特許 7593592 血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-25

(45)【発行日】2024-12-03

(54)【発明の名称】血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/42 20060101AFI20241126BHJP

   A61K 41/00 20200101ALI20241126BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20241126BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20241126BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241126BHJP

【ＦＩ】

A61K38/42

A61K41/00

A61K47/22

A61K47/28

A61K9/127

A61K47/24

A61P17/00

A61P17/02

A61P9/00

A61P35/00

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2020206156

(22)【出願日】2020-12-11

(65)【公開番号】P2022093069

(43)【公開日】2022-06-23

【審査請求日】2023-12-05

(73)【特許権者】

【識別番号】507126487

【氏名又は名称】公立大学法人奈良県立医科大学

(73)【特許権者】

【識別番号】304021831

【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学

(73)【特許権者】

【識別番号】500481031

【氏名又は名称】一般財団法人食品薬品安全センター

(73)【特許権者】

【識別番号】520490864

【氏名又は名称】医療法人社団淳英会

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(74)【代理人】

【識別番号】100125081

【弁理士】

【氏名又は名称】小合 宗一

(72)【発明者】

【氏名】酒井 宏水

(72)【発明者】

【氏名】力久 直昭

(72)【発明者】

【氏名】斉藤 義明

【審査官】星 浩臣

(56)【参考文献】

【文献】特開２００７－２６９６６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／１３７８３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Journal of Functional Biomaterials，2017年，8(2), 14, doi: 10.3390/jfb8020014，pp.1-10

【文献】Transplantation，2015年，99(4)，pp.687-692

【文献】Bioconjugate Chemistry，2009年，20(8)，pp.1419-1440

【文献】Optics and Spectroscopy，2010年，109(2)，pp.237-242

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

一酸化炭素（ＣＯ）を結合したヘモグロビン（以下、「ＣＯＨｂ」という。）を含む、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤。

【請求項2】

ＣＯＨｂ水溶液をカプセルに内包したカプセル化ヘモグロビンとして前記ＣＯＨｂを含む、請求項１に記載の光増感剤。

【請求項3】

前記水溶液は、ピリドキサル５’－リン酸を含む、請求項２に記載の光増感剤。

【請求項4】

メトヘモグロビンを還元する酵素活性が実質的にない、請求項２又は３に記載の光増感剤。

【請求項5】

前記水溶液は、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを含む、請求項４に記載の光増感剤。

【請求項6】

前記水溶液は生分解性蛍光色素を含む、請求項２ないし５のいずれか１項に記載の光増感剤。

【請求項7】

前記水溶液中のヘモグロビンの濃度は1．６ｍＭ～７．０ｍＭである、請求項２ないし６のいずれか１項に記載の光増感剤。

【請求項8】

前記カプセルは、リポソーム、ポリマーソーム又は高分子薄膜である、請求項２ないし７のいずれか１項に記載の光増感剤。

【請求項9】

前記リポソームは、ホスファチジルコリン型リン脂質である１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、コレステロール、負電荷脂質である１，５－Ｏ－ｄｉｈｅｘａｄｅｃｙｌ－Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ、及び、ポリエチレングリコールを結合した脂質である１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－ｐｏｌｙ（ｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）_５０００（ポリエチレングリコール鎖の分子量５０００）を含む、請求項８に記載の光増感剤。

【請求項10】

重合型修飾ヘモグロビン、水溶性高分子結合型修飾ヘモグロビン及び分子内架橋ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１つの非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体にＣＯが結合した、ＣＯを結合した非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体の水溶液として前記ＣＯＨｂを含む、請求項１に記載の光増感剤。

【請求項11】

前記非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体は、重合型修飾ヘモグロビン及び／又は水溶性高分子結合型修飾ヘモグロビンである、請求項１０に記載の光増感剤。

【請求項12】

０．４６ｍＭ～３．６ｍＭのヘモグロビン濃度で投与される、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の光増感剤。

【請求項13】

体重１ｋｇ当たり０．００４ｍｍｏｌ（ミリモル）～０．３６ｍｍｏｌ（ミリモル）の一酸化炭素を投与する、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の光増感剤。

【請求項14】

単純性血管腫、毛細血管奇形、サーモンパッチ、ウンナ母斑、血管腫、ｐｏｒｔ ｗｉｎｅ ｓｔａｉｎ、スタージーウエバー症候群、クリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群その他の毛細血管の過形成による皮膚病変と、酒さ及び毛細血管拡張症と、肥厚性瘢痕、外傷性瘢痕及び植皮後瘢痕に伴う病的な血管拡張と、いちご状血管腫及び皮膚の乳児血管腫と、房状血管腫、血管拡張性肉芽腫その他の皮膚の血管性腫瘍性病変とからなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療のための請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の光増感剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、レーザー照射療法用光増感剤に関し、具体的には、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤に関する。

【背景技術】

【0002】

毛細血管を治療標的とするレーザー照射療法は１９８３年に提唱された（非特許文献１）。前記療法の原理は以下のとおりである。オキシヘモグロビンの吸収波長の光を短時間照射できるレーザー照射装置を用意する。レーザー光源から照射された光子は毛細血管内の赤血球オキシヘモグロビンに吸収され、熱エネルギーに変換される。該熱エネルギーが血管壁の内皮細胞を破壊するため、最終的に毛細血管は壊死吸収されて消滅する。前記熱エネルギーは血管内に止まるので、毛細血管周囲の組織には熱影響の障害を及ぼすことは少ない。ヘモグロビンへの光の吸収率と皮膚内のその他の治療標的となりうる水分・コラーゲン・メラニンへの吸収率の関係、また光線の皮膚への深達度といった条件から５７７ｎｍ、５８５ｎｍ又は５９５ｎｍの波長をもつパルス色素レーザー（ｐｕｌｓｅｄ ｄｙｅ ｌａｓｅｒ。以下、「ＰＤＬ」という。）が単純性血管腫の治療に用いられてきた。光学技術の進歩に伴って、レーザー照射のパルス幅を広げたり、サブパルスの頻度を高める、照射ハンドピースの大口径化、レーザー装置のハイパワー化等レーザー照射装置の改良も進んだ。皮膚深部に存在する血管病変にたいしては波長が長い１０６４ｎｍの光を治療に用いるなど罹患した皮膚の状態に合わせて波長を変えてレーザーを照射している施設もある。６３０ｎｍ又は６６４ｎｍの波長の光に反応して組織を障害する活性酸素を産生する色素化合物と、前記波長の光レーザー光照射装置とを組み合わせた光線力学療法（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ）を単純性血管腫の治療に用いる試みもある。このように毛細血管のＰＤＬを含むレーザー照射療法について様々な改良が施されてきたが、過去３０年余の間、クリアランス（傷跡なく患部を健常な皮膚に近づけること）の成績に大きな進歩がみられていない（非特許文献２）。

【0003】

単純性血管腫又は毛細血管奇形は皮膚毛細血管の拡張による平坦な赤色斑である。新生児の０．３％にみられ、新生児の色素性皮膚病変として頻度が高い。単純計算では年間３０万人もの患者が国内で発症する。傷跡なく患部を健常な皮膚に近づけること（クリアランス）を目標にレーザー照射療法が行われているが、一定の効果を得るためには複数回治療を行うことが必要である。本発明の発明者の自験例７０８症例の治療成績をまとめたところ、治療回数が２回以下の症例は６９％、３～５回は２０％、６回以上治療を行った治療抵抗性の症例は１１％だった。これは、治療抵抗性の病変が５～２０％ほど存在するとする非特許文献３の記載と矛盾しない。具体的に５９０ｎｍの波長の光を皮膚に照射した場合を想定し、１００万個の光子を皮膚モデルに照射するシュミレーションを行うと、約５６％が生体に吸収され、約４７％がメラニンや真皮に吸収され、約９％が血管に吸収される。患部に照射されたレーザー光エネルギーのうち生体に吸収されるエネルギーは約５６％だが、大半は血管周辺組織に吸収され、血管に吸収されるレーザー光エネルギーは患部に照射されたレーザー光エネルギーのうち約９％にすぎない。血管周囲組織に熱傷の後遺症を残さないで単純性血管腫を完全に除去するためには、血管に吸収されるレーザー光エネルギーの割合を高め、かつ、血管周囲組織の熱傷を軽減できる光増感剤を開発する必要がある。

【0004】

カプセル化ヘモグロビンは、１０～５０ｇ／ｄＬ（１．６ｍＬ～７．６ｍＭ）の高濃度精製ヘモグロビン水溶液を内包した粒子径数百ｎｍの粒子である。カプセル化ヘモグロビンのうちヘモグロビンがリポソームに内包された粒子をヘモグロビンベシクルという。ヘモグロビン水溶液のリポソームへの内包、内包されなかったヘモグロビンの除去、光反応によるＣＯ除去、脱酸素化などの工程を経て長期保存可能なヘモグロビンベシクルが製造される。ヘモグロビンベシクルは、ヘモグロビンを精製する工程で血液型物質や感染源を完全に排除してあり、また、長期間備蓄が可能なので、緊急時に直ちに使用できる利点を有する。またＣＯ（一酸化炭素）をヘモグロビンに結合させたカルボキシヘモグロビン（以下、「ＣＯＨｂ」という。）がリポソームに内包された粒子（以下、「ＣＯＨｂ－Ｖ」という。）は、循環血中に投与後数時間ＣＯを徐々に放出して血管拡張作用や抗炎症作用をもたらすとともに、ＣＯ放出後は酸素運搬体として機能する（非特許文献４）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｒ．Ｒ．及びＰａｒｒｉｓｈ Ｊ．Ａ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２０：５２４－５２７（１９８３）

【文献】ｖａｎ Ｒａａｔｈ Ｍ．Ｉ．ら、Ｊ． Ｅｕｒ． Ａｃａｄ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．、３３：１３６９－７７（２０１９）

【文献】Ｔｉｎｇ， Ｐ． Ｔ．及びＲａｏ， Ｊ．， Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｌｅｓｉｏｎｓ， ｉｎ Ｂａｓｉｃｓ ｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉ． Ｂｏｇｄａｎ Ａｌｌｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４２ （２０１１））

【文献】Ｓａｋａｉ Ｈ．、Ｊ． Ｆｕｎｃｔ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ．、８：１０（２０１７）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の課題は、血管を治療標的とするレーザー照射療法の治療効果を増強するための新規の光増感剤を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、ＣＯＨｂを含む、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤を提供する。

【0008】

本発明の光増感剤は、ＣＯＨｂ水溶液をカプセルに内包したカプセル化ヘモグロビン（以下、「ＣＯＨｂ－Ｃ」という。）として前記ＣＯＨｂを含むことができる。

【0009】

本発明の光増感剤において、前記水溶液は、ピリドキサル５’－リン酸（以下、「ＰＬＰ」という。）を含むことができる。

【0010】

本発明の光増感剤は、メトヘモグロビンを還元する酵素活性が実質的にないことがある。

【0011】

本発明の光増感剤において、前記水溶液は、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを含むことができる。

【0012】

本発明の光増感剤において、前記水溶液は生分解性蛍光色素を含むことができる。

【0013】

本発明の光増感剤において、前記水溶液中のヘモグロビン濃度は１．６ｍＭ～７．０ｍＭ（１０ｇ／ｄＬ～４５ｇ／ｄＬ）とすることができる。

【0014】

本発明の光増感剤において、前記カプセルは、リポソーム、ポリマーソーム又は高分子薄膜とすることができる。

【0015】

本発明の光増感剤において、前記リポソームは、ホスファチジルコリン型リン脂質である１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、コレステロール、負電荷脂質である１，５－Ｏ－ｄｉｈｅｘａｄｅｃｙｌ－Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｙｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ、及び、ポリエチレングリコールを結合した脂質である１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－ｐｏｌｙ（ｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）_５０００（ポリエチレングリコール鎖の分子量５０００）を含むことができる。

【0016】

本発明の光増感剤は、ＣＯを結合した非細胞性（ａｃｅｌｌｕｌａｒ）ヘモグロビン由来酸素運搬体（Ｈｂ ｂａｓｅｄ Ｏ_２ ｃａｒｒｉｅｒ）の水溶液として前記ＣＯＨｂを含むことができる。前記非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体は、重合型修飾ヘモグロビン、水溶性高分子結合型修飾ヘモグロビン及び分子内架橋ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１つとすることができる。

【0017】

本発明の光増感剤において、前記非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体は、重合型修飾ヘモグロビン及び／又は水溶性高分子結合型修飾ヘモグロビンとすることができる。

【0018】

本発明の光増感剤は、０．４６ｍＭ～３．６ｍＭ（３ｇ／ｄＬ～２３ｇ／ｄＬ）のヘモグロビン濃度で投与することができる。

【0019】

本発明の光増感剤は、体重１ｋｇ当たり０．００４ｍｍｏｌ（ミリモル）～０．３６ｍｍｏｌ（ミリモル）の一酸化炭素を投与することができる。

【0020】

本発明の光増感剤は、単純性血管腫、毛細血管奇形、サーモンパッチ、ウンナ母斑、血管腫、ｐｏｒｔ ｗｉｎｅ ｓｔａｉｎ、スタージーウエバー症候群、クリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群その他の毛細血管の過形成による皮膚病変と、酒さ及び毛細血管拡張症と、肥厚性瘢痕、外傷性瘢痕及び植皮後瘢痕に伴う病的な血管拡張と、いちご状血管腫及び皮膚の乳児血管腫と、房状血管腫、血管拡張性肉芽腫その他の皮膚の血管性腫瘍性病変とからなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療のために使用されることがある。

【0021】

本発明は、本発明の光増感剤を投与した後にレーザー照射を行う工程を含む、血管を治療標的とするレーザー照射療法を提供する。

【0022】

本発明のレーザー照射療法は、単純性血管腫、毛細血管奇形、サーモンパッチ、ウンナ母斑、血管腫、ｐｏｒｔ ｗｉｎｅ ｓｔａｉｎ、スタージーウエバー症候群、クリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群その他の毛細血管の過形成による皮膚病変と、酒さ及び毛細血管拡張症と、肥厚性瘢痕、外傷性瘢痕及び植皮後瘢痕に伴う病的な血管拡張と、いちご状血管腫及び皮膚の乳児血管腫と、房状血管腫、血管拡張性肉芽腫その他の皮膚の血管性腫瘍性病変とからなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療に使用されることがある。

【0023】

本発明は、ＣＯＨｂの血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤の製造のための使用を提供する。

【0024】

本発明の血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤の製造のための使用において、前記ＣＯＨｂを、ＣＯＨｂ－Ｃとすることができる。あるいは、本発明の血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤の製造のための使用において、重合型修飾ヘモグロビン、水溶性高分子結合型修飾ヘモグロビン及び分子内架橋ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１つの非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体にＣＯが結合した、ＣＯを結合した非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体の水溶液として前記ＣＯＨｂを前記光増感剤に含むことができる。

【0025】

本発明の血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤の製造のための使用は、単純性血管腫、毛細血管奇形、サーモンパッチ、ウンナ母斑、血管腫、ｐｏｒｔ ｗｉｎｅ ｓｔａｉｎ、スタージーウエバー症候群、クリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群その他の毛細血管の過形成による皮膚病変と、酒さ及び毛細血管拡張症と、肥厚性瘢痕、外傷性瘢痕及び植皮後瘢痕に伴う病的な血管拡張と、いちご状血管腫及び皮膚の乳児血管腫と、房状血管腫、血管拡張性肉芽腫その他の皮膚の血管性腫瘍性病変とからなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療のための前記光増感剤の製造のための使用とすることができる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1-A】完全に酸素を除去したヘモグロビンベシクル（以下、図面の簡単な説明及び実施例では「Ｈｂ－Ｖ」という）を投与したウサギ耳介に色素レーザーを照射して４日後の照射部位１の耳介皮膚外表写真。

【図1-B】ＣＯＨｂ－Ｖを投与したウサギ耳介に色素レーザーを照射して４日後の照射部位１の耳介皮膚外表写真。

【図2-A】Ｈｂ－Ｖを投与したウサギ耳介に色素レーザーを照射して４日後の照射部位２の耳介皮膚外表写真。

【図2-B】ＣＯＨｂ－Ｖを投与したウサギ耳介に色素レーザーを照射して４日後の照射部位２の耳介皮膚外表写真。

【図3-A】Ｈｂ－Ｖを投与したウサギ耳介に色素レーザーを照射して４日後の照射部位３の耳介皮膚外表写真。

【図3-B】ＣＯＨｂ－Ｖを投与したウサギ耳介に色素レーザーを照射して４日後の照射部位３の耳介皮膚外表写真。

【図4-A】Ｈｂ－Ｖを投与したウサギ耳介に色素レーザーを照射して４日後の照射部位４の耳介皮膚外表写真。

【図4-B】ＣＯＨｂ－Ｖを投与したウサギ耳介に色素レーザーを照射して４日後の照射部位３の耳介皮膚外表写真。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本発明の１つの実施態様は、ＣＯＨｂを含む、血管を治療標的とするレーザー治療用光増感剤である。

【0028】

血管を治療標的とするレーザー照射療法は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｒ．Ｒ．及びＰａｒｒｉｓｈ Ｊ．Ａ．（非特許文献１）により提唱された。毛細血管又はメラノーマに適切な波長、強度及び照射時間等の設定条件でレーザー光を照射することにより、毛細血管又はメラノーマだけに熱エネルギーを集中させて周辺組織に影響を与えずに毛細血管又はメラノーマを除去する治療方法である。毛細血管の場合にはオキシヘモグロビン（以下、「Ｏ_２Ｈｂ」という。）を標的としてレーザー光を照射する。レーザー光が血管内赤血球のＯ_２Ｈｂに吸収され、熱エネルギーに変換される。この熱エネルギーが血管壁に伝わり血管内皮が破壊され、最終的に異常血管が壊死し吸収される。熱エネルギーは血管内に止まるため血管周囲の組織に熱影響の障害を及ぼすことは少ない。Ｏ_２Ｈｂへの光の吸収率と皮膚内のその他の標的となりうる水分・コラーゲン・メラニンへの吸収率の関係、また光線の皮膚への深達度といった条件から５７７ｎｍ、５８５ｎｍ、５９５ｎｍ又は１０６４ｎｍの波長をもつレーザーが血管を治療標的とするレーザー照射療法に用いられる。

【0029】

血管壁近傍での血液の流速は血管中央部でのそれに比べて遅い。壁面付近では流れのせん断応力が大きいため、赤血球は変形しながら管中心へ移動し血管の中央を流れるようになる。この結果、管内壁面付近では赤血球の存在しない血漿層が形成される。これを「ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｌａｙｅｒ」又は「ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｌａｙｅｒ」と呼ぶ（Ｋｉｍ， Ｓ．ら、Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ ４６： １８１-１８９ （２００９））。カプセル化ヘモグロビン及び／又は非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体（重合型修飾ヘモグロビン、水溶性高分子結合型修飾ヘモグロビン及び分子内架橋ヘモグロビンを含む）は、赤血球よりサイズが小さいので、赤血球とは異なり、管壁近傍のｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｌａｙｅｒを流れることができる。また毛細血管では、血漿はその内腔を連続的に流れているが、赤血球は連続的に流れているわけではなく、その形を変形させながら断続的に流れる。これに対し、カプセル化ヘモグロビンは、血漿の流れに乗って毛細血管中を連続的に流れることができる（Ｈｙａｋｕｔａｋｅ， Ｔ．ら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｃｈ Ｅｎｇ．， １３０： ０１１０１４ （２００８））。非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体は血漿に溶解又は懸濁された状態で血漿とともに毛細血管中を連続的に流れることができる。このように、カプセル化ヘモグロビン及び／又は非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体の血管内投与は、自然発生している血管断面のヘモグロビン濃度分布を均一化する作用があり、レーザー光を吸収して熱に変換するヘモグロビン（光吸収体兼発熱体）を血管内皮近くに配置することを可能にする。光吸収体／発熱体と血管壁がこれまでになく近い距離となり効率的に熱が血管壁に伝わる。これは血管壁を治療標的とするレーザー照射療法に有利である。

【0030】

血管を治療標的とするレーザー照射療法に使用する光源は、５７７、５８５又は５９５ｎｍのＰＤＬ、７５５ｎｍのアレキサンドライトレーザー、８１０ｎｍのダイオードレーザー及び１０６４ｎｍのロングパルスＮｄ：ＹＡＧレーザーを含む。レーザーの種類によって光エネルギーが到達する皮膚表面からの距離が異なり、皮膚表面から浅い毛細血管を治療標的とする治療にはＰＤＬが最も好ましい。しかしＰＤＬ以外の光源も血管を治療標的とするレーザー照射療法の光源の選択肢である（非特許文献３）。

【0031】

本発明の血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤は、血管を治療標的とするレーザー照射療法の効果を増強するために用いられる。本発明の光増感剤は静脈又は動脈への注射によって血管内に投与される。本発明の光増感剤を静脈に投与するときには、静脈内に投与された前記光増感剤は、心臓から動脈を経て治療対象の毛細血管に到達するため、大量の光増感剤を投与する必要がある。その量は循環血液量の５％～２０％にも達する。循環血液量は患者の体重の約１３分の１なので、例えば体重２０ｋｇの小児であれば循環血液量が約１．５ｋｇすなわち約１．５Ｌとなる。したがって、循環血液量の５％～２０％は約７７ｍＬ～３０７ｍＬに相当する。治療対象の毛細血管の上流の動脈に本発明の光増感剤を投与する場合には、静脈投与よりは少量の光増感剤で治療上有効な局所濃度とすることができる。

【0032】

本発明のレーザー治療用光増感剤に用いるヘモグロビンの調製方法は、Ｓａｋａｉ Ｈ．ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ４６５：３６３－８４（２００９））及び国際公開公報第ＷＯ２０１２／１３７８３４号パンフレットに説明されている。

【0033】

簡潔には、本発明のレーザー治療用光増感剤に用いるヘモグロビンは、ヒト又は家畜由来の血液から精製濃縮される。あるいは遺伝子組み換え技術により微生物に産生させたものを精製濃縮させる。精製濃縮は、例えば、以下の手順で行われることがあるが、この手順に限定されず、当業者に知られたいかなる手順によって行われても構わない。ヒト又は家畜由来の血液を元に、まず遠心分離をして上澄みの血漿成分とバッフィーコートを除去し、等張液(生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水)を添加して穏やかに攪拌したのち、再度遠心分離をして上澄みを除去する操作を３回繰り返し、洗浄赤血球を得る。低張液（純水など）を添加すると、赤血球は溶血し、ヘモグロビンが遊離する。超遠心分離によって膜成分を沈殿除去するか、或いは限外濾過膜（分画分子量１，０００，０００程度）によってヘモグロビンのみ透過させて膜成分を除去する。

【0034】

本発明のレーザー治療用光増感剤に用いるヘモグロビンの調製において、ヒト又は家畜由来の血液からヘモグロビンを精製濃縮した後、ウィルス不活化のための加熱処理及び／又はウィルス除去のためのナノフィルトレーション処理を行う。ウィルス不活化のための加熱処理は、例えば、前記精製濃縮されたヘモグロビン溶液を６０℃にて１０～１２時間加熱することにより行われる場合がある。ヘモグロビンを耐熱化するために、加熱処理の前に、前記精製濃縮されたヘモグロビン溶液を耐熱性密封容器に移し、一酸化炭素ガスを充填して撹拌する操作を繰り返し、Ｏ_２ＨｂをＣＯＨｂに置換する。ウィルス除去のためのナノフィルトレーション処理は、例えば、前記精製濃縮され、さらに、ウィルス不活化のための加熱処理を施したヘモグロビン溶液を孔径１５～５０ｎｍの精密ろ過膜（Ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）でろ過することにより行われることがある。

【0035】

加熱処理とナノフィルトレーションの操作によって、不活化率・除去率（Ｌｏｇ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｖａｌｕｅ）の総計は９を上回り、ウィルスクリアランスバリデーションとして必要とされる規定をクリアする。これらの操作によって、解糖系、メトヘモグロビン還元系、脱炭酸酵素、及び、活性酸素を消去する酵素類は全て排除される。特に、本発明に関わるＮＡＤＨを基質とするＮＡＤＨ－ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ_５ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、及び、電子伝達体であるｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ_５が耐熱性に乏しいことはよく知られており（Ａｒｉｎｃ Ｅ．ら、Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ． Ｊａｎ－Ｆｅｂ；１０１（１－２）：２３５－４２． （１９９２））、加熱処理中に変性、失活する。加熱処理によってヘモグロビン溶液のタンパク質純度は極めて高くなる（９９．８％以上）。また、ＮＡＤＨ－ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ_５ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ及びＮＡＤＰＨ－ｆｌａｖｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅの酵素活性を測定しても、活性がないことを確認できる。

【0036】

上記ウィルス不活化工程及び除去工程を経たＣＯＨｂ溶液は、透析、ｐＨ調整などを経て、限外濾過膜によって濃縮される。このときの分画分子量は、８，０００～３０，０００程度で効率良く実施することができる。得られたＣＯＨｂ溶液は、Ｈｂ濃度が３０～４５ｇ／ｄＬと濃厚である。この溶液をアニオン交換樹脂処理させ、孔径０．２２μｍの滅菌フィルタに透過させる。

【0037】

本発明の１つの実施態様は、ＣＯＨｂ水溶液をカプセルに内包したカプセル化ヘモグロビン（ＣＯＨｂ－Ｃ）として前記ＣＯＨｂを含む、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。

【0038】

本発明のレーザー照射療法用光増感剤において、前記カプセルは、リポソーム、ポリマーソーム又は高分子薄膜とすることができる。

【0039】

前記カプセルがリポソームのとき、該リポソームにはさまざまな組成とすることができる（Ｓａｋａｉ Ｈ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２００９；４６５：３６３－８４．）、Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃｈ， Ｌ．及びＭｉｌｌｅｒ， Ｉ．Ｆ．、Ｆｅｄ． Ｐｒｏｃ．， ３６：５６７（１９７７））。カプセル化ヘモグロビンのカプセルがリポソームのとき、カプセル化ヘモグロビンはヘモグロビンベシクルという。ヘモグロビンベシクルの１つの例では、前記リポソームは、１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ （ＤＰＰＣ）と、ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌと、１，５－Ｏ－ｄｉｈｅｘａｄｅｃｙｌ－Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｙｌ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ （ＤＨＳＧ）と、１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－ＰＥＧ_５０００（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ_５０００）という４つの成分からなる。

【0040】

前記カプセルがポリマーソームのとき、該ポリマーソームは、親水性高分子と疎水性高分子が共重合した両親媒性高分子、例えば、ポリブタジエン－ポリエチレンオキシド（ＰＢＤ－ＰＥＯ）の両親媒性ジブロック共重合体が形成するカプセルである（Ａｒｉｆｉｎ， Ｄ．Ｒ．及びＰａｌｍｅｒ．， Ａ．Ｆ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，； ６：２１７２－８１（２００５））。

【0041】

前記カプセルが高分子薄膜のとき、該高分子薄膜は、ポリスチレン、アラビアゴム、ナイロン、シリコーンなどの高分子、ゼラチンなどの生体由来材料、ポリεカプロラクタムやポリエチレングリコールと生分解性高分子であるポリ乳酸やポリグリコール酸などの共重合体、多糖類、アミノ酸高分子の共重合体を含むが、これらに限定されない高分子を用いることができる（Ｃｈａｎｇ Ｔ．Ｍ．Ｓ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ． ４５：３－８．（１９９８））。

【0042】

ヘモグロビンをカプセル化する手段としては、超音波処理法（プローブ法、浴槽法）、有機溶媒注入法、界面活性剤除去法、凍結融解法、逆相蒸発法、押出し法（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法）、乾燥脂質粉末－水和法、高圧乳化分散法、遊星運動による混錬法などが知られている。ヘモグロビンを変性させずに、カプセル化させるには、乾燥脂質粉末－水和法、押し出し法、混錬法などが好ましい。

【0043】

本発明のレーザー照射療法用光増感剤において、前記ＣＯＨｂ－Ｃのサイズは、血管内壁面付近に形成される血漿層（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｌａｙｅｒ又はｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｌａｙｅｒ）に分散して流動することが可能な程度に赤血球より小さいサイズであることが必要とされる。前記ＣＯＨｂ－Ｃの平均サイズは、動的光散乱法による測定で約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、あるいは、約２２０ｎｍ～約２８０ｎｍ、あるいは、約２５０ｎｍ～約２８０ｎｍ、あるいは約２５０ｎｍである。

【0044】

ＣＯＨｂ－Ｃに内包されるＣＯＨｂ溶液には添加物を添加することができる。該添加物には、ＰＬＰ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨが含まれるが、これらに限定されない。

【0045】

カプセル化工程の後、カプセルの中に封入されなかったヘモグロビンは、限外濾過膜処理（例えば分画分子量１０００ｋＤａ）により濾過除去することができる。あるいは、遠心分離操作によってカプセル化ヘモグロビンを沈降させ、上澄みのヘモグロビン溶液を除去し、沈殿に生理食塩水などを添加しカプセル化ヘモグロビンを再分散させてもよい。カプセル化ヘモグロビンを再分散させた溶液には、電解質、糖質、アミノ酸及び／又は膠質を含ませてもよく、またこれらに限定されない添加物を添加することができる。

【0046】

ＣＯを結合しないヘモグロビンが必要な場合には、酸素気流下、光反応によりＣＯＨｂをＯ_２Ｈｂに変換することができる。液膜を形成させる、或いは透析膜を通過中に可視光を照射することで反応は速やかに進行する（特許第３６８２０７２号公報）。

【0047】

本発明の１つの実施態様は、前記カプセル化ヘモグロビンに内包させるヘモグロビン水溶液がピリドキサル５’－リン酸（ＰＬＰ）を含む、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。

【0048】

ＰＬＰは、ヘモグロビンの酸素親和度を調節するためのアロステリック因子として、ヘモグロビンに対するモル比が０．５～３となるように添加できる。あるいは、本発明の人工赤血球に内包されるＰＬＰ及びヘモグロビンのモル濃度を、それぞれ、［ＰＬＰ］及び［Ｈｂ］と表すとき、

【数1】

となるように添加することができる。
好ましいヘモグロビンに対するＰＬＰのモル比は約１である。

【0049】

本発明の１つの実施態様は、メトヘモグロビンを還元する酵素活性が実質的にない、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。

【0050】

本明細書の「メトヘモグロビンを還元する酵素」は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を基質とするＮＡＤＨ系メトヘモグロビン還元酵素と、ＮＡＤＰＨ系メトヘモグロビン還元酵素とを含むが、これらに限定されない。ＮＡＤＨ系メトヘモグロビン還元酵素としては、ＮＡＤＨ－ｍｅｔｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅが報告されたが、これはＮＡＤＨ－ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ_５ ｒｅｄｕｃｔａｓｅの作用とｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ_５が電子媒体となってｍｅｔＨｂが還元される機構であることが明らかになっている。酸化型のＮＡＤ^＋はＥｍｂｄｅｎ Ｍｙｅｒｈｏｆ 経路によってＮＡＤＨに復元される。ＮＡＤＨ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ_５ ｒｅｄｕｃｔａｓｅは、赤血球膜中に存在するものと、赤血球中に溶解しているものがある。ＮＡＤＰＨ系メトヘモグロビン還元酵素は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（ＮＡＤＰＨ）を基質とするＮＡＤＰＨ ｍｅｔｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅの作用でｍｅｔＨｂが還元され、酸化型のＮＡＤＰ^＋はｐｅｎｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ経路によってＮＡＤＰＨに復元される。本発明の「ＮＡＤ^＋をＮＡＤＨに変換可能な酵素系」及び「ＮＡＤＰ^＋をＮＡＤＰＨに変換可能な酵素系」は、それぞれ、Ｅｍｂｄｅｎ Ｍｙｅｒｈｏｆ 経路のｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧＡＰＤＨ）と、ｐｅｎｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ経路のｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （Ｇ６ＰＤＨ） 及び６－ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （６ＰＧＤＨ）とである。したがって、「メトヘモグロビンを還元する酵素」と、「ＮＡＤ^＋及び／又はＮＡＤＰ^＋をＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨに変換可能な酵素系」とは異なる酵素である。

【0051】

本明細書のメトヘモグロビンを還元する酵素について、「酵素活性が実質的にない」とは、ヒト又は家畜由来の血液から精製濃縮されたヘモグロビン溶液の酵素活性の１０％、５％、３％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％又は０．０３％以下か、あるいは、メトヘモグロビン還元酵素の酵素活性の検出限界以下かの酵素活性をいう。ここで、本明細書のメトヘモグロビンを還元する酵素の酵素活性は、例えば、以下の手順で決定することができる。

【0052】

ＮＡＤＨ－ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂ_５ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ活性の測定は、Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｅ．（ＲＥＤ ＣＥＬＬ ＭＴＡＢＯＬＩＳＭ： Ａ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤ， Ｇｒｕｎｅ ＆Ｓｔｒａｔｔｏｎ， Ｉｎｃ． ｐｐ．８１－８２（１９８７））にしたがって行うことができる。測定原理は、ＮＡＤＨ ｍｅｔｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅを本方法では、ＮＡＤＨ－ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ活性として測定する。

【化1】

の反応において、酵素を含有する検体の添加によって促進される程度を追跡することから活性測定する。消費されるＮＡＤＨの特性吸収３４０ｎｍの吸光度変化（減少）を測定する。

【0053】

また、ＮＡＤＰＨ－ｆｌａｖｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ活性の測定は、Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｅ．（ＲＥＤ ＣＥＬＬ ＭＴＡＢＯＬＩＳＭ： Ａ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤ， Ｇｒｕｎｅ ＆Ｓｔｒａｔｔｏｎ， Ｉｎｃ．ｐｐ． ７９－８０（１９８７）））にしたがって行うことができる。測定原理は、ＮＡＤＨ ｍｅｔｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ を本方法では、ＮＡＤＨ ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ活性として測定する。メチレンブルー（ＭＢ）がルーコメチレンブルー（ＬｅｕｋＭＢ）に還元される反応である、

【化2】

は遅い反応として知られているが、酵素を含有する検体の添加によって促進される程度を追跡することによって活性を測定する。具体的には、消費されるＮＡＤＰＨ特性吸収３４０ｎｍの吸光度変化（減少）を測定し、上記原理に基づいて活性を決定する。

【0054】

本明細書のメトヘモグロビンを還元する酵素の活性が実質的にない状態は、ヒト又は家畜由来の血液からヘモグロビンを精製濃縮した後、ウィルス不活化のための加熱処理及び／又はウィルス除去のためのナノフィルトレーション処理により達成することができる。

【0055】

本発明の１つの実施態様は、前記カプセル化ヘモグロビンに内包させるヘモグロビン水溶液が、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを含む、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。

【0056】

本発明のＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨは、本発明のカプセル化ヘモグロビンに内包されるヘモグロビン溶液中のヘモグロビンに対してモル比で０．５～１０の量を添加される。あるいは、前記カプセル化ヘモグロビンに内包されるヘモグロビン水溶液中のヘモグロビンに対してモル比で１～３の量を添加される。前記カプセル化ヘモグロビンに内包されるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ及びヘモグロビンのモル濃度を、それぞれ、［ＮＡＤＨ］、［ＮＡＤＰＨ］及び［Ｈｂ］と表すとき、

【数2】

あるいは

【数3】

となるように添加することができる。本発明において、「ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨ」の代わりに、「ＮＡＤ^＋及び／又はＮＡＤＰ^＋をＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨに変換可能な酵素系と、ＮＡＤ^＋及び／又はＮＡＤＰ^＋と」で置換可能であることは当業者に周知である。ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨが、カプセル化ヘモグロビンに内包されるヘモグロビン水溶液に添加されるだけでなく、カプセル化ヘモグロビンを分散した溶液中にも添加される場合には、さらなるヘモグロビンの保護効果が期待できる。

【0057】

本発明の１つの実施態様は、前記ヘモグロビン水溶液は生分解性蛍光色素を含む、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。

【0058】

前記生分解性蛍光色素は、例えば、フルオレセインナトリウムその他の従来から臨床的に使用されている蛍光造影剤を含むが、これらに限られない。前記生分解性蛍光色素は、５７７～５９５ｎｍの波長をもつレーザー照射による本発明の血管を治療標的とするレーザー照射療法による治療において、本発明の色素レーザー治療用光増感剤の効果を損なわないことが望ましい。その点、フルオレセインナトリウムは極大吸収波長が４９４ｎｍで、５５０ｎｍでは４８８ｎｍでの吸光度のほぼ０％となるので前記レーザー照射の影響は想定し難い。前記生分解性蛍光色素を含むレーザー治療用光増感剤は、治療対象の毛細血管におけるヘモグロビン粒子の濃度をリアルタイムで非侵襲的に確認することができ、最も濃度が高いときにレーザー照射を行うことができるという利点がある。前記生分解性蛍光色素の１つであるフルオレセインナトリウムを蛍光眼底造影剤として用いる場合には、２００ｍｇ～５００ｍｇを肘静脈から投与することが添付文書に記載されている。したがって本発明の光増感剤を後述する用量で使用するとき、患者の全投与量中に前記生分解性蛍光色素が最大で２００ｍｇ～５００ｍｇ含むように配合することが好ましい。

【0059】

本発明の１つの実施態様は、カプセル化ヘモグロビンに内包させる水溶液中のヘモグロビン濃度が１．６ｍＭ～７．０ｍＭである、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。

【0060】

最初に赤血球を溶血して精製したヘモグロビン溶液の濃度は３０ｇ／ｄＬ～５０ｇ／ｄＬである。前記ヘモグロビン溶液を生理食塩水のような水性溶媒で希釈した後にカプセルに内包することにより、カプセルに内包されるヘモグロビン水溶液のヘモグロビン濃度を１０ｇ／ｄＬ～４５ｇ／ｄＬとすることができる。このヘモグロビン濃度はモル濃度に換算すると、１．６ｍＭ～７．０ｍＭに相当する。前記モル濃度は、ヘモグロビンの分子量が６４５００であることから計算される。ヘモグロビン１分子は、グロビンポリペプチド４本からなるので、ヘモグロビン１モルに結合する酸素あるいは一酸化炭素は４倍の４モルとなる。

【0061】

カプセル化ヘモグロビンを分散させる膠質の水溶液は、前記カプセル化ヘモグロビンの分散液に膠質浸透圧を付与することができる。前記膠質は、アルブミン（５ｇ／ｄＬ以下）、ヒロドキシエチルスターチ（１０ｇ／ｄＬ以下）、デキストラン（１０ｇ／ｄＬ以下）、修飾ゼラチン（５ｇ／ｄＬ以下）を含むが、これらに限定されない。晶質浸透圧は３００ｍＯｓｍに調節されることが望ましい。

【0062】

上述のとおり、本発明の光増感剤を静脈に投与するときには、静脈内に投与された前記光増感剤は、心臓から動脈を経て治療対象の毛細血管に到達するため、大量の光増感剤を投与する必要がある。その量は循環血液量の５％～２０％にも達する。循環血液量を患者の体重の約１３分の１とすると、例えば体重２０ｋｇの小児であれば循環血液量が約１．５ｋｇすなわち約１．５Ｌとなるので、循環血液量の５％～２０％は約７７ｍＬ～３０７ｍＬに相当する。つまり、患者の体重１ｋｇあたりの光増感剤の投与量は３．８５ｍＬ～１５．３５ｍＬとなる。したがって本発明の光増感剤の用量は、最終的には処置を行う医師の判断によるが、一般的には、静脈投与の場合で患者の体重１ｋｇあたり２ｍＬ～２５ｍＬ、あるいは、３．８５ｍＬ～１５．３５ｍＬとすることができる。

【0063】

本発明の１つの実施態様は、前記カプセルが、リポソーム、ポリマーソーム又は高分子薄膜である、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。

【0064】

本発明のカプセル化ヘモグロビンのカプセルがポリマーソームのとき、該ポリマーソームは、親水性高分子と疎水性高分子が共重合した両親媒性高分子、例えば、ポリブタジエン－ポリエチレンオキシド（ＰＢＤ－ＰＥＯ）の両親媒性ジブロック共重合体が形成するカプセルである。

【0065】

本発明のカプセル化ヘモグロビンのカプセルが高分子薄膜のとき、該高分子薄膜は、ポリスチレン、アラビアゴム、ナイロン、シリコーンなどの高分子、ゼラチンなどの生体由来材料、ポリεカプロラクタムやポリエチレングリコールと生分解性高分子であるポリ乳酸やポリグリコール酸などの共重合体、多糖類、アミノ酸高分子の共重合体を含むが、これらに限定されない高分子を用いることができる。

【0066】

本発明の１つの実施態様は、前記リポソームが、ホスファチジルコリン型リン脂質、コレステロール、負電荷脂質及び、ポリエチレングリコールを結合した脂質を含む、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。ここで前記ホスファチジルコリン型リン脂質は１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅであり、前記負電荷脂質は１，５－Ｏ－ｄｉｈｅｘａｄｅｃｙｌ－Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｙｌ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅであり、前記ポリエチレングリコールを結合した脂質は１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－Ｐｏｌｙ（ｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）_５０００（ポリエチレングリコール鎖の分子量５０００）である。またここで、前記リポソームは、高濃度Ｈｂ溶液を内包するベシクルが毛細血管を容易に通過できるように、粒径が制御され、血中分散安定性が向上される。前記リポソームは、ヘモグロビン水溶液を内包し、かつ、該リポソームが水溶液に懸濁できるいずれかの構造のリン脂質二分子膜のベシクルでもかまわない。リポソームは単一のリン脂質二分子膜からなるベシクルであってもよい。

【0067】

ホスファチジルコリン型リン脂質としては、過酸化脂質の生成を抑制するため、グリセロール骨格の１，２位水酸基にエステル結合している脂肪酸が飽和型であることが好ましく、１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ （ＤＭＰＣ）のほか、１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ （ＤＰＰＣ）、１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ （ＤＳＰＣ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ （ＰＭＰＣ）、１－ｓｔｅａｒｏｙｌ－２－ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ （ＳＭＰＣ）、また大豆由来の水素添加レシチン（ＨＳＰＣ）、また、不飽和型リン脂質でも、比較的安定な脂肪酸であるオレイン酸が結合したリン脂質として、１－ｓｔｅａｒｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ （ＳＯＰＣ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ （ＰＯＰＣ）などが好ましい。これらリン脂質の中でも、得られる小胞体の安定性と、マクロファージに捕捉された後の蓄積性の回避を考慮すると、ＤＰＰＣが好ましいとされてきた。しかし、製造の簡便さの観点からは、ＤＰＰＣの相転移温度（Ｔｃ＝４１℃）よりも低いホスファチジルコリン型リン脂質が分散性や粒子径の制御の点で好ましく、例えば、ＳＭＰＣ（Ｔｃ＝３０℃）、ＰＭＰＣ（２８℃）、ＤＭＰＣ（２３℃）、ＳＯＰＣ（６℃）、ＰＯＰＣ（－３℃）などが挙げられる。従来、相転移温度の低いホスファチジルコリン型脂質では、得られるベシクルの構造が不安定とみなされてきたが、実際の使用目的の観点から安定性が十分かどうか判断する必要がある。

【0068】

負電荷脂質としては、１，５－Ｏ－ｄｉｈｅｘａｄｅｃｙｌ－Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｙｌ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ（ＤＨＳＧ）を利用することが好ましい。負電荷脂質は、リポソームの被覆層数（Ｌａｍｅｌｌａｒｉｔｙ）の低減と生体適合性の付与に必要である。

【0069】

コレステロール（ＣＨＯ）は、ホスファチジルコリン型リン脂質の明確な相転移温度をなくし、脂質膜を安定化させる。

【0070】

また、前記リポソームは、血中滞留性の向上、ヘモグロビンベシクル粒子間の凝集の抑制、分散安定性の向上等の目的のために、ポリアルキレングリコールで、典型的にはポリエチレングリコールで修飾（ＰＥＧ修飾）されていてもよい。リポソームのＰＥＧ修飾は一般的な方法、例えばＰＥＧを結合させた適当な脂質を脂質二重膜の構成脂質としてリポソームを調製することで行うことができる。本発明にかかるリポソームの場合、ＰＥＧ修飾は、１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ）にＰＥＧを結合させた（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）を脂質二重膜の構成脂質として利用することで行うことが好ましい。ポリエチレングリコールの分子量は、４００ Ｄａから１２０００ Ｄａ程度、好ましくは１０００Ｄａから５０００Ｄａである。ＰＥＧ修飾脂質として、ポリエチレングリコール鎖の分子量が５０００の１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－Ｐｏｌｙ（ｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ）_５０００（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）を用いることが好ましい。また、前記ＰＥＧ修飾に関連して、医用高分子として汎用されているＰＥＧの代替材料として、ポリ（２―オキサゾリン）や、ポリサルコシンなどの高分子をＤＳＰＥなどの脂質類に結合した物質を使用してリポソームの表面を修飾してもよい。

【0071】

本発明のリポソームの脂質二重膜を構成する好ましい脂質の一例は、ＤＰＰＣ、ＣＨＯ、ＤＨＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥであり、その構成比は、モル比で５：４：０．９：０．０３である。

【0072】

本発明の１つの実施態様は、ＣＯを結合した非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体の水溶液として前記ＣＯＨｂを含む、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。ここで、前記非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体は、重合型修飾ヘモグロビン、水溶性高分子結合型修飾ヘモグロビン及び分子内架橋ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１つである。

【0073】

前記非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体は、Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｋ．ら（Ｊ． Ｆｕｎｃｔ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ８， １１（２０１７））及びＣｈａｎｇ Ｔ．Ｍ．（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｎａｎｏｍｅｄ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２：４１８－３０ （２０１０））に詳しく説明される。

【0074】

本発明の１つの実施態様は、前記非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体が、重合型修飾ヘモグロビン及び／又は水溶性高分子結合型修飾ヘモグロビンである、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。

【0075】

前記重合型修飾ヘモグロビンは、グルタルアルデヒド等の架橋剤でヘモグロビンの表面のリジン残基と結合させたヘモグロビン重合体（Ｇｏｕｌｄ Ｓ．Ａ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｓｕｒｇ．，１９５：４４５－５２（２００２））、及び、Ｈｂのグロビン鎖の末端カルボン酸とリジン残基を分子間で直接結合させたＨｂ重合体（Ｍａｔｈｅｓｏｎ Ｂ．ら、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３：１４７９－８６（２００２））に一酸化炭素を結合させたものを含むが、これらに限定されない。

【0076】

前記水溶性高分子結合型修飾ヘモグロビンは、ヘモグロビンとヒドロキシエチルスターチとの共重合体（Ｈｕ Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、３９２：５５５－６４（２００５））、及び、ヘモグロビンの表面に片末端メトキシ基ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させたＰＥＧ結合ヘモグロビン（Ｃｈａｎｇ， Ｔ．Ｍ．、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １０：５－２４（１９８４））に一酸化炭素を結合させたものを含むが、これらに限定されない。

【0077】

本発明の１つの実施態様は、０．４６ｍＭ～３．６ｍＭのヘモグロビン濃度で投与される、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。ここで０．４６ｍＭ～３．６ｍＭのヘモグロビン濃度（３ｇ／ｄＬ～２３ｇ／ｄＬ）は、ＣＯＨｂを、カプセルに内包されるか否かを問わず、電解質、糖質、アミノ酸及び／又は膠質その他を含む水性溶媒に分散した、本発明の光増感剤の製剤全体積中のヘモグロビンの濃度である。

【0078】

前記光増感剤がＣＯを結合した非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体の水溶液のとき、前記本発明の光増感剤の製剤全体積の中のヘモグロビンのモル濃度とは、前記非細胞性ヘモグロビン由来酸素運搬体中のヘモグロビン重合体又は共重合体に含まれるヘモグロビンを全てヘモグロビン単量体に換算した場合のモル濃度をいう。

【0079】

本発明の１つの実施態様は、体重１ｋｇ当たり０．００４～０．３６ｍｍｏｌ（ミリモル）の一酸化炭素量で投与される、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。

【0080】

ＣＯはほぼ全てがヘモグロビンに結合した状態で投与されるので、ＣＯ投与総量が容易に管理できる。本発明の光増感剤製剤に含有されるヘモグロビンは、血管拡張作用のあるＣＯＨｂを含み、投与後次第に、ＣＯガスを遊離し、Ｏ_２Ｈｂに変換される。ＣＯＨｂもＯ_２Ｈｂと同等の光吸収を示し、またレーザー照射療法の増強効果を奏することができる。さらに、可視光領域のレーザー照射により、ＣＯＨｂが光解離してＣＯを遊離し、ＣＯ濃度を局所的に高めることができる。ＣＯガスは毒性も示すので、投与に際しては血行動態や血液ガス組成を継続してモニタリングする。また、投与されたＣＯＨｂから解離したＣＯは体内で薬理効果を示した後、最終的には呼気として排出されるのみであるので、呼吸状態の維持管理が重要である。血中のＣＯＨｂ量の推移は、採血液の可視吸収スペクトルにおいてソレー帯又はＱ帯におけるデオキシＨｂとの吸光度比から容易に算出できる。本発明の光増感剤の製剤の投与量としては、ＣＯとして、体重１ｋｇ当たり０．００４ｍｍｏｌ（ミリモル）～０．３６ｍｍｏｌ（ミリモル）となる量である。

【0081】

本発明の血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤に含まれる有効成分であるＣＯＨｂは、血液から精製濃縮されたヘモグロビン溶液をウィルス不活化のための加熱処理に供する前に、ヘモグロビンの耐熱化の目的でＯ_２Ｈｂから置換されている。したがって本発明の光増感剤において、有効成分であるＣＯＨｂは、本発明の光増感剤に含まれるヘモグロビンの約１００％か、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％かである。そこで本発明の光増感剤が０．４６ｍＭ～３．６ｍＭ（３ｇ／ｄＬ～２３ｇ／ｄＬ）のヘモグロビン濃度で投与される場合には、本発明の光増感剤の製剤全体に占める有効成分であるＣＯＨｂの重量百分率は、Ｈｂの約１００％がＣＯＨｂのとき、約３％～約２３％となる。本発明の光増感剤の製剤全体に占める有効成分であるＣＯＨｂの重量百分率は、Ｈｂの少なくとも６５％がＣＯＨｂのとき、約１．９５％～約１４．９５％となる。すなわち、本発明の光増感剤の製剤全体に占める有効成分であるＣＯＨｂの重量百分率は、約１．９５％～約２３％の範囲内である。

【0082】

本発明の１つの実施態様は、単純性血管腫、毛細血管奇形、サーモンパッチ、ウンナ母斑、血管腫、ｐｏｒｔ ｗｉｎｅ ｓｔａｉｎ、スタージーウエバー症候群、クリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群その他の毛細血管の過形成による皮膚病変と、酒さ及び毛細血管拡張症と、肥厚性瘢痕、外傷性瘢痕及び植皮後瘢痕に伴う病的な血管拡張と、いちご状血管腫及び皮膚の乳児血管腫と、房状血管腫、血管拡張性肉芽腫その他の皮膚の血管性腫瘍性病変とからなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療のための血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤である。

【0083】

本発明の光増感剤は、ＣＯＨｂの吸収波長の色素レーザーで照射された光子を吸収してＣＯを放出し、該ＣＯは血管を拡張してＣＯＨｂ－Ｖ及び赤血球の流量を増大させる。ＣＯを放出後のＨｂは、照射された光子を吸収して熱エネルギーに変換し、該熱エネルギーは血管壁に伝わり血管内皮を破壊する。一方、放出されたＣＯは血管を拡張させるだけでなく、血管周囲組織において抗炎症作用を発揮する。そのため、本発明の光増感剤は、レーザー照射による血管周囲組織の熱傷に伴う炎症を抑制して、血管周囲組織の損傷を軽減すると同時に異常血管を壊死吸収させる。その結果、従来の血管を治療標的とするレーザー照射療法と比較して、血管への効果はより高いが血管周囲組織への副作用はより少ない。したがって本発明の光増感剤を適用できる疾患は、体表の毛細血管の過形成による疾患である。体表とは、レーザー光線が到達可能な、皮膚表面から１５０～４００μｍまでの深さを指す。

【0084】

体表の毛細血管の過形成による疾患は、具体的には、単純血管腫、毛細血管奇形、サーモンパッチ、ウンナ母斑、血管腫、ｐｏｒｔ ｗｉｎｅ ｓｔａｉｎ、スタージーウエバー症候群及びクリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群と呼ばれる、出生時又は新生児の間に顕在化する、毛細血管の過形成による、ピンク色、紅色、又は紫色の平坦な皮膚病変と、酒さを含む毛細血管拡張症と、肥厚性瘢痕、外傷性瘢痕及び植皮後瘢痕に伴う病的な血管拡張と、いちご状血管腫及び皮膚の乳児血管腫と、房状血管腫及び血管拡張性肉芽腫を含むその他の皮膚の血管性腫瘍性病変とを含むが、これらに限定されない。本発明の光増感剤を適用できる疾患は、単純血管腫、毛細血管奇形、サーモンパッチ、血管腫及び／又はｐｏｒｔ ｗｉｎｅ ｓｔａｉｎが好ましい。

【0085】

本発明の１つの実施態様は、ＣＯＨｂの、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤の製造のための使用である。

【0086】

本発明の光増感剤の使用は、単純性血管腫、毛細血管奇形、サーモンパッチ、ウンナ母斑、血管腫、ｐｏｒｔ ｗｉｎｅ ｓｔａｉｎ、スタージーウエバー症候群、クリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群その他の毛細血管の過形成による皮膚病変と、酒さ及び毛細血管拡張症と、肥厚性瘢痕、外傷性瘢痕及び植皮後瘢痕に伴う病的な血管拡張と、いちご状血管腫及び皮膚の乳児血管腫と、房状血管腫、血管拡張性肉芽腫その他の皮膚の血管性腫瘍性病変とからなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療のための使用とすることができる。

【0087】

本発明の１つの実施態様は、本発明の光増感剤を血管内に投与すること、及び、処置をすべき血管を治療標的としてレーザーを照射することを含む、単純性血管腫、毛細血管奇形、サーモンパッチ、ウンナ母斑、血管腫、ｐｏｒｔ ｗｉｎｅ ｓｔａｉｎ、スタージーウエバー症候群、クリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群、その他の毛細血管の過形成による皮膚病変と、酒さ及び毛細血管拡張症と、肥厚性瘢痕、外傷性瘢痕及び植皮後瘢痕に伴う病的な血管拡張と、いちご状血管腫及び皮膚の乳児血管腫と、房状血管腫、血管拡張性肉芽腫その他の皮膚の血管性腫瘍性病変とからなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療方法である。

【0088】

本明細書において数値について修飾する連体詞「約」は、当該数値の９０％以上、かつ、１１０％以内の数値範囲であることを意味する。例えば、ＣＯＨｂ－Ｃの平均サイズが「約２５０ｎｍ」であるとは、前記ＣＯＨｂ－Ｃの平均サイズは、２２５ｎｍ及び２７５ｎｍをそれぞれ下限及び上限として、該下限及び上限を含む数値範囲内のいずれかの数値であることを指す。

【0089】

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

【0090】

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

【実施例】

【0091】

実施例１ 本発明の色素レーザー治療用光増感剤の調製
本発明の色素レーザー治療用光増感剤に含まれるヘモグロビンベシクルは、既報（Ｓａｋａｉ Ｈ．ら、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， ２００４； ３１１：８７４－８４）に従って調製した。先ず、ヒト赤血球に生理食塩水を等量添加し、遠心分離をして上澄を除去する操作を３回行い、洗浄赤血球を得た。これに注射用蒸留水を添加して溶血させて、限外濾過膜処理を行い、ストローマフリーヘモグロビン溶液を得た。該ストローマフリーヘモグロビン溶液に一酸化炭素を結合させて６０℃にて１０時間の加熱処理を行い、さらに限外濾過膜処理により高純度高濃度Ｈｂ溶液（４０ｇ／ｄＬ）を得た。これにアロステリック因子としてピリドキサル５’－リン酸をヘモグロビンに対して等モル量添加した。次いで、混合脂質粉末（ジパルミトイルホスファチジルコリン／コレステロール／負電荷脂質／ポリエチレングリコール結合型ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）を添加し、国際公開第ＷＯ２０１２／１３７８３４号パンフレットで説明した混錬法によりヘモグロビンベシクルを形成させ、平均粒径を２５０ｎｍに制御した。リポソームに内包されなかったヘモグロビンを限外濾過膜で除去し、ヘモグロビン濃度を１０ｇ／ｄＬに調節し、ＣＯＨｂ－Ｖを調製した。また、ＣＯＨｂ－Ｖを酸素気流下、可視光の照射によりＨｂに結合した一酸化炭素を光解離させ、酸素と置換させた。最後に、ガラス容器に封入して、窒素ガスを通気して完全に酸素を除去して保存した。以下の実施例では、完全に酸素を除去したヘモグロビンベシクルを「Ｈｂ－Ｖ」という。

【0092】

実施例２ ウサギ耳介への色素レーザー照射に対する光増感剤の効果
以下の動物実験は、千葉大学の大学動物実験実施規程に従って承認された実験計画（動物実験計画書承認番号: 動１－９８）に則って実施された。

【0093】

２０週齢のウサギ（Ｓｌｃ：ＪＷ／ＣＳＫ、オス、日本エスエルシー）３匹に吸入麻酔を導入して１０～１５分後に、左耳介の４か所に可変式ロングパルス色素レーザーを照射した。左耳介へのレーザー照射から約１５分後に、ヘモグロビンベシクルＨｂ－Ｖ若しくはＣＯＨｂ－Ｖを１０ｍＬ、又は、Ｈｂ－Ｖ５ｍＬ及びＣＯＨｂ－Ｖ５ｍＬの混合物（以下、「Ｍｉｘｅｄ」という。）をそれぞれウサギ１匹ずつに静脈投与した。ヘモグロビンベシクルの投与約３０分後に各個体の右耳介の４か所に可変式ロングパルス色素レーザーを照射した。使用した可変式ロングパルス色素レーザーは、Ｃａｎｄｅｌａ Ｃｏｒｐ （米国、マサチューセッツ州、Ｗａｙｌａｎｄ）製Ｖｂｅａｍ（登録商標）であった。照射条件は直径7ミリの円形の照射エリアに照射パルス幅を１．５ｍｓ、照射エネルギーを１０Ｊ／ｃｍ^２とし、照射３０ｍｓ前に２０ｍｓ間照射皮膚表面を寒剤で冷却した（ダイナミッククーリングディバイス）。各個体の耳介の４か所に可変式ロングパルス色素レーザーを照射した。照射部位１～４は、耳介の照射部位のうち、最も近位側の照射部位を照射部位１とし、順に遠位側にナンバリングを行い、最も遠位側の照射部位を照射部位４とした。照射後４日目に、照射部の耳介皮膚の外表観察して写真に記録するとともに、照射部組織を採取してホルマリン固定し、パラフィン包埋ＨＥ染色標本を作製した。組織切片は、各照射部位から亜連続で５枚、合計１２０枚作製した。

【0094】

耳介動脈及び耳介静脈の組織所見は、血管壁の変性・壊死（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ／ｎｅｃｒｏｓｉｓ， ｖａｓｃｕｌａｒ ｗａｌｌ）とした。また、血管周囲組織の変化は、浮腫、出血、膠原線維束の壊死及び炎症細胞浸潤に着目した。各所見は、下記に示す定義に基づいて評価した。なお、炎症細胞浸潤については視野あたりの数や分布の度合いを指標として－～３＋の５段階で評価した。また、その他の所見が認められた場合にも記録した。

【0095】

血管壁の変性・壊死
－：変化なし
±：内皮細胞の一部変性・壊死
＋：内皮細胞の脱落
２＋：内皮細胞の脱落、中膜及び外膜の変性・壊死 （細胞成分の残存）
３＋：内皮細胞の脱落、中膜及び外膜の変性・壊死 （細胞成分の消失）

【0096】

血管周囲組織の浮腫
－：変化なし
±：血管周囲にわずかにみられる
＋：血管から表皮側にやや広範性にみられる
２＋：血管を中心として広範性にみられる
３＋：照射部 （組織切片） 全般にみられる

【0097】

血管周囲組織の出血
－：変化なし
±：小血管を含む血管周囲のわずかな漏出
＋：血管周囲や真皮層に散在性にみられる
２＋：血管周囲や真皮層に散在性又は集簇巣がみられる
３＋：広範性にみられる

【0098】

膠原線維束の壊死
－：変化なし
±：血管周囲のわずかな凝固壊死
＋：血管周囲から広がりを持った凝固又は融解壊死
２＋：広範性の凝固又は融解壊死
３＋：照射部 （組織切片） 全般の凝固又は融解壊死

【0099】

データの解析
グレード分けした組織所見はＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定により、また陽性グレードの合計値はＦｉｓｈｅｒの直接確立の片側検定により、Ｈｂ－Ｖ又はＣＯＨｂ－Ｖ投与と非投与との間及びＨｂ－Ｖ投与とＣＯＨｂ－Ｖ投与との間の有意差検定を行った（有意水準：５％）。

【0100】

試験成績（１）Ｈｂ－Ｖ投与
所見を以下の表１に示す。

【0101】

【表1】

【0102】

表１のＨｂ－Ｖ（－）は、Ｈｂ－Ｖを投与した個体について、Ｈｂ－Ｖ投与前にレーザー照射を行った（非投与）部位を意味し、Ｈｂ－Ｖ（＋）は、Ｈｂ－Ｖを投与した個体について、Ｈｂ－Ｖ投与後にレーザー照射を行った（投与）部位を意味する。

【0103】

非投与耳介組織２０枚中４枚、Ｈｂ－Ｖ投与耳介組織２０枚中２枚の組織切片上に耳介動脈がなかったため、これらについて評価できなかった。前記６枚を除く標本の耳介動脈及び全標本の耳介静脈いずれにも血管壁の変性・壊死が認められ、Ｈｂ－Ｖ投与では耳介静脈の変性・壊死の程度が非投与と比較して有意に増強した。周囲組織では炎症細胞浸潤、水腫、出血及び膠原線維束の壊死が非投与及びＨｂ－Ｖ投与いずれにも認められたが、炎症細胞浸潤の発現頻度、水腫及び膠原線維束の壊死の程度がＨｂ－Ｖ投与で有意に軽減した。

【0104】

試験成績（２） ＣＯＨｂ－Ｖ投与
所見を以下の表２に示す。

【0105】

【表2】

【0106】

表２のＣＯＨｂ－Ｖ（－）は、ＣＯＨｂ－Ｖを投与した個体について、ＣＯＨｂ－Ｖ投与前にレーザー照射を行った（非投与）部位を意味し、ＣＯＨｂ－Ｖ（＋）は、ＣＯＨｂ－Ｖを投与した個体について、ＣＯＨｂ－Ｖ投与後にレーザー照射を行った（投与）部位を意味する。

【0107】

非投与及びＣＯＨｂ－Ｖ投与の全標本について、耳介動脈及び耳介静脈いずれにも軽度又は中等度以上の血管壁の変性・壊死が認められたが、非投与とＣＯＨｂ－Ｖ投与の間に頻度、程度の差はなかった。一方、周囲組織では炎症細胞浸潤、水腫、出血及び膠原線維束の壊死の発現頻度及び程度がＣＯＨｂ－Ｖ投与で有意に軽減した。

【0108】

試験成績（３） Ｈｂ－Ｖ投与個体とＣＯＨｂ－Ｖ投与個体の組織学的変化の比較
所見を以下の表３に示す。

【0109】

【表3】

【0110】

表３のＨｂ－Ｖ（＋）は、Ｈｂ－Ｖを投与した個体について、Ｈｂ－Ｖ投与後にレーザー照射を行った部位を意味し、ＣＯＨｂ－Ｖ（＋）は、ＣＯＨｂ－Ｖを投与した個体について、ＣＯＨｂ－Ｖ投与後にレーザー照射を行った部位を意味する。

【0111】

血管壁の変性・壊死は、耳介動脈ではＨｂ－Ｖ投与とＣＯＨｂ－Ｖ投与との間に頻度及び程度の差は認められなかったが、耳介静脈ではＣＯＨｂ－Ｖ投与で所見の程度が増強した。周囲組織では水腫、出血及び膠原線維束の壊死の発現頻度及び程度がＣＯＨｂ－Ｖ投与で有意に軽減した。

【0112】

試験成績（４） Ｈｂ－Ｖ及びＣＯＨｂ－Ｖ等量（以下、「Ｍｉｘｅｄ」という。）投与個体とＣＯＨｂ－Ｖ投与個体との組織学的変化の比較
所見を以下の表４に示す。

【0113】

【表4】

【0114】

表４のＭｉｘｅｄ（＋）は、Ｈｂ－Ｖ及びＣＯＨｂ－Ｖ等量ずつを投与した個体について、投与後にレーザー照射を行った部位を意味し、ＣＯＨｂ－Ｖ（＋）は、ＣＯＨｂ－Ｖを投与した個体について、ＣＯＨｂ－Ｖ投与後にレーザー照射を行った部位を意味する。

【0115】

血管壁の変性・壊死は、耳介動脈ではＭｉｘｅｄ投与とＣＯＨｂ－Ｖ投与との間に頻度及び程度の差は認められなかったが、耳介静脈ではＣＯＨｂ－Ｖ投与で血管壁の変性・壊死の程度が増強した。周囲組織では水腫、出血及び膠原線維束の壊死の発現頻度及び程度がＣＯＨｂ－Ｖ投与で有意に軽減した。

【0116】

以上の病理学的、統計学的な結果から、Ｈｂ－Ｖ投与、ＣＯＨｂ－Ｖ投与及びＭｉｘｅｄ投与いずれも非投与と比較して血管周囲組織の傷害性は弱く、ＣＯＨｂ－Ｖ投与ではＨｂ－Ｖ投与及びＭｉｘｅｄ投与に比べ傷害性がさらに減弱した。また静脈損傷程度についてＣＯＨｂ－Ｖ投与をＨｂ－Ｖ投与及びＭｉｘｅｄ投与を比較すると、ＣＯＨｂ－Ｖ投与のほうが強く障害された。血管を強く熱損傷しながら、一方で血管以外の組織に対する熱作用を軽減するＣＯＨｂ－Ｖは、Ｈｂ－Ｖと比較して、血管を治療標的とするレーザー照射療法用光増感剤として優れている。

【0117】

試験成績（５） 照射部位の耳介皮膚外表所見
図１－Ａ、図２－Ａ、図３－Ａ及び図４－Ａは、Ｈｂ－Ｖを投与したウサギ耳介に色素レーザーを照射して４日後の、それぞれ、照射部位１、照射部位２、照射部位３及び照射部位４の耳介皮膚外表写真である。図１－Ｂ、図２－Ｂ、図３－Ｂ及び図４－Ｂは、ＣＯＨｂ－Ｖを投与したウサギ耳介に色素レーザーを照射して４日後の、それぞれ、照射部位１、照射部位２、照射部位３及び照射部位４の耳介皮膚外表写真である。図の黒いリングは、耳介皮膚にフェルトペンで書き込んだ照射範囲の目印である。図の白いリングは、撮影した写真の照射部位の中心の血管の位置を示すために写真に張り付けた。図１－Ｂ、図２－Ｂ、図３－Ｂ及び図４－Ｂの矢印は、照射により狭窄又は閉塞が認められた血管の位置を示す。

【0118】

図１－Ａ、図２－Ａ、図３－Ａ及び図４－Ａを対比すると、照射部位１から照射部位４への順に皮膚の紫斑・発赤の程度が弱くなる傾向が認められた。図１－Ｂ、図２－Ｂ、図３－Ｂ及び図４－Ｂの対比でも同様の傾向が認められた。しかし、同じ照射部位どうし、すなわち、図１－Ａ対図１－Ｂ、図２－Ａ対図２－Ｂ、図３－Ａ対図３－Ｂ、及び、図４－Ａ対図４－Ｂを対比すると、ＣＯＨｂ－Ｖを投与したウサギ（図１－Ｂ、図２－Ｂ、図３－Ｂ及び図４－Ｂ）のほうが、Ｈｂ－Ｖを投与したウサギ（図１－Ａ、図２－Ａ、図３－Ａ及び図４－Ａ）よりも皮膚の紫斑・発赤の程度が弱かったが、血管は細くなり、図１－Ｂ、図２－Ｂ、図３－Ｂ及び図４－Ｂの矢印で示すとおり、血管の狭窄又は閉塞が認められた。

【0119】

本試験成績の照射部位の耳介皮膚外表所見は、血管への効果はより高いが血管周囲組織への副作用はより少ないという本発明の光増感剤の効果を裏付けている。

【0120】

ＣＯＨｂから解離されるＣＯガスが血管を拡張したり抗炎症作用を示すことは知られている。しかし本発明の光増感剤に含まれるＣＯＨｂの光解離の量子収率は０．５～１と極めて高く、レーザー光も極めて強いので、本発明の光増感剤を用いるレーザー照射療法では、照射部位の血管内のＣＯＨｂに結合していたＣＯのほぼ全てが同時に解離すると考えられる。その結果、照射部位に局所的に極めて高い濃度のＣＯが発生し、血管拡張作用及び血管周囲組織での抗炎症作用が増強されたため、血管壁の損傷効果は大きいが、照射部位の皮膚への副作用は抑制された。以上のとおり本明細書の実施例は、本発明の光増感剤が血管を治療標的とするレーザー照射療法の治療効果を増強することを証明した。

【産業上の利用可能性】

【0121】

本発明によれば、照射部位に局所的に極めて高い濃度のＣＯを発生させることにより、血管を拡張できるとともに血管周囲組織での抗炎症作用を増強できるため、血管を治療標的とするレーザー照射療法の治療効果を増強することができる。したがって、本発明は血管を治療標的とするレーザー照射療法を用いる臨床医学の治療手段として極めて有用である。

【図1-A】

【図1-B】

【図2-A】

【図2-B】

【図3-A】

【図3-B】

【図4-A】

【図4-B】