメリカ）のＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで実施した。
【0204】
分子モデリング
元のＯ３－３３アセンブリ（ＰＤＢ：３ＶＣＤ）（Ｋｉｎｇ，Ｎ．Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２，３３６，１１７１－１１７４）のＸ線回折データを使用して、アルギニンへの変異の配列位置を選出し、これは、Ｄｙｎａｍｅｏｍｉｃｓ骨格に依存しない回転異性体ライブラリー（Ｓｃｏｕｒａｓ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１１，２０，３４１－３５２）を用いてＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２００４，２５，１６０５－１６１２）によりモデル化した。
元のＯ３－３３アセンブリ（ＰＤＢ：３ＶＣＤ）（Ｋｉｎｇ，Ｎ．Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２，３３６，１１７１－１１７４）のＸ線回折データを使用して、アルギニンへの変異の配列位置を選出し、これは、Ｄｙｎａｍｅｏｍｉｃｓ骨格に依存しない回転異性体ライブラリー（Ｓｃｏｕｒａｓ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１１，２０，３４１－３５２）を用いてＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２００４，２５，１６０５－１６１２）によりモデル化した。
【0205】
分子クローニング
ＯＰの遺伝子は、ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ（ドイツ）から購入し、プラスミドｐＧＨ－ＯＰとして入手した。ＯＰ遺伝子インサートをｐＧＨ－ＯＰから切り出し、ＸｈｏＩおよびＮｄｅＩ制限部位を使用してベクターｐＥＴ２９ｂ（＋）－Ｏ３－３３ベクター（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２、前掲書）にクローニングし、Ｏ３－３３遺伝子を置換し、プラスミドｐＥＴ２９ｂ（＋）－ＯＰを得た。Ｈｉｓ６タグのないＯＰの遺伝子は、Ｈｉｓ６タグのすぐ上流にあるＸｈｏＩ部位でＧＳ＊＊をコードするＤＮＡカセットにクローニングすることによって調製した。プラスミド配列は、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（スイス）により実行されたＳａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列決定によって確認した。
ＯＰの遺伝子は、ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ（ドイツ）から購入し、プラスミドｐＧＨ－ＯＰとして入手した。ＯＰ遺伝子インサートをｐＧＨ－ＯＰから切り出し、ＸｈｏＩおよびＮｄｅＩ制限部位を使用してベクターｐＥＴ２９ｂ（＋）－Ｏ３－３３ベクター（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２、前掲書）にクローニングし、Ｏ３－３３遺伝子を置換し、プラスミドｐＥＴ２９ｂ（＋）－ＯＰを得た。Ｈｉｓ６タグのないＯＰの遺伝子は、Ｈｉｓ６タグのすぐ上流にあるＸｈｏＩ部位でＧＳ＊＊をコードするＤＮＡカセットにクローニングすることによって調製した。プラスミド配列は、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（スイス）により実行されたＳａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【0206】
タンパク質発現
タンパク質は、ｐＥＴ２９ｂ（＋）－Ｏ３－３３、ｐＥＴ２９ｂ（＋）－ＯＰ、またはｐＥＴ２９ｂ（＋）－ＯＰ＿Ｈｉｓ６なしのいずれかで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）で発現した。細胞は、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで、硫酸カナマイシン（８６μＭ）を含むＬＢ培地で３７℃で増殖させ、タンパク質の過剰発現をＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）で誘導した。２５℃で約１８時間培養した後、４℃で１５分間遠心分離（５，０００×ｇ）することにより細胞を収集した。細胞ペレットは精製するまで－２０℃で保存した。
タンパク質は、ｐＥＴ２９ｂ（＋）－Ｏ３－３３、ｐＥＴ２９ｂ（＋）－ＯＰ、またはｐＥＴ２９ｂ（＋）－ＯＰ＿Ｈｉｓ６なしのいずれかで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）で発現した。細胞は、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで、硫酸カナマイシン（８６μＭ）を含むＬＢ培地で３７℃で増殖させ、タンパク質の過剰発現をＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）で誘導した。２５℃で約１８時間培養した後、４℃で１５分間遠心分離（５，０００×ｇ）することにより細胞を収集した。細胞ペレットは精製するまで－２０℃で保存した。
【0207】
ＯＰの細胞溶解、Ｎｉ－ＮＴＡおよびＲＮＡ除去
ＯＰはＥ．ｃｏｌｉでの発現中に低分子ＲＮＡ分子を搭載できるため、空のケージを高純度で分離するために最適化されたプロトコルが開発された。これらには、高イオン強度緩衝液を使用して核酸との相互作用を弱めること、およびＲＮａｓｅＡとの長時間のインキュベーションが含まれる。８００ｍＬの培養液から得た各細胞ペレットは、リゾチーム（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮａｓｅＩ（１０Ｕ／ｍＬ）、ＲＮａｓｅ Ａ（５Ｕ／ｍＬ）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を補充した１０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）に再懸濁し、３７℃で１．５時間インキュベーションした。
ＯＰはＥ．ｃｏｌｉでの発現中に低分子ＲＮＡ分子を搭載できるため、空のケージを高純度で分離するために最適化されたプロトコルが開発された。これらには、高イオン強度緩衝液を使用して核酸との相互作用を弱めること、およびＲＮａｓｅＡとの長時間のインキュベーションが含まれる。８００ｍＬの培養液から得た各細胞ペレットは、リゾチーム（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮａｓｅＩ（１０Ｕ／ｍＬ）、ＲＮａｓｅ Ａ（５Ｕ／ｍＬ）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を補充した１０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）に再懸濁し、３７℃で１．５時間インキュベーションした。
【0208】
溶解、超音波処理、および２５℃で２５分間の遠心分離（１０，０００×ｇ）後、上清を重力流カラムの５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂に充填し、１５分間インキュベーションした。２０ｍＭおよび４０ｍＭイミダゾールを含む溶解緩衝液で複数回洗浄した後、標的タンパク質を溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）で溶出した。通常、１０～２０ｍＬを収集し、２Ｕ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充し、３７℃で一晩インキュベーションし、Ｎｉ－ＮＴＡ精製中に除去されなかった混入Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡを消化した。その後、タンパク質はＳＥＣの準備が整った。この時点以降、特に明記しない限り、タンパク質の保存およびすべての実験は室温で実施した。
【0209】
Ｏ３－３３の溶解およびＮｉ－ＮＴＡ
Ｏ３－３３の単離は、ＯＰと同じ段階に従ったが、核酸混入が問題にならないため、条件はそれほど厳しくなかった。溶解、超音波処理、およびＮｉ－ＮＴＡの場合、使用した緩衝液はイオン強度が低かった（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭイミダゾール）。溶出緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）でＮｉ－ＮＴＡから単離した後、タンパク質はＳＥＣの準備が整った。
Ｏ３－３３の単離は、ＯＰと同じ段階に従ったが、核酸混入が問題にならないため、条件はそれほど厳しくなかった。溶解、超音波処理、およびＮｉ－ＮＴＡの場合、使用した緩衝液はイオン強度が低かった（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭイミダゾール）。溶出緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）でＮｉ－ＮＴＡから単離した後、タンパク質はＳＥＣの準備が整った。
【0210】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣの前に、タンパク質サンプルを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニット（３０ｋ ＭＷＣＯ）（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、アメリカ）を使用して、２００ｍＭＮａＣｌおよび５ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。このプロセスでは、ＯＰからＲＮａｓｅＡおよび消化された核酸断片の一部も除去される。次に、完全に組み立てられた２４量体ケージを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（アメリカ）のＳｕｐｅｒｏｓｅ ６Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムを使用して、室温で１．０ｍＬ／分の流速でＳＥＣによって単離した。Ｏ３－３３ケージとＯＰケージはどちらも、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）の溶離液で１５～１６ｍＬで溶出する。精製タンパク質は、ＳＥＣ溶離液緩衝液に室温で保存した。タンパク質は２８０ｎｍでの吸光度によって定量化した。加えて、すべてのＲＮＡの除去は、Ａ２６０／Ａ２８０比から、および高感度の核酸染色剤であるＧｅｌＲｅｄで染色された未変性アガロースゲルによって確認した。タンパク質の純度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。
ＳＥＣの前に、タンパク質サンプルを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニット（３０ｋ ＭＷＣＯ）（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、アメリカ）を使用して、２００ｍＭＮａＣｌおよび５ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。このプロセスでは、ＯＰからＲＮａｓｅＡおよび消化された核酸断片の一部も除去される。次に、完全に組み立てられた２４量体ケージを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（アメリカ）のＳｕｐｅｒｏｓｅ ６Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムを使用して、室温で１．０ｍＬ／分の流速でＳＥＣによって単離した。Ｏ３－３３ケージとＯＰケージはどちらも、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）の溶離液で１５～１６ｍＬで溶出する。精製タンパク質は、ＳＥＣ溶離液緩衝液に室温で保存した。タンパク質は２８０ｎｍでの吸光度によって定量化した。加えて、すべてのＲＮＡの除去は、Ａ２６０／Ａ２８０比から、および高感度の核酸染色剤であるＧｅｌＲｅｄで染色された未変性アガロースゲルによって確認した。タンパク質の純度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。
【0211】
タンパク質ケージの一般的特性
すべての未変性ゲル電気泳動は、Ｔｒｉｓ－アセテート－ＥＤＴＡ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１９ｍＭ酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）で２％または３％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを使用して実施した。必要に応じて、非標識核酸を検出するためにゲルをＧｅｌＲｅｄでキャストし、タンパク質の可視化のためにＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色した。タンパク質分析の典型的な実験では、レーンあたり約１００または２００ｐｍｏｌのキャプシド（モノマーに関して）を、追加の２μＬの７０％（ｖ／ｖ）水性グリセロールを含む１０μＬの緩衝液にローディングした。ゲルを１００Ｖで３０分間泳動し、タンパク質を可視化するためにＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色し、Ａｔｔｏ４８８蛍光でＯＮを検出した。
すべての未変性ゲル電気泳動は、Ｔｒｉｓ－アセテート－ＥＤＴＡ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１９ｍＭ酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）で２％または３％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを使用して実施した。必要に応じて、非標識核酸を検出するためにゲルをＧｅｌＲｅｄでキャストし、タンパク質の可視化のためにＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色した。タンパク質分析の典型的な実験では、レーンあたり約１００または２００ｐｍｏｌのキャプシド（モノマーに関して）を、追加の２μＬの７０％（ｖ／ｖ）水性グリセロールを含む１０μＬの緩衝液にローディングした。ゲルを１００Ｖで３０分間泳動し、タンパク質を可視化するためにＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色し、Ａｔｔｏ４８８蛍光でＯＮを検出した。
【0212】
ＳＥＣ分析は、ケージの単離に使用したのと同じ条件下で実施した。以前に報告されたように（Ｂｅｃｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４，９３７－９４０）、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を実施した。すべてのＴＥＭ実験では、３～５μＭ（モノマー）のタンパク質サンプルを含む保存緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用した。ＤＬＳ測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、イギリス）で２５℃で実施し、０．２２μｍ濾過したサンプルを１５０～２５０μＭ（モノマー）含む保存緩衝液を使用した。
【0213】
融解温度
融解温度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＴｈｅｒｍａｌＳｈｉｆｔ（商標）Ｄｙｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）を使用して、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、アメリカ）で得られた。タンパク質は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌで構成される緩衝液で、５、１０、および２０μＭで３回測定した。すべてのデータを平均して値を算出した。
融解温度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＴｈｅｒｍａｌＳｈｉｆｔ（商標）Ｄｙｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）を使用して、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、アメリカ）で得られた。タンパク質は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌで構成される緩衝液で、５、１０、および２０μＭで３回測定した。すべてのデータを平均して値を算出した。
【表1】
【0214】
表４は、２当量のｓｉＲＮＡ二重鎖の存在下および非存在下でのＯ３－３３およびＯＰタンパク質の融解温度Ｔｍを示す。
【0215】
タンパク質結晶学
Ｐｈｏｅｎｉｘ結晶化ロボット（Ａｒｔ ＲｏｂｂｉｎｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、Ｉｎｔｅｌｌｉ－Ｐｌａｔｅ Ｒ９６－３ＬＶでシッティングドロップ蒸気拡散実験を設定した。最初の結晶化の試みは２０℃で行われた。十分に回折するＯＰ結晶は、２０℃で２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４および５％２－プロパノールと３ｍｇ／ｍＬの酵素溶液中で、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して得られた。結晶を凍結防止剤として２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むリザーバー溶液に移した後、窒素ガス流中で－１７３℃でフラッシュ冷却した。Ｘ線回折データセットは、ＥＩＧＥＲ Ｘ １６Ｍ検出器を使用して、スイス光源（Ｐａｕｌ ＳｃｈｅｒｒｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、スイス、フィリゲン）のＸ０６ＳＡで収集された。データ収集には１．００００Åの波長を使用した。
Ｐｈｏｅｎｉｘ結晶化ロボット（Ａｒｔ ＲｏｂｂｉｎｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、Ｉｎｔｅｌｌｉ－Ｐｌａｔｅ Ｒ９６－３ＬＶでシッティングドロップ蒸気拡散実験を設定した。最初の結晶化の試みは２０℃で行われた。十分に回折するＯＰ結晶は、２０℃で２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４および５％２－プロパノールと３ｍｇ／ｍＬの酵素溶液中で、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して得られた。結晶を凍結防止剤として２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むリザーバー溶液に移した後、窒素ガス流中で－１７３℃でフラッシュ冷却した。Ｘ線回折データセットは、ＥＩＧＥＲ Ｘ １６Ｍ検出器を使用して、スイス光源（Ｐａｕｌ ＳｃｈｅｒｒｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、スイス、フィリゲン）のＸ０６ＳＡで収集された。データ収集には１．００００Åの波長を使用した。
【0216】
ＯＰの回折データは、ＸＤＳプログラムパッケージ（Ｋａｂｓｃｈ Ｗ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２０１０，６６，１２５－１３２）を使用して処理およびスケーリングされた。初期段階は、Ｏ３－３３（ＰＤＢコード：３ＶＣＤ）の構造を検索モデルとして使用して、分子置換によって決定された。分子置換は、Ｐｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００７，４０，６５８－６７４）を用いて実施した。構造は、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００４，６０，２１２６－２１３２）を用いて手動で変更し、ＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２０１０，６６，２１３－２２１）を用いて精密化した。最終的な結晶データおよび強度の統計を表５にまとめている。
【0217】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
すべてのＥＭＳＡは、上記のように３％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで実施した。Ａｔｔｏ４８８標識ｓｓＤＮＡの場合、サンプル（＝１つのゲルレーン）あたり１０ｐｍｏｌのＤＮＡを使用し、各種モル当量のタンパク質を含む総量１０μＬのＰＢＳを用いて室温でインキュベーションした。非標識ｄｓＤＮＡおよびｄｓＲＮＡの場合、同じインキュベーション条件下でサンプルあたり４０ｐｍｏｌの二本鎖を使用し、可視化のためにゲルをＧｅｌＲｅｄでキャストした。
すべてのＥＭＳＡは、上記のように３％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで実施した。Ａｔｔｏ４８８標識ｓｓＤＮＡの場合、サンプル（＝１つのゲルレーン）あたり１０ｐｍｏｌのＤＮＡを使用し、各種モル当量のタンパク質を含む総量１０μＬのＰＢＳを用いて室温でインキュベーションした。非標識ｄｓＤＮＡおよびｄｓＲＮＡの場合、同じインキュベーション条件下でサンプルあたり４０ｐｍｏｌの二本鎖を使用し、可視化のためにゲルをＧｅｌＲｅｄでキャストした。
【0218】
カーゴ搭載量
純粋なＯＰタンパク質（１ｎｍｏｌ）を、５当量のｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはｄｓＲＮＡのいずれかを含む総量２００μＬのＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍＭ ＥＤＴＡ）とともに室温で一晩インキュベーションした。混合物をＳＥＣによって精製し、吸光度スペクトルを得た。すべての吸光度スペクトルは、ａ｜ｅ ＵＶ－Ｖｉｓ－ＩＲソフトウェアを使用して光散乱について補正された。タンパク質および核酸の濃度は、ＰｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄおよびＺｌｏｔｎｉｃｋ（Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１０，４０７，２８１－２８８）によって説明された式を使用して、２８０および２６０ｎｍでの吸光度値から決定された。
純粋なＯＰタンパク質（１ｎｍｏｌ）を、５当量のｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはｄｓＲＮＡのいずれかを含む総量２００μＬのＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および５ｍＭ ＥＤＴＡ）とともに室温で一晩インキュベーションした。混合物をＳＥＣによって精製し、吸光度スペクトルを得た。すべての吸光度スペクトルは、ａ｜ｅ ＵＶ－Ｖｉｓ－ＩＲソフトウェアを使用して光散乱について補正された。タンパク質および核酸の濃度は、ＰｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄおよびＺｌｏｔｎｉｃｋ（Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１０，４０７，２８１－２８８）によって説明された式を使用して、２８０および２６０ｎｍでの吸光度値から決定された。
【0219】
カプセル化動態
すべての動態測定は、ＰＢＳ中で室温で実施された。ｋｏｎを決定するための各実験について、８００μＬのＡｔｔｏ４８８標識ＤＮＡ（１０ｎＭ）溶液の蛍光発光を５１５ｎｍ（励起、４８８ｎｍ）で測定し、この値をｔ＝０秒とした。次に、少量の濃縮ＯＰ溶液を添加して、最終濃度を５～１２５ｎＭにし、経時的な発光の低下を１０秒間隔でモニターした。放出対時間の各測定値は単一の指数関数に適合し、ＯＰの各濃度にｋｏｂｓを提供した。次に、これらのｋｏｂｓ値は、［ＯＰ］に対してプロットし、ｋｏｎは、線形フィットの傾きから得られた。低濃度（＜２５ｎＭ）のＯＰでのｋｏｂｓの値は、ケージ当たり１つから２つのゲストＤＮＡ分子にシフトするため、信頼できない（図１７）。このように、２５～１２５ｎＭの範囲でｋｏｂｓのみがｋｏｎを決定するために使用され、線形近似のためのｙ－切片を１．６×１０－４ｓのｋｏｆｆ測定値に固定した。
すべての動態測定は、ＰＢＳ中で室温で実施された。ｋｏｎを決定するための各実験について、８００μＬのＡｔｔｏ４８８標識ＤＮＡ（１０ｎＭ）溶液の蛍光発光を５１５ｎｍ（励起、４８８ｎｍ）で測定し、この値をｔ＝０秒とした。次に、少量の濃縮ＯＰ溶液を添加して、最終濃度を５～１２５ｎＭにし、経時的な発光の低下を１０秒間隔でモニターした。放出対時間の各測定値は単一の指数関数に適合し、ＯＰの各濃度にｋｏｂｓを提供した。次に、これらのｋｏｂｓ値は、［ＯＰ］に対してプロットし、ｋｏｎは、線形フィットの傾きから得られた。低濃度（＜２５ｎＭ）のＯＰでのｋｏｂｓの値は、ケージ当たり１つから２つのゲストＤＮＡ分子にシフトするため、信頼できない（図１７）。このように、２５～１２５ｎＭの範囲でｋｏｂｓのみがｋｏｎを決定するために使用され、線形近似のためのｙ－切片を１．６×１０－４ｓのｋｏｆｆ測定値に固定した。
【0220】
ｋｏｆｆを測定するため、８００μＬのＡｔｔｏ４８８標識ＤＮＡ（１０ｎＭ）およびＯＰ（５ｎＭ）溶液を、蛍光の変化がさらに観察されなくなるまでインキュベーションした。これは、２つのｓｓＤＮＡ分子を含むＯＰケージを提供し、１：１複合体への第２のＤＮＡ分子のカプセル化が除外される場合のように、Ｋｏｆｆ測定を唯一の速度定数まで簡約する。ＯＰ：ＤＮＡ複合体の安定性が高いため、過剰な非標識ｓｓＤＮＡを使用して、カプセル化されたＡｔｔｏ４８８－ＤＮＡを置換し、タンパク質ケージから放出される場合に蛍光を回復した。１μＭの非標識ｓｓＤＮＡを添加した後、５１５ｎｍでの蛍光発光の変化を６０秒間隔で１６時間モニターした。データを単一の指数関数に適合させ、ｋｏｆｆを生成した。
【0221】
ヌクレアーゼ消化アッセイ
ＯＰと、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはｄｓＲＮＡのいずれかとの複合体（モル比１：１）は、室温で１時間ＰＢＳでインキュベーションすることにより調製した。核酸のみを含む同等のストックも調製した。次に、ストックをアリコートに分け、各ゲルレーンのサンプルを提供した。各サンプルには、ＭｇＣｌ２（２．５ｍＭ）、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）を添加した総量１０μＬのＰＢＳに２４ｐｍｏｌのＯＰ／核酸が含まれていた。対照サンプルはそのまま保存し、ヌクレアーゼサンプルには０．２ＵのＲＮａｓｅＡ、ＤＮａｓｅＩ、またはＢｅｎｚｏｎａｓｅを添加した。次に、すべてのサンプルを３７℃で１８時間インキュベーションした後、ＧｅｌＲｅｄ、次にＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色した未変性アガロースゲルで分析した（図１４）。
ＯＰと、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはｄｓＲＮＡのいずれかとの複合体（モル比１：１）は、室温で１時間ＰＢＳでインキュベーションすることにより調製した。核酸のみを含む同等のストックも調製した。次に、ストックをアリコートに分け、各ゲルレーンのサンプルを提供した。各サンプルには、ＭｇＣｌ２（２．５ｍＭ）、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）を添加した総量１０μＬのＰＢＳに２４ｐｍｏｌのＯＰ／核酸が含まれていた。対照サンプルはそのまま保存し、ヌクレアーゼサンプルには０．２ＵのＲＮａｓｅＡ、ＤＮａｓｅＩ、またはＢｅｎｚｏｎａｓｅを添加した。次に、すべてのサンプルを３７℃で１８時間インキュベーションした後、ＧｅｌＲｅｄ、次にＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで染色した未変性アガロースゲルで分析した（図１４）。
【0222】
細胞培養
ＨｅＬａおよびＡ４３１細胞はダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）で維持し、ＭＣＦ－７およびＶｅｒｏ細胞はイスコーブ改変ダルベッコ培地で維持し、ＨｅｐＧ２およびＨＴ２９はＲＰＭＩ－１６４０培地で、ＣＨＯはハムのＦ－１２Ｋ培地で維持した。すべての場合において、培地には１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、および１μｇ／ｍＬゲンタマイシンが添加された。細胞は３７℃で５％ＣＯ２で培養され、通常３日ごとに１：４の比率で分割された。ＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞は、ＨｅＬａ細胞と同じ方法で、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）および１０μｇ／ｍＬブラストサイジン（選択抗生物質）を培地に添加して維持した。ＮＥＡＡもブラストサイジンも、これらの時間枠内では効果がないことが分かったため、実験用の培地には添加しなかった。
ＨｅＬａおよびＡ４３１細胞はダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）で維持し、ＭＣＦ－７およびＶｅｒｏ細胞はイスコーブ改変ダルベッコ培地で維持し、ＨｅｐＧ２およびＨＴ２９はＲＰＭＩ－１６４０培地で、ＣＨＯはハムのＦ－１２Ｋ培地で維持した。すべての場合において、培地には１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、および１μｇ／ｍＬゲンタマイシンが添加された。細胞は３７℃で５％ＣＯ２で培養され、通常３日ごとに１：４の比率で分割された。ＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞は、ＨｅＬａ細胞と同じ方法で、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）および１０μｇ／ｍＬブラストサイジン（選択抗生物質）を培地に添加して維持した。ＮＥＡＡもブラストサイジンも、これらの時間枠内では効果がないことが分かったため、実験用の培地には添加しなかった。
【0223】
細胞毒性
ＯＰおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）の細胞毒性は、製造元の指示に従ってＳｉｇｍａのＷＳＴ－８系Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８を使用して評価した。ＨｅＬａ細胞は、培地１００μＬで９６ウェルプレートにウェル当たり５，０００細胞の密度で播種し、２４時間３７℃、５％ＣＯ２で回収させた。ＯＰ（０．２２μｍ膜を通したろ過により前滅菌）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のサンプルは、滅菌ＰＢＳで段階希釈により調製した。図１５に示す最終濃度を提供するために、総量１０μＬのサンプルを各ウェルに添加した。陰性対照として、１０％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む１０μＬのＰＢＳをウェルごとに使用した。陽性対照は単なるＰＢＳであった。各ウェルに１０μＬのＣＫＫ－８試薬を添加する前に、細胞を５％ＣＯ２、３７℃で２４時間または４８時間インキュベーションした。次に、プレートを３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。細胞を含まない培地でのＣＫＫ－８の吸光度をバックグラウンド減算に使用し、サンプルを未処理の細胞に対して正規化し、図１５に示す値を提供した。サンプルは３回測定された。
ＯＰおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）の細胞毒性は、製造元の指示に従ってＳｉｇｍａのＷＳＴ－８系Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８を使用して評価した。ＨｅＬａ細胞は、培地１００μＬで９６ウェルプレートにウェル当たり５，０００細胞の密度で播種し、２４時間３７℃、５％ＣＯ２で回収させた。ＯＰ（０．２２μｍ膜を通したろ過により前滅菌）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のサンプルは、滅菌ＰＢＳで段階希釈により調製した。図１５に示す最終濃度を提供するために、総量１０μＬのサンプルを各ウェルに添加した。陰性対照として、１０％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む１０μＬのＰＢＳをウェルごとに使用した。陽性対照は単なるＰＢＳであった。各ウェルに１０μＬのＣＫＫ－８試薬を添加する前に、細胞を５％ＣＯ２、３７℃で２４時間または４８時間インキュベーションした。次に、プレートを３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした後、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。細胞を含まない培地でのＣＫＫ－８の吸光度をバックグラウンド減算に使用し、サンプルを未処理の細胞に対して正規化し、図１５に示す値を提供した。サンプルは３回測定された。
【0224】
フローサイトメトリーによる細胞取り込み
ＨｅＬａ細胞は、２４ウェルプレートにウェル当たり３０，０００細胞の密度で５００μＬの培地に播種し、２４時間３７℃、５％ＣＯ２で回収し、集密度は７０～９０％に達した。ＯＰタンパク質およびＡｔｔｏ４８８－ＤＮＡの両方を０．２２μｍ膜でろ過滅菌し、ストックを滅菌ＰＢＳで調製した。各ウェルについて、２０μＬのサンプルを含むＰＢＳを２００μＬの培地に添加し、２００ｎＭの最終Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡ濃度を得た。細胞を５％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理した（０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）、３７℃で４分間）。細胞を冷培地に収集し、冷ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメトリー緩衝液（５％ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳ）に再懸濁した。
ＨｅＬａ細胞は、２４ウェルプレートにウェル当たり３０，０００細胞の密度で５００μＬの培地に播種し、２４時間３７℃、５％ＣＯ２で回収し、集密度は７０～９０％に達した。ＯＰタンパク質およびＡｔｔｏ４８８－ＤＮＡの両方を０．２２μｍ膜でろ過滅菌し、ストックを滅菌ＰＢＳで調製した。各ウェルについて、２０μＬのサンプルを含むＰＢＳを２００μＬの培地に添加し、２００ｎＭの最終Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡ濃度を得た。細胞を５％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理した（０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）、３７℃で４分間）。細胞を冷培地に収集し、冷ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメトリー緩衝液（５％ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳ）に再懸濁した。
【0225】
共焦点蛍光顕微鏡による細胞取り込み
ＨｅＬａ細胞は、ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ（ドイツ）のｉｂｉＴｒｅａｔ表面を備えたμスライド８ウェルチャンバーカバースリップにウェルあたり１５，０００細胞の密度で播種された。細胞は、試料添加前に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間２００μＬの培地でインキュベーションした。ＯＰタンパク質およびＡｔｔｏ４８８－ＤＮＡの両方を０．２２μｍ膜でろ過滅菌し、ストックを滅菌ＰＢＳで調製した。各ウェルについて、１０μＬのサンプルを含むＰＢＳを１００μＬの培地に添加し、２００ｎＭの最終Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡ濃度を得た。細胞を５％Ｃ ＣＯ２ Ｏ２、３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄し、１００μＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２溶液（ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬ）で３７℃で１０分間核染色した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５％ＦＢＳを含むＰＢＳで３７℃で顕微鏡検査を行った。
ＨｅＬａ細胞は、ｉｂｉｄｉ ＧｍｂＨ（ドイツ）のｉｂｉＴｒｅａｔ表面を備えたμスライド８ウェルチャンバーカバースリップにウェルあたり１５，０００細胞の密度で播種された。細胞は、試料添加前に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間２００μＬの培地でインキュベーションした。ＯＰタンパク質およびＡｔｔｏ４８８－ＤＮＡの両方を０．２２μｍ膜でろ過滅菌し、ストックを滅菌ＰＢＳで調製した。各ウェルについて、１０μＬのサンプルを含むＰＢＳを１００μＬの培地に添加し、２００ｎＭの最終Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡ濃度を得た。細胞を５％Ｃ ＣＯ２ Ｏ２、３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄し、１００μＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２溶液（ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬ）で３７℃で１０分間核染色した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５％ＦＢＳを含むＰＢＳで３７℃で顕微鏡検査を行った。
【0226】
ＧＦＰノックダウン
ＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞を、５００μＬの培地にウェルあたり３０，０００細胞の密度で２４ウェルプレートの培地に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間回収し、約７０％の集密度に到達した。滅菌タンパク質、ＲＮＡ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のサンプルをＰＢＳで調製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の対照を除いて、すべてのサンプル（ＰＢＳ中２０μＬ）を２００μＬ ＯｐｔｉＭＥＭの細胞に添加し、３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした後、３００μＬの完全培地を添加した。次に、細胞を３７℃および５％ＣＯ２でさらにインキュベーションし、サンプルの添加およびフローサイトメトリー分析の間に合計４８時間を与えた。他のすべてのサンプルに使用された条件下でのリポフェクタミン２０００のノックダウン効率の変化はごくわずかであったが、毒性が問題であった。そのため、必要な最小量のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用し、ノックダウン効率を損なうことなく毒性を最小限に抑えた。これは、ｓｉＲＮＡ ４０ｐｍｏｌあたり１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００であると決定され、これは、製造元ーが推奨する最小量でもある。次に、フローサイトメトリー分析の前に、製造元の推奨プロトコル、およびｓｉＲＮＡリポプレックス（ＰＢＳで予め調製）を含む培地で３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベーションされた細胞を使用した。
ＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞を、５００μＬの培地にウェルあたり３０，０００細胞の密度で２４ウェルプレートの培地に播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間回収し、約７０％の集密度に到達した。滅菌タンパク質、ＲＮＡ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のサンプルをＰＢＳで調製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の対照を除いて、すべてのサンプル（ＰＢＳ中２０μＬ）を２００μＬ ＯｐｔｉＭＥＭの細胞に添加し、３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした後、３００μＬの完全培地を添加した。次に、細胞を３７℃および５％ＣＯ２でさらにインキュベーションし、サンプルの添加およびフローサイトメトリー分析の間に合計４８時間を与えた。他のすべてのサンプルに使用された条件下でのリポフェクタミン２０００のノックダウン効率の変化はごくわずかであったが、毒性が問題であった。そのため、必要な最小量のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用し、ノックダウン効率を損なうことなく毒性を最小限に抑えた。これは、ｓｉＲＮＡ ４０ｐｍｏｌあたり１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００であると決定され、これは、製造元ーが推奨する最小量でもある。次に、フローサイトメトリー分析の前に、製造元の推奨プロトコル、およびｓｉＲＮＡリポプレックス（ＰＢＳで予め調製）を含む培地で３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベーションされた細胞を使用した。
【0227】
フローサイトメトリー分析の前に、蛍光顕微鏡検査を２４ウェルプレートで直接実施し、ＧＦＰ発現レベルの定性的測定値を取得し、細胞の健康状態を評価した（図１６）。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理した。細胞を冷培地に収集し、冷ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメトリー緩衝液（５％ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳ）に再懸濁した。培地およびインキュベーション条件を一致させた未処理のＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞を陽性対照として使用し、ＧＦＰを発現しないＨｅＬａ細胞をＧＦＰ蛍光の陰性対照として使用し、サイトメーターの設定を最適化した。タンパク質およびｓｉＲＮＡの異なるバッチを用いて、サンプルを少なくとも３回何度も測定した。
【0228】
Ｈｉｓ６タグなしのＯＰの精製
以前に報告されたように、硫酸アンモニウム沈殿を使用した（Ｂｅｃｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．＿Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２０１５，５４，９３７－９４０）が、低分子ＲＮＡ分子の除去を最適化するために変更が加えられている。８００ｍＬの培養液からの各細胞ペレットを、リゾチーム（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮａｓｅＩ（１０Ｕ／ｍＬ）、ＲＮａｓｅ Ａ（５Ｕ／ｍＬ）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を添加した１０ｍＬの緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１０００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、３７℃で１．５時間インキュベーションした。溶解後、懸濁液を超音波処理し、遠心分離した（１０，０００×ｇ、２５℃、２５分）。次に、上清を６５℃で３０分間加熱し、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２５分）し、変性Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質をペレット化した。硫酸アンモニウムをその飽和濃度の７０％まで上清に添加し、懸濁液を遠心分離した（１０，０００×ｇ、４℃、２０分）。タンパク質ペレットを２０ｍＬの緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１０００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、硫酸アンモニウム沈殿をさらに２回行った。最後に、沈殿したタンパク質を低塩緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、２Ｕ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した後、混入物のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡを消化するため、３７℃で一晩インキュベーションした。次に、タンパク質をＳＥＣで精製し、これは、２５ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＨ５．５）、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、および２５０ｍＭ ＭｇＳＯ４で構成される緩衝液で行い、残存するゲスト分子とタンパク質ケージとの相互作用を弱めた。これ以降、タンパク質を室温でＰＢＳ緩衝液に保存した。
以前に報告されたように、硫酸アンモニウム沈殿を使用した（Ｂｅｃｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．＿Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２０１５，５４，９３７－９４０）が、低分子ＲＮＡ分子の除去を最適化するために変更が加えられている。８００ｍＬの培養液からの各細胞ペレットを、リゾチーム（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮａｓｅＩ（１０Ｕ／ｍＬ）、ＲＮａｓｅ Ａ（５Ｕ／ｍＬ）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を添加した１０ｍＬの緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１０００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、３７℃で１．５時間インキュベーションした。溶解後、懸濁液を超音波処理し、遠心分離した（１０，０００×ｇ、２５℃、２５分）。次に、上清を６５℃で３０分間加熱し、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２５分）し、変性Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質をペレット化した。硫酸アンモニウムをその飽和濃度の７０％まで上清に添加し、懸濁液を遠心分離した（１０，０００×ｇ、４℃、２０分）。タンパク質ペレットを２０ｍＬの緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１０００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、硫酸アンモニウム沈殿をさらに２回行った。最後に、沈殿したタンパク質を低塩緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、２Ｕ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した後、混入物のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡを消化するため、３７℃で一晩インキュベーションした。次に、タンパク質をＳＥＣで精製し、これは、２５ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＨ５．５）、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、および２５０ｍＭ ＭｇＳＯ４で構成される緩衝液で行い、残存するゲスト分子とタンパク質ケージとの相互作用を弱めた。これ以降、タンパク質を室温でＰＢＳ緩衝液に保存した。
【0229】
ｔＲＮＡによるカーゴの置換
最初に、ＯＰがｔＲＮＡをカプセル化する能力をＥＭＳＡにより検定した（図１７）。サンプルは、２０ｐｍｏｌのｔＲＮＡ（小麦胚芽から得たトランスファーＲＮＡ、Ｆｌｕｋａ、ドイツ）を含む１０μＬのＰＢＳを用いて、ＯＰ（１．２モル当量）を含むまたは含まずに調製し、ＧｅｌＲｅｄで染色した未変性アガロースゲルにより分析した。ｔＲＮＡの細胞内濃度は、ＨｅＬａ細胞の平均体積、単一細胞から単離されたＲＮＡの質量、およびｔＲＮＡである全ＲＮＡのパーセンテージに基づいて算出した（Ｌｕｂｙ－Ｐｈｅｌｐｓ，Ｋ．ＩｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗａｌｔｅｒ，Ｈ．，Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．，Ｓｒｅｒｅ，Ｐ．Ａ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：１９９９；Ｖｏｌ．１９２，ｐ１８９－２２１、Ｌｏｄｉｓｈ Ｈ，Ｂ．Ａ．，Ｚｉｐｕｒｓｋｙ ＳＬＩｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）。この推定値は、細胞質内の分子密集の影響、遊離ｔＲＮＡの相対的な割合、またはＯＰによってカプセル化もされ得る他の分子を考慮に入れていない。置換アッセイでは、ＯＰとＡｔｔｏ４８８－ＤＮＡの二本鎖との複合体（モル比１：１）を、室温で１時間ＰＢＳでインキュベーションすることにより調製した。次に、ストックをアリコートに分け、各ゲルレーンのサンプルを提供した。各サンプルには、総量１０μＬのＰＢＳに１０ｐｍｏｌのＯＰ／核酸が含まれていた。次に、２μＬの濃縮ｔＲＮＡストックをさまざまな時点でサンプルに添加して、２６μＭの最終［ｔＲＮＡ］を得、サンプルを３７℃でインキュベーションした。次に、サンプルを未変性アガロースゲルで分析し、Ａｔｔｏ４８８蛍光で可視化した（図４ｂ）。
最初に、ＯＰがｔＲＮＡをカプセル化する能力をＥＭＳＡにより検定した（図１７）。サンプルは、２０ｐｍｏｌのｔＲＮＡ（小麦胚芽から得たトランスファーＲＮＡ、Ｆｌｕｋａ、ドイツ）を含む１０μＬのＰＢＳを用いて、ＯＰ（１．２モル当量）を含むまたは含まずに調製し、ＧｅｌＲｅｄで染色した未変性アガロースゲルにより分析した。ｔＲＮＡの細胞内濃度は、ＨｅＬａ細胞の平均体積、単一細胞から単離されたＲＮＡの質量、およびｔＲＮＡである全ＲＮＡのパーセンテージに基づいて算出した（Ｌｕｂｙ－Ｐｈｅｌｐｓ，Ｋ．ＩｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗａｌｔｅｒ，Ｈ．，Ｂｒｏｏｋｓ，Ｄ．Ｅ．，Ｓｒｅｒｅ，Ｐ．Ａ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：１９９９；Ｖｏｌ．１９２，ｐ１８９－２２１、Ｌｏｄｉｓｈ Ｈ，Ｂ．Ａ．，Ｚｉｐｕｒｓｋｙ ＳＬＩｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）。この推定値は、細胞質内の分子密集の影響、遊離ｔＲＮＡの相対的な割合、またはＯＰによってカプセル化もされ得る他の分子を考慮に入れていない。置換アッセイでは、ＯＰとＡｔｔｏ４８８－ＤＮＡの二本鎖との複合体（モル比１：１）を、室温で１時間ＰＢＳでインキュベーションすることにより調製した。次に、ストックをアリコートに分け、各ゲルレーンのサンプルを提供した。各サンプルには、総量１０μＬのＰＢＳに１０ｐｍｏｌのＯＰ／核酸が含まれていた。次に、２μＬの濃縮ｔＲＮＡストックをさまざまな時点でサンプルに添加して、２６μＭの最終［ｔＲＮＡ］を得、サンプルを３７℃でインキュベーションした。次に、サンプルを未変性アガロースゲルで分析し、Ａｔｔｏ４８８蛍光で可視化した（図４ｂ）。
【0230】
血清安定性
ＯＰとｓｉＲＮＡとの複合体（モル比１：１）は、室温で１時間ＰＢＳでインキュベーションすることにより調製した。次に、ストックをアリコートに分け、各ゲルレーンのサンプルを提供した。各サンプルには、総量５μＬのＰＢＳに１０ｐｍｏｌのＯＰ／核酸が含まれていた。さまざまな時点で、２０％ウシ胎児血清を含む５μＬのＰＢＳをサンプルに添加し、３７℃でインキュベーションした。次に、サンプルを未変性アガロースゲルで分析し、ＧｅｌＲｅｄおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで可視化した（図２２）。
ＯＰとｓｉＲＮＡとの複合体（モル比１：１）は、室温で１時間ＰＢＳでインキュベーションすることにより調製した。次に、ストックをアリコートに分け、各ゲルレーンのサンプルを提供した。各サンプルには、総量５μＬのＰＢＳに１０ｐｍｏｌのＯＰ／核酸が含まれていた。さまざまな時点で、２０％ウシ胎児血清を含む５μＬのＰＢＳをサンプルに添加し、３７℃でインキュベーションした。次に、サンプルを未変性アガロースゲルで分析し、ＧｅｌＲｅｄおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーで可視化した（図２２）。
【0231】
小角Ｘ線散乱
ＳＡＸＳデータは、ＰＥＴＲＡ－ＩＩＩシンクロトロン（ＤＥＳＹ、ハンブルグ、ドイツ）のビームラインＰ１２で得られ、Ｘ線波長は１．２４Åであった。Ｐｉｌａｔｕｓ １Ｍ検出器をサンプルから２ｍに配置し、０．０２８～６．７ｎｍ－１の散乱ベクトル範囲を収集した。サンプルは、各種濃度（０．５～５ｍｇ／ｍＬタンパク質）のＳＡＸＳ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０％グリセロール）で測定され、最小の凝集およびノイズを示すサンプルのデータは、さらなる分析に使用した。すべてのサンプルをＳＡＸＳ緩衝液で透析し、よく一致する緩衝液ブランクを提供した。ＯＰ：ｄｓＤＮＡおよびＯＰ：ｄｓＲＮＡの場合、ＳＡＸＳ緩衝液での透析前に、タンパク質ケージを２当量の二本鎖とともに一晩インキュベーションした。散乱曲線はＰＲＩＭＵＳ１６を使用して分析し、ペア距離分布はＡＵＴＯＧＮＯＭを使用して計算した。
ＳＡＸＳデータは、ＰＥＴＲＡ－ＩＩＩシンクロトロン（ＤＥＳＹ、ハンブルグ、ドイツ）のビームラインＰ１２で得られ、Ｘ線波長は１．２４Åであった。Ｐｉｌａｔｕｓ １Ｍ検出器をサンプルから２ｍに配置し、０．０２８～６．７ｎｍ－１の散乱ベクトル範囲を収集した。サンプルは、各種濃度（０．５～５ｍｇ／ｍＬタンパク質）のＳＡＸＳ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０％グリセロール）で測定され、最小の凝集およびノイズを示すサンプルのデータは、さらなる分析に使用した。すべてのサンプルをＳＡＸＳ緩衝液で透析し、よく一致する緩衝液ブランクを提供した。ＯＰ：ｄｓＤＮＡおよびＯＰ：ｄｓＲＮＡの場合、ＳＡＸＳ緩衝液での透析前に、タンパク質ケージを２当量の二本鎖とともに一晩インキュベーションした。散乱曲線はＰＲＩＭＵＳ１６を使用して分析し、ペア距離分布はＡＵＴＯＧＮＯＭを使用して計算した。
【0232】
二本鎖ＤＮＡの解離
ｈｐＤＮＡが解離しないことを確認するために、１０ｎＭ Ａｔｔｏ４８８－ｈｐＤＮＡを含む８００μＬのＰＢＳ溶液の蛍光スペクトルを４５０ｎｍ～６００ｎｍで測定した。続いて、５０ｎＭ ＯＴＲ５０１を各サンプルに添加し、別のスペクトルを記録する前に、６００秒にわたって蛍光減衰を追跡した。同じ手順を、１０ｎＭ ｄｓＤＮＡ溶液（Ａｔｔｏ－４８８ ｓｓＤＮＡおよびＬｕｃ－ｇ）、８Ｍ尿素を含む１０ｎＭ ｄｓＤＮＡ溶液、およびＡｔｔｏ－４８８ｓｓＤＮＡおよびＧＦＰ－ｇの１０ｎＭ溶液に適用した。
ｈｐＤＮＡが解離しないことを確認するために、１０ｎＭ Ａｔｔｏ４８８－ｈｐＤＮＡを含む８００μＬのＰＢＳ溶液の蛍光スペクトルを４５０ｎｍ～６００ｎｍで測定した。続いて、５０ｎＭ ＯＴＲ５０１を各サンプルに添加し、別のスペクトルを記録する前に、６００秒にわたって蛍光減衰を追跡した。同じ手順を、１０ｎＭ ｄｓＤＮＡ溶液（Ａｔｔｏ－４８８ ｓｓＤＮＡおよびＬｕｃ－ｇ）、８Ｍ尿素を含む１０ｎＭ ｄｓＤＮＡ溶液、およびＡｔｔｏ－４８８ｓｓＤＮＡおよびＧＦＰ－ｇの１０ｎＭ溶液に適用した。
【0233】
実施例２－タンパク質および核酸配列
タンパク質の分子量（ＭＷ）、等電点（ｐＩ）、および２８０ｎｍでの吸光係数（ε２８０、Ｍ－１ｃｍ－１）は、ＳＩＢ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｏｒｔａｌツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）を使用して計算した。
タンパク質の分子量（ＭＷ）、等電点（ｐＩ）、および２８０ｎｍでの吸光係数（ε２８０、Ｍ－１ｃｍ－１）は、ＳＩＢ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｏｒｔａｌツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）を使用して計算した。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0234】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーの可視化は、タンパク質ＯＰおよびＯＴＲ１０１からＯＴＲ５０３への異なる移動度から生じた異なる移動度を示した。これは、すべてのタンパク質が約２０ ｋＤａの同じ重量を有し、すべての変異型が適正な純度であることを証明している。
【表3】
【0235】
大文字はデオキシリボヌクレオチドを示し、小文字はリボヌクレオチドをそれぞれ示す。Ａ４８８は、固相合成中に結合するフルオロフォアＡｔｔｏ４８８ホスホルアミダイトを指す。
【0236】
実施例３－ナノ粒子の構造的特徴
出発足場として、本発明者らは、ベイカーおよび同僚によってコンピュータ設計された自己組織化タンパク質ケージであるＯ３－３３を選択し（Ｋｉｎｇ，Ｎ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ Ａｔｏｍｉｃ Ｌｅｖｅｌ Ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２，３３６，１１７１－１１７４）、これは非機能性タンパク質ケージであり、高分子を細胞内にカプセル化または送達する能力がない、コンピュータ設計された未変性の足場である。
出発足場として、本発明者らは、ベイカーおよび同僚によってコンピュータ設計された自己組織化タンパク質ケージであるＯ３－３３を選択し（Ｋｉｎｇ，Ｎ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ Ａｔｏｍｉｃ Ｌｅｖｅｌ Ａｃｃｕｒａｃｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２，３３６，１１７１－１１７４）、これは非機能性タンパク質ケージであり、高分子を細胞内にカプセル化または送達する能力がない、コンピュータ設計された未変性の足場である。
【0237】
カーゴの搭載を可能にするために、本発明者らは、Ｏ３－３３に結合相互作用を導入した。アミノ酸のＴｈｒ１１、Ｐｒｏ３９、Ｇｌｕ６６、Ｔｒｐ１０３、Ｐｈｅ１３０、およびＬｅｕ１６３をアルギニンに置き換えて、Ｏ３－３３変異型（本明細書ではＯＰと呼ぶ）を作成し、これは、強く正に帯電した内部空洞を有する（図１ｂ、５）。ＯＰタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で過剰発現し、Ｃ末端のＨｉｓ６タグを介したＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより単離できる（図６）。強く正に帯電した内部空洞のため、内因性Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡからの有意な混入があった。ただし、これらのＲＮＡ混入は、静電相互作用を弱めるための高イオン強度緩衝液および混入ＲＮＡを消化するためのＲＮａｓｅ Ａを用いて容易に除去された（ＯＰについての材料および方法、細胞溶解、Ｎｉ－ＮＴＡおよびＲＮＡ除去を参照）。
【0238】
所望するケージ状四次構造を形成するＯＰの能力（図１ａ）は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、および未変性アガロースゲル電気泳動（ＡＧＥ）によって評価された（図７、８）。すべてのデータは、Ｏ３－３３ケージと同じサイズのアセンブリの形成と一致していた。さらに、ＯＰとＯ３－３３はＴＥＭで識別できず（図１ｃ、９）、Ｘ線回折により、直径約８ｎｍの空洞に１４４個のアルギニンを添加しても、モノマーの折り畳みおよびケージ構造にほとんど影響を及ぼさないことが確認された（図１ｄ）。平均二乗偏差は、各モノマーのすべてのＣα原子で０．５～０．７Åであった。
【0239】
さらに、ＳＥＣ、ＡＧＥ、およびＴＥＭによるＯＰ変異型のＯＴＲ１０１～ＯＴＲ５０３の特性評価では、すべてのＯＰ変異型の構造がＯＰと同じであることが示された。
【0240】
実施例４－核酸カーゴの搭載
空のタンパク質ケージの構造的一体性が確立されたので、核酸カーゴの搭載をインビトロで調査した。直径２ｎｍのＤＮＡおよびＲＮＡ二重鎖は、直径約３．５ｎｍの細孔を通過できるため、カプセル化が可能である。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により、親Ｏ３－３３ケージが２１ｎｔのＡｔｔｏ４８８標識一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡであるＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡの電気泳動移動度に影響を及ぼさないことが明らかになった（図１０）。対照的に、ＯＰではタンパク質およびＤＮＡバンドの共局在が観察された（図２ａ）。二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡおよびｄｓＲＮＡとＯＰの結合も評価され（図１１）、ｓｓＤＮＡに類似した結果が得られた。すべての場合において、０．５当量のＯＰを添加すると、オリゴヌクレオチドのほぼ完全な結合が観察され、ケージあたり２個のゲストが示唆された。この化学量論は、ＯＰとｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはｄｓＲＮＡとのＳＥＣ精製複合体のＡ２６０／Ａ２８０比から確認された（図２ｂおよび１２、表３）。
空のタンパク質ケージの構造的一体性が確立されたので、核酸カーゴの搭載をインビトロで調査した。直径２ｎｍのＤＮＡおよびＲＮＡ二重鎖は、直径約３．５ｎｍの細孔を通過できるため、カプセル化が可能である。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により、親Ｏ３－３３ケージが２１ｎｔのＡｔｔｏ４８８標識一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡであるＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡの電気泳動移動度に影響を及ぼさないことが明らかになった（図１０）。対照的に、ＯＰではタンパク質およびＤＮＡバンドの共局在が観察された（図２ａ）。二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡおよびｄｓＲＮＡとＯＰの結合も評価され（図１１）、ｓｓＤＮＡに類似した結果が得られた。すべての場合において、０．５当量のＯＰを添加すると、オリゴヌクレオチドのほぼ完全な結合が観察され、ケージあたり２個のゲストが示唆された。この化学量論は、ＯＰとｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはｄｓＲＮＡとのＳＥＣ精製複合体のＡ２６０／Ａ２８０比から確認された（図２ｂおよび１２、表３）。
【表4】
【0241】
実施例５－結合動態
ＤＮＡ結合フルオロフォアＡｔｔｏ４８８のカプセル化による蛍光消光を使用して、蛍光測定により結合動態を決定した（図１３）。結合速度定数ｋｏｎ＝（６．６±０．６）ｘ１０５Ｍ－１ｓ－１（図２ｃ）および解離速度定数ｋｏｆｆ＝（１．６±０．１）ｘ１０－４ｓ－１（図２ｄ）は、このタンパク質－ＤＮＡ複合体の解離定数Ｋｄ＝（２．４±０．３）ｘ１０－１０Ｍを計算するために使用された。このＫｄ値は、ウイルスにおけるＲＮＡ－タンパク質相互作用について報告されている値（１０－８－１０－７Ｍ）よりも２桁低く、最も緊密な結合転写因子の範囲（１０－１５－１０－１０ Ｍ）にある。この人工システムの決定的な違いは、配列特異性の欠如であり、これは、任意の所望のヌクレオチド配列のパッケージング、および負の電荷を保持するオリゴヌクレオチド化学修飾を可能にするため、送達デバイスにとって有利であることに留意しなければならない。
ＤＮＡ結合フルオロフォアＡｔｔｏ４８８のカプセル化による蛍光消光を使用して、蛍光測定により結合動態を決定した（図１３）。結合速度定数ｋｏｎ＝（６．６±０．６）ｘ１０５Ｍ－１ｓ－１（図２ｃ）および解離速度定数ｋｏｆｆ＝（１．６±０．１）ｘ１０－４ｓ－１（図２ｄ）は、このタンパク質－ＤＮＡ複合体の解離定数Ｋｄ＝（２．４±０．３）ｘ１０－１０Ｍを計算するために使用された。このＫｄ値は、ウイルスにおけるＲＮＡ－タンパク質相互作用について報告されている値（１０－８－１０－７Ｍ）よりも２桁低く、最も緊密な結合転写因子の範囲（１０－１５－１０－１０ Ｍ）にある。この人工システムの決定的な違いは、配列特異性の欠如であり、これは、任意の所望のヌクレオチド配列のパッケージング、および負の電荷を保持するオリゴヌクレオチド化学修飾を可能にするため、送達デバイスにとって有利であることに留意しなければならない。
【0242】
核酸送達システムの重要な役割は、そのカーゴをヌクレアーゼ分解から保護することである。そのため、ＤＮａｓｅＩ（３０ ｋＤａ）、ＲＮａｓｅ Ａ（１４ ｋＤａ）、およびｂｅｎｚｏｎａｓｅ５０（６０ ｋＤａ）の３つのヌクレアーゼを使用した消化アッセイを実施した。ＡＧＥ（図１４）は、より大きな酵素からの保護を示した。ＲＮａｓｅ Ａのみがケージに入り、カーゴを消化することができた。これらのヌクレアーゼアッセイデータは、ゲストがごくわずかな解離速度で内部空洞に緊密に結合することを示唆する動態研究を裏付けている。
【0243】
カチオン性脂質およびポリマーなどの多くの核酸送達ベクターでは、トランスフェクション効率と細胞毒性の間で妥協が必要である。デヒドロゲナーゼ活性を定量化するためにＷＳＴ－８を使用して、ＨｅＬａ細胞で２４時間にわたってインビトロ細胞毒性を測定した（図１５、表６）。ＯＰは、４００ｎＭケージ（１９３μｇ／ｍＬタンパク質）まで無視できる毒性を示した。これらの結果は、一般的に使用されているトランスフェクション試薬であるカチオン性脂質のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と比較して遜色がなく、上記のアッセイ条件下で１９倍低い質量濃度（１０μｇ／ｍＬ）で細胞生存率を３５％～４５％低下させた。
【表5】
【0244】
実施例６－細胞取り込みおよびカーゴ放出
さらに、本発明のナノ粒子が細胞に進入し、その核酸カーゴを送達する能力を、プローブとしてＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡカーゴを用いて、フローサイトメトリーおよび共焦点蛍光顕微鏡法（ＣＦＭ）を使用して調査した。ＨｅＬａ細胞を含む７つの異なる細胞株を、ＯＰケージ内にパッケージングされた２００ｎＭの遊離Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡまたはＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡのいずれかで処理し、細胞の蛍光をフローサイトメトリーにより測定した。蛍光強度の中央値のプロットは、試験した７つの細胞株のうち６つでＯＰケージの効率的な細胞取り込みを示している（図３ａ－ｃ）。ＨｅＬａ細胞では、バックグラウンドに比べてこれらの細胞のｓｓＤＮＡの細胞取り込みがほぼ３０倍に増加し、ＨｅＬａ細胞の９０％超への送達が示された。ＶｅｒｏおよびＨｅｐＧ２細胞ではさらに大きな効果が見られた。この発見を確認するために、遊離Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡまたはＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡを搭載したＯＰケージのいずれかで処理された細胞で、ＣＦＭを実行した（図１６）。遊離Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡで処理された細胞は、感知できるほどの蛍光を示さなかったが、ＯＰ：Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡで処理された細胞では、細胞内蛍光が多くの強い病巣に局在しており、高い取り込み効率を裏付けている（図３ｂ）。これらの点状構造は、エンドサイトーシスを示唆しており、このサイズ領域のナノ粒子でよく観察される。
さらに、本発明のナノ粒子が細胞に進入し、その核酸カーゴを送達する能力を、プローブとしてＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡカーゴを用いて、フローサイトメトリーおよび共焦点蛍光顕微鏡法（ＣＦＭ）を使用して調査した。ＨｅＬａ細胞を含む７つの異なる細胞株を、ＯＰケージ内にパッケージングされた２００ｎＭの遊離Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡまたはＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡのいずれかで処理し、細胞の蛍光をフローサイトメトリーにより測定した。蛍光強度の中央値のプロットは、試験した７つの細胞株のうち６つでＯＰケージの効率的な細胞取り込みを示している（図３ａ－ｃ）。ＨｅＬａ細胞では、バックグラウンドに比べてこれらの細胞のｓｓＤＮＡの細胞取り込みがほぼ３０倍に増加し、ＨｅＬａ細胞の９０％超への送達が示された。ＶｅｒｏおよびＨｅｐＧ２細胞ではさらに大きな効果が見られた。この発見を確認するために、遊離Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡまたはＡｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡを搭載したＯＰケージのいずれかで処理された細胞で、ＣＦＭを実行した（図１６）。遊離Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡで処理された細胞は、感知できるほどの蛍光を示さなかったが、ＯＰ：Ａｔｔｏ４８８－ＤＮＡで処理された細胞では、細胞内蛍光が多くの強い病巣に局在しており、高い取り込み効率を裏付けている（図３ｂ）。これらの点状構造は、エンドサイトーシスを示唆しており、このサイズ領域のナノ粒子でよく観察される。
【0245】
実施例７－遺伝子発現の調節
追加のトランスフェクション剤を必要とせずに機能的な核酸カーゴを送達できる非ウイルス送達システムの報告は、まれである。ＯＰケージの高い細胞取り込みが確認されたため、タンパク質発現を測定するモデルとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定して発現するＨｅＬａ細胞を使用して、ｓｉＲＮＡを送達し、遺伝子発現を調節するケージの能力を試験した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を陽性対照として使用して、ＧＦＰ発現ＨｅＬａ細胞を、裸ｓｉＲＮＡ、ＯＰカプセル化ｓｉＲＮＡ、空のＯＰケージ、およびスクランブル配列ｓｉＲＮＡを搭載したＯＰケージで処理した。遺伝子ノックダウン効率を決定するために、ＧＦＰ蛍光を蛍光顕微鏡（図１６）によって定性測定し、フローサイトメトリー（図４ａ）によって定量測定した。２０ｐｍｏｌのＯＰパッケージｓｉＲＮＡで処理し、４８時間インキュベーションした後、ＧＦＰ蛍光の約７０％の減少が観察され、これは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の範囲内の有効性である。さらに、ＯＰの毒性が有意に低いため、市販の試薬（図１６）に関しては、細胞の生存率が向上し、該試薬はこれらのアッセイで２．５μｇ／ｍＬの濃度であった。スクランブル配列ｓｉＲＮＡを搭載したＯＰケージの効果の欠如は、発現レベルが抗ウイルスインターフェロン経路機構の誘導によるものではなく、標的ｍＲＮＡ特異的であることを確認した。
追加のトランスフェクション剤を必要とせずに機能的な核酸カーゴを送達できる非ウイルス送達システムの報告は、まれである。ＯＰケージの高い細胞取り込みが確認されたため、タンパク質発現を測定するモデルとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定して発現するＨｅＬａ細胞を使用して、ｓｉＲＮＡを送達し、遺伝子発現を調節するケージの能力を試験した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を陽性対照として使用して、ＧＦＰ発現ＨｅＬａ細胞を、裸ｓｉＲＮＡ、ＯＰカプセル化ｓｉＲＮＡ、空のＯＰケージ、およびスクランブル配列ｓｉＲＮＡを搭載したＯＰケージで処理した。遺伝子ノックダウン効率を決定するために、ＧＦＰ蛍光を蛍光顕微鏡（図１６）によって定性測定し、フローサイトメトリー（図４ａ）によって定量測定した。２０ｐｍｏｌのＯＰパッケージｓｉＲＮＡで処理し、４８時間インキュベーションした後、ＧＦＰ蛍光の約７０％の減少が観察され、これは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の範囲内の有効性である。さらに、ＯＰの毒性が有意に低いため、市販の試薬（図１６）に関しては、細胞の生存率が向上し、該試薬はこれらのアッセイで２．５μｇ／ｍＬの濃度であった。スクランブル配列ｓｉＲＮＡを搭載したＯＰケージの効果の欠如は、発現レベルが抗ウイルスインターフェロン経路機構の誘導によるものではなく、標的ｍＲＮＡ特異的であることを確認した。
【0246】
実施例８－Ｈｉｓ６タグおよび高細胞質濃度のＲＮＡがＯＮ送達効率に寄与する
ＲＮＡｉの誘導を成功させるには、細胞質へのｓｉＲＮＡの送達が必要である。したがって、上記のデータは、ＯＰケージがエンドソーム脱出を達成し、それらのカーゴを放出できることを示唆している。いかなる理論にも拘束されることなく、本発明者らは２つの説明を提唱する。
第一に、エンドソーム脱出を促進するヒスチジンに富むペプチドの能力は、プロトンスポンジ効果およびエンドソーム膜を透過性にするプロトン化ヒスチジンの能力の両方により、十分に立証されている。各ＯＰモノマーはＨｉｓ６タグを有するため、完全な２４量体ケージは、その外部に合計１４４個のヒスチジル残基を示す。これがｓｉＲＮＡ送達に影響を及ぼすか否かを試験するために、本発明者らは、Ｈｉｓ６タグを有さないＯＰの変異型を作成し、ＲＮＡｉ活性について検定した（材料および方法、Ｈｉｓ６タグなしのＯＰの精製）。同じ実験条件下で、ＧＦＰ蛍光の約４０％の減少のみが観察され（図４ａ）、Ｈｉｓ６タグが実際に送達効率に寄与することを示している。
ＲＮＡｉの誘導を成功させるには、細胞質へのｓｉＲＮＡの送達が必要である。したがって、上記のデータは、ＯＰケージがエンドソーム脱出を達成し、それらのカーゴを放出できることを示唆している。いかなる理論にも拘束されることなく、本発明者らは２つの説明を提唱する。
第一に、エンドソーム脱出を促進するヒスチジンに富むペプチドの能力は、プロトンスポンジ効果およびエンドソーム膜を透過性にするプロトン化ヒスチジンの能力の両方により、十分に立証されている。各ＯＰモノマーはＨｉｓ６タグを有するため、完全な２４量体ケージは、その外部に合計１４４個のヒスチジル残基を示す。これがｓｉＲＮＡ送達に影響を及ぼすか否かを試験するために、本発明者らは、Ｈｉｓ６タグを有さないＯＰの変異型を作成し、ＲＮＡｉ活性について検定した（材料および方法、Ｈｉｓ６タグなしのＯＰの精製）。同じ実験条件下で、ＧＦＰ蛍光の約４０％の減少のみが観察され（図４ａ）、Ｈｉｓ６タグが実際に送達効率に寄与することを示している。
【0247】
第２に、細胞質内のカーゴ分子の放出は、図２ｄに示す動態パラメーターの観点から説明できる。ＯＰ－核酸複合体は安定しているが、カプセル化は、高濃度の競合ゲスト分子の存在下で可逆的である。したがって、本発明者らは、高細胞質濃度のｔＲＮＡがｓｉＲＮＡカーゴに位置特異的放出メカニズムを提供し、ＲＮＡｉ誘導性遺伝子ノックダウン用にそれを遊離させると予想した。この仮説はインビトロで検証され、Ａ４８８－ｄｓＤＮＡを含むＯＰケージを細胞内濃度のｔＲＮＡ（２６μＭ）を含むＰＢＳで３７℃で処理し、６時間にわたってカーゴの時間依存性放出を観察した（図４ｂおよび１９）。細胞質内のｍＲＮＡに作用するオリゴヌクレオチドの場合、細胞質の物理化学的特性を利用することで、カーゴ放出の単純解が提供される。
【0248】
逆に、１０％ウシ胎児血清を使用して実施した同じ実験では、カーゴの放出または分解は見られなかった（図２２）。
【0249】
実施例９－ナノ粒子のタンパク質結晶学
【表6】
【0250】
実施例１０－ＯＰおよびその変異型ＯＴＲ１０１～ＯＴＲ５０３
一本鎖ＤＮＡ搭載のインビトロ研究
ＯＰの各種変異型であるＯＴＲ１０１～ＯＴＲ５０３がｓｓＤＮＡを搭載できるか否かを試験するために、電気泳動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）でｓｓＤＮＡとの相互作用を調べた。これにより、ＤＮＡとタンパク質バンドの共局在が結合変異型で観察される一方で、ｓｓＤＮＡバンドの移動度は非結合変異型の影響を受けないと予想される。図２６に示すように、この共局在は、モノマーあたり最低３つのアルギニン変異を含むすべての調査済み変異型で観察されるが、モノマーあたり１つまたは２つのアルギニンを含むすべての調査済み変異型、およびＯ３－３３では、Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡバンドの移動はなかった。
一本鎖ＤＮＡ搭載のインビトロ研究
ＯＰの各種変異型であるＯＴＲ１０１～ＯＴＲ５０３がｓｓＤＮＡを搭載できるか否かを試験するために、電気泳動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）でｓｓＤＮＡとの相互作用を調べた。これにより、ＤＮＡとタンパク質バンドの共局在が結合変異型で観察される一方で、ｓｓＤＮＡバンドの移動度は非結合変異型の影響を受けないと予想される。図２６に示すように、この共局在は、モノマーあたり最低３つのアルギニン変異を含むすべての調査済み変異型で観察されるが、モノマーあたり１つまたは２つのアルギニンを含むすべての調査済み変異型、およびＯ３－３３では、Ａｔｔｏ４８８－ｓｓＤＮＡバンドの移動はなかった。
【0251】
ＯＰと比較した変異型の結合動態
ＥＭＳＡから得られた結果が蛍光アッセイの枠組みで検証できるか否かを調査した。図２７に示すように、アルギニンが２つ以下の変異型はｓｓＤＮＡに結合しないと実際に結論付けることができる。さらに、キャプシドの消光効果に対応する蛍光の相対的低下は、静電的寄与の増大とともに増加することが分かる。
ＥＭＳＡから得られた結果が蛍光アッセイの枠組みで検証できるか否かを調査した。図２７に示すように、アルギニンが２つ以下の変異型はｓｓＤＮＡに結合しないと実際に結論付けることができる。さらに、キャプシドの消光効果に対応する蛍光の相対的低下は、静電的寄与の増大とともに増加することが分かる。
【0252】
モノマーあたり３つ以上のアルギニン変異を持つすべての変異型によるｓｓＤＮＡの結合についての動態パラメーターを以下の表７に示す。
【表7】
【0253】
二本鎖ＤＮＡ搭載のインビトロ研究
３、４、または５つのアルギニンをもつＯＰタンパク質変異型がｓｓＤＮＡを搭載できることを示し、特に二本鎖ｓｉＲＮＡが生物医学用途により関連しているため、ｄｓＤＮＡについての搭載能力は興味深いであろう。すべてのｄｓＤＮＡ測定には、ヘアピンＤＮＡ（ｈｐＤＮＡ）を使用し、これには、２つの相補鎖の間に４つの核酸塩基のループ領域が含まれている。ｈｐＤＮＡは、ｄｓＤＮＡの２つの相補鎖の解離を回避するために選択された。
３、４、または５つのアルギニンをもつＯＰタンパク質変異型がｓｓＤＮＡを搭載できることを示し、特に二本鎖ｓｉＲＮＡが生物医学用途により関連しているため、ｄｓＤＮＡについての搭載能力は興味深いであろう。すべてのｄｓＤＮＡ測定には、ヘアピンＤＮＡ（ｈｐＤＮＡ）を使用し、これには、２つの相補鎖の間に４つの核酸塩基のループ領域が含まれている。ｈｐＤＮＡは、ｄｓＤＮＡの２つの相補鎖の解離を回避するために選択された。
【0254】
蛍光測定ベースのアッセイを開発する前に、ｓｓＤＮＡに結合するすべての変異型について、カーゴの搭載をＥＭＳＡによって調査した（図２８）。変異型ＯＴＲ４０２、ＯＴＲ５０１、ＯＴＲ５０２、ＯＴＲ５０３、およびＯＰがｈｐＤＮＡに結合することが分かったが、これはＯＴＲ３０１、ＯＴＲ３０２、およびＯＴＲ４０１には該当しない。したがって、ｓｓＤＮＡに対して１０－１０Ｍ－１の最大結合親和性を持つキャプシド変異型のみがｄｓＤＮＡ／ｈｐＤＮＡにも結合できる。
【0255】
モノマーあたり５つ以上のアルギニン変異を持つすべての変異型によるｈｐＤＮＡの結合についての動態パラメーターは、以下の表８に示す。
【表8】
【0256】
実施例１１－外部に示されたヒスチジンに富むペプチドの変異
Ｃ末端にモノマータンパク質あたり１つのヘキサ－ヒスチジンタグを付けたＯＰケージは、効率的にエンドソームトラップを脱出し、それによって遺伝子ノックダウン用にそのｓｉＲＮＡカーゴを細胞の細胞質に正常に放出することが示されている。Ｃ末端に融合した３、６、または９個のヒスチジンを含むヒスチジンタグを付けたＯＰケージの変異型を作成し、６個のヒスチジンタグを含むＯＰケージを参照して遺伝子ノックダウン活性を検定した。図２９に示すように、３つの変異型はすべて、ｓｉＲＮＡを哺乳動物細胞に送達し、標的タンパク質、この場合はＧＦＰ、の発現レベルを低下させる同じ能力を示す。加えて、ヘキサヒスチジンタグの位置の重要性は、遺伝子サイレンシング活性について変異型ＯＰ－ｃＯＤＣを試験することによって調査された。ＯＰ－ｃＯＤＣには、ヘキサヒスチジンタグの後に３８アミノ酸のＣ末端付属物が含まれている。図２９に示すように、これにより、ＯＰケージを含むｓｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン能が無効になり、ヘキサヒスチジンタグのエンドソーム脱出メカニズムに干渉するためと考えられる。
Ｃ末端にモノマータンパク質あたり１つのヘキサ－ヒスチジンタグを付けたＯＰケージは、効率的にエンドソームトラップを脱出し、それによって遺伝子ノックダウン用にそのｓｉＲＮＡカーゴを細胞の細胞質に正常に放出することが示されている。Ｃ末端に融合した３、６、または９個のヒスチジンを含むヒスチジンタグを付けたＯＰケージの変異型を作成し、６個のヒスチジンタグを含むＯＰケージを参照して遺伝子ノックダウン活性を検定した。図２９に示すように、３つの変異型はすべて、ｓｉＲＮＡを哺乳動物細胞に送達し、標的タンパク質、この場合はＧＦＰ、の発現レベルを低下させる同じ能力を示す。加えて、ヘキサヒスチジンタグの位置の重要性は、遺伝子サイレンシング活性について変異型ＯＰ－ｃＯＤＣを試験することによって調査された。ＯＰ－ｃＯＤＣには、ヘキサヒスチジンタグの後に３８アミノ酸のＣ末端付属物が含まれている。図２９に示すように、これにより、ＯＰケージを含むｓｉＲＮＡの遺伝子ノックダウン能が無効になり、ヘキサヒスチジンタグのエンドソーム脱出メカニズムに干渉するためと考えられる。
【0257】
実施例１２－マウスにおけるＯＰケージの免疫原性
４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの２つのグループは、０、１６、および３８日目に尾静脈注射によって１または１０μｇのＯＰ粒子を含むＰＢＳを投与され、０、１４、２９、５２、および７３日目に採血した。血清中のＯＰ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂの評価は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって実施された。簡単に説明すると、２倍希釈系列のマウス血清サンプルをＯＰコーティングされたマルチウェル免疫プレート（Ｓｉｇｍａ Ｍ９４１０）にアプライした後、各種ＩｇＧアイソタイプ（Ａｂｃａｍ ａｂ９７２３８／ａｂ９７２４３／ａｂ９７２４８）に対するビオチン化抗マウス抗体で検出した。ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４０５２１０）、および発色基質として３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ７７２４７／７７２４８）を使用して、比色分析で開発を行った。発色基質の光学密度は４５０ｎｍで測定され、血清サンプル希釈に対してプロットされる（図３０）。各時点での免疫応答を比較するために、１／２０００希釈を選択した（図３１）。すべての注射後、抗ＯＰＩｇＧ力価の上昇が、用量依存的な反応とともに測定された（図３１）。２回目の追加免疫の１か月後の７２日目までに、ＩｇＧ力価はわずかな低下を示した。この調査は、ＯＰ粒子が特定の免疫反応を誘発することを示している。
４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの２つのグループは、０、１６、および３８日目に尾静脈注射によって１または１０μｇのＯＰ粒子を含むＰＢＳを投与され、０、１４、２９、５２、および７３日目に採血した。血清中のＯＰ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂの評価は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって実施された。簡単に説明すると、２倍希釈系列のマウス血清サンプルをＯＰコーティングされたマルチウェル免疫プレート（Ｓｉｇｍａ Ｍ９４１０）にアプライした後、各種ＩｇＧアイソタイプ（Ａｂｃａｍ ａｂ９７２３８／ａｂ９７２４３／ａｂ９７２４８）に対するビオチン化抗マウス抗体で検出した。ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４０５２１０）、および発色基質として３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ７７２４７／７７２４８）を使用して、比色分析で開発を行った。発色基質の光学密度は４５０ｎｍで測定され、血清サンプル希釈に対してプロットされる（図３０）。各時点での免疫応答を比較するために、１／２０００希釈を選択した（図３１）。すべての注射後、抗ＯＰＩｇＧ力価の上昇が、用量依存的な反応とともに測定された（図３１）。２回目の追加免疫の１か月後の７２日目までに、ＩｇＧ力価はわずかな低下を示した。この調査は、ＯＰ粒子が特定の免疫反応を誘発することを示している。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18】
【図18f】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27a】
【図27b】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】