知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-29
(45)【発行日】2024-12-09
(54)【発明の名称】抗炎症組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/704 20060101AFI20241202BHJP
A61K 36/11 20060101ALI20241202BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20241202BHJP
【ＦＩ】
A61K31/704
A61K36/11
A61P1/02
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2018129381
(22)【出願日】2018-07-06
(65)【公開番号】P2019014714
(43)【公開日】2019-01-31
【審査請求日】2021-03-19
【審判番号】
【審判請求日】2023-02-01
(31)【優先権主張番号】P 2017133008
(32)【優先日】2017-07-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000100539
【氏名又は名称】アース製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002000
【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所
(72)【発明者】
【氏名】新居 沙織
(72)【発明者】
【氏名】芝 典江
(72)【発明者】
【氏名】浅井 梨加
【合議体】
【審判長】原田 隆興
【審判官】池上 京子
【審判官】渕野 留香
(56)【参考文献】
【文献】特開平９－２９１０１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－１０７９８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平８－４０８５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００１－２６１５６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００３－５５２４１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１０－２７９４９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】ＢＭＣ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１３，２０１３年，ＵＲＬは以下：［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／１４７２－６８８２／１３／２０８］
【文献】ＦＥＢＳ Ｊ．，Ｖｏｌ．２８１，２０１４年，ｐｐ．２５４３－２５５７
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K 31/00, 33/00, 36/00, 8/00
ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭｅｄＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
グリチルリチン酸又はその塩と、スギナのアルコール類による抽出物を含有する、口腔用の抗炎症組成物（ドクダミ、シナノキ、チャ、ユリ又は海藻の抽出物を含む組成物を除く）。
【請求項2】
グリチルリチン酸又はその塩と、スギナのアルコール類による抽出物と、シラカバのアルコール類による抽出物とを含有する、口腔用の抗炎症組成物（ドクダミ、シナノキ、チャ、ユリ又は海藻の抽出物を含む組成物を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グリチルリチン酸又はその塩を含有する抗炎症組成物に関し、特にグリチルリチン酸又はその塩と、特定の植物抽出物を含有する抗炎症組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
グリチルリチン酸又はその塩は、カンゾウ（甘草）という生薬に含まれる成分であり、抗炎症作用を示すことが知られている。グリチルリチン酸又はその塩は、抗炎症作用を有することにより、炎症性疾患の一種である歯周病等の症状を抑えたり予防するための洗口液や、皮膚の炎症を抑えるための皮膚外用剤、育毛剤、石鹸等に幅広く使用されている。
【0003】
例えば、特許文献１には、抗炎症剤としてグリチルリチン酸塩を含有する液体口腔用組成物が開示されており、歯肉炎等の口腔内疾患を予防できることが記載されている。
また、特許文献２には、グリチルリチン酸を含有する皮膚外用剤が開示されており、アレルギー性の炎症やアトピー性の皮膚炎等の炎症に効果がある旨記載されている。
また、特許文献２には、グリチルリチン酸を含有する皮膚外用剤が開示されており、アレルギー性の炎症やアトピー性の皮膚炎等の炎症に効果がある旨記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２００１－２６１５７６号公報
【文献】特開２００６－３２７９６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上述したような抗炎症組成物に対しては、超高齢化社会を迎える中で進行した炎症を抱える高齢者も増加していることもあり、より高い抗炎症効果が求められている。したがって本発明の目的は、抗炎症効果が増強した、グリチルリチン酸又はその塩を含有する抗炎症組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、グリチルリチン酸又はその塩とともに、ある特定の植物抽出物を含有させることにより、グリチルリチン酸又はその塩の抗炎症効果が増強されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0007】
すなわち、本発明は、下記に示す手段により上記課題を解決することができたものである。
１．グリチルリチン酸又はその塩と、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ及びセージの抽出物からなる群より選ばれる少なくとも１つの抽出物を含有する抗炎症組成物。
２．口腔用組成物である、前記１に記載の抗炎症組成物。
１．グリチルリチン酸又はその塩と、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ及びセージの抽出物からなる群より選ばれる少なくとも１つの抽出物を含有する抗炎症組成物。
２．口腔用組成物である、前記１に記載の抗炎症組成物。
【発明の効果】
【0008】
本発明の抗炎症組成物は、グリチルリチン酸又はその塩と、特定の植物抽出物を含有することにより、グリチルリチン酸又はその塩の抗炎症効果を増強させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【0011】
＜抗炎症組成物＞
本発明の抗炎症組成物は、グリチルリチン酸又はその塩と、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ及びセージの抽出物からなる群より選ばれる少なくとも１つの抽出物を含有することを特徴とする。
本発明の抗炎症組成物は、グリチルリチン酸又はその塩と、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ及びセージの抽出物からなる群より選ばれる少なくとも１つの抽出物を含有することを特徴とする。
【0012】
グリチルリチン酸又はその塩は、生薬の一種である甘草の根や茎に含まれている成分である。グリチルリチン酸又はその塩は、口内炎や喉等の炎症を抑える効果が知られており、すなわち、抗炎症作用を有することが知られている。
本発明におけるグリチルリチン酸又はその塩としては、例えばグリチルリチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）、グリチルリチン酸トリナトリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム、グリチルリチン酸ジアンモニウム、グリチルリチン酸ジナトリウムなどが挙げられ、これらの１種を単独又は２種以上を併用して配合できる。なかでもグリチルリチン酸ジカリウムが、本発明の効果を高く得られる観点から、より好適である。
グリチルリチン酸又はその塩は、甘草から従来公知の方法を用いて抽出して得ることもできるし、市販品を使用することもできる。市販品として、例えば、アルプス薬品工業社製や丸善製薬社製のグリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム等を使用することができる。
本発明におけるグリチルリチン酸又はその塩としては、例えばグリチルリチン酸、グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）、グリチルリチン酸トリナトリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム、グリチルリチン酸ジアンモニウム、グリチルリチン酸ジナトリウムなどが挙げられ、これらの１種を単独又は２種以上を併用して配合できる。なかでもグリチルリチン酸ジカリウムが、本発明の効果を高く得られる観点から、より好適である。
グリチルリチン酸又はその塩は、甘草から従来公知の方法を用いて抽出して得ることもできるし、市販品を使用することもできる。市販品として、例えば、アルプス薬品工業社製や丸善製薬社製のグリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム等を使用することができる。
【0013】
グリチルリチン酸又はその塩は、本発明の抗炎症組成物の全量に対して、例えば、０．０００１～１．０質量％、好ましくは０．０００５～０．１質量％、より好ましくは０．００１～０．０１５質量％含有することができる。０．０００１質量％以上とすることによって、グリチルリチン酸又はその塩の抗炎症効果の増強が期待され、１．０質量％以下とすることによって、処方化が容易となり、特に液体口腔用組成物において良好な使用感が得られる。
【0014】
本発明の抗炎症組成物は、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ及びセージの抽出物からなる群より選ばれる少なくとも１つの抽出物を含有する。
本発明の抗炎症組成物は、グリチルリチン酸又はその塩に加え、上記特定の植物抽出物を組み合わせたものである。すなわち、グリチルリチン酸又はその塩に対し、数ある植物抽出物の中から、上記特定の植物抽出物を組み合わせることによって、抗炎症効果が増強したものである。
本発明の抗炎症組成物は、グリチルリチン酸又はその塩に加え、上記特定の植物抽出物を組み合わせたものである。すなわち、グリチルリチン酸又はその塩に対し、数ある植物抽出物の中から、上記特定の植物抽出物を組み合わせることによって、抗炎症効果が増強したものである。
【0015】
なかでも、抗炎症作用を増強させるという本発明の効果の観点からは、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリスの抽出物からなる群より選ばれる少なくとも１つの抽出物を含有することが好ましく、スギナ及びセイヨウサンザシの少なくともいずれか一方の抽出物を含有することがより好ましい。
また、上記抽出物を３種以上含有する場合は、スギナ及びセイヨウサンザシの抽出物に加え、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ又はセージの抽出物を少なくとも含有することが好ましい。
また、上記抽出物を３種以上含有する場合は、スギナ及びセイヨウサンザシの抽出物に加え、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ又はセージの抽出物を少なくとも含有することが好ましい。
【0016】
また、本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、グリチルリチン酸又はその塩：スギナ抽出物、セイヨウサンザシ抽出物、シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、及びセージ抽出物＝６００：１～５：４であることが好ましく、より好ましくは４５０：１～３：２、さらに好ましくは３００：１～２：１、最も好ましくは、２００：１～１０：３である。なお、上記含有比率における「スギナ抽出物、セイヨウサンザシ抽出物、シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、及びセージ抽出物」とは、各植物抽出物の含有量の合計を意味する。
【0017】
また、上記抽出物を３種以上含有する場合は質量比で、グリチルリチン酸又はその塩：スギナ抽出物：セイヨウサンザシ抽出物：シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、又はセージ抽出物＝６００：１：１：１～１．２５：１：１：１であることが好ましく、より好ましくは４５０：１：１：１～１．５：１：１：１、さらに好ましくは３００：１：１：１～２：１：１：１、最も好ましくは、２００：１：１：１～３：１：１：１である。なお、上記含有比率における「シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、又はセージ抽出物」とは、各植物抽出物のいずれか１種の含有量を意味する。
【0018】
本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、グリチルリチン酸又はその塩：スギナ抽出物＝６００：１～５：４であることが好ましく、４５０：１～３：２であることがより好ましく、３００：１～２：１であることがさらに好ましい。
本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、グリチルリチン酸又はその塩：セイヨウサンザシ抽出物＝６００：１～５：４であることが好ましく、４５０：１～３：２であることがより好ましく、３００：１～２：１であることがさらに好ましい。
本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、グリチルリチン酸又はその塩：シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、又はセージ抽出物＝６００：１～５：４であることが好ましく、４５０：１～３：２であることがより好ましく、３００：１～２：１であることがさらに好ましい。
本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、スギナ抽出物：セイヨウサンザシ抽出物＝１：１００００～１００００：１であることが好ましく、１：１０００～１０００：１であることがより好ましく、１：５００～５００：１であることがさらに好ましい。
本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、スギナ抽出物：シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、又はセージ抽出物＝１：１００００～１００００：１であることが好ましく、１：１０００～１０００：１であることがより好ましく、１：５００～５００：１であることがさらに好ましい。
本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、セイヨウサンザシ抽出物：シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、又はセージ抽出物＝１：１００００～１００００：１であることが好ましく、１：１０００～１０００：１であることがより好ましく、１：５００～５００：１であることがさらに好ましい。
なお、上記含有比率における「シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、又はセージ抽出物」とは、各植物抽出物のいずれか１種の含有量を意味する。
本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、グリチルリチン酸又はその塩：セイヨウサンザシ抽出物＝６００：１～５：４であることが好ましく、４５０：１～３：２であることがより好ましく、３００：１～２：１であることがさらに好ましい。
本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、グリチルリチン酸又はその塩：シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、又はセージ抽出物＝６００：１～５：４であることが好ましく、４５０：１～３：２であることがより好ましく、３００：１～２：１であることがさらに好ましい。
本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、スギナ抽出物：セイヨウサンザシ抽出物＝１：１００００～１００００：１であることが好ましく、１：１０００～１０００：１であることがより好ましく、１：５００～５００：１であることがさらに好ましい。
本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、スギナ抽出物：シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、又はセージ抽出物＝１：１００００～１００００：１であることが好ましく、１：１０００～１０００：１であることがより好ましく、１：５００～５００：１であることがさらに好ましい。
本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、セイヨウサンザシ抽出物：シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、又はセージ抽出物＝１：１００００～１００００：１であることが好ましく、１：１０００～１０００：１であることがより好ましく、１：５００～５００：１であることがさらに好ましい。
なお、上記含有比率における「シャクヤク抽出物、ハマメリス抽出物、シラカバ抽出物、又はセージ抽出物」とは、各植物抽出物のいずれか１種の含有量を意味する。
【0019】
また、本発明の抗炎症組成物が液体組成物である場合は、長期保管時にも凝集物を生じにくいという観点から、スギナ抽出物、セイヨウサンザシ抽出物、及びハマメリス抽出物の少なくとも１つを含有することが好ましい。
【0020】
上記植物抽出物は、実施例で後述するように市販のものを使用することもできるし、植物から後述する方法等により抽出したものを使用することもできる。植物抽出物の抽出方法は特に制限されず、従来公知の方法に従えばよい。例えば、上記植物の任意の部位をそのまま、または裁断、粉砕等したのち、搾取、溶媒抽出、水蒸留、及び水蒸気蒸留等によって抽出物を得ることができる。溶媒抽出の方法としては、当該技術分野において公知の方法を採用すればよく、例えば水（温水、熱水を含む）抽出、アルコール抽出、超臨界抽出、マイクロウエーブ抽出、及び圧搾抽出等の従来公知の抽出方法を利用することができる。
【0021】
溶媒抽出を行う場合、溶媒としては、例えば水；メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、及び１，３－ブチレングリコール等のアルコール類（無水、含水の別を問わない）；アセトン等のケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン等のエーテル類；アセトニトリル等のニトリル類；酢酸エチルエステル等のエステル類；ヘキサン、キシレン、ベンゼン、及びクロロホルム等が例示される。
溶媒抽出における溶媒として好ましくは、水、アルコール類、ケトン類、及びヘキサン等であり、より好ましくは水、アルコール類、及びケトン類である。これらの溶媒は１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
溶媒抽出における溶媒として好ましくは、水、アルコール類、ケトン類、及びヘキサン等であり、より好ましくは水、アルコール類、及びケトン類である。これらの溶媒は１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【0022】
得られた抽出物は、そのままの状態で使用してもよく、乾燥させて使用してもよい。また、必要に応じて、得られた抽出物に精製、及び濃縮処理等を施してもよい。精製処理としては、例えば濾過またはイオン交換樹脂や活性炭カラム等を用いた吸着、脱色、及び分離といった処理を例示できる。また、濃縮処理としては、エバポレーター等の常法を例示できる。また、これらに対して更に凍結乾燥等の乾燥処理を施してもよく、更に従来公知の方法に従って粉末化させてもよい。また、このようにして得た抽出物を、必要に応じて水やエタノール等に溶解して用いてもよい。
【0023】
本発明の抗炎症組成物は、口腔用組成物である場合は、上記植物抽出物全体（固形物換算）を例えば０．００１質量ｐｐｍ～３質量％、好ましくは０．０１質量ｐｐｍ～０．１質量％含有することができる。０．００１質量ｐｐｍ以上とすることによって、上記抽出物（固形物換算）の抗炎症効果を発揮しうる濃度となり、３質量％以下にすることにより、着色しにくく、香味に与える影響も少ない。
【0024】
また、本発明の抗炎症組成物が含有する植物抽出物（固形物換算）の含有比率は質量比で、グリチルリチン酸又はその塩：（植物抽出物）＝４５０：１～３：２であることが好ましく、３００：１～２：１であることがより好ましく、２００：１～１０：３であることが最も好ましい。ここで、上記含有比率における「植物抽出物」とは、組成物が含有する植物抽出物の全体量を意味する。
【0025】
本発明の抗炎症組成物の用途としては、グリチルリチン酸又はその塩の抗炎症作用の効果を享受できるような用途であれば特に制限されず、様々な用途に使用できる。例えば、口腔用組成物、皮膚外用組成物、化粧料、及び洗浄剤等が挙げられる。
【0026】
本発明の抗炎症組成物が口腔用組成物である場合、口腔内に生じる種々の炎症性疾患、例えば、歯肉炎や歯周炎等の歯周病や、口内炎やカンジダ菌等の真菌感染に起因する炎症、義歯等の補綴物との接触により生じる粘膜炎、歯科治療に伴う創傷部の腫れ等に適用することができる。
口腔用組成物は、例えば、洗口液、歯磨き、口中清涼剤、うがい薬（含嗽剤）、液状歯磨き及び練り歯磨き等の歯磨き類、トローチ、チューインガム等の形態とすることができる。
なかでも、組成物全体を口腔内に十分にいきわたらせるため、口腔内に適量を含み使用する洗口液としての用途が好適である。洗口液とするには、例えば、水やエタノール等を溶剤とし、常法によって調製すればよい。
また、例えば、液体歯磨き剤としては、例えば、リン酸水素カルシウム、水酸化アルミニウム、無水ケイ酸、及び炭酸カルシウム等の研磨剤を必要に応じて含有したものとして使用することもできる。
口腔用組成物は、例えば、洗口液、歯磨き、口中清涼剤、うがい薬（含嗽剤）、液状歯磨き及び練り歯磨き等の歯磨き類、トローチ、チューインガム等の形態とすることができる。
なかでも、組成物全体を口腔内に十分にいきわたらせるため、口腔内に適量を含み使用する洗口液としての用途が好適である。洗口液とするには、例えば、水やエタノール等を溶剤とし、常法によって調製すればよい。
また、例えば、液体歯磨き剤としては、例えば、リン酸水素カルシウム、水酸化アルミニウム、無水ケイ酸、及び炭酸カルシウム等の研磨剤を必要に応じて含有したものとして使用することもできる。
【0027】
また、口腔用組成物は、本発明の効果を損なわない限り、その他任意の成分を含有してよい。
例えば、フッ化ナトリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム等のフッ化物；アズレン、アズレンスルホン酸塩、β－グリチルレチン酸、ジヒドロコレステロール、エピジヒドロコレステリン、酢酸ｄｌ－α－トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ－α－トコフェロール、ε－アミノカプロン酸、トラネキサム酸、アラントイン、アスコルビン酸等の抗炎症剤；リン酸塩、ポリリン酸塩、メトキシエチレン無水マレイン酸共重合体、塩化亜鉛、有機酸亜鉛等の歯石予防剤；ヒノキチオール、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、アラントインジヒドロキシアルミニウム、塩化ナトリウム等の収斂剤；グリセリン、ソルビトール、ポリエチレングリコール等の湿潤剤；ラウリル硫酸ナトリウム等の発泡剤；ピネン、ペパーミント油、シナモンオイル、クローブオイル、オイゲノール、レモンオイル、バニリン、シネオール、ユーカリオイル等の香料；サッカリン、サッカリンナトリウム、スクラロース、キシリトール、エリスリトール、ソルビトール、マルチトール、ステビア等の甘味料；青色１号、黄色５号、黄色４号、黄色２０３号、緑色３号、緑色２０１号、赤色１０２号等の着色剤；パラベン類、安息香酸ナトリウム等の保存剤；リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム等のｐＨ調整剤；ＰＯＥ硬化ヒマシ油、ＰＯＥ・ＰＯＰブロックポリマー、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、ＰＯＥ高級アルコールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰ脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤；ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ＰＯＥアルキルエーテル硫酸塩、ラウロイルサルコシナトリウム、ミリストイルサルコシンナトリウム、アルキルエーテルカルボン酸塩、アルキルリン酸塩、ＰＯＥアルキルエーテルリン酸塩、Ｎ－アシルタウリン塩、ＰＯＥアルキルエーテルリン酸・リン酸塩、スルホン酸塩等のアニオン性界面活性剤；塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、ＰＯＥアルキルアミン・脂肪酸アミド等のカチオン性界面活性剤；２－アルキル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリルジアミノエチルグリシンナトリウム等の両性界面活性剤等が挙げられる。
例えば、フッ化ナトリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム等のフッ化物；アズレン、アズレンスルホン酸塩、β－グリチルレチン酸、ジヒドロコレステロール、エピジヒドロコレステリン、酢酸ｄｌ－α－トコフェロール、ニコチン酸ｄｌ－α－トコフェロール、ε－アミノカプロン酸、トラネキサム酸、アラントイン、アスコルビン酸等の抗炎症剤；リン酸塩、ポリリン酸塩、メトキシエチレン無水マレイン酸共重合体、塩化亜鉛、有機酸亜鉛等の歯石予防剤；ヒノキチオール、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、アラントインジヒドロキシアルミニウム、塩化ナトリウム等の収斂剤；グリセリン、ソルビトール、ポリエチレングリコール等の湿潤剤；ラウリル硫酸ナトリウム等の発泡剤；ピネン、ペパーミント油、シナモンオイル、クローブオイル、オイゲノール、レモンオイル、バニリン、シネオール、ユーカリオイル等の香料；サッカリン、サッカリンナトリウム、スクラロース、キシリトール、エリスリトール、ソルビトール、マルチトール、ステビア等の甘味料；青色１号、黄色５号、黄色４号、黄色２０３号、緑色３号、緑色２０１号、赤色１０２号等の着色剤；パラベン類、安息香酸ナトリウム等の保存剤；リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム等のｐＨ調整剤；ＰＯＥ硬化ヒマシ油、ＰＯＥ・ＰＯＰブロックポリマー、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、ＰＯＥ高級アルコールエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰ脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤；ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ＰＯＥアルキルエーテル硫酸塩、ラウロイルサルコシナトリウム、ミリストイルサルコシンナトリウム、アルキルエーテルカルボン酸塩、アルキルリン酸塩、ＰＯＥアルキルエーテルリン酸塩、Ｎ－アシルタウリン塩、ＰＯＥアルキルエーテルリン酸・リン酸塩、スルホン酸塩等のアニオン性界面活性剤；塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、ＰＯＥアルキルアミン・脂肪酸アミド等のカチオン性界面活性剤；２－アルキル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリルジアミノエチルグリシンナトリウム等の両性界面活性剤等が挙げられる。
【0028】
また、本発明の抗炎症組成物が皮膚外用組成物である場合、皮膚に生じる種々の炎症性疾患、例えば、アレルゲンとの接触や虫刺されなどによるアレルギー性の皮膚炎、アトピー性皮膚炎などの内因性の皮膚疾患、乾皮症などバリア機能の低下に伴う皮膚炎等に適用することができる。
皮膚外用組成物は、例えば、ローション剤型、乳液やクリーム等の乳化剤型、オイル剤型等、特に限定されず、任意に設計することができる。
皮膚外用組成物は、例えば、通常化粧料などの皮膚外用剤で使用される任意成分を含有することができ、上記所望の剤型に応じて適宜選択して使用できるものである。この様な任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボカド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類；流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール類；イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸－２－エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ－２－エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ－２－ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ－２－エチルヘキサン酸グリセリン、トリ－２－エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ－２－エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の合成エステル油類；ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン；オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン；アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類；脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類；塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類；イミダゾリン系両性界面活性剤（２－ココイル－２－イミダゾリニウムヒドロキサイド－１－カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類；ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２－オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２－デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類；ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３－ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２－ペンタンジオール、２，４－ヘキサンジオール、１，２－ヘキサンジオール、１，２－オクタンジオール等の多価アルコール類；ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；表面を処理されていてもよい、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類；表面を処理されていてもよい、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類；表面を処理されていてもよい雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類；レーキ化されていてもよい赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類；パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤；アントラニル酸系紫外線吸収剤；サリチル酸系紫外線吸収剤；桂皮酸系紫外線吸収剤；ベンゾフェノン系紫外線吸収剤；糖系紫外線吸収剤；２－（２’－ヒドロキシ－５’－ｔ－オクチルフェニル）ベンゾトリアゾール、４－メトキシ－４’－ｔ－ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類；ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテート、ビタミンＢ６ジオクタノエート、ビタミンＢ２又はその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類；α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類；フェノキシエタノール等の抗菌剤などが例示できる。
皮膚外用組成物は、例えば、ローション剤型、乳液やクリーム等の乳化剤型、オイル剤型等、特に限定されず、任意に設計することができる。
皮膚外用組成物は、例えば、通常化粧料などの皮膚外用剤で使用される任意成分を含有することができ、上記所望の剤型に応じて適宜選択して使用できるものである。この様な任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボカド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類；流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール類；イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバシン酸－２－エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ－２－エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ－２－ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ－２－エチルヘキサン酸グリセリン、トリ－２－エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ－２－エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の合成エステル油類；ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン；オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン；アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類；脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類；塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類；イミダゾリン系両性界面活性剤（２－ココイル－２－イミダゾリニウムヒドロキサイド－１－カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類；ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２－オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２－デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類；ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３－ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２－ペンタンジオール、２，４－ヘキサンジオール、１，２－ヘキサンジオール、１，２－オクタンジオール等の多価アルコール類；ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；表面を処理されていてもよい、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類；表面を処理されていてもよい、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類；表面を処理されていてもよい雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類；レーキ化されていてもよい赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類；パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤；アントラニル酸系紫外線吸収剤；サリチル酸系紫外線吸収剤；桂皮酸系紫外線吸収剤；ベンゾフェノン系紫外線吸収剤；糖系紫外線吸収剤；２－（２’－ヒドロキシ－５’－ｔ－オクチルフェニル）ベンゾトリアゾール、４－メトキシ－４’－ｔ－ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類；ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテート、ビタミンＢ６ジオクタノエート、ビタミンＢ２又はその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類；α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類；フェノキシエタノール等の抗菌剤などが例示できる。
【0029】
本発明の抗炎症組成物による抗炎症効果は、例えば、炎症が生じている各種器官から採取した組織、細胞や、実施例で後述するように、ＬＰＳ等の刺激を与えた培養細胞において、炎症性サイトカインのｍＲＮＡやタンパク質の発現量を測定することで評価することができる。
炎症性サイトカインとしては、例えば、ＩＬ－６やＴＮＦ-α等を炎症マーカーとして使用することができる。
炎症性サイトカインとしては、例えば、ＩＬ－６やＴＮＦ-α等を炎症マーカーとして使用することができる。
【0030】
例えば、ＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量により抗炎症効果を評価する場合、後述する実施例に記載の条件で各種測定したＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量に基づき、ＩＬ－６のｍＲＮＡの相対発現量を求めることにより評価できる。
詳細は実施例にて後述する。
詳細は実施例にて後述する。
【0031】
あるいは、ＴＮＦ-αのタンパク質発現量により、抗炎症効果を評価する場合、後述する実施例に記載の条件で各種測定したＴＮＦ-αのタンパク質発現量から、下記式により、炎症抑制率を求め、植物抽出物を用いない場合（ＧＫ２処理：ＧＫ２のみを適用しかつＬＰＳ刺激を行う場合）の炎症抑制率を１とした場合の各検体における炎症抑制率を求めることにより評価できる。
「ＧＫ２処理」の炎症抑制率＝（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「ＧＫ２処理」のＴＮＦ-α量）／（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「無処理」のＴＮＦ-α量）
各検体における炎症抑制率＝｛（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－各検体のＴＮＦ-α量）／（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「無処理」のＴＮＦ-α量）｝／ＧＫ２処理の炎症抑制率
詳細は実施例にて後述する。
「ＧＫ２処理」の炎症抑制率＝（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「ＧＫ２処理」のＴＮＦ-α量）／（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「無処理」のＴＮＦ-α量）
各検体における炎症抑制率＝｛（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－各検体のＴＮＦ-α量）／（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「無処理」のＴＮＦ-α量）｝／ＧＫ２処理の炎症抑制率
詳細は実施例にて後述する。
【0032】
上記炎症抑制率は、１．０以上であることが好ましく、２．０以上であることがより好ましい。
また、上記ＩＬ－６のｍＲＮＡの相対発現量は、１．０以下であることが好ましく、０．５以下であることがより好ましい。
また、上記ＩＬ－６のｍＲＮＡの相対発現量は、１．０以下であることが好ましく、０．５以下であることがより好ましい。
【実施例】
【0033】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されるものではない。
【0034】
実施例１：炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量を指標とした抗炎症効果の評価
（実施例１－１）
本試験では、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ(以下、Ｐ．ｇ．という）由来ＬＰＳで細胞に炎症を惹起した細胞について、炎症性サイトカインの１種であるＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量を測定することにより、本発明の抗炎症組成物の抗炎症効果を評価した。
具体的には、まず、グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）を含有するＧＫ２溶液、植物抽出物１種を含む植物抽出物溶液、および細胞を刺激するＰ．ｇ．由来ＬＰＳを含むＬＰＳ溶液をそれぞれ調製した。つづいて、上記調製した溶液の存在下で細胞の培養を行い、炎症性サイトカインの一種であるＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量を測定することによって、抗炎症効果の評価を行った。
なお、本試験では、対照検体として、ＧＫ２のみを適用しかつＬＰＳ刺激を行った「ＧＫ２処理」（植物抽出物なし）、ＬＰＳ刺激のみを行った「ＬＰＳ処理」（ＧＫ２及び植物抽出物なし）、およびＧＫ２及び植物抽出物を適用せずＬＰＳ刺激も行わない「無処理」（ＧＫ２、植物抽出物、及びＬＰＳ刺激なし）についても試験を行った。
また、細胞培養用培地は、１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地を使用した。
（実施例１－１）
本試験では、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ(以下、Ｐ．ｇ．という）由来ＬＰＳで細胞に炎症を惹起した細胞について、炎症性サイトカインの１種であるＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量を測定することにより、本発明の抗炎症組成物の抗炎症効果を評価した。
具体的には、まず、グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）を含有するＧＫ２溶液、植物抽出物１種を含む植物抽出物溶液、および細胞を刺激するＰ．ｇ．由来ＬＰＳを含むＬＰＳ溶液をそれぞれ調製した。つづいて、上記調製した溶液の存在下で細胞の培養を行い、炎症性サイトカインの一種であるＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量を測定することによって、抗炎症効果の評価を行った。
なお、本試験では、対照検体として、ＧＫ２のみを適用しかつＬＰＳ刺激を行った「ＧＫ２処理」（植物抽出物なし）、ＬＰＳ刺激のみを行った「ＬＰＳ処理」（ＧＫ２及び植物抽出物なし）、およびＧＫ２及び植物抽出物を適用せずＬＰＳ刺激も行わない「無処理」（ＧＫ２、植物抽出物、及びＬＰＳ刺激なし）についても試験を行った。
また、細胞培養用培地は、１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地を使用した。
【0035】
［方法］
１．グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）溶液の調製
ＧＫ２（丸善製薬社製）およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）、精製水を、いずれも１質量％となるようにプロピレングリコールに溶解し、ＧＫ２原液を得た。このＧＫ２原液を１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地で２５００倍に希釈することで、ＧＫ２溶液を調製した。
１．グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）溶液の調製
ＧＫ２（丸善製薬社製）およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）、精製水を、いずれも１質量％となるようにプロピレングリコールに溶解し、ＧＫ２原液を得た。このＧＫ２原液を１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地で２５００倍に希釈することで、ＧＫ２溶液を調製した。
【0036】
２．植物抽出物溶液の調製
濃度が０．１質量％となるように植物抽出物を量りとり、ＧＫ２およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、精製水をそれぞれ１質量％となるように加え、プロピレングリコールに溶解し植物抽出物原液を得た。この植物抽出物原液を１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地で２５００倍に希釈することで、各種植物抽出物溶液を調製した。
濃度が０．１質量％となるように植物抽出物を量りとり、ＧＫ２およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、精製水をそれぞれ１質量％となるように加え、プロピレングリコールに溶解し植物抽出物原液を得た。この植物抽出物原液を１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地で２５００倍に希釈することで、各種植物抽出物溶液を調製した。
【0037】
３．ＬＰＳ溶液の調製
１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地でＰ．ｇ．由来のＬＰＳ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社製）を５００倍希釈し、ＬＰＳ溶液を調製した。
１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地でＰ．ｇ．由来のＬＰＳ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社製）を５００倍希釈し、ＬＰＳ溶液を調製した。
【0038】
４．供試細胞の準備
１２ｗｅｌｌプレートに培地とヒト口腔扁平上皮癌細胞：Ｃａ９－２２を１０６個／ｗｅｌｌずつ播種し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２：５％、３７℃）で２４時間培養し、供試細胞とした。
１２ｗｅｌｌプレートに培地とヒト口腔扁平上皮癌細胞：Ｃａ９－２２を１０６個／ｗｅｌｌずつ播種し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２：５％、３７℃）で２４時間培養し、供試細胞とした。
【0039】
５．ＬＰＳによる炎症誘導および検体暴露、ＲＮＡの抽出
（１）供試細胞から培地を除いたのち、ＧＫ２溶液、植物抽出物溶液、及びＬＰＳ溶液を、下記（ｉ）～（ｉｖ）のとおり全量２ｍＬになるよう添加し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２：５％、３７℃）で２４時間培養した。
（ｉ）各検体（植物抽出物含有検体）には、各種植物抽出物溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ１ｍＬずつ添加し、終濃度をＧＫ２は２．０質量ｐｐｍ、植物抽出物は０．２質量ｐｐｍとした。
（ｉｉ）「ＧＫ２処理」（対照検体）には、ＧＫ２溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ１ｍＬずつ添加した。
（ｉｉｉ）「ＬＰＳ処理」（対照検体）には、ＬＰＳ溶液と１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地をそれぞれ１ｍＬずつ添加した。
（ｉｖ）「無処理」（対照検体）には、１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地を２ｍＬ添加した。
（２）ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、細胞からトータルＲＮＡを抽出・精製した。
（１）供試細胞から培地を除いたのち、ＧＫ２溶液、植物抽出物溶液、及びＬＰＳ溶液を、下記（ｉ）～（ｉｖ）のとおり全量２ｍＬになるよう添加し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２：５％、３７℃）で２４時間培養した。
（ｉ）各検体（植物抽出物含有検体）には、各種植物抽出物溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ１ｍＬずつ添加し、終濃度をＧＫ２は２．０質量ｐｐｍ、植物抽出物は０．２質量ｐｐｍとした。
（ｉｉ）「ＧＫ２処理」（対照検体）には、ＧＫ２溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ１ｍＬずつ添加した。
（ｉｉｉ）「ＬＰＳ処理」（対照検体）には、ＬＰＳ溶液と１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地をそれぞれ１ｍＬずつ添加した。
（ｉｖ）「無処理」（対照検体）には、１質量％ＦＢＳ添加Ｅ－ＭＥＭ培地を２ｍＬ添加した。
（２）ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、細胞からトータルＲＮＡを抽出・精製した。
【0040】
６．ｍＲＮＡ発現量の測定（ＲＴ－ＰＣＲ）
細胞から抽出したＲＮＡをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。
細胞から抽出したＲＮＡをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。
【0041】
（リアルタイムＰＣＲ）
ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。なお、９５℃で６００秒を１サイクル、９５℃で１０秒および６０℃で３０秒のサイクルを計５０サイクルとして、リアルタイムＰＣＲを行った。使用したＰｒｉｍｅｒを下記に示す。
ＧＡＰＤＨ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ－３’
ＩＬ－６
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧ－３’
ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。なお、９５℃で６００秒を１サイクル、９５℃で１０秒および６０℃で３０秒のサイクルを計５０サイクルとして、リアルタイムＰＣＲを行った。使用したＰｒｉｍｅｒを下記に示す。
ＧＡＰＤＨ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ－３’
ＩＬ－６
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧ－３’
【0042】
［結果］
ＧＡＰＤＨの発現量で補正した「ＧＫ２処理」のＩＬ－６の相対発現量を１としたときの各検体の数値（相対発現量）を図１に示す（各検体及び「ＧＫ２処理」のみ図示）。なお、図１中のＩＬ－６の相対発現量は合計２回試験を行った平均を示している。
また、図１中の各種植物抽出物は下記のものを使用した。
・スギナ：丸善製薬社製、（製品名）スギナ抽出液ＢＧ
・セイヨウサンザシ：一丸ファルコス社製、（製品名）ファルコレックス セイヨウサンザシＢ
・シャクヤク：丸善製薬社製、（製品名）シャクヤク抽出液ＢＧ－ＪＣ
・ハマメリス：丸善製薬社製、（製品名）ハマメリス抽出液ＢＧ‐Ｊ
・シラカバ：丸善製薬社製、（製品名）シラカバ抽出液ＢＧ
・セージ：一丸ファルコス社製、（製品名）ファルコレックスセージＢ
・ドクダミ：一丸ファルコス社製、（製品名）ファルコレックスドクダミＢ
ＧＡＰＤＨの発現量で補正した「ＧＫ２処理」のＩＬ－６の相対発現量を１としたときの各検体の数値（相対発現量）を図１に示す（各検体及び「ＧＫ２処理」のみ図示）。なお、図１中のＩＬ－６の相対発現量は合計２回試験を行った平均を示している。
また、図１中の各種植物抽出物は下記のものを使用した。
・スギナ：丸善製薬社製、（製品名）スギナ抽出液ＢＧ
・セイヨウサンザシ：一丸ファルコス社製、（製品名）ファルコレックス セイヨウサンザシＢ
・シャクヤク：丸善製薬社製、（製品名）シャクヤク抽出液ＢＧ－ＪＣ
・ハマメリス：丸善製薬社製、（製品名）ハマメリス抽出液ＢＧ‐Ｊ
・シラカバ：丸善製薬社製、（製品名）シラカバ抽出液ＢＧ
・セージ：一丸ファルコス社製、（製品名）ファルコレックスセージＢ
・ドクダミ：一丸ファルコス社製、（製品名）ファルコレックスドクダミＢ
【0043】
図１の結果から分かるとおり、グリチルリチン酸ジカリウムに加えて、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ、又はセージの抽出物を加えた場合、植物抽出物を加えない「ＧＫ２処理」と比較して、ＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量が減少した。
一方、ドクダミの抽出物を加えた場合は、植物抽出物を加えない「ＧＫ２処理」と比較して、ＩＬ－６の相対発現量が増加した。
したがって、植物抽出物の中でも、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ、又はセージの抽出物を選択し、グリチルリチン酸ジカリウムに加えることによって、抗炎症効果が向上することが確認された。
一方、ドクダミの抽出物を加えた場合は、植物抽出物を加えない「ＧＫ２処理」と比較して、ＩＬ－６の相対発現量が増加した。
したがって、植物抽出物の中でも、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ、又はセージの抽出物を選択し、グリチルリチン酸ジカリウムに加えることによって、抗炎症効果が向上することが確認された。
【0044】
（実施例１－２）
実施例１－１において、植物抽出物をスギナ及び／又はセイヨウサンザシの植物抽出物とし、植物抽出物の終濃度を図２に示す濃度にしたことを除いては実施例１－１と同様に、抗炎症効果の評価を行った。
実施例１－１において、植物抽出物をスギナ及び／又はセイヨウサンザシの植物抽出物とし、植物抽出物の終濃度を図２に示す濃度にしたことを除いては実施例１－１と同様に、抗炎症効果の評価を行った。
【0045】
［結果］
ＧＡＰＤＨの発現量で補正した「ＧＫ２処理」のＩＬ－６の相対発現量を１としたときの、各検体の数値（相対発現量）を図２に示す（各検体及び「ＧＫ２処理」のみ図示）。なお、図２中のＩＬ－６相対発現量は合計２回試験を行った平均を示している。
ＧＡＰＤＨの発現量で補正した「ＧＫ２処理」のＩＬ－６の相対発現量を１としたときの、各検体の数値（相対発現量）を図２に示す（各検体及び「ＧＫ２処理」のみ図示）。なお、図２中のＩＬ－６相対発現量は合計２回試験を行った平均を示している。
【0046】
図２の結果から分かるとおり、グリチルリチン酸ジカリウムに加えて、スギナ及びセイヨウサンザシの抽出物の両方を加えた場合も、植物抽出物を加えない「ＧＫ２処理」と比較して、ＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量が減少した。特に、スギナ０．２質量ｐｐｍとセイヨウサンザシ０．２質量ｐｐｍの両方を加えた場合にＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量は最も減少した。また、たとえば、スギナを単独で０．２質量ｐｐｍまたはセイヨウサンザシを単独で０．２質量ｐｐｍ加えるよりも、スギナ０．０４質量ｐｐｍとセイヨウサンザシ０．０４質量ｐｐｍを組み合わせて加えた場合の方がＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量が減少しているように、スギナまたはセイヨウサンザシの抽出物を単独で加える場合よりも、スギナおよびセイヨウサンザシの抽出物の両方を組み合わせて加えた場合の方が、ＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量が減少することがわかった。
【0047】
（実施例１－３）
実施例１－１において、使用する植物抽出物を表１に示す３種の植物抽出物とし、ＧＫ２及び各植物抽出物の終濃度を表１に示す濃度にしたことを除いては実施例１－１と同様に、抗炎症効果の評価を行った。
実施例１－１において、使用する植物抽出物を表１に示す３種の植物抽出物とし、ＧＫ２及び各植物抽出物の終濃度を表１に示す濃度にしたことを除いては実施例１－１と同様に、抗炎症効果の評価を行った。
【0048】
［結果］
ＧＡＰＤＨの発現量で補正した「ＧＫ２処理」のＩＬ－６の相対発現量を１としたときの、各検体の数値（相対発現量）を下記表１に示す。なお、表１中のＩＬ－６相対発現量は合計２回試験を行った平均を示している。
ＧＡＰＤＨの発現量で補正した「ＧＫ２処理」のＩＬ－６の相対発現量を１としたときの、各検体の数値（相対発現量）を下記表１に示す。なお、表１中のＩＬ－６相対発現量は合計２回試験を行った平均を示している。
【0049】
【表1】
【0050】
表１の結果から分かるとおり、植物抽出物として、スギナ及びセイヨウサンザシの抽出物に加え、さらにシャクヤク、ハマメリス、シラカバ、又はセージの抽出物を加えても、植物抽出物を加えない「ＧＫ２処理」と比較して、ＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量が減少した。
【0051】
（実施例１－４）
本試験では、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｏｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｃｅ(以下、Ａ．ａ．という）由来ＬＰＳで細胞に炎症を惹起した細胞について、各種炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦ－α）のｍＲＮＡ発現量を測定することにより、本発明の抗炎症組成物の抗炎症効果を評価した。
具体的には、まず、グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）を含有するＧＫ２溶液、植物抽出物を含む植物抽出物溶液、細胞を刺激するＡ．ａ．由来ＬＰＳを含むＬＰＳ溶液、及びコントロール溶液をそれぞれ調製した。つづいて、上記調製した溶液の存在下で細胞の培養を行い、炎症性サイトカインの一種であるＩＬ－６およびＴＮＦ－αのｍＲＮＡ発現量を測定することによって、抗炎症効果の評価を行った。
なお、本試験では、対照検体として、ＧＫ２のみを適用しかつＬＰＳ刺激を行った「ＧＫ２処理」（植物抽出物なし）、ＬＰＳ刺激のみを行った「ＬＰＳ処理」（ＧＫ２及び植物抽出物なし）、およびＧＫ２及び植物抽出物を適用せずＬＰＳ刺激も行わない「無処理」（ＧＫ２、植物抽出物、及びＬＰＳ刺激なし）についても試験を行った。
また、細胞培養用培地は、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ－ＳＦＭ（１×）［＋］Ｌ－ＧｌｕｔａｍｉｎにＢｏｖｉｎｅ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ｅｘｔｒａｃｔ（終濃度：２５μｇ／ｍＬ）、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（終濃度：０．０５ｎｇ／ｍＬ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（終濃度：１００Ｕ／ｍＬ）、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（終濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した後、フィルター減菌したもの（以下、Ｋ－ＳＦＭ培地という）を使用した。
本試験では、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｏｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｃｅ(以下、Ａ．ａ．という）由来ＬＰＳで細胞に炎症を惹起した細胞について、各種炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦ－α）のｍＲＮＡ発現量を測定することにより、本発明の抗炎症組成物の抗炎症効果を評価した。
具体的には、まず、グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）を含有するＧＫ２溶液、植物抽出物を含む植物抽出物溶液、細胞を刺激するＡ．ａ．由来ＬＰＳを含むＬＰＳ溶液、及びコントロール溶液をそれぞれ調製した。つづいて、上記調製した溶液の存在下で細胞の培養を行い、炎症性サイトカインの一種であるＩＬ－６およびＴＮＦ－αのｍＲＮＡ発現量を測定することによって、抗炎症効果の評価を行った。
なお、本試験では、対照検体として、ＧＫ２のみを適用しかつＬＰＳ刺激を行った「ＧＫ２処理」（植物抽出物なし）、ＬＰＳ刺激のみを行った「ＬＰＳ処理」（ＧＫ２及び植物抽出物なし）、およびＧＫ２及び植物抽出物を適用せずＬＰＳ刺激も行わない「無処理」（ＧＫ２、植物抽出物、及びＬＰＳ刺激なし）についても試験を行った。
また、細胞培養用培地は、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ－ＳＦＭ（１×）［＋］Ｌ－ＧｌｕｔａｍｉｎにＢｏｖｉｎｅ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ｅｘｔｒａｃｔ（終濃度：２５μｇ／ｍＬ）、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（終濃度：０．０５ｎｇ／ｍＬ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（終濃度：１００Ｕ／ｍＬ）、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（終濃度：１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した後、フィルター減菌したもの（以下、Ｋ－ＳＦＭ培地という）を使用した。
【0052】
［方法］
１．グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）溶液の調製
ＧＫ２（丸善製薬社製）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）及び精製水がそれぞれ１質量％となるようにプロピレングリコールに溶解し、ＧＫ２原液を得た。このＧＫ２原液をＫ－ＳＦＭ培地で２５００倍に希釈することで、ＧＫ２溶液を調製した。
２．植物抽出物溶液の調製
ＧＫ２（丸善製薬社製）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）及び精製水がそれぞれ１質量％、植物抽出物が０．０５質量％または０．０１質量％となるようにプロピレングリコールに溶解し、植物抽出物原液を得た。この植物抽出物原液をＫ－ＳＦＭ培地で２５００倍に希釈することで、各種植物抽出物溶液を調製した。
３．ＬＰＳ溶液の調製
Ａ．ａ．由来のＬＰＳを、その濃度が２μｇ／ｍＬとなるようにＫ－ＳＦＭ培地で希釈し、ＬＰＳ溶液を調製した。
４．コントロール溶液の調製
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）及び精製水がそれぞれ１質量％となるようにプロピレングリコールに溶解し、さらにＫ－ＳＦＭ培地で２５００倍に希釈することで、コントロール溶液を調製した。
５．供試細胞の準備
１２ｗｅｌｌプレートに培地と不死化口腔粘膜上皮細胞：ＲＴ７を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２：５％、３７℃）で２４時間培養し、供試細胞とした。
１．グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）溶液の調製
ＧＫ２（丸善製薬社製）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）及び精製水がそれぞれ１質量％となるようにプロピレングリコールに溶解し、ＧＫ２原液を得た。このＧＫ２原液をＫ－ＳＦＭ培地で２５００倍に希釈することで、ＧＫ２溶液を調製した。
２．植物抽出物溶液の調製
ＧＫ２（丸善製薬社製）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）及び精製水がそれぞれ１質量％、植物抽出物が０．０５質量％または０．０１質量％となるようにプロピレングリコールに溶解し、植物抽出物原液を得た。この植物抽出物原液をＫ－ＳＦＭ培地で２５００倍に希釈することで、各種植物抽出物溶液を調製した。
３．ＬＰＳ溶液の調製
Ａ．ａ．由来のＬＰＳを、その濃度が２μｇ／ｍＬとなるようにＫ－ＳＦＭ培地で希釈し、ＬＰＳ溶液を調製した。
４．コントロール溶液の調製
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）及び精製水がそれぞれ１質量％となるようにプロピレングリコールに溶解し、さらにＫ－ＳＦＭ培地で２５００倍に希釈することで、コントロール溶液を調製した。
５．供試細胞の準備
１２ｗｅｌｌプレートに培地と不死化口腔粘膜上皮細胞：ＲＴ７を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２：５％、３７℃）で２４時間培養し、供試細胞とした。
【0053】
６．ＬＰＳによる炎症誘導および検体暴露、ＲＮＡの抽出
（１）供試細胞から培地を除いたのち、新たに培地を５００μＬずつ添加し、３７℃で４８時間培養した。培地を除去した後、調製したＧＫ２溶液、植物抽出物溶液、ＬＰＳ溶液、及びコントロール溶液を、下記（ｉ）～（ｉｖ）のとおり全量１ｍＬになるよう添加し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２：５％、３７℃）内で３時間静置後、細胞を回収した。
（ｉ）各検体（植物抽出物含有検体）には、各種植物抽出物溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ５００μＬずつ添加した。ＧＫ２及び植物抽出物の終濃度は表２に示す濃度とした。
（ｉｉ）「ＧＫ２処理」（対照検体）には、ＧＫ２溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ５００μＬずつ添加した。
（ｉｉｉ）「ＬＰＳ処理」（対照検体）には、ＬＰＳ溶液とコントロール溶液をそれぞれ５００μＬずつ添加した。
（ｉｖ）「無処理」（対照検体）には、Ｋ－ＳＦＭ培地とコントロール溶液をそれぞれ５００μＬずつ添加した。
（２）ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、細胞からトータルＲＮＡを抽出・精製した。
（１）供試細胞から培地を除いたのち、新たに培地を５００μＬずつ添加し、３７℃で４８時間培養した。培地を除去した後、調製したＧＫ２溶液、植物抽出物溶液、ＬＰＳ溶液、及びコントロール溶液を、下記（ｉ）～（ｉｖ）のとおり全量１ｍＬになるよう添加し、ＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２：５％、３７℃）内で３時間静置後、細胞を回収した。
（ｉ）各検体（植物抽出物含有検体）には、各種植物抽出物溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ５００μＬずつ添加した。ＧＫ２及び植物抽出物の終濃度は表２に示す濃度とした。
（ｉｉ）「ＧＫ２処理」（対照検体）には、ＧＫ２溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ５００μＬずつ添加した。
（ｉｉｉ）「ＬＰＳ処理」（対照検体）には、ＬＰＳ溶液とコントロール溶液をそれぞれ５００μＬずつ添加した。
（ｉｖ）「無処理」（対照検体）には、Ｋ－ＳＦＭ培地とコントロール溶液をそれぞれ５００μＬずつ添加した。
（２）ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、細胞からトータルＲＮＡを抽出・精製した。
【0054】
７．ｍＲＮＡ発現量の測定
（ＲＴ－ＰＣＲ）
細胞から抽出したＲＮＡをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ＲＴ－ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを合成した。
（ＲＴ－ＰＣＲ）
細胞から抽出したＲＮＡをＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ＲＴ－ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを合成した。
【0055】
（リアルタイムＰＣＲ）
ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。なお、９５℃で６０秒を１サイクル、９５℃で１０秒および６０℃で３０秒のサイクルを計４５サイクルとして、リアルタイムＰＣＲを行った。使用したＰｒｉｍｅｒを下記に示す。
・ＧＡＰＤＨ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ－３’
・ＩＬ－６
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧ－３’
・Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－α
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＡＣＡＡＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＡＣＡＴ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＴＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＧＴＣＡＧＴＡＴ－３’
ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。なお、９５℃で６０秒を１サイクル、９５℃で１０秒および６０℃で３０秒のサイクルを計４５サイクルとして、リアルタイムＰＣＲを行った。使用したＰｒｉｍｅｒを下記に示す。
・ＧＡＰＤＨ
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ－３’
・ＩＬ－６
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧ－３’
・Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－α
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＡＣＡＡＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＡＣＡＴ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＴＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＧＴＣＡＧＴＡＴ－３’
【0056】
［結果］
ＧＡＰＤＨの発現量で補正した「ＧＫ２処理」のＩＬ－６の相対発現量を１としたときの各検体の数値（相対発現量）を表２に示す。なお、表２中のＩＬ－６の相対発現量は合計３回試験を行った平均を示している。
また、ＧＡＰＤＨの発現量で補正した「ＧＫ２処理」のＴＮＦ－αの相対発現量を１としたときの各検体の数値（相対発現量）を表３に示す。なお、表３中のＴＮＦ－αの相対発現量は合計５回試験を行った平均を示している。
ＧＡＰＤＨの発現量で補正した「ＧＫ２処理」のＩＬ－６の相対発現量を１としたときの各検体の数値（相対発現量）を表２に示す。なお、表２中のＩＬ－６の相対発現量は合計３回試験を行った平均を示している。
また、ＧＡＰＤＨの発現量で補正した「ＧＫ２処理」のＴＮＦ－αの相対発現量を１としたときの各検体の数値（相対発現量）を表３に示す。なお、表３中のＴＮＦ－αの相対発現量は合計５回試験を行った平均を示している。
【0057】
【表2】
【0058】
【表3】
【0059】
表２、３の結果から分かるとおり、グリチルリチン酸ジカリウムに加えて、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ、又はセージの抽出物を加えた場合、植物抽出物を加えない「ＧＫ２処理」と比較して、ＩＬ－６やＴＮＦ－αのｍＲＮＡ発現量が減少した。
したがって、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ、又はセージの抽出物を選択し、グリチルリチン酸ジカリウムに加えることによって、抗炎症効果が向上することが確認された。
したがって、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ、又はセージの抽出物を選択し、グリチルリチン酸ジカリウムに加えることによって、抗炎症効果が向上することが確認された。
【0060】
実施例２：ＴＮＦ-αのタンパク質発現量を指標とした抗炎症効果の評価
（実施例２－１）
本試験では、Ｐ．ｇ．由来ＬＰＳで細胞に炎症を惹起した細胞について、炎症性サイトカインの１種であるＴＮＦ-αのタンパク質発現量を下記のＥＬＩＳＡ法で測定することにより、本発明の抗炎症組成物の抗炎症効果を評価した。
（実施例２－１）
本試験では、Ｐ．ｇ．由来ＬＰＳで細胞に炎症を惹起した細胞について、炎症性サイトカインの１種であるＴＮＦ-αのタンパク質発現量を下記のＥＬＩＳＡ法で測定することにより、本発明の抗炎症組成物の抗炎症効果を評価した。
【0061】
［方法］
１．１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に１０ｎＭ ＰＭＡを加え、ＴＨＰ－１細胞を１０５個／ｗｅｌｌずつ２４ｗｅｌｌプレートに播種して７日間培養し、マクロファージ様に分化誘導した。
２．分化誘導を確認した後、１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、２４時間培養した。
３．後述の被検体をＲＰＭＩ１６４０培地で５０００倍希釈した希釈被検体液１ｍＬを細胞に添加し、２時間後に希釈被検体液を除去した。その後、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し、Ｐ．ｇ．由来ＬＰＳ（０．２μｇ／ｍＬ、１質量％ＦＢＳ添加培地）で細胞を刺激した。
４．刺激６時間後に上清を回収してＥＬＩＳＡ法にてＴＮＦ-αタンパク質の量を測定した。
１．１０質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に１０ｎＭ ＰＭＡを加え、ＴＨＰ－１細胞を１０５個／ｗｅｌｌずつ２４ｗｅｌｌプレートに播種して７日間培養し、マクロファージ様に分化誘導した。
２．分化誘導を確認した後、１質量％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、２４時間培養した。
３．後述の被検体をＲＰＭＩ１６４０培地で５０００倍希釈した希釈被検体液１ｍＬを細胞に添加し、２時間後に希釈被検体液を除去した。その後、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し、Ｐ．ｇ．由来ＬＰＳ（０．２μｇ／ｍＬ、１質量％ＦＢＳ添加培地）で細胞を刺激した。
４．刺激６時間後に上清を回収してＥＬＩＳＡ法にてＴＮＦ-αタンパク質の量を測定した。
【0062】
炎症抑制率は下記の式を用いて算出し、下記「ＧＫ２処理」の炎症抑制率を１．０とした場合の各検体における炎症抑制率を求めた。
「ＧＫ２処理」の炎症抑制率＝（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「ＧＫ２処理」のＴＮＦ-α量）／（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「無処理」のＴＮＦ-α量）
各検体における炎症抑制率＝｛（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－各検体のＴＮＦ-α量）／（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「無処理」のＴＮＦ-α量）｝／「ＧＫ２処理」の炎症抑制率
式中、「ＬＰＳ処理のＴＮＦ-α量」とは、上記方法３．において、希釈被検体液の代わりに液体培地を用いて試験を行った際のＴＮＦ-α量を示す。
また、「無処理のＴＮＦ-α量」とは、ＬＰＳ刺激を行わずに、代わりに１質量％ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地で６時間培養した際の上清を用いて試験を行った際のＴＮＦ-α量を示す。
「ＧＫ２処理」の炎症抑制率＝（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「ＧＫ２処理」のＴＮＦ-α量）／（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「無処理」のＴＮＦ-α量）
各検体における炎症抑制率＝｛（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－各検体のＴＮＦ-α量）／（「ＬＰＳ処理」のＴＮＦ-α量－「無処理」のＴＮＦ-α量）｝／「ＧＫ２処理」の炎症抑制率
式中、「ＬＰＳ処理のＴＮＦ-α量」とは、上記方法３．において、希釈被検体液の代わりに液体培地を用いて試験を行った際のＴＮＦ-α量を示す。
また、「無処理のＴＮＦ-α量」とは、ＬＰＳ刺激を行わずに、代わりに１質量％ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地で６時間培養した際の上清を用いて試験を行った際のＴＮＦ-α量を示す。
【0063】
［被検体］
・植物抽出物含有検体：ＧＫ２ １質量％＋ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）＋植物抽出物（ＧＫ２の終濃度が２．０質量ｐｐｍ、植物抽出物の終濃度が０．０５質量ｐｐｍまたは０．０１質量ｐｐｍになるように添加）
・ＧＫ２処理：ＧＫ２ １質量％＋ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）（ＧＫ２の終濃度が２．０質量ｐｐｍになるように添加）
・植物抽出物含有検体：ＧＫ２ １質量％＋ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）＋植物抽出物（ＧＫ２の終濃度が２．０質量ｐｐｍ、植物抽出物の終濃度が０．０５質量ｐｐｍまたは０．０１質量ｐｐｍになるように添加）
・ＧＫ２処理：ＧＫ２ １質量％＋ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（日光ケミカルズ社製、ＨＣＯ－１００）（ＧＫ２の終濃度が２．０質量ｐｐｍになるように添加）
【0064】
［結果］
結果を表２に示す。なお、用いた植物抽出物は下記のとおりである。
・スギナ：丸善製薬社製、（製品名）スギナ抽出液ＢＧ
・セイヨウサンザシ：一丸ファルコス社製、（製品名）ファルコレックス セイヨウサンザシＢ
・シャクヤク：丸善製薬社製、（製品名）シャクヤク抽出液ＢＧ－ＪＣ
・ドクダミ：一丸ファルコス社製、（製品名）ファルコレックスドクダミＢ
・シナノキ：丸善製薬社製、（製品名）シナノキ抽出液ＢＧ－Ｊ
・チャ：丸善製薬社製、（製品名）緑茶抽出液ＢＧ
・ユリ：丸善製薬社製、（製品名）ユリ抽出液ＢＧ
・海藻：一丸ファルコス社製、（製品名）ＩＰＦ－１００Ｋ
結果を表２に示す。なお、用いた植物抽出物は下記のとおりである。
・スギナ：丸善製薬社製、（製品名）スギナ抽出液ＢＧ
・セイヨウサンザシ：一丸ファルコス社製、（製品名）ファルコレックス セイヨウサンザシＢ
・シャクヤク：丸善製薬社製、（製品名）シャクヤク抽出液ＢＧ－ＪＣ
・ドクダミ：一丸ファルコス社製、（製品名）ファルコレックスドクダミＢ
・シナノキ：丸善製薬社製、（製品名）シナノキ抽出液ＢＧ－Ｊ
・チャ：丸善製薬社製、（製品名）緑茶抽出液ＢＧ
・ユリ：丸善製薬社製、（製品名）ユリ抽出液ＢＧ
・海藻：一丸ファルコス社製、（製品名）ＩＰＦ－１００Ｋ
【0065】
【表4】
【0066】
表４の結果から分かるとおり、グリチルリチン酸ジカリウムに加えて、スギナ、セイヨウサンザシ、又はシャクヤクの抽出物を加えた場合、植物抽出物を加えない「ＧＫ２処理」と比較して、炎症抑制率が高い結果となった。
一方、植物抽出物であっても、ドクダミ、シナノキ、チャ、ユリ、又は海藻の抽出物を加えた場合は、植物抽出物を加えない「ＧＫ２処理」と比較して、炎症抑制率が低い結果となった。
一方、植物抽出物であっても、ドクダミ、シナノキ、チャ、ユリ、又は海藻の抽出物を加えた場合は、植物抽出物を加えない「ＧＫ２処理」と比較して、炎症抑制率が低い結果となった。
【0067】
（実施例２－２）
本試験では、Ａ．ａ．由来ＬＰＳで細胞に炎症を惹起した細胞について、炎症性サイトカインの１種であるＴＮＦ-αのタンパク質発現量を下記のＥＬＩＳＡ法で測定することにより、本発明の抗炎症組成物の抗炎症効果を評価した。
なお、グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）溶液、植物抽出物溶液、ＬＰＳ溶液、コントロール溶液および供試細胞は、上記実施例１－４と同様に調製したものを使用した。
本試験では、Ａ．ａ．由来ＬＰＳで細胞に炎症を惹起した細胞について、炎症性サイトカインの１種であるＴＮＦ-αのタンパク質発現量を下記のＥＬＩＳＡ法で測定することにより、本発明の抗炎症組成物の抗炎症効果を評価した。
なお、グリチルリチン酸ジカリウム（ＧＫ２）溶液、植物抽出物溶液、ＬＰＳ溶液、コントロール溶液および供試細胞は、上記実施例１－４と同様に調製したものを使用した。
【0068】
［方法］
１．供試細胞から培地を除いたのち、その後ＧＫ２溶液、植物抽出物溶液、ＬＰＳ溶液、コントロール溶液を、下記（ｉ）～（ｉｖ）のとおり添加した。
（ｉ）各検体（植物抽出物含有検体）には、各種植物抽出物溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加した。ＧＫ２及び植物抽出物の終濃度は表５に示す濃度とした。
（ｉｉ）「ＧＫ２処理」（対照検体）には、ＧＫ２溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加した。
（ｉｉｉ）「ＬＰＳ処理」（対照検体）には、ＬＰＳ溶液とコントロール溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加した。
（ｉｖ）「無処理」（対照検体）には、Ｋ－ＳＦＭ培地とコントロール溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加した。
２．各検体をＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２：５％、３７℃）内に静置し、６時間後に細胞および上清を回収した。
３．Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－ａｌｐｈａ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてメーカー指定の手順に従い実施した。
４．炎症抑制率は上記実施例２－１と同様に求めた。
１．供試細胞から培地を除いたのち、その後ＧＫ２溶液、植物抽出物溶液、ＬＰＳ溶液、コントロール溶液を、下記（ｉ）～（ｉｖ）のとおり添加した。
（ｉ）各検体（植物抽出物含有検体）には、各種植物抽出物溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加した。ＧＫ２及び植物抽出物の終濃度は表５に示す濃度とした。
（ｉｉ）「ＧＫ２処理」（対照検体）には、ＧＫ２溶液とＬＰＳ溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加した。
（ｉｉｉ）「ＬＰＳ処理」（対照検体）には、ＬＰＳ溶液とコントロール溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加した。
（ｉｖ）「無処理」（対照検体）には、Ｋ－ＳＦＭ培地とコントロール溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加した。
２．各検体をＣＯ２インキュベーター（ＣＯ２：５％、３７℃）内に静置し、６時間後に細胞および上清を回収した。
３．Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－ａｌｐｈａ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてメーカー指定の手順に従い実施した。
４．炎症抑制率は上記実施例２－１と同様に求めた。
【0069】
［結果］
結果を表５に示す。なお、用いた植物抽出物は実施例２－１と同様である。
結果を表５に示す。なお、用いた植物抽出物は実施例２－１と同様である。
【0070】
【表5】
【0071】
表５の結果から分かるとおり、グリチルリチン酸ジカリウムに加えて、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ、またはセージの抽出物を加えた場合、植物抽出物を加えない「ＧＫ２処理」と比較して、炎症抑制率が高い結果となった。
【0072】
以上の実施例の結果より、グリチルリチン酸又はその塩と、スギナ、セイヨウサンザシ、シャクヤク、ハマメリス、シラカバ及びセージの抽出物からなる群より選ばれる少なくとも１つの抽出物を含有する組成物は、抗炎症効果を有することがわかった。
【図1】
【図2】