7595883 唾液腺の再生

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-29

(45)【発行日】2024-12-09

(54)【発明の名称】唾液腺の再生

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4178 20060101AFI20241202BHJP

   A61K 31/439 20060101ALI20241202BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20241202BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20241202BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20241202BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241202BHJP

【ＦＩ】

A61K31/4178

A61K31/439

A61K47/36

A61P1/02

A61K47/02

A61P43/00 111

【請求項の数】 43

(21)【出願番号】P 2021555150

(86)(22)【出願日】2019-12-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-17

(86)【国際出願番号】 US2019065415

(87)【国際公開番号】W WO2020123470

(87)【国際公開日】2020-06-18

【審査請求日】2022-12-09

(31)【優先権主張番号】62/777,459

(32)【優先日】2018-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(73)【特許権者】

【識別番号】597138069

【氏名又は名称】ケース ウエスタン リザーブ ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】アルスバーグ， エベン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン， オジュ

(72)【発明者】

【氏名】バーニー， チェルシー エス．

(72)【発明者】

【氏名】ノックス， サラ

【審査官】佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１６－２１０７０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－０６６１２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／０９０９２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１１－５０４９２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－１２０８５５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

口腔乾燥症の治療に使用するための、唾液腺への局所腺内投与のために製剤化されたヒドロゲルに封入されたセビメリンまたはピロカルピンを含む組成物であって、前記ヒドロゲルがアルギネートを含む、組成物。

【請求項2】

前記アルギネートが、イオン的に架橋されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記アルギネートが、二価カルシウムカチオンによってイオン的に架橋されている、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ヒドロゲル中の前記アルギネートの濃度が、約２～約１０重量パーセント（重量％）の範囲である、請求項２または３に記載の組成物。

【請求項5】

前記アルギネートが、少なくとも部分酸化される、請求項２または３に記載の組成物。

【請求項6】

前記アルギネートの約２％～約１０％が酸化される、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

前記アルギネートの約２％が酸化され、前記ヒドロゲル中の前記アルギネート濃度が、約５重量％である、請求項５に記載の組成物。

【請求項8】

前記ヒドロゲルが、対象への投与後少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも４週間、前記セビメリンまたはピロカルピンの送達を維持する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

造影剤をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

口腔乾燥症の対象を治療する方法において使用するための請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法が、治療有効量の前記組成物を前記対象の唾液腺に局所投与することを含む、組成物。

【請求項12】

前記組成物が、前記唾液腺に、または前記唾液腺に隣接して注入される、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記方法が、注入の前に、前記唾液腺の位置を特定するために、医用画像化または触診を実行することをさらに含む、請求項１１または１２に記載の組成物。

【請求項14】

前記医用画像化が、超音波を実行することを含む、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記組成物の複数の治療有効用量が、前記対象に投与される、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記口腔乾燥症が、放射線またはシェーグレン症候群による前記唾液腺の損傷によって引き起こされる、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記対象が、ペットまたは家畜である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

前記対象が、哺乳動物である、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

前記哺乳動物が、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、またはブタである、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１８に記載の組成物。

【請求項21】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物と、口腔乾燥症を治療するための説明書と、を含む、口腔乾燥症を治療するためのキット。

【請求項22】

前記組成物を対象に送達するための手段をさらに含む、請求項２１に記載のキット。

【請求項23】

アルギネートヒドロゲルに封入されたセビメリンまたはピロカルピンを含む組成物を含有する第１のシリンジと、塩化カルシウムを含む溶液を含有する第２のシリンジと、ルアーロックとをさらに含み、前記第２のシリンジは、前記ルアーロックを介して前記第１のシリンジに接続され得る、請求項２１に記載のキット。

【請求項24】

アルギネートヒドロゲルに封入された前記セビメリンまたはピロカルピンを含む前記組成物を含有する前記第１のシリンジが、凍結される、請求項２３に記載のキット。

【請求項25】

唾液腺再生を促進することを必要とする対象における唾液腺再生を促進する方法において使用するための、唾液腺への局所腺内投与のために製剤化されたヒドロゲルに封入されたセビメリンまたはピロカルピンを含む組成物であって、前記方法が、唾液腺の腺房前駆細胞および腺房細胞に前記組成物を局所投与して、前記腺房前駆細胞および前記腺房細胞の増殖を促進し、それによって唾液産生を増加させることを含み、前記ヒドロゲルがアルギネートを含む、組成物。

【請求項26】

前記腺房前駆細胞が、ＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞である、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

前記アルギネートが、イオン的に架橋される、請求項２５または２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記アルギネートが、二価カルシウムカチオンによってイオン的に架橋される、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

前記ヒドロゲル中の前記アルギネートの濃度が、２～１０重量パーセント（重量％）の範囲である、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項30】

前記アルギネートが、少なくとも部分酸化される、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

前記アルギネートの約２％～約１０％が、酸化される、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

前記アルギネートの約２％が、酸化され、前記ヒドロゲル中の前記アルギネート濃度が、約５重量％である、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

前記ヒドロゲルが、前記対象への投与後少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも４週間、前記セビメリンまたはピロカルピンの送達を維持する、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項34】

前記腺房前駆細胞が、Ｋｉ６７^＋またはＥｄＵ ^＋ の腺房前駆細胞である、請求項２５～３３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項35】

前記セビメリンまたはピロカルピンに応答した前記腺房細胞増殖の結果として、唾液流量が増加する、請求項２５～３４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項36】

前記唾液腺が、舌下線である、請求項２５～３５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項37】

前記腺房前駆細胞が、ＳＯＸ２ ^＋ ／ＡＱＰ５ ^＋ ／Ｋｉ６７^＋細胞である、請求項２５～３６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項38】

前記腺房前駆細胞が、ムチン（ＭＵＣ）１９^－細胞である、請求項２５～３７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項39】

前記方法が、前記対象の前記唾液腺からＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞を単離し、前記ＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞を増大させることをさらに含む、請求項２５～３８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項40】

前記増大された細胞が、前記セビメリンまたはピロカルピンの前記増大された細胞への制御放出を提供する操作された組織構築物または生体適合性基質で提供され、前記制御放出が、遅延放出、持続放出、勾配放出、時間放出、パターン化放出、または空間的放出のうちの少なくとも１つを含む、請求項３９に記載の組成物。

【請求項41】

前記増大された細胞および前記セビメリンまたはピロカルピンが、生分解性天然ポリマーまたはマクロマー上および／またはその中に提供される、請求項４０に記載の組成物。

【請求項42】

前記生分解性天然ポリマーまたはマクロマーが、ヒドロゲルを含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項43】

前記対象が、口腔乾燥症を引き起こすのに有効な放射線で治療されている、請求項２５～４２のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月１０日に出願された仮出願第６２／７７７，４５９号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究または開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された助成金番号Ｕ２４ＤＥ０２６９１４の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

唾液腺（ＳＧ）の機能障害は、患者の口腔の健康および生活の質を深刻に損なう：唾液は、口腔粘膜を保護し、食物の消化および構音を容易にし、歯の硬組織の再石灰化を助ける。ドライマウス、または口腔乾燥症は、自己免疫疾患シェーグレン症候群に起因する不可逆的な病理学的傷害（米国では１００～２００万人）から、またはＳＧが腫瘍と一緒に不注意に照射される頭頸部癌の治療放射線（米国では６万人／年）から発生する可能性がある。この組織の再生能力の喪失は、唾液の産生を排除し、これらの患者の生活の質を著しく損なう。唾液機能障害のための利用可能な再生治療薬はなく、新しい変換可能な解決策が必要とされている。

【0004】

現在、標準的治療法は、唾液代替物または人工唾液、および／または全身性唾液分泌促進薬などの緩和的治療を推奨することである。セビメリンおよびピロカルピンは、唾液の一時分泌を促進する２つのＦＤＡ承認ムスカリン作動薬である。ピロカルピンは、非選択的ムスカリン作動薬である一方で、セビメリンは、Ｍ１およびＭ３ムスカリン受容体サブタイプに対してより高い親和性を有し、これらは両方とも、顎下腺および舌下腺において発現される。これらの薬物は、１日に３～４回服用されると、短期間の唾液産生を促進するのに有効であるが、それらは、患者のコンプライアンスを低下させる過度の発汗および下痢、頭痛、ならびにかすみ目を含む、望ましくない副交感神経刺激様の（ｐａｒａｓｙｍｐａｔｈｅｔｏｍｉｍｅｔｉｃ）副作用と関連している。最近、患者におけるセビメリンまたはピロカルピンの長期間の経口使用が唾液腺機能を改善することが報告された（Ｂａｒｂｅ（２０１７）Ｊ．Ｅｖｉｄ．Ｂａｓｅｄ Ｄｅｎｔ．Ｐｒａｃｔ．１７（３）：２６８－２７０）。頭頸部へのガンマ線照射で処理されたマウスへのピロカルピンの継続的な経口投与は、未処理の対照と比較して唾液の流れを促進し（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５２（３）：４５－５８）、ムスカリンアゴニズムが唾液腺の修復を促進する可能性があることを示唆しているが、これがどのように達成されたかは決定されていない。
唾液機能障害を治療するより良い方法、特に唾液分泌腺房細胞および唾液産生を回復させることができる再生的治療に対する必要性が依然として存在する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ｂａｒｂｅ（２０１７）Ｊ．Ｅｖｉｄ．Ｂａｓｅｄ Ｄｅｎｔ．Ｐｒａｃｔ．１７（３）：２６８－２７０

【文献】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５２（３）：４５－５８

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

腺房細胞置換を促進することによる唾液腺再生のための組成物および方法が提供される。成人唾液腺におけるＳＯＸ２^＋前駆細胞を含む腺房前駆細胞が、放射線誘発損傷後に組織を再増殖させる（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）予期しない能力を備えた腺房細胞の補充に不可欠であることが見出された。また、コリン作動性神経が恒常性維持の間、腺房細胞置換を制御する上で極めて重要な役割を果たし、この神経細胞の影響は、腺房前駆細胞にコリン作動性模倣物を添加することにより再現され得ることも見出された。したがって、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬で組織内の腺房前駆細胞を直接標的化することによって、唾液腺の分泌部を再生して、機能的唾液腺房の回復を提供し、放射線療法後またはシェーグレン症候群に関連する口腔乾燥症などの口腔障害を治療することができる。

【0007】

一態様では、口腔乾燥症の治療で使用するための、唾液腺への局所投与のために製剤化されたヒドロゲルに封入されたムスカリン作動薬を含む組成物が提供される。このような組成物は、放射線または自己免疫疾患（例えば、シェーグレン症候群）による唾液腺への損傷によって引き起こされるような口腔乾燥症の治療に使用され得る。

【0008】

ある特定の実施形態では、ムスカリン作動薬は、Ｍ１および／またはＭ３ムスカリン受容体サブタイプに対して選択的である。一実施形態では、ムスカリン作動薬は、セビメリンである。

【0009】

ある特定の実施形態では、ムスカリン作動薬は、ピロカルピンである。

【0010】

ある特定の実施形態では、ヒドロゲルは、アルギネートを含む。アルギネートは、二価カチオンとイオン的に架橋され得る。いくつかの実施形態では、アルギネートは、二価カルシウムカチオン（Ｃａ^２＋）とイオン的に架橋されている。

【0011】

ある特定の実施形態では、ヒドロゲル中のアルギネートの濃度は、約２～約１０重量パーセント（重量％）の範囲であり、この範囲内の任意の重量％、例えば、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０重量％を含む。

【0012】

ある特定の実施形態では、アルギネートは、少なくとも部分酸化される。いくつかの実施形態では、アルギネートの約２％～約１０％が酸化され、この範囲の任意の割合、例えば２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％を含む。一実施形態では、ヒドロゲル中のアルギネートは、約２％酸化され、５重量％の濃度である。

【0013】

ある特定の実施形態では、ヒドロゲルは、対象への投与後少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも４週間以上の間、ムスカリン作動薬の送達を維持する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、ムスカリン作動薬の送達を最大３０日間維持する。

【0014】

ある特定の実施形態では、組成物は、造影剤をさらに含み、例えば、投与後の医用画像化によって唾液腺への組成物の局在化の確認を可能にする。いくつかの実施形態では、造影剤は、マイクロバブル（例えば、超音波で使用するため）または放射線不透過性造影剤（例えば、Ｘ線撮影で使用するため）である。

【0015】

ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

【0016】

別の態様では、本明細書に記載されるように、ヒドロゲルに封入されたムスカリン作動薬を含む組成物、および口腔乾燥症を治療するための説明書を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、対象に当該組成物を送達するための手段をさらに含む。例えば、キットは、アルギネートヒドロゲルに封入されたムスカリン作動薬を含む組成物を含有する第１のシリンジと、塩化カルシウムを含む溶液を含有する第２のシリンジと、ルアーロックとを含み得、第２のシリンジは、ルアーロックを介して第１のシリンジに接続することができる。アルギネートヒドロゲルに封入されたムスカリン作動薬を含む組成物を含有する第１のシリンジは、凍結保存され得る。いくつかの実施形態では、キット中のムスカリン作動薬は、セビメリンまたはピロカルピンである。

【0017】

別の態様では、口腔乾燥症の対象を治療する方法が提供され、本方法は、対象の唾液腺に、治療有効量のヒドロゲルに封入されたムスカリン作動薬を含む組成物を局所的に投与することを含む。

【0018】

ある特定の実施形態では、組成物は、唾液腺に、または唾液腺に隣接して注入される。

【0019】

ある特定の実施形態では、複数の治療有効用量の組成物が対象に投与される。

【0020】

ある特定の実施形態では、口腔乾燥症は、放射線またはシェーグレン症候群からの唾液腺の損傷によって引き起こされる。

【0021】

ある特定の実施形態では、本方法は、注入の前に唾液腺の位置を特定するために医用画像化（例えば、超音波）または触診を実行することをさらに含む。

【0022】

ある特定の実施形態では、唾液腺再生を促進することを必要とする対象における唾液腺再生を促進する方法であって、この方法は、唾液腺の腺房前駆細胞および腺房細胞に、コリン作動薬またはムスカリン作動薬のうちの少なくとも１つを局所投与して、腺房前駆細胞および腺房細胞の増殖を促進し、それによって唾液産生を増加させることを含む、方法。

【0023】

ある特定の実施形態では、コリン作動薬は、アセチルコリンまたはアセチルコリン類似体のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、アセチルコリン類似体は、カルバコールである。

【0024】

ある特定の実施形態では、腺房前駆細胞は、ＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞である。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞は、ＡＱＰ５７Ｋｉ６７^＋細胞である。他の実施形態では、ＳＯＸ２７ＡＱＰ５７Ｋｉ６７^＋腺房前駆細胞を含むＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞が、ムチン（ＭＵＣ）１９－細胞である。

【0025】

いくつかの実施形態では、本方法は、治療される対象の唾液腺からＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞を単離することと、単離されたＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞を増大させることと、次いで、増大された細胞を対象の唾液腺に移植することと、をさらに含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、移植前に、増大された細胞は、少なくとも１つのコリン作動薬またはムスカリン作動薬の増大された細胞への制御放出を提供する操作された組織構築物または生体適合性基質に提供される制御放出は、遅延放出、持続放出、勾配放出、時間放出、パターン化放出、または空間的放出のうちの少なくとも１つを含み得る。操作された組織構築物または生体適合性基質は、生体適合性ヒドロゲルなどの生分解性天然ポリマーまたはマクロマーを含むことができる。

【0027】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって治療される対象は、唾液の産生に影響を及ぼす障害などの口腔障害を有する。口腔障害の例としては、唾液腺腫瘍、嚢胞性線維症、シェーグレン症候群、唾液腺炎、耳下腺炎、唾液腺管炎（ｓｉａｌｏａｎｇｉｔｉｓ）、唾液管炎（ｓｉａｌｏｄｏｃｈｉｔｉｓ）、唾石症、唾液腺結石症（ｓｉａｌｏｄｏｃｈｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ）、粘液嚢胞、ガマ腫、分泌不全、唾液分泌過多症、流涎症、口腔乾燥症、唾液腺の良性リンパ上皮病変、唾液腺拡張（ｓｉａｌｅｃｔａｓｉａ）、唾液腺症（ｓｉａｌｏｓｉｓ）、唾液管狭窄（ｓｔｅｎｏｓｉｓ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｄｕｃｔ）、および唾液管狭窄（ｓｔｒｉｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｄｕｃｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、対象は、口腔乾燥症を引き起こすのに有効な放射線で以前に治療されていてもよい。本明細書に記載される方法は、唾液の産生（すなわち、口腔乾燥症）に影響を与えるそのような口腔障害に対してヒト対象を治療するために使用することができる。本明細書に記載の方法は、イヌおよびネコなどのペット、ならびにヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマおよびウシなどの家畜を含むが、これらに限定されない、飼育動物における口腔乾燥症の治療のための獣医用途でも使用されることが分かるであろう。

【0028】

本明細書に記載される他の実施形態は、対象の唾液腺のＳＯＸ２＋腺房前駆細胞を単離し、増大させ、次いで増大された細胞を対象の唾液腺に移植することによって、唾液腺再生を促進することを必要とする対象における唾液腺再生を促進する方法に関する。増大されたＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞は、ＡＱＰ５７Ｋｉ６７７ＭＵＣ１９^－細胞であり得る。

【0029】

いくつかの実施形態では、増大された細胞の移植の前および／または後に、増大された細胞は、腺房細胞の生成を促進するために、コリン作動薬またはムスカリン作動薬のうちの少なくとも１つを投与され得る。

【0030】

他の実施形態では、増大された細胞は、操作された組織構築物または生体適合性基質に提供され得る。操作された組織構築物または生体適合性基質は、少なくとも１つのコリン作動薬またはムスカリン作動薬の増大された細胞への制御放出を提供することができ、制御放出は、遅延放出、持続放出、勾配放出、時間放出、パターン化放出、または空間的放出のうちの少なくとも１つを含む。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1A】ＳＯＸ２が、成人の唾液腺において腺房細胞を生じるが、導管細胞を生じさせない前駆細胞をマークすることを示す。［図１Ａ］ＳＯＸ２、上皮（Ｅ－カドヘリン、ＥＣＡＤ）またはＣＤ４４、および核について免疫染色した、成人ヒト顎下（ＳＭＧ）、舌下（ＳＬＧ）、および耳下（ＰＧ）唾液腺（非ＩＲ、２８～３３歳）の代表的な画像。単方向矢印は、ＳＯＸ２発現腺房細胞を示す。スケールバーは、２０μｍである。［図１Ｂ］ＳＯＸ２、ＥＣＡＤ、および核について染色された野生型マウスＳＭＧおよびＳＬＧ。矢じりは、ＳＯＸ２発現細胞を示す。スケールバーは５０μｍである。黄色の破線は、ＳＭＧとＳＬＧとの間の境界を示す。［図１Ｃ］Ｓｏｘ２^ｅＧＦＰ舌下唾液腺（ＳＬＧ）を、ＧＦＰおよび分化した腺房マーカームチン１９（ＭＵＣ１９）について免疫染色した。白い破線は、Ｓｏｘ２^{ｅＧＦＰ＋}ＭＵＣ１９（－）細胞の輪郭を示す。スケールバー＝２０μｍ。［図１Ｄ］総ＡＱＰ５^＋腺房細胞の割合としてのＡＱＰ５^＋ＳＯＸ２^＋細胞。［図１Ｅ］ＳＯＸ２、Ｋｉ６７、および上皮マーカーＥ－カドヘリン（ＥＣＡＤ）について免疫染色したＳＬＧ。白い矢印は、増殖するＫｉ６７^＋ＳＯＸ２^＋細胞を示す。白線は、個々の細胞および核の輪郭を示す。スケールバー＝１０μｍ。［図１Ｆ］Ｓｏｘ２系統追跡した（ｌｉｎｅａｇｅ－ｔｒａｃｅｄ）ＳＬＧの代表的な画像。組み換えは、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}、Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスで誘導され、唾液腺は、ＳＯＸ２、腺房マーカーＡＱＰ５およびＭＵＣ１９、ならびに導管マーカーＫＲＴ８について免疫染色する前に、２４時間および３０日間追跡された。＊は、ＭＵＣ１９（－）Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}ＧＦＰ（＋）細胞を示す。スケールバー＝３０μｍ。ｍＴ＝膜結合型トマト（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ Ｔｏｍａｔｏ）。データ情報：（図１Ｄ）で定量化された細胞を、ｎ＝５、女性成人ＳＬＧの３つの非連続切片からカウントした。データは、平均±ＳＤとして提示される。

【図1B】同上。

【図1C】同上。

【図1D】同上。

【図1E】同上。

【図1F】同上。

【図2A】唾液腺房細胞の補充に必須であるＳＯＸ２およびＳＯＸ２^＋細胞を示す。［図２Ａ］、［図２Ｂ］Ｓｏｘ２またはＳＯＸ２^＋細胞を、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}；Ｒｏｓａ２６^{ｍＴｍＧ／＋}マウス（図２Ａ、概略図を参照）またはＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡ；Ｒｏｓａ２６^{ｍＴｍＧ／＋}マウス（図２Ｂ、概略図を参照）のＳＬＧ中で除去（ａｂｌａｔｅ）した。切片を、ＡＱＰ５、ＫＲＴ８、またはＥＣＡＤおよび核について免疫染色した。スケールバー＝５０μｍ。破線の白線は、導管の輪郭を示す。遺伝子型あたりｎ＝３。［図２Ｃ］、［図２Ｄ］Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}（図２Ｃ）またはＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡ；Ｒｏｓａ２６^{ｍＴｍＧ／＋}ＳＬＧ（図２Ｄ）中の導管面積の定量化は、全上皮面積の割合として表される。（図２Ｃ）、右グラフでは、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}ＳＬＧ中のＳＯＸ２^＋細胞の数は、全細胞の割合として発現した。（図２Ｄ）、右グラフでは、野生型およびＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡ；Ｒｏｓａ２６^{ｍＴｍＧ／＋}マウスにおけるＫＲＴ８^＋導管、ＡＱＰ５^＋およびＳＯＸ２^＋腺房細胞の総数をカウントした。データ情報：細胞数／導管面積の計算は、ｎ＝３マウス／遺伝子型からの各ＳＬＧの３つの非連続蛍光切片上で実行された。（図２Ｃおよび２Ｄ）におけるデータ（ｎ＝３）は、平均±ＳＤであり、スチューデントのｔ検定によって分析された。（図２Ｃ）では、^＊Ｐ＝０．０１１および^＊＊Ｐ＝０．００４１、ならびに（図２Ｄ）では、左グラフ^＊＊Ｐ＝０．００１５および右グラフ^＊＊＊Ｐ＝０．０００７および^＊＊Ｐ＝０．００１８。

【図2B】同上。

【図2C】同上。

【図2D】同上。

【図3A】副交感神経が、ＳＯＸ２^＋細胞を維持し、ＳＯＸ２を介して腺房細胞の置換を促進するために必要であることを示す。［図３Ａ］概略図は、成体マウスにおける鼓索（ＣＴ）の除神経の時間経過および位置を示す。［図３Ｂ］手術後７日および３０日（Ｄ７またはＤ３０）の無傷（未傷害の反対側の腺）および神経切断ＳＬＧの遺伝子発現（ｑＰＣＲ）分析。遺伝子発現は、各時点についてＲｓｐ１８および無傷の対照に対して正規化された。［図３Ｃ～３Ｆ］神経（ＧＦＲａ２）、腺房細胞（ＡＱＰ５およびＭＩＳＴ１）、導管細胞（ＫＲＴ８）、および上皮細胞（ＥＣＡＤ）の除神経の７日後に、対照および神経切断ＳＬＧを免疫染色した。対照および切断ＳＬＧ中のＳＯＸ２^＋、ＡＱＰ５^＋、ＭＩＳＴ１^＋、ＫＲＴ８^＋、およびＫＲＴ５^＋細胞の数をカウントし、対照ＳＬＧ中の細胞の数の割合として表した（図３Ｆ）。（図３Ｃ、３Ｄおよび３Ｅ）のスケールバー＝２５μｍ。［図３Ｇ］、［図３Ｈ］組み換えは、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ^{２６ｍＴｍＧ}マウスにおいて神経切断の３日後に誘導され、ＴＵＢＢ３について免疫染色される前に、ＳＬＧが１１日間追跡された。対照および切断腺におけるＧＦＰ^＋およびｍＴ^＋腺房細胞の割合を（図３Ｇ）に示す。（図３Ｈ）のスケールバー＝２５μｍ。データ情報：（図３Ｂ）のデータ（ｎ＝５）は、平均±ＳＥＭであり、事後ダネット検定による一元配置分散分析を使用して分析した。Ｓｏｘ２（Ｄ７）^＊Ｐ＝０．０４５５、Ｔｕｂｂ３（Ｄ７）^＊＊Ｐ＝０．００８２、Ｔｕｂｂ３（Ｄ３０）^＊＊Ｐ＝０．００９１、Ｖｉｐ（Ｄ７）^＊＊Ｐ＝０．００９８、Ｖｉｐ（Ｄ３０）^＊＊Ｐ＝０．００６３、Ｖａｃｈｔ（Ｄ７）^＊＊Ｐ＝０．００７１、Ｍｕｃ１９（Ｄ７）^＊Ｐ＝０．０４１９、Ａｑｐ５（Ｄ７）^＊Ｐ＝０．０４６８。（図３Ｆおよび３Ｇ）中のデータは、ｎ＝５マウス／群または遺伝子型からの各ＳＬＧの３つの非連続蛍光切片から計算され、平均±ＳＤであり、スチューデントのｔ検定によって分析された。ＳＯＸ２^{＋ ＊}Ｐ＝０．０１９７、ＡＱＰ５^{＋ ＊}Ｐ＝０．０１０６、％ＧＦＰ^{＋ ＊＊＊}Ｐ＝０．０００００９６、％ｍＴ^{＋ ＊＊＊}Ｐ＝０．０００００９６。

【図3B】同上。

【図3C】同上。

【図3D】同上。

【図3E】同上。

【図3F】同上。

【図3G】同上。

【図3H】同上。

【図4A】ムスカリンシグナル伝達がＳＯＸ２^＋細胞増殖を促進することを示す。［図４Ａ］成人ＳＬＧを、ＳＯＸ２、ＣＨＲＭ３、および核について免疫染色した。画像は、１－μｍおよび０．１７５－μｍの共焦点切片の６μｍ（左）および１μｍ（右）投影である。スケールバー＝１０μｍ。［図４Ｂ］ＣＨＲＭ１^＋またはＣＨＲＭ３^＋である上皮ＳＯＸ２^＋細胞の割合をフローサイトメトリーを使用してカウントし、全ＥｐＣＡＭ^＋ＳＯＸ２^＋細胞の割合として発現した。［図４Ｃ］、［図４Ｄ］ピロカルピンまたは生理食塩水（対照）で処理されたマウスからの成体ＳＬＧを、ＳＯＸ２、Ｋｉ６７、および核について免疫染色した。白色の矢印は、増殖しているＳＯＸ２^＋（ＳＯＸ２^＋Ｋｉ６７^＋）細胞を示す（図４Ｃ）。スケールバー＝２０μｍ。（図４Ｄ）ピロカルピン処理によるＳＯＸ２^＋およびＳＯＸ２^＋Ｋｉ６７^＋細胞の倍率変化％。データ情報：（図４Ｂ）ｎ＝３のマウスからＳＬＧをプールした（１０，０００事象）。（図４Ｄ）のデータは、ｎ＝４（生理食塩水）またはｎ＝５（ピロカルピン）マウスからの各ＳＬＧの３つの非連続蛍光切片から計算され、平均±ＳＤであり、スチューデントのｔ検定によって分析された。^＊Ｐ＝０．０４８７。

【図4B】同上。

【図4C】同上。

【図4D】同上。

【図5A】Ｓｏｘ２が、放射線傷害後のＳＬＧ再生に不可欠であることを示す。［図５Ａ～５Ｄ］野生型（図５Ａ）およびＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２^{６ｍＴｍＧ}（図５Ｄ）マウスからの対照（０Ｇｙ、非ＩＲ）および照射（１０Ｇｙ、ＩＲ）ＳＬＧの代表的な画像を示し、１、３、および１４日後に分析された。（図５Ａ～５Ｃ）ＳＬＧを、神経（ＴＵＢＢ３）、ＳＯＸ２、サイクリンＤＩ（ＣＣＮＤ１）、および核（図５Ａ、５Ｃ）について染色し、神経密度を計算した（図５Ｂ）。（図５Ｃ）ＳＯＸ２^＋およびＣＣＮＤ１^＋細胞の数を定量化した。（図５Ｄ）Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスを照射後１４日間追跡し（ＩＲ）、ＳＯＸ２について免疫染色した（図５Ｄ、赤色）。白い矢じりは、ＳＯＸ２陰性子孫を示す。（図５Ａおよび５Ｄ）中のスケールバーは、５０μｍである。［図５Ｅ］Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}マウスおよび野生型同腹仔に、１０Ｇｙ ＩＲを照射し、１３日後にＳＬＧを分析した。ＳＬＧをＳＯＸ２、ＡＱＰ５、および核について免疫染色した。スケールバー＝５０μｍ。データ情報：（図５Ｂ）のデータは平均±ＳＤであり、ｎ＝３であり、個々の値がプロットされる。（図５Ｃ）のデータは、ｎ＝３のマウス／処理からの各ＳＬＧの３つの非連続蛍光切片から計算され、平均±ＳＤであり、データは事後ダネット検定による一元配置分散分析を使用して分析された。ＳＯＸ２^＋（Ｄ１）^＊Ｐ＝０．０４８７、ＳＯＸ２^＋ＣＣＮＤ１^＋（Ｄ３）^＊Ｐ＝０．３１８、ＳＯＸ２^＋ＣＣＮＤ１^＋（Ｄ７）^＊Ｐ＝０．０２９１。

【図5B】同上。

【図5C】同上。

【図5D】同上。

【図5E】同上。

【図6A】ＳＯＸ２^＋前駆体が、ムスカリン刺激に応答して放射線誘発損傷後に腺房細胞を補充することができることを示す。［図６Ａ］Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスからのＳＬＧを、単回１５Ｇｙ線量のＩＲおよび０～４８時間培養された外植片の後に収集した。概略図は、組み換え、培養、および分析のタイミングを示す。［図６Ｂ］核について免疫染色された系統追跡外植片の代表的な画像。スケールバーは５０μｍである。［図６Ｃ］ＧＦＰ^＋細胞の数の定量化。データ情報：（図６Ｃ）のデータは、各処理についてｎ＝３の免疫染色された外植片の３つのランダムなエリアから計算され、個々の値がプロットされ、事後ダネット検定による一元配置分散分析を使用してデータを分析した。エラーバーは、平均値±ＳＤを示す。非ＩＲ対ＩＲ ^＊＊＊Ｐ＝０．００２２、ＩＲ対ＩＲ＋ＣＣｈ ^＊＊Ｐ＝０．００５８、ＩＲ対ＩＲ＋４－ＤＡＭＰ ^＊＊＊Ｐ＝０．００１０。

【図6B】同上。

【図6C】同上。

【図7A】アセチルコリン／ムスカリンシグナル伝達が、ヒトＳＧにおいてＳＯＸ２および腺房系統を維持することを示す。［図７Ａ］健康な個人（非ＩＲ、顎下腺）または頭頸部癌の放射線療法を受けた患者（ＩＲ）から得られたヒト唾液腺をｑＰＣＲに供した。［図７Ｂ～７Ｄ］マウス胎生期（Ｅ）１３副交感神経節（神経）またはＥ１３間葉（ＭＥＳ）のいずれかと共に７日間培養したヒトＳＭＧ外植片。神経（図７Ｂ、ＴＵＢＢ３）または細胞増殖（図７Ｃ、Ｋｉ６７）のマーカーについての免疫染色によって、またはｑＰＣＲ（図７Ｄ）によって、外植片を分析した。スケールバー＝５０μｍ（図７Ｂ、７Ｃ）。［図７Ｅ］４時間±ＣＣｈ（２００ｎＭ、ｎ＝４）で培養された４人の異なる個体の成人ヒト唾液腺（ＳＭＧまたはＰＧ）外植片のｑＰＣＲ分析。個々のデータセットを図１４Ｄに示す。データ情報：（図７Ａ）のデータは、非ＩＲの場合ｎ＝１１、ＩＲの場合ｎ＝７、３０～８５歳。データは、ＧＡＰＤＨに正規化され、個々の値がプロットされ、偽発見率が０．０５に設定されたスチューデントのｔ検定を使用して分析された。エラーバーは、平均値±ＳＤを示す。ＡＱＰ３ Ｐ＝０．０１７、ＭＩＳＴ１ Ｐ＝０．０８６、ＡＭＹ１ Ｐ＝０．００５、ＳＯＸ２ Ｐ＝０．０７９、ＣＨＲＭ１ Ｐ＝０．０４０、ＣＨＲＭ３ Ｐ＝０．０１１、ＥＧＦＲ Ｐ＝０．９３１、ＫＲＴ１９ Ｐ＝０．６１８。（図７Ｄ）のデータは、ｎ＝２の個体の平均±ＳＤであり、実線カラムは個体＃１を表し、破線カラムは個体＃２を表す。データは、マウス間葉で培養した同じ個体の唾液腺に対して正規化された（対照、黒い破線）。（図７Ｅ）のデータは、ｎ＝４の異なる個体の箱ひげ図であり、平均（水平線）、上下の四分位数（箱）、ならびに上下の値（ひげ）を示す。データは、未処理対照に対して正規化された（黒い破線）。ｎ＝５～８、の個体当たりの外植片。データは、事後ダネット検定による一元配置分散分析を使用して分析された。ＳＯＸ２ ^＊＊Ｐ＝０．００８３４、ＣＨＲＭ３ ^＊Ｐ＝０．０４４９、ＣＨＲＭ１ ^＊＊Ｐ＝０．００９３、ＡＱＰ５ ^＊＊Ｐ＝０．００６９、ＡＱＰ３ ^＊Ｐ＝０．０３７５、ＭＩＳＴ１ ^＊Ｐ＝０．０３７９、ＣＤ４４ ^＊Ｐ＝０．０４８５、ＫＲＴ１９ ^＊Ｐ＝０．０４６１

【図7B】同上。

【図7C】同上。

【図7D】同上。

【図7E】同上。

【図8A】ＳＯＸ２^＋細胞の短期間の除去が腺房細胞の置換を低減させることを示す。（図８Ａ）ＳＯＸ２^＋細胞を、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^ｍ；Ｒｏｓａ２６^{ｍＴｍＧ／＋}マウスのＳＬＧで３日間にわたって除去し、ＳＬＧを４日目に分析した（概略図を参照）。Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２ｆｌ／ｆｌ；Ｒｏｓａ２６^{ｍＴｍＧ／＋}ＳＬＧの切片を、ＳＯＸ２および筋上皮細胞（ａ－平滑筋アクチン、ＳＭＡ）について免疫染色した。スケールバー＝５０ｐｍ（図８Ｂ）ＳＯＸ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡ；Ｒｏｓａ２６^{ｍＴｍＧ／＋}マウスのＳＬＧでＳＯＸ２^＋細胞を４日間にわたって除去し、ＳＬＧを５日目に分析した（概略図を参照）。Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡＳＬＧの切片を、ＳＯＸ２および腺房細胞（アクアポリン５、ＡＱＰ５）について免疫染色するか、またはｑＰＣＲに供した。スケールバー＝５０ｐｍ。データ情報：図８Ｂのデータは、Ｇａｐｄｈおよび野生型対照に対して正規化された。データは平均±ＳＤである。（ｎ＝１、３回の技術的複製）。

【図8B】同上。

【図9A】鼓索の切断から３０日後の再神経支配が、腺房系統を回復することを示す（図９Ａ～９Ｃ）ＳＬＧをＳＯＸ２、ＴＵＢＢ３、ＡＱＰ５、ＭＩＳＴ１およびＥＣＡＤ（図９Ａ）について免疫染色し、ＳＯＸ２^＋、ＡＱＰ５^＋、ＭＩＳＴ１^＋およびＫＲＴ８^＋細胞の数（図９Ｂ）、ならびに腺房細胞サイズ（図９Ｃ）を除神経の３０日後に測定した。ｎ＝５、の１条件ごとの時点ごとのマウス。細胞を、１動物ごとに３～４視野でカウントした。データ情報：図９Ｂおよび図９Ｃのデータ、ｎ＝５。図９Ｂのデータは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍであり、一元配置分散分析を使用して分析され、図９Ｃのデータは、ｎ＝５のマウスの箱ひげ図であり、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを示し、スチューデントのｆ検定を使用して分析された。^＊ｐ＝０．０４９８。

【図9B】同上。

【図9C】同上。

【図10A】ＳＯＸ２が、腺房を補充する腺房細胞のサブセットをマークすることを示す。［図１０Ａ］ＳＯＸ２、ＥＣＡＤ、および核について染色された野生型マウスＰＧ。スケールバーは５０ｐｍである。［図１０Ｂ］Ｋｉ６７^＋である腺房ＳＯＸ２^＋およびＳＯＸ２^－細胞の割合をＦＡＣＳを使用してカウントし、総ＡＱＰ５^＋ＳＯＸ２^＋またはＡＱＰ５^＋ＳＯＸ２^－細胞の割合として示す。［図１０Ｃ］サイクリンＤ１^＋またはサイクリンＤＴのいずれかであるＳＯＸ２^＋腺房細胞のパーセント。［図１０Ｄ］Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧＣｒｅを介した遺伝子切除の概略図（出典、Ｍｕｚｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。［図１０Ｅ］Ｓｏｘ２系統追跡ＳＬＧの代表的な画像。Ｃｒｅを介した組み換えは、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスにおいて誘導され、ＳＬＧを、ＳＯＸ２についての免疫染色によって１４または３０日後に分析した。スケールバー＝２５μｍ。［図１０Ｆ］キット系統追跡ＳＬＧおよびＳＭＧの代表的な画像。Ｃｒｅを介した組み換えがＫｉｔ^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスにおいて誘導され、ＳＭＧ／ＳＬＧを１４日後および６ヶ月後に分析した。組織を腺房細胞をマークするためＡＱＰ５で染色し、介在された導管細胞をマークするためＫＲＴ８で染色した。スケールバー＝２５μｍ。ｍＴ＝膜結合トマト。データ情報：（図１０Ｂ）のデータ、ＳＬＧをｎ＝２、マウスからプールした（８５，０００事象）。（図１０Ｃ）のデータを、ｎ＝３、マウスからの各ＳＬＧの３つの非連続蛍光切片から計算し、個々の値がプロットされた。エラーバーは、平均値±ＳＤを示す。

【図10B】同上。

【図10C】同上。

【図10D】同上。

【図10E】同上。

【図10F】同上。

【図11A】Ｓｏｘ２またはＳＯＸ２^＋細胞の除去が、神経の存在にもかかわらず、腺房細胞の置換を低減させることを示す。［図１１Ａ～１１Ｃ］Ｓｏｘ２またはＳＯＸ２^＋細胞を、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}；Ｒｏｓａ２６^{ｍＴｍＧ／＋}マウス（図２Ａ、概略図を参照）またはＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡ；Ｒｏｓａ２６^{ｍＴｍＧ／＋}マウス（図２Ｂ、概略図を参照）のＳＬＧで除去した。（図１１Ａ、１１Ｂ）ＷＴ、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}、およびＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡのＳＬＧの切片をＳＯＸ２またはＴＵＢＢ３および核について免疫染色した。白い矢じりはＳＯＸ２^＋細胞を示す。白い点線の正方形が右の画像で拡大され、組織に残っているＳＯＸ２^＋細胞がほとんどなく、非核（緑色）染色が破片を示唆することを強調している。スケールバー＝５０μｍ。（図１１Ｃ）神経の生の総密度を、ＩｍａｇｅＪを使用して計算した。［図１１Ｄ］ＷＴまたはＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}のＳＬＧを、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）および核について免疫染色した。破線＝導管、矢じり＝ＣＣＮＤ１^＋腺房細胞。スケールバー＝５０μｍ。データ情報：（図１１Ｃ）のデータ、ＷＴ ｎ＝４、Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ} ｎ＝４、ＤＴＡ ｎ＝３。平均±ＳＤとして個々の値をプロットし、事後ダネット検定による一元配置分散分析を使用してデータを分析した。^＊＊Ｐ＝０．００９１。（図１１Ｄ）のデータは、ｎ＝４、のマウスからの代表的な画像である。

【図11B】同上。

【図11C】同上。

【図11D】同上。

【図12A】鼓索の切断が７日で腺房細胞を枯渇させることを示す。（図１２Ａ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｇ）対照および神経切断ＳＬＧを、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、図１２Ａ）、ＳＯＸ２およびＴＵＢＢ３（図１２Ｃ）、ＫＲＴ５（図１２Ｄ）、カスパーゼ－３（ＣＡＳＰ３、図１２Ｇ）、上皮細胞（ＥＣＡＤ）、および核について、除神経７日後、免疫染色した。除神経の７日後の、無傷または切断された鼓索（ＣＴ）を有する成体野生型（ＷＴ）ＳＬＧにおける腺房細胞のサイズの定量化（図１２Ｂ）。（図１２Ａ、１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｇ）のスケールバー＝２５μｍ。（図１２Ｅ、１２Ｆ）神経切断の２４時間前にＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスにおいて、組み換えが誘導され、ＳＬＧは、ＴＵＢＢ３について免疫染色される前に１５日間追跡された。対照および切断腺におけるＧＦＰ^＋およびｍＴ^＋腺房細胞の割合を（図１２Ｆ）に示す。スケールバー（図１２Ｅ）＝２５μｍ。（Ｈ）無傷の対照と比較した、除神経の７日後の細胞周期およびアポトーシスに関与する遺伝子の発現の変化倍率。破線は、無傷の対照を示す。データ情報：（図１２Ｂ、１２Ｆ、および１２Ｈ）のデータ、ｎ＝５。（図１２Ｂ）のデータは、ｎ＝５、マウスの箱ひげ図であり、平均（水平線）、上下の四分位数（箱）ならびに上下の値（ひげ）を示し、スチューデントのｔ検定を使用して分析された。^＊＊＊Ｐ＝０．０００００３４７。（図１２Ｆ）のデータは、平均±ＳＤであり、スチューデントのｔ検定によって分析された。％ＧＦＰ^{＋ ＊＊＊}Ｐ＝０．００００２０８、％ｍＴ^{＋ ＊＊＊}Ｐ＝０．００００２０８。（図１２Ｈ）のデータは、Ｒｓｐ１８および無傷の対照（破線）に対して正規化された。Ｃｃｎｄｌ ^＊Ｐ＝０．０４７７。

【図12B】同上。

【図12C】同上。

【図12D】同上。

【図12E】同上。

【図12F】同上。

【図12G】同上。

【図12H】同上。

【図13A】ＩＲが細胞損傷ならびに神経の喪失を誘発し、ＳＯＸ２およびＳＯＸ２^＋前駆体が、コリン作動性模倣物に応答してマウス腺房細胞を補充することができることを示す。［図１３Ａ］、［図１３Ｂ］マウスＳＬＧを、１０ＧｙのＩＲ後０、１、３、および７日目にｑＰＣＲによって転写変化について分析した。［図１３Ｃ～１３Ｅ］Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスＳＬＧ外植片を、エクスビボで４８時間培養し、平滑筋アクチン（ＳＭＡ、図１３Ｃ）、ＳＯＸ２（図１３Ｄ）またはＫｉ６７（図１３Ｅ）および核について免疫染色した。培養のためにＳＬＧを採取する２４時間前に組み換えを誘導した。スケールバー＝５０μｍ。データ情報：（図１３Ａおよび１３Ｂ）のデータは、Ｒｓｐ２９および０日目の対照に対して正規化された。（図１３Ａおよび１３Ｂ）のデータ（ｎ＝３、１時点当たり）は、平均±ＳＥＭであり、事後ダネット検定を用いた一元配置分散分析を使用して分析された。Ｂａｘ（Ｄ１）＊＊Ｐ＝０．００８２６、Ｂａｘ（Ｄ３）＊＊Ｐ＝０．０８７１、Ｐｍａｉｐｌ（Ｄ３）＊Ｐ＝０．０３６９、ｐ２１（Ｄ３）＊Ｐ＝０．０４８１、ｐ５３（Ｄ１）＊Ｐ＝０．０３３７、ＭＫｉ６７（Ｄ１）＊Ｐ＝０．０３１９、Ｓｏｘ２（Ｄ１）＊＊Ｐ＝０．００７２、Ｓｏｘ２（Ｄ３）＊Ｐ＝０．０４１８、Ａｑｐ５（Ｄ１）＊Ｐ＝０．０４２１、Ｍｉｓｔｉ（Ｄ１）＊Ｐ＝０．０４３２、Ｔｕｂｂ３（Ｄ１）＊Ｐ＝０．０４６７、Ｔｕｂｂ３（Ｄ３）＊Ｐ＝０．０４７０、Ｔｕｂｂ３（Ｄ７）＊Ｐ＝０．０４８９、Ｖｉｐ（Ｄ１）＊Ｐ＝０．０４０２。（図１３Ｃ、１３Ｄ、および１３Ｅ）の画像は、３つの実験を代表するものであり、ｎ＝３、の１実験ごとのＳＬＧ断片である。

【図13B】同上。

【図13C】同上。

【図13D】同上。

【図13E】同上。

【図14A】ムスカリン活性化が、ヒト成人の唾液腺におけるＳＯＸ２発現および腺房系統を増加させるのに十分であることを示す。［図１４Ａ］健康な個体（非ＩＲ、顎下腺）または頭頸部癌の放射線療法を受けた患者（ＩＲ）から得られたヒト唾液腺をｑＰＣＲに供した。［図１４Ｂ］内因性ＳＯＸ１０、ＭＩＳＴ１、ＥＧＦＲ、ＣＤ４４、ＫＲＴ７、ＡＱＰ３、ＫＲＴ５、ＥＣＡＤ、および核について免疫染色された成人ヒト（ｈ）唾液腺（非ＩＲ、２２～３１歳、ＳＭＧ）の代表的な画像。単方向の矢じりは、ＳＯＸ１０を発現する腺房および導管細胞を示す。スケールバー＝５０μｍ。［図１４Ｃ］神経共培養物中のＫｉ６７^＋細胞の数の定量化（図７Ｃに示す代表的な画像）。［図１４Ｄ］４人の個々の患者（健常、非ＩＲ）からの成人ヒト唾液腺外植片（ＳＭＧまたはＰＧ）を４時間±２００ｎＭのＣＣｈで培養した。図７Ｅに提示されるプールされたデータ。データ情報：（図１４Ａ）のデータは、非ＩＲの場合はｎ＝１１であり、ＩＲの場合はｎ＝７であり、３０～８５歳である。データは、ＧＡＰＤＨに正規化され、個々の値がプロットされ、偽発見率が０．０５に設定されたスチューデントのｔ検定を使用して分析された。エラーバーは、平均値±ＳＤを示す。ＴＵＢＢ３ Ｐ＝０．３４６、ＶＩＰ Ｐ＝０．４６１、ＧＦＲＡ Ｐ＝０．００２、ＴＨ Ｐ＝０．４３３。（図１４Ｃ）のデータはｎ＝３で、平均±ＳＥＭであり、スチューデントのｔ検定を使用して分析された。^＊Ｐ＝０．０１５１。（図１４Ｄ）中のデータ（ｎ＝４、の別々の個体）は、ＣＣｈなしで培養した同じ個体（対照、黒い破線）からのＧＡＰＤＨ発現および唾液腺に対して正規化され、３連で実行され、平均値±ＳＤとして提示される。

【図14B】同上。

【図14C】同上。

【図14D-1】同上。

【図14D-2】同上。

【図15A】セビメリンの腺内注入が、マウス唾液腺における腺房細胞増殖を促進することを示す。マウスに、セビメリン（ＣＶ）または生理食塩水（Ｓ、対照）を腺内注入した。１８時間後にマウスを屠殺し、組織切片（３切片／腺、３匹のマウス／処理）から増殖細胞を定量化した。スケールバー＝６０ｐｍ（図１５Ａに示される代表的な画像、図１５Ｂに示されるセビメリン処理対生理食塩水の腺房細胞％を比較するプロット）。

【図15B】同上。

【図16A】酸化アルギネート（ＯＡ）ヒドロゲルの物理的分解を示す。（図１６Ａ）物理的分解に対する酸化の影響、重量％は５重量％で一定に保持された。（図１６Ｂ）物理的分解に対する重量％の影響、ＯＡ％は２％ＯＡで一定に保持された。（図１６Ｃ）５重量％で２％ＯＡのインビトロ対インビボ分解。（図１６Ｄ）冷蔵（４℃）対冷凍（－２０℃）下での５重量％での２％ＯＡの安定性。

【図16B】同上。

【図16C】同上。

【図16D】同上。

【図17A】酸化アルギネート（ＯＡ）ヒドロゲルからのセビメリン放出を示す。（図１７Ａ）セビメリン放出に対する酸化の影響、重量％は５重量％で一定に保持された。（図１７Ｂ）セビメリンに対する重量％の影響、ＯＡ％は２％ＯＡで一定に保持された。（図１７Ｃ）５重量％の２％ＯＡヒドロゲルからの放出動態に対するセビメリンの増加した初期薬物負荷の影響。（図１７Ｄ）異なる初期セビメリン濃度での５重量％の２％ＯＡヒドロゲルからの時間当たりのセビメリン放出。

【図17B】同上。

【図17C】同上。

【図17D】同上。

【図18A】バルクアルギネートからのセビメリン放出が３日間腺細胞増殖を促進することを示す。アルギネート（ＡＬＧ、５％重量：２％ＯＡ）またはアルギネート＋セビメリン（ＡＬＧ＋ＣＶ）を唾液腺のすぐ隣に注入した（図１８Ａ）。赤い円は注入後にアルギネートを強調表示する。３日でマウスを屠殺し、増殖しているＫｉ６７＋およびＥｄＵ＋細胞を定量化した（図１８Ｂおよび図１８Ｃ、３切片／腺、３～４匹のマウス／処理）。＋ＣＶをＡＬＧ対照と比較するスチューデントのｔ検定、＊ｐ＜０．０５。スケールバー＝４０ｐｍ。

【図18B】同上。

【図18C】同上。

【図19A】セビメリン有り、または無しのアルギネートが、注入後の７日で修復促進性の（ｐｒｏ－ｒｅｐａｉｒ）炎症応答を促進することを示す。アルギネート（ＡＬＧ、５％重量：２％ＯＡ）またはアルギネート＋セビメリン（ＡＬＧ＋ＣＶ）を唾液腺のすぐ隣に注入した。７日目にマウスを屠殺した。唾液腺組織切片を、ＣＤ３＋Ｔ細胞（図１９Ａおよび１９Ｂ）、ＣＤ６８＋マクロファージ（図１９Ｃおよび１９Ｄ）、またはＣＤ２０６＋修復マクロファージ（図１９Ｅ）および核について免疫染色した。マクロファージ密度を定量化し、年齢が一致した生理食塩水注入動物（ｉ．ｐ．）または２２ヶ月齢のマウス（３切片／腺、３～４匹／処理）と比較した。＋ＣＶとＡＬＧ対照と対照を比較する一元配置分散分析検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。スケールバー＝４０ｐｍ。

【図19B】同上。

【図19C】同上。

【図19D】同上。

【図19E】同上。

【図20A】セビメリンが、放射線誘発損傷後の腺房細胞の増殖を促進することを示す。（図２０Ａ）放射線処理の概略図。（図２０Ｂ）クエン酸塩刺激唾液分泌は、１０Ｇｙ線量の放射線を受けてから１３日後の６～８週のＣ５７／ＢＬ６雌マウスにおいて、低減する。（図２０Ｃ～２０Ｆ）１４日後、動物に生理食塩水もしくは１０ｍｇ／ｋｇのセビメリンを腹腔内注入するか（図２０Ｂおよび２０Ｄ）、または腺内に注入した（図２０Ｃおよび２０Ｄ）。動物は、組織処理および免疫蛍光のために、注入の１８時間後に安楽死させた。増殖およびＳＯＸ２＋細胞の定量化を組織切片から行った（動物当たり３切片）。

【図20B】同上。

【図20C】同上。

【図20D】同上。

【図20E】同上。

【図20F】同上。

【図21A】アルギネート＋セビメリンによる照射された唾液腺の処理が、腺房細胞増殖を促進し、唾液流量を改善することを示す。［図２１Ａ］マウスの処理のタイムラインの概略図を示す。放射線照射の１４日後に、マウスにアルギネートまたはアルギネート＋セビメリンを注入し、増殖の分析のために３日目に屠殺した。［図２１Ｂ］アルギネート＋セビメリンがアルギネートのみのレベルを上回る増殖速度を増加させたことを示す。［図２１Ｃ］アルギネートのみのアルギネート＋セビメリンで処理した後の上皮細胞の割合を比較する。［図２１Ｄ］放射線照射から１３日後、生理食塩水、アルギネート、またはアルギネート＋セビメリンの皮下注入の１日前および７日後に唾液を測定したことを示す。二元配置分散分析、ＲＭなし、ｐ＝０．０２４４、時間パラメータに対する。

【図21B】同上。

【図21C】同上。

【図21D】同上。

【図22】セビメリンの増加による増殖の増加がないことを示す。１０ｍｇまたは２５ｍｇ／ｋｇを含有するアルギネートをマウスに送達し、増殖（Ｋｉ６７＋）腺房細胞を３日目に定量化した。

【図23】アルギネートが腺房細胞増殖を促進することを示す。

【図24】セビメリンの有無にかかわらず、アルギネートがマウスの健康に悪影響を及ぼさないことを示す。

【図25】アルギネートの酸化効率を分析するための^１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを示す。３－（トリメチルシリル）プロピオン酸－ｄ４ナトリウム塩（０．０５ｗ／ｖ％）を内部標準として使用した。

【図26】注入可能なヒドロゲルを製造するための一対のシリンジを示す。ヒドロゲルを産生するためのカルシウム架橋溶液を含有するシリンジは、ルアーロックを介して、アルギネートおよび神経伝達物質模倣物（例えば、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬）の溶液を含有する第２のシリンジに接続される。

【図27A】イヌおよびヒト唾液腺の位置を示す。１．５ｍｌ～２ｍｌのアルギネートヒドロゲルは、ヒト対象またはイヌ対象のいずれかにおいて下顎腺に直接注入することができる。

【図27B】同上。

【図28】イヌおよびヒト唾液腺が類似していることを示す。イヌとヒトの耳下腺および舌下腺は、最も類似しているように見える。イヌ下顎腺は、混合細胞腺（ｍｉｘｅｄ ｃｅｌｌ ｇｌａｎｄ）であるという点でヒトと同様である。

【図29】イヌの下顎腺へのアルギネートヒドロゲルの注入を示す。

【発明を実施するための形態】

【0032】

腺房細胞の置換を促進することによる唾液腺の再生のための組成物、方法、およびキットが提供される。本発明者らは、成人唾液腺におけるＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞を含む前駆細胞が、放射線誘発損傷後に組織を再増殖させる予期しない能力を備えた腺房細胞の補充に不可欠であることを示した（実施例１）。本発明者らは、コリン作動性神経が、恒常性維持の間、腺房細胞の置換を制御する上で極めて重要な役割を果たし、この神経細胞の影響は、腺房前駆細胞にコリン作動性模倣物を添加することにより再現され得ることを、さらに示した。したがって、組織内のＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞を含む前駆細胞をコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬で直接標的化することによって、唾液腺の分泌部を再生して、機能的唾液腺房の回復を提供し、放射線療法後またはシェーグレン症候群に関連する口腔乾燥症などの口腔障害を治療することができる。特に、アルギネートヒドロゲルに封入されたセビメリンなどのムスカリン作動薬を含む製剤は、唾液腺への局所投与のために製剤化することができ、口腔乾燥症の治療において使用することができる（実施例２）。

【0033】

本発明の組成物、方法、およびキットを説明する前に、本発明は記載された特定の方法または組成物に限定されるものではなく、それ自体が勿論、変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

【0034】

値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までのそれぞれの間に介在する値もまた、具体的に開示されていることが理解される。任意の記載値または記載された範囲内の間に介在する値と、任意の他の記載値またはその記載された範囲内の間に介在する値との間の、それぞれより小さい範囲が、本発明に包含される。これらの小さい範囲の上限および下限は、独立して範囲に含まれていても、除外されていてもよく、いずれか、どちらでもない、または両方の限定が小さい範囲に含まれている各範囲も、記載されている範囲の中で任意の具体的に除外されている限定に従うことを条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限定の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限定のいずれかまたは両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。

【0035】

別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験に使用することができるが、ここでは、いくつかの潜在的かつ好ましい方法および材料を説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本開示は、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先されることを理解されたい。

【0036】

本開示を読むことで当業者に明らかになるように、本明細書に記載および例示される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分離され得るか、またはそれと組み合わされ得る別個の構成要素および特徴を有する。任意の記載された方法は、記載された事象の順序、または論理的に可能な任意の他の順序で実行することができる。

【0037】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」への言及は、複数のかかる細胞を含み、「ｔｈｅ ａｇｏｎｉｓｔ（作動薬）」への言及は、例えば当業者に既知のリガンドおよび活性化因子など１つ以上の作動薬およびその等価物への言及を含む。

【0038】

本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前に専らそれらの開示のために提供されている。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が先行発明を理由に、そのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。

【0039】

定義
「約」という用語は、特に所与の量に関して、プラスまたはマイナス５％の偏差を包含することを意味する。

【0040】

「薬剤」という用語は、薬学的組成物および診断組成物を調製するために使用され得るすべての材料、またはすべて本発明に従う、そのような目的のために独立して使用され得る小さな合成もしくは天然由来の有機化合物、核酸、ポリペプチド、抗体、断片、アイソフォーム、変異体、または他の材料などの化合物であり得るすべての材料を指す。

【0041】

「作動薬」という用語は、特定の受容体に結合し、細胞内で応答を引き起こす物質を指す。それは、同じ受容体に結合する内因性リガンド（ホルモンまたは神経伝達物質など）の作用を模倣する。「完全作動薬」は、受容体に結合し（に対する親和性を有し）、受容体を活性化し、その受容体で完全な有効性を示す。完全作動薬として作用する薬物の一例は、βアドレナリン受容体におけるアセチルコリンの作用を模倣するイソプロテレノールである。「部分作動薬」（ブスピロン、アリピプラゾール、ブプレノルフィン、またはノルクロザピンなど）は、所与の受容体にも結合し、活性化するが、完全作動薬と比較して受容体において部分的な有効性のみを有する。

【0042】

「部分作動薬」はまた、作動薬効果および拮抗薬効果の両方を示すリガンドとみなされ得、完全作動薬および部分作動薬の両方が存在する場合、部分作動薬は実際に競合的な拮抗薬として作用し、受容体占有について完全作動薬と競合し、完全作動薬単独で観察される受容体活性化の正味の減少を生じる。「共作動薬（ｃｏ－ａｇｏｎｉｓｔ）」は、他の共作動薬と協力して、所望の効果を一緒に生じる。拮抗薬は、作動薬による受容体の活性化を遮断する。受容体は、内因性（ホルモンおよび神経伝達物質など）または外因性（薬物など）作動薬および拮抗薬のいずれかによって活性化または不活性化され、その結果生物学的応答を刺激または阻害することができる。リガンドは、エフェクター経路に応じて、同じ受容体で作動薬および拮抗薬として同時に作用させることができる。

【0043】

作動薬の効力は、通常、そのＥＣ_５０値によって定義される。これは、所与の作動薬について、作動薬の最大生物学的応答の半分を誘発するのに必要な作動薬の濃度を決定することによって算出することができる。ＥＣ_５０値を明らかにすることは、生理学的に類似の効果を生じる類似の有効性を有する薬物の効力を比較するのに有用である。ＥＣ_５０が低いほど、作動薬の効力が高くなり、最大生物学的応答を誘発するために必要とされる薬物濃度が低くなる。

【0044】

本明細書で使用される場合、「生体適合性基質」は、１つ以上のコリン作動薬および／もしくはムスカリン作動薬を封入するために使用され得るか、または細胞集団をその上に沈着させたりすることができる、対象への移植に好適な材料を指す。生体適合性基質は、一度対象に移植されると毒性または有害な影響を引き起こさない。一実施形態では、生体適合性基質は、修復または置換を必要とする所望の構造に成形することができる表面を有するポリマーである。ポリマーはまた、修理または置換を必要とする構造の一部に成形され得る。別の実施形態では、生体適合性基質は直線的に変形して唾液腺を充填し、唾液腺全体へ分布する。生体適合性基質は、１つ以上のコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬の持続放出を提供し、細胞がそれに付着し、その上で増殖することを可能にする支持フレームワークも提供し得る。いくつかの実施形態では、培養された細胞集団は、細胞－細胞間相互作用に必要な適切な間質距離を提供する、生体適合性基質上で増殖する。

【0045】

本明細書で使用される場合、「分化する（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）」、「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」、「分化形質転換する（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）」、または「分化転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」という用語は、概して、前駆（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）細胞または前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞が特定の細胞型に分化するプロセスを指す。この用語は、腺房前駆細胞を発現するＳＯＸ２発現などの腺房前駆細胞が分化した腺房細胞になるプロセスを指し得る。遺伝子発現および細胞表面タンパク質発現のパターンによって、分化した細胞を同定することができる。本明細書で使用される「分化する」という用語は、元のタイプの組織または細胞とは異なる性格または機能を有することを指す。したがって、「分化」は、分化するプロセスまたは行動である。

【0046】

「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」または「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「調節すること（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」という用語は、タンパク質、タンパク質をコードする核酸、経路、経路内のタンパク質などの活性を上方調節または下方調節のいずれかによって変化させる能力など、応答の上方調節（すなわち、活性化または刺激）、下方調節（すなわち、阻害または抑制）、または２つの組み合わせもしくは分離を指す。

【0047】

「口腔組織細胞」という語句は、口に由来する任意の細胞集団を指す。これらには、唾液腺、顎下腺、舌下腺、舌腺、口唇腺、頬腺、口蓋腺、線条導管、排出管、歯髄組織、象牙質、歯周組織、骨、セメント質、歯肉粘膜下組織、口腔粘膜下組織、舌および味蕾組織から単離され得る１つ以上の異なる細胞型が含まれる。好ましい実施形態では、口腔組織細胞は、唾液腺に由来する。口腔組織細胞の例としては、限定されないが、筋上皮細胞、上皮細胞などが挙げられる。

【0048】

「口腔組織」という語句は、口内に構造を形成する細胞の任意の集合体を指す。ほんの一例として、口腔組織には、唾液腺、顎下腺、舌下腺、舌腺、口唇腺、頬腺、口蓋腺、線条導管、排出管、歯髄組織、象牙質、歯周組織、骨、セメント質、歯肉粘膜下組織、口腔粘膜下組織、舌および味蕾組織が含まれる。好ましい実施形態では、口腔組織は、唾液腺である。この語句はまた、口腔組織の一部、例えば、唾液腺の一部を指す。

【0049】

「口腔組織構築物」という語句は、口腔組織細胞が播種された基質、好ましくは、生体適合性基質で、細胞が付着し、成長し、増殖し、分化し、および定植した生体適合性基質を指す。この語句はまた、口腔組織の発達の初期段階を表す新形態構造も指す。

【0050】

「唾液腺構築物」という語句は、唾液腺細胞が播種された基質、好ましくは生体適合性基質で、細胞が付着し、成長し、増殖し、分化し、および定植した生体適合性基質を指す。この語句はまた、唾液腺の発達の初期段階を表す新形態構造も指す。

【0051】

「口腔障害」という語句は、口に影響を与える疾患または障害を指す。特に、唾液の産生に影響を及ぼす疾患または障害。口腔障害の例としては、唾液腺腫瘍、嚢胞性線維症、シェーグレン症候群、唾液腺炎、耳下腺炎、唾液腺管炎（ｓｉａｌｏａｎｇｉｔｉｓ）、唾液管炎（ｓｉａｌｏｄｏｃｈｉｔｉｓ）、唾石症、唾液腺結石症（ｓｉａｌｏｄｏｃｈｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ）、粘液嚢胞、ガマ腫、分泌不全、唾液分泌過多症、流涎症、口腔乾燥症、唾液腺の良性リンパ上皮病変、唾液腺拡張（ｓｉａｌｅｃｔａｓｉａ）、唾液腺症（ｓｉａｌｏｓｉｓ）、唾液管狭窄（ｓｔｅｎｏｓｉｓ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｄｕｃｔ）、および唾液管狭窄（ｓｔｒｉｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｄｕｃｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0052】

「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、療法、防止および予防を指し、特に、予防（防止）のために、または虚弱もしくは病弊もしくは病態もしくは事象の程度もしくは発生の可能性を治癒または低減するために、患者に薬を投与すること、または医療処置を行うことを指す。本明細書に記載の薬剤を使用する治療は、唾液腺の再生および／または唾液腺における腺房細胞の置換を刺激または促進するために提供され得る。

【0053】

「個体」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、これらに限定されないが、ヒトならびに、チンパンジーおよび他の類人猿などの非ヒト霊長類を含む他の霊長類、ならびにサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどの飼育哺乳動物；マウス、ラット、およびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物；鶏、七面鳥、および他の家禽鳥、アヒル、ガチョウなどの飼育鳥、野鳥および狩猟鳥類を含む鳥類を含む、脊索動物亜門の任意のメンバーを指す。場合によっては、本発明の方法は、実験動物で、獣医学的用途で、ならびにマウス、ラット、およびハムスターを含むげっ歯類、霊長類、およびトランスジェニック動物を含むがこれらに限定されない、疾患のための動物モデルの開発で使用される。

【0054】

「治療有効用量」または「治療用量」は、所望の臨床結果をもたらす（すなわち、治療有効性を達成する）ために十分な量である。治療有効用量は、１回以上の投与で投与することができる。

【0055】

コリン作動薬（例えば、アセチルコリンもしくはカルバコール）および／またはムスカリン作動薬（例えば、ヒドロゲルに封入されたセビメリン）を含む組成物の「治療有効用量または量」によって、本明細書に記載されるように投与された場合、口腔乾燥症からの回復の改善などの陽性の治療応答をもたらす量が意図される。回復の改善には、唾液腺機能の改善、ならびに唾液産生および唾液流量の増加が含まれ得る。さらに、治療有効用量または量は、腺房細胞および腺房細胞前駆体の増殖を刺激し、腺房細胞による唾液腺の再増殖をもたらし得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、治療される状態の重症度、使用される特定の１つまたは複数の薬物、投与様式などに応じて、対象によって異なる。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、本明細書に提供される情報に基づいて、日常的な実験を使用して、当業者によって決定され得る。治療有効用量は、１回以上の投与で投与することができる。

【0056】

「薬学的に許容される」という語句は、ヒト（または獣医学的使用の場合には非ヒト動物）に投与されるときに生理学的に許容され、典型的には急性胃蠕動（ｇａｓｔｒｉｃ ｕｐｓｅｔ）、めまいなどのアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または動物、特にヒトにおいて使用するための米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる薬学的担体は、水、ならびに石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、を含む油などの滅菌液体であり得る。水または水溶液生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、特に注入可能な溶液のための担体として好ましく使用される。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。

【0057】

「薬学的に許容される賦形剤」とは、一般的に安全であり、無毒であり、かつ望ましい薬学的組成物を調製する際に有用である賦形剤を意味し、獣医学的使用およびヒトの薬学的使用のために許容される賦形剤を含む。かかる賦形剤は、固体、液体、半固体、または、エアロゾル組成物の場合、気体であり得る。

【0058】

「薬学的に許容される塩」としては、限定されないが、アミノ酸塩、塩化物、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化物、および硝酸塩などの無機酸で調製された塩、または前述のいずれかの対応する無機酸形態から調製された塩、例えば、塩酸塩などの塩、またはリンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、エチルコハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、パラ－トルエンスルホン酸塩、パルモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、サリチル酸塩およびステアリン酸塩などの有機酸で調製された塩、ならびにエストレート、グルセプテートおよびラクトビオネート塩が挙げられる。同様に、薬学的に許容されるカチオンを含有する塩としては、限定されないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、およびアンモニウム（置換アンモニウムを含む）が挙げられる。

【0059】

本明細書で使用される場合、「造影剤」という用語は、対象の体内の標的組織、流体、または構造（例えば、唾液腺）の医用画像化のためのコントラストを改善する物質を指す。例示的な造影剤としては、超音波造影剤（例えば、六フッ化硫黄を含むＳｏｎｏＶｕｅマイクロバブル、アルブミンシェルおよびオクタフルオロプロパンガスコアを含むＯｐｔｉｓｏｎマイクロバブル、脂質／ガラクトースシェルおよび空気コアを含むＬｅｖｏｖｉｓｔマイクロバブル、パーフルオロカーボンマイクロバブルを含むペルフレキサン脂質マイクロスフェア、ならびに外側脂質シェルに封入されたオクタフルオロプロパンを含むペルフルトレン脂質マイクロスフェア）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）造影剤（例えば、ガドジアミド、ガドベン酸、ガドペンテト酸、ガドテリドール、ガドフォスベセット、ガドベルセタミド、ガドキセト酸）、ならびに例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、Ｘ線撮影、または蛍光透視のための放射線造影剤（例えば、ジアトリゾ酸、メトリゾ酸、ヨーダミド、イオタラム酸、イオキシタラム酸、イオグリシン酸、アセトリゾ酸、イオカルミン酸、メチオダール、ジオドン、メトリザミド、イオへキソール、イオキサグル酸、イオパミドール、イオプロミド、イオトロラン、イオベルソール、イオペントール、イオジキサノール、イオメプロール、イオビトリドール、イオキシラン、ヨードキサム酸、イオトロクス酸、イオグリカム酸、アジピオドン、イオベンザミン酸、イオパノ酸、イオセタム酸、イポダートナトリウム、チロパノ酸、およびイポダートカルシウム）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

腺房細胞の置換を促進することによる唾液腺の再生
腺房細胞の置換を促進することによる唾液腺の再生のための組成物および方法が提供される。唾液腺の再生は、口腔乾燥症の永続的な緩和をもたらす可能性がある。自律神経系は唾液腺、筋上皮、血管および介在された導管細胞を神経支配する。唾液腺房細胞は、唾液中の液体、電解質、タンパク質のほとんどを分泌する。神経伝達物質受容体は、ａ－アドレナリン作動性、β－アドレナリン作動性、Ｍ３ムスカリン作動性、およびコリン作動性サブスタンスＰ受容体を有する腺房細胞の側底膜上に存在する。タンパク質エキソサイトーシスの主要な経路はβアドレナリン受容体の活性化を介して生じる（交感神経経路）が、体液分泌の主要な刺激はＭ３ムスカリン受容体の活性化を介して生じる（副交感神経経路）。

【0061】

成人唾液腺におけるＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞を含む前駆細胞が、放射線誘発損傷後に組織を再増殖させる予期しない能力を備えた腺房の補充に不可欠であることが見出された。また、コリン作動性神経が恒常性維持の間、腺房細胞置換を制御する上で極めて重要な役割を果たし、この神経細胞の影響は、腺房前駆細胞にコリン作動性模倣物を添加することにより再現され得ることも見出された。したがって、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬で組織内の腺房前駆細胞を直接標的化することによって、またはコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬で移植および活性化するために腺房前駆細胞を単離および増大することによって、唾液腺の分泌部を再生して、機能的唾液腺房の回復を提供し、放射線療法後またはシェーグレン症候群に関連する口腔乾燥症などの口腔障害を治療することができる。腸、腺胃、気管、および味蕾などの所与の臓器は、ＳＯＸ２を発現し、自律神経系によって強く神経支配され、癌を排除するための治療放射線によって損傷を受けるため、このような戦略は、多臓器系の修復に適用可能であり得る。

【0062】

いくつかの実施形態では、唾液腺再生を促進することを必要とする対象における唾液腺再生を促進する方法は、唾液腺の腺前駆細胞に、コリン作動薬またはムスカリン作動薬のうちの少なくとも１つを投与して、腺房細胞の生成を促進することを含む。コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬は、ヒト唾液腺において腺房を維持することが見出された副交感神経アセチルコリン／ムスカリンシグナル伝達を模倣することができる。いくつかの実施形態では、腺房細胞増殖を促進し、唾液産生を増加させるために、１つ以上のコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬を唾液腺に局所的に投与する。

【0063】

いくつかの実施形態では、１つ以上のコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬が投与される腺房前駆細胞は、ＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞を含む。ＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞は、ＡＱＰ５７Ｋｉ６７^＋細胞および／またはムチン（ＭＵＣ）１９－細胞を含んでもよい。内因性腺房前駆細胞をコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬に曝露すると、腺房前駆細胞が増殖し、分泌性腺房細胞が発達する。かかる処置を使用して、例えば、唾液流量を回復することによって、口腔障害、例えば、唾液腺障害を有する対象を治療するために、機能的分泌腺房細胞を唾液腺に再増殖させることができる。唾液腺障害の改善、ならびに唾液の産生および分泌について治療後に対象を監視することができる。

【0064】

いくつかの実施形態では、コリン作動薬は、アセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、メタコリン、アレコリン、ニコチン、ガランタミン、セビメリン、レバミゾール、ムスカリン、ピロカルピン、ドネペジル、エドロホニウム、ネオスチグミン、フィゾスチグミン、ピリドスチグミン、リバスチグミン、タクリン、カフェイン、フペルジン、エコチオフェート、イソフルロフェート、シサプリド、ドロペリドール、ドンペリドン、メトクロプラミド、リスペリドン、およびパリペリドンからなる群から選択され得る。他の実施形態では、コリン作動薬は、アセチルコリンまたはアセチルコリン類似体のうちの少なくとも１つを含み得る。例えば、アセチルコリン類似体は、カルバコールを含むことができる。

【0065】

いくつかの実施形態では、ムスカリン作動薬は、ムスカリン性アセチルコリン受容体（「ムスカリン受容体」）を活性化する作動薬を含み得る。ムスカリン受容体は、Ｍ１～Ｍ５という名前の５つのサブタイプに分けられる。ムスカリン作動薬としては、以下に限定されないが、ピロカルピン、アセクリジン、キサノメリン、タルサクリジン、サブコメリン、セビメリン、アルバメリン、アレコリン、ミラメリン、ＳＤＺ－２１０－０８６、ＹＭ－７９６、ＲＳ－８６、ＣＤＤ－０１０２Ａ（５－［３－エチル－１，２，４－オキサジアゾール－５－イル］－１，４，５，６－テトラヒドロピリミジン塩酸塩）、Ｎ－アリール尿素－置換３－モルホリンアレコリン、ＶＵＯ２５５－０３５（Ｎ－［３－オキソ－３－［４－（４－ピリジニル）－１－ピペラジニル］プロピル］－２，１，３－ベンゾチアジアゾール－４－スルホンアミド）、ベンジルキノロンカルボン酸（ＢＱＣＡ）、ＷＡＹ－１３２９８３、ＡＦＢ２６７Ｂ（ＮＧＸ２６７）、ＡＣ－４２、ＡＣ－２６０５８４、クロロピラジン（限定されないが、Ｌ－６８７、３０６、Ｌ－６８９－６６０、７７－ＬＨ－２８－１、およびＬＹ５９３０３９を含む）、ならびに置換された窒素（複数可）および／または酸素（複数可）を含めて、特にエステル、硫黄、または５もしくは６個の炭素環構造を含む、１つ以上の炭素置換を有する任意のキニクリジン環、または
それらの任意の薬学的に許容される塩、エステル、類似体、プロドラッグまたはそれらの誘導体、が挙げられる。いくつかの実施形態では、セビメリンなどのＭ１および／またはＭ３ムスカリン受容体サブタイプに対して選択的なムスカリン作動薬が使用される。

【0066】

コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬は、インビボまたはエクスビボでＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞を含む腺房前駆細胞に投与され得る薬学的組成物に提供され得る。薬学的組成物は、様々な剤形に製剤化され得る。投薬量は、腺房細胞の置換ならびに／または腺房前駆細胞の維持および生存を促進するための薬学的または治療有効量であり得る。

【0067】

本明細書に記載のコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬の治療有効投薬量は、様々な実施形態において様々な量で存在し得る。例えば、いくつかの実施形態では、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬の治療有効量は、約１０～１０００ｍｇ（例えば、約２０ｍｇ～１，０００ｍｇ、３０ｍｇ～１，０００ｍｇ、４０ｍｇ～１，０００ｍｇ、５０ｍｇ～１，０００ｍｇ、６０ｍｇ～１，０００ｍｇ、７０ｍｇ～１，０００ｍｇ、８０ｍｇ～１，０００ｍｇ、９０ｍｇ～１，０００ｍｇ、約１０～９００ｍｇ、１０～８００ｍｇ、１０～７００ｍｇ、１０～６００ｍｇ、１０～５００ｍｇ、１００～１０００ｍｇ、１００～９００ｍｇ、１００～８００ｍｇ、１００～７００ｍｇ、１００～６００ｍｇ、１００～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１００～３００ｍｇ、２００～１０００ｍｇ、２００～９００ｍｇ、２００～８００ｍｇ、２００～７００ｍｇ、２００～６００ｍｇ、２００～５００ｍｇ、２００～４００ｍｇ、３００～１０００ｍｇ、３００～９００ｍｇ、３００～８００ｍｇ、３００～７００ｍｇ、３００～６００ｍｇ、３００～５００ｍｇ、４００ｍｇ～１，０００ｍｇ、５００ｍｇ～１，０００ｍｇ、１００ｍｇ～９００ｍｇ、２００ｍｇ～８００ｍｇ、３００ｍｇ～７００ｍｇ、４００ｍｇ～７００ｍｇ、および５００ｍｇ～６００ｍｇ）の範囲の量であってよい。いくつかの実施形態では、１５－ＰＧＤＨ阻害剤は、約１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ以上の量で存在する。いくつかの実施形態では、１５－ＰＧＤＨ阻害剤は、約１０００ｍｇ、９５０ｍｇ、９００ｍｇ、８５０ｍｇ、８００ｍｇ、７５０ｍｇ、７００ｍｇ、６５０ｍｇ、６００ｍｇ、５５０ｍｇ、５００ｍｇ、４５０ｍｇ、４００ｍｇ、３５０ｍｇ、３００ｍｇ、２５０ｍｇ、２００ｍｇ、１５０ｍｇ、または１００ｍｇ以下の量で存在する。

【0068】

他の実施形態では、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬の治療有効投薬量は、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～４００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～３００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～２００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～９０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～８０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～７０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～４０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重体重であってよい。

【0069】

さらに他の実施形態では、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬の治療有効投薬量は、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．１ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重／ｋｇ体重～０．０１２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００２ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。

【0070】

いくつかの実施形態では、治療有効用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００４ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００６ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００７ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００８ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００９ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重、０．００２ｍｇ／ｋｇ体重、０．００３ｍｇ／ｋｇ体重、０．００４ｍｇ／ｋｇ体重、０．００５ｍｇ／ｋｇ体重、０．００６ｍｇ／ｋｇ体重、０．００７ｍｇ／ｋｇ体重、０．００８ｍｇ／ｋｇ体重、０．００９ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。特定の個体の有効用量は、個体のニーズに応じて、経時的に変化（例えば、増加または減少）し得る。

【0071】

いくつかの実施形態では、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬の治療有効投薬量は、１０ｐｇ／ｋｇ／日、５０ｐｇ／ｋｇ／日、１００ｐｇ／ｋｇ／日、２５０ｐｇ／ｋｇ／日、５００ｐｇ／ｋｇ／日、１０００ｐｇ／ｋｇ／日以上の投薬量であり得る。様々な実施形態では、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬の量は、０．０１ｐｇ／ｋｇ～１０ｐｇ／ｋｇ、０．１ｐｇ／ｋｇ～５ｐｇ／ｋｇ、０．１ｐｇ／ｋｇ～１０００ｐｇ／ｋｇ、０．１ｐｇ／ｋｇ～９００ｐｇ／ｋｇ、０．１ｐｇ／ｋｇ～９００ｐｇ／ｋｇ、０．１ｐｇ／ｋｇ～８００ｐｇ／ｋｇ、０．１ｐｇ／ｋｇ～７００ｐｇ／ｋｇ、０．１ｐｇ／ｋｇ～６００ｐｇ／ｋｇ、０．１ｐｇ／ｋｇ～５００ｐｇ／ｋｇ、または０．１ｐｇ／ｋｇ～４００ｐｇ／ｋｇの投薬量を患者に提供するのに十分である。

【0072】

様々な実施形態は、異なる投与レジメンを含み得る。いくつかの実施形態では、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬は、隔月、毎月、毎月２回、３週間毎、隔週、毎週、週２回、週３回、毎日、１日２回、または別の臨床的に望ましい投薬スケジュールで投与することができる。単一の対象に対する投与レジメンは、一定の間隔である必要はないが、対象のニーズに応じて経時的に変化し得る。

【0073】

治療される対象、投与様式、および所望の治療の種類、例えば、防止、予防、療法に応じて、組成物は、これらのパラメータと一致する方法で製剤化される。そのような技術の要約は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに記載されている。

【0074】

有効成分として小有機分子ポリペプチド、類似体、または活性断片を含有する治療組成物の調製は、当該技術分野において十分に理解されている。本発明の組成物は、非経口的に、局所的に、または移植されたリザーバを介して投与され得る。そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注入可能なものとして調製され得るが、注入前の液体中の溶液または液体中の懸濁液に好適な固体形態も調製され得る。調製物を乳化することもできる。有効治療成分は、多くの場合、薬学的に許容され、有効成分に適合する賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。製剤は、概して、希釈剤、ならびに場合によっては、アジュバント、緩衝液、防腐剤などを含む。さらに、必要に応じて、組成物は、有効成分の有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有することができる。

【0075】

組成物はまた、当業者に既知の様々な技術を使用して、対象の部位に局所投与され得る。例えば、これらは、スプレー、ローション、ゲル、またはアルコール、ポリグリコール、エステル、油、およびシリコーンなどの他のビヒクルを含み得る。本明細書に記載の組成物の投与は、頻度、投薬量、持続時間モード、および投与の経路を含む様々な投与パラメータを較正することによって、薬物動態的および薬力学的に制御され得る。投薬量、持続時間、および投与様式の変化もまた、必要な活性を生じるように操作され得る。治療組成物は、従来の方式で例えば、単位用量の注入によって、例えば静脈内に単位用量の形態で投与される。本発明の治療組成物に関して使用される場合の「単位用量」という用語は、ヒトに対する単位となる投薬量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性物質の所定の量を含有する。

【0076】

組成物は、対象を治療するために選択される薬剤、剤形と適合する様式で、かつ治療有効量で投与することができる。インビトロで所望の効果を達成することを所望する場合、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬の有効量は、約０．１ｎＭ～約１０Ｍ、より好ましくは約０．１ｎＭ～約５Ｍ、および最も好ましくは約０．１ｎＭ～約１Ｍの範囲であり得る。所望の効果は、腺房細胞の置換ならびに／または腺房前駆細胞の維持および生存を促進するための薬剤の効果を指す。投与される必要がある有効成分の正確な量は、施術者の判断に依存し、各個体に固有である。

【0077】

本明細書に記載の薬剤は、病変部位での投与のために改変または製剤化され得る。かかる改変は、例えば、特に環境において、化合物または組成物の半減期を促進または延長する製剤を含み得る。加えて、そのような改変は、腺房前駆細胞への化合物／組成物の取り込みを促進または増強する、標的タンパク質または配列を含むための化合物または組成物の製剤を含み得る。特定の実施形態では、そのような改変は、他の位置または細胞と比較して、唾液腺におけるＳＯＸ２^＋腺房前駆細胞への化合物の優先的な標的化をもたらす。

【0078】

組成物の滅菌注入可能形態は、水性または油性懸濁液であり得る。懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当該技術において既知の技術に従って製剤化され得る。注入可能な滅菌調製物はまた、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の注入可能な滅菌溶液または懸濁液でもあり得る。利用できる許容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来から利用されている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の刺激の少ない固定油を利用することができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に許容される油、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンと同様に、注入剤の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、エマルションおよび懸濁液を含む薬学的に許容される剤形の製剤化に一般的に使用される、カルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤などの長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含有してもよい。薬学的に許容可能な固体、液体、または他の剤形の製造に一般的に使用される、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎｓ、および他の乳化剤のような他の一般的に使用される界面活性剤またはバイオアベイラビリティ増強剤もまた、製剤化の目的のために使用され得る。

【0079】

非経口製剤は、単回ボーラス投与、注入またはローディングボーラス投与、その後の維持投与が可能である。これらの組成物は、１日に１回、または「必要に応じて」投与され得る。薬学的組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または溶液を含む、任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体としては、ラクトースおよびコーンデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も典型的には添加される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用に水性懸濁液が必要な場合、有効成分は、乳化剤および懸濁化剤と組み合わされる。必要に応じて、特定の甘味剤、香味剤、または着色剤もまた添加してもよい。あるいは、薬学的組成物は、直腸投与のための座薬の形態で投与され得る。これらは、室温では固体であるが直腸温度では液体であるため、直腸内で融解して薬物を放出する好適な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することによって、調製することができる。そのような材料としては、カカオバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。本発明の薬学的組成物は、局所投与することもできる。局所適用は、直腸座薬製剤（上記参照）または好適な浣腸製剤で行うことができる。局所経皮パッチも使用され得る。局所適用のために、薬学的組成物は、１つ以上の担体中に懸濁または溶解させた活性成分を含有する適切な軟膏に製剤化することができる。本発明の化合物の局所投与のための担体としては、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水が挙げられる。あるいは、薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適なローションまたはクリームに製剤化することができる。好適な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が挙げられるが、これらに限定されない。

【0080】

いくつかの実施形態では、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬は、内因性唾液腺腺房前駆細胞へのコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬の制御放出を提供するように製剤化することができる。制御放出は、遅延放出、持続放出、勾配放出、時間放出、パターン化放出、または空間的放出のうちの少なくとも１つを含み得る。遅延放出、持続放出、勾配放出、時間放出、パターン化放出、または空間的放出は、経時的に有効成分への放出を可能にするために医学で使用される機構である。制御放出製剤の利点は、それらが同じ活性化合物の即時放出製剤よりも少ない頻度で規定された放出パターンで送達されることである。

【0081】

制御放出製剤は、投与後または薬剤の遅延放出に関連する遅延期間の後に、最大約１時間、約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間以上、指定された延長期間にわたって一定の薬剤レベルを維持するように、所定の速度で活性薬剤を放出するように設計することができる。ある特定の実施形態では、活性薬剤は、約１週間～約２週間以上の時間間隔にわたって放出される。あるいは、活性薬剤は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または最大１４日間、最大２０日間、最大３０日間もしくはそれ以上の間放出され得る。さらに他の実施形態では、活性薬剤は、投与後、約１週間～約３週間以上の期間にわたって放出される。

【0082】

他の実施形態では、コリン作動薬またはムスカリン作動薬は、対象に投与され得る生体適合性担体、マトリックスまたは足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）に提供される。例として、生体適合性基質は、ポリマーマクロ足場またはマイクロ足場と、ポリマーマクロ足場またはマイクロ足場上にまたはその中に組み込まれる少なくとも１つの担体材料と、を含むことができる。少なくとも１つの担体材料、マトリックス、または足場は、少なくとも１つのコリン作動薬またはムスカリン作動薬を内因性唾液腺房前駆細胞に運び、かつ差次的に、および／または制御可能に放出することができる材料を含み得る。

【0083】

担体、マトリックス、または足場は、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬が組み込まれることを可能にし、増大した腺房前駆細胞（例えば、ＳＯＸ２^＋細胞）の添加にまたは細胞の存在下で適合性であリ得る、任意の材料のものであってよい。担体、マトリックス、または足場は、主に非免疫原性であり、生分解性であり得る。生分解性材料の例としては、アルギネート、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ヒアルロン酸、カットグット縫合材料、ゼラチン、セルロース、ニトロセルロース、コラーゲン、アルブミン、フィブリン、コットン、または他の天然に存在する生分解性材料が挙げられるが、これらに限定されない。投与または移植の前に、例えば、エチレンオキシドで処理することによって、またはガンマ照射もしくは電子ビームで照射することによって、マトリックスまたは足場材料を滅菌することが好ましい場合がある。加えて、以下に限定されないが、ナイロン（ポリアミド）、ダクロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物（例えば、ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、テフロン（登録商標））、サーマノックス（ＴＰＸ）、ヒドロキシ酸のポリマー、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、およびポリ乳酸－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、ならびに様々なポリヒドロキシアルカノエート、ならびにそれらの組み合わせを含む、他の多くの材料を使用して、足場またはフレームワーク構造を形成することができる。

【0084】

好適なマトリックスとしては、ポリマーメッシュまたはスポンジ、およびポリマーヒドロゲルが挙げられる。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然または合成）が共有結合、イオン結合、または水素結合を介して架橋され、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元オープンラティス（ｏｐｅｎ－ｌａｔｔｉｃｅ）構造を作成したときに形成される物質として定義される。一般に、これらのポリマーは、荷電側基を有する水、緩衝塩溶液、もしくは水性アルコール溶液、またはそれらの一価イオン塩などの水溶液中に少なくとも部分的に可溶性である。

【0085】

いくつかの実施形態では、マトリックスは、１年未満、より好ましくは６ヶ月未満、最も好ましくは２～１０週間にわたって生分解性である。ポリマー組成、ならびに製造方法を、分解速度を決定するために使用することができる。例えば、増加量のポリ乳酸をポリグリコール酸と混合すると、分解時間が短縮される。使用することができるポリグリコール酸のメッシュは、例えば、外科用品供給会社（例えば、Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｎ．Ｊ．）から商業的に入手することができる。

【0086】

例えば、ムスカリン作動薬は、アルギネートヒドロゲルに封入され得る。いくつかの実施形態では、封入されるムスカリン作動薬は、Ｍ１および／またはＭ３ムスカリン受容体サブタイプ（例えば、セビメリン）に対して選択的である。他の実施形態では、ムスカリン作動薬は、非選択的ムスカリン作動薬（例えば、ピロカルピン）である。ヒドロゲル中のアルギネートは、二価カチオンとイオン的に架橋され得る（例えば、セビメリンを封入する生分解性のカルシウム架橋アルギネートヒドロゲルの説明については、実施例２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ヒドロゲル中のアルギネートの濃度は、約２～約１０重量パーセント（重量％）の範囲であり、この範囲内の任意の重量％、例えば、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０重量％を含む。いくつかの実施形態では、アルギネートは、部分酸化されている。例えば、アルギネートの約２％～約１０％が、酸化され得、この範囲の任意の割合、例えば２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、または１０％を含む。一実施形態では、ヒドロゲル中のアルギネートは、約２％酸化され、５重量％の濃度である。かかるアルギネートヒドロゲルは、対象への投与後少なくとも７日間、ムスカリン作動薬の送達を維持することができる（例えば、実施例２を参照されたい）。

【0087】

封入されたコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬を含む組成物は、唾液腺への局所送達に適している。医師は、例えば、触診または医用画像化（例えば、超音波、Ｘ線撮影、またはＭＲＩ）によって注入される唾液腺の位置を特定し得る。いくつかの実施形態では、造影剤は、封入されたコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬を含む組成物中に含まれ、投与後の医用画像化によって唾液腺への組成物の局在化の確認を可能にする。いくつかの実施形態では、造影剤は、マイクロバブル（例えば、超音波で使用するため）または放射線不透過性造影剤（例えば、放射線撮影で使用するため）である。造影剤は、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬と同じ組成物中に含有され得るか、または異なる組成物中に含有され得、コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬の投与の前または後に使用され得る。

【0088】

ある特定の実施形態では、組成物は、唾液腺にまたは唾液腺に隣接して注入される。主題の方法によって治療され得る唾液腺には、耳下腺、顎下腺、および舌下腺、ならびに漿液性、粘液性、または漿粘液性唾液腺を含む少数の唾液腺が含まれるが、これらに限定されない。

【0089】

いくつかの実施形態では、治療される対象は、唾液の産生に影響を及ぼす障害などの口腔障害を有する。口腔障害の例としては、唾液腺腫瘍、嚢胞性線維症、シェーグレン症候群、唾液腺炎、耳下腺炎、唾液腺管炎（ｓｉａｌｏａｎｇｉｔｉｓ）、唾液管炎（ｓｉａｌｏｄｏｃｈｉｔｉｓ）、唾石症、唾液腺結石症（ｓｉａｌｏｄｏｃｈｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ）、粘液嚢胞、ガマ腫、分泌不全、唾液分泌過多症、流涎症、口腔乾燥症、唾液腺の良性リンパ上皮病変、唾液腺拡張（ｓｉａｌｅｃｔａｓｉａ）、唾液腺症（ｓｉａｌｏｓｉｓ）、唾液管狭窄（ｓｔｅｎｏｓｉｓ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｄｕｃｔ）、および唾液管狭窄（ｓｔｒｉｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｄｕｃｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、対象は、口腔乾燥症を引き起こすのに有効な放射線で以前に治療されていてもよい。本明細書に記載される方法は、唾液の産生に影響を与えるかかる口腔障害（例えば、口腔乾燥症）についてヒト対象を治療するために使用することができる。本明細書に記載の方法はまた、例えば、イヌおよびネコなどのペット、ならびにヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマおよびウシなどの家畜を含むがこれらに限定されない飼育動物における口腔乾燥症の治療のための獣医用途での使用も見出すであろう。

【0090】

キット
また、腺房細胞生成を促進するため、コリン作動薬またはムスカリン作動薬のうちの少なくとも１つで、口腔乾燥症の対象を治療するためのキットも提供される。コリン作動薬および／またはムスカリン作動薬は、別個の組成物または同じ組成物中に含有されてもよい。キットは、本明細書に記載の治療方法で使用するのに好適なコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬を含む製剤の単位用量、例えば、注入可能な用量（複数可）を含み得る。かかるキットでは、単位用量を含有する容器に加えて、口腔乾燥症のための治療の使用およびそれに伴う利益を説明する情報の添付文書が提供される。キットには、例えば、キットに含まれるコリン作動薬および／またはムスカリン作動薬の投与レジメンが含まれ得る。

【0091】

唾液腺への局所投与に好適な製剤は、特に興味深いものであり、そのような実施形態では、キットは、そのような投与を達成するための１つ以上のシリンジまたは他のデバイスをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、組成物（例えば、凍結保存され得るアルギネートヒドロゲルに封入されたセビメリンなどのムスカリン作動薬）で予め充填された第１のシリンジまたはデバイスを含む。キットは、ルアーロックを介して第１のシリンジに接続することができる、塩化カルシウムで充填された第２のシリンジをさらに含み得る。キットは、例えば、第１のシリンジの内容物（例えば、アルギネートヒドロゲルに封入されたセビメリン）を解凍し、唾液腺に注入する前に、第２のシリンジの内容物（例えば、セビメリンを封入するカルシウム架橋アルギネートヒドロゲルを生成するＣａＣｌ_２）と混合することによって使用され得る。医師は、例えば、触診または超音波によって注入される唾液腺の位置を特定し得る。

【0092】

いくつかの実施形態では、キットは、投与後の医用画像化によって、ムスカリン作動薬（例えば、アルギネートヒドロゲルに封入されたセビメリン）を含む組成物の唾液腺への局在化の確認を可能にする造影剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、造影剤は、マイクロバブル（例えば、超音波で使用するため）または放射線不透過性造影剤（例えば、Ｘ線撮影で使用するため）である。造影剤は、ムスカリン作動薬と同じ組成物中に、または異なる組成物中に含有されてもよく、ムスカリン作動薬の投与の前または後に添加されてもよい。

【0093】

上記の構成要素に加えて、主題のキットは、（特定の実施形態では）主題の方法を実施するための説明書をさらに含み得る。これらの説明書は、様々な形態で主題のキット内に存在し得、そのうちの１つ以上が、キット内に存在し得る。これらの説明書が存在し得る１つの形態は、例えば、情報が印刷される１枚または複数枚の紙などの好適な媒体または基板上、キットのパッケージ中、添付文書などの中の印刷情報としてである。これらの説明書のさらに別の形態は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、フラッシュドライブなどである。存在し得る、これらの説明書のさらに別の形態は、隔たったサイトで情報にアクセスするために、インターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。

【0094】

本明細書に記載される他の実施形態は、本明細書に開示される本発明の仕様および実践の考慮から、当業者には明らかであろう。理由の如何を問わず、本明細書に記載されているすべての米国特許および他の参照文献は、参照により具体的に組み込まれる。本明細書および実施例は、以下の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および精神をもって、単なる例示とみなされるべきである。

【実施例】

【0095】

以下の実施例は、当業者に、本発明の作製および使用方法の完全な開示および説明を提供するために提示されるものであり、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が行われるすべてまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に対する正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別様に示されない限り、部とは重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。

【0096】

本明細書で引用されるすべての刊行物および特許出願は、各々個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0097】

本発明は、本発明の実施のための好ましいモードを含むように、本発明者によって見出されるか、または提供される特定の実施形態に関して説明されている。当業者は、本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態で多数の修正および変更を行うことができることを理解されたい。例えば、コドン冗長性によって、タンパク質配列に影響を与えることなく、基礎となるＤＮＡ配列の変更を行うことができる。生物学的機能的等価性を考慮することによって、種類または量において生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造の変更を行うことができる。かかる修正はすべて、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

【0098】

実施例１
前駆細胞依存性機構を介したコリン作動性活性化に応答した放射線照射後の唾液腺房の再生
序論
治療用放射線は、癌患者のための救命治療であり続け、頭頸部の悪性腫瘍を含む様々な悪性腫瘍に利用される。実際、頭頸部癌に罹患している患者の大多数は、化学療法および手術に加えて放射線療法を受けるであろう（米国では、年間６０，０００人の新規患者；Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。この併用治療は、腫瘍を排除する上で非常に有効であるが、重度の副作用は、放射線照射の範囲にある健康な組織の損傷および／または破壊である。かかる臓器としては、低線量の放射線照射後であっても組織機能障害を示す、唾液腺が挙げられる（Ｇｒｕｎｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。日常的に患者に与えられる高線量（６０Ｇｙ）では、標的外放射線照射が唾液を合成する腺房細胞を破壊し（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｒｅｄｍａｎ，２００８）、生涯にわたるドライマウスおよび併存疾患をもたらす（例えば、虫歯、口腔感染症、創傷治癒不良（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９７５、Ｄｒｅｉｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７７、Ｄｕｓｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。３つの主要唾液腺（耳下腺）のうちの１つを温存するための強度変調放射線では成功しているが、腫瘍部位への腺の近接は、しばしばこの技法の適用を妨げ、８０％の頭頸部癌患者がドライマウス症候群を有する（Ｌｅｅ＆Ｌｅ，２００８）。

【0099】

肺、心臓、および膀胱を含む放射線照射によって損傷されたすべての他の臓器と同様に（Ｅｍａｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、組織機能を改善または回復するために利用可能な治療法は、あるとしてもごくわずかである。放射線誘発性唾液機能障害および変性を患う癌生存者のための現在の治療選択肢は、症状の短期的な緩和に焦点を当てているが、長期的な回復療法は利用できない。内因性幹細胞の再活性化または非照射幹細胞の移植などの再生戦略が提案されている（Ｌｏｍｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｐｒｉｎｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。しかしながら、これらの適用は、恒常的または傷害条件下で腺房に寄与する成人唾液前駆細胞の同一性に関する知識の乏しさによって制限される。腺房細胞は、定義された前駆体からではなく自己複製によって誘導されることが最近提案されたが（Ａｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、前駆体様活性のためのこれらの細胞の亜集団の分析は実行されなかった。自己複製または前駆細胞増殖のいずれかを介して、腺房細胞が遺伝毒性損傷後に細胞を再増殖できるかどうかもまた決定されていない。多数の研究は、照射された唾液腺を変性のモデルとして利用している（Ｚｅｉｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｃｏｐｐｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，２００２）が、放射線照射によって損傷された成人の唾液細胞の再生能力はインビボでは調査されていない。

【0100】

唾液腺の恒常性維持の間に腺房細胞がどのように置き換えられるかもよく分かっていない。過去１５０年間にわたる成人器官の研究は、末梢神経が器官および組織の完全性の維持に不可欠であることを明らかに示している（Ｅｒｂ，１８６８）。骨格筋は、運動神経の刺激の不在下で萎縮し（Ｆｕ＆Ｇｏｒｄｏｎ，１９９５、Ｂａｔｔ＆Ｂａｉｎ，２０１３）、茸状の味蕾（Ｖｏｎ Ｖｉｎｔｓｃｈｇａｕ＆Ｈｏｎｉｇｓｃｈｍｉｅｄ，１８７７）、前立腺（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｌｕｊａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、ならびに唾液腺などの上皮器官は感覚神経および／または自律神経を除去後に退縮する（Ｓｃｈｎｅｙｅｒ＆Ｈａｌｌ，１９６７、Ｍａｎｄｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７、Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。これらの器官について、神経が組織の恒常性をどのように制御するかは不明であるが、皮膚における研究では、ソニックヘッジホッグ分泌を通じて、感覚神経が、成人上皮幹細胞の自己再生を促進し、その結果、皮膚における下流細胞系統、すなわちドーム細胞の維持を促進することを示す（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。加えて、サンショウウオ（Ｗａｌｌａｃｅ，１９７２）および胎生唾液腺（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１３）における研究は、末梢神経が、多能性幹細胞の活性化を介して組織を再生する能力を有することを示唆しているが、成体哺乳動物系におけるその証拠は欠如している。

【0101】

マウス遺伝学、エクスビボ培養、およびヒト組織外植片の組み合わせを使用して、唾液腺房が放射線照射後に再生可能であり、前駆細胞依存性機構を介したコリン作動性活性化に応答して再生することを予期せず発見した。我々は、ＳＯＸ２が恒常性維持の間および放射線誘発傷害後に腺房細胞を置き換えることができる腺房系統の唯一の前駆体であることを示し、唾液前駆体が少なくとも短期的に遺伝毒性ショックに耐えることができることを示している。重要なことに、コリン作動性模倣物による、健康な組織および照射された組織の処理は、腺房細胞の補充を刺激した。したがって、我々のデータは、遺伝毒性ショック下であっても組織の広範な再生能力を明らかにし、ＳＯＸ２^＋細胞の標的化が放射線療法によって損傷された組織を再生するための治療アプローチであり得ることを示唆している。

【0102】

結果
ＳＯＸ２は、唾液腺恒常性維持の間に腺房細胞を生じさせるが、導管細胞を生じさせない前駆細胞をマークする
ＳＯＸ２は、胎児マウスの下顎および舌下唾液腺において前駆細胞マーカーとして確立されているが、成体組織中のＳＯＸ２^＋細胞が腺房および導管細胞も産生するかどうかは不明である（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｅｍｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。さらに、これらの細胞が成人ヒト唾液腺にも存在するかどうかは、分かっていない。ＳＯＸ２は、主要な成人ヒト唾液腺［図１Ａ、顎下腺（ＳＭＧ）、舌下腺（ＳＬＧ）、耳下腺（ＰＧ）］の３つすべてにおいて、腺房細胞のサブセットによって発現することが見出された。マウスでは、ＳＯＸ２タンパク質は、成体マウスＳＬＧ（ＳＭＧおよびＰＧには存在しない、図１Ｂおよび１０Ａ）に限定され、未分化アクアポリン（ＡＱＰ）５陽性、ムチン（ＭＵＣ）１９－陰性腺房細胞（すべてのＡＱＰ５^＋腺房細胞の２１±４％、図１Ｃおよび１Ｄ）によって発現されていた。前駆細胞としてのそれらの潜在的な役割と一致して、約６％のＳＯＸ２^＋ＡＱＰ５^＋細胞がＫｉ６７を共発現し（図１Ｅおよび１０Ｂ）、一方で１９±４％は細胞周期にあった（サイクリンＤ１^＋、図１０Ｃ）。ＳＯＸ２^＋細胞が腺房および導管系統に寄与したかどうかを決定するために、Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧレポーター株と交差させた、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}マウス（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）を使用して遺伝子系統追跡を実行した。Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスは、Ｃｒｅラインと交差すると、Ｃｒｅ媒介性切除前に膜標的タンデムダイマートマト（ｍＴ）、および切除後に膜標的緑色蛍光タンパク質（ｍＧ）を発現する二重蛍光レポーターである（Ｍｕｚｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７、図１０Ｄ）。このように、系統追跡された細胞は、ｍＧを発現する。図１Ｆに示されるように、ＳＯＸ２^＋細胞は、１４日または３０日後に自己再生し、ＡＱＰ５およびＭＵＣ１９によってマークされる分化腺房細胞を産生するが、ＫＲＴ８^＋導管細胞は産生しない（図１ＦおよびＥＶ１Ｅ）。したがって、我々の系統追跡結果は、ＳＯＸ２^＋細胞が、表皮、腸、および切歯において観察されたものと同様に、分化した子孫を生じる系統限定された前駆細胞であることを示す（Ｏｗｅｎｓ＆Ｗａｔｔ，２００３、Ｂａｒｋｅｒ，２０１４、Ｓｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。

【0103】

ＳＬＧとＳＭＧとの間の介在された導管に主に存在するＫＩＴ^＋細胞（Ａｎｄｒｅａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）が、成体組織の腺房細胞を生じさせることが以前に提案されていることから（Ｌｏｍｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｎａｎｄｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，２０１４、Ｐｒｉｎｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、６週齢でＲｏｓａ２６^ｍＴｍＧレポーターと交差したＫｉｔ^{ＣｒｅＥＲＴ２}プロモーターを使用して、これらの細胞を遺伝学的に追跡した。しかしながら、ＫＩＴ^＋細胞由来の腺房細胞（すなわち、ＡＱＰ５およびｍＧについての二重陽性）は、誘導の１４日後または６ヶ月後にＳＬＧまたはＳＭＧのいずれにおいても明らかには見られなかった（図１０Ｆ）。代わりに、ＫＩＴ^＋細胞は、ＳＬＧの介在導管（介在導管マーカーＫＲＴ８の共染色によって観察され得る）、ならびにＳＭＧ中の介在導管およびより大きな導管にのみに寄与した。したがって、これらのデータは、ＫＩＴ^＋細胞が、腺房系統の導管およびＳＯＸ２^＋細胞の前駆体であることを示す。

【0104】

ＳＯＸ２およびＳＯＸ２^＋細胞は、分泌性腺房の産生に不可欠である
我々の系統追跡分析は、ＳＯＸ２^＋細胞が腺房細胞を生じさせるが、導管細胞は生じさせないことを確認した。しかしながら、腺房系統に対する代替的な前駆細胞またはＴＡ細胞（ｔｒａｎｓｉｔ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｌ）を示唆するＫｉ６７^＋ＳＯＸ２^－腺房細胞（約６％ＳＯＸ２^＋Ｋｉ６７^＋および１６．５％ＳＯＸ２^－Ｋｉ６７^＋細胞、図１０Ｂ）の存在も観察したので、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}マウス（図２Ａおよび２Ｃ）を使用してＳＯＸ２^＋細胞中のＳｏｘ２を遺伝子的に取り除くか、または誘導性Ｓｏｘ２プロモーター（Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡ、図２Ｂおよび２Ｄ）の制御下で発現されるジフテリア毒素（ＤＴＡ）を使用してＳＯＸ２^＋細胞を除去することによって、ＳＬＧ維持および修復におけるＳＯＸ２およびＳＯＸ２^＋細胞の要件を調査した。後者のアッセイでは、ＳＯＸ２^＋細胞は、ＤＴＡの細胞内産生に応答して細胞死を起こす。ＳＯＸ２^＋細胞からのＳｏｘ２の除去またはＤＴＡを介したＳＯＸ２^＋細胞の排除は、ＳＯＸ２^＋およびＡＱＰ５^＋細胞を著しく枯渇させたがＫＲＴ８^＋導管細胞ではそうならず、機能的な腺房を維持するためにＳｏｘ２およびＳＯＸ２^＋細胞が必要であることを示している（図２Ａ～２Ｄ、Ｓｏｘ２またはＳＯＸ２^＋細胞の除去の効率を図１１Ａに示す）。Ｓｏｘ２の不在下で、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）^＋腺房細胞の減少によって示されるように、腺房細胞が細胞周期を終了したが、導管細胞では終了しなかった（図１１Ｄ；矢先は、ＣＣＮＤ１^＋細胞を示し、点線の白線は、導管細胞を強調する）。さらに、ＳＯＸ２^＋細胞の除去では、ＡＱＰ５^＋細胞を完全に欠く導管ネットワークの広範な領域によって示されるように、８日までに残存する腺房が少なかった（図２Ｂおよび２Ｄ、ならびに１１Ａ）（導管は、図２Ｂにおいて破線またはＫＲＴ８によってマークされる）。組織の変性が、腺房細胞置換の喪失ではなく、組織の不安定化にのみ起因する可能性を除外するために、短期除去後にＳＬＧを検査した。図８に示されるように、４日目または５日目（タモキシフェン処理の３日または４日）に、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}およびＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡＳＬＧの両方の腺にＳＯＸ２^＋細胞はほとんど残っておらず（図８Ａおよび８Ｂ）、Ｓｏｘ２転写産物は実質的に減少した（図８Ｂ）。しかしながら、腺房は、外観は無秩序で萎縮しているにもかかわらず、存在した。さらに、ＳＯＸ２^＋細胞（またはＳｏｘ２転写産物）の増加は観察されず、ＳＯＸ２が組織損傷に応答して腺房細胞で異所的に発現しないことを示した。また、組織組成の変化が組織機能の必須調節因子である神経支配の低下に起因するかどうかも決定した。しかしながら、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}ＳＬＧでは、野生型対照と同様の神経支配を測定し、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡＳＬＧでは、軸索束の有意な増加を測定した（図１１Ｂおよび１１Ｃ）。後者の発見は、細胞の除去が神経支配を促進する因子の放出を引き起こすが、神経支配の増加があっても、ＳＯＸ２＋細胞なしでは再生は不可能であることを示唆する。要約すると、これらの結果は、少なくとも試験した条件下で、ＳＯＸ２^＋細胞がＳＬＧ中の唯一の腺房前駆体であり、先に示唆されるように、完全に分化した腺房細胞の自己複製から腺房が生じないことを示す（Ａｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。表皮、腸、および切歯における研究（Ｏｗｅｎｓ＆Ｗａｔｔ，２００３、Ｂａｒｋｅｒ，２０１４、Ｓｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）と同様に、我々のデータはまた、腺房コンパートメントの急速な再増殖に関与し得るＳＯＸ２^＋細胞由来のＴＡ（ｔｒａｎｓｉｔ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）集団の存在を示唆している。

【0105】

副交感神経は、ＳＯＸ２^＋前駆体を保存し、ＳＯＸ２を介した腺房細胞の置換を促進する
成体マウスおよびヒト唾液腺は、副交感神経活性を除去した後、萎縮する。しかしながら、腺房細胞の置換および前駆細胞に対する除神経の影響は調査されていない（Ｇａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｒａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。この目的のために、我々は、鼓索を切断することによって、２対のマウスＳＬＧのうちの１つを除神経した（図３Ａ、反対側の腺を内部対照として使用した）。７日後、ニューロン遺伝子Ｔｕｂｂ３、Ｖｉｐ、およびＶａｃｈｔ（図３Ｂ、赤色バー）、ならびにＧＦＲａ２^＋またはＴＵＢＢ３^＋神経（図３Ｃおよび１２Ｃ）の転写レベルが著しく低減し、除神経の成功を示した。コリン作動性ムスカリン受容体ＣｈｒｍｌおよびＣｈｒｍ３転写産物の同時損失は観察されなかった（図３Ｂ、赤色バー）が、副交感神経支配の不在下で、代償機構がＣｈｒｍｌおよびＣｈｒｍ３転写を維持し得る可能性がある。ＳＬＧは、主に副交感神経分岐によって提供され、比較すると交感神経支配はほとんどないが（Ｅｍｍｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５）、鼓索切断後の交感神経支配の減少を観察した（図１２Ａ）。したがって、交感神経のレベルは軽微であるが、除神経の効果の一部が交感神経入力の喪失に起因する可能性があることを排除することはできない。

【0106】

放射線療法が組織構造に及ぼす影響と同様に（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｒｅｄｍａｎ，２００８）、成人腺房細胞、ならびにＳＯＸ２^＋前駆体は、導管よりも神経支配の喪失に対して感受性が高かった。除神経は、腺房細胞サイズの減少をもたらし（以前に観察されたように、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７５、図１２Ｂ）、分化した腺房細胞マーカーＭｕｃ１９のＡＱＰ５タンパク質および転写レベルを低下させた（図３Ｂおよび３Ｄ）。興味深いことに、ＭＩＳＴ１の転写およびタンパク質レベルは、除神経後に変化しなかった（図３Ｂ、３Ｅおよび３Ｆ）が、これは、腺房細胞の機能マーカーが神経支配の不在下で破壊される一方で、腺房細胞同一性が悪影響を受けないことを示唆している。驚くべきことに、ＳＯＸ２^＋細胞はＳｏｘ２の発現を失い（Ｓｏｘ２^ｅＧＦＰマウスを使用して実証された）、Ｓｏｘ２タンパク質および転写産物のレベルが大幅に低減し（図３Ｂ、３Ｃおよび３Ｆ、ならびに１２Ｃ）、ＳＯＸ２の維持が神経支配を必要とすることを示している。ＳＯＸ２^＋細胞が除神経後も組織を再増殖させる能力が残っているかどうかを決定するために、内因性Ｓｏｘ２プロモーター（Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧ）によって駆動されるＣｒｅが除神経後３日後に活性化され、１４日目まで追跡する遺伝的系統追跡を実行した。図３Ｇおよび３Ｈに示されるように、ＳＯＸ２^＋前駆体による腺房細胞の置換は、切断の１４日後に有意に低減した（－５０％）。同様に、神経切断前（切断１日前のタモキシフェン）に組み換えが誘導されたＳＬＧでは、ＳＯＸ２^＋前駆体による腺房細胞の置換は、１４日後に有意に枯渇した（－５０％）（図１２Ｅおよび１２Ｆ）。腺房細胞の置換の減少は、Ｃｃｎｄｌの減少を測定したため、細胞死ではなく細胞増殖の減少に起因する可能性があるが、細胞死のマーカー［図１２Ｇ中の活性化カスパーゼ－３（ＣＡＳＰ３^＋）細胞、または図１２Ｈ）でのＢａｘ、Ｐｍａｉｐｌ（ＮＯＸＡ）およびＢｂｃ３（ＰＵＭＡ）］は、観察されなかったか、または変化しないままであった。細胞死の不在はまた、以前ＳＯＸ２に対して陽性であった細胞が引き続き存在するが、コリン作動性神経支配がＳＯＸ２発現を維持するために不可欠であることも示唆する。

【0107】

除神経がＳＬＧ中の腺房系統に優先的に影響を与えることを確認するために、他の上皮細胞系統も分析した。除神経された腺内のＫＲＴ８^＋導管は、導管遺伝子Ｋｒｔ７、Ｋｒｔ８、およびＫｒｔ１９の転写レベルと同様に、神経支配された対照に類似していた（図３Ｂ、３Ｄ、および３Ｆ）。さらに、副交感神経（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１０）によって維持されるＳＭＧ／ＳＬＧを発生させる前駆体であるＫＲＴ５^＋細胞（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｌｏｍｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）は、除神経の影響を受けなかった（図３Ｆおよび１２、転写Ｋｒｔ５発現については、図３Ｂを参照されたい）。これらの発見に基づいて、ＳＯＸ２およびＳＯＸ２^＋細胞の調節を通じて機能的腺房を優先的に維持および置換することによって、成人ＳＬＧ組織の恒常性維持に副交感神経支配が必要であると結論付けている。

【0108】

神経で唾液腺を再補給することで腺房およびＳＯＸ２を救出できるかどうかを決定するために、除神経３０日後にマウス唾液腺を検査した。末梢神経系の可塑性により、切断から３０日後にＴＵＢＢ３^＋神経が再出現すること（図９Ａ）、ならびにニューロン遺伝子Ｔｕｂｂ３、Ｖｉｐ、およびＶａｃｈｔが再発現することよって示されるように、マウス唾液腺は経時的に神経再支配されるようになる（図３Ｂ、青色バー、Ｙａｗｏ，１９８７）。驚くべきことに、我々は、元の傷害に応答して、過剰な神経支配（ｈｙｐｅｒｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ）を示唆する、３０日目のこれらのニューロン遺伝子の発現の上昇を見出した（図３Ｂ）。注目すべきことに、神経再支配されると、Ｓｏｘ２およびＡｑｐ５転写産物ならびにＳＯＸ２タンパク質のレベル、ならびにＳＯＸ２^＋およびＡＱＰ５^＋細胞の数、ならびに腺房細胞サイズは、対照レベル以上に戻った（図３Ｂおよび９Ａ～９Ｃ）。

【0109】

ＳＬＧのＳＯＸ２^＋細胞が副交感神経によって産生されるアセチルコリンに直接応答することができることを確実にするために、ＳＯＸ２^＋細胞によるアセチルコリン／ムスカリン受容体の発現、ならびにそれらのインビボでのムスカリン作動薬に応答する能力を分析した。ＳＯＸ２^＋細胞は、ＣＨＲＭ１およびＣＨＲＭ３の両方を発現し（それぞれ９５％および９９％、図４Ａおよび４Ｂ）、ムスカリン作動薬ピロカルピンによる野生型マウスの短期処理（Ｉ．Ｐ．送達し、１８時間で屠殺した）により、増殖ＳＯＸ２^＋細胞の割合が増加した（ＳＯＸ２^＋Ｋｉ６７^＋細胞、図４Ｃおよび４Ｄ）。しかしながら、ＳＯＸ２^＋細胞の割合は、注入後１８時間までに有意に変化せず（図４Ｄ）、ムスカリン活性化がＳＯＸ２の異所性発現を誘導しないことを示している。したがって、これらのデータは、アセチルコリンムスカリンシグナル伝達を介した副交感神経がＳＯＸ２^＋前駆体および腺房を維持し、腺房細胞の補充を促進するという仮説を裏付ける。

【0110】

マウスの唾液腺は、放射線誘発損傷後にＳＯＸ２を介して再生する
マウス唾液腺（主にＳＭＧ）は、典型的な分析が退行的応答に限定される、腺機能および構造に対する電離放射線（ＩＲ）の影響を調査するために広く使用されてきた。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドでは、１０Ｇｙの単回線量後に腺房細胞の喪失および唾液流量の減少を受けることが報告されている（Ｚｅｉｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｃｏｐｐｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，２００２）。しかしながら、組織の再生能力、およびＩＲ後にそれが神経支配されたままであるかどうかは不明である。ＳＯＸ２を介した唾液腺の再生に対する放射線の影響を試験するために、頭頚部へのガンマ線の単回照射後のマウスＳＬＧにおける神経支配、ＳＯＸ２^＋細胞、およびＳＯＸ２を介した腺房細胞の補充を分析した。唾液腺における以前の研究と同様に（Ａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，２００９）、１０Ｇｙ線量が、ＩＲ後の初日に、ＤＮＡ損傷および細胞周期停止を誘導すると共に、プロアポトーシス遺伝子Ｂａｘおよび細胞周期阻害剤Ｃｄｋｎｌａ（ｐ２１）の実質的な増加（図１３Ａ）ならびに細胞増殖マーカーＭｋｉ６７の転写レベルの低下（図１３Ａ）によって示されるようにＳＬＧ中の細胞増殖を低下させることを見出した。次に、ＴＵＢＢ３^＋神経について免疫標識を行い、Ｔｕｂｂ３および副交感神経由来神経伝達物質Ｖｉｐについて半定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実行することによって、ＩＲ ＳＬＧにおける神経支配および神経機能の変化を測定した。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、ＩＲ ＳＬＧ中のＴＵＢＢ３^＋神経は、放射線照射の１日後および３日後に非ＩＲ対照と比較して変化しなかった。しかしながら、Ｔｕｂｂ３およびＶｉｐの転写レベルは、ＩＲ後１日目および３日目に有意に低減し、神経機能が初期段階で低減することを示唆した（図１３Ｂ）。同様に、Ｓｏｘ２、Ｍｉｓｔｉ、およびＡｑｐ５の転写産物は、ＩＲの直後に低減したが、１Ｒ後７日目までに対照レベルに戻った（図１３Ｂ）。ＳＯＸ２^＋細胞の数は、ＩＲ後１日目に有意に低減し（図５Ｃ）、一方、ＣＣＮＤ１^＋ＳＯＸ２^＋細胞の数は、ＩＲ後３日目および７日目に有意に増加した（図５Ｃ）。ＩＲ誘発損傷後にＳＯＸ２を介した細胞の置換が影響を受けたかどうかを決定するために、ＩＲの１４日後のＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスにおけるＳＯＸ２を介した補充の程度を分析した。驚くべきことに、非ＩＲ対照と同様にＩＲ ＳＬＧでは、腺房細胞がＳＯＸ２^＋細胞（ＧＦＰ^＋細胞）に置き換わり、ＳＯＸ２^＋ＧＦＰ^＋およびＳＯＸ２陰性の両方の子孫が産生することが見出され（図５Ｄ、白い矢じりはＳＯＸ２陰性子孫を示す）、これはもはやＳＯＸ２^＋ではなく、ＳＯＸ２^＋細胞に由来するＴＡ細胞（ｔｒａｎｓｉｔ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｌ）の存在を示唆する（すなわち、系統追跡された）。さらに、ＩＲ ＳＬＧ中のＳＯＸ２^＋細胞の数は、１４日目までに対照と同様であった（図５Ｄ）。したがって、神経シグナル伝達、ＳＯＸ２、および腺房細胞マーカーの初期喪失にもかかわらず、腺房コンパートメントは、放射線誘発損傷後にＳＯＸ２^＋細胞によって補充されることができる。

【0111】

次に、Ｓｏｘ２の非存在下でＩＲ傷害後にＳＬＧが再生できるかどうかを試験した。図５Ｅに示されるように、単回１０Ｇｙ線量で照射されたＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}マウスは、機能的ＡＱＰ５＋腺房で組織を再増殖することができなかった。実際、Ｓｏｘ２の非存在下では、ＩＲの１４日後の野生型マウスと比較して、ＡＱＰ５^＋腺房細胞の喪失および組織アーキテクチャの破壊が観察された（図５Ｅ）。この結果はさらに、Ｓｏｘ２が、放射線誘発性傷害後のＳＬＧ再生に不可欠であることを確認する。

【0112】

ＳＯＸ２＋細胞は、コリン作動性模倣物に応答して照射された唾液腺を補充することができる
我々のデータが示すように、コリン作動性の手がかりは、ＳＬＧ中の腺房系統を補充することを示唆しているため、エクスビボ系統追跡モデルを使用して、健康で照射されたＳＬＧ中のムスカリン活性化に応答してＳＯＸ２^＋細胞が腺房を補充できるかどうかを決定した。図６Ａおよび６Ｂに示されるように、アセチルコリン模倣カルバコール（ＣＣｈ）で４８時間培養した健康なＳＬＧ組織においてＧＦＰ^＋クローンの増加があった。ＧＦＰ^＋クローンのこの増加は、ＣＣｈ処理による細胞増殖（Ｋｉ６７^＋細胞）の増加と関連していた（図１３Ｅ）。我々のＩＲモデルでは、動物を単回線量のＩＲに供する２４時間前にＳｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスで組み換えを誘導した（図６Ａ）。この時点は、マウスにおけるＣｒｅ系統のタモキシフェン誘発性組み換えについて１２～２４時間のラグタイムが以前に報告されていることから選択された（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００６）。したがって、単一のＳＯＸ２^＋細胞は、注入後２４時間までに標識される（図６Ｂ、０時間パネルを参照されたい）。ＳＬＧを放射線曝露から１時間以内に収集し、ＣＣｈ有りまたは無しでエクスビボで４８時間培養した。図６Ｂに示され、図６Ｃで定量化されるように、ＧＦＰ^＋クローンは、非ＩＲ対照と比較して、ＩＲ ＳＬＧにおいてより豊富であり、ＩＲ活性化ＳＯＸ２^＋細胞が組織を再増殖することを示唆した。これは、ムスカリン受容体拮抗薬４－ＤＡＭＰで培養したＩＲ外植片が、非ＩＲの培養唾液腺と同様の腺房細胞補充を示したため、残存神経からのコリン作動性シグナル伝達に起因する可能性があった（図６Ｂおよび６Ｃ）。重要なことに、ＣＣｈによるＩＲ外植片の処理は、ＩＲ単独と比較してＧＦＰ^＋細胞を増加させた（図６Ｂおよび６Ｃ、ならびに１３Ｃおよび１３Ｄ）。これらのデータに基づいて、ＳＯＸ２^＋細胞が、ムスカリン活性化に応答してＩＲ ＳＬＧを再増殖することができると結論付けている。

【0113】

アセチルコリン／ムスカリンシグナル伝達は、ヒトＳＧにおけるＳＯＸ２および腺房系統を維持する
ヒトの場合、ＩＲは、非ＩＲ対照と比較して、ＳＧにおける副交感神経性（および交感神経性）神経支配（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１３、図１４Ａ、ＧＦＲＡ２）、ならびに腺房系統のマーカー（ＡＱＰ３、ＭＩＳＴ１、ＡＭＹ１）を不可逆的に低減するが、導管系統（ＥＧＦＲ、ＫＲＴ１９）は低減しない（図７Ａ、ＩＲは、手術の約２年前に送達されており、ｎ＝７、ＩＲおよび１１、非ＩＲ）。免疫蛍光によって、ヒト組織において系統マーカーを確認した（利用可能性のためにＳＭＧを使用した）（図１４Ｂ）。さらに、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、交感神経マーカー）ではなく、ＳＯＸ２、ＧＦＲＡ２、ＣＨＲＭ１、およびＣＨＲＭ３の転写レベルはまた、ＩＲ後に有意に下方調節されたか、または下方調節に向かう傾向にあり（図７Ａおよび１４Ａ）、副交感神経機能、ならびに細胞がアセチルコリンに応答する能力が枯渇したことを示す。したがって、ＩＲ後のヒト唾液腺の再生能力の喪失は、ＳＯＸ２^＋前駆細胞の副交感神経支配の低下に起因し、アセチルコリン／ムスカリンシグナル伝達がＳＯＸ２発現を維持し、腺房系統を促進するのに十分であると仮定した。この仮説を検証するために、我々は新規のヒト外植片－マウス神経共培養システムを確立した。このモデルでは、非照射のヒトＳＭＧを＜１ｍｍの小片に解剖し、胚の１３日目のマウス顎下腺副交感神経節（間葉を含む）または間葉のみ（対照、神経なし）と並べて配置する。次いで、組織を無血清培地の上に浮遊するフィルター上で７日間共培養する。神経は、組織内およびその周囲に移動し（図７Ｂ）、間葉単独と比較して、神経と共培養した外植片中の高レベルのＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン、遺伝子、およびタンパク質発現）によって示されるように、組織構造を活発に維持した（図７Ｃおよび７Ｄ）。我々は、どの因子がこの神経移行を誘発したかを確認する試みで、神経誘引物質（ｎｅｕｒｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）ニュールツリン（ＮＲＴＮ）および神経成長因子（ＮＧＦ）について外植片を分析した（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。しかしながら、間葉単独と比較して、神経節の存在下での発現の増加は発見されず（図７Ｄ）、他の神経誘引物質が合成されていたこと、神経が存在するか否かにかかわらず上皮がこれらの神経誘引物質を産生していること（すなわち、間葉は上皮恒常性を維持するのに十分に支持されている）、またはこの現象が培養の早い段階（すなわち、神経が上皮を包囲し始めたばかりの早い段階）に発生し、この後の時点（７日目）までにいかなる相違も解消されていることを示唆している。驚くべきことに、神経と共に培養した腺外植片は、間葉のみの対照と比較して、ＳＯＸ２（約１．８倍～２倍）ならびに腺房マーカーＭＩＳＴ１およびＣＤ４４、ムスカリン受容体ＣＨＲＭ３（腺房細胞によっても発現する、Ｇｉｒａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８）の転写レベルも増加したが、導管遺伝子ＫＲＴ１９、ＫＩＴ、およびＥＧＦＲの転写レベルは一貫して低かった（図７Ｄ、間葉のみに正規化されたデータ、ｎ＝２の別個体）。さらに、Ｋｉ６７^＋細胞の存在によって特徴付けられる上皮細胞の増殖は、神経の存在下で増加した（図７Ｃおよび１４Ｃ）。これらのデータをまとめると、副交感神経がヒト唾液腺におけるＳＯＸ２発現ならびに腺房および導管マーカーを維持できることを示唆している。

【0114】

アセチルコリン／ムスカリンシグナル伝達がヒト唾液腺中の腺房およびＳＯＸ２^＋細胞を維持するのに十分であるかどうかに対処するために、非照射ヒトＳＭＧまたはＰＧ（両方ともＳＯＸ２を発現する）組織外植片をエクスビボ系中のムスカリン刺激に供した。ＣＣｈを有する４つの別個の個人（ｎ＝４）からの患者由来のヒト組織の培養は、ムスカリン刺激から４時間以内に、ＳＯＸ２、ムスカリン受容体ＣＨＲＭ１およびＣＨＲＭ３［いずれも成人腺房細胞によって発現される（Ｇｉｒａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０）］、ならびにＡＱＰ３、ＡＱＰ５（Ｇｒｅｓｚ ｅｔ ａｌ．，２００１）、およびＭＩＳＴ１の発現を著しく増加させた（図７Ｅ、ｎ＝４、図１４Ｄに示される個々のデータセット）。外科的除神経は、Ｍｉｓｔｉの発現に悪影響を及ぼさないが（図３Ｂおよび３Ｅ）、ムスカリン刺激は、ヒト培養物中のＭＩＳＴ１を増加させるのに十分であり、腺房細胞同一性には必要ではないが、アセチルコリン／ムスカリンシグナル伝達が分泌プログラムの陽性調節因子として機能し得ることを示唆する。４つの患者由来試料間の応答の変動性は、ヒト患者間の生物学的多様性、供給される腺の種類（使用されるＳＭＧおよびＰＧ）の差、ならびに患者の年齢（供与者の年齢は３０～７８歳の範囲）に起因する可能性が高い。しかしながら、すべての場合において、ＣＣｈの存在下で、ＳＯＸ２およびいくつかの腺房マーカーの増加を観察した。ＣＣｈでＫＲＴ１９遺伝子発現の増加も測定したが、他の排他的な導管マーカーＥＧＦＲ、ＫＲＴ７、およびＫＲＴ８は変わらず、導管細胞が一般にムスカリン作動薬に応答しないことを示唆した（図７Ｅ）。共培養におけるヒト唾液腺の神経導管遺伝子の増加を考慮すると、導管の変化を誘発する他の因子が神経によって産生される可能性がある（図７Ｄおよび７Ｅを比較する）。したがって、神経細胞のアセチルコリン／ムスカリンシグナル伝達は、腺房系統を促進し、成人ヒト唾液腺におけるＳＯＸ２発現を維持するのに十分である。

【0115】

考察
我々の研究は、放射線誘発損傷後に組織を再増殖する予期しない能力を備えた腺房の補充に不可欠な成人唾液腺中の前駆体としてのＳＯＸ２^＋細胞を明らかにする。さらに、恒常性維持の間のＳＯＸ２を介した腺房細胞の置換の制御においてコリン作動性神経が重要な役割を果たすことを示し、この神経細胞の影響は、照射された組織にコリン作動性模倣物を添加することによって再現できることを示す。したがって、マウス唾液腺が放射線誘発損傷後に再生しないという現在の教義とは対照的に（Ｚｅｉｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｃｏｐｐｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，２００２）、これらのデータは、少なくともマウスにおいて、唾液腺が放射線誘発損傷後に広範な再生能力を有することを示す。さらに、ヒト組織における腺房系統（およびＳＯＸ２）もコリン作動性模倣物に応答することが分かるように、ＳＯＸ２^＋細胞を標的とし、コリン作動性神経を維持することは、放射線療法による損傷後の機能的唾液腺房の回復に役立つ可能性がある。

【0116】

ＳＯＸ２は、生物の発達に不可欠な役割を有し、胃、気管、および腸などの上皮組織の恒常性を調節する（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。Ｓｏｘ２除去後の成人気管細胞の恒常性維持能力の低下と同様に（Ｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）、恒常性維持および損傷の両方の条件下でのＳＯＸ２^＋腺房前駆体におけるＳｏｘ２の除去後のＡＱＰ５^＋腺房細胞の枯渇を見出した。興味深いことに、萎縮したものの、Ｓｏｘ２の非存在下で細胞死の増加は見られなかったが、循環している腺房細胞が実質的に減少しており、除去時にこれらの細胞が細胞周期を離れ、分化を受けて休眠型ＡＱＰ５欠損腺房細胞を産生することを示唆した。ＳＯＸ２^＋細胞の除去による腺房の著しい喪失は、これらがＳＬＧ中の腺房系統の唯一の前駆体であることをさらに確認し、膵臓腺房細胞が等効力ではないが、前駆体のサブセットを含有することを実証する最近の報告と一致する（Ｗｏｌｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。我々の結果は、膵ベータ細胞と同様に、前駆体分化を介さずに成熟細胞の自己複製を通じて唾液腺房細胞が補充されることを示すＡｕｒｅとその同僚による最近の報告（Ａｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）とは対照的である（Ｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。組織の再増殖が唾液腺房細胞の自己複製に起因するという結論は、ＳＯＸ２^＋ＭＵＣ１９^－細胞を含むすべての腺房細胞によって発現される誘導性Ｍｉｓｔｉプロモーターの使用に基づいていた。したがって、組み換え時に追跡される細胞のサブセットには、前駆体が含まれる可能性が高いが、これらのサブセットが幹細胞シグネチャを有するかどうかを判定するための分析は行われなかった。

【0117】

すべての上皮臓器と同様に、末梢神経は、げっ歯類およびヒト唾液腺の構造的恒常性を維持するために必要である（Ｓｃｈｎｅｙｅｒ＆Ｈａｌｌ，１９６７、Ｍａｎｄｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｆｕ＆Ｇｏｒｄｏｎ，１９９５、Ｌｕｊａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｂａｔｔ＆Ｂａｉｎ，２０１３）。臓器形成中、副交感神経は、アセチルコリン／ムスカリンシグナル伝達を介した放射線損傷後の組織に寄与し得る前駆体集団を維持する（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。唾液腺における以前の除神経研究は、臓器および腺房細胞のサイズが減少することを示した（Ｓｃｈｎｅｙｅｒ＆Ｈａｌｌ，１９６７、Ｍａｎｄｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７、Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）が、腺房細胞の置換に神経支配が必要であるかどうかは知られていなかった。ここでは、神経がＳＯＸ２を直接調節して系統が制限された前駆体から腺房細胞の置換を促進することを明らかにする。この結果は、多くの他の臓器における自己更新および細胞運命の調節におけるＳＯＸ２の周知の役割と一致する（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかしながら、これまでに、ＷＮＴ、ＦＧＦ、およびＥＧＦＲファミリーによって媒介されるものを含む細胞内部のシグナル伝達経路のみが、ＳＯＸ２を調節することが示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｄｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。この外因性神経ベースのモデルは、それらの標的臓器とは異なり、ニューロン自体が放射線損傷に対して非常に耐性があるという点で、細胞－内因性シグナルよりも明らかな利点を有する（Ｔｏｆｉｌｏｎ＆Ｆｉｋｅ，２０００、Ｗｏｎｇ＆Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｇｅｌ，２００４）。この機構が、他のＳＯＸ２発現上皮臓器、例えば、味蕾（Ｓｕｚｕｋｉ，２００８）、前立腺および精嚢（Ｗａｎｉｇａｓｅｋａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００４）、胃（Ｔａｔｓｕｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、および角膜（Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）の維持も調節するかどうかは、まだ試験されていない。しかしながら、これらの結果は、コリン作動性神経がこれらの組織の再生において機能し得ることを示唆している。

【0118】

以前の研究は、放射線誘導変性のモデルとしてマウス唾液腺を利用している（Ｚｅｉｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｃｏｐｐｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，２００２）。これらの調査は、放射線を受ける動物において測定された唾液流量の減少によって裏付けられた仮説である、中～高用量の放射線の後に再生が損なわれるという仮定に基づいていた（Ｒｅｄｍａｎ，２００８）。しかしながら、これまでに放射線照射後の細胞置換のインビボ分析は行われていない。我々のデータによると、マウスの腺房細胞は、少なくとも放射線曝露後の最初の３０日間は高度に再生可能であり、未傷害の対照と同様に腺房を再増殖させることができることを示している。しかしながら、マウス唾液腺の変性／老化は放射線の３～６ヶ月後に起こるため、この再生能力は長期的に維持できないことは明らかである（Ｕｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｍａｒｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。したがって、ＳＯＸ２^＋細胞の再生能力は最終的に機能しなくなる可能性が高く、原因を特定するためにさらなる分析が必要である。また、ヒト唾液腺が治療用放射線照射の数日／数ヶ月後に再生できるかどうか、および副交感神経と組み合わせたＳＯＸ２^＋細胞の不在により、この再生能力が長期的に機能しないかどうかはまだ決定されていない。実際、これらの臓器が短期的および長期的にどのように影響を受けるかを理解するためには、患者からの唾液腺の変化の時間経過解析が必要である。しかしながら、我々の結果は、放射線損傷に応答して組織再生を制御および維持するためにこれらの幹細胞およびその神経支配神経を標的化することが、長期的に組織を維持／修復する手段を提供し得ることを示唆している。

【0119】

最近の多くの研究は、再移植のために推定幹細胞集団を単離するか（Ｎａｎｄｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，２０１４）、または幹細胞を保有すると考えられる腺内領域を温存（ｓｐａｒｉｎｇ）するかのいずれかによって、マウスモデルにおける放射線損傷後の腺再生に対処することを目的としている（ｖａｎ Ｌｕｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。しかしながら、これらの内因性幹細胞の同一性、およびそれらが腺房細胞コンパートメントに寄与するかどうかは不明であった。さらに、このような操作が唾液腺神経支配に及ぼす影響は報告されていない。我々の研究に基づくと、組織の乱れによる意図しない神経支配の増加が、腺房を再生して唾液機能を回復させるＳＯＸ２^＋前駆細胞の維持および増大につながる可能性がある。Ｘｉａｏら（２０１４）は、神経誘引因子であるグリア由来神経因子（ｇｌｉａｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｒｖｅ ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＮＦ）を添加することにより放射線誘発損傷後のマウス唾液機能および構造の回復を報告した（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。しかしながら、最近の研究では、ＧＤＮＦ自体がＳＧ幹細胞を放射線誘発損傷から直接保護しないことが実証され（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、そのような結果が支持ニッチの改善の結果であり得ることを示唆した。

【0120】

まとめて、我々の研究は、遺伝毒性ショックに直面しても、前駆細胞集団の増大および分化を通じて発生する唾液腺の広範な再生能力を強調する。これらのデータに基づいて、我々は、組織内のＳＯＸ２^＋細胞を直接標的化することによって、または移植および活性化のためにこれらの細胞を単離および増大させることによって、唾液腺の分泌部を再生し、患者に生活の質を回復する可能性があることを提案する。これはまた、ＳＯＸ２^＋集団を維持するために、以前に提案された（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１３）副交感神経の維持も必要になる。腸、腺胃、気管、および味蕾などの所与の臓器は、ＳＯＸ２を発現し、自律神経系によって強く神経支配され、癌を排除するための治療放射線によって損傷を受けるため、このような戦略は、多臓器系の修復に適用可能であり得る。

【0121】

材料および方法
マウス系統
すべての手順は、ＵＣＳＦ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認され、実験動物の管理および使用に関するＮＩＨガイドに準拠していた。この研究で使用されるマウス対立遺伝子は、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって提供され、Ｓｏｘ２^ｅＧＦＰ（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００９）、Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}（Ｔａｒａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６）、Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧ（Ｍｕｚｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）、Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２００６）、およびＫｉｔ^{ＣｒｅＥＲＴ２}（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）が含まれる。

【0122】

動物実験
別途明記されない限り、すべての実験で成体雌マウス（６～８週齢）を使用した。マウスは、ＡＡＡＬＡＣ認定のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｐａｒｎａｓｓｕｓ ｃａｍｐｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ （ＬＡＲＣ）に収容された。マウスを、可能な限り、１ケージ当たり最大５匹の群で、新鮮な水、定期的な清掃、および環境エンリッチメントが施された、個々に換気されたケージ（ＩＶＣ）に収容した。適切な試料サイズを検出力計算（ｐｏｗｅｒ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）を使用して計算した。トランスジェニック研究の場合、試料サイズは、必要な遺伝子型および性別の動物を十分な繁殖させるのに必要な時間の長さによって制限された。野生型動物を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌソフトウェアを使用して実験群にランダム化した。遺伝子型に基づいて、トランスジェニック動物を群に割り当てた。すべての動物に固有のＩＤ番号が与えられ、したがって、分析中は研究者に対し盲検化された。

【0123】

Ｓｏｘ２またはＳＯＸ２^＋細胞の遺伝子的除去
Ｓｏｘ２の条件的除去を、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｓｏｘ２^{ｆｌ／ｆｌ}：Ｒ２６^ｍＴｍＧマウスに、１８日目に安楽死させる前に、２．５ｍｇ／２０ｇのタモキシフェンを毎日４日間連続して、および３日ごとに注入することによって達成させた。ＳＯＸ２^＋細胞の除去は、７日目に安楽死させる前に、Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ＤＴＡ：Ｒ２６^ｍＴｍＧマウスに、２．５ｍｇ／２０ｇのタモキシフェンを毎日４日間連続して注入することによって、実行した。Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスは、細胞の除去／組み換えと組み合わせて系統追跡するための貴重なツールを提供する（Ｍｕｚｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。簡潔に述べると、このモデルは、Ｃｒｅを介した切除前に膜標的タンデムダイマートマト（ｍＴ）と、切除後に膜標的緑色蛍光タンパク質（ｍＧ）を発現する二重蛍光Ｃｒｅレポーターから構成される（図１０Ｄ）。したがって、これらのマウスにおいて、組み換えが起こったためＳｏｘ２を欠いているか、またはＤＴＡを発現している細胞は、ＧＦＰを発現する。内因性ＧＦＰを、凍結切片を使用した実験において画像化し、一方、ＧＦＰ抗体はパラフィン包埋組織に使用した（ニワトリ抗ＧＦＰ、１：５００、Ａｖｅｓ Ｌａｂｓ、ＧＦＰ－１０２０）。

【0124】

ＳＯＸ２^＋細胞の系統追跡
Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスに２．５ｍｇのタモキシフェンを注入し、２４時間、１４日、または３０日後に安楽死させた。

【0125】

ＫＩＴ＋細胞の系統追跡
Ｋｉｔ^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウスに、２．５ｍｇのタモキシフェンを４日間連続して毎日注入し、１４日後または６ヶ月後に安楽死させた。

【0126】

インビボ除神経実験
Ｃ５７ＢＬ／６またはＳｏｘ２^ｅＧＦＰマウスに、手術の３０分前に鎮痛剤（カルプロフェンおよびブプレノルフィン；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙおよびＢｕｐｒｅｎｅｘ；それぞれ０．１および１００ｍｇ／ｋｇ（ＩＰ））と共に投与し、２％イソフルラン／０_２混合物を吸入して麻酔した。手術部位を剃毛し、ヨウ素およびアルコールで交互に洗浄し、続いて局所麻酔薬（リドカイン、Ｈｏｓｐｉｒａ Ｉｎｃ．、８ｍｇ／ｋｇ）を用い、切開の準備をした。耳の前方で切開し、前述のように鼓索を配置し（Ｋｌｉｍａｓｃｈｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、スプリングハサミを使用して完全に切断した。非吸収性の絹縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して皮膚を縫合し、創傷をさらに外科用接着剤（Ｖｅｔｂｏｎｄ）で覆った。反対側の神経は対照として無傷のままにした。７日または３０日後、マウスを安楽死させた。

【0127】

ピロカルピン実験
成体雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）をピロカルピン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ０４７２；０．９％滅菌生理食塩水中０．６８ｍｇ／ｍｌ）で処理した。マウスをイソフルランを使用して麻酔し、４．５ｍｇ／ｋｇ体重（２００μＩ）の用量でピロカルピンを、またはビヒクル対照として０．９％生理食塩水を腹腔内注入した。１８時間後にマウスを安楽死させ、免疫蛍光分析のために腺を処理した。

【0128】

ガンマ線実験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．９％生理食塩水（Ｖｅｄｃｏ Ｉｎｃ．）中の１．２５％２，２，２－トリブロモエタノール（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）で麻酔した。Ｓｈｅｐｈｅｒｄ Ｍａｒｋ－Ｉ－６８Ａ^１３７Ｃｓ照射装置（ＪＬ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）に配置することによって、^１３７Ｃｓ線源を使用してマウスを照射した。１．５ｃｍ間隔で配置された２つの鉛ブロックを使用して、マウスの身体および口の最前部（鼻）を遮蔽し、首および頭部の一部のみを露出させた。１．５ｃｍの開口部は、位置３（^１３７Ｃｓ源から２０ｃｍ、照射器空洞の幅から１５．５ｃｍ）に中心を置いた。唾液腺を照射するため、マウスを、１６７Ｒａｄ／分の線量率で２回の５Ｇｙの線量に２．５９分間（頭部の各側１回ずつ、両側、および順次であるが、同日に実施）、合計１０Ｇｙの線量で曝露した。この線量は、製造業者によって提供される等線量プロットマッピング（線量分布）によって計算され、ＥＢＴフィルム（Ｂｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．，２００９）を使用して、マウス配置のために１００％の曝露領域を特定した。対照マウスは実験マウスに従って麻酔したが、放射線処理を受けなかった。正常な飼育に戻る前に、すべてのマウスを完全に回復させ、自由に柔らかい食餌を与えた（ＣｌｅａｒＨ_２０）。マウスを、１時間後、または１、３、７、１４、または３０日後に安楽死させた。

【0129】

臓器培養実験
成人の唾液腺におけるエクスビボリネージュ追跡
Ｓｏｘ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}由来の唾液腺；Ｒｏｓａ２６^ｍＴｍＧマウス（組み換え誘導２４時間前）を１ｍｍ未満のピースに機械的に解剖し、２００ｎＭのＣＣｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）または１０μＭの４－ＤＡＭＰ（Ｔｏｃｒｉｓ）の有無で完全培地に配置し、４８時間培養した後、免疫蛍光のために固定した。場合によっては、マウスに５Ｇｙの３回投与を照射した後、上記のように腺を培養用に服用した。

【0130】

人間の唾液腺組織の分離と培養
成人ヒト唾液腺は、頚部切除を受ける患者（２８～７８歳、男性および女性）の同意を得て、破棄された識別不可能な組織から得られた。すべての被験者からインフォームドコンセントが与えられ、ＷＭＡヘルシンキ宣言および保健福祉省ベルモントレポートに定められた原則に準拠した実験が行われた。患者は、手術の２年未満前に照射療法を受けていなかったか（非ＩＲ）または分割照射療法（ＩＲ）を受けていた。組織を、生細胞外植片培養のために４％のＰＦＡ、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に直ちに入れた。エクスビボ培養では、非ＩＲ組織を＜１ｍｍの小片に解剖し、ホロトランスフェリンおよびアスコルビン酸を含有する無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。外植片アッセイのために、組織（ＳＭＧおよびＰＧ）を５０～２００ｎＭのＣＣｈ（２００ｎＭのＣＣｈが結果に示される）と共に４時間インキュベートした後、ＲＮＡを溶解した。唾液腺外植片－副交感神経顎下神経節（ＳＭＧ）共培養の場合、組織を１ｍｍ未満の小片に解剖し、無血清培地上のフローティングフィルター上で培養した。Ｅ１３マウス副交感神経顎下神経節を、以前に記載されているように単離した（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。外植片ごとに１つの副交感神経顎下神経節をヒト唾液腺の隣に配置し、７日間培養し、免疫蛍光分析のために固定するか、ＲＮＡのために溶解させた。

【0131】

組織処理
固定後、唾液腺（ヒトおよびマウス）をＯＣＴまたはパラフィン包埋のために処理した。凍結切片の生成のために、組織をスクロースの濃度を増加させて（２５～７５％）インキュベートし、ＯＣＴに包埋した。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ）を用いて１２μｍの切片を切り取り、－２０℃で保管した。パラフィンワックス（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に包埋する前に、パラフィン用の組織を、エタノール濃度を増加させてインキュベートし、その後Ｈｉｓｔｏ－Ｃｌｅａｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とインキュベートすることにより脱水した。１２μｍ切片をミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して切り取り、室温で保存した。

【0132】

免疫蛍光分析
全組織標本唾液腺および組織切片免疫蛍光分析は、以前に記載されている（Ｋｎｏｘ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。簡潔に述べると、氷冷アセトン／メタノール（１：１）で１分間、または４％ＰＦＡで２０～３０分間のいずれかで固定した後、０．１～０．３％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘで透過処理した。組織を、０．０１％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中の１０％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＥ）、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＭＯＭ ＩｇＧブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ）で４℃で一晩ブロックした。唾液腺を、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした：ヤギ抗ＳＯＸ２（１：２００、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、ＧＴ１５０９８）、ヤギ抗ＳＯＸ１０（１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ－１７３４２）、マウス抗ＴＵＢＢ３（１：４００のクローンＴＵＪ１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ１１９５）、ヤギ抗ＧＦＲａ２（１：１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ４２９）、ウサギ抗チロシンヒドロキシラーゼ（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ１５２）、ラット抗Ｅ－カドヘリン（１：３００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１３－１９００）、ウサギ抗ＥＧＦＲ（１：２００、Ａｂｅａｍ、ａｂ５２８９４）、ウサギ抗ＫＲＴ５（１：１，０００、Ｃｏｖａｎｃｅ、ＰＲＢ－１６０Ｐ）、ラット抗ＫＲＴ８（１：２００、ＤＳＨＢ、ｔｒｏｍａ Ｉ）、マウス抗ＫＲＴ７（１：５０、Ｃｏｖａｎｃｅ、ＭＭＳ－１４８Ｓ）、ラット抗ＣＤ４４（１：２００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１０３００１）、マウス抗Ｋｉ６７（１：５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５０６０９）、ウサギ抗ＣＣＮＤ１（１：２００、Ａｂｅａｍ、ａｂ１６６６３）、ウサギ抗カスパーゼ－３（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３４－１７００）、ウサギ抗ＡＱＰ３（１：４００、Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、ＬＳ－Ｂ８１８５）、ウサギ抗ＡＱＰ５（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ３５５９）、ヤギ抗ＭＵＣ１９（１：２００、Ａｂｃｏｒｅ、ＡＣ２１－２３９６）、マウス抗ａＳＭＡ（１：４００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ６１９８）、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：５００、Ａｖｅｓ Ｌａｂｓ、ＧＦＰ－１０２０）、ウサギ抗ＣＨＲＭ３（１：１，０００、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＡＳ－３７４１Ｓ）、およびウサギ抗ＭＩＳＴ１（１：５００、Ｐｕｒｄｕｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳｔｅｐｈｅｎ Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ氏から寄贈）。Ｃｙ２－、Ｃｙ３－、またはＣｙ５－コンジュゲート二次Ｆａｂ断片抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して抗体を検出し、核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１：１，０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）使用して染色した。蛍光をＬｅｉｃａＳｐ５共焦点顕微鏡およびＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。

【0133】

形態測定分析および細胞数
免疫蛍光分析（例えば、図２Ｄ）のために、マーカーに対して陽性に染色された細胞を、ＩｍａｇｅＪを使用してカウントした。腺房細胞のサイズは、ＩｍａｇｅＪを使用して測定した。すべてのデータは、３～５個の視野／群を使用して得られ、各実験を３回繰り返した。神経密度分析のために、神経マーカーＴＵＢＢ３の免疫蛍光を分析し、ＩｍａｇｅＪを使用して生の総密度（ｒａｗ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｅｎｓｉｔｙ）（任意単位、ＡＵとして表示）を計算した。

【0134】

定量的ＰＣＲ分析
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ （Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、全組織からＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用したｃＤＮＡ合成の前に、総ＲＮＡ試料をＤＮａｓｅ処理した（Ａｍｂｉｏｎ）。ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲは、５ｎｇ（マウス）または４～１０ｎｇ（ヒト）のｃＤＮＡならびにＰｒｉｍｅｒ３およびＢｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウェアを使用して設計されたか、またはＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ（ｐｇａ．ｍｇｈ．ｈａ ｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒｂａｎｋ／）に記載されているプライマーを使用して実行した。プライマー配列を表１および２に列挙する。融解曲線およびプライマー効率を、以前に記載されたように決定した（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子Ｓ１８およびＳ２９（Ｒｐｓ１８およびＲｓｐ２９）、またはマウスのＧＡＰＤＨ、およびヒトのＧＡＰＤＨ、ならびに対応する実験対照に対して正規化した。反応を３連で実行し、実験を２～３回実行した。

【0135】

フローサイトメトリー
成体マウス舌下唾液腺（ＣＤ１）を解剖し、ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ中で洗浄した。細胞単離およびフローサイトメトリーを、以前に記載されているように実行した（Ｍｕｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｐｒｉｎｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。簡潔に述べると、ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中の組織をメス刃で細かく切り刻み、５０ｍＭ ＣａＣｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、４０ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および２３ｍｇ／ｍｌコラーゲナーゼＩＩ型（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＨＢＳＳ溶液中で３７℃で１５～４５分間インキュベートすることによって、単一細胞懸濁液を作成した。酵素反応をＢＳＡの添加によってクエンチし、溶液を７０μｍストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を通して濾過し、４００ｇで８分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを滅菌ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡで洗浄し、遠心分離し、ブロッキング緩衝液（５％血清および０．０１％ＮａＮ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）中に再懸濁した。細胞表面染色は、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９８－１１３）、ウサギ抗ＣＨＲＭ１（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＡＳ－３７０１Ｓ）、ウサギ抗ＣＨＲＭ３（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＡＳ－３７４１Ｓ）、およびウサギ抗ＡＱＰ５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ３５５９）に対する抗体と共に細胞懸濁液をインキュベートすることによって達成された。その後、細胞内染色キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，００－５５２３－００）、ならびにＳＯＸ２に対する抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５６２１９５）およびＫｉ６７に対する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，６５２４０５）を使用して、固定および透過後に細胞内染色を達成した。適切な単一染色対照を使用してＬＳＲＩＩ（ＢＤ）でフローサイトメトリーを実行し、データはＦＡＣＳＤｉｖａ（ＢＤ）を使用して収集し、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。特に明記しない限り、各試料について１００，０００の事象を収集した。

【0136】

統計検定
正常分布を、Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ－Ｐｅａｒｓｏｎオムニバス検定を使用して評価した。データを、スチューデントのｔ検定（対応のない、２群）または一元配置分散分析（多群）を使用して統計的有意性を分析し、ダネットまたはテューキー検定を使用して事後検定を実行した（ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍまたはＳＰＳＳ）。多重検定では、０．０５の誤検出率を使用した。すべてのグラフは、凡例に示されるように、平均値＋標準偏差（ＳＤ）または平均±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。

【0137】

参考文献
Ａｎｄｒｅａｄｉｓ Ｄ，Ｅｐｉｖａｔｉａｎｏｓ Ａ，Ｐｏｕｌｏｐｏｕｌｏｓ Ａ，Ｎｏｍｉｋｏｓ Ａ，Ｐａｐａｚｏｇｌｏｕ Ｇ，Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ Ｄ，Ｂａｒｂａｔｉｓ Ｃ（２００６）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ－ＫＩＴ（ＣＤ１１７）ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎ ｂｅｎｉｇｎ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ ４２：５７－６５

【0138】

Ａｒｎｏｌｄ Ｋ，Ｓａｒｋａｒ Ａ，Ｙｒａｍ ＭＡ，Ｐｏｌｏ ＪＭ，Ｂｒｏｎｓｏｎ Ｒ，Ｓｅｎｇｕｐｔａ Ｓ，Ｓｅａｎｄｅｌ Ｍ，Ｇｅｉｊｓｅｎ Ｎ，Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ Ｋ（２０１１）Ｓｏｘ２（＋）ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ

【0139】

９：３１７－３２９

【0140】

Ａｕｒｅ ＭＨ，Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ ＳＦ，Ｏｖｉｔｔ ＣＥ（２０１５）Ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｓ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｃｉｎａｒ ｃｅｌｌ ｓｅｌｆ－ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ３３：２３１－２３７

【0141】

Ａｖｉｌａ ＪＬ，Ｇｒｕｎｄｍａｎｎ Ｏ，Ｂｕｒｄ Ｒ，Ｌｉｍｅｓａｎｄ ＫＨ（２００９）Ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ ７３：５２３－５２９

【0142】

Ｂａｒｋｅｒ Ｎ（２０１４）Ａｄｕｌｔ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｃｒｉｔｉｃａｌ ｄｒｉｖｅｒｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５：１９－３３

【0143】

Ｂａｔｔ ＪＡ，Ｂａｉｎ ＪＲ（２０１３）Ｔｉｂｉａｌ ｎｅｒｖｅ ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ－ａ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ａｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ８１：ｅ５０６５７

【0144】

Ｂｒａｄｙ ＳＬ，Ｔｏｎｃｈｅｖａ Ｇ，Ｄｅｗｈｉｒｓｔ ＭＷ，Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ ＴＴ（２００９）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ １３７Ｃｓ ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ ｆｒｏｍ ａ ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｒｎ ｄｏｓｉｍｅｔｒｉｃ ｔｏｏｌｓ．Ｈｅａｌｔｈ Ｐｈｙｓ ９７：１９５－２０５

【0145】

Ｂｒｏｗｎ ＬＲ，Ｄｒｅｉｚｅｎ Ｓ，Ｈａｎｄｌｅｒ Ｓ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＤＡ（１９７５）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ ｉｎｄｕｃｅｄ ｘｅｒｏｓｔｏｍｉａ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｏｒａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ ５４：７４０－７５０

【0146】

Ｃｏｐｐｅｓ ＲＰ，Ｚｅｉｌｓｔｒａ ＬＪ，Ｋａｍｐｉｎｇａ ＨＨ，Ｋｏｎｉｎｇｓ ＡＷ（２００１）Ｅａｒｌｙ ｔｏ ｌａｔｅ ｓｐａｒｉｎｇ ｏｆ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｒｏｔｉｄ ｇｌａｎｄ ｂｙ ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ａｎｄ ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８５：１０５５－１０６３

【0147】

Ｃｏｐｐｅｓ ＲＰ，Ｖｉｓｓｉｎｋ Ａ，Ｋｏｎｉｎｇｓ ＡＷ（２００２）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒａｔ ｐａｒｏｔｉｄ ａｎｄ ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｇｌａｎｄｓ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｓｃｈｅｄｕｌｅｓ．Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ ６３：３２１－３２８

【0148】

Ｄｏｇａｎ Ｉ，Ｋａｗａｂａｔａ Ｓ，Ｂｅｒｇｂｏｗｅｒ Ｅ，Ｇｉｌｌｓ ＪＪ，Ｅｋｍｅｋｃｉ Ａ，Ｗｉｌｓｏｎ Ｗ ｉｌｌ，Ｒｕｄｉｎ

【0149】

ＣＭ，Ｄｅｎｎｉｓ ＰＡ（２０１４）ＳＯＸ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ａｎ ｅａｒｌｙ ｅｖｅｎｔ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ

【0150】

ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＥＧＦＲ ｍｕｔａｎｔ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ＥＧＦＲ ｍｕｔａｎｔ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ８５：１－６

【0151】

Ｄｏｒ Ｙ，Ｂｒｏｗｎ Ｊ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＯＩ，Ｍｅｌｔｏｎ ＤＡ（２００４）Ａｄｕｌｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｓｅｌｆ－ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ

【0152】

４２９：４１－４６

【0153】

Ｄｒｅｉｚｅｎ Ｓ，Ｂｒｏｗｎ ＬＲ，Ｄａｌｙ ＴＥ，Ｄｒａｎｅ ＪＢ（１９７７）Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｘｅｒｏｓｔｏｍｉａ－ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅｎｔａｌ ｃａｒｉｅｓ ｉｎ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ ５６：９９－１０４

【0154】

Ｄｕｓｅｋ Ｍ，Ｓｉｍｍｏｎｓ Ｊ，Ｂｕｓｃｈａｎｇ ＰＨ，ａｌ－Ｈａｓｈｉｍｉ Ｉ（１９９６）Ｍａｓｔｉｃａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｘｅｒｏｓｔｏｍｉａ．Ｇｅｒｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ １３：３－８

【0155】

Ｅｍａｍｉ Ｂ，Ｌｙｍａｎ Ｊ，Ｂｒｏｗｎ Ａ，Ｃｏｉａ Ｌ，Ｇｏｉｔｅｉｎ Ｍ，Ｍｕｎｚｅｎｒｉｄｅｒ ＪＥ，Ｓｈａｎｋ Ｂ，Ｓｏｌｉｎ ＬＪ，Ｗｅｓｓｏｎ Ｍ（１９９１）Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ ２１：１０９－１２２

【0156】

Ｅｍｍｅｌｉｎ Ｎ，Ｈｏｌｍｂｅｒｇ Ｊ，Ｏｈｌｉｎ Ｐ（１９６５）Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｔｅｃｈｏｌ ａｍｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｙ ｇｌａｎｄｓ ｏｆ ｒａｔｓ．Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２５：１３４－１３８

【0157】

Ｅｍｍｅｒｓｏｎ Ｅ，Ｍａｙ ＡＪ，Ｎａｔｈａｎ Ｓ，Ｃｒｕｚ－Ｐａｃｈｅｃｏ Ｎ，Ｌｉｚａｍａ ＣＯ，Ｍａｌｉｓｋｏｖａ Ｌ，Ｚｏｖｅｉｎ ＡＣ，Ｓｈｅｎ Ｙ，Ｍｕｅｎｃｈ ＭＯ，Ｋｎｏｘ ＳＭ（２０１７）ＳＯＸ２ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｃｉｎａｒ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ．ｅＬｉｆｅ １７：ｅ２６６２０

【0158】

Ｅｒｂ Ｗ（１８６８）Ｚｕｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ ｕｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｃｈｅｎ Ａｕｔｏｎｏｍｉｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒｉｓｃｈｅｒ

【0159】

Ｐａｒａｌｙｓｅｎ．Ｄｔｓｃｈ Ａｒｃｈ ｋｌｉｎ Ｍｅｄ ４：５３５

【0160】

Ｆｕ ＳＹ，Ｇｏｒｄｏｎ Ｔ（１９９５）Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｏ ｐｏｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｄｅｌａｙｅｄ ｎｅｒｖｅ ｒｅｐａｉｒ：ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １５：３８８６－３８９５

【0161】

Ｇａｒｒｅｔｔ ＪＲ，Ｅｋｓｔｒｏｍ Ｊ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＬＣ（１９９９）Ｎｅｕｒａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｂａｓｅｌ：Ｋａｒｇｅｒ

【0162】

Ｇｉｒａｌｄｏ Ｅ，Ｍａｒｔｏｓ Ｆ，Ｇｏｍｅｚ Ａ，Ｇａｒｃｉａ Ａ，Ｖｉｇａｎｏ ＭＡ，Ｌａｄｉｎｓｋｙ Ｈ，Ｓａｎｃｈｅｚ ｄｅ Ｌａ Ｃｕｅｓｔａ Ｆ（１９８８）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ４３：１５０７－１５１５

【0163】

Ｇｒｅｓｚ Ｖ，Ｋｗｏｎ ＴＨ，Ｈｕｒｌｅｙ ＰＴ，Ｖａｒｇａ Ｇ，Ｚｅｌｌｅｓ Ｔ，Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｓ，Ｃａｓｅ ＲＭ，Ｓｔｅｗａｒｄ ＭＣ（２００１）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ｗａｔｅｒ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８１：Ｇ２４７－Ｇ２５４

【0164】

Ｇｒｕｎｄｍａｎｎ Ｏ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＧＣ，Ｌｉｍｅｓａｎｄ ＫＨ（２００９）Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄｓ ｔｏ ｒａｄｉａｔｉｏｎ：ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ ８８：８９４－９０３

【0165】

Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｑｕｅ Ｊ，Ｂｒｏｃｋｗａｙ ＢＬ，Ｄｒａｋｅ ＪＡ，Ｓｎｙｄｅｒ ＪＣ，Ｒａｎｄｅｌｌ ＳＨ，Ｓｔｒｉｐｐ ＢＲ（２０１２）ｂｅｔａ－Ｃａｔｅｎｉｎ－ＳＯＸ２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｆａｔｅ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２５：９３２－９４２

【0166】

Ｈｏｆｆｍａｎ ＭＰ，Ｋｉｄｄｅｒ ＢＬ，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ＺＬ，Ｌａｋｈａｎｉ Ｓ，Ｈｏ Ｓ，Ｋｌｅｉｎｍａｎ ＨＫ，Ｌａｒｓｅｎ Ｍ（２００２）Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｇｌａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ＦＧＦＲ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｈｒｏｕｇｈ ＢＭＰ－ａｎｄ ＦＧＦ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２９：５７６７－５７７８

【0167】

Ｋａｎｇ ＪＨ，Ｋｉｍ ＢＫ，Ｐａｒｋ ＢＩ，Ｋｉｍ ＨＪ，Ｋｏ ＨＭ，Ｙａｎｇ ＳＹ，Ｋｉｍ ＭＳ，Ｊｕｎｇ ＪＹ，Ｋｉｍ ＷＪ，Ｏｈ ＷＭ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｐａｒａｓｙｍｐａｔｈｅｃｔｏｍｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓ ｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｇｌａｎｄ．Ａｒｃｈ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ ５５：７－１４

【0168】

Ｋｌｅｉｎ Ｓ，Ｓｅｉｄｌｅｒ Ｂ，Ｋｅｔｔｅｎｂｅｒｇｅｒ Ａ，Ｓｉｂａｅｖ Ａ，Ｒｏｈｎ Ｍ，Ｆｅｉｌ Ｒ，Ａｌｌｅｓｃｈｅｒ ＨＤ，Ｖａｎｄｅｒｗｉｎｄｅｎ ＪＭ，Ｈｏｆｍａｎｎ Ｆ，Ｓｃｈｅｍａｎｎ Ｍ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｃａｊａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｅ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｌｏｗ－ｗａｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４：１６３０

【0169】

Ｋｌｉｍａｓｃｈｅｗｓｋｉ Ｌ，Ｇｒｏｈｍａｎｎ Ｉ，Ｈｅｙｍ Ｃ（１９９６）Ｔａｒｇｅｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇａｌａｎｉｎ ａｎｄ ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｎｅｒｖｅ ｌｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅ－ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ７２：２６５－２７２

【0170】

Ｋｎｏｘ ＳＭ，Ｌｏｍｂａｅｒｔ ＩＭ，Ｒｅｅｄ Ｘ，Ｖｉｔａｌｅ－Ｃｒｏｓｓ Ｌ，Ｇｕｔｋｉｎｄ ＪＳ，Ｈｏｆｆｍａｎ ＭＰ（２０１０）Ｐａｒａｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓａｌｉｖａｒｙ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９：１６４５－１６４７

【0171】

Ｋｎｏｘ ＳＭ，Ｌｏｍｂａｅｒｔ ＩＭ，Ｈａｄｄｏｘ ＣＬ，Ａｂｒａｍｓ ＳＲ，Ｃｏｔｒｉｍ Ａ，Ｗｉｌｓｏｎ ＡＪ，Ｈｏｆｆｍａｎ ＭＰ（２０１３）Ｐａｒａｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｒｇａｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４：１４９４

【0172】

Ｌｅｅ ＮＹ，Ｌｅ ＧＴ（２００８）Ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ：ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ－ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉａ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３５：２３６－２５０

【0173】

Ｌｅｅ ＭＪ，Ｋｉｍ ＥＪ，Ｏｔｓｕ Ｋ，Ｈａｒａｄａ Ｈ，Ｊｕｎｇ ＨＳ（２０１６）Ｓｏｘ２ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｏｏｔｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｖｉａ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ３６５：７７－８４

【0174】

Ｌｏｍｂａｅｒｔ ＩＭ，Ｂｒｕｎｓｔｉｎｇ ＪＦ，Ｗｉｅｒｅｎｇａ ＰＫ，Ｆａｂｅｒ Ｈ，Ｓｔｏｋｍａｎ ＭＡ，Ｋｏｋ Ｔ，Ｖｉｓｓｅｒ ＷＨ，Ｋａｍｐｉｎｇａ ＨＨ，ｄｅ Ｈａａｎ Ｇ，Ｃｏｐｐｅｓ ＲＰ（２００８）Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｇｌａｎｄｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ３：ｅ２０６３

【0175】

Ｌｏｍｂａｅｒｔ ＩＭ，Ａｂｒａｍｓ ＳＲ，Ｌｉ Ｌ，Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ ＶＰ，Ｓｅｔｈｉ ＡＪ，Ｗｉｔｔ ＲＬ，Ｈｏｆｆｍａｎ ＭＰ（２０１３）Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＫＩＴ ａｎｄ ＦＧＦＲ２ｂ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １：６０４－６１９

【0176】

ｖａｎ Ｌｕｉｊｋ Ｐ，Ｐｒｉｎｇｌｅ Ｓ，Ｄｅａｓｙ ＪＯ，Ｍｏｉｓｅｅｎｋｏ ＶＶ，Ｆａｂｅｒ Ｈ，Ｈｏｖａｎ Ａ，Ｂａａｎｓｔｒａ Ｍ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ ＨＰ，Ｋｉｅｒｋｅｌｓ ＲＧ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｃｈａａｆ Ａ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｓｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ ｓａｌｉｖａ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ７：３０５ｒａ１４７

【0177】

Ｌｕｊａｎ Ｍ，Ｐａｅｚ Ａ，Ｌｌａｎｅｓ Ｌ，Ａｎｇｕｌｏ Ｊ，Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒ Ａ（１９９８）Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ：ａ ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｕｒｏｌ １６０：１９１９－１９２３

【0178】

Ｍａｎｄｏｕｒ ＭＡ，Ｈｅｌｍｉ ＡＭ，Ｅｌ－Ｓｈｅｉｋｈ ＭＭ，Ｅｌ－Ｇａｒｅｍ Ｆ，Ｅｌ－Ｇｈａｚｚａｗｉ Ｅ（１９７７）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｙｍｐａｎｉｃ ｎｅｕｒｅｃｔｏｍｙ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｐａｒｏｔｉｄ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｕｄｙ．Ａｒｃｈ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ １０３：３３８－３４１

【0179】

Ｍａｒｍａｒｙ Ｙ，Ａｄａｒ Ｒ，Ｇａｓｋａ Ｓ，Ｗｙｇｏｄａ Ａ，Ｍａｌｙ Ａ，Ｃｏｈｅｎ Ｊ，Ｅｌｉａｓｈａｒ Ｒ，Ｍｉｚｒａｃｈｉ Ｌ，Ｏｒｆａｉｇ－Ｇｅｖａ Ｃ，Ｂａｕｍ ＢＪ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｓｓ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｓ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ＩＬ６ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｃａｎ Ｒｅｓ ７６：１１７０－１１８０

【0180】

Ｍｅｉ Ｌ，Ｒｏｅｓｋｅ ＷＲ，Ｉｚｕｔｓｕ ＫＴ，Ｙａｍａｍｕｒａ ＨＩ（１９９０）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌａｂｉａｌ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １７６：３６７－３７０

【0181】

Ｍｕｅｎｃｈ ＭＯ，Ｓｕｓｋｉｎｄ ＤＬ，Ｂａｒｃｅｎａ Ａ（２００２）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ，ｍｙｅｌｏｉｄ，ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｎｄ ＮＫ－ｃｅｌｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ．Ｂｉｏｌ Ｐｒｏｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ ４：１０－２３

【0182】

Ｍｕｚｕｍｄａｒ ＭＤ，Ｔａｓｉｃ Ｂ，Ｍｉｙａｍｉｃｈｉ Ｋ，Ｌｉ Ｌ，Ｌｕｏ Ｌ（２００７）Ａ ｇｌｏｂａｌ ｄｏｕｂｌｅ－ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｒｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｍｏｕｓｅ．Ｇｅｎｅｓｉｓ ４５：５９３－６０５

【0183】

Ｎａｋａｍｕｒａ Ｅ，Ｎｇｕｙｅｎ ＭＴ，Ｍａｃｋｅｍ Ｓ（２００６）Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔａｍｏｘｉｆｅｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｃｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｃａｒｔｉｌａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣｒｅＥＲ（Ｔ）ｔｏ ａｓｓａｙ ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｎｄｏｗｓ ａｌｏｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｘｉｍｏｄｉｓｔａｌ ｌｉｍｂ ｓｋｅｌｅｔｏｎ．Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２３５：２６０３－２６１２

【0184】

Ｎａｎｄｕｒｉ ＬＳ，Ｌｏｍｂａｅｒｔ ＩＭ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｗａａｇ Ｍ，Ｆａｂｅｒ Ｈ，Ｂｒｕｎｓｔｉｎｇ ＪＦ，ｖａｎ Ｏｓ ＲＰ，Ｃｏｐｐｅｓ ＲＰ（２０１３）Ｓａｌｉｓｐｈｅｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｃ－Ｋｉｔ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｔｉｓｓｕｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ．Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ １０８：４５８－４６３

【0185】

Ｎａｎｄｕｒｉ ＬＳ，Ｂａａｎｓｔｒａ Ｍ，Ｆａｂｅｒ Ｈ，Ｒｏｃｃｈｉ Ｃ，Ｚｗａｒｔ Ｅ，ｄｅ Ｈａａｎ Ｇ，ｖａｎ Ｏｓ Ｒ，Ｃｏｐｐｅｓ ＲＰ（２０１４）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３：９５７－９６４

【0186】

Ｎｅｌｓｏｎ ＤＡ，Ｍａｎｈａｒｄｔ Ｃ，Ｋａｍａｔｈ Ｖ，Ｓｕｉ Ｙ，Ｓａｎｔａｍａｒｉａ－Ｐａｎｇ Ａ，Ｃａｎ Ａ，Ｂｅｌｌｏ Ｍ，Ｃｏｒｗｉｎ Ａ，Ｄｉｎｎ ＳＲ，Ｌａｚａｒｅ Ｍ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌ Ｏｐｅｎ ２：４３９－４４７

【0187】

Ｏｇａｗａ Ｍ，Ｏｓｈｉｍａ Ｍ，Ｉｍａｍｕｒａ Ａ，Ｓｅｋｉｎｅ Ｙ，Ｉｓｈｉｄａ Ｋ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｋ，Ｎａｋａｊｉｍａ Ｋ，Ｈｉｒａｙａｍａ Ｍ，Ｔａｃｈｉｋａｗａ Ｔ，Ｔｓｕｊｉ Ｔ（２０１３）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｏｒｇａｎ ｇｅｒｍ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４：２４９８

【0188】

Ｏｗｅｎｓ ＤＭ，Ｗａｔｔ ＦＭ（２００３）Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３：４４４－４５１

【0189】

Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ Ｊ，Ｌｌｏｙｄ ＬＣ，Ｔｉｔｃｈｅｎ ＤＡ（１９７５）Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｒｏｔｉｄ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｏｆ ｓｈｅｅｐ ａｎｄ ｌａｍｂｓ ａｆｔｅｒ ｐａｒａｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｑ Ｊ Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｏｇｎ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ６０：２２３－２３２

【0190】

Ｐｅｎｇ Ｘ，Ｖａｒｅｎｄｉ Ｋ，Ｍａｉｍｅｔｓ Ｍ，Ａｎｄｒｅｓｓｏｏ ＪＯ，Ｃｏｐｐｅｓ ＲＰ（２０１７）Ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｉａｌ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ １２４：４４８－４５４

【0191】

Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＳＣ，Ｅｂｅｒｌ Ｍ，Ｖａｇｎｏｚｚｉ ＡＮ，Ｂｅｌｋａｄｉ Ａ，Ｖｅｎｉａｍｉｎｏｖａ ＮＡ，Ｖｅｒｈａｅｇｅｎ ＭＥ，Ｂｉｃｈａｋｊｉａｎ ＣＫ，Ｗａｒｄ ＮＬ，Ｄｌｕｇｏｓｚ ＡＡ，Ｗｏｎｇ ＳＹ（２０１５）Ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｒｉｓｅｓ ｆｒｏｍ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｉｎ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｏｒｙ ｎｉｃｈｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １６：４００－４１２

【0192】

Ｐｒｉｎｇｌｅ Ｓ，Ｎａｎｄｕｒｉ ＬＳ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｗａａｇ Ｍ，ｖａｎ Ｏｓ Ｒ，Ｃｏｐｐｅｓ ＲＰ（２０１１）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ８：２４８４

【0193】

Ｐｒｉｎｇｌｅ Ｓ，Ｍａｉｍｅｔｓ Ｍ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｗａａｇ Ｍ，Ｓｔｏｋｍａｎ ＭＡ，ｖａｎ Ｇｏｓｌｉｇａ Ｄ，Ｚｗａｒｔ Ｅ，Ｗｉｔｊｅｓ ＭＪ，ｄｅ Ｈａａｎ Ｇ，ｖａｎ Ｏｓ Ｒ，Ｃｏｐｐｅｓ ＲＰ（２０１６）Ｈｕｍａｎ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｓｔｏｒｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｄａｍａｇｅｄ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄｓ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ３４：６４０－６５２

【0194】

Ｇｕｅ Ｊ，Ｌｕｏ Ｘ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＲＪ，Ｈｏｇａｎ ＢＬ（２００９）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｏｘ２ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｔｒａｃｈｅａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３６：１８９９－１９０７

【0195】

Ｒａｚ Ｅ，Ｓａｂａ Ｌ，Ｈａｇｉｗａｒａ Ｍ，Ｈｙｇｉｎｏ ｄｅ Ｃｒｕｚ ＬＣ Ｊｒ，Ｓｏｍ ＰＭ，Ｆａｔｔｅｒｐｅｋａｒ ＧＭ（２０１３）Ｐａｒｏｔｉｄ ｇｌａｎｄ ａｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｎｅｒｖｅ ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ．ＡＪＮＲ Ａｍ Ｊ Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ ３４：８６０－８６３

【0196】

Ｒｅｄｍａｎ ＲＳ（２００８）Ｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄｓ ｄａｍａｇｅｄ ｂｙ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ，ｗｉｔｈ ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ８３：１０３－１３０

【0197】

Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ ＳＭ，Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ Ｋ，Ｃｕｌｌｅｎ Ｓ，Ｂｏｕｌａｙ Ｇ，Ｔｕｒｋｅ ＡＢ，Ｆａｂｅｒ ＡＣ，Ｌｏｃｋｅｒｍａｎ ＥＬ，Ｒｉｖｅｒａ ＭＮ，Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＪＡ，Ｍａｈｅｓｗａｒａｎ Ｓ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＥＧＦＲ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｒｉｇｇｅｒｓ Ｓ０Ｘ２－Ｆ０Ｘ０６－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｔｈｗａｙｓ．ｅＬｉｆｅ ４：ｅ０６１３２

【0198】

Ｓｃｈｎｅｙｅｒ ＣＡ，Ｈａｌｌ ＨＤ（１９６７）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｒａｔ ｐａｒｏｔｉｄ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２１２：８７１－８７６

【0199】

Ｓｅｉｄｅｌ Ｋ，Ｍａｒａｎｇｏｎｉ Ｐ，Ｔａｎｇ Ｃ，Ｈｏｕｓｈｍａｎｄ Ｂ，Ｄｕ Ｗ，Ｍａａｓ ＲＬ，Ｍｕｒｒａｙ Ｓ，Ｏｌｄｈａｍ ＭＣ，Ｋｌｅｉｎ ＯＤ（２０１７）Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｉｎｃｉｓｏｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｇｅｎｅ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．ｅＬｉｆｅ ５：ｅ２４７１２

【0200】

Ｓｉｅｇｅｌ ＲＬ，Ｍｉｌｌｅｒ ＫＤ，Ｊｅｍａｌ Ａ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１５．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ

【0201】

６５：５－２９

【0202】

Ｓｍｉｔｈ ＡＮ，Ｍｉｌｌｅｒ ＬＡ，Ｒａｄｉｃｅ Ｇ，Ａｓｈｅｒｙ－Ｐａｄａｎ Ｒ，Ｌａｎｇ ＲＡ（２００９）Ｓｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｄｅｓ ｏｆ Ｐａｘ６－Ｓｏｘ２ ｅｐｉｓｔａｓｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｌｅｎｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｙｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３６：２９７７－２９８５

【0203】

Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＣＡ，Ｈａｄｄａｄ ＲＩ，Ｔｉｓｈｌｅｒ ＲＢ，Ｍａｈａｄｅｖａｎ Ａ，Ｋｒａｎｅ ＪＦ（２００５）Ｃｈｅｍｏｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｌｏｓｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｇｌａｎｄｓ．Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ １１５：９５８－９６４

【0204】

Ｓｕｚｕｋｉ Ｙ（２００８）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｘ２ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｔａｓｔｅ ｂｕｄｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ３３２：３９３－４０１

【0205】

Ｔａｒａｎｏｖａ ＯＶ，Ｍａｇｎｅｓｓ ＳＴ，Ｆａｇａｎ ＢＭ，Ｗｕ Ｙ，Ｓｕｒｚｅｎｋｏ Ｎ，Ｈｕｔｔｏｎ ＳＲ，Ｐｅｖｎｙ ＬＨ（２００６）ＳＯＸ２ ｉｓ ａ ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２０：１１８７－１２０２

【0206】

Ｔａｔｓｕｔａ Ｍ，Ｙａｍａｍｕｒａ Ｈ，Ｉｉｓｈｉ Ｈ，Ｉｃｈｉｉ Ｍ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｓ，Ｂａｂａ Ｍ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｈ（１９８５）Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｂｙ ｖａｇｏｔｏｍｙ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ

【0207】

Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｉｎ Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ．Ｃａｎ Ｒｅｓ ４５：１９４－１９７

【0208】

Ｔｏｆｉｌｏｎ ＰＪ，Ｆｉｋｅ ＪＲ（２０００）Ｔｈｅ ｒａｄｉｏｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ：ａ ｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ １５３：３５７－３７０

【0209】

Ｕｅｎｏ Ｈ，Ｆｅｒｒａｒｉ Ｇ，Ｈａｔｔｏｒｉ Ｔ，Ｓａｂａｎ ＤＲ，Ｋａｔｉｋｉｒｅｄｄｙ ＫＲ，Ｃｈａｕｈａｎ ＳＫ，Ｄａｎａ Ｒ（２０１２）Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｒｎｅａｌ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｏｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５３：８６７－８７２

【0210】

Ｕｒｅｋ ＭＭ，Ｂｒａｌｉｃ Ｍ，Ｔｏｍａｃ Ｊ，Ｂｏｒｃｉｃ Ｊ，Ｕｈａｃ Ｉ，Ｇｌａｚａｒ Ｉ，Ａｎｔｏｎｉｅ Ｒ，Ｆｅｒｒｅｒｉ Ｓ（２００５）Ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｌａｔｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｘ－ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｇｌａｎｄ：ａ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ａｒｃｈ Ｍｅｄ Ｒｅｓ ３６：３３９－３４３

【0211】

Ｖｏｎ Ｖｉｎｔｓｃｈｇａｕ Ｍ，Ｈｏｎｉｇｓｃｈｍｉｅｄ Ｊ（１８７７）Ｎｅｒｖｕｓ Ｇｌｏｓｓｏｐｈａｒｙｎｇｅｕｓ ｕｎｄ Ｓｃｈｍｅｃｋｂｅｃｈｅｒ．Ａｒｃｈ Ｇｅｓａｍｍｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌ １４：４４３－４４８

【0212】

Ｗａｌｌａｃｅ Ｈ（１９７２）Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｒｅｇｒｏｗｉｎｇ ｎｅｒｖｅｓ ｗｈｉｃｈ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｓａｌａｍａｎｄｅｒ ｌｉｍｂｓ．Ｊ Ｅｍｂｒｙｏｌ Ｅｘｐ Ｍｏｒｐｈｏｌ ２８：４１９－４３５

【0213】

Ｗａｎｇ ＪＭ，ＭｃＫｅｎｎａ ＫＥ，ＭｃＶａｒｙ ＫＴ，Ｌｅｅ Ｃ（１９９１）Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ４４：１１７１－１１７６

【0214】

Ｗａｎｉｇａｓｅｋａｒａ Ｙ，Ａｉｒａｋｓｉｎｅｎ ＭＳ，Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＲＯ，Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ Ｊ，Ｋｅａｓｔ ＪＲ（２００４）Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｖｉａ ＧＦＲａｌｐｈａ２ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｂｕｔ ｎｏｔ ｍｕｓｃｌｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｓａｃｒａｌ ｐａｒａｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５：２８８－３００

【0215】

Ｗｏｌｌｎｙ Ｄ，Ｚｈａｏ Ｓ，Ｅｖｅｒｌｉｅｎ Ｉ，Ｌｕｎ Ｘ，Ｂｒｕｎｋｅｎ Ｊ，Ｂｒｕｎｅ Ｄ，Ｚｉｅｂｅｌｌ Ｆ，Ｔａｂａｎｓｋｙ Ｉ，Ｗｅｉｃｈｅｒｔ Ｗ，Ｍａｒｃｉｎｉａｋ－Ｃｚｏｃｈｒａ Ａ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｎｃｏｖｅｒｓ ｃｌｏｎａｌ ａｃｉｎａｒ ｃｅｌｌ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ３９：２８９－３０１

【0216】

Ｗｏｎｇ ＣＳ，Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｇｅｌ ＡＪ（２００４）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ４：２７３－２８４

【0217】

Ｗｕ Ｓ，Ｗｕ Ｙ，Ｃａｐｅｃｃｈｉ ＭＲ（２００６）Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ａｒｅ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ ｄｏ ｎｏｔ ａｐｐｅａｒ ｔｏ ｓｈａｒｅ ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｎｅａｇｅ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３３：５８１－５９０

【0218】

Ｘｉａｏ Ｎ，Ｌｉｎ Ｙ，Ｃａｏ Ｈ，Ｓｉｒｊａｎｉ Ｄ，Ｇｉａｃｃｉａ ＡＪ，Ｋｏｏｎｇ ＡＣ，Ｋｏｎｇ ＣＳ，Ｄｉｅｈｎ Ｍ，Ｌｅ ＱＴ（２０１４）Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ＧＤＮＦ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｓａｌｉｖａｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２４：３３６４－３３７７

【0219】

Ｘｉａｏ Ｙ，Ｔｈｏｒｅｓｅｎ ＤＴ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＳ，Ｗａｎｇ Ｃ，Ｐｅｒｎａ Ｊ，Ｐｅｔｒｏｖａ Ｒ，Ｂｒｏｗｎｅｌｌ Ｉ（２０１５）Ｎｅｕｒａｌ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｎｅｗａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｎｓｏｒｙ ｔｏｕｃｈ ｄｏｍｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：７１９５－７２００

【0220】

Ｙａｗｏ Ｈ（１９８７）Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｇｅｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｏｓｔｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ ａｘｏｔｏｍｙ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ７：３７０３－３７１１

【0221】

Ｚｅｉｌｓｔｒａ ＬＪ，Ｖｉｓｓｉｎｋ Ａ，Ｋｏｎｉｎｇｓ ＡＷ，Ｃｏｐｐｅｓ ＲＰ（２０００）Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｌｏｓｓ ｉｎ ｒａｔ ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｇｌａｎｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｌａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ ７６：４１９－４２９

【0222】

Ｚｈａｏ ＣＭ，Ｈａｙａｋａｗａ Ｙ，Ｋｏｄａｍａ Ｙ，Ｍｕｔｈｕｐａｌａｎｉ Ｓ，Ｗｅｓｔｐｈａｌｅｎ ＣＢ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＧＴ，Ｆｌａｔｂｅｒｇ Ａ，Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ Ｈ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＲＡ，Ｒｅｎｚ ＢＷ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｇａｓｔｒｉｃ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６：２５０ｒａ１１５

【0223】

実施例２
注入可能なアルギネートヒドロゲル中のムスカリン作動薬の局所送達による内因性唾液腺幹細胞集団の治療的活性化
唾液機能を回復するための代替的な再生アプローチは、自家幹細胞／前駆細胞が、傷害された臓器に移植されるか、または組織内の生存幹細胞が再活性化される幹細胞療法である。しかしながら、放射線および自己免疫疾患によって損傷された主要細胞型である唾液分泌腺房細胞を生じさせる前駆細胞は、以前は知られていなかった。我々は最近、ＳＯＸ２をマウス唾液腺における上皮前駆細胞のマーカーとして同定した（Ｅｍｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＳＯＸ２＋腺房細胞は、すべての主要なヒト唾液腺（顎下（ＳＭＧ））に見られ、マウス舌下腺（ＳＬＧ）内の腺房コンパートメントの２０％を構成する。我々は、ＳＯＸ２＋細胞および組織恒常性の維持は、ムスカリン受容体を活性化して細胞増殖を促進するアセチルコリンの副交感神経産生に依存することを見出した。我々は、ムスカリン模倣物のカルバコールおよびピロカルピンが、インビボおよび／またはエクスビボでの送達後にＳＯＸ２＋細胞増殖を促進することができ、ムスカリンアゴニズムが放射線による損傷後の唾液腺の再生を促進することをさらに示した。まとめると、これらの研究は、既存の幹細胞の再活性化が臓器を再生するための実現可能な戦略であることを強く示唆している。

【0224】

ここでは、唾液腺の幹細胞を介した再増殖を促進するための局所的かつ持続的なセビメリン送達の能力を試験する。具体的には、我々は、局所的な標的化された持続的な唾液腺への送達のために、ムスカリン作動薬の生分解性カルシウム架橋アルギネートヒドロゲルへの封入を含む組み合わせ生成物を考案した。インビトロおよびインビボ試験の組み合わせを使用して、組織内の線形分布およびムスカリン受容体作動薬セビメリンの持続的な送達を可能にするアルギネート系ヒドロゲルの化学的性質を定義した。マウスにおけるインビボ試験は、封入された薬物が、持続的送達と一致する様式で対照動物および照射動物の両方の唾液腺内の幹細胞増殖を促進するのに有効であることを実証している。したがって、唾液腺の再生および唾液流量の回復のための新規の治療薬を提供する。

【0225】

結果
セビメリンは、局所注入を介して送達されると、細胞増殖を促進する
ムスカリン模倣物の全身投与が唾液腺の増殖を促進するという以前の知見を考慮して、次に、局所腺内注入がまた有糸分裂応答を促進することができたかどうかを決定した。セビメリンが唾液腺に局所的に作用して腺房細胞増殖を誘導できるかどうかを判断するために、１０ｍｇ／ｋｇ体重（２０μＩ＿）のセビメリンを舌下腺に直接注入し、１８時間後に増殖を測定した。図１５に示すように、腺房細胞増殖が著しく増加し（図１５）、セビメリンが唾液腺に直接作用して細胞有糸分裂を促進することができることを示す。

【0226】

操作された生分解性カルシウム架橋アルギネートヒドロゲル
細胞増殖を促進する局所セビメリン送達の有効性に基づいて、次に、腺房再生を促進するセビメリンの局所的かつ持続的な放出のための注入可能な薬物送達プラットフォームを開発することに着手した。この目的のために、セビメリンの送達のために、カルシウム架橋アルギネート系生体材料を利用することを選択した。アルギネートは、褐色藻類から抽出される天然に生じるアニオン性ポリマーである。アルギネートは、その生体適合性、最小限の毒性、比較的低いコスト、およびＣａ^２＋などの二価カチオンを使用して細胞適合性条件下で架橋される能力のため、多くの生体医学用途に使用されるＦＤＡ承認のヒドロゲルである。（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．３７（１）：１０６－１２６）カルシウム架橋アルギネートは、生体組織の細胞外マトリックスと構造的に類似しており、高親水性で、生理学的に湿潤な微小環境を維持する。重要なことに、アルギネートは、臨床に関連する注入針（ｓｙｒｉｎｇｅ－ｎｅｅｄｌｅｓ）システムを介した注入を可能にする濃度で再懸濁させることができ、その間、剪断力が静電架橋を破壊して材料を直線的に変形させるが、ゲル化はインビボで自発的に再形成する。

【0227】

アルギネートは、ポリマー鎖切断酵素アルギナーゼが欠如しているため、哺乳動物において本質的に非分解性である。しかしながら、イオン的に架橋されたアルギネートゲルは、ゲルを架橋している二価イオンがナトリウムイオンなどの一価カチオンとの交換反応によって、周囲媒体に放出され、溶解される。アルギネート分解速度は、ポリマー鎖の部分酸化によってさらに制御され得る。埋め込み型ではなく治療薬とする場合ＦＤＡ承認にとって重要なのは、注入後３０日までにアルギネートヒドロゲルを分解する必要がある。しかしながら、セビメリンの持続的な送達を達成するために、アルギネートは７日＋期間にわたって存在するべきである。この分解プロファイルを満たすために、アルギネート鎖を２％または５％のいずれかで部分酸化した。インビトロ分解試験は、２つのヒドロゲルが有意に異なる分解プロファイルを有し、遅い分解が２％酸化アルギネート（ＯＡ）ヒドロゲルで達成されることを示す。（図１６Ａ）２％ＯＡヒドロゲルは、インビトロでほぼ５日間、ゲル質量の５０％超を維持するが、５％ＯＡヒドロゲルは１日でこの質量を失う。培養の７日間のインビトロ分解試験後、２％ＯＡヒドロゲルのおよそ３０％対５％ＯＡヒドロゲルの１４％が残存する。

【0228】

このより長い物理的保持期間に基づいて、２％ＯＡヒドロゲルを使用することを選択した。次に、２％ＯＡヒドロゲルの重量パーセント（重量％）が物理的分解にどのように影響したかを試験した。２％のＯＡヒドロゲルの１０重量％は、２重量％または５重量％よりも著しくゆっくりと分解されるが、この濃度は、唾液腺へのインビボ送達に必要な小口径の針から容易に注入することができなかった（＞２３ゲージ）。（図１６Ｂ）。

【0229】

その後、５重量％での２％ＯＡヒドロゲルの物理的分解を、野生型マウスの背側面（ｄｏｒｓａｌ ａｓｐｅｃｔ）の皮下ポケットに１００μＩのヒドロゲルを注入することによって、より生理学的に関連する条件下で試験した。この量のヒドロゲルは、数分以内に小さなディスクを形成し、次いで、それを取り出して、分析のために秤量することができる。インビトロシステムとは対照的に、インビボでは、注入後７日で質量損失がほとんど見出されないことを見出し（図１６Ｃ）、このヒドロゲルがセビメリンのインビボ送達に好適であることを示す。

【0230】

商業的可能性にとって重要な別の因子は、可溶化アルギネートの貯蔵安定性である。分解を遅らせるために、可溶化酸化アルギネートは、材料を４℃または＜－２０℃で保管する必要があると推定したが、これらの保管条件が材料安定性に与える具体的な影響は不明である。したがって、可溶化酸化アルギネートを４℃または－２０℃で３０日間貯蔵した後の、カルシウム架橋アルギネートの圧縮弾性率の変化を試験した。５重量％の２％ＯＡヒドロゲルを冷蔵条件下（４℃）で保管したとき、架橋有効性は、２０日間の圧縮弾性率の低下によって著しく影響を受け、酸化アルギネートの分解を示唆した（図１６Ｃ）。しかしながら、アルギネートを凍結条件下（－２０℃）で維持すると、合成後３０日で初期材料特性が安定化した。

【0231】

アルギネートヒドロゲルからのセビメリンの局所的および持続的な放出
アルギネートの薬学的用途は、様々な低分子量薬物の制御放出のためにヒドロゲルを利用することに従来関与してきた。架橋アルギネートは、出発分子量が１９７ｋＤａであることを考慮すると、約５ｎｍで予測される我々の材料の理論的孔径を有するナノ多孔質材料を形成する。薬物の制御放出は、正荷電セビメリン（ｐＫＡ＝９．５）と負荷電アルギネートヒドロゲルとの間の静電相互作用を通じて主に調節される。インビトロセビメリン放出研究は、２日間にわたって薬物の放出を持続することができることを実証する。（図１７）物理的分解特性を変化させたにもかかわらず（図１６Ａ～１６Ｂ）、アルギネートヒドロゲルの酸化量（ＯＡ％）も重量パーセント（重量％）も薬物放出動態に有意な影響を及ぼさず、８５±５％を超えるセビメリンが２日間までにインビトロで放出された。（図１７Ａ～１７Ｂ）薬物の開始濃度の変更が放出に影響を及ぼしたかどうかを試験するために、３０００ｎｇ、６００００ｎｇ、または１２０００ｎｇのセビメリンのいずれかを各ディスクに装填し、インビトロで放出を試験した。放出速度は比較的一貫したままである（図１７Ｃ）ため、２日間にわたって送達される薬物の量の予測可能な増加を生じさせる（図１７Ｄ）。

【0232】

セビメリンは、アルギネートに封入されると腺細胞増殖を促進する
次に、この成功した薬物送達プラットフォームを考慮して、アルギネート＋セビメリンの有効性、毒性、および分解をインビボで試験した。マウス唾液腺のサイズが小さいため、組織損傷によって引き起こされる合併症を避けるために、ヒドロゲルを腺に直接注入するのではなく、Ｘ線で可視化されるように腺に直接隣接する領域に注入することを選択した（図１８Ａ、Ｘ線不透過性造影剤として封入されたオムニパーク）。１０ｍｇ／ｋｇのセビメリンを含むもしくは含まないアルギネートまたは生理食塩水を、唾液腺に隣接して注入し、注入後１８時間（図１８Ｃ、１群当たりｎ＝３～４）または３日（図１８、１群当たりｎ＝３～６）に唾液腺を分析した。図１８に示すように、アルギネート単独と比較して、１０ｍｇ／ｋｇのアルギネート＋セビメリンに応答して、３日目に増殖するＫｉ６７＋およびＥｄＵ＋腺房細胞の数の有意な増加を測定した（図１８Ｃ、１８Ｄ）が、これはアルギネートと組み合わせた場合に薬物が長期の活性を有することと一致する。我々は、より高い２５ｍｇ／ｋｇのアルギネート＋セビメリンに応答して、３日時点で増殖するＫｉ６７＋腺房細胞の同様の増加が見られたことから、用量の増加が有効性を有意に改善しないことを示唆された（図１８）。また、アルギネート単独で処理したマウスの腺内の細胞増殖を、生理食塩水の腹腔内（ＩＰ）注入のみを受けたマウスと比較することによって、アルギネート自体が有糸分裂性であるかどうかを試験した。アルギネートだけで上皮細胞増殖を促進するのに十分であり、３～７日間にわたってそうなることが分かり（図２３）、この組み合わせが有益な影響を有することを示している。

【0233】

アルギネートまたはアルギネート＋セビメリン処理がマウスにおいて毒性作用を示したかどうかを判断するために、マウス体重を測定し、唾液腺における炎症細胞を特徴付けた。我々は、アルギネート＋セビメリンの用量を増加させることで、注入後３日までに体重の減少を引き起こさなかったことを見出した（図２４）。さらに、生理食塩水を注入した対照と比較して、下痢などの毒性作用は観察されなかった。ＣＤ３＋Ｔ細胞の免疫組織学的分析はまた、未処理または老化（陽性対照）マウスに由来する組織と比較して、増加を示さなかった（図１９Ａ、１９Ｂ）。主要な先天性免疫細胞であり、損傷に対する最初の応答者であるＣＤ６８＋マクロファージの分析では、未処理の対照と直接比較した場合、アルギネートまたはアルギネート＋セビメリン処理に応答して、これらの細胞のわずかな増加を示唆した（図１９Ｃ、１９Ｄ）。マクロファージ集団のさらなる分析は、生理食塩水処理対照と比較した場合、修復促進性（ｐｒｏ－ｒｅｐａｉｒ）ＣＤ２０６＋マクロファージがアルギネート処理組織において有意に増加したことを示し（図１９Ｅ）、アルギネートが抗炎症性マクロファージを活性化することによって唾液腺に有益な影響を及ぼし得ることを示唆している。

【0234】

放射線誘発損傷後の唾液腺に対するセビメリン－アルギネートの影響
次に、セビメリンまたはアルギネート＋セビメリンが、ガンマ線誘発損傷後に唾液腺における細胞増殖を促進することができるかどうかを試験した。７～８週齢のＣ５７ＢＬ６の頚部に単回で１０Ｇｙ線量の放射線を照射し、１４日後に、生理食塩水または１０ｍｇ／ｋｇのセビメリンのいずれかを全身または線内に注入し、１８時間後に増殖する腺房細胞の数を分析した（図２０Ａの概略図を参照されたい）。このレベルの放射線は、クエン酸塩によって誘発される唾液流量を３０％減少させる（図２０Ｂ）。セビメリンの全身投与および局所投与の両方が、照射されたマウスにおける腺房細胞の増殖を増加させたことを見出し（図２０Ｃ～２０Ｅ）、セビメリンが損傷した唾液腺において有効であることを示している。

【0235】

最後に、アルギネートに封入されたセビメリンが、細胞の増殖および唾液流量を促進したかどうかを試験した。放射線の１４日後に、マウスにアルギネートまたはアルギネート＋セビメリンを注入し、増殖の分析のために３日で屠殺した（図２１Ａ概略図）。アルギネート＋セビメリンは、アルギネートのみのレベルを上回って増殖速度を増加させた（図２１Ｂ、２１Ｃ）。アルギネートまたはアルギネート＋セビメリンでの処理が唾液流量を補助するかどうかをさらに決定した。驚くべきことに、アルギネートおよびアルギネート＋セビメリンの両方が、クエン酸塩によって誘発される唾液流量を７日間増加させることができ（図２１Ｄ）、アルギネート自体が照射された臓器に利益をもたらすことを示唆する。

【0236】

考察
ムスカリン作動薬の経口投与は、口腔乾燥症に罹患している患者の唾液の一時的な産生を刺激するために処方されるが、過度の発汗、顔面紅潮、尿意逼迫、胃腸の不快感、および頭痛などの一般的な副作用を伴う。ここでは、注入可能なカルシウム架橋アルギネートヒドロゲルからのムスカリン作動薬セビメリンを局所放出することが、免疫応答を誘発することなく、放射線誘発損傷後に、腺房細胞の補充を促進し、唾液腺機能を改善することができることを示す。これは、照射された組織の腺房前駆体が増殖するように刺激され得、ムスカリン受容体活性化がこの結果を達成するのに十分であるという最初のインビボ証拠を表す。また、小分子セビメリンの放出を３日間にわたって持続させることに加えて、カルシウム架橋アルギネートが単独で、再生促進応答を刺激することも実証している。まとめると、これらの所見は、様々なドライマウスに適している可能性のある放射線誘発損傷後の唾液腺機能障害を逆転させるための潜在的な新しい併用療法を提供する。

【0237】

我々の療法は、唾液腺機能、恒常性、および再生に末梢神経が不可欠であるという過去１００年以上の証拠に基づいている。副交感神経の除去は、組織の再神経支配を通じて元に戻すことができる分泌性腺房の萎縮をもたらす（Ｅｍｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。副交感神経支配は、頭頸部癌の治療放射線を受けた患者からの唾液腺において著しく減少するため（Ｅｍｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、萎縮した組織に神経由来因子を再供給することで組織構造と機能を回復させることができるかどうかを疑問視した。ここに示されるインビボ実験は、胎児の唾液腺における放射線曝露後のニューロン生存率および機能の増加、または照射された成人組織をムスカリン作動薬で治療することが、前駆細胞を介した機構による腺房細胞補充を促進するのに十分であることを実証する我々の以前のエクスビボ研究に続くものである（Ｋｎｏｘ ２０１３、Ｅｍｍｅｒｓｏｎ ２０１８）。さらに、現在のデータは、照射された唾液腺を有するマウスおよびヒトにおけるムスカリン作動薬の長期経口投与後の唾液流量の改善（Ｂａｒｂｅ ２０１７、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ２０１９）は、細胞死の減少ではなく、腺房細胞補充に起因する可能性があることも示唆している。しかしながら、ヒト腺房細胞がムスカリン刺激に応答して増殖することができるかどうかは、まだ決定されていない。

【0238】

照射された唾液腺の再生のために多くの戦略が検討されてきた。我々の治療への適用は、アセチルコリン相同体の提供を通じて副交感神経系による組織の内因性調節を模倣することを目的としている。このアプローチは、神経栄養性成長因子であるニュールツリンの発現を通じて臓器に機能的神経を再補給することを目的とする最近の遺伝子治療研究と類似している。他の戦略は、胚発生中に分岐形態形成を促進することが知られている成長因子：線維芽細胞成長因子７の腺内投与（ＦＧＦ７、Ｌｏｍｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、またはインスリン様成長因子１の全身送達Ｇｒｕｎｄｍａｎｎ（２０１０）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １０：４１７）、または管カニューレ挿入を介したソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）の遺伝子送達（Ｈａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２７（５）：３９０－３９９）、を利用して照射された唾液腺の唾液機能および組織保存を改善した。しかしながら、これらの因子のクリニックによる取り込みは、癌成長を加速させる可能性によって妨げられてきた。ピロカルピンの長期経口投与は腫瘍発生性であることは示されなかったが、セビメリンの局所投与が癌の開始、進行、または転移に影響を及ぼすかどうかを判断するには、さらなる研究が必要である。

【0239】

以前の研究は、骨、軟骨、および皮膚を含む様々な臓器系において創傷治癒を促進するためのカルシウム架橋アルギネートヒドロゲルを示す（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８（６）：６６３６－６６４５）。しかし、この機能が細胞増殖、生存および／または移行を介して直接媒介されるかどうかは、依然としてあまり分かっていない。我々のデータは、カルシウムアルギネートが、細胞増殖を誘導することによって照射された唾液腺の組織再生を促進する能力を有することを示している。これを達成する可能性のある機構は、細胞外カルシウムの上昇によるものである。多糖骨格に架橋されていないカルシウムは、アルギネートから細胞外空間に直接放出され（Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．３２（４）：５６１－５６８）、または材料の分解中に放出される可能性がある。次いで、このＣａ^２＋デポは、カルシウム感知受容体を活性化して、細胞内Ｃａ^２＋放出および／または細胞増殖を促進するための他のシグナル伝達経路を媒介することができる。カルシウム感知受容体は、腺房細胞を含む多くの細胞型に存在するため、アルギネートに由来するＣａ^２＋イオンが、これらの受容体を刺激することを介して有糸分裂促進剤（ｐｒｏ－ｍｉｔｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）として機能し得ることを提案する。

【0240】

カルシウムアルギネートゲルからのＣａ^２＋の放出も炎症誘発性であり得ることが最近報告されている（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．９（１２）：９２８１－９２９１）。カルシウムアルギネートがマウスの皮下に与えると、周囲の組織のＩＬ－ｉｐを著しく上方制御し、ＬＰＳの炎症作用を増強した。しかしながら、我々の結果は、セビメリンを含むかまたは含まないカルシウムアルギネートが非常に生体適合性が高く、唾液腺の周囲の領域に注入されると炎症をほとんどまたは全く引き起こさないことを示している。

【0241】

ヒドロゲルに必要とされる重要な特性の１つは、持続的な薬物放出を提供する能力である。小化学薬品から巨大分子タンパク質までの薬物分子は、架橋剤の種類および架橋方法に応じて、制御された様式でアルギネートゲルから放出され得る。実際に、架橋などの薬物放出の動力学を制御するために、複数の化学物質が適用されてきた。

【0242】

材料および方法
ＯＡの合成
酸化アルギネートナトリウム（ＯＡ）を、以前に記載された方法の改変を使用して、アルギネートナトリウム（Ｐｒｏｔａｎａｌ ＬＦ２０／４０、アルギネートＭＷ＝１９７，０００Ｄａ、ＦＭＣバイオポリマー＃Ｓ１８４０７）と過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃３１１４４８）と反応させることによって調製した。簡潔に述べると、アルギネートナトリウム（１０ｇ）を超高純度脱イオン水（ｄｉＨ_２Ｏ、９００ｍｌ）に一晩溶解した。暗所で室温（ＲＴ）で撹拌しながら、１００ｍｌのｄｉＨ_２Ｏ中に過ヨウ素酸ナトリウム（０．２２ｇ）を溶解させ、アルギネート溶液に添加した。２４時間反応させた後、エチレングリコール（５２μＩ、Ｓｉｇｍａ）の添加によって反応を停止させた。ＯＡを、ｄｉＨ_２Ｏに対する透析（ＭＷＣＯ＝３５００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって３日間精製し、活性炭（５ｇ／ｌ、５０～２００メッシュ、Ｆｉｓｈｅｒ、０５－６９０Ｂ）で３０分間処理し、濾過し（０．２２ｐｍフィルター）、凍結乾燥した。

【0243】

ＯＡの酸化効率を分析するために、ＯＡを酸化ジュウテリウム（５重量／体積％）に溶解し、ＮＭＲチューブに入れた。^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを、内部標準として３－（トリメチルシリル）プロピオン酸－ｄ_４ナトリウム塩（０．０５ｗ／ｖ％）を使用して、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＤＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ）で記録した。実際の酸化は、アルギネートの酸化によって新たに形成されたアルデヒドのカルボニル炭素に対する炭素の積分の比率に基づいて、^１３Ｈ－ＮＭＲスペクトルから決定した。（図２５）。

【0244】

カルシウム架橋ＯＡヒドロゲルの合成
ＯＡは、ヒドロゲルを形成する準備ができるまで、凍結乾燥形態で－２０℃に維持される。ヒドロゲルは、ＯＡをダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＃１１８８５０８４）中に、所望の重量／体積（重量％）で室温で最低３０分間一定の撹拌下で、溶解することによって形成される。ＯＡは、超飽和硫酸カルシウム（ＣａＳ０_４、８４ｍｇ／ｍＬ）溶液と、アルギネート１ｍＬ当たりの１重量％当たり２０μＬのＣａＳ０_４（例えば、それぞれ、２％、５％、および１０重量％のアルギネート１ｍＬと混合された４０、１００、および２００ｐＬのＣａＳ０_４）の濃度で混合することによって架橋される。ＯＡ溶液およびＣａＳ０_４スラリーを２つの１ｍＬシリンジに別々に装填した。２つのシリンジをメス－メスのルアーロックカプラ（Ｖａｌｕｅ Ｐｌａｓｔｉｃｓ）と一緒に接続した後、２つのシリンジを混合した（約３０回）。

【0245】

酸化アルギネートヒドロゲルの物理的分解
ＯＡヒドロゲルのインビトロ物理分解を、２重量％、５重量％、または１０重量％の重量／体積で２％または５％のいずれかの酸化を有する１ｍｍｘ４ｍｍディスクを作成することによって試験した。ディスクは、２５ゲージ針を使用して、１．０ｍｍスペーサーによって分離された２つのガラスプレート間にＯＡヒドロゲルを注入することによって形成された。３０～４５分後に室温で重合したゲルおよび生検パンチを使用して直径４ｍｍのディスクを作成した。ゲルを、３．２ｍｌのＤＭＥＭを含有する１２ウェルプレート中の０．４ｐｍのトランスウェル（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ，＃ＭＣＨＴ１２Ｈ４８）に移し、プレートを３７℃で連続的に振とうした（１００ＲＰＭ）。ヒドロゲルをＴｏ（初期対照）、４時間、１日、３日、５日、および７日（Ｄ）で収集した。３つのヒドロゲルを、各時点で平均３～５個の別個の複製物（試料）と共にプールした。試料を－８０℃で凍結させ、その後凍結乾燥させた（ＶｉｒＴｉｓ Ｗｉｚａｒｄ ２．０）。乾燥重量を分析天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＡＴ２０１）で測定した。

【0246】

インビボ分解アッセイを、マウス皮下アッセイを使用して実行した。すべての実験はＵＣＳＦ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。動物をイソフルラン（２．５％誘導、１．５％維持）を使用して麻酔し、皮膚を７０％のエタノールで洗浄し、次いで、２５ゲージ針を使用して、マウスの背側面の個々の皮下ポケットに１００μＩのＯＡヒドロゲルのゲルを注入した（最大６のヒドロゲル／動物）。マウスを社会的に飼育し、疼痛および苦痛の徴候について４８時間モニタリングした。動物を１８時間、３日、５日、または７日生存させた。最終時点で、ゲルを皮下ポケットから顕微解剖し、－８０℃で凍結させ、凍結乾燥させ、乾燥重量をインビトロ分解のために行われたと同様に記録した。

【0247】

ＯＡの安定性
２％ＯＡポリマーを、上記のように５重量％で溶解し、３ｍｌシリンジ中に吸引し、４℃または－２０℃で保管した。溶解後１、４、１０、２０、または３０日でシリンジ（ｎ＝５／回）を、保管場所から取り出し、室温に戻し、次いで、上記のように、ＯＡ溶液を超飽和硫酸カルシウムスラリーと混合することによって架橋した。混合後、架橋したＯＡを、０．７５ｍｍスペーサーによって分離された２つのガラスプレートの間に直ちに配置し、室温で３０分間、ヒドロゲルを形成させた。直径６ｍｍの生検パンチを使用して、カルシウム架橋ＯＡヒドロゲルディスクを作成した。ＯＡ溶液の安定性を評価するために、カルシウム架橋ＯＡヒドロゲルの経時的な弾性率を測定した。５Ｎロードセルを備えた機械的試験機（２２５ｌｂｓアクチュエータ、ＴｅｓｔＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）で、毎秒１％の定クロスヘッド速度を使用して、室温で一軸定ひずみ速度圧縮試験（ｕｎｉａｘｉａｌ，ｕｎｃｏｎｆｉｎｅｄ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｒａｔｅ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｅｓｔｉｎｇ）を実行することによって、ヒドロゲルの弾性係数を決定した。弾性係数（Ｅｌａｓｔｉｃ ｍｏｄｕｌｉ）を応力対ひずみプロットの最初の非ゼロ線形勾配（ｎｏｎ－ｚｅｒｏ ｌｉｎｅａｒ ｓｌｏｐｅ）から計算し、ひずみの最初の５％に限定した。

【0248】

セビメリンを測定するための質量分析
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えた４５００ＱＴｒａｐ質量分析計に接続された島津プロミネンスＬＣ－２０ＡＤＸＲシステムを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために操作した。クロマトグラフィーによる分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ Ｃ１８ガードカラム（３ｍｍ×２．０ｍｍ）と結合したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＫｉｎｅｔｅＸ（登録商標）Ｃ１８（５０×３ｍｍ、２．６ｐｍ）カラムを使用して達成した。カラム温度を３０℃で制御した。移動相Ａは水中０．１％のトリフルオロ酢酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル（ＡＣＮ）であった。注入体積は１０ｐＬであり、流量は０．５ｍＬ／分であった。勾配条件は以下の通りであった。（時間／分、移動相Ｂ％）：（０、１５）、（１、１５）、（２．５、２２．８）、（２．６、９８）、（５、９８）、（５．１、１５）、および（８、１５）。ソースパラメータには、４５ｐｓｉのカーテンガス、４０００Ｖのイオン噴霧電圧、５５０のイオンソース温度、および中程度の衝突ガスが含まれた。陽イオンＥＳＩモードでのＭＳ／ＭＳパラメータ設定の概要を表１に提示する。

【0249】

メタノール中の１０．０～１００００．０ｎｇ／ｍＬの範囲にわたって、セビメリンの標準作業溶液を調製した。作業溶液を１００μＩ＿のＤＭＥＭにスパイクして、標準またはＱＣ試料を生成した。較正標準の最終濃度は、ＤＭＥＭ中０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、２５．０、５０．０、および１００．０、２５０．０、および５００ｎｇ／ｍＬであった。ＱＣ試料は、０．９、４、３０．０、および４００．０ｎｇ／ｍＬであった。

【0250】

試料調製ステップでは、１００μＬのＤＭＥＭごとに、１０μＬのＩＳ作業溶液（１０００ｎｇ／ｍＬ）を添加した。９６ウェルタンパク質沈殿フィルタープレートＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および３００ｐｉのＭｅＯＦＬＡＣＮ（１５：８５）をタンパク質沈殿に使用した。濾過後、２００ｐｉのＮＨ_４ＯＨ５％を２００ｐｉの試料に添加し、１０ｐｉをＬＣＭＳ系に注入した。生物分析法は、選択性、直線性、日中および日間精密度および正確度、回復率および安定性を含む米国ＦＤＡの現在のガイドラインに従って検証された（「Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，」２０１８ ｆｄａ．ｇｏｖ／ｍｅｄｉａ／７０８５８／ｄｏｗｎｌｏａｄ）。

【表1】

【0251】

アルギネートヒドロゲルからのセビメリン放出
ＯＡヒドロゲルからのインビトロセビメリン（ＣＶ）放出を、２、５、または１０％重量／体積で２または５％のいずれかの酸化を有する１ｍｍｘ４ｍｍディスクを作成することによって試験した。アルギネート＋セビメリン（Ａｂｅａｍ，ａｂ１４１３１７）ヒドロゲルを、凍結乾燥されたＯＡと混合する前に、薬物をＤＭＥＭ中の所望の濃度で再懸濁させることによって作成し、その後の架橋が上述のように進み、薬物をＯＡヒドロゲルで封入した。３つの４ｍｍのアルギネート＋セビメリンヒドロゲルを、ゆっくりと連続的に撹拌（１００ＲＰＭ）しながら３７℃にてインキュベートする、３．２ｍｌのＤＭＥＭを含有する１２ウェルプレートの０．４μｍトランスウェルに入れた。試料培地（３ｍｌ ＤＭＥＭ）を収集し、４時間、１日、２日、３日、４日、５日、および７日（Ｄ）に補充した。３つのヒドロゲルを、各時点で平均３～５個の別個の複製物（試料）と共にプールした。質量分析が実行されるまで、試料培地を－２０℃で保存した。グラフは、その時点までにすべてのセビメリンが放出されたため、４日目までしか表示されない。Ｔｏ（初期対照）ゲルをＤＭＥＭに溶解して、ヒドロゲルに封入されたセビメリンのベースラインを確立した。

【0252】

動物実験
特に明記されない限り、Ｃ５７／ＢＬ６近交系（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの成体雌マウス（６～８週齢）をすべての実験に使用した。すべての手順は、ＵＣＳＦ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認され、実験動物の管理および使用に関するＮＩＨガイドに準拠していた。

【0253】

インビボセビメリン送達
セビメリンを前述のように調製し、遊離セビメリン用に２８Ｇ１／２針（Ｃｏｖｉｄｉｅｎ）を備えた０．５ｍｌのＭｏｎｏｊｅｃｔ（商標）Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎシリンジを使用して腹腔内（ＩＰ）注入によって、またはアルギネートと混合したセビメリン用に２５Ｇ×５／８針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を備えた１ｍｌのＴＢシリンジを使用して皮下注入によって送達した。

【0254】

セビメリンの腸内注入については、マウスに手術の３０分前に鎮痛剤（カルプロフェンおよびブプレノルフィン；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙおよびＢｕｐｒｅｎｅｘ；それぞれ０．１ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ（ＩＰ））を投与し、２％イソフルラン／０_２混合物を吸入して麻酔した。手術部位を剃毛し、ヨウ素およびアルコールで交互に洗浄し、続いて局所麻酔薬（リドカイン、Ｈｏｓｐｉｒａ Ｉｎｃ．、８ｍｇ／ｋｇ）を用い、切開の準備をした。スプリングハサミを使用して、頭尾軸に沿って喉を切開した。次いで、スリップチップのツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に取り付けられた２ ２７Ｇｘ１／２針（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、セビメリンを、下顎腺および舌下唾液腺の葉に注入した。皮膚を、非吸収性絹縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して縫合した。マウスを１８時間後、３日後または７日後に安楽死させ、一部の動物に、屠殺の２時間前に、０．２５ｍｇ／２５ｇの５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する０．９％生理食塩水を注入した。

【0255】

γ線処理
動物を、０．９％生理食塩水（Ｖｅｄｃｏ Ｉｎｃ．）中の１００μｌ／１０ｇｂｗの２．５％アバチン（２，２，２－トリブロモエタノール（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）、ｔｅｒｔ－アミルアルコール（２－メチル－２－ブタノール）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ））で麻酔した。マウスをＳｈｅｐｈｅｒｄ Ｍａｒｋ Ｉ照射装置（ＪＬ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）に入れた。鉛ブロックを使用して身体を放射線から遮蔽し、頭頸部領域を２回の５Ｇｙ線量（合計１０Ｇｙ）に曝露して唾液腺（ＳＧ）を照射した。対照マウスを麻酔したが、放射線処理を受けなかった。正常な飼育に戻る前に、すべてのマウスを完全に回復させ、自由に柔らかい食餌（ＣｌｅａｒＨａＯ）を与えた。

【0256】

唾液収集
２％吸入イソフルランまたはアバチンを使用してマウスを麻酔した（放射線研究用）。１２．５ｐｉ滅菌水中の５ｍｇのクエン酸ナトリウム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）をマウスの口に落とした。２分後、１枚の濾紙を動物の口に挿入し、麻酔下で５分間放置した。分泌された唾液の量は、精密スケール（Ｄｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＳＩ－６４、ｄｉ＝０．１ｍｇ）を使用して、収集の前後の濾紙の重量を測定することによって決定された。

【0257】

組織処理
安楽死後、ＳＧを収集し、スナップ凍結し、ＯＣＴに埋め込んだ。１０ｐｍの凍結した切片をクライオスタット（Ｌｅｉｃａ）を使用して切り取り、免疫蛍光試験に使用した。

【0258】

免疫蛍光試験
組織切片免疫蛍光分析を以下のように処理した。簡単に説明すると、新鮮な凍結組織を４％のＰＦＡで室温で１０分間固定した後、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ１００で室温で１０分間透過処理した。組織を、０．０１％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０中の１０％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＥ）、５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＭＯＭ ＩｇＧブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）を使用して室温で２時間ブロックした。ＳＧ切片を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした：ウサギ抗ＡＱＰ５（１：２００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ３５５９）、ヤギ抗ＳＯＸ２（１：２００、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、ＧＴ１５０９８）、ウサギ抗Ｋｉ６７（１：２００、ＡｂＣａｍ、ａｂ１６６６７）、ラット抗Ｋｉ６７（１：２００、ＤＡＫＯ、Ｍ７２４９）、ウサギ－ＣＨＲＭ３（１：１０００、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＡＳ－３７４１Ｓ）、ラット抗Ｅ－カドヘリン（１：４００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１３－１９００）。Ｃｙ２－、Ｃｙ３－またはＣｙ５－コンジュゲート二次Ｆａｂ断片抗体（１：３００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して抗体を検出し、核はＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２（１：１０００、ＡｎａＳｐｅｃ Ｉｎｃ．）を使用して染色した。Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８または６４７キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＥｄＵ染色を実行した。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してスライドを取り付け、ＬｅｉｃａＳｐ５共焦点顕微鏡を使用して蛍光を分析した。画像処理および定量は、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実行した。

【0259】

統計
統計検定は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ８を使用して実行した。データは、平均値±ＳＤとして提示され、２つのデータセットについては両側の対応のないスチューデントのｔ検定、または３つ以上のデータセットについては、テューキーの多重比較検定を使用する、通常の一元配置分散分析に供された。以下に示されたＰ値カットオフを使用して有意性を評価した：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。特定のデータセット分析は、図の凡例に記載されている。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
口腔乾燥症の治療に使用するための、唾液腺への局所投与のために製剤化されたヒドロゲルに封入されたムスカリン作動薬を含む組成物。
(項目２)
前記ムスカリン作動薬が、Ｍ１および／またはＭ３ムスカリン受容体サブタイプに対して選択的である、項目１に記載の組成物。
(項目３)
前記ムスカリン作動薬が、セビメリンである、項目２に記載の組成物。
(項目４)
前記ムスカリン作動薬が、ピロカルピンである、項目１に記載の組成物。
(項目５)
前記ヒドロゲルが、アルギネートを含む、項目１～４のいずれか一項に記載の組成物。
(項目６)
前記アルギネートが、イオン的に架橋されている、項目５に記載の組成物。
(項目７)
前記アルギネートが、二価カルシウムカチオンによってイオン的に架橋されている、項目６に記載の組成物。
(項目８)
前記ヒドロゲル中の前記アルギネートの濃度が、約２～約１０重量パーセント（重量％）の範囲である、項目５～７のいずれか一項に記載の組成物。
(項目９)
前記アルギネートが、少なくとも部分酸化される、項目５～７のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１０)
前記アルギネートの約２％～約１０％が酸化される、項目８に記載の組成物。
(項目１１)
前記アルギネートの約２％が酸化され、前記ヒドロゲル中の前記アルギネート濃度が、約５重量％である、項目９に記載の組成物。
(項目１２)
前記ヒドロゲルが、対象への投与後少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも４週間、前記ムスカリン作動薬の送達を維持する、項目１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１３)
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１４)
造影剤をさらに含む、項目１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１５)
口腔乾燥症の対象を治療する方法であって、治療有効量の項目１～１４のいずれか一項に記載の組成物を前記対象の唾液腺に局所投与することを含む、方法。
(項目１６)
前記組成物が、前記唾液腺に、または前記唾液腺に隣接して注入される、項目１５に記載の方法。
(項目１７)
注入の前に、前記唾液腺の位置を特定するために、医用画像化または触診を実行することをさらに含む、項目１５または１６に記載の方法。
(項目１８)
前記医用画像化が、超音波を実行することを含む、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記組成物の複数の治療有効用量が、前記対象に投与される、項目１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０)
前記口腔乾燥症が、放射線またはシェーグレン症候群による前記唾液腺の損傷によって引き起こされる、項目１５～１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１)
前記対象が、ペットまたは家畜である、項目１５～２０のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２)
前記対象が、哺乳動物である、項目１５～２１のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
前記哺乳動物が、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、またはブタである、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目２２に記載の方法。
(項目２５)
項目１～１４のいずれか一項に記載の組成物と、口腔乾燥症を治療するための説明書と、を含むキット。
(項目２６)
前記組成物を対象に送達するための手段をさらに含む、項目２５に記載のキット。
(項目２７)
アルギネートヒドロゲルに封入されたムスカリン作動薬を含む組成物を含有する第１のシリンジと、塩化カルシウムを含む溶液を含有する第２のシリンジと、ルアーロックとをさらに含み、前記第２のシリンジは、前記ルアーロックを介して前記第１のシリンジに接続され得る、項目２５に記載のキット。
(項目２８)
アルギネートヒドロゲルに封入された前記ムスカリン作動薬を含む前記組成物を含有する前記第１のシリンジが、凍結される、項目２７に記載のキット。
(項目２９)
前記ムスカリン作動薬が、セビメリンまたはピロカルピンである、項目２５～２８のいずれか一項に記載のキット。
(項目３０)
唾液腺再生を促進することを必要とする対象における唾液腺再生を促進する方法であって、唾液腺の腺房前駆細胞および腺房細胞に、コリン作動薬またはムスカリン作動薬のうちの少なくとも１つを局所投与して、前記腺房前駆細胞および前記腺房細胞の増殖を促進し、それによって唾液産生を増加させることを含む、方法。
(項目３１)
前記腺房前駆細胞が、ＳＯＸ２ ^＋ 腺房前駆細胞である、項目３０に記載の方法。
(項目３２)
前記ムスカリン作動薬が、前記唾液腺への局所投与のために製剤化されたヒドロゲル中に封入される、項目３０または３１に記載の方法。
(項目３３)
前記ヒドロゲルが、アルギネートを含む、項目３２に記載の方法。
(項目３４)
前記アルギネートが、イオン的に架橋される、項目３３に記載の方法。
(項目３５)
前記アルギネートが、二価カルシウムカチオンによってイオン的に架橋される、項目３４に記載の方法。
(項目３６)
前記ヒドロゲル中の前記アルギネートの濃度が、２～１０重量パーセント（重量％）の範囲である、項目３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
(項目３７)
前記アルギネートが、少なくとも部分酸化される、項目３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
(項目３８)
前記アルギネートの約２％～約１０％が、酸化される、項目３７に記載の方法。
(項目３９)
前記アルギネートの約２％が、酸化され、前記ヒドロゲル中の前記アルギネート濃度が、約５重量％である、項目３８に記載の方法。
(項目４０)
前記ムスカリン作動薬が、Ｍ１および／またはＭ３ムスカリン受容体サブタイプに対して選択的である、項目３０～３９のいずれか一項に記載の方法。
(項目４１)
前記ムスカリン作動薬が、セビメリンである、項目４０に記載の方法。
(項目４２)
前記ムスカリン作動薬が、ピロカルピンである、項目３０～３９に記載の方法。
(項目４３)
前記ヒドロゲルが、前記対象への投与後少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも４週間、前記ムスカリン作動薬の送達を維持する、項目３２～４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目４４)
前記腺房前駆細胞が、Ｋｉ６７ ^＋ またはＥｄｌＴ腺房前駆細胞である、項目３０～４３のいずれか一項に記載の方法。
(項目４５)
前記ムスカリン作動薬に応答した前記腺房細胞増殖の結果として、唾液流量が増加する、項目３０～４４のいずれか一項に記載の方法。
(項目４６)
前記唾液腺が、舌下線である、項目３０～４５のいずれか一項に記載の方法。
(項目４７)
前記コリン作動薬が、アセチルコリンまたはアセチルコリン類似体のうちの少なくとも１つを含む、項目３０～４６のいずれか一項に記載の方法。
(項目４８)
前記アセチルコリン類似体が、カルバコールを含む、項目４７に記載の方法。
(項目４９)
前記腺房前駆細胞が、ＳＯＸ２７ＡＱＰ５７Ｋｉ６７ ^＋ 細胞である、項目３０～４８のいずれか一項に記載の方法。
(項目５０)
前記腺房前駆細胞が、ムチン（ＭＵＣ）１９－細胞である、項目３０～４９のいずれか一項に記載の方法。
(項目５１)
前記対象の前記唾液腺からＳＯＸ２ ^＋ 腺房前駆細胞を単離し、前記ＳＯＸ２ ^＋ 腺房前駆細胞を増大させることをさらに含む、項目３０～５０のいずれか一項に記載の方法。
(項目５２)
前記増大された細胞が、前記少なくとも１つのコリン作動薬またはムスカリン作動薬の前記増大された細胞への制御放出を提供する操作された組織構築物または生体適合性基質で提供され、前記制御放出が、遅延放出、持続放出、勾配放出、時間放出、パターン化放出、または空間的放出のうちの少なくとも１つを含む、項目５１に記載の方法。
(項目５３)
前記増大された細胞および前記少なくとも１つのコリン作動薬またはムスカリン作動薬が、生分解性天然ポリマーまたはマクロマー上および／またはその中に提供される、項目５２に記載の方法。
(項目５４)
前記生分解性天然ポリマーまたはマクロマーが、ヒドロゲルを含む、項目５３に記載の方法。
(項目５５)
前記対象が、口腔乾燥症を引き起こすのに有効な放射線で治療されている、項目３０～５４のいずれか一項に記載の方法。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図12F】

【図12G】

【図12H】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D-1】

【図14D-2】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図19E】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図20E】

【図20F】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図28】

【図29】