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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-02
(45)【発行日】2024-12-10
(54)【発明の名称】毛乳頭細胞のＦＧＦ－７産生促進剤およびＶＥＧＦ産生促進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/06 20060101AFI20241203BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241203BHJP
【ＦＩ】
A61K38/06 ZNA
A61P43/00 111
A61P43/00 121
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2021150798
(22)【出願日】2021-09-16
(62)【分割の表示】P 2021521073の分割
【原出願日】2020-09-23
(65)【公開番号】P2021193134
(43)【公開日】2021-12-23
【審査請求日】2023-09-21
(31)【優先権主張番号】P 2019190689
(32)【優先日】2019-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】398034593
【氏名又は名称】株式会社アジュバンホールディングス
(73)【特許権者】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100185258
【弁理士】
【氏名又は名称】横井 宏理
(74)【代理人】
【識別番号】100134131
【弁理士】
【氏名又は名称】横井 知理
(72)【発明者】
【氏名】中村 荘太
(72)【発明者】
【氏名】高橋 秀樹
(72)【発明者】
【氏名】中池 佑紀美
(72)【発明者】
【氏名】永谷 貴弘
(72)【発明者】
【氏名】金澤 由紀
(72)【発明者】
【氏名】辻 孝
(72)【発明者】
【氏名】小川 美帆
【審査官】柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１１－５２４８８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５２５２６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５３５３１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１５７６９２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０５１４７５３４（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０６７９８６５５（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／０６
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を含む毛乳頭細胞のＦＧＦ－７産生促進剤。
【請求項2】
パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を含む毛乳頭細胞のＶＥＧＦ産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、育毛剤に関する。さらに詳しくは、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を含む外用剤である育毛剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトを始めとする哺乳動物において、育毛効果および毛種・毛質を改善する育毛剤などの外用剤の需要が伸びている。育毛効果および毛種・毛質を改善のため、毛のライフサイクルである毛周期を調節することに寄与する有効成分が提案され、育毛剤として上市されつつある。
【0003】
たとえば、育毛剤の有効成分としてミノキシジルの利用が提案され（特許文献１～３などを参照。）、ヒト臨床試験を経て、ミノキシジルを有効成分とする育毛剤が上市されている。しかしながら、その医薬用途は本邦においては男性の壮年性脱毛症に限られるなど、育毛効果および毛種・毛質改善効果を所望する幅広い消費者の要望を十分に叶えるものとはなっていない。
【0004】
また、育毛剤の有効成分としてchiro-イノシトールの利用が提案されている（特許文献４を参照。）。しかしながら、特許文献４に記載のchiro-イノシトールを含む外用剤である育毛剤は、インスリン抵抗性ではない対象においてのみ育毛効果が裏付けられるに留まり、投与対象者が限られている。そのため、育毛効果および毛種・毛質改善効果を所望する幅広い消費者の要望を十分に叶えるものとはなっていない。
【0005】
パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸は、化粧品原材料として知られている（特許文献５を参照。）。しかしながら、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の育毛効果に関する報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】米国特許第４１３９６１９号明細書
【文献】特開昭６３－１５０２１１号公報
【文献】特開昭６３－１４５２１７号公報
【文献】国際公開第２０１７／１８８３９３号
【文献】特許第５０２８４７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、優れた育毛作用を有する育毛剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を有効成分とすることで、優れた育毛活性を発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
上記の課題を解決するための本発明の第１の手段は、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を含む外用剤である育毛剤である。
【0010】
上記の課題を解決するための本発明の第２の手段は、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の含有量が全体に対して０．００１～２０重量％である、本発明の第１の手段に記載の育毛剤である。
【0011】
上記の課題を解決するための本発明の第３の手段は、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の含有量が全体に対して０．００５～１０重量％である、本発明の第１の手段または第２の手段に記載の育毛剤である。
【0012】
上記の課題を解決するための本発明の第４の手段は、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸とを含有してなり、その質量比（パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニン／パルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸）が９９／１～１／９９である、本発明の第１～第３の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
【0013】
上記の課題を解決するための本発明の第５の手段は、毛幹成長促進または発毛に用いるための、本発明の第１～第４の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
【0014】
上記の課題を解決するための本発明の第６の手段は、毛幹伸長速度を向上させるために使用する、本発明の第１～第５の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
【0015】
上記の課題を解決するための本発明の第７の手段は、毛幹最大長を向上させるために使用する、本発明の第１～第５の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
【0016】
上記の課題を解決するための本発明の第８の手段は、毛幹径を増大させるために使用する、本発明の第１～第５の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
【0017】
上記の課題を解決するための本発明の第９の手段は、毛数を増加させるために使用する、本発明の第１～第５の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
【0018】
上記の課題を解決するための本発明の第１０の手段は、溶液である、本発明の第１～第９の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
【0019】
上記の課題を解決するための本発明の第１１の手段は、頭髪、眉毛および／または睫毛用の、本発明の第１～第１０の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤である。
【0020】
上記の課題を解決するための本発明の第１２の手段は、本発明の第１～第１１の手段のいずれか１の手段に記載の育毛剤を対象に投与することを含む育毛方法である。
【0021】
上記の課題を解決するための本発明のその他の手段は、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を含む外用剤であるスカルプケア剤である。
【0022】
上記の課題を解決するための本発明のその他の手段は、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を含む外用剤であるスカルプケア剤を対象に投与することを含む頭皮症状改善方法である。
【発明の効果】
【0023】
本発明の手段により、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を、外用剤である育毛剤の有効成分とすることで、頭髪、眉毛および／または睫毛における毛幹成長促進、毛幹伸長速度の向上、毛幹最大長の向上、毛幹径の増大の効果並びにスカルプケア効果が奏される優れた育毛剤およびスカルプケア剤が提供されることとなる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】図１は、６０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない６０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図2】図２は、ミノキシジル（５％）を含む６０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない６０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図3】図３は、ミノキシジル（３％）を含む６０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない６０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図4】図４は、ミノキシジル（１％）を含む６０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない６０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図5】図５は、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸（３％）を含む６０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない６０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図6】図６は、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸（１％）を含む６０％エタノール水溶液の塗布後の、マウスの薬剤塗布部位における毛幹長の変化を示すプロットである。縦軸は毛幹長（ｍｍ）を表し、横軸は日数を表す。なお、第一毛周期は、薬剤を含まない６０％エタノール水溶液を塗布した標準データを示す。
【図7】図７は、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物による細胞分裂活性評価を示す。ＢｒｄＵ取り込みが確認できる細胞を上向きの矢印で示した。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明を実施するための形態について、以下に説明する。なお、本発明はこれらの例示にのみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々の変更を加え得ることは勿論である。
【0026】
本発明に係る外用剤である育毛剤およびスカルプケア剤の有効成分は、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニン（Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ－５ Ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔｙｌｏｙｌ Ｈｙｄｒｏｘｙｔｈｒｅｏｎｉｎｅ（Ｐａｌｍ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｄａｂ－Ｔｈｒ－ＯＨ））およびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸（Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ－５ Ｄｉａｍｉｎｏｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（Ｐａｌｍ－Ｌｙｓ－Ｖａｌ－Ｄａｂ－ＯＨ））とからなる。
【0027】
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤における有効成分であるパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物の濃度は、育毛剤およびスカルプケア剤の全体に対し、０．００１～２０重量％である。より具体的には、０．００５～１０重量％である。
【0028】
本発明のパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸とを含有してなる育毛剤の質量比（パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニン／パルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸）は、９９／１～１／９９である。
【0029】
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤は、医薬品、医薬部外品、頭髪、眉毛および／または睫毛用化粧品および頭皮用化粧品を含む化粧品などとし、軟膏、パップ、リニメント、ローション、外用液剤、散布剤、クリーム、ジェル、乳液、ヘアトニック、ヘアスプレーなどといった様々な態様の製剤として使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【0030】
また、さらに、本発明の育毛効果およびスカルプケア効果を妨げない程度において、医薬品、医薬部外品、頭髪、眉毛および／または睫毛用化粧品および頭皮用化粧品を含む化粧品などにおいて通常含有することが許容される添加物等の成分を、配合したものとしてもよい。この添加物等の成分としては、例えば賦形剤、安定剤、矯臭剤、基剤、分散剤、希釈剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性重合体、非イオン性重合体、エチレンオキシド・プロピレンオキシドブロック共重合体、アルコール類、乳化剤、経皮吸収促進剤、ｐＨ調整剤、保存剤、着色剤、油脂、鉱物油などの油分、保湿剤、増粘剤、ポリマー、皮膜形成剤、紫外線吸収剤、細胞賦活剤、保湿剤、無機塩、機能性ビーズ・カプセル類、シリコーン類、金属キレート剤、酸化防止剤、防腐剤、清涼剤、消臭剤、顔料、染料、香料、糖類、アミノ酸類、ビタミン類、有機酸、有機アミン、植物抽出物、粘土鉱物や各種ポリマーなどの粘度調整剤などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【0031】
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤は、発毛、育毛、養毛などの効果を有する公知の成分を含有するものとしてもよい。
【0032】
本発明の手段における育毛剤およびスカルプケア剤の１投与あたりの有効成分の投与量は、本発明の育毛剤およびスカルプケア剤の効果が奏されるように調節することができる。そして、その投与量は、例えば０．００５～２００ｍｇ、具体的には０．０５～１００ｍｇ、より具体的には０．５～１０ｍｇとすることができる。
【0033】
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤の投与回数は、本発明の育毛剤およびスカルプケア剤の効果が奏されるよう、１回もしくは複数回とすることができる。そして、本発明の育毛剤およびスカルプケア剤の投与回数は、例えば１日あたり１～６回とすることができる。そして、具体的には１日あたり１～３回、より具体的には１日あたり１～２回とすることができる。
【0034】
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤は、毛幹成長促進、発毛および脱毛防止に関するものであり、好ましくは毛幹成長促進および発毛に関するものである。
【0035】
本明細書において、「毛幹成長促進」との用語は、毛幹伸長速度を向上させること、毛幹最大長を向上させること、および／または毛幹径を増大させることを意味する。
【0036】
本明細書において、「発毛」との用語は、毛が生えていない（表皮から外に毛幹が出ていない）または毛数の少ない部位において発毛が停止した、または発毛能力が低下した毛穴から新しい毛が生えることを促進して毛数を増加させることを意味し、詳細には、毛周期における休止期を短縮すること、および／または停止した毛周期を再開させることを意味する。
【0037】
本明細書において、「毛幹成長促進効果を有する」とは毛幹成長促進に有利に作用することを意味し、毛幹成長促進効果を示す特質を「毛幹成長促進活性」と称する。また、「発毛効果を有する」とは発毛に有利に作用することを意味し、発毛効果を示す特質を「発毛促進活性」と称する。
【0038】
本明細書において、「脱毛」との用語は毛穴から毛幹が脱落する現象を意味し、詳細には、細胞増殖を阻害する抑制性サイトカイン等の増加および、それらの細胞死を意味する。脱毛防止効果を示す特質を「脱毛防止活性」と称する。また、「脱毛防止効果を有する」とは、抑制サイトカインの阻害もしくは減少、および細胞死の抑制を介して、毛穴からの毛幹の脱落数が減少することを意味し、毛幹成長促進、発毛効果を示す特質とは異なる生理現象である。
【0039】
本明細書において、「頭皮症状」とは、ふけ、頭皮の肌荒れ、頭皮のかさつき、紅斑、かゆみ、吹き出物などの症状を意味する。そして、本明細書において「頭皮症状改善」とは、ふけ、頭皮の肌荒れ、頭皮のかさつき、紅斑、かゆみ、吹き出物などの抑制又は改善を意味する。
【0040】
本発明の育毛剤は、毛幹伸長速度または毛幹最大長を向上させるために使用することができる。そして、毛幹伸長速度については、毛周期の標準データにおける毛幹伸長速度と比較して、例えば最大１１０％程度向上させることができ、具体的には２５～１１０％程度向上させることができ、より具体的には３３～１１０％程度向上させることができる。また、毛幹最大長については、毛周期の標準データにおける毛幹最大長と比較して、例えば最大４９％程度向上させることができ、具体的には１～４９％程度向上させることができ、より具体的には２～４９％程度向上させることができる。
【0041】
本発明の育毛剤は、毛幹径を増大させるために使用することができる。
【0042】
本発明の育毛剤は、毛が生えていない（表皮から外に毛幹が出ていない）または毛数の少ない部位において発毛が停止した、または発毛能力が低下した毛穴から新しい毛が生えることを促進して毛数を増加させるために使用することができ、詳細には毛周期における休止期を短縮する、および／または停止した毛周期を再開させるために使用することができる。
【0043】
本発明の育毛剤およびスカルプケア剤は、ヒトの他、家畜や愛玩動物などの動物用に使用することもできる。本発明の１つの側面において、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を含む外用剤を、ヒト及び家畜や愛玩動物などの動物を含む対象に投与することを含む、育毛方法および頭皮症状改善方法が提供される。
【実施例】
【0044】
＜試験例１：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物による育毛活性評価＞
【0045】
１． 材料と方法
（１）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（オス）およびＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス）を日本エスエルシー株式会社（日本）より購入し、飼育の後に以下の実験に供した。なお、動物の飼育および試験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
（１）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（オス）およびＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス）を日本エスエルシー株式会社（日本）より購入し、飼育の後に以下の実験に供した。なお、動物の飼育および試験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
【0046】
（２）試薬
以下の試薬をそれぞれ用意した。
比較例１：６０％エタノール水溶液
比較例２：ミノキシジル ５％溶液
比較例３：ミノキシジル ３％溶液
比較例４：ミノキシジル １％溶液
実施例１：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ３％溶液
実施例２：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 １％溶液
以下の試薬をそれぞれ用意した。
比較例１：６０％エタノール水溶液
比較例２：ミノキシジル ５％溶液
比較例３：ミノキシジル ３％溶液
比較例４：ミノキシジル １％溶液
実施例１：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ３％溶液
実施例２：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 １％溶液
【0047】
（３）マウス背部体毛皮膚由来の皮膚試験片の作製
【0048】
抜毛後１２～１４日目の成長期ＶＩ皮膚を背部体毛皮膚として採取するため、７～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの背部体毛皮膚採取予定部位を抜毛し、１２～１４日飼育した。その後、抜毛したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを頸椎脱臼により安楽死させた後に、背部体毛皮膚採取予定部位から背部体毛皮膚を適量採取した。
【0049】
採取した皮膚は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０％牛胎児血清、および１％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ培地（以下、「ＤＭＥＭ１０」という。）に浸した。採取した背部体毛皮膚を先曲がりピンセットでつまみ、滅菌用溶液に１０秒浸して処理する。ポビドンヨード７％溶液処理２回、ＰＢＳ（－）処理３回、ＤＭＥＭ１０処理２回の順で、それぞれ新鮮な溶液を用いて滅菌処理を行った。滅菌処理後、清浄なＤＭＥＭ１０中に浸漬した。
【0050】
滅菌処理後の背部体毛皮膚を切り分け、ブロック化する。皮膚の皮筋層に付着している透明な結合組織を曲ハサミを用いて切除し、毛群を毛流に沿って長方形の短冊状に切り分ける。その際、毛包が短軸５列になるように調整し、長軸の毛包が６列になるようにして切り分け、ブロック化した。
【0051】
（４）皮膚試験片のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスへの移植
【0052】
上記で作製した背部体毛皮膚由来の皮膚試験片を、４～６週齢のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに移植する。定法に従い、マウスに対してイソフルランによるガス麻酔を行った。次いで、マウスの背部をポビドンヨード７％溶液にて消毒した後、自然横臥位をとらせた。そして、マニーオフサルミックナイフ（マニー株式会社、日本）を用いてマウスの背部を穿刺し、皮膚表皮層から真皮層下層部に至る移植創を形成した。
【0053】
形成された移植創へ、背部体毛皮膚由来の皮膚試験片を、移植創の体表側に毛群が向くようにして挿入した。皮膚試験片の移植深度は、移植創上端部に毛群の上端部が露出した状態となるように調節した。次いで、背部体毛皮膚由来の皮膚試験片が移植された移植創を、ナースバン（登録商標）（株式会社サンプラネット、日本）およびサージカルテープ（スリーエム ジャパン株式会社、日本）を保護テープとして用いて被覆し、移植創を保護した。
【0054】
移植後５－７日で保護テープを除去し、移植した背部体毛皮膚由来の皮膚試験片の生着を目視またはデジタルマイクロスコープ（株式会社キーエンス、日本）で判定した後に経過観察を行った。
【0055】
（５）移植皮膚試験片への薬剤塗布
毛周期の１周期目は、６０％エタノール水溶液をプラセボとして塗布する。上記の皮膚試験片を移植したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに、マイクロピペットを用いて２５μＬの６０％エタノールを、皮膚試験片の生着させた左右の背部にそれぞれ塗布した。その後、ドライヤーを用いて冷風をあててエタノールを素早く乾燥させた。この作業を、マウス左右背部に各４回ずつ繰り返した。
毛周期の１周期目は、６０％エタノール水溶液をプラセボとして塗布する。上記の皮膚試験片を移植したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに、マイクロピペットを用いて２５μＬの６０％エタノールを、皮膚試験片の生着させた左右の背部にそれぞれ塗布した。その後、ドライヤーを用いて冷風をあててエタノールを素早く乾燥させた。この作業を、マウス左右背部に各４回ずつ繰り返した。
【0056】
毛周期の２周期目以降は、上記の方法に従い、毛群移植したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに、６０％エタノール水溶液に換えて、各種濃度のパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合溶液を塗布した。
【0057】
（６）発毛経過観察および組織学的分析
Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの皮膚試験片の移植部位から３領域をそれぞれ選択し、それら領域からそれぞれ５本の毛を選択して、発毛の状態を確認し記録した。観察と記録は、目視およびデジタルマイクロスコープ（株式会社キーエンス、日本）により行った。
Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの皮膚試験片の移植部位から３領域をそれぞれ選択し、それら領域からそれぞれ５本の毛を選択して、発毛の状態を確認し記録した。観察と記録は、目視およびデジタルマイクロスコープ（株式会社キーエンス、日本）により行った。
【0058】
２． 結果
【0059】
薬剤ごとに、１～３日おきに毛幹の長さを計測し、経時的に変化する各時点での毛幹の長さの平均値を１つのドットとしてグラフにプロットし、同様のプロットを３匹分繰返した。結果を表１～６および図１～６に示す。
【0060】
【表1】
【0061】
【表2】
【0062】
上記表２中、＊はｐ＜０．０５で有意であることを示す。
【0063】
【表3】
【0064】
上記表３中、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１で有意であることを示す。
【0065】
【表4】
【0066】
上記表４中、＊＊はｐ＜０．０１で有意であることを示す。
【0067】
【表5】
【0068】
上記表５中、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１で有意であることを示す。
【0069】
【表6】
【0070】
上記表６中、＊はｐ＜０．０５で有意であることを示す。
【0071】
マウスの皮膚試験片の移植部位に、６０％エタノール水溶液を塗布した場合には、溶液塗布を行っていない標準データと比較して、毛幹成長速度および毛幹最大長はいずれも有意差は見られず、育毛活性は認められなかった(表１および図１を参照。)。
【0072】
マウスの皮膚試験片の移植部位に、ミノキシジルを５％、３％、または１％含有する溶液を塗布した場合には、標準データと比較して毛幹成長速度および毛幹最大長がともに有意に向上しており、育毛活性が認められた（表２～４および図２～４を参照。）。
【0073】
一方、マウスの皮膚試験片の移植部位に、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物を３％で含有する溶液を塗布した場合には、標準データと比較して毛幹成長速度は有意に向上した。また、毛幹最大長は、有意差が見られないが向上していた（表５および図５を参照。）。これらの結果から、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物を３％で含有する溶液には、育毛活性が認められた。
【0074】
一方、マウスの皮膚試験片の移植部位に、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物を１％で含有する溶液を塗布した場合には、標準データと比較して毛幹成長速度は第二毛周期に有意差が見られず、毛幹最大長は第三毛周期に有意差が見られないが向上していた（表６および図６を参照。）。これらの結果から、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物を１％で含有する溶液の育毛活性は、有意傾向であった。
【0075】
したがって、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の育毛活性の有効下限濃度は、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物の含有量として、１％から３％の間であることが示唆された。
【0076】
＜試験例２：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物による細胞分裂活性評価＞
【0077】
１． 材料と方法
（１）実験動物
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（日本エスエルシー株式会社、日本）より背部体毛皮膚を採取した。動物の飼育および実験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
（１）実験動物
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（日本エスエルシー株式会社、日本）より背部体毛皮膚を採取した。動物の飼育および実験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
【0078】
（２）薬剤
以下の薬剤をそれぞれ用意した。
実施例１：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ３％溶液
実施例２：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 １％溶液
比較例１：６０％エタノール水溶液
比較例５：ＲｉＵＰＸ５ＰＬＵＳ（大正製薬、日本）
以下の薬剤をそれぞれ用意した。
実施例１：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ３％溶液
実施例２：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 １％溶液
比較例１：６０％エタノール水溶液
比較例５：ＲｉＵＰＸ５ＰＬＵＳ（大正製薬、日本）
【0079】
（３）薬剤塗布
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの背部の体毛を抜毛した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの左右背部に、マイクロピペットを用いて２５μＬの薬剤を塗布した。その後、塗布部位にドライヤーを用いて冷風をあてて薬剤を素早く乾燥させた。この作業を左右背部に各４回ずつ繰り返した。この薬剤塗布作業を抜毛した翌日から７日間行った。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの背部の体毛を抜毛した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの左右背部に、マイクロピペットを用いて２５μＬの薬剤を塗布した。その後、塗布部位にドライヤーを用いて冷風をあてて薬剤を素早く乾燥させた。この作業を左右背部に各４回ずつ繰り返した。この薬剤塗布作業を抜毛した翌日から７日間行った。
【0080】
（４）ＢｒｄＵ投与
７日間薬剤を塗布したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスから背部体毛皮膚を採取する２４時間および４８時間前に、各マウスの後足部分の腹部に１０ｍｇ／ｍＬのＢｒｄＵ／生理食塩水 ０．５ｍＬを注射器（テルモ株式会社、日本）を用いて投与した。
７日間薬剤を塗布したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスから背部体毛皮膚を採取する２４時間および４８時間前に、各マウスの後足部分の腹部に１０ｍｇ／ｍＬのＢｒｄＵ／生理食塩水 ０．５ｍＬを注射器（テルモ株式会社、日本）を用いて投与した。
【0081】
（５）マウス皮膚組織採取及び固定
８日目に投与した時間と同じ時間にＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを頸椎脱臼により安楽死させた後に、毛球部を傷つけないように皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織をＳｕｐｅｒＦｉｘ（東洋紡株式会社、日本）に１６～２４時間固定液に浸した後、１×ＰＢＳで４回洗い、新しい１×ＰＢＳに入れ保管した。その皮膚組織を必要な部分を切り出しし、パラフィン液交換機（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）にてパラフィンブロックを作製した。
８日目に投与した時間と同じ時間にＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを頸椎脱臼により安楽死させた後に、毛球部を傷つけないように皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織をＳｕｐｅｒＦｉｘ（東洋紡株式会社、日本）に１６～２４時間固定液に浸した後、１×ＰＢＳで４回洗い、新しい１×ＰＢＳに入れ保管した。その皮膚組織を必要な部分を切り出しし、パラフィン液交換機（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）にてパラフィンブロックを作製した。
【0082】
（６）切片作製
パラフィン化した皮膚組織のブロックをミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）で切片化し、プラチナコートしたスライドガラス（プラチナ プロ（松浪硝子工業株式会社、日本））に切片を張り付けて、４０℃のウォームスチームで８～１０時間放置し、乾燥させた。
パラフィン化した皮膚組織のブロックをミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）で切片化し、プラチナコートしたスライドガラス（プラチナ プロ（松浪硝子工業株式会社、日本））に切片を張り付けて、４０℃のウォームスチームで８～１０時間放置し、乾燥させた。
【0083】
（７）ＢｒｄＵ免疫染色
脱パラフィン処理を施すため、サンプルの乗ったスライドガラスを、キシレン、キシレン、１００％エタノール、９５％エタノール、７０％エタノールに、順に３分間ずつ浸した。脱パラフィン処理を施したスライドガラスを、室温にて２Ｍ ＨＣｌに３０分間浸した。スライドガラスをベンタディスカバリーＵＬＴＲＡ（自動染色装置）にセットし、プログラムを起動した。１次抗体Ａｎｔｉ－ＢｒｄＵ ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｍａｒｋｅｒ（ａｂｃａｍ、英国）を希釈溶液（１％ＢＳＡ、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳ）にて１６０倍希釈し、１次抗体を加えるタイミングで１００μＬ／サンプル数 添加した。２次抗体Ｄｏｎｋｅｙ Ａｎｔｉ－Ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５９４）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）およびへキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を希釈溶液（１％ＢＳＡ、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳ）にて５００倍希釈し、１００μＬ／サンプル数 添加した。プログラム終了後、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳにて流しながら洗浄し、１×ＰＢＳに浸した。水溶性封入剤（０．５％没食子酸、９０％グリセロール／ＰＢＳ）を８０μＬ／サンプル数 滴下した後、カバーガラスを乗せ、黄色チップで空気を押し出し、アスピレーターでカバーガラスの位置を修正しながら余分な封入剤を除き、トップコート（マニュキュア用）を使ってカバーガラスの４辺に封をした。トップコートが乾いていることを確認し、Ａｘｉｏ Ｓｃａｎで画像をスキャンし、解析した。
脱パラフィン処理を施すため、サンプルの乗ったスライドガラスを、キシレン、キシレン、１００％エタノール、９５％エタノール、７０％エタノールに、順に３分間ずつ浸した。脱パラフィン処理を施したスライドガラスを、室温にて２Ｍ ＨＣｌに３０分間浸した。スライドガラスをベンタディスカバリーＵＬＴＲＡ（自動染色装置）にセットし、プログラムを起動した。１次抗体Ａｎｔｉ－ＢｒｄＵ ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｍａｒｋｅｒ（ａｂｃａｍ、英国）を希釈溶液（１％ＢＳＡ、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳ）にて１６０倍希釈し、１次抗体を加えるタイミングで１００μＬ／サンプル数 添加した。２次抗体Ｄｏｎｋｅｙ Ａｎｔｉ－Ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５９４）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）およびへキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を希釈溶液（１％ＢＳＡ、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳ）にて５００倍希釈し、１００μＬ／サンプル数 添加した。プログラム終了後、０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳにて流しながら洗浄し、１×ＰＢＳに浸した。水溶性封入剤（０．５％没食子酸、９０％グリセロール／ＰＢＳ）を８０μＬ／サンプル数 滴下した後、カバーガラスを乗せ、黄色チップで空気を押し出し、アスピレーターでカバーガラスの位置を修正しながら余分な封入剤を除き、トップコート（マニュキュア用）を使ってカバーガラスの４辺に封をした。トップコートが乾いていることを確認し、Ａｘｉｏ Ｓｃａｎで画像をスキャンし、解析した。
【0084】
（８）ＢｒｄＵの計測方法
５０００μｍの線を引き、その範囲にある表皮層、真皮層、毛包にあるＢｒｄＵの数を計測した。
５０００μｍの線を引き、その範囲にある表皮層、真皮層、毛包にあるＢｒｄＵの数を計測した。
【0085】
２．結果
本試験例では、抜毛したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを用いて、６０％エタノールへ溶解した濃度１％および３％のパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を試験用の薬剤液とし、連日塗布を施した。陰性対照として６０％エタノールおよび陽性対象としてＲｉＵＰ（５％製剤）を塗布を施した。これら塗布は、１回／日で総塗布量１００μｌとなるようにして７日間行った。また、６、７日目の同じ時間にＢｒｄＵを腹部から投与し、その翌日に皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織をパラフィン化し切片を作製し、ＢｒｄＵの免疫染色を行い、ＢｒｄＵ数の計測により細胞活性を観察した。結果を図７及び図８に示す。
本試験例では、抜毛したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを用いて、６０％エタノールへ溶解した濃度１％および３％のパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を試験用の薬剤液とし、連日塗布を施した。陰性対照として６０％エタノールおよび陽性対象としてＲｉＵＰ（５％製剤）を塗布を施した。これら塗布は、１回／日で総塗布量１００μｌとなるようにして７日間行った。また、６、７日目の同じ時間にＢｒｄＵを腹部から投与し、その翌日に皮膚組織を採取した。採取した皮膚組織をパラフィン化し切片を作製し、ＢｒｄＵの免疫染色を行い、ＢｒｄＵ数の計測により細胞活性を観察した。結果を図７及び図８に示す。
【0086】
図７及び図８から明らかであるように、陰性対照および陽性対象と比較して、本発明の手段の有効成分であるパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の塗布によって、細胞分裂活性増大傾向が得られており、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸 ３％において少なくとも毛包における細胞分裂活性が向上しており、本発明の手段の有効成分に育毛活性があることが示唆される結果が得られた。また、本発明の手段の有効成分であるパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の塗布によって、表皮基底層における細胞分裂活性の亢進も確認され、本発明の手段の有効成分によりスカルプケア効果が得られることが確認された。本発明の手段の有効成分であるパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸は、優れた育毛活性を奏するものであるとともに、塗布部分におけるスカルプケア効果をも同時に発揮することが可能な優れた効果を奏するものであることが明らかとなった。
【0087】
＜試験例３：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物による太毛化活性評価＞
【0088】
１． 材料と方法
（１）実験動物
上記試験例１と同様の手順にて、７～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（ＳＬＣ）より背部体毛皮膚を採取し、作製した背部体毛皮膚由来の毛群を４～６週齢のＢａｌ
ｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（ＳＬＣ）に移植した後、薬剤を塗布した。動物の飼育および実験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
（１）実験動物
上記試験例１と同様の手順にて、７～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（ＳＬＣ）より背部体毛皮膚を採取し、作製した背部体毛皮膚由来の毛群を４～６週齢のＢａｌ
ｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（ＳＬＣ）に移植した後、薬剤を塗布した。動物の飼育および実験は、関連法規、省令、および指針を遵守し、理化学研究所実験倫理審査会の承認のもとに実施した。
【0089】
（２）薬剤
以下の薬剤を試験に使用した。
実施例１：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ３％溶液
実施例２：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 １％溶液
比較例１：６０％エタノール水溶液
比較例５：ＲｉＵＰＸ５ＰＬＵＳ（登録商標）（大正製薬、日本）
（３）太毛化の計測方法
試験例１において３周期目終了した成長した毛幹を用いて、太毛化の計測を行った。採取した毛幹のうち、Ｚｉｇｚａｇ毛の２本を用いた。その中心部分の太くなっている範囲を１辺 １００μmの正方形で３か所を選択した。選択した範囲の５か所を計測した。
以下の薬剤を試験に使用した。
実施例１：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ３％溶液
実施例２：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 １％溶液
比較例１：６０％エタノール水溶液
比較例５：ＲｉＵＰＸ５ＰＬＵＳ（登録商標）（大正製薬、日本）
（３）太毛化の計測方法
試験例１において３周期目終了した成長した毛幹を用いて、太毛化の計測を行った。採取した毛幹のうち、Ｚｉｇｚａｇ毛の２本を用いた。その中心部分の太くなっている範囲を１辺 １００μmの正方形で３か所を選択した。選択した範囲の５か所を計測した。
【0090】
２． 結果
薬剤塗布後の毛を用い、毛幹径を計測した結果を図９に示す。また、対照となる６０％エタノール水溶液を塗布した比較例１における毛幹径からの増加率を評価した結果を表７に示す。
薬剤塗布後の毛を用い、毛幹径を計測した結果を図９に示す。また、対照となる６０％エタノール水溶液を塗布した比較例１における毛幹径からの増加率を評価した結果を表７に示す。
【0091】
【表7】
【0092】
本発明の手段の有効成分であるパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を塗布すると、、対照となる６０％エタノール水溶液を塗布した比較例１に比べ、明らかな太毛化が生じたことが確認された。この太毛化の程度は比較例５と同等であり、上市されている育毛剤であるＲｉＵＰＸ５ＰＬＵＳと同等の活性が認められた。
【0093】
＜試験例４：ヒト毛乳頭細胞におけるＦＧＦ－７遺伝子及びＶＥＧＦ遺伝子発現の評価＞
【0094】
１． 材料と方法
（１）ヒト毛乳頭細胞及び培地について
ヒト毛乳頭細胞（カタログ番号：ＣＡ６０２０５ａ、白色人種、２９歳男性由来、東洋紡株式会社（日本））を購入し、プロトコールに記載されるようにして細胞を維持・培養して試験評価を行った。
（１）ヒト毛乳頭細胞及び培地について
ヒト毛乳頭細胞（カタログ番号：ＣＡ６０２０５ａ、白色人種、２９歳男性由来、東洋紡株式会社（日本））を購入し、プロトコールに記載されるようにして細胞を維持・培養して試験評価を行った。
【0095】
（２）薬剤
試験用薬剤として、以下の各濃度（終濃度）の薬剤溶液を調製し、使用した。
実施例１：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ３％溶液
実施例３：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ０．１％溶液
実施例４：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ０．０２５％溶液
ミノキシジル ３０μＭ
アデノシン １００μＭ
試験用薬剤として、以下の各濃度（終濃度）の薬剤溶液を調製し、使用した。
実施例１：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ３％溶液
実施例３：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ０．１％溶液
実施例４：パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物 ０．０２５％溶液
ミノキシジル ３０μＭ
アデノシン １００μＭ
【0096】
（３）試験方法
ヒト毛乳頭細胞を５×１０４個／ウェルとなるように、９６ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）内で、１日間培養後、各試験用薬剤を含む培地に置換した。その後、細胞プレートをＣＯ２インキュベーターに戻し、さらに２４時間又は７２時間培養した。培養後、各ウェルより、全ＲＮＡを抽出、回収して、それをｃＤＮＡに逆転写した。調製したｃＤＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＦＧＦ－７遺伝子の発現を測定した。内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用い、陰性対照群との相対値としてＦＧＦ－７遺伝子の発現量を算出した。
ヒト毛乳頭細胞を５×１０４個／ウェルとなるように、９６ウェルプレートに播種した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）内で、１日間培養後、各試験用薬剤を含む培地に置換した。その後、細胞プレートをＣＯ２インキュベーターに戻し、さらに２４時間又は７２時間培養した。培養後、各ウェルより、全ＲＮＡを抽出、回収して、それをｃＤＮＡに逆転写した。調製したｃＤＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲ法にてＦＧＦ－７遺伝子の発現を測定した。内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用い、陰性対照群との相対値としてＦＧＦ－７遺伝子の発現量を算出した。
【0097】
細胞からの全ＲＮＡの回収にはＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ（カタログ番号：ＦＧ－８０２５０、日本ジェネティクス株式会社（日本））を使用した。
【0098】
ウェルあたり１００μＬの溶解バッファーＲＬを添加し、ピペッティングにて細胞を溶解した。細胞溶解液に７０％エタノールを１００μＬ添加し、ピペッティングにて混合した。サンプル溶液をＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎに添加し、１００００ｇで１分間、室温で遠心した。カラムを通過したろ液をコレクションチューブから廃棄し、ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎを元のコレクションチューブに戻した後、６００μＬの洗浄バッファーＲＷ１をＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎに加え、１００００ｇで１分間、 室温で遠心した。ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎを新しいコレクションチューブに移してセットし、７００μＬの洗浄バッファーＲＷ２をＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎに加え、１００００ｇで１分間、 室温で遠心した。ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎを新しいコレクションチューブに移してセットし、１５０００ｒｐｍで１分間、 室温で遠心した。ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎを新しいコレクションチューブに移してセットし、５０μＬの溶出バッファー RE をＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎのメンブレンの中央に添加し、１００００ｇで１分間、室温で遠心し、精製したＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ（カタログ番号：ＮＤ－ＬＩＴＥ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）にて測定し、－８０℃にて次のｃＤＮＡ化作業まで保存した。
【0099】
ｃＤＮＡの合成にはＦａｓｔＧｅｎｅ ｓｃｒｉｐｔａｓｅＩＩ ｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ５× Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（カタログ番号：ＮＥ－ＬＳ６４、日本ジェネティクス株式会社（日本））を使用した。新しい チューブに生成した全ＲＮＡ の濃度が２０ｎｇ／ｍＬ になるように、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで希釈し、このサンプル溶液１６μＬにＦａｓｔＧｅｎｅ ｓｃｒｉｐｔａｓｅＩＩ ｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ５× Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘを４μＬ添加し、ボルテックスにて攪拌した。 ＭｉｎｉＡｍｐサーマルサイクラー （サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用い、２５℃で１０分間、４２℃で６０分間、８５℃で５分間インキュベートし、ｃＤＮＡを合成した。
【0100】
上記の方法にて合成したｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲに用いた。９６ウェルプレートの所定のウェルに、各ｃＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ 希釈液を添加し、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（カタログ番号： ＱＰＳー２０１、東洋紡株式会社（日本））とプライマーを添加して混合し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号：４４８５６９３、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）にて遺伝子発現を解析した。ＰＣＲ反応として、９５℃５秒間、６０℃３０秒間、及び７２℃３０秒間を４０サイクル行った。
【0101】
試験に使用したＶＥＧＦ遺伝子に特異的なプライマー、ＦＧＦ－７遺伝子に特異的なプライマー、及び内部標準としたＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的なプライマーを以下に示す。
ＦＧＦ－７遺伝子発現検出用プライマー
順方向：tctgtcgaacacagtggtacctgag（配列番号１）
逆方向：gccactgtcctgatttccatga（配列番号２）
ＶＥＧＦ遺伝子発現検出用プライマー
順方向：atcttcaagccatcctgtgtgc（配列番号３）
逆方向：caaggcccacagggattttc（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ遺伝子発現検出用プライマー
順方向：catccctgcctctactggcgctgcc（配列番号５）
逆方向：ccaggatgcccttgagggggccctc（配列番号６）
ＦＧＦ－７遺伝子発現検出用プライマー
順方向：tctgtcgaacacagtggtacctgag（配列番号１）
逆方向：gccactgtcctgatttccatga（配列番号２）
ＶＥＧＦ遺伝子発現検出用プライマー
順方向：atcttcaagccatcctgtgtgc（配列番号３）
逆方向：caaggcccacagggattttc（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ遺伝子発現検出用プライマー
順方向：catccctgcctctactggcgctgcc（配列番号５）
逆方向：ccaggatgcccttgagggggccctc（配列番号６）
【0102】
以下のようにして各遺伝子の相対発現量を算出した。
各遺伝子の増幅曲線と閾値線との交点より、Ｃｔ値（ＰＣＲサイクル数）を算出した。目的遺伝子のＣｔ値より内部標準ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｔ値で除した値が相対発現量となる。
各遺伝子の増幅曲線と閾値線との交点より、Ｃｔ値（ＰＣＲサイクル数）を算出した。目的遺伝子のＣｔ値より内部標準ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｔ値で除した値が相対発現量となる。
【0103】
２． 結果
ヒト毛乳頭細胞にパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物を２４時間及び７２時間作用させた後のＦＧＦ－７遺伝子並びにＶＥＧＦ遺伝子の発現量の変化を測定し、その結果を、それぞれ図１０（２４時間）及び図１１（７２時間）に示した。
ヒト毛乳頭細胞にパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物を２４時間及び７２時間作用させた後のＦＧＦ－７遺伝子並びにＶＥＧＦ遺伝子の発現量の変化を測定し、その結果を、それぞれ図１０（２４時間）及び図１１（７２時間）に示した。
【0104】
図１０に示すように、ヒト毛乳頭細胞に対してパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物を終濃度３％にて２４時間作用させた群では、無添加対照群に比して有意にＦＧＦ－７遺伝子発現量及びＶＥＧＦ遺伝子発現量が上昇することが確認された。
【0105】
そして、これらＦＧＦ－７遺伝子発現量及びＶＥＧＦ遺伝子発現量は、いずれもミノキシジル又はアデノシンを作用させた場合よりも大きいものであった。
【0106】
また、ヒト毛乳頭細胞に対してパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物を終濃度０．１％で２４時間作用させた群においても、無添加対照群に比してＦＧＦ－７遺伝子発現量及びＶＥＧＦ遺伝子発現量が有意に上昇することが確認された。
【0107】
またさらに、図１１に示すように、ヒト毛乳頭細胞に対してパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物を終濃度３％にて７２時間作用させた群において、無添加対照群に比してＦＧＦ－７遺伝子発現量及びＶＥＧＦ遺伝子発現量が有意に上昇することが確認された。また、それら遺伝子発現量の上昇の程度は、２４時間作用させた場合に比してより大きくなることが確認された。
【0108】
そして、これらＦＧＦ－７遺伝子発現量及びＶＥＧＦ遺伝子発現量は、いずれもミノキシジル又はアデノシンを作用させた場合よりも大きいものであった。
【0109】
また、ヒト毛乳頭細胞に対してパルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸の混合物を終濃度０．１％で７２時間作用させた群においても、無添加対照群に比してＦＧＦ－７遺伝子発現量及びＶＥＧＦ遺伝子発現量が有意に上昇することが確認された。
【0110】
ヒト毛乳頭細胞におけるＦＧＦ－７遺伝子の発現亢進、及びＶＥＧＦ遺伝子の発現亢進は、いずれもヒトにおける育毛活性の亢進に寄与するものであることが知られている。上記に示した試験結果から、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸は、ヒト毛乳頭細胞におけるＦＧＦ－７遺伝子及びＶＥＧＦ遺伝子の発現量をいずれも亢進させるものであること、及び、より長時間作用させることでそれら遺伝子発現量をより高めるものであることが示された。このように、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシトレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸は、ヒトにおける育毛活性を亢進させるための有効成分として大いに有用であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0111】
本発明の手段により、外用剤である育毛剤の有効成分として、パルミトイルジペプチド－５ジアミノブチロイルヒドロキシスレオニンおよびパルミトイルジペプチド－５ジアミノヒドロキシ酪酸を用いるものとすることで、頭髪、眉毛および／または睫毛などの毛における毛幹の成長促進効果、毛幹伸長速度の向上効果、毛幹最大長の向上効果および毛幹径の増大の効果並びにスカルプケア効果を奏する新たな育毛剤およびスカルプケア剤を提供することが可能となる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】