知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-27
(45)【発行日】2024-12-05
(54)【発明の名称】抗タウ抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20241128BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241128BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241128BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241128BHJP
C12N 5/20 20060101ALI20241128BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241128BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241128BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20241128BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20241128BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20241128BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241128BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241128BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
C07K16/46
C12N15/63 Z
C12N15/13
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12P21/08
C12N5/20
A61K39/395 N
A61P25/00
A61P25/28
A61P25/16
A61P25/14
A61K48/00
G01N33/53 D
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022503414
(86)(22)【出願日】2020-07-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-26
(86)【国際出願番号】 KR2020009207
(87)【国際公開番号】W WO2021010712
(87)【国際公開日】2021-01-21
【審査請求日】2023-07-13
(31)【優先権主張番号】10-2019-0085233
(32)【優先日】2019-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCTC KCTC14155BP
(73)【特許権者】
【識別番号】522021077
【氏名又は名称】アデル，インコーポレーテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＤＥＬ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｒａｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｓａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｌｓａｎ， ８８， Ｏｌｙｍｐｉｃ－ｒｏ ４３－ｇｉｌ， Ｓｏｎｇｐａ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０５５０５， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】ユン，スン－ヨン
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－００７２５７９（ＫＲ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５３０９７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２５１７３１（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）
Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号７により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１２により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；配列番号８により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号９により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号９により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号９により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１０により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；ならびに
配列番号１１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント
からなる群より選択される抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
フラグメントが、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖからなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
請求項１に記載の抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項4】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項5】
請求項４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項6】
請求項１に記載の抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを生成するための方法であって、請求項５に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、前記方法。
【請求項7】
請求項１に記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体の重鎖および軽鎖をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項8】
アクセッション番号ＫＣＴＣ １４１５５ＢＰを有するハイブリドーマ。
【請求項9】
変性性神経疾患を予防または処置するための医薬組成物であって、活性成分として請求項１に記載の抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、前記医薬組成物。
【請求項10】
変性性神経疾患が、タウタンパク質媒介性神経疾患であり、ここで、タウタンパク質媒介性神経疾患が、タウオパシー、原発性加齢性タウオパシー、慢性外傷性脳症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭型認知症、リティコ・ボディグ病、パーキンソニズム、亜急性硬化性髄膜炎、鉛脳症, 結節性硬化症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ハラーホルデン・スパッツ病、またはリポフスチン沈着症であり、ここで、タウオパシーが、アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17：ＦＴＤＰ－１７）と集合的に称される一群の関連障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ボクシング認知症（ＤＰ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳＤ）、レビー小体病、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはハンチントン病である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
脳内、脳室内、腹腔内、経皮、筋肉内、硬膜内、静脈内、皮下、および鼻の投与の経路からなる群より選択されるいずれか１つの投与の経路を介して投与される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項12】
予防または処置が、変性性神経疾患を有するようになることが予測されるかまたはこれを現在有する対象に、請求項１に記載の抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項13】
変性性神経を診断するための組成物であって、請求項１に記載の抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、前記組成物。
【請求項14】
変性性神経疾患を予防、処置または診断するためのキットであって、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の発現ベクター、または請求項５に記載の宿主細胞を含む、前記キット。
【請求項15】
変性性神経疾患を予防または処置するために使用される医薬を調製するための、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タウタンパク質に特異的に結合する抗タウ抗体、およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
認知症の発症形態のうちの約５０％の原因であるアルツハイマー病は、６５歳以上で発症率が増加する変性性の頭部の神経疾患であり、それは、高齢化により世界中で迅速に増加している。
アルツハイマー病の発症の原因は、主に、β－アミロイドの蓄積、タウタンパク質の過剰リン酸化、またはプレセニリン１により引き起こされるβ－アミロイド産生の増加が原因であると考えられている。これらの中で、β－アミロイドの蓄積により引き起こされる神経細胞毒性は、アルツハイマー型認知症の発症の主要な原因であると考えられている（Hardy AJ et al., Science, 256, 184-185, 1992）。しかし、イーライリリー・アンド・カンパニーのアルツハイマー病のための新薬候補であったソラネズマブについての第ＩＩＩ相試験が失敗したことから、β－アミロイドの蓄積により引き起こされる神経細胞毒性は、顕著なものではないことが見出された。したがって、異常なタウタンパク質の過剰リン酸化がアルツハイマー病の発症の主要な原因として作用するという考えに、焦点が当てられている。
アルツハイマー病の発症の原因は、主に、β－アミロイドの蓄積、タウタンパク質の過剰リン酸化、またはプレセニリン１により引き起こされるβ－アミロイド産生の増加が原因であると考えられている。これらの中で、β－アミロイドの蓄積により引き起こされる神経細胞毒性は、アルツハイマー型認知症の発症の主要な原因であると考えられている（Hardy AJ et al., Science, 256, 184-185, 1992）。しかし、イーライリリー・アンド・カンパニーのアルツハイマー病のための新薬候補であったソラネズマブについての第ＩＩＩ相試験が失敗したことから、β－アミロイドの蓄積により引き起こされる神経細胞毒性は、顕著なものではないことが見出された。したがって、異常なタウタンパク質の過剰リン酸化がアルツハイマー病の発症の主要な原因として作用するという考えに、焦点が当てられている。
【0003】
タウタンパク質は、細胞の材料を輸送するタンパク質である微小管を安定化させるタンパク質である。タウタンパク質は、ヒトの体内において６つのアイソフォームにおいて存在し、中枢神経系のニューロンにおいて豊富である。加えて、タウタンパク質において変異が生じた場合、タウタンパク質は過剰リン酸化され、これが神経細胞において神経原線維タングル（ＮＦＴ）を異常に蓄積させ、それにより認知症およびパーキンソン病などの変性性神経疾患を引き起こすことが知られている（Dong Hee Choi et al., Brain & NeuroRehabilitation, 4, 21-29, 2011）。
【0004】
しかし、４４１アミノ酸からなるヒトタウタンパク質は、翻訳語修飾が起こり得る広範な部位を有し、これが、タウタンパク質において、認知症に対する予防的または治療的効果を発揮する標的部分を見出すことを困難にする。かかる多様な修飾に起因して、治療剤を開発することにおいてもまた困難が存在する。
【発明の概要】
【0005】
発明の開示
技術的課題
したがって、本発明者らは、変性性神経疾患のために有効な治療剤を開発するために研究してきた。結果として、本発明者らは、２８０番目のリジンがアセチル化されているタウタンパク質のフラグメントに特異的に結合しタウタンパク質の凝集を減少させる抗体を見出した。加えて、本発明者らは、認知症が誘導された動物モデルを用いた実験において、抗体が投与された動物モデルは、改善された運動機能および認知機能を示すことを見出した。
技術的課題
したがって、本発明者らは、変性性神経疾患のために有効な治療剤を開発するために研究してきた。結果として、本発明者らは、２８０番目のリジンがアセチル化されているタウタンパク質のフラグメントに特異的に結合しタウタンパク質の凝集を減少させる抗体を見出した。加えて、本発明者らは、認知症が誘導された動物モデルを用いた実験において、抗体が投与された動物モデルは、改善された運動機能および認知機能を示すことを見出した。
【0006】
課題に対する解決方法
上の課題を解決するために、本発明の側面において、（ｉ）配列番号１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｉｉ）配列番号４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
上の課題を解決するために、本発明の側面において、（ｉ）配列番号１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに（ｉｉ）配列番号４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0007】
本発明の別の側面において、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント、または抗タウ抗体の重鎖可変領域および／もしくは軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明の別の側面において、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
本発明のさらなる別の側面において、発現ベクターが導入される宿主細胞が提供される。
本発明の別の側面において、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
本発明のさらなる別の側面において、発現ベクターが導入される宿主細胞が提供される。
【0008】
本発明のなおさらに別の側面において、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを生成するための方法が提供され、該方法は、宿主細胞を培養するステップを含む。
本発明のなおさらに別の側面において、アクセッション番号ＫＣＴＣ １４１５５ＢＰを有するハイブリドーマが提供される。
本発明のなおさらに別の側面において、変性性神経疾患を予防または処置するための医薬組成物が提供され、該医薬組成物は、活性成分として、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
本発明のなおさらに別の側面において、アクセッション番号ＫＣＴＣ １４１５５ＢＰを有するハイブリドーマが提供される。
本発明のなおさらに別の側面において、変性性神経疾患を予防または処置するための医薬組成物が提供され、該医薬組成物は、活性成分として、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【0009】
本発明のなおさらに別の側面において、変性性神経疾患を診断するための組成物が提供され、該組成物は、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
本発明のなおさらに別の側面において、変性性神経疾患を予防、処置または診断するためのキットが提供され、該キットは、抗体またはその抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、発現ベクター、または宿主細胞を含む。
本発明のなおさらに別の側面において、変性性神経疾患を予防、処置または診断するためのキットが提供され、該キットは、抗体またはその抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、発現ベクター、または宿主細胞を含む。
【0010】
発明の有利な効果
本発明による抗タウ抗体は、２８０番目のリジンがアセチル化されているタウタンパク質に特異的に結合することができ、異常なタウタンパク質の凝集が阻害される。加えて、本発明による抗タウ抗体が認知症が誘導された動物モデルに投与された場合、抗タウ抗体は、動物モデルの運動機能および認知機能を改善することができる。したがって、本発明による抗タウ抗体は、変性性神経疾患を予防または処置するために有利に用いることができる。
本発明による抗タウ抗体は、２８０番目のリジンがアセチル化されているタウタンパク質に特異的に結合することができ、異常なタウタンパク質の凝集が阻害される。加えて、本発明による抗タウ抗体が認知症が誘導された動物モデルに投与された場合、抗タウ抗体は、動物モデルの運動機能および認知機能を改善することができる。したがって、本発明による抗タウ抗体は、変性性神経疾患を予防または処置するために有利に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図3】図３は、タンパク質フラグメントＫ２８０－ａｃに対して特異的に結合するモノクローナル抗体を選択するために、抗体とタンパク質フラグメントＫ２８０－ａｃとの間の結合を同定するために行われた、ウェスタンブロット試験の結果を図示する。
【0012】
【図6】図６は、アセチル化された野生型タンパク質およびアセチル化されていない野生型タウタンパク質がＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ＿ｖ０１抗体に対して特異的に結合するか否かを同定するために行われた、試験の結果を図示する。
【0013】
【0014】
【0015】
【図21】図２１は、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体と、正常マウス（野生型）または認知症誘導マウスモデル（Ｔａｕ Ｐ３０１Ｌ）の大脳皮質および海馬の組織において発現されるアセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）との間の結合を同定するために行われた、免疫沈降およびウェスタンブロット試験の結果を図示する。
【図23A】図２３Ａは、正常な高齢者の脳組織またはアルツハイマー病を有する患者の脳組織における、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）、アセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）、およびアミロイド－βの発現レベルを同定するために行われた、試験の結果を図示する。
【図23B】図２３Ｂは、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体と、正常な高齢者の脳組織またはアルツハイマー病を有する患者の脳組織において発現されたアセチル化タウタンパク質との間の結合を同定するために行われた、試験の結果を図示する（*ｐ＜０．０５）。
【0016】
【図26】図２６は、正常マウス、認知症誘導マウスモデル、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を脳室内投与した認知症誘導マウスモデルの脳組織における、リン酸化されたタウタンパク質（ｐＳｅｒ３９６）の発現レベルを図示する（**ｐ＜０．０１）。
【図27】図２７は、正常マウス、認知症誘導マウスモデル、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を脳室内投与した認知症誘導マウスモデルの脳組織における、アセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）の発現レベルを図示する。
【図28】図２８は、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体で免疫染色された脳組織を示す写真を図示し、ここで、脳組織は、正常マウス、認知症誘導マウスモデル、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を脳室内投与した認知症誘導マウスモデル（Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ）から得られたものである。
【0017】
【図31】図３１は、正常マウス、認知症誘導マウスモデル、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を腹腔内投与した認知症誘導マウスモデルの脳組織における、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）の発現レベルを図示する（*ｐ＜０．０５）。
【図32】図３２は、正常マウス、認知症誘導マウスモデル、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を腹腔内投与した認知症誘導マウスモデルの脳組織における、アセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）の発現レベルを図示する（*ｐ＜０．０５）。
【図33】図３３は、正常マウス、認知症誘導マウスモデル、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を腹腔内投与した認知症誘導マウスモデルの脳組織における、リン酸化されたタウタンパク質（ｐＴ２３１）の発現レベルを図示する（*ｐ＜０．０５）。
【0018】
【0019】
【0020】
【図46】図４６は、正常マウス、高齢の認知症誘導マウスモデル、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を腹腔内投与した高齢の認知症誘導マウスモデルの脳組織における、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）の発現レベルを図示する（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）。
【図47】図４７は、正常マウス、高齢の認知症誘導マウスモデル、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を腹腔内投与した高齢の認知症誘導マウスモデルの脳組織における、アセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）の発現レベルを図示する（**ｐ＜０．０１）。
【図48】図４８は、正常マウス、高齢の認知症誘導マウスモデル、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を腹腔内投与した高齢の認知症誘導マウスモデルの脳組織における、リン酸化された全タウタンパク質（ｐＴ２３１）の発現レベルを図示する（*ｐ＜０．０５）。
【0021】
【図51】図５１は、アセチル化タウタンパク質により処置されたドナー細胞の培地を得た後で行われるウェスタンブロット試験により同定される、ヘマグルチニン（ＨＡ）、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）、およびアセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）の発現レベルを図示する。
【図52】図５２は、アセチル化タウタンパク質により処置されたドナー細胞の培養物を神経細胞に適用し、１時間または２０時間後に当該神経細胞を溶解させた後で行われるウェスタンブロット試験により同定される、細胞内タウタンパク質凝集物を図示する。
【図53】図５３は、アセチル化タウタンパク質で処置されたドナー細胞の培養物を神経細胞に適用し、１時間または２０時間後に神経細胞を溶解させた後で、ウェスタンブロットおよび免疫沈降試験により同定される細胞内タウタンパク質凝集物を図示する。
【0022】
【図56】図５６は、抗ＡＴ８抗体で免疫染色された脳組織を示す写真を図示し、ここで、脳組織は、アルツハイマー病を有する患者からのサルコシル不溶性画分が、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの左海馬におけるＣＡ１層に投与された後で抽出される（Ｉｐｓｉ：同側、Ｃｏｎｔｒａ：対側）。
【図57】図５７は、抗ＡＴ８抗体で免疫染色された脳組織を示す写真を図示し、ここで、脳組織は、アルツハイマー病を有する患者からのサルコシル不溶性画分が、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの左海馬におけるＣＡ１層に投与された後で抽出される（ＤＧ：歯状回、ＥＣ：嗅内皮質）。
【図58】図５８および５９は、脳組織が抗ＡＴ８抗体で免疫染色される程度を示すグラフであり、ここで、脳組織は、アルツハイマー病を有する患者からのサルコシル不溶性画分が、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの左海馬におけるＣＡ１層に投与された後で抽出される（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１）。
【0023】
【図61】図６１は、タウタンパク質（Ｋ１８）、アセチル化タウタンパク質（Ｋ１８＋Ｐ３００）、および凝集したアセチル化タウタンパク質（Ｋ１８＋Ｐ３００＋ヘパリン）をＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体で処置した後の、凝集したアセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）の量の変化を同定するために行われた試験の結果を図示する。
【図62】図６２は、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体で処置されたマウス由来神経細胞をアセチル化タウタンパク質凝集物で処置した後に得られた上清中に含まれる、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性を示すグラフである（***ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【0024】
発明の詳細な説明
本明細書において以後、本発明を詳細に説明する。
本発明の一側面において、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、これは、配列番号１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
本明細書において以後、本発明を詳細に説明する。
本発明の一側面において、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、これは、配列番号１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号２により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３により表されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【0025】
用語「抗体」とは、本明細書において用いられる場合、抗原に結合することができ、それにより抗原の作用を妨害するか、または抗原を除去することができる、免疫タンパク質を意味する。５つの型の抗体：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在し、これらの抗体は、重鎖定常領域遺伝子により生成される重鎖、それぞれμ、δ、γ、αおよびεを含む。抗体を用いる技術において、ＩｇＧが主に用いられる。ＩｇＧは、４つのアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を有し、それらの構造的および機能的特徴は、異なり得る。
【0026】
ＩｇＧは、２本の重鎖（約５０ｋＤａ）タンパク質および２本の軽鎖（約２５ｋＤａ）タンパク質から構成されるＹ形状の安定な構造（分子量：約１５０ｋＤａ）を形成する。抗体において、軽鎖および重鎖は、そのアミノ酸配列が抗体ごとに異なる可変領域、およびそのアミノ酸配列が抗体の間で同じである定常領域からなる。重鎖定常領域においては、ＣＨ１、Ｈ（ヒンジ）、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが存在する。ドメインの各々は、２つのβ－シートから構成され、ドメインは、分子間ジスルフィド結合を介して互いに連結される。軽鎖および軽鎖の２つの可変領域は、組み合わされて、抗原結合部位を形成する。抗原結合部位は、２つのＹ形状の腕において存在する。抗原に結合することができる部分は、Ｆａｂ（抗体結合フラグメント）と称され、抗原に結合しない部分は、Ｆｃ（結晶化可能なフラグメント）と称される。ＦａｂとＦｃとは、可撓性のヒンジ領域を介して互いに連結される。
【0027】
用語「ＣＤＲ」とは、本明細書において用いられる場合、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域における部位であって、そのアミノ酸配列が抗体ごとに異なる、高頻度可変領域を意味し、ここで、当該部位が抗原に結合する。抗体の三次元構造において、ＣＤＲは、抗体の表面上のループとして形成され、ループの下に、ＣＤＲを構造的に支持するためにフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する。重鎖においては３つのループ構造が存在し、軽鎖においては３つのループ構造が存在し、これら６つの局所ループ構造が一緒に組み合わされて、抗原に対して直接的に接触する。
【0028】
重鎖可変領域は、配列番号７～１１からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよく、軽鎖可変領域は、配列番号１２～１５からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含んでもよい。
【0029】
加えて、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の群より選択されるいずれか１つであってよい：
配列番号７により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１２により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号９により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号９により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号９により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１０により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１０により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１０により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；ならびに
配列番号１１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント。
配列番号７により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１２により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号８により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号９により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号９により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号９により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１０により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１０により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１０により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；
配列番号１１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１４により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント；ならびに
配列番号１１により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１５により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0030】
軽鎖可変領域または重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が同じである場合、そのフレームワーク部分を修飾することが可能である。特に、フレームワーク部分の一部のアミノ酸配列を、ヒト化抗体を調製するために修飾してもよい。
【0031】
本発明の例にかかる抗タウ抗体のアミノ酸配列および配列番号を、以下の表１および２においてまとめる。
【表1】
【0032】
【表2】
【0033】
本発明の例にかかる抗タウ抗体のヌクレオチド配列を、以下の表３においてまとめる。
用語「ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ」は、本明細書において用いられる場合、配列番号２５により表されるタウタンパク質の２７５番目～２８６番目のアミノ酸配列セクションのアミノ酸配列において２８０番目のアミノ酸がアセチル化されているタンパク質フラグメントに対して特異的に結合するマウス抗体に関する。加えて、用語「ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ」は、本明細書において用いられる場合、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体をヒト化することにより得られた抗体を指す。
【表3】
【0034】
抗体の抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖからなる群より選択されるいずれか１つであってよい。フラグメントとは、抗原に結合することにより引き起こされる刺激を細胞、補体などに伝達する機能（エフェクター機能）を有する結晶化可能な領域（Ｆｃ領域）を除く、抗原結合ドメインを指し、フラグメントは、シングルドメイン抗体およびミニボディーなどの第３世代フラグメントを含んでもよい。
【0035】
フラグメントのサイズは完全な構造のＩｇＧのものよりも小さいので、フラグメントは、血液脳関門中への良好な浸透速度を有するという利点、および、フラグメントは細菌により生成させることができるので、低い生成コストを有するという利点を有する。加えて、抗体フラグメントはＦｃを欠いているので、抗体フラグメントは、抗原との結合により引き起こされる刺激を細胞、補体などに伝達する能力が所望されない場合に用いられる。フラグメントは、ヒトの体内における短い半減期に起因して、生体における診断のために好適である。しかし、抗体を構成するアミノ酸の中で、いくつかの塩基性、酸性または中性のアミノ酸が互いに置き換えられている場合、抗体自体に固有の等電点（ｐＩ）が変化し得る。抗体の等電点のかかる変化は、in vivoでの抗体の毒性の副作用の軽減、または水溶性の増大などの変化をもたらし得る。したがって、治療用抗体の場合、そのアフィニティーまたは構造形態を考慮して、完全な構造のＩｇＧを用いてもよい。
【0036】
抗タウ抗体の重鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７～１１から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列を有していてもよく、または、それは、重鎖可変領域配列に対して９５％、９７％、９８％または９９％の相同性を有していてもよい。
【0037】
抗タウ抗体の軽鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２～１５から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を有していてもよく、または、それは、軽鎖可変領域配列に対して少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％の相同性を有していてもよい。
【0038】
抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７～１１から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列に対して、および配列番号１２～１５から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列に対して、少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％の相同性を有していてもよい。
【0039】
抗タウ抗体は、モノクローナル抗体を調製するための既知の技術により容易に調製することができる。モノクローナル抗体は、免疫した動物からのＢリンパ球を用いてハイブリドーマを得ることにより、または、ファージディスプレイ技術を用いることにより、調製することができる。しかし、モノクローナル抗体を調製するための方法は、それらに限定されない。
【0040】
本発明の一態様において、抗タウ抗体のモノクローナル抗体は、配列番号２５の野生型タウタンパク質のアミノ酸配列において２８０番目のアミノ酸がアセチル化されている、２７５番目～２８６番目のアミノ酸配列セクションを有するタンパク質フラグメント（Ｋ２８０－ａｃ）をマウスに注射することにより得られるＢリンパ球を調製することにより、ハイブリドーマ細胞株として、容易に調製することができる。
【0041】
本発明の別の側面において、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明のさらなる別の側面において、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドが提供される。具体的には、ポリヌクレオチドは、配列番号１６～２０からなる群より選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列、および／または配列番号２１～２４からなる群より選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列を含んでもよい。
【0042】
ポリヌクレオチドは、以下の群より選択されるいずれか１つであってよい：
配列番号１６により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２１により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１７により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２２により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１７により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２３により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１７により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２４により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１８により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２２により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１８により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２３により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１８により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２４により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１９により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２２により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１９により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２３により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１９により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２４により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号２０により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２２により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号２０により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２３により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；ならびに
配列番号２０により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２４により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
配列番号１６により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２１により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１７により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２２により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１７により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２３により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１７により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２４により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１８により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２２により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１８により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２３により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１８により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２４により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１９により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２２により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１９により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２３により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号１９により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２４により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号２０により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２２により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；
配列番号２０により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２３により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド；ならびに
配列番号２０により表されるヌクレオチド配列および／または配列番号２４により表されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【0043】
ポリヌクレオチドは、少なくとも１塩基の置換、欠失もしくは挿入、またはそれらの組み合わせにより、修飾することができる。ヌクレオチド配列が、化学合成により調製される場合、Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988において記載されるものなどの、当該分野において周知の合成方法を用いてもよい。かかる方法は、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホルアミダイト法およびＨ－ホスフェート法、ＰＣＲおよび他のオートプライマー（autoprimer）法、固相上でのオリゴヌクレオチド合成などを含んでもよい。
【0044】
本発明のなおさらに別の側面において、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。発現ベクターは、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどであってよく、それはまた、商業的に開発されたプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤ、ｐＩＤＴＳＡＭＲＴ－ＡＭＰなど）、E. coli由来プラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９など）、Bacillus subtilis由来プラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５など）、酵母由来プラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０など）、ファージＤＮＡ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰなど）、動物ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスなど）、昆虫ウイルスベクター（バキュロウイルス）などを含んでもよい。発現ベクターにおいて、タンパク質の発現レベル、修飾などは、宿主細胞に依存して変化し、したがって、目的のために最も好適な宿主細胞を選択して使用することが好ましい。
【0045】
本発明のなおさらに別の側面において、発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。形質転換された細胞のための宿主細胞として、これらに限定されないが、哺乳動物、植物、昆虫、真菌または細菌の起源を有する細胞が挙げられ得る。哺乳動物細胞として、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Bowesメラノーマ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などを用いてもよい；しかし、哺乳動物細胞は、これらに限定されない。当業者に公知であって哺乳動物宿主細胞として用いることができる任意の細胞を用いてもよい。
【0046】
加えて、発現ベクターが宿主細胞中に導入される場合、以下の方法を用いてもよい：ＣａＣｌ２沈殿、効率の増大のためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と称される還元性物質をＣａＣｌ２沈殿と組み合わせて用いるHanahan法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、プロトプラスト融合、シリコンカーバイド繊維を用いた撹拌、アグロバクテリウム属により媒介される形質転換、ＰＥＧにより媒介される形質転換、硫酸デキストラン、リポフェクタミン、乾燥／阻害により媒介される形質転換など。
【0047】
本発明のなおさらに別の側面において、抗体またはその抗原結合フラグメントを生成するための方法が提供され、該方法は、宿主細胞を培養することを含む。具体的には、生成方法は、ｉ）宿主細胞を培養して培養物を得るステップ、ｉｉ）培養物から抗体またはその抗原結合フラグメントを回収するステップを含んでもよい。
【0048】
宿主細胞を培養するステップは、当該分野において公知の方法を用いて行ってもよい。具体的には、培養は、回分（batch）プロセスにおいて行われても、流加回分（fed-batch）または繰り返しの流加回分プロセスにおいて行われてもよい。
【0049】
培養物から抗体またはその抗原結合フラグメントを回収するステップは、当該分野において公知の方法を用いて行われてもよい。具体的には、回収は、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、画分への分解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、または分子ふるいクロマトグラフィー）などを含む方法により行われてもよい。
【0050】
本発明のなおさらに別の側面において、アクセッション番号ＫＣＴＣ１４１５５ＢＰを有するハイブリドーマが提供される。アクセッション番号ＫＣＴＣ１４１５５ＢＰを有するハイブリドーマは、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍを産生することができる。ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍについて、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントについての上記の説明に対する参照がなされる。本発明のなおさらに別の側面において、変性性神経疾患を予防または処置するための医薬組成物が提供され、該医薬組成物は、活性成分として抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【0051】
変性性神経疾患は、タウタンパク質媒介性神経疾患であってよい。具体的には、タウタンパク質媒介性神経疾患は、タウオパシー、原発性加齢性タウオパシー、慢性外傷性脳症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭型認知症、リティコ・ボディグ病、パーキンソニズム、亜急性硬化性髄膜炎（subacute sclerosing meningitis）、鉛脳症（lead encephalopathy）、結節性硬化症、神経節膠腫、神経節細胞腫、髄膜血管腫症（meningioangiomatosis）、亜急性硬化性全脳炎（subacute sclerosing panencephalitis）、ハラーホルデン・スパッツ病、またはリポフスチン沈着症であってよい。
【0052】
加えて、タウオパシーは、アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17：ＦＴＤＰ－１７）と集合的に称される一群の関連障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ボクシング認知症（ＤＰ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳＤ）、レビー小体病、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはハンチントン病であってよい。
【0053】
医薬組成物は、薬学的に受入可能なキャリア、希釈剤およびアジュバントからなる群より選択される１つ以上をさらに含んでもよい。医薬組成物のための好適なキャリアは、当業者に公知であり、これらに限定されないが、タンパク質、糖などを含んでもよい。キャリアは、水性または非水性の、溶液、懸濁液および乳液であってよい。非水性の溶液であるキャリアの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの可食油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含んでもよい。
【0054】
水性の溶液であるキャリアの例は、食塩水および緩衝媒を含む、水、アルコール／水溶液、乳液または懸濁液を含んでもよい。非経口投与のためのキャリアの例は、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンガー、または不揮発性油（fixed oil）を含んでもよい。静脈内注射のためのキャリアの例は、リンガーデキストロース、液体、および栄養補助に基づくものなどの電解質補助を含んでもよい。保存剤、および抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの他の添加物が、さらに存在してもよい。好ましい保存剤として、ホルマリン、チメロサール、ネオマイシン、ポリミキシンＢおよびアンホテリシンＢが挙げられる。
【0055】
医薬組成物は、アジュバント（免疫調節剤または免疫増強剤）をさらに含んでもよい。アジュバントとは、免疫応答を増強するか、および／または接種の後の吸収を促進する化合物または混合物を指し、それは、任意の吸収促進剤を含んでもよい。受入可能なアジュバントとして、これらに限定されないが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油脂または炭化水素エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどが挙げられる。
【0056】
医薬組成物は、脳内、脳室内、腹腔内、経皮、筋肉内、硬膜内、静脈内、皮下、および鼻の投与の経路からなる群より選択されるいずれか１つの投与の経路を通して投与してもよく、それは、好ましくは、脳内、脳室内、硬膜内または腹腔内経路により投与される。
【0057】
特に、脳内、脳室内または硬膜内投与は、血液脳関門（ＢＢＢ）の浸透の問題を考慮する必要がない点において、有用であり得る。加えて、脳内投与は、脳内の特定の領域に対する薬物の効果を知ることが望ましい場合に、少量の薬物の当該領域への直接投与により用いてもよい。脳室内投与とは、薬物を脳室へ投与する方法であり、脳の全領域に対する薬物の効果を知ることが所望される場合に用いてもよい。さらに、硬膜内投与とは、脊椎の下部における２つの椎骨の間の脊髄の周りの空間中に針を挿入することにより、薬物を脊柱管中に注射する方法であり、脳、脊髄、または脳もしくは脊髄を被覆する組織層（髄膜）に対して、薬物が迅速または局所的な効果を提供することが必要とされる場合に用いてもよい。
【0058】
本発明の一態様により、本発明にかかる抗体は、認知症が誘導された動物モデルにおいて、腹腔内投与ならびに脳室内投与を通して、運動機能認知機能を効果的に改善した。
【0059】
医薬組成物は、治療有効量において投与される。用語「治療有効量」とは、本明細書において用いられる場合、医薬組成物が、副作用または重篤なもしくは過剰な免疫応答を引き起こすことなく治療効果を発揮することを可能にするために十分な量を意味する。有効量のレベルは、処置されるべき障害、障害の重篤度、特定の化合物の活性、投与の経路、タンパク質が除去される速度、処置の期間、タンパク質と組み合わせてまたはこれと同時に用いられる薬物、個体の年齢、体重、性別、食事週間、一般的健康状態、および医学の分野において公知の要因を含む、多様な要因に依存して変化し得る。
【0060】
医薬組成物の用量は、患者の年齢、性別、状態、その活性成分の体内における吸収の程度、不活性化の速度、および組み合わせて用いられる薬物を考慮して、望ましいように決定される。医薬組成物は、抗体またはその抗原結合フラグメントに基づいて、０．０００１ｍｇ／ｋｇ（体重）～３００ｍｇ／ｋｇ（体重）の量において投与してもよい。
【0061】
本発明のさらなる別の側面において、変性性神経疾患を予防または処置するための方法が提供され、該方法は、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを、変性性神経疾患を発症することが予測されるかまたは変性性神経疾患を発症している個体に投与するステップを含む。
【0062】
抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントは、上記のとおりである。
抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントの用量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与の時間、投与の方法、排出の速度および疾患の重篤度に依存して、その範囲が変化する。単一用量は、１日１回、または週１回に基づいて、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇの量において投与してもよい。有効量は、患者を処置する医師が随意に決定することができる。
抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントの用量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与の時間、投与の方法、排出の速度および疾患の重篤度に依存して、その範囲が変化する。単一用量は、１日１回、または週１回に基づいて、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～３００ｍｇ／ｋｇの量において投与してもよい。有効量は、患者を処置する医師が随意に決定することができる。
【0063】
抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量は、患者の年齢、体重、症状の特徴および程度、現在の処置の型、処置の数、投与形態ならびに投与の経路などの多様な要因に依存して変化し得、関連する分野における専門家により容易に決定され得る。
【0064】
抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントは、上述の薬理学的または生理学的な構成成分と一緒に、またはこれと連続して、投与してもよく、また、さらなる従来の治療剤と組み合わせて投与してもよく、ここで、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを、当該従来の治療剤と連続的にまたは同時に投与してもよい。上の要因の全てを考慮して、最小量であって、かつ副作用なしで最大効果を可能にする量を投与することが重要であり、当該量は、当業者により容易に決定され得る。
【0065】
発明のなおさらなる別の側面において、変性性神経疾患を診断するための組成物が提供され、該組成物は、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。抗タウ抗体は、修飾されたタウタンパク質に結合する抗体であってよい。抗体は、上で記載される。
【0066】
特に、タウタンパク質のアミノ酸配列における２８０番目のアミノ酸のアセチル化が、タウの凝集およびタウタンパク質媒介性神経疾患を引き起こすことが同定された。抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２５により表されるタウタンパク質のアミノ酸配列において、２８０番目のアミノ酸がアセチル化されている、２７８番目～２８４番目のアミノ酸を含むエピトープに結合し、したがって、抗タウ抗体または抗原結合フラグメントは、タウタンパク質媒介性神経疾患をより効果的に診断するために用いてもよい。
【0067】
抗体が用いられる場合、それに結合する修飾されたタウタンパク質の量を同定するためのアッセイとして、これらに限定されないが、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、同位元素標識免疫拡散法（radioimmunodiffusion）、オークタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学染色、免疫沈降アッセイ、補体結合（complement fixation）アッセイ、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）、プロテインチップ法などが挙げられる。
【0068】
本発明のなおさらに別の側面において、変性性神経疾患を予防、処置または診断するためのキットが提供され、該キットは、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、発現ベクター、または宿主細胞を含む。
【0069】
本発明のなおさらに別の側面において、変性性神経疾患のための診断キットが提供され、該キットは、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【0070】
キットは、変性性神経疾患を診断するために、個体の試料からの修飾されたタウタンパク質の発現レベルを測定するために用いることができる。加えて、抗体、ならびに、１つ以上の他の構成要素を含み、アッセイ方法のために好適である組成物、溶液またはデバイスが、修飾されたタウタンパク質の発現レベルを測定するためにその中に含まれていてもよい。
【0071】
試料は、既知のプロセスを用いることにより、個体から単離してもよい。用語「試料」とは、本明細書において用いられる場合、これらに限定されないが、組織、細胞、血液および血漿などの試料を含み、これらの各々は、異なる発現レベルの修飾されたタウタンパク質などを有する。
【0072】
加えて、タンパク質を測定するステップは、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、同位元素標識免疫拡散法、オークタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学染色、免疫沈降アッセイ、補体結合アッセイ、ＦＡＣＳまたはプロテインチップ法により行ってもよい。しかし、本発明は、これらに限定されない。
【0073】
上のアッセイ方法を通して、正常な対照において形成された抗原－抗体複合体の量を、個体において形成された抗原－抗体複合体の量と比較して、タウタンパク質媒介性神経疾患を決定することが可能である。
【0074】
用語「抗原－抗体複合体」とは、本明細書において用いられる場合、修飾されたタウタンパク質とそれに対して特異的な抗体とのコンジュゲートを意味し、形成された抗原－抗体複合体の量は、検出標識のシグナルのサイズを通して、定量的に測定することができる。かかる検出標識は、酵素、蛍光物質、リガンド、発光物質、微粒子、酸化還元分子および放射性同位元素からなる群より選択してもよいが、必ずしもこれらに限定されない。検出標識として酵素が用いられる場合、利用可能な酵素として、β－グルクロニダーゼ、β－Ｄ－グルコシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。リガンドとして、これらに限定されないが、ビオチン誘導体などが挙げられる。
【0075】
本発明のなおさらに別の側面において、変性性神経疾患を予防または処置するための、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントに使用が提供される。
本発明のなおさらに別の側面において、変性性神経疾患の予防または処置のための医薬を調製するための、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントの使用が提供される。
本発明のなおさらに別の側面において、変性性神経疾患の予防または処置のための医薬を調製するための、抗タウ抗体またはその抗原結合フラグメントの使用が提供される。
【0076】
本明細書において以後、本発明は、例により詳細に記載されるであろう。しかし、以下の例は本発明を説明することを意図するにすぎず、本発明はこれらに限定されない。
【0077】
Ｉ．修飾タウタンパク質フラグメントおよびそれに対する抗体の調製
調製例１．修飾タウタンパク質フラグメントの調製
修飾タウタンパク質フラグメントを調製するために、４４１アミノ酸からなるタウタンパク質（２Ｎ４Ｒ）のアミノ酸配列において、アルツハイマー病の病態形成において作用し、タウ遺伝子が修飾されたマウスモデルの能動免疫により認知機能改善効果を示す、タウタンパク質フラグメントを選択した。図１において示されるとおり、微小管結合ドメインに位置するタウタンパク質フラグメントのアミノ酸配列において、１２アミノ酸からなるセクションを指定した。
調製例１．修飾タウタンパク質フラグメントの調製
修飾タウタンパク質フラグメントを調製するために、４４１アミノ酸からなるタウタンパク質（２Ｎ４Ｒ）のアミノ酸配列において、アルツハイマー病の病態形成において作用し、タウ遺伝子が修飾されたマウスモデルの能動免疫により認知機能改善効果を示す、タウタンパク質フラグメントを選択した。図１において示されるとおり、微小管結合ドメインに位置するタウタンパク質フラグメントのアミノ酸配列において、１２アミノ酸からなるセクションを指定した。
【0078】
具体的には、配列番号２５の野生型タウタンパク質アミノ酸配列において、２８０番目のアミノ酸がアセチル化されている、２７５番目～２８６番目のアミノ酸配列セクションを有するタンパク質フラグメントを、Ｋ２８０－ａｃとして指定した。Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントは、Peptron Inc.にこれを生成するように依頼することにより生成した。
【0079】
加えて、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）がＮ末端に結合したＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントを、ANYGEN Inc.（Nam-myeon, South Korea）にこれを生成するように依頼することにより生成した。ＫＬＨがＮ末端に結合したＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントを、Shimadzu HPLC 10AVPシステムを用いて、０．０５％ＴＦＡ中５％～６５％のアセトニトリルによる濃度勾配条件下において、精製した（９１．８％の純度）。
【0080】
さらに、配列番号２５の野生型タウタンパク質アミノ酸配列において、２４４番目～３７２番目のアミノ酸（配列番号２６）を含む、リピートドメイン（ＲＤ）１、２、３および４のタンパク質フラグメントを、Ｋ１８として指定した。Ｋ１８タンパク質フラグメントをコードする遺伝子を含むベクターをE. coli細胞中に形質導入して、Ｋ１８タンパク質フラグメントを産生させた。
【0081】
具体的には、Ｋ１８タンパク質フラグメントは、以下のとおり生成した。ｐＥＴ－２１ｂ－Ｔａｕ（Ｋ１８）発現ベクター（図２）を、初めに、E. coli BL21（DE3）中に形質導入し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含むＬＢ培地中で、６００ｎｍの波長における光学密度（Ｏ．Ｄ．）が０．６～０．８に達するまで、３７℃の温度で培養した。その後、０．５ｍＭの濃度のＩＰＴＧによる処置を行い、得られたものを、３７℃の温度で３時間にわたり培養し、１８℃の温度で１８時間にわたり培養した。
【0082】
１８時間後に、形成された単一のコロニーを、種菌と共に、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含む５ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃の温度および２２０ｒｐｍの条件下において約１６時間にわたり培養した。種菌を、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含む５ＬのＬＢ培地を入れたエルレンマイヤーフラスコ中に、１：５００の比において植菌し、次いで３７℃の温度で４時間にわたり培養した。その後、培養物を３，５００ｒｐｍで３０分間にわたり遠心分離した。次いで、上清を取り除き、残りのペレットを－２０℃の温度で凍結した。
【0083】
凍結したペレットを、溶解バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、ｐＨ８．０）中で２５ｍｌ／ｇの割合で再懸濁した。細胞を、JY99-IIDN超音波ホモジナイザーを用いて、３０分間にわたり１，５００Ｗの条件下において溶解した。その後、得られたものを、４℃の温度および１５，０００ｒｐｍの条件下において２０分間にわたり遠心分離し、上清を０．４５μｍのフィルターでろ過した。
【0084】
ろ過物を、バッファーＡ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化された５ｍＬのHis-Trap SPカラムを通してろ過した。非特異的結合を取り除くために、５カラム容積（ＣＶ）のバッファーＡによる洗浄を行い、次いで、１０ＣＶのバッファーＢ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ）を用いて、０～１Ｍの濃度勾配のＮａＣｌで溶離を行った。
【0085】
Ｋ１８タンパク質フラグメントを含む画分を回収し、次いで、バッファーＣ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール）で平衡化された５ｍＬのHi-Trap SPカラムを通して、当該画分をろ過した。非特異的結合を取り除くために、１０ＣＶのバッファーＣによる洗浄を行った。その後、２０ＣＶのバッファーＤ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのイミダゾール）により、溶離を行った。精製されたＫ１８タンパク質フラグメントを含む溶離液を、１０ｋＤａの分子量の遠心フィルターを用いて濃縮した。
【0086】
アセチル化Ｋ１８タンパク質フラグメント（ａｃＫ１８）は、（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２．５ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのＥＤＴＡのアセチル化バッファーを、８μＭの濃度のＫ１８タンパク質フラグメント、１２５μＭの濃度のアセチルＣｏＡ、および０．５μｇのＰ３００酵素（これはアセチルトランスフェラーゼである）と、３０℃の温度で３時間にわたり反応させることにより調製した。
【0087】
Ｋ１８タンパク質フラグメントの凝集物は、２５μＭの濃度のＫ１８タンパク質フラグメントを、２５ｍＭのＤＴＴ溶液中で１時間にわたり２４℃の温度で溶解させ、（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、ヘパリン（２５ｍＭ）の溶液中で、Eppendorf Thermomixer Cを用いて、３７℃の温度および７００ｒｐｍの条件下において撹拌を行うことにより調製した。
【0088】
調製例２．修飾タウタンパク質フラグメントに結合する抗体の調製
調製例１において調製されたＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントに特異的に結合する抗体は、韓国のマウスモノクローナル抗体開発会社であるAbFrontierにこれを生成するように依頼することにより生成した。Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントを抗原としてマウス中に注射することにより得られたＢリンパ球を、ハイブリドーマ細胞として生成した。その後、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントに特異的に結合する抗体を産生する細胞株を、ＥＬＩＳＡを通してスクリーニングした。加えて、韓国における大学の抗体開発研究者により、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントに対して特異的に結合する抗体を開発するために、ファージディスプレイライブラリースクリーニングが行われた。
調製例１において調製されたＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントに特異的に結合する抗体は、韓国のマウスモノクローナル抗体開発会社であるAbFrontierにこれを生成するように依頼することにより生成した。Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントを抗原としてマウス中に注射することにより得られたＢリンパ球を、ハイブリドーマ細胞として生成した。その後、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントに特異的に結合する抗体を産生する細胞株を、ＥＬＩＳＡを通してスクリーニングした。加えて、韓国における大学の抗体開発研究者により、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントに対して特異的に結合する抗体を開発するために、ファージディスプレイライブラリースクリーニングが行われた。
【0089】
結果として、１つのマウスハイブリドーマ細胞株（マウスハイブリドーマ細胞株）が最終的に選択され、ファージディスプレイライブラリースクリーニングを通して選択された候補は除外された。なぜならば、それらは、マウスハイブリドーマ細胞株よりも低いアフィニティーを有する抗体を産生するからである。マウスハイブリドーマ細胞株から産生される抗体を、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントとの結合について、ウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡを通してin vitroでチェックした。
【0090】
結果として、＃１５Ｅ５ハイブリドーマ細胞株（クローン＃１）から産生される抗体が、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントと特異的に結合する抗体であることが同定された（図３および４）。＃１５Ｅ５ハイブリドーマ細胞株から産生される抗体を、最終的に、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍとして指定した。
【0091】
このマウス抗体から出発して、抗体可変領域分析、ＣＤＲ調査、分子モデリング、ヒト生殖系列抗体分析、ＣＤＲ移植および遺伝子配列決定を含む従来から知られている技術を用いて、ヒト化抗体を生成し、それらのヒト化抗体を、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ（ｖ０１～ｖ１０）として指定した。
【0092】
一方、＃１５Ｅ５ハイブリドーマ細胞株は、Korean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）において、２０２０年３月１８日に寄託し、それは、微生物アクセッション番号ＫＣＴＣ１４１５５ＢＰを割り当てられた。
【0093】
実験例１．抗原特異的結合の同定
調製例２において調製されたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の、アセチル化タウタンパク質に対する特異的結合を同定するために、野生型タウタンパク質および２８０番目のアミノ酸リジンがアラニンで置き換えられたタウタンパク質（タウＫ２８０Ａ）を、in vitroでアセチル化した。ここで、野生型タウタンパク質およびタウＫ２８０Ａタンパク質のアセチル化は、調製例１におけるアセチル化Ｋ１８タンパク質フラグメントの調製方法におけるものと同じ様式において行われた。次いで、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の抗原－抗体特異的結合反応を、ウェスタンブロッティングを通してチェックした。
調製例２において調製されたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の、アセチル化タウタンパク質に対する特異的結合を同定するために、野生型タウタンパク質および２８０番目のアミノ酸リジンがアラニンで置き換えられたタウタンパク質（タウＫ２８０Ａ）を、in vitroでアセチル化した。ここで、野生型タウタンパク質およびタウＫ２８０Ａタンパク質のアセチル化は、調製例１におけるアセチル化Ｋ１８タンパク質フラグメントの調製方法におけるものと同じ様式において行われた。次いで、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の抗原－抗体特異的結合反応を、ウェスタンブロッティングを通してチェックした。
【0094】
初めに、野生型タウタンパク質およびタウＫ２８０Ａタンパク質の濃度を、ブラッドフォードアッセイを通して測定した。タンパク質の各々を、４×サンプルバッファー（６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、２％ｗ／ｖのＳＤＳ、２５％ｖ／ｖのグリセロール、１４．４ｍＭのｖ／ｖのβ－メルカプトエタノール、およびブロモフェノールブルー）と混合した。その後、各々のタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。次いで、電気泳動したゲルを分離し、ＰＶＤＦメンブレン（BioRad, California, USA）上にトランスファーした。ブロッキングバッファー（ＰＢＳバッファー中、０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０［ＰＢＳＴ］、３％ｗ／ｖのＢＳＡ、または５％ｖ／ｖのスキムミルク）による処置を行い、１時間にわたり反応を進行させた。次いで、一次抗体として抗アセチル－リジン抗体（抗アセチル－リジン、Cell Signaling, 9441）またはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体による処置を行い、４℃で一晩反応を進行させた。翌日、ＰＶＤＦメンブレンを、洗浄バッファー（ＰＢＳバッファー中、０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０［ＰＢＳＴ］）で３回洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）で処置した。ＰＶＤＦメンブレンを、化学発光試薬（Thermo Fisher Scientific）で処置した。次いで、Ｘ線フィルムおよびImageJソフトウェア（NIH, Bethesda, MD）を用いて、測定および分析を行った。
【0095】
結果として、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体は、タウＫ２８０Ａタンパク質に対して、およびアセチル化されたタウＫ２８０Ａタンパク質に対して結合しないことが同定された（図５）。これらの結果から、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体が、２８０番目のアミノ酸リジンがアセチル化タウタンパク質に対してのみ特異的に結合する抗体であることが同定された。
【0096】
加えて、調製例２において調製されたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ０１＿ｖ０１抗体との特異的結合を同定するために、ウェスタンブロッティングを、上と同じ様式において、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントおよびＫ１８タンパク質フラグメントを用いて行った。ここで、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ０１＿ｖ０１抗体およびＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0297）を用いた。
結果として、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ０１＿ｖ０１抗体が、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントについて高い抗体アフィニティーを示すことが同定された（図６）。
結果として、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ０１＿ｖ０１抗体が、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントについて高い抗体アフィニティーを示すことが同定された（図６）。
【0097】
実験例２．抗原－抗体アフィニティーの同定
調製例１において調製されたＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントと調製例２において調製されたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体との間のアフィニティーを、Octet（登録商標）K2システム（Fortebio）を通して測定した。
調製例１において調製されたＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントと調製例２において調製されたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体との間のアフィニティーを、Octet（登録商標）K2システム（Fortebio）を通して測定した。
【0098】
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を、AR2Gバイオセンサー上に、製造者のマニュアルに従って固定した。バイオセンサーの表面を、１０分間にわたり水で水和し、２０ｍＭの１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１０ｍＭのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓ－ＮＨＳ）の混合物を用いて活性化した。ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を、１０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）を用いて、活性化されたバイオセンサー上に固定し、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．０）で５分間にわたりクエンチした。ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を固定したバイオセンサーを、１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中に６０秒間にわたり浸漬して、ベースラインを確立した。次いで、バイオセンサーを、６０秒間にわたり、様々な濃度のＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメント（抗原）またはＢＳＡ結合ペプチドを含むウェル中に浸漬した。その後、解離が生じるように、バイオセンサーを、１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中に１０分間にわたり再び浸漬した。実験データは、Octet Data Analysis（SWバージョン：9.0.0.10）により評価した。
結果として、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体とＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントとの間のアフィニティーについて、抗原解離定数（Ｋｄ）値は、２．５７×１０－１０Ｍとして測定された（図７）。
加えて、調製例１において調製されたＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントの調製例２において調製されたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ（ｖ０１～ｖ１２）抗体との結合を、ＥＬＩＳＡにより測定した。
結果として、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体とＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントとの間のアフィニティーについて、抗原解離定数（Ｋｄ）値は、２．５７×１０－１０Ｍとして測定された（図７）。
加えて、調製例１において調製されたＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントの調製例２において調製されたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ（ｖ０１～ｖ１２）抗体との結合を、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【0099】
初めに、プレートを、２５０ｎｇ／ウェルのＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントで処置し、４℃で一晩反応を進行させた。翌日、洗浄バッファーによる洗浄を３回行い、次いで、一次抗体による処置を、８つの濃度（２μｇ、１μｇ、０．５μｇ、０．２５μｇ、０．１２μｇ、０．０６μｇ、０．０３μｇ、０．０１μｇ）により行った。二次抗体として、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた。
結果として、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ（ｖ０１～ｖ１０）抗体が、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントについて高い抗体アフィニティーを示すことが同定された（図８）。
結果として、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ（ｖ０１～ｖ１０）抗体が、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントについて高い抗体アフィニティーを示すことが同定された（図８）。
【0100】
ＩＩ．動物モデルを用いたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされる治療効果の同定
調製例３．認知症マウスモデルの調製
Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ変異体遺伝子を発現するＪＮＰＬ３マウスをTaconicから購入し、Asan Institute for Life Sciences（韓国）の実験動物室において、Ｃ５７ｂｌ／６マウスと５世代にわたり戻し交配した。次いで、マウスを特定病原体除去（ＳＰＥ）条件下において生育した。
調製例３．認知症マウスモデルの調製
Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ変異体遺伝子を発現するＪＮＰＬ３マウスをTaconicから購入し、Asan Institute for Life Sciences（韓国）の実験動物室において、Ｃ５７ｂｌ／６マウスと５世代にわたり戻し交配した。次いで、マウスを特定病原体除去（ＳＰＥ）条件下において生育した。
【0101】
実験例３．認知症マウスモデルの特徴の同定
実験において用いられたTau-P301L認知症マウスモデルは、正常マウスと比較して、脳組織における加齢に伴うタウタンパク質の蓄積における差異を示した。調製例２において調製されたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を用いたイムノブロッティングを行った。
実験において用いられたTau-P301L認知症マウスモデルは、正常マウスと比較して、脳組織における加齢に伴うタウタンパク質の蓄積における差異を示した。調製例２において調製されたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を用いたイムノブロッティングを行った。
【0102】
正常マウスおよびＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスから脳を抽出し、次いで、サルコシル画分を通して脳組織から可溶性タンパク質および不溶性タンパク質を分離した。脳試料を、ＲＡバッファーＢ（１００ｍＭのＭＥＳ、０．７５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．８＋プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤）によりホモジナイズした。試料を、氷上で２０分間にわたりインキュベートし、９，０００ｒｐｍで２０分間にわたり４℃で遠心分離した。遠心分離の後、上清を回収した（可溶性タンパク質）。ペレットを、抽出バッファー（１％サルコシル、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１０％スクロース、０．８５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．４）でホモジナイズした。試料を、１時間にわたり室温でインキュベートし、１３，０００ｒｐｍで２０分間にわたり４℃で遠心分離した。遠心分離の後、上清を回収した（タウ凝集体）。分離したタンパク質を、実験例１と同じ様式においてウェスタンブロッティングに供した。
【0103】
結果として、１２か月齢の認知症マウスモデルが、脳組織において、アセチル化タウタンパク質の数の増大を示すことが同定された。特に、４か月齢の認知症マウスモデルは、正常マウスにおけるものと同様のタウタンパク質の発現レベルを示すが、一方で、重篤な認知症の症状を示す１２か月齢の認知症マウスモデルは、正常マウスと比較して約２倍のタウタンパク質の発現レベルを示すことが同定された（図９）。
【0104】
実験例４．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされる行動改善効果の同定：脳室内投与
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされる治療効果を同定するために、図１０において図示される実験スケジュールに従って、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を、調製例３において調製されたＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの側脳室に浸透圧ポンプを用いて投与した。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされる治療効果を同定するために、図１０において図示される実験スケジュールに従って、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を、調製例３において調製されたＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの側脳室に浸透圧ポンプを用いて投与した。
【0105】
実験例４．１．巣作り試験を通した行動改善効果の同定
マウスのマルチモーダルな脳機能を同定することができる巣作り試験を行った。
具体的には、マウスが生育された１つのケージの中の同腹仔のうちの３分の２を取り除き、４層の無菌綿（５ｃｍ×５ｃｍ）をケージの中に置いた。１個体のマウスを、１つのケージに入らせた。翌朝、巣の完成の程度を分析した。
マウスのマルチモーダルな脳機能を同定することができる巣作り試験を行った。
具体的には、マウスが生育された１つのケージの中の同腹仔のうちの３分の２を取り除き、４層の無菌綿（５ｃｍ×５ｃｍ）をケージの中に置いた。１個体のマウスを、１つのケージに入らせた。翌朝、巣の完成の程度を分析した。
【0106】
巣の完成に従ったスコアを、１～５ポイントに分けることにより計算した。提供された無菌綿が９０％以上維持されているか、またはほとんど触れられていなかったケースについて、当該ケージを１ポイントとして計算し；無菌綿が約５０％～９０％維持され、部分的に裂かれているケースについて、当該ケースを２ポイントとして計算し；無菌綿が５０％以上裂かれてケージ周辺に広がっているケースについて、当該ケースを３ポイントとして計算し；無菌綿が９０％以上裂かれてケージの端に集められているケースについて、当該ケースを４ポイントとして計算した。無菌綿が完全に裂かれており、ケージの端に完全な巣の形状が形成されているケースについて、当該ケースを５ポイントとして計算した。
【0107】
結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスは、正常マウスと比較して約６０％の巣作りスコア（building score）の低下を示し、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与した認知症マウス（Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ）は、正常マウスと同様の巣作りスコアを示すことが同定された（図１１）。
【0108】
実験例４．２．Ｙ迷路試験を通した行動改善効果の同定
認知機能の回復を同定するために、Ｙ迷路試験を行った。Ｙ迷路試験とは、短期記憶能力を同定するための実験である。具体的には、Ｙの形のボックスの中にＡ、ＢおよびＣのゾーンを設定し、Ｂゾーンが遮断された状態において、５分間にわたりマウスを自由に動かせた。１時間後、Ｂゾーンが遮断された状態を取り除き、全てのゾーンが開いた状態において、５分間にわたりマウスの運動を観察した。
認知機能の回復を同定するために、Ｙ迷路試験を行った。Ｙ迷路試験とは、短期記憶能力を同定するための実験である。具体的には、Ｙの形のボックスの中にＡ、ＢおよびＣのゾーンを設定し、Ｂゾーンが遮断された状態において、５分間にわたりマウスを自由に動かせた。１時間後、Ｂゾーンが遮断された状態を取り除き、全てのゾーンが開いた状態において、５分間にわたりマウスの運動を観察した。
【0109】
結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスの場合、ＡまたはＣゾーンにおいて滞在して過した時間は、１００秒間以下であり、これは、正常マウスと比較して約５０％低かった。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの場合、ＡまたはＣゾーンにおいて滞在して過した時間は、約１５０秒間であり、これは、正常マウスと同様であった。これらの結果から、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの短期記憶能力が回復したことが同定された（図１２）。
【0110】
実験例４．３．水迷路試験を通した行動改善効果の同定
マウスの学習および記憶の能力を評価するために、水中迷路試験を行った。水中迷路試験のために用いられた設備およびプログラムについては、Asan Institute for Life Sciencesの実験動物室により所有される行動学の設備を用いた。具体的には、水中迷路試験は、全５日間を要した。マウスは、プラットフォームおよびプラットフォームの位置についてのビジュアルキューが置かれた状態において、４日間にわたり訓練された。
マウスの学習および記憶の能力を評価するために、水中迷路試験を行った。水中迷路試験のために用いられた設備およびプログラムについては、Asan Institute for Life Sciencesの実験動物室により所有される行動学の設備を用いた。具体的には、水中迷路試験は、全５日間を要した。マウスは、プラットフォームおよびプラットフォームの位置についてのビジュアルキューが置かれた状態において、４日間にわたり訓練された。
【0111】
学習は、プラットフォームを有するスイミングプール（直径１．４ｍ、深さ４５ｃｍ）を、約２６．５ｃｍの深さまで水（２９±０．５℃）で満たし、次いで、マウスがプラットフォームをキューのみで記憶できるように、１．５Ｌの全脂粉乳を加えて水を濁らせることにより行った。次いで、マウスを、６０秒間にわたり自由に泳ぐように慣れさせて、プラットフォーム上で１分間にわたり休息させた。実験は、３つの異なる出発位置での４セットにより、全１２回にわたり行った。各々の試験の最後に、３０秒間の休み時間を与えた。１セットの最後に、３０～４５分間の休み時間を与えた。
【0112】
４日間の学習の後で、第５日に試験を行った。評価のための実験において、マウスがキューのみを用いてプラットフォームの位置をよく訪れたか否かを同定するために、プラットフォームは置かず、プラットフォームが置かれていた領域における滞在の回数を測定した。加えて、マウスは、１分間以内に、プラットフォームが置かれていた位置に到達させられた。マウスが１分間以内にプラットフォームの位置に到達できなかった場合、マウスを、スイミングプールから取り除いた。
【0113】
初めに、４日間の学習の間にマウスがプラットフォームを見つけるために要した時間を測定した。結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスの場合、４日間の間、プラットフォームを見つけるために要した時間は、２０秒間以上であった。一方、正常マウス、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの場合、プラットフォームを見つけるために要した時間は、第２日から、２０秒間以下まで短縮された（図１３）。
【0114】
加えて、第５日において、プラットフォームが置かれていたＮＷゾーンにおいて滞在して過した時間について評価を行った。結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスは、１０秒間以下にわたりＮＷゾーンに滞在するが、一方、正常マウスおよびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスは、２０秒間以下にわたりＮＷゾーンに滞在することが同定された（図１４）。
【0115】
実験例４．４．握力試験を通した行動改善効果の同定
マウスの筋力を同定するために、握力試験を行った。実験において用いられた鉄バンドルについて、Asan Institute for Life Sciencesにより所有される行動学の設備を用いた。ここで、４０ｇの重量の鉄バンドルを鉄バンドルのために用いた。調製例３において調製されたマウスを、尾の端により保定し、マウスの前足を４０ｇの鉄バンドル上に置かせて、マウスが鉄バンドルを握ることができるようにした。次いで、マウスの尾を保定した状態で、約３０ｃｍの高さまでマウスを持ち上げた。マウスが鉄バンドルを放すまでの時間を測定し、それぞれのマウスについて比較を行った。
マウスの筋力を同定するために、握力試験を行った。実験において用いられた鉄バンドルについて、Asan Institute for Life Sciencesにより所有される行動学の設備を用いた。ここで、４０ｇの重量の鉄バンドルを鉄バンドルのために用いた。調製例３において調製されたマウスを、尾の端により保定し、マウスの前足を４０ｇの鉄バンドル上に置かせて、マウスが鉄バンドルを握ることができるようにした。次いで、マウスの尾を保定した状態で、約３０ｃｍの高さまでマウスを持ち上げた。マウスが鉄バンドルを放すまでの時間を測定し、それぞれのマウスについて比較を行った。
【0116】
結果として、正常マウスは、握る強さについて２０秒間以下の測定時間を示し、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスは、握る強さについて５秒間以下の測定時間を示た。対照的に、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの場合、握る強さについての測定時間は２０秒間以上であり、これは、正常マウスよりも長かった（図１５）。これらの結果から、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの運動能力が回復したことが同定された。
【0117】
実験例５．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の行動改善効果の同定：腹腔内投与
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の治療効力を同定するために、図１６において図示される実験スケジュールに従って、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を、調製例３において調製されたＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスに、３か月間にわたり腹腔内投与した。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の治療効力を同定するために、図１６において図示される実験スケジュールに従って、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を、調製例３において調製されたＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスに、３か月間にわたり腹腔内投与した。
【0118】
実験例５．１．巣作り試験を通した行動改善効果の同定
マウスのマルチモーダルな脳機能を同定することができる巣作り試験は、実験例４．１と同様に行った。
結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスは、正常マウスと比較して約６０％の巣作りスコアの低下を示すこと、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスは、正常マウスと同様の巣作りスコアを示すことが同定された（図１７）。
マウスのマルチモーダルな脳機能を同定することができる巣作り試験は、実験例４．１と同様に行った。
結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスは、正常マウスと比較して約６０％の巣作りスコアの低下を示すこと、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスは、正常マウスと同様の巣作りスコアを示すことが同定された（図１７）。
【0119】
実験例５．２．Ｙ迷路試験を通した行動改善効果の同定
認知機能の回復を同定するために、Ｙ迷路試験を、実験例４．２におけるものと同じ様式において行った。結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスの場合、ＡまたはＣゾーンにおいて滞在して過した時間は約８０秒間であり、これは、正常マウスと比較して約５０％低下した。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの場合、ＡまたはＣゾーンにおいて滞在して過した時間は、約１１０秒間であり、これは、正常マウスと同様であった。これらの結果から、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの短期記憶能力が回復したことが同定された（図１８）。
認知機能の回復を同定するために、Ｙ迷路試験を、実験例４．２におけるものと同じ様式において行った。結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスの場合、ＡまたはＣゾーンにおいて滞在して過した時間は約８０秒間であり、これは、正常マウスと比較して約５０％低下した。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの場合、ＡまたはＣゾーンにおいて滞在して過した時間は、約１１０秒間であり、これは、正常マウスと同様であった。これらの結果から、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの短期記憶能力が回復したことが同定された（図１８）。
【0120】
実験例５．３．水迷路試験を通した行動改善効果の同定
水中迷路試験を、実験４．３におけるものと同じ様式において行った。４日間の学習の間にマウスがプラットフォームを見つけるために要した時間を測定した。結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスの場合、４日間の間、プラットフォームを見つけるために要した時間は、２０秒間以下であった。一方、正常マウスおよびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの場合、プラットフォームを見つけるために要した時間は、第３日から、１５秒間以下まで短縮された（図１９）。
水中迷路試験を、実験４．３におけるものと同じ様式において行った。４日間の学習の間にマウスがプラットフォームを見つけるために要した時間を測定した。結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスの場合、４日間の間、プラットフォームを見つけるために要した時間は、２０秒間以下であった。一方、正常マウスおよびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの場合、プラットフォームを見つけるために要した時間は、第３日から、１５秒間以下まで短縮された（図１９）。
【0121】
加えて、第５日において、プラットフォームが置かれていたＮＷゾーンにおいて滞在して過した時間について評価を行った。結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスは、２０秒間以下にわたりＮＷゾーンに滞在するが、一方、正常マウスおよびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスは、約２５秒間にわたりＮＷゾーンに滞在することが同定された（図２０）。
【0122】
実験例６．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体とマウス組織において発現された修飾タウタンパク質との間の特異的結合の同定Ｉ
正常マウスおよび調製例３において調製されたＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの大脳皮質および海馬の組織を、ＩｇＧおよびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）およびウェスタンブロッティングに供した。
正常マウスおよび調製例３において調製されたＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの大脳皮質および海馬の組織を、ＩｇＧおよびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）およびウェスタンブロッティングに供した。
【0123】
初めに、蒸留水に、１％Ｔｘ－１００、１００ｍＭのＮａＣｌ、および５０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加し、ｐＨをｐＨ７．４に調整することにより、サンプルバッファーを調製した。その後、サンプルバッファーを用いて、正常マウスおよびＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの大脳皮質および海馬の組織を再懸濁し、それにより再懸濁された試料を得た。得られた試料の各々を、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体で処置し、２４時間にわたり反応を進行させた。次いで、試料を、１００μｌのタンパク質Ｇ－アガロースビーズ（GE Healthcare Life Sciences）で処置し、４℃で一晩反応を進行させた。翌日、６，０００ｒｐｍで１分間にわたり４℃で遠心分離を行って試料を回収し、０．１％のTriton X-100を含むＰＢＳで３回洗浄を行った。試料を、１×サンプルバッファーで処置し、ウェスタンブロッティングに供した。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、ＩｇＧ、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。
【0124】
結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの大脳皮質および海馬の組織において、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体と、２８０番目のアミノ酸リジンがアセチル化されたタウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）との間に特異的結合反応が存在することが同定された。加えて、これらの結果から、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体が、in vivoで脳組織において発現される修飾タウタンパク質に良好に結合することが同定された（図２１）。
【0125】
実験例７．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体とヒト組織において発現された修飾タウタンパク質との間の結合の同定ＩＩ
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体とヒト脳組織において発現された修飾タウタンパク質との間の特異的結合を同定するために、正常な高齢者およびアルツハイマー病を有する患者の脳組織における側頭皮質を、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を用いた免疫組織化学染色に供した。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体とヒト脳組織において発現された修飾タウタンパク質との間の特異的結合を同定するために、正常な高齢者およびアルツハイマー病を有する患者の脳組織における側頭皮質を、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を用いた免疫組織化学染色に供した。
【0126】
初めに、正常な高齢者およびアルツハイマー病を有する患者の脳組織における側頭皮質の各々を、薄切し、スライドグラスに貼り付けた。脳組織は、Netherlands Brain Bankにより提供された。切片を、１×ＰＢＳで洗浄し、０．１％のTriton X-100を含む１×ＰＢＳで 室温で１０分間にわたり透過処理を行った。次いで、切片を洗浄し、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで室温で１時間にわたりブロッティングした。切片を、１×ＰＢＳで洗浄し、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体と４℃で一晩反応させた。
【0127】
翌日、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色のために、一次抗体と一晩反応させることにより得られた切片を、１×ＰＢＳで洗浄した。切片を、二次抗体としてビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Vector Laboratories, California, USA）と室温で１時間にわたり反応させた。切片を１×ＰＢＳで洗浄し、アビジン－ビオチン－ペルオキシダーゼ複合体で処置し（Vector Laboratories, California, USA）、反応させた。脳組織切片を、１０分間にわたりＤＡＢ溶液中で反応させ、次いで、１×ＰＢＳで洗浄した。切片カナダバルサム（Sigma-Aldrich）上にマウントした。Zeiss顕微鏡（Carl Zeiss, Oberkochen, Germany）を用いて切片をイメージングし、AxioVision Imaging Systemを用いて画像を処理した。
【0128】
結果として、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体による染色は、正常な高齢者の側頭皮質においては観察されなかったが、一方、アルツハイマー病を有する患者の側頭皮質においては、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体による染色が観察された。加えて、これらの結果から、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体が、in vivoで脳組織において発現された修飾タウタンパク質に良好に結合することが同定された（図２２）。
【0129】
加えて、正常な高齢者およびアルツハイマー病を有する患者の脳組織を、ウェスタンブロッティングを通して分析した。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、抗Ｔａｕ５抗体（Invitrogen、AHB0042）、抗アセチル－Ｋ２８０抗体（Anaspec、AS-56077）、抗アミロイド－β抗体（Covance、SIG-39300）、抗ＧＡＰＤＨ抗体（Millipore、MAB374）、およびＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた。
【0130】
結果として、アルツハイマー病を有する患者の脳組織において、正常な高齢者の脳組織と比較して、より高い発現レベルの全タウタンパク質、アセチル化タウタンパク質、およびアミロイド－βが観察された（図２３Ａ）。特に、アルツハイマー病を有する患者の脳組織において、約３倍多いアセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）が観察された（図２３Ｂ）。
【0131】
実験例８．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の脳室内投与の後のタウオパシー軽減効果の同定
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の投与の後のタウオパシー軽減効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスおよび正常マウスの脳組織を抽出し、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）、アセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）、およびタウタンパク質のアミノ酸配列における３９６番目のアミノ酸であるセリンをリン酸化することにより得られたタウ（Ｓｅｒ３９６）の発現レベルを、ウェスタンブロッティングを通してチェックした。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、抗Ｔａｕ５抗体（Invitrogen、AHB0042）、抗ｐＳｅｒ３９６抗体（Thermo、44-752G）、抗アセチル－Ｋ２８０抗体（Anaspec、AS-56077）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の投与の後のタウオパシー軽減効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスおよび正常マウスの脳組織を抽出し、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）、アセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）、およびタウタンパク質のアミノ酸配列における３９６番目のアミノ酸であるセリンをリン酸化することにより得られたタウ（Ｓｅｒ３９６）の発現レベルを、ウェスタンブロッティングを通してチェックした。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、抗Ｔａｕ５抗体（Invitrogen、AHB0042）、抗ｐＳｅｒ３９６抗体（Thermo、44-752G）、抗アセチル－Ｋ２８０抗体（Anaspec、AS-56077）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。
【0132】
結果として、全タウタンパク質、アセチル化タウタンパク質、およびリン酸化されたタウタンパク質が、ＩｇＧを脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、正常マウスの脳組織より高い量において存在することが同定された。一方、全タウタンパク質、アセチル化タウタンパク質、およびリン酸化されたタウタンパク質は、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、ＩｇＧを脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織よりも低い量において存在した（図２４～２７）。
【0133】
加えて、マウスの脳組織における、タウタンパク質のアミノ酸配列における２０２番目のアミノ酸であるセリンおよび２０５番目のアミノ酸であるスレオニンをリン酸化することにより得られたタウタンパク質（ｐＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５）、ならびにリン酸化タウ（ｐＴ２３１）の発現レベルを同定するために、免疫組織化学染色を行った。ここで、免疫組織化学染色は、実験例７におけるものと同じ様式において行い、抗ＡＴ８抗体（Thermo、MN1020）および抗ｐＴ２３１抗体（Thermo、MN1040）を一次抗体として用いた。
【0134】
結果として、ＩｇＧを脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、正常マウスの脳組織と比較して、より高い発現レベルのリン酸化タウタンパク質が観察された。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、ＩｇＧを脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織と比較して、より低い発現レベルのリン酸化されたタウタンパク質が観察された（図２８および２９）。
【0135】
実験例９．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の腹腔内投与の後のタウオパシー軽減効果の同定
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の投与の後のタウオパシー軽減効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を５０ｍｇ／ｋｇの量において腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウス、および正常マウスの脳組織を抽出し、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）、アセチル化タウ、およびリン酸化タウ（ｐＴ２３１）の発現レベルを、半変性（semi-denaturating）ウェスタンブロッティングを通してチェックした。ここで、半変性ウェスタンブロッティングは、マウス脳組織をβ－メルカプトエタノールなしの２×レムリ（laemmli）サンプルバッファーと混合したことを除いて、実験例１におけるウェスタンブロッティングと同じ様式において行った。加えて、抗Ｔａｕ５抗体（Invitrogen、AHB0042）、抗ｐＴ２３１抗体（Thermo、MN1040）、抗アセチル－Ｋ２８０抗体（Anaspec、AS-56077）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の投与の後のタウオパシー軽減効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を５０ｍｇ／ｋｇの量において腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウス、および正常マウスの脳組織を抽出し、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）、アセチル化タウ、およびリン酸化タウ（ｐＴ２３１）の発現レベルを、半変性（semi-denaturating）ウェスタンブロッティングを通してチェックした。ここで、半変性ウェスタンブロッティングは、マウス脳組織をβ－メルカプトエタノールなしの２×レムリ（laemmli）サンプルバッファーと混合したことを除いて、実験例１におけるウェスタンブロッティングと同じ様式において行った。加えて、抗Ｔａｕ５抗体（Invitrogen、AHB0042）、抗ｐＴ２３１抗体（Thermo、MN1040）、抗アセチル－Ｋ２８０抗体（Anaspec、AS-56077）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。
【0136】
結果として、全タウタンパク質、リン酸化されたタウタンパク質、およびアセチル化タウタンパク質のオリゴマー形態は、ＩｇＧを腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、正常マウスの脳組織より高い量において存在することが同定された。一方、全タウタンパク質、リン酸化されたタウタンパク質、およびアセチル化タウタンパク質は、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの脳組織において、ＩｇＧを腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織におけるものよりも、著しくより低い量において存在した（図３０～３３）。
【0137】
実験例１０．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされるシナプス改善効果の同定：脳室内投与
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の投与の後のシナプス改善効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を５０ｍｇ／ｋｇの量において脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウス、および正常マウスの脳組織を抽出し、シナプス関連タンパク質についてウェスタンブロッティングを行った。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、抗ＰＳＤ９５抗体（Abcam、ab2723）、抗シナプシン－１抗体（Chemicon, MAB355）、抗β－アクチン抗体（Sigma、A5441）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の投与の後のシナプス改善効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を５０ｍｇ／ｋｇの量において脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウス、および正常マウスの脳組織を抽出し、シナプス関連タンパク質についてウェスタンブロッティングを行った。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、抗ＰＳＤ９５抗体（Abcam、ab2723）、抗シナプシン－１抗体（Chemicon, MAB355）、抗β－アクチン抗体（Sigma、A5441）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。
【0138】
結果として、ＩｇＧを脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、正常マウスの脳組織と比較して、より高い発現レベルのＰＳＤ５９およびシナプシン－１が観察された。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、ＩｇＧを脳室内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織と比較して、より低い発現レベルのＰＳＤ５９およびシナプシン－１が観察された（図３４～３６）。
【0139】
実験例１１．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされるシナプス改善効果の同定：腹腔内投与
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の投与の後のシナプス改善効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を５０ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスおよび正常マウスの脳組織を抽出し、シナプス関連タンパク質についてウェスタンブロッティングを行った。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１０と同じ様式において行われた。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の投与の後のシナプス改善効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を５０ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスおよび正常マウスの脳組織を抽出し、シナプス関連タンパク質についてウェスタンブロッティングを行った。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１０と同じ様式において行われた。
【0140】
結果として、ＩｇＧを腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、正常マウスの脳組織と比較して、より高い発現レベルのＰＳＤ５９およびシナプシン－１が観察された。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、ＩｇＧを腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織と比較して、より低い発現レベルのＰＳＤ５９およびシナプシン－１が観察された（図３７～３９）。
【0141】
実験例１２．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の腹腔内投与の後のＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の脳組織中への浸透および抗原に対するその結合の同定
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の腹腔内投与の後の脳組織における抗体の分布を同定するために、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を５０ｍｇ／ｋｇの量において腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウス、および正常マウスを、生理食塩水による心灌流に供した。次いで、それらから脳組織を抽出し、タンパク質－Ｇセファロース（ＰＧＳ）による免疫沈降に供した。その後、抗マウスＩｇＧ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、抗Ｔａｕ５抗体（Invitrogen、AHB0042）、抗アセチル－Ｋ２８０抗体（Anaspec、AS-56077）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の腹腔内投与の後の脳組織における抗体の分布を同定するために、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を５０ｍｇ／ｋｇの量において腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウス、および正常マウスを、生理食塩水による心灌流に供した。次いで、それらから脳組織を抽出し、タンパク質－Ｇセファロース（ＰＧＳ）による免疫沈降に供した。その後、抗マウスＩｇＧ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、抗Ｔａｕ５抗体（Invitrogen、AHB0042）、抗アセチル－Ｋ２８０抗体（Anaspec、AS-56077）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。
【0142】
結果として、ＩｇＧを腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織においては、いずれの抗体も検出されなかった。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、抗体が存在することが同定された（図４０）。
【0143】
実験例１３．高齢の認知症マウスモデルにおいてＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされた行動改善効果の同定：腹腔内投与
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の治療効力を同定するために、高齢の１４か月齢のマウスを調製例３におけるものと同じ様式において用いて、高齢の認知症マウスモデルを作製した。図４１において図示される実験スケジュールに従って、高齢の認知症マウスモデルを用いて、調製例２において調製されたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体をそれに投与した。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の治療効力を同定するために、高齢の１４か月齢のマウスを調製例３におけるものと同じ様式において用いて、高齢の認知症マウスモデルを作製した。図４１において図示される実験スケジュールに従って、高齢の認知症マウスモデルを用いて、調製例２において調製されたＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体をそれに投与した。
【0144】
実験例１３．１．巣作り試験を通した行動改善効果の同定
マウスのマルチモーダルな脳機能を同定することができる巣作り試験を、実験例４．１と同じ様式において行った。
結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスは、正常マウスと比較して約６０％の巣作りスコアの低下を示すこと、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスは、正常マウスと同様の巣作りスコアを示すことが同定された（図４２）。
マウスのマルチモーダルな脳機能を同定することができる巣作り試験を、実験例４．１と同じ様式において行った。
結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスは、正常マウスと比較して約６０％の巣作りスコアの低下を示すこと、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスは、正常マウスと同様の巣作りスコアを示すことが同定された（図４２）。
【0145】
実験例１３．２．Ｙ迷路試験を通した行動改善効果の同定
認知機能の回復を同定するために、Ｙ迷路試験を、実験例４．２におけるものと同じ様式において行った。
結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスの場合、ＡまたはＣゾーンにおいて滞在して過した時間は、約８０秒間であり、これは、正常マウスと比較して約２５％低かった。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの場合、ＡまたはＣゾーンにおいて滞在して過した時間は、約１２０秒間であり、これは、正常マウスと同様であった。これらの結果から、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの短期記憶能力が回復したことが同定された（図４３）。
認知機能の回復を同定するために、Ｙ迷路試験を、実験例４．２におけるものと同じ様式において行った。
結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスの場合、ＡまたはＣゾーンにおいて滞在して過した時間は、約８０秒間であり、これは、正常マウスと比較して約２５％低かった。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの場合、ＡまたはＣゾーンにおいて滞在して過した時間は、約１２０秒間であり、これは、正常マウスと同様であった。これらの結果から、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスの短期記憶能力が回復したことが同定された（図４３）。
【0146】
実験例１３．３．水迷路試験を通した行動改善効果の同定
水中迷路試験は、実験４．３におけるものと同じ様式において行われた。
結果として、第５日において、プラットフォームが置かれていたＮＷゾーンにおいて滞在して過した時間について評価を行った。結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスは、１０秒間以下にわたりＮＷゾーンに滞在するが、一方、正常マウスおよびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスは、２５秒間以上にわたりＮＷゾーンに滞在することが同定された（図４４）。
水中迷路試験は、実験４．３におけるものと同じ様式において行われた。
結果として、第５日において、プラットフォームが置かれていたＮＷゾーンにおいて滞在して過した時間について評価を行った。結果として、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌマウスは、１０秒間以下にわたりＮＷゾーンに滞在するが、一方、正常マウスおよびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ－ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ認知症マウスは、２５秒間以上にわたりＮＷゾーンに滞在することが同定された（図４４）。
【0147】
実験例１４．高齢の認知症マウスモデルにおいてＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされたタウオパシー軽減効果の同定：腹腔内投与
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の投与の後のタウオパシー軽減効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を５０ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内投与した高齢のＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスおよび正常マウスの脳組織を抽出し、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）、アセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）、およびリン酸化タウ（ｐＴ２３１）の発現レベルを、ウェスタンブロッティングを通してチェックした。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、抗Ｔａｕ５抗体（Invitrogen、AHB0042）、抗ｐＴ２３１抗体（Thermo、MN1040）、抗アセチル－Ｋ２８０抗体（Anaspec、AS-56077）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の投与の後のタウオパシー軽減効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を５０ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内投与した高齢のＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスおよび正常マウスの脳組織を抽出し、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）、アセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）、およびリン酸化タウ（ｐＴ２３１）の発現レベルを、ウェスタンブロッティングを通してチェックした。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、抗Ｔａｕ５抗体（Invitrogen、AHB0042）、抗ｐＴ２３１抗体（Thermo、MN1040）、抗アセチル－Ｋ２８０抗体（Anaspec、AS-56077）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。
【0148】
結果として、ＩｇＧを腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、より高い発現レベルの全タウタンパク質、リン酸化されたタウタンパク質およびアセチル化タウタンパク質のオリゴマー形態が観察された。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、ＩｇＧを腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織と比較して、著しくより低い発現レベルの全タウタンパク質、リン酸化されたタウタンパク質、およびアセチル化タウタンパク質が観察された（図４５～４８）。
【0149】
加えて、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を５０ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内投与した高齢のＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスおよび正常マウスの脳組織を抽出し、ギ酸を用いてそれらから大脳皮質組織を部分的に単離した。大脳皮質組織において、半変性ウェスタンブロッティングを通して不溶性タウ凝集物をチェックした。ここで、半変性ウェスタンブロッティングは、実験例９におけるものと同じ様式において行われた。
【0150】
結果として、ＩｇＧを腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、不溶性タウ凝集物の増加が観察された。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織において、ＩｇＧを腹腔内投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの脳組織と比較して、不溶性タウ凝集物の著しい減少が観察された（図４９）。
【0151】
ＩＩＩ．抗タウ抗体のタウシーディング阻害効果の同定
実験例１５．タウの凝集およびアセチル化タウタンパク質のシーディングの同定
初めに、野生型タウタンパク質（Ｔａｕ）を、in vitroで、アセチルトランスフェラーゼであるＰ３００酵素と反応させた。培養された神経細胞を、Ｐ３００と反応させたアセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－Ｋ２８０－ａｃ）で処置した。アセチル化タウタンパク質が細胞内凝集を誘導するか否かを同定するために、アセチル化タウタンパク質または野生型タウタンパク質による処置を行い、１時間または２０時間が経過した時点で、ドナー細胞ライセートに対して、抗ＨＡ抗体（Sigma-Aldrich、#11867423001）を用いてウェスタンブロッティングを行った。
実験例１５．タウの凝集およびアセチル化タウタンパク質のシーディングの同定
初めに、野生型タウタンパク質（Ｔａｕ）を、in vitroで、アセチルトランスフェラーゼであるＰ３００酵素と反応させた。培養された神経細胞を、Ｐ３００と反応させたアセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－Ｋ２８０－ａｃ）で処置した。アセチル化タウタンパク質が細胞内凝集を誘導するか否かを同定するために、アセチル化タウタンパク質または野生型タウタンパク質による処置を行い、１時間または２０時間が経過した時点で、ドナー細胞ライセートに対して、抗ＨＡ抗体（Sigma-Aldrich、#11867423001）を用いてウェスタンブロッティングを行った。
【0152】
ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、抗Ｔａｕ５抗体（Invitrogen、AHB0042）、抗アセチル－Ｋ２８０抗体（Anaspec、AS-56077）、抗β－アクチン抗体（Sigma、A5441）、抗ＨＡ抗体（Sigma、#11867423001）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。結果として、アセチル化タウタンパク質で処置されたドナー細胞のライセートにおいて、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）およびアセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）の凝集の増加が観察された（図５０）。
【0153】
加えて、細胞の外に分泌されるタウタンパク質の量が変化するか否かを同定するために、ドナー細胞の培地を、抗ＨＡ抗体（Sigma-Aldrich、#11867423001）を用いた免疫沈降に供し、次いで、ウェスタンブロッティングを行った。
【0154】
具体的には、ドナー細胞培地を、１３，０００ｒｐｍで１分間にわたり遠心分離して、細胞デブリを取り除いた。次いで、ドナー細胞培地を、タンパク質Ｇ－アガロースビーズ（GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA）で処置し、４℃で１時間にわたり反応させた。その後、１μｌの抗ＨＡ抗体による処置を行い、４℃で一晩反応を進行させた。翌日、タンパク質Ｇセファロースビーズをこれに添加し、４℃で１時間にわたり反応を進行させた。次いで、６，０００ｒｐｍで１分間にわたり４℃で遠心分離を行って、試料を回収した。試料の各々を、０．１％のTriton X-100を含むＰＢＳで２回洗浄した。試料を、サンプルバッファーで処置し、次いで、ウェスタンブロッティングを行った。ここで、ウェスタンブロッティングは、ドナー細胞ライセートについて行われたものと同じ様式において行われた。
【0155】
結果として、アセチル化タウタンパク質で処置されたドナー細胞の培地において、全タウタンパク質（Ｔａｕ５）およびアセチル化タウタンパク質（Ｔａｕ－ａｃＫ２８０）の量の増加が観察された（図５１）。
【0156】
加えて、他の神経細胞（レシピエント細胞）を、ドナー細胞培地で処置し、１時間または２０時間が経過した時点でレシピエント細胞のライセートを回収した。各々の試料に対して、タウ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。ここで、ウェスタンブロッティングは、実験例１と同じ様式において行われ、抗Ｔａｕ５抗体（Invitrogen、AHB0042）、抗アセチル－Ｋ２８０抗体（Anaspec、AS-56077）、抗β－アクチン抗体（Sigma、A5441）、抗ＨＡ抗体（Sigma、#11867423001）、およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Bioxcell、BE0083）を用いた。
【0157】
結果として、アセチル化タウタンパク質で処置されたドナー細胞の培地（Ｔａｕ－ａｃ－ＨＡ）で処置されたレシピエント細胞のライセートにおいて、タウタンパク質凝集物が観察された（図５２および５３）。
【0158】
実験例１６．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ抗体により引き起こされたタウシーディング阻害効果の同定：In vitro
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ０１＿ｖ０１抗体によりin vitroで引き起こされたタウシーディング阻害効果を同定するために、アルツハイマー病を有する患者の脳組織における、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメント（ｍＡＣ）、その凝集物（ａＡＣ）、またはサルコシル不溶性画分を、タウ－ＦＲＥＴの安定な細胞系に投与し、タウシーディングのレベルを測定した。タウがシーディングされた細胞に対して、それぞれ、ＩｇＧおよびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ０１＿ｖ０１抗体を投与した。それらについての比較分析を行った。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ０１＿ｖ０１抗体によりin vitroで引き起こされたタウシーディング阻害効果を同定するために、アルツハイマー病を有する患者の脳組織における、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメント（ｍＡＣ）、その凝集物（ａＡＣ）、またはサルコシル不溶性画分を、タウ－ＦＲＥＴの安定な細胞系に投与し、タウシーディングのレベルを測定した。タウがシーディングされた細胞に対して、それぞれ、ＩｇＧおよびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ０１＿ｖ０１抗体を投与した。それらについての比較分析を行った。
【0159】
初めに、細胞を処置するために用いられるべきＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントの凝集物を、以下のとおり調製した。２５μＭの濃度を有するＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメントを、２５ｍＭのＤＴＴ溶液中で２４℃の温度で１時間にわたり溶解し、生じた生成物を、撹拌しながら、（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、およびヘパリン（２５ｍＭ）の溶液中で、Eppendorf Thermomixer Cを用いて、７００ｒｐｍで３７℃の温度の条件下において溶解した。そうすることにより、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントの凝集物を調製した。
【0160】
その後、HEK293 Tau RD P301S-FRET Biosensor（ATCC CRL-3275）を、９６ウェルのプレート中に３．５×１０４細胞／ウェルで分注した。１８時間後、各々のウェルのうちの約６０％がHEK 293 Tau RD P301S-FRET Biosensorで被覆されたか否かを同定した。次いで、８．７５μｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ、１．２５μｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）、およびＫ２８０－ａｃタンパク質フラグメント、その凝集物、またはサルコシル不溶性画分を混合して、混合物を室温で２０分間にわたり反応させた。その後、各々のウェルを、混合物による処置に供し、次いで、３７℃の温度で２４時間にわたりインキュベーションを行った。次いで、CLARIOstar（登録商標）（BMG Labtech）装置を用いて蛍光波長分析を行った。
【0161】
結果として、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ０１＿ｖ０１抗体が投与された場合、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントで処置された細胞は、統合されたＦＲＥＴ密度の低下を示し；ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ０１＿ｖ０１抗体が投与された場合、Ｋ２８０－ａｃタンパク質フラグメントの凝集物で処置された細胞もまた、統合されたＦＲＥＴ密度の低下を示した（図５４）。加えて、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ抗体が投与された場合、アルツハイマー病を有する患者の脳組織におけるサルコシル不溶性画分で処置された細胞は、統合されたＦＲＥＴ密度の低下を示した（図５５）。これらの結果から、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ０１＿ｖ０１抗体が投与された場合、タウシーディングが阻害されることが同定された。
【0162】
実験例１７．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされたタウシーディング阻害効果の同定：In vivo
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体によりin vivoで引き起こされたタウシーディング阻害効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の静脈内注射を開始して２週間後に、調製例３において作製されたＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの左海馬におけるＣＡ１層に対して、アルツハイマー病を有する患者からのサルコシル不溶性画分を投与した。サルコシル不溶性画分は、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの左海馬におけるＣＡ１層に投与した。その後、各々のマウスを安楽死させて脳組織を抽出し、次いで、凍結して薄切した。脳切片を、抗ＡＴ８抗体による免疫組織化学染色に供し、タウシーディングのレベルをチェックした。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体によりin vivoで引き起こされたタウシーディング阻害効果を同定するために、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体の静脈内注射を開始して２週間後に、調製例３において作製されたＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの左海馬におけるＣＡ１層に対して、アルツハイマー病を有する患者からのサルコシル不溶性画分を投与した。サルコシル不溶性画分は、Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの左海馬におけるＣＡ１層に投与した。その後、各々のマウスを安楽死させて脳組織を抽出し、次いで、凍結して薄切した。脳切片を、抗ＡＴ８抗体による免疫組織化学染色に供し、タウシーディングのレベルをチェックした。
【0163】
具体的には、BraakステージＩＶにおけるアルツハイマー病を有する患者の脳組織におけるサルコシル不溶性フラグメント（３μｌ、３．３μｇ／μｌ）を、超音波処理に供し、６か月齢のＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスの左海馬のＣＡ１層（前－後：－１．９ｍｍ、内側－外側：１．５ｍｍ、左：－１．８ｍｍ）中に注射した。Ｔａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスに、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を２０ｍｇ／ｋｇ／週の量において静脈内注射を開始し、２週間後に、サルコシル不溶性フラグメントを投与した；および、マウスに、ＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を、サルコシル不溶性フラグメントの投与の週から第１２週まで、週１回静脈内投与した。ここで、サルコシル不溶性フラグメントは、０．２μｌ／分の速度で、１０μｌのガラスシリンジ（Hamilton、０．４９ｍｍ、Reno, NV）を用いて注射し、逆流を防ぐために、取り除く前に５分間待った後で、針を取り除いた。１２週間後、各々のマウスを安楽死させて脳組織を抽出し、Leica CM1860を用いて３０μｍ厚の凍結切片に切った。
【0164】
免疫組織化学染色のために、脳切片の各々をバッファーＡ（１％のＮＧＳ、０．２％のTriton X-100および３０％のＨ２Ｏ２、およびＰＢＳ）で洗浄した。脳切片を、１％のＮＧＳおよび０．２％のTriton X-100を含むＰＢＳ、ならびにＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体による処置に供し、４℃で一晩反応させた。脳切片を、ＰＢＳ溶液で数回洗浄し、次いで、二次抗体（Vector Laboratories）と、室温で１時間にわたり反応させた。その後、脳切片を、Vectastain ABCキット（Vector Laboratories）を用いて免疫染色に供し、製造者のマニュアルに従って免疫染色を行った。染色された脳切片を、ImageJソフトウェア（NIH, Bethesda, MD）を用いて分析し、海馬を含む３つの脳切片を定量した。抗ＡＴ８抗体で染色された神経細胞について、３人の盲検試験者により、実験において用いられた脳切片による測定を行い、特定の閾値において定量的分析を行った。ＩｇＧを投与した７個体のＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウス、およびＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与した８個体のＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスにおける、十字縫合－１．７５と十字縫合－２．２５との間の３つの脳切片を、分析のために用いた。統計学的分析のために、ｔ検定を用いた。
【0165】
結果として、ＩｇＧを投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスについて、患者の不溶性フラグメントが投与された側とは反対側の脳領域（皮質、海馬）において、神経細胞体の染色が強力に観察された。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を投与したＴａｕ－Ｐ３０１Ｌ認知症マウスについて、海馬および皮質において、低下した染色が観察された（図５６～５９）。
【0166】
実験例１８．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ／ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ抗体により引き起こされたタウの凝集およびシーディング阻害効果の同定
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされたタウ凝集阻害効果を同定するために、in vitroタウ凝集アッセイを行った。in vitroで生成されたＫ１８タンパク質フラグメントを、１．５μｇのＰ３００および１ｍＭのアセチル－ＣｏＡと、３０℃の温度で３時間にわたり反応させることによりアセチル化した。その後、単量体Ｋ１８タンパク質フラグメントを、２５μＭのアセチル化Ｋ１８タンパク質フラグメント（Ｋ１８－Ｐ３０１Ｌ）と、室温で１時間にわたり反応させた。次いで、得られたものを、２５ｍＭのヘパリン５７、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）およびＮａＣｌ（１００ｍＭ）で処置し、７００ｒｐｍの条件下において撹拌して、タウタンパク質の凝集を誘導した。次いで、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を用いて、ウェスタンブロッティングおよびチオフラビン－Ｔアッセイを通して、タウの凝集およびそのシーディング阻害効果を分析した。チオフラビン－Ｔアッセイにより、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ抗体による処置を行った場合、アセチル化タウタンパク質が凝集した場合と比較して、アセチル化タウタンパク質の凝集が阻害されることが同定された。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされたタウ凝集阻害効果を同定するために、in vitroタウ凝集アッセイを行った。in vitroで生成されたＫ１８タンパク質フラグメントを、１．５μｇのＰ３００および１ｍＭのアセチル－ＣｏＡと、３０℃の温度で３時間にわたり反応させることによりアセチル化した。その後、単量体Ｋ１８タンパク質フラグメントを、２５μＭのアセチル化Ｋ１８タンパク質フラグメント（Ｋ１８－Ｐ３０１Ｌ）と、室温で１時間にわたり反応させた。次いで、得られたものを、２５ｍＭのヘパリン５７、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）およびＮａＣｌ（１００ｍＭ）で処置し、７００ｒｐｍの条件下において撹拌して、タウタンパク質の凝集を誘導した。次いで、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体を用いて、ウェスタンブロッティングおよびチオフラビン－Ｔアッセイを通して、タウの凝集およびそのシーディング阻害効果を分析した。チオフラビン－Ｔアッセイにより、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｈ抗体による処置を行った場合、アセチル化タウタンパク質が凝集した場合と比較して、アセチル化タウタンパク質の凝集が阻害されることが同定された。
【0167】
初めに、細動反応のために、１０Ｍ～２０Ｍのアセチル化タウタンパク質（２Ｎ４Ｒ）を、ヘパリン（Sigma-Aldrich）およびＤＴＴを２ｍＭの濃度で１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中に添加することにより得られた溶液中で、３７℃でインキュベートした。タンパク質およびＴｈＴ溶液（１：１の比におけるもの）を、各々のウェルに添加した。様々な時点におけるＴｈＴ蛍光分析を、CLARIOstar（登録商標）（BMG Labtech, Ortenberg, Germany）を４５０ｎｍ（励起）および５１０ｎｍ（発光）波長において用いて測定した。
【0168】
培養されたマウス神経細胞を、アセチル化されたタンパク質の凝集物で処置し、ウェスタンブロッティングを行って、結果を同定した。
実験のために、初代大脳皮質ニューロン（ＤＩＶ１０）を、３μｇ／ｍｌの濃度の単量体Ｋ１８－Ｐ３０１Ｌ、凝集したＫ１８－Ｐ３０１Ｌ、またはアセチル化Ｋ１８－Ｐ３０１Ｌで、２４時間にわたり処置した。ニューロンを、Ｋ１８タンパク質処置の前に、３μｇ／ｍｌのＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体で３０分間にわたり前処置した。
実験のために、初代大脳皮質ニューロン（ＤＩＶ１０）を、３μｇ／ｍｌの濃度の単量体Ｋ１８－Ｐ３０１Ｌ、凝集したＫ１８－Ｐ３０１Ｌ、またはアセチル化Ｋ１８－Ｐ３０１Ｌで、２４時間にわたり処置した。ニューロンを、Ｋ１８タンパク質処置の前に、３μｇ／ｍｌのＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体で３０分間にわたり前処置した。
【0169】
結果として、多くのタウ凝集体が神経細胞に侵入し、内在性タウタンパク質の凝集を誘導することが観察された；しかし、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体と同時に処置された場合、かかる現象が減少することが同定された（図６０および６１）。
【0170】
実験例１９．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされた神経細胞保護効果の同定
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体抗体により引き起こされた神経細胞保護効果を同定するために、大脳皮質神経細胞を、初めに、胎生期の間にマウス脳から単離した。具体的には、１６日齢のマウスを安楽死させて脳組織を抽出し、それから大脳皮質を単離した。その後、大脳皮質組織を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンク平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）中で解離させて、０．１２５％トリプシン溶液中で、３７℃で１５分間にわたりインキュベートした。２０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）による処置により、トリプシンを不活化させて、ピペットを用いて大脳皮質組織を微粉砕した。得られた細胞懸濁液を、Ｂ２７（登録商標）サプリメント（GibcoBRL）を補充したＮＢ培地（Neurobasal（登録商標）培地）中で希釈し、５０μｇ／ｍｌのポリ－Ｄ－リジン（Sigma）および１μｇ／ｍｌのラミニン（GibcoBRL）でコーティングされたプレート上に分注した。神経細胞を、３７℃および５％ＣＯ２の条件下において１０日間にわたり培養した。次いで、培養された神経細胞を、３μｇ／ｍｌのアセチル化Ｋ１８タンパク質フラグメントの凝集物、およびＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体で処置し、２４時間にわたり反応させた。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体抗体により引き起こされた神経細胞保護効果を同定するために、大脳皮質神経細胞を、初めに、胎生期の間にマウス脳から単離した。具体的には、１６日齢のマウスを安楽死させて脳組織を抽出し、それから大脳皮質を単離した。その後、大脳皮質組織を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンク平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）中で解離させて、０．１２５％トリプシン溶液中で、３７℃で１５分間にわたりインキュベートした。２０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）による処置により、トリプシンを不活化させて、ピペットを用いて大脳皮質組織を微粉砕した。得られた細胞懸濁液を、Ｂ２７（登録商標）サプリメント（GibcoBRL）を補充したＮＢ培地（Neurobasal（登録商標）培地）中で希釈し、５０μｇ／ｍｌのポリ－Ｄ－リジン（Sigma）および１μｇ／ｍｌのラミニン（GibcoBRL）でコーティングされたプレート上に分注した。神経細胞を、３７℃および５％ＣＯ２の条件下において１０日間にわたり培養した。次いで、培養された神経細胞を、３μｇ／ｍｌのアセチル化Ｋ１８タンパク質フラグメントの凝集物、およびＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体で処置し、２４時間にわたり反応させた。
【0171】
２４時間後、上清を回収し、細胞毒性検出キット（ＬＤＨ、Roche Applied Sciences）を用いて分析した。細胞死を定量する比色アッセイとして、損傷を受けた神経細胞の細胞質ゾルから上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性を測定する方法を用いた。Tecan Infinite（登録商標）200装置を用いて、４９０ｎｍの波長における吸光度を測定した。結果は、陰性対照（ブランク）と比較した細胞生存率のパーセンテージにおいて表した。
【0172】
加えて、細胞生存率は、ＭＴＴ（チアゾリルブルーテトラゾリウム臭化物、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）還元アッセイを用いて測定した。５４０ｎｍの波長における吸光度を、TecanInfinite（登録商標）200装置を用いて測定し、結果は、陰性対照（ブランク）と比較したパーセンテージにおいて表した。
【0173】
加えて、結果は、２回の独立した培養および６個のウェルの条件下において得たものであり、全ての値は、平均値±平均値のｓ．ｅ．として表した。統計学的分析のために、Tukey多重比較検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを用いた。
【0174】
結果として、図６２において示されるとおり、ＩｇＧ処置された神経細胞においては、高いＬＤＨ活性が観察された。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体処置された神経細胞においては、ＩｇＧ処置された神経細胞と比較して、低下したＬＤＨ活性が観察された。加えて、図６３において示されるとおり、ＩｇＧ処置された神経細胞においては、大きく低下した生存率が観察された。一方、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体処置された神経細胞においては、ＩｇＧ処置された神経細胞と比較して、著しく増大した生存率が観察された。これらの結果から、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体が、アセチル化タウタンパク質の凝集により引き起こされた神経細胞における損傷に対して、保護効果を発揮することが同定された。
【0175】
実験例２０．ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされたミクログリア食作用促進効果の同定
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされたミクログリア食作用促進効果を同定するために、初代ミクログリアを、初めに、２日齢～３日齢のマウスの大脳皮質から単離し、McDonald DR et al., J Neurosci. 1997; 17: 2284-94において記載される方法に従って培養した。
ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体により引き起こされたミクログリア食作用促進効果を同定するために、初代ミクログリアを、初めに、２日齢～３日齢のマウスの大脳皮質から単離し、McDonald DR et al., J Neurosci. 1997; 17: 2284-94において記載される方法に従って培養した。
【0176】
その後、ミクログリア食作用の分析のために、アセチル化Ｋ１８タンパク質フラグメントを、HiLyte（商標）Fluor 488で、製造者の指示に従って標識した。HiLyte（商標）Fluor 488で標識されたアセチル化Ｋ１８タンパク質の凝集のために、タンパク質を、その凝集が誘導されるように、ヘパリン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）および２ｍＭのＤＴＴを含む１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中で、３７℃でインキュベートした。
【0177】
１２ウェルプレート中に５×１０４細胞／ウェルでミクログリアを分注し、次いで、アセチル化Ｋ１８タンパク質フラグメントの凝集物（３μｇ／ｍｌ）を、３７℃で２時間にわたり反応させた。４．５μｇ／ｍｌの濃度におけるＩｇＧまたはＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体による前処置は、アセチル化Ｋ１８タンパク質フラグメントの凝集物と共に、処置の３０分前に行った。
食作用の分析のために、細胞を、トリプシンによる処置で分離し、次いで、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。フローサイトメトリーのために、２００μｌの２％ウシ胎仔血清を含むＨＢＳＳ溶液による処置を行い、FACSCanto（商標）II（BD Biosciences）装置および４８８蛍光フィルターを用いて分析を行った。
結果として、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体で処置されたミクログリアにおいて、ＩｇＧ処置されたミクログリアと比較して、促進された食作用が観察された（図６４）。
食作用の分析のために、細胞を、トリプシンによる処置で分離し、次いで、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。フローサイトメトリーのために、２００μｌの２％ウシ胎仔血清を含むＨＢＳＳ溶液による処置を行い、FACSCanto（商標）II（BD Biosciences）装置および４８８蛍光フィルターを用いて分析を行った。
結果として、ＡＤＥＬ－Ｙ０１ｍ抗体で処置されたミクログリアにおいて、ＩｇＧ処置されたミクログリアと比較して、促進された食作用が観察された（図６４）。
【0178】
統計学的分析
統計学的分析は、GraphPadソフトウェア（GraphPad Prism v7.0およびGraphPad Prism v8.0、GraphPad Softwere、San Diego, CA, USA）を用いて行った。データは、一方向ＡＮＯＶＡ（Tukeyの事後試験）およびStudentのｔ検定により分析した。０．０５より低いＰ値を、有意とみなした。
統計学的分析は、GraphPadソフトウェア（GraphPad Prism v7.0およびGraphPad Prism v8.0、GraphPad Softwere、San Diego, CA, USA）を用いて行った。データは、一方向ＡＮＯＶＡ（Tukeyの事後試験）およびStudentのｔ検定により分析した。０．０５より低いＰ値を、有意とみなした。
【0179】
［アクセッション番号］
受託機関の名称：Korean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１４１５５ＢＰ
アクセッションの日付：２０２０年３月１８日
受託機関の名称：Korean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）
アクセッション番号：ＫＣＴＣ１４１５５ＢＰ
アクセッションの日付：２０２０年３月１８日
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59】
【図60】
【図61】
【図62】
【図63】
【図64】
【配列表】