特許 7595939 ヒト肝臓様立体構造体、肝毒性を評価する方法およびヒト肝臓様複合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-29

(45)【発行日】2024-12-09

(54)【発明の名称】ヒト肝臓様立体構造体、肝毒性を評価する方法およびヒト肝臓様複合体

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20241202BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20241202BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20241202BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20241202BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12Q1/02 ZNA

C12Q1/686 Z

C12Q1/6837 Z

【請求項の数】 23

(21)【出願番号】P 2021502202

(86)(22)【出願日】2020-02-21

(86)【国際出願番号】 JP2020007156

(87)【国際公開番号】W WO2020171220

(87)【国際公開日】2020-08-27

【審査請求日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】P 2019030240

(32)【優先日】2019-02-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （１） （１）開催日：平成３０年２月２３日 （２）集会名、開催場所：ｉＣｅｌｌ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ２．０を使って３Ｄ（スフェロイド）培養を実感するセミナー、神奈川県川崎市川崎区殿町３－２５－２２ライフイノベーションセンター４１０号 （３）公開者：井出 いずみ （４）公開された発明の内容：井出 いずみが、セルラー・ダイナミクス・インターナショナル・ジャパン株式会社が開催した「ｉＣｅｌｌ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ２．０を使って３Ｄ（スフェロイド）培養を実感する」と題するセミナーにて、「バイオ３Ｄプリンターを利用した細胞立体構造物の構築と肝毒性評価」について公開した。 （２－１） （１）開催日：平成３０年５月２５日 （２）集会名、開催場所：第２５回ＨＡＢ研究機構学術年会、産業技術総合研究所 つくば中央第一共用講堂（茨城県つくば市東１丁目１－１） （３）公開者：井出 いずみ （４）公開された発明の内容：井出 いずみが、特定非営利活動法人 エイチ・エー・ビー研究機構が開催した第２５回ＨＡＢ研究機構学術年会にて、「バイオ３Ｄプリンタを用いた創薬支援ツールの開発」について公開した。 （２－２） （１）発行日：平成３０年５月８日 （２）刊行物：第２５回ＨＡＢ研究機構学術年会 人体模倣システムを用いた創薬研究基盤技術の新基軸、第５６～５７頁 （３）公開者：井出 いずみ （４）公開された発明の内容：井出 いずみが、第２５回ＨＡＢ研究機構学術年会 人体模倣システムを用いた創薬研究基盤技術の新基軸、第５６～５７頁にて、「バイオ３Ｄプリンターを用いた創薬支援ツールの開発」について公開した。 （３－１） （１）開催日：平成３０年７月１８日 （２）集会名、開催場所：第４５回日本毒性学会学術年会、大阪国際会議場（大阪府大阪市北区中之島５丁目３－５１） （３）公開者：鍛治山 咲良、長尾 映里、溝口 奈津美、島村 満、岸井 保人、井出 いずみ （４）公開された発明の内容：鍛治山 咲良、長尾 映里、溝口 奈津美、島村 満、岸井 保人および井出 いずみが、第４５回日本毒性学会学術年会にて、「バイオ３Ｄプリンターで作製したヒト肝臓モデルの構築：新鮮ヒト肝細胞（キメラマウス由来ヒト肝細胞）を用いた肝臓構造体の毒性評価」について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （３－２） （１）発行日：平成３０年６月２７日 （２）刊行物：第４５回日本毒性学会学術年会 プログラム・要旨集、第２１７頁 （３）公開者：鍛治山 咲良、長尾 映里、溝口 奈津美、島村 満、岸井 保人、井出 いずみ （４）公開された発明の内容：鍛治山 咲良、長尾 映里、溝口 奈津美、島村 満、岸井 保人および井出 いずみが、第４５回 日本毒性学会学術年会 プログラム・要旨集、第２１７頁にて、「バイオ３Ｄプリンターで作製したヒト肝臓モデルの構築：新鮮ヒト肝細胞（キメラマウス由来ヒト肝細胞）を用いた肝臓構造体の毒性評価」について公開した。（４－１） （１）開催日：平成３０年７月１８日 （２）集会名、開催場所：第４５回日本 毒性学会学術年会、大阪国際会議場（大阪府大阪市北区中之島５丁目３－５１） （３）公開者：長尾 映里、鍛治山 咲良、溝口 奈津美、島村 満、井出 いずみ （４）公開された発明の内容：長尾 映里、鍛治山 咲良、溝口 奈津美、島村 満および井出 いずみが、第４５回日本毒性学会学術年会にて、「バイオ３Ｄプリンタで作製したヒト肝臓モデルの構築：ヒト凍結初代肝細胞を用いた構造体とスフェロイドの毒性評価比較」について公開した。 （４－２） （１）発行日：平成３０年６月２７日（２）刊行物：第４５回日本毒性学会学術年会 プログラム・要旨集、第２１７頁 （３）公開者：長尾 映里、鍛治山 咲良、溝口 奈津美、島村 満、井出 いずみ （４）公開された発明の内容：長尾 映里、鍛治山 咲良、溝口 奈津美、島村 満および井出 いずみが、第４５回日本毒性学会学術年会 プログラム・要旨集、第２１７頁にて、「バイオ３Ｄプリンタで作製したヒト肝臓モデルの構築：ヒト凍結初代肝細胞を用いた構造体とスフェロイドの毒性評価比較」について公開した。 （５） （１）開催日：平成３０年７月１８～２０日 （２）集会名、開催場所：第４５回日本毒性学会学術年会、大阪国際会議場（大阪府大阪市北区中之島５丁目３－５１）、積水メディカル社展示ブース内 （３）公開者：長尾 映里、鍛治山 咲良 （４）公開された発明の内容：長尾 映里及び鍛治山 咲良が、第４５回日本毒性学会学術年会の積水メディカル株式会社展示ブースにて、「サイフューズの３Ｄ構造体を使った創薬支援」について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （６）（１）ウェブサイトの掲載日：平成３０年１１月１日 （２）ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔａｇｅ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｊｐｓｔｊ／７８／６／７８＿２７５／＿ａｒｔｉｃｌｅ／－ｃｈａｒ／ｊａ （３）公開者：長尾 映里、國富 芳博 （４）公開された発明の内容：長尾 映里および國富 芳博は、薬剤学Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．６，２７５－２７８（２０１８）にて、「バイオ３Ｄプリンタが描く創薬研究および再生医療の未来」について公開した。 （７－１） （１）開催日：平成３１年１月１０日 （２）集会名、開催場所：第１回医薬品毒性機序研究会、名古屋大学 野依記念学術交流館（愛知県名古屋市千種区不老町） （３）公開者：長尾 映里、鍛治山 咲良、溝口 奈津美、島村 満、井出 いずみ （４）公開された発明の内容：長尾 映里、鍛治山 咲良、溝口 奈津美、島村 満および井出 いずみは、第１回医薬品毒性機序研究会にて、「バイオ３Ｄプリンタで作製したヒト肝臓モデルの構築：ヒト凍結初代肝細胞を用いた構造体とスフェロイドの毒性評価比較」について公開した。 （７－２）（１）発行日：平成３１年１月５日 （２）刊行物：第１回医薬品毒性機序研究会 講演プログラム・要旨集、第８１頁 （３）公開者：長尾 映里、鍛治山 咲良、溝口 奈津美、島村 満、井出 いずみ （４）公開された発明の内容：長尾 映里、鍛治山 咲良、溝口 奈津美、島村 満及び井出いずみは、第１回医薬品毒性機序研究会 講演プログラム・要旨集、第８１頁にて、「バイオ３Ｄプリンタで作製したヒト肝臓モデルの構築：ヒト凍結初代肝細胞を用いた構造体とスフェロイドの毒性評価比較」について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （８－１） （１）開催日：平成３１年１月１０日 （２）集会名、開催場所：第１回医薬品毒性機序研究会、名古屋大学 野依記念学術交流館（愛知県名古屋市千種区不老町） （３）公開者：鍛治山 咲良、長尾 映里、溝口 奈津美、島村 満、岸井 保人、井出 いずみ （４）公開された発明の内容：鍛治山 咲良、長尾 映里、溝口 奈津美、島村 満、岸井 保人及び井出 いずみは、第１回医薬品毒性機序研究会にて、「バイオ３Ｄプリンタで作製したヒト肝臓モデルの構築：新鮮ヒト肝細胞（キメラマウス由来ヒト肝細胞）を用いた肝臓構造体の毒性評価」について公開した。 （８－２） （１）発行日：平成３１年１月５日 （２）刊行物：第１回医薬品毒性機序研究会 講演プログラム・要旨集、第８２頁 （３）公開者：鍛治山 咲良、長尾 映里、溝口 奈津美、島村 満、岸井 保人、井出 いずみ （４）公開された発明の内容：鍛治山 咲良、長尾 映里、溝口 奈津美、島村 満、岸井 保人及び井出 いずみは、第１回医薬品毒性機序研究会 講演プログラム・要旨集、第８２頁にて、「バイオ３Ｄプリンタで作製したヒト肝臓モデルの構築：新鮮ヒト肝細胞（キメラマウス由来ヒト肝細胞）を用いた肝臓構造体の毒性評価」について公開した。 （９） （１）展示日：平成３０年１０月１０～１２日 （２）展示会名、開催場所：Ｂｉｏ Ｊａｐａｎ２０１８、パシフィコ横浜（神奈川県横浜市西区みなとみらい１丁目１－１） （３）公開者：鍛治山 咲良、鳥井 蓉子、大島 恵美、國富 芳博、岸井 保人、油谷 篤志、鴨下 里美、星野 友紀、渡辺 麻里恵、三條 真弘、横地 貴弘 （４）出品内容：鍛治山 咲良、鳥井 蓉子、大島 恵美、國富 芳博、岸井 保人、油谷 篤志、鴨下 里美、星野 友紀、渡辺 麻里恵、三條 真弘及び横地 貴弘が、Ｂｉｏ Ｊａｐａｎ２０１８にて、「サイフューズの３Ｄ構造体を使った創薬支援」について公開した。

(73)【特許権者】

【識別番号】511155187

【氏名又は名称】株式会社サイフューズ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100186897

【弁理士】

【氏名又は名称】平川 さやか

(72)【発明者】

【氏名】前川 敏彦

(72)【発明者】

【氏名】長尾 映里

(72)【発明者】

【氏名】井出 いずみ

(72)【発明者】

【氏名】鍛治山 咲良

【審査官】田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】特表２００６－５０４７６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１６６８７０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１９／０３１６０９３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／１１５５３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／２００１１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／０６７９７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】長尾映里ほか，バイオ３Ｄプリンタで作成したヒト肝臓モデルの構築：ヒト凍結初代肝細胞を用いた構造体とスフェロイドの毒性評価比較，第４５回日本毒性学会学術年会 発表ポスター，2018年07月18日

【文献】清水 一郎，小柴胡湯による肝線維化および肝発癌阻止機構，医学のあゆみ 現代西洋医学からみた東洋医学１３，vol.203, no.3，藤田 勝治 医歯薬出版株式会社，2002年，214-218

【文献】西藤 有希奈，抗線維化物質テトランドリンによるオートファジー経路制御機構の解明 ，日本農芸化学会 ２０１４年度大会講演要旨集（オンライン）ＤＶＤ－Ｒ，公益社団法人日本農芸化学会，2014年，講演番号2A05a05

【文献】MOSEDALE, Merrie et al.，miR-122 release in exosomes precedes overt tolvaptan-induced necrosis in a primary human hepatocyte，Toxicological Sciences，2018年，vol.161,no.1，p.149-158

【文献】COSTA DE FREITAS,Renata C. et al.，Modulation of miR-26a-5p and miR-15b-5p exosomal expression associated with clopidogrel-induced hepa，Frontiers in Pharmacology，2017年，vol.8，906/1-906/11

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－ １／７０

Ｃ１２Ｎ ５／００－ ５／２８

Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト肝細胞と、ヒト肝細胞以外の他のヒト由来細胞とを凝集させたヘテロスフェロイドからなるヒト肝臓様立体構造体であって、
前記他のヒト由来細胞が、ヒト肝星細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト大動脈外膜線維芽細胞、ヒト歯周靱帯線維芽細胞、ヒト腸筋線維芽細胞、ヒト腱細胞、ヒトアストロサイト、ヒト新生児皮膚線維芽細胞、ヒト滑膜間質細胞、ヒト脳毛細血管周皮細胞、ヒト腎メサンギウム細胞、ヒト心臓線維芽細胞、ヒト大動脈血管平滑筋細胞、ヒト骨芽細胞、正常ヒト骨格筋細胞、ヒト歯髄幹細胞、ヒト髄核細胞、ヒト線維輪細胞、ヒト靱帯細胞、ヒト軟骨細胞、ヒトクッパー細胞、ヒト類洞内皮細胞、ヒト胆管上皮細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞およびヒト脂肪由来間葉系幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記ヒト肝細胞に対する前記他のヒト由来細胞の細胞数の比が、０．０５～０．１である、
ことを特徴とする、ヒト肝臓様立体構造体。

【請求項2】

前記ヘテロスフェロイドが、積層または配合されてなる、請求項１に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項3】

前記ヒト肝細胞と前記他のヒト由来細胞とが、均一に分布している、請求項１または２に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項4】

前記他のヒト由来細胞がヒト肝星細胞を含んでいる、請求項３に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項5】

前記ヒト肝星細胞が集合した集合部が、最大で１００μｍの投影面積円相当径を有する、請求項４に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項6】

前記ヘテロスフェロイドの投影面積円相当径が３００～１０００μｍである、請求項１～５のいずれか一項に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項7】

前記ヘテロスフェロイドの投影面積円相当径が４００～６００μｍである、請求項６に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項8】

立体構造体の投影面積円相当径が少なくとも１．０ｍｍの大きさを有する略球状のものである、請求項１～７のいずれか一項に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項9】

投影面積円相当径が１．１～１０．０ｍｍの大きさを有する略球状のものである、請求項８に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項10】

投影面積円相当径が１．２～５．０ｍｍの大きさを有する略球状のものである、請求項９に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項11】

中空または中実の略円柱状または略多角柱状であり、
断面の直径の平均値が１．０～１０．０ｍｍである、請求項１～７のいずれか一項に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項12】

リング状であり、
底面と天面の短径の平均値が１．０～１０．０ｍｍである、請求項１～７のいずれか一項に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項13】

平均厚みが少なくとも３００μｍのシート状である、請求項１～７のいずれか一項に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項14】

平均厚みが少なくとも５００μｍのシート状である、請求項１３に記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項15】

ヒトに対する被検物質の肝毒性を評価する方法であって、
（１）請求項１～１４のいずれか一項に記載のヒト肝臓様立体構造体に、前記被検物質を接触させる接触工程、並びに、
（２）該ヒト肝臓様立体構造体の障害の有無またはその程度を、ＡＴＰ活性に基づく肝細胞の生存率と、ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルブミン及び尿素から選ばれる肝障害マーカーと、エクソソームに含まれるｍｉＲＮＡとの組み合わせを指標として測定する測定工程、
を含むことを特徴とする、方法。

【請求項16】

前記エクソソームに含まれるｍｉＲＮＡを指標として測定する測定工程が、前記立体構造体から放出されたエクソソームを回収するエクソソーム回収工程、及び、前記エクソソームに含まれるｍｉＲＮＡを解析するｍｉＲＮＡ解析工程を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記ｍｉＲＮＡ解析工程が、マイクロアレイまたはＰＣＲによるものである、請求項１６に記載の肝臓毒性評価方法。

【請求項18】

請求項１～１４のいずれか一項に記載のヒト肝臓様立体構造体が２個以上連結されてなる、ヒト肝臓様複合体。

【請求項19】

２つ以上の前記ヘテロスフェロイドが融合されてなる、請求項１～１４のいずれかに記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項20】

前記他のヒト細胞がヒト肝星細胞を含み、該ヒト肝星細胞が静止状態である、上記請求項４～１４のいずれかに記載のヒト肝臓様立体構造体。

【請求項21】

ヒトに対する被検物質の肝毒性を評価する方法であって、
（１）請求項２０に記載のヒト肝臓様立体構造体に、前記被検物質を接触させる接触工程、および、
（２）該ヒト肝臓様立体構造体の障害の有無またはその程度を測定する測定工程、
を含むことを特徴とする、方法。

【請求項22】

ヒト肝細胞と、ヒト肝細胞以外の他のヒト由来細胞とを、前記ヒト肝細胞に対する前記他のヒト由来細胞の細胞数の比が０．０５～０．１となる量で混合して培養し、前記ヒト肝細胞と前記他のヒト由来細胞とが凝集したヘテロスフェロイドを得る工程、および
前記ヘテロスフェロイドを配合又は積層する工程からなり、
前記他のヒト由来細胞が、ヒト肝星細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト大動脈外膜線維芽細胞、ヒト歯周靱帯線維芽細胞、ヒト腸筋線維芽細胞、ヒト腱細胞、ヒトアストロサイト、ヒト新生児皮膚線維芽細胞、ヒト滑膜間質細胞、ヒト脳毛細血管周皮細胞、ヒト腎メサンギウム細胞、ヒト心臓線維芽細胞、ヒト大動脈血管平滑筋細胞、ヒト骨芽細胞、正常ヒト骨格筋細胞、ヒト歯髄幹細胞、ヒト髄核細胞、ヒト線維輪細胞、ヒト靱帯細胞、ヒト軟骨細胞、ヒトクッパー細胞、ヒト類洞内皮細胞、ヒト胆管上皮細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞およびヒト脂肪由来間葉系幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、ヒト肝臓様立体構造体の製造方法。

【請求項23】

請求項２２に記載の製造方法により得られた、ヒト肝臓様立体構造体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヘテロスフェロイドを含むヒト肝臓様立体構造体、該構造体を用いて肝毒性を評価する方法並びに該構造体を２個以上連結させたヒト肝臓様複合体に関する。

【背景技術】

【0002】

製薬企業では、多額の費用と時間を要する臨床試験において、毒性や代謝物の試験の対象となる創薬候補化合物を絞り込むためのｉｎ ｖｉｔｒｏヒト肝臓モデルのニーズが高い。臨床試験での毒性を予測可能なヒト肝臓モデルは、創薬研究を効率化、加速化するツールとして期待されている。

【0003】

現在、既存のｉｎ ｖｉｔｒｏヒト肝臓モデルの製法の一つとして、肝細胞をマウス線維芽細胞と共培養して高機能化する方法が知られている（非特許文献１、非特許文献２）。

【0004】

しかしながら、これらの方法により得られるヒト肝臓モデルは、ヒト肝細胞以外にマウス由来細胞を含む。このため、薬物の毒性試験や代謝物の評価において、マウス特有の代謝系の影響を考慮する必要があった。この際、対照としてマウス由来細胞のみをネガティブコントロールに用いる方法が採用されているが、共培養がもたらすマウス細胞への影響が考慮されていないため、厳密には正確なネガティブコントロールと言い難く、得られた薬物評価結果へのマウス細胞の影響を完全には排除できなかった。

【0005】

特許文献１には、ヒト肝細胞と、ヒト肝細胞以外のヒト由来細胞とを用いて作製されたヒト肝臓様立体構造体が提案されている。特許文献１のヒト肝臓様立体構造体によれば、ヒト肝細胞とマウス線維芽細胞を用いた共培養系で懸念されていたマウス特有の代謝系の影響を考慮することなく、ヒト特異的な毒性の評価等を正確かつ簡便に実施可能であるが、改善の余地があった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】国際公開第２０１７／２００１１１号

【非特許文献】

【0007】

【文献】Ｋｈｅｔａｎｉ Ｓ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６： １２０－１２６ （２００８）

【文献】Ｏｈｋｕｒａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ２９： ３７３－３７８ （２０１４）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

ヒト特異的な毒性の評価等を正確かつ簡便に実施することを可能にする、ヒト肝臓様立体構造体の提供が待たれている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］ヒト肝細胞と、ヒト肝細胞以外の他のヒト由来細胞とを凝集させたヘテロスフェロイドを含むヒト肝臓様立体構造体であって、
前記他のヒト由来細胞が、ヒト肝星細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト大動脈外膜線維芽細胞、ヒト歯周靱帯線維芽細胞、ヒト腸筋線維芽細胞、ヒト腱細胞、ヒトアストロサイト、ヒト新生児皮膚線維芽細胞、ヒト滑膜間質細胞、ヒト脳毛細血管周皮細胞、ヒト腎メサンギウム細胞、ヒト心臓線維芽細胞、ヒト大動脈血管平滑筋細胞、ヒト骨芽細胞、正常ヒト骨格筋細胞、ヒト歯髄幹細胞、ヒト髄核細胞、ヒト線維輪細胞、ヒト靱帯細胞、ヒト軟骨細胞、ヒトクッパー細胞、ヒト類洞内皮細胞、ヒト胆管上皮細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞およびヒト脂肪由来間葉系幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種であり、
前記ヒト肝細胞に対する前記他のヒト由来細胞の細胞数の比が、０．０１以上であり且つ１より小さい、
ことを特徴とする、ヒト肝臓様立体構造体。
［２］前記ヘテロスフェロイドが、積層または配合されてなる、上記［１］に記載のヒト肝臓様立体構造体。
［３］前記ヒト肝細胞と前記他のヒト由来細胞とが、均一に分布している、上記［１］または［２］に記載のヒト肝臓様立体構造体。
［４］前記他のヒト由来細胞がヒト肝星細胞を含んでいる、上記［３］に記載のヒト肝臓様立体構造体。
［５］前記ヒト肝星細胞が集合した集合部が、最大で１００μｍの投影面積円相当径を有する、上記［４］に記載のヒト肝臓様立体構造体。
［６］前記ヘテロスフェロイドの投影面積円相当径が３００～１０００μｍである、上記［１］～［５］のいずれかに記載のヒト肝臓様立体構造体。
［７］前記ヘテロスフェロイドの投影面積円相当径が４００～６００μｍである、上記［６］に記載のヒト肝臓様立体構造体。
［８］投影面積円相当径が少なくとも１．０ｍｍの大きさを有する略球状のものである、上記［１］～［７］のいずれかに記載のヒト肝臓様立体構造体。
［９］投影面積円相当径が１．１～１０．０ｍｍの大きさを有する略球状のものである、上記［８］に記載のヒト肝臓様立体構造体。
［１０］投影面積円相当径が１．２～５．０ｍｍの大きさを有する略球状のものである、上記［９］に記載のヒト肝臓様立体構造体。
［１１］中空または中実の略円柱状または略多角柱状であり、
断面の直径の平均値が１．０～１０．０ｍｍである、上記［１］～［７］のいずれかに記載のヒト肝臓様立体構造体。
［１２］リング状であり、
底面と天面の短径の平均値が１．０～１０．０ｍｍである、上記［１］～［７］のいずれかに記載のヒト肝臓様立体構造体。
［１３］平均厚みが少なくとも３００μｍのシート状である、上記［１］～［７］のいずれかに記載のヒト肝臓様立体構造体。
［１４］平均厚みが少なくとも５００μｍのシート状である、上記［１３］に記載のヒト肝臓様立体構造体。
［１５］ヒトに対する被検物質の肝毒性を評価する方法であって、
（１）上記［１］～［１４］のいずれかに記載のヒト肝臓様立体構造体に、前記被検物質を接触させる接触工程、および、
（２）該ヒト肝臓様立体構造体の障害の有無またはその程度を測定する測定工程、
を含むことを特徴とする、方法。
［１６］前記測定工程が、前記立体構造体から放出されたエクソソームを回収するエクソソーム回収工程、及び、前記エクソソームに含まれるｍｉＲＮＡを解析するｍｉＲＮＡ解析工程を含む、上記［１５］に記載の方法。
［１７］前記ｍｉＲＮＡ解析工程が、マイクロアレイまたはＰＣＲによるものである、上記［１５］または［１６］に記載の肝臓毒性評価方法。
［１８］上記［１］～［１４］のいずれかに記載のヒト肝臓様立体構造体が２個以上連結されてなる、ヒト肝臓様複合体。
［１９］２つ以上の前記ヘテロスフェロイドが融合されてなる、上記［１］～［１４］のいずれかに記載のヒト肝臓様立体構造体。
［２０］前記他のヒト細胞がヒト肝星細胞を含み、該ヒト肝星細胞が静止状態である、上記［４］～［１４］のいずれかに記載のヒト肝臓様立体構造体。
［２１］ヒトに対する被検物質の肝毒性を評価する方法であって、
（１）上記［２０］に記載のヒト肝臓様立体構造体に、前記被検物質を接触させる接触工程、および、
（２）該ヒト肝臓様立体構造体の障害の有無またはその程度を測定する測定工程、
を含むことを特徴とする、方法。
［２２］ヒト肝細胞と、ヒト肝細胞以外の他のヒト由来細胞とを、前記ヒト肝細胞に対する前記他のヒト由来細胞の細胞数の比が０．０１以上１未満となる量で混合して培養し、前記ヒト肝細胞と前記他のヒト由来細胞が凝集したヘテロスフェロイドを得る工程、および
前記ヘテロスフェロイドを配合又は積層する工程を含み、
前記他のヒト由来細胞が、ヒト肝星細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト大動脈外膜線維芽細胞、ヒト歯周靱帯線維芽細胞、ヒト腸筋線維芽細胞、ヒト腱細胞、ヒトアストロサイト、ヒト新生児皮膚線維芽細胞、ヒト滑膜間質細胞、ヒト脳毛細血管周皮細胞、ヒト腎メサンギウム細胞、ヒト心臓線維芽細胞、ヒト大動脈血管平滑筋細胞、ヒト骨芽細胞、正常ヒト骨格筋細胞、ヒト歯髄幹細胞、ヒト髄核細胞、ヒト線維輪細胞、ヒト靱帯細胞、ヒト軟骨細胞、ヒトクッパー細胞、ヒト類洞内皮細胞、ヒト胆管上皮細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞およびヒト脂肪由来間葉系幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、ヒト肝臓様立体構造体の製造方法。
［２３］上記［２２］に記載の製造方法により得られた、ヒト肝臓様立体構造体。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、ヒト体内における肝機能に類似した機能を発揮できるヒト肝臓様立体構造体、および、該ヒト肝臓様立体構造体を使用し、ヒトに対する被検物質の肝毒性を評価する方法が提供される。また、ヒト肝臓様立体構造体を複数連結してなる、ヒト肝臓様複合体も提供される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実験例４における、ヒト肝臓様立体構造体Ａの遺伝子発現解析の結果を示す図である。

【図2】実験例４における、ヒト肝臓様立体構造体Ｂの遺伝子発現解析の結果を示す図である。

【図3】実験例５における、培地中のアルブミン濃度の変化を示す図である。

【図4】実験例５における、ヒト肝臓様立体構造体に含有されるＡＴＰ量変化を示す図である。

【図5】実験例５における、ヒト肝臓様立体構造体の免疫染色像である。

【図6】実験例６における、エクソソームの粒子数と粒度分布測定結果を示す図である。

【図7】実験例４´における、ヒト肝臓様立体構造体Ａ中のＣＹＰ３Ａ４酵素の活性を示すグラフである。

【図8】実験例５´における、毒性検出結果を示す図である。

【図9】実験例７において、ヒト肝臓様立体構造体にフェニトインを与えたときの、各代謝生成物のマスクロマトグラムである。

【図10】実験例８において、ヒト肝臓様立体構造体にトルセトラピブを与えたときの、各代謝生成物のマスクロマトグラムである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をできる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。

【0013】

本発明は、ヒト肝細胞と、ヒト肝細胞以外の他のヒト由来細胞とを凝集させたヘテロスフェロイドを含むヒト肝臓様立体構造体に関する。ヘテロスフェロイドに含まれる細胞はヒト由来であり、マウス由来の細胞は含まれない。本発明においては、ヒト肝細胞と、ヒト肝星細胞などの他のヒト由来細胞とを共培養するだけでよく、これにより、高い肝機能を獲得したヒト肝臓モデルを作製できる。

【0014】

１．培養条件
本発明においては、ヒト由来肝細胞（第一細胞）と、当該肝細胞以外のヒト由来細胞（第二細胞）とを共培養することにより、当該肝細胞とヒト由来細胞とが混在したスフェロイドを作製する。作製されたスフェロイドには種類の異なる細胞が混在しているため、このスフェロイドを「ヘテロスフェロイド」という。但し、本明細書では単に「スフェロイド」ともいう。

【0015】

本発明において使用する肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ；Ｈｅｐともいう）は、ヒト由来の細胞であり、生検された肝細胞、市販の凍結肝細胞などが用いられるが、その他にも、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、生体由来細胞等から試薬、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等を用いて分化誘導させた肝細胞、リプログラミングされた肝細胞などを用いることができる。

【0016】

他方、本発明において用いられる第二細胞である、ヒト肝細胞以外の他のヒト由来細胞は、ヒト肝星細胞、ヒト肺線維芽細胞、ヒト大動脈外膜線維芽細胞、ヒト歯周靱帯線維芽細胞、ヒト腸筋線維芽細胞、ヒト腱細胞、ヒトアストロサイト、ヒト新生児皮膚線維芽細胞、ヒト滑膜間質細胞、ヒト脳毛細血管周皮細胞、ヒト腎メサンギウム細胞、ヒト心臓線維芽細胞、ヒト大動脈血管平滑筋細胞、ヒト骨芽細胞、正常ヒト骨格筋細胞、ヒト歯髄幹細胞、ヒト髄核細胞、ヒト線維輪細胞、ヒト靱帯細胞、ヒト軟骨細胞、ヒトクッパー細胞、ヒト類洞内皮細胞、ヒト胆管上皮細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞及びヒト脂肪由来間葉系幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種である。これらの第二細胞は、正常、病態の由来を問わない。第二細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、生体由来細胞等から試薬、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等を用いて分化誘導させた細胞や、リプログラミングされた細胞であってもよい。また、市販の細胞でもよく、ヒト組織から酵素または物理的な処理によって調製してもよい。

【0017】

第二細胞は、ヒト肝星細胞、ヒトクッパー細胞、ヒト類洞内皮細胞、ヒト胆管上皮細胞、ヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト脂肪由来間葉系幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、ヒト肝星細胞を含むことが特に好ましい。

【0018】

上記第一細胞及び第二細胞は、それぞれの細胞に適した培地中で培養又は維持し、混合する。混合後培養すると、第一細胞と第二細胞とは集合して細胞凝集体、すなわちヘテロスフェロイドを形成する。

【0019】

本発明において、第一細胞の培養培地は、一般に肝細胞の培養に使用される培地を採用できる。そのような培地としては、例えばＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ―１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｍｅｄｉｕｍ Ｅなどが挙げられる。また、市販の肝細胞培養培地（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（ＣＭシリーズ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））などが挙げられる。

【0020】

また、第二細胞の培地は、それぞれの細胞の種類に応じて適宜選択される。例えば、ヒト骨芽細胞（ＮＨＯＳＴ）の培養培地はＯＧＭ Ｂｕｌｌｅｔ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）、正常ヒト腱細胞（ＴＥＮ）の培養培地はＴｅｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｚｅｎｂｉｏ）、正常ヒト脳毛細血管周皮細胞（ＨＢＭＰＣ）の培養培地はＣＳＣ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、正常ヒト胆管上皮細胞（ＩＨＢＥＣ）の培養培地はＩｎｔｒａ―Ｈｅｐａｔｉｃ Ｂｉｌｉａｒｙ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｚｅｎｂｉｏ）、正常ヒト類洞内皮細胞（ＳＥＣ）の培養培地はＰｒｉｇｒｏｗ Ｉ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．）などを使用できる。

【0021】

培地には、例えば、各種抗生物質、ウシ胎児血清などの血清を添加してもよい。

【0022】

ここで「混合」とは、第一細胞と第二細胞とが接触し得る状況にあれば特に限定されるものではなく、例えば、（ｉ）それぞれの細胞の細胞懸濁液を１つの容器に入れて混合する態様、（ｉｉ）第一細胞及び第二細胞の一方の培養容器中に他方の細胞の細胞懸濁液を添加する態様、（ｉｉｉ）一方の細胞を培養容器に接着又は沈殿させておいて培地の全部又は一部を取り除き、他の細胞の細胞懸濁液をその培養液に添加する態様などがある。

【0023】

ヘテロスフェロイドを作製するための細胞の混合比については、第一細胞（肝細胞）の数を第二細胞（肝細胞以外の他のヒト由来細胞）の数よりも多くする。好ましくは、第一細胞に対する第二細胞（第二細胞／第一細胞）の割合を、０．０１～１．０とする。より好ましくは、０．０１以上であり且つ１未満とし、さらに好ましくは０．０２～０．５とする。最も好ましくは、０．０５～０．１とする。

【0024】

第一細胞の共培養培地中の濃度は、少なくとも０．４×１０^５個／ｍｌ以上が好ましく、０．６×１０^５～２．０×１０^５個／ｍｌがより好ましく、０．８×１０^５～１．２×１０^５個／ｍｌが最も好ましい。この第一細胞の細胞数に対して、上記比率となるように第二細胞を調製し、両者を混合することが好ましい。
なお、上記の濃度範囲は、共培養開始前の濃度を意味する。

【0025】

３．測定及び選抜指標
スフェロイドの形成能は、光学顕微鏡による形態検査により調べることができる。
また、スフェロイドが所定の機能を有するか否かは、スフェロイド中の遺伝子発現を指標として調べることができる。指標とする遺伝子は特に限定されるものではないが、肝機能関連遺伝子、薬物代謝関連遺伝子などを利用することが好ましい。薬物代謝関連遺伝子としては、例えばＣＹＰ１Ａ２，ＣＹＰ２Ａ６，ＣＹＰ２Ｂ６，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｃ１９，ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｅ１、ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＴ１、ＳＵＬＴ２Ａ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ２Ｂ４、ＢＣＲＰ、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ２、ＭＡＴＥ１、ＭＲＰ６、ＭＤＲ１、ＮＴＣＰ、ＯＣＴ１、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３などが好ましい。肝機能関連遺伝子としてはＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ３Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６、ＰＲＯＸ１、ＣＥＢＰＡ、ＣＡＲ、ＡＬＢなどが挙げられる。但し、薬物代謝関連遺伝子及び肝機能関連遺伝子はこれらに限定されるものではない。

【0026】

遺伝子発現の確認方法は、一般的手法、例えばＲＴ―ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなどを単独で、又は適宜組み合わせて行うことができる。

【0027】

あるいは、スフェロイドが所定の機能を有しているかどうかは、ＡＴＰの量、アルブミンの分泌、アンモニア代謝、尿素の産生、薬物の代謝、タンパク質の発現などを指標として評価してもよい。

【0028】

４．ヒト肝臓様立体構造体の製造
本発明においては、前記のように形成させたスフェロイドを配合又は積層することにより、ヒト肝臓様立体構造体を作製できる。

【0029】

スフェロイドを立体的に配合又は積層する方法は、特に限定されるものではない。例えばスフェロイドを立体的に配合する方法としては、チューブなどにスフェロイドを入れて培養する方法が挙げられる。これにより、スフェロイド同士が融合してさらに大きなスフェロイドの塊となり、本発明のヒト肝臓様立体構造体となる。

【0030】

また、スフェロイドを任意の３次元空間に配置することにより、スフェロイドを積層して細胞の立体構造体を作製する方法が知られている（ＷＯ２００８／１２３６１４号）。この方法は、基板に針状体を剣山状に配置させて、その針状体に細胞塊を突き刺すか、細胞塊に針状体を突き刺すことによりスフェロイドを配置させるというものである。この方法により、スキャフォールドフリーの立体構造体を得ることを可能にする。
なお、本明細書において「積層」とは、スフェロイドを縦方向、横方向ならびに高さ方向に合計２個以上好ましくは９個以上配置させることで構造体を形成することを意味する。

【0031】

本発明においては、上記の針状体を用いる方法を利用して肝臓様立体構造体（３次元構造体）を作製することが好ましい。既に上記方法を実現するための自動積層ロボットが知られているので（バイオ３Ｄプリンター「レジェノバ」（登録商標）、「Ｓ－ＰＩＫＥ」（登録商標）、いずれも株式会社サイフューズ）、このロボットを用いることが好ましい。

【0032】

ここで、上述の好適な方法の例を、簡単に説明する。かかる好適な方法の例では、自動積層ロボット「レジェノバ」（登録商標）を用い、本発明のヒト肝臓様立体構造体を、例えば工程Ｉ～工程ＩＶにより作製する。

【0033】

工程Ｉでは、前述のスフェロイドを提供する。提供するスフェロイドの大きさとしては、投影面積円相当径が３００～１０００μｍであることが好ましく、３００～８００μｍであることがより好ましく、４００～６００μｍであることが特に好ましい。
投影面積円相当径は、光学顕微鏡による観測で投影面積の円相当直径である。上記した自動積層ロボットを使用する場合においては、装置に搭載されている測定機能を使用して測定できる。それ以外の場合は、実体顕微鏡により測定できる。

【0034】

工程ＩＩと工程ＩＩＩは、剣山方式のＢｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇで構造体前駆体を作製するアプローチである。工程ＩＩでは、スフェロイドを所定ピッチの剣山（例えばステンレス製、タングステン製）を用いて積層する。

【0035】

工程ＩＩＩは、剣山にスフェロイドを刺した状態での灌流培養プロセスであり、これにより積層したスフェロイドが融合して賽子状やパッチ状などのＢｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ構造を形成する。灌流培養プロセスにおける培地の流速は、１～４ｍｌ／分が好ましい。灌流培養に際しては、培地成分を効率的に供給する観点から、専用の循環培養装置（例えばサイフューズ社製、製品名灌流培養器タイプ１ ＰＣ１００４）を使用するとよい。

【0036】

工程ＩＶでは、前記潅流培養後にスフェロイド同士が融合していることを確認してから剣山から構造体前駆体を引き抜き、引き抜いた構造体前駆体を振盪培養して、目的のヒト肝臓様立体構造体を得る。

【0037】

上記工程Ｉ～工程ＩＶは一例であり、本発明のヒト肝臓様立体構造体が得られる限り、適宜工程の内容を変更してもよく、工程を省略してもよく、工程を追加してもよい。

【0038】

例えば、工程ＩＩにおいて、スフェロイドを剣山に突き刺すかわりに、剣山をスフェロイドに刺してもよい。工程ＩＩＩにおいて、灌流培養に変えて振とう培養を行ってもよい。また、同じく工程ＩＩＩにおいて、培養時に培養系に超音波を照射してもよい。工程ＩＶにおいて、剣山から構造体を引き抜かずそのまま振盪培養もしくは灌流培養を行っても良い。

【0039】

スフェロイドの配置数及び配置形状は特に限定するものではなく、任意である。

【0040】

ヒト肝星細胞を第二細胞として用いる場合、製造時においてヒト肝星細胞を活性化状態から静止状態（不活化状態ともいう）に転換する星細胞静止化剤を培地成分に添加することが好ましい。
本明細書において、静止状態とは、細胞が分裂を行わない状態を意味する。細胞周期におけるＧ０期にある細胞は、静止状態にあると言える。

【0041】

ヒト肝星細胞は、ヒトの体内において肝臓内のディッセ腔と呼ばれる肝細胞と類洞内皮細胞の間隙に存在する線維芽細胞である。ヒト肝星細胞は、受容体ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－β（ＰＤＧＦＲβ）；酵素ｌｅｃｉｔｈｉｎ ｒｅｔｉｎｏｌ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＬＲＡＴ）；細胞骨格蛋白ｄｅｓｍｉｎやｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；転写因子ｈｅａｒｔ－ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓやグロビン、ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ（ＣＹＧＢ）等の分子を発現するという点で、肝内の他の細胞と区別される。肝星細胞は、肝障害時や初代培養を行う際に活性化し、筋線維芽細胞（ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＭＦＢ）様細胞へと形質転換する。ヒト体内の肝臓において、活性化した肝星細胞は増殖し，炎症反応に加担し，自らがＴＧＦ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）－β等の線維化誘導因子を産生しつつ，ＥＣＭを過剰産生し，線維化反応の鍵となる。ヒトの生体において、炎症が起こっていない通常の肝内では星細胞は静止状態である。

【0042】

ヒト肝星細胞は通常の培養条件下では活性化状態にある。即ち、通常の培養条件下にあるヒト肝星細胞は、高い増殖性や線維化を示し、生体の肝臓において何らかの炎症が起きている時に匹敵する状態となっている。よって、肝毒性評価などに利用するにあたって、本態様のヒト肝臓様立体構造体は、通常の肝臓に近い状態にあることが好ましい。
また、ＥＣＭの産生はヒト肝臓様立体構造体を形成しやすくするが、ヒト肝臓様立体構造体完成後に過剰量のＥＣＭが構造体中に存在すると、肝毒性の評価等に影響する虞がある。
よって、ヒト肝臓様立体構造体の製造時には、ヒト星細胞を静止状態にするために、星細胞静止化剤を使用することが好ましい。

【0043】

本発明において、細胞静止化剤としては、星細胞の静止化剤（不活性化剤）として知られている化合物群から選ぶことができる。例えば、ＴＧＦβ阻害剤であるＡ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２２３３４；血管新生阻害剤ＴＮＰ－４７０；ＬＤＨＡ阻害剤ＦＸ－１１；解糖系阻害剤２デオキシグルコース；などがあげられる。

【0044】

星細胞静止化剤の添加は、その種類や培養条件等に応じて、スフェロイドの形成開始から肝毒性評価までの間に任意のタイミングで行えばよい。しかしながら、星細胞の静止化は、静止剤の添加から時間がかかる一方、静止状態のタイミングが早すぎると、製造直後の構造体の活性は高いが、活性の持続性が損なわれる虞がある。そのため、静止化剤の添加は、スフェロイドの形成開始から２日目以降肝毒性評価の開始前に行うことが好ましい。
前述の工程Ｉ～ＩＶを含む好適な方法の例の場合であれば、下記のタイミングで星細胞静止化剤を添加することが特に好ましい。
・工程Ｉのスフェロイド形成開始から二日目；
・工程ＩＩＩ開始時；または
・工程ＩＶで剣山から構造体前駆体を引き抜き、引き抜いた構造体前駆体の振盪培養開始時。

【0045】

星細胞静止化剤の濃度は、培地中において０．１～３（μｍｏｌ／ｌ）の範囲内であることが好ましい。

【0046】

星細胞静止化剤を添加してから星細胞の静止化には時間（培養条件にもよるが、通常２～７日程度）を要するので、この期間に培地交換をする場合、星細胞静止化剤を添加した培地に交換することが好ましい。

【0047】

星細胞の静止化が達成されたことの確認では、スフェロイドもしくは構造体の遺伝子として、α―ＳＭＡ（ＡＣＴＡ２）の発現をマーカーとすることが好ましい。この場合、α－ＳＭＡ遺伝子発現量が静止化剤添加前の１／１０～１／１００に低下すると肝星細胞が静止化したと判断できる。肝毒性の評価を開始するまでには、肝星細胞の静止化状態への転換を完了することが好ましい。

【0048】

５．ヒト肝臓様立体構造体
本発明のヒト肝臓様立体構造体は、スキャフォールド（足場）フリーとすることでき、細胞同士は、直接または細胞外マトリクス若しくはＥカドヘリンを介して接着することができる。本発明のヒト肝臓様立体構造体中の細胞外マトリクスは、乾燥重量で、Ｉ型コラーゲンを１～３質量％、ＩＩＩ型コラーゲンを１～３質量％含んでいることが好ましい。Ｅカドヘリンを介する場合、Ｅカドヘリンは、肝細胞と肝細胞の境界面もしくは胆管様構造などの接合部分に局在する傾向にある。
なお、細胞外マトリクスとＥカドヘリンは、どちらもヒト肝臓様立体構造体を構成する細胞に由来するものである。

【0049】

また、本発明のヒト肝臓様立体構造体は、完成時に第一細胞を第二細胞より多く有しており、第一細胞（ヒト肝細胞）に対する第二細胞（他のヒト由来細胞）の数の比が０．０１以上であり且つ１より小さくなっている。好ましくは０．０１～０．１、より好ましくは０．０１～０．０５となっている。

【0050】

本発明のヒト肝臓様立体構造体においては、共培養条件や使用する細胞種類などを調節することにより、第一細胞と第二細胞とを均一に分布させることが好ましい。より好ましくは、第二細胞がヒト肝星細胞を含んでいるという条件の下、第一細胞と第二細胞とが均一に分布している。

【0051】

第一細胞と第二細胞とが均一に分布しているか否かは、以下の方法で判断できる。即ち、ヒト肝臓様立体構造体をホルマリンで固定し、パラフィンで固めて組織のブロックを作製する。得られたブロックから切片を切り出し、組織切片を作製する。得られた組織切片を、ＨＥ染色と免疫染色し、撮影する。免疫染色には、第一細胞を認識する一次抗体と第二細胞を認識する一次抗体を使用するとよい。例えば、肝細胞に対しては、抗アルブミン抗体を使用することが好ましい。第二細胞が肝星細胞を含んでいる場合には、肝星細胞を認識する抗デスミン抗体を用いることが好ましい。得られた染色像について、２００μｍ×２００μｍの領域ごとに第一細胞領域と第二細胞領域の面積を測定し、下記式を用い、第一細胞と第二細胞の領域の面積比率Ｒを算出する。
Ｒ＝（第二細胞の面積）／｛（第二細胞の面積）＋（第一細胞の面積）｝×１００（％）
それぞれの領域で計測された面積比Ｒ（％）のヒストグラムが正規分布に従った分散状態となっており、かつ、Ｒの標準偏差（σ）が３．０未満、特に１．５～２．０である場合に、第一細胞と第二細胞とが均一に分布していると判断する。

【0052】

さらに、面積比Ｒのヒストグラムが正規分布に従った分散状態となっており、かつ、σが上記の数値範囲を満たすという条件のもと、ヒト肝星細胞などの第二細胞が集合した集合部が、最大で１００μｍ、特に２０～１００μｍの投影面積円相当径を有していることが特に好ましい。

【0053】

本発明のヒト肝臓様立体構造体は、スキャフォールド（足場）フリーにできるにも関わらず、大きなサイズを有することができる。上述した好適な製造方法によれば、スキャフォールド（足場）フリーで大きなヒト肝臓様立体構造体を作製することが可能である。

【0054】

例えば、本発明のヒト肝臓様立体構造体を略球体状とする場合、投影面積円相当径を少なくとも１．０ｍｍとすることが好ましく、１．１～１０．０ｍｍとすることがより好ましく、１．２～５．０ｍｍとすることが特に好ましい。

【0055】

本発明のヒト肝臓様立体構造体を中空または中実の略円柱状とする場合、長さ方向等間隔で３箇所切断したときの断面（中空の場合は断面の外周）の直径は、平均で、１．０～１０．０ｍｍであることが好ましく、１．２～５ｍｍであることがより好ましい。断面がゆがみを有する楕円等である場合、「断面の直径」としては、断面の短径を測定する。

【0056】

本発明のヒト肝臓様立体構造体を中空または中実の略多角柱状とする場合、長さ方向等間隔で３箇所切断したときの断面（中空の場合は切断面の外周）の外接円の直径は、平均で、１．０～１０．０ｍｍであることが好ましく、１．２～５ｍｍであることがより好ましい。外接円がゆがみを有する楕円等である場合、「外接円の直径」としては、外接円の短径を測定する。

【0057】

本発明のヒト肝臓様立体構造体をリング状とする場合、底面の外周円の直径と、天面の外周円の直径の平均値を１．０～１０．０ｍｍとすることが好ましく、１．２～５ｍｍとすることがより好ましい。外周円がゆがみを有する楕円等である場合、「外周円の直径」としては、外周円の短径を測定する。

【0058】

なお、本明細書において、リング状は、胴部の長さが底面の外周円の直径より短い形状を意味し、胴部の長さが底面の外周円の直径以上の場合は、中空の円柱状に分類する。

【0059】

本発明のヒト肝臓様立体構造体は、ヘテロスフェロイドを平面方向に配列することで、シート状とすることもできる。ヘテロスフェロイドは、細胞単体に比べて大きいことから、ヘテロスフェロイドを平面方向に配列してできるシートも、ある程度の厚みを有する立体的なシートとなっている。その厚みは、平均で少なくとも３００μｍであることが好ましく、少なくとも５００μｍであることがより好ましく、５００～１０００μｍであることが特に好ましい。厚みは、光学顕微鏡により測定することができる。

【0060】

本発明のヒト肝臓様立体構造体が、肝臓モデルとして機能しうるか否かは、上述の３．測定及び選抜指標においてスフェロイドの選抜指標として説明した手法と同じ手法により判断することができる。指標とする遺伝子としては、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９等の薬物代謝におけるｐｈａｓｅ１酵素遺伝子；ＵＧＴ１Ａ１等の薬物代謝におけるｐｈａｓｅ２酵素遺伝子；またはＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３等のトランスポーター遺伝子が好ましい。

【0061】

また、ヒト肝臓様立体構造体特有の指標として、検出蛍光プローブ（ＭＡＲ、五稜化薬）により構造体内部の酸素濃度をモニタリングしてもよい。

【0062】

さらにまた、生体内の肝細胞でリファンピシン暴露によりＣＹＰ３Ａ４酵素の発現が高くなるという知見に基づき、ヒト肝臓様立体構造体にリファンピシンを接触させてＣＹＰ３Ａ４の発現量を確認してもよい。

【0063】

本発明のヒト肝臓様立体構造体は、長期培養後もヒト肝臓に類似した機能を維持しており、生存率も高い。

【0064】

本発明のヒト肝臓様立体構造体は、肝臓モデルとして、ヒト体内における被検物質の代謝の評価、ヒトに対する被検物質の肝毒性の評価等の各種用途に使用できる。

【0065】

例えば代謝を評価する際には、本発明のヒト肝臓様立体構造体に後述の被検物質を接触させ、被検物質の代謝産物が構造体内部もしくは構造体の外に反応生成物として検出された場合に、被検物質が代謝されたと判定される。被検物質の代謝産物としては、被検物質の第１相代謝産物、第２相代謝産物が挙げられる。検出には、例えばＬＣ／ＭＳ／ＭＳ等の公知の手段を利用することができる。

【0066】

本発明のヒト肝臓様立体構造体は、好適には、第２細胞としてヒト肝星細胞を含んでおり、且つ、ヒト肝星細胞が静止状態にある。

【0067】

本発明のヒト肝臓様立体構造体は、好ましくは、ヒトに対する被検物質の肝毒性を評価する方法に使用される。

【0068】

５．ヒト肝臓様複合体
本発明のヒト肝臓様立体構造体は、そのまま各種用途に適用してもよいが、ヒト肝臓様立体構造体同士を２個以上連結して、融合させ、ヒト肝臓様複合体としてもよい。本発明のヒト肝臓複合体は、ヒト肝臓様立体構造体の場合と同様の用途に適用できる。

【0069】

６．肝毒性を評価する方法
ヒトに対する被検物質の肝毒性を評価する方法としては、例えば、以下の（１）（２）工程を含む方法が挙げられる。以下、この方法を「本発明の肝毒性を評価する方法」と呼ぶことがある。
（１）本発明のヒト肝臓様立体構造体に、被検物質を接触させる接触工程。
（２）本発明のヒト肝臓様立体構造体の障害の有無またはその程度を測定する測定工程。

【0070】

本発明の肝毒性を評価する方法で用いる被検物質に、特に制限はなく、例えば、天然化合物；有機化合物；無機化合物；高分子化合物；タンパク質；ペプチド；化合物ライブラリー；遺伝子ライブラリーの発現産物；細胞抽出物；細胞培養上清；発酵微生物産生物；海洋生物抽出物；植物抽出物；等や、これらを含む薬物、食品添加物などの生体異物を用いることができる。本明細書において「生体異物」は、生体にとって異物である限り、あらゆる物質を含む。また、生体異物とリポソームや合成高分子とを用いてドラッグデリバリーシステムの検討を行うこともできる。

【0071】

薬物としては、例えば、分子量が２，０００以下の低分子医薬品；分子量が２，０００より大きく数千程度であるもしくは一部のペプチドからなる中分子医薬品；抗体医薬品や高分子を結合させた高分子医薬品；アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、アプタマー、デコイなどの核酸医薬品；体性幹細胞に代表される細胞医薬品；などが挙げられる。

【0072】

薬物の具体的な化合物としては、例えば、リファンピシン、デキサメタゾン、フェノバルビタール、シグリタゾン、フェニトイン、エファビレンツ、シンバスタチン、β－ナフトフラボン、オメプラゾール、クロトリマゾール、３－メチルコラントレンアセトアミノフェン、トロバフロキサシン、エストロン、ニフェディピン、ジクロフェナック、インドメタシン、メトトキサレート、トログリタゾン、ＣＣｌ４、パラセタノール、ハロタン、アミオダロン、チオライダジン、メチルドーパ、イソニアジド、レボフロキサシン、スタブディン、フェルバメート、シクロフォスファミド、ピオグリタゾン、ロジグリタゾン、ケトコナゾール、ペリヘキシリン、ベノキサプロフェン、アセトアミノフェン、クロミプラミン、フェノフィブレート、イミプラミン、ジロートン、トログリタゾン、アルベンダゾール、フルコナゾール、グラフェミン、グリソフラビン、ラベタロール、等が例示できる。

【0073】

接触工程（１）において、ヒト肝臓様立体構造体と被検物質との接触は、通常、培地や培養液に被検物質を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検物質がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、接触を行うこともできる。

【0074】

測定工程（２）では、本発明のヒト肝臓様立体構造体の障害の有無またはその程度を測定する。障害の有無またはその程度は、例えば肝細胞の生存率、肝障害マーカー、エクソソームを指標に測定できる。また、ＨＥ染色や抗体染色によっても確認できる。

【0075】

例えば、ヒト肝臓様立体構造体の培養液に被検物質を添加することにより、ヒト肝臓様立体構造体中の細胞の生存率が低下する場合、該被検物質は肝毒性を有すると判定される。生存率に有意な変化がない場合、該被検物質は肝毒性を有さないと判定される。生存率は、例えばＡＴＰ活性を測定することにより確認できる。

【0076】

肝障害マーカーとしては、ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルブミン、尿素等が挙げられる。例えば、ヒト肝臓様立体構造体の培養液に被検物質を添加後、培養液中のＡＬＴやＡＳＴが上昇する場合、該被検物質は肝毒性を有すると判定される。ＡＬＴやＡＳＴに有意な変化がない場合、該被検物質は肝毒性を有さないと判定される。また、ヒト肝臓様立体構造体の培養液に被検物質を添加後、培養液中のアルブミンや尿素の量が低下する場合、該被検物質は肝毒性を有すると判定される。アルブミンや尿素に有意な変化がない場合、該被検物質は肝毒性を有さないと判定される。

【0077】

エクソソームは、生体内で細胞外に放出される直径約３０～１００ｎｍ程度の超小型の膜小胞である。培地中に放出されたエクソソームの数、大きさ、内包成分等をモニタリングすることにより、肝毒性の有無またはその程度を測定できる。

【0078】

モニタリング対象とする内包成分としては、ｍｉＲＮＡやタンパク質が挙げられる。特に、エクソソームに内包されるｍｉＲＮＡの解析は、既に血液中から回収された疾患特異的なエクソソーム中に含まれるｍｉＲＮＡがその病態や進行度と関係することが癌やＣ型慢性肝炎などで報告され、疾患バイオマーカーとしての利用が検討されている。このように、ｍｉＲＮＡが細胞に起こるイベントに応答しているという観点から、肝毒性の有無またはその程度の判断手法として好適である。

【0079】

解析対象とするｍｉＲＮＡは、肝毒性の程度に応じて細胞から分泌される量が変化するものであれば特に限定されない。また、このようなｍｉＲＮＡとしては、細胞の種類等によってそれぞれ適切なものが選択され得る。

【0080】

例えば、第二細胞としてヒト肝星細胞を用い、ヒト肝細胞とヒト肝星細胞とを含むヒト肝臓様立体構造体の場合、下記実施例に記載されるように、配列番号１～６に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ；ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－２２４は、肝毒性が高い程培養上清への分泌が増加する。

【表1】

【0081】

肝毒性の有無またはその程度を判断する指標としては、ｍｉＲＮＡをいずれか１種類のみ測定してもよいし、複数種類測定してもよい。

【0082】

細胞から放出されたエクソソーム中のｍｉＲＮＡを測定する際の工程としては、例えば、以下が挙げられる。
（２－１）前記立体構造体から放出されたエクソソームを回収するエクソソーム回収工程。
（２－２）エクソソームに含まれるｍｉＲＮＡを解析するｍｉＲＮＡ解析工程。

【0083】

エクソソーム回収工程（２－１）では、例えば培養上清の一部をサンプリングし、超遠心分離法、市販のエクソソーム単離キットの利用等公知の手法により、サンプリングした培養上清からエクソソームを回収する。

【0084】

ｍｉＲＮＡ解析工程（２－２）では、まず、市販のｍｉＲＮＡ抽出キットを用いるなど公知の手法により、回収したエクソソームからｍｉＲＮＡを抽出する。次に、ｍｉＲＮＡ用マイクロアレイや定量的リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲに代表されるＰＣＲ等の公知の手段を利用し、抽出した全ｍｉＲＮＡ中の特定のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する。

【0085】

肝毒性の程度によって増減することが判明している特定のｍｉＲＮＡについて、そのｍｉＲＮＡの発現レベルを、被験物質と接触していない状態の細胞が分泌するｍｉＲＮＡの発現レベル（基準値）と比較して、肝毒性の程度を評価することができる。また、基準値以外に、ｍｉＲＮＡの種類毎に適切な閾値を決め、その値を超える又は下回る値になった場合に肝毒性を有する等と判断をすることもできる。

【0086】

複数種のｍｉＲＮＡの発現プロファイルを網羅的に確認することができるという観点から、ｍｉＲＮＡ用のマイクロアレイが好ましい。

【0087】

また、ｍｉＲＮＡ回収工程（２－２）においては、更に、複数種の被験物質について、それぞれで検出されたｍｉＲＮＡ発現量の配列データから主成分分析を行ってもよい。例えば第一主成分ＰＣ１と第二主成分ＰＣ２の相関図を作製することにより、被験物質の毒性機構ごとの相関関係を確認することができる。

【0088】

本発明の肝毒性を評価する方法により、臨床では肝毒性があることが分かっているが従来の方法では肝毒性を検出できない被検物質でも、肝毒性があることを確認することができる。

【実施例】

【0089】

以下、実験例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実験例に制限されるものではない。

【0090】

［実験例１］ヒト肝臓様立体構造体の前駆体の作製
細胞非接着処理を施したスフェロイド作製用プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ製マイクロプレート９６ｗｅｌｌ）に、１ウェルあたり凍結ヒト肝臓細胞（Ｓｅｋｉｓｕｉ ＸｅｎｏＴｅｃｈ社製Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）１×１０^４個とヒト肝星細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌｓ）５×１０^２個を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で３～５日間培養して直径（投影面積円相当径）５００μｍのスフェロイドを得た。
次に、得られたスフェロイドと三次元細胞積層システムＲｅｇｅｎｏｖａ（株式会社サイフューズ製）を用いて、縦３個、横３個、合計９個のスフェロイドを配列し、潅流培養装置内で５日間培養した。

【0091】

９個のスフェロイドが融合して１つの塊状になり、ヒト肝臓様立体構造体の前駆体Ａが得られた。

【0092】

［実験例２］ヒト肝臓様立体構造体の前駆体の作製
細胞非接着処理を施したスフェロイド作製用プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ製マイクロプレート９６ｗｅｌｌ）に、１ウェルあたり凍結ヒト肝臓細胞（Ｓｅｋｉｓｕｉ ＸｅｎｏＴｅｃｈ社製Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）１×１０^４個とヒト肝星細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌｓ）５×１０^２個を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で３～５日間培養して直径（投影面積円相当径）５００μｍのスフェロイドを得た。
次に、得られたスフェロイドと三次元細胞積層システムＲｅｇｅｎｏｖａ（株式会社サイフューズ製）を用いて、縦３個、横３個、高さ３個、合計２７個のスフェロイドを配列し、潅流培養装置内で５日間培養した。

【0093】

２７個のスフェロイドが融合して１つの塊状になり、ヒト肝臓様立体構造体の前駆体Ｂが得られた。

【0094】

［実験例３］ヒト肝臓様立体構造体の振とう培養による作製
実験例１もしくは実験例２で作製した前駆体Ａ，Ｂを剣山から抜き取った後、１ｍＬの培地を分注したザルスタット８ｍＬチューブに別々に入れ、ＣＯ_２インキュベーター内で５日間振とう培養した。

【0095】

前駆体の剣山の針跡は振とう培養中に消失し、また形状が球状に変化し、ヒト肝臓様立体構造体Ａ，Ｂが得られた。ヒト肝臓様立体構造体Ａの球相当直径は、１．０ｍｍ、ヒト肝臓様立体構造体Ｂの球相当直径は、１．５ｍｍであった。

【0096】

［実験例３´］
実験例１で作製した前駆体Ａを剣山から抜き取った後、３μｍｏｌ／ｌになるようにＴＧＦβ阻害剤Ａ８３－０１を添加した１ｍＬの培地を、分注したザルスタット８ｍＬチューブに別々に入れ、ＣＯ_２インキュベーター内で５日間振とう培養した。得られた肝臓様立体構造体を肝臓様立体構造体Ａ´と呼ぶ。

【0097】

［実験例４］ヒト肝臓様立体構造体の遺伝子の発現解析
実験例３で作製した各ヒト肝臓様立体構造体Ａ，Ｂに発現している遺伝子として、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＵＧＴ１Ａ１、ＭＲＰ２、ＢＳＥＰ、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３をリアルタイムＰＣＲ法で計測した。

【0098】

ヒト肝臓様立体構造体Ａの結果を図１に、ヒト肝臓様立体構造体Ｂの結果を図２に示した。実験例３で作製したヒト肝臓様立体構造体Ａ，Ｂでは、作製してから２０日以上、原料の凍結肝臓細胞を解凍してから３０日以上の長い間、それぞれの遺伝子が持続的に発現していた。平面培養した細胞では、解凍後７～１０日で死滅することと対照的であった。
実験例３で作製したヒト肝臓様立体構造体Ａ，Ｂは、肝臓が本来有している代謝、抱合、細胞への取り込みと排泄に関わる機能を極めて高いレベルと長期間維持できる点で優勢であることが判明した。

【0099】

［実験例４´］ヒト肝臓様立体構造体Ａ´のＣＹＰ３Ａ４酵素活性
実験例３´で作製したヒト肝臓様立体構造体Ａ´中のＣＹＰ３Ａ４酵素の活性をＣＹＰ３Ａ４ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ）で評価した。結果を図７に示した。比較対象として、ＴＧＦβ阻害剤Ａ８３－０１を添加せず、星細胞が静止状態にない処方（処方Ａ。実験例３で作製したヒト肝臓様立体構造体Ａに相当。）の結果を示した。
Ａ８３－０１の添加によってＣＹＰ３Ａ４の活性は約１０倍程度高くなり、さらにこの酵素活性は２８日間経ても、初期値の７０％以上の高い値を示していた。星細胞を静止状態にすることで肝臓構造体の代謝機能をより高くでき、かつ長期間維持できることがわかった。

【0100】

［実験例５］肝毒性の評価
ヒトに投与すると肝毒性を示すことが既知の薬剤であるトロバフロキサシンのＤＭＳＯ溶液を調液した。得られた薬剤入りＤＭＳＯ溶液を、実験例３で作製したヒト肝臓様立体構造体Ａの培養培地に、培地中の濃度が５～１０００μｍｏｌ／ｌとなるように添加した。対照として実験例３で作製したヒト肝臓様立体構造体の培養培地にＤＭＳＯ溶液のみを添加したものを準備した。薬剤添加後２４日までの培地中のアルブミン濃度の変化、並びに、実験終了後の構造体に含有されるＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ３Ｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて計測した。さらに構造体の組織切片を作製し、ＨＥ染色、アルブミンの免疫染色像を得た。

【0101】

トロバフロキサシンを含有する培地中のアルブミン濃度の変化を図３に示した。また、ヒト肝臓様立体構造体に含有されるＡＴＰ量変化を図４に示した。ヒト肝臓様立体構造体の免疫染色像を図５に示した。
アルブミン濃度の薬剤濃度依存的な減少が観測され、薬物毒性を検出できることがわかった。比較対象とした平面培養系ではアルブミン濃度の減少は観測されない（詳細は記載せず）ことから、本発明の毒性評価方法の毒性評価能が優れていることが示された。

【0102】

［実験例５´］肝毒性の評価
ヒトに投与すると肝毒性を示すことが既知の薬剤２０種のＤＭＳＯ溶液を調液した。得られた薬剤入りＤＭＳＯ溶液を、実験例３で作製したヒト肝臓様立体構造体Ａの培養培地に、培地中の濃度がそれぞれの薬剤のヒト臨床で報告されている最大血中濃度（Ｃmax）の２０～５０倍となるように添加した。対照として実験例３で作製したヒト肝臓様立体構造体の培養培地にＤＭＳＯ溶液のみを添加したものを準備した。薬剤添加後７日、１４日の培地中のアルブミン濃度の変化をＤＭＳＯのみを添加したものを１００％に規格化して図８に示した。１４日後には、全ての化合物でＤＭＳＯのみを添加したときに比べて統計的に有意な差がある８０％以下となり、優れた毒性検出能を有することが示された。

【0103】

［実験例６］エクソソームによる肝毒性の評価
実験例５の培養培地を４℃にて２，０００ｘｇ，２０分間遠心し，回収した上清を続けて１５，０００ｘｇにて３０分間遠心した。回収した試料溶液各２．２ｍＬに対し，ＥｘｏＣａｐ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ／Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｏｏｓｔｅｒ（登録商標） １．１ｍＬおよび超純水７．７ｍＬを加え均一に撹拌した後，超遠心分離操作（３５，０００ｒｐｍ，７０分，４°Ｃ）にそれぞれ供した。遠心後，デカンテーションおよびアスピレーターにて上清を取り除いた後，超純水で１０倍希釈したＥｘｏＣａｐ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ／Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｏｏｓｔｅｒ（登録商標）溶液にて再懸濁し，エクソソーム溶液７５μＬをそれぞれ得た。
エクソソームの粒子数と粒度分布測定には、ｑＮａｎｏ（ナノ粒子マルチアナライザー）を用いた。また、回収されたエクソソームについて、ウェスタンブロット法でＣＤ９の発現を確認した。ＲＮＡ抽出キットを用いてエクソソームから抽出した試料中のｍｉＲＮＡをデジタルＰＣＲで計測した。さらにエクソソームに含まれるマイクロＲＮＡを取り出し、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－１９２およびｍｉＲ－１の量を定量ＰＣＲ法で計測した。尚、ｍｉＲ－１は毒性と関係しないと言われているｍｉＲＮＡであり、ｍｉＲ－１２２やｍｉＲ－１９２の増減を判断する際の基準としての役割を果たすものである。

【表2】

【0104】

結果を図６に示した。図６（ａ）は、実験例５でＤＭＳＯのみを添加３日後に培養培地から回収されたエクソソームの粒度分布結果を示す図である。図６（ｂ）は、トロバフロキサシンＤＭＳＯ溶液を添加３日後に培養培地から回収されたエクソソームの粒度分布結果を示す図である。図６（ｃ）は、各条件で回収されたエクソソーム粒子数濃度を示す図である。薬剤添加してわずか３日後には培地中のエクソソーム粒子数濃度の上昇を観測した。さらに回収されたエクソソームからｍｉＲ－１２２を検出した。

【0105】

下記表に、薬物としてトロバフロキサシンの他、インドメタシン、ジクロフェナック、ベノキサプロフェン、ジロートン、トログリタゾンを培地に添加し、添加３日後、１０日後に培地から回収したエクソソームから検出されたｍｉＲ－１２２－５ｐの濃度をデジタルＰＣＲで定量した結果を示した。いずれの化合物を添加した場合もｍｉＲ－１２２－５ｐが検出され、ｍｉＲＮＡが毒性評価の１つの指標となることが示された。

【表3】

【0106】

［実験例７］フェニトインの代謝反応生成物の化学構造解析
フェニトインのＤＭＳＯ溶液を調液した。得られた薬剤入りＤＭＳＯ溶液を、実験例３´で作製したヒト肝臓様立体構造体Ａ´の培養培地に、培地中の濃度が１０μｍｏｌ／ｌとなるように添加した。薬剤添加後６日までの培地をサンプリングし、培地中の代謝生成物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法で分離・構造解析を実施した。図９に各代謝生成物のマスクロマトグラムを示した。各ピーク検出の同定に用いた質量数を下記表に示した。ここで、各代謝物の略称は、次の構造を示す。
ＤＰＨ；５，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｈｙｄａｎｔｏｉｎ（フェニトイン）、
ＤＰＨ－Ｇｌｕ；ＤＰＨ－Ｎ-ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ、
４‘－ＨＰＰＨ；（４’－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｈｙｄａｎｔｏｉｎ、
４‘－ＨＰＰＨ－Ｏ－Ｇｌｕ；（４’－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｈｙｄａｎｔｏｉｎ－Ｏ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ。

【表4】

４種の代謝生成物と原料のフェニトインがＬＣで分離検出された。また、分離された各ピーク位置のＭＳ／ＭＳ測定から得られた質量分析結果から、代謝生成物の化学構造を推定した。
最終的に得られたフェニトインの代謝反応機構を以下に示した。

【化1】

このように、本ヒト肝臓様立体構造体を用いてヒト肝臓中で起こる代謝反応をｉｎ ｖｉｔｒｏ評価系で予測することができる。

【0107】

［実験例８］トルセトラピブの代謝反応生成物の化学構造解析
トルセトラピブのＤＭＳＯ溶液を調液した。得られた薬剤入りＤＭＳＯ溶液を、実験例３´で作製したヒト肝臓様立体構造体Ａ´の培養培地に、培地中の濃度が１０μｍｏｌ／ｌとなるように添加した。薬剤添加後６日までの培地をサンプリングし、培地中の代謝生成物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法で分離・構造解析を実施した。図１０に各代謝生成物のマスクロマトグラムを示した。各ピーク検出の同定に用いた質量数を下記表に示した。

【表5】

【0108】

２種の代謝生成物Ｍ２とＭ５、原料のトルセトラピブがＬＣで分離検出された。また、分離された各ピーク位置のＭＳ／ＭＳ測定から得られた質量分析結果から、代謝生成物の化学構造を推定した。最終的に得られたトラセトラピブの代謝反応機構を以下に示した（Drug Metab Dispos. 2008 Oct;36(10):2064-79．）。

【化2】

代謝生成物Ｍ２、Ｍ５は、トルセトラピブ（Ｍ）をヒトに投与した時に検出されるものである（Drug Metab Dispos. 2010 Oct;38(10):1900-5.）。従って、本肝臓様立体構造体によれば、ヒト肝臓中で起こる代謝反応をｉｎ ｖｉｔｒｏ評価系で予測することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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