特許 7595099 固形腫瘍細胞及びエスケープバリアントを治療するための足場

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-27

(45)【発行日】2024-12-05

(54)【発明の名称】固形腫瘍細胞及びエスケープバリアントを治療するための足場

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/06 20060101AFI20241128BHJP

   A61L 27/56 20060101ALI20241128BHJP

   A61L 27/54 20060101ALI20241128BHJP

   A61L 27/22 20060101ALI20241128BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20241128BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241128BHJP

【ＦＩ】

A61L27/06

A61L27/56

A61L27/54

A61L27/22 ZNA

A61L27/38

A61P35/00

【請求項の数】 10

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023012548

(22)【出願日】2023-01-31

(62)【分割の表示】P 2019534814の分割

【原出願日】2017-12-21

(65)【公開番号】P2023065362

(43)【公開日】2023-05-12

【審査請求日】2023-03-01

(31)【優先権主張番号】62/437,572

(32)【優先日】2016-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519223941

【氏名又は名称】モナーク・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】マティーアス・シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】コリン・パトリック・キーリー

【審査官】伊藤 基章

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１４／１１０５９１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０１８０３９９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１２／０２４５７０６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００２／００６２１５４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／０７９８９９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｌ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）薄膜ニチノール（ＴＦＮ）マイクロメッシュを含む足場マトリックス、（ｉｉ）ＣＤ１３７に特異的な抗体を含むリンパ球活性化部分、及び（ｉｉｉ）リンパ球接着部分としてフィブリンを含む、対象における固形腫瘍を治療するためのリンパ球足場を形成するためのキット。

【請求項2】

多孔質粒子をさらに含む、請求項１に記載のキット。

【請求項3】

リポソームをさらに含む、請求項１に記載のキット。

【請求項4】

原細胞をさらに含む、請求項１に記載のキット。

【請求項5】

ＳＴＩＮＧアゴニストをさらに含む、請求項１に記載のキット。

【請求項6】

ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＧＭＰ、ｃ－ｄｉＡＭＰ、ｃ－ＧＡＭＰ、ｃ－ＡＩＭＰ、（３’，２’）ｃ－ＡＩＭＰ、（２’，２’）ｃ－ＡＩＭＰ、（２’，３’）ｃ－ＡＩＭＰ、ｃ－ＡＩＭＰ（Ｓ）、ｃ－（ｄＡＭＰ－ｄＩＭＰ）、ｃ－（ｄＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、ｃ－（２’ＦｄＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、（２’，３’）ｃ－（ＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、ｃ－［２’ＦｄＡＭＰ（Ｓ）－２’ＦｄＩＭＰ（Ｓ）］、ｃ－［２’ＦｄＡＭＰ（Ｓ）－２’ＦｄＩＭＰ（Ｓ）］（ＰＯＭ）２及び／又はＤＭＸＡＡを含む、請求項５に記載のキット。

【請求項7】

ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＧＭＰを含む、請求項５に記載のキット。

【請求項8】

免疫刺激剤をさらに含む、請求項１に記載のキット。

【請求項9】

免疫刺激剤が、サイトカイン、抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ及び／又はワクチンアジュバントである、請求項８に記載のキット。

【請求項10】

免疫刺激剤が、（ｉ）ＣｐＧ、Ｃｐｇ－２８、ポリ（Ｉ：Ｃ）、α－ガラクトセラミド、ＭＰＬＡ、ＶＴＸ－２３３７、ＥＭＤ１２０１０８１）イミキモド、ＭＧＮ１７０３、Ｇ１００、ＣＢＬＢ５０２、ヒルトノール及びイミキモドから選択されるＴｏｌｌ様受容体リガンド並びに／又は（ｉｉ）１７－ジメチルアミノエチルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン）から選択される、請求項８に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦政府によって支援を受けた研究又は開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＣＡ１８１４１３に基づき政府支援によって行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／４３７，５７２号に対する優先権を主張し、この全内容は参照により組み込まれる。

【0003】

配列表に対する言及
５０ＫＢのファイルサイズである、２０１７年１１月３０日に作成された又はこの付近に作成された「１ＱＪ８７９６．ｔｘｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ）」というタイトルのコンピューター可読テキストファイルは、本出願についての配列表を含み、この全体は参照により本明細書に組み込まれる。

【0004】

本開示の分野
本開示は、固形腫瘍及びエスケープバリアント（ｅｓｃａｐｅ ｖａｒｉａｎｔ）を治療し、がん再発に対する有効なワクチン接種を提供する移植可能な足場を提供する。足場は、遺伝的に再プログラムされたリンパ球、及びリンパ球活性化部分を含む。

【背景技術】

【0005】

がん免疫療法は、がんを治療するために患者の免疫系が使用される分野を指す。例えば、がん免疫療法は、がんの発生に対して患者を免疫化するためのワクチンの使用を含む。残念なことに、がんワクチンが誘発させることができる応答は、成熟するのに数ヶ月を要することがあり、通常、進行した疾患を抑制するには不十分である。

【0006】

また、がん細胞を攻撃するために患者自身のＴ細胞をより迅速に刺激する又は強力に刺激する試みもなされてきた。しかしながら、Ｔ細胞によって通常発現される受容体のレパートリーは一般に自己／腫瘍抗原に対して低い親和性を有するので、このアプローチは、がんに対する戦いにおいて十分な成功を達成していない。

【0007】

新たな免疫療法アプローチは、腫瘍における選択された巨大分子標的に対して高い親和性を有するように操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子を用いて患者由来のリンパ球（例えば、Ｔ細胞）を変化させることを含む。導入された遺伝子はまた、強力なＴ細胞増殖を誘発するための共刺激シグナルを産生することができる。この方法は、患者からＴ細胞を回収し、これらを、共刺激及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと融合した腫瘍特異的一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）から構成されるＣＡＲを発現するようにエキソビボで再指向することを含み、これにより、プログラムされた細胞が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に依存しない様式で腫瘍標的を溶解させることが可能となる。

【0008】

このようなＣＡＲプログラムされたＴ細胞を利用する療法は、臨床試験において血液学的悪性腫瘍（すなわち、液体血液がん）を有する患者において一貫して陽性の結果を生じた。しかしながら、固形腫瘍に関しては、これらの療法の有効性は、１）腫瘍部位に対するリンパ球の非効率的なホーミング、２）免疫抑制性微小環境固形腫瘍が生じること、及び３）ＣＡＲプログラムされたＴ細胞のターゲティング受容体によって認識されないがん細胞が、プログラムされたＴ細胞を回避するエスケープバリアントを形成し得ることを意味する固形腫瘍の表現型多様性によって制限されてきた。したがって、Ｔ細胞の遺伝的再プログラミングは依然として有望な療法であるが、有意な改善が、固形腫瘍を治療するためのこれらの使用において必要とされる。

【0009】

ＵＳ２０１６／０００８３９９は、遺伝的に再プログラムされたリンパ球（例えば、Ｔ細胞）が固形腫瘍を治療する能力を大幅に改善する移植可能な足場を記載している。移植可能な足場は、遺伝的に再プログラムされたリンパ球、足場に関連する少なくとも１つのリンパ球接着部分、足場に関連する少なくとも１つのリンパ球活性化部分、及び任意選択的に免疫刺激剤を含む。足場は固形腫瘍の部位に移植され得るので、腫瘍部位に対するリンパ球の非効率的なホーミングに関する問題が克服される。

【0010】

ＵＳ２０１６／０００８３９９はまた、移植可能な足場が、腫瘍細胞に対する延長された第２の波の防御をどのように生じるかを記載している。特に、足場内に播種されたリンパ球は、移植後に足場から出て、例えば、切除後に残った残存腫瘍細胞を破壊するために、腫瘍切除床全体にわたって高密度にて分散し、及び流入領域リンパ節内に高密度にて分散する。このステップは、死にかけている腫瘍細胞から大量の腫瘍抗原を組織内に放出する。腫瘍抗原は、続いて抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれる。免疫刺激剤を放出することによって、足場は、強力な宿主抗腫瘍免疫応答を開始するためにＡＰＣ及び腫瘍反応性免疫細胞を活性化することができる。抗腫瘍免疫のこの「第２の波」はより広く、残った腫瘍細胞を排除するために相乗的に作用する複数の細胞型を含む。

【0011】

ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ＩＮｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｇｅｎｅｓ））経路アゴニストは、がん免疫療法における集中的な研究の焦点となっている有力な免疫刺激剤の一種である。しかしながら、以前に記載されたアジュバント化合物（例えば、Ｒ８４８及び関連するイミダゾキノリンＴＬＲ７／８アゴニスト、（ＮＯＤ）様受容体を誘発するムラミルジペプチド及びＲＩＧ－ＩのＲＮＡオリゴヌクレオチドリガンド）と同様に、定式化されていないＳＴＩＮＧアゴニストによる治療は全身性炎症毒性を伴い、このことは、がん患者を治療するためにこれらの化合物を使用することに関して大きな障害となる。したがって、臨床的に有効であるためには、高用量のＳＴＩＮＧアゴニストが、腫瘍病変に繰り返し直接注射されることが必要であり、このことは、この療法を、毎日の接種が可能である部位（例えば、皮膚悪性腫瘍）に制限する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０００８３９９号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

（開示の要旨）
本開示は、改善された移植可能な足場を提供することによって、がん免疫療法を進化させ続ける。本明細書に開示される移植可能な足場には、（ｉ）遺伝的に再プログラムされたリンパ球、及び（ｉｉ）少なくとも１つのリンパ球活性化部分が播種されている。したがって、特定の実施形態では、これらの移植可能な足場は、ＵＳ２０１６／０００８３９９に記載されているものよりも形態が単純であり得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される移植可能な足場はまた、ＳＴＩＮＧアゴニストを含んでもよい。これらの実施形態は、全身性炎症毒性を伴わず、毎日の注射を必要としない、ＳＴＩＮＧアゴニストの有効な免疫賦活効果を利用する機構を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0014】

開示されている移植可能な足場により観察された抗がん作用のロバスト性は、相乗的であり、予想外であり、注目すべきであった。試験された全ての対象のほぼ半分において、固形腫瘍の完全な根絶が達成された。したがって、遺伝的に再プログラムされたリンパ球によって認識された腫瘍細胞並びに通常、エスケープバリアントになっていた腫瘍細胞は効果的に治療された。さらに、固形腫瘍の完全な根絶後、対象はがん細胞により再チャレンジされた。再チャレンジされた対象の１００％は測定可能な腫瘍を全く発生せず、自己ワクチン部位の有効性が実証された。したがって、本明細書に開示される移植可能な足場は、固形腫瘍がんに対する進行中の戦いにおいて有意な進化を提供する。

【0015】

特定の実施形態では、足場は、マイクロパターン化金属薄膜又はポリマーから選択される足場マトリックス材料を含む。特定の実施形態では、遺伝的に再プログラムされたリンパ球は、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。特定の実施形態では、少なくとも１つのリンパ球活性化部分は、インターロイキン１５並びに／又はＣＤ３、ＣＤ２８及び／又はＣＤ１３７に特異的な抗体から選択される。特定の実施形態では、足場はＳＴＩＮＧアゴニストを含む。特定の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストはｃ－ｄｉＧＭＰである。特定の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、薬物溶出ポリマー内に埋め込まれている。特定の実施形態では、足場はリンパ球接着部分を含む。特定の実施形態では、リンパ球接着部分は、フィブリン又はＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドから選択される。

【0016】

特定の実施形態では、足場は、（ｉ）薄膜ニチノール（ＴＦＮ）マイクロメッシュ内に配置された遺伝的に再プログラムされたリンパ球を含む。遺伝的に再プログラムされたリンパ球は、ＣＤ３、ＣＤ２８及び／若しくはＣＤ１３７に特異的な抗体を含むリンパ球活性化部分を有するＴ細胞を含んでもよく、並びに／又はインターロイキン－１５及びＣＤ１３７に特異的な抗体を含むリンパ球活性化部分を有するＮＫ細胞を含んでもよい。特定の実施形態では、これらの実施形態は、リンパ球接着部分フィブリンを含んでもよい。特定の実施形態では、これらの実施形態は、ｃ－ｄｉＧＭＰを含んでもよい。特定の実施形態では、これらの実施形態は、ＴＦＮマイクロメッシュの表面上にコーティングされた薬物溶出ポリマー内に埋め込まれたｃ－ｄｉＧＭＰを含んでもよい。特定の実施形態では、これらの実施形態は、粒子内に埋め込まれたＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、ｃ－ｄｉＧＭＰ）を含んでもよい。粒子が使用される場合、１つ以上のリンパ球活性化部分は、粒子の表面上にあってもよい。

【0017】

特定の実施形態では、ＴＦＮマイクロメッシュを含む足場は、高密度の細胞（１ｃｍ^２当たり少なくとも７×１０^６個又は１ｃｍ^２当たり少なくとも８×１０^６個の細胞）を含んでもよい。ＴＦＮマイクロメッシュは、例えば、３層の細胞をＴＦＮマイクロメッシュの各層に充填することによって、高い細胞密度を可能にすることができる。

【0018】

特定の実施形態では、ＴＦＮマイクロメッシュを含む足場は、数日間、１週間より長い間及び／又は２週間より長い間、リンパ球を送達し続けることができる長時間作用する足場として使用され得る。

【0019】

特定の実施形態では、足場は、（ｉ）アルギネート足場マトリックス内に配置された遺伝的に再プログラムされたリンパ球を含む。遺伝的に再プログラムされたリンパ球は、ＣＤ３、ＣＤ２８及び／若しくはＣＤ１３７に特異的な抗体を含むリンパ球活性化部分を有するＴ細胞を含んでもよく、並びに／又はインターロイキン－１５及びＣＤ１３７に特異的な抗体を含むリンパ球活性化部分を有するＮＫ細胞を含んでもよい。特定の実施形態では、これらの実施形態は、ＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドリンパ球接着部分を含んでもよい。特定の実施形態では、これらの実施形態はｃ－ｄｉＧＭＰを含んでもよい。特定の実施形態では、これらの実施形態は、アルギネート足場の表面上にコーティングされた薬物溶出ポリマー内に埋め込まれたｃ－ｄｉＧＭＰを含んでもよい。特定の実施形態では、これらの実施形態は、粒子内に埋め込まれたＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、ｃ－ｄｉＧＭＰ）を含んでもよい。粒子が使用される場合、１つ以上のリンパ球活性化部分は、粒子の表面上にあってもよい。

【0020】

本明細書において提出された図面の多くは、色がより良く理解される。出願人は、図面のカラー版を最初の提出物の一部とみなし、後の手続きにおいて図面のカラー画像を提示する権利を留保する。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】固形腫瘍は不均一であり、療法のための標的として一般に使用される様々なレベルの抗原を発現することを示す図である。これは、これらの腫瘍によるタンパク質発現のかなりの多様性を示すヒト膵管腺がんの代表的な共焦点画像である。サイトケラチン発現は、一般に腺がんにおいて発生するので、汎サイトケラチン（ｐａｎ－ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）抗体が腫瘍細胞集団を定義するために使用された。腫瘍分化抗原メソテリンは免疫療法についての可能性がある候補であり、がん幹細胞マーカーＥｐＣＡＭをターゲティングする治療は、現在、臨床開発中である。スケールバー、１００μｍ。この図の色再現において、汎サイトケラチン抗体は緑色であり、メソテリンは赤色であり、ＥｐＣＡＭは青色である。

【図2A】腫瘍特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の全身注入は、わずかな治療効果しか生じないことを示す図である。膵管腺がんの同所性マウスモデルの図である。

【図2B】腫瘍特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の全身注入は、わずかな治療効果しか生じないことを示す図である。外科的移植から７日後のＫＰＣ膵臓の明視野顕微鏡検査の図である。ヘマトキシリン／エオシン染色により、膵頭部において実質組織が散在している侵襲性腺がんが明らかとなり、隣接する健康な組織により、新生物領域の無秩序な性質が強調される。腺がんの特徴である、分化腺房構造及び未分化腺房構造（すなわち、腺及び管）の両方の形成もまた、これらの試料において明らかである。拡大（２０倍）画像の分析により、腫瘍微小環境内の多形核白血球を含む、免疫細胞のかなりの動員が明らかとなった。破線の長方形は拡大された挿入物を特定している。スケールバー、１００μｍ。

【図2C】腫瘍特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の全身注入は、わずかな治療効果しか生じないことを示す図である。ＫＰＣ腫瘍によるＲａｅ－１発現における細胞間変動性を定量化するフローサイトメトリーデータのヒートマップの図である。７日齢の腫瘍（これらを区別するためにＧＦＰによりタグ化した）を単一細胞懸濁液中に分離し、Ｒａｅ－１に対する抗体により標識化したので、この抗原の平均蛍光強度はフローサイトメトリーによって測定され得、陰影はアイソタイプ対照と比較した相対発現レベルを示す。１，８００個のランダムに選択した細胞からの結果を示す。

【図2D】腫瘍特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の全身注入は、わずかな治療効果しか生じないことを示す図である。Ｒａｅ－１を認識するために使用されるキメラ受容体が、ネズミＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達分子と融合した全長マウスＮＧＫ２Ｄをどのように含むかを示す概略図である。

【図2E】腫瘍特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の全身注入は、わずかな治療効果しか生じないことを示す図である。レトロウイルス形質導入及びＧ４１８を含有する培地中での３日間の増殖後の、マウスエフェクターＴ細胞上のＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲの表面発現を測定するフローサイトメトリーの図である。

【図2F】腫瘍特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の全身注入は、わずかな治療効果しか生じないことを示す図である。ＫＰＣ臓腫瘍細胞と反応するＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の^５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイの図である。

【図2G】腫瘍特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の全身注入は、わずかな治療効果しか生じないことを示す図である。ホタルルシフェラーゼ発現ＫＰＣ腫瘍細胞をアルビノＣ５７ＢＬ／６マウスの膵臓に移植してから１０日後、動物に１０^７個のＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を注射した図である。プログラムされたリンパ球ターゲティングの動態を測定するために、並行実験において、マウスに、コメツキムシ赤色ルシフェラーゼレポーターを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を注射した。各コホート（ｎ＝１０）からの５匹の代表的なマウスにおけるＫＰＣ腫瘍及び養子導入Ｔ細胞の連続生物発光イメージングを示す。

【図2H】腫瘍特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の全身注入は、わずかな治療効果しか生じないことを示す図である。処置マウス及び対照マウスについてのカプラン－マイヤー生存曲線を示す図である。３回の独立した実験からプールした処置群当たり１０匹のマウスを示し、ｍｓは生存期間中央値である。ここで示した、処置した実験群と未処置の対照群との間の統計分析はＬｏｇ－ｒａｎｋ検定を使用して行い、Ｐ＜０．０５を有意とみなした。

【図2I】腫瘍特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の全身注入は、わずかな治療効果しか生じないことを示す図である。ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法後のＫＰＣ腫瘍細胞上のＲａｅ－１抗原発現のフローサイトメトリー定量の図である。１，８００個のランダムに選択した細胞を示す。

【図3A】膵臓腫瘍上に直接配置されたバイオマトリックスは、ＣＡＲプログラムされたＴ細胞のための有効な送達プラットフォームとして機能することができることを示す図である。足場に組み込まれた刺激性ミクロスフェアの明視野顕微鏡検査の図である。下側は微粒子組成の図である。スケールバー、７０μｍ。

【図3B】膵臓腫瘍上に直接配置されたバイオマトリックスは、ＣＡＲプログラムされたＴ細胞のための有効な送達プラットフォームとして機能することができることを示す図である。このシリーズは、開示されている方法を例示している図である：［１］足場；［２］腫瘍反応性Ｔ細胞の装置への播種；［３］切開；［４］同所性ＫＰＣ膵臓腫瘍；［５］～［７］Ｔ細胞負荷装置の移植；［８］創傷閉鎖；［９］腫瘍反応性Ｔ細胞の持続放出を示す図である。

【図4A】ポリマーが放たれた（ｐｏｌｙｍｅｒ－ｌａｕｎｃｈｅｄ）ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍部位で強力に増殖し、腫瘍退縮を誘発するが、標的抗原を欠く細胞には影響を及ぼさないことを示す図である。ＫＰＣ腫瘍及び養子導入ＣＡＲ－Ｔ細胞の生物発光イメージングの図である。マウスを、腫瘍に局所的に注射した１０^７個のＮＫＧ２Ｄ形質導入リンパ球により処置した又は腫瘍表面上に直接移植した生物活性足場に含まれた１０^７個のＮＫＧ２Ｄ形質導入リンパ球により処置した。各コホート（ｎ＝１０）からの５匹の代表的なマウスを示す。

【図4B】ポリマーが放たれたＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍部位で強力に増殖し、腫瘍退縮を誘発するが、標的抗原を欠く細胞には影響を及ぼさないことを示す図である。細胞導入後２日毎に捕捉した連続生物発光画像からのＴ細胞シグナル強度の図である。各線は１匹の動物を表し、各点は動物全体の光子計数を示す。示した時点において、処置群間の光子計数のペアワイズ差を、ウィルコクソンの順位和検定により分析した。

【図4C】ポリマーが放たれたＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍部位で強力に増殖し、腫瘍退縮を誘発するが、標的抗原を欠く細胞には影響を及ぼさないことを示す図である。定量化したＫＰＣ生物発光腫瘍シグナルの図である。

【図4D】ポリマーが放たれたＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍部位で強力に増殖し、腫瘍退縮を誘発するが、標的抗原を欠く細胞には影響を及ぼさないことを示す図である。処置マウス及び対照マウスについてのカプラン－マイヤー生存曲線を示す図である。３回の独立した実験からプールした処置群当たり１０匹のマウスを示し、ｍｓは生存期間中央値である。ここで示した、処置した実験群と未処置の対照群との間の統計分析はＬｏｇ－ｒａｎｋ検定を使用して行い、Ｐ＜０．０５を有意とみなした。

【図4E】ポリマーが放たれたＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍部位で強力に増殖し、腫瘍退縮を誘発するが、標的抗原を欠く細胞には影響を及ぼさないことを示す図である。ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法後のＫＰＣ腫瘍細胞上のＲａｅ－１抗原発現のフローサイトメトリー定量の図である。１，８００個のランダムに選択した細胞を示す。

【図5A】不均一ながん細胞を同時に除去し、全身性抗腫瘍免疫を確立するためにＣＡＲ発現Ｔ細胞及び免疫刺激剤（この例ではワクチンアジュバントとして示される）を同時送達する生体材料担体の設計を示す図である。腫瘍床と相互作用するＣＡＲ－Ｔ細胞を負荷した足場の概略図である：パネル１及び２は、装置に組み込まれた因子含有ミクロスフェアが、どのようにＣＡＲ発現Ｔ細胞の増殖を刺激し、周囲組織へのこれらの放出を促進するかを示す。ＡＰＣ、抗原提示細胞。パネル２及び３は、腫瘍細胞を認識し、溶解し、それによって抗原エスケープバリアントに対して防御する宿主免疫細胞をプライミングする、Ｔ細胞負荷足場からのワクチンアジュバントの放出を例示する。

【図5B】不均一ながん細胞を同時に除去し、全身性抗腫瘍免疫を確立するためにＣＡＲ発現Ｔ細胞及び免疫刺激剤（この例ではワクチンアジュバントとして示される）を同時送達する生体材料担体の設計を示す図である。ポリマーコアに捕捉されたＳＴＩＮＧアゴニストサイクリックジＧＭＰ（すなわち、交換可能に使用されるｃ－ｄｉＧＭＰ又はｃｄＧＭＰ）及びこのリン脂質膜につながれた刺激性抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７抗体を用いて微粒子により機能化した多孔質アルギネートマトリックスの巨視的図及び微視的図である。ｃ－ｄｉＧＭＰの化学構造を下側に示す。

【図6A】足場により放出されたＣＡＲ－Ｔ細胞及びＳＴＩＮＧアゴニストは、宿主抗原提示細胞を活性化するために相乗作用することを示す図である。ルシフェラーゼ発現ＫＰＣ腫瘍細胞をマウスの膵臓に移植してから１０日後、７×１０^６個の腫瘍反応性ＣＡＲ－Ｔ細胞、６μｇのｃ－ｄｉＧＭＰ又は両方の組合せのいずれかを含有する足場を腫瘍表面上に移植した；対照マウスは処置を受けなかった。５日後、膵周囲リンパ節を、フローサイトメトリーによる分析のために細胞懸濁液中で消化した。腫瘍に取り込まれていないリンパ節のみを使用し、これらを少なくとも５匹の動物からプールした。（図６Ａ）骨髄成熟マーカー（ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃ）のフローサイトメトリーの図である：右側に示されるヒストグラムは、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋二重陽性細胞集団に対してゲーティングした後の共刺激因子ＣＤ８６及びＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を示す。

【図6B】足場により放出されたＣＡＲ－Ｔ細胞及びＳＴＩＮＧアゴニストは、宿主抗原提示細胞を活性化するために相乗作用することを示す図である。ルシフェラーゼ発現ＫＰＣ腫瘍細胞をマウスの膵臓に移植してから１０日後、７×１０^６個の腫瘍反応性ＣＡＲ－Ｔ細胞、６μｇのｃ－ｄｉＧＭＰ又は両方の組合せのいずれかを含有する足場を腫瘍表面上に移植した；対照マウスは処置を受けなかった。５日後、膵周囲リンパ節を、フローサイトメトリーによる分析のために細胞懸濁液中で消化した。腫瘍に取り込まれていないリンパ節のみを使用し、これらを少なくとも５匹の動物からプールした。（図６Ｂ）膵周囲リンパ節における成熟及び活性化（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８６＋ＭＨＣ－ＩＩ＋）樹状細胞の絶対数の図である。点は５匹のマウスからプールした試料におけるリンパ節当たりの細胞数を表し、データは４つの別々の研究を表す。

【図7A】足場からのＣＡＲ発現Ｔ細胞と一緒のｃ－ｄｉＧＭＰの同時放出は、内因性腫瘍反応性リンパ球をプライミングすることを示す図である。糖タンパク質３３を発現するＫＰＣ腫瘍をマウスに移植した。これらのマウスを、生体材料により送達されるｃ－ｄｉＧＭＰ、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はこの２つの組合せにより処置し、末梢血中の宿主ｇｐ３３特異的Ｔ細胞を四量体染色によって定量した。内因性Ｔ細胞を養子導入Ｔ細胞から区別するために、コンジェニックＣＤ４５．１受容マウスをこれらの研究のために使用した。（図７Ａ）ＣＤ４５．１＋（宿主）ＣＤ８＋細胞に対してゲーティングした、足場移植から１０日後の末梢血中のｇｐ３３四量体陽性細胞のパーセンテージを示す代表的なフローサイトメトリープロットの図である。示したプロファイルは３回の独立した実験の代表である。

【図7B】足場からのＣＡＲ発現Ｔ細胞と一緒のｃ－ｄｉＧＭＰの同時放出は、内因性腫瘍反応性リンパ球をプライミングすることを示す図である。糖タンパク質３３を発現するＫＰＣ腫瘍をマウスに移植した。これらのマウスを、生体材料により送達されるｃ－ｄｉＧＭＰ、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はこの２つの組合せにより処置し、末梢血中の宿主ｇｐ３３特異的Ｔ細胞を四量体染色によって定量した。内因性Ｔ細胞を養子導入Ｔ細胞から区別するために、コンジェニックＣＤ４５．１受容マウスをこれらの研究のために使用した。（図７Ｂ）プライミングされた（ＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋ｇｐ３３＋）Ｔ細胞の絶対数の図である。３回の独立した実験からプールした１０匹のマウスを示す。各バーは平均絶対細胞計数±ｓ．ｅ．ｍを表す。対応のないスチューデントのｔ検定を使用して、絶対細胞計数間の差を検定した。

【図8A】ＣＡＲ発現Ｔ細胞と一緒にＳＴＩＮＧアゴニストを同時送達する足場は、腫瘍免疫エスケープを制限することができることを示す図である。ＫＰＣ－ｌｕｃ腫瘍の連続インビボ生物発光イメージングの図である。各コホート（ｎ＝１０）からの５匹の代表的なマウスを示す。

【図8B】ＣＡＲ発現Ｔ細胞と一緒にＳＴＩＮＧアゴニストを同時送達する足場は、腫瘍免疫エスケープを制限することができることを示す図である。定量化したＫＰＣ生物発光腫瘍シグナルの図である；３回の独立した実験からプールした処置群当たり１０匹のマウスを示す。

【図8C】ＣＡＲ発現Ｔ細胞と一緒にＳＴＩＮＧアゴニストを同時送達する足場は、腫瘍免疫エスケープを制限することができることを示す図である。処置マウス及び対照マウスについてのカプラン－マイヤー生存曲線である。ｍｓ、生存期間中央値。ここで示した、処置した実験群と未処置の対照群との間の統計分析はＬｏｇ－ｒａｎｋ検定を使用して行い、Ｐ＜０．０５を有意とみなした。

【図9A】足場は、全体的な抗腫瘍免疫を誘発できることを示す図である。図８Ａ～８Ｃに関連して記載されているように完全な腫瘍退縮を経験した４匹のマウスに静脈内注射したＫＰＣ－ｌｕｃ腫瘍細胞の連続インビボ生物発光イメージングの図である。年齢を一致させたナイーブマウスを対照として使用した。

【図9B】足場は、全体的な抗腫瘍免疫を誘発できることを示す図である。カプラン－マイヤー生存曲線である。

【図10A】細胞足場（例えば、薄膜ニチノール（ＴＦＮ）マイクロメッシュ）との部分の共有結合によってリンパ球活性化部分（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７抗体）により機能化された足場を示す概略図である。

【図10B】細胞足場（例えば、ＴＦＮマイクロメッシュ）と共有結合した又は細胞足場（例えば、ＴＦＮマイクロメッシュ）上にコーティングされたリンパ球接着部分（例えば、フィブリン、コラーゲン）との部分の共有結合によってリンパ球活性化部分（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７抗体）により機能化された細胞足場を示す概略図である。

【図10C】多層薄膜マイクロメッシュ（例えば、ＴＦＮマイクロメッシュ）により形成され、超高密度の腫瘍反応性免疫細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）が埋め込まれた三次元インプラントを示す概略図である。

【図10D】機能化されたマイクロパターン化金属薄膜（例えば、ＴＦＮマイクロメッシュ）は、超高細胞密度を達成する図である。

【図11A】適切なリンパ球接着部分及び刺激の合図により機能化されたＴＦＮマイクロメッシュは、Ｔ細胞の迅速な移動及び強力な増殖を支持することを示す図である。ＴＦＮマイクロメッシュの写真である。スケールバー：２ｍｍ。

【図11B】適切なリンパ球接着部分及び刺激合図により機能化されたＴＦＮマイクロメッシュは、Ｔ細胞の迅速な移動及び強力な増殖を支持することを示す図である。コーティングされていない（左パネル）及びフィブリンコーティングされた（右パネル）ＴＦＮマイクロメッシュの光学顕微鏡画像である。倍率：４０倍。スケールバー：１２０μｍ。

【図11C】適切なリンパ球接着部分及び刺激合図により機能化されたＴＦＮマイクロメッシュは、Ｔ細胞の迅速な移動及び強力な増殖を支持することを示す図である。コーティングされていない（左パネル）及びフィブリンコーティングされた（右パネル）ＴＦＮマイクロメッシュの電子顕微鏡画像である。

【図11D】適切なリンパ球接着部分及び刺激合図により機能化されたＴＦＮマイクロメッシュは、Ｔ細胞の迅速な移動及び強力な増殖を支持する。倍率：２７０×１，１００倍の拡大されたバージョンはパネル（図１１Ｄ）に示される。

【図11E】適切なリンパ球接着部分及び刺激合図により機能化されたＴＦＮマイクロメッシュは、Ｔ細胞の迅速な移動及び強力な増殖を支持することを示す図である。３０分間追跡した、コーティングされていない（左）及びフィブリンコーティングされた（右）ＴＦＮマイクロメッシュを通るリンパ球の移動の低速度ビデオ投影の図であり、各陰影の色は個々のＴ細胞を表す。スケールバー：５０μｍ。２回の独立した実験からランダムに選択した３０個の細胞に基づく、平均速度及び平均Ｔ細胞変位の比較を下側に示す。

【図11F】適切なリンパ球接着部分及び刺激合図により機能化されたＴＦＮマイクロメッシュは、Ｔ細胞の迅速な移動及び強力な増殖を支持することを示す図である。フィブリンコーティングされたＴＦＮマイクロメッシュにおいて捕捉されたヒトＴ細胞（Ａｌｅｘａ ４８８標識化：緑色）の高倍率共焦点画像である。スケールバー：１００μｍ。挿入図は拡大を示す。スケールバー：５０μｍ。

【図11G】適切なリンパ球接着部分及び刺激合図により機能化されたＴＦＮマイクロメッシュは、Ｔ細胞の迅速な移動及び強力な増殖を支持することを示す図である。Ｔ細胞接着リガンド（フィブリン）及び刺激リガンド（ＥＤＣ化学によってフィブリンと共有結合した抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７抗体）により機能化したＴＦＮマイクロメッシュの概略図である。

【図11H】適切なリンパ球接着部分及び刺激合図により機能化されたＴＦＮマイクロメッシュは、Ｔ細胞の迅速な移動及び強力な増殖を支持することを示す図である。７日の試験期間の間にＴＦＮマイクロメッシュから出たＴ細胞の代表的なカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）アッセイの図であり、ここで、増殖は、フローサイトメトリーを使用してＣＦＳＥ希釈（細胞分裂による結果）を測定することによって評価された。リンパ球集団についての平均ＣＦＳＥ蛍光強度（ＭＦＩ）は左上に示される。

【図12A】生物活性ＴＦＮマイクロメッシュからのＴ細胞の持続放出を示す図である。抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７抗体機能化フィブリン及び腫瘍反応性ＣＡＲ Ｔ細胞により機能化された単層ＴＦＮマイクロメッシュ（図１２Ａ）の概略図である。

【図12B】生物活性ＴＦＮマイクロメッシュからのＴ細胞の持続放出を示す図である。抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ１３７抗体機能化フィブリン及び腫瘍反応性ＣＡＲ Ｔ細胞により機能化されたステント（図１２Ｂ）の概略図である。

【図12C】生物活性ＴＦＮマイクロメッシュからのＴ細胞の持続放出を示す図である。マイクロメッシュフィルムの顕微鏡写真である。

【図12D】生物活性ＴＦＮマイクロメッシュからのＴ細胞の持続放出を示す図である。ステントの顕微鏡写真である。

【図12E】生物活性ＴＦＮマイクロメッシュからのＴ細胞の持続放出を示す図である。ＴＦＮマイクロメッシュからのリンパ球の放出は、これらを１０ｎｇ／ｍＬの炎症性サイトカインＩＰ－１０を含有する三次元コラーゲンゲル（ＰｕｒｅＣｏｌ）と当接させ、完全ＲＰＭＩ培地中で培養することによって測定された。０日目又は２日目に埋め込まれたＣＡＲ Ｔ細胞を含有するＴＦＮマイクロメッシュ（図１２Ｅ）の顕微鏡検査の図である。

【図12F】生物活性ＴＦＮマイクロメッシュからのＴ細胞の持続放出を示す図である。ＴＦＮマイクロメッシュからのリンパ球の放出は、これらを１０ｎｇ／ｍＬの炎症性サイトカインＩＰ－１０を含有する三次元コラーゲンゲル（ＰｕｒｅＣｏｌ）と当接させ、完全ＲＰＭＩ培地中で培養することによって測定された。０日目又は２日目に埋め込まれたＣＡＲ Ｔ細胞を含有するステント（図１２Ｆ）の顕微鏡検査の図である。

【図12G】生物活性ＴＦＮマイクロメッシュからのＴ細胞の持続放出を示す図である。これらのＴＦＮマイクロメッシュ（図１２Ｇ）から周囲のコラーゲンマトリックスに移行した生存Ｔ細胞の絶対計数のグラフである。各線は、１つのＴＦＮマイクロメッシュを表す。データは３回の独立した実験の代表である。

【図12H】生物活性ＴＦＮマイクロメッシュからのＴ細胞の持続放出を示す図である。これらのステント（図１２Ｈ）から周囲のコラーゲンマトリックスに移行した生存Ｔ細胞の絶対計数のグラフである。各線は、１つのＴＦＮマイクロメッシュを表す。データは３回の独立した実験の代表である。

【図12I】生物活性ＴＦＮマイクロメッシュからのＴ細胞の持続放出を示す図である。リンパ球が、６日後にＴＦＮマイクロメッシュ上で高い持続性を実証している図である。ＴＦＮマイクロメッシュにはＣＡＲ－Ｔ細胞が負荷され、６日間、組織模倣物に対して配置された。６日後、超高細胞密度が依然として膜上に存在し、良好なリンパ球持続性が腫瘍部位において得られ得ることを示した。

【図13A】生物活性ＴＦＮマイクロメッシュから卵巣がん特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を開始すると、罹患している多病巣疾患が根絶されることを示す図である。１００万個のＯＶＣＡＲ－３ヒト卵巣がん細胞（腫瘍抗原チロシンキナーゼ様オーファン受容体ＲＯＲ１及びホタルルシフェラーゼを発現する）を、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスの横隔膜に外科的に移植し、８週間定着させた。この時点において、全ての動物は、卵巣がんを有するメスにおいて横隔膜への広がりを模倣する卵巣がん病変を発生した。マウスを、腫瘍病変に静脈内注射、局所注射したＲＯＲ－１に特異的な１０×１０^６個のヒトＣＡＲ Ｔ細胞により処置した又は移植したＴＦＮマイクロメッシュから送達された２×１０^６個の細胞により処置した。（図１３Ａ）アプローチの実施の図である：［１］横隔膜における定着した卵巣がん病変；Ｌｉ：肝臓。Ｄｉａｐｈ：横隔膜。Ｔｕ：腫瘍。［２］肝臓と横隔膜との間に抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を負荷したＴＦＮマイクロメッシュの移植。［３］移植後のＴＦＮマイクロメッシュ。

【図13B】生物活性ＴＦＮマイクロメッシュから卵巣がん特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を開始すると、罹患している多病巣疾患が根絶されることを示す図である。１００万個のＯＶＣＡＲ－３ヒト卵巣がん細胞（腫瘍抗原チロシンキナーゼ様オーファン受容体ＲＯＲ１及びホタルルシフェラーゼを発現する）を、ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスの横隔膜に外科的に移植し、８週間定着させた。この時点において、全ての動物は、卵巣がんを有するメスにおいて横隔膜への広がりを模倣する卵巣がん病変を発生した。マウスを、腫瘍病変に静脈内注射、局所注射したＲＯＲ－１に特異的な１０×１０^６個のヒトＣＡＲ Ｔ細胞により処置した又は移植したＴＦＮマイクロメッシュから送達された２×１０^６個の細胞により処置した。（図１３Ｂ）ＯＶＣＡＲ－３－ｌｕｃ腫瘍の連続インビボ生物発光イメージングの図である。

【図14】ＴＦＮマイクロメッシュリンパ球足場により処置したマウスについてのカプラン－マイヤー生存曲線である。

【図15】小分子（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又は免疫刺激剤）が、薬物溶出ポリマーを使用してリンパ球足場（例えば、ＴＦＮマイクロメッシュ足場）に組み込まれ得ることを示す図である。

【図16】ＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）接着モチーフのポリペプチド配列を示す図である。

【図17】例示的なＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチド（配列番号２）のポリペプチド配列を示す図である。

【図18】ＩＣＡＭ－１細胞接着分子のポリペプチド配列（配列番号３）を示す図である。

【図19】ＦＮ－ＩＩＩ_７～１０断片のポリペプチド配列（配列番号４）を示す図である。

【図20-1】キメラ抗原受容体（配列番号１４～２７）を操作するために使用され得る例示的な配列を示す図である。

【図20-2】キメラ抗原受容体（配列番号１４～２７）を操作するために使用され得る例示的な配列を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

がん免疫療法は、がんを治療するために患者の免疫系が使用される分野を指す。例えば、がん免疫療法は、がんの発生に対して患者を免疫化するためのワクチンの使用を含む。残念なことに、がんワクチンが誘発させることができる応答は、成熟するのに数ヶ月を要することがあり、通常、進行した疾患を抑制するには不十分である。

【0023】

また、がん細胞を攻撃するために患者自身のＴ細胞をより迅速に刺激する又は強力に刺激する試みもなされてきた。しかしながら、Ｔ細胞によって通常発現される受容体のレパートリーは一般に自己／腫瘍抗原に対して低い親和性を有するので、このアプローチは、がんに対する戦いにおいて十分な成功を達成していない。

【0024】

新たな免疫療法アプローチは、腫瘍における選択された巨大分子標的に対して高い親和性を有するように操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子を用いて患者由来のリンパ球（例えば、Ｔ細胞）を変化させることを含む。導入された遺伝子はまた、強力なＴ細胞増殖を誘発するための共刺激シグナルを産生することができる。この方法は、患者からＴ細胞を回収し、これらを、共刺激及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと融合した腫瘍特異的一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）から構成されるＣＡＲを発現するようにエキソビボで再指向することを含み、これにより、プログラムされた細胞が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に依存しない様式で腫瘍標的を溶解させることが可能となる。

【0025】

このようなＣＡＲプログラムされたＴ細胞を利用する療法は、臨床試験において血液学的悪性腫瘍を有する患者において一貫して陽性の結果を生じた。しかしながら、固形腫瘍に関しては、これらの療法の有効性は、１）腫瘍部位に対するリンパ球の非効率的なホーミング、及び２）免疫抑制性微小環境固形腫瘍が生じることによって制限されてきた。さらに、３）ＣＡＲプログラムされたＴ細胞は腫瘍抗原のみを認識し、この腫瘍抗原のために、これらはプログラムされている。しかしながら、固形腫瘍の表現型多様性は、ＣＡＲプログラムされたＴ細胞によって認識されないがん細胞が、プログラムされたＴ細胞を回避するエスケープバリアントを形成し得ることを意味する。したがって、Ｔ細胞の遺伝的再プログラミングは依然として有望な療法であるが、有意な改善が、固形腫瘍を治療するためのこれらの使用において必要とされる。

【0026】

ＵＳ２０１６／０００８３９９は、遺伝的に再プログラムされたリンパ球（例えば、Ｔ細胞）が固形腫瘍を治療する能力を大幅に改善する移植可能な足場を記載している。移植可能な足場は、遺伝的に再プログラムされたリンパ球、足場に関連する少なくとも１つのリンパ球接着部分、足場に関連する少なくとも１つのリンパ球活性化部分、及び任意選択的に免疫刺激剤を含む。

【0027】

ＵＳ２０１６／０００８３９９はまた、移植可能な足場が、腫瘍細胞に対する延長された第２の波の防御をどのように生じるかを記載している。特に、足場内に播種されたリンパ球は、移植後に足場から出て、例えば、切除後に残っている残存腫瘍細胞を破壊するために、腫瘍切除床全体にわたって高密度にて分散し、及び流入領域リンパ節内に高密度にて分散する。このステップは、死にかけている腫瘍細胞から大量の腫瘍抗原を組織内に放出する。腫瘍抗原は、続いて抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれる。免疫刺激剤を放出することによって、足場は、強力な宿主抗腫瘍免疫応答を開始するためにＡＰＣ及び腫瘍反応性免疫細胞を活性化することができる。抗腫瘍免疫のこの「第２の波」はより広く、残った腫瘍細胞を排除するために相乗的に作用する複数の細胞型を含む。

【0028】

ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ ＩＮｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｇｅｎｅｓ））経路アゴニストは、がん免疫療法における集中的な研究の焦点となっている有力な免疫刺激剤の一種である。しかしながら、以前に記載されているアジュバント化合物（例えば、Ｒ８４８及び関連するイミダゾキノリンＴＬＲ７／８アゴニスト、（ＮＯＤ）様受容体を誘発するムラミルジペプチド及びＲＩＧ－ＩのＲＮＡオリゴヌクレオチドリガンド）と同様に、定式化されていないＳＴＩＮＧアゴニストによる治療は全身性炎症毒性を伴い、このことは、がん患者を治療するためにこれらの化合物を使用することに関して大きな障害となる。したがって、臨床的に有効であるためには、高用量のＳＴＩＮＧアゴニストが、腫瘍病変に繰り返し直接注射されることが必要であり、このことは、この療法を、毎日の接種が可能である部位（例えば、皮膚悪性腫瘍）に制限する。

【0029】

本開示は、（ｉ）遺伝的に再プログラムされたリンパ球、及び（ｉｉ）少なくとも１つのリンパ球活性化部分が播種された移植可能な足場を提供することによって、がん免疫療法を進化させ続ける。この足場は、１）足場が固形腫瘍の部位に移植され得るので、腫瘍に対するリンパ球の非効率的なホーミングを克服し、免疫抑制性腫瘍微小環境は、Ｔ細胞増殖及び腫瘍細胞殺傷を促進する足場にリンパ球刺激抗体を含めることによって対処され、３）このような足場にＳＴＩＮＧアゴニストを含めることは、全身性炎症毒性を伴わず、毎日の注射を必要としない、これらの有効な免疫賦活効果を利用する機構を提供するので、固形腫瘍において細胞療法を用いて上述した３つの問題を克服する。

【0030】

開示されている移植可能な足場により観察された抗がん作用のロバスト性は、相乗的であり、予想外であり、注目すべきであった。試験された全ての対象のほぼ半分において、固形腫瘍の完全な根絶が達成された。したがって、遺伝的に再プログラムされたリンパ球によって認識された腫瘍細胞並びに通常、エスケープバリアントになっていた腫瘍細胞は効果的に治療された。さらに、固形腫瘍の完全な根絶後、対象はがん細胞により再チャレンジされた。再チャレンジされた対象の１００％は測定可能な腫瘍を全く発生せず、自己ワクチン部位の有効性が実証された。したがって、本明細書に開示される移植可能な足場は、固形腫瘍がんに対する進行中の戦いにおいて有意な進化を提供する。

【0031】

特定の実施形態では、本明細書に開示される移植可能な足場はまた、ＵＳ２０１６／０００８３９９に記載されているものよりも形態が単純であり得、製造するのが容易であり得る。本明細書に開示される移植可能な足場はまた、ＳＴＩＮＧアゴニストを含んでもよい。

【0032】

明確にするために、本開示において、不均一な固形腫瘍は、遺伝的に再プログラムされたリンパ球（例えば、遺伝的に再プログラムされたＣＡＲ－Ｔ細胞）によって標的化された抗原を発現する腫瘍細胞及び標的化された抗原を発現しない腫瘍細胞を含むものである。標的化された抗原を発現するこれらの腫瘍細胞は、標的化された固形腫瘍細胞である。標的化された抗原を発現しない腫瘍細胞は、エスケープバリアントである。

【0033】

ここで、開示された移植可能な足場の様々な構成要素を、より詳細に記載する。

【0034】

移植可能な足場マトリックス材料。本明細書に開示される移植可能な足場の構造は、種々の材料から構成され得る。

【0035】

特定の実施形態では、足場マトリックス材料は、マイクロパターン化金属薄膜を含む。マイクロパターン化金属薄膜は、少なくとも１種の金属材料から形成され、これらの構造において反復パターンを含み、１００μｍ又はこれ未満の厚さを有する。マイクロパターン化金属薄膜のために使用され得る例示的な金属には、ＥＬＧＩＬＯＹ（登録商標）（Ｅｌｇｉｌｏｙ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｔａｌｓ、Ｅｌｇｉｎ、ＩＬ）、ステンレス鋼及びニチノールが含まれる。特定の実施形態では、薄膜ニチノール（ＴＦＮ）マイクロメッシュが足場マトリックス材料として使用される（例えば、Ｒｉｇｂｅｒｇら、Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ．２００９年８月；５０（２）：３７５～８０頁）。ニチノールとは、５０％～６０％のニッケル及び４０％～５０％のチタンを含むニッケル及びチタンの合金のファミリーを指す。ニチノール合金において２％までのニッケルがコバルトと置き換えられてもよい。ＴＦＮマイクロメッシュは、スパッタ堆積プロセスを介してマイクロパターン化シリコンウェハ上に生成されるバルク材料の変形である。ＴＦＮマイクロメッシュの特定の利点は、これがフォトリソグラフィー技術に基づいているので、ＴＦＮマイクロメッシュ細孔のサイズ及び形状に対して精巧な制御を与えることができることである。ＴＦＮマイクロメッシュとは、薄いシート又は膜（例えば、１００μｍ、１０μｍ、１μｍ又は０．１μｍの厚さ）の形状のニチノールを指すことができる。単層ＴＦＮマイクロメッシュの細胞カーゴ容量を高めるために、ＴＦＮ層及び細胞層が交互になっているサンドイッチ状の層ごとの薄膜が、（図１０Ｃに例示されているように）三次元構造に製造され得る。

【0036】

特定の実施形態では、足場マトリックス材料は生体適合性ポリマーを含む。例示的な生体適合性ポリマーには、単独で又は任意の他のポリマー組成物と組み合わせて、任意の濃度及び任意の比率において、寒天、アガロース、アルギネート、アルギネート／リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（β－ＧＡＬ）、（１，２，３，４，６－ペンタアセチルａ－Ｄ－ガラクトース）、セルロース、キチン、キトサン（例えば、多孔質キトサン足場を記載している、Ｌｅｖｅｎｇｏｏｄら、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ、２０１４年、２、３１６１～３１８４頁を参照のこと。）、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシ－ヘキサノエート）（ＰＨＢＨＨｘ）、ポリ（ラクチド）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、乳酸－グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ；例えば、多孔質ＰＬＧＡ足場を記載している、Ｏｍａｒら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２００９年１１月２５日；１（８）：８ｒａ１９を参照のこと。）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、絹、ダイズタンパク質及びダイズタンパク質分離物が含まれる。様々なグレードを使用して異なる比率において異なるポリマー種を混合することにより、寄与するポリマーの各々から取り入れられる特性がもたらされ得る。様々な末端基の化学的性質もまた、採用されてもよい。

【0037】

注射可能な移植可能な足場が使用される場合、足場マトリックス（例えば、ポリマー）は、移植後の変化した環境条件に応答することができる。これらの特性を有するポリマーは当業者に公知である。例えば、特定の実施形態では、注射可能なその場のゲル形成系が使用される。特定の実施形態では、ポリマー製剤は、温度変化（熱ゲル化）に応答して、ｐＨ変化に応答して又は光に応答してインビボでゲル化することができる。例えば、紫外線（ＵＶ）光に応答してゲル化するポリマーが使用されてもよい。特定の実施形態では、ポリマー製剤は、イオン架橋に応答してインビボでゲル化することができる。特定の実施形態では、ポリマー製剤は、溶媒交換に応答してインビボでゲル化することができる。特定の実施形態では、使用されるゲルは、熱可逆性、ｐＨ可逆性又は光可逆性である。特定の実施形態では、使用されるゲルは、高粘度及びずり減粘である。さらなるゲル化の実施形態では、ゲルは、任意の適切なポリマーから形成されたゲルであってもよい。メソ多孔質シリカロッドから作製された注射可能な自発的に集合する足場は、Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３、６４～７２頁（２０１５年）に記載されている。

【0038】

自己集合ペプチド足場はまた、足場マトリックス材料として使用されてもよい。（例えば、Ｚａｃｃｏら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１５年７月１３日；１６（７）：２１８８～９７頁を参照のこと。）。

【0039】

特定の実施形態では、アルギネートは、別々に又は１種以上の他の材料と組み合わせてのいずれかで、足場マトリックス材料として使用される。アルギネートは、容易に加工され、水溶性であり、非免疫原性である。アルギネートは、容易にゲル化する遊離ヒドロキシル基を有する生分解性アニオン性多糖である。代替の実施形態では、ポリマーは、アルギネート及びキトサンの１：１溶液から形成される高分子電解質複合体混合物（ＰＥＣ）であってもよい。

【0040】

特定の実施形態では、構造（例えば、足場マトリックス材料）は、２：１：１（アルギネート：ＣａＣＯ_３：ＧＤＬ）の比において、０．５～５％のアルギネート、０．５～１５ｇ／Ｌの炭酸カルシウム及び１～５０ｇ／Ｌのグルコノ（ｇｌｕｃｏｎｏｎ）－デルタ－ラクトンのようなアルギネート／炭酸カルシウム／グルコノ－デルタ－ラクトン混合物から形成され得る。ポリマー構造はまた、種々の量のアルギネートと組み合わせて種々の量のゼラチンを含んでもよい。混合物中の材料及び材料比に応じて、構造は任意選択的に架橋されてもよい。Ｌｅｅら、Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．、２０１２年、２４（５）、８８１～８９１頁に記載されているもののようなコラーゲン／アルギネートハイブリッド足場もまた、使用されてもよい。

【0041】

特定の実施形態では、酸性溶液に溶解した種々の量のポリマーを有するポリマー溶液が、本明細書に開示される構造を形成するために使用されてもよい。酸の濃度は、溶解したポリマーの量に応じて調節されてもよい。一態様では、酸性溶液は１％（ｖ／ｖ）酢酸である。特定の実施形態では、溶液中のポリマーの量は、０．５～５％（ｗ／ｖ）及びこれらの間の任意の全増分又は部分増分である。例えば、溶液中のポリマーの量（ｗ／ｖ）は、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％又は５％であってもよい。特定の実施形態では、溶液中のポリマーの量は、２．４％（ｗ／ｖ）である。他の様々な実施形態では、ポリマーは、水、酸、酢酸、カンフェン又はカンフェン－ナフタレンのうちの少なくとも１つに溶解される。

【0042】

ゼラチンが組み込まれる場合、酸の濃度は、溶解されるポリマー（特定の実施形態では、アルギネート）と組み合わせてゼラチンの量に応じて調節されてもよい。一態様では、酸性溶液は１％（ｖ／ｖ）酢酸である。特定の実施形態では、溶液中のゼラチンの量は、１～１０％（ｗ／ｖ）及びこれらの間の任意の全増分又は部分増分である。例えば、溶液中のアルギネートの量（ｗ／ｖ）は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％であってもよい。特定の実施形態では、溶液中のアルギネートの量は５．５％（ｗ／ｖ）である。特定の実施形態では、ポリマー溶液は、２．４％（ｗ／ｖ）のアルギネート溶液及び５．５％（ｗ／ｖ）のゼラチン溶液の組合せを含む。他の様々な実施形態では、種々の量のアルギネートと組み合わせたゼラチンは、水、酸、酢酸、カンフェン又はカンフェン－ナフタレンのうちの少なくとも１つに溶解される。

【0043】

特定の実施形態では、ポリマーベースの足場は以下のように形成され得る：ある重量／体積（ｗ／ｖ）のポリマーの脱イオン（ＤＩ）水中溶液が調製され得、あらゆる粒子を除去するために０．４５マイクロメートルのボトルフィルターにより濾過し、次いで－８０℃に凍結する。凍結した試料は、４．５リットルのベンチトップ凍結乾燥システム（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）において凍結乾燥され得る。濾過した凍結乾燥ポリマーは、水又は緩衝液を用いて様々な濃度（０．１％～５％）の溶液中で再構成され得る。

【0044】

架橋は、例えば、塩化カルシウム及び／又は炭酸カルシウムを用いて実施されてもよい。炭酸カルシウムは、遅い架橋剤であり、試料は完全に架橋するのに数時間かかる。反応速度を増加させるために、グルコノデルタラクトン（ＧＤＬ）が添加されてもよい。塩化カルシウムは、速い架橋剤であり、試料は数分で完全にゲル化する。一つの方法では、ポリマー溶液へのＣａＣｌ_２の添加が凍結の前に行われてもよい。他の方法は、最初の凍結前にポリマー溶液に添加された炭酸カルシウム＋ＧＤＬの５．５％（ｗ／ｖ）溶液の使用を含む。

【0045】

特定の実施形態では、ポリマー溶液は、スピードミキサーにおいて脱気され得、泡が形成することを防ぐために鋳型にゆっくり注がれ得る。ポリマー溶液を小さな型にピペットにより移す場合、気泡の形成は、マイクロピペットを型の溝の開放端に配置し、残留空気がフラッシュアウトされるまで管システム全体を繰り返しフラッシュすることによって回避され得る。

【0046】

凍結キャスティングが、本明細書に開示される足場を形成するために使用され得る。当業者に理解されるように、様々なポリマー溶液が様々なサイズの鋳型に凍結キャスティングされ得る。冷却速度は、細孔のサイズ及び整列並びに隆起の形成に影響を及ぼすので、制御されるべきである。特定の実施形態では、冷却速度は、０．１～１００℃／分（ｍ）の範囲及びこれらの間の任意の全増分又は部分増分であってもよい。特定の実施形態では、冷却速度は、１～１０℃／ｍの範囲及びこれらの間の任意の全増分又は部分増分であってもよい。例えば、冷却速度（℃／ｍ）は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０であってもよい。

【0047】

特定の実施形態では、アルギネート足場を調製する際に、アルギネート／炭酸カルシウム／グルコノ－デルタ－ラクトン混合物が、「プレゲル化」プロセスとして２：１：１（アルギネート：ＣａＣＯ_３：ＧＤＬ）の体積比において、０．５～５ｗｔ％のアルギネート、０．５～１５ｇ／Ｌの炭酸カルシウム及び１～５０ｇ／Ｌのグルコノ－デルタ－ラクトンの範囲の濃度で撹拌することによって調製され得る。特定の実施形態では、得られた混合物は、固体になるまで一定の冷却速度（０．１°／分～１０°／分）にて凍結キャスティング（一方向的凍結）されてもよく、乾燥するまで凍結乾燥されてもよい。乾燥した足場は、０．１～２．５ｗｔ％の塩化カルシウム中で５～３０分間架橋されてもよく、足場の任意のさらなる使用の前に、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中で洗浄されてもよい。

【0048】

特定の実施形態では、アルギネート－キトサン足場を調製する際に、アルギネート－キトサン高分子電解質複合体（ＰＥＣ）混合物が、アルギネート（水中で調製した）及びキトサン（１％酢酸中で調製した）の１：１～１：９溶液の範囲（両方の手段）並びに０．５％～５％の範囲の総ポリマー含有量において、氷上で超音波処理又は均質化することによって調製されてもよい。得られた混合物のｐＨは、ＮａＯＨにより最大で１０．０まで調整され得る。特定の実施形態では、アルギネート－キトサンＰＥＣ混合物は、固体になるまで一定の冷却速度（０．１°／分～１０°／分）にて凍結キャスティングされてもよく、乾燥するまで凍結乾燥されてもよい。乾燥した足場は、０．１～２．５％の塩化カルシウム中で５～３０分間架橋されてもよく、足場の任意のさらなる使用の前に、ＰＢＳ中で洗浄されてもよい。

【0049】

移植可能な足場はまた、３Ｄバイオプリンティングを使用して様々な材料から製造され得る（例えば、Ｓｉｎｇｈら、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ２０１６年、８（１）、１９；及びＡｎら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅ １、Ｉｓｓｕｅ ２、２０１５年６月、２６１～２６８頁を参照のこと。）。

【0050】

リンパ球活性化部分。本明細書に開示される移植可能な足場の特定の実施形態はまた、リンパ球活性化部分（ＬＡＭ）を含んでもよい。ＬＡＭは、リンパ球を活性化し、本明細書に開示される移植可能な足場に組み込まれ得る又は付着され得る任意の化合物を含む。リンパ球の活性化とは、検出可能な細胞増殖、サイトカイン産生又は腫瘍ターゲティング及び／若しくは殺傷のようなエフェクター機能を誘導するように十分に刺激されているリンパ球の状態を指す。リンパ球がＴ細胞である場合、活性化はまた、Ｔ細胞型に特有の細胞表面マーカーの発現を生じる。例示的なＬＡＭには、ＩＬ－１５、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４－１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３及びＣＤ８３リガンド若しくは抗体、ＣＤ１ｄ、α－ガラクトシルセラミドを予め負荷した組換えＣＤ１ｄ分子並びに／又は足場内に埋め込まれた特定のリンパ球型を選択的に増加させるために定義された腫瘍抗原若しくはペプチドを負荷した組換え主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子が含まれる。ＮＫ細胞についての例示的なＬＡＭには、ＩＬ－１５及びＣＤ１３７が含まれる。

【0051】

ＳＴＩＮＧアゴニスト。「ＳＴＩＮＧ」は、「インターフェロン遺伝子の刺激因子」の略語であり、これは、「小胞体インターフェロン刺激因子（ＥＲＩＳ）」、「ＩＲＦ３活性化のメディエーター（ＭＩＴＡ）」、「ＭＰＹＳ」又は「膜貫通タンパク質１７３（ＴＭ１７３）」としても知られている。ＳＴＩＮＧは膜貫通受容体タンパク質であり、ヒトにおいて遺伝子ＴＭＥＭ１７３によってコードされる。ＳＴＩＮＧの活性化は、ＩＲＦ３（インターフェロン調節因子３）経路を介したＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－ａ及びＩＦＮ－β）の産生を導き、並びにＮＦ－κＢ経路及び／又はＮＬＲＰ３インフラマソームを介した炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－ａ及びＩＬ－Ｉβ）の産生を導く。

【0052】

ヒト及びネズミＳＴＩＮＧは、侵入細菌又は古細菌によって放出される外因性（３’，３）サイクリックジヌクレオチド（ｃ－ｄｉＧＭＰ、ｃ－ｄｉＡＭＰ及びｃ－ＧＡＭＰ）の結合を介する及び外因性二本鎖ＤＮＡ（例えば、侵入細菌、ウイルス又は原生動物によって放出される）の存在下で酵素サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ；Ｃ６ｏｒｆｌ５０又はＭＢ２１Ｄ１としても知られている）によって産生される内因性サイクリックジヌクレオチドである、（２’，３’）サイクリックグアノシン一リン酸－アデノシン一リン酸（（２’，３’）ｃ－ＧＡＭＰ）の結合を介する、２つの手段により天然に活性化される。

【0053】

「ＳＴＩＮＧアゴニスト」という用語は、インビトロ又はインビボでＳＴＩＮＧ受容体を活性化する物質を指す。化合物は、（ｉ）ＳＴＩＮＧを含有するヒト又は動物細胞においてインビトロでＩ型インターフェロンを誘導する場合、及び（ｉｉ）ＳＴＩＮＧを含有しない又は機能的ＳＴＩＮＧを含有しないヒト又は動物細胞においてインビトロでＩ型インターフェロンを誘導しない場合、ＳＴＩＮＧアゴニストとみなされ得る。リガンドがＳＴＩＮＧアゴニストであるかどうかを確認するための典型的な試験は、野生型ヒト又は動物細胞株及びＳＴＩＮＧコード遺伝子が数塩基又はより長い欠失によって遺伝的に不活性化されている対応する細胞株（例えば、ホモ接合性ＳＴＩＮＧノックアウト細胞株）においてリガンドをインキュベートすることである。ＳＴＩＮＧのアゴニストは、野生型細胞においてＩ型インターフェロンを誘導するが、ＳＴＩＮＧが不活性化される細胞においてＩ型インターフェロンを誘導しない。

【0054】

特定の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、２つのヌクレオチド間に１つ若しくは２つのホスホジエステル結合及び／又は１つ若しくは２つのホスホロチオエートジエステル結合を有する環状分子を含む。これには、（３’，５’）－（３’，５’）ヌクレオチド結合（（３’、３’）と省略される）；（３’，５’）－（２’，５’）ヌクレオチド結合（（３’，２’）と省略される）；（２’，５’）－（３’，５’）ヌクレオチド結合（（２’，３’）と省略される）、及び（２’，５’）－（２’，５’）ヌクレオチド結合（２’，２’）と省略される）が含まれる。「ヌクレオチド」とは、糖部分の５’、３’又は２’位においてリン酸基に連結した任意のヌクレオシドを指す。

【0055】

特定の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは以下の式の化合物を含む：

【0056】

【化1】

【0057】

特定の実施形態では、Ｒ１及びＲ２は独立して、以下に示されるように、９－プリン、９－アデニン、９－グアニン、９－ヒポキサンチン、９－キサンチン、９－尿酸又は９－イソグアニンであってもよい：

【0058】

【化2】

【0059】

特定の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストには、ジチオ－（Ｒ_Ｐ，Ｒ_Ｐ）－［サイクリック［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］］（２’－５’，３’－５’混合型ホスホジエステル結合（ＭＬ）ＲＲ－Ｓ２ ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ又はＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡとしても知られている）、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２－ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ（ＭＬ－ＣＤＧ）、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ｃＧＡＭＰ又はこれらの任意の混合物が含まれ得る。

【0060】

ｃ－ｄｉＧＭＰの構造は図５Ｂに示される。ｃ－ｄｉＡＭＰの構造には、以下が含まれる：

【0061】

【化3】

【0062】

ｃ－ＧＡＭＰの構造には、以下が含まれる：

【0063】

【化4】

【0064】

ＳＴＩＮＧアゴニストのさらなる特定の例には、以下が含まれる：

【0065】

【表1】

【0066】

また、ＳＴＩＮＧアゴニストの例には、ＤＭＸＡＡが含まれる：

【0067】

【化5】

【0068】

ＳＴＩＮＧアゴニストのさらなる例は、ＷＯ２０１６／１４５１０２に記載されている。

【0069】

さらなる免疫刺激剤及びリンパ球接着部分の任意選択的な使用は次に記載されている。

【0070】

さらなる免疫刺激剤。特定の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストに加えて免疫刺激剤が含まれてもよい。特定の実施形態では、免疫刺激剤は、サイトカイン、抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ及び／又はワクチンアジュバントである。

【0071】

例示的なサイトカインには、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＴＮＦα、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ又はＧＭ－ＣＳＦが含まれる。特定の実施形態では、免疫刺激剤は、サイトカイン及び／又はＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β若しくはＩＦＮ－γと組み合わせたＩＬ－２、ＩＬ－１２若しくはＩＬ－１５のようなサイトカインの組合せ又はＧＭ－ＣＳＦ又はこれらの任意の有効な組合せ又はサイトカインの任意の他の有効な組合せであってもよい。上記に特定したサイトカインはＴ_Ｈ１応答を刺激するが、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１又はこれらの任意の有効な組合せのような、Ｔ_Ｈ２応答を刺激するサイトカインもまた、使用されてもよい。また、Ｔ_Ｈ１応答を刺激するサイトカインと、Ｔ_Ｈ２応答を刺激するサイトカインとの組合せが使用されてもよい。

【0072】

例示的な抗体には、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＴＩＭ３、アゴニスト抗ＣＤ４０、アゴニスト抗４－１ＢＢ及び／又は二重特異性抗体（例えば、ＢＩＴＥ抗体：抗ＣＤ３／抗腫瘍抗原）が含まれる。例示的な小分子薬物には、ＴＧＦ－ベータ阻害剤、ＳＨＰ阻害剤、ＳＴＡＴ－３阻害剤及び／又はＳＴＡＴ－５阻害剤が含まれる。免疫抑制シグナル又は発がん経路（ｋｒａｓのような）を下方制御することができる任意のｓｉＲＮＡが使用されてもよく、一方で、免疫刺激タンパク質をコードする任意のプラスミドＤＮＡ（ミニサークルＤＮＡのような）が使用されてもよい。例示的なワクチンアジュバントには、任意の種類のＴｏｌｌ様受容体リガンド又はこれらの組合せ（例えば、ＣｐＧ、Ｃｐｇ－２８（ＴＬＲ９アゴニスト）、ポリリボイノシン酸－ポリリボシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））、α－ガラクトセラミド、ＭＰＬＡ、モトリモド（ＶＴＸ－２３３７、ＶｅｎｔｉＲｘによって開発された新規ＴＬＲ８アゴニスト）、ＩＭＯ－２０５５（ＥＭＤ１２０１０８１）、ＴＭＸ－１０１（イミキモド）、ＭＧＮ１７０３（ＴＬＲ９アゴニスト）、Ｇ１００（ＴＬＲ４アゴニストグルコピラノシルリピドＡの安定化したエマルション）、エントリモド（ＣＢＬＢ５０２としても知られているサルモネラフラジェリンの誘導体）、ヒルトノール（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ）（ＴＬＲ３アゴニスト）及びイミキモド）及び／又は１７－ＤＭＡＧ（１７－ジメチルアミノエチルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン）のような熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）の阻害剤が含まれる。

【0073】

以前の段落に記載した分子に由来する免疫刺激剤もまた、使用されてもよい。例えば、ＲＬＩは、ＩＬ－１５単独よりも５０倍高い効力を示すＩＬ－１５－ＩＬ－１５受容体－α融合タンパク質である。ＩＬ－１５は、複数の点において抗腫瘍免疫応答に影響を及ぼす。これは、単球を刺激性抗原提示細胞に分化させることができ、腫瘍反応性Ｔ細胞のエフェクター機能及び増殖を促進することができ、ＮＫ細胞を動員し、活性化することができる。

【0074】

リンパ球接着部分。開示されている足場は、移植された足場からのリンパ球の移動を促進するためにリンパ球接着部分を含んでもよい。リンパ球接着部分は、細胞外マトリックス（コラーゲンのような）を模倣する細胞接着ポリペプチドのような細胞接着部分を含む。本明細書に使用される場合、「細胞接着ポリペプチド」とは、インテグリンのような細胞表面分子を介して結合することができる分子当たり少なくとも２つのアミノ酸を有する化合物を指す。細胞接着ポリペプチドは、Ｂｏａｔｅｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．－ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏ．２８８：３０～３８頁（２００５年）に記載されているように、フィブリン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エラスチン、フィブリノーゲン、Ｉ型、ＩＩ型及びＶ型コラーゲンを含む、細胞接着において役割を果たすことが知られている細胞外マトリックスのタンパク質のいずれかであってもよい。さらに、細胞接着ポリペプチドは、結合ドメインを含有する断片又は配列を含む、これらのタンパク質のいずれかに由来する任意のペプチドであってもよい。細胞接着ポリペプチドには、ＩＣＡＭ－１モチーフのようなインテグリン結合モチーフを有するもの及び機能的等価物である関連ペプチドが含まれる。細胞接着ポリペプチドはまた、米国特許出願公開第２００６００６７９０９に記載されているペプチドのいずれかであってもよい。

【0075】

特定の実施形態では、構造は、α_１β_１インテグリンについてのリガンド、α_２β_１インテグリンについてのリガンド、α４β_１インテグリンについてのリガンド、α_５β_１インテグリンについてのリガンド、リンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ－１）についてのリガンド又はこれらの組合せのようなリンパ球接着部分を有する化合物を含む。特定の実施形態では、リガンドは１つのインテグリンと特異的に相互作用する。特定の実施形態では、リガンドは、完全なフィブロネクチン分子ではない又は完全なコラーゲン分子ではない。

【0076】

リンパ球接着部分は、ペプチド、抗体又は小有機分子であってもよい。小有機分子とは、５００ダルトン又はこれ未満の分子量を有する炭素系分子を指す。抗体又はこのインテグリン結合断片は、一本鎖、ヒト化又はキメラであってもよい。特定の実施形態では、リンパ球接着部分は、コラーゲン模倣ペプチド、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＧＦＰ^＊ＧＥＲ（配列番号１）由来のＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）接着モチーフを含有する安定な三重らせんコラーゲン模倣ペプチドであってもよく、ここで、Ｐ^＊は、α_２β_１インテグリンによって認識される４－ヒドロキシプロリンである。このペプチドは、Ｉ型コラーゲンの天然構造と類似した安定な三重らせん構造をとる。「ＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチド」とは、ＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）接着モチーフを含有するコラーゲン模倣ペプチドを指すことができる。例示的なＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチド配列は、ＧＧＹＧＧＧＰＣ（ＧＰＰ）_５ＧＦＰ^＊ＧＥＲ（ＧＰＰ）_５ＧＰＣ（配列番号２）であり、ここで、Ｐ^＊は、４－ヒドロキシプロリンである。

【0077】

特定の実施形態は、リンパ球接着部分としてＩＣＡＭ－１を利用する。ＩＣＡＭ－１は、細胞間接着を促進するインテグリンに結合するＩｇ様細胞接着分子であり、リンパ球機能関連（ＬＦＡ）抗原についてのリガンドである。ＩＣＡＭ－１は、主に単球及び内皮細胞上に見出され、Ｔ細胞、Ｂ細胞、胸腺細胞、樹状細胞、内皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞及び上皮細胞を含む多くの細胞上で広範に誘導可能である又は上方制御される。このタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞相互作用に対して共刺激効果を有し、多くの細胞間結合相互作用において利用される。特定の実施形態では、ＩＣＡＭ－１は配列番号３を含む。

【0078】

特定の実施形態は、リンパ球接着部分としてＦＮＩＩＩ_７～１０を利用する。ＦＮＩＩＩ_７～１０は、フィブロネクチンの７～１０番目のＩＩＩ型反復に及ぶフィブロネクチン断片である。フィブロネクチンの配列は当該技術分野において公知である。特定の実施態様では、ＦＮＩＩＩ_７～１０は配列番号４を含む。

【0079】

様々な方法が、本明細書に開示される移植可能な足場内又は上に、ＬＡＭ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、さらなる免疫刺激剤及び／又はリンパ球活性化部分を組み込むために利用されてもよい。この説明の目的のために、ＬＡＭ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、さらなる免疫刺激剤及び／又はリンパ球活性化部分は、「構成要素」と称される。

【0080】

構成要素は、注射可能な形態の構造内に見出されてもよく、又は足場の細孔内に埋め込まれてもよく、足場の表面に付着されてもよく、足場の表面上にコーティングされてもよく、及び／又は足場自体の中に埋め込まれてもよい。

【0081】

特定の実施形態の範囲内で、構成要素はポリマー鎖の骨格に組み込まれてもよい。例えば、Ｊｕｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉ．、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄ．１５（１）、７３～９４頁（２００４年）に記載されているように、骨格にＹＩＧＳＲ（配列番号５）を含有するポリマーが作製されてもよい。

【0082】

特定の実施形態では、構成要素はポリマー上にグラフトされてもよい。一つの方法では、エポキシド、ハロゲン化物、アミン、アルコール、スルホネート、アジド、無水物又はカルボン酸部分のような反応性官能基を含有する側枝を有するポリマーが、カルボジイミド反応のような従来のカップリング技術を使用して、反応性側枝を介してポリペプチドのアミン末端に共有結合されてもよい。例えば、ＲＧＤ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）含有ペプチドは、Ｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓ、２８（３）、３２９～４２頁（１９９４年）に記載されているようにポリマーの骨格上にグラフトされている。別の例では、ＲＧＤ含有ペプチドは、Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２６、８６１～８７２頁（２００５年）に記載されているようにポリエチレングリコールベースのポリマーの側枝上にグラフトされている。特定の実施形態では、構成要素は、移植可能な足場骨格（図１０Ａに示される）に直接連結されてもよく、又は足場形成（例えば、成形）の前にカルボジイミド化学を使用してリンパ球接着部分（例えば、フィブリン、コラーゲン；図１０Ｂに示される）に連結されてもよい。

【0083】

製造の観点からこれらのアプローチの利点は、移植された足場が、第２の構成要素として粒子を使用することなく、単一の生分解性材料から完全に構成されることである。さらに、ＬＡＭを足場に一体化するストラテジーは、リンパ球接着部分を使用する必要性を回避することができる。理論に束縛されるものではないが、これらの実施形態では、足場に埋め込まれたリンパ球が、接着分子及び刺激合図としての役割を果たす、提示されたＬＡＭ（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ１３７抗体、ＩＬ－１５）と一緒に移動する。このアプローチは、本明細書に開示される実施形態において、粒子及びリンパ球接着部分の使用を任意選択的にする。

【0084】

製造において、３Ｄバイオプリンティングは、明確に定義された足場の多孔性及び組成をより確実にすることができ、ＧＭＰ製造を容易にすることができる。この状況において、構成要素はまた、足場内のこれらの構成要素の制御された空間分布をより確実にするために足場内にプリントされてもよい。

【0085】

以前に示されているように、ＴＦＮマイクロメッシュは、スパッタ堆積プロセスを介してマイクロパターン化シリコンウェハ上に生成されるバルク材料の変形である。ＴＦＮマイクロメッシュの特定の利点は、これがフォトリソグラフィー技術に基づいているので、このマイクロメッシュ細孔のサイズ及び形状に対して精巧な制御を与えることができることである。

【0086】

特定の実施形態では、足場はまた、１種以上の構成要素を含む生物活性コーティング（例えば、薬物溶出ポリマー）によりコーティングされてもよい。特定の実施形態では、足場は、生物活性コーティングにより少なくとも部分的にコーティングされる。生物活性コーティングは、当該技術分野において公知であるコーティング方法の使用を含む、様々な方法において足場の表面上に適用され得る。例えば、生物活性コーティング（例えば、薬物溶出ポリマー）は、従来の静電噴霧プロセスによって足場上に噴霧されてもよく、その結果、荷電した液滴が足場の表面上に堆積される。コーティング液が乾燥するにつれて、構成要素、例えば、ポリペプチド及び／又は小分子は、例えば、ポリペプチド上の側鎖基との分子間結合によって足場の表面に接着したままになる。特定の実施形態では、堆積した生物活性コーティングは、足場の表面上に単層を形成することができる。

【0087】

特定の実施形態では、生物活性コーティングは、共有結合、極性結合、イオン結合、配位結合、金属結合、静電結合又は分子間双極性（ファンデルワールスを含む）結合を含む、化学的又は物理的結合手段のいずれかの種類によって足場の表面に結合されてもよい。生物活性コーティングは、足場の表面を変化させるための他の構成要素、例えば、ポリリシン、ポリオルニチン（ｐｏｌｙｏｒｎｉｔｉｎｅ）又は他の糖タンパク質をさらに含んでもよい。

【0088】

薬物溶出ポリマーとして使用され得る例示的な生体適合性ポリマーには、単独で又は任意の他のポリマー組成物と組み合わせて、任意の濃度及び任意の比率において、寒天、アガロース、アルギネート、アルギネート／リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（β－ＧＡＬ）、（１，２，３，４，６－ペンタアセチルａ－Ｄ－ガラクトース）、セルロース、キチン、キトサン（例えば、多孔質キトサン足場を記載している、Ｌｅｖｅｎｇｏｏｄら、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ、２０１４年、２、３１６１～３１８４頁を参照のこと。）、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシ－ヘキサノエート）（ＰＨＢＨＨｘ）、ポリ（ラクチド）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、乳酸－グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ；例えば、多孔質ＰＬＧＡ足場を記載している、Ｏｍａｒら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２００９年１１月２５日；１（８）：８ｒａ１９を参照のこと。）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、絹、ダイズタンパク質及びダイズタンパク質分離物が含まれる。

【0089】

特定の実施形態では、生物活性コーティングの配置のために、足場の表面は、ポリリシン又はポリオルニチン（３～１０分間、０．１～１．０ｍｇ／ｍｌ）によりコーティングされてもよく、続いてＬＡＭ（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び／若しくは抗ＣＤ１３７抗体並びに／又はＩＬ－１５）及び／又はＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチド又はフィブリン（３０分～２４時間、１０μｇ／ｍｌ～２５０μｇ／ｍｌ）のようなタンパク質によりコーティングされてもよい。

【0090】

特定の実施形態では、生物活性コーティングの配置のために、足場の表面は、ポリリシン又はポリオルニチン（６分間、０．５ｍｇ／ｍｌ）によりコーティングされてもよく、続いてＬＡＭ（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び／若しくは抗ＣＤ１３７抗体並びに／又はＩＬ－１５）及び／又はＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチド又はフィブリン（３０分～２４時間、１０μｇ／ｍｌ～２５０μｇ／ｍｌ）のようなタンパク質によりコーティングされてもよい。

【0091】

特定の実施形態では、足場の表面は、ＬＡＭ及び／又はＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドによりコーティングされる。例として、精製したＬＡＭ及び／又はＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチド又はフィブリンは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩として保存されてもよく、０．１％ＴＦＡ及び０．０１％アジ化ナトリウム中で１０ｍｇ／ｍＬに再構成されてもよく、使用前に４℃にて保存されてもよい。足場が、夾雑物を除去するためにエタノールによりリンスされ、新鮮なエタノール中で清浄化され、ｄｄＨ_２Ｏ中でリンスされた後、これらはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬され得る。次いでＬＡＭ及び／又はＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチド又はフィブリンは、ＬＡＭ及び／又はＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチド又はフィブリンのＰＢＳ中溶液において足場をインキュベートすることによって受動的に足場上に吸収され得る。移植の前に、足場は、結合していないペプチドを除去するためにＰＢＳ中でリンスされ得る。

【0092】

特定の実施形態では、薬物溶出ポリマーのような生物活性コーティングは、足場マトリックス材料（例えば、ＴＦＮマイクロメッシュ又はアルギネート）上にコーティングされ得る。薬物溶出ポリマーは、例えば、小分子（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト）を含有してもよく、経時的（例えば、３、４又は５日、１週間又は２週間）に小分子をゆっくりと溶出することができる。

【0093】

特定の実施形態では、薬物溶出ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ）は、単層として足場マトリックスの表面を直接コーティングしており、リンパ球足場の他の構成要素（例えば、リンパ球活性化部分）は、薬物溶出ポリマー上に適用され得る。薬物溶出ポリマーは、例えば、コーティングからリンパ球足場が移植される環境に小分子又は薬物をゆっくりと溶出するために有用であり得る。

【0094】

示されているように、構成要素は、移植可能な足場の構造内又は上に直接組み込まれてもよい。特定の実施形態では、構成要素は、粒子内又は上に組み込まれてもよい。多孔質粒子は、多孔質ネットワークを形成することができる任意の材料から構築されてもよい。例示的な材料には、生体適合性ポリマー、金属、遷移金属及び半金属のような様々な材料が含まれる。例示的な生体適合性ポリマーには、単独で又は任意の他のポリマー組成物と組み合わせて、任意の濃度及び任意の比率において、寒天、アガロース、アルギネート、アルギネート／リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（β－ＧＡＬ）、（１，２，３，４，６－ペンタアセチルａ－Ｄ－ガラクトース）、セルロース、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシ－ヘキサノエート）（ＰＨＢＨＨｘ）、ポリ（ラクチド）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）、乳酸－グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、絹、ダイズタンパク質及びダイズタンパク質分離物が含まれる。様々なグレードを使用して異なる比率において異なるポリマー種を混合することにより、寄与するポリマーの各々から取り入れられる特性がもたらされ得る。様々な末端基の化学的性質もまた、採用されてもよい。例示的な金属、遷移金属及び半金属には、リチウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム及びシリカが含まれる。特定の実施形態では、多孔質粒子はシリカを含む。メソ多孔質シリカの非常に高い表面積（１，０００ｍ２／ｇを超える）は、リポソーム又はポリマーコンジュゲートのような従来の担体を超えるレベルにてＳＴＩＮＧアゴニストの負荷を可能にする。さらなる実施形態では、細孔は１０～２０ｎｍのサイズの範囲である。

【0095】

また、特定の実施形態の有用な粒子には、カチオン性脂質、イオン化可能なカチオン性脂質、脂質様分子及びｐＨ感受性両親媒性物質を含む脂質ベースの送達系に基づくもの並びに／又は（ｉｉ）デンドリマー（ポリ－アミドアミン（ＰＡＭＡＭ）及びポリ－プロピレンイミン（ｐｏｌｙ－ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｉｍｉｎｉｅ）（ＰＰＩ）から合成された高度に分枝した球状巨大分子並びにＰＡＡ／ＢＭＡ／ＤＭＡＥＭＡ及びＰＤＭＡＥＭＡのようなブロックコポリマーが含まれる。

【0096】

粒子は、回転楕円体、立方体、ピラミッド形、長方形、円筒形、トロイダル形などを含む、様々な異なる形状であってもよい。構成要素は、様々な手段において多孔質ナノ粒子に含まれてもよい。例えば、構成要素は、多孔質粒子内に封入されてもよい。他の態様では、構成要素は、粒子の表面と会合（例えば、共有結合及び／又は非共有結合）されてもよく、又は粒子の表面に近接した下層付近と会合（例えば、共有結合及び／又は非共有結合）されてもよい。特定の実施形態では、構成要素は、粒子内に組み込まれてもよく、例えば、粒子の材料内に一体化されてもよい。例えば、構成要素は、ポリマー粒子のポリマーマトリックス内に組み込まれてもよい。当業者は、本明細書に記載されているような移植可能な足場内に構成要素を運ぶための様々な手段を理解している。

【0097】

特定の実施形態では、粒子はリポソームを含む。リポソームは、少なくとも１つの同心円脂質二重層を含む微視的小胞である。小胞形成脂質は、最終複合体の特定の程度の流動性又は剛性を達成するように選択される。特定の実施形態では、リポソームは、粒子を取り囲む外層である脂質組成を提供する。

【0098】

リポソームは、中性（コレステロール）であってもよく、又は双極性であってもよく、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）のようなリン脂質並びにジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む他の種類の双極性脂質を含み、１４～２２の範囲の炭化水素鎖長を有し、飽和されており、又は１つ以上の二重Ｃ＝Ｃ結合を有する。単独で又は他の脂質成分と組み合わせて安定なリポソームを生成することができる脂質の例は、水素添加ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミド－メチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）のようなリン脂質である。リポソームに組み込まれ得るさらなる非リン含有脂質には、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ミリスチン酸イソプロピル、トリエタノールアミン－ラウリル硫酸、アルキル－アリール硫酸、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｓｔｅｒｅａｔｅ）、両性アクリルポリマー、ポリエチルオキシル化脂肪酸アミド及び上述のカチオン性脂質（ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＭＲＩＥ、ＤＭＴＡＰ、ＤＯＧＳ、ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＭＡ）、ＤＯＳＰＡ、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ）が含まれる。負に荷電した脂質には、小胞を形成することができるホスファチジン酸（ＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、及び（ＤＯＰＧ）、ジセチルホスフェートが含まれる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるリポソームを作製するために使用される脂質には、コレステロール、水素添加ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及び誘導体化小胞形成脂質ＰＥＧ－ＤＳＰＥが含まれる。

【0099】

リポソームを形成する方法は、例えば、米国特許第４，２２９，３６０；４，２２４，１７９；４，２４１，０４６；４，７３７，３２３；４，０７８，０５２；４，２３５，８７１；４，５０１，７２８；及び４，８３７，０２８並びにＳｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０年）及びＨｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６年）に記載されている。

【0100】

粒径は、広範囲にわたって変化してもよく、異なる手段において測定され得る。例えば、本開示の粒子は、１００ｎｍの最小寸法を有してもよい。本開示の粒子はまた、５００ｎｍ以下、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満又は１０ｎｍ未満の最小寸法を有してもよい。特定の実施形態では、粒子は、５ｎｍ～５００ｎｍ、１０ｎｍ～１００ｎｍ、２０ｎｍ～９０ｎｍ、３０ｎｍ～８０ｎｍ、４０ｎｍ～７０ｎｍ及び４０ｎｍ～６０ｎｍの範囲の最小寸法を有してもよい。特定の実施形態では、寸法は粒子の直径である。特定の実施形態では、粒子の集団は、５００ｎｍ以下、１００ｎｍ未満、９０ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満又は１０ｎｍ未満の平均最小寸法を有してもよい。特定の実施形態では、移植可能な足場における粒子の集団は、５ｎｍ～５００ｎｍ、１０ｎｍ～１００ｎｍ、２０ｎｍ～９０ｎｍ、３０ｎｍ～８０ｎｍ、４０ｎｍ～７０ｎｍ及び４０ｎｍ～６０ｎｍの範囲の平均直径を有してもよい。粒子の寸法は、例えば、動的光散乱及び／又は電子顕微鏡法のような従来の技術を使用して決定され得る。

【0101】

特定の実施形態では、足場は、粒子として原細胞を含む。原細胞は、リポソームの多孔質シリカナノ粒子との融合によって形成され得る。球状メソ多孔質シリカコアの大きい細孔容積及び表面積は、構成要素を含む、様々な種類のカーゴの高容量封入を可能にする。組成が特定の生物学的応用のために修飾され得る、支持される脂質二重層は、モジュール式の再構成可能な足場として機能することができ、本明細書のいずれかに記載されている構成要素のような様々な機能分子の付着を可能にする。

【0102】

所望の場合、粒子からの様々な材料の放出は、界面活性剤、洗浄剤、錯化剤、内相粘度増強剤、界面活性分子、共溶媒、キレート剤、安定剤、セルロースの誘導体、ポリソルベート、ＰＶＡ又はスクロースの組み込みによって修飾され得る。塩及び緩衝液もまた、放出特性を変化させるために使用され得る。

【0103】

特定の実施形態では、ＴＦＮマイクロメッシュを含むリンパ球足場は、医療装置上にコーティングされ得る。ＴＦＮは、ステント又は別の円筒形状の装置のような低侵襲性医療装置に容易に組み込まれ得るという点で、細胞足場の間で特有である。低侵襲性医療装置とは、低侵襲性処置を使用して配置／移植され得る医療装置を指すことができる。低侵襲性処置は、非常に小さい切開（例えば、１ｃｍ未満又は２ｃｍ未満）のみを必要とする処置であり得る及び／又はより大きい切開を必要とする処置と比較して、短縮された創傷治癒時間、感染の関連する疼痛又はリスクに関連する。ＴＦＮマイクロメッシュにより覆われたステントの例は図１２Ｄに示される。この特有の装置は、開腹術を必要とせずに、固形腫瘍の部位への抗がんリンパ球の直接送達を容易にする。

【0104】

遺伝的に再プログラムされたリンパ球。本明細書に開示される足場の構造は、埋め込まれたリンパ球を含む。腫瘍細胞をターゲティング及び殺傷することができ、他の細胞型による殺傷のために腫瘍細胞をターゲティングすることができ、又は別様で腫瘍細胞殺傷を媒介することができるいずれかの種類のリンパ球が使用され得る。リンパ球は、足場が投与される個体に対して自己由来であってもよい。

【0105】

リンパ球には、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。本開示は、埋め込まれたＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の使用に焦点を当てているが、他の種類のリンパ球もまた、単独で又は組み合わせて使用されてもよい。

【0106】

Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されており、各々は異なる機能を有する。Ｔ細胞には、ヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）及び細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）が含まれる。

【0107】

ヘルパーＴ細胞は、他の機能の中でも特に、形質細胞へのＢ細胞の成熟並びに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。これらの細胞は、これらの表面上にＣＤ４タンパク質を発現するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られている。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。一旦活性化されると、これらは迅速に分裂し、活性免疫応答を調節する又は補助するサイトカインと呼ばれる小タンパク質を分泌する。

【0108】

細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。これらの細胞はまた、これらの表面においてＣＤ８糖タンパク質を発現するのでＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られている。これらの細胞は、身体のほぼ全ての細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩに関連する抗原と結合することによって、これらの標的を認識する。

【0109】

Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴＣＲは、独立したＴ細胞受容体アルファ及びベータ（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）遺伝子から産生され、α－及びβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれる、２つの別々のペプチド鎖から構成される。ガンマ－デルタ（γΔ）Ｔ細胞は、これらの表面上に異なるＴＣＲを有するＴ細胞の小さなサブセットを表す。しかしながら、γΔＴ細胞では、ＴＣＲは１つのγ鎖及び１つのΔ鎖から構成される。このＴ細胞の群は、αβＴ細胞ほど一般的ではない（全Ｔ細胞の２％）。

【0110】

本明細書に使用される場合、「セントラルメモリー」Ｔ細胞（又は「Ｔ_ＣＭ」）とは、これらの表面上でＣＤ６２Ｌ又はＣＣＲ－７及びＣＤ４５ＲＯを発現し、ナイーブ細胞と比較してＣＤ４５ＲＡを発現しない又はＣＤ４５ＲＡの発現が減少している抗原を経験したＣＴＬを指す。特定の実施形態では、セントラルメモリー細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２Ｓ、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ９５の発現に対して陽性であり、ナイーブ細胞と比較してＣＤ５４ＲＡの発現が減少している。

【0111】

本明細書に使用される場合、「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（又は「Ｔ_ＥＭ」）とは、セントラルメモリー細胞と比較してこれらの表面上でＣＤ６２Ｌを発現しない又はＣＤ６２Ｌの発現が減少しており、ナイーブ細胞と比較してＣＤ４５ＲＡを発現しない又はＣＤ４５ＲＡの発現が減少している、抗原を経験したＴ細胞を指す。特定の実施形態では、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞又はセントラルメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７の発現に対して陰性であり、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＡを変化可能に発現する。

【0112】

本明細書に使用される場合、「ナイーブ」Ｔ細胞とは、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＡを発現し、セントラル又はエフェクターメモリー細胞と比較してＣＤ４５ＲＯを発現しない、抗原を経験しないＴリンパ球を指す。特定の実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７及びＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる。

【0113】

本明細書に使用される場合、「エフェクター」又は「ＴＥ」Ｔ細胞とは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８を発現しない又はＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現が減少しており、セントラルメモリー又はナイーブＴ細胞と比較してグランザイムＢ及びパーフォリンに対して陽性である、抗原を経験した細胞傷害性Ｔリンパ球細胞を指す。

【0114】

ＮＫ細胞は、ウイルス感染又は腫瘍形成に迅速に応答することができる細胞傷害性リンパ球である。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ発現又は抗体の非存在下で「ストレスを受けた」細胞を認識することができ、近接細胞の細胞膜において細孔を形成することができる、パーフォリンのようなタンパク質を含有する細胞傷害性顆粒を放出することができる。ＮＫ細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２及びＣＣＬ５を含むサイトカインの存在下で活性化され得る。ＮＫ細胞は、リガンドがＮＫ細胞活性化受容体と結合すると活性化され得る。ＮＫ細胞活性化に寄与し得る受容体には、ＣＤ１３７、ＣＤ２及びＣＤ４４が含まれる。

【0115】

本明細書に記載されているリンパ球型の各々は、本明細書に開示される足場内に埋め込まれ得る。特定の実施形態では、初代リンパ球細胞型はＣＴＬである。ＣＴＬは、埋め込まれたリンパ球集団の５０％以上、埋め込まれたリンパ球集団の５５％以上、埋め込まれたリンパ球集団の６０％以上、埋め込まれたリンパ球集団の６５％以上、埋め込まれたリンパ球集団の７０％以上、埋め込まれたリンパ球集団の７５％以上、埋め込まれたリンパ球集団の８０％以上、埋め込まれたリンパ球集団の８５％以上、埋め込まれたリンパ球集団の９０％以上、埋め込まれたリンパ球集団の９５％以上又は埋め込まれたリンパ球集団の１００％に含まれ得る。

【0116】

リンパ球の様々な組み合わせもまた、本明細書に開示される足場に使用され得る。特定の実施形態では、足場は、ＣＤ８＋細胞、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞）、Ｔｈ１７ＣＤ４＋細胞及び／又はＢ細胞の混合物を含む。特定の実施形態では、足場は、ＣＤ８＋細胞及びＮＫ細胞の混合物を含む。特定の実施形態では、ＣＤ８＋細胞及びＮＫ細胞の混合物は５０：５０混合物である。特定の実施形態では、足場は、ＣＤ８＋細胞及びｉＮＫＴ細胞の混合物を含む。特定の実施形態では、ＣＤ８＋細胞及びｉＮＫＴ細胞の混合物は５０：５０混合物である。開示されている細胞型の全ての他の可能な組み合わせもまた、本明細書に開示される足場内に使用され得る。

【0117】

特定の実施形態では、リンパ球は、切除された腫瘍から単離及び増殖され得る。特定の実施形態では、対象は、腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ２に対する）によりワクチン接種されてもよく、ワクチン誘導性Ｔ細胞集団は、増殖され得、足場内に埋め込まれ得る。

【0118】

足場内のリンパ球は、非遺伝的に修飾されてもよく若しくは遺伝的に修飾されてもよく、又は非遺伝的に修飾された形態及び遺伝的に修飾された形態の組合せにおいて提供されてもよい。遺伝子修飾は、成長、生存、免疫機能及び／又は腫瘍細胞ターゲティングを増強するためになされ得る。遺伝子修飾の例には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、αβＴ細胞受容体（又はこの修飾）及び／若しくは炎症性サイトカインの発現を可能にするもの又は阻害シグナル（例えば、キラー細胞免疫グロブリン様受容体）の発現を遮断するものが含まれる。ＣＡＲ修飾及び／又はαβ Ｔ細胞受容体修飾は、修飾されたリンパ球が細胞型を特異的に標的化することを可能にする。

【0119】

一態様では、遺伝子修飾されたリンパ球は、腫瘍認識を改善することができ、増加した天然のＴ細胞増殖及び／又はサイトカイン産生を誘発することができる。異なるリガンド結合ドメイン、異なるスペーサー領域長、異なる細胞内結合ドメイン及び／又は異なる膜貫通ドメインをコードする異なる潜在的ＣＡＲ核酸構築物が、非遺伝的に修飾されたリンパ球及び／又は他のＣＡＲよりも改善された機能を有するＣＡＲを同定するためにインビボで（動物モデルにおいて）及び／又はインビトロで試験され得、特定の実施形態では、インビボスクリーニング手段として本明細書に開示される足場を使用して試験され得る。

【0120】

例示的なＣＡＲは、例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンド、メソテリン、Ｈｅｒ２、ＷＴ－１及び／又はＥＧＲＦを標的とするリガンド結合ドメインを発現する。例示的なＴ細胞受容体修飾は、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）Ａ３ ＴＣＲを標的とする。

【0121】

特定の以下のがんは、ＴＣＲ又はＣＡＲの細胞外成分内に、関連する細胞マーカーに結合する結合ドメインを含むことによって標的化され得る：

【0122】

【表2】

【0123】

上述に限定されずに、細胞マーカーには、Ａ３３；ＢＡＧＥ；Ｂｃｌ－２；β－カテニン；Ｂ７Ｈ４；ＢＴＬＡ；ＣＡ１２５；ＣＡ１９－９；ＣＤ３、ＣＤ５；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２１；ＣＤ２２；ＣＤ２５；ＣＤ２８；ＣＤ３０；ＣＤ３３；ＣＤ３７；ＣＤ４０；ＣＤ５２；ＣＤ４４ｖ６；ＣＤ４５；ＣＤ５６；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８６；ＣＤ１２３；ＣＤ１３４；ＣＤ１３７；ＣＤ１５１；ＣＤ１７１；ＣＤ２７６；ＣＥＡ；ＣＥＡＣＡＭ６；ｃ－Ｍｅｔ；ＣＳ－１；ＣＴＬＡ－４；サイクリンＢ１；ＤＡＧＥ；ＥＢＮＡ；ＥＧＦＲ；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｅｐｈｒｉｎＢ２；ＥｒｂＢ２；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；ＥｐｈＡ２；エストロゲン受容体；ＦＡＰ；フェリチン；α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）；ＦＬＴ１；ＦＬＴ４；葉酸結合タンパク質；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ；ＧＡＧＥ；Ｇ２５０；ＧＤ－２；ＧＨＲＨＲ；ＧＨＲ；ＧＩＴＲ；ＧＭ２；ｇｐ７５；ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）；ｇｐ１３０；ＨＬＡ；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；ＨＰＶ Ｅ６；ＨＰＶ Ｅ７；ｈＴＥＲＴ；ＨＶＥＭ；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＬ６Ｒ；ＫＤＲ；Ｋｉ－６７；Ｌｅｗｉｓ Ａ；Ｌｅｗｉｓ Ｙ；ＬＩＦＲβ；ＬＲＰ；ＬＲＰ５；ＬＴβＲ；ＭＡＧＥ；ＭＡＲＴ；メソテリン；ＭＵＣ；ＭＵＣ１；ＭＵＭ－１－Ｂ；ｍｙｃ；ＮＹＥＳＯ－１；Ｏ－アセチルＧＤ－２；Ｏ－アセチルＧＤ３；ＯＳＭＲβ；ｐ５３；ＰＤ１；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２；ＰＲＡＭＥ；プロゲステロン受容体；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＰＴＣＨ１；ＲＡＮＫ；ｒａｓ；Ｒｏｂｏ１；ＲＯＲｌ；スルビビン；ＴＣＲα；ＴＣＲβ；テネイシン；ＴＧＦＢＲ１；ＴＧＦＢＲ２；ＴＬＲ７；ＴＬＲ９；ＴＮＦＲ１；ＴＮＦＲ２；ＴＮＦＲＳＦ４；ＴＷＥＡＫ－Ｒ；ＴＳＴＡチロシナーゼ；ＶＥＧＦ及びＷＴ１も含まれる。

【0124】

特定のがん細胞の細胞マーカーには、以下が含まれる：

【0125】

【表3】

【0126】

特定の実施形態では、ＲＯＲ１特異的及びＣＤ１９特異的ＣＡＲは、２Ａ２、Ｒ１２及びＲ１１ ｍＡｈｓ（ＲＯＲ１）並びにＦＭＣ６３ ｍＡｂ（ＣＤ１９）のＶＬ及びＶＨ鎖セグメントを使用して構築され得る。Ｒ１１及びＲ１２についての可変領域配列は、Ｙａｎｇら、Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ６（６）：ｅ２１０１８、２０１１年６月１５日に提供されている。各々のｓｃＦＶは、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３（配列番号１３）タンパク質によって、「ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３」（２２９ＡＡ、配列番号１５）、「ヒンジ－ＣＨ３」（１１９ＡＡ、配列番号１６）又は「ヒンジ」のみ（１２ＡＡ、配列番号１７）配列のいずれかを含むＩｇＧ４－Ｆｃ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベース：Ｐ０１８６１、配列番号１４）に由来するスペーサードメインと連結され得る。全てのスペーサーは、天然ＩｇＧ４－Ｆｃタンパク質の１０８位に位置する「ヒンジ」ドメイン内にＳ→Ｐ置換を含有することができ、ヒトＣＤ２８の２７ＡＡ膜貫通ドメイン（配列番号１８、例示的な全長ＣＤ２８については、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１０７４７を参照のこと）と連結され得、（ｉ）天然ＣＤ２８タンパク質（配列番号１９）の１８６～１８７位に位置するＬＬ→ＧＧ置換を有するヒトＣＤ２８の４１ＡＡ細胞質ドメイン又は（ｉｉ）ヒト４－１ＢＢの４２ＡＡ細胞質ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０７０１１、配列番号２０）のいずれかを含むエフェクタードメインシグナル伝達モジュールと連結され得、これらの各々は、ヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３の１１２ＡＡ細胞質ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２０９６３、配列番号２１）と連結され得る。この構築物は、キメラ受容体の下流のＴ２Ａリボソームスキップエレメント（配列番号２２）及びｔＥＧＦＲ配列（配列番号２３）をコードする。ｔＥＧＦＲは、ＳＴＲＥＰ－ＴＡＧ（登録商標）ＩＩ（配列番号２４；ＩＢＡ ＧＭＢＨ Ｌｔｄ．、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ＤＥ）、Ｍｙｃタグ（配列番号２５）、Ｖ５タグ（配列番号２６）、ＦＬＡＧ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）タグ（配列番号２７）、Ｈｉｓタグ又は本明細書に開示される他のペプチド若しくは分子のような配列と結合するタグカセットと置き換えられ得る又はこれにより補足され得る。各導入遺伝子をコードするコドン最適化遺伝子配列が合成され得（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｎｈｅｌ及びＮｏｔ１制限酵素部位を使用してｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターにクローニングされ得る。ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターは、ｐＨＩＶ７のサイトメガロウイルスプロモーターをＥＦ－１プロモーターと置き換えることによってｐＨＩＶ７ベクターに由来し得る。ＲＯＲ１－キメラ受容体、ＣＤ１９－キメラ受容体、ｔＥＧＦＲ又はタグカセットをコードするレンチウイルスは、パッケージングベクターｐＣＨＧＰ－２、ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２及びｐＣＭＶ－Ｇ並びにＣａｌｐｈｏｓトランスフェクション試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して２９３Ｔ細胞において産生され得る。

【0127】

ＨＥＲ２特異的キメラ受容体は、ＨＥＲ２上の膜近位エピトープを認識するＨＥＲ２特異的ｍＡｂのＶＬ及びＶＨ鎖セグメントを使用して構築され得、ｓｃＦＶは、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ３及びＩｇＧ４ヒンジのみの細胞外スペーサードメイン並びにＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと連結され得る。

【0128】

示されているように、各ＣＤ１９キメラ受容体は、ＣＤ１９特異的ｍＡｂ ＦＭＣ６３（ｓｃＦｖ：ＶＬ－ＶＨ）の配列に対応する一本鎖可変断片、「ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３」ドメイン（２２９ＡＡ、長いスペーサー）又は「ヒンジ」ドメインのみ（１２ＡＡ、短いスペーサー）のいずれかを含むＩｇＧ４－Ｆｃに由来するスペーサー及び膜近位ＣＤ２８又は４－１ＢＢ共刺激ドメインを有するＣＤ３ζのシグナル伝達モジュールを、単独で又はタンデムのいずれかで含んでもよい。導入遺伝子カセットは、キメラ受容体遺伝子から下流に切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）を含んでもよく、キメラ受容体修飾細胞のための形質導入、選択及びインビボ追跡のためのタグ配列として機能するように、切断可能なＴ２Ａエレメントによって分離されてもよい。ｔＥＧＦＲは、ＳＴＲＥＰ－ＴＡＧ（登録商標）ＩＩ（配列番号２４）、Ｍｙｃタグ（配列番号２５）、Ｖ５タグ（配列番号２６）、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ（配列番号２７）、Ｈｉｓタグ又は本明細書に開示される他のペプチド若しくは分子のようなＥｘｏＣＢＭと結合するタグカセットと置き換えられ得る又はこれにより補足され得る。

【0129】

スペーサー、細胞内ドメイン、共刺激ドメイン及び膜貫通ドメインのような操作されたＣＡＲの他の一般的な特徴は、当業者に公知である。

【0130】

特定の実施形態では、例えば、Ｌｕｐｔｏｎら、Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１：６頁（１９９１年）；及びＲｉｄｄｅｌｌら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１９～３３８頁（１９９２年）に記載されているように、インビボで陰性選択を可能にするために、リンパ球に機能的遺伝子を導入することが望まれ得る；優性の陽性選択可能マーカーを陰性選択可能マーカーと融合することに由来する二機能性の選択可能な融合遺伝子の使用を記載しているＬｕｐｔｏｎらによる公報ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８４４２及びＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１も参照のこと。これは、公知の技術（例えば、米国特許第６，０４０，１７７、１４～１７欄を参照のこと。）又は本開示に基づいて当業者に明らかであるこの変形に従って実施され得る。例えば、刺激因子（例えば、リンホカイン又はサイトカイン）の過剰発現は、処置される対象に対して毒性であり得ることが意図される。したがって、本開示の細胞をインビボでの陰性選択に対して感受性にさせる遺伝子セグメントを含むことは、本開示の範囲内である。「陰性選択」とは、注入された細胞が、個体のインビボでの状態の変化の結果として排除され得ることを意味する。陰性の選択可能な表現型は、投与される薬剤、例えば、化合物に対する感受性をもたらす遺伝子の挿入から生じ得る。陰性の選択可能な遺伝子は、当該技術分野において公知であり、とりわけ、以下：ガンシクロビル感受性をもたらす単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｉ ＴＫ）遺伝子；細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子及び細菌シトシンデアミナーゼを含む。

【0131】

所望の遺伝子は、本明細書に開示される足場に埋め込む前にリンパ球に導入され得る。細胞の遺伝子再プログラミングには、例えば、遺伝子配列の挿入、遺伝子配列の変更及び／又は遺伝子配列の欠失が含まれ得る。特定の実施形態では、リンパ球は、遺伝子再プログラミングのためのベクターをリンパ球に導入することによって、遺伝的に再プログラミングされ得る。特定の実施形態は、遺伝子編集システム内でヌクレオチドを送達することができる。遺伝子編集システムは、細胞の内因性ゲノムの特定の配列を修飾し、又はこれに影響を及ぼす。遺伝子編集システムは、標的化されたゲノム編集、例えば、遺伝子破壊、相同組換えによる遺伝子編集及びヒトゲノムを有する適切な染色体標的部位に治療遺伝子を挿入するための遺伝子療法に有用である。

【0132】

特定の実施形態は、遺伝子編集システムとして転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を利用する。ＴＡＬＥＮとは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合タンパク質及びＤＮＡ切断ドメインを含む融合タンパク質を指す。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡにおいて二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することによって遺伝子及びゲノムを編集するために使用され、これは細胞において修復機構を誘導する。一般に、２つのＴＡＬＥＮは、二量体化し、ＤＳＢを誘導するためにＤＮＡ切断ドメインのための標的ＤＮＡ部位の各側に結合し、隣接しなければならない。ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって細胞内で修飾され、又は外因性二本鎖ドナーＤＮＡ断片との相同組換え（ＨＲ）によって細胞内で修復される。

【0133】

示されているように、ＴＡＬＥＮは、例えば、内因性ゲノムの標的配列に結合し、標的配列の位置においてＤＮＡを切断するように操作されている。ＴＡＬＥＮのＴＡＬＥは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌によって分泌されるＤＮＡ結合タンパク質である。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、高度に保存された３３又は３４個のアミノ酸反復を含み、各反復の１２番目及び１３番目の位置に異なる残基を有する。反復可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）と称される、これら２つの位置は、特異的ヌクレオチド認識と強い相関関係を示す。したがって、ターゲティング特異性は、ＲＶＤにおけるアミノ酸を変化させ、従来的でないＲＶＤアミノ酸を組み込むことによって改善され得る。

【0134】

ＴＡＬＥＮ融合において使用され得るＤＮＡ切断ドメインの例は、野生型及びバリアントＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。ＦｏｋＩドメインは、標的配列上の部位のための特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする二量体として機能する。ＦｏｋＩ切断ドメインは、２つの逆方向の半分の部位を分離する５又は６塩基対のスペーサー配列内で切断する。

【0135】

特定の実施形態は、遺伝子編集システムとしてＭｅｇａＴＡＬを利用する。ＭｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥがメガヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインと融合される、単鎖の切断頻度が低い（ｒａｒｅ－ｃｌｅａｖｉｎｇ）ヌクレアーゼ構造を有する。ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られているメガヌクレアーゼは、同一ドメイン内にＤＮＡ認識及びヌクレアーゼ機能の両方を有する単一のペプチド鎖である。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ｍｅｇａＴＡＬは、機能的活性のために単一のペプチド鎖の送達のみを必要とする。

【0136】

特定の実施形態は、遺伝子編集システムとしてジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を利用する。ＺＦＮは、特定の位置においてＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断するように操作された部位特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＺＦＮは、このＺＦＮが、様々な異なる細胞中のゲノム内の特有の配列を標的化することを可能にするＤＮＡ配列中の特定の部位においてＤＳＢを導入するために使用される。さらに、二本鎖切断に続いて、相同組換え又は非相同末端結合がＤＳＢを修復するために行われ、これによりゲノム編集が可能となる。

【0137】

ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって合成される。ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子である３～６個のジンクフィンガータンパク質を含む。ＤＮＡ切断ドメインは、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインを含む。

【0138】

ガイドＲＮＡは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのような遺伝子編集システムと共に使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ反復及びＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（Ｃａｓ）のセットを含む。

【0139】

一般に、送達されたヌクレオチドの機能的発現をもたらすことができる任意のシステムが、本開示内で使用され得る。

【0140】

遺伝子の導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、遺伝子配列を含有するウイルス又はバクテリオファージベクター（例えば、レンチウイルスベクター又はプラスミド）による感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト（ｓｈｅｒｏｐｌａｓｔ）融合などを含む、当該技術分野において公知の任意の方法によって実施され得る。外来遺伝子を細胞に導入するための多数の技術が当該技術分野において公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ及びＢｅｈｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、２１７、５９９～６１８頁（１９９３年）；Ｃｏｈｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、２１７、６１８～６４４頁（１９９３年）；Ｃｌｉｎｅ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ、２９、６９～９２頁（１９８５年）を参照のこと。）、リンパ球の必要な発達及び生理学的機能が破壊されない限り、本開示に従って使用され得る。特定の実施形態では、この技術は、遺伝子が細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝性であり、この細胞子孫によって発現可能であるように、遺伝子の細胞への安定な導入を提供する。特定の実施形態では、この技術は、細胞内での遺伝子の一過性発現を提供する。

【0141】

リンパ球を遺伝的に修飾するために使用され得る組換えＤＮＡ技術の分野において一般的に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．）、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹに記載されている。

【0142】

特定の実施形態では、リンパ球は、対象における足場移植時又はこの付近、例えば、移植の４８時間以内、移植の３６時間以内、移植の２４時間以内、移植の１２時間以内、移植の６時間以内、移植の３時間以内、移植の１時間以内又は移植の３０分以内に足場内に埋め込まれる。一般に、予め成形された足場へのリンパ球の負荷は移植の３０分以内に行われるが、足場の注入可能な形態が使用される場合、負荷は、大抵、実際の移植時間のより近く（すなわち、５分以内、２分以内、１分以内又は３０秒以内）に行われる。

【0143】

リンパ球は、新しいリンパ球であってもよく、又は以前に凍結保存されたリンパ球であってもよい。以前に凍結保存されたリンパ球が使用される場合、これらは、速やかに解凍され（例えば、３７°～４１℃に維持した水浴中で）、解凍直後に冷却されるべきである。解凍時の細胞凝集を防ぐために、リンパ球をさらに処理することが望まれ得る。凝集を防ぐために、凍結前及び／又は凍結後にＤＮａｓｅ、低分子量デキストラン及びクエン酸塩、ヒドロキシエチルデンプンなどの添加を含む、様々な手順が使用され得る。必要な場合、潜在的な細胞障害性のために、凍結防止剤は除去されるべきである。凍結防止剤の除去後、必要な場合、細胞計数及び／又は生存試験が実施され得る。

【0144】

本明細書に開示される構造にリンパ球を埋め込むための様々な方法が使用され得る（「埋め込み」は「播種」とも称される）。例えば、受動的（静的）播種が使用され得る。特定の実施形態では、リンパ球は細胞培養培地（例えば、ＲＰＭＩ）に再懸濁される。次いで、この細胞懸濁液は凍結乾燥された足場の上に滴下により加えられる。特定の実施形態では、静的播種が使用される場合、リンパ球懸濁液は構造上に播種され、その後、例えば、ゆっくり撹拌されるスピナーフラスコへの動的培養条件に曝露される前に、撹拌せずに特定の時間インキュベートされる。特定の実施形態では、動的播種が使用され得る。動的播種のために、構造及びリンパ球懸濁液は、例えば、容器内に一緒に配置されてもよく、次いで、容器は、リンパ球が構造内にこられ自体で埋め込まれることを可能にする特定の時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートされる。さらなる実施形態では、回転システム（遠心分離機を含む）及び／又は真空システムが使用され得る。さらなる実施形態では、シートベースのリンパ球播種、静電リンパ球播種、磁性リンパ球播種、濾過リンパ球播種及び／又は振動潅流リンパ球播種が使用され得る。これらの方法の様々な組み合わせも使用されてもよい。様々な生物学的ヒドロゲルの使用もまた適切である。様々な播種の選択肢の説明に関しては、Ｌｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ、１７、９３５～９４４頁（２００１年）；Ｗｅｎｄｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８４、２０５～２１４頁（２００３年）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ、５５、３７９～３８６頁（２００１年）及びＳｉｔｔｉｎｇｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ、２０、５７頁（１９９７年）を参照のこと。

【0145】

特定の実施形態では、ＴＦＮマイクロメッシュを含むリンパ球足場は、高密度の細胞（１ｃｍ^２当たり少なくとも７×１０^６個又は１ｃｍ^２当たり少なくとも８×１０^６個の細胞）を含んでもよい。ＴＦＮマイクロメッシュは、例えば、３層の細胞をＴＦＮマイクロメッシュの各層に充填することによって、高い細胞密度を可能にすることができる（例えば、図１０Ｄを参照のこと。）。マイクロパターン化金属薄膜（例えば、ＴＦＮマイクロメッシュ）の複数の層を積層することもまた、高密度の細胞を達成するために有用であり得る。

【0146】

本明細書に開示されるタンパク質及びタンパク質配列の有効なバリアントもまた、使用されてもよい。バリアントは、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するペプチドを含む。本明細書に使用される場合、「保存的置換」は、１つのアミノ酸の、以下の保存的置換基のうちの１つに見出される別のアミノ酸への置換を含む：群１：アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）；群２：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；群３：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；群４：アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）；群５：イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）及び群６：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）。

【0147】

さらに、アミノ酸は、類似の機能又は化学構造又は組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄含有）によって保存的置換基に分類され得る。例えば、脂肪族の分類には、置換の目的のために、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅが含まれ得る。互いに保存的置換とみなされるアミノ酸を含有する他の基には、以下が含まれる：硫黄含有：Ｍｅｔ及びシステイン（Ｃｙｓ）；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ及びＧｌｎ；低分子脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；極性、負に荷電した残基及びこれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ；高分子脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ並びに高分子芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。さらなる情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに見出される。

【0148】

バリアントはまた、配列番号１～２７のいずれかに対して、少なくとも７０％の配列同一性、８０％の配列同一性、８５％の配列、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、９６％の配列同一性、９７％の配列同一性、９８％の配列同一性又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0149】

「同一性％」とは、配列を比較することによって決定される、２つ以上のタンパク質配列間の関係を指す。当該技術分野において、「同一性」はまた、このような配列の一続きの間の一致によって決定される、タンパク質間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」（しばしば「類似性」と称される）は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、ｅｄ．）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８年）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９４年）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４年）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．、ｅｄ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．、ｅｄｓ．）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９２年）に記載されているものを含む、公知の方法によって容易に計算され得る。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最適な一致を与えるように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公表されているコンピュータープログラムにおいて体系化されている。配列アラインメント及び同一性パーセントの計算は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施され得る。また、配列の多重アラインメントは、デフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長さペナルティ＝１０）を用いて、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ、５、１５１～１５３頁（１９８９年）を使用して実施され得る。また、関連プログラムには、プログラムのＧＣＧスーツ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０頁（１９９０年））；ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）及びＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んでいるＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２年、１１１～２０頁、編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ、出版社：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）が含まれる。本開示の文脈において、配列分析ソフトウェアが分析のために使用される場合、分析の結果は、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。本明細書に使用される場合、「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに初めからロードされている値又はパラメータの任意のセットを意味する。

【0150】

本開示はまた、本明細書に記載されている分子及び／又はペプチドの塩、溶媒和物、水和物、Ｎ－オキシド、プロドラッグ及び／又は活性代謝産物を提供する。適切な酸付加塩は、無機酸又は有機酸、特に薬学的に許容される有機酸から調製され得る。このような無機酸の例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸及びリン酸が含まれる。適切な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、アリール脂肪族、複素環式、カルボン酸及びスルホン酸のクラスの有機酸から選択され得る。

【0151】

適切な塩基付加塩は金属塩又は有機塩から調製され得る。金属塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛から調製され得る。有機塩は、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレン－ジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、リシン、アルギニン、プロカイン及び任意の薬学的に許容される有機塩基から調製され得る。

【0152】

使用方法。本明細書に記載されている足場は、対象において抗腫瘍効果を有するように固形腫瘍、切除不可能な腫瘍及び／又は切除されていない腫瘍細胞の近接に配置され得る。本明細書に使用される場合、「対象」又は「個体」という用語は典型的にヒトのような哺乳動物を指すが、また、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマなどのような別の哺乳動物であってもよい。

【0153】

「腫瘍」は、細胞の異常な成長によって形成される腫れ又は病変である（新生細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる）。「腫瘍細胞」は、急速な制御されない細胞増殖によって分裂し、新たな分裂を開始した刺激が終わった後も分裂し続ける異常な細胞である。腫瘍は、構造的組織化及び正常組織との機能的協調の部分的又は完全な欠如を示し、通常、良性、前悪性又は悪性のいずれかであり得る明らかに異なる組織塊を形成する。

【0154】

本明細書に使用される場合、抗腫瘍効果とは、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均寿命の増加又はがん性状態に関連する様々な生理学的症状の減少によって示され得る生物学的効果を指す。抗腫瘍効果はまた、再発の減少又は再発前の時間の増加によっても示され得る。したがって、本明細書に開示される足場は、様々ながんを治療するために使用され得、転移を予防若しくは有意に遅延することができ、及び／又は再発を予防若しくは有意に遅延することができる。図９Ａ及び９Ｂに示されるように、リンパ球足場は、初期腫瘍の根絶／低減後に抗腫瘍免疫を提供し続けることができ、転移又は二次腫瘍の発生を予防及び／又は低減させることができる。

【0155】

がん（医学用語：悪性新生物）とは、細胞の群が、制御されない成長（正常限界を超える分裂）、浸潤（隣接組織への侵入及び隣接組織の破壊）及び時々、転移を示す疾患のクラスを指す。「転移」とは、がん細胞の増殖の元の部位から身体の別の部分へのこれらの広がりを指す。転移の形成は非常に複雑なプロセスであり、原発腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの浸潤、体腔及び血管に入る内皮基底膜の浸透、次いで血液によって輸送された後の標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍、すなわち二次腫瘍又は転移性腫瘍の成長は、血管新生に依存する。腫瘍転移は、腫瘍細胞又は成分が残存し、転移の可能性を生じ得るので、原発腫瘍の除去後でさえしばしば起こる。

【0156】

本明細書に開示される足場及び方法の抗腫瘍効果により治療され得るがんには、例えば、副腎がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、大腸がん、耳、鼻及び咽喉（ＥＮＴ）がん、子宮内膜がん、食道がん、消化管がん、グリオーマ、頭頸部がん、腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、リンパ節がん、黒色腫、神経芽腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、直腸がん、セミノーマ、皮膚がん、胃がん、奇形腫、甲状腺がん、子宮がん及びこれらの転移がんが含まれる。

【0157】

本開示の範囲を限定することなく、以下のがんの種類が注目される：
脳腫瘍（膠芽腫）：米国では、１年当たり推定１０，０００の新たな症例が見られる。現在、利用可能な根治療法は存在しない。膠芽腫は、非常に浸潤性の成長を示し、完全に切除することはできない。腫瘍の９０％は、最初に切除された腫瘍から２ｃｍの縁内で再発する。化学療法剤を負荷した生体材料ウェハは、膠芽腫のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されている（ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）、ＭＧＩ Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｃｌｉｆｆ Ｌａｋｅ、ＮＪ）。しかしながら、不十分な組織透過性に起因して、生体材料インプラント送達化学療法は、ほとんど効果がない。対照的に、本明細書に開示される足場から展開される腫瘍反応性リンパ球は、罹患組織に能動的に移動することができ、残存腫瘍細胞を探し出し、破壊する。

【0158】

膵臓腺がん：２０１２年に米国において、推定４３，９２０の膵臓がんの新たな症例が発生すると予測された。診断時に切除可能な疾患を有するのはわずか２０％である（患者の８０％は、診断時に腫瘍が進行しすぎるため、手術を受けていない。）。手術でさえも、５年生存率がわずか２０％である一時的に苦痛を緩和する試みであると考えられている。局所再発は、通常、顕微鏡により陰性の外科的縁を達成することの困難性に起因する。外科的腫瘍切除後の残存疾患を根絶する現在の足場の能力以外に、足場はまた、手術不可能な疾患を有する膵臓腫瘍患者（患者の８０人％）に非常に有効な治療選択肢を提供することができる。特定の実施形態では、足場は、切除不可能な樹立された膵臓腺がん上に直接移植される。

【0159】

卵巣がん：２０１２年に米国において、推定２２，０００の新たな症例が見られた。手術及び化学療法による集学的療法にもかかわらず、ほとんどの卵巣がん患者は予後不良（米国では１年当たり１５，５００人の推定死亡者数）である。卵巣がんは主に腹膜腔内に広がる。卵巣がん患者における養子Ｔ細胞療法は、現在、いくつかの施設において研究されている。しかしながら、現在まで、注入されたＴ細胞の生存率が低く、Ｔ細胞を機能不全にする、腫瘍細胞によって放出された免疫抑制因子に対抗することができないため、臨床結果は期待外れであった。腫瘍反応性リンパ球が埋め込まれた複数の足場は、卵巣がん患者の腹膜腔内に腹腔鏡下で移植され得、そこでこれらは、長期間にわたって腫瘍反応性リンパ球及びＳＴＩＮＧアゴニストを放出する。

【0160】

当業者によって理解されるように、足場は、固形腫瘍、切除不可能な腫瘍細胞に近接して移植され、及び／又は切除後の腫瘍切除床内に移植される。足場は、多数の異なるサイズ及び形状で利用可能であり得、個々の対象の特定の必要性に合うように形状適合性であり得る。特定の実施形態では、足場は、固形腫瘍、切除不可能な腫瘍細胞又は切除されていない腫瘍細胞に近接して（又は物理的に接触して）、超音波誘導を使用して注入される。腫瘍の段階、サイズ又は重症度に応じて、足場に異なる治療強度を提供することができる。治療強度は、足場のサイズ、足場の体積、足場内に埋め込まれたリンパ球の数、足場内のリンパ球活性化部分の数、足場内のＳＴＩＮＧアゴニストの存在又は量などを変更することによって操作され得る。これらのパラメータの各々は、治療する医師によって評価され、決定され得る。

【0161】

本開示の目的のために、「近接」という用語は、固形腫瘍、切除不可能な腫瘍、切除不可能な腫瘍細胞及び／又は腫瘍切除床から１０ｃｍ以内、９ｃｍ以内、８ｃｍ以内、７ｃｍ以内、６ｃｍ以内、５ｃｍ以内、４ｃｍ以内、３ｃｍ以内、２ｃｍ以内、１ｃｍ以内、０．９ｃｍ以内、０．８ｃｍ以内、０．７ｃｍ以内、０．６ｃｍ以内、０．５ｃｍ以内、０．４ｃｍ以内、０．３ｃｍ以内、０．２ｃｍ以内又は０．１ｃｍ以内の距離を指す。

【0162】

また、足場は、固形腫瘍、切除不可能な腫瘍、切除不可能な腫瘍細胞及び／又は腫瘍切除床を有する対象に、切除時又は最初の治療時に１回だけ移植され得ることも当業者に理解される。さらに、足場は、数ヶ月又は数年にわたって継続的な療法を提供するために複数回移植され得る。このような治療レジメンは、治療する医師によって決定され得る。

【0163】

特定の実施形態では、ＴＦＮマイクロメッシュを含むリンパ球足場は、長時間作用する足場として使用され得る（例えば、図１２Ｉを参照のこと）。ＴＦＮマイクロメッシュは非生分解性足場マトリックス材料として使用され得、したがってＴＦＮマイクロメッシュベースのリンパ球足場は、数日間、１週間より長い間及び／又は２週間より長い間、リンパ球を送達し続けることができる。

【0164】

本明細書に使用される場合、「外科治療の失敗」という用語は、以前に腫瘍切除を受けた対象におけるがんの再発を指す。外科治療の失敗は転移性再発を含み得る。

【0165】

以下の実施例及び例示的な実施形態は、本開示の特定の実施形態を実証するために含まれる。当業者は、本開示の観点から、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される特定の実施形態に対して多くの変更がなされてもよく、それでも同様又は類似の結果を得ることができることを認識すべきである。

【0166】

例示的な実施形態。
１．（ｉ）マイクロパターン化金属薄膜を含む足場マトリックス内に配置された遺伝的に再プログラムされたリンパ球、及び（ｉｉ）リンパ球活性化部分を含むリンパ球足場。
２．ＳＴＩＮＧアゴニストをさらに含む、実施形態１に記載のリンパ球足場。
３．ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＧＭＰ、ｃ－ｄｉＡＭＰ、ｃ－ＧＡＭＰ、ｃ－ＡＩＭＰ、（３’，２’）ｃ－ＡＩＭＰ、（２’，２’）ｃ－ＡＩＭＰ、（２’，３’）ｃ－ＡＩＭＰ、ｃ－ＡＩＭＰ（Ｓ）、ｃ－（ｄＡＭＰ－ｄＩＭＰ）、ｃ－（ｄＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、ｃ－（２’ＦｄＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、（２’，３’）ｃ－（ＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、ｃ－［２’ＦｄＡＭＰ（Ｓ）－２’ＦｄＩＭＰ（Ｓ）］、ｃ－［２’ＦｄＡＭＰ（Ｓ）－２’ＦｄＩＭＰ（Ｓ）］（ＰＯＭ）２及び／又はＤＭＸＡＡを含む、実施形態２に記載のリンパ球足場。
４．ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＧＭＰを含む、実施形態２に記載のリンパ球足場。
５．薬物溶出ポリマーをさらに含む、実施形態１～４のいずれかに記載のリンパ球足場。
６．ＳＴＩＮＧアゴニストが、薬物溶出ポリマー内に埋め込まれている、実施形態５に記載のリンパ球足場。
７．薬物溶出ポリマーがＰＬＧＡを含む、実施形態５又は６に記載のリンパ球足場。
８．リンパ球が、Ｔ細胞及び／又はナチュラルキラー細胞を含む、実施形態１～７のいずれかに記載のリンパ球足場。
９．リンパ球が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態１～８のいずれかに記載のリンパ球足場。
１０．少なくとも２×１０^６個のリンパ球を含む、実施形態１～９のいずれかに記載のリンパ球足場。
１１．少なくとも７×１０^６個のリンパ球を含む、実施形態１～９のいずれかに記載のリンパ球足場。
１２．リンパ球活性化部分が、ＩＬ－１５、又はＣＤ３、ＣＤ２８若しくはＣＤ１３７に特異的な抗体のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１～１１のいずれかに記載のリンパ球足場。
１３．リンパ球活性化部分が、ＣＤ３、ＣＤ１２８及びＣＤ１３７に特異的な抗体を含む、実施形態１～１２のいずれかに記載のリンパ球足場。
１４．リンパ球活性化部分が、ＩＬ－１５及びＣＤ１３７を含む、実施形態１～１３のいずれかに記載のリンパ球足場。
１５．免疫刺激剤をさらに含む、実施形態１～１４のいずれかに記載のリンパ球足場。
１６．免疫刺激剤が、サイトカイン、抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ及び／又はワクチンアジュバントである、実施形態１５に記載のリンパ球足場。
１７．免疫刺激剤が、（ｉ）ＣｐＧ、Ｃｐｇ－２８、ポリ（Ｉ：Ｃ）、α－ガラクトセラミド、ＭＰＬＡ、ＶＴＸ－２３３７、ＥＭＤ１２０１０８１）イミキモド、ＭＧＮ１７０３、Ｇ１００、ＣＢＬＢ５０２、ヒルトノール及びイミキモドから選択されるＴｏｌｌ様受容体リガンド並びに／又は（ｉｉ）１７－ジメチルアミノエチルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン）から選択される、実施形態１５に記載のリンパ球足場。
１８．免疫刺激剤が、薬物溶出ポリマー内に埋め込まれている、実施形態１５～１７のいずれかに記載のリンパ球足場。
１９．リンパ球接着部分をさらに含む、実施形態１～１８のいずれかに記載のリンパ球足場。
２０．リンパ球接着部分及びリンパ球活性化部分が、共有結合している、実施形態１９に記載のリンパ球足場。
２１．リンパ球接着部分がフィブリンを含む、実施形態１９又は２０に記載のリンパ球足場。
２２．リンパ球接着部分が、α１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン又はリンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ－１）に結合するペプチドを含む、実施形態１９～２１のいずれかに記載のリンパ球足場。
２３．リンパ球接着部分が、ＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドを含む、実施形態１９～２２のいずれかに記載のリンパ球足場。
２４．リンパ球接着部分が、配列番号１又は配列番号２のＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドを含む、実施形態１９～２３のいずれかに記載のリンパ球足場。
２５．リンパ球接着部分が、ＩＣＡＭ－１ペプチドを含む、実施形態１９～２４のいずれかに記載のリンパ球足場。
２６．リンパ球接着部分が、配列番号３のＩＣＡＭ－１ペプチドを含む、実施形態１９～２５のいずれかに記載のリンパ球足場。
２７．リンパ球接着部分が、ＦＮＩＩＩ_７～１０ペプチドを含む、実施形態１９～２６のいずれかに記載のリンパ球足場。
２８．リンパ球接着部分が、配列番号４のＦＮＩＩＩ_７～１０ペプチドを含む、実施形態１９～２７のいずれかに記載のリンパ球足場。
２９．ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又はリンパ球活性化部分が、足場マトリックスと連結している、実施形態２～２８のいずれかに記載のリンパ球足場。
３０．ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又はリンパ球活性化部分が、足場マトリックス内に埋め込まれている、実施形態２～２９のいずれかに記載のリンパ球足場。
３１．ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又はリンパ球活性化部分が、足場マトリックスの表面の少なくとも一部を覆う生物活性コーティング内にある、実施形態２～３０のいずれかに記載のリンパ球足場。
３２．生物活性コーティングが、薬物溶出ポリマーを含む、実施形態３１に記載のリンパ球足場。
３３．リンパ球接着部分をさらに含み、ＳＴＩＮＧアゴニストが薬物溶出ポリマー内にあり、薬物溶出ポリマーが足場マトリックスの表面上に単層を形成し、リンパ球接着部分が薬物溶出ポリマーを直接コーティングしている、実施形態３２に記載のリンパ球足場。
３４．ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又はリンパ球活性化部分が、粒子と連結している、実施形態２～３３のいずれかに記載のリンパ球足場。
３５．粒子が、足場と連結しており、及び／又は足場マトリックス内に埋め込まれている、実施形態３４に記載のリンパ球足場。
３６．ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又はリンパ球活性化部分が、原細胞のリポソームと結合している、実施形態２～３５のいずれかに記載のリンパ球足場。
３７．原細胞と足場マトリックス内のリンパ球との比が、０．５：１、１：１、５：１又は１０：１である、実施形態３６のリンパ球足場。
３８．７×１０^６個～１×１０^１０個の原細胞を含む、実施形態１～３７のいずれかに記載のリンパ球足場。
３９．マイクロパターン化金属薄膜が、ＴＦＮマイクロメッシュを含む、実施形態１～３８のいずれかに記載のリンパ球足場。
４０．足場マトリックス、遺伝的に再プログラムされたリンパ球及び３つのリンパ球活性化部分からなる、リンパ球足場。
４１．足場マトリックスが、アルギネート足場、コラーゲン／アルギネート足場、キトサン足場、自己集合ペプチド足場、メソ多孔質シリカ足場、マイクロパターン化金属薄膜足場又はＰＬＧＡ足場を含む、実施形態４０に記載のリンパ球足場。
４２．マイクロパターン化金属薄膜足場が、ＴＦＮマイクロメッシュ足場を含む、実施形態４０又は４１に記載のリンパ球足場。
４３．足場マトリックスが、アルギネート足場を含む、実施形態４０～４２のいずれかに記載のリンパ球足場。
４４．足場マトリックスが、ポリマーカルシウム架橋アルギネート足場を含む、実施形態４０～４３のいずれかに記載のリンパ球足場。
４５．遺伝的に再プログラムされたリンパ球が、遺伝的に再プログラムされたＴ細胞及び／又はナチュラルキラー細胞である、実施形態４０～４４のいずれかに記載のリンパ球足場。
４６．遺伝的に再プログラムされたリンパ球が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態４０～４５のいずれかに記載のリンパ球足場。
４７．少なくとも２×１０^６個の遺伝的に再プログラムされたリンパ球を含む、実施形態４０～４６のいずれかに記載のリンパ球足場。
４８．少なくとも７×１０^６個の遺伝的に再プログラムされたリンパ球を含む、実施形態４０～４６のいずれかに記載のリンパ球足場。
４９．リンパ球活性化部分が、ＣＤ３、ＣＤ２８及び／又はＣＤ１３７に特異的な抗体を含む、実施形態４０～４８のいずれかに記載のリンパ球足場。
５０．リンパ球活性化部分が、足場と連結している、実施形態４０～４９のいずれかに記載のリンパ球足場。
５１．リンパ球活性化部分が、足場内に埋め込まれている、実施形態４０～５０のいずれかに記載のリンパ球足場。
５２．足場マトリックス、遺伝的に再プログラムされたリンパ球、及びリンパ球活性化部分を含むリンパ球足場。
５３．ＳＴＩＮＧアゴニストをさらに含む、実施形態５２に記載のリンパ球足場。
５４．ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＧＭＰ、ｃ－ｄｉＡＭＰ、ｃ－ＧＡＭＰ、ｃ－ＡＩＭＰ、（３’，２’）ｃ－ＡＩＭＰ、（２’，２’）ｃ－ＡＩＭＰ、（２’，３’）ｃ－ＡＩＭＰ、ｃ－ＡＩＭＰ（Ｓ）、ｃ－（ｄＡＭＰ－ｄＩＭＰ）、ｃ－（ｄＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、ｃ－（２’ＦｄＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、（２’，３’）ｃ－（ＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、ｃ－［２’ＦｄＡＭＰ（Ｓ）－２’ＦｄＩＭＰ（Ｓ）］、ｃ－［２’ＦｄＡＭＰ（Ｓ）－２’ＦｄＩＭＰ（Ｓ）］（ＰＯＭ）２及び／又はＤＭＸＡＡを含む、実施形態５３に記載のリンパ球足場。
５５．ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＧＭＰを含む、実施形態５２又は５３に記載のリンパ球足場。
５６．遺伝的に再プログラムされたリンパ球が、遺伝的に再プログラムされたＴ細胞及び／又はナチュラルキラー細胞である、実施形態５２～５５のいずれかに記載のリンパ球足場。
５７．遺伝的に再プログラムされたリンパ球が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態５２～５６のいずれかに記載のリンパ球足場。
５８．少なくとも２×１０^６個又は少なくとも７×１０^６個の遺伝的に再プログラムされたリンパ球を含む、実施形態５２～５７のいずれかに記載のリンパ球足場。
５９．リンパ球活性化部分が、ＩＬ－１５並びに／又はＣＤ３、ＣＤ２８及び／若しくはＣＤ１３７に特異的な抗体を含む、実施形態５２～５８のいずれかに記載のリンパ球足場。
６０．免疫刺激剤をさらに含む、実施形態５２～５９のいずれかに記載のリンパ球足場。
６１．免疫刺激剤が、サイトカイン、抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ及び／又はワクチンアジュバントを含む、実施形態６０に記載のリンパ球足場。
６２．免疫刺激剤が、（ｉ）ＣｐＧ、Ｃｐｇ－２８、ポリ（Ｉ：Ｃ）、α－ガラクトセラミド、ＭＰＬＡ、ＶＴＸ－２３３７、ＥＭＤ１２０１０８１）イミキモド、ＭＧＮ１７０３、Ｇ１００、ＣＢＬＢ５０２、ヒルトノール及びイミキモドから選択されるＴｏｌｌ様受容体リガンド並びに／又は（ｉｉ）１７－ジメチルアミノエチルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン）を含む、実施形態６０又は６１に記載のリンパ球足場。
６３．リンパ球接着部分をさらに含む、実施形態５２～６２のいずれかに記載のリンパ球足場。
６４．リンパ球接着部分がフィブリンを含む、実施形態６３に記載のリンパ球足場。
６５．リンパ球接着部分が、α１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン又はリンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ－１）に結合するペプチドを含む、実施形態６３又は６４に記載のリンパ球足場。
６６．リンパ球接着部分が、ＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドを含む、実施形態６３～６５のいずれかに記載のリンパ球足場。
６７．リンパ球接着部分が、配列番号１又は配列番号２のＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドを含む、実施形態６３～６６のいずれかに記載のリンパ球足場。
６８．リンパ球接着部分が、ＩＣＡＭ－１ペプチドを含む、実施形態６３～６７のいずれかに記載のリンパ球足場。
６９．リンパ球接着部分が、配列番号３のＩＣＡＭ－１ペプチドを含む、実施形態６３～６８のいずれかに記載のリンパ球足場。
７０．リンパ球接着部分が、ＦＮＩＩＩ_７～１０ペプチドを含む、実施形態６３～６９のいずれかに記載のリンパ球足場。
７１．リンパ球接着部分が、配列番号４のＦＮＩＩＩ_７～１０ペプチドを含む、実施形態６３～７０のいずれかに記載のリンパ球足場。
７２．ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又はリンパ球活性化部分が、足場マトリックスと連結している、実施形態５３～７１のいずれかに記載のリンパ球足場。
７３．ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又はリンパ球活性化部分が、足場マトリックス内に埋め込まれている、実施形態５３～７２のいずれかに記載のリンパ球足場。
７４．ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又はリンパ球活性化部分が、足場マトリックスの表面の少なくとも一部を覆う生物活性コーティング内にある、実施形態５３～７３のいずれかに記載のリンパ球足場。
７５．ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又はリンパ球活性化部分が、粒子と連結している、実施形態５３～７４のいずれかに記載のリンパ球足場。
７６．粒子が、足場マトリックスと連結している及び／又は足場マトリックス内に埋め込まれている、実施形態７５に記載のリンパ球足場。
７７．ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又はリンパ球活性化部分が、原細胞のリポソームと結合している、実施形態５３～７６のいずれかに記載のリンパ球足場。
７８．原細胞と足場マトリックス内のリンパ球との比が、０．５：１、１：１、５：１又は１０：１である、実施形態７７のリンパ球足場。
７９．７×１０^６個～１×１０^１０個の原細胞を含む、実施形態５３～７８のいずれかに記載のリンパ球足場。
８０．足場マトリックスが、アルギネート足場、コラーゲン／アルギネート足場、キトサン足場、自己集合ペプチド足場、メソ多孔質シリカ足場、マイクロパターン化金属薄膜足場又はＰＬＧＡ足場を含む、実施形態５２～７９のいずれかに記載のリンパ球足場。
８１．マイクロパターン化金属薄膜足場が、ＴＦＮマイクロメッシュ足場を含む、実施形態８０に記載のリンパ球足場。
８２．足場マトリックスが、アルギネート足場を含む、実施形態８０又は８１に記載のリンパ球足場。
８３．足場マトリックスが、ポリマーカルシウム架橋アルギネート足場を含む、実施形態８０～８２のいずれかに記載のリンパ球足場。
８４．（ｉ）足場マトリックス材料、（ｉｉ）抗がん活性を有するナチュラルキラー細胞並びに（ｉｉｉ）ＩＬ－１５、及びＣＤ１３７に特異的な抗体を含むリンパ球活性化部分を含むリンパ球足場。
８５．足場マトリックス材料が、マイクロパターン化金属薄膜を含む、実施形態８４に記載のリンパ球足場。
８６．マイクロパターン化金属薄膜が、ＴＦＮマイクロメッシュを含む、実施形態８４又は８５に記載のリンパ球足場。
８７．ＳＴＩＮＧアゴニストをさらに含む、実施形態８４～８６のいずれかに記載のリンパ球足場。
８８．ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＧＭＰ、ｃ－ｄｉＡＭＰ、ｃ－ＧＡＭＰ、ｃ－ＡＩＭＰ、（３’，２’）ｃ－ＡＩＭＰ、（２’，２’）ｃ－ＡＩＭＰ、（２’，３’）ｃ－ＡＩＭＰ、ｃ－ＡＩＭＰ（Ｓ）、ｃ－（ｄＡＭＰ－ｄＩＭＰ）、ｃ－（ｄＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、ｃ－（２’ＦｄＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、（２’，３’）ｃ－（ＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、ｃ－［２’ＦｄＡＭＰ（Ｓ）－２’ＦｄＩＭＰ（Ｓ）］、ｃ－［２’ＦｄＡＭＰ（Ｓ）－２’ＦｄＩＭＰ（Ｓ）］（ＰＯＭ）２及び／又はＤＭＸＡＡを含む、実施形態１１３に記載のリンパ球足場。
８９．薬物溶出ポリマーをさらに含む、実施形態８４～８８のいずれかに記載のリンパ球足場。
９０．薬物溶出ポリマーがＰＬＧＡを含む、実施形態８９に記載のリンパ球足場。
９１．ＳＴＩＮＧアゴニストが、薬物溶出ポリマー内に埋め込まれている、実施形態８７又は８８に記載のリンパ球足場。
９２．リンパ球接着部分をさらに含む、実施形態８４～９１のいずれかに記載のリンパ球足場。
９３．リンパ球接着部分がフィブリンを含む、実施形態９２に記載のリンパ球足場。
９４．リンパ球接着部分が、α１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン又はリンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ－１）に結合するペプチドを含む、実施形態９２又は９３に記載のリンパ球足場。
９５．リンパ球接着部分が、ＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドを含む、実施形態９２～９４のいずれかに記載のリンパ球足場。
９６．リンパ球接着部分が、配列番号１又は配列番号２のＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドを含む、実施形態９２～９５のいずれかに記載のリンパ球足場。
９７．リンパ球接着部分が、ＩＣＡＭ－１ペプチドを含む、実施形態８４～９６のいずれかに記載のリンパ球足場。
９８．リンパ球接着部分が、配列番号３のＩＣＡＭ－１ペプチドを含む、実施形態８４～９７のいずれかに記載のリンパ球足場。
９９．リンパ球接着部分が、ＦＮＩＩＩ_７～１０ペプチドを含む、実施形態８４～９８のいずれかに記載のリンパ球足場。
１００．リンパ球接着部分が、配列番号４のＦＮＩＩＩ_７～１０ペプチドを含む、実施形態８４～９９のいずれかに記載のリンパ球足場。
１０１．対象におけるエスケープバリアント腫瘍細胞を含む不均一な固形腫瘍を治療する方法であって、対象における不均一な固形腫瘍の破壊を導くのに十分な不均一な固形腫瘍細胞の近位内に、実施形態１～１００のいずれかに記載のリンパ球足場を対象に移植し、それによってエスケープバリアント腫瘍細胞を含む不均一な固形腫瘍を治療するステップを含む、方法。
１０２．がん再発の発生に対して対象にワクチン接種をする方法であって、実施形態１～１００のいずれかに記載のリンパ球足場を、対象の不均一な固形腫瘍の近位内に、又は対象の固形腫瘍切除床内に移植し、それによってがん再発の発生に対して対象にワクチン接種をするステップを含む、方法。
１０３．腫瘍細胞の治療を必要とする対象において腫瘍細胞を治療する方法であって、実施形態１～１００のいずれかに記載のリンパ球足場を、腫瘍切除床内で対象に移植し、それによって対象において腫瘍細胞を治療するステップを含む、方法。
１０４．治療される腫瘍細胞が、副腎がん細胞、脳がん細胞、乳がん細胞、子宮頸がん細胞、結腸がん細胞、大腸がん細胞、耳、鼻及び咽喉（ＥＮＴ）がん細胞、子宮内膜がん細胞、食道がん細胞、消化管がん細胞、グリオーマ細胞、頭頸部がん細胞、腸がん細胞、腎臓がん細胞、肝臓がん細胞、肺がん細胞、リンパ節がん細胞、黒色腫細胞、神経芽腫細胞、卵巣がん細胞、膵臓がん細胞、前立腺がん細胞、直腸がん細胞、セミノーマ細胞、皮膚がん細胞、胃がん細胞、奇形腫細胞、甲状腺がん細胞又は子宮がん細胞である、実施形態１０３に記載の方法。
１０５．治療される腫瘍細胞が、膠芽腫細胞、膵臓腺がん細胞又は卵巣がん細胞である、実施形態１０３に記載の方法。
１０６．原発腫瘍の切除後、転移性再発によって引き起こされる外科治療の失敗を低減させる方法であって、実施形態１～１００のいずれかに記載のリンパ球足場を対象の腫瘍切除床に投与し、それによって原発腫瘍の切除後、転移性再発によって引き起こされる外科治療の失敗を低減させるステップを含む、方法。
１０７．原発腫瘍が、セミノーマ細胞、黒色腫細胞、奇形腫細胞、神経芽腫細胞、グリオーマ細胞、直腸がん細胞、子宮内膜がん細胞、腎臓がん細胞、副腎がん細胞、甲状腺がん細胞、皮膚がん細胞、脳がん細胞、子宮頸がん細胞、腸がん細胞、肝臓がん細胞、結腸がん細胞、胃がん細胞、頭頸部がん細胞、消化管がん細胞、リンパ節がん細胞、食道がん細胞、大腸がん細胞、膵臓がん細胞、耳、鼻及び咽喉（ＥＮＴ）がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、子宮がん細胞、卵巣がん細胞又は肺がん細胞を含む、実施形態１０６に記載の方法。
１０８．がんについて対象を治療する方法であって、ＴＦＮマイクロメッシュ、遺伝的に修飾されたリンパ球、及びリンパ球活性化部分を含むリンパ球足場によりコーティングされた医療装置を対象に移植するステップを含む、方法。
１０９．移植するステップが、低侵襲性処置を含む、実施形態１０８に記載の方法。
１１０．医療装置が、ステントを含む、実施形態１０８に記載の方法。
１１１．対象における固形腫瘍を治療するためのリンパ球足場を形成するためのキットであって、（ｉ）足場マトリックス、及び（ｉｉ）ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７に特異的な抗体を含むリンパ球活性化部分を含む、キット。
１１２．多孔質粒子をさらに含む、実施形態１１１に記載のキット。
１１３．リポソームをさらに含む、実施形態１１１又は１１２に記載のキット。
１１４．原細胞をさらに含む、実施形態１１１～１１３のいずれかに記載のキット。
１１５．ＳＴＩＮＧアゴニストをさらに含む、実施形態１１１～１１４のいずれかに記載のキット。
１１６．ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＧＭＰ、ｃ－ｄｉＡＭＰ、ｃ－ＧＡＭＰ、ｃ－ＡＩＭＰ、（３’，２’）ｃ－ＡＩＭＰ、（２’，２’）ｃ－ＡＩＭＰ、（２’，３’）ｃ－ＡＩＭＰ、ｃ－ＡＩＭＰ（Ｓ）、ｃ－（ｄＡＭＰ－ｄＩＭＰ）、ｃ－（ｄＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、ｃ－（２’ＦｄＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、（２’，３’）ｃ－（ＡＭＰ－２’ＦｄＩＭＰ）、ｃ－［２’ＦｄＡＭＰ（Ｓ）－２’ＦｄＩＭＰ（Ｓ）］、ｃ－［２’ＦｄＡＭＰ（Ｓ）－２’ＦｄＩＭＰ（Ｓ）］（ＰＯＭ）２及び／又はＤＭＸＡＡを含む、実施形態１１５に記載のキット。
１１７．ＳＴＩＮＧアゴニストが、ｃ－ｄｉＧＭＰを含む、実施形態１１５に記載のキット。
１１８．免疫刺激剤をさらに含む、実施形態１１１～１１７のいずれかに記載のキット。
１１９．免疫刺激剤が、サイトカイン、抗体、小分子、ｓｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ及び／又はワクチンアジュバントを含む、実施形態１１８に記載のキット。
１２０．免疫刺激剤が、（ｉ）ＣｐＧ、Ｃｐｇ－２８、ポリ（Ｉ：Ｃ）、α－ガラクトセラミド、ＭＰＬＡ、ＶＴＸ－２３３７、ＥＭＤ１２０１０８１）イミキモド、ＭＧＮ１７０３、Ｇ１００、ＣＢＬＢ５０２、ヒルトノール及びイミキモドから選択されるＴｏｌｌ様受容体リガンド並びに／又は（ｉｉ）１７－ジメチルアミノエチルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン）を含む、実施形態１１８又は１１９に記載のキット。
１２１．リンパ球接着部分をさらに含む、実施形態１１１～１２０のいずれかに記載のキット。
１２２．リンパ球接着部分がフィブリンを含む、実施形態１２１に記載のキット。
１２３．リンパ球接着部分が、α１β１インテグリン、α２β１インテグリン、α４β１インテグリン、α５β１インテグリン又はリンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ－１）に結合するペプチドを含む、実施形態１２１又は１２２に記載のキット。
１２４．リンパ球接着部分が、ＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドを含む、実施形態１２１～１２３のいずれかに記載のキット。
１２５．リンパ球接着部分が、配列番号１又は配列番号２のＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドを含む、実施形態１２１～１２４のいずれかに記載のキット。
１２６．リンパ球接着部分が、ＩＣＡＭ－１ペプチドを含む、実施形態１２１～１２５のいずれかに記載のキット。
１２７．リンパ球接着部分が、配列番号３のＩＣＡＭ－１ペプチドを含む、実施形態１２１～１２６のいずれかに記載のキット。
１２８．リンパ球接着部分が、ＦＮＩＩＩ_７～１０ペプチドを含む、実施形態１２１～１２７のいずれかに記載のキット。
１２９．リンパ球接着部分が、配列番号４のＦＮＩＩＩ_７～１０ペプチドを含む、実施形態１２１～１２８のいずれかに記載のキット。
１３０．７×１０^６～１×１０^１０個の粒子、リポソーム又は原細胞を含む、実施形態１１１～１２９のいずれかに記載のキット。
１３１．遺伝的に再プログラムされたリンパ球をさらに含む、実施形態１１１～１３０のいずれかに記載のキット。
１３２．遺伝的に再プログラムされたリンパ球が、Ｔ細胞及び／又はナチュラルキラー細胞を含む、実施形態１３１に記載のキット。
１３３．遺伝的に再プログラムされたリンパ球が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、実施形態１３１又は１３２に記載のキット。
１３４．リンパ球が、少なくとも７×１０^６個のリンパ球を含む、実施形態１３１～１３３のいずれかに記載のキット。
１３５．足場マトリックスが、アルギネート、コラーゲン、キトサン、自己集合ペプチド、メソ多孔質シリカ、ＴＦＮマイクロメッシュ又はＰＬＧＡを含む、実施形態１３１～１３４のいずれかに記載のキット。
１３６．足場マトリックスが、アルギネートを含む、実施形態１３５に記載のキット。
１３７．カルシウムをさらに含む、実施形態１１１～１３６のいずれかに記載のキット。
１３８．薬物溶出ポリマーをさらに含む、実施形態１１１～１３７のいずれかに記載のキット。
１３９．薬物溶出ポリマーが、足場マトリックス上にコーティングされる、実施形態１３８に記載のキット。
１４０．ＳＴＩＮＧアゴニスト又は免疫刺激剤が、薬物溶出ポリマー内に埋め込まれている、実施形態１３８に記載のキット。
１４１．薬物溶出ポリマーがＰＬＧＡを含む、実施形態１１１～１４０のいずれかに記載のキット。
１４２．（ｉ）マイクロパターン化金属薄膜足場、（ｉｉ）遺伝的に再プログラムされたリンパ球、及び（ｉｉｉ）リンパ球活性化部分を含む、移植可能な医療装置。
１４３．ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又は免疫刺激剤をさらに含む、実施形態１４２に記載の移植可能な医療装置。
１４４．薬物溶出ポリマーをさらに含み、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／又は免疫刺激剤が、薬物溶出ポリマー内に埋め込まれている、実施形態１４３に記載の移植可能な医療装置。
１４５．マイクロパターン化金属薄膜足場が、三次元形状を有する、実施形態１４２～１４４のいずれかに記載の移植可能な医療装置。
１４６．三次元形状が円筒形である、実施形態１４５に記載の移植可能な医療装置。
１４７．ステントを含む、実施形態１４２～１４６のいずれかに記載の移植可能な医療装置。
１４８．低侵襲性医療装置を含む、実施形態１４２～１４７のいずれかに記載の移植可能な医療装置。
１４９．マイクロパターン化金属薄膜足場が、層内に積層される、実施形態１４２～１４８のいずれかに記載の移植可能な医療装置。
１５０．マイクロパターン化金属薄膜が、ＴＦＮマイクロメッシュを含む、実施形態１４２～１４９のいずれかに記載の移植可能な医療装置。
１５１．遺伝的に再プログラムされたリンパ球が、少なくとも細胞７×１０^６個／ｃｍ^３の濃度にて存在する、実施形態１４２～１５０のいずれかに記載の移植可能な医療装置。

【実施例】

【0167】

実施例。方法。ヒト膵管腺がん。ヒト膵臓腺がん（ＰＤＡ、図１）の共焦点イメージングのために、新鮮な腫瘍を、ＰＤＡのための膵臓切除を受けている患者から入手し、この患者は、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＣｅｎｔｅｒにおいてＣａｎｃｅｒ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＣＣ－ＩＲＢ）によって承認された研究プロトコールの下で書面によるインフォームドコンセントを与えられていた。

【0168】

細胞株。Ｓｕｎｉｌ Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ博士（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から提供されたネズミ膵管腺がん細胞株ＫＰＣは、１７週齢におけるトランスジェニックＫＰＣ（ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３ｌｏｘ／＋）マウスの自然発生した膵臓腫瘍に由来した。この細胞株を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び０．０５ｍＭの２－メルカプトエタノールを含むＩＭＤＭ培地中で培養した。Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）Ｅｃｏレトロウイルスパッケージング細胞株（Ｏｒｂｉｇｅｎ）を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン酸塩、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。インビボ生物発光イメージングのために、ＫＰＣ細胞株にホタルルシフェラーゼ（Ｆ－ｌｕｃ）をレトロウイルスによって形質導入した。

【0169】

マウス及びインビボ腫瘍モデル。動物を、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒの動物施設に収容し、これらの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された動物プロトコールの文脈において使用した。膵管腺がんの同所性マウスモデルに関して、１×１０^５個のＫＰＣ腫瘍細胞を、メスのＡｌｂｉｎｏ Ｂ６（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｙｒ＜ｃ－２Ｊ＞）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）における膵頭部に外科的に移植し、治療前の１週間定着させた。図７Ａ、７Ｂに示されるフローサイトメトリー研究において養子導入Ｔ細胞と内因性Ｔ細胞とを区別するために、野生型（ＣＤ４５．２＋）Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した脾細胞からＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。遺伝子導入後、Ｔ細胞を使用して、ｐａｎ白血球マーカーＣＤ４５．１を発現するＢ６．ＳＪＬ－Ｐｔｐｒｃａ Ｐｅｐｃｂ／ＢｏｙＪレシピエントマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を処置した。

【0170】

レトロウイルスベクター及びウイルス産生。ＳＦＧ－ＣＢＲ－ｌｕｃ（コメツキムシ赤色ルシフェラーゼを発現する）及びＳＦＧ－Ｆ－ｌｕｃ（ホタルルシフェラーゼを発現する）は、親切にもＭｉｃｈｅｌ Ｓａｄｅｌａｉｎ博士（Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ－Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によって提供された。レトロウイルスベクターｐＦｂ－ｃｈＮＫＧ２Ｄ－ＩＲＥＳ－Ｎｅｏは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓｅｎｔｍａｎ博士（Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ、ＬｅｂａｎｏｎにおけるＴｈｅ Ｇｅｉｓｅｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）によって提供され、以前に記載されている。Ｚｈａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ １０^６、１５４４～１５５１頁（２００５年）。ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲは、ＣＤ３ζの細胞質部分と融合した全長マウスＮＫＧ２Ｄ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｎｏ．Ｏ５４７０９）を含む。レトロウイルス粒子を生成するために、標準的なリン酸カルシウム法を使用してＰｈｏｅｎｉｘ Ｅｃｏ細胞（１．５×１０^６個／１０ｃｍの培養プレート）に１０μｇのベクターＤＮＡを一晩トランスフェクトした；翌日、これらを１０ｍＬの新鮮なＤＭＥＭ中でさらに１日の間インキュベートし、その後、レトロウイルス上清を濾過し（０．４５μｍ、Ｎａｌｇｅｎｅ）、Ｕｌｔｒａｃｅｌ １００Ｋ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１０倍濃縮した。

【0171】

腫瘍ターゲティングリンパ球の調製。膵臓がん特異的（ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ形質導入）Ｔ細胞を生成するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓を回収し、フィルター上で柔らかくし、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）に再懸濁した。エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞を、１ｎｇ／ｍＬのインターロイキン－７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及び２μｇ／ｍＬのＣｏｎｃａｖａｌｉｎ Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含む完全ＲＰＭＩ １６４０中で脾細胞（３×１０^６個／ｍＬ）を３７℃にてインキュベートすることによって調製した。２日後、死細胞をＦｉｃｏｌｌ勾配分離（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって除去し、ＣＤ８＋細胞を、マウスＣＤ８ネガティブ単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲのＴ細胞への導入は、レトロウイルス形質導入によって実施した。濃縮したＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ発現レトロウイルス（１ｍＬ）を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（ＴａｋｉｒａＢｉｏ）によりコーティングした６ウェルの非組織培養処理皿上に予め負荷し、３７℃にて１時間インキュベートした。等体積の単離されたＴ細胞（１０ｎｇのｍＩＬ－２／ｍＬを補足した３×１０^６個／ｍＬの細胞）を添加し、２０００×ｇにて３０分間遠心分離した）。スピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）の６時間後、１０ｎｇのｍＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含有する１ｍＬの新鮮な予め温めたＲＰＭＩを添加した。感染の２日後、形質導入された初代Ｔ細胞（０．５～１×１０個／ｍＬ）を、Ｇ４１８（０．５ｍｇ／ｍＬ）＋２５Ｕ／ｍＬの組換えヒト（ｒＨｕ）ＩＬ－２を含有するＲＰＭＩ－１０培地中でさらに３日間選択した。生存細胞を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０８３（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して単離し、養子導入前にＧ４１８なしで２日間増殖させた。生物発光Ｔ細胞イメージング実験のために、標的化Ｔ細胞を、コメツキムシ赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ－ｌｕｃ）により遺伝的にタグ化した。Ｄｏｂｒｅｎｋｏｖら、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ４９、１１６２～１１７０頁（２００８年）。このスピノキュレーションの６時間後、５０ＩＵのＩＬ－２を含有する１ｍＬのＲＰＭＩを添加し、形質導入されたＴ細胞を１日後、実験のために使用した。

【0172】

刺激性脂質によりコーティングしたシリカミクロスフェアの調製。マレイミドにより機能化した脂質膜の調製。脂質ストック溶液をクロロホルム中で製剤化した。１４０ｍＬのＤＯＰＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）、３０ｍＬのＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）マレイミド（５ｍｇ／ｍＬ）、１５０ｍＬのコレステロール（５ｍｇ／ｍＬ）及び５０ｍＬの１８：１のＰＥＧ２０００－ＰＥ（５ｍｇ／ｍＬ、全てＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入した）を合わせて、５５：５：３０：１０のＤＯＰＣ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）マレイミド：コレステロール：ＰＥＧ２０００－ＰＥ質量比及び２．５ｍｇの総脂質を得た。クロロホルムを窒素ストリーム下で蒸発させ、残留溶媒を真空下で一晩除去した。

【0173】

シリカ微粒子のアミン修飾。５００ｍｇの球状シリカゲル（粒径１５μｍ、孔径１００Å、Ｓｏｒｂｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３－［２－（２－アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリメトキシシラン（ＡＥＰＴＭＳ）のエタノール中２５％溶液４ｍＬに懸濁し、次いで室温にて５時間穏やかに混合した。未反応のＡＥＰＴＭＳを、遠心分離（２分、１０００×ｇ）及び上清のデカンテーションによって除去した。アミン修飾シリカをエタノール（４×２ｍＬ）により洗浄し、次いで２日間風乾した。

【0174】

ＳＴＩＮＧアゴニストのメソ多孔質シリカ微粒子への負荷。アミン修飾シリカの１００ｍｇ／ｍＬ懸濁液を、ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製し、この３６０μＬを５００μＬのｃ－ｄｉ－ＧＭＰ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）と合わせ、１時間穏やかにボルテックスし、次いで４００μＬのＰＢＳにより希釈した。

【0175】

シリカへの脂質吸着。４００μＬのＳｉＯ２／ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ懸濁液を２．５ｍｇバッチの脂質膜に添加し、１０分間隔にて１５秒間、合計１時間ボルテックスした。粒子を３５００×ｇにて２分間ペレット化し、ＰＢＳ（２×１ｍＬ）により洗浄し、次いで２５０μＬのＰＢＳに再懸濁した。

【0176】

脂質によりコーティングされた粒子への抗体コンジュゲーション。抗マウスＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）のヒンジ領域ジスルフィド結合を、以前に記載されているようにジチオスレイトール（ＤＴＴ）により選択的に還元した。Ｋｗｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３、１５４７～１５５８頁（２０１３年）。ＤＴＴを脱塩カラムにより除去した後、これらの穏やかに還元された抗体（抗ＣＤ３：２００μｇ；抗ＣＤ２８及びＣＤ１３７：４００μｇ）を２５０μＬのマレイミドにより機能化された粒子に添加し、手短にボルテックスし、その後、２時間回転させ、３５００×ｇにて２分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳ（２×１ｍＬ）により洗浄し、次いで１２５μＬのＰＢＳに懸濁した。

【0177】

足場作製。アルギネート足場は、以前に記載されているように、過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化して、加水分解的に不安定な結合を生じた後、Ｇブロック（≧６０％）が豊富な高分子量（２５０ｋＤａ）の超高純度アルギン酸ナトリウム粉末（Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｎｏｖａ ＵＰ ＭＶＧアルギネート）から産生した。Ｂｏｏｎｔｈｅｅｋｕｌら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６、２４５５～２４６５頁（２００５年）。

【0178】

簡潔に述べると、２００μＬの０．２５％過ヨウ素酸ナトリウムを１０ｍＬの１％アルギネート水溶液に滴下して加え、暗所において２５℃にて５時間撹拌した後、等モルのエチレングリコールにより３０分間撹拌することによって反応をクエンチした。３，５００分子量カットオフを有する膜を使用して、試料を脱イオン水に対して３日間透析し、次いで凍結乾燥した。酸化したアルギネート溶液をＭＥＳ溶液（０．１ＭのＭＥＳ、０．３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）中で再構成し、カルボジイミド化学５１：スルホ－ＮＨＳ、ＥＤＣ（両方ともＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してコラーゲン模倣ペプチド「ＧＦＯＧＥＲ５０」（ＭＩＴ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓの施設から得た）に共有結合によりコンジュゲートさせ、ＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチドを連続的に添加し、２４時間後、溶液を再び透析し（ＭＷＣＯ ２０ｋＤａ透析膜、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、凍結乾燥した。

【0179】

足場を作製するために、アルギネートストックを、ＰＢＳ中２％ｗ／ｖ溶液７ｍＬに再構成し、５５℃に加温した後、水性懸濁液中の７×１０^６個の刺激性ミクロスフェアと混合した。穏やかな架橋を、１．４ｍＬの０．１％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム溶液をボルテックスしながら添加することによって開始し、次いで１５ｍｍの丸いテフロン（登録商標）コーティングされた型１つにつき７００μＬを直ちに移して２ｍｍ厚の足場を形成した。これらを－７８℃にて凍結し、凍結乾燥して多孔質マトリックスを得、これをデシケーター中で４℃にて保存した。

【0180】

足場へのＴ細胞播種。エキソビボ増殖後、４Ｔ１乳房腫瘍抗原に特異的な又はＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたマウスＣＤ８＋エフェクターＴ細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、細胞１４×１０^６個／ｍＬの濃度にてＲＰＭＩを補足していない培地に再懸濁した。５％のＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ Ｆｉｒｍｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した後、５００μＬのこの細胞懸濁液を、２４ウェル組織培養プレート中の各凍結乾燥足場の上に直ちに接種した。細胞を、氷上で３０分間、これらのマトリックスに注入した後、腫瘍切除腔又は腹膜腔に移植した。

【0181】

細胞傷害性アッセイ。Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性活性を、他の箇所に記載されているように、標準的な^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して測定した。Ｅｒｓｋｉｎｅ、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ、ｅ３６８３（２０１２年）。簡潔に述べると、４Ｔ１乳房腫瘍、ＩＤ８－ＶＥＧＦ卵巣腫瘍又はＢ１６Ｆ１０黒色腫対照腫瘍細胞を、３７℃にて１時間、^５１Ｃｒにより標識化し、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩにより洗浄し、１×１０^５個の腫瘍細胞／ｍＬの濃度にて同じ培地に再懸濁した。Ｔ細胞を、９６ウェルプレート（最終体積、２００μＬ）中で種々のエフェクター対標的細胞比にて懸濁液に添加し、３７℃にて４時間インキュベートし、次いで各ウェルからの３０μＬの上清を、Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ ＮＸＴマイクロプレートシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による分析のためにＬｕｍａｐｌａｔｅ－９６マイクロプレート（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に移した。市販のキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してフローサイトメトリーによって測定したＩＦＮ－γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の総数に基づいて、エフェクター細胞数を計算した。

【0182】

インビボ生物発光及びイメージング。ＰＢＳ（１５ｍｇ／ｍＬ）中のＤ－ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を、Ｆ－ｌｕｃ（４Ｔ１乳房腫瘍及びＩＤ８－ＶＥＧＦ卵巣腫瘍のイメージング）及びＣＢＲ－ｌｕｃ４７（Ｔ細胞イメージング）のための基質として使用した。生物発光画像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて収集した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアバージョン４．３．１（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して、１５０ｍｇ／ｋｇの２％イソフルラン（Ｆｏｒａｎｅ、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により麻酔した動物へのＤ－ルシフェリンの腹腔内注射の１０分後にデータを取得（及びその後定量）した。取得時間は１０秒～５分の範囲であった。

【0183】

フローサイトメトリー。抗組換えアネキシンＶ（アポトーシス細胞を定量するために使用される）及びＦＡＣＳＣａｎｔｏ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に使用される他の抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。

【0184】

共焦点顕微鏡。共焦点顕微によって足場を可視化するために、Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ａｎａｓｐｅｃ）を、標準的なＥＤＣ／ＮＨＳ化学を使用してアルギネートにコンジュゲートし、次いで１部のコンジュゲートを９部のＧＦＯＧＥＲ（配列番号１）ペプチド修飾アルギネートと混合して上記のように足場を作製した。Ｔ細胞を、これらの足場に播種する直前に、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＴＭＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により標識化した。移植の３日後、腫瘍切除床をＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）中で急速凍結して凍結切片を生成し、これを２％パラホルムアルデヒドにより固定し、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でマウントし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０ ＮＬＯレーザー走査共焦点顕微鏡により画像化した。

【0185】

統計。Ｔ細胞移動パラメータにおける測定差の統計的有意性を、一元配置分散分析、続いてダネットの比較検定を使用して計算した。生物発光腫瘍及びＴ細胞シグナルにおけるペアワイズ差を、ウィルコクソンの順位和検定を使用して選択した時点において分析し、生存データを、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ検定を使用して特徴付けた。全ての統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６．０を使用して実施した。

【0186】

研究の承認。マウスの実験及び取り扱いは、ＩＡＣＵＣプロトコールの下で、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ＩＡＣＵＣからの承認を得て、連邦、州及び地方のガイドラインの下で行った。

【0187】

結果。腫瘍反応性Ｔ細胞の静脈内注射は、膵管腺がんを除去することができない。臨床的に関連した環境において新しい免疫療法アプローチを試験するために、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３ｌｏｘ／＋（ＫＰＣ）マウスが産生する自然発生膵臓腫瘍に由来する細胞株を使用して、記載されている実験を実施した（Ｈｉｎｇｏｒａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ７、４６９～４８３頁（２００５年））；これは、急速及び予測可能な成長動態を有する膵臓がんの免疫応答性同所性ネズミモデルの作製を可能にした。ＫＰＣ細胞をルシフェラーゼにより遺伝的にタグ化し、それにより腫瘍負荷を、生物発光イメージングを使用して非侵襲的に定量することができるようにした。非ＫＰＣ同腹子の膵臓に同所移植した場合、これらの腫瘍細胞は、遺伝子変異、組織学的外観及び抗原／標的発現の不均一性に関して、ヒト膵臓がんを模倣する病変に再現可能に発達する（図２Ａ～２Ｃ）。

【0188】

膵臓がん特異的リンパ球の従来の静脈内注射は、このＫＰＣモデルにおいて腫瘍を根絶することができないことが最初に確認された。これらのリンパ球を作製するために、マウスＴ細胞に、これらの受容体を発現するＴ細胞によって認識されるＫＰＣ抗原である、Ｒａｅ－１に特異的なキメラナチュラルキラー受容体（ＣＤ３ζ３０の細胞質シグナル伝達ドメインと連結されたＮＫＧ２Ｄを含む；図２Ｄ）をコードするレトロウイルスを形質導入した（図２Ｅ、２Ｆ）。ＫＰＣ腫瘍に関する導入されたＴ細胞のインビボでの移動及び蓄積を追跡及び定量するために、コメツキムシルシフェラーゼのためのベクターをプラスミドに含めた。この結果により、静脈内に注入されたＴ細胞が脾臓及び肝臓において高レベルにて蓄積するが、これらはＫＰＣ腫瘍部位への輸送が非効率的であり（図２Ｇ）、未処置の対照動物と比較して、わずかな４日間の生存の利点を生じることが確立される（図２Ｈ）。さらに、Ｒａｅ－１標的抗原発現レベルは、対照リンパ球と比較した場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞の注入後、ほんの少しだけ低かった（図２Ｉ）。

【0189】

生物活性担体を介した送達は、腫瘍部位におけるＴ細胞の増殖及び機能を実質的に改善するが、抗原陰性腫瘍サブタイプはこれらの細胞による排除を回避する。上記の結果は、膵臓腫瘍部位への腫瘍反応性Ｔ細胞の局所送達のために生体材料を使用する可能性の探求を促し、これらを維持する方法を創出することを促した。腫瘍が切除された場所又は切除されていない場所に（図３Ａ）、外科的に移植され得る再吸収性ポリマー装置に抗がん免疫細胞を埋め込む方法が最近開発され、ＵＳ２０１６／０００８３９９及びＳｔｅｐｈａｎら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３、９７～１０１頁（２０１５年）に記載されている。すでにこれらの標的部位において、送達されたリンパ球は直ちにがん細胞の除去を開始する。多孔質足場は、この非常に優れた生体適合性及び生分解性のために、ＦＤＡによってヒトへの使用が承認されている、キャスティング可能な天然に存在する多糖である、重合アルギネートから作製される。Ｂａｌｄｗｉｎ ＆ Ｋｉｉｃｋ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ９４、１２８～１４０頁（２０１０年）。これらが活性Ｔ細胞のための効率的な送達ビヒクルとして機能することができるように、これらの装置を、移動促進巨大分子（例えば、コラーゲン模倣ペプチド）及び刺激合図（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ１３７抗体を提示する埋め込まれた微粒子；図３Ａ）により増強した。ルシフェラーゼ発現ＫＰＣ腫瘍細胞を導入してから１０日後、７×１０^６個のＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ＋Ｔ細胞を含有する足場を、得られた膵臓腫瘍の上に直接移植した（図３Ｂ）。第２の群は腫瘍に直接注射された同じ用量の細胞を受け、対照マウスは処置を受けなかった。生物発光イメージングを使用して腫瘍成長を定量し、並行実験において、リンパ球の組織分布、増殖及び持続性を追跡した。膵臓腫瘍に直接注射されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、免疫抑制性微小環境ではあまり持続せず、疾患進行において一時的な遅延しか生じなかったことが見出された（未処置の対照群における全生存期間中央値１４．５日と比較して２１日、図４Ａ～４Ｄ）。対照的に、移植された足場から送達されたＴ細胞は、腫瘍部位において有意に増殖し（８日目に注射されたＴ細胞と比較して１６６倍高いピーク光子計数、Ｐ＜０．０００１、図４Ａ、４Ｂ）、ＫＰＣ腫瘍成長を大幅に低減させた（図４Ａ、４Ｃ）。しかしながら、これらが処置されたマウスの生存率を２倍より多くしたとしても、全てのマウスが最終的にＲａｅ－１低／陰性免疫エスケープバリアントを発生したので、Ｔ細胞を負荷した足場は、疾患を完全に除去することができなかった（図４Ｅ）。

【0190】

足場からのＣＡＲ－Ｔ細胞及びＳＴＩＮＧアゴニストの組合せ放出は、宿主抗原提示細胞の相乗的成熟及び活性化を生じる。上記の観察は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて単一抗原をターゲティングすることが、腫瘍が、移植可能な足場から送達される最適に刺激された抗がんＴ細胞により飽和される場合でさえ、抗原陰性細胞の増殖に対して保護する可能性が低いことを示す。したがって、次に、残存ＣＡＲ耐性腫瘍細胞型を除去する目的のために宿主Ｔ細胞応答を相乗的に開始することを試みた（図５Ａを参照のこと）。無傷の免疫系は効果的な腫瘍特異的応答を生じることができるが、そうするために刺激を必要とする。残念なことに、腫瘍は、これらの流入領域リンパ節に位置する抗原提示細胞の成熟及び活性化を阻害し、それによって腫瘍反応性Ｔ細胞が細胞溶解性エフェクターに分化することを阻止する。この抑制を逆転させること目的として、足場を使用して、腫瘍環境を、抗原提示細胞の動員及び刺激を介してＴ細胞プライミングをより導きやすくするために高い局所濃度の免疫刺激性ＳＴＩＮＧアゴニストサイクリックジＧＭＰ（ｃ－ｄｉＧＭＰ）を達成した（図５Ｂ）。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）及びＴ細胞共刺激分子（例えば、ＣＤ８６）の高発現によって定義される樹状細胞（ＤＣ）は、最も有力な抗原提示細胞であり、適応抗腫瘍免疫応答を組織化することができる。樹立されたＫＰＣ腫瘍に関連する腫瘍関連リンパ節の免疫表現型決定により、これらのＤＣの６％未満（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋としてフローサイトメトリーにおいて認識される）が、ＣＤ８６のこれらの発現によって証明されるように、適切に活性化されたことが明らかになった；ＤＣの大部分は免疫寛容原性であった（ＣＤ８６陰性；図６Ａ）。移植された足場からのｃ－ｄｉＧＭＰのみの放出は、これらのＤＣの大部分によってＣＤ８６及びＭＨＣ－ＩＩ発現を上方制御し、流入領域リンパ節におけるこれらの全体の頻度を３８倍増加させた（図６Ｂ）。ＳＴＩＮＧアゴニストなしで作製したＣＡＲ－Ｔ細胞を負荷した足場の移植後、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８６＋成熟ＤＣの数はわずか（９．４倍）しか増加しなかったが、これらの細胞でのＭＨＣ－ＩＩ発現レベルは、ｃ－ｄｉＧＭＰ処置群と比較して２倍超高かった（図６Ａ、６Ｂ）。移植マトリックスからのｃ－ｄｉＧＭＰ及びＣＡＲ－Ｔ細胞の両方の放出は、活性化ＤＣの頻度の大幅な増加（ｃ－ｄｉＧＭＰ単独と比較して３．７倍高い）によって反映されるＤＣの相乗的活性化を生じた。特に、これらの細胞は高レベルの共刺激分子並びにＭＨＣ－ＩＩを発現し、これらが腫瘍抗原を効果的に交差提示することができ、抗腫瘍Ｔ細胞応答を開始することができることを示す（図６Ｂ）。

【0191】

ＣＡＲ－Ｔ細胞／ＳＴＩＮＧアゴニスト併用療法は、強力な腫瘍特異的宿主リンパ球応答をプライミングする。宿主における腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を測定するために、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）糖タンパク質ｇｐ３３を発現するＫＰＣ膵臓腫瘍モデルを使用した。代用膵臓腫瘍抗原として、このタンパク質は、足場がＣＤ８＋Ｔ細胞の中の四量体陽性細胞の頻度にどのように影響を及ぼすかを分析するためのフローサイトメトリーの使用を可能にした。足場により送達されたＴ細胞と内因性Ｔ細胞とを区別するために、ドナー細胞をＣＤ４５．２マーカーにより遺伝的にタグ化し、ＣＤ４５．１トランスジェニックマウスを宿主として使用した。マウスを、ｃ－ｄｉＧＭＰ、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はこの２つの組合せのいずれかを腫瘍に放出するように操作した生体材料足場により処置した。対照マウスは処置を受けなかった。予想されたように、自然発生的な抗腫瘍Ｔ細胞応答は未処置のマウスにおいてめったに起こらず（図７Ａ）、ｇｐ３３異種抗原のこれらの発現にもかかわらず、ＫＰＣ－ｇｐ３３腫瘍が高度に免疫抑制性であり続けることが確立された。ｃ－ｄｉＧＭＰが負荷された足場又はリンパ球のみにより調製した足場による処置は宿主抗腫瘍Ｔ細胞活性を生じたが、全体的な応答はわずかであった（末梢血ｇｐ３３四量体陽性Ｔ細胞において、それぞれ１．３倍及び２倍の増加した数；図７Ａ、７Ｂ）。対照的に、ｃ－ｄｉＧＭＰ及びＣＡＲ発現Ｔ細胞の併用は相乗的な抗腫瘍応答を誘発し、これはリンパ球のみを放出するインプラントより平均で６．４倍高かった（図７Ａ、７Ｂ）。

【0192】

足場は腫瘍を除去し、転移を排除するのに十分な宿主抗腫瘍免疫を誘発することができる。ＣＡＲプログラムされたＴ細胞と一緒にＳＴＩＮＧアゴニストを同時送達する足場によって提供される抗腫瘍効果を測定するために、同所性ＫＰＣ腫瘍を有するマウスを、ｃ－ｄｉＧＭＰ単独又はｃ－ｄｉＧＭＰ及びＣＡＲ－Ｔ細胞の両方のいずれかにより機能化された足場を使用して処置した；対照マウスは処置を受けなかった。腫瘍成長を連続生物発光イメージングによって定量した。足場からのＣＡＲ－Ｔ細胞及びｃ－ｄｉＧＭＰの組み合わせた放出は、１０匹の処置マウスのうちの４匹においてＫＰＣ腫瘍を根絶し（図８Ａ～８Ｃ）、他の６匹は生存の平均３７日の改善を伴う実質的な腫瘍退縮を示したことが見出された。ＳＴＩＮＧアゴニスト単独は完全なクリアランスを決して生じなかったが、対照群と比較して６日まで生存を増加させた。足場が全体的な抗腫瘍免疫を誘発するかどうかを決定するために、完全な腫瘍退縮を経験した４匹のマウス（図９Ａ、９Ｂ）を、１０^４個のルシフェラーゼ発現ＫＰＣ腫瘍細胞の全身投与により再チャレンジした；腫瘍ナイーブマウスを対照として使用した。次いで生物発光イメージングを使用して、処置群間の肺転移の成長率の差を定量した。この結果により、ＣＡＲ－Ｔ細胞／ＳＴＩＮＧアゴニスト免疫療法により治癒した全てのマウスがこの再チャレンジから完全に防御され、ＫＰＣ細胞が投与された４週間後に測定可能な腫瘍塊はなかったことが確立される。対照的に、対照動物はこれらの肺において転移病巣を急速に形成し、これらの疾患により急速に死亡した（図９Ｂ）。したがって、ＣＡＲプログラムされたＴ細胞及びＳＴＩＮＧアゴニストを使用する適切に処方された併用療法は、局所腫瘍を排除することができ、未処置の遠隔転移を阻止するのに十分に強力な全身性宿主抗腫瘍免疫を誘発することができる。

【0193】

この研究は、迅速な腫瘍クリアランス及び全身性抗腫瘍免疫の両方を達成する、がん療法における新たな概念を実証している。開発された足場は、外科医が、有力なＳＴＩＮＧアゴニストと一緒に抗がんリンパ球を、高い局所濃度にて、かつ長期間にわたって、腫瘍に直接送達することを可能にする。このことは、例えば、膵臓腫瘍手術後の治療成功を最大化するだけでなく、開示された足場を用いた単一の治療が、複雑な第２又は第３の手術、費用のかかる長期の入院、放射線及び化学療法のサイクル並びに高価な緩和ケアから患者を救う可能性が高いので医療費も低減する。より広義には、このプラットフォームは、治療を容易及び安全に固形腫瘍に直接適用するための適切な手段を外科医に提供することによって、広範な影響を及ぼす化学的及び放射線ベースのアプローチから腫瘍特異的免疫療法に最終的に焦点を移すことができる。

【0194】

当業者によって理解されるように、本明細書に開示される各実施形態は、明記しているその特定の要素、ステップ、成分又は構成要素を含むことができ、これらから本質的になることができ、又はこれらからなることができる。本明細書に使用される場合、「含む」という移行語は、含むが、限定されないという意味であり、具体的に記載していない要素、ステップ、成分又は構成要素を多量でさえも含むことを許容している。「からなる」という移行語は、具体的に記載していない要素、ステップ、成分又は構成要素を全て除外する。「から本質的になる」という移行語は、実施形態の範囲を、具体的に記載している要素、ステップ、成分又は構成要素及び実施形態に重大な影響を与えない要素、ステップ、成分又は構成要素に制限する。本明細書に使用される場合、重大な影響とは、本明細書に開示される抗腫瘍活性の少なくとも２つの尺度において、請求されている足場又は方法の抗腫瘍効果の統計的に有意な低下を生じるものである。

【0195】

特に指定しない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量のような性質、反応条件などを表す全数値はいずれの場合も、「約」という用語で修飾されていると理解すべきである。したがって、特に逆の記載がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載されている数値パラメータは概数であり、本発明により獲得しようとする所望の性質に応じて変動することができる。特許請求の範囲への均等論の適用を制限しようとするものではないが、最低限でも、各数値パラメータは少なくとも報告する有効数字を踏まえて通常の丸め方を適用することにより解釈すべきである。さらに明瞭にする必要がある場合には、「約」という用語は明記する数値又は範囲と共に使用するときに当業者が妥当に割り当てる意味であり、すなわち記載値の±２０％、記載値の±１９％、記載値の±１８％、記載値の±１７％、記載値の±１６％、記載値の±１５％、記載値の±１４％、記載値の±１３％、記載値の±１２％、記載値の±１１％、記載値の±１０％、記載値の±９％、記載値の±８％、記載値の±７％、記載値の±６％、記載値の±５％、記載値の±４％、記載値の±３％、記載値の±２％又は記載値の±１％の範囲内までで記載値又は範囲よりも多少大きい又は多少小さい数値又は範囲を意味する。

【0196】

本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは概数であるが、具体例に記載している数値は可能な限り正確に報告する。しかしながら、いかなる数値もこれらのそれぞれの試験測定値に見出される標準偏差により必然的に生じる所定の誤差を内在的に含む。

【0197】

本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）において使用される「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、「この」という用語及び同類の指示語は、本明細書において特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、単数及び複数の両方に対応すると解釈すべきである。本明細書における数値範囲の列挙は、この範囲内に該当する個々の数値を個別に表す省略法として利用する目的に過ぎない。本明細書において特に指定しない限り、個々の数値を本明細書に個別に記載しているものとして本明細書に組み入れる。本明細書において特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、本明細書に記載されている全方法は、任意の適切な順序で実施されてもよい。本明細書に提供されているありとあらゆる例又は例示的文言（例えば「のような」）の使用は、本発明をより明瞭にする目的に過ぎず、この例又は文言がなく請求されている本発明の範囲に制限を加えるものではない。本明細書中のいかなる文言も本発明の実施に不可欠な請求外の要素を表すと解釈すべきではない。

【0198】

本明細書に開示される本発明の択一的要素又は実施形態のグループを、制限として解釈すべきではない。各グループメンバーを個々に又はこのグループの他のメンバー若しくは本明細書に見出される他の要素とのあらゆる組合せにおいて、言及及び請求することができる。便宜及び／又は特許性の理由からあるグループの１つ以上のメンバーをあるグループに組み入れることもできるし、削除することもできることが予測される。あらゆるこのような組み入れ又は削除が行われる場合には、本明細書は変更されているグループを含むものとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲において使用される全マーカッシュグループの文言を満足する。

【0199】

本発明を実施するために本発明者が知る限り最良の形態を含めて、本明細書には、本発明の所定の実施形態が記載されている。当然のことながら、記載されているこれらの実施形態に対する変形も上述の記載を通読後に当業者に明らかとなる。本発明者は、当業者がこのような変形を適宜利用するものと予想し、また、本発明者は、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本発明が実施されることも想定している。したがって、準拠法により許可される範囲において本発明は添付の特許請求の範囲に記載されている主題の全変形及び均等物を含む。さらに、本明細書において特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、上記要素のあらゆる組合せを可能な全てのこの変形として本発明に包含する。

【0200】

さらに、本明細書では随所で特許及び出版物を多数引用している。上記引用文献及び出版物の各々は、これらの全体が参照により本明細書に個々に組み込まれる。

【0201】

終わりに、本明細書に開示される本発明の実施形態は本発明の原理を例証するものであることを理解すべきである。利用され得る他の変更も本発明の範囲内である。したがって、限定するものではないが、例として、本発明の代替構成も本明細書の教示に従って利用され得る。したがって、本発明は厳密に示され、記載されている通りに制限されない。

【0202】

本明細書に示される詳細事項は例示であり、本発明の好ましい実施形態を具体的に説明する目的に過ぎず、本発明の様々な実施形態の原理及び概念的側面の最も有用で理解し易い説明であると考えられるものを提供するために提示しているに過ぎない。この点については、本発明の基本的な理解に必要である以上に詳細に本発明の構成内容を示そうとするものではなく、本発明の複数の形態を実際にどのように具体化できるかは説明を図面及び／又は実施例と勘案することにより当業者に明らかである。

【0203】

以下の実施例において明瞭かつ明確に変更されている場合又はこの意味を適用すると構文の意味が通らない場合若しくは本質的に意味が通らない場合を除き、本開示において使用される定義及び説明は、後続する全構文に適用されるものとする。用語の構文では意味が通らない場合又は本質的に意味が通らない場合には、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第３版又はＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００４年）のような当業者に公知の辞書から定義を参照されたい。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図11H】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図12F】

【図12G】

【図12H】

【図12I】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【配列表】

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