特許 7596304 ゲル化マメ科タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-11-29

(45)【発行日】2024-12-09

(54)【発明の名称】ゲル化マメ科タンパク質

(51)【国際特許分類】

   A23J 3/14 20060101AFI20241202BHJP

   A23J 1/14 20060101ALI20241202BHJP

   A61K 36/48 20060101ALI20241202BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20241202BHJP

   A61P 3/02 20060101ALI20241202BHJP

【ＦＩ】

A23J3/14

A23J1/14

A61K36/48

A61K9/16

A61P3/02

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2021564680

(86)(22)【出願日】2020-04-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-05

(86)【国際出願番号】 FR2020050726

(87)【国際公開番号】W WO2020221978

(87)【国際公開日】2020-11-05

【審査請求日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】1904521

(32)【優先日】2019-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】591169401

【氏名又は名称】ロケット フレール

【氏名又は名称原語表記】ＲＯＱＵＥＴＴＥ ＦＲＥＲＥＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100090398

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 美千栄

(74)【代理人】

【識別番号】100090387

【弁理士】

【氏名又は名称】布施 行夫

(72)【発明者】

【氏名】ラロシュ、クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】カルモン、ルシル

【審査官】村松 宏紀

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５１８１９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／００１７３１０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００８／０２２６８１０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開平１１－３０８９６９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ２３Ｊ、Ａ２３Ｌ、Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

マメ科植物タンパク質組成物であって、前記マメ科植物がエンドウマメ植物であり、
試験Ａによる前記マメ科植物タンパク質組成物のゲル強度が２００Ｐａ超であり、
前記マメ科植物タンパク質組成物は、固形分の総重量に対して、固形分の８０重量％超のタンパク質含有量を有し、
前記マメ科植物タンパク質組成物は、２０マイクロメートル未満の粒径Ｄ９０を有することを特徴とし、
前記試験Ａは以下の工程；
１）固形分１５％±２％及びｐＨ７で、水中で前記タンパク質組成物の６０℃±２℃での可溶化、
２）６０℃±２℃で５分間撹拌、
３）２０℃±２℃までの冷却、及び３５０ｒｐｍで２４時間撹拌、
４）同心円筒を備える制御された応力レオメータを用いた懸濁の実施、
５）以下の温度プロファイルを適用することによる弾性率Ｇ’及び粘性弾性率Ｇ”の測定：
ａ．フェーズ１：２０℃±２℃での安定化、及び２０℃±２℃の温度から８０℃±２℃の温度への１０分間の加熱後のパラメータＧ’１の測定、
ｂ．フェーズ２：８０℃±２℃の温度で１１０分間安定化、
ｃ．フェーズ３：８０℃±２℃の温度から２０℃±２℃の温度まで３０分間冷却、及び２０℃±２℃での安定化後のＧ’２の測定、
６）Ｇ’２－Ｇ’１に等しい前記ゲル強度の計算、
を含む、マメ科植物タンパク質組成物。

【請求項2】

前記マメ科植物タンパク質組成物が、エンドウマメタンパク質単離物である、請求項１に記載のタンパク質組成物。

【請求項3】

試験Ｂによる、３０～６５％の範囲の溶解度を有することを特徴とし、
前記試験Ｂは、１５０ｇの水を、磁気撹拌棒で撹拌しながら２０℃±２℃で４００ｍＬビーカーに入れ、前記ビーカーに前記タンパク質組成物を５ｇ添加して混合物とし、必
要に応じて前記混合物のｐＨを７に調整し、前記混合物の水が２００ｇになるように水を添加し、前記混合物を１０００ｒｐｍで３０分間混合及び３０００ｇで１５分間遠心分離し、前記混合物の上清を２５ｇ回収し結晶皿に入れ、前記結晶皿を１０３℃±２℃のオーブンに１時間置き、前記結晶皿を乾燥器内に置いて周囲温度に冷却したとき、以下の式：

【数1】

［式中、Ｐ＝前記タンパク質組成物の重量（ｇ）＝５ｇ、ｍ１＝乾燥後の前記結晶皿の重量（ｇ）、ｍ２＝空の前記結晶皿の重量（ｇ）、Ｐ１＝収集した前記上清の重量（ｇ）＝２５ｇ］
により前記溶解度を計算するものである、請求項１又は２に記載のタンパク質組成物。

【請求項4】

請求項１～３に記載のタンパク質組成物の製造方法であって、
１）エンドウマメを準備する工程と、
２）前記エンドウマメを粉砕し、水性懸濁液を生成する工程と、
３）遠心力を用いて不溶性画分を分離する工程と、
４）５５℃＋／－２℃～６５℃＋／－２℃の温度で、３．５分～４．５分間、等電ｐＨで加熱することによって、前記タンパク質を凝固させる工程と、
５）凝固した前記タンパク質フロックを遠心分離により回収する工程と、
６）ｐＨを６＋／－０．５～９＋／－０．５の値に調整する工程と、
７）任意選択的に、熱処理する工程と、
８）凝固した前記タンパク質フロックを乾燥させる工程と、
９）ジェットミルを使用して凝固した前記タンパク質フロックを粉砕し、乾燥させて、２０マイクロメートル未満の粒径Ｄ９０を得るようにする工程と、
を含むことを特徴とする、方法。

【請求項5】

工程７における前記熱処理が、１００℃＋／－２℃～１６０℃＋／－２℃、０．０１秒～３秒のプロトコルからなり、直後に冷却されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

工程８における前記乾燥が、霧化によって実施されることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。

【請求項7】

工程９における前記粉砕が、対向ジェットミルを使用して実施されることを特徴とする、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記試験Ａによる前記タンパク質組成物のゲル強度が、工程８において乾燥された前記タンパク質フロックのゲル強度の少なくとも１５０％であることを特徴とする、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

食品又は医薬製品における、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項10】

前記食品又は医薬製品が、４～９のｐＨを有する、請求項９に記載の使用。

【請求項11】

前記製品が肉又は魚代替物であることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、植物性タンパク質、特にマメ科植物タンパク質単離物、更に特にエンドウマメタンパク質単離物の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトの１日当たりのタンパク質必要量は、食物摂取量のうちの１２～２０％である。これらのタンパク質は、動物由来の製品（肉、魚、卵、乳製品）によっても、植物由来の食品（穀物、マメ科植物、海藻）によっても得られる。

【0003】

しかしながら、先進国では、タンパク質摂取は主に動物由来のタンパク質によりなされる。しかし、数多くの研究により、動物由来のタンパク質を過剰摂取し、植物性タンパク質の摂取が不足することは、がん及び心血管疾患を増加させる原因の１つであることが示されている。

【0004】

更に、動物性タンパク質は、特に乳又は卵からのタンパク質に関してアレルゲン性の点、及び集約農業の有害な影響に関連して環境上の点の両方で、多くの欠点を有する。

【0005】

したがって、有益な栄養特性及び機能特性を有するが、動物由来の化合物の欠点は有さない、植物由来の化合物に対し、製造業者からの需要が高まっている。

【0006】

大豆は、動物性タンパク質に代わる主要な植物である。しかしながら、大豆の使用は、特定の欠点を呈する。大豆種子の起源は、大半の場合、遺伝子組み換え農産物（ＧＭＯ）由来ではなく、そのタンパク質の産生は、溶媒を使用する脱油工程を介して進行する。

【0007】

１９７０年代以来、特に欧州、主にフランスでは、特にエンドウマメを含む豆類植物は、動物及びヒトの食物消費のための動物タンパク質に対する代替的なタンパク質資源として劇的に発展を遂げている。エンドウマメは約２７重量％のタンパク質を含有する。用語「エンドウマメ」は、本明細書においてその最も広く許容される使用法により考慮され、特に、その品種の通常の使用目的（ヒトの食品、動物用飼料及び／又は他の用途）に関わらず、「丸エンドウマメ」の全ての野生品種、並びに「丸エンドウマメ」及び「しわのあるエンドウマメ」の全ての変異品種を含む。これらの種子は、非ＧＭＯであり、溶媒を使用する脱油工程を必要としない。

【0008】

エンドウマメタンパク質、主にエンドウマメグロブリンは、長年にわたって工業的に抽出及び利用されてきた。エンドウマメタンパク質を抽出するための方法の一例として、欧州特許第１４００５３７号に言及することができる。このプロセスでは、エンドウ粉を得るために、種子を水の非存在下で粉砕して（「乾式製粉」と呼ばれるプロセス）。次いで、この粉を水に懸濁させて、タンパク質を抽出する。マメ科植物タンパク質を抽出するための他の方法も、米国特許第４０６０２０３（Ａ）号、仏特許２８８９４１６（Ａ１）号、及び国際公開第２０１１／１２４８６２（Ａ１）号に記載されている。日本特許第５５－１３１３５１（Ａ）号は、微粒子の形態の粗挽き粉が水溶液中で作製され、酸性ｐＨに上記水溶液を調整することによってタンパク質画分が沈殿する、大豆タンパク質単離物の製造を記載している。次いで、沈殿したタンパク質溶液は、大豆タンパク質単離物を形成するために、熱処理される前に中和され、任意選択的に霧化される。

【0009】

しかしながら、マメ科植物タンパク質、特にエンドウマメタンパク質は、大豆のゲル化特性に著しく劣るゲル化特性を有する。「Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ ｇｅｌｌｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（流動学的蛍光法を用いる野菜タンパク質のゲル化評価）」（Ｂａｓｔｉｓｔａａら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３６（２００５）１３５～１４３，２００５）に示されるように、エンドウマメ及びウチワマメタンパク質は、大豆タンパク質よりもゲル化が低いとして提示されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、ゲル化力又はゲル強度の改善を呈する、マメ科植物タンパク質、特にマメ科植物タンパク質単離物、更に特にエンドウマメタンパク質単離物を得ることが有利である。これらのマメ科植物タンパク質は、食品又は医薬製品に組み込まれ得る。これらの生成物は、４～９の範囲の非常に変化し易いｐＨ値を有し得る。しかしながら、肉又は魚代替物などの多くの用途では、これらのタンパク質は、「中性ｐＨ」、すなわち約６～約８の範囲のｐＨで使用される。例として、かかるタンパク質が、ゲル化後に他の質感のタンパク質を共に接着させるのに有用である肉又は魚代替物を挙げることができる。したがって、改善された機能特性として、中性ｐＨでのより高いゲル強度を示す新規なマメ科植物タンパク質を提供できることは、特に有益である。

【0011】

タンパク質単離物及び濃縮物粒子のサイズを低減し、その結果得られた組成物の機能特性を研究する試みは、既に行われている。例えば、Ｓｕｎら、（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ ｇｒｉｎｄｉｎｇ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｌｌｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（超微細研削に基づく粒径の減少：ホエイタンパク質濃縮物の構造、レオロジー、及びゲル化特性への影響））、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１８６巻、２０１６、６９～７６頁）は、ナノボールミルを使用した乳清タンパク質濃縮物の粉砕を記載している。粒径、様々なｐＨ値におけるゲル強度、赤外技術を用いた着色及び構造を含む、タンパク質の様々な特性が研究されている。ゲル強度に関しては、粉砕前のタンパク質と比較して、粉砕は、酸性ｐＨ（４．５）でより高いゲル強度を有し、中性（６．５）及び塩基性（８．５）ｐＨでより低いゲル強度を有する、タンパク質を含有するタンパク質組成物をもたらす。

【0012】

Ｈａｙａｋａｗａら、（Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｊｅｔ Ｍｉｌｌ Ｇｒｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｏｗｄｅｒｓ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ（タンパク質粉末のジェットミル粉砕による極微粒子化及び疎水性に及ぼす影響））、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第５８巻５号、１９９３、１０２６～１０２９頁）は、ジェットミルを使用した、カゼイン及び卵白型タンパク質並びに大豆繊維の極微粒子化を記載している。この物品は、マメ科植物タンパク質を記載していない。タンパク質のゲル強度の向上も記載していない。

【0013】

Ｌｉｕら、（Ｂａｌｌ－ｍｉｌｌｉｎｇ ｃｈａｎｇｅｄ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＳＰＩ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｌｄ－ｓｅｔ ｇｅｌｓ（ボールミル粉砕によるＳＰＩ及びその冷間硬化ゲルの物理化学的特性の変更））、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１９５巻、２０１７、１５８～１６５頁）は、粒径（８０μｍの平均サイズ）をわずかに減少させるために、遊星ＢＭ及びミキサーミルＭＭ４００などのボールミルの大豆タンパク質単離物への使用を記載している。しかしながら、酸性条件下（グルコ－δ－ラクトンの存在下）でのこの単離物のゲル強度が、ミキサーミルＭＭ４００などのミルを使用して粉砕することによって増加させることができるときでも、この増加は非常に低いままである（最大で約３０％の増加）。更に、遊星ＢＭなどのミルを用いた粉砕では、観察されたゲル強度に差がなかった。更に、この刊行物は、中性ｐＨで使用されるタンパク質のゲル強度を調査していない。

【0014】

発明の概要

【0015】

本発明の第１の態様によると、マメ科植物タンパク質組成物であって、特にエンドウマメ、ウチワマメ、及びファバマメから選択されるマメ科植物が提案され、試験Ａによるタンパク質組成物のゲル強度が、２００Ｐａ超、好ましくは２５０Ｐａ超、更により好ましくは３００Ｐａ超、最も好ましくは３５０Ｐａ超であることを特徴とする、マメ科植物タンパク質組成物である。好ましくは、マメ科植物タンパク質組成物は、マメ科植物タンパク質単離物であり、より好ましくはエンドウマメタンパク質単離物である。

【0016】

別の態様によると、本発明によるタンパク質組成物の製造方法が提示され、該方法は、以下の工程を含むことを特徴とする：
１）好ましくはエンドウマメ、ウチワマメ、及びファバマメから選択されるマメ科植物種子を準備する工程、
２）種子を粉砕し、水性懸濁液を生成する工程、
３）遠心力を用いて不溶性画分を分離する工程、
４）５５℃＋／－２℃～６５℃＋／－２℃、好ましくは６０℃＋／－２℃の温度で、３．５分～４．５分、好ましくは４分間、等電ｐＨで加熱することによって、タンパク質を凝固させる工程、
５）凝固したタンパク質フロックを遠心分離により回収する工程、
６）ｐＨを６＋／－０．５～９＋／－０．５の値に調整する工程、
７）任意選択的に、熱処理工程、
８）凝固したタンパク質フロックを乾燥させる工程、
９）ジェットミルを使用して凝固したタンパク質フロックを粉砕し、乾燥させて、２０マイクロメートル未満、好ましくは１５マイクロメートル未満、更により好ましくは１０マイクロメートル未満の粒径Ｄ９０を得る工程。

【0017】

本発明の最後の態様によれば、本発明によるマメ科植物タンパク質組成物、好ましくはエンドウマメ、ウチワマメ、及びファバマメから選択されるマメ科植物タンパク質単離物、更により好ましくは、エンドウマメタンパク質単離物の、食品又は医薬製品における工業用途、特に動物用飼料及びヒトの食品用途が提案される。

【0018】

本発明は、以下の実施例によって更に良好に理解されるであろう。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明の第１の態様によれば、マメ科植物タンパク質組成物であって、特にエンドウマメ、ウチワマメ、及びファバマメから選択されるマメ科植物が提案され、試験Ａによるタンパク質組成物のゲル強度が、２００Ｐａ超、好ましくは２５０Ｐａ超、更により好ましくは３００Ｐａ超、最も好ましくは３５０Ｐａ超であることを特徴とする、マメ科植物タンパク質組成物である。マメ科植物は、最も好ましくはエンドウマメである。例として、試験Ａによるタンパク質組成物のゲル強度は、４５０Ｐａ未満、例えば、４００Ｐａ未満であり得る。好ましくは、マメ科植物タンパク質組成物は、マメ科植物タンパク質単離物であり、より好ましくはエンドウマメタンパク質単離物である。

【0020】

用語「タンパク質組成物」は、抽出及び精製によって得られる組成物を意味するものとして本特許出願において理解されるべきであり、この組成物は、ペプチド結合を介して一緒に連結されたアミノ酸残基の配列からなる１つ以上のポリペプチド鎖から形成されるタンパク質高分子を意味するものとして理解されるべきである。エンドウマメタンパク質の特定の文脈において、本発明は、より詳細には、グロブリン（エンドウマメタンパク質の約５０～６０％）に関する。エンドウマメグロブリンは、主にレグミン、ビシリン及びコンビシリンの３種類のサブファミリーに分類される。

【0021】

「マメ科の植物」又は「マメ科植物」は、本出願において、マメ目の双子葉植物の科を意味することが理解されるであろう。マメ科は、種の数がラン科及びキク科に次いで３番目に多い顕花植物科である。マメ科には約７６５属、１９，５００種超が含まれる。大豆、インゲンマメ、エンドウマメ、ヒヨコマメ、ファバマメ、ナンキンマメ、栽培レンズマメ、栽培アルファルファ、各種クローバ、ソラマメ、イナゴマメ、カンゾウ、及びウチワマメなどの、いくつかのマメ科植物は、重要な作物植物である。

【0022】

用語「ゲル化力」は、ゲル又はネットワークを形成するためのタンパク質組成物の能力から成り、粘度を増加させ、液体状態と固体状態との間の物質の状態を生成する機能特性を意味する。用語「ゲル強度」も使用されてもよい。ゲル化力を定量化するために、このネットワークを生成し、その強度を評価する必要がある。この定量を行うために、本発明では、試験Ａを使用し、以下それについて説明する。

【0023】

１）固形分１５％＋／－２％及びｐＨ７で、水中で試験したタンパク質組成物の６０℃＋／－２℃での可溶化
２）６０℃＋／－２℃で５分間撹拌
３）２０℃＋／－２℃までの冷却、及び３５０ｒｐｍで２４時間撹拌
４）同心円筒を備える制御された応力レオメータを用いた懸濁の実施
５）以下の温度プロファイルを適用することによる弾性率Ｇ’及び粘性弾性率Ｇ”の測定：
ａ．フェーズ１：２０℃＋／－２℃での安定化、及び２０℃＋／－２℃の温度から８０℃＋／－２℃の温度への１０分間の加熱後のパラメータＧ’１の測定、
ｂ．フェーズ２：８０℃＋／－２℃の温度で１１０分間安定化、
ｃ．フェーズ３：８０℃＋／－２℃の温度から２０℃＋／－２℃の温度まで３０分間冷却、及び２０℃＋／－２℃での安定化後のＧ’２の測定、
６）Ｇ’２－Ｇ’１に等しいゲル化力の計算。

【0024】

好ましい方法では、制御応力レオメータは、同心円筒型のスピンドルを有するモデルＤＨＲ２（ＴＡ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及びＭＣＲ３０１（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ）から選択される。これらはペルチェ効果に基づく温度調節システムを備えている。高温での蒸発の問題を回避するために、液体パラフィンを試料の上に添加する。

【0025】

本発明の目的のために、「レオメータ」は、流体又はゲルのレオロジーに関する測定値を得るための試験用機械である。レオメータは、試料に力を印加する。一般的に、特徴的な小さな寸法（ロータの非常に小さい機械的慣性）に関して、レオメータは、印加力に応答する、液体、ゲル、懸濁液、ペーストなどの機械的特性の基本調査を可能にする。

【0026】

いわゆる「制御応力」モデルは、正弦波応力（振動モード）の印加によって、特に時間（又は角速度ω）及び温度に依存する物質の固有粘弾性値を判定することができる。具体的には、このタイプのレオメータは、複素弾性率Ｇ^＊へのアクセスを提供し、それ自体が弾性部の弾性率Ｇ’又は粘性部の弾性率Ｇ”へのアクセスを提供する。

【0027】

最初の３つの工程は、後続の測定を最大限に活用することができる正確な条件を使用して、タンパク質を水に再懸濁させることから成る。

【0028】

選択される水は、好ましくは逆浸透水であるが、飲料水も使用され得る。

【0029】

その温度は、初期の再懸濁中は６０℃＋／－２℃（第１及び第２の工程）、次いで、測定前の２４時間可溶化及び冷却後は２０℃＋／－２℃である（第３工程）。一般に、特に指示がない限り、本明細書において温度が与えられる場合、温度は、常に＋／－２℃の変動、例えば２０℃＋／－２℃又は８０℃＋／－２℃の変動を含む。

【0030】

定義された量のタンパク質を水に添加して、１５％＋／－２％の固形分を含有する懸濁液を得る。これを行うために、当業者に周知のビーカ及び撹拌棒などの装置が使用される。５０ｍＬの量を、室温で３５０ｒｐｍで少なくとも１０時間撹拌する。一般に、特に指示がない限り、本明細書に与えられる固形分の含有量は、常に、＋／－２％の変動、例えば１５％＋／－２％の変動を含む。ｐＨは、先行技術において周知のように、ｐＨメータ及び酸塩基試薬を使用して７＋／－０．５に調整される。

【0031】

第４工程は、レオメータに試料を導入することと、蒸発を制限するために、試料を薄い油層で被覆することと、から成る。

【0032】

次に、第５の工程中、次の温度プロトコルが適用される：ａ．フェーズ１：２０℃＋／－２℃の温度から８０℃＋／－２℃の温度まで１０分間加熱；ｂ．フェーズ２：８０℃＋／－２℃の温度で１１０分間安定化；ｃ．フェーズ３：８０℃＋／－２℃の温度から２０℃＋／－２℃の温度まで３０分間冷却。

【0033】

パラメータＧ’の測定は、このプロトコル中に連続的に実行され、記録される。

【0034】

試験Ａの第６及び最後の工程は、記録を活用することから成る。２つの値を抽出する。Ｇ’１＝２０℃＋／－２℃での安定化後のフェーズ１の開始時のＧ’の値、及びＧ’２＝２０℃＋／－２℃での安定化後のフェーズ３の終了時のＧ’の値。

【0035】

ゲル化力は、Ｇ’２－Ｇ’１に等しい。

【0036】

好ましくは、本発明によるマメ科植物タンパク質組成物は、固形分の総重量に対して、固形分の８０重量％超、好ましくは８５重量％超、更により好ましくは９０重量％超のタンパク質含有量を有する。

【0037】

タンパク質含有量は、当業者に周知の任意の技術によって測定される。好ましくは、全窒素を（組成物の総乾燥重量に対する窒素の重量百分率として）アッセイし、結果に６．２５の係数を掛ける。植物タンパク質の分野におけるこの周知の方法論は、タンパク質が平均で１６％窒素を含有するという観察に基づく。当業者に周知の任意の乾燥物アッセイ法も使用することができる。

【0038】

更により好ましくは、タンパク質組成物は、２０マイクロメートル未満、好ましくは１５マイクロメートル未満、更により好ましくは１０マイクロメートル未満の粒径Ｄ９０を有する。

【0039】

本発明において、用語「Ｄ９０」は、タンパク質組成物の粒子の総量のそれぞれ９０％及び１０％を含む２つの集団に数で分離する粒径（マイクロメートル）を意味する。

【0040】

このＤ９０測定を行うために、レーザー粒径分析器が好ましくは使用され、更により好ましくはＭａｌｖｅｒｎ製のＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００が使用される。使用するパラメータは以下のとおりである。液体経路での使用、エタノール中分散液、屈折率：１．５２；吸収指数：０．１；超音波処理の使用はない。

【0041】

好ましくは、本発明によるタンパク質組成物は、中性ｐＨで高い溶解度を有する。本発明によると、試験Ｂは、タンパク質組成物の溶解度を定量化するために使用される。この試験Ｂは、以下の工程からなる。

【0042】

１５０ｇの蒸留水を磁気撹拌棒で撹拌しながら２０℃＋／－２℃で４００ｍＬのビーカに入れて、試験するマメ科植物のタンパク質試料を正確に５ｇ添加する。必要に応じて、０．１Ｎ ＮａＯＨ又は０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨを７に調整する。水を添加して、２００ｇの水を構成する。混合を１０００ｒｐｍで３０分間行って、３０００ｇで１５分間遠心分離する。２５ｇの上澄みを回収し、予め乾燥させて風袋を計量した結晶皿に入れる。結晶皿を１０３℃＋／－２℃のオーブンに１時間置く。次いで、結晶皿を乾燥器（乾燥剤を含む）内に置いて、周囲温度に冷却し、秤量する。

【0043】

溶解度は、可溶性乾燥物の含有量に相当し、試料の重量に対する重量％として表される。溶解度は、以下の式で計算される：

【0044】

【数1】

［式中、
Ｐ＝試料の重量（ｇ）＝５ｇ
ｍ１＝乾燥後の結晶皿の重量（ｇ）
ｍ２＝空の結晶皿の重量（ｇ）
Ｐ１＝収集した試料の重量（ｇ）＝２５ｇ］

【0045】

有利には、試験Ｂによる本発明のタンパク質組成物の溶解度は、３０～６５％、例えば、３３～６２％、特に３８～６０％の範囲である。

【0046】

本発明の更なる利点は、溶解性を維持しつつ、エンドウマメタンパク質のゲル化特性を改善することが可能であることである。しかしながら、これらの特性は、十分に両立し得ないように思われる。例えば、タンパク質分解によりタンパク質の溶解度を上昇させることにより、そのゲル化特性が失われる。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、このことは、一般にタンパク質ゲルを形成するために、タンパク質が凝集後にネットワークを形成する必要があるという事実によって説明される。したがって、ゲル化タンパク質は、再溶解した後であっても、比較的大きいサイズであるため、通常は溶解度の低下を示す。しかしながら、本発明により、２つの特性を両立させることが可能になる。

【0047】

別の態様によると、本発明によるマメ科植物タンパク質組成物の製造方法が提示され、該方法は以下の工程を含むことを特徴とする。
１）好ましくはエンドウマメ、ウチワマメ、及びファバマメから選択されるマメ科植物種子を準備する工程、
２）種子を粉砕し、水性懸濁液を生成する工程、
３）遠心力を用いて不溶性画分を分離する工程、
４）５５℃＋／－２℃～６５℃＋／－２℃、好ましくは６０℃＋／－２℃の温度で、３．５分～４．５分、好ましくは４分間、等電ｐＨで加熱することによって、タンパク質を凝固させる工程、
５）凝固したタンパク質フロックを遠心分離により回収する工程、
６）ｐＨを６＋／－０．５～９＋／－０．５の値に調整する工程、
７）任意選択的に、熱処理工程、
８）凝固したタンパク質フロックを乾燥させる工程、
９）ジェットミルを使用して凝固したタンパク質フロックを粉砕して、２０マイクロメートル未満、好ましくは１５マイクロメートル未満、更により好ましくは１０マイクロメートル未満の粒径Ｄ９０を得る工程。

【0048】

したがって、この方法は、好ましくはエンドウマメ、ウチワマメ、及びファバマメから選択されるマメ科植物種子を準備する工程１）から開始される。

【0049】

選択されたマメ科植物がエンドウマメである場合、工程１）で使用されるエンドウマメは、例えば、特に洗浄（石、死んだ虫、土壌残渣などの望ましくない粒子の除去）、又は更には、周知の「殻取り」工程によるエンドウマメの外部繊維（外部セルロース外皮）の除去などの、当業者にとって周知の工程を予め経ていてもよい。

【0050】

乾燥加熱（又は焙煎）又は湿潤漂白などの感覚刺激的特性を改善するための処理も可能である。漂白の場合、温度は、好ましくは７０℃＋／－２℃～９０℃＋／－２℃であり、ｐＨは８＋／－０．５～１０＋／－０．５、好ましくは９＋／－０．５に調整される。これらの条件は、２～４分、好ましくは３分間維持される。

【0051】

本発明による方法は、種子を粉砕し、水性懸濁液を生成する工程２）を含む。種子が既に水の存在下にある場合、水は保持されるが、新しく取り換えられてもよく、種子は直接粉砕される。種子が乾燥している場合、粗挽き粉が最初に生成され、次いで水に懸濁される。

【0052】

粉砕は、ボールミル、コニカルミル、螺旋ミル、ジェットミル、又はロータ／ロータシステムなどの、当業者に既知の任意の種類の好適な技術によって実行される。

【0053】

粉砕中、水は、懸濁液の重量に対して、固形分（ＳＣ）の１５重量％～２５重量％、好ましくはＳＣの２０重量％の粉砕されたエンドウマメの水性懸濁液を生成するように、粉砕開始時、粉砕中、又は粉砕終了時に連続的又は不連続的に添加されてもよい。

【0054】

粉砕終了時に、ｐＨを確認することができる。好ましくは、工程２の終了時の粉砕されたエンドウマメの水性懸濁液のｐＨは、５．５＋／－０．５～１０＋／－０．５に調整され、例えば、調整されたｐＨは６＋／－０．５～９＋／－０．５である。あるいは、ｐＨは、８＋／－０．５～１０＋／－０．５の間で調整されたｐＨ、例えば、ｐＨ９に調整されたｐＨである。ｐＨは、酸及び／又は塩基、例えば水酸化ナトリウム又は塩酸を添加することによって調整することができる。

【0055】

次に、本発明による方法は、遠心力を用いて不溶性画分を分離する工程３）から成る。これらの画分は、主にデンプン及び「内部繊維」と呼ばれる多糖類から成る。したがって、上澄みに溶解できるタンパク質が濃縮される。

【0056】

本発明による方法は、５５℃＋／－２℃～６５℃＋／－２℃、好ましくは６０℃＋／－２℃の温度で、３．５分～４．５分、好ましくは４分間、等電ｐＨで加熱することによって、タンパク質を凝固させる工程４）を含む。ここでの目的は、工程３）の上澄みの他の成分から対象のエンドウマメタンパク質を分離することである。このような方法の例は、例えば、出願人の欧州特許第１４００５３７号の段落１２７～段落１４３に記載されている。時間／温度プロトコルを適切に制御することは必須である。以下の実施例のセクションに示されるように、これらのパラメータは、本発明によるゲル化タンパク質組成物を製造するために最も重要である。

【0057】

以下の工程５）は、凝固したタンパク質フロックを遠心分離により回収することから成る。よって、濃縮タンパク質を有する固体画分は、濃縮糖及び塩を有する液体画分から分離される。

【0058】

工程６）では、フロックは水に再懸濁され、そのｐＨは６＋／－０．５～９＋／－０．５の値に調整される。固形分含有量は、懸濁液の重量に対して、１０重量％～２０重量％、好ましくは１５重量％の固形分に調整される。ｐＨは、任意の酸性及び塩基性試薬を使用して調整される。アスコルビン酸、クエン酸、水酸化カリウム、及び水酸化ナトリウムの使用が好ましい。

【0059】

タンパク質の微生物学的性質を確保することを目的とした熱処理から成る任意選択的な工程７）を実施することが可能である。この熱処理はまた、タンパク質組成物を官能化するために使用されてもよい。したがって、１００℃＋／－２℃～１６０℃＋／－２℃で、０．０１秒～３秒、好ましくは１～２秒の従来のプロトコルを用いて実行され、直後に冷却が続く。

【0060】

工程８）では、固形分の重量に対して、８０重量％超、好ましくは９０重量％超の固形分含有量に達するように、凝固したタンパク質フロックが乾燥させられる。この目的のために、当業者に周知の任意の技術、例えば、凍結乾燥又は霧化を使用することができる。霧化は、好ましい技術、特に多重効果霧化である。

【0061】

固形分含有量は、当業者に公知の任意の方法によって測定される。好ましくは、「乾燥」方法が使用される。それは、既知の重量の試料の既知の量を加熱することによって蒸発した水の量を測定することで構成される。試料を最初に秤量し、ｇ中の質量ｍ１を測定し、試料塊が安定化するまで試料を加熱チャンバ内に配置することによって水を蒸発させ、水を完全に蒸発させ（好ましくは、温度は大気圧下１０５℃である）、最終試料を秤量し、ｇ中の質量ｍ２を測定する。固形分含有量は、以下の計算によって得られる。（ｍ２／ｍ１）^＊１００

【0062】

最後の工程９）は、本発明によるタンパク質組成物の製造に不可欠な、先行する工程４）と同様である。この工程は、凝固して乾燥したタンパク質フロックを粉砕して、２０マイクロメートル未満、好ましくは１５マイクロメートル未満、更により好ましくは１０マイクロメートル未満の粒径Ｄ９０を得ることから成る。本発明の方法のこの工程では、ジェットミルが使用される。しかしながら、対向ジェットミル、更により好ましくはＮｅｔｚｓｃｈ ＣＧＳ１０ミルを使用することが好ましい。このタイプのミルは、衝突の発生によってサイズの減少をもたらし、高速ガスジェットによって加速された粒子が、衝撃を介して分解される。

【0063】

本発明の有益な方法では、試験Ａによるタンパク質組成物のゲル強度は、工程８において乾燥したタンパク質フロックのゲル強度の少なくとも１５０％、有利には少なくとも２００％、例えば少なくとも３００％である。試験Ａによるタンパク質組成物のゲル強度は、例えば、工程８において乾燥したタンパク質フロックのゲル強度の最大６００％であってもよい。

【0064】

上述したように、本発明の利点の１つは、タンパク質溶解度が粉砕工程中に維持され得ることである。有利には、試験Ｂによるタンパク質組成物の溶解度は、工程８における乾燥タンパク質フロックの溶解度の少なくとも７５％であり、有利には少なくとも９０％である。

【0065】

本発明の利点は、本発明のタンパク質組成物が、試験Ａの条件下で、様々なｐＨ値、特に中性ｐＨでより高いゲル強度を有し得ることである。本発明によるタンパク質組成物の使用は、任意の種類の食品又は医薬製品において有利である。食品又は医薬製品は、４～９、例えば５～８．５、特に６～８、又は約７の範囲のｐＨを有し得る。

【0066】

本発明の最後の態様によれば、本発明によるマメ科植物タンパク質組成物、好ましくはエンドウマメ、ウチワマメ、及びファバマメから選択されるマメ科植物タンパク質単離物、更により好ましくはエンドウマメタンパク質単離物の工業的用途、特に、動物及びヒトの食品用途が提案される。

【0067】

向上したゲル化力により、本発明によるタンパク質組成物は、野菜ヨーグルト又は肉類似体などの食品用途に特に適している。特に、肉又は魚代替物に使用されてもよい。特に、結合剤として、例えば、肉又は魚代替物の製造に有用な結合剤として使用されてもよい。したがって、本発明の別の態様は、本発明のタンパク質組成物を含む肉又は魚代替物である。

【0068】

本発明は、以下の非限定的実施例によって更に良好に理解されるであろう。

【実施例】

【0069】

実施例１：本発明によるマメ科植物タンパク質組成物の製造

【0070】

ハンマーミルを用いて外側の繊維を殻取りした後、エンドウマメの種子を粉砕して粗挽き粉を製造する。次いで、この粗挽き粉を、室温で３０分間、ｐＨ６．５で、この懸濁液の重量に対して固形分の２５重量％の最終濃度となるまで水に浸漬する。次に、固形分の２５重量％の粗挽き粉懸濁液を一連のハイドロサイクロンに導入し、これをタンパク質、内部繊維（パルプ）、及び可溶性物質の混合物からなる軽質相と、デンプンを含有する重質相とからなる重質相とに分離する。次いで、ハイドロサイクロンの出口における軽質相は、この懸濁液の重量に対して１０．７％の固形分含有量に調整される。内部繊維の分離は、ＷＥＳＴＦＡＬＩＡ型の遠心分離機での処理によって行われる。デカンタ型遠心分離機の出口の軽質相は、タンパク質と可溶性物質との混合物を含有し、一方、重質相はエンドウマメの繊維を含有する。
遠心分離機の出口の軽質相をｐＨ４．６に調整し、この溶液を６０℃で４分間加熱することにより、タンパク質をその等電点で凝固させる。タンパク質の凝固後、タンパク質フロックが得られる。このタンパク質フロックを、飲料水中の懸濁液の重量に対して固形分１５．１％で再懸濁させる。懸濁液のｐＨは、水酸化カリウムで７の値に調整される。最後に、１３０℃で０．４秒間熱処理を行い、続いてフラッシュ冷却する。懸濁液は、最後に、空気入口の温度１８０℃、及び空気出口の温度８０℃のＮＩＲＯ ＭＳＤ多重効果アトマイザ内で最終的に霧化される。得られた粉末は固形分の総重量に対して９２．３％の固形分を含有し、そのうち８５．５％はタンパク質であった。この粉末は、「本発明による組成物のためのベース」と称する。
次いで、この粉末を、対向ジェットミルＮｅｔｚｓｃｈ ＣＧＳ１０を使用して粉砕し、７．３マイクロメートルの粒径Ｄ９０を有する粉末を生成した。
得られた粉末状タンパク質組成物は、「本発明による微紛化タンパク質組成物」と称する。

【0071】

実施例２：凝固中のタンパク質組成物の加熱プロトコルの影響を実証することを目的とした比較例

【0072】

この実施例は、本発明によるタンパク質組成物の機能性に対する凝固プロトコルの影響を示すことを目的とする。

【0073】

ハンマーミルを用いて外側の繊維を殻取りした後、エンドウマメの種子を粉砕して粗挽き粉を製造する。次いで、この粗挽き粉を、室温で３０分間、ｐＨ６．５で、この懸濁液の重量に対して固形分の２５．１重量％の最終濃度となるまで水に浸漬する。次に、固形分の２５重量％の粗挽き粉懸濁液を一連のハイドロサイクロンに導入し、これをタンパク質、内部繊維（パルプ）、及び可溶性物質の混合物からなる軽質相と、デンプンを含有する重質相とからなる重質相とに分離する。次いで、ハイドロサイクロンの出口における軽質相は、この懸濁液の重量に対して１１．２％の固形分含有量に調整される。内部繊維の分離は、ＷＥＳＴＦＡＬＩＡ型の遠心分離機での処理によって行われる。デカンタ型遠心分離機の出口の軽質相は、タンパク質と可溶性物質との混合物を含有し、一方、重質相はエンドウマメの繊維を含有する。
遠心分離機の出口の軽質相をｐＨ４．６に調整し、この溶液を７０℃で４分間加熱することにより、タンパク質をその等電点で凝固させる。タンパク質の凝固後、タンパク質フロックが得られる。このタンパク質フロックを、飲料水中の懸濁液の重量に対して固形分１４．９％で再懸濁させる。懸濁液のｐＨは、水酸化カリウムで７の値に調整される。最後に、１３０℃で０．４秒間熱処理を行い、続いてフラッシュ冷却する。懸濁液は、最後に、空気入口の温度１８０℃、及び空気出口の温度８０℃のＮＩＲＯ ＭＳＤ多重効果アトマイザ内で最終的に霧化される。得られた粉末は固形分の総重量に対して９１．９％の固形分を含有し、そのうち８４．９％はタンパク質であった。この粉末は、「比較タンパク質組成物１のベース」と称する。
次いで、この粉末を、対向ジェットミルＮｅｔｚｓｃｈ ＣＧＳ１０を使用して粉砕し、８．２マイクロメートルの粒径Ｄ９０を有する粉末を生成した。
得られた粉末状タンパク質組成物は、「比較用微粉化タンパク質組成物１」と称する。

【0074】

実施例３：実施例１及び２で得られた様々なタンパク質組成物の比較

【0075】

前述の試験Ａ、並びに固形分含有量及びタンパク質含有量も、タンパク質組成物を比較するために使用される。

【0076】

【表1】

【0077】

上記の表１は、ゲル化力を最大化するために、凝固温度プロトコルと、１０マイクロメートル未満の粒径Ｄ９０までの粒径の減少との間の相乗効果が明らかに非常に重要であることを示す。本発明による微紛化タンパク質組成物のゲル化力は、本発明によるタンパク質組成物のベース、タンパク質組成物１号の比較用ベース、及び比較用微粉化タンパク質組成物１号のゲル化力よりも約４倍高い。

【0078】

実施例４：本発明によるマメ科植物タンパク質組成物の製造
ハンマーミルを用いて外側の繊維を殻取りした後、エンドウマメの種子を粉砕して粗挽き粉を製造する。次いで、この粗挽き粉を、室温で３０分間、ｐＨ６．５で、この懸濁液の重量に対して固形分の２５重量％の最終濃度となるまで水に浸漬する。次に、固形分の２５重量％の粗挽き粉懸濁液を一連のハイドロサイクロンに導入し、これをタンパク質、内部繊維（パルプ）、及び可溶性物質の混合物からなる軽質相と、デンプンを含有する重質相とからなる重質相とに分離する。次いで、ハイドロサイクロンの出口における軽質相は、この懸濁液の重量に対して１０％の固形分含有量に調整される。内部繊維の分離は、ＷＥＳＴＦＡＬＩＡ型の遠心分離機での処理によって行われる。デカンタ型遠心分離機の出口の軽質相は、タンパク質と可溶性物質との混合物を含有し、一方、重質相はエンドウマメの繊維を含有する。
遠心分離機の出口の軽質相をｐＨ５．０に調整し、この溶液を６０℃で４分間加熱することにより、タンパク質をその等電点で凝固させる。タンパク質の凝固後、タンパク質フロックが得られる。このタンパク質フロックを、飲料水中の懸濁液の重量に対して１８％の固形分再懸濁させる。懸濁液のｐＨは、水酸化ナトリウムで７の値に調整される。最後に、１３０℃で０．４秒間熱処理を行い、続いてフラッシュ冷却する。懸濁液は、最後に、空気入口の温度１８０℃、及び空気出口の温度８０℃のＮＩＲＯ ＭＳＤ多重効果アトマイザ内で最終的に霧化される。得られた粉末は固形分の総重量に対して９３．２％の固形分を含有し、そのうち８０．７％はタンパク質であった。この粉末は、「本発明による組成物のベース２」と称する。
次いで、この粉末を、対向ジェットミルＮｅｔｚｓｃｈ ＣＧＳ１０を使用して２つの異なる時間にわたって粉砕し、１６．９マイクロメートルの粒径Ｄ９０を有する第１の粉末及び７．９マイクロメートルの粒径Ｄ９０を有する第２の粉末を製造した。得られた粉末状タンパク質組成物は、それぞれ「本発明による微紛化タンパク質組成物２」及び「本発明による微紛化タンパク質組成物３」と称する。
前述の試験Ａ及びＢ、並びに固形分含有量及びタンパク質含有量も、タンパク質組成物を比較するために使用される。

【0079】

【表2】

上記の表２は、ゲル化力を最大化することが可能であることを再度示している。本発明による微紛化タンパク質組成物のゲル化力は、２倍以上高い。更に、タンパク質溶解度を維持することも可能である。