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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-11-29
(45)【発行日】2024-12-09
(54)【発明の名称】変異ＩＤＨ阻害剤との併用療法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/5365 20060101AFI20241202BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241202BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241202BHJP
A61K 31/553 20060101ALI20241202BHJP
A61K 31/706 20060101ALI20241202BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20241202BHJP
【ＦＩ】
A61K31/5365
A61P35/02
A61P43/00 121
A61K31/553
A61K31/706
A61K31/7068
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022557831
(86)(22)【出願日】2021-03-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-16
(86)【国際出願番号】 US2021023436
(87)【国際公開番号】W WO2021194946
(87)【国際公開日】2021-09-30
【審査請求日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】62/993,254
(32)【優先日】2020-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/024,713
(32)【優先日】2020-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/053,875
(32)【優先日】2020-07-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(72)【発明者】
【氏名】ブルックス，ネイサン アーサー
(72)【発明者】
【氏名】ギルモア，レイモンド
【審査官】鈴木 理文
(56)【参考文献】
【文献】特表２０２０－５０２１５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／２２２５５３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５１０７４６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／５３６５
Ａ６１Ｐ ３５／０２
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｋ ３１／５５３
Ａ６１Ｋ ３１／７０６
Ａ６１Ｋ ３１／７０６８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の式:【化1】
【請求項2】
前記ＩＤＨ変異が、ＩＤＨ１変異である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ＩＤＨ１変異が、ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異である、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＩＤＨ変異が、ＩＤＨ２変異である、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記ＩＤＨ２変異が、ＩＤＨ２ Ｒ１４０またはＩＤＨ２ Ｒ１７２変異である、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、下記の式:
【化2】
【請求項7】
少なくともシタラビン、またはその薬学的に許容される塩と組み合わせて用いるための、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
少なくともアザシチジン、またはその薬学的に許容される塩と組み合わせて用いるための、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
Ｂｃｌ－２阻害剤またはその薬学的に許容される塩とさらに組み合わせられる、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記Ｂｃｌ－２阻害剤が、ベネトクラクス、またはその薬学的に許容される塩である、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
少なくともミドスタウリン、またはその薬学的に許容される塩と組み合わせて用いるための、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、がんの治療のための、変異イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）阻害剤ならびに代謝拮抗剤、低メチル化剤、および変異ＦＭＳ－様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ３）阻害剤のうちの１つ以上による併用療法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＩＤＨ１およびＩＤＨ２は、イソクエン酸からα－ケトグルタル酸への変換を触媒し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）をＮＡＤＰＨに還元する酵素である（Megias-Vericat J, et al., Blood Lymph. Cancer: Targets and Therapy 2019; 9: 19～32）。
【0003】
ＩＤＨ１、例えばＩＤＨ１アミノ酸残基Ｒ１３２における新たな（de novo）変異は、固形腫瘍癌および血液悪性腫瘍など、いくつかの種類のがんの腫瘍形成に寄与している(Badur MG, et al., Cell Reports 2018; 25: 1680)。ＩＤＨ１変異は、高濃度の２－ヒドロキシグルタル酸（２－ＨＧ）をもたらし、細胞分化を阻害することがあり、変異ＩＤＨ１の阻害剤は、２－ＨＧ濃度を減少させ、細胞分化を促進することがある（Molenaar RJ, et al., Oncogene 2018; 37 : 1949～1960）。変異は、ＩＤＨ２、例えば、アミノ酸残基Ｒ１７２、Ｒ１４０およびＲ１７２においてもまた、起こる（Yang H, et al., Clin. Cancer. Res. 2012; 18: 5562-5571; Mondesir J, et al., J. Blood Med. 2016; 7: 171～180）。
【0004】
例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、様々な種類の変異遺伝子、ならびに治療による選択圧の下、経時的に、動的に進化する前白血病性クローンおよび白血病性クローンを含むマルチクローン性のゲノム構造を特徴とする（Bloomfield CD, et al., Blood Revs. 2018; 32: 416～425）。
【0005】
シタラビンおよびアントラサイクリンによる導入化学療法（「７＋３」）は、４０年以上の間、新たにＡＭＬと診断された対象にとっての標準治療となっている。
【0006】
近年、５つのさらなる薬物が米国食品医薬局によって、ＡＭＬの治療のために承認された（ミドスタウリン、エナシデニブ、ＣＰＸ－３５１、ゲムツズマブ、オゾガマイシン）（Megias-Vericat J, et al., Blood Lymph. Cancer: Targets and Therapy 2019; 9: 19～32）。
【0007】
ＡＭＬを有する成人の約６０％から７０％が、適切な導入療法後に完全寛解（ＣＲ）状態に達すると予想され、ＡＭＬを有する成人の２５％以上（ＣＲに達する人の約４５％）が、３年以上生存し、治癒すると予想される。
【0008】
しかしながら、ＩＤＨ１耐性変異は、ＡＭＬ対象の７～１４％で認められ、それに伴う高濃度２－ＨＧは、エピジェネティックな高メチル化表現型および分化の阻害をもたらし、これにより白血病誘発をもたらすことがある（Megias-Vericat J, et al., Blood Lymph. Cancer: Targets and Therapy 2019; 9: 19～3）。さらに、Ｆｌｔ３キナーゼの変異は、ＡＭＬ対象のおよそ３分の１で認められる（Lee HJ, et al., Oncotarget 2018; 9: 924～936）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
それゆえ、代わりとなる変異ＩＤＨ関連がんの治療法は、依然として必要である。
【0010】
特定の変異ＩＤＨ１およびＩＤＨ２阻害剤は、ＷＯ ２０１８／１１１７０７ Ａ１に開示されており、本明細書で「化合物Ａ」と定義される、（α－ＫＧ）濃度に影響を及ぼすことなく、アロステリック結合ポケットにあるシングルシステイン（Ｃｙｓ２６９）を修飾し、酵素を急速に不活性化し、２－ＨＧの産生を選択的に阻害する変異ＩＤＨ１の共有結合性阻害剤である、化合物（ＷＯ ２０１８／１１１７０７ Ａ１）が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、ＩＤＨ変異を有するヒトがん対象に治療有効量の
（ａ）下記の式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１は、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、または－ＣＨ２－シクロプロピルであり;
Ｒ２は、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３であり；および
Ｘは、ＮまたはＣＨである］
で示される第１の化合物またはその薬学的に許容される塩；および
（ｂ）代謝拮抗剤、またはその薬学的に許容される塩；低メチル化剤、またはその薬学的に許容される塩；および変異Ｆｌｔ３阻害剤、またはその薬学的に許容される塩である、第２の化合物のうちの１つ以上
を投与することを特徴とする、がんを治療する方法を提供する。
（ａ）下記の式（Ｉ）：
【化1】
Ｒ１は、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、または－ＣＨ２－シクロプロピルであり;
Ｒ２は、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３であり；および
Ｘは、ＮまたはＣＨである］
で示される第１の化合物またはその薬学的に許容される塩；および
（ｂ）代謝拮抗剤、またはその薬学的に許容される塩；低メチル化剤、またはその薬学的に許容される塩；および変異Ｆｌｔ３阻害剤、またはその薬学的に許容される塩である、第２の化合物のうちの１つ以上
を投与することを特徴とする、がんを治療する方法を提供する。
【0012】
一つの実施形態において、前記ＩＤＨ変異は、ＩＤＨ１変異またはＩＤＨ２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ変異は、ＩＤＨ１変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｈである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｇ、Ｒ１３２Ｌ、またはＲ１３２Ｓである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異は、Ｒ１３２Ｈである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｃである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｇである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｌである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｓである。
【0013】
もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ変異は、ＩＤＨ２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ２変異は、ＩＤＨ２ Ｒ１４０変異またはＩＤＨ２ Ｒ１７２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ２変異は、Ｒ１４０変異である。もう一つの実施形態において、前記Ｒ１４０変異は、Ｒ１４０Ｑ、Ｒ１４０Ｌ、またはＲ１４０Ｗである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ２変異は、Ｒ１７２変異である。もう一つの実施形態において、前記Ｒ１７２変異は、Ｒ１７２Ｋ、Ｒ１７２Ｍ、Ｒ１７２Ｇ、Ｒ１７２ＳまたはＲ１７２Ｗである。
【0014】
本発明の方法の一つの実施形態において、前記式Ｉの第１の化合物、またはその薬学的に許容される塩において、ＸはＮである。もう一つの実施形態において、前記第１の化合物、またはその薬学的に許容される塩において、ＸはＮであり、Ｒ１は－ＣＨ２－シクロプロピルであり、Ｒ２は－ＣＨ２ＣＨ３である。もう一つの実施形態において、前記第１の化合物の式中、ＸはＮであり、Ｒ１は－ＣＨ２－シクロプロピルであり、Ｒ２は－ＣＨ２ＣＨ３である。
【0015】
もう一つの実施形態において、前記第１の化合物は、
7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-シクロプロピル-1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)エチル]フェニル]エチル]アミノ]-1-エチル-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；
7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-シクロプロピル-1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)エチル]フェニル]エチル]アミノ]-1-エチル-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；もしくは
1-エチル-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)プロピル]フェニル]エチル]アミノ]-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；
またはその薬学的に許容される塩である。
7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-シクロプロピル-1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)エチル]フェニル]エチル]アミノ]-1-エチル-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；
7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-シクロプロピル-1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)エチル]フェニル]エチル]アミノ]-1-エチル-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；もしくは
1-エチル-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)プロピル]フェニル]エチル]アミノ]-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；
またはその薬学的に許容される塩である。
【0016】
もう一つの実施形態において、前記第１の化合物は、7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-シクロプロピル-1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1－イル)エチル]フェニル]エチル]アミノ]-1-エチル-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2－オンである。
【0017】
もう一つの実施形態において、前記第１の化合物は、
またはその薬学的に許容される塩である。
【化2】
【0018】
もう一つの実施形態において、前記第１の化合物は、化合物Ａである。
【0019】
もう一つの実施形態において、前記対象は、ＩＤＨ１変異、例えば、Ｒ１３２ ＩＤＨ１変異を有することが確認される。もう一つの実施形態において、前記対象は、ＩＤＨ２変異、例えば、ＩＤＨ２ Ｒ１７２、Ｒ１４０またはＲ１７２変異を有することが確認される。もう一つの実施形態において、前記対象は、組織中にＩＤＨ変異を有することが確認される。
【0020】
もう一つの実施形態において、前記がんは血液悪性腫瘍であり、前記対象は、血液、骨髄、リンパ節またはリンパ液中にＩＤＨ変異を有することが確認される。もう一つの実施形態において、前記対象は、血液細胞、骨髄細胞、リンパ節細胞、またはリンパ液細胞中にＩＤＨ変異を有することが確認される。
【0021】
もう一つの実施形態において、前記がんは固形腫瘍癌であり、前記対象は、固形腫瘍組織中にＩＤＨ１変異を有することが確認される。もう一つの実施形態において、前記対象は、固形腫瘍組織細胞中にＩＤＨ変異を有することが確認される。
【0022】
もう一つの実施形態において、変異Ｆｌｔ３阻害剤の投与の前に、前記ヒト対象は、Ｆｌｔ３変異を有することが確認されている。もう一つの実施形態において、前記Ｆｌｔ３変異は、Ｆｌｔ３遺伝子内縦列重複（Ｆｌｔ３－ＩＴＤ）変異である。もう一つの実施形態において、前記Ｆｌｔ３変異は、Ｆｌｔ３チロシンキナーゼドメイン（Ｆｌｔ３－ＴＫＤ）変異である。もう一つの実施形態において、前記Ｆｌｔ３変異は、Ｆｌｔ３ Ｄ８３５変異である。
【0023】
もう一つの実施形態において、前記第１の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、前記第２の化合物、またはその薬学的に許容される塩の前に投与される。
【0024】
もう一つの実施形態において、前記第１の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、第２の化合物、またはその薬学的に許容される塩の後に投与される。
【0025】
もう一つの実施形態において、前記第１の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、前記第２の化合物、またはその薬学的に許容される塩とともに処方される。
【0026】
本発明の方法のもう一つの実施形態において、前記がんは、固形腫瘍癌である。もう一つの実施形態において、前記固形腫瘍癌は、胆管癌、頭頸部癌、軟骨肉腫、肝細胞癌、黒色腫、膵臓癌、星状細胞腫、乏突起膠腫、神経膠腫、神経膠芽腫、膀胱癌、結腸直腸癌、肺癌、または副鼻腔未分化癌である。もう一つの実施形態において、前記肺癌は、非小細胞性肺癌である。もう一つの実施形態において、前記肺癌は、非小細胞性肺癌であり、α－ＫＲ Ｇ１２Ｃ阻害剤および／またはＥＧＦＲ阻害剤もまた投与される。もう一つの実施形態において、前記固形腫瘍は、胆管癌である。もう一つの実施形態において、放射線療法もまた、前記対象に施される。
【0027】
もう一つの実施形態において、前記がんは血液悪性腫瘍である。もう一つの実施形態において、前記血液悪性腫瘍は、ＡＭＬ、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症、または慢性骨髄性白血病である。もう一つの実施形態において、前記血液悪性腫瘍は、ＡＭＬである。
【0028】
本発明の方法のもう一つの実施形態において、前記第２の化合物は、代謝拮抗剤、またはその薬学的に許容される塩である。本発明の方法のもう一つの実施形態において、前記代謝拮抗剤は、シタラビン、5-フルオロウラシル（５－ＦＵ）、6-メルカプトプリン(6-mercaptourine)（６－ＭＰ）、カペシタビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルボアミド、メトトレキサート、ペメトレキセド、またはフォトトレキサート（phototrexate）、またはそれらのうちいずれか１つの薬学的に許容される塩である。もう一つの実施形態において、前記代謝拮抗剤は、シタラビン、またはその薬学的に許容される塩である。もう一つの実施形態において、前記代謝拮抗剤は、シタラビンである。もう一つの実施形態において、前記第１の化合物は、化合物Ａであり、前記第２の化合物は、シタラビンである。もう一つの実施形態において、前記がんは、ＡＭＬであり、前記第１の化合物は、化合物Ａであり、前記第２の化合物は、シタラビンである。もう一つの実施形態において、前記がんは、胆管癌であり、前記第１の化合物は、化合物Ａであり、前記第２の化合物は、シタラビンである。
【0029】
本発明の方法のもう一つの実施形態において、前記第２の化合物は、低メチル化剤、またはその薬学的に許容される塩である。本発明の方法のもう一つの実施形態において、前記低メチル化剤は、アザシチジン（５－アザシチジン）、５－アザ－２’－デオキシシチジン(5-aza-2'-deoxycitidine)（デシタビン）、グアデシタビン（ＳＧＩ－１１０）、５－フルオロ－２’－デオキシシチジン、ゼブラリン、ＣＰ－４２００、ＲＧ１０８、ナナオマイシンＡ、またはそれらのうちいずれか１つの薬学的に許容される塩である。もう一つの実施形態において、前記低メチル化剤は、アザシチジン、またはその薬学的に許容される塩である。もう一つの実施形態において、前記低メチル化剤は、アザシチジンである。もう一つの実施形態において、前記第１の化合物は、化合物Ａであり、前記第２の化合物は、アザシチジンである。もう一つの実施形態において、前記がんは、ＡＭＬであり、前記第１の化合物は、化合物Ａであり、前記第２の化合物は、アザシチジンである。もう一つの実施形態において、前記がんは、胆管癌であり、前記第１の化合物は、化合物Ａであり、前記第２の化合物は、アザシチジンである。
【0030】
もう一つの実施形態において、前記式Ｉの第１の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、低メチル化剤、またはその薬学的に許容される塩、およびＢｃｌ－２阻害剤、またはその薬学的に許容される塩とともに投与される。もう一つの実施形態において、前記式Ｉの第１の化合物は、低メチル化剤およびＢｃｌ－２阻害剤とともに投与される。もう一つの実施形態において、前記Ｂｃｌ－２阻害剤は、ベネトクラクス、オバトクラックス、ナビトクラクス、またはそれらのうちいずれか１つの薬学的に許容される塩である。もう一つの実施形態において、前記Ｂｃｌ－２阻害剤は、ベネトクラクス、またはその薬学的に許容される塩である。もう一つの実施形態において、前記Ｂｃｌ－２阻害剤は、ベネトクラクスである。もう一つの実施形態において、化合物Ａは、低メチル化剤およびＢｃｌ－２阻害剤とともに投与される。もう一つの実施形態において、化合物Ａは、アザシチジンおよびベネトクラクスとともに投与される。もう一つの実施形態において、前記がんは、ＡＭＬであり、化合物Ａは、アザシチジンおよびベネトクラクスとともに投与される。もう一つの実施形態において、前記がんは、胆管癌であり、化合物Ａは、アザシチジンおよびベネトクラクスとともに投与される。
【0031】
本発明の方法のもう一つの実施形態において、前記第２の化合物は、変異Ｆｌｔ３阻害剤、またはその薬学的に許容される塩である。本発明の方法のもう一つの実施形態において、前記変異Ｆｌｔ３阻害剤は、ミドスタウリン、ギルテリチニブ、キザルチニブ（ＡＣ２２０）、ソラフェニブ、スニチニブ、レスタウルチニブ、またはクレノラニブ、またはそれらのうちいずれか１つの薬学的に許容される塩である。もう一つの実施形態において、前記変異Ｆｌｔ３阻害剤は、ミドスタウリン、またはその薬学的に許容される塩である。もう一つの実施形態において、前記変異Ｆｌｔ３阻害剤は、ミドスタウリンである。もう一つの実施形態において、前記第１の化合物は、化合物Ａであり、前記第２の化合物は、ミドスタウリンである。もう一つの実施形態において、前記がんは、ＡＭＬであり、前記第１の化合物は、化合物Ａであり、前記第２の化合物は、ミドスタウリンである。もう一つの実施形態において、前記がんは、胆管癌であり、前記第１の化合物は、化合物Ａであり、前記第２の化合物は、ミドスタウリンである。
【0032】
本発明の方法のもう一つの実施形態において、化合物Ａは、代謝拮抗剤および低メチル化剤とともに投与される。
【0033】
本発明の方法のもう一つの実施形態において、化合物Ａは、代謝拮抗剤および変異Ｆｌｔ３阻害剤とともに投与される。
【0034】
本発明の方法のもう一つの実施形態において、化合物Ａは、低メチル化剤および変異Ｆｌｔ３阻害剤とともに投与される。
【0035】
本発明の方法のもう一つの実施形態において、化合物Ａは、代謝拮抗剤、低メチル化剤および変異Ｆｌｔ３阻害剤とともに投与される。
【0036】
本発明は、下記の式（Ｉ）:
［式中、
Ｒ１は、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、または－ＣＨ２－シクロプロピルであり;
Ｒ２は、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３であり；および
Ｘは、ＮまたはＣＨである］
の化合物またはその薬学的に許容される塩であって、代謝拮抗剤、もしくはその薬学的に許容される塩；低メチル化剤、もしくはその薬学的に許容される塩；または変異Ｆｌｔ３阻害剤、もしくはその薬学的に許容される塩のうちの１つ以上と組み合わせて、ＩＤＨ変異を有するヒト対象におけるがんの治療に用いるための、化合物またはその薬学的に許容される塩もまた、提供する。
【化3】
Ｒ１は、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、または－ＣＨ２－シクロプロピルであり;
Ｒ２は、－ＣＨ３または－ＣＨ２ＣＨ３であり；および
Ｘは、ＮまたはＣＨである］
の化合物またはその薬学的に許容される塩であって、代謝拮抗剤、もしくはその薬学的に許容される塩；低メチル化剤、もしくはその薬学的に許容される塩；または変異Ｆｌｔ３阻害剤、もしくはその薬学的に許容される塩のうちの１つ以上と組み合わせて、ＩＤＨ変異を有するヒト対象におけるがんの治療に用いるための、化合物またはその薬学的に許容される塩もまた、提供する。
【0037】
一つの実施形態において、前記対象は、血液、骨髄、リンパ節、リンパ液、血液細胞、骨髄細胞、リンパ節細胞またはリンパ液細胞中にＩＤＨ変異、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤ２変異を有することが確認される。
【0038】
もう一つの実施形態において、式Ｉの化合物は、ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異を有することが確認されるヒト対象におけるがんの治療において、低メチル化剤（例えば、アザシチジン）、またはその薬学的に許容される塩、およびＢｃｌ－２阻害剤、またはその薬学的に許容される塩と組み合わせて使用される。
【0039】
一つの実施形態において、前記ＩＤＨ変異は、ＩＤＨ１変異またはＩＤＨ２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ変異は、ＩＤＨ１変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｇ、Ｒ１３２Ｌ、またはＲ１３２Ｓである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異は、Ｒ１３２Ｈである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｃである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｇである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｌである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｓである。
【0040】
もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ変異は、ＩＤＨ２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ２変異は、ＩＤＨ２ Ｒ１４０変異またはＩＤＨ２ Ｒ１７２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ２変異は、Ｒ１４０変異である。もう一つの実施形態において、前記Ｒ１４０変異は、Ｒ１４０Ｑ、Ｒ１４０Ｌ、またはＲ１４０Ｗである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ２変異は、R172変異である。もう一つの実施形態において、前記Ｒ１７２変異は、Ｒ１７２Ｋ、Ｒ１７２Ｍ、Ｒ１７２Ｇ、Ｒ１７２ＳまたはＲ１７２Ｗである。
【0041】
一つの実施形態において、前記対象は、ＩＤＨ変異、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２変異を有することが確認される。
【0042】
式Ｉの使用のための化合物について、ＸがＮである化合物、またはその薬学的に許容される塩が好ましい；Ｒ１が－ＣＨ２－シクロプロピルである化合物、またはその薬学的に許容される塩が好ましい；Ｒ２が－ＣＨ２ＣＨ３である化合物、またはその薬学的に許容される塩が好ましい；ＸがＮであり、Ｒ１が－ＣＨ２－シクロプロピルである化合物、またはその薬学的に許容される塩が好ましい；Ｒ１が－ＣＨ２－シクロプロピルであり、Ｒ２が－ＣＨ２ＣＨ３である化合物、またはその薬学的に許容される塩が好ましい；ＸがＮであり、Ｒ１が－ＣＨ２－シクロプロピルであり、Ｒ２が－ＣＨ２ＣＨ３である化合物、またはその薬学的に許容される塩がより好ましい；ＸがＮであり、Ｒ１が－ＣＨ２－シクロプロピルであり、Ｒ２が－ＣＨ２ＣＨ３である化合物が最も好ましい。
【0043】
好ましい化合物は、
7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-シクロプロピル-1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)エチル]フェニル]エチル]アミノ]-1-エチル-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；
7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-シクロプロピル-1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)エチル]フェニル]エチル]アミノ]-1-エチル-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；もしくは
1-エチル-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)プロピル]フェニル]エチル]アミノ]-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；
またはその薬学的に許容される塩である。
7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-シクロプロピル-1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)エチル]フェニル]エチル]アミノ]-1-エチル-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；
7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-シクロプロピル-1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)エチル]フェニル]エチル]アミノ]-1-エチル-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；もしくは
1-エチル-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-プロパ－2-エノイルピペラジン-1-イル)プロピル]フェニル]エチル]アミノ]-4H-ピリミド[4,5-d][1,3]オキサジン-2-オン；
またはその薬学的に許容される塩である。
【0044】
もう一つの実施形態において、前記第１の化合物は、
（化合物Ａ）、またはその薬学的に許容される塩である。
【化4】
【0045】
もう一つの実施形態において、前記第１の化合物は、化合物Ａである。
【0046】
がんを治療するための、式Ｉの化合物および代謝拮抗剤、低メチル化剤、または変異Ｆｌｔ３阻害剤のうちの１つ以上を組み合わせて用いる新規方法が、本明細書に提示される。したがって、本発明のいくつかの態様は、ＩＤＨ変異、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２変異を有することが確認される対象におけるがんの治療において、同時に、別々に、または連続的に、代謝拮抗剤、低メチル化剤、または変異Ｆｌｔ３阻害剤のうちの１つ以上と組み合わせて用いるための、式Ｉの化合物を提供する。さらに、本発明のいくつかの態様は、固形腫瘍癌の治療において、同時に、別々に、または連続的に、代謝拮抗剤、低メチル化剤、または変異Ｆｌｔ３阻害剤のうちの１つ以上と組み合わせて用いるための、式Ｉの化合物を提供する。さらに、本発明のいくつかの態様は、血液悪性腫瘍の治療において、同時に、別々に、または連続的に、代謝拮抗剤、低メチル化剤、または変異Ｆｌｔ３阻害剤のうちの１つ以上と組み合わせて用いるための、式Ｉの化合物を提供する。本発明のもう一つの態様は、ＩＤＨ変異、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２変異を有することが確認される対象におけるがんの治療において、同時に、別々に、または連続的に、低メチル化剤およびＢｃｌ－２阻害剤と組み合わせて用いるための、式Ｉの化合物を提供する。
【0047】
一つの実施形態において、前記ＩＤＨ変異は、ＩＤＨ１変異またはＩＤＨ２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ変異は、ＩＤＨ１変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｇ、Ｒ１３２Ｌ、またはＲ１３２Ｓである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異は、Ｒ１３２Ｈである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｃである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｇである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｌである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ１変異は、Ｒ１３２Ｓである。
【0048】
もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ変異は、ＩＤＨ２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ２変異は、ＩＤＨ２ Ｒ１４０変異またはＩＤＨ２ Ｒ１７２変異である。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ２変異は、Ｒ１４０変異である。もう一つの実施形態において、前記Ｒ１４０変異は、Ｒ１４０Ｑ、Ｒ１４０Ｌ、またはＲ１４０Ｗである。もう一つの実施形態において、前記ＩＤＨ２変異は、Ｒ１７２変異である。もう一つの実施形態において、前記Ｒ１７２変異は、Ｒ１７２Ｋ、Ｒ１７２Ｍ、Ｒ１７２Ｇ、Ｒ１７２ＳまたはＲ１７２Ｗである。
【0049】
本発明は、ＩＤＨ変異を有することが確認されるヒト対象におけるがんの治療において、代謝拮抗剤、もしくはその薬学的に許容される塩；低メチル化剤、もしくはその薬学的に許容される塩；または変異Ｆｌｔ３阻害剤；もしくはその薬学的に許容される塩のうちの１つ以上と組み合わせて用いるための、式Ｉの化合物を含む医薬組成物もまた、提供する。一つの実施形態において、前記ＩＤＨ変異は、血液細胞、骨髄細胞、または血液および骨髄細胞において確認される。
【0050】
本発明は、ＩＤＨ変異、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２変異を有するヒト対象におけるがんの治療のための薬物の製造における、式Ｉの化合物の使用もまた、提供する。一つの実施形態において、前記対象は、血液、骨髄、リンパ節、リンパ液、血液細胞、骨髄細胞、リンパ節細胞またはリンパ液細胞においてＩＤＨ変異が確認され、ここで、薬物の製造に用いるための式Ｉの化合物は、代謝拮抗剤、もしくはその薬学的に許容される塩；低メチル化剤、もしくはその薬学的に許容される塩；または変異Ｆｌｔ３阻害剤；もしくはその薬学的に許容される塩のうちの１つ以上と組み合わせて投与される。
【0051】
本発明の方法または本発明の使用のための化合物の一つの実施形態において、前記がんは、フロントラインのがんである。もう一つの実施形態において、前記フロントラインのがんは、固形腫瘍癌である。もう一つの実施形態において、前記フロントラインのがんは、血液悪性腫瘍である。もう一つの実施形態において、前記フロントラインの血液悪性腫瘍は、フロントラインのＡＭＬである。
【0052】
本発明の方法または本発明の使用のための化合物のもう一つの実施形態において、前記がんは、再発がんである。もう一つの実施形態において、前記再発がんは、固形腫瘍癌である。もう一つの実施形態において、前記再発がんは、血液悪性腫瘍である。もう一つの実施形態において、前記再発血液悪性腫瘍は、再発ＡＭＬである。
【0053】
本発明の方法または本発明の使用のための化合物のもう一つの実施形態において、前記がんは、難治性がんである。もう一つの実施形態において、前記難治性がんは、固形腫瘍癌である。もう一つの実施形態において、前記難治性がんは、血液悪性腫瘍である。もう一つの実施形態において、前記難治性血液悪性腫瘍は、難治性ＡＭＬである。
【0054】
本発明の方法または本発明の使用のための化合物のもう一つの実施形態において、前記がんは、進行がんである。もう一つの実施形態において、前記進行がんは、進行固形腫瘍癌である。もう一つの実施形態において、前記進行がんは、進行血液悪性腫瘍である。もう一つの実施形態において、前記進行血液悪性腫瘍は、進行ＡＭＬである。
【0055】
もう一つの実施形態において、前記ＡＭＬは、急性前骨髄球性白血病である。
【0056】
変異ＩＤＨ１酵素活性のアッセイ法は、当業者に既知であり、例えば、ＷＯ ２０１８／１１１７０７ Ａ１に記載される。
【0057】
上記および本発明の説明を通して使用される以下の用語は、特に断らない限り、以下の意味を持つものであると理解されるべきである。
【0058】
「血液学的組織」という用語は、血液、骨髄、脾臓、リンパ節、またはリンパ液を指す。
【0059】
「固形腫瘍組織」という用語は、血液学的組織でない組織を指す。固形組織の非限定的な例は、胆管組織、膵臓組織、頭部組織、頸部組織、肝臓組織、皮膚組織、星状細胞腫組織、乏突起膠細胞組織、神経膠組織、脳組織、膀胱組織、結腸直腸組織、肺組織、および副鼻腔未分化癌組織である。
【0060】
「固形腫瘍癌」という用語は、血液または骨髄でない組織で起こるがんを意味する。
【0061】
「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節またはリンパ液で起こるがんに関する。
【0062】
「フロントラインのがん」という用語は、ヒトがん対象が、治療下のがんの治療を受けたことがないことを意味する。
【0063】
「難治性がん」という用語は、治療されているが、ヒトがん対象が治療に反応しないがんを指す。
【0064】
「再発がん」という用語は、ヒトがん対象がある期間治療に反応したが、がんが再発したことを意味する。
【0065】
「進行がん」という用語は、リンパ節に、またはがんの起点の外側のその他の組織に転移しているがんを指す。例えば、進行ＡＭＬは、血液または骨髄の外側の組織に転移しているＡＭＬである。
【0066】
「がん対象」という用語は、がんと診断されている対象を意味する。
【0067】
「固形腫瘍対象」という用語は、固形腫瘍癌と診断されている対象を意味する。一つの実施形態において、前記固形腫瘍癌は、胆管癌である。
【0068】
「血液悪性腫瘍対象」という用語は、血液悪性腫瘍と診断されている対象を意味する。一つの実施形態において、前記血液悪性腫瘍対象は、ＡＭＬ対象である。「ＡＭＬ対象」という用語は、ＡＭＬと診断されている対象を意味する。ＡＭＬを診断する方法は、当業者に既知であり、例えば、Dohner H, et al., Blood 2017; 129: 424～447に記載がある。
【0069】
「急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia）」、「急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia）」、および「急性非リンパ性白血病」という用語は、同義である。
【0070】
「血液悪性腫瘍（例えば、ＡＭＬ）治療への反応性」には、全生存の向上、部分反応、長期安定状態、または完全寛解（骨髄中で骨髄芽球が５％未満、循環血中に芽球がない、血液学的回復(末梢血絶対好中球数が１，０００細胞数／μＬ以上および血小板数が１００，０００／μＬ以上であって、赤血球輸血の必要がなく、髄外疾患がないことで証明される)によって判定される）とみなされる長期生存の向上が挙げられる（Bloomfield CD, et al., Blood Revs. 2018; 32: 416～425）。
【0071】
「ＩＤＨ１ Ｒ１３２変異」という用語は、「Ｒ１３２ ＩＤＨ１変異」と同義であり、例えば、対象の核酸（例えば、ＤＮＡ）において決定される、対象のＩＤＨ１遺伝子におけるアミノ酸残基１３２のＩＤＨ１変異を指す。
【0072】
「Ｆｌｔ３変異」という用語は、対象のＦｌｔ３遺伝子における変異を指す。
【0073】
「変異ＩＤＨ阻害剤」という用語は、変異ＩＤＨ酵素の酵素活性および／または変異ＩＤＨ酵素による２－ＨＧの産生を阻害する化合物を指す。変異ＩＤＨ１およびＩＤＨ２酵素活性のアッセイ法は、当業者に既知であり、例えば、ＷＯ ２０１８／１１１７０７ Ａ１に記載がある。「変異ＩＤＨ阻害剤」という用語において、「変異」という単語は、阻害剤ではなく、ＩＤＨ遺伝子について言及する。
【0074】
「変異Ｆｌｔ３阻害剤」という用語は、変異Ｆｌ３キナーゼ活性を阻害する化合物を指す。変異Ｆｌｔ３活性のアッセイ法は、当業者に既知であり、例えば、Lee HJ, et al., Oncotarget 2018; 9: 924～936に記載がある。「変異Ｆｌｔ３阻害剤」という用語において、「変異」という単語は、阻害化合物ではなく、Ｆｌｔ３タンパク質について言及する。
【0075】
「ＩＤＨ変異、例えば、ＩＤＨ１またはＩＤＨ２変異を有することが確認される」という用語は、ヒト対象の組織または細胞に由来する核酸（例えば、ＤＮＡ）が分析され、前記ヒト対象がＩＤＨ変異を有するかどうか判定されていることを意味する。一つの実施形態において、前記ヒト対象の血液、骨髄、リンパ節、リンパ液、血液細胞、骨髄細胞、リンパ節細胞、またはリンパ液細胞は、ＩＤＨ変異について分析されている。もう一つの実施形態において、前記ヒト対象の固形組織は、ＩＤＨ変異について分析されている。
【0076】
「Ｂｃｌ－２阻害剤」という用語は、Ｂｃｌ－２に結合し、がん細胞における細胞傷害性、がん細胞におけるＢｃｌ－２発現の下方制御、がん細胞におけるミトコンドリア機能障害、およびがん細胞におけるアポトーシスのうちの１つ以上をもたらす化合物である。その効果を測定する方法は、当業者に既知であり、例えば、Wen M, et al., Front. Pharmacol. 2019; 10: 391に記載がある。
【0077】
本発明の方法の一つの実施形態において、ヒト対象がＩＤＨ１ Ｒ１３２変異を有することを確認する当事者は、第１および第２の化合物を投与する当事者と異なることがある。もう一つの実施形態において、ヒト対象がＩＤＨ１ Ｒ１３２変異を有することを確認する当事者は、第１および第２の化合物を投与する当事者と異なる。もう一つの実施形態において、ヒト対象がＩＤＨ１ Ｒ１３２変異を有することを確認する当事者は、第１および第２の化合物を投与する当事者と同じである。
【0078】
「Ｆｌｔ３変異を有することが確認される」という用語は、ヒト対象の血液細胞、骨髄細胞、または血液細胞および骨髄細胞に由来する核酸（例えば、ＤＮＡ）が分析され、前記ヒト対象が一つ以上のＦｌｔ３変異を有するかどうか判定されたことを意味する。
【0079】
ＩＤＨ１およびＦｌｔ３変異の確認についての分析方法は、当業者に既知であり（Clark, O., et al., Clin. Cancer. Res. 2016; 22: 1837～42）、これらに限らないが、核型分析（Guller JL, et al., J. Mol. Diagn. 2010; 12: 3～16）、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（Yeung DT, et al., Pathology 2011; 43: 566～579）、サンガー法（Lutha, R et al., Haematologica 2014; 99: 465～473）、メタボリックプロファイリング（Miyata S, et al., Scientific Reports 2019; 9: 9787）、ポリメラーゼ連鎖反応法（Ziai, JM and AJ Siddon, Am. J. Clin. Pathol 2015; 144: 539～554）、および次世代シーケンシング（例えば、全トランスクリプトームシーケンシング）（Lutha, R et al., Haematologica 2014; 99: 465-473; WangH-Y, et al., J. Exp. Clin. Cancer Res. 2016; 35: 86）が挙げられる。
【0080】
「治療」、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」という用語、および同類のものは、がんの進行を緩徐化、停止、または逆転させることを包含するように意図されている。これらの用語は、たとえがんが実際に除去されていなくても、およびたとえがんの進行そのものが緩徐化、停止、または逆転していなくても、障害または疾患のうちの１つ以上の症状を軽減、寛解、減弱、除去、または減少させることもまた、包含する。
【0081】
「治療有効量」は、対象の生物学的もしくは医学的応答または対象への望ましい治療効果を誘導する、対象に投与される化合物、またはその薬学的に許容される塩の量を意味する。
【0082】
治療有効量は、当業者として担当の臨床医が、既知の技術を使用し、類似の状況下で得られた結果を観察することによって、容易に決定できる。対象の有効量を決定する際、担当の臨床医は、複数の因子（個々の対象の大きさ、年齢、および全体的な健康；関連する具体的な疾患または障害；疾患もしくは障害の、程度または関与もしくは重症度；個々の対象の反応；投与される特定の化合物；投与方法；投与される製剤のバイオアベイラビリティ特性；選択される投与レジメン；併用薬の使用；およびその他の関連する状況が挙げられるが、これらに限らない）を考慮する。
【0083】
「と組み合わせて」という用語は、式Ｉの化合物が、ＩＤＨ変異を有するヒト対象におけるがんの治療において、同時に、別々に、または連続的に、代謝拮抗剤、もしくはその薬学的に許容される塩；低メチル化剤、もしくはその薬学的に許容される塩、適宜Ｂｃｌ－２阻害剤もしくはその薬学的に許容される塩；または変異Ｆｌｔ３阻害剤；もしくはその薬学的に許容される塩のうちのいずれか１つ以上と組み合わせて用いられるか、または組み合わせて用いるためのものであることを意味する。
【0084】
本発明の方法で投与される化合物は、化合物が生物学的に利用可能となる任意の経路で投与される医薬組成物として適宜製剤化されてもよい。ある実施形態において、かかる組成物は、経口投与用に製剤化される。かかる医薬組成物およびその調製方法は、当技術分野で周知である（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21 st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006を参照）。
【0085】
「薬学的に許容される担体、希釈剤、または添加剤」は、生物活性剤を哺乳動物、例えば、ヒトに運搬するための、当技術分野で一般的に受容される媒質である。
【0086】
本発明の方法で投与される化合物は、塩を形成することができるということを当業者は理解するものである。前記化合物は、複数の無機酸および有機酸のいずれかと反応し、薬学的に許容される酸付加塩を形成する。かかる薬学的に許容される酸付加塩およびそれらの一般的な調製方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌ，ｅｔ ａｌ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８）を参照されたい。
【0087】
「薬学的に許容される塩（pharmaceutically acceptable salts）」または「薬学的に許容される塩（a pharmaceutically acceptable salt）」は、相対的に非毒性な、本発明の化合物の無機塩および有機塩を指す（S.M. Berge, et al., “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977）。
【実施例】
【0088】
材料および方法
化合物および製剤
インビボ実験のために、ビークルを用いて適切な濃度でそれぞれの被験物質を調製する。インビボ実験のために、アカシアビークル（水、１０％ アカシア、０．０５％ Ａｎｔｉｆｏａｍ［Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ １５１０－ＵＳ］）中で、１．１モル当量のＨＣｌとともに化合物Ａを製剤化する。７日おきに、ビークルを用いて化合物Ａを適切な濃度で新しく調製し、投与間は４℃で保存する。水中２０％ ＰＥＧ４００中でミドスタウリン（Medchem Express、バッチ/ロット番号23950）を製剤化し、毎週新たに調製する（投与間は４℃で保存する）。シタラビンの原液を滅菌食塩水で希釈して、シタラビンを毎週新たに調製する（注射剤 ２０ｍｇ／ｍＬ(Pfizer injectables)）。アザシチジン（Sigma、ロット番号MKBR7212）を滅菌水中で製剤化し、毎日投与直前に新しく調製する。
化合物および製剤
インビボ実験のために、ビークルを用いて適切な濃度でそれぞれの被験物質を調製する。インビボ実験のために、アカシアビークル（水、１０％ アカシア、０．０５％ Ａｎｔｉｆｏａｍ［Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ １５１０－ＵＳ］）中で、１．１モル当量のＨＣｌとともに化合物Ａを製剤化する。７日おきに、ビークルを用いて化合物Ａを適切な濃度で新しく調製し、投与間は４℃で保存する。水中２０％ ＰＥＧ４００中でミドスタウリン（Medchem Express、バッチ/ロット番号23950）を製剤化し、毎週新たに調製する（投与間は４℃で保存する）。シタラビンの原液を滅菌食塩水で希釈して、シタラビンを毎週新たに調製する（注射剤 ２０ｍｇ／ｍＬ(Pfizer injectables)）。アザシチジン（Sigma、ロット番号MKBR7212）を滅菌水中で製剤化し、毎日投与直前に新しく調製する。
【0089】
インビボヒトＡＭＬ ＰＤｘモデル
初代ヒトＡＭＬ細胞をメスのＮＯＤ ＳＣＩＤ Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ，ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ＃００５５５７］）マウス（６から７週齢）に尾静脈注射し、ＡＭＬモデルを確立する。本実験では２つのモデルを使用する：（１）ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ），ＮＲａｓ（Ｑ６１Ｈ）初代ヒトＡＭＬおよび（２）ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ），Ｆｌｔ３－ＩＴＤ初代ヒトＡＭＬ。必要に応じて、担がんマウスからの脾細胞を用いて、記載されるようにモデルを増殖および拡張させる。それぞれの被験物質を上記の通りに、適切な濃度でビークルとともに調製し、本実験で試験される薬物を１０μＬ／体重１グラムの用量で動物に投与する。化合物Ａ投与マウス（ＰＯ，ＱＤ）は、実験期間中、指示される用量で治療される。組み合わせの薬剤は、以下の通りに投与される：ミドスタウリン ５０ｍｇ／ｋｇ ＰＯ，ＱＤ（５３日間、化合物Ａ投与開始の７日後に開始)、シタラビン ２ｍｇ／ｋｇ ＩＰ［（ＱＤｘ５、休養 ２）ｘ２］休養 １４ｄおよび繰り返し（２サイクル、化合物Ａ投与開始時に開始）、アザシチジン １ｍｇ／ｋｇ ＩＰ［（ＱＤｘ５、休養 ２）ｘ２］休養 １４ｄおよび繰り返し（２サイクル、化合物Ａ投与開始時に開始）。ビークル治療コントロールマウスおよびナイーブコントロールマウス（非担がん）と比較して、治療を受けたマウスを評価する。１週間に２回、体重を記録する。実験期間中、２週間に１回、顎下を出血させることで全血サンプル（＜１００μＬ）をＫ－ＥＤＴＡ採血管中に回収し、ＦＡＣＳによって分析を行い、実験マウスにおける分化状態および白血病の腫瘍量を観察する（実験期間中、２－ＨＧ分析のために血漿を定期的に回収する）。血漿回収のために、各被験体について、５０から７０μＬの全血を１．５ｍＬマイクロチューブ中に等分し、３００ｘｇで８分間（４℃）遠心する。１０μＬの血漿を回収し、新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移し、２－ＨＧ ＬＣＭＳ分析のために－８０℃で凍結させる。コントロールとしてビークル治療マウス、およびナイーブマウスからの血漿を用いる血漿２－ＨＧの評価により、２－ＨＧ産生の阻害を観察する。フローサイトメトリーのために、５０～７０μＬの全血を回収し、６０μＬ染色／洗浄バッファー（ＤＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００２８）中、５％ 加熱不活性化（ＨＩ）－ＦＢＳ（ｖ/ｖ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １００８２））をチューブごとに添加し、３から４回ピペットで上下にかき混ぜ、１００μＬの血液懸濁液を５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、染色し、下記の通りに分析する。
初代ヒトＡＭＬ細胞をメスのＮＯＤ ＳＣＩＤ Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ，ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ＃００５５５７］）マウス（６から７週齢）に尾静脈注射し、ＡＭＬモデルを確立する。本実験では２つのモデルを使用する：（１）ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ），ＮＲａｓ（Ｑ６１Ｈ）初代ヒトＡＭＬおよび（２）ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ），Ｆｌｔ３－ＩＴＤ初代ヒトＡＭＬ。必要に応じて、担がんマウスからの脾細胞を用いて、記載されるようにモデルを増殖および拡張させる。それぞれの被験物質を上記の通りに、適切な濃度でビークルとともに調製し、本実験で試験される薬物を１０μＬ／体重１グラムの用量で動物に投与する。化合物Ａ投与マウス（ＰＯ，ＱＤ）は、実験期間中、指示される用量で治療される。組み合わせの薬剤は、以下の通りに投与される：ミドスタウリン ５０ｍｇ／ｋｇ ＰＯ，ＱＤ（５３日間、化合物Ａ投与開始の７日後に開始)、シタラビン ２ｍｇ／ｋｇ ＩＰ［（ＱＤｘ５、休養 ２）ｘ２］休養 １４ｄおよび繰り返し（２サイクル、化合物Ａ投与開始時に開始）、アザシチジン １ｍｇ／ｋｇ ＩＰ［（ＱＤｘ５、休養 ２）ｘ２］休養 １４ｄおよび繰り返し（２サイクル、化合物Ａ投与開始時に開始）。ビークル治療コントロールマウスおよびナイーブコントロールマウス（非担がん）と比較して、治療を受けたマウスを評価する。１週間に２回、体重を記録する。実験期間中、２週間に１回、顎下を出血させることで全血サンプル（＜１００μＬ）をＫ－ＥＤＴＡ採血管中に回収し、ＦＡＣＳによって分析を行い、実験マウスにおける分化状態および白血病の腫瘍量を観察する（実験期間中、２－ＨＧ分析のために血漿を定期的に回収する）。血漿回収のために、各被験体について、５０から７０μＬの全血を１．５ｍＬマイクロチューブ中に等分し、３００ｘｇで８分間（４℃）遠心する。１０μＬの血漿を回収し、新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移し、２－ＨＧ ＬＣＭＳ分析のために－８０℃で凍結させる。コントロールとしてビークル治療マウス、およびナイーブマウスからの血漿を用いる血漿２－ＨＧの評価により、２－ＨＧ産生の阻害を観察する。フローサイトメトリーのために、５０～７０μＬの全血を回収し、６０μＬ染色／洗浄バッファー（ＤＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００２８）中、５％ 加熱不活性化（ＨＩ）－ＦＢＳ（ｖ/ｖ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １００８２））をチューブごとに添加し、３から４回ピペットで上下にかき混ぜ、１００μＬの血液懸濁液を５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、染色し、下記の通りに分析する。
【0090】
ＡＭＬ ＰＤｘモデルの増殖
ヒトＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）ＡＭＬ細胞を移植されたマウスは、患者由来のＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）白血病モデルにおける全血サンプルのフローサイトメトリーにより、進行疾患の進行が確認される。下記の通りに脾臓を処理し、脾細胞を単離する。被験体あたり２００μＬの脾細胞調製液をＩＶ（静脈内、尾静脈）で受容ＮＳＧマウスに注射する。（１ｍＬあたり１０ｅ６～２５ｅ６個、マウス１匹あたり２ｅ６～５ｅ６個の生存白血球を用いて、モデルを増やす）。ＡＭＬが末梢血中で確認されるまで（＞０．２％ ヒトＡＭＬ細胞(総白血球数(WBCs)のうちの％ｈＣＤ３３＋ｈＣＤ４５＋)）、フローサイトメトリー分析により４週間に１回、進行を観察する。一度生着が確認されると、実験の準備が整うまでマウスを２週間に１回観察する。マウスを無作為化し、平均％ヒトＡＭＬ（総ＷＢＣｓのうちの）が２～８％に到達したときに実験を開始する。
ヒトＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）ＡＭＬ細胞を移植されたマウスは、患者由来のＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）白血病モデルにおける全血サンプルのフローサイトメトリーにより、進行疾患の進行が確認される。下記の通りに脾臓を処理し、脾細胞を単離する。被験体あたり２００μＬの脾細胞調製液をＩＶ（静脈内、尾静脈）で受容ＮＳＧマウスに注射する。（１ｍＬあたり１０ｅ６～２５ｅ６個、マウス１匹あたり２ｅ６～５ｅ６個の生存白血球を用いて、モデルを増やす）。ＡＭＬが末梢血中で確認されるまで（＞０．２％ ヒトＡＭＬ細胞(総白血球数(WBCs)のうちの％ｈＣＤ３３＋ｈＣＤ４５＋)）、フローサイトメトリー分析により４週間に１回、進行を観察する。一度生着が確認されると、実験の準備が整うまでマウスを２週間に１回観察する。マウスを無作為化し、平均％ヒトＡＭＬ（総ＷＢＣｓのうちの）が２～８％に到達したときに実験を開始する。
【0091】
顎下の血液を回収する。
【0092】
脾臓／脾細胞の処理および調製
切除後、脾臓の重量を量り、脾臓の３／４をＰＢＳが入った標準的な滅菌１５ｍＬポリプロピレン円錐管に入れ、氷上に置く。脾臓の残りの１／４を１０％ ＮＢＦで固定し、病理検査に回す。脾臓を１５ｍＬコレクションチューブ中の氷冷滅菌ＰＢＳの中に入れる。脾臓をコレクションチューブから取り出し、１００ミクロン ５０ｍＬ円錐管用セルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ＃３５２３６０）の中に入れる。５ｍＬシリンジのプランジャーの先端で、円運動で脾臓組織をセルストレーナーの表面に優しくこすり付けることで、脾臓を処理する。処理の間、ストレーナーの表面を１０ｍＬ室温滅菌ＤＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００２８）で３回洗浄する。無傷の脾臓組織が見えなくなった後、ストレーナーの最終的な洗浄を行い、１０ｍＬ滅菌血清用ピペットを用いて細胞調製液を１５回上下にかき混ぜる。遠心分離（３００ｘｇ）によって細胞ペレットを回収し、３０ｍＬ滅菌ＤＰＢＳで３回洗浄する。細胞をカウントし、望ましい移植濃度で、ＤＰＢＳ中で再懸濁する。
切除後、脾臓の重量を量り、脾臓の３／４をＰＢＳが入った標準的な滅菌１５ｍＬポリプロピレン円錐管に入れ、氷上に置く。脾臓の残りの１／４を１０％ ＮＢＦで固定し、病理検査に回す。脾臓を１５ｍＬコレクションチューブ中の氷冷滅菌ＰＢＳの中に入れる。脾臓をコレクションチューブから取り出し、１００ミクロン ５０ｍＬ円錐管用セルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ＃３５２３６０）の中に入れる。５ｍＬシリンジのプランジャーの先端で、円運動で脾臓組織をセルストレーナーの表面に優しくこすり付けることで、脾臓を処理する。処理の間、ストレーナーの表面を１０ｍＬ室温滅菌ＤＰＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３００２８）で３回洗浄する。無傷の脾臓組織が見えなくなった後、ストレーナーの最終的な洗浄を行い、１０ｍＬ滅菌血清用ピペットを用いて細胞調製液を１５回上下にかき混ぜる。遠心分離（３００ｘｇ）によって細胞ペレットを回収し、３０ｍＬ滅菌ＤＰＢＳで３回洗浄する。細胞をカウントし、望ましい移植濃度で、ＤＰＢＳ中で再懸濁する。
【0093】
骨髄回収
１ｍＬのＰＢＳが入った１ｍＬシリンジをつけた２７Ｇから２５Ｇの針を用いて、脛骨および大腿骨から骨髄を回収する。
１ｍＬのＰＢＳが入った１ｍＬシリンジをつけた２７Ｇから２５Ｇの針を用いて、脛骨および大腿骨から骨髄を回収する。
【0094】
ヒト白血球のフローサイトメトリー分析
インビボ実験から顎下の血液サンプルを回収する。製造業者の説明書に従って、蛍光結合抗体染色剤を添加する（抗ヒトＣＤ３３－ＰＥ(クローンＷＭ５３、ＢＤカタログ番号５５５４５０)、抗ヒトＣＤ１４－ＡＰＣ(クローンＭφＰ９、ＢＤカタログ番号３４０４３６)、抗ヒトＣＤ１５－Ｖ４５０(クローンＨＩ９８、ＢＤカタログ番号５６１５８４)、抗ヒトＣＤ１１７－ＢＶ４２１(クローンＹＢ５．Ｂ８、ＢＤカタログ番号５６２４３４)、抗ヒトＣＤ１１ｂ－ＡＰＣＣｙ７(クローンＩＣＲＦ４４、ＢＤカタログ番号５５７７５４)、抗ヒトＣＤ４５－ＰＥＣｙ７(クローンＨＩ３０、ＢＤカタログ番号５５７７４８)、および抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ(クローンＳＫ７、ＢＤカタログ番号３４０５４２)）。３０分間室温で、遮光でサンプルをインキュベートする。インキュベート後、１．５ｍＬ １Ｘ ＢＤ Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ（３７℃(ＢＤカタログ番号５５８０４９)）を各サンプルに添加し、１２分間室温でインキュベートする。チューブを３００ｘｇで７分間遠心する。ＢＤ Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ溶液を吸引し、細胞ペレットを染色／洗浄バッファーで３回洗浄する（１回の洗浄ステップは以下からなる：ペレットを３ｍＬ染色／洗浄バッファー中で再懸濁し、３００ｘｇで遠心し、洗浄バッファーを吸引する）。次に、固定した細胞を３００から４００μＬ染色／洗浄バッファー中で再懸濁する。標準的なフローサイトメトリーの原理および技術を用いて、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ Ｆｌｏｗサイトメーター（カタログ番号６５１１５５ シリアル番号Ｚ６５１１５５０４４７）でサンプルを分析する。サンプルの染色および固定を行ったその日にサンプルを分析する。ポピュレーションのゲーティングおよびポピュレーションの割合のデータ分析をＦＡＣＳＶｅｒｓｅサイトメーター上のＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェアで行う。データ分析から得たポピュレーションのパーセント値をＧｒａｐｈｐａｄ ＰｒｉｓｍまたはＪＭＰ１３でプロットする。動物が疾患に屈する場合、または任意の所定の日に技術的な理由で血液を得ることができない場合、データ点はその日についてはないものとし、それゆえ未検（ＮＤ）となる。
インビボ実験から顎下の血液サンプルを回収する。製造業者の説明書に従って、蛍光結合抗体染色剤を添加する（抗ヒトＣＤ３３－ＰＥ(クローンＷＭ５３、ＢＤカタログ番号５５５４５０)、抗ヒトＣＤ１４－ＡＰＣ(クローンＭφＰ９、ＢＤカタログ番号３４０４３６)、抗ヒトＣＤ１５－Ｖ４５０(クローンＨＩ９８、ＢＤカタログ番号５６１５８４)、抗ヒトＣＤ１１７－ＢＶ４２１(クローンＹＢ５．Ｂ８、ＢＤカタログ番号５６２４３４)、抗ヒトＣＤ１１ｂ－ＡＰＣＣｙ７(クローンＩＣＲＦ４４、ＢＤカタログ番号５５７７５４)、抗ヒトＣＤ４５－ＰＥＣｙ７(クローンＨＩ３０、ＢＤカタログ番号５５７７４８)、および抗ヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ(クローンＳＫ７、ＢＤカタログ番号３４０５４２)）。３０分間室温で、遮光でサンプルをインキュベートする。インキュベート後、１．５ｍＬ １Ｘ ＢＤ Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ（３７℃(ＢＤカタログ番号５５８０４９)）を各サンプルに添加し、１２分間室温でインキュベートする。チューブを３００ｘｇで７分間遠心する。ＢＤ Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ溶液を吸引し、細胞ペレットを染色／洗浄バッファーで３回洗浄する（１回の洗浄ステップは以下からなる：ペレットを３ｍＬ染色／洗浄バッファー中で再懸濁し、３００ｘｇで遠心し、洗浄バッファーを吸引する）。次に、固定した細胞を３００から４００μＬ染色／洗浄バッファー中で再懸濁する。標準的なフローサイトメトリーの原理および技術を用いて、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ Ｆｌｏｗサイトメーター（カタログ番号６５１１５５ シリアル番号Ｚ６５１１５５０４４７）でサンプルを分析する。サンプルの染色および固定を行ったその日にサンプルを分析する。ポピュレーションのゲーティングおよびポピュレーションの割合のデータ分析をＦＡＣＳＶｅｒｓｅサイトメーター上のＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェアで行う。データ分析から得たポピュレーションのパーセント値をＧｒａｐｈｐａｄ ＰｒｉｓｍまたはＪＭＰ１３でプロットする。動物が疾患に屈する場合、または任意の所定の日に技術的な理由で血液を得ることができない場合、データ点はその日についてはないものとし、それゆえ未検（ＮＤ）となる。
【0095】
ＡＭＬ ＰＤｘモデルの血漿中のＬＣ－ＭＳ代謝産物分析
２－ＨＧおよびα－ＫＧの合計濃度に及ぼすＩＤＨ１阻害の効果を血漿の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により決定する。２－ＨＧおよびα－ＫＧを水に添加することで検量線を準備する。この方法では、ＬＣ－ＭＳによる分析の前に、Ｏ－ベンジルヒドロキシルアミンによる誘導体化を利用した。１０マイクロリットルの各スタンダードまたはサンプルをディープウェルの９６ウェルプレートに入れ、１０μＭ ｄ５－３－ヒドロキシグルタル酸および１０μＭ ｄ６－α－ＫＧを含む１００μＬの内部標準液と組み合わせる。次に血漿サンプルを２１０ｕＬ ４：３ メタノール：クロロホルムで処理し、遠心分離し、上清を除去し、乾燥させる。１００ｕＬのピリジン緩衝液（８．６％ ピリジン、ｐＨ５）中、１Ｍ Ｏ－ベンジルヒドロキシルアミンおよび１００ｕＬのピリジン緩衝液中、１Ｍ Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を各サンプルに添加する。誘導体化反応は室温で１時間かけて進む。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸリキッドハンドラーを用いて、３００μＬの酢酸エチルを各サンプルに添加する。プレートを密閉し、５分間ボルテックスし、その後５分間、４０００ｒｐｍで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ遠心分離機で遠心する。２２０μＬの上層を新しい９６ウェルプレートに移す。サンプルを加熱窒素下で、５０℃で乾燥させ、１００ｕＬのメタノール／水（１：１）でもどす。１マイクロリットルの誘導体化サンプルをＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ２０Ａ ＨＰＬＣシステムおよびＴｈｅｒｍｏ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（商標）三連四重極型質量分析計からなるＬＣ－ＭＳシステムに注入する。分析物をＷａｔｅｒ ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｃ１８カラム（２．１ｘ５０ｍｍ、３．５μｍ）で、０．６ｍＬ／分の流速で分離する。移動相Ａは０．１％ ギ酸水溶液であり、移動相Ｂはメタノールである。勾配プロファイルは、０分、５％ Ｂ；２分、１００％ Ｂ；４．００分、１００％ Ｂ；４．１分、５％ Ｂ；５．５０分、終了。質量分析計は、正イオン選択反応モニタリングモードで操作されるＨＥＳＩ－ＩＩプローブを利用する。分析物濃度対分析物／内部標準ピーク面積比をプロットし、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標）ソフトウェアで１／濃度重み付けを用いるデータの二次フィットを実行することで、検量線を作成する。未知の分析物濃度を検量線から逆算する。
２－ＨＧおよびα－ＫＧの合計濃度に及ぼすＩＤＨ１阻害の効果を血漿の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により決定する。２－ＨＧおよびα－ＫＧを水に添加することで検量線を準備する。この方法では、ＬＣ－ＭＳによる分析の前に、Ｏ－ベンジルヒドロキシルアミンによる誘導体化を利用した。１０マイクロリットルの各スタンダードまたはサンプルをディープウェルの９６ウェルプレートに入れ、１０μＭ ｄ５－３－ヒドロキシグルタル酸および１０μＭ ｄ６－α－ＫＧを含む１００μＬの内部標準液と組み合わせる。次に血漿サンプルを２１０ｕＬ ４：３ メタノール：クロロホルムで処理し、遠心分離し、上清を除去し、乾燥させる。１００ｕＬのピリジン緩衝液（８．６％ ピリジン、ｐＨ５）中、１Ｍ Ｏ－ベンジルヒドロキシルアミンおよび１００ｕＬのピリジン緩衝液中、１Ｍ Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を各サンプルに添加する。誘導体化反応は室温で１時間かけて進む。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸリキッドハンドラーを用いて、３００μＬの酢酸エチルを各サンプルに添加する。プレートを密閉し、５分間ボルテックスし、その後５分間、４０００ｒｐｍで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ遠心分離機で遠心する。２２０μＬの上層を新しい９６ウェルプレートに移す。サンプルを加熱窒素下で、５０℃で乾燥させ、１００ｕＬのメタノール／水（１：１）でもどす。１マイクロリットルの誘導体化サンプルをＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ２０Ａ ＨＰＬＣシステムおよびＴｈｅｒｍｏ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（商標）三連四重極型質量分析計からなるＬＣ－ＭＳシステムに注入する。分析物をＷａｔｅｒ ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｃ１８カラム（２．１ｘ５０ｍｍ、３．５μｍ）で、０．６ｍＬ／分の流速で分離する。移動相Ａは０．１％ ギ酸水溶液であり、移動相Ｂはメタノールである。勾配プロファイルは、０分、５％ Ｂ；２分、１００％ Ｂ；４．００分、１００％ Ｂ；４．１分、５％ Ｂ；５．５０分、終了。質量分析計は、正イオン選択反応モニタリングモードで操作されるＨＥＳＩ－ＩＩプローブを利用する。分析物濃度対分析物／内部標準ピーク面積比をプロットし、Ｘｃａｌｉｂｕｒ（商標）ソフトウェアで１／濃度重み付けを用いるデータの二次フィットを実行することで、検量線を作成する。未知の分析物濃度を検量線から逆算する。
【0096】
統計的手法
Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄ（ＩＶＥＦ実験のためのＢｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）は、結果を分析するのに利用され得る。通常の反復測定モデルは、ｌｏｇ体積対群および時間に適合する。Ｃｏｎｔｒａｓｔステートメントは、併用される２つの具体的な治療を用いて、各タイムポイントで交互作用効果を検定するために使用される。これは、Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ法と同等であり、腫瘍体積が、理論上は０に到達し得る、すなわち、完全退縮し得ると仮定する。
Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄ（ＩＶＥＦ実験のためのＢｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）は、結果を分析するのに利用され得る。通常の反復測定モデルは、ｌｏｇ体積対群および時間に適合する。Ｃｏｎｔｒａｓｔステートメントは、併用される２つの具体的な治療を用いて、各タイムポイントで交互作用効果を検定するために使用される。これは、Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ法と同等であり、腫瘍体積が、理論上は０に到達し得る、すなわち、完全退縮し得ると仮定する。
【0097】
組み合わせについて予想される相加反応（ＥＡＲ）は、反応（ＥＡＲ）として腫瘍体積スケールで算出される：ＥＡＲ体積＝Ｖ１＊Ｖ２／Ｖ０（式中、Ｖ０、Ｖ１、およびＶ２は、それぞれビークルコントロール、治療１単独、および治療２単独の推定平均腫瘍体積である）。相互作用検定が有意である場合、組み合わせ効果はそれぞれ、観察される併用時の平均体積がＥＡＲ体積よりも小さいか、または大きいかによって、相加効果以上または相加効果未満であると統計学的に断言される。そうでなければ、統計的結論は相加的である。
【0098】
腫瘍増殖停止が、期待される最高の反応である場合、Ｂｌｉｓｓ法を％デルタＴ／Ｃ値に直接適用し、ＥＡＲパーセント反応を得ることができる：ＥＡＲ％デルタＴ／Ｃ＝Ｙ１＊Ｙ２／１００（式中、Ｙ１およびＹ２は、単剤治療のパーセントデルタＴ／Ｃ値である）。
【0099】
１．化合物Ａおよびシタラビンの組み合わせ
本質的に上記の通り実施された実験において、表１Ａ～１Ｄの結果は、化合物Ａおよびシタラビンの組み合わせについて得られたものである。
本質的に上記の通り実施された実験において、表１Ａ～１Ｄの結果は、化合物Ａおよびシタラビンの組み合わせについて得られたものである。
【0100】
【表1】
【0101】
４７日目において、各治療群の％血漿ＡＭＬ細胞はそれぞれ、Ａ：ビークル（８６％）；Ｂ：化合物Ａ（３９％）；Ｃ：シタラビン（５．２％）；およびＥ：化合物Ａ＋シタラビン（０．４８％）（ｐ＜０．００１）である。
【0102】
【表2】
【0103】
４７日目において、各治療群の％ＡＭＬ細胞分化はそれぞれ、Ａ：ビークル（１０％）；Ｂ：化合物Ａ（３７％）；Ｃ：シタラビン（８％）；およびＥ：化合物Ａ＋シタラビン（７１％）（ｐ＜０．００１）である。
【0104】
【表3】
【0105】
【表4】
【0106】
結論として、化合物Ａおよびシタラビンの組み合わせは、骨髄および末梢の両方においてＡＭＬの抑制を高める。
【0107】
２．化合物Ａおよびアザシチジンの組み合わせ
本質的に上記の通り実施された実験において、表２Ａ～２Ｄの結果は、化合物Ａおよびアザシチジンの組み合わせについて得られたものである。
本質的に上記の通り実施された実験において、表２Ａ～２Ｄの結果は、化合物Ａおよびアザシチジンの組み合わせについて得られたものである。
【0108】
【表5】
【0109】
４３日目において、各治療群の％血漿ＡＭＬ細胞はそれぞれ、Ａ：ビークル（７１％）；Ｂ：化合物Ａ（５２％）；Ｇ：アザシチジン（２２％）；およびＨ：化合物Ａ＋アザシチジン（９．７％）（ｐ＜０．０２３）である。
【0110】
【表6】
【0111】
４３日目において、各治療群の％ＡＭＬ細胞分化はそれぞれ、Ａ：ビークル（１５％）；Ｂ：化合物Ａ（３７％）；Ｇ：アザシチジン（１０％）；およびＨ：化合物Ａ＋アザシチジン（５９％）（ｐ＜０．００１）である。
【0112】
【表7】
【0113】
【表8】
【0114】
結論として、化合物Ａおよびアザシチジンの組み合わせは、骨髄および末梢の両方においてＡＭＬの抑制を高める。
【0115】
３．化合物Ａおよびミドスタウリンの組み合わせ
本質的に上記の通り実施された実験において、表３Ａ～３Ｄの結果は、化合物Ａおよびミドスタウリンの組み合わせについて得られたものである。
本質的に上記の通り実施された実験において、表３Ａ～３Ｄの結果は、化合物Ａおよびミドスタウリンの組み合わせについて得られたものである。
【0116】
【表9】
【表10】
【0117】
５０日目において、各治療群の％血漿ＡＭＬ細胞はそれぞれ、Ａ：ビークル（３２％）；Ｂ：１ｍｇ 化合物Ａ（３７％）；Ｆ：ミドスタウリン（１．１％）；およびＩ：１ｍｇ 化合物Ａ＋ミドスタウリン（２．２％）（ｐ＝０．４７３）である。
【0118】
５０日目において、各治療群の％血漿ＡＭＬ細胞はそれぞれ、Ａ：ビークル（３２％）；Ｃ：１０ｍｇ 化合物Ａ（２．８％）；Ｆ：ミドスタウリン（１．１％）；およびＬ：１０ｍｇ 化合物Ａ＋ミドスタウリン（０．６％）（ｐ＝０．０１６）である。
【0119】
６４日目において、各治療群の％血漿ＡＭＬ細胞はそれぞれ、Ａ：ビークル（６７％）；Ｂ：１ｍｇ 化合物Ａ（５１％）；Ｆ：ミドスタウリン（２．２％）；およびＩ：１ｍｇ 化合物Ａ＋ミドスタウリン（１．３％）（ｐ＝０．７６７）である。
【0120】
６４日目において、各治療群の％血漿ＡＭＬ細胞はそれぞれ、Ａ：ビークル（６７％）；Ｃ：１０ｍｇ 化合物Ａ（１．１％）；Ｆ：ミドスタウリン（２．２％）；およびＬ：１０ｍｇ 化合物Ａ＋ミドスタウリン（０．５６％）（ｐ＜０．００１）である。
【0121】
７８日目において、各治療群の％血漿ＡＭＬ細胞はそれぞれ、Ａ：ビークル（１２９％）；Ｂ：１ｍｇ 化合物Ａ（６５％）；Ｆ：ミドスタウリン（３．９％）；およびＩ：１ｍｇ 化合物Ａ＋ミドスタウリン（１．６％）（ｐ＝０．８２９）である。
【0122】
７８日目において、各治療群の％血漿ＡＭＬ細胞はそれぞれ、Ａ：ビークル（１２９％）；Ｃ：１０ｍｇ 化合物Ａ（０．６６％）；Ｆ：ミドスタウリン（３．９％）；およびＬ：１０ｍｇ 化合物Ａ＋ミドスタウリン（０．２５％）（ｐ＜０．００１）である。
【0123】
【表11】
【0124】
５０日目において、各治療群の％ＡＭＬ細胞分化はそれぞれ、Ａ：ビークル（２８％）；Ｂ：１ｍｇ 化合物Ａ（４３％）；Ｆ：ミドスタウリン（３３％）；およびＩ：１ｍｇ 化合物Ａ＋ミドスタウリン（８１％）（ｐ＜０．００１）である。
【0125】
５０日目において、各治療群の％ＡＭＬ細胞分化はそれぞれ、Ａ：ビークル（２８％）；Ｃ：１０ｍｇ 化合物Ａ（７９％）；Ｆ：ミドスタウリン（３３％）；およびＬ：１０ｍｇ 化合物Ａ＋ミドスタウリン（８０％）（ｐ ０．７７６）である。
【0126】
【表12】
【0127】
各治療群の％骨髄ＡＭＬクリアランスはそれぞれ、Ａ：ビークル（８６％）；Ｃ：１０ｍｇ 化合物Ａ（２．３％）；Ｆ：ミドスタウリン（２６％）；およびＬ：１ｍｇ 化合物Ａ＋ミドスタウリン（０．５８％）（ｐ＝０．９０６）である。
【0128】
【表13】
【0129】
各治療群の％血漿２－ＨＧはそれぞれ、Ａ：ビークル（１００％）；Ｃ：１０ｍｇ 化合物Ａ（９．２％）；Ｆ：ミドスタウリン（７０％）；およびＬ：１０ｍｇ 化合物Ａ＋１０ｍｇ ミドスタウリン（６．８％）（ｐ＝０．３７３）である。
【0130】
結論として、化合物Ａおよびミドスタウリンの組み合わせは、骨髄および末梢の両方においてＡＭＬの抑制を高める。