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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-27
(45)【発行日】2024-12-05
(54)【発明の名称】肝細胞の長期間培養のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/02 20060101AFI20241128BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20241128BHJP
【ＦＩ】
C12N5/02
C12N5/071
【請求項の数】
24
(21)【出願番号】P 2021549702
(86)(22)【出願日】2019-02-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-12
(86)【国際出願番号】 CN2019076151
(87)【国際公開番号】W WO2020172792
(87)【国際公開日】2020-09-03
【審査請求日】2021-10-21
(73)【特許権者】
【識別番号】507232478
【氏名又は名称】北京大学
【氏名又は名称原語表記】ＰＥＫＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５， Ｙｉｈｅｙｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８７１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】デン，ホンクイ
(72)【発明者】
【氏名】シャン，チェンガン
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ，ユアンユアン
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１４８２１６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特許第６９６８３４７（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１９８２５４（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００ － ５／２８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アデニル酸シクラーゼの活性化剤、ＴＧＦβ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、及びＢＭＰ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、少なくとも２週間の長期間、インビトロで機能性肝細胞の機能を維持するための、補充された肝細胞培養組成物であって、該補充された肝細胞培養組成物中で少なくとも２週間のインビトロでの肝細胞培養の後に、アデニル酸シクラーゼの活性化剤及びＴＧＦβ阻害剤を含まない、補充されていない培養組成物中で培養した肝細胞と比較して、少なくとも１つの肝細胞マーカーの発現の増加として測定される、インビトロで長期間の機能性肝細胞機能を維持するのに有効な量で前記因子を含む、補充された肝細胞培養組成物であって、アデニル酸シクラーゼの活性化剤及びＴＧＦβ阻害剤の組み合わせを含む、補充された肝細胞培養組成物。
【請求項2】
少なくとも、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤を更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項3】
前記肝細胞が、ヒト肝細胞又は誘導性肝細胞（ｉＨｅｐ）である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項4】
少なくとも、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤の組み合わせ（「５Ｃ」）を含む、請求項１～３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項5】
アデニル酸シクラーゼの活性化剤がフォルスコリンである、請求項１～４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項6】
ＴＧＦβ阻害剤がＳＢ４３１５４２（ＳＢ４３）である、請求項１～４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項7】
Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項１～４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項8】
Ｗｎｔ阻害剤がＩＷＰ２である、請求項１～４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項9】
ＢＭＰ阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である、請求項１～４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項10】
肝細胞機能性タンパク質が、アルブミン（ＡＬＢ）、ＣＰＳ１、ＡＲＧ、ＮＡＧＳ、ＰＸＲ、ＣＡＲ、ＡＰＯＡ２、ＡＰＯＢ、Ｆ２、Ｆ１０、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＮＴＣＰ、ＰＸＲ、ＣＡＲ及びＵＧＴ２Ｂ７からなる群より選択される、請求項１～９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項11】
肝細胞が、少なくとも６０日間の培養後に、同一の生物由来の単離したばかりの初代肝細胞（Ｆ－ＰＨＨ）と同一のレベルで、少なくとも６つの肝細胞機能性タンパク質を発現する、請求項１～１０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項12】
肝細胞が、少なくとも９０日間の培養後に、同一の生物由来のＦ－ＰＨＨと同一のレベルで、少なくとも６つの肝細胞機能性タンパク質を発現する、請求項１～１０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項13】
請求項１～９のいずれか一項記載の組成物を用いることによって、少なくとも２週間の長期間、機能性肝細胞をインビトロ培養するための方法。
【請求項14】
肝細胞が、少なくとも２週間のインビトロでの培養後に、肝細胞形態（多角形形状）、アルブミン分泌及び尿素合成などの確立された肝細胞機能、及び少なくとも１つの既知の肝細胞マーカーの発現からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項15】
肝細胞が、３～８週間の培養後に、少なくとも１つの特徴を有する、請求項１４記載の方法。
【請求項16】
少なくとも１つの肝細胞マーカーが、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）３Ａ４；ＣＹＰ１Ａ２；ＣＹＰ２Ｃ９；ＣＹＰ２Ｄ６；ＣＹＰ２Ｂ６；ＣＹＰ２Ｃ１９；ＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）１Ａ３；ＵＧＴ１Ａ４；ＵＧＴ２Ｂ１５；ＵＧＴ２Ｂ７、ＮＴＣＰ（Ｎａ＋－タウロコール酸共輸送ポリペプチド）；ＡＢＣＧ２（ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーＧメンバー２）；ＭＲＰ２（多剤耐性関連タンパク質２）；及び有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）１Ｂ１からなる群より選択される、請求項１３～１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項17】
肝細胞が、同一の生物由来の単離したばかりの肝細胞によって発現されるレベルと比較した場合、同等の（統計的有意差なしとして測定される）又はそれ以上のレベルで、列挙された少なくとも１つの肝細胞マーカーを発現する、請求項１３～１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項18】
前記肝細胞が、９０日間の培養で、同一の生物から得た単離したばかりの肝細胞と同等の（統計的有意差なしとして測定される）レベルで、次の肝細胞マーカー：ＡＰＯＡ２、ＡＰＯＢ、Ｆ２、Ｆ１０、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９及びＵＴＧ２Ｂ７の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つを発現する、請求項１３～１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項19】
前記肝細胞が、２週間の培養後に、Ｆ－ＰＨＨのレベルと同等の（統計的有意差なしとして測定される）レベルで、代謝的に活性なＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｂ６を発現する、請求項１３～１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項20】
請求項１～９のいずれか一項記載の組成物を用いることによって、少なくとも２週間の長期間、機能性肝細胞をインビトロで培養すること、寄生体感染に有効な時間、前記培養された機能性肝細胞に肝寄生体を接種すること、及び
肝細胞培養（ＨＣ）用の補充された肝基礎培地において、前記寄生体に感染した細胞をインビトロで培養すること
を含む、インビトロ肝寄生体感染モデルを生産する方法。
【請求項21】
請求項２０記載の方法であって、寄生体が肝炎ウイルスであり、方法が、ウイルス感染に有効な時間、請求項１３記載の方法によって培養された肝細胞に肝炎ウイルスを接種すること、及び肝細胞培養（ＨＣ）用の補充された肝基礎培地において、前記ウイルスに感染した細胞をインビトロで培養することを含む、方法。
【請求項22】
肝炎ウイルスが、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎又はＣ型肝炎である、請求項２１記載の方法。
【請求項23】
インビトロでの４週間の培養で、ＨＢＶの共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項24】
寄生体が、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、及び四日熱マラリア原虫（P. malariae）からなる群より選択されるマラリア寄生虫である、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は一般に、肝細胞の長期間維持及び肝細胞の機能的成熟に関する。
【背景技術】
【0002】
最終的に分化した細胞は、インビボで機能的に安定であり、微小環境シグナルによる正確な時空間的調節に高度に依存している状態である。一旦単離されると、細胞は、微小環境の変化を受け、機能的な退行をもたらす。インビトロで最終的に分化した細胞の長期間維持は、困難であることが証明されている。一旦単離されると、これらの細胞は一般的にその特異的機能を失う（Haenseler et al., Stem Cell Reports 8, 1727-1742 (2017); Louch, et al., J Mol Cell Cardiol 51, 288-298 (2011); Ootani et al., Nat Med 15, 701-706 (2009); Shulman, et al., Methods Mol Biol 945, 287-302 (2013)）。特に、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の長期間維持の失敗は、世界的に流行している疾患である、ＨＢＶ感染などの肝指向性感染のモデル化におけるそれらの適用を制限する（Zhong, et al., Clin. Chim. Acta: 412:1905-1911 (2011)）。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の機能的な受容体である、Ｎａ＋－タウロコール酸共輸送ペプチド（ＮＴＣＰ）の同定などの進歩は、ＨＢＶ感染を研究するための肝細胞がん細胞株の確立を可能にした（Yan, et al., eLife 1, (2012)）。しかしながら、経時的なＨＢＶライフサイクル、特にｃｃｃＤＮＡの持続性を調査する研究は、依然として困難なままである（Liang et al., Hepatology 62, 1893-1908 (2015)）。ＰＨＨは、デノボヒトＨＢＶ感染と非常に類似した感染特性を共有し、ＨＢＶモデル化に理想的であると考えられてきたが、それらの長期間の有用性は、インビトロでの限られた生存能及び不安定な機能維持によって制限される（Lu, et al., International journal of medical sciences 1, 21-33 (2004); Xia et al., J Hepatol 66, 494-503 (2017); Elaut et al., Curr Drug Metab 7, 629-660 (2006)）。従って、真正ヒト肝細胞の機能維持のための培養条件の確立は、ＨＢＶ研究に有益でありうる。
【0003】
更に、最終的に分化した細胞の機能を安定化するための効率的な培養条件の欠如は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化及び直接系統リプログラミングによる機能的な成熟細胞の生成も制限した。ｈＰＳＣは、大量の様々なヒト細胞型を生成するための理想的な潜在的細胞源と考えられているが、ほとんどのｈＰＳＣ由来の細胞は、現在のプロトコル（Hrvatin, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (8) 3038-3043 (2014)Takayama, et al., Drug Metab Pharmacokinet 32(1): 12-20 (2017)）により生成した場合、未成熟な表現型を示した。ｈＰＳＣ由来の細胞の機能的な未熟性の主要な理由の１つは、その最終分化段階の取得を可能にする、利用可能な培養条件の欠如である。従って、最終的に分化した細胞の機能性の維持を支持する培養条件の同定は、それらのインビトロでの適用と生成の両方に利益をもたらす可能性がある。
【0004】
ヒト肝細胞を含む、分化した細胞型の長期間の、機能的維持に対する解決策を提供する細胞培養法が依然として必要である。
【0005】
本発明の目的は、機能的に分化した細胞をインビトロで長期間培養するための方法を提供することである。
【0006】
また、本発明の目的は、機能的に分化した細胞をインビトロで長期間維持するための組成物を提供することである。
【0007】
また、本発明の目的は、インビトロで改善された機能の維持を伴った分化した細胞を提供することである。
【発明の概要】
【0008】
培養における機能性肝細胞を長期間維持するための組成物、インビトロで機能性肝細胞を維持するための改善された方法、及び本明細書に開示された方法による機能性肝細胞培養物が提供される。
。
。
【0009】
前記組成物は、少なくともアデニル酸シクラーゼの活性化剤、ＴＧＦβ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、及び／又はＢＭＰ阻害剤を含む。いくつかの好ましい実施態様では前記組成物は、アデニル酸シクラーゼの活性化剤、及びＴＧＦβ阻害剤の組み合わせを含む。特に好ましい実施態様では、前記組成物は、少なくとも、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤の組み合わせ（本明細書では、「５Ｃ」）を含む。アデニル酸シクラーゼの活性化剤の最も好ましい活性化剤はフォルスコリン（ＦＳＫ）であり；好ましいＴＧＦβ阻害剤はＳＢ４３１５４２（ＳＢ４３）であり；好ましいＮｏｔｃｈ阻害剤はＤＡＰＴであり；好ましいＷｎｔ阻害剤はＩＷＰ２であり、そして好ましいＢＭＰ阻害剤はＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ）である。前記化合物の組み合わせを、インビトロで長期間、機能的な肝細胞機能を維持するための有効量で、任意の肝細胞培養培地に加える。
【0010】
前記組成物は、インビトロでの機能性肝細胞の維持を改善するために使用される。
【0011】
また、本明細書に開示された方法により得られる肝細胞（「本明細書では、５Ｃ肝細胞」）も提供される。本明細書に開示された方法により培養した場合、前記肝細胞は、インビトロでの肝細胞機能の改善された維持を示す。好ましい実施態様では、前記５Ｃ肝細胞は、少なくとも６０日間の培養後に、同一の生物から単離したばかりの初代肝細胞と同一のレベルで、少なくとも６つの肝細胞機能性タンパク質を発現する。特に好ましい実施態様では、５Ｃ肝細胞は、少なくとも９０日間の培養後に、同一の生物から単離したばかりの初代肝細胞と同一のレベルで、少なくとも６つの肝細胞機能性タンパク質を発現する。特に好ましい実施態様では、例示的な肝細胞機能性タンパク質は、アルブミン（ＡＬＢ）、ＡＰＯＡ２、ＡＰＯＢ、Ｆ２、Ｆ１０、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９及びＵＧＴ２Ｂ７を含む。
【0012】
培養における機能性肝細胞の長期間維持のためのキットが提供される。前記キットは、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤（本明細書では、「５Ｃ」）を含む。アデニル酸シクラーゼ活性化剤の最も好ましい活性化剤はフォルスコリンであり；好ましいＴＧＦβ阻害剤はＳＢ４３であり；好ましいＮｏｔｃｈ阻害剤はＤＡＰＴであり；好ましいＷｎｔ阻害剤はＩＷＰ２であり、そして好ましいＢＭＰ阻害剤はＬＤＮである。
【0013】
また、機能性分化細胞、例えば肝細胞のインビトロでの維持を改善する薬剤を特定するための方法が提供される。前記方法は、単離したばかりの初代肝細胞と２４時間だけ培養した肝細胞との全体的な遺伝子発現プロファイルを比較し、そして肝細胞の運命のパターン化、分化及びリプログラミングに関与する小分子標的をスクリーニングすることを含む。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】図１は、ＨＣＭ中で２４時間培養した肝細胞（２４時間培養した肝細胞）及び単離したばかりの肝細胞（Ｆ－ＰＨＨ）における、ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）により分析した、機能マーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。
【図2A】図２Ａ及び２Ｂは、インビトロでＰＨＨ維持を部分的に支持する因子としてのＴＧＦ－β阻害剤（ＳＢ４３１５４２）の同定を示す。図２Ａは、ＨＣＭ中で２４時間培養した肝細胞（２４時間培養した肝細胞）及び単離したばかりの肝細胞（Ｆ－ＰＨＨ）中で、ＴＧＦβシグナル伝達経路において富化された遺伝子がＲＮＡシーケンスにより検出されたことを示す。
【図2B】図２Ｂは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって検出された、異なる条件下で培養したＰＨＨにおける間葉系マーカー遺伝子及び肝細胞機能遺伝子の遺伝子発現を示す。ｎ＝２。相対的な遺伝子発現は、Ｆ－ＰＨＨに対して正規化した。
【図3A】図３Ａ及び３Ｂは、インビトロで、ｃＡＭＰ活性化剤のフォルスコリンが、ＰＨＨ培養に対して有利であると同定したことを示す。ＥＭＴマスター遺伝子の発現を効果的に阻害し、重要な肝細胞遺伝子の発現を維持する候補のための小分子プールのスクリーニング。培養１４日目にｑＲＴ－ＰＣＲ分析を実施した；Ｆ－ＰＨＨを陽性対照として用いた。相対的な遺伝子発現はヌル（Null）に対して正規化した。ｎ＝２。
【図3B】図３Ａ及び３Ｂは、インビトロで、ｃＡＭＰ活性化剤のフォルスコリンが、ＰＨＨ培養に対して有利であると同定したことを示す。ＥＭＴマスター遺伝子の発現を効果的に阻害し、重要な肝細胞遺伝子の発現を維持する候補のための小分子プールのスクリーニング。培養１４日目にｑＲＴ－ＰＣＲ分析を実施した；Ｆ－ＰＨＨを陽性対照として用いた。相対的な遺伝子発現はヌル（Null）に対して正規化した。ｎ＝２。
【図4B】図４Ｂは、間葉マーカー遺伝子及び肝細胞機能遺伝子発現の調節中に、ＳＢ４３とＦＳＫ（２Ｃと称される）との間の相乗効果が、ＲＴ－ｑＰＣＲによる検出により観察されたことを示す。相対的な遺伝子発現は、Ｆ－ＰＨＨに対して正規化される。
【図4F】図４Ｆは、ＬＣ／ＭＳにより測定した異なる条件下で培養したＰＨＨにおけるＣＹＰ酵素の薬物代謝活性を示す。テストステロン（ＣＹＰ３Ａ４－Ｔ）及びミダゾラム（ＣＹＰ３Ａ４－Ｍ）を用いてＣＹＰ３Ａ４の比活性を測定した。結果は百万細胞あたりのpmol／分で示す。ｎ＝３。
【図4G】図４Ｇ～Ｉは、ｑＲＴ－ＰＣＲ（図４Ｇ）及びＬＣ／ＭＳ（図４Ｈ）によって検出された２Ｃ－ＰＨＨにおけるＣＹＰ４５０活性の誘導を示す。Ｒｉｆは、リファンピン；ＰＢは、フェノバルビタール；ＥＴＯＨは、エタノール；βＮＦは、β－ナフトフラボン。ｎ≧２。（図４Ｉ）２Ｃ－ＰＨＨにおけるＣＹＰ４５０活性の阻害を、２Ｃで培養した肝細胞においてＬＣ／ＭＳにより検出した。ｎ＝３。ＫＣは、ケトコナゾール；ＳＸは、スルファフェナゾール；ＡＮＦは、α－ナフトフラボン。
【図4H】図４Ｇ～Ｉは、ｑＲＴ－ＰＣＲ（図４Ｇ）及びＬＣ／ＭＳ（図４Ｈ）によって検出された２Ｃ－ＰＨＨにおけるＣＹＰ４５０活性の誘導を示す。Ｒｉｆは、リファンピン；ＰＢは、フェノバルビタール；ＥＴＯＨは、エタノール；βＮＦは、β－ナフトフラボン。ｎ≧２。（図４Ｉ）２Ｃ－ＰＨＨにおけるＣＹＰ４５０活性の阻害を、２Ｃで培養した肝細胞においてＬＣ／ＭＳにより検出した。ｎ＝３。ＫＣは、ケトコナゾール；ＳＸは、スルファフェナゾール；ＡＮＦは、α－ナフトフラボン。
【図4I】図４Ｇ～Ｉは、ｑＲＴ－ＰＣＲ（図４Ｇ）及びＬＣ／ＭＳ（図４Ｈ）によって検出された２Ｃ－ＰＨＨにおけるＣＹＰ４５０活性の誘導を示す。Ｒｉｆは、リファンピン；ＰＢは、フェノバルビタール；ＥＴＯＨは、エタノール；βＮＦは、β－ナフトフラボン。ｎ≧２。（図４Ｉ）２Ｃ－ＰＨＨにおけるＣＹＰ４５０活性の阻害を、２Ｃで培養した肝細胞においてＬＣ／ＭＳにより検出した。ｎ＝３。ＫＣは、ケトコナゾール；ＳＸは、スルファフェナゾール；ＡＮＦは、α－ナフトフラボン。
【図4K】図４Ｋは、ｑＲＴ－ＰＣＲにより検出した、２Ｃ条件で１４日間及び／又は３０日間培養したＰＨＨにおける主要なＣＹＰ酵素の発現を示す。ウィリアムズ培地Ｅ（ＷＭＥ）及びＨＣＭの２つの基礎培地を適用した。相対的な遺伝子発現は、Ｆ－ＰＨＨに対して正規化する。
【図5B】図５Ｂは、ＳＢ４３及びＦＳＫと単独で併用した場合の、ＥＭＴ遺伝子発現（抑制する）又は肝機能遺伝子発現（増加する）に対するＤＡＰＴ、ＬＤＮ１９３１８９及びＩＷＰ２の効果を示す。相対的な遺伝子発現は、ＤＭＳＯに対して正規化した。ｎ＝２。
【図5C】図５Ｃは、ＳＢ４３及びＦＳＫと併用した場合、培養したＰＨＨにおける間葉系マーカー遺伝子ＣＯＬ１Ａ１の発現を減少させる、３つの追加した小分子（ＩＷＰ２、ＤＡＰＴ及びＬＤＮ１９３１８９）の効果を示す。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を１４日目に実施した。相対的な遺伝子発現は、ＦＳＫ＋ＳＢ４３に対して正規化した。ｎ＝３。
【図5D】図５Ｄは、ＥＭＴマーカーを抑制する上で、ＩＷＰ２、ＤＡＰＴ、及びＬＤＮ１９３１８９を、同一のシグナル伝達経路を標的とする小分子又はサイトカインで置換する効果を示す。相対的な遺伝子発現は、ＦＳＫ＋ＳＢ４３に対して正規化した。ｎ＝３。
【図5E】図５Ｅは、単一の小分子を含まないアッセイによるＰＨＨの維持に対する５Ｃのそれぞれの小分子の効果を示す。肝転写因子と機能遺伝子の発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより検出した。相対的な遺伝子発現は５Ｃに対して正規化した。ｎ＝２。
【図6A】図６Ａは、肝細胞培養培地（ヌル）及び５Ｃ培養条件（５Ｃ）において２週間培養した、Ｃｒｙｏ－ＰＨＨの間葉系マーカー遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。ＤＭＳＯをビヒクル対照として用いた。ｎ＝３。同様の結果が３つの独立したバッチで得られた。
【図6B】図６Ｂ及び６Ｃは、５Ｃ及び対照条件下に維持された、アジア人のドナー由来の単離したばかりのＰＨＨ（図６Ｂ）及び白色人種のドナー由来の復元した凍結保存ＰＨＨ（図６Ｃ）のヒトアルブミン分泌及び尿素合成の時間経過分析を示す。ｎ＝３。
【図6C】図６Ｂ及び６Ｃは、５Ｃ及び対照条件下に維持された、アジア人のドナー由来の単離したばかりのＰＨＨ（図６Ｂ）及び白色人種のドナー由来の復元した凍結保存ＰＨＨ（図６Ｃ）のヒトアルブミン分泌及び尿素合成の時間経過分析を示す。ｎ＝３。
【図6D】図６Ｄ及び６Ｅは、２ヶ月以上５Ｃを用いてＰＨＨを維持した研究を示す。図６Ｄは、５Ｃの条件下で培養したＰＨＨの６０日間のアルブミン分泌及び尿素合成アッセイを示す。ｎ＝３。同様の結果が２つの独立したバッチで得られた。
【図7】図７は、異なる条件下で培養したＰＨＨ、多能性幹細胞に由来する肝細胞（ｈｉＰＳＣ－Ｈｅｐ＿ｒｅｐ１／２／３／４）、単離したばかりのヒト肝細胞（ＰＨＨ０ｄ）及び成体肝組織の全体的な遺伝子発現プロファイルを比較するための階層クラスタリングを示す。ＰＨＨの３つの独立したバッチを適用し、対応する成体肝組織を陽性対照として用いた。ＰＨＨ０ｄ及びｈｉＰＳＣ－Ｈｅｐ＿ｒｅｐ１／２／３／４の発現プロファイルは、Gao et al., Stem Cell Reports 9, 1813-1824 (2017)から得たＲＮＡシーケンスデータであった。
【図8A】図８Ａは、ｑＲＴ－ＰＣＲによる、サンドイッチ培養下で維持された５Ｃ－ＰＨＨ及びＰＨＨにおける肝代理機能マーカー及び間葉系マーカーの遺伝子発現分析を示す。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は１５日目に実施した。相対的な発現レベルは、Ｆ－ＰＨＨに対して正規化した。ｎ＝２。
【図8D】図８Ｄは、４週間の培養後の５Ｃ－ＰＨＨにおける主要な第II相酵素及び第III相輸送体のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。相対的な発現レベルは、Ｆ－ＰＨＨに対して正規化した。ｎ＝２。同様な結果が、少なくとも３つの独立したバッチで得られた。
【図8E】図８Ｅは、異なる条件下でのＣｒｙｏ－ＰＨＨにおけるｑＲＴ－ＰＣＲによる薬物代謝関連遺伝子の動的な遺伝子発現分析を示す。再生した凍結保存ＰＨＨは、対照条件（ヌル及びＤＭＳＯ）での１週間の培養後に重度の細胞死を示したため、１０日目以降のデータは提示しない。相対的な遺伝子発現は、Ｃｒｙｏ－ＰＨＨに対して正規化した。ｎ＝２。
【図8F】図８Ｆは、２週間の培養後にＬＣ－ＭＳにより、５つのコアＣＹＰ４５０酵素の薬物代謝活性としてインビトロで測定された、培養ヒト肝細胞の薬物代謝活性に及ぼす５Ｃの効果を示す。ｎ＝３。検出されなかったデータは「ｎ．ｄ」とラベル付けした。
【図9H】図９Ｈは、感染した５Ｃ－ＰＨＨにおけるＨＢＶｃｃｃＤＮＡのサザンブロット分析である。ＨＢＶ ＤＮＡはコアＤＮＡ抽出法（レーン１と４）及び改良したＨｉｒｔＤＮＡ抽出法（レーン２、３、５、及び６）により抽出した。ｃｃｃＤＮＡの同一性を確認するために、無処理（レーン２及び５）及びＳｐｅＩ消化（レーン３及び６）で５Ｃ－ＰＨＨから抽出したＨｉｒｔＤＮＡ調製物をアガロースゲルで分離した。Ｄｐｉは、感染後の日数。
【図10A】図１０Ａ－Ｂは、感染多重度（ＭＯＩ）が低下した５Ｃ－ＰＨＨのＨＢＶ感染を示す。ＨＢＶ感染は、分泌したＨＢＶ抗原（ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ）（図１０Ａ）及び細胞内のＨＢＶ転写産物（図１０Ｂ）により検出した。ｎ＝３。
【図10B】図１０Ａ－Ｂは、感染多重度（ＭＯＩ）が低下した５Ｃ－ＰＨＨのＨＢＶ感染を示す。ＨＢＶ感染は、分泌したＨＢＶ抗原（ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ）（図１０Ａ）及び細胞内のＨＢＶ転写産物（図１０Ｂ）により検出した。ｎ＝３。
【図11B】図１１Ｂ～Ｄは、ＨｅｐＡＤ３８から生成したＨＢＶ粒子を用いて感染させた５Ｃ－ＰＨＨの効果を示す。（図１１Ｂ）５Ｃ－ＰＨＨの上清におけるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの時間経過分析。ｎ＝３。（図１１Ｃ）ＨＢＶ ＲＮＡ、（図１１Ｄ）細胞内のＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡを７ｄｐｉ及び１８ｄｐｉで検出した。ｎ＝３。同様の結果が、少なくとも３つの独立したバッチにおいて得られた。
【図11C】図１１Ｂ～Ｄは、ＨｅｐＡＤ３８から生成したＨＢＶ粒子を用いて感染させた５Ｃ－ＰＨＨの効果を示す。（図１１Ｂ）５Ｃ－ＰＨＨの上清におけるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの時間経過分析。ｎ＝３。（図１１Ｃ）ＨＢＶ ＲＮＡ、（図１１Ｄ）細胞内のＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡを７ｄｐｉ及び１８ｄｐｉで検出した。ｎ＝３。同様の結果が、少なくとも３つの独立したバッチにおいて得られた。
【図11D】図１１Ｂ～Ｄは、ＨｅｐＡＤ３８から生成したＨＢＶ粒子を用いて感染させた５Ｃ－ＰＨＨの効果を示す。（図１１Ｂ）５Ｃ－ＰＨＨの上清におけるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの時間経過分析。ｎ＝３。（図１１Ｃ）ＨＢＶ ＲＮＡ、（図１１Ｄ）細胞内のＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡを７ｄｐｉ及び１８ｄｐｉで検出した。ｎ＝３。同様の結果が、少なくとも３つの独立したバッチにおいて得られた。
【図11E】図１１Ｅ～Ｆは、５Ｃ－ＰＨＨにおけるＨＢＶ拡散を中和抗体（抗Ｓ抗体）が遮断することを示す。（図１１Ｅ）様々なＭＯＩにおいて感染した５Ｃ－ＰＨＨのＨＢｅＡｇの時間経過分析。中和抗体（抗Ｓ抗体）を１Ｄｐｉから加えた。ｎ＝３。（図１１Ｆ）Ｄｐｉ２８でのＨＢｃＡｇ陽性細胞の定量。ｎ＝３。
【図11F】図１１Ｅ～Ｆは、５Ｃ－ＰＨＨにおけるＨＢＶ拡散を中和抗体（抗Ｓ抗体）が遮断することを示す。（図１１Ｅ）様々なＭＯＩにおいて感染した５Ｃ－ＰＨＨのＨＢｅＡｇの時間経過分析。中和抗体（抗Ｓ抗体）を１Ｄｐｉから加えた。ｎ＝３。（図１１Ｆ）Ｄｐｉ２８でのＨＢｃＡｇ陽性細胞の定量。ｎ＝３。
【図12A】図１２Ａ～Ｄは、ＨＢＶに感染した５Ｃ－ＰＨＨの抗ＨＢＶ薬に対する反応を示す。図１２Ａ～Ｄは、感染した５Ｃ－ＰＨＨにおける、ＨＢＶ抗原（ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ）（図１２Ａ）、ＨＢＶ ＲＮＡ（１６Ｄｐｉで検出）（図１２Ｂ）、ＨＢＶ ＤＮＡ（２１Ｄｐｉで検出）（図１２Ｃ）及びＨＢＶｃｃｃＤＮＡ（３４Ｄｐｉで検出）（図１２Ｄ）に対する抗ＨＢＶ薬（ＥＴＶ、ＬＡＭ、ＩＦＮ－α）の効果を示す。
【図12B】図１２Ａ～Ｄは、ＨＢＶに感染した５Ｃ－ＰＨＨの抗ＨＢＶ薬に対する反応を示す。図１２Ａ～Ｄは、感染した５Ｃ－ＰＨＨにおける、ＨＢＶ抗原（ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ）（図１２Ａ）、ＨＢＶ ＲＮＡ（１６Ｄｐｉで検出）（図１２Ｂ）、ＨＢＶ ＤＮＡ（２１Ｄｐｉで検出）（図１２Ｃ）及びＨＢＶｃｃｃＤＮＡ（３４Ｄｐｉで検出）（図１２Ｄ）に対する抗ＨＢＶ薬（ＥＴＶ、ＬＡＭ、ＩＦＮ－α）の効果を示す。
【図12C】図１２Ａ～Ｄは、ＨＢＶに感染した５Ｃ－ＰＨＨの抗ＨＢＶ薬に対する反応を示す。図１２Ａ～Ｄは、感染した５Ｃ－ＰＨＨにおける、ＨＢＶ抗原（ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ）（図１２Ａ）、ＨＢＶ ＲＮＡ（１６Ｄｐｉで検出）（図１２Ｂ）、ＨＢＶ ＤＮＡ（２１Ｄｐｉで検出）（図１２Ｃ）及びＨＢＶｃｃｃＤＮＡ（３４Ｄｐｉで検出）（図１２Ｄ）に対する抗ＨＢＶ薬（ＥＴＶ、ＬＡＭ、ＩＦＮ－α）の効果を示す。
【図12D】図１２Ａ～Ｄは、ＨＢＶに感染した５Ｃ－ＰＨＨの抗ＨＢＶ薬に対する反応を示す。図１２Ａ～Ｄは、感染した５Ｃ－ＰＨＨにおける、ＨＢＶ抗原（ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ）（図１２Ａ）、ＨＢＶ ＲＮＡ（１６Ｄｐｉで検出）（図１２Ｂ）、ＨＢＶ ＤＮＡ（２１Ｄｐｉで検出）（図１２Ｃ）及びＨＢＶｃｃｃＤＮＡ（３４Ｄｐｉで検出）（図１２Ｄ）に対する抗ＨＢＶ薬（ＥＴＶ、ＬＡＭ、ＩＦＮ－α）の効果を示す。
【図13B】図１３Ｂ～Ｄは、長期間の肝細胞維持及びＨＢＶ許容性に関する、５Ｃと、他に報告されている３つのＰＨＨ培養条件との比較である。条件１、Ｃ１（Winer et al., Nat Comm. 8:125 (2017)）；条件２、Ｃ２（Lucifora, et al., Science, 343:1221-28 (2014)）及び条件３、Ｃ３（Xia, et al., J. Hepatol., 66:494-503 (2017)）。（図１３Ｂ）異なる培養条件下で培養したＰＨＨの肝機能遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。ｎ＝３。（図１３Ｃ）異なる培養条件下で培養したＰＨＨのヒトアルブミン分泌及び尿素合成の時間経過分析。ｎ＝３。（図１３Ｄ）ＨＢｅＡｇの時間経過分析。ＰＨＨは、Ｂ型肝炎患者由来の血漿を用いて感染させ、更に異なる条件下で長期間培養した。ｎ＝３。同様の結果が、３つの独立したバッチで得られた。
【図13C】図１３Ｂ～Ｄは、長期間の肝細胞維持及びＨＢＶ許容性に関する、５Ｃと、他に報告されている３つのＰＨＨ培養条件との比較である。条件１、Ｃ１（Winer et al., Nat Comm. 8:125 (2017)）；条件２、Ｃ２（Lucifora, et al., Science, 343:1221-28 (2014)）及び条件３、Ｃ３（Xia, et al., J. Hepatol., 66:494-503 (2017)）。（図１３Ｂ）異なる培養条件下で培養したＰＨＨの肝機能遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。ｎ＝３。（図１３Ｃ）異なる培養条件下で培養したＰＨＨのヒトアルブミン分泌及び尿素合成の時間経過分析。ｎ＝３。（図１３Ｄ）ＨＢｅＡｇの時間経過分析。ＰＨＨは、Ｂ型肝炎患者由来の血漿を用いて感染させ、更に異なる条件下で長期間培養した。ｎ＝３。同様の結果が、３つの独立したバッチで得られた。
【図13D】図１３Ｂ～Ｄは、長期間の肝細胞維持及びＨＢＶ許容性に関する、５Ｃと、他に報告されている３つのＰＨＨ培養条件との比較である。条件１、Ｃ１（Winer et al., Nat Comm. 8:125 (2017)）；条件２、Ｃ２（Lucifora, et al., Science, 343:1221-28 (2014)）及び条件３、Ｃ３（Xia, et al., J. Hepatol., 66:494-503 (2017)）。（図１３Ｂ）異なる培養条件下で培養したＰＨＨの肝機能遺伝子発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。ｎ＝３。（図１３Ｃ）異なる培養条件下で培養したＰＨＨのヒトアルブミン分泌及び尿素合成の時間経過分析。ｎ＝３。（図１３Ｄ）ＨＢｅＡｇの時間経過分析。ＰＨＨは、Ｂ型肝炎患者由来の血漿を用いて感染させ、更に異なる条件下で長期間培養した。ｎ＝３。同様の結果が、３つの独立したバッチで得られた。
【図14A】図１４Ａ～Ｃは、様々なプレーティングフォーマットに対する５Ｃの培養条件の適用を示す。ＰＨＨをマイクロウェルプレート（９６ウェルプレート及び３８４ウェルプレート）にプレーティングし、更に５Ｃで培養した。（図１４Ａ）２週間の培養後、ＥＭＴマーカー及び肝機能遺伝子を分析した。（図１４Ｂ）培養の７及び１４日後に、ＡＬＢ分泌及び尿素合成を検出した。（図１４Ｃ）マイクロウェルプレートにおいてＨＢＶ感染を実施し、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを分析した。ｎ＝３。同様の結果が、２つの独立したバッチで得られた。
【図14B】図１４Ａ～Ｃは、様々なプレーティングフォーマットに対する５Ｃの培養条件の適用を示す。ＰＨＨをマイクロウェルプレート（９６ウェルプレート及び３８４ウェルプレート）にプレーティングし、更に５Ｃで培養した。（図１４Ａ）２週間の培養後、ＥＭＴマーカー及び肝機能遺伝子を分析した。（図１４Ｂ）培養の７及び１４日後に、ＡＬＢ分泌及び尿素合成を検出した。（図１４Ｃ）マイクロウェルプレートにおいてＨＢＶ感染を実施し、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを分析した。ｎ＝３。同様の結果が、２つの独立したバッチで得られた。
【図14C】図１４Ａ～Ｃは、様々なプレーティングフォーマットに対する５Ｃの培養条件の適用を示す。ＰＨＨをマイクロウェルプレート（９６ウェルプレート及び３８４ウェルプレート）にプレーティングし、更に５Ｃで培養した。（図１４Ａ）２週間の培養後、ＥＭＴマーカー及び肝機能遺伝子を分析した。（図１４Ｂ）培養の７及び１４日後に、ＡＬＢ分泌及び尿素合成を検出した。（図１４Ｃ）マイクロウェルプレートにおいてＨＢＶ感染を実施し、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを分析した。ｎ＝３。同様の結果が、２つの独立したバッチで得られた。
【図15A】図１５Ａ～Ｃは、Ｃｒｙｏ－ＰＨＨにおけるＨＣＶ感染に対する５Ｃの効果を示す。Ｃｒｙｏ－ＰＨＨをＨＣＶｃｃ（ＭＯＩ＝２）に感染させ、更にＤＣＶ処理を用いて、又は用いずに５Ｃで培養した。（図１５Ａ及Ｂ）分泌ＨＣＶ産物（図１５Ａ）及び細胞内ＨＣＶ ＲＮＡ（図１５Ｂ）を測定した。ｎ＝３。図１５Ｃは、ＨＣＶに感染した５Ｃ－ＰＨＨ（ここではＪｃ１Ｇと示す）及び非感染５Ｃ－ＰＨＨにおけるＩＳＧ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。ｎ＝３。
【図15B】図１５Ａ～Ｃは、Ｃｒｙｏ－ＰＨＨにおけるＨＣＶ感染に対する５Ｃの効果を示す。Ｃｒｙｏ－ＰＨＨをＨＣＶｃｃ（ＭＯＩ＝２）に感染させ、更にＤＣＶ処理を用いて、又は用いずに５Ｃで培養した。（図１５Ａ及Ｂ）分泌ＨＣＶ産物（図１５Ａ）及び細胞内ＨＣＶ ＲＮＡ（図１５Ｂ）を測定した。ｎ＝３。図１５Ｃは、ＨＣＶに感染した５Ｃ－ＰＨＨ（ここではＪｃ１Ｇと示す）及び非感染５Ｃ－ＰＨＨにおけるＩＳＧ発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。ｎ＝３。
【0015】
［発明の詳細な説明］
ここで、本発明者らは、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）において、小分子の組み合わせを用いて細胞シグナル伝達経路を調節することにより、この基本的な問題を克服できることを実証する。ＰＨＨの長期間の機能維持のための５つの化学物質条件（５Ｃ）を特定した。５Ｃで培養したＰＨＨは、単離したばかりのヒト肝細胞に類似した全体的な遺伝子発現プロファイル及び肝細胞の特異的機能を示した。５Ｃで培養したＰＨＨは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を許容し、持続的に検出可能なＨＢＶの共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）を維持しながら、４週間にわたりＨＢＶ感染の全過程を効率的に再現した。本研究は、ＨＢＶ病理及び抗ウイルス薬物スクリーニングを理解するための効率的なプラットフォームを提供し、この化学的アプローチは、インビトロでの他の機能的細胞型の維持に適用可能であった。
ここで、本発明者らは、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）において、小分子の組み合わせを用いて細胞シグナル伝達経路を調節することにより、この基本的な問題を克服できることを実証する。ＰＨＨの長期間の機能維持のための５つの化学物質条件（５Ｃ）を特定した。５Ｃで培養したＰＨＨは、単離したばかりのヒト肝細胞に類似した全体的な遺伝子発現プロファイル及び肝細胞の特異的機能を示した。５Ｃで培養したＰＨＨは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を許容し、持続的に検出可能なＨＢＶの共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）を維持しながら、４週間にわたりＨＢＶ感染の全過程を効率的に再現した。本研究は、ＨＢＶ病理及び抗ウイルス薬物スクリーニングを理解するための効率的なプラットフォームを提供し、この化学的アプローチは、インビトロでの他の機能的細胞型の維持に適用可能であった。
【0016】
前記開示された培養条件はまた、成熟段階に近づいたｈＥＳＣ－肝細胞を維持及び促進した。本発明者らの条件下で、ｈＥＳＣ－肝細胞は１か月以上維持され、そして長期培養したｈＥＳＣ－肝細胞の機能的成熟が観察された。本発明者らの条件下で培養したｈＥＳＣ－肝細胞は、一連のＣＹＰ酵素を進行的に発現し、ｈＰＳＣからの機能的に成熟した細胞の生成を促進する成熟様段階に近いｈＥＳＣ－肝細胞の機能的成熟を示した。
【0017】
Ｉ．定義
本明細書で使用するとき、「５Ｃ培地」は、少なくとも、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤が補充された肝細胞のための基礎細胞培養培地、例えば、フォルスコリン、ＳＢ４３１５４２、ＤＡＰＴ、ＩＷＰ２及びＬＤＮ１９３１８９が補充された、２％ Ｂ２７（Gibco）、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを含む、ＨＣＭ培地（肝細胞培養培地、Lonza）又はウィリアムズＥ培地を指す。
本明細書で使用するとき、「５Ｃ培地」は、少なくとも、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤が補充された肝細胞のための基礎細胞培養培地、例えば、フォルスコリン、ＳＢ４３１５４２、ＤＡＰＴ、ＩＷＰ２及びＬＤＮ１９３１８９が補充された、２％ Ｂ２７（Gibco）、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを含む、ＨＣＭ培地（肝細胞培養培地、Lonza）又はウィリアムズＥ培地を指す。
【0018】
本明細書中で使用するとき、「培養」は、培地中で増殖され、場合により継代された細胞の集団を意味する。細胞培養は、初代培養（例えば、継代されていない培養）であってもよく、二次培養又は後続の培養（例えば、継代培養した又は１回以上継代した細胞の集団）であってもよい。
【0019】
本明細書で使用するとき、「ダウンレギュレーション」又は「ダウンレギュレートする」は、細胞が、外部変数に応じて、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質などの細胞成分の量及び／又は活性を減少させるプロセスを指す。
【0020】
本明細書で使用するとき、用語「誘導性肝細胞」（ｉＨｅｐ）は、天然に存在する肝細胞ではなく、非肝細胞から人工的に派生させた細胞を指す。
【0021】
用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、又は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。したがって、例えば、本明細書で使用するとき、ポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又は、より典型的には、二本鎖又は一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を指す。用語「核酸」又は「核酸配列」はまた、上記で定義されたポリヌクレオチドを包含する。
【0022】
本明細書中で使用するとき、用語ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾された塩基を含有する、上記のＤＮＡ又はＲＮＡを含む。したがって、安定性又は他の理由のために修飾されたバックボーンを有するＤＮＡ又はＲＮＡは、その用語が本明細書で意図されているように「ポリヌクレオチド」である。更に、ほんの２つの例を挙げると、イノシンなどの異常な塩基、又はトリチル化塩基などの修飾された塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、その用語が本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチドである。
【0023】
本明細書で使用するとき、「リプログラミング」は、ある特定の細胞型から別の細胞型への変換を指す。例えば、肝細胞でない細胞は、形態学的及び機能的に肝細胞のような細胞にリプログラムすることができる。
【0024】
用語「発現をアップレギュレートする」は、例えば、発現に影響を与えて、発現又は活性を誘導するか、又は未処理の細胞と比較して、増加した／より大きな発現又は活性を誘導することを意味する。
【0025】
本明細書で使用するとき、「アップレギュレーション」又は「アップレギュレートする」は、細胞が、外的変数に応じて、細胞成分、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の量及び／又は活性を増加させるプロセスを指す。
【0026】
ＩＩ．組成物
前記組成物は、少なくとも、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び／又は１つのＢＭＰ阻害剤が補充された肝細胞培養培地を含む。
前記組成物は、少なくとも、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び／又は１つのＢＭＰ阻害剤が補充された肝細胞培養培地を含む。
【0027】
いくつかの好ましい実施態様では、前記組成物は、アデニル酸シクラーゼの活性化剤、及びＴＧＦβ阻害剤の組み合わせ（本明細書では、２Ｃ）を含む。
【0028】
より好ましい実施態様では、前記組成物は、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、及びＢＭＰ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの薬剤と組み合わせて、アデニル酸シクラーゼの活性化剤、及びＴＧＦβ阻害剤を含む。
【0029】
特に好ましい実施態様では、前記組成物は、少なくとも、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤の組み合わせ（本明細書では、「５Ｃ」）を含む。アデニル酸シクラーゼ活性化剤の最も好ましい活性化剤は、フォルスコリンであり；好ましいＴＧＦβ阻害剤は、ＳＢ４３であり；好ましいＮｏｔｃｈ阻害剤は、ＤＡＰＴであり；好ましいＷｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ２であり、そして好ましいＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９である。
【0030】
いくつかの実施態様では、同一の生物由来の単離したばかりの初代肝細胞と同一のレベルで、少なくとも６０日間の培養後に、少なくとも６つの肝細胞機能性タンパク質の発現を維持するための有効量として測定される、インビトロで、長期間、機能的な肝細胞機能を維持するための有効量で、前記化合物の組み合わせが、任意の肝細胞培養培地に加えられる。
【0031】
肝細胞培養に使用される有用な細胞培養培地は、当技術分野において公知である（本明細書では、「肝細胞基礎培地」）。有用な例としては、Ｂ２７、Ｇｌｕｔｍａｘ及びペニシリンストレプトマイシン（Pen Strep）を含むウイリアムズ培地Ｅ；肝細胞培地；ダルベッコ改変イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）及びＨａｍ’ｓＦ１２培地の単独又は併用；Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓＭＢ－７５２／１、Ｈａｍ’ｓＦ１２、ＲＰＭＩ１６４０、ダルベッコ改変イーグル培地、Lｅｉｂｏｖｉｔｚ’Ｌ１５、ＨＢＭ(商標)（Lonza）、肝細胞基礎培地ＷＡＪＣ１１０（MyBiosouirce.com）及び改変Ｃｈｅｅ’ｓ培地が挙げられるが、これらに限定されない。
【0032】
肝細胞培養培地サプリメント
ｃＡＭＰアゴニスト
好ましいｃＡＭＰアゴニストはフォルスコリンであり、２～１００μM、好ましくは５～５０μM、より好ましくは１８～２２μMの範囲の濃度で使用される。しかしながら、任意のｃＡＭＰアゴニストを、本明細書に開示するＣＩＮＰのカクテルに含めることができる。例としては、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ロリプラム、ゲニステイン、及びＤＢｃＡＭＰ又は８－ブロモ－ｃＡＭＰなどのｃＡＭＰ類似体が挙げられるが、これらに限定されない。
ｃＡＭＰアゴニスト
好ましいｃＡＭＰアゴニストはフォルスコリンであり、２～１００μM、好ましくは５～５０μM、より好ましくは１８～２２μMの範囲の濃度で使用される。しかしながら、任意のｃＡＭＰアゴニストを、本明細書に開示するＣＩＮＰのカクテルに含めることができる。例としては、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ロリプラム、ゲニステイン、及びＤＢｃＡＭＰ又は８－ブロモ－ｃＡＭＰなどのｃＡＭＰ類似体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0033】
ＴＧＦβ阻害薬
ＴＧＦβ阻害剤は、いくつかの実施態様では、好ましくはＴＧＦβ１型受容体アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）５を阻害し、他の実施態様では、ＡＬＫ４及び節性受容体１受容体ＡＬＫ７を更に阻害することができる。ＴＧＦβ受容体阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）であり得、その構造は以下に示され、２～５０μM、好ましくは２～１５μM、より好ましくは８～１２μMの濃度で使用される。
ＴＧＦβ阻害剤は、いくつかの実施態様では、好ましくはＴＧＦβ１型受容体アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）５を阻害し、他の実施態様では、ＡＬＫ４及び節性受容体１受容体ＡＬＫ７を更に阻害することができる。ＴＧＦβ受容体阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）であり得、その構造は以下に示され、２～５０μM、好ましくは２～１５μM、より好ましくは８～１２μMの濃度で使用される。
【化1】
【0034】
当技術分野で公知であり、市販されている他のＴＧＦβ阻害剤。例としては：Ｅ－６１６４５２（［２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン］；８３－０１［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド］；ＳＢ５０５１２４［２－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－２－（１，１－ジメチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－６－メチル－ピリジン］；ＧＷ７８８３８８［４－［４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－２－ピリジニル］－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）－ベンズアミド］；及びＳＢ５２５３３４［６－［２－（１，１－ジメチルエチル）－５－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］キノキサリン］、及びドルソモルフィンが挙げられる。
【0035】
Ｎｏｔｃｈ阻害剤
前記組成物は、好ましくは１つ以上のＮｏｔｃｈ阻害剤、より好ましくはＤＡＰＴ（（２Ｓ）－Ｎ－［（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］－Ｌ－アラニル－２－フェニル］グリシン１，１－ジメチルエチルエステル）を含み、その構造は以下に示され、０．１μM～１０μMの間、好ましくは０．５μM～２．５μMの間、そしてより好ましくは、１μM～２μMの間の濃度で使用される。
前記組成物は、好ましくは１つ以上のＮｏｔｃｈ阻害剤、より好ましくはＤＡＰＴ（（２Ｓ）－Ｎ－［（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］－Ｌ－アラニル－２－フェニル］グリシン１，１－ジメチルエチルエステル）を含み、その構造は以下に示され、０．１μM～１０μMの間、好ましくは０．５μM～２．５μMの間、そしてより好ましくは、１μM～２μMの間の濃度で使用される。
【化2】
【0036】
他のＮｏｔｃｈ阻害剤は、当技術分野で公知である。代表的な例としては、ＭＫ０７５２が挙げられ、その構造は以下に示され、０．０２μM～２０μMの間、好ましくは０．２μM～１０μMの間、より好ましくは１μM～５μMの間の濃度で使用される。
【化3】
【0037】
ＲＯ４９２９０９７（その構造を以下に示す）は、０．０２μM～２０μMの間、好ましくは０．２μM～１０μMの間、より好ましくは１μM～５μMの間の濃度で使用される。
【化4】
【0038】
ＸＸｉ（（Ｓ，Ｓ）－２－［２－（３，５－ジフルオロフェニル）－アセチルアミノ］－Ｎ－（１－メチル－２－オキソ－５－フェニル－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼピン－３－イル）－プロピオンアミド）（０．２～１μMの間の好ましい濃度で使用される）；ＤＢＺ（Ｎ－［（１Ｓ）－２－［［（７Ｓ）－６，７－ジヒドロ－５－メチル－６－オキソ－５Ｈ－ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン－７－イル］アミノ］－１－メチル－２－オキソエチル］－３，５－ジフルオロベンゼンアセトアミド）；ＳＡＨＭ１（ペプチド配列ＡＥＲＬＲＲＲＩＸＬＣＲＸＨＨＳＴであり、以下の修飾：（Ａｌａ－１＝Ｎ末端Ａｃ、Ａｌａ－１＝β－Ａｌａ、Ｘ＝（Ｓ）－２－（４－ペンテニル）アラニン、Ｘ－９及びＸ－１３は二重結合で互いに結合されている）を有する）；及びＦＬI０６（シクロヘキシル１，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－２，７，７－トリメチル－４－（４－ニトロフェニル）－５－オキソ－３－キノリンカルボキシラート）。
【0039】
Ｗｎｔ阻害薬
前記開示された組成物は、１つ以上のＷｎｔ阻害剤を含むことができる。好ましいＷｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ２（Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－４－オキソ－３－フェニルチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］－アセトアミド）であり、その構造は以下に示され、例えば、０．０１μM～２．５μMの間、好ましくは０．１μM～１μMの間、より好ましくは０．５μM～１μMの間の濃度で使用される。
前記開示された組成物は、１つ以上のＷｎｔ阻害剤を含むことができる。好ましいＷｎｔ阻害剤は、ＩＷＰ２（Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－４－オキソ－３－フェニルチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］－アセトアミド）であり、その構造は以下に示され、例えば、０．０１μM～２．５μMの間、好ましくは０．１μM～１μMの間、より好ましくは０．５μM～１μMの間の濃度で使用される。
【化5】
【0040】
ＩＷＰ２は、Ｗｎｔのプロセシング及び分泌を阻害する。それは膜結合Ｏ－アシルトランスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）であるＰＯＲＣＮを不活性化し、そしてＷｎｔのパルミチン酸化を選択的に阻害する。Ｌｒｐ６受容体及びＤｖｌ２のＷｎｔ依存性リン酸化、及びβ－カテニンの蓄積を遮断する。
【0041】
他のＷｎｔシグナル伝達阻害剤は当技術分野で公知である。代表的な例としては、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）（１０ng／mL～１０００ng／mLの間の好ましい濃度、より好ましくは５０ng／mL～１５０ng／mLの間の濃度で使用される）；ＩＷＲ１（４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド）（０．１μM～５μMの間の好ましい濃度、より好ましくは１μM～２μMの間の濃度で使用される）；Ｗｎｔ－Ｃ５９（４－（２－メチル－４－ピリジニル）－Ｎ－［４－（３－ピリジニル）フェニル］ベンゼンアセトアミド）（０．０１μM～５μMの好ましい濃度、より好ましくは０．０５μM～１μMの間の濃度で使用される）、ＩＷＰＬ６（Ｎ－（５－フェニル－２－ピリジニル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－４－オキソ－３－フェニルチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］アセトアミド）及びＩＷＰ１２（Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－３，６－ジメチル－４－オキソチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］アセトアミド）が挙げられる。
【0042】
ＢＭＰ阻害薬
前記組成物は、１つ以上のＢＭＰ阻害剤を含む。好ましいＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９ ２ＨＣl（４－［６－［４－（１－ピペラジニル）フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノリン二塩酸塩）であり、その構造は以下に示され、例えば、０．０１μM～０．５μMの間の濃度で、好ましくは０．０５μM～０．２５μMの間の濃度で、そしてより好ましくは０．１μM～０．２μMの間の濃度で使用される。
前記組成物は、１つ以上のＢＭＰ阻害剤を含む。好ましいＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９ ２ＨＣl（４－［６－［４－（１－ピペラジニル）フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノリン二塩酸塩）であり、その構造は以下に示され、例えば、０．０１μM～０．５μMの間の濃度で、好ましくは０．０５μM～０．２５μMの間の濃度で、そしてより好ましくは０．１μM～０．２μMの間の濃度で使用される。
【化6】
【0043】
ＬＤＮ１９３１８９は、強力かつ選択的なＡＬＫ２及びＡＬＫ３阻害薬であり（ＩＣ５０値はそれぞれ５及び３０nMである）；ＢＭＰ４媒介Ｓｍａｄ１／５／８活性化を阻害する。ＴＧＦ－βシグナル伝達よりもＢＭＰシグナル伝達に対して２００倍以上の選択性を示す。ＡＭＰＫ、ＰＤＧＦＲ及びＭＡＰＫシグナル伝達に対する選択性も示す。
【0044】
他の有用なＢＭＰ阻害剤は、当技術分野で公知である。代表的な例は、ＬＤＮ２１２８５４（５－［６－［４－（１－ピペラジニル）フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］－キノリン）を含むが、それらに限定されず；その構造は以下に示され、０．０５μM～５μMの間の好ましい濃度で、より好ましくは０．１μM～２μMの間の濃度で使用される。
【化7】
【0045】
ノギンは、１０ng／mL～１０００ng／mLの間の好ましい濃度で、より好ましくは５０ng／mL～５００ng／mLの間の濃度で使用される；ドルソモルフィン２塩酸塩（６－［４－［２－（１－ピペリジニル）エトキシ］フェニル］－３－（４－ピリジニル）－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン２塩酸塩）；及びＫ０２２８８（３－［（６－アミノ－５－（３，４，５－トリメトキシフェニル）－３－ピリジニル］フェノール。
【0046】
Ｂ．小分子が補充された培地中で培養した肝細胞
本明細書に開示された、補充された肝細胞培養培地を用いて培養した肝細胞は、肝細胞の形態（多角形形状）、アルブミン分泌及び尿素合成などの確立された肝細胞機能、及び少なくとも１つの公知の肝細胞マーカーの発現からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する肝細胞という点で測定された、機能性肝細胞を長期間インビトロで維持する。肝細胞マーカーの発現レベルは、肝細胞マーカーをコードするオリゴヌクレオチドの発現レベルを測定することによって、又は当技術分野で公知であり、そして本明細書で例示した方法を用いてタンパク質レベルを測定することによって決定することができる。
本明細書に開示された、補充された肝細胞培養培地を用いて培養した肝細胞は、肝細胞の形態（多角形形状）、アルブミン分泌及び尿素合成などの確立された肝細胞機能、及び少なくとも１つの公知の肝細胞マーカーの発現からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する肝細胞という点で測定された、機能性肝細胞を長期間インビトロで維持する。肝細胞マーカーの発現レベルは、肝細胞マーカーをコードするオリゴヌクレオチドの発現レベルを測定することによって、又は当技術分野で公知であり、そして本明細書で例示した方法を用いてタンパク質レベルを測定することによって決定することができる。
【0047】
１つの実施態様では、機能性肝細胞をインビトロで長期間維持する能力は、肝細胞が少なくとも２週間の培養の後に、上に列挙された特徴の少なくとも１つを有するという点で測定される。いくつかの実施態様では、前記肝細胞は、培養３週間後に、上に列挙された特徴のうちの少なくとも１つを有する。例えば、前記肝細胞は、同一の生物から得られ且つ本明細書に開示された肝細胞培養サプリメントを細胞培養培地に補充することなく培養した肝細胞と比較したとき、改善されたレベルで、４週間培養、５週間培養、６週間培養、７週間培養、８週間、９週間、及び９０日以上の培養の後に上に列挙された特徴の少なくとも１つを有する。
【0048】
培養における機能性肝細胞の長期間の維持を決定するために用いることができる肝細胞マーカーには、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）３Ａ４；ＣＹＰ１Ａ２；ＣＹＰ２Ｃ９；ＣＹＰ２Ｄ６；ＣＹＰ２Ｂ６；ＣＹＰ２Ｃ８；ＣＳＰ１；ＣＹＰ２Ｃ１９；ＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）１Ａ３；ＵＧＴ１Ａ４；ＵＧＴ２Ｂ１５；ＵＧＴ２Ｂ７；ＮＴＣＰ（Ｎａ＋－タウロコール酸共輸送ペプチド）；ＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰとも知られる、ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーＧメンバー２）；ＭＲＰ２（多剤耐性関連タンパク質２）；有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）１Ｂ１；ＡＰＯＡ２、ＡＰＯＢ、Ｆ２（凝固因子II）、Ｆ１０（凝固因子Ｘ）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本明細書に開示された、補充された肝細胞培養培地において培養した肝細胞は、本明細書に開示された小分子を補充せずに、同一の基礎肝細胞培養培地を用いて培養した同一の生物由来の肝細胞と比較した場合、Ｐ４５０（ＣＹＰ）３Ａ４；ＣＹＰ１Ａ２；ＣＹＰ２Ｃ９；ＣＹＰ２Ｄ６；ＣＹＰ２Ｂ６；ＣＹＰ２Ｃ１９の少なくとも１つの改善された発現を示す。改善された発現は、発現のレベルにおいて統計的有意差として測定することができる。
【0049】
いくつかの好ましい実施態様では、本明細書に開示された方法により培養した肝細胞は、同一の生物由来の単離したばかりの肝細胞によって発現したレベルと比較した場合と同等の（統計的有意差なしとして測定される）又はそれ以上のレベルで、上に列挙された肝細胞マーカーの少なくとも１つを発現する。
【0050】
特に好ましい実施態様では、本明細書に開示された補充された細胞培養培地を用いてインビトロで維持された肝細胞は、以下の肝細胞マーカー：ＡＰＯＡ２、ＡＰＯＢ、Ｆ２、Ｆ１０、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９及びＵＴＧ２Ｂ７の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ又は少なくとも６つを、９０日間の培養で、同一の生物から得られた単離したばかりの肝細胞と同等のレベルで発現する。
【0051】
５Ｃで培養した肝細胞は、２週間の培養後に、代謝的に活性なＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｂ６を、Ｆ－ＰＨＨのそれらと同等のレベルで有する。対照的に、対照群（５Ｃの補充なしの肝細胞培養培地）で培養したＰＨＨの代謝活性は、同じ時点でほとんど検出されない。
【0052】
ＩＩＩ．使用方法
Ａ．肝細胞培養
開示された細胞培養組成物は、機能性肝細胞をインビトロで長期間維持するのための肝細胞培養に使用される。開示された細胞培養組成物は、肝細胞の維持のためだけでなく、肝細胞（例えば、分化又はリプログラミングから生成された肝細胞）の機能的成熟のためにも使用することができる。
Ａ．肝細胞培養
開示された細胞培養組成物は、機能性肝細胞をインビトロで長期間維持するのための肝細胞培養に使用される。開示された細胞培養組成物は、肝細胞の維持のためだけでなく、肝細胞（例えば、分化又はリプログラミングから生成された肝細胞）の機能的成熟のためにも使用することができる。
【0053】
いくつかの実施態様における開示された方法は、肝細胞と第２の細胞型、例えばサテライト細胞との共培養に依存しない。しかしながら、他の実施態様では、サテライト細胞などの第２の細胞型を含む共培養フォーマットを使用してもよい。いくつかの実施態様では、前記細胞培養は、例えば、Dunn, et al., Biotechnol. Prog., 7:237-245 (1991)に開示されているサンドイッチ培養フォーマットである。
【0054】
任意の供給源からの肝細胞は、本明細書に開示された補充された細胞培養培地を用いて培養することができる。肝細胞は、動物、例えば、マウス、家畜、霊長類又はヒトから単離することができる。好ましい実施態様では、肝細胞はヒトから単離される。肝細胞はまた、誘導性肝細胞（ｉＨｅｐ）でもあり得る。例えば、このｉＨｅｐは、リプログラミング又は分化によって得ることができる。いくつかの好ましい実施態様では、肝細胞は初代肝細胞であり、そしていくつかの実施態様では、肝細胞は、凍結保存した肝細胞であり得る。
【0055】
初代肝細胞は、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、２段階のコラゲナーゼ灌流方法（Lee et al., J Vis Exp, 79, e50615 (2013)）を用いてドナーから単離することができる。例えば、肝臓サンプルを適切な灌流緩衝液（ＰＢ）で灌流して、血液細胞を除去し、続いて灌流緩衝液＋ＥＤＴＡ（ＰＢＥ）で処理し、次いで灌流緩衝液＋コラゲナーゼ（ＰＢＣ）で処理する。例示的な灌流緩衝液は、（０．１５Ｍ ＮａＣｌ；５mM ＫＣｌ；２５mM ＮａＨＣＯ３；５mM グルコース；２０mM Ｈｅｐｅｓ）である。肝細胞懸濁液を、肝細胞基礎培地、例えば、ウイリアムズ培地Ｅで洗浄し、濾過し、そして単離した肝細胞を、肝細胞培養に使用される組織培養プレート／マトリックス中に播種し、そして１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び／又は１つのＢＭＰ阻害剤が補充された基礎肝細胞培養培地で培養する。
【0056】
いくつかの実施態様では、単離した肝細胞は、コラーゲンの単層上に播種され、そしてコラーゲンの第二層は、サンドイッチタイプの肝細胞培養を提供するために加えても加えなくてもよい。肝細胞はまた、軟又は非粘着性の細胞外マトリックス上で培養した場合、肝スフェロイドのような形態で培養することもできる。
【0057】
好ましい培養条件は、３７℃で５％ＣＯ２下の加湿インキュベーターにおけるものを含む。
【0058】
前記基礎肝細胞培養培地には、アデニル酸シクラーゼ、ＴＧＦβ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、及びＢＭＰ阻害剤の少なくとも１つが補充される。いくつかの好ましい実施態様では、前記基底肝細胞培養培地には、アデニル酸シクラーゼの活性化剤、及びＴＧＦβ阻害剤の組み合わせが補充される。
【0059】
より好ましい実施態様では、前記基礎肝細胞培養培地には、Ｎｏｔｃｈ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、及びＢＭＰ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの薬剤と組み合わせたアデニル酸シクラーゼの活性化剤、及びＴＧＦβ阻害剤が補充される。
【0060】
特に好ましい実施態様では、前記基礎肝細胞培養培地には、少なくとも、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤の組み合わせ（本明細書では、「５Ｃ」）が補充される。アデニル酸シクラーゼ活性化剤の最も好ましい活性化剤は、フォルスコリンであり；好ましいＴＧＦβ阻害剤はＳＢ４３１５４２（ＳＢ４３）であり；好ましいＮｏｔｃｈ阻害剤はＤＡＰＴであり；好ましいＷｎｔ阻害剤はＩＷＰ２であり、そして好ましいＢＭＰ阻害剤はＬＤＮ１９３１８９である。
【0061】
Ｂ．研究関連の用途
本明細書に開示された研究は、本明細書に開示された方法により培養したヒト肝細胞が、長期間薬物代謝活性を保持することができ、したがって、医薬用途のためのプラットフォームを提供することを示す。
本明細書に開示された研究は、本明細書に開示された方法により培養したヒト肝細胞が、長期間薬物代謝活性を保持することができ、したがって、医薬用途のためのプラットフォームを提供することを示す。
【0062】
（ｉ）薬物試験
肝臓が薬物の代謝活性において中心的役割を果たすために、肝実質細胞は、医薬品開発において重要な役割を果たす。現在、薬物候補の失敗の主な原因は、そのＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝、排泄）が理想的でないことである。創薬研究の根幹は、薬物代謝の全てに関与するヒト肝実質細胞である肝細胞における候補薬物の、代謝及び毒性の効果に対するものである。現在、インビトロでの薬物開発に使用される主な肝細胞は、ヒト成体の初代肝細胞である。初代肝細胞の機能をインビトロで維持することが困難であるために、薬剤開発における薬剤候補の適用は極めて限られている。本明細書に開示された方法により培養した肝細胞は、培養において薬物代謝遺伝子を長期間発現し、そして培養において代謝活性を長期間維持し、そしてインビトロでの薬物代謝研究に使用することができる。上述のように、５Ｃで培養した肝細胞は、２週間の培養後に、Ｆ－ＰＨＨと同等なレベルで、代謝的に活性なＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｂ６を有する。対照的に、対照群（５Ｃ補充の無い肝細胞培養培地）で培養したＰＨＨの代謝活性は、同じ時点でほとんど検出されない。
肝臓が薬物の代謝活性において中心的役割を果たすために、肝実質細胞は、医薬品開発において重要な役割を果たす。現在、薬物候補の失敗の主な原因は、そのＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝、排泄）が理想的でないことである。創薬研究の根幹は、薬物代謝の全てに関与するヒト肝実質細胞である肝細胞における候補薬物の、代謝及び毒性の効果に対するものである。現在、インビトロでの薬物開発に使用される主な肝細胞は、ヒト成体の初代肝細胞である。初代肝細胞の機能をインビトロで維持することが困難であるために、薬剤開発における薬剤候補の適用は極めて限られている。本明細書に開示された方法により培養した肝細胞は、培養において薬物代謝遺伝子を長期間発現し、そして培養において代謝活性を長期間維持し、そしてインビトロでの薬物代謝研究に使用することができる。上述のように、５Ｃで培養した肝細胞は、２週間の培養後に、Ｆ－ＰＨＨと同等なレベルで、代謝的に活性なＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｂ６を有する。対照的に、対照群（５Ｃ補充の無い肝細胞培養培地）で培養したＰＨＨの代謝活性は、同じ時点でほとんど検出されない。
【0063】
（ｉｉ）肝疾患モデル
感染症に関与する研究において遭遇する問題は、適切なモデルの欠如である。インビトロで培養した肝細胞は、肝臓の寄生体による感染、例えば、肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、又はＤ型肝炎の感染）、マラリアを引き起こす寄生虫による感染の研究のための細胞モデルとして使用することができる。これらのモデルは、感染症、特に肝臓に感染する疾患を処置するためのワクチン及び薬物の開発のための効果的なプラットフォームを提供することができる。
感染症に関与する研究において遭遇する問題は、適切なモデルの欠如である。インビトロで培養した肝細胞は、肝臓の寄生体による感染、例えば、肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、又はＤ型肝炎の感染）、マラリアを引き起こす寄生虫による感染の研究のための細胞モデルとして使用することができる。これらのモデルは、感染症、特に肝臓に感染する疾患を処置するためのワクチン及び薬物の開発のための効果的なプラットフォームを提供することができる。
【0064】
本明細書に開示された方法により培養した肝細胞は、肝疾患、例えば肝臓のウイルス感染を研究するためのインビトロでのモデルとして用いることができる。好ましい例は、肝炎ウイルスによる感染及び疾患進行である。特に好ましい実施態様では、肝細胞は、Ｂ型及びＣ型肝炎感染及び疾患進行のモデルとして役立つことができる。
【0065】
従って、本明細書に開示された肝細胞は、開示された肝細胞に、寄生体による感染に有効な時間肝寄生体を接種し、そして肝細胞培養（ＨＣ）用の補充された肝基礎培地中でインビトロで寄生体により感染した細胞を培養することを含む方法によって作製されたインビトロでの肝細胞の寄生体による感染モデルとして使用することができる。
【0066】
ＨＢＶの産物（分泌されたＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＤＮＡ粒子）が、５Ｃ－ＰＨＨ培養の上清中において検出されており、本願のこのデータは、（本明細書に開示された方法により培養した）ＰＨＨへの、ＨＢＶに感染した患者由来の血漿又は細胞培養において生成したＨＢＶ粒子の接種が、ＨＢＶ感染の成功をもたらしたことを示す。この高レベルのＨＢＶ産物の生成は、５Ｃ－ＰＨＨにおいて少なくとも１か月間持続した。ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの形成は、５Ｃの条件下の培養において４週目で検出することができた。５Ｃ－ＰＨＨの効率的なＨＢＶ感染は、ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）の免疫染色により実証された（データは示さず）。更に、５Ｃ－ＰＨＨは、ＭＯＩ（感染の多重度）を１０に減少しても、ＨＢＶ感染に対して依然感受性があった。ＨＢＶ感染は、ＭＯＩ＝１０で達成でき、５Ｃ－ＰＨＨがＨＢＶ感染に対して非常に感受性の高い系であることを示した。
【0067】
重要なことに、５Ｃは、様々な遺伝子型のＨＢＶ及びインビトロ産生細胞株ＨｅｐＡＤ３８を含む、様々な感染源からのＨＢＶ感染を安定的に支持できる。５Ｃ－ＰＨＨはＨＢＶのライフサイクル全体を支持し、ＨＢＶの感染粒子を生成することができる。
【0068】
更に、５Ｃ－ＰＨＨはまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などの他の肝炎ウイルスにも感染され得る。
【0069】
本明細書に開示された方法により培養した肝細胞はまた、肝疾患のための処置選択肢／新規治療薬剤の効果をテキスト化するためにも使用され得る。
【0070】
本願におけるデータは、本明細書に開示されたように培養され、ウイルス療法に反応した肝細胞を例示する。５Ｃ－ＰＨＨの感染モデルは、２つのクラスの臨床抗ＨＢＶ薬物に敏感に反応した。
【0071】
肝細胞への肝炎ウイルスの接種の成功は、肝臓を感染させる他の寄生体、例えばマラリア原虫に拡大することができる。
【0072】
マラリアは、マラリア原虫群（Plasmodium group）に属する微生物によって引き起こされる蚊が媒介する感染症であり、人間及び他の動物に感染する。５種類のマラリア原虫が、ヒトを感染させ、蔓延させる。三日熱マラリア原虫（P. vivax）、卵形マラリア原虫（P. ovale）、及び四日熱マラリア原虫（P. malariae）は一般に軽度のマラリアを引き起こすため、ほとんどの死亡は熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）によって引き起こされる。この疾患は、感染したメスのハマダラカ属（Anopheles）の蚊によって一般的に伝染される。蚊に刺されると、蚊の唾液に含まれる寄生虫が、刺された対象の血液中に入り込む。寄生虫は肝臓に移動し、そこで成熟して繁殖する。
【0073】
Ｖ．キット
培養における機能性肝細胞の長期間維持のためのキットが提供される。前記キットは、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤（本明細書では、「５Ｃ」）を含む。アデニル酸シクラーゼ活性化剤の最も好ましい活性化剤はフォルスコリンであり；好ましいＴＧＦβ阻害剤はＳＢ４３１５４２（ＳＢ４３）であり；好ましいＮｏｔｃｈ阻害剤はＤＡＰＴであり；好ましいＷｎｔ阻害剤はＩＷＰ２であり、そして好ましいＢＭＰ阻害剤はＬＤＮ１９３１８９である。前記キットは、少なくとも、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤を基礎肝細胞培養培地に補充するための指示を含む。
培養における機能性肝細胞の長期間維持のためのキットが提供される。前記キットは、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤（本明細書では、「５Ｃ」）を含む。アデニル酸シクラーゼ活性化剤の最も好ましい活性化剤はフォルスコリンであり；好ましいＴＧＦβ阻害剤はＳＢ４３１５４２（ＳＢ４３）であり；好ましいＮｏｔｃｈ阻害剤はＤＡＰＴであり；好ましいＷｎｔ阻害剤はＩＷＰ２であり、そして好ましいＢＭＰ阻害剤はＬＤＮ１９３１８９である。前記キットは、少なくとも、１つのアデニル酸シクラーゼの活性化剤、１つのＴＧＦβ阻害剤、１つのＮｏｔｃｈ阻害剤、１つのＷｎｔ阻害剤、及び１つのＢＭＰ阻害剤を基礎肝細胞培養培地に補充するための指示を含む。
【実施例】
【0074】
材料及び方法
ヒト肝細胞の単離及び培養
本研究は、日中友好病院の研究倫理委員会によって承認された（倫理承認番号：２００９－５０）。ＰＨＨはヒトのドナーから入手した。ヒト肝細胞は廃棄されたヒト肝臓から単離した。これらの組織から初代ヒト肝細胞を分離するために、修正した２段階のコラゲナーゼ潅流方法を用いた（OOtani, et al., Nat Med., 15:701-706 (2009)）。簡単に言うと、この肝組織をＰＢ（灌流緩衝液：０．１５Ｍ ＮａＣｌ；５mM ＫＣｌ；２５mM ＮａＨＣＯ３；５mMグルコース；２０mM Ｈｅｐｅｓ）で灌流して、残りの血液細胞を除去し、続いてＰＢＥ（灌流緩衝液＋１mM ＥＤＴＡ）で灌流した。次いで、組織をＰＢＣ（灌流緩衝液＋１mg／mL ＩＶ型コラゲナーゼ、５mM ＣａＣｌ２、Gibco）で灌流した。全ての緩衝液は、分離工程の前に３７℃に予熱した。肝細胞懸濁液を採取し、ウイリアムズ培地Ｅ（Gibco）で洗浄し、次いで４０μmナイロンセルストレーナー（Falcon）を通して濾過した。次いで、単離した肝細胞をＩ型コラーゲンでコーティングした（ラット尾部I型コラーゲン、Gibco）プレート上に２．５×１０５／cm２の密度で播種した。
ヒト肝細胞の単離及び培養
本研究は、日中友好病院の研究倫理委員会によって承認された（倫理承認番号：２００９－５０）。ＰＨＨはヒトのドナーから入手した。ヒト肝細胞は廃棄されたヒト肝臓から単離した。これらの組織から初代ヒト肝細胞を分離するために、修正した２段階のコラゲナーゼ潅流方法を用いた（OOtani, et al., Nat Med., 15:701-706 (2009)）。簡単に言うと、この肝組織をＰＢ（灌流緩衝液：０．１５Ｍ ＮａＣｌ；５mM ＫＣｌ；２５mM ＮａＨＣＯ３；５mMグルコース；２０mM Ｈｅｐｅｓ）で灌流して、残りの血液細胞を除去し、続いてＰＢＥ（灌流緩衝液＋１mM ＥＤＴＡ）で灌流した。次いで、組織をＰＢＣ（灌流緩衝液＋１mg／mL ＩＶ型コラゲナーゼ、５mM ＣａＣｌ２、Gibco）で灌流した。全ての緩衝液は、分離工程の前に３７℃に予熱した。肝細胞懸濁液を採取し、ウイリアムズ培地Ｅ（Gibco）で洗浄し、次いで４０μmナイロンセルストレーナー（Falcon）を通して濾過した。次いで、単離した肝細胞をＩ型コラーゲンでコーティングした（ラット尾部I型コラーゲン、Gibco）プレート上に２．５×１０５／cm２の密度で播種した。
【0075】
市販の肝細胞：プレート可能な凍結保存したヒト肝細胞（ロット：ＨＶＮ及びＨＮＮ）をBioreclamationIVTから購入した（製品番号：Ｍ００９９５－Ｐ）。
【0076】
肝細胞の培養に使用した無血清培地（ヌル）：Ｂ２７（５０×、Gibco）、Ｇｌｕｔｍａｘ（Gibco）及びＰｅｎＳｔｒｅｐ（Gibco）を含むウイリアムズ培地Ｅ。ＤＭＳＯビヒクル対照：約０．０３５％のＤＭＳＯを補充したヌル。５Ｃ条件：フォルスコリン（１０μM）、ＳＢ４３１５４２（１０μM）、ＩＷＰ２（１μM）、ＤＡＰＴ（１μM）及びＬＤＮ１９３１８９（０．５μM）を補充したヌル。２４時間培養した肝細胞を市販の培地ＨＣＭ（Lonza）で培養した。
【0077】
ヒト肝細胞の凍結保存及び再生
肝細胞を、６０％ ウイリアムズ培地Ｅ（Gibco）、３０％ ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌＦＲＳ（BioLife Solutions）及び１０％ ＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich）を含む凍結保存培地を用いて、１×１０７細胞／mL（１mL／バイアル）の濃度で凍結保存した。次いで、バイアルをクライオ１℃凍結容器（Nalgene）に直ちに移し、－８０℃の冷凍庫で２４時間凍結した。その後、長期間の貯蔵のためにバイアルを液体窒素に移した。
肝細胞を、６０％ ウイリアムズ培地Ｅ（Gibco）、３０％ ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌＦＲＳ（BioLife Solutions）及び１０％ ＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich）を含む凍結保存培地を用いて、１×１０７細胞／mL（１mL／バイアル）の濃度で凍結保存した。次いで、バイアルをクライオ１℃凍結容器（Nalgene）に直ちに移し、－８０℃の冷凍庫で２４時間凍結した。その後、長期間の貯蔵のためにバイアルを液体窒素に移した。
【0078】
再生のために、凍結保存した肝細胞バイアルを３７℃の水浴中で解凍した。次いで、１mLの細胞懸濁液を５mLのヌルに加え、続いて４℃にて１６０ｇで５分間遠心分離し、次いで培地中に再懸濁した。細胞生存性はトリパンブルー（Gibco）で確認した。
【0079】
小分子化合物及びサイトカイン
スクリーニングに使用される小分子化合物及びサイトカインは、表１に記載されるように購入又は合成された。それらの濃度を表１に示す。
スクリーニングに使用される小分子化合物及びサイトカインは、表１に記載されるように購入又は合成された。それらの濃度を表１に示す。
【0080】
【表1】
【0081】
薬物代謝活性アッセイ
薬物代謝活性を以前に記載された方法（Kyffin et al., Toxicol. In vitro. An Int, J. Published in assoc with BBIBRA, 48:262-275 (2018).）を用いて評価した。簡単に言うと、肝細胞を細胞懸濁液として採取し、薬物代謝活性を評価した。１mLの予熱したインキュベーション培地（ウイリアムズ培地Ｅ、１０mM Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．４、ＧｌｕｔａＭＡＸ）を１×１０６細胞に加えた。基質溶液は、基質を個々にインキュベーション培地に加えることにより調製した。２５０μLの基質溶液を、５mLのポリスチレン丸底管（BD Falcon）中で２５０μLの細胞懸濁液と混合することにより、代謝反応を開始した。この管を、インキュベーター内で２１０rpmの振盪速度に設定した軌道振盪機に載せた。３７℃で１５～１２０分インキュベートした後、反応管を室温で遠心分離し、上清を採取した。採取した上清に三倍容量のメタノールを加えて、－８０℃で凍結することにより薬物代謝反応を停止させた。代謝産物を定量するために、各基質の１％の内部基準物質を加え、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）分析を行った。結果は、１００万細胞あたりに１分あたりで形成される代謝物のｐｍｏｌに対して正規化した。各ＣＹＰ酵素に特異的な基質及びその濃度を表２に示す。同位体標識した基準代謝物及び標準代謝物を表２に列挙した。
薬物代謝活性を以前に記載された方法（Kyffin et al., Toxicol. In vitro. An Int, J. Published in assoc with BBIBRA, 48:262-275 (2018).）を用いて評価した。簡単に言うと、肝細胞を細胞懸濁液として採取し、薬物代謝活性を評価した。１mLの予熱したインキュベーション培地（ウイリアムズ培地Ｅ、１０mM Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．４、ＧｌｕｔａＭＡＸ）を１×１０６細胞に加えた。基質溶液は、基質を個々にインキュベーション培地に加えることにより調製した。２５０μLの基質溶液を、５mLのポリスチレン丸底管（BD Falcon）中で２５０μLの細胞懸濁液と混合することにより、代謝反応を開始した。この管を、インキュベーター内で２１０rpmの振盪速度に設定した軌道振盪機に載せた。３７℃で１５～１２０分インキュベートした後、反応管を室温で遠心分離し、上清を採取した。採取した上清に三倍容量のメタノールを加えて、－８０℃で凍結することにより薬物代謝反応を停止させた。代謝産物を定量するために、各基質の１％の内部基準物質を加え、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）分析を行った。結果は、１００万細胞あたりに１分あたりで形成される代謝物のｐｍｏｌに対して正規化した。各ＣＹＰ酵素に特異的な基質及びその濃度を表２に示す。同位体標識した基準代謝物及び標準代謝物を表２に列挙した。
【0082】
【表2】
【0083】
ＨＢＶストックの調製
ＨＢＶウイルスは、書面による同意を得て、慢性ＨＢＶキャリアの血漿から得た。ＨｅｐＡＤ３８細胞を、１０％ ＦＢＳ及び０．１mM 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を補充したダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）において培養した。３日後に、細胞がコンフルエントに達したとき、培地を３％ ＦＢＳ、０．１mM ＮＥＡＡ、及び２％ ＤＭＳＯからなる培地に変更した。上清を３日ごとに採取し、新たな培地を加えた。採取した培地をプールし、遠心フィルター装置（Amicon Ultra-15, 再生セルロース 100.000, Merck Millipore Corp.）を用いた遠心分離を介して１００倍に濃縮した。濃縮したウイルスストックを等分し、－８０℃で保存した。
ＨＢＶウイルスは、書面による同意を得て、慢性ＨＢＶキャリアの血漿から得た。ＨｅｐＡＤ３８細胞を、１０％ ＦＢＳ及び０．１mM 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を補充したダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）において培養した。３日後に、細胞がコンフルエントに達したとき、培地を３％ ＦＢＳ、０．１mM ＮＥＡＡ、及び２％ ＤＭＳＯからなる培地に変更した。上清を３日ごとに採取し、新たな培地を加えた。採取した培地をプールし、遠心フィルター装置（Amicon Ultra-15, 再生セルロース 100.000, Merck Millipore Corp.）を用いた遠心分離を介して１００倍に濃縮した。濃縮したウイルスストックを等分し、－８０℃で保存した。
【0084】
Bremer et al. 2009 and Glebe and Gerlich, 2004に記載のように、スクロース密度勾配遠心法によるＨＢＶ精製を行った。簡単に言うと、密度６０％、４５％、３５％、２５％及び１５％で不連続なスクロース勾配を含む、超遠心管上にＨＢＶ感染患者血漿をロードした。スクロース溶液をＴＮＥ（２０mM トリス－ＨＣｌ、１４９mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）で調製した。次いで、血漿をロードした管を、１０℃にて、ＳＷ３２ローター（Beckman）中で１１２，０００ｇで１５時間、遠心分離した。遠心分離後、ウイルス含有画分（リアルタイムＰＣＲ法を介した検出キット（KHB, Shanghai, China）を用いて決定された４５％と３５％の間の画分の間）をＴＮＥで希釈し、１０～１５％ スクロースを介して、ＳＷ３２ローター中１１２，０００ｇで１５時間かけてペレット化した。ペレットを２mLのヌル培地に再懸濁した。
【0085】
ＣｓＣｌ密度勾配精製のために、密度１．１から１．５ｇ／mL（５段階各２mL）でＣｓＣｌステップ勾配に血漿をロードした。ＳＷ４１ローター（Beckman）を用いて４℃で３５時間、１７４，０００ｇで遠心分離した後、勾配画分を採取し、リアルタイムＰＣＲ法を介したキット（KHB, Shanghai, China）によりウイルス含有画分を検出した。
【0086】
ＨＢＶ感染
ＨＢＶのウイルス感染は、２００のゲノム等価物、すなわち１×１０５細胞で接種した２×１０７コピーのゲノム等価物で行った。接種培地は、最初にＰＥＧを４％の最終ＰＥＧ濃度になるようにヌルに溶解し、ＤＭＳＯを添加せずに新たに作製した。接種容量はプレーティングフォーマット（２５μL（３８４ウェルプレート用）、１００μL（９６ウェルプレート用）、５００μL（２４ウェルプレート用））に調整した。２０時間後、接種物を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで３時間後に別に３回洗浄して、３日ごとに培地を変えて異なる条件（Ｎｕｌｌ／ＤＭＳＯ／５Ｃ）で培養した。細胞を示された時間培養した（ＰＥＧフリー、ＤＭＳＯフリー）後、収集してさらなる分析を行った。いくつかの比較実験では、接種はＭＯＩ滴定（１０／５０／１００／２００／４００）で行った。
ＨＢＶのウイルス感染は、２００のゲノム等価物、すなわち１×１０５細胞で接種した２×１０７コピーのゲノム等価物で行った。接種培地は、最初にＰＥＧを４％の最終ＰＥＧ濃度になるようにヌルに溶解し、ＤＭＳＯを添加せずに新たに作製した。接種容量はプレーティングフォーマット（２５μL（３８４ウェルプレート用）、１００μL（９６ウェルプレート用）、５００μL（２４ウェルプレート用））に調整した。２０時間後、接種物を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで３時間後に別に３回洗浄して、３日ごとに培地を変えて異なる条件（Ｎｕｌｌ／ＤＭＳＯ／５Ｃ）で培養した。細胞を示された時間培養した（ＰＥＧフリー、ＤＭＳＯフリー）後、収集してさらなる分析を行った。いくつかの比較実験では、接種はＭＯＩ滴定（１０／５０／１００／２００／４００）で行った。
【0087】
再感染のために、ＨＢＶに感染した５Ｃ－ＰＨＨの上清を採取し、遠心フィルター装置（(Amicon Ultra-15, 再生したセルロース 100.000, Merck Millipore Corp.）を用いて、４℃で、１時間、３，０００ｇでの遠心分離を経て１００倍に濃縮し、次いで、上述の感染方法を用いてナイーブＰＨＨに接種した。
【0088】
ＨＢＶ産物の検出
ＨＢＶウイルス抗原のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇは、市販のＥＬＩＳＡキット（Autobio, Zhengzhou, China）を用いて、製造業者の指示に従って、培養したＰＨＨの上清 ５０μLを用いて検出した。
ＨＢＶウイルス抗原のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇは、市販のＥＬＩＳＡキット（Autobio, Zhengzhou, China）を用いて、製造業者の指示に従って、培養したＰＨＨの上清 ５０μLを用いて検出した。
【0089】
ＨＢＶ ＤＮＡの定量のため、ウイルスＤＮＡをDNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Cat No: 69504)を用いて単離した。単離したＤＮＡをリアルタイムＰＣＲを介した検出キット（中国上海市ＫＨＢ）を用いて定量した。ウイルスゲノム等価物コピーは既知のコピー数で作成した標準曲線に基づいて算出した。
【0090】
ＨＢＶ特異的ＲＮＡの定量のため、ＨＢＶに感染した細胞からの全ＲＮＡをRNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN)を用いて単離した。約４００ngの全ＲＮＡを、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (TransGen Biotech)を用いてｃＤＮＡに逆転写した。プライマー ５’－ＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴＣＣ－３’及び５－ＧＡＧＧＣＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴ－３’をＨＢＶ ３．５kbの転写産物に用いた；プライマー ５’－ＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＣ－３’及び５’－ＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧ－３’を、全ＨＢＶに特異的な転写産物に使用した。３．５kbの転写産物のための１２３bpの断片及び全ＨＢＶに特異的な転写産物のための９２bpの産物の増幅は、両方とも９５℃で３０秒間の変性、続いて９５℃で３秒間／サイクルの変性、及び６０℃で３０秒間のアニーリング／伸長の４０サイクルにより行った。
【0091】
この研究で用いたｃｃｃＤＮＡ検出法を実施した。簡単に言うと、DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Cat No: 69504)を用いてＤＮＡを単離した。抽出したＤＮＡをPlasmid-safe ATPdependent DNase (Epicentre Technologies)を用いて、３７℃で０．５時間消化して、７０℃で３０分間不活性化した。次いで、１０μLの反応物の内の０．５μLを１０μLのリアルタイムＰＣＲ反応物に加えた。ウイルスゲノム等価物コピーは、既知のコピー数で作成した標準曲線に基づいて算出した。リアルタイムＰＣＲはPower SYBR(登録商標) Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いて行い、CFX384(商標) Real-Time PCR detection system (Bio-Rad)で実施した。ＨＢＶｃｃｃＤＮＡのサザンブロット分析のため、コアＤＮＡ抽出法及び改良したＨｉｒｔＤＮＡ抽出法によりＨＢＶ ＤＮＡを抽出した。サザンブロットについては、調製したＤＮＡサンプルを０．８％アガロースゲルで分離した後、ナイロン膜（Amersham）に転写した。ｃｃｃＤＮＡの同一性を確認するために、無処理で、且つＳｐｅＩ消化した５Ｃ－ＰＨＨからのＨｉｒｔＤＮＡ調製物をアガロースゲルで分離した。また、標識化したＨＢＶプローブ（３７０bp～７０５bpのＨＢＶ ＤＮＡ断片、サザンブロットプローブ）を含む１．７k－bp、２．１k－bp及び３．１k－bpのＨＢＶ ＤＮＡ断片も同一のアガロースゲル上で泳動し、サザンブロット分析における弛緩環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）、ｃｃｃＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の分子マーカーとして用いた。サザンブロットは、DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche, 11 585 614 910)を用いて実施した。ＤＮＡマーカー（遺伝子型Ｄ：Wenhui Li教授のご好意により提供頂いた）を調製するためのプライマー配列は以下の通りである：ＨＢＶ３．２kbマーカー：ＨＢＶ－Ｄ－ＥｃｏｒＩ－Ｆ ５’－ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡ ＨＢＶ－Ｄ－ＥｃｏｒＩ－Ｒ ５’－ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡ ＨＢＶ２．１kbマーカー：ＨＢＶ－Ｄ－ＥｃｏｒＩ－Ｆ ５’－ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡ ＱＹＨ－２．１kb－Ｒ ５’－ＣＣＣＡＧＧＴＡＧＣＴＡＧＡＧＴＣＡＴＴＡＧＴ ＨＢＶ１．７kbマーカー：ＨＢＶ－Ｄ－ＥｃｏｒＩ－Ｆ ５’－ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡ ＱＹＨ－１．７kb－Ｒ ５’－ＡＡＧＧＴＣＧＧＴＣＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＡ
【0092】
ＨＣＶ感染及びＨＣＶ産物の検出
Ｈｕｈ７．５細胞株は、Charles Rice教授のご厚意により提供され、そして１０％ウシ胎児血清（Biological industries）、２５mM ＨＥＰＥＳ（Gibco）及び非必須アミノ酸（Gibco）を補充したダルベッコ改変培地中で日常的に維持された。細胞培養したＨＣＶを生成するために、HCV Jc1FLAG2 (p7-nsGluc2A) (本文中では、Jc1G)をコードするプラスミドを、ＸｂａI消化によって最初に直線化し、ＭＥＧＡスクリプト（Invitrogen）を用いるインビトロでの転写のためのテンプレートとして使用した。ＨＣＶｃｃは、前述したように、インビトロで転写されたJc1G RNAのＨｕｈ７．５細胞への電気穿孔によって生成した。ウイルス含有上清を、電気穿孔後３日目以降、及び電気穿孔後７日目まで、毎日回収した。上清を合わせ、Amicon(登録商標) Ultra-15 (100K)遠心フィルター装置（Millipore）を用いた遠心分離によって、４℃で３０分間、５０００ｇでウイルスを濃縮した。Amicon(登録商標) Ultra-15を用いた反復遠心分離により、緩衝液をＰＢＳに交換した。濃縮したウイルスを限定希釈法によりＨｕｈ７．５において力価測定した。
Ｈｕｈ７．５細胞株は、Charles Rice教授のご厚意により提供され、そして１０％ウシ胎児血清（Biological industries）、２５mM ＨＥＰＥＳ（Gibco）及び非必須アミノ酸（Gibco）を補充したダルベッコ改変培地中で日常的に維持された。細胞培養したＨＣＶを生成するために、HCV Jc1FLAG2 (p7-nsGluc2A) (本文中では、Jc1G)をコードするプラスミドを、ＸｂａI消化によって最初に直線化し、ＭＥＧＡスクリプト（Invitrogen）を用いるインビトロでの転写のためのテンプレートとして使用した。ＨＣＶｃｃは、前述したように、インビトロで転写されたJc1G RNAのＨｕｈ７．５細胞への電気穿孔によって生成した。ウイルス含有上清を、電気穿孔後３日目以降、及び電気穿孔後７日目まで、毎日回収した。上清を合わせ、Amicon(登録商標) Ultra-15 (100K)遠心フィルター装置（Millipore）を用いた遠心分離によって、４℃で３０分間、５０００ｇでウイルスを濃縮した。Amicon(登録商標) Ultra-15を用いた反復遠心分離により、緩衝液をＰＢＳに交換した。濃縮したウイルスを限定希釈法によりＨｕｈ７．５において力価測定した。
【0093】
細胞内ＨＣＶ ＲＮＡを定量するために、細胞をトリゾール試薬（Invitrogen）に溶解した。ＲＮＡは、トリゾール抽出物から精製し、そして、製造者の指示に従って、TaKaRa製のPrimeScript(商標) RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)を使用して、逆転写した。このｃＤＮＡサンプルは、次に列挙した特定の遺伝子（ＧＡＰＤＨ：（ｓ）ＧＧＴ ＡＴＣ ＧＴＧ ＧＡＡ ＧＧＡ ＣＴＣ ＡＴＧ Ａ，（ａｓ）ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＴＧ ＧＣＴ ＴＣＣ ＣＧＴ ＴＣＡ ＧＣ；ＨＣＶ：（ｓ）ＣＣＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＴＡ ＣＴＧ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＧＣ，（ａｓ）ＧＣＴ ＣＡＴ ＧＧＴ ＧＣＡ ＣＧＧ ＴＣＴＡ ＣＧＡ ＧＡＣ ＣＴ）に対するプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲ（SYBR(登録商標) Premix Ex Taq(商標) Tli RNaseH Plus）に供した。相対的なＲＮＡレベルは２－ΔΔＣｔ法を用いて算出した。ローディングの正規化のためのハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用した。
【0094】
ルシフェラーゼ活性を定量するために、各ウェルから上清を採取し、等容量の２×passive lysis buffer (Promega)と混合した。ルシフェラーゼ活性は、製造業者のプロトコルに従ってレニラルシフェラーゼ基質（Renilla luciferase substrate）(Promega)を用いて測定した。
【0095】
免疫組織化学染色及び免疫蛍光染色
細胞を４％ パラホルムアルデヒド（DingGuo, AR-0211）中で、室温で２０分間固定し、次に透過処理して、３％ 正常ロバ血清（Jackson Immuno Research, 017-000-121）及び０．２５％ Triton X-100 (Sigma-Aldrich, T8787)を含むＰＢＳを用いて室温で６０分間遮断した。次いで、細胞を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。二次抗体（Jackson ImmunoResearch）を室温で１時間インキュベートした。細胞核をＤＡＰＩ（(Roche Life Science, 10236276001）を用いて染色した。使用した一次抗体を表３に列挙した。
細胞を４％ パラホルムアルデヒド（DingGuo, AR-0211）中で、室温で２０分間固定し、次に透過処理して、３％ 正常ロバ血清（Jackson Immuno Research, 017-000-121）及び０．２５％ Triton X-100 (Sigma-Aldrich, T8787)を含むＰＢＳを用いて室温で６０分間遮断した。次いで、細胞を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。二次抗体（Jackson ImmunoResearch）を室温で１時間インキュベートした。細胞核をＤＡＰＩ（(Roche Life Science, 10236276001）を用いて染色した。使用した一次抗体を表３に列挙した。
【0096】
【表3】
【0097】
ＨＢＶ感染の広がりを検出するため、ＨＢｃＡｇの免疫組織化学的染色を実施した。簡単に言うと、細胞を３．７％ パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。ＰＢＳ洗浄後、細胞を５０％ エタノールの蒸留水中で処理し、次いで、７０％ エタノールの蒸留水中で４℃で少なくとも１時間処理した。少なくとも２時間のブロッキング（ブロッキング溶液：１０％ＦＢＳを加えたＰＢＳ）の後、細胞を抗ＨＢｃＡｇ（ブロッキング溶液中で２００倍に希釈）と共に４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を洗浄除去し、細胞をポスト一次（post-primary）で室温で３０分間処理した。細胞を二次抗体と共に室温で３０分間インキュベートした。染色メディアを、ＤＡＢ希釈剤でＤＡＢを５０倍に希釈することによって新たに作り、次いで１５０μLの基質溶液を各ウェルに加えた。ＤＡＢ反応後、細胞をヘマトキシリンで５～１０分間、対比染色した。
【0098】
ｑＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡをRNeasy Micro Kit (QIAGEN)を用いて単離した。First-Strand Synthesis SuperMix、ｑＲＴ－ＰＣＲ用（Invitrogen）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＰＣＲは、Power SYBR(登録商標) Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いて行い、そしてMX3000P Sequence Detection System (Stratagene)を用いて実施した。データはΔΔＣｔ法を用いて分析した。ｑＲＴ－ＰＣＲのために用いられるプライマーを表４に列挙した。
全ＲＮＡをRNeasy Micro Kit (QIAGEN)を用いて単離した。First-Strand Synthesis SuperMix、ｑＲＴ－ＰＣＲ用（Invitrogen）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＰＣＲは、Power SYBR(登録商標) Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いて行い、そしてMX3000P Sequence Detection System (Stratagene)を用いて実施した。データはΔΔＣｔ法を用いて分析した。ｑＲＴ－ＰＣＲのために用いられるプライマーを表４に列挙した。
【0099】
【表4】
【0100】
ＲＮＡシーケンス
全ＲＮＡをRNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN)を用いて単離した。Illumina mRNA-Seq Prep Kit (Illumina)を用いてＲＮＡシーケンスするライブラリーを構築した。断片化及びランダムにプライミングした１５０bpの対末端ライブラリーをIllumina HiSeq 4000を用いて配列決定した。
全ＲＮＡをRNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN)を用いて単離した。Illumina mRNA-Seq Prep Kit (Illumina)を用いてＲＮＡシーケンスするライブラリーを構築した。断片化及びランダムにプライミングした１５０bpの対末端ライブラリーをIllumina HiSeq 4000を用いて配列決定した。
【0101】
トランスクリプトーム分析に使用されるソフトウェア及びアルゴリズムには、Cutadapt 1.16 (http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html), Salmon 0.8.2 (https://combinelab. github.io/salmon/)、及びR 3.5.0 (https://www.r-project.org)が含まれる。ＨｅｐＧ２、Ｆ－ＰＨＨ－３及びＦ－ＰＨＨ－４の発現プロファイルを生データとしてダウンロードした。ＰＨＨ０ｄ、ｈｉＰＳＣ－Ｈｅｐ ｒｅｐ１、ｈｉＰＳＣ－Ｈｅｐ ｒｅｐ２、ｈｉＰＳＣ－Ｈｅｐ ｒｅｐ３及びｈｉＰＳＣ－Ｈｅｐ ｒｅｐ４（Gordillo, et al., Development, 142:2094-2108 (2015)）の発現プロファイルを、生のシーケンスリードとしてＧＥＯデータベース（ＧＳＭ２８１７１１２、ＧＳＭ２７５３３７６、ＧＳＭ２７５３３７７、ＧＳＭ２７５３３７８、ＧＳＭ２７５３３７９）からダウンロードした。ペアエンド及びシングルエンドライブラリーの間の遺伝子発現プロファイルを比較するために、本発明者らは、本発明者らが生成したペアエンドリードからのリード１を使用した。リード１及びダウンロードしたシングルエンドのリードは、Cutadaptを用いて同じ４０ｂｐの長さにトリミングした。各サンプルの発現値はSalmonにより定量した。ＲＮＡシーケンスデータの教師なしの階層的クラスタリングはＲにおけるｈｃｌｕｓｔパッケージにより生成した。
【0102】
生化学アッセイ
ヒトアルブミンは、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キット（Bethyl Laboratories）を用いて測定された。尿素濃度はQuantiChrom(商標) Urea Assay Kit (BioAssay Systems)により測定した。ＭＴＴアッセイは、製造業者の指示（Vybrant(登録商標) MTT Cell Proliferation Assay Kit, Invitrogen)に従って、示された時点で行った。
ヒトアルブミンは、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キット（Bethyl Laboratories）を用いて測定された。尿素濃度はQuantiChrom(商標) Urea Assay Kit (BioAssay Systems)により測定した。ＭＴＴアッセイは、製造業者の指示（Vybrant(登録商標) MTT Cell Proliferation Assay Kit, Invitrogen)に従って、示された時点で行った。
【0103】
統計解析
統計解析には、両側、対応の無いｔ検定を用いた。結果は平均±ＳＥＭで表され、ｎはＰＨＨの同一のバッチからの反復回数を示す。ｐ値は以下のとおりである：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１。
統計解析には、両側、対応の無いｔ検定を用いた。結果は平均±ＳＥＭで表され、ｎはＰＨＨの同一のバッチからの反復回数を示す。ｐ値は以下のとおりである：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１。
【0104】
結果及び考察
ＰＨＨをインビトロで長期間維持するために、小分子の組み合わせを用いた新たな化学的戦略が開発された。小分子は、特定の細胞標的の柔軟な時空間的調節を達成するそれらの能力のために、培養した細胞において自然シグナルを相乗的に組織化する利点を与える。ＰＨＨの維持を促進する小分子を同定するために、ＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）を最初に用いて、単離したばかりの初代ヒト肝細胞（Ｆ－ＰＨＨ）の全体的な遺伝子発現プロファイルを、インビトロで２４時間だけ培養した肝細胞と比較した。これまでの研究に則して、重要な肝細胞機能遺伝子は２４時間培養後に劇的にダウンレギュレーションされた（図１）。注目すべきことに、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路の主要成分の発現は、２４時間培養した肝細胞でアップレギュレートされた（図２Ａ）。
ＰＨＨをインビトロで長期間維持するために、小分子の組み合わせを用いた新たな化学的戦略が開発された。小分子は、特定の細胞標的の柔軟な時空間的調節を達成するそれらの能力のために、培養した細胞において自然シグナルを相乗的に組織化する利点を与える。ＰＨＨの維持を促進する小分子を同定するために、ＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）を最初に用いて、単離したばかりの初代ヒト肝細胞（Ｆ－ＰＨＨ）の全体的な遺伝子発現プロファイルを、インビトロで２４時間だけ培養した肝細胞と比較した。これまでの研究に則して、重要な肝細胞機能遺伝子は２４時間培養後に劇的にダウンレギュレーションされた（図１）。注目すべきことに、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路の主要成分の発現は、２４時間培養した肝細胞でアップレギュレートされた（図２Ａ）。
【0105】
以前の研究は、ＴＧＦ－βシグナル伝達が肝細胞のための上皮間葉転換（ＥＭＴ）の主要な誘導因子であることを示した。従って、ＴＧＦ－βシグナル伝達誘導のＥＭＴを遮断するために、ＴＧＦ－β阻害剤ＳＢ４３１５４２（ＳＢ４３）を使用し、そしてＳＢ４３処理をすることにより、培養した肝細胞は、２週間後でもＥ－カドヘリンの発現を伴う上皮形態を維持した（データは示さず）。しかしながら、ＴＧＦ－βシグナル伝達の遮断は、ＥＭＴ関連の転写因子であるカタツムリファミリー転写リプレッサー２（ＳＮＡＩ２）；ツイスト関連タンパク質１（ＴＷＩＳＴ１）の発現を抑制することができず、そして肝機能遺伝子（ＡＬＢ；ＣＰＳ１（カルバモイルリン酸シンテターゼ１）；ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２）の発現を助けることもできず（図２Ｂ）、ＴＧＦ－βシグナル伝達の遮断が、部分的にＥＭＴを抑制するが、ＰＨＨの機能状態の維持には限定的な効果しか持たないことを示した。
【0106】
機能的ＰＨＨを維持するために重要な他のシグナル伝達経路を同定するために、培養した肝細胞にＳＢ４３と組み合わせた個々の小分子を加えることによって、小分子の化学ライブラリーをスクリーニングした。アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）の活性剤であるフォルスコリン（ＦＳＫ）は、肝機能遺伝子発現（ＡＬＢ；ＣＳＰ１；ＣＹＰ３Ａ４；ＯＡＴＰ１Ｂ１)を維持し、α－平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）ＥＭＴマーカー遺伝子発現をダウンレギュレートし、（図３Ａ及び図３Ｂ）、肝形態の維持を伴うＰＨＨの生存を維持した。ＦＳＫ及びＳＢ４３（本明細書では、「２Ｃ」）を含むこの２つの化学的条件下で、本発明者らは、肝細胞が、２週間の培養後に典型的な肝極性化多角形形態及び稀な細胞死を示すことを観察した。対照的に、ＦＳＫ及びＳＢ４３の非存在下では、肝細胞は２週間以内で形態学的に脱極性化となり、培養細胞の生存率も低かった。
【0107】
長期的に２Ｃ条件下で維持されたＰＨＨ（２Ｃ－ＰＨＨ）は、それらの単離したばかりの対照物の機能的特性を有する
２Ｃ条件が長期的にＰＨＨの機能を維持できるかどうかを試験するための研究を行った。肝臓で合成及び分泌される血清タンパク質（ＡＬＢ及びＡｐｏＣ１）、窒素代謝の律速酵素（ＮＡＧＳ、ＣＰＳ１及びＯＴＣ）、重要な薬物動態代謝チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素（ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ９）及び輸送体（ＮＴＣＰ、ＭＲＰ２及びＢＳＥＰ）を含む、重要な肝機能マーカーのパネルの発現を最初に評価した。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析により、これらの遺伝子の発現は２Ｃ－ＰＨＨとＦ－ＰＨＨの間で同等であった（図４Ｂ）。更に、アミノ酸及び脂肪酸の代謝ならびに凝固に関与する遺伝子などの、他の肝機能遺伝子の広域スペクトルを分析した。結果は、２Ｃ－ＰＨＨの遺伝子発現プロファイルがＦ－ＰＨＨのそれと類似していることを示した。２Ｃが基礎培地型と機能的に独立していることを更に確認するために、２ＣをＷＭＥとＨＣＭの両方で試験した。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析は、培養４週間後に、ＨＣＭとＷＭＥの両方において２Ｃ処理した２Ｃ－ＰＨＨが、Ｆ－ＰＨＨと同等のレベルで肝遺伝子を発現することを示した（図４Ｃ；下パネル）。この結果は、２Ｃが培養培地の種類とは無関係に作用することを示しており、そして以下の実験はＷＭＥに基づいている。重要なことに、ＳＢ４３と併用したＦＳＫは、潜在的にｃＡＭＰを活性化することによって、（ＦＳＫ又はＳＢ４３単独と比較して、ＦＳＫ＋ＳＢ４３処理における、ＡＬＢ；Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）、アポリポタンパク質Ｃ－Ｉ（ＡＰＯＣ１）；ＣＹＰ２Ｄ６；ＮＴＣＰ発現のアップレギュレーション；及びＳＮＡＩ２及びＴＷＩＳＴ１のダウンレギュレーションとして測定される）肝細胞の維持に対して相乗効果を示した（図４Ａ－図４Ｄ）。
２Ｃ条件が長期的にＰＨＨの機能を維持できるかどうかを試験するための研究を行った。肝臓で合成及び分泌される血清タンパク質（ＡＬＢ及びＡｐｏＣ１）、窒素代謝の律速酵素（ＮＡＧＳ、ＣＰＳ１及びＯＴＣ）、重要な薬物動態代謝チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素（ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ９）及び輸送体（ＮＴＣＰ、ＭＲＰ２及びＢＳＥＰ）を含む、重要な肝機能マーカーのパネルの発現を最初に評価した。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析により、これらの遺伝子の発現は２Ｃ－ＰＨＨとＦ－ＰＨＨの間で同等であった（図４Ｂ）。更に、アミノ酸及び脂肪酸の代謝ならびに凝固に関与する遺伝子などの、他の肝機能遺伝子の広域スペクトルを分析した。結果は、２Ｃ－ＰＨＨの遺伝子発現プロファイルがＦ－ＰＨＨのそれと類似していることを示した。２Ｃが基礎培地型と機能的に独立していることを更に確認するために、２ＣをＷＭＥとＨＣＭの両方で試験した。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析は、培養４週間後に、ＨＣＭとＷＭＥの両方において２Ｃ処理した２Ｃ－ＰＨＨが、Ｆ－ＰＨＨと同等のレベルで肝遺伝子を発現することを示した（図４Ｃ；下パネル）。この結果は、２Ｃが培養培地の種類とは無関係に作用することを示しており、そして以下の実験はＷＭＥに基づいている。重要なことに、ＳＢ４３と併用したＦＳＫは、潜在的にｃＡＭＰを活性化することによって、（ＦＳＫ又はＳＢ４３単独と比較して、ＦＳＫ＋ＳＢ４３処理における、ＡＬＢ；Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）、アポリポタンパク質Ｃ－Ｉ（ＡＰＯＣ１）；ＣＹＰ２Ｄ６；ＮＴＣＰ発現のアップレギュレーション；及びＳＮＡＩ２及びＴＷＩＳＴ１のダウンレギュレーションとして測定される）肝細胞の維持に対して相乗効果を示した（図４Ａ－図４Ｄ）。
【0108】
まとめると、これらのデータは、２Ｃ条件が、長期培養したＰＨＨの重要な肝機能遺伝子発現を効果的に維持したことを示す。
【0109】
次に、ヒト肝細胞における、タンパク質合成と分泌の能力を示すアルブミン（ＡＬＢ）分泌、及び窒素の代謝能力を示す尿素合成を定量した。ＡＬＢの分泌は、２Ｃ無しの肝細胞では１週間以内に劇的に減少したが、２Ｃ－ＰＨＨでは約４週間良好に維持された。尿素合成についても同様の結果が得られた。これらの結果はＰＨＨの異なるバッチで再現性があった（図４Ｅ）。
【0110】
２Ｃ－ＰＨＨのインビボ生着能を試験した。４週間後に、２Ｃ－ＰＨＨは、移植先のマウスの肝臓に強固に再生着し、そしてＦ－ＰＨＨと同等のレベルでヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を分泌した。対照的に、２Ｃ無しで培養した肝細胞は、移植の２週間後にＨＳＡを検出できず、移植の４週間後にはＨＳＡレベルは２Ｃ－ＰＨＨとは対照的にかろうじて検出されたという事実が示すように、マウス肝臓の再生着は不十分あった（図４Ｊ）。まとめると、これらのデータは、２Ｃが、少なくとも４週間インビトロでＰＨＨの機能維持を支持できることを示した。
【0111】
２Ｃ条件における培養した肝細胞の薬物代謝能の維持
２Ｃ－ＰＨＨの薬物代謝能を評価するために、重要なＣＹＰ酵素の発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより定量した。培養１か月後に、２Ｃ－ＰＨＨにおけるＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｃ１９の発現は、Ｆ－ＰＨＨのそれと同等であった（図４）。薬物代謝活性を更に評価するために、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）アッセイを使用した。データは、１か月の培養後に、ヒト薬物酸化の８０％以上に関わる、２Ｃ－ＰＨＨ中のＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ１Ａ２の代謝活性が、Ｆ－ＰＨＨのそれらと同程度であることを示す一方で、２Ｃ無しで培養した肝細胞はこれらの代謝活性を消失した（図４Ｆ）。
２Ｃ－ＰＨＨの薬物代謝能を評価するために、重要なＣＹＰ酵素の発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより定量した。培養１か月後に、２Ｃ－ＰＨＨにおけるＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｃ１９の発現は、Ｆ－ＰＨＨのそれと同等であった（図４）。薬物代謝活性を更に評価するために、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）アッセイを使用した。データは、１か月の培養後に、ヒト薬物酸化の８０％以上に関わる、２Ｃ－ＰＨＨ中のＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ１Ａ２の代謝活性が、Ｆ－ＰＨＨのそれらと同程度であることを示す一方で、２Ｃ無しで培養した肝細胞はこれらの代謝活性を消失した（図４Ｆ）。
【0112】
２Ｃ－ＰＨＨが薬物－薬物相互作用（ＤＤＩ）を予測するために適用できるかどうかを試験するために、更なる実験を行った。ＤＤＩ試験において一般的に使用される強力なＣＹＰ酵素阻害剤及び誘導剤を適用し（Baranczewski et al., PR, 58:453-472, (2006)）、そして結果は２Ｃ－ＰＨＨがこれらの阻害剤及び誘導剤に効果的に反応することを示した（図４Ｇ、図４Ｈ及び図４Ｉ）。２Ｃ－ＰＨＨの薬物代謝活性はＣＹＰ酵素に特異的な阻害剤により劇的に抑制された（図４Ｉ）。加えて、１か月の培養後、２Ｃ－ＰＨＨにおける３つの主要なＣＹＰ酵素であるＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ２Ｂ６の遺伝子発現レベル及び代謝活性は、特定の誘導物質（図４Ｇ及び図４Ｈ）によく反応した。まとめると、これらのデータは、２ＣがインビトロでのＰＨＨの薬物代謝活性の維持を支持できることを示唆している。
【0113】
追加の小分子を有する２Ｃにより凍結保存し、再生した肝細胞の維持
２Ｃが、長期間ＰＨＨの強固な機能維持を可能にすることを考慮して、次いで、本発明者らは、２Ｃが適用におけるヒト肝細胞の主要な資源である凍結保存した初代ヒト肝細胞（Ｃｒｙｏ－ＰＨＨ）の維持を支持できるかどうかを試験した。しかしながら、Ｃｒｙｏ－ＰＨＨは、凍結保存のプロセスに起因する貧弱な生存率と機能性のため（(Donato et al., Current Drug Metabolis, 9:1-11 (2008b)）、インビトロで安定に維持することがより困難である。本発明者らは、２Ｃ条件下で、培養したＣｒｙｏ－ＰＨＨの改善された生存率を観察した。しかしながら、培養の４週間後には多角形の形態が失われ（データは示さず）、２Ｃで処理したＣｒｙｏ－ＰＨＨにおいて、ＥＭＴが起こったことが示唆された。
２Ｃが、長期間ＰＨＨの強固な機能維持を可能にすることを考慮して、次いで、本発明者らは、２Ｃが適用におけるヒト肝細胞の主要な資源である凍結保存した初代ヒト肝細胞（Ｃｒｙｏ－ＰＨＨ）の維持を支持できるかどうかを試験した。しかしながら、Ｃｒｙｏ－ＰＨＨは、凍結保存のプロセスに起因する貧弱な生存率と機能性のため（(Donato et al., Current Drug Metabolis, 9:1-11 (2008b)）、インビトロで安定に維持することがより困難である。本発明者らは、２Ｃ条件下で、培養したＣｒｙｏ－ＰＨＨの改善された生存率を観察した。しかしながら、培養の４週間後には多角形の形態が失われ（データは示さず）、２Ｃで処理したＣｒｙｏ－ＰＨＨにおいて、ＥＭＴが起こったことが示唆された。
【0114】
このＳＢ４３とＦＳＫの併用に基づいて、さらなる化学的スクリーニングを実施して、ＤＡＰＴ（Ｎｏｔｃｈ阻害剤）、ＩＷＰ２（Ｗｎｔ阻害剤）及びＬＤＮ１９３１８９（ＢＭＰ阻害剤）がＥＭＴマーカー遺伝子（コラーゲンＩ型α１（ＣＯＬ１Ａ１）；胸腺細胞抗原１（Ｔｈｙ１）；ビメンチン（ＶＩＭ））の発現を更に遮断することを示した（図５Ａ－図５Ｃ）。特に、同一のシグナル伝達経路を標的とする小分子又はサイトカインは、ＥＭＴ遺伝子の同様の抑制をもたらした（図５Ｄ）。５つの化学物質（５Ｃ）であるＦＳＫ、ＳＢ４３、ＤＡＰＴ、ＩＷＰ２及びＬＤＮ１９３１８９からなるこの最小条件は、培養した凍結保存の初代ヒト肝細胞（Ｃｒｙｏ－ＰＨＨ）において、ＥＭＴ遺伝子の発現を効果的に遮断し（図６Ａ及び図５Ｅ）（間葉系の典型的なバイオマーカーであるＣＯＬ１Ａ１の発現は、５Ｃ処理後に効果的にダウンレギュレートされた）、そして４週間にわたりＦ－ＰＨＨ及びＣｒｙｏ－ＰＨＨの両方の典型的な多角形の維持を支持した（データは示さず）。更に、５Ｃで培養したＰＨＨ（５Ｃ－ＰＨＨ）は、４週間培養後に、極性化とともに代理肝機能マーカー（ＡＬＢ、ＡＡＴ（α１－アンチトリプシン）、ＣＰＳ１、ＣＹＰ３Ａ４；ＣＹＰ１Ａ２）を発現し、細胞－細胞境界でＣＤＦＤＡの沈着として測定された（データは示さず）。また５Ｃ－ＰＨＨにおけるアルブミン分泌及び尿素合成も、少なくとも３週間維持され、ＰＨＨの９バッチで再現性があった（図６Ｂ－図６Ｅ）。興味深いことに、高い生存能力を有するＰＨＨのバッチは、５Ｃの条件下で２か月間機能的に維持することができた。
【0115】
次に、全体的な遺伝子発現プロファイリングの時間経過分析を、単離から１か月間にわたって５Ｃ－ＰＨＨのＲＮＡシーケンスにより実施した。よく用いられる肝細胞培養条件（Dunn, et al., Biotechnol. Prog., 7:237-245 (1991)）である、サンドイッチ培養法（すなわち、２層のゲル化コラーゲン間の肝細胞の培養）を同様に比較のために分析した。階層的クラスタ化は、１２時間後の長期培養では、サンドイッチ培養におけるＰＨＨのトランスクリプトームはヌル及びＤＭＳＯ群のものと類似したが、５Ｃ－ＰＨＨのみがＦ－ＰＨＨとともにクラスタ化されたことを例証した。注目すべきことは、サンドイッチ培養は５Ｃと組み合わされなかったことである。全体的な肝遺伝子発現を支持する５Ｃ条件の能力は、ＰＨＨの別の３つの独立したバッチで再現性があった（図７）。更に、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、サンドイッチ法と比較して、５Ｃ条件が代理肝細胞機能マーカーの発現を維持し、間葉系マーカー遺伝子の発現を抑制するのにより有効であることを確認した（図８Ａ）。また、５Ｃは、肝細胞機能において重要な役割を果たす転写因子の発現を効率的に維持した（図８Ｂ）。まとめると、これらの結果から、５Ｃ条件は、ヒト肝細胞の全体的な遺伝子発現パターンをインビトロで長期間維持できることが示された。
【0116】
肝細胞は、外因性薬物の代謝及び解毒に重要であることが知られている；しかしながら、肝細胞のＣＹＰの代謝活性は培養において急速に失われる（図１）。開示された５Ｃ系では、４週間培養したＰＨＨは、Ｆ－ＰＨＨと同等のレベルでコアＣＹＰ酵素を発現することが見出された。更に、５Ｃ－ＰＨＨにおける主要な第II相薬物代謝酵素及び第III相薬物代謝関連輸送体は、Ｆ－ＰＨＨと同レベルで発現した（図８Ｄ及び図８Ｅ）。これらのデータは、５Ｃが薬物代謝遺伝子の発現を効果的に維持することを示唆した。
【0117】
次に、ヒトにおける臨床薬物の約８０～９０％の代謝に関与するＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｂ６を含む重要なＣＹＰ酵素を特性化した。液体クロマトグラフィー－質量分析は、培養２週間後に、５Ｃ－ＰＨＨにおけるこれらの主要酵素の代謝活性がＦ－ＰＨＨのそれらと同等であることを示した（図８Ｆ）。対照的に、対照群で培養したＰＨＨの代謝活性はほとんど検出されなかった（図８Ｆ）。これらの結果は、ＰＨＨの３つの異なるバッチで再現性があった。まとめると、これらの結果は、５Ｃが培養ヒト肝細胞の薬物代謝活性をインビトロで維持することを示した。
【0118】
５Ｃ培養条件によるヒト肝細胞の強固な機能維持は、インビトロでのＨＢＶ感染をモデル化するためのプラットフォームを提供する。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、４週間、５Ｃ条件下で培養したＦ－ＰＨＨとＰＨＨの間でＮＴＣＰの同等の発現レベルを確認した（図９Ａ）。次に、ＰＨＨにＨＢＶ感染患者由来の血漿を接種することにより、５Ｃ－ＰＨＨ培養物の上清中で検出されたＨＢＶ産物（分泌されたＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＤＮＡ粒子）を伴う、ＨＢＶ感染の成功が達成された（図９Ｂ及び図９Ｄ）。細胞内ＨＢＶ－３．５kb及びＨＢＶ全ＲＮＡ転写産物のレベルも時間とともに増加した（図９Ｃ）。ＨＢＶ産物の高レベルでの生成は５Ｃ－ＰＨＨにおいて少なくとも１か月間持続された。重要なことに、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの形成は、５Ｃ－ＰＨＨにおけるサザンブロットによって検出可能であり（図９Ｈ）、ｑＰＣＲ分析は、ｃｃｃＤＮＡが５Ｃ条件下の４週間の培養で持続的に検出可能であることを示した（図９Ｅ）。５Ｃ－ＰＨＨの効率的なＨＢＶ感染は、ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）の免疫染色により実証された（データは示さず）。更に、５Ｃ－ＰＨＨは、ＭＯＩを１０に減少しても、ＨＢＶ感染に対して感受性があった（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。５Ｃで支持されたＨＢＶ感染は、Ｃｒｙｏ－ＰＨＨを含むＰＨＨの追加バッチ（＞５バッチ）において良く再現された（図１１Ａ－図１１Ｅ）。重要なことに、５Ｃは、様々な遺伝子型のＨＢＶ及びインビトロ産生細胞株ＨｅｐＡＤ３８を含む、様々な感染源からのＨＢＶ感染を安定的に支持することができた（図１１Ａ－図１１Ｄ）。
【0119】
ウイルス粒子をＨＢＶに感染した５Ｃ－ＰＨＨの上清から回収し、それらを用いてナイーブＰＨＨに接種した。ＨＢＶに感染した５Ｃ－ＰＨＨの上清を接種したＰＨＨにおいてＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡが検出され（図９Ｆ－図９Ｇ）、５Ｃ－ＰＨＨがＨＢＶライフサイクル全体を支持し、ＨＢＶの感染粒子を生成できることを示した。更に、ＨＢＶに感染した５Ｃ－ＰＨＨの割合は、培養時間の延長とともに増加し（データは示さず；図１１Ｅ）、細胞間の感染及び／又はＨＢＶ粒子のデノボ感染によるＨＢＶ拡散の可能性を示唆した。
【0120】
５Ｃ－ＰＨＨ感染モデルは、２つのクラスの臨床抗ＨＢＶ薬物：エンテカビル（ＥＴＶ）及びラミブジン（ＬＡＭ）などのインターフェロン－α（ＩＦＮ－α）及びヌクレオシド（ヌクレオチド）逆転写酵素阻害剤に敏感に反応することが分かった。ＨＢＶに感染した５Ｃ－ＰＨＨの３つの薬物全て（ＥＴＶ、ＬＡＭ及びＩＦＮ－α）による処理は、ＨＢＶ産物の減少をもたらした（図１２Ａ－図１２Ｄ）。５Ｃで培養した凍結保存ＰＨＨでも、ＩＦＮ－αによるｃｃｃＤＮＡの著しい減少が見られ、同様の結果が得られた。更に、インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）は、ＩＦＮ－αで処理した場合、長期間培養した５Ｃ－ＰＨＨにおいて有意にアップレギュレートしたが、ＨＢＶ感染に対しては弱く反応し、肝細胞の自然免疫からＨＢＶが回避されるという以前の報告（Cheng, et al., Hepatol., 66:1779-1793 (2017)）と一致した（図１３Ａ）。
【0121】
更に、前記培養条件をＰＨＨにおける長期間ＨＢＶ感染に対する他の報告されている培養条件（Lucifira, et al., Science, 343:1221-1228 (2014), Winner, et al., Nat. Comm., 8:1256 (2017), Xia, et al., J. Hepatol., 656:494-5603 (2017))と比較し、そして５Ｃが、特に肝機能の長期間維持及びＨＢＶ感染の安定支持において、明らかな利点を示すことを見出した（データは示さず；図１３Ｂ、図１３Ｃ及び図１３Ｄ）。重要なことに、５Ｃ条件は、マイクロウェルフォーマットに小型化することができ、高スループットアプリケーションに適用可能である（図１４Ａ－図１４Ｃ）。更に、これらの結果は、インビトロでのＰＨＨの長期間維持のために、単純ではあるが、非常に効果的且つ安定した培養条件として５Ｃを確立しており、そしてＨＢＶ感染の研究に大きな価値がある。
【0122】
ＨＢＶに加えて、５Ｃ－ＰＨＨはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のような他の肝炎ウイルスにも感染する可能性がある。５Ｃ－ＰＨＨを分泌型ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）レポーターを発現するＨＣＶＪｃ１Ｇの感染性ウイルス粒子に曝露した。ウイルス複製は５Ｃ－ＰＨＨで検出され、そしてＣ型肝炎処置のための直接作用抗ウイルス薬であるＤＣＶにより効果的に遮断された（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。ＨＢＶとは異なり、ＨＣＶは５Ｃ－ＰＨＨにおいて強固なＩＳＧ発現を誘導した（図１５Ｃ）。まとめると、これらの結果は、５Ｃ－ＰＨＨが肝指向性感染をモデル化し、そして抗ウイルス戦略を研究するための有効なモデルとして役立つことを示す。
【0123】
要約すると、初代ヒト肝細胞の機能を長期間維持するための化学的アプローチが開発された。このプラットフォームを用いて、ＰＨＨにおける全ウイルスライフサイクルに及び、インビトロで子孫ウイルスを放出する持続性ＨＢＶ感染が実証された。特に、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの形成はＰＨＨにおいて捕捉されたが、これはＨＢＶがウイルスライフサイクルに再び入り、そしてヒト肝臓においてＨＢＶの再発を誘導するための鍵である。このプラットフォームは、単純であり、そして新しい抗ウイルス戦略を考案するための、特に慢性肝炎の治癒を見出すために不可欠の可能性がある、ｃｃｃＤＮＡを標的とする化合物のためのハイスループットスクリーニングに容易に適用できる。方法論的には、小分子は、細胞シグナルを正確にバランスさせ、そして成熟細胞の細胞同一性と機能性を安定化するために分子ネットワークを調節する、高度に調節可能な機能性を有し、他の機能性細胞型の維持にも拡張が可能な戦略を有する。
【0124】
２Ｃ及び５Ｃ条件で培養した肝細胞の全体的な遺伝子発現
全培養工程中のＰＨＨの動的遺伝子発現変化をモニターするために、２Ｃ及び５Ｃを用いて又は用いずに、それぞれ培養した２つの異なるバッチ（Ｂ１及びＢ２）の肝細胞を、ＲＮＡシーケンスによる遺伝子発現プロファイリングのために１．５、３、５、８、１５及び２７日目に回収した。Ｆ－ＰＨＨとＣｒｙｏ－ＰＨＨの両方を陽性対照として使用した。階層的クラスタリングは、２Ｃ－ＰＨＨ及び５Ｃ－ＰＨＨが単離したばかりの対照物と同等な全体的な遺伝子発現プロファイルを有することを例証した（データは示さず）。機能維持と同様に、結果は、２Ｃ及び５Ｃの条件が肝細胞の重要な転写因子（ＴＦ）の発現を維持し、その発現レベルはＦ－ＰＨＨのそれらと同等であることを示した（データは示さず）。これらのデータは、２Ｃ／５Ｃが、Ｆ－ＰＨＨと同様に培養したＰＨＨの全体的な遺伝子発現プロファイルの長期間の維持を支持することを示す。
全培養工程中のＰＨＨの動的遺伝子発現変化をモニターするために、２Ｃ及び５Ｃを用いて又は用いずに、それぞれ培養した２つの異なるバッチ（Ｂ１及びＢ２）の肝細胞を、ＲＮＡシーケンスによる遺伝子発現プロファイリングのために１．５、３、５、８、１５及び２７日目に回収した。Ｆ－ＰＨＨとＣｒｙｏ－ＰＨＨの両方を陽性対照として使用した。階層的クラスタリングは、２Ｃ－ＰＨＨ及び５Ｃ－ＰＨＨが単離したばかりの対照物と同等な全体的な遺伝子発現プロファイルを有することを例証した（データは示さず）。機能維持と同様に、結果は、２Ｃ及び５Ｃの条件が肝細胞の重要な転写因子（ＴＦ）の発現を維持し、その発現レベルはＦ－ＰＨＨのそれらと同等であることを示した（データは示さず）。これらのデータは、２Ｃ／５Ｃが、Ｆ－ＰＨＨと同様に培養したＰＨＨの全体的な遺伝子発現プロファイルの長期間の維持を支持することを示す。
【0125】
ｃＡＭＰ－ＰＫＡとｃＡＭＰ－ＥＰＡＣの両方はＰＨＨの維持に不可欠である
本発明者らの化学的条件の根底にある潜在的なメカニズムを調査するために、ヒト肝細胞を維持するコア小分子の組み合わせであるＦＳＫ及びＳＢ４３を、同一のシグナル伝達経路を遮断するか又は刺激するかどちらかのそれらの類似体で置き換えた。一方、培養した肝細胞の遺伝子発現レパートリーは、ＲＮＡシーケンスによりプロファイリングされた。階層的クラスタリング分析は、ＦＳＫがＰＨＨの維持において中心的役割を果たすことを示した（データは示さず）。ＮＫＨ４７７（ｃＡＭＰアゴニスト）及びｄｂ－ｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ類似体）は、ＦＳＫを置き換え、ＰＨＨの全体的な遺伝子発現を維持した。対照的に、ＦＳＫの不活性類似体である１、９－ジデオキシホルスコリン（１，９－ｄＦＳＫ）で処理した肝細胞は、ＦＳＫ無しの対照群と同様の発現プロファイルを誘導した。肝マーカー遺伝子発現、ＡＬＢ分泌及び尿素合成に対するｄｂ－ｃＡＭＰの効果を調査した（データは示さず）。このデータは、ＦＳＫがＰＨＨの維持に必須の小分子であり、ＡＣの活性化を介して機能していたことを示した（データは示さず）。
本発明者らの化学的条件の根底にある潜在的なメカニズムを調査するために、ヒト肝細胞を維持するコア小分子の組み合わせであるＦＳＫ及びＳＢ４３を、同一のシグナル伝達経路を遮断するか又は刺激するかどちらかのそれらの類似体で置き換えた。一方、培養した肝細胞の遺伝子発現レパートリーは、ＲＮＡシーケンスによりプロファイリングされた。階層的クラスタリング分析は、ＦＳＫがＰＨＨの維持において中心的役割を果たすことを示した（データは示さず）。ＮＫＨ４７７（ｃＡＭＰアゴニスト）及びｄｂ－ｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ類似体）は、ＦＳＫを置き換え、ＰＨＨの全体的な遺伝子発現を維持した。対照的に、ＦＳＫの不活性類似体である１、９－ジデオキシホルスコリン（１，９－ｄＦＳＫ）で処理した肝細胞は、ＦＳＫ無しの対照群と同様の発現プロファイルを誘導した。肝マーカー遺伝子発現、ＡＬＢ分泌及び尿素合成に対するｄｂ－ｃＡＭＰの効果を調査した（データは示さず）。このデータは、ＦＳＫがＰＨＨの維持に必須の小分子であり、ＡＣの活性化を介して機能していたことを示した（データは示さず）。
【0126】
ｃＡＭＰの下流標的を更に調査した。結果は、ＰＫＡ又はＥＰＡＣのいずれかの阻害が個々に間葉系マーカーの発現を増強することを示し、肝細胞培養の間のＥＭＴの発生を示唆した（データは示さず）。更に、ＰＫＡ又はＥＰＡＣのいずれかの単独の活性化は、２ＣからのＦＳＫの離脱を完全に補償することができなかった（データは示さず）。これらのデータは、ｃＡＭＰが、ＰＨＨ維持において相乗的であるが非重複的であるＰＫＡ、ＥＰＡＣ、及びｃＡＭＰの下流経路の中心的なシグナル伝達ハブである可能性を示唆する。
【0127】
ｈＥＳＣ由来の肝細胞の機能的成熟を促進する化学物質カクテル
２Ｃがヒト肝細胞の成熟機能を維持できること考慮して、開示された化学培養条件がヒト胚性幹細胞由来の肝細胞（ｈＥＳＣ－Ｈｅｐｓ）の成熟を促進できるかどうかを試験する研究を行った。ｈＥＳＣ－Ｈｅｐｓは確立されたプロトコル（Zhao et al., Cell Res., 23:157-161 (2013))の修正を用いて生成した。免疫蛍光分析は、ｈＥＳＣ－Ｈｅｐｓが、肝細胞に特異的なＴＦである、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦＡ４、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１及びＣＥＢＰＡを発現することを示した（データは示さず）。アルブミンはｈＥＳＣ－Ｈｅｐにおいて検出された。ｈＥＳＣ－ＨｅｐはＡＦＰ及びＡＬＢ（データは示さず）及びＣＹＰ３Ａ４に対して免疫陽性であったが、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１（データは示さず）に対して免疫陽性ではなかった。これらのデータはｈＥＳＣ－Ｈｅｐの胎児様機能の特徴を示した。
２Ｃがヒト肝細胞の成熟機能を維持できること考慮して、開示された化学培養条件がヒト胚性幹細胞由来の肝細胞（ｈＥＳＣ－Ｈｅｐｓ）の成熟を促進できるかどうかを試験する研究を行った。ｈＥＳＣ－Ｈｅｐｓは確立されたプロトコル（Zhao et al., Cell Res., 23:157-161 (2013))の修正を用いて生成した。免疫蛍光分析は、ｈＥＳＣ－Ｈｅｐｓが、肝細胞に特異的なＴＦである、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦＡ４、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１及びＣＥＢＰＡを発現することを示した（データは示さず）。アルブミンはｈＥＳＣ－Ｈｅｐにおいて検出された。ｈＥＳＣ－ＨｅｐはＡＦＰ及びＡＬＢ（データは示さず）及びＣＹＰ３Ａ４に対して免疫陽性であったが、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１（データは示さず）に対して免疫陽性ではなかった。これらのデータはｈＥＳＣ－Ｈｅｐの胎児様機能の特徴を示した。
【0128】
対照的に、ｈＥＳＣ－Ｈｅｐｓを２Ｃ条件に移した後に、ｈＥＳＣ－Ｈｅｐｓは小さな核－細胞質比を有する多角形様形態を獲得した（データは示さず）。更に、肝機能マーカー遺伝子（ＨＮＦＡ４、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１、ＣＥＢＰＡ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ１Ａ２など）は、２Ｃで培養７日目から徐々にアップレギュレートされた（示されないデータ及び図１６）。特に、細胞間毛細胆管は、培養２週間後に構成され（データは示さず）、そして低下したＡＦＰ発現を有した（データは示さず）。重要なことに、２Ｃで培養したｈＥＳＣ－Ｈｅｐは、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ｅ１を含むＣＹＰ酵素のスペクトルを発現した（データは示さず）。薬物代謝に関連する二つの重要な核内受容体であるＰＸＲ及びＣＡＲは、２Ｃ条件下で著しくアップレギュレートされた（図１６）。２Ｃ条件下で、成体肝細胞に特異的な遺伝子のマスターレギュレーターである、ＨＮＦ４Ａの発現が観察され、そしてＣＥＢＰＡ、ＰＲＯＸ１及びＡＴＦ５を含む成熟因子の発現が増加した。それ以外の肝細胞に特異的な遺伝子は２Ｃの処理なしで徐々に減少した（図１６）。まとめると、これらのデータは、成体肝細胞に対する開示された化学的条件が、ｈＰＳＣ－Ｈｅｐの機能的成熟を成熟肝細胞のそれに近い形で促進したことを示す。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【図4J】
【図4K】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図9H】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】