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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-02
(45)【発行日】2024-12-10
(54)【発明の名称】タグペプチド及びポリペプチドの精製方法
(51)【国際特許分類】
C07K 7/08 20060101AFI20241203BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20241203BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20241203BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241203BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20241203BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241203BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241203BHJP
【ＦＩ】
C07K7/08
C07K7/06 ZNA
C07K14/00
C12N15/63 Z
C07K1/22
C07K19/00
C12N15/11 Z
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2020026375
(22)【出願日】2020-02-19
(65)【公開番号】P2021129515
(43)【公開日】2021-09-09
【審査請求日】2022-11-28
(73)【特許権者】
【識別番号】304020177
【氏名又は名称】国立大学法人山口大学
(74)【代理人】
【識別番号】100177714
【弁理士】
【氏名又は名称】藤本 昌平
(72)【発明者】
【氏名】赤田 倫治
(72)【発明者】
【氏名】柳井 和弥
(72)【発明者】
【氏名】星田 尚司
【審査官】大西 隆史
(56)【参考文献】
【文献】特表平０５－５０５９４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５３３１２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】SHARMA, Satish K. et al.，Methods，1992年，Vol. 4, Issue 1，pp. 57-67，DOI: 10.1016/1046-2023(92)90056-E
【文献】VOSTERS, A. F. et al.，Protein Expression and Purification，1992年02月，Vol. 3, Issue 1，pp. 18-26，DOI: 10.1016/1046-5928(92)90051-W
【文献】HOFSTROM, Camilla et al.，Journal of Medicinal Chemistry，2013年05月21日，Vol. 56, No. 12，pp. 4966-4974，DOI: 10.1021/jm400218y
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（１－３’）～（１－９’）のいずれかのポリペプチドからなるタグペプチド。
（１－３’）配列番号３に示すアミノ酸配列において２又は３個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換し、かつ
ヒスチジン－アスパラギン酸若しくはヒスチジン－グルタミン酸を２又は３か所、又はアスパラギン酸－ヒスチジン若しくはグルタミン酸－ヒスチジンを２又は３か所含むポリペプチド；
（１－４’）配列番号４に示すアミノ酸配列において２又は３個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換し、かつ
ヒスチジン－アスパラギン酸若しくはヒスチジン－グルタミン酸を２又は３か所、又はアスパラギン酸－ヒスチジン若しくはグルタミン酸－ヒスチジンを２又は３か所含むポリペプチド；
（１－５’）配列番号５に示すアミノ酸配列において３個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換し、かつ
ヒスチジン－アスパラギン酸若しくはヒスチジン－グルタミン酸を３か所、又はアスパラギン酸－ヒスチジン若しくはグルタミン酸－ヒスチジンを３か所含むポリペプチド；
（１－６’）配列番号６に示すアミノ酸配列において３又は４個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換し、かつ
ヒスチジン－アスパラギン酸若しくはヒスチジン－グルタミン酸を３又は４か所、又はアスパラギン酸－ヒスチジン若しくはグルタミン酸－ヒスチジンを３又は４か所含むポリペプチド；
（１－７’）配列番号７に示すアミノ酸配列において４又は５個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換し、かつ
ヒスチジン－アスパラギン酸若しくはヒスチジン－グルタミン酸を４又は５か所、又はアスパラギン酸－ヒスチジン若しくはグルタミン酸－ヒスチジンを４又は５か所含むポリペプチド；
（１－８’）配列番号８に示すアミノ酸配列において４又は５個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換し、かつ
ヒスチジン－アスパラギン酸若しくはヒスチジン－グルタミン酸を４又は５か所、又はアスパラギン酸－ヒスチジン若しくはグルタミン酸－ヒスチジンを４又は５か所含むポリペプチド；
（１－９’）配列番号９に示すアミノ酸配列において５又は６個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換し、かつ
ヒスチジン－アスパラギン酸若しくはヒスチジン－グルタミン酸を５又は６か所、又はアスパラギン酸－ヒスチジン若しくはグルタミン酸－ヒスチジンを５又は６か所含むポリペプチド；
【請求項2】
配列番号１２～１５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるトリペプチドを含有することを特徴とする請求項１記載のタグペプチド。
【請求項3】
配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項１又は２に記載のタグペプチド。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか記載のタグペプチドとポリペプチドが融合したタグペプチド融合ポリペプチド。
【請求項5】
タグペプチドと融合するポリペプチドがタンパク質であることを特徴とする請求項４記載のタグペプチド融合ポリペプチド。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか記載のタグペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項7】
請求項６記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項8】
以下の工程（２－１）～（２－３）を備えたポリペプチドの精製方法。（２－１）ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体と、請求項４又は５記載のタグペプチド融合ポリペプチドとを吸着液の存在下で混合して、前記タグペプチド融合ポリペプチドを前記担体に吸着させる工程；
（２－２）タグペプチド融合ポリペプチドが吸着した担体を洗浄液で洗浄する工程；
（２－３）溶出液を用いて前記担体に吸着したタグペプチド融合ポリペプチドを前記担体から溶出する工程；
【請求項9】
工程（２－１）において、吸着液が０．０３Ｍ以上のアルカリ金属塩溶液であることを特徴とする請求項８記載のポリペプチドの精製方法。
【請求項10】
工程（２－２）において、洗浄液が０．０３Ｍ以上のアルカリ金属塩溶液であることを特徴とする請求項８又は９記載のポリペプチドの精製方法。
【請求項11】
工程（２－３）において、溶出液がイミダゾール溶液、Ｌ－ヒスチジン溶液、緩衝液、アルカリ金属塩溶液又は水であることを特徴とする請求項８～１０のいずれか記載のポリペプチドの精製方法。
【請求項12】
金属イオンがニッケルであることを特徴とする請求項８～１１のいずれか記載のポリペプチドの精製方法。
【請求項13】
請求項７記載の発現ベクターを含有するポリペプチドの精製キット。
【請求項14】
（２－１’）ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体と、タグペプチド融合ポリペプチドとを吸着液の存在下で混合して、前記タグペプチド融合ポリペプチドを前記担体に吸着させる工程；（２－２’）タグペプチド融合ポリペプチドが吸着した担体を洗浄液で洗浄する工程；
（２－３’）Ｌ－ヒスチジン溶液、緩衝液（イミダゾールを含有する緩衝液を除く）、又は水を用いて前記担体に吸着したタグペプチド融合ポリペプチドを前記担体から溶出する工程；
の上記工程（２－１’）～（２－３’）を備えたポリペプチドの精製方法であって、上記（２－１’）におけるタグ融合ペプチドが、
（１－４’’）配列番号４に示すアミノ酸配列において４個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換し、かつ
ヒスチジン－アスパラギン酸若しくはヒスチジン－グルタミン酸を４か所、又はアスパラギン酸－ヒスチジン又はグルタミン酸－ヒスチジンを４か所含むポリペプチドからなるタグペプチド；又は
（１－５’’）配列番号５に示すアミノ酸配列において４個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換し、かつ
ヒスチジン－アスパラギン酸若しくはヒスチジン－グルタミン酸を４か所、又はアスパラギン酸－ヒスチジン又はグルタミン酸－ヒスチジンを４か所含むポリペプチドからなるタグペプチド；とポリペプチドが融合したタグペプチド融合ポリペプチドである、前記精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はタグペプチドや、タグペプチド融合ポリペプチドや、タグペプチドをコードするポリヌクレオチドや、前記ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターや、ポリペプチドの精製方法や、前記発現ベクターを含有するポリペプチドの精製キットに関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子工学の知見により、大腸菌や酵母を用いたタンパク質合成を行った場合、その目的とするタンパク質等のポリペプチドを分離して精製する場合が多い。そのタンパク質精製法として、ポリヒスチジンとニッケルカラムを用いた精製法が広く行われている。具体的には、以下の（１）～(４)のように６連続させたヒスチジン、すなわちヒスチジンタグを付加した目的タンパク質を、ヒスチジン～ニッケル金属の接合能力を使って精製する方法である。
【0003】
（１）６連続ヒスチジンからなるヒスチジンタグを付加した目的タンパク質を酵母、大腸菌などの宿主細胞で生産する。
（２）宿主細胞からの目的タンパク質抽出液をニッケルカラムに通し、上記の目的タンパク質をニッケルに吸着させる。
（３） 低濃度(５～１０ｍＭ程度)イミダゾール水溶液を上記カラムに通して洗浄する。ここで、目的タンパク質はニッケルに吸着し、それ以外はこの洗浄によりカラムから流れ落ちる。
（４）高濃度(２００ｍＭ程度)イミダゾール水溶液を上記カラムに通し、（２）でトラップされていた目的タンパク質をニッケルからはがして溶出させる。
（２）宿主細胞からの目的タンパク質抽出液をニッケルカラムに通し、上記の目的タンパク質をニッケルに吸着させる。
（３） 低濃度(５～１０ｍＭ程度)イミダゾール水溶液を上記カラムに通して洗浄する。ここで、目的タンパク質はニッケルに吸着し、それ以外はこの洗浄によりカラムから流れ落ちる。
（４）高濃度(２００ｍＭ程度)イミダゾール水溶液を上記カラムに通し、（２）でトラップされていた目的タンパク質をニッケルからはがして溶出させる。
【0004】
しかし、タンパク質合成を行わせた大腸菌や酵母の細胞内には、ヒスチジンを多く含むタンパク質やニッケル金属と結合するタンパク質も多数存在するため、それらのタンパク質もニッケルカラムに吸着してしまい、目的タンパク質を高純度で精製することが困難であった。また、ニッケルに吸着した目的タンパク質を溶出液にてニッケルから外して溶出する際に、通常イミダゾール水溶液を用いるが、目的タンパク質を利用するときにはイミダゾールを取り除く作業が必要な場合があった。
【0005】
タグペプチドとしては６連続させたヒスチジン以外にも、たとえば、式：（Ｈｉｓ）ｘ－（Ａ）ｙ－（Ｈｉｓ）ｚ［式中、Ａは１またはそれ以上のアミノ酸であり；ｘは０～１０であり；ｙは０～４であり；ｚは０～１０である］で示されるキレート化ペプチド（特許文献１参照）や、式Ｒ１－（Ｈｉｓ）２－６－Ｒ２（式中Ｒ１は、水素、１個のアミノ酸または数個のアミノ酸を示し、Ｒ２は、Ｑ、Ｑ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ又はＱ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－を示し、及びＱはペプチド結合、１個のアミノ酸又は数個の、最大３０個のアミノ酸の配列を示す）（特許文献２参照）や、塩基性アミノ酸が３個以上連続した配列（特許文献３参照）が開示されている。しかしながら、イミダゾールで溶出することが主であり、必要に応じてイミダゾール以外で精度良く溶出が可能なタグペプチドではなかった。
【0006】
また、本発明者らは、５００ｍＭ以上の濃度のイミダゾールを用いても、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンと結合可能なタグペプチドを提案した（特許文献４参照）。かかるタグペプチドは、高濃度のイミダゾールでも溶出されにくいため、高純度で目的とするタンパク質を固定化することは可能である。しかしながら、必要に応じて目的とするタンパク質を溶出することが難しかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開平６－１５７６００号公報
【文献】特開昭６３－２５１０９５号公報
【文献】特開２００８－２４１５６０号公報
【文献】特開２０１７－８８５３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の課題は、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンと結合可能であり、イミダゾール以外を用いても溶出が可能なタグペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、目的タンパク質のみが効率よく分離、精製できるペプチドタグやペプチドタグが付与されたタンパク質の効率的な分離・精製方法の研究を進めていた。その過程で、連続するヒスチジンをタンパク質に付加することで、タンパク質の活性を低下させることを確認した。そこで、タンパク質の活性の低下を抑制可能なヒスチジンタグペプチドを検討した。
【0010】
その結果、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンやプロリン等をヒスチジンに組み込むように連結したタグペプチドを目的タンパク質に付加することで連続するヒスチジンのタグペプチドを用いた場合と比較してタンパク質の活性低下が抑制され、活性の高いタンパク質を得られることを見出した。さらに、ニッケルからの溶出について検討したところ、従来用いられているイミダゾールだけでなく、低濃度の塩溶液や水で溶出が可能であることを見出し、本発明を完成した。
【0011】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の（１－１）～（１－１１）のいずれかのポリペプチドからなるタグペプチド。
（１－１）配列番号１に示すアミノ酸配列において１個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は２個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－３）配列番号３に示すアミノ酸配列において１～３個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－４）配列番号４に示すアミノ酸配列において１～４個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－５）配列番号５に示すアミノ酸配列において１～５個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－６）配列番号６に示すアミノ酸配列において１～６個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－７）配列番号７に示すアミノ酸配列において１～７個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－８）配列番号８に示すアミノ酸配列において１～８個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－９）配列番号９に示すアミノ酸配列において１～９個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－１０）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１～１０個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－１１）配列番号１１に示すアミノ酸配列において１～１１個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
〔２〕配列番号１２～１５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるトリペプチドを含有することを特徴とする上記〔１〕記載のタグペプチド。
〔３〕配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載のタグペプチド。
〔４〕上記〔１〕～〔３〕のいずれか記載のタグペプチドとポリペプチドが融合したタグペプチド融合ポリペプチド。
〔５〕タグペプチドと融合するポリペプチドがタンパク質であることを特徴とする上記〔４〕記載のタグペプチド融合ポリペプチド。
〔６〕上記〔１〕～〔３〕のいずれか記載のタグペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕上記〔６〕記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
〔８〕以下の工程（２－１）～（２－３）を備えたポリペプチドの精製方法。
（２－１）ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体と、上記〔４〕又は〔５〕記載のタグペプチド融合ポリペプチドとを吸着液の存在下で混合して、前記タグペプチド融合ポリペプチドを前記担体に吸着させる工程；
（２－２）タグペプチド融合ポリペプチドが吸着した担体を洗浄液で洗浄する工程；
（２－３）溶出液を用いて前記担体に吸着したタグペプチド融合ポリペプチドを前記担体から溶出する工程；
〔９〕工程（２－１）において、吸着液が０．０３Ｍ以上のアルカリ金属塩溶液であることを特徴とする上記〔８〕記載のポリペプチドの精製方法。
〔１０〕工程（２－２）において、洗浄液が０．０３Ｍ以上のアルカリ金属塩溶液であることを特徴とする上記〔８〕又は〔９〕記載のポリペプチドの精製方法。
〔１１〕工程（２－３）において、溶出液がイミダゾール溶液、Ｌ－ヒスチジン溶液、緩衝液、アルカリ金属塩溶液又は水であることを特徴とする上記〔８〕～〔１０〕のいずれか記載のポリペプチドの精製方法。
〔１２〕金属イオンがニッケルであることを特徴とする上記〔８〕～〔１１〕のいずれか記載のポリペプチドの精製方法。
〔１３〕上記〔７〕記載の発現ベクターを含有するポリペプチドの精製キット。
〔１〕以下の（１－１）～（１－１１）のいずれかのポリペプチドからなるタグペプチド。
（１－１）配列番号１に示すアミノ酸配列において１個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は２個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－３）配列番号３に示すアミノ酸配列において１～３個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－４）配列番号４に示すアミノ酸配列において１～４個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－５）配列番号５に示すアミノ酸配列において１～５個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－６）配列番号６に示すアミノ酸配列において１～６個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－７）配列番号７に示すアミノ酸配列において１～７個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－８）配列番号８に示すアミノ酸配列において１～８個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－９）配列番号９に示すアミノ酸配列において１～９個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－１０）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１～１０個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－１１）配列番号１１に示すアミノ酸配列において１～１１個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
〔２〕配列番号１２～１５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるトリペプチドを含有することを特徴とする上記〔１〕記載のタグペプチド。
〔３〕配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載のタグペプチド。
〔４〕上記〔１〕～〔３〕のいずれか記載のタグペプチドとポリペプチドが融合したタグペプチド融合ポリペプチド。
〔５〕タグペプチドと融合するポリペプチドがタンパク質であることを特徴とする上記〔４〕記載のタグペプチド融合ポリペプチド。
〔６〕上記〔１〕～〔３〕のいずれか記載のタグペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕上記〔６〕記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
〔８〕以下の工程（２－１）～（２－３）を備えたポリペプチドの精製方法。
（２－１）ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体と、上記〔４〕又は〔５〕記載のタグペプチド融合ポリペプチドとを吸着液の存在下で混合して、前記タグペプチド融合ポリペプチドを前記担体に吸着させる工程；
（２－２）タグペプチド融合ポリペプチドが吸着した担体を洗浄液で洗浄する工程；
（２－３）溶出液を用いて前記担体に吸着したタグペプチド融合ポリペプチドを前記担体から溶出する工程；
〔９〕工程（２－１）において、吸着液が０．０３Ｍ以上のアルカリ金属塩溶液であることを特徴とする上記〔８〕記載のポリペプチドの精製方法。
〔１０〕工程（２－２）において、洗浄液が０．０３Ｍ以上のアルカリ金属塩溶液であることを特徴とする上記〔８〕又は〔９〕記載のポリペプチドの精製方法。
〔１１〕工程（２－３）において、溶出液がイミダゾール溶液、Ｌ－ヒスチジン溶液、緩衝液、アルカリ金属塩溶液又は水であることを特徴とする上記〔８〕～〔１０〕のいずれか記載のポリペプチドの精製方法。
〔１２〕金属イオンがニッケルであることを特徴とする上記〔８〕～〔１１〕のいずれか記載のポリペプチドの精製方法。
〔１３〕上記〔７〕記載の発現ベクターを含有するポリペプチドの精製キット。
【発明の効果】
【0012】
本発明のタグペプチドを用いれば、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体にポリペプチドが吸着させた後、イミダゾールだけでなく、Ｌ－ヒスチジン、トリス塩基、又は水によっても溶出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】実施例１において、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）のＣ末端側に、３つのヒスチジンの間に様々なアミノ酸を配置したタグペプチドを付加したタグペプチド融合ＲＦＰの活性を評価した結果を示す図である。
【図2】実施例２において、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）のＣ末端側に、ヒスチジンとアスパラギン酸との様々な組み合わせからなるタグペプチドを付加したタグペプチド融合ルシフェラーゼの活性を調べた結果である。
【図3】実施例３において、ＲＦＰ－６ＨＥ、ＲＦＰ－６ＨＤ、ＲＦＰ－６Ｈ又はＲＦＰのタンパク質抽出液をニッケルビーズと混合して吸着を調べた結果を示す図である。
【図4】実施例４において、ＲＦＰ－６ＨＥ、又はＲＦＰ－６Ｈのタンパク質抽出液をニッケルビーズと混合して、吸着液の塩溶液の種類及び濃度を変えて吸着を調べた結果を示す図である。
【図5】実施例５において、ニッケルビーズに吸着したＲＦＰ－６ＨＥ及びＲＦＰ－６Ｈをイミダゾールによって溶出した結果を示す図である。
【図6】実施例５において、ニッケルビーズに吸着したＲＦＰ－６ＨＥ及びＲＦＰ－６Ｈをヒスチジンによって溶出した結果を示す図である。
【図7】実施例５において、ニッケルビーズに吸着したＲＦＰ－６ＨＥ及びＲＦＰ－６Ｈをトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液によって溶出した結果を示す図である。
【図8】実施例６において、ニッケルカラムに吸着したＲＦＰ－６ＨＥ及びＲＦＰ－６Ｈをイミダゾールによって溶出した結果を示す図である。図８（ａ）、（ｂ）はＵＶ２８０ｎｍを測定した結果、図８（ｃ）はＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果である。
【図9】実施例７において、ニッケルカラムに吸着したＲＦＰ－６ＨＰ及びＲＦＰ－６ＨＧをイミダゾールの濃度勾配によって溶出した結果を示す図である。
【図10】実施例７において、ニッケルカラムに吸着したＲＦＰ－６ＨＥ及びＲＦＰ－６Ｈを蒸留水による洗浄なしで溶出した結果を示す図である。
【図11】実施例８において、ニッケルカラムに吸着したＲＦＰ－６ＨＥを１Ｍ－０．１Ｍ及び０．１Ｍ－０ＭのＮａＣｌの濃度勾配により洗浄した結果を示す図である。上段は左から洗浄前（１Ｍ）、０．１Ｍ ＮａＣｌ洗浄後、０．０１Ｍ ＮａＣｌ洗浄後のカラムの写真、下段は０．１Ｍ－０ＭのＮａＣｌの濃度勾配により洗浄した時のＵＶ２８０ｎｍを測定した結果である。
【図12】実施例８において、ニッケルカラムに吸着したＲＦＰ－６ＨＥを１Ｍ－０．１Ｍ及び／又は０．１Ｍ－０ＭのＫＣｌ、ＬｉＣｌ、又はＲｂＣｌの濃度勾配により洗浄した場合の、左から洗浄前（１Ｍ）、０．１Ｍ 洗浄後、０．０１Ｍ 洗浄後のカラムの写真である。
【図13】実施例９において、１Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０でニッケルカラムに吸着したＲＦＰ－６ＨＥを０．０５Ｍ ＫＣｌで３０分洗浄後、０－１００ｍＭの濃度勾配のイミダゾールで溶出してＵＶ２８０ｎｍを測定した結果である。
【図14】実施例９において、１Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０でニッケルカラムに吸着したＲＦＰ－６ＨＥを０．０５Ｍ ＫＣｌで３０分洗浄後、０－１００ｍＭの濃度勾配のＬ－ヒスチジンで溶出してＵＶ２８０ｎｍを測定した結果である。
【図15】実施例９において、１Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０でニッケルカラムに吸着したＲＦＰ－６ＨＥを０．０５Ｍ ＫＣｌで３０分洗浄後、蒸留水で３０分ほど溶出してＵＶ２８０ｎｍを測定した結果である。
【図16】実施例１０において、１Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０でニッケルカラムに吸着したＤＮＡポリメラーゼ－６ＨＥを０．０５Ｍ ＫＣｌで３０分洗浄後、１００ｍＭ イミダゾールで３０分ほど溶出してＵＶ２８０ｎｍを測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明の一態様は、
（１－１）配列番号１に示すアミノ酸配列において１個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は２個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－３）配列番号３に示すアミノ酸配列において１～３個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－４）配列番号４に示すアミノ酸配列において１～４個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－５）配列番号５に示すアミノ酸配列において１～５個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－６）配列番号６に示すアミノ酸配列において１～６個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－７）配列番号７に示すアミノ酸配列において１～７個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－８）配列番号８に示すアミノ酸配列において１～８個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－９）配列番号９に示すアミノ酸配列において１～９個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－１０）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１～１０個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－１１）配列番号１１に示すアミノ酸配列において１～１１個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
の（１－１）～（１－１１）のいずれかのポリペプチドからなるタグペプチドであり、以下、「本件タグペプチド」ともいう。
（１－１）配列番号１に示すアミノ酸配列において１個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は２個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－３）配列番号３に示すアミノ酸配列において１～３個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－４）配列番号４に示すアミノ酸配列において１～４個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－５）配列番号５に示すアミノ酸配列において１～５個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－６）配列番号６に示すアミノ酸配列において１～６個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－７）配列番号７に示すアミノ酸配列において１～７個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－８）配列番号８に示すアミノ酸配列において１～８個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－９）配列番号９に示すアミノ酸配列において１～９個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－１０）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１～１０個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
（１－１１）配列番号１１に示すアミノ酸配列において１～１１個のヒスチジンがアスパラギン酸又はグルタミン酸に置換したポリペプチド；
の（１－１）～（１－１１）のいずれかのポリペプチドからなるタグペプチドであり、以下、「本件タグペプチド」ともいう。
【0015】
また、本発明の他の態様の一つは、
（２－１）ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体と、上記本件タグペプチド融合ポリペプチドとを混合して、前記タグペプチド融合ポリペプチドを前記担体に吸着させる工程；
（２－２）タグペプチド融合ポリペプチドを吸着した担体を洗浄液で洗浄する工程；
（２－３）イミダゾール、Ｌ－ヒスチジン、トリス塩基、又は水を用いて、前記担体に吸着したタグペプチド融合ポリペプチドを前記担体から溶出する工程；
の工程（２－１）～（２－３）を備えたポリペプチドの精製方法であり、以下、「本件ポリペプチドの精製方法」ともいう。
（２－１）ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体と、上記本件タグペプチド融合ポリペプチドとを混合して、前記タグペプチド融合ポリペプチドを前記担体に吸着させる工程；
（２－２）タグペプチド融合ポリペプチドを吸着した担体を洗浄液で洗浄する工程；
（２－３）イミダゾール、Ｌ－ヒスチジン、トリス塩基、又は水を用いて、前記担体に吸着したタグペプチド融合ポリペプチドを前記担体から溶出する工程；
の工程（２－１）～（２－３）を備えたポリペプチドの精製方法であり、以下、「本件ポリペプチドの精製方法」ともいう。
【0016】
本明細書において、ヒスチジンをＨ、アスパラギン酸をＤ、グルタミン酸をＥ、トリプトファンをＷ、バリンをＶ、トレオニンをＴ、アルギニンをＲ、メチオニンをＭ、ロイシンをＬ、プロリンをＰ、アスパラギンをＮ、リシンをＫ、グルタミンをＱ、イソロイシンをＩ、フェニルアラニンをＦ、システインをＣ、チロシンをＹ、セリンをＳ、グリシンをＧ、アラニンをＡで表すこともある。
【0017】
本明細書における「ポリペプチド」とは、５残基以上のアミノ酸がペプチド結合によって連結されて形成されたペプチドを意味する。また、本明細書における「タグペプチド」とは、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンと親和性を有するアフィニティタグを意味する。
【0018】
本件タグペプチドとしては、上記（１－１）～（１－１１）のいずれかのポリペプチドからなるタグペプチドであるかぎり特に制限されないが、かかるタグペプチドのＮ末端又はＣ末端には、さらに任意のアミノ酸、好ましくはヒスチジン、アスパラギン酸又グルタミン酸が１～５残基、好ましくは１～３残基、より好ましくは１又は２残基、さらに好ましくは１残基連結していてもよい。
【0019】
本明細書における（１－１）～（１－１１）のポリペプチドにおいて、アスパラギン酸又はグルタミン酸に置換するヒスチジンの位置は特に制限されないが、ヒスチジンとヒスチジンとの間にアスパラギン酸又はグルタミン酸が連結するように置換することが好ましい。具体的には、配列番号１２に示すＨＥＨ、配列番号１３に示すＥＨＥ、配列番号１４に示すＨＤＨ、又は配列番号１５に示すＤＨＤのいずれかのトリペプチドを少なくとも１カ所含むことが好ましい。
【0020】
また、（１－２）又は（１－３）のポリペプチドにおいては、ＨＥ、ＥＨ、ＨＤ、又はＤＨを２カ所以上、より好ましくは３カ所以上、（１－４）又は（１－５）のポリペプチドにおいては、ＨＥ、ＥＨ、ＨＤ、又はＤＨを２カ所以上、より好ましくは３カ所以上、さらに好ましくは４カ所以上、（１－６）又は（１－７）のポリペプチドにおいては、ＨＥ、ＥＨ、ＨＤ、又はＤＨを２カ所以上、より好ましくは３カ所以上、さらに好ましくは４カ所以上、さらにより好ましくは５カ所以上、（１－８）又は（１－９）のポリペプチドにおいては、ＨＥ、ＥＨ、ＨＤ、又はＤＨを２カ所以上、より好ましくは３カ所以上、さらに好ましくは４カ所以上、さらにより好ましくは５カ所以上、中でも６カ所以上、（１－１０）又は（１－１１）のポリペプチドにおいては、ＨＥ、ＥＨ、ＨＤ、又はＤＨを
２カ所以上、より好ましくは３カ所以上、さらに好ましくは４カ所以上、さらにより好ましくは５カ所以上、中でも６カ所以上、特に好ましくは７カ所以上、最も好ましくは８カ所以上含んでもよい。（１－７）のポリペプチドとしては、たとえば、ＨＤを５カ所含有する配列番号１６に示すアミノ酸配列やＨＥを５カ所含有する配列番号１７に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
２カ所以上、より好ましくは３カ所以上、さらに好ましくは４カ所以上、さらにより好ましくは５カ所以上、中でも６カ所以上、特に好ましくは７カ所以上、最も好ましくは８カ所以上含んでもよい。（１－７）のポリペプチドとしては、たとえば、ＨＤを５カ所含有する配列番号１６に示すアミノ酸配列やＨＥを５カ所含有する配列番号１７に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
【0021】
複数箇所のヒスチジンが置換する場合における置換するアスパラギン酸又はグルタミン酸の組み合わせは特に制限されず、すべてがアスパラギン酸であっても、すべてがグルタミン酸であっても、アスパラギン酸とグルタミン酸との組み合わせでも良い。
【0022】
本発明のタグペプチド融合ポリペプチドとしては、上記本件タグペプチドとポリペプチドが融合したタグペプチド融合ポリペプチド（以下、「本件タグペプチド融合ポリペプチド」ともいう）であればよく、かかるタグペプチド融合ポリペプチドにおいて、融合させるポリペプチドとタグペプチドとの間に任意のアミノ酸が結合していても、融合させるポリペプチドとタグペプチドとが直接連結していてもよい。なお、任意のアミノ酸としては１～３０００残基、好ましくは２～１０００残基、より好ましくは３～１００残基を挙げることができる。
【0023】
上記本件タグペプチドと融合するポリペプチドとしては、タンパク質、ペプチドホルモン、エピトープ等を挙げることができる。タンパク質としては特に制限されないが、酵素、蛍光タンパク質、構造タンパク質、金属結合タンパク質、補因子タンパク質、抗体、糖タンパク質等を挙げることができる。
【0024】
さらに、タグペプチド融合ポリペプチドには標識配列を含んでもよい。標識配列の位置はタグペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれか、又は両方のいずれでもよく、標識配列としては、ＦＬＡＧ配列、ＨＡ配列、ＭＹＣ配列、ＧＦＰ配列、ＭＢＰ配列、ＧＳＴ配列、ＳＮＡＰ配列、ＡＣＰ配列、ＣＬＩＰ配列、ＴＡＰ配列、Ｖ５配列などを挙げることができる。
【0025】
また、タグペプチド融合ポリペプチドにおいて、タグペプチドとポリペプチドの間にプロテアーゼを認識するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含んでもよい。プロテアーゼを認識するアミノ酸配列としては、トロンビン、エンテロキナーゼ、ＴＥＶプロテアーゼ、Ｘａ因子、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）を認識するアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。かかるプロテアーゼを認識するアミノ酸配列からなるポリペプチドを備えていれば、必要に応じてプロテアーゼを用いてタグペプチドとポリペプチドとの融合を切断することが可能となる。
【0026】
上記本件タグペプチドや、本件タグペプチドと融合するポリペプチドは、遺伝子工学的手法や、液相法や固相法によるペプチド合成法などの公知の手法によって作製することが可能である。
【0027】
本発明のタグペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、本件タグペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「本件ポリヌクレオチド」ともいう）であれば特に制限されず、かかるポリヌクレオチドは遺伝子工学的手法を用いた公知の手法によって作製することが可能である。本件タグペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、たとえば配列番号１８又は１９に示すポリヌクレオチドを挙げることができるが、これらのヌクレオチドにおけるヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸の対応する他のコドンに置換した配列を用いてもよい。
【0028】
本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターとしては、上記本件ポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクター（以下、「本件発現ベクター」ともいう）であれば特に制限されず、発現ベクターとしては、宿主に応じて適宜選択することができ、ｐＥＴベクター、ｐＢＴベクター、ｐＧＥＸベクター、ｐＫＫベクター、ｐＳＥベクター、ｐＱＥベクター等の細菌用発現ベクターや、ｐｃＤＮＡベクター、ｐＣＭＶ－ＦＬＡＧベクター、ｐＥＧＦＰベクター、ｐｃＤＭベクター等の哺乳動物用発現ベクターや、ＹＥｐベクター等の酵母用発現ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃｌベクター、ＢａｋＰＡＫベクター等の昆虫用発現ベクターや、タバコモザイクウイルスベクター等の植物用発現ベクターを挙げることができる。
【0029】
本発明のポリペプチドの精製方法としては、
（２－１）ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体と、上記本件タグペプチド融合ポリペプチドとを吸着液の存在下で混合して、前記タグペプチド融合ポリペプチドを前記担体に吸着させる工程；
（２－２）タグペプチド融合ポリペプチドが吸着した担体を洗浄液で洗浄する工程；
（２－３）イミダゾール、Ｌ－ヒスチジン、トリス塩基、又は水を用いて、前記担体に吸着したタグペプチド融合ポリペプチドを前記担体から溶出する工程；
の工程（２－１）～（２－３）を備えたポリペプチドの精製方法（以下、「本件ポリペプチドの精製方法」ともいう）であればよく、金属イオンとしてはニッケルであることが好ましい。
（２－１）ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体と、上記本件タグペプチド融合ポリペプチドとを吸着液の存在下で混合して、前記タグペプチド融合ポリペプチドを前記担体に吸着させる工程；
（２－２）タグペプチド融合ポリペプチドが吸着した担体を洗浄液で洗浄する工程；
（２－３）イミダゾール、Ｌ－ヒスチジン、トリス塩基、又は水を用いて、前記担体に吸着したタグペプチド融合ポリペプチドを前記担体から溶出する工程；
の工程（２－１）～（２－３）を備えたポリペプチドの精製方法（以下、「本件ポリペプチドの精製方法」ともいう）であればよく、金属イオンとしてはニッケルであることが好ましい。
【0030】
上記金属イオンと本件タグペプチド融合ポリペプチドが結合することにより、タグペプチドが融合したポリペプチドを上記担体に固定化することが可能となる。なお、本件タグペプチドが融合したポリペプチドと、上記金属イオンを固定化した担体とは吸着液の存在下で混合後直ちに配位結合するが、混合した後に１分以上、１時間以上、又は６時間以上静置してもよい。
【0031】
上記担体としては、水に対して不溶なものであれば特に制限されず、シリカゲル、多孔性ガラス、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、磁気ビーズを挙げることができる。
【0032】
上記吸着液としては、上記金属イオンを固定化した担体と上記本件タグペプチド融合ポリペプチドを混合して、上記担体に固定化された金属イオンと上記本件タグペプチド融合ポリペプチドが結合し、上記担体に上記本件タグペプチド融合ポリペプチドが吸着できるものであれば特に制限されないが、カリウム、ナトリウム、リチウム、ルビジウム等のアルカリ金属塩を含む溶液や、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩を含む溶液や、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等の緩衝液を挙げることができる。アルカリ金属塩を含む溶液としては、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＲｂＣｌ溶液を挙げることができ、アルカリ土類金属塩を含む溶液としては、ＣａＣｌ２やＭｇＣｌ２溶液を挙げることができる。
【0033】
上記吸着液としてアルカリ金属塩を含む溶液やアルカリ土類金属塩を含む溶液を用いる場合の濃度としては、０．０３～２．５Ｍ、０．０５～２．２Ｍ、０．１～２Ｍ、０．５～１．８Ｍ、１～１．５Ｍを挙げることができる。０．０３Ｍ以上とすることで、上記担体に固定化された金属イオンと上記本件タグペプチド融合ポリペプチドとの吸着効率を高めることが可能となる。
【0034】
上記吸着液として緩衝液を用いる場合のｐＨとしては、用いる緩衝液の種類や濃度により適宜調整できるが、ｐＨ６～１０、好ましくはｐＨ６．５～９、より好ましくはｐＨ７～８．６を挙げることができる。また、緩衝液の濃度としては、０．０５～２Ｍ、好ましくは０．１～１Ｍを挙げることができる。
【0035】
上記洗浄液としては、上記担体に固定化された金属イオンと上記本件タグペプチド融合ポリペプチドとの結合が維持又はほとんど維持される溶液であれば特に制限されず、ここで、「上記担体に固定化された金属イオンと上記本件タグペプチド融合ポリペプチドとの結合がほとんど維持される溶液」とは、上記担体に固定化された金属イオンと上記本件タグペプチド融合ポリペプチドとの結合がいったん外れても、周辺の（カラムを用いた場合は下方の）担体に固定化された金属イオンと再度結合しうる溶液を意味する。
【0036】
上記洗浄液は、上記吸着液を用いることができる。上記洗浄液としてアルカリ金属塩を含む溶液やアルカリ土類金属塩を含む溶液を用いる場合の濃度としては、０．０３～２．５Ｍ、０．０５～２．２Ｍ、０．１～２Ｍ、０．５～１．８Ｍ、１～１．５Ｍを挙げることができる。ただし、目的外のポリペプチドが担体に固定化された金属イオンへ非特異的に結合すること防ぐという観点からは、アルカリ金属塩を含む溶液やアルカリ土類金属塩を含む溶液を用いる場合の濃度の下限としては、０．０７Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ、より好ましくは０．０３Ｍを挙げることができ、上限としては０．１Ｍ、好ましくは０．０８Ｍ、より好ましくは０．０６Ｍを挙げることができる。
【0037】
また、上記洗浄液として緩衝液を用いる場合のｐＨとしては、用いる緩衝液の種類や濃度により適宜調整できるが、ｐＨ６～１０、好ましくはｐＨ６．５～９、より好ましくはｐＨ７～８．６を挙げることができる。また、緩衝液の濃度としては、０．０５～２Ｍ、好ましくは０．１～１Ｍを挙げることができる。ただし、目的外のポリペプチドが担体に固定化された金属イオンへ非特異的に結合することを防ぐという観点から、ｐＨとしてはｐＨ７～８、好ましくはｐＨ７．２～７．４を挙げることができる。
【0038】
上記溶出液は、上記担体に固定化された金属イオンと上記本件タグペプチド融合ポリペプチドとの結合が外れる溶液であれば特に制限されないが、イミダゾール溶液、Ｌ－ヒスチジン溶液、緩衝液、アルカリ金属塩溶液又は水を挙げることができる。
【0039】
上記溶出液としてイミダゾール溶液を用いる場合は、好ましくは０．００５～１Ｍ、好ましくは０．０５～０．１Ｍを挙げることができ、所定の濃度のイミダゾール溶液を用いて溶出してもよいが、たとえば０－１００ｍＭのイミダゾールの濃度勾配により溶出を行ってもよい。
【0040】
上記溶出液としてＬ－ヒスチジン溶液を用いる場合は、好ましくは０．００５～１Ｍ、より好ましくは０．０５～０．１Ｍを挙げることができ、所定の濃度のＬ－ヒスチジン溶液を用いて溶出してもよいが、たとえば０－１００ｍＭのヒスチジンの濃度勾配により溶出を行ってもよい。
【0041】
上記溶出液として緩衝液を用いる場合のｐＨとしては、用いる緩衝液の種類や濃度により適宜調整できるが、好ましくはｐＨ６～１０、より好ましくはｐＨ８．５～９を挙げることができる。緩衝液の濃度としては、０．１～２Ｍ、好ましくは０．５～１Ｍを挙げることができる。
【0042】
本発明のポリペプチドの精製キットとしては、上記本件発現ベクターを含有していればよく、ニッケル、銅、亜鉛、及び、コバルトから選択される１又は２以上の金属イオンを固定化した担体を含んでもよい。また、必要に応じてポリペプチドを精製するための説明書や、上記本件ポリペプチドの精製方法において用いる吸着液、洗浄液、溶出液を含んでもよい。
【0043】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
例示に限定されるものではない。
【0044】
［実施例１］
これまで６つのヒスチジンからなるヒスチジンタグが広く使われているが、かかるヒスチジンが連続したタグを用いるとタンパク質の活性が低下することが知られている。そこで、ヒスチジンとヒスチジン以外のアミノ酸との組み合わせによりタンパク質の活性低下を抑制できないか検討した。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰタンパク質）のＣ末端側に、ヒスチジンが連続したタグペプチドを融合したＲＦＰ及び３つのヒスチジンの間に様々なアミノ酸を配置したタグペプチドが付加したタグペプチドを作製した。かかるタグペプチドを融合したＲＦＰを生産する株を作製し、ＲＦＰによる蛍光を調べることでタンパク質の活性を評価した。
これまで６つのヒスチジンからなるヒスチジンタグが広く使われているが、かかるヒスチジンが連続したタグを用いるとタンパク質の活性が低下することが知られている。そこで、ヒスチジンとヒスチジン以外のアミノ酸との組み合わせによりタンパク質の活性低下を抑制できないか検討した。赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰタンパク質）のＣ末端側に、ヒスチジンが連続したタグペプチドを融合したＲＦＰ及び３つのヒスチジンの間に様々なアミノ酸を配置したタグペプチドが付加したタグペプチドを作製した。かかるタグペプチドを融合したＲＦＰを生産する株を作製し、ＲＦＰによる蛍光を調べることでタンパク質の活性を評価した。
【0045】
（ａ－１）６Ｈ：ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２）
（ａ－２）１２Ｈ：ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号８）
（ａ－３）１５Ｈ：ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１）
（ａ－４）１８Ｈ：ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０）
（ａ－５）３ＨＷ×５：ＨＨＨＷＨＨＨＷＨＨＨＷＨＨＨＷＨＨＨ（配列番号２１）
（ａ－６）３ＨＶ×５：ＨＨＨＶＨＨＨＶＨＨＨＶＨＨＨＶＨＨＨ（配列番号２２）
（ａ－７）３ＨＴ×５：ＨＨＨＴＨＨＨＴＨＨＨＴＨＨＨＴＨＨＨ（配列番号２３）
（ａ－８）３ＨＲ×５：ＨＨＨＲＨＨＨＲＨＨＨＲＨＨＨＲＨＨＨ（配列番号２４）
（ａ－９）３ＨＭ×５：ＨＨＨＭＨＨＨＭＨＨＨＭＨＨＨＭＨＨＨ（配列番号２５）
（ａ－１０）３ＨＬ×５：ＨＨＨＬＨＨＨＬＨＨＨＬＨＨＨＬＨＨＨ（配列番号２６）
（ａ－１１）３ＨＰ×５：ＨＨＨＰＨＨＨＰＨＨＨＰＨＨＨＰＨＨＨ（配列番号２７）
（ａ－１２）３ＨＮ×５：ＨＨＨＮＨＨＨＮＨＨＨＮＨＨＨＮＨＨＨ（配列番号２８）
（ａ－１３）３ＨＫ×５：ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ（配列番号２９）
（ａ－１４）３ＨＱ×５：ＨＨＨＱＨＨＨＱＨＨＨＱＨＨＨＱＨＨＨ（配列番号３０）
（ａ－１５）３ＨＩ×５：ＨＨＨＩＨＨＨＩＨＨＨＩＨＨＨＩＨＨＨ（配列番号３１）
（ａ－１６）３ＨＦ×５：ＨＨＨＦＨＨＨＦＨＨＨＦＨＨＨＦＨＨＨ（配列番号３２）
（ａ－１７）３ＨＥ×５：ＨＨＨＥＨＨＨＥＨＨＨＥＨＨＨＥＨＨＨ（配列番号３３）
（ａ－１８）３ＨＤ×５：ＨＨＨＤＨＨＨＤＨＨＨＤＨＨＨＤＨＨＨ（配列番号３４）
（ａ－１９）３ＨＣ×５：ＨＨＨＣＨＨＨＣＨＨＨＷＨＨＨＣＨＨＨ（配列番号３５）
（ａ－２０）３ＨＹ×５：ＨＨＨＹＨＨＨＹＨＨＨＹＨＨＨＹＨＨＨ（配列番号３６）
（ａ－２１）３ＨＳ×５：ＨＨＨＳＨＨＨＳＨＨＨＳＨＨＨＳＨＨＨ（配列番号３７）
（ａ－２２）３ＨＧ×５：ＨＨＨＧＨＨＨＧＨＨＨＧＨＨＨＧＨＨＨ（配列番号３８）
（ａ－２３）３ＨＡ×５：ＨＨＨＡＨＨＨＡＨＨＨＡＨＨＨＡＨＨＨ（配列番号３９）
（ａ－２）１２Ｈ：ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号８）
（ａ－３）１５Ｈ：ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１）
（ａ－４）１８Ｈ：ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０）
（ａ－５）３ＨＷ×５：ＨＨＨＷＨＨＨＷＨＨＨＷＨＨＨＷＨＨＨ（配列番号２１）
（ａ－６）３ＨＶ×５：ＨＨＨＶＨＨＨＶＨＨＨＶＨＨＨＶＨＨＨ（配列番号２２）
（ａ－７）３ＨＴ×５：ＨＨＨＴＨＨＨＴＨＨＨＴＨＨＨＴＨＨＨ（配列番号２３）
（ａ－８）３ＨＲ×５：ＨＨＨＲＨＨＨＲＨＨＨＲＨＨＨＲＨＨＨ（配列番号２４）
（ａ－９）３ＨＭ×５：ＨＨＨＭＨＨＨＭＨＨＨＭＨＨＨＭＨＨＨ（配列番号２５）
（ａ－１０）３ＨＬ×５：ＨＨＨＬＨＨＨＬＨＨＨＬＨＨＨＬＨＨＨ（配列番号２６）
（ａ－１１）３ＨＰ×５：ＨＨＨＰＨＨＨＰＨＨＨＰＨＨＨＰＨＨＨ（配列番号２７）
（ａ－１２）３ＨＮ×５：ＨＨＨＮＨＨＨＮＨＨＨＮＨＨＨＮＨＨＨ（配列番号２８）
（ａ－１３）３ＨＫ×５：ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ（配列番号２９）
（ａ－１４）３ＨＱ×５：ＨＨＨＱＨＨＨＱＨＨＨＱＨＨＨＱＨＨＨ（配列番号３０）
（ａ－１５）３ＨＩ×５：ＨＨＨＩＨＨＨＩＨＨＨＩＨＨＨＩＨＨＨ（配列番号３１）
（ａ－１６）３ＨＦ×５：ＨＨＨＦＨＨＨＦＨＨＨＦＨＨＨＦＨＨＨ（配列番号３２）
（ａ－１７）３ＨＥ×５：ＨＨＨＥＨＨＨＥＨＨＨＥＨＨＨＥＨＨＨ（配列番号３３）
（ａ－１８）３ＨＤ×５：ＨＨＨＤＨＨＨＤＨＨＨＤＨＨＨＤＨＨＨ（配列番号３４）
（ａ－１９）３ＨＣ×５：ＨＨＨＣＨＨＨＣＨＨＨＷＨＨＨＣＨＨＨ（配列番号３５）
（ａ－２０）３ＨＹ×５：ＨＨＨＹＨＨＨＹＨＨＨＹＨＨＨＹＨＨＨ（配列番号３６）
（ａ－２１）３ＨＳ×５：ＨＨＨＳＨＨＨＳＨＨＨＳＨＨＨＳＨＨＨ（配列番号３７）
（ａ－２２）３ＨＧ×５：ＨＨＨＧＨＨＨＧＨＨＨＧＨＨＨＧＨＨＨ（配列番号３８）
（ａ－２３）３ＨＡ×５：ＨＨＨＡＨＨＨＡＨＨＨＡＨＨＨＡＨＨＨ（配列番号３９）
【0046】
ＹＥｐＧＡＰｃｈｅｒｒｙベクター（特開２０１７－８８５３６参照）をテンプレートとして上記タグペプチドがＲＦＰタンパク質のＣ末端側に付加するようにプライマーを設計してＰＣＲを行い、上記タグペプチド融合ＲＦＰをコードする塩基配列をＰＣＲにより増幅した。かかるＰＣＲ産物をＹＥｐＧＡＰｃｈｅｒｒｙベクターに相同組み換えにより組み込み、サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株（Brachmann et al., Yeast Volume14, Issue2 30 January 1998参照）へ形質転換し、それぞれのタグペプチドを融合したＲＦＰを生産する形質転換体を作製した。
【0047】
次に、２４－ｗｅｌｌ プレートにＹＰＤを１ｍＬ加え、上記で作製した形質転換体を植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。その後、培養液１０μＬを取り、ＹＰＤ１ｍＬに混ぜてさらに２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。培養液１０μＬを蒸留水で１００倍希釈してＳｙｎｅｒｇｙ ＭＸ ＳＭＡＴＢＬ（BioTek社）でＯＤ６００及び蛍光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ５５８， ｅｍｉｓｓｉｏｎ ６１３）を測定した。ＲＦＰの活性（赤色の強度）は、「ＲＦＰ活性＝蛍光／ＯＤ６００」で算出した。結果を図１に示す。
【0048】
図１に示すように、連続するヒスチジンの数が多くなるほどＲＦＰの活性が低下していた。また、同じヒスチジンを１５個有しているタグと比較して、３連続するヒスチジンの間にプロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）を有していれば、１．５倍以上の活性を有していることが明らかとなった。
【0049】
［実施例２］
実施例１により、連続するヒスチジンにプロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、又はグルタミン（Ｑ）が含まれることでタンパク質の活性低下を抑制していることが確認された。そこで、以下に示すヒスチジンとアスパラギン酸との様々な組み合わせにおけるタンパク質の活性を調べた。
実施例１により、連続するヒスチジンにプロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、又はグルタミン（Ｑ）が含まれることでタンパク質の活性低下を抑制していることが確認された。そこで、以下に示すヒスチジンとアスパラギン酸との様々な組み合わせにおけるタンパク質の活性を調べた。
【0050】
（ｂ－１）タグペプチド無し
（ｂ－２）ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２）
（ｂ－３）ＨＤＨＤＨＤＨＤＨＤＨ（配列番号１６）
（ｂ－４）ＨＨＤＨＨＤＨＨ（配列番号４０）
（ｂ－５）ＨＨＨＤＨＨＨ（配列番号４１）
（ｂ－６）ＨＨＨＨＨＨＤＤＤＤＤＤ（配列番号４２）
（ｂ－７）ＤＤＤＤＤＤＨＨＨＨＨＨ（配列番号４３）
（ｂ－８）ＤＤＤＨＨＨＨＨＨＤＤＤ（配列番号４４）
（ｂ－９）ＨＨＨＨＨＨＤＤＤ（配列番号４５）
（ｂ－１０）ＤＤＤＨＨＨＨＨＨ（配列番号４６）
（ｂ－２）ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２）
（ｂ－３）ＨＤＨＤＨＤＨＤＨＤＨ（配列番号１６）
（ｂ－４）ＨＨＤＨＨＤＨＨ（配列番号４０）
（ｂ－５）ＨＨＨＤＨＨＨ（配列番号４１）
（ｂ－６）ＨＨＨＨＨＨＤＤＤＤＤＤ（配列番号４２）
（ｂ－７）ＤＤＤＤＤＤＨＨＨＨＨＨ（配列番号４３）
（ｂ－８）ＤＤＤＨＨＨＨＨＨＤＤＤ（配列番号４４）
（ｂ－９）ＨＨＨＨＨＨＤＤＤ（配列番号４５）
（ｂ－１０）ＤＤＤＨＨＨＨＨＨ（配列番号４６）
【0051】
ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）のＣ末端側に、上記（ｂ－１）～（ｂ－１０）のタグペプチドが付加したタグペプチド融合ＧＬｕｃを生産する形質転換体を作製し、ＧＬｕｃによる蛍光を調べることでタンパク質の活性を評価した。
【0052】
ＧＬｕｃを含むベクター（New England Biolabs Japan社）をテンプレートとして上記タグペプチドがＧＬｕｃタンパク質のＣ末端側に付加するようにプライマーを設計してＰＣＲを行い、上記タグペプチド融合ＧＬｕｃをコードする塩基配列をＰＣＲにより増幅した。かかるＰＣＲ産物を上記ＹＥｐＧＡＰｃｈｅｒｒｙベクターに相同組み換えにより組み込んで、サッカロマイセス・セレビシエの上記ＢＹ４７４１株へ形質転換し、それぞれのタグペプチドを融合したＧＬｕｃを生産する形質転換体を作製した。
【0053】
次に、２４－ｗｅｌｌ プレートにＹＰＤを１ｍＬ加え、上記で作製した形質転換体を植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。その後、培養液１０μＬを取り、ＹＰＤ１ｍＬに混ぜてさらに２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。培養液１０μＬを蒸留水で１００倍希釈して分光光度計でＯＤ６００を測定した。また、ＢｉｏＬｕｘ（登録商標）Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（New England Biolabs社）とルミノメータ(Glo Max20/20n Luminometer：Promega社)を用いて培養液中のルシフェラーゼの相対発現量（ＲＬＵ／（μＬ・ＯＤ））をルシフェラーゼ活性として算出した。結果を図２に示す。
【0054】
図２から明らかなように、６個のヒスチジン（Ｈ）が連続した６Ｈの場合と比較して、アスパラギン酸（Ｄ）を含有した場合にはルシフェラーゼ活性が２倍以上となっており、特に配列番号１６に示すヒスチジンとアスパラギン酸を交互に配置したＨＤＨＤＨＤＨＤＨＤＨにおいては６Ｈと比較して１０倍以上活性が高いことが確認された。したがって、ヒスチジンの連続を少なくすること、及び／又はアスパラギン酸の連続性を少なくすることで高いルシフェラーゼ活性が維持できると考えられた。
【0055】
［実施例３］＜チューブ内でのニッケルビーズへの吸着－１＞
実施例２によりタグペプチドとして配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるＨＤＨＤＨＤＨＤＨＤＨ（６ＨＤ）を用いればタンパク質の活性低下を抑制することが確認された。ここで、タグペプチドを利用してタンパク質を精製するには、タグペプチドがニッケルに吸着する必要がある。そこで、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるタグペプチド（ＨＤＨＤＨＤＨＤＨＤＨ：６ＨＤ）又は配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるタグペプチドＨＥＨＥＨＥＨＥＨＥＨ：６ＨＥ）のニッケルビーズへの吸着を調べた。
実施例２によりタグペプチドとして配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるＨＤＨＤＨＤＨＤＨＤＨ（６ＨＤ）を用いればタンパク質の活性低下を抑制することが確認された。ここで、タグペプチドを利用してタンパク質を精製するには、タグペプチドがニッケルに吸着する必要がある。そこで、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるタグペプチド（ＨＤＨＤＨＤＨＤＨＤＨ：６ＨＤ）又は配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるタグペプチドＨＥＨＥＨＥＨＥＨＥＨ：６ＨＥ）のニッケルビーズへの吸着を調べた。
【0056】
（ＲＦＰタンパク質抽出液の調製）
上記実施例１と同様に、ＹＥｐＧＡＰｃｈｅｒｒｙベクターを用いてＲＦＰタンパク質のＣ末端側に配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるタグペプチドを融合したタグペプチド融合ポリペプチド（ＲＦＰ－６ＨＤ）又はＲＦＰタンパク質のＣ末端側に配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるタグペプチドを融合したタグペプチド融合ポリペプチド（ＲＦＰ－６ＨＥ）を生産するサッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株の形質転換体を作製した。かかる形質転換体、及び実施例１で作製したＲＦＰ－６Ｈを生産する形質転換体、タグペプチドなしのＲＦＰを生産する形質転換体を培養し、培養液を１５ｍＬチューブに移し、３０００ｒｐｍで１分ほど遠心分離し、上清を捨てた。そこに０．１Ｍ トリス塩基を５ｍＬ加え、攪拌後に３０００ｒｐｍで１分遠心分離して上清を捨てた。そこに０．１Ｍ トリス塩基＋１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を１．５ｍＬ加え、攪拌後に５０℃で１時間熱した。その後、９０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清をＲＦＰ－６ＨＤ、ＲＦＰ－６ＨＥ、ＲＦＰ－６Ｈ、又はＲＦＰのタンパク質抽出液とした。
上記実施例１と同様に、ＹＥｐＧＡＰｃｈｅｒｒｙベクターを用いてＲＦＰタンパク質のＣ末端側に配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるタグペプチドを融合したタグペプチド融合ポリペプチド（ＲＦＰ－６ＨＤ）又はＲＦＰタンパク質のＣ末端側に配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるタグペプチドを融合したタグペプチド融合ポリペプチド（ＲＦＰ－６ＨＥ）を生産するサッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株の形質転換体を作製した。かかる形質転換体、及び実施例１で作製したＲＦＰ－６Ｈを生産する形質転換体、タグペプチドなしのＲＦＰを生産する形質転換体を培養し、培養液を１５ｍＬチューブに移し、３０００ｒｐｍで１分ほど遠心分離し、上清を捨てた。そこに０．１Ｍ トリス塩基を５ｍＬ加え、攪拌後に３０００ｒｐｍで１分遠心分離して上清を捨てた。そこに０．１Ｍ トリス塩基＋１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を１．５ｍＬ加え、攪拌後に５０℃で１時間熱した。その後、９０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清をＲＦＰ－６ＨＤ、ＲＦＰ－６ＨＥ、ＲＦＰ－６Ｈ、又はＲＦＰのタンパク質抽出液とした。
【0057】
（ニッケルビーズへの吸着）
ニッケルビーズ（His-Select Nickel Affinity Gel:シグマアルドリッチ社)５０μＬ、上記ＲＦＰ－６ＨＥ、ＲＦＰ－６ＨＤ、ＲＦＰ－６Ｈ又はＲＦＰのタンパク質抽出液１００μＬ及び吸着液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７）１００μＬを１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ（sorenson社）に加えて混合し、Ｉｎｔｅｌｌｉ－ｍｉｘｔｅｒを用いて、３０ｒｐｍで１０分混合し、その後６０００ｒｐｍで数秒遠心した。結果を図３に示す。
ニッケルビーズ（His-Select Nickel Affinity Gel:シグマアルドリッチ社)５０μＬ、上記ＲＦＰ－６ＨＥ、ＲＦＰ－６ＨＤ、ＲＦＰ－６Ｈ又はＲＦＰのタンパク質抽出液１００μＬ及び吸着液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７）１００μＬを１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ（sorenson社）に加えて混合し、Ｉｎｔｅｌｌｉ－ｍｉｘｔｅｒを用いて、３０ｒｐｍで１０分混合し、その後６０００ｒｐｍで数秒遠心した。結果を図３に示す。
【0058】
図３から明らかなように、６ＨＥ、６ＨＤをタグペプチドとして融合したＲＦＰ－６ＨＥ及びＲＦＰ－６ＨＤはニッケルビーズに吸着することが確認された。
［実施例４］＜チューブ内でのニッケルビーズへの吸着－２＞
［実施例４］＜チューブ内でのニッケルビーズへの吸着－２＞
【0059】
（塩の影響）
実施例３では吸着液としてＴｒｉｓ－ＨＣｌを用いたが、他の吸着液を用いてタグペプチド融合ペプチドのニッケルビーズへの吸着を調べた。また、実施例３ではタグペプチド融合ペプチドとして酵母で生産したタンパク質抽出液を用いたが、以下の方法で大腸菌で生産したＲＦＰ－６ＨＥ、ＲＦＰ－６Ｈタンパク質抽出液を用いた。
実施例３では吸着液としてＴｒｉｓ－ＨＣｌを用いたが、他の吸着液を用いてタグペプチド融合ペプチドのニッケルビーズへの吸着を調べた。また、実施例３ではタグペプチド融合ペプチドとして酵母で生産したタンパク質抽出液を用いたが、以下の方法で大腸菌で生産したＲＦＰ－６ＨＥ、ＲＦＰ－６Ｈタンパク質抽出液を用いた。
【0060】
ＲＦＰのＣ末端側に６ＨＥが結合したＲＦＰ－６ＨＥを発現する形質転換体ＲＡＫ２６１１８株（ＤＨ５α株／genotype:pAmpOri-srlA100p-eEmRFP-6HE：Nakamura et al., molecular Biotechnology December 2018, Volume 60, Issue 12, pp 912-923）、及びＲＦＰのＣ末端側に６Ｈが結合したＲＦＰ－６Ｈを発現する形質転換体ＲＡＫ２６１１７株（ＤＨ５α株／genotype:pAmpOri-srlA100p-eEmRFP-6H）を酵母エキス及びポリペプトンを含む培地で３７℃、４８時間、１７５ｒｐｍで培養した。次に、培養液を５０ｍＬチューブに移し、１２，０００ｒｐｍで１分遠心して上清を捨てた。１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む溶液を３ｍＬ加えて攪拌し、ＲＦＰ－６ＨＥ又はＲＦＰ－６Ｈタンパク質抽出液を得た。
【0061】
また、吸着液として、吸着液の種類を０．１Ｍ ＬｉＣｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＫＣｌとした場合、吸着液の濃度を１Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍ ＫＣｌ、０．０１Ｍ ＫＣｌとした場合に分けて行った。それぞれの吸着液を用いた場合の結果をそれぞれ図４（ａ）、（ｂ）に示す。
【0062】
図４（ａ）、（ｂ）から明らかなように、ＲＦＰ－６ＨＥは０．１Ｍ ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ、ＫＣｌのいずれの塩の存在下でもニッケルビーズに吸着することが明らかとなった。なお、吸着液として蒸留水を用いた場合にはＲＦＰ－６ＨＥはニッケルビーズに吸着しなかった（図示なし）。また、ＫＣｌにおいて、塩濃度が０．０１Ｍでは吸着せず、０．１Ｍ、１Ｍで吸着した。かかる結果より、ＲＦＰ－６ＨＥは一定の濃度以上の塩の存在下でニッケルビーズに吸着することが確認された。一方、ＲＦＰ－６Ｈは蒸留水や０．０１Ｍ ＫＣｌでも吸着しており、ＲＦＰ－６Ｈは塩濃度に依存せずにニッケルビーズに吸着すると考えられた。また、通常、１Ｍの濃度のＫＣｌ溶液は、通常のイオン交換クロマトグラフィーでは溶出に用いる塩濃度であるため、１Ｍの濃度のＫＣｌを用いてニッケルに吸着させれば、目的外のタンパク質の非特異的な吸着を低減させることが可能となる。
【0063】
また、一定の塩の存在下での吸着ということから、ＲＦＰ－６ＨＥとニッケルビーズとの吸着にはグルタミン酸の側鎖が関与している可能性が示唆された。
【0064】
［実施例５］＜ＲＦＰ－６ＨＥの溶出（チューブ）＞
上記実施例３及び４によりＲＦＰ－６ＨＥはニッケルビーズに吸着することが確認できた。ここで、タンパク質を精製するには、ニッケルビーズに吸着したタンパク質を溶出する必要がある。そこで、さらに吸着したタンパク質をニッケルビーズから溶出できるかどうかをマイクロ遠心チューブを用いて調べた。
上記実施例３及び４によりＲＦＰ－６ＨＥはニッケルビーズに吸着することが確認できた。ここで、タンパク質を精製するには、ニッケルビーズに吸着したタンパク質を溶出する必要がある。そこで、さらに吸着したタンパク質をニッケルビーズから溶出できるかどうかをマイクロ遠心チューブを用いて調べた。
【0065】
（イミダゾールによる溶出）
吸着液として２Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０を用いて実施例３と同様にニッケルビーズに６ＨＥを吸着させた。次に、０．１Ｍのイミダゾールで溶出を行った。結果を図５に示す。図５から明らかなようにチューブ全体が青紫色となり、ＲＦＰ－６ＨＥはＲＦＰ－６Ｈと同様に０．１Ｍのイミダゾールでニッケルビーズから溶出することが確認された。
吸着液として２Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０を用いて実施例３と同様にニッケルビーズに６ＨＥを吸着させた。次に、０．１Ｍのイミダゾールで溶出を行った。結果を図５に示す。図５から明らかなようにチューブ全体が青紫色となり、ＲＦＰ－６ＨＥはＲＦＰ－６Ｈと同様に０．１Ｍのイミダゾールでニッケルビーズから溶出することが確認された。
【0066】
（ヒスチジンによる溶出）
イミダゾールによる溶出が確認されたが、イミダゾールは塩基性であるため、溶出するタンパク質の種類及び溶出したタンパク質の用途によっては、溶出液からイミダゾールを取り除く必要がある。ここで、イミダゾールは構造的にヒスチジンと部分的に類似している。また、ヒスチジンはイミダゾールより低コストであると共にｐＨの調整が容易である。そこで、イミダゾールの代わりにヒスチジン（１、１０、２０、４０、６０、８０、１００ｍＭ）での溶出を試みた。結果を図６に示す。図６から明らかなように、ヒスチジンによってもＲＦＰ－６ＨＥはニッケルビーズから溶出することが確認された。
イミダゾールによる溶出が確認されたが、イミダゾールは塩基性であるため、溶出するタンパク質の種類及び溶出したタンパク質の用途によっては、溶出液からイミダゾールを取り除く必要がある。ここで、イミダゾールは構造的にヒスチジンと部分的に類似している。また、ヒスチジンはイミダゾールより低コストであると共にｐＨの調整が容易である。そこで、イミダゾールの代わりにヒスチジン（１、１０、２０、４０、６０、８０、１００ｍＭ）での溶出を試みた。結果を図６に示す。図６から明らかなように、ヒスチジンによってもＲＦＰ－６ＨＥはニッケルビーズから溶出することが確認された。
【0067】
（Ｔｒｉｓ緩衝液による溶出）
ヒスチジンタグのイミダゾールを用いた溶出ではｐＨを制御するためにＴｒｉｓ緩衝液を用いることが多い。そこで、吸着液として２Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０を用いて実施例３と同様にニッケルビーズにＲＦＰ－６ＨＥを吸着させた。次に、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８、９、及び１０、濃度０．５及び１Ｍ）で溶出を行った。結果を図７に示す。図７から明らかなように、いずれのＴｒｉｓ緩衝液でもＲＦＰ－６ＨＥはニッケルビーズから溶出すること、０．５Ｍより１Ｍの方が溶出されやすいことが分かった。なお、０．５ＭではＲＦＰ－６Ｈの場合には溶出されにくいのに対して、ＲＦＰ－６ＨＥでは溶出でき、特にｐＨ９及び１０で溶出されやすいことが明らかとなった。
ヒスチジンタグのイミダゾールを用いた溶出ではｐＨを制御するためにＴｒｉｓ緩衝液を用いることが多い。そこで、吸着液として２Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０を用いて実施例３と同様にニッケルビーズにＲＦＰ－６ＨＥを吸着させた。次に、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８、９、及び１０、濃度０．５及び１Ｍ）で溶出を行った。結果を図７に示す。図７から明らかなように、いずれのＴｒｉｓ緩衝液でもＲＦＰ－６ＨＥはニッケルビーズから溶出すること、０．５Ｍより１Ｍの方が溶出されやすいことが分かった。なお、０．５ＭではＲＦＰ－６Ｈの場合には溶出されにくいのに対して、ＲＦＰ－６ＨＥでは溶出でき、特にｐＨ９及び１０で溶出されやすいことが明らかとなった。
【0068】
［実施例６］＜ＲＦＰ－６ＨＥの溶出（カラム）＞
実施例５ではチューブを用いて所定の溶出液で溶出を行ったが、タンパク質の精製ではカラムを用いて溶出することが一般的である。そこで、カラムを用いた溶出を検討した。
実施例５ではチューブを用いて所定の溶出液で溶出を行ったが、タンパク質の精製ではカラムを用いて溶出することが一般的である。そこで、カラムを用いた溶出を検討した。
【0069】
ペリスタルティックポンプ ＵＶモニター一体型クロマトグラフィーシステム ＡＫＴＡ ｓｔａｒｔ（ＧＥヘルスケアジャパン社）にニッケル充填カラム（Ｈｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰ：ＧＥヘルスケアジャパン社）を連結した。ＲＦＰ－６ＨＥ又はＲＦＰ－６Ｈを上記ニッケル充填カラムにアプライし、１Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０で吸着後、１０分同液で洗浄し、さらに蒸留水で５分洗浄した。次に、０－１００ｍＭイミダゾールの濃度勾配によりＲＦＰ－６ＨＥ又はＲＦＰ－６Ｈを溶出してＵＶ２８０ｎｍの吸収を測定した。溶出したときピークが見られた液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した。ゲルはＥｘｔｒａ ＰＡＧＥ Ｏｎｅ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ １０－２０％を用いて３００Ｖ、３５分で電気泳動した。イミダゾールの濃度勾配による溶出結果を図８（ａ）、（ｂ）に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を図８（ｃ）に示す。
【0070】
図８（ａ）、（ｂ）から明らかなように、ＲＦＰ－６Ｈと比較してＲＦＰ－６ＨＥはシャープなピークで溶出していること、及び低濃度のイミダゾールで溶出可能であることが明らかとなった。また、図８（ｃ）から明らかなように、ＲＦＰ－６ＨＥはＲＦＰ－６Ｈと同程度に精製されていることが確認された。
【0071】
なお、実施例１において、タグペプチドとして３連続するヒスチジンの間にプロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）を有している場合にタンパク質の活性が高かったため、ＲＦＰ－６ＨＰ及びＲＦＰ－６ＨＧを実施例２と同様の方法で作製して、上記と同様に０－１００ｍＭイミダゾールの濃度勾配によりニッケル充填カラムからの溶出を試みた。結果を図９（ａ）、（ｂ）に示す。
【0072】
図９（ａ）、（ｂ）から明らかなように、ＲＦＰ－６ＨＰ及びＲＦＰ－６ＨＧではニッケル充填カラムからの溶出がほとんどなく、タンパク質の精製にはＲＦＰ－６ＨＰ及びＲＦＰ－６ＨＧではなくＲＦＰ－６ＨＥの方が好ましいことが明らかとなった。
【0073】
［実施例７］＜ＲＦＰ－６ＨＥの溶出（カラム）－２＞
実施例６においては、イミダゾールの濃度勾配による溶出の前に蒸留水で洗浄していたが、その後の本発明者らの解析により蒸留水でも一部溶出することが確認された。そこで、より精製度を向上させるために、実施例６における溶出において蒸留水での洗浄工程を除いた溶出を検討した。結果を図１０に示す。
実施例６においては、イミダゾールの濃度勾配による溶出の前に蒸留水で洗浄していたが、その後の本発明者らの解析により蒸留水でも一部溶出することが確認された。そこで、より精製度を向上させるために、実施例６における溶出において蒸留水での洗浄工程を除いた溶出を検討した。結果を図１０に示す。
【0074】
【0075】
［実施例８］＜ＲＦＰ－６ＨＥの洗浄（カラム）＞
実施例４の結果により、塩の濃度によってはＲＦＰ－６ＨＥがニッケルに吸着しづらい。一方で、精製度を高めるためには、ニッケルに対する目的外タンパク質の非特異的な結合を防ぐために洗浄液として低い塩濃度の方が好ましい。そこで、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ及びＲｂＣｌを用いて濃度勾配をかけて洗浄し、塩溶液を用いて洗浄をする場合の濃度の検討を行った。
実施例４の結果により、塩の濃度によってはＲＦＰ－６ＨＥがニッケルに吸着しづらい。一方で、精製度を高めるためには、ニッケルに対する目的外タンパク質の非特異的な結合を防ぐために洗浄液として低い塩濃度の方が好ましい。そこで、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ及びＲｂＣｌを用いて濃度勾配をかけて洗浄し、塩溶液を用いて洗浄をする場合の濃度の検討を行った。
【0076】
実施例６と同様にニッケル充填カラムにＲＦＰ－６ＨＥをアプライし、１Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０で吸着後、１－０．１ＭのＮａＣｌ、１－０．１Ｍ ＫＣｌ、又は１－０．１Ｍ Ｌｉｃｌでの濃度勾配、及び０．１－０．０１ＭのＮａＣｌ、０．１－０．０１Ｍ ＫＣｌ、０．１－０．０１Ｍ ＬｉＣｌ、又は０．１－０．０１Ｍ ＲｂＣｌでの濃度勾配により洗浄し、ＵＶ２８０ｎｍを測定した。ＮａＣｌの結果を図１１に、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、及びＲｂＣｌの結果を図１２（ａ）～（ｃ）に示す。
【0077】
図１１、１２に示すようにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ及びＲｂＣｌのいずれも０．１Ｍの濃度では溶出されていなかった。一方、０．０１Ｍではニッケルカラム内での移動が観察されていた。したがって、タンパク質の精製における精製度の向上及び収率の向上の観点からは、塩溶液を用いて洗浄をする場合の濃度としては０．０３Ｍ以上が妥当であると考えられた。
【0078】
［実施例９］＜ＲＦＰ－６ＨＥの溶出（カラム）－３＞
実施例８により、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ及びＲｂＣｌを用いて洗浄する場合には、０．０３Ｍ付近であればＲＦＰ－６ＨＥがニッケルカラムに吸着したままであることが確認された。そこで、上記洗浄後に、イミダゾール、ヒスチジン、又は水で溶出が可能かどうかを調べた。
実施例８により、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ及びＲｂＣｌを用いて洗浄する場合には、０．０３Ｍ付近であればＲＦＰ－６ＨＥがニッケルカラムに吸着したままであることが確認された。そこで、上記洗浄後に、イミダゾール、ヒスチジン、又は水で溶出が可能かどうかを調べた。
【0079】
実施例６と同様にニッケル充填カラムにＲＦＰ－６ＨＥをアプライし、１Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０で吸着後、０．０５Ｍ ＫＣｌで３０分洗浄後、０－１００ｍＭの濃度勾配のイミダゾール又はＬ－ヒスチジンで溶出した。結果を図１３、１４に示す。
【0080】
【0081】
さらに、 実施例６と同様にニッケル充填カラムにＲＦＰ－６ＨＥをアプライし、１Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０で吸着後、０．１Ｍ ＫＣｌで５０分洗浄後、蒸留水で３０分ほど溶出した。結果を図１５に示す。
【0082】
図１５から明らかなように、低濃度の塩での洗浄後、水によってもシャープな溶出となることが明らかとなった。
【0083】
［実施例１０］＜ＤＮＡポリメラーゼの溶出（カラム）＞
上記ではＲＦＰの精製を行ったが、他のタンパク質としてＤＮＡポリメラーゼでの精製を検討した。
上記ではＲＦＰの精製を行ったが、他のタンパク質としてＤＮＡポリメラーゼでの精製を検討した。
【0084】
実施例２と同様の方法で、ＤＮＡポリメラーゼのＣ末端側にタグペプチド６ＨＥが付加したタグペプチド融合ＤＮＡポリメラーゼを生産する大腸菌ＨＳＴ０８株の形質転換体を作製した。次に、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を３ｍＬ加えて攪拌後の温浴を９５℃、５分とする以外は実施例３と同様の方法でＤＮＡポリメラーゼ－６ＨＥのタンパク質抽出液とした。
【0085】
実施例６と同様にニッケル充填カラムに上記ＤＮＡポリメラーゼ－６ＨＥをアプライし、１Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ８．０で吸着後、１Ｍ ＫＣｌにより３０分洗浄し、１００ｍＭ イミダゾールで３０分ほど溶出し、ＵＶ２８０ｎｍを測定した。結果を図１６に示す。
【0086】
図１６から明らかなように、極めてシャープにＤＮＡポリメラーゼ－６ＨＥが溶出することが確認された。したがって、本件タグペプチドを用いれば、タンパク質の種類にかかわらずタンパク質を高純度で精製可能であることが明らかとなった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】