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特許7597719ｃｏｓ型バクテリオファージに対する感受性が引き下げられた乳酸菌
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-02
(45)【発行日】2024-12-10
(54)【発明の名称】ｃｏｓ型バクテリオファージに対する感受性が引き下げられた乳酸菌
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20241203BHJP
C12N 15/57 20060101ALI20241203BHJP
A23C 9/123 20060101ALI20241203BHJP
A23C 19/032 20060101ALI20241203BHJP
A23K 10/16 20160101ALI20241203BHJP
C12N 15/74 20060101ALI20241203BHJP
C12P 1/04 20060101ALI20241203BHJP
C12N 9/48 20060101ALN20241203BHJP
C12Q 1/70 20060101ALN20241203BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12N15/57
A23C9/123
A23C19/032
A23K10/16
C12N15/74 110Z
C12P1/04 Z
C12N9/48
C12Q1/70
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021547392
(86)(22)【出願日】2020-02-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-21
(86)【国際出願番号】 EP2020053676
(87)【国際公開番号】W WO2020165301
(87)【国際公開日】2020-08-20
【審査請求日】2023-02-03
(31)【優先権主張番号】62/805,388
(32)【優先日】2019-02-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/904,787
(32)【優先日】2019-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】397060588
【氏名又は名称】インターナショナル エヌ アンド エイチ デンマーク エーピーエス
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】クリストフ・フレモー
(72)【発明者】
【氏名】フィリップ・ホルヴァト
(72)【発明者】
【氏名】アルメル・コシュ－ブラシェール
(72)【発明者】
【氏名】デニス・ロメロ
(72)【発明者】
【氏名】シルヴァン・モワノー
(72)【発明者】
【氏名】シモン・ラブリエ
【審査官】平林 由利子
(56)【参考文献】
【文献】Nature Reviews，2013年，Vol.11，pp.675-687
【文献】Applied and Environmental Microbiology，1997年，Vol.63, No.8，pp.3246-3253
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
Ａ２３Ｃ １／００－２３／００
Ａ２３Ｋ １０／００－５０／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰＲタンパク質）タンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含む、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株又はストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）株からなる群から選択される連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の株であって、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げるｍｅｔＡＰ対立遺伝子と定義され、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められ、前記ＭｅｔＡＰRタンパク質は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ＭｅｔＡＰ R タンパク質の配列は、位置５７のリシン、位置１５３のプロリン、位置１６８のグルタミン酸、位置２０６のグルタミン、位置２２８のアスパラギン酸、位置２３３のグルタミン、及び位置２３３のロイシンからなる群から選択されるアミノ酸を含み、ここで配列番号２に示されるアミノ酸配列がナンバリングに用いられ、または
前記ＭｅｔＡＰ R タンパク質は：
ａ）位置２２６にて終止コドンを含み、それ以外は配列番号２に定義される通りであるアミノ酸配列と；
ｂ）配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有し、且つ位置２２６にて終止コドンを含むアミノ酸配列と；
ｃ）位置２２６にて終止コドンを含み、それ以外は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質のアミノ酸配列と定義されるアミノ酸配列と
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、若しくはこれからなる、株。
【請求項2】
ｍｅｔＡＰ遺伝子の唯一の対立遺伝子として前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含む、請求項１に記載の株。
【請求項3】
ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げるｍｅｔＡＰ対立遺伝子であり、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められ、前記ＭｅｔＡＰRタンパク質は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、
前記ＭｅｔＡＰ R タンパク質の配列は、位置５７のリシン、位置１５３のプロリン、位置１６８のグルタミン酸、位置２０６のグルタミン、位置２２８のアスパラギン酸、位置２３３のグルタミン、及び位置２３３のロイシンからなる群から選択されるアミノ酸を含み、ここで配列番号２に示されるアミノ酸配列がナンバリングに用いられ、または
前記ＭｅｔＡＰ R タンパク質は：
ａ）位置２２６にて終止コドンを含み、それ以外は配列番号２に定義される通りであるアミノ酸配列と；
ｂ）配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有し、且つ位置２２６にて終止コドンを含むアミノ酸配列と；
ｃ）位置２２６にて終止コドンを含み、それ以外は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質のアミノ酸配列と定義されるアミノ酸配列と
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、若しくはこれからなる、ポリヌクレオチド。
【請求項4】
ファージＤＴ１に対する感受性の前記引下げは、少なくとも４対数、少なくとも５対数、又は少なくとも６対数のＥＯＰ引下げによって特徴付けられる、請求項１若しくは２に記載の株、又は請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項１、２、及び４のいずれか一項に記載の株、並びに、場合によっては、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からなる群から選択される１つ又は複数の更なる乳酸菌を含む細菌組成物。
【請求項6】
請求項１、２、及び４のいずれか一項に記載の株、又は請求項５に記載の細菌組成物を含む食品又は飼料製品、特に乳製品、肉製品、又は禾穀類食品若しくは飼料製品、より詳細には発酵乳製品。
【請求項7】
発酵製品を製造する方法であって：ａ）基質、好ましくは乳基質に、請求項１、２、及び４のいずれか一項に記載の株、又は請求項５に記載の細菌組成物を接種することと；
ｂ）工程ａ）から得た、接種された前記基質を発酵させて、発酵製品、好ましくは発酵乳製品を得ることと
を含む方法。
【請求項8】
食品又は飼料製品、好ましくは発酵食品、より好ましくは発酵乳製品を製造するための、請求項１、２、及び４のいずれか一項に記載の株、又は請求項５に記載の細菌組成物の使用。
【請求項9】
ｃｏｓ型ファージに対して感受性の、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌、特にストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株又はストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）株の、少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性を引き下げ、少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性は、ＥＯＰアッセイＩによって求められる、請求項３に記載のポリヌクレオチドの、又は請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクターの使用。
【請求項10】
少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられている、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌、特にストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株又はストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）株を調製する方法であって：ａ）ｃｏｓ型ファージに対して感受性の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌を用意することと；
ｂ）ｃｏｓ型ファージに対して感受性の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の前記細菌のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子を、請求項３に記載のポリヌクレオチドで置換すること、又は請求項３に記載のポリヌクレオチドと配列が同じｍｅｔＡＰ対立遺伝子を有するように、ｃｏｓ型ファージに対して感受性の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の前記細菌のｍｅｔＡＰ遺伝子の配列を修飾することと；
ｃ）少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌を回収することと
を含み、少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性は、ＥＯＰアッセイＩによって求められる、方法。
【請求項11】
感受性の前記引下げは、少なくとも４対数、少なくとも５対数、又は少なくとも６対数のＥＯＰ引下げによって特徴付けられる、請求項９に記載の使用、又は請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
請求項１０又は１１に記載の方法によって得られる乳酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ｃｏｓ型バクテリオファージに対する感受性が引き下げられた乳酸菌に関する。
【背景技術】
【0002】
乳酸菌のスターター培養が、乳製品（例えば、ヨーグルト、バター、及びチーズ）、肉製品、ベーカリー製品、ワイン、及び野菜製品が挙げられる発酵製品の製造のために、食品業界において広範囲にわたって用いられている。食品業界において広く用いられている乳酸菌の例として、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属が挙げられる。例えば、乳酸菌ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は、酪農業界によって、広範囲にわたって用いられている。培養の調製は、大きな労働力を要し、大量の空間及び装置を占有し、そして乳発酵中にバクテリオファージ（ファージ）が混入するリスクがかなりある。
【0003】
バクテリオファージの感染及び増殖による細菌培養の攻撃は、細菌培養の産業用途の主要な問題の１つであると考えられる。細菌を攻撃する様々なメカニズムを有する、様々な多くのファージ型が存在する。さらに、新しい株のバクテリオファージが発生する。乳酸菌の種、例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる、業界で用いられている細菌株に感染することができる様々な多くのバクテリオファージ株が見出されており、そして単離されている。
【0004】
バクテリオファージ感染、及びこれによる細菌培養の失敗を最小限に抑えるために業界で用いられている戦略は、完全には有効でない。そのような戦略として、ファージ攻撃に対するある程度のレベルの耐性が存在することを確実にするための、混合スターター培養の使用が挙げられる。また、異なるバクテリオファージに対して感受性である選択された細菌株のローテーションが用いられている。しかしながら、新しいファージの発生後の、細菌株の、耐性株との迅速な置換えは、通常、可能でない。したがって、食品業界においてファージ混入物を除去することは、未だ可能でない。
【0005】
バクテリオファージの溶解感染サイクルは特に、新たにアセンブルされたファージ粒子を放出するための、細菌宿主細胞表面へのファージ吸着、細胞中へのファージＤＮＡの注入、ファージＤＮＡ複製、ファージタンパク質発現、ファージアセンブリ、及び宿主細菌細胞溶解を伴う。細菌のファージ耐性メカニズムは、ファージ複製の溶菌サイクルの１つ又は複数の工程に関与する宿主因子によって決まり、そして通常、干渉する感染サイクルの工程に基づいて分類される。
【0006】
多数のファージ耐性メカニズムが、他の細菌種において見出されてきた一方、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）においては少数しか識別されていない。この種において最も支配的な防御メカニズムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である（非特許文献１；非特許文献２）。この防御メカニズムにおいては、細菌細胞は、ファージゲノム由来の、スペーサーという名の短い配列を蓄積し、これは、以前の遭遇に対する細胞の記憶として作用して、侵入ファージＤＮＡの特異的切断のためのガイドとして機能する。この食品グレードの連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種において、ファージ感染に関与する他の宿主因子についての情報は、ほとんど利用できない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７
【文献】Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
食品業界又は飼料業界で用いられる向上した細菌株、例えばファージに対する感受性が引き下げられた細菌株を提供することが、当該技術において必要とされ続けている。したがって、乳酸菌、例えば連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属におけるファージ感染に関与する宿主因子を識別する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、驚くべきことに、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰタンパク質）をコードする宿主遺伝子が、ファージ感染に関与し、そしてｃｏｓ型ファージＤＴ１がその溶菌サイクルを完了するのに必須であることを見出した。ｍｅｔＡＰ遺伝子中の突然変異は、ｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられたストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を提供する。突然変異株の、感受性株のｍｅｔＡＰ遺伝子との相補性により、ファージ感受性表現型の回復が生じる。また、同じ突然変異を、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）株内に導入することで、ファージ感受性表現型の引下げが実現される。このことは、ファージ感染における宿主ＭｅｔＡＰの広範囲の重要性を示唆している。また、発明者らは、ｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた表現型が、経時的に（少なくとも６０世代）安定することを示した。これにより、産業用の発酵におけるｍｅｔＡＰ突然変異の安定性及びｍｅｔＡＰ突然変異乳酸菌の重要性を確認した。
【0010】
一態様において、本発明は、メチオニンアミノペプチダーゼタンパク質（ＭｅｔＡＰＲタンパク質）をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含む乳酸菌に関し、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げ、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩ（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｐｌａｑｕｉｎｇ（ＥＯＰ）Ａｓｓａｙ Ｉ）によって求められる。ゆえに、本発明は、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰＲタンパク質）タンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含む乳酸菌に関し、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げるｍｅｔＡＰ対立遺伝子と定義され、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。特定の実施形態において、前記乳酸菌は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株又はストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）株からなる群から選択される連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の株である。
【0011】
一態様において、本発明は、本発明の乳酸菌を含む細菌組成物に関する。
【0012】
一態様において、本発明は、本発明の乳酸菌又は細菌組成物を含む食品又は飼料製品に関する。
【0013】
一態様において、本発明は、発酵製品を製造する方法であって：ａ）基質に、本発明の乳酸菌又は細菌組成物を接種することと、ｂ）工程ａ）から得た、接種された基質を発酵させて、発酵製品、好ましくは発酵乳製品を得ることとを含む方法に関する。
【0014】
一態様において、本発明は、食品又は飼料製品、好ましくは発酵食品、より好ましくは発酵乳製品を製造するための、本発明の乳酸菌又は細菌組成物の使用に関する。
【0015】
一態様において、本発明は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関し、前記ポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げ、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。ゆえに、本発明は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関し、前記ポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げるｍｅｔＡＰ対立遺伝子であり、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。
【0016】
一態様において、本発明は、ｃｏｓ型ファージに対して感受性の乳酸菌の少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性を引き下げるための、本発明のポリヌクレオチドの使用に関し、少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性は、ＥＯＰアッセイＩによって求められる。
【0017】
一態様において、本発明は、少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた乳酸菌株を調製する方法であって：ａ）ｃｏｓ型ファージに対して感受性の乳酸菌株を用意することと；ｂ）ｃｏｓ型ファージに対して感受性の前記乳酸菌株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子を、本発明のポリヌクレオチドで置換すること、又は本発明のポリヌクレオチドと配列が同じｍｅｔＡＰ対立遺伝子を有するように、ｃｏｓ型ファージに対して感受性の乳酸菌株のｍｅｔＡＰ遺伝子の配列を修飾することと；ｃ）少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた乳酸菌株を回収することとを含み、少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性は、ＥＯＰアッセイＩによって求められる、方法に関する。
【0018】
一態様において、本発明は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を識別する方法であって：ａ）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに、試験されることとなるｍｅｔＡＰ対立遺伝子を挿入して、ＳＭＱ－３０１誘導株を得ることと；ｂ）工程ａ）のＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰをプラーク形成効率アッセイＩによって求めることとを含み、少なくとも４対数、少なくとも５対数、又は少なくとも６対数のＥＯＰ引下げが、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であるｍｅｔＡＰ対立遺伝子を示す、方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【0019】
一般的な定義
特に定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
特に定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【0020】
本開示は、本明細書に開示される例示的な方法及び原材料によって制限されず、本明細書に記載のものと類似の又は同等のいかなる方法及び原材料も、本開示の実施形態の実施又は試験において使用することができる。
【0021】
本明細書において提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって用いることができる本開示の種々の態様又は実施形態を制限するものではない。したがって、直ぐ下で定義する用語は、本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
【0022】
本明細書において使用する用語「ポリヌクレオチド」は、用語「ヌクレオチド配列」及び／又は用語「核酸配列」と同義である。他に規定しない限り、いずれの核酸配列も、左から右に向けて５’から３’の向きに記す。
【0023】
本明細書において使用する用語「タンパク質」には、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドが含まれる。本明細書において使用する用語「アミノ酸配列」は、用語「タンパク質」と同義である。本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基について、アミノ酸名、従来の３文字コード、又は従来の１文字コードが用いられる。また、タンパク質が、遺伝コードの縮重に起因して、複数のヌクレオチド配列によってコードされ得ることが理解される。他に規定しない限り、いずれのアミノ酸配列も、左から右に向けてアミノからカルボキシの向きに記す。
【0024】
本発明において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質内のアミノ酸残基位置の特定のナンバリングが使用されてもよい。サンプルＭｅｔＡＰタンパク質のアミノ酸配列の、配列番号２のＭｅｔＡＰタンパク質とのアライメントによって、前記サンプルＭｅｔＡＰタンパク質内のアミノ酸残基位置に、本発明の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基位置又はナンバリングに対応する番号を割り当てることが可能である。
【0025】
用語の他の定義が、本明細書の全体にわたって出現する場合がある。例示的な実施形態をより詳細に説明する前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されないので、勿論変化してもよいことが理解されるべきである。また、本明細書中で用いられる専門用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、制限であることは意図されないことも理解されるべきである。なぜなら、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることとなるからである。
【0026】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上そうでないと明記されない限り、複数形の指示対象も含むことに留意しなければならない。
【0027】
本明細書中で使用する用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「で構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包含的又はオープンエンドであり、列挙されていない追加の部材、要素、又は方法工程を排除しない。また、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「で構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を含む。
【0028】
本明細書中で考察される刊行物は専ら、それらの開示について、本出願の出願日よりも前に提供されている。本明細書中では、そのような刊行物はいずれも、本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの容認と解釈されるべきでない。
【0029】
本発明者らは、驚くべきことに、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ）をコードする宿主遺伝子が、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属株におけるｃｏｓ型ファージ増殖に関与する細菌宿主因子であることを見出した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子が、少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属株の感受性を引き下げることを見出した。
【0030】
一態様において、本発明は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を識別する方法であって：
ａ）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに、試験されることとなるｍｅｔＡＰ対立遺伝子（候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子）を挿入して、ＳＭＱ－３０１誘導株を得ることと；
ｂ）工程ａ）のＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰをプラーク形成効率アッセイＩによって求めることと
を含み、少なくとも４対数のＥＯＰ引下げが、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であるｍｅｔＡＰ対立遺伝子を示す、方法を提供する。
ａ）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに、試験されることとなるｍｅｔＡＰ対立遺伝子（候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子）を挿入して、ＳＭＱ－３０１誘導株を得ることと；
ｂ）工程ａ）のＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰをプラーク形成効率アッセイＩによって求めることと
を含み、少なくとも４対数のＥＯＰ引下げが、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であるｍｅｔＡＰ対立遺伝子を示す、方法を提供する。
【0031】
本明細書中で使用する表現「ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子」は、特定の乳酸菌において見出されるｍｅｔＡＰ遺伝子のバージョンを意味する。ほとんどの細菌遺伝子について、遺伝子のヌクレオチド配列は変動し得、そして対立遺伝子は、同じ遺伝子の異なる配列を表す。ゆえに、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子は、配列番号１に示される通りである。配列番号１に定義されるこの対立遺伝子は、配列番号２に示されるＭｅｔＡＰタンパク質をコードする。
【0032】
ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子
発明者らは、これらのｍｅｔＡＰ対立遺伝子の一部が、ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ遺伝子（配列番号１）の元の（すなわち天然の）対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ファージＤＴ１に対するストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１の感受性を引き下げることができることを示した。これらのｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、「ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子」として本明細書中で定義される。これらのｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によってコードされるタンパク質は、本明細書中で「ＭｅｔＡＰＲタンパク質」と称される。
発明者らは、これらのｍｅｔＡＰ対立遺伝子の一部が、ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ遺伝子（配列番号１）の元の（すなわち天然の）対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ファージＤＴ１に対するストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１の感受性を引き下げることができることを示した。これらのｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、「ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子」として本明細書中で定義される。これらのｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によってコードされるタンパク質は、本明細書中で「ＭｅｔＡＰＲタンパク質」と称される。
【0033】
ゆえに、ファージＤＴ１（本明細書中で定義される）に対するＳＭＱ－３０１株の感受性を引き下げるあらゆるｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子（ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする）が、本発明の一部である。言い換えると、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げるｍｅｔＡＰ対立遺伝子として定義され、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によって元のｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株である。
【0034】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、以下の方法によって識別されるｍｅｔＡＰ対立遺伝子として、本明細書中で（特に、本発明の乳酸菌又はポリヌクレオチドの文脈において）定義される：
ａ）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１（配列番号１に示される）のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに、試験されることとなるｍｅｔＡＰ対立遺伝子（候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子）を挿入して、ＳＭＱ－３０１誘導株を得ることと；
ｂ）工程ａ）のＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰをプラーク形成効率アッセイＩによって求めること
（少なくとも４対数のＥＯＰ引下げが、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であるｍｅｔＡＰ対立遺伝子を示す）。
ａ）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１（配列番号１に示される）のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに、試験されることとなるｍｅｔＡＰ対立遺伝子（候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子）を挿入して、ＳＭＱ－３０１誘導株を得ることと；
ｂ）工程ａ）のＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰをプラーク形成効率アッセイＩによって求めること
（少なくとも４対数のＥＯＰ引下げが、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であるｍｅｔＡＰ対立遺伝子を示す）。
【0035】
ＭｅｔＡＰＲタンパク質の非限定的な例が、以下で開示される。
【0036】
本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によって与えられる、バクテリオファージに対する感受性の引下げを求める一方法が、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属株のｍｅｔＡＰ遺伝子の元の対立遺伝子の代わりに本発明の候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子が挿入されている連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属株に対するファージのプラーク形成効率（ＥＯＰ）を求めるものである。
【0037】
一実施形態において、感受性の引下げは、本明細書中に記載されるプラーク形成効率アッセイＩ（ＥＯＰアッセイＩ）でプラーク形成効率（ＥＯＰ）を算出することによって求められる。
【0038】
プラーク形成効率アッセイＩ
候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子によって与えられるｃｏｓ型バクテリオファージに対する感受性の引下げを求める一方法が、ｃｏｓ型ファージに対して感受性の乳酸菌（本明細書中で「参照株」と称される）、及び、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子でｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子が置換されている、対応する誘導乳酸菌（本明細書中で「誘導株」と称される）の双方の感受性を求めるものである。
候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子によって与えられるｃｏｓ型バクテリオファージに対する感受性の引下げを求める一方法が、ｃｏｓ型ファージに対して感受性の乳酸菌（本明細書中で「参照株」と称される）、及び、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子でｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子が置換されている、対応する誘導乳酸菌（本明細書中で「誘導株」と称される）の双方の感受性を求めるものである。
【0039】
本発明の乳酸菌の（特に連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の、特にストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株の）バクテリオファージ感受性は、本明細書中に記載されるプラーク形成効率アッセイＩ（ＥＯＰアッセイＩ）でプラーク形成効率（ＥＯＰ）を算出することによって求めることができる。
【0040】
感染性ファージ粒子の数え方は、Ｋｒｏｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００９によって記載される、本明細書中で「プラーク形成効率アッセイＩ」の名の二重アガーオーバレイプラークアッセイを用いて実行される。当該方法は、ソフトアガー栄養培地において表面上に増殖する細菌のローンに感染させることからなる。ファージによる感染により、細菌が死滅するか、又は増殖していない領域に対応する、局在化された澄明な、又は半透明のゾーンが生じることとなり、プラークと称される。ゆえに、感染性ファージ単位は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）と称される。当該アッセイを用いたファージの数え方は、１プレートあたり最小３０～最大３００ｐｆｕを必要とするので、ファージ懸濁液は希釈を必要とする場合がある。この目的のために、一次ファージ懸濁液が、５ｇ／Ｌラクトース（ｖ／ｖ）を含有する１０ｍＬのＭ１７培地中に１０倍段階希釈される。
【0041】
プラーク形成効率アッセイＩは、以下の：
ｉ．５ｇ／Ｌのラクトース（ｖ／ｖ）を含有するＭ１７培地中で３７℃にて一晩試験されることとなる各株（本明細書中で定義される通りに試験されることとなる参照株及びその誘導株）を前培養する工程と；
ｉｉ．各前培養体を別々に用いて、５ｇ／Ｌのラクトース、１０ｍＭのＣａＣｌ２、及び５ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）のアガーを含有する５ｍＬの溶融Ｍ１７－ＣａＣｌ２ソフトアガー培地（水浴中で４７℃にて維持されている）中１％（ｖ／ｖ）にて播種する工程と；
ｉｉｉ．試験されることとなる１００μＬのファージ希釈液を、播種された各培地に加える工程と；
ｉｖ．混合の後に、各混合液を、５ｇ／Ｌのラクトース、１０ｍＭのＣａＣｌ２、及び１５ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）のアガーを含有するＭ１７－ＣａＣｌ２固体アガー培地の表面上に注ぐ工程と；
ｖ．オーバレイの固化の後に、逆さにしたプレートを３７℃にて４８時間インキュベートする工程と；
ｖｉ．（３０～３００プラークを示すプレート上の）プラークを数え上げる工程と；
ｖｉｉ．病原性ファージの力価を：プラーク数×１０×希釈率の逆数として算出して、ｐｆｕ／ｍＬで表す工程と；
ｖｉｉｉ．参照株（参照株のＥＯＰは１である）に対するファージ力価で割った、試験されることとなる誘導株に対するファージ力価として、誘導株に対するファージのＥＯＰを算出する工程と
を有する。
ｉ．５ｇ／Ｌのラクトース（ｖ／ｖ）を含有するＭ１７培地中で３７℃にて一晩試験されることとなる各株（本明細書中で定義される通りに試験されることとなる参照株及びその誘導株）を前培養する工程と；
ｉｉ．各前培養体を別々に用いて、５ｇ／Ｌのラクトース、１０ｍＭのＣａＣｌ２、及び５ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）のアガーを含有する５ｍＬの溶融Ｍ１７－ＣａＣｌ２ソフトアガー培地（水浴中で４７℃にて維持されている）中１％（ｖ／ｖ）にて播種する工程と；
ｉｉｉ．試験されることとなる１００μＬのファージ希釈液を、播種された各培地に加える工程と；
ｉｖ．混合の後に、各混合液を、５ｇ／Ｌのラクトース、１０ｍＭのＣａＣｌ２、及び１５ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）のアガーを含有するＭ１７－ＣａＣｌ２固体アガー培地の表面上に注ぐ工程と；
ｖ．オーバレイの固化の後に、逆さにしたプレートを３７℃にて４８時間インキュベートする工程と；
ｖｉ．（３０～３００プラークを示すプレート上の）プラークを数え上げる工程と；
ｖｉｉ．病原性ファージの力価を：プラーク数×１０×希釈率の逆数として算出して、ｐｆｕ／ｍＬで表す工程と；
ｖｉｉｉ．参照株（参照株のＥＯＰは１である）に対するファージ力価で割った、試験されることとなる誘導株に対するファージ力価として、誘導株に対するファージのＥＯＰを算出する工程と
を有する。
【0042】
特定の実施形態において、本発明の前記乳酸菌は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の株である。候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子によって与えられるバクテリオファージに対する感受性は、ｃｏｓ型ファージ（参照株）に対して感受性の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の株、及び、ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子が候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子で置換されている連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の対応する誘導株を用いて、本明細書中に記載されるプラーク形成効率アッセイＩによって求められる。
【0043】
特定の実施形態において、本発明の前記乳酸菌は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種のものである。候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子によって与えられるバクテリオファージに対する感受性は、ｃｏｓ型ファージ（参照株）に対して感受性のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株、及び、ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子が候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子で置換されている対応する誘導ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株を用いて、本明細書中に記載されるプラーク形成効率アッセイＩによって求められる。
【0044】
候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子が、本発明に従うｍｅｔＡＰＲであるかを判定するために、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株ＳＭＱ－３０１が「参照株」として用いられ、そしてストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子の挿入によって得られたストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株が誘導株（本明細書中で「ＳＭＱ－３０１誘導体」と呼ばれる）として用いられる。
【0045】
ゆえに、一実施形態において、本明細書中で定義されるプラーク形成効率アッセイＩは、以下により実行される：
－「参照株」としてのストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株ＳＭＱ－３０１；ＳＭＱ－３０１株は、商業的に入手可能であり、ファージ－宿主相互作用を研究するモデル生物として用いられており（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ａｎｄ Ｍｏｉｎｅａｕ，１９９９；Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、そしてＦｅｌｉｘ ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ（ｗｗｗ．ｐｈａｇｅ．ｕｌａｖａｌ．ｃａ）にて照会先ＨＥＲ １３６８の下で入手可能であり；この株のゲノム配列は、受託番号ＣＰ０１１２１７．１の下で入手可能である；
－ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子が候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子によって置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株ＳＭＱ－３０１（ＳＭＱ－３０１誘導株）；ゆえに、ＳＭＱ－３０１誘導株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子は、配列番号２に示されるＭｅｔＡＰタンパク質をコードせず、特に、配列番号１に記載されていない；並びに
－商業的に入手可能であり（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ａｎｄ Ｍｏｉｎｅａｕ １９９９；Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、そしてＦｅｌｉｘ ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓにて照会先ＨＥＲ ３６８の下で入手可能であるファージＤＴ１；このファージのゲノム配列は、受託番号ＮＣ＿００２０７２．２の下で入手可能である。
－「参照株」としてのストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株ＳＭＱ－３０１；ＳＭＱ－３０１株は、商業的に入手可能であり、ファージ－宿主相互作用を研究するモデル生物として用いられており（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ａｎｄ Ｍｏｉｎｅａｕ，１９９９；Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、そしてＦｅｌｉｘ ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ（ｗｗｗ．ｐｈａｇｅ．ｕｌａｖａｌ．ｃａ）にて照会先ＨＥＲ １３６８の下で入手可能であり；この株のゲノム配列は、受託番号ＣＰ０１１２１７．１の下で入手可能である；
－ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子が候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子によって置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株ＳＭＱ－３０１（ＳＭＱ－３０１誘導株）；ゆえに、ＳＭＱ－３０１誘導株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子は、配列番号２に示されるＭｅｔＡＰタンパク質をコードせず、特に、配列番号１に記載されていない；並びに
－商業的に入手可能であり（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ａｎｄ Ｍｏｉｎｅａｕ １９９９；Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、そしてＦｅｌｉｘ ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓにて照会先ＨＥＲ ３６８の下で入手可能であるファージＤＴ１；このファージのゲノム配列は、受託番号ＮＣ＿００２０７２．２の下で入手可能である。
【0046】
本明細書中で定義される候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、前記候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子が、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げると、本発明に従うｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であるとみなし、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。ゆえに、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、前記候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子が、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げると、本発明に従うｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であるとみなし、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によって元のｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。
【0047】
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ遺伝子の元の対立遺伝子の代わりの候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子（本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子又は本明細書中で定義されるｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子を含む）の挿入は、ＳＭＱ－３０１誘導株をもたらすに違いなく、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって試験することができることは注目すべきである。ＥＯＰアッセイＩを使用しても、ＤＴ１に対する感受性の判定を可能にしない配列のいかなるｍｅｔＡＰ対立遺伝子も、本明細書中で定義されるｍｅｔＡＰ対立遺伝子とみなさない。
【0048】
ＥＯＰアッセイＩによる「ファージＤＴ１に対する感受性の引下げ」とは、少なくとも４対数のＥＯＰ引下げを意味する。一実施形態において、ＥＯＰ引下げは、少なくとも５対数である。一実施形態において、ＥＯＰ引下げは、少なくとも６対数である。一実施形態において、ＥＯＰ引下げは、少なくとも７対数である。一実施形態において、ＥＯＰ引下げは、少なくとも８対数である。一実施形態において、ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、ＥＯＰ引下げが、少なくとも４対数、少なくとも５対数、少なくとも６対数、少なくとも７対数、及び少なくとも８対数のＥＯＰ引下げからなる群から選択される場合、本発明に従うｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であるとみなし、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。ゆえに、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、前記候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子が、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を少なくとも４対数引き下げると、本発明に従うｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であるとみなし、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって（すなわち、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株と比較して）求められる。
【0049】
対照的に、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ＥＯＰを少なくとも４対数引き下げない（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、本発明に従うｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であるとみなさない。ゆえに、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰを少なくとも４対数引き下げない候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子（前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）は、本発明に従うｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であるとみなさない。
【0050】
表現「感受性を引き下げる」又は「ＥＯＰを引き下げる」は、アッセイＩに従って、すなわち、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰを求めて、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株に対するファージＤＴ１のＥＯＰと比較することによって、定義される。
【0051】
ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードするｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰタンパク質をコードし、そして２）ＥＯＰを引き下げないか、又はＥＯＰを３対数未満引き下げる（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）ｍｅｔＡＰ候補対立遺伝子は、本明細書中で、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子（ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードする）と称される。表現「ｍｅｔＡＰ変異型タンパク質」は、表現「配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するｍｅｔＡＰ変異型タンパク質」と互換的に用いられる。
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰタンパク質をコードし、そして２）ＥＯＰを引き下げないか、又はＥＯＰを３対数未満引き下げる（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）ｍｅｔＡＰ候補対立遺伝子は、本明細書中で、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子（ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードする）と称される。表現「ｍｅｔＡＰ変異型タンパク質」は、表現「配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するｍｅｔＡＰ変異型タンパク質」と互換的に用いられる。
【0052】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ＥＯＰを３対数未満引き下げる（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）。ゆえに、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰを３対数未満引き下げ、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。一実施形態において、ＥＯＰ引下げは、３対数未満である。一実施形態において、ＥＯＰ引下げは、２対数未満である。一実施形態において、ＥＯＰ引下げは、３対数未満又は２対数未満である。
【0053】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、同じＥＯＰをもたらす（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）。ゆえに、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株に対するファージＤＴ１のＥＯＰと同じ、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰをもたらし、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。
【0054】
先のＥＯＰ引下げに関する実施形態のいずれかとの組合せにおいても、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子は、配列が配列番号２と少なくとも８０％同一であるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードすると定義される。「配列番号２と少なくとも８０％同一」によって意味されるのは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である。一実施形態において、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされる）は、配列番号２と少なくとも８５％同一である配列を有する。一実施形態において、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされる）は、配列番号２と少なくとも８５％同一である配列を有する。一実施形態において、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされる）は、配列番号２と少なくとも９０％同一である配列を有する。一実施形態において、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされる）は、配列番号２と少なくとも９５％同一である配列を有する。一実施形態において、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされる）は、配列番号２と少なくとも９６％同一である配列を有する。一実施形態において、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされる）は、配列番号２と少なくとも９７％同一である配列を有する。一実施形態において、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされる）は、配列番号２と少なくとも９８％同一である配列を有する。一実施形態において、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされる）は、配列番号２と少なくとも９９％同一である配列を有する。
【0055】
一実施形態において、同一性のパーセンテージと組み合わせて、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質のサイズは、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質（２８６アミノ酸残基）と同じである；ゆえに、一実施形態において、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子は、加えて、２８６アミノ酸ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードすると定義される。
【0056】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子は、本明細書中で：
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードし；且つ
２）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ＥＯＰを３対数未満又は２対数未満引き下げる（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）
と定義される。
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードし；且つ
２）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ＥＯＰを３対数未満又は２対数未満引き下げる（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）
と定義される。
【0057】
ゆえに、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子は、本明細書中で：
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードし；且つ
２）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰを３対数未満引き下げる（前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）
と定義される。
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードし；且つ
２）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰを３対数未満引き下げる（前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）
と定義される。
【0058】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子は、本明細書中で：
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードし；且つ
２）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、同じＥＯＰをもたらす（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）
と定義される。
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードし；且つ
２）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、同じＥＯＰをもたらす（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）
と定義される。
【0059】
ゆえに、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子はまた、本明細書中で：
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードし；且つ
２）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株に対するファージＤＴ１のＥＯＰと同じ、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰをもたらす（前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）
と定義される。
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードし；且つ
２）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株に対するファージＤＴ１のＥＯＰと同じ、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰをもたらす（前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）
と定義される。
【0060】
本明細書中で定義されるｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子は、ファージＤＴ１に対して感受性である（ファージＤＴ１に対する感受性は、ＥＯＰアッセイＩによって求められる）と知られているか、又は特徴付けることができるストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株から始めて、当業者が容易に識別することができる。
【0061】
表現「同じＥＯＰ」又は「ＥＯＰを３対数未満又は２対数未満引き下げた」は、アッセイＩに従って、すなわち、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰを求めて、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株に対するファージＤＴ１のＥＯＰと比較することによって、定義される。
【0062】
乳酸菌の（特にＳＭＱ－３０１株の）ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の置換
ｍｅｔＡＰ対立遺伝子（例えば候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子又はｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子）による参照乳酸菌の（特に連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の株の、特にストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株の）ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の置換は、分子生物学における従来の技術を用いて実行され、そして当業者の能力の範囲内である。一般的に言えば、適切なルーチン方法は、相同組換えを介した置換を含む。
ｍｅｔＡＰ対立遺伝子（例えば候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子又はｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子）による参照乳酸菌の（特に連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の株の、特にストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株の）ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の置換は、分子生物学における従来の技術を用いて実行され、そして当業者の能力の範囲内である。一般的に言えば、適切なルーチン方法は、相同組換えを介した置換を含む。
【0063】
表現「ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されているｍｅｔＡＰ対立遺伝子」は、表現「ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子は、ｍｅｔＡＰ対立遺伝子によって置換されている」（例えば候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子又はｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子）と同義である。表現「ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されているｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子」は、表現「ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子は、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によって置換されている」と同義である。
【0064】
置換されている（又は代わりに挿入されている）は、挿入されることとなるｍｅｔＡＰ対立遺伝子（特に、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子又はｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子）によってコードされるＭｅｔＡＰタンパク質の配列が、元の株（例えば参照株）のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子によってコードされるＭｅｔＡＰタンパク質の配列と異なることを意味する。ゆえに、置換されている（又は代わりに挿入されている）は、元の株のｍｅｔＡＰ遺伝子のコーディング配列（開始コドンの第１のヌクレオチドから終止コドンの最後のヌクレオチドまで）が、ｍｅｔＡＰ対立遺伝子の（特に、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子又はｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子の）対応するコーディング配列によって置換されていることを意味する。
【0065】
ＳＭＱ－３０１株の場合、置換されている（又は代わりに挿入されている）は、挿入されることとなるｍｅｔＡＰ対立遺伝子（特に、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子又はｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子）によってコードされるＭｅｔＡＰタンパク質の配列が、ＳＭＱ－３０１株の元のｍｅｔＡＰ遺伝子によってコードされるＭｅｔＡＰタンパク質の配列と異なることを意味する。ゆえに、置換されている（又は代わりに挿入されている）は、ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子のコーディング配列（開始コドンの第１のヌクレオチドから終止コドンの最後のヌクレオチドまで、すなわち、配列番号１のヌクレオチド１～８６１）が、ｍｅｔＡＰ対立遺伝子の（特に、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子又はｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子の）対応するコーディング配列によって置換されていることを意味する。
【0066】
候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子を生成すること
候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子でないｍｅｔＡＰ対立遺伝子から始めて、特に配列番号２において定義されるＭｅｔＡＰタンパク質をコードするｍｅｔＡＰ対立遺伝子（例えば配列番号１）から、又は本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型対立遺伝子から始めて、ランダム突然変異誘発又は指向性突然変異誘発によって生成することができる。一実施形態において、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、ランダム突然変異誘発によって生成する。別の実施形態において、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、指向性突然変異誘発によって生成することができる。ランダム突然変異誘発又は指向性突然変異誘発に適した突然変異誘発プロトコルは、以下の材料及び方法のセクションに記載されている。
候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子でないｍｅｔＡＰ対立遺伝子から始めて、特に配列番号２において定義されるＭｅｔＡＰタンパク質をコードするｍｅｔＡＰ対立遺伝子（例えば配列番号１）から、又は本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型対立遺伝子から始めて、ランダム突然変異誘発又は指向性突然変異誘発によって生成することができる。一実施形態において、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、ランダム突然変異誘発によって生成する。別の実施形態において、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、指向性突然変異誘発によって生成することができる。ランダム突然変異誘発又は指向性突然変異誘発に適した突然変異誘発プロトコルは、以下の材料及び方法のセクションに記載されている。
【0067】
また、候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）細菌（ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子は、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子でない）（例えばＳＭＱ－３０１株）を、ファージＤＴ１によるチャレンジに提示することによって、生成することができる。株をファージによりチャレンジするのに適したプロトコルは、以下の材料及び方法のセクションに記載されている。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に起因する、ファージに対する感受性の引下げをもたらす遺伝的事象の数を減少させるために（ゆえに、ｍｅｔＡＰ突然変異に関連する遺伝的事象の数を増大させるために）、抗ＣＲＩＳＰＲ遺伝子（ａｃｒ遺伝子）を有するファージを用いることによって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の効率を阻害するか、又は低下させることが可能である（国際公開第２０１８／１９７４９５号パンフレット）。
【0068】
このように生成された候補ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、本明細書中で定義されるｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を識別する方法を用いてスクリーニングすることができる。
【0069】
一態様において、本発明は、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子（ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする）を含む乳酸菌を提供し、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げ、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。ゆえに、本発明は、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰＲタンパク質）タンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含む乳酸菌に関し、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げるｍｅｔＡＰ対立遺伝子と定義され、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によって（元の）ｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、生成されたもの、スクリーニングされたもの、及び／又は本明細書中で定義されるものである。表現「ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げる」は、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子の定義のために本明細書中で定義される通りである。特に、そして本明細書中で定義されるように、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子に関連する、ファージＤＴ１に対する感受性の引下げは、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められて、少なくとも４対数の引下げである。
【0070】
注目すべきは、表現「ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含む」は、乳酸菌（ＬＡＢ）のゲノム内に含有されるｍｅｔＡＰ遺伝子の唯一の対立遺伝子が、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であることを意味することである。ゆえに、本発明のＬＡＢのｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子は、本明細書中で定義されるｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子である。本発明のＬＡＢが、ｍｅｔＡＰ遺伝子のいくつかの対立遺伝子を含むことは意図されない。一実施形態において、本発明のＬＡＢは、ｍｅｔＡＰ遺伝子の唯一の対立遺伝子として、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げるｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含み、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。ゆえに、本発明のＬＡＢは、ｍｅｔＡＰ遺伝子の唯一の対立遺伝子として、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げるｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含み、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。
【0071】
一態様において、本発明は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げ、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。ゆえに、本発明は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げるｍｅｔＡＰ対立遺伝子であり、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書中で定義されるｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子からなる。ポリヌクレオチドは、生成された、スクリーニングされた、且つ／又は本明細書中で定義されるｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含むか、又はこれからなる。表現「ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げる」は、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子の定義のために本明細書中で定義される通りであある。特に、そして本明細書中で定義されるように、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子に関連するファージＤＴ１に対する感受性の引下げは、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められて、少なくとも４対数の引下げである。
【0072】
ＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列
（本発明のポリヌクレオチドの一部としての、又は本発明の乳酸細菌中に含有される）本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、その、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げる能力、特にその、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げる能力（本明細書中でＥＯＰアッセイＩによって求められる）に加えて、そのヌクレオチド配列によって、又はそれがコードするＭｅｔＡＰＲタンパク質のアミノ酸配列によって、定義することができる。
（本発明のポリヌクレオチドの一部としての、又は本発明の乳酸細菌中に含有される）本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、その、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げる能力、特にその、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げる能力（本明細書中でＥＯＰアッセイＩによって求められる）に加えて、そのヌクレオチド配列によって、又はそれがコードするＭｅｔＡＰＲタンパク質のアミノ酸配列によって、定義することができる。
【0073】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、以下からなる群から選択されるＭｅｔＡＰタンパク質に対する、アミノ酸の抑制、アミノ酸の付加、アミノ酸の置換、又はアミノ酸の抑制及び付加を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする：
ａ）配列番号２に定義されるアミノ酸配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質；及び
ｂ）配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質。本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ＥＯＰを引き下げないか、又はＥＯＰを３対数未満引き下げるｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされている（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）。本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰを３対数未満引き下げる、又はストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１の同じＥＯＰをもたらすｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされており、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。
ａ）配列番号２に定義されるアミノ酸配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質；及び
ｂ）配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質。本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、ＥＯＰを引き下げないか、又はＥＯＰを３対数未満引き下げるｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされている（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）。本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１のＥＯＰを３対数未満引き下げる、又はストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株に対するファージＤＴ１の同じＥＯＰをもたらすｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってコードされており、前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、前記ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株であり、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。
【0074】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列が配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する（が、配列番号２と異なる）ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0075】
ＥＯＰに関する特定の実施形態において、ｍｅｔＡＰ変異型タンパク質の文脈内で本出願の他の場所に記載される同一性及びサイズのパーセンテージは、ＭｅｔＡＰＲタンパク質の文脈において同様に当てはまる。
【0076】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ａ）配列番号２に定義されるアミノ酸配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質、及びｂ）配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質からなる群から選択されるＭｅｔＡＰタンパク質に対するアミノ酸の抑制を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする；特定の実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸の抑制によって、特に１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸の抑制によって特徴付けられる。特定の実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質は、１つのアミノ酸の抑制によって特徴付けられる。特定の実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質は、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸の抑制によって特徴付けられる。特定の実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質は、２つ、３つ、４つ、又は５つの連続アミノ酸の抑制によって特徴付けられる。
【0077】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ａ）配列番号２に定義されるアミノ酸配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質、及びｂ）配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質からなる群から選択されるＭｅｔＡＰタンパク質に対するアミノ酸の付加を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする；特定の実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸の付加によって、特に１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸の付加によって特徴付けられる。特定の実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質は、１つのアミノ酸の付加によって特徴付けられる。特定の実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質は、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸の付加によって特徴付けられる。特定の実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質は、２つ、３つ、４つ、又は５つの連続アミノ酸の付加によって特徴付けられる。
【0078】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ａ）配列番号２に定義されるアミノ酸配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質、及びｂ）配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質からなる群から選択されるＭｅｔＡＰタンパク質に対するアミノ酸の置換を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする；特定の実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸の置換によって、特に１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸の置換によって特徴付けられる。特定の実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質は、１つのアミノ酸の置換によって特徴付けられる。特定の実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質は、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸の置換によって特徴付けられる。
【0079】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、前記ＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列は、位置５７のグルタミン、位置１５３のロイシン、位置１６８のアラニン、位置２０６のヒスチジン、位置２２８のバリン、及び位置２３３のプロリンからなる群から選択されるアミノ酸を含まず、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0080】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、前記ＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列は、位置５７のグルタミンを含まず、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0081】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、前記ＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列は、位置１５３のロイシンを含まず、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0082】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、前記ＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列は、位置１６８のアラニンを含まず、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0083】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、前記ＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列は、位置２０６のヒスチジンを含まず、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0084】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、前記ＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列は、位置２２８のバリンを含まず、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0085】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、前記ＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列は、位置２３３のプロリンを含まず、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0086】
これらの実施形態のいずれにおいても、ＭｅｔＡＰＲタンパク質のサイズは、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質（２８６アミノ酸残基）と同じである。
【0087】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置５７のリシン又はその等価のアミノ酸、位置１５３のプロリン又はその等価のアミノ酸、位置１６８のグルタミン酸又はその等価のアミノ酸、位置２０６のグルタミン又はその等価のアミノ酸、位置２２８のアスパラギン酸又はその等価のアミノ酸、位置２３３のグルタミン又はその等価のアミノ酸、及び位置２３３のロイシン又はその等価のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0088】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置５７にてリシン又はその等価のアミノ酸を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0089】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置１５３にてプロリン又はその等価のアミノ酸を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0090】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置１６８にてグルタミン酸又はその等価のアミノ酸を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0091】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置２０６にてグルタミン又はその等価のアミノ酸を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0092】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置２２８にてアスパラギン酸又はその等価のアミノ酸を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0093】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置２３３にてグルタミン又はその等価のアミノ酸を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0094】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置２３３にてロイシン又はその等価のアミノ酸を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0095】
これらの実施形態のいずれにおいても、ＭｅｔＡＰＲタンパク質のサイズは、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質（２８６アミノ酸残基）と同じである。
【0096】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置５７のリシン、位置１５３のプロリン、位置１６８のグルタミン酸、位置２０６のグルタミン、位置２２８のアスパラギン酸、位置２３３のグルタミン、及び位置２３３のロイシンからなる群から選択されるアミノ酸を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0097】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置５７にてリシンを含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0098】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置１５３にてプロリンを含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0099】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置１６８にてグルタミン酸を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0100】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置２０６にてグルタミンを含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0101】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置２２８にてアスパラギン酸を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0102】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置２３３にてグルタミンを含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0103】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置２３３にてロイシンを含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0104】
これらの実施形態のいずれにおいても、ＭｅｔＡＰＲタンパク質のサイズは、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質（２８６アミノ酸残基）と同じである。
【0105】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、以下を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする：
ａ）普通であれば配列番号２に定義されるが、位置５７のグルタミン、位置１５３のロイシン、位置１６８のアラニン、位置２０６のヒスチジン、位置２２８のバリン、及び位置２３３のプロリンからなる群から選択されるアミノ酸を含まないアミノ酸配列；これらのｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、それぞれ配列番号５～１０に示されるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする；
ｂ）配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ、位置５７のグルタミン、位置１５３のロイシン、位置１６８のアラニン、位置２０６のヒスチジン、位置２２８のバリン、及び位置２３３のプロリンからなる群から選択されるアミノ酸を含まないアミノ酸配列；又は
ｃ）普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質）の１つであるが、位置５７のグルタミン、位置１５３のロイシン、位置１６８のアラニン、位置２０６のヒスチジン、位置２２８のバリン、及び位置２３３のプロリンからなる群から選択されるアミノ酸を含まないアミノ酸配列。
ａ）普通であれば配列番号２に定義されるが、位置５７のグルタミン、位置１５３のロイシン、位置１６８のアラニン、位置２０６のヒスチジン、位置２２８のバリン、及び位置２３３のプロリンからなる群から選択されるアミノ酸を含まないアミノ酸配列；これらのｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、それぞれ配列番号５～１０に示されるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする；
ｂ）配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ、位置５７のグルタミン、位置１５３のロイシン、位置１６８のアラニン、位置２０６のヒスチジン、位置２２８のバリン、及び位置２３３のプロリンからなる群から選択されるアミノ酸を含まないアミノ酸配列；又は
ｃ）普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質）の１つであるが、位置５７のグルタミン、位置１５３のロイシン、位置１６８のアラニン、位置２０６のヒスチジン、位置２２８のバリン、及び位置２３３のプロリンからなる群から選択されるアミノ酸を含まないアミノ酸配列。
【0106】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置５７のグルタミンを含まないアミノ酸配列（配列番号５）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置５７のグルタミンを含まないアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置５７のグルタミンを含まないアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0107】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置１５３のロイシンを含まないアミノ酸配列（配列番号６）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置１５３のロイシンを含まないアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置１５３のロイシンを含まないアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0108】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置１６８のアラニンを含まないアミノ酸配列（配列番号７）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置１６８のアラニンを含まないアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置１６８のアラニンを含まないアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0109】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２０６のヒスチジンを含まないアミノ酸配列（配列番号８）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２０６のヒスチジンを含まないアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置２０６のヒスチジンを含まないアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0110】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２２８のバリンを含まないアミノ酸配列（配列番号９）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２２８のバリンを含まないアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置２２８のバリンを含まないアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0111】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２３３のプロリンを含まないアミノ酸配列（配列番号１０）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２３３のプロリンを含まないアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置２３３のプロリンを含まないアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0112】
これらの実施形態のいずれにおいても、ＭｅｔＡＰＲタンパク質のサイズは、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質（２８６アミノ酸残基）と同じである。
【0113】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、以下を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする：
ａ）普通であれば配列番号２に定義されるが、位置５７のリシン若しくはその等価のアミノ酸、位置１５３のプロリン若しくはその等価のアミノ酸、位置１６８のグルタミン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２０６のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、位置２２８のアスパラギン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２３３のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、及び位置２３３のロイシン若しくはその等価のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列；
ｂ）配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置５７のリシン若しくはその等価のアミノ酸、位置１５３のプロリン若しくはその等価のアミノ酸、位置１６８のグルタミン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２０６のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、位置２２８のアスパラギン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２３３のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、及び位置２３３のロイシン若しくはその等価のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列；又は
ｃ）普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質）の１つであるが、位置５７のリシン若しくはその等価のアミノ酸、位置１５３のプロリン若しくはその等価のアミノ酸、位置１６８のグルタミン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２０６のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、位置２２８のアスパラギン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２３３のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、及び位置２３３のロイシン若しくはその等価のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列。
ａ）普通であれば配列番号２に定義されるが、位置５７のリシン若しくはその等価のアミノ酸、位置１５３のプロリン若しくはその等価のアミノ酸、位置１６８のグルタミン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２０６のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、位置２２８のアスパラギン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２３３のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、及び位置２３３のロイシン若しくはその等価のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列；
ｂ）配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置５７のリシン若しくはその等価のアミノ酸、位置１５３のプロリン若しくはその等価のアミノ酸、位置１６８のグルタミン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２０６のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、位置２２８のアスパラギン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２３３のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、及び位置２３３のロイシン若しくはその等価のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列；又は
ｃ）普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質）の１つであるが、位置５７のリシン若しくはその等価のアミノ酸、位置１５３のプロリン若しくはその等価のアミノ酸、位置１６８のグルタミン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２０６のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、位置２２８のアスパラギン酸若しくはその等価のアミノ酸、位置２３３のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸、及び位置２３３のロイシン若しくはその等価のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列。
【0114】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置５７のリシン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置５７のリシン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置５７のリシン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0115】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置１５３のプロリン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置１５３のプロリン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置１５３のプロリン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0116】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置１６８のグルタミン酸若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置１６８のグルタミン酸若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置１６８のグルタミン酸若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0117】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２０６のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２０６のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置２０６のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0118】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２２８のアスパラギン酸若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２２８のアスパラギン酸若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置２２８のアスパラギン酸若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0119】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２３３のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２３３のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置２３３のグルタミン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0120】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２３３のロイシン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２３３のロイシン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置２３３のロイシン若しくはその等価のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0121】
これらの実施形態のいずれにおいても、ＭｅｔＡＰＲタンパク質のサイズは、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質（２８６アミノ酸残基）と同じである。
【0122】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、以下を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする：
ａ）普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２０６のグルタミン、位置５７のリシン、位置１５３のプロリン、位置１６８のグルタミン酸、位置２２８のアスパラギン酸、位置２３３のグルタミン、及び位置２３３のロイシンからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列；これらのｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、それぞれ配列番号４及び１１～１６に示されるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする；
ｂ）配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２０６のグルタミン、位置５７のリシン、位置１５３のプロリン、位置１６８のグルタミン酸、位置２２８のアスパラギン酸、位置２３３のグルタミン、及び位置２３３のロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列；又は
ｃ）普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質）の１つであるが、位置５７のリシン、位置１５３のプロリン、位置１６８のグルタミン酸、位置２０６のグルタミン、位置２２８のアスパラギン酸、位置２３３のグルタミン、及び位置２３３のロイシンからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列。
ａ）普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２０６のグルタミン、位置５７のリシン、位置１５３のプロリン、位置１６８のグルタミン酸、位置２２８のアスパラギン酸、位置２３３のグルタミン、及び位置２３３のロイシンからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列；これらのｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、それぞれ配列番号４及び１１～１６に示されるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする；
ｂ）配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２０６のグルタミン、位置５７のリシン、位置１５３のプロリン、位置１６８のグルタミン酸、位置２２８のアスパラギン酸、位置２３３のグルタミン、及び位置２３３のロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列；又は
ｃ）普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質）の１つであるが、位置５７のリシン、位置１５３のプロリン、位置１６８のグルタミン酸、位置２０６のグルタミン、位置２２８のアスパラギン酸、位置２３３のグルタミン、及び位置２３３のロイシンからなる群から選択されるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列。
【0123】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置５７のリシンを含むアミノ酸配列（配列番号１１）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置５７のリシンを含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置５７のリシンを含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0124】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置１５３のプロリンを含むアミノ酸配列（配列番号１２）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置１５３のプロリンを含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置１５３のプロリンを含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0125】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置１６８のグルタミン酸を含むアミノ酸配列（配列番号１３）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置１６８のグルタミン酸を含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置１６８のグルタミン酸を含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0126】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２０６のグルタミンを含むアミノ酸配列（配列番号４）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２０６のグルタミンを含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置２０６のグルタミンを含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0127】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２２８のアスパラギン酸を含むアミノ酸配列（配列番号１４）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２２８のアスパラギン酸を含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置２２８のアスパラギン酸を含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0128】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２３３のグルタミンを含むアミノ酸配列（配列番号１５）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２３３のグルタミンを含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置２３３のグルタミンを含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0129】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義されるが、位置２３３のロイシンを含むアミノ酸配列（配列番号１６）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２３３のロイシンを含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の１つであるが、位置２３３のロイシンを含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0130】
これらの実施形態のいずれにおいても、ＭｅｔＡＰＲタンパク質のサイズは、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質（２８６アミノ酸残基）と同じである。
【0131】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列番号２に示される配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質から、Ｑ５７Ｋ、Ｌ１５３Ｐ、Ａ１６８Ｅ、Ｈ２０６Ｑ、Ｖ２２８Ｄ、Ｐ２３３Ｑ、及びＰ２３３Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換によって得られるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0132】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰタンパク質変異型から、Ｑ５７Ｋ、Ｌ１５３Ｐ、Ａ１６８Ｅ、Ｈ２０６Ｑ、Ｖ２２８Ｄ、Ｐ２３３Ｑ、及びＰ２３３Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換によって得られるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0133】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列番号２に示される配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質から、又は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する、本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質から、Ｑ５７Ｋ置換によって得られるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0134】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列番号２に示される配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質から、又は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する、本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質から、Ｌ１５３Ｐ置換によって得られるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0135】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列番号２に示される配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質から、又は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する、本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質から、Ａ１６８Ｅ置換によって得られるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0136】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列番号２に示される配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質から、又は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する、本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質から、Ｈ２０６Ｑ置換によって得られるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0137】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列番号２に示される配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質から、又は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する、本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質から、Ｖ２２８Ｄ置換によって得られるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0138】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列番号２に示される配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質から、又は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する、本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質から、Ｐ２３３Ｑ置換によって得られるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0139】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列番号２に示される配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質から、又は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する、本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質から、Ｐ２３３Ｌ置換によって得られるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0140】
これらの実施形態のいずれにおいても、ＭｅｔＡＰＲタンパク質のサイズは、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質（２８６アミノ酸性残基）と同じである。
【0141】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、最後の四分の一がトランケートされているアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。「最後の四分の一」とは、ＭｅｔＡＰタンパク質のＣ末端部分が、残基２１５から残基２８６で構成されることを意味し、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。したがって、一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、残基２１５から残基２８６で構成される残基に終止コドンを含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、残基２２６から残基２８６で構成される残基に終止コドンを含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。
【0142】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、最後の四分の一がトランケートされているアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、前記ＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列は、配列番号２の対応する部分と少なくとも８０％の同一性を有する。「対応する部分」とは、パーセンテージ同一性が、同じアミノ酸範囲についての２つの配列のアライメントに基づいて、残基１から始まって終止コドンの位置まで算出されることを意味する（一例として、タンパク質が位置２２６にてトランケートされているならば、配列番号２とのＭｅｔＡＰＲタンパク質の８０％の同一性は、残基１～２２６についての２つの配列のアライメントに基づいて算出される）。「配列番号２の対応する部分との少なくとも８０％の同一性」とは、配列番号２の対応する部分との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％の同一性を意味する。一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義される通りであるが、終止コドンを最後の四分の一内に含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0143】
一実施形態において、終止コドンは、ヌクレオチドの挿入及び／又は欠失に由来する。
【0144】
一実施形態において、終止コドンは、１ヌクレオチドの置換に由来する；一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、位置２２６にてトランケートされた（すなわち、位置２２６にて終止コドンを示す）ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ナンバリングに用いられる。一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子のコドン２２６は、ＴＧＡである。
【0145】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、普通であれば配列番号２に定義される通りであるが、位置２２６に終止コドンを含むアミノ酸配列（配列番号１７）を含むか、配列番号２と８０％の同一性を有し、且つ位置２２６に終止コドンを含むアミノ酸配列を含むか、又は普通であれば配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰ変異型タンパク質（本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質）の１つであるが、位置２２６に終止コドンを含むアミノ酸配列を含むＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする。
【0146】
一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列番号２に示される配列を有するＭｅｔＡＰタンパク質から得られるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、位置２２６のグリシンは、終止コドンで置換されている。一実施形態において、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子は、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する、本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰ変異型タンパク質から得られるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードし、位置２２６のグリシンは、終止コドンで置換されている。
【0147】
アミノ酸ナンバリング
本発明において、アミノ酸残基位置の具体的なナンバリングが、本発明のＭｅｔＡＰタンパク質の特性評価に用いられる。候補ＭｅｔＡＰタンパク質の、ＭｅｔＡＰＲタンパク質の、又はＭｅｔＡＰ変異型タンパク質のアミノ酸配列の、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質とのアライメントによって、それぞれ前記候補ＭｅｔＡＰタンパク質、前記ＭｅｔＡＰＲタンパク質、又は前記ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質内のアミノ酸残基位置に対して番号を割り当てることが可能であり、これらは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基の位置又はナンバリングと対応する。
本発明において、アミノ酸残基位置の具体的なナンバリングが、本発明のＭｅｔＡＰタンパク質の特性評価に用いられる。候補ＭｅｔＡＰタンパク質の、ＭｅｔＡＰＲタンパク質の、又はＭｅｔＡＰ変異型タンパク質のアミノ酸配列の、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質とのアライメントによって、それぞれ前記候補ＭｅｔＡＰタンパク質、前記ＭｅｔＡＰＲタンパク質、又は前記ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質内のアミノ酸残基位置に対して番号を割り当てることが可能であり、これらは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基の位置又はナンバリングと対応する。
【0148】
本出願で用いられるアミノ酸ナンバリングを説明する別の方法は、アミノ酸位置が、配列番号２に示されるアミノ酸配列内の特定の位置に「対応する」アミノ酸位置によって識別されると言うものである。これは、本発明の配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含まなければならないことを意味すると解釈されるべきでない。当業者であれば、ＭｅｔＡＰタンパク質配列が、様々な細菌株の間で異なることを容易に認識するであろう。配列番号２に示されるアミノ酸配列への言及は、単に、特定のあらゆるＭｅｔＡＰタンパク質内の特定のアミノ酸位置の識別を可能にするために用いられる。そのようなアミノ酸位置は、配列アライメントプログラムを使用してルーチン的に識別することができ、その使用は、当該技術において周知である。
【0149】
乳酸菌
本明細書中で用いられる用語「乳酸菌」又は「ＬＡＢ」は、糖を発酵させて、乳酸を排他的に、又は支配的に産生するグラム陽性菌を指す。
本明細書中で用いられる用語「乳酸菌」又は「ＬＡＢ」は、糖を発酵させて、乳酸を排他的に、又は支配的に産生するグラム陽性菌を指す。
【0150】
一態様において、本発明は、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含む乳酸菌を提供する。別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む乳酸菌を提供する。
【0151】
産業的に最も有用な乳酸菌は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の中で見出される。したがって、一実施形態において、乳酸菌は、この属群から選択されることが好ましい。
【0152】
一実施形態において、本発明の乳酸菌は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のものである。一実施形態において、本発明の乳酸菌は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種又はストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）種のものである。特定の実施形態において、本発明の乳酸菌は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種のものである。
【0153】
一実施形態において、本発明の乳酸菌は、本明細書中で記載されるように、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含むように操作されていてもよい。先に記載したように、「ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含む」は、ＬＡＢのゲノム内に含有されるｍｅｔＡＰ遺伝子の唯一の対立遺伝子が、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であることを意味する。一実施形態において、本発明の乳酸菌は、ｍｅｔＡＰ遺伝子の唯一の対立遺伝子として、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含む。
【0154】
そのような乳酸菌は、ｍｅｔＡＰ遺伝子の元の対立遺伝子を、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子によって置換することによって操作されていてもよい；置換は、本明細書中で定義される従来の技術を用いて行うことができる。
【0155】
別の実施形態において、そのような乳酸菌は：
ａ）ｃｏｓ型ファージに対して感受性の親ＬＡＢ株（参照株）を、前記ｃｏｓ型ファージによってチャレンジすることと；
ｂ）前記ｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた株を選択することと（前記ｃｏｓ型ファージに対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）；
ｃ）工程ｂ）において識別された、前記ｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた株から、配列が親のＬＡＢ株のｍｅｔＡＰ対立遺伝子と異なるｍｅｔＡＰ対立遺伝子を有する株を選択することと；
ｄ）工程ｃ）において識別された株のｍｅｔＡＰ対立遺伝子が、本明細書中で定義されるｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であることをチェックすることと
を含む方法によって操作されてもよい。
ａ）ｃｏｓ型ファージに対して感受性の親ＬＡＢ株（参照株）を、前記ｃｏｓ型ファージによってチャレンジすることと；
ｂ）前記ｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた株を選択することと（前記ｃｏｓ型ファージに対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）；
ｃ）工程ｂ）において識別された、前記ｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた株から、配列が親のＬＡＢ株のｍｅｔＡＰ対立遺伝子と異なるｍｅｔＡＰ対立遺伝子を有する株を選択することと；
ｄ）工程ｃ）において識別された株のｍｅｔＡＰ対立遺伝子が、本明細書中で定義されるｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子であることをチェックすることと
を含む方法によって操作されてもよい。
【0156】
工程ａ）のファージによる株のチャレンジに適したプロトコルは、材料及び方法のセクションにおいて記載されている。感受性の引下げ（工程ｂ）は、親のＬＡＢ株を参照株として用いて、本明細書中で定義されるプラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。特定の実施形態において、感受性の引下げは、ＥＯＰアッセイＩによって求めた場合、少なくとも４対数、少なくとも５対数、少なくとも６対数、少なくとも７対数、又は少なくとも８対数のＥＯＰ引下げによって特徴付けられる。工程ｂ）において識別された株のｍｅｔＡＰ遺伝子と、親の株のｍｅｔＡＰ遺伝子間の配列の差は、従来のあらゆる方法、例えばＤＮＡシーケンシングによって実行することができる。特定の実施形態において、チェック工程ｄ）は、本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を識別する方法を用いて実行される。
【0157】
一実施形態において、方法はまた、工程ｂ）と工程ｃ）との間に、工程ｂ）において識別された株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と、親のＬＡＢ株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座とを比較して、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が、親のＬＡＢ株の対応するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と比較して修飾されていない株を選択することからなる追加の工程［工程ｂ１］を含む。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の比較は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の長さを比較することによって、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を配列決定することによって実行することができる。続いて、工程ｃ）が、工程ｂ１）によって選択された株に実行される。
【0158】
バクテリオファージ
本明細書中で用いられる用語「バクテリオファージ」は、当該技術において理解される通りの従来の意味を有する、すなわち、細菌に選択的に感染するウイルスである。多くのバクテリオファージは、細菌の特定の属、種、又は株に特異的である。用語「バクテリオファージ」は、用語「ファージ」と同義である。
本明細書中で用いられる用語「バクテリオファージ」は、当該技術において理解される通りの従来の意味を有する、すなわち、細菌に選択的に感染するウイルスである。多くのバクテリオファージは、細菌の特定の属、種、又は株に特異的である。用語「バクテリオファージ」は、用語「ファージ」と同義である。
【0159】
「ｃｏｓ型ファージ」の定義は、当該技術に従い、ファージＤＮＡのパッケージングに必要とされる特定の配列（ｃｏｓ部位）の存在を指す。ゆえに、ｃｏｓ型ファージは、ゲノム（ｃｏｓ部位）中に「粘着」末端を組み込み、これは、いわゆるヘッドフルＤＮＡパッケージングシステムを使用し、従って、ゲノム（ｐａｃ部位）中に追加の冗長性の（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）ＤＮＡを組み込み得るｐａｃ型ファージと対照的である。乳酸菌が挙げられる細菌の種に感染するｃｏｓ型ファージが知られており、ＤＮＡパッケージング戦略に基づいて、又は遺伝的分析若しくはゲノム分析に基づいて識別することができる。
【0160】
Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）において、ｃｏｓ型ファージ及びｐａｃ型ファージ（シホウイルス（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）科）が、Ｌｅ Ｍａｒｒｅｃ ｅｔ ａｌ．（１９９７）に詳述されている。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株に感染する代表的なｃｏｓ型ファージが、ファージＤＴ１（本明細書中に記載されている）である。
【0161】
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）株に感染する代表的なｃｏｓ型ファージが、ファージＭ１０２ＡＤであり、これは、Ｄｅｌｉｓｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）に記載されている。Ｍ１０２ＡＤファージは、Ｆｅｌｉｘ ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓにて、照会先ＨＥＲ５０３の下で入手可能である。このファージの宿主株は、Ｆｅｌｉｘ ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓにて、照会先ＨＥＲ１５０３の下で入手可能であるストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＨＥＲ １５０３である。
【0162】
ポリヌクレオチド
更なる態様において、本発明は、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子［ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする］を含むか、又はこれからなるポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子［ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする］である。
更なる態様において、本発明は、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子［ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする］を含むか、又はこれからなるポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子［ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする］である。
【0163】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドのサイズは、少なくとも８４３ヌクレオチド、少なくとも８４６ヌクレオチド、少なくとも８４９ヌクレオチド、少なくとも８５２ヌクレオチド、少なくとも８５５ヌクレオチド、少なくとも８５８ヌクレオチド、又は少なくとも８６１ヌクレオチドである。一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドのサイズは、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、又は１ｋｂ未満である。一実施形態において、ポリヌクレオチドのサイズは、少なくとも８４３ヌクレオチド、少なくとも８４６ヌクレオチド、少なくとも８４９ヌクレオチド、少なくとも８５２ヌクレオチド、少なくとも８５５ヌクレオチド、少なくとも８５８ヌクレオチド、及び少なくとも８６１ヌクレオチドからなる群から選択される最小サイズから、１ｋｂ、２ｋｂ、及び３ｋｂからなる群から選択される最大サイズに及ぶ。一実施形態において、ポリヌクレオチドのサイズは、８５８ヌクレオチド又は８６１ヌクレオチドである。
【0164】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、５００ｂｐから１ｋｂに及ぶヌクレオチド領域の片側（５’、及び３’）、又は両側の側面に独立して位置する、本明細書中で定義されるｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子からなる。
【0165】
典型的には、本発明の範囲によって包含されるポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される組換えＤＮＡ技術（すなわち組換えＤＮＡ）を用いて調製される。しかしながら、本発明の別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、当該技術において周知の化学的方法を用いて全部又は一部を合成することができる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２１５－２３及びＨｏｒｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２２５－２３２参照）。
【0166】
本明細書中で定義されるＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、あらゆる乳酸菌から識別且つ／又は単離且つ／又は精製することができる。ポリヌクレオチドの識別及び／又は単離及び／又は精製について、種々の方法が当該技術内で周知である。
【0167】
一例として、適切なポリヌクレオチドが識別且つ／又は単離且つ／又は精製されると、より多くのポリヌクレオチドコピーを調製するＰＣＲ増幅技術を用いることができる。
【0168】
更なる例として、ＭｅｔＡＰＲタンパク質を産生する乳酸菌由来の染色体ＤＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡライブラリを構築することができる。ＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを合成してこれを用いて、乳酸菌から調製されたゲノムライブラリ由来のタンパク質コーディングクローンを同定することができる。
【0169】
これ以外にも、本発明のＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、確立された標準的な方法、例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９－１８６９によって記載されるホスホラミダイト法、又はＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．，３：８０１－８０５によって記載される方法によって合成的に調製することができる。ホスホラミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置で合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、且つ適切なベクター中にクローニングされる。
【0170】
ポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書又はＳａｉｋｉ Ｒ Ｋ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１に記載されるように、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製することができる。
【0171】
本発明によって包含されるポリヌクレオチド及び核酸は、単離されていてもよいし、実質的に精製されていてもよい。「単離された」又は「精製された」とは、ポリヌクレオチドが、天然の状態でポリヌクレオチドと通常は関連して見出される構成要素から、実質的に、又は本質的に解き放たれていることを意図する。そのような構成要素として、他の細胞材料、組換え生産由来の培地、及び核酸を化学的に合成する際に用いられる種々の化学物質が挙げられる。
【0172】
「単離された」ポリヌクレオチド又は核酸は、典型的に、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の注目する核酸の側面に位置する核酸配列（５’末端又は３’末端に存在するコーディング配列等）から解き放たれている。しかしながら、分子は、組成物の基本的な特徴に悪影響を与えない、一部の追加の塩基又は部分（ｂａｓｅｓ ｏｒ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含んでもよい。
【0173】
ベクター
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。一実施形態において、当該ベクターはプラスミドである。
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。一実施形態において、当該ベクターはプラスミドである。
【0174】
一実施形態において、ベクターは、１つ又は複数の選択マーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含有する。一実施形態において、ベクターは、問題となっている宿主細胞内でベクターが複製することを可能とするヌクレオチド配列を含む。そのような配列の例として、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢｌ １０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢｌ、及びｐＩＪ７０２の複製起源がある。
【0175】
本発明のベクターを用いて、本発明の乳酸菌を操作することができる。
【0176】
本発明のポリヌクレオチド又はベクターに基づく使用及び方法
一実施形態において、本発明は、ｃｏｓ型ファージに対して感受性の乳酸菌の少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性を引き下げるための、本発明のポリヌクレオチド又はベクターの使用に関する。本発明のＬＡＢが、ｍｅｔＡＰ遺伝子のいくつかの対立遺伝子を含むことは意図されない。ゆえに、ポリヌクレオチド又はベクターは、結果として生じる乳酸菌が、ゲノム内にｍｅｔＡＰ遺伝子の１つのｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含むように用いられる。一実施形態において、ポリヌクレオチド又はベクターは、元の乳酸菌のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子が、本発明のポリヌクレオチドによって置換されるように用いられる；置換は、本明細書中で定義される従来の技術を用いて行うことができる。
一実施形態において、本発明は、ｃｏｓ型ファージに対して感受性の乳酸菌の少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性を引き下げるための、本発明のポリヌクレオチド又はベクターの使用に関する。本発明のＬＡＢが、ｍｅｔＡＰ遺伝子のいくつかの対立遺伝子を含むことは意図されない。ゆえに、ポリヌクレオチド又はベクターは、結果として生じる乳酸菌が、ゲノム内にｍｅｔＡＰ遺伝子の１つのｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子を含むように用いられる。一実施形態において、ポリヌクレオチド又はベクターは、元の乳酸菌のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子が、本発明のポリヌクレオチドによって置換されるように用いられる；置換は、本明細書中で定義される従来の技術を用いて行うことができる。
【0177】
一態様において、本発明は、少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた乳酸菌株を調製する方法であって：
ａ）ｃｏｓ型ファージ（参照株）に対して感受性の乳酸菌株を用意することと；
ｂ）ｃｏｓ型ファージに対して感受性の前記乳酸菌株のｍｅｔＡＰ遺伝子を、本発明のポリヌクレオチドで置換することと；
ｃ）少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた乳酸菌株を回収することと
を含む方法に関する。
ａ）ｃｏｓ型ファージ（参照株）に対して感受性の乳酸菌株を用意することと；
ｂ）ｃｏｓ型ファージに対して感受性の前記乳酸菌株のｍｅｔＡＰ遺伝子を、本発明のポリヌクレオチドで置換することと；
ｃ）少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた乳酸菌株を回収することと
を含む方法に関する。
【0178】
一実施形態において、工程ｂ）は、ｃｏｓ型ファージに対して感受性の前記乳酸菌株のｍｅｔＡＰ遺伝子を、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子からなるポリヌクレオチドで置換することからなる。
【0179】
一態様において、本発明は、少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた乳酸菌株を調製する方法であって：
ａ）ｃｏｓ型ファージ（参照株）に対して感受性の乳酸菌株を用意することと；
ｂ）ｃｏｓ型ファージに対して感受性の乳酸菌株のｍｅｔＡＰ遺伝子を、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子と同じ配列を有するように修飾することと；
ｃ）少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた乳酸菌株を回収することと
を含む方法に関する。
ａ）ｃｏｓ型ファージ（参照株）に対して感受性の乳酸菌株を用意することと；
ｂ）ｃｏｓ型ファージに対して感受性の乳酸菌株のｍｅｔＡＰ遺伝子を、本発明のｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子と同じ配列を有するように修飾することと；
ｃ）少なくとも１つのｃｏｓ型ファージに対する感受性が引き下げられた乳酸菌株を回収することと
を含む方法に関する。
【0180】
これらの２つの方法の実施形態において、乳酸菌は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のものである。特定の実施形態において、乳酸菌は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種又はストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）種のものである。一実施形態において、乳酸菌は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種のものである。
【0181】
本発明の使用又は方法内で、バクテリオファージに対する乳酸菌の感受性は、本明細書中に記載されるプラーク形成効率アッセイＩでプラーク形成効率（ＥＯＰ）を算出することによって求めることができる。
【0182】
「ｃｏｓ型ファージに対する感受性の引下げ」とは、ＥＯＰアッセイＩによって求めた場合の、少なくとも４対数のＥＯＰ引下げを意味する。一実施形態において、ＥＯＰ引下げは、少なくとも５対数の引下げである。一実施形態において、ＥＯＰ引下げは、少なくとも６対数の引下げである。一実施形態において、ＥＯＰ引下げは、少なくとも７対数の引下げである。一実施形態において、ＥＯＰ引下げは、少なくとも８対数の引下げである。
【0183】
本発明のポリヌクレオチドを含む乳酸菌
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む乳酸菌に関する。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む乳酸菌に関する。
【0184】
更なる態様において、本発明は、本発明の使用又は方法によって得た乳酸菌に関する。
【0185】
さらに他の態様において、本発明は、本発明の方法によって生産される、本発明に従う乳酸菌を提供する。
【0186】
セクション「乳酸菌」の下で先に与えた定義は、ここでも同様に当てはまる。
【0187】
一実施形態において、乳酸菌は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のものである。一実施形態において、乳酸菌は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種又はストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）種のものである。一実施形態において、乳酸菌は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種のものである。
【0188】
一実施形態において、本発明の乳酸菌は、本発明のポリヌクレオチドを含むように操作されていてもよい。本発明のＬＡＢが、ｍｅｔＡＰ遺伝子のいくつかの対立遺伝子を含むことは意図されない。一実施形態において、本発明の乳酸菌は、ｍｅｔＡＰ遺伝子の唯一の対立遺伝子として、本発明のポリヌクレオチドを含む。そのような乳酸菌は、ｍｅｔＡＰ遺伝子の元の対立遺伝子を、本発明のポリヌクレオチドによって置換することによって操作されていてもよい；置換は、本明細書中で定義される従来の技術を用いて行うことができる。一実施形態において、本発明の乳酸菌は、本明細書中に記載される乳酸菌の株を調製する方法によって操作されている。
【0189】
細菌組成物
また、本発明は、少なくとも１つ、好ましくは１つの、本発明の乳酸菌株を含むか、又はこれからなる細菌組成物に関する。特定の実施形態において、乳酸菌は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。一実施形態において、細菌組成物は、純粋な培養体である、すなわち、本発明の単一の乳酸菌株を含むか、又はこれからなる。別の実施形態において、細菌組成物は、混合培養体である、すなわち、本発明の乳酸菌株及び少なくとも１つの他の細菌株を含むか、又はこれらからなる。一実施形態において、細菌組成物は、純粋な培養体である、すなわち、本発明の単一のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株を含むか、又はこれらからなる。別の実施形態において、細菌組成物は、混合培養体である、すなわち、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株及び少なくとも１つの他の細菌株を含むか、又はこれらからなる。「少なくとも」１つの他の細菌株とは、１つ又はそれ以上、特に１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの株を意味する。
また、本発明は、少なくとも１つ、好ましくは１つの、本発明の乳酸菌株を含むか、又はこれからなる細菌組成物に関する。特定の実施形態において、乳酸菌は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。一実施形態において、細菌組成物は、純粋な培養体である、すなわち、本発明の単一の乳酸菌株を含むか、又はこれからなる。別の実施形態において、細菌組成物は、混合培養体である、すなわち、本発明の乳酸菌株及び少なくとも１つの他の細菌株を含むか、又はこれらからなる。一実施形態において、細菌組成物は、純粋な培養体である、すなわち、本発明の単一のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株を含むか、又はこれらからなる。別の実施形態において、細菌組成物は、混合培養体である、すなわち、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株及び少なくとも１つの他の細菌株を含むか、又はこれらからなる。「少なくとも」１つの他の細菌株とは、１つ又はそれ以上、特に１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの株を意味する。
【0190】
ゆえに、一実施形態において、本発明の細菌組成物は、本発明の乳酸菌株、例えばストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株、並びにラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられるラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属種、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、及びオエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種、又はそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される種の１つ又は複数の更なる乳酸菌を含むか、又はこれらからなる。ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種として、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシズ・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシズ・ラクティス・バイオバリアント・ダイアセチラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｂｉｏｖａｒ ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）を含むラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種として、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、特にビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｕｂｓｐ ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。他の乳酸菌種として、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属種、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ・サブスピーシズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、及びラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）が挙げられる。
【0191】
一実施形態において、細菌組成物は、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株、及び本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株とは異なる少なくとも１つのストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株、及び／又はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種の少なくとも１つの株、及び／又はそれらのあらゆる組合せを含むか、又はこれらからなる。特定の実施形態において、細菌組成物は、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株、ラクトバチルス・デルブリュッキイ・サブスピーシズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）種の１つ若しくはいくつかの株、及び／又はラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）種の１つ若しくはいくつかの株、及び／又はそれらのあらゆる組合せ、並びに、場合によっては、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株とは異なる少なくとも１つのストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株を含むか、又はこれらからなる。特定の実施形態において、細菌組成物は、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株とは異なるストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の少なくとも１つの株、及びラクトバチルス・デルブリュッキイ・サブスピーシズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）種の株を含むか、又はこれらからなる。別の特定の実施形態において、細菌組成物は、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株、及びラクトバチルス・デルブリュッキイ・サブスピーシズ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）種の株を含むか、又はこれらからなる。
【0192】
一実施形態において、細菌組成物は、本発明の乳酸菌株、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシズ・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、及び／又はラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）を含むか、又はこれらからなる。一実施形態において、細菌組成物は、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシズ・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、及び／又はラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）を含むか、又はこれらからなる。
【0193】
本明細書中で定義されるあらゆる細菌組成物の特定の実施形態において、純粋培養体又は混合培養体のいずれかとして、細菌組成物はさらに、少なくとも１つのプロバイオティック株、例えばビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、又はラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）を含む。
【0194】
特定の実施形態において、細菌組成物は、先で定義される純粋培養体又は混合培養体のいずれかとして、凍結したか、乾燥したか、凍結乾燥したか、液体か、若しくは固体のフォーマット、ペレット若しくは凍結ペレットの形態、又は粉末若しくは乾燥粉末である。特定の実施形態において、本発明の細菌組成物は、特に１つ又は複数のボックス又はサシェ中に含有される、凍結フォーマット、又はペレット若しくは凍結ペレットの形態である。別の実施形態において、本明細書中で定義される細菌組成物は、特に１つ又は複数のボックス又はサシェ中に含有される、粉末形態、例えば乾燥粉末又は凍結乾燥粉末である。
【0195】
特定の実施形態において、本発明の細菌組成物は、先で定義される純粋培養体又は混合培養体のいずれかとして、そしてフォーマット（凍結したか、乾燥したか、凍結乾燥したか、液体か、若しくは固体のフォーマット、ペレット若しくは凍結ペレットの形態、又は粉末若しくは乾燥粉末）が何であれ、本発明の乳酸菌株を、細菌組成物の１グラムあたり１０５～１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）（ｃｆｕ／ｇ）の範囲内に含まれる濃度で含む。特定の実施形態において、本発明の細菌組成物内の乳酸菌株の濃度は、細菌組成物の１グラムあたり１０７～１０１２ｃｆｕの範囲内、特に少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、又は少なくとも１０１１ｃｆｕ／細菌組成物ｇである。特定の実施形態において、凍結濃縮物又は乾燥濃縮物の形態である場合、細菌組成物内の（純粋培養体として、又は混合培養体としての）本発明の乳酸菌株の濃度は、１０８～１０１２ｃｆｕ／凍結濃縮物又は乾燥濃縮物ｇの範囲内、より好ましくは少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、又は少なくとも１０１２ｃｆｕ／凍結濃縮物又は乾燥濃縮物ｇである。
【0196】
特定の実施形態において、本発明の細菌組成物は、先で定義される純粋培養体又は混合培養体のいずれかとして、そしてフォーマット（凍結したか、乾燥したか、凍結乾燥したか、液体か、若しくは固体のフォーマット、ペレット若しくは凍結ペレットの形態、又は粉末若しくは乾燥粉末）が何であれ、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株を、細菌組成物の１グラムあたり１０５～１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）の範囲内に含まれる濃度で含む。特定の実施形態において、本発明の細菌組成物内のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株の濃度は、細菌組成物の１グラムあたり１０７～１０１２ｃｆｕの範囲内、特に少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、又は少なくとも１０１１ｃｆｕ／細菌組成物ｇである。特定の実施形態において、凍結濃縮物又は乾燥濃縮物の形態である場合、細菌組成物内の（純粋培養体として、又は混合培養体としての）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株の濃度は、１０８～１０１２ｃｆｕ／凍結濃縮物又は乾燥濃縮物ｇの範囲内、より好ましくは少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、又は少なくとも１０１２ｃｆｕ／凍結濃縮物又は乾燥濃縮物ｇである。
【0197】
一実施形態において、株の数及び性質、株の組成物のフォーマット及び濃度が何であれ、細菌組成物はさらに、食品が許容可能な構成要素を含む。
【0198】
更なる態様において、発酵製品を製造する方法であって、ａ）基質に、本発明に従う乳酸菌又は細菌組成物を接種することと、ｂ）接種された基質を発酵させて、発酵製品を得ることとを含む方法が提供される。特定の実施形態において、本発明の乳酸菌株は、本明細書中で定義される細菌組成物、例えば純粋培養体又は混合培養体として接種される。好ましくは、基質は、乳基質、より好ましくは乳である。「乳基質」とは、動物起源及び／又は植物起源の乳を意味する。特定の実施形態において、乳基質は、動物起源のもの、特にあらゆる哺乳動物、例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、バッファロー、シマウマ、ウマ、ロバ、又はラクダのものである。乳は、天然の状態、還元乳、脱脂乳、又は細菌の増殖に、若しくは発酵乳の以降のプロセシングに必須の化合物が補充された乳であってもよい。好ましくは、乳基質は、固体の品目を含む。好ましくは、固体の品目は、果物、チョコレート製品、又は禾穀類を含むか、又はそれからなる。好ましくは、発酵製品は、発酵乳製品である。したがって、特定の実施形態において、本発明はまた、発酵乳製品を製造する方法であって、ａ）乳基質に本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株又は細菌組成物を接種することと、ｂ）前記接種された乳基質を発酵させて、発酵乳製品を得ることとを含む方法を提供する。
【0199】
また、本発明は、更なる態様において、食品又は飼料製品、好ましくは発酵乳製品を製造するための、本発明に従う乳酸菌又は細菌組成物の使用を提供する。
【0200】
また、本発明は、本発明の乳酸菌株又は細菌組成物を用いて得られる、特に本発明の方法によって得られるか、又は獲得可能である発酵乳製品に関する。ゆえに、本発明は、本発明の乳酸菌株を含む発酵乳製品に関する。好ましくは、発酵乳製品は、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株を含む。特定の実施形態において、本発明の発酵乳食品は、フレッシュな発酵乳である。
【0201】
製品
本発明の乳酸菌又は細菌組成物から調製されるか、これを含有するか、又はこれを含むあらゆる製品が、本発明に従って意図される。
本発明の乳酸菌又は細菌組成物から調製されるか、これを含有するか、又はこれを含むあらゆる製品が、本発明に従って意図される。
【0202】
適切な製品として、以下に限定されないが、食品又は飼料製品が挙げられる。
【0203】
これらとして、以下に限定されないが、果物、豆類、飼料作物、及び野菜が挙げられ、派生製品、穀物及び穀物由来製品、乳食品及び乳食品由来製品、肉、鳥肉、並びに海産食品が挙げられる。好ましくは、食品又は飼料製品は、乳製品、肉製品、又は禾穀類製品である。
【0204】
用語「食品」は、広義に用いられ、飼料、食材、食物成分、食物補助食品、及び機能性食品が挙げられる。本明細書では、用語「食品」は、広義に用いられ、ヒト用の食品及び動物用の食品（すなわち飼料）を包含する。好ましい態様において、食品は、ヒト食用である。
【0205】
本明細書中で用いられる用語「食物成分」は、製剤を含み、これは、食品に加えられるか、又は加えることができ、例えば酸性化又は乳化を必要とする、多種多様な製品に低いレベルにて用いることができる製剤が挙げられる。
【0206】
本明細書中で用いられる用語「機能性食品」は、栄養学的効果及び／又は味覚の満足感を提供することができるだけでなく、消費者に更なる有益な効果を届けることもできる食品を意味する。機能性食品の法的な定義は存在しないが、この分野において関心があるほとんどの団体は、特定の健康効果を有するものとして市販されている食品が存在することに同意している。
【0207】
本発明の乳酸菌は、食物成分、食物補助食品、又は機能性食品であってもよいし、これらに加えられてもよい。
【0208】
食品は、用途及び／又は使用モード及び／又は投与モードに応じて、溶液の形態であっても固体としてあってもよい。
【0209】
本発明の乳酸菌は、食品、例えば菓子類製品、乳製品、肉製品、鳥肉製品、魚製品、又はベーカリー製品の調製に用いることができる。
【0210】
一例として、細菌は、ソフトドリンク、フルーツジュース、又はホエータンパク質を含む飲料、茶、ココア飲料、乳飲料、及び乳酸菌飲料、ヨーグルト、飲用ヨーグルト、及びワインを調製する成分として用いることができる。
【0211】
好ましくは、本明細書中で記載される食品は、乳製品である。より好ましくは、本明細書中で記載される乳製品は、以下の１つ又は複数である：ヨーグルト、チーズ（例えば、酸凝乳チーズ、ハードチーズ、セミハードチーズ、カテージチーズ）、バターミルク、クワルク、サワークリーム、ケフィア、発酵ホエーベースの飲料、クミス、乳飲料、ヨーグルト飲料、発酵乳、マチュアクリーム、チーズ、フロマージュフレ、乳、乳製品リテンテート、プロセスチーズ、クリーム状のデザート、又は乳児用ミルク。
【0212】
好ましくは、本明細書中に記載される食品は、発酵食品である。より好ましくは、本明細書中に記載される食品は、発酵乳製品、例えば、発酵乳、ヨーグルト、クリーム、マチュアクリーム、チーズ、フロマージュフレ、乳飲料、プロセスチーズ、クリーム状のデザート、カテージチーズ、ヨーグルト飲料、乳製品リテンテート、又は乳児用ミルクである。
【0213】
好ましくは、本発明に従う乳製品は、動物起源及び／又は植物起源の乳を含む。
【0214】
乳は、動物起源のもの、特にあらゆる哺乳動物、例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、バッファロー、シマウマ、ウマ、ロバ、又はラクダ等のものを意味することが理解される。また、用語乳は、植物性ミルクと一般的に呼ばれているもの、すなわち、処理された植物材料、又はそうでなければ、例えば、マメ科植物（ダイズ、ヒヨコマメ、レンズマメ等）又は油糧種子（ナタネ、ダイズ、ゴマ、ワタ等）の抽出液に用いられ、当該抽出液は、溶液中に、又はコロイド懸濁液中にタンパク質を含有し、当該タンパク質は、化学作用によって、酸発酵によって、且つ／又は熱によって凝固可能である。最後に、文言乳はまた、動物性ミルクの、そして植物性ミルクの混合液を表す。
【0215】
一実施形態において、用語「乳」は、１０分±１分間の９０℃±０．２℃での加熱によって低温殺菌した３％（ｗ／ｗ）の半脱脂粉乳を補充した市販のＵＨＴ乳を意味する。
【0216】
本発明のＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列内のアミノ酸等価物
一実施形態において、本発明のＭｅｔＡＰＲタンパク質は、位置５７のリシン又はその等価のアミノ酸、位置１５３のプロリン又はその等価のアミノ酸、位置１６８のグルタミン酸又はその等価のアミノ酸、位置２０６のグルタミン又はその等価のアミノ酸、位置２２８のアスパラギン酸又はその等価のアミノ酸、位置２３３のグルタミン又はその等価のアミノ酸、及び位置２３３のロイシン又はその等価のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸を含むことによって特徴付けられる。
一実施形態において、本発明のＭｅｔＡＰＲタンパク質は、位置５７のリシン又はその等価のアミノ酸、位置１５３のプロリン又はその等価のアミノ酸、位置１６８のグルタミン酸又はその等価のアミノ酸、位置２０６のグルタミン又はその等価のアミノ酸、位置２２８のアスパラギン酸又はその等価のアミノ酸、位置２３３のグルタミン又はその等価のアミノ酸、及び位置２３３のロイシン又はその等価のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸を含むことによって特徴付けられる。
【0217】
「その等価のアミノ酸」とは、ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードするｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子が、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子の代わりに挿入されている場合に、（本明細書中で定義される）ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げる限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質の類似性を有するあらゆるアミノ酸を意味し、ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる。
【0218】
一実施形態において、リシンに等価のアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びアルギニンからなる群から選択される。
【0219】
一実施形態において、プロリンに等価のアミノ酸は、アラニン及びグリシンからなる群から選択される。
【0220】
一実施形態において、グルタミン酸に等価のアミノ酸は、アスパラギン酸及びリシンからなる群から選択される。
【0221】
一実施形態において、グルタミンに等価のアミノ酸は、アスパラギン及びセリンからなる群から選択される。
【0222】
一実施形態において、アスパラギン酸に等価のアミノ酸は、グルタミン酸及びリシンからなる群から選択される。
【0223】
一実施形態において、ロイシンに等価のアミノ酸は、メチオニン、バリン、イソロイシン、及びフェニルアラニンからなる群から選択される。
【0224】
ＭｅｔＡＰタンパク質の同一性のパーセンテージ
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰタンパク質をコードし、且つ２）ＥＯＰを引き下げないか、又はＥＯＰを３対数未満引き下げる（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子（ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードする）と本明細書中で定義される。配列番号２に対する少なくとも８０％の同一性のパーセンテージは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％からなる群から選択される同一性のパーセンテージを意味する。一実施形態において、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の配列は、配列番号２と異なるが、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質のサイズは、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質（２８６アミノ酸残基）と同じである。
１）配列が配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰタンパク質をコードし、且つ２）ＥＯＰを引き下げないか、又はＥＯＰを３対数未満引き下げる（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、ｍｅｔＡＰ変異型対立遺伝子（ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質をコードする）と本明細書中で定義される。配列番号２に対する少なくとも８０％の同一性のパーセンテージは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％からなる群から選択される同一性のパーセンテージを意味する。一実施形態において、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質の配列は、配列番号２と異なるが、ＭｅｔＡＰ変異型タンパク質のサイズは、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質（２８６アミノ酸残基）と同じである。
【0225】
１）配列が、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するＭｅｔＡＰタンパク質をコードし、且つ２）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１誘導株の、ファージＤＴ１に対する感受性を少なくとも４対数引き下げる［前記ＳＭＱ－３０１誘導株は、ｍｅｔＡＰ対立遺伝子によってｍｅｔＡＰ対立遺伝子が置換されているストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１株である］（ファージＤＴ１に対する感受性は、プラーク形成効率（ＥＯＰ）アッセイＩによって求められる）ｍｅｔＡＰ対立遺伝子は、ｍｅｔＡＰＲ対立遺伝子（ＭｅｔＡＰＲタンパク質をコードする）と本明細書中で定義される。配列番号２に対する少なくとも８０％の同一性のパーセンテージは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％からなる群から選択される同一性のパーセンテージを意味する。一実施形態において、ＭｅｔＡＰＲタンパク質の配列は、配列番号２と異なるが、ＭｅｔＡＰＲタンパク質のサイズは、配列番号２に定義されるＭｅｔＡＰタンパク質（２８６アミノ酸残基）と同じである。
【0226】
配列の比較は、目視によって、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを使用して行うことができる。これらの市販の、又は自由に利用できるコンピュータプログラムは、２つ又はそれ以上の配列間の類似性値又は同一性値を算出することができる。
【0227】
相同性のパーセンテージは、アラインした連続配列にわたって算出することができ、すなわち、一方の配列を別の配列に対してアラインして、一方の配列内の各アミノ酸を、他方の配列内の対応するアミノ酸と、１回に１残基、直接比較する。これは「ギャップなし」アライメントと呼ばれる。典型的には、そのようなギャップなしアライメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実行される。
【0228】
これは非常に簡易で一貫した方法であるが、例えば、配列の普通であれば同一のペアにおいて、ある挿入又は欠失が、後続のアミノ酸残基をアライメントから外すこととなることを考慮できないので、グローバルアライメントを実施する場合に同一性を大きく低下させる可能性がある。結果的に、ほとんどの配列比較法は、同一性スコア全体を不当にペナルティ化することなく、考えられる挿入及び欠失を考慮する最適なアライメントをもたらすように設計されている。これは、配列アライメント中に「ギャップ」を挿入して、局所同一性の最大化を試みることによって達成される。これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸について、ギャップが可能な限り少ない配列アライメント（２つの比較配列間のより高い関係性を反映する）が、ギャップが多いものよりも高いスコアを達成するように、アライメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。典型的には、あるギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、そして当該ギャップ中の後続の各残基に対してより小さいペナルティを課す「アファインギャップコスト」が使用される（ギャップエクステンションペナルティ）。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、勿論、ギャップがより少ない最適化されたアライメントを生成することとなる。ほとんどのアライメントプログラムは、ギャップペナルティが変更されることを許容する。しかしながら、配列比較にそのようなソフトウエアを用いる場合、デフォルト値を用いることが可能である。なぜなら、当該デフォルト値は、ほとんどの場合、妥当な結果をもたらすように調整されてきたからである。したがって、同一性の最大パーセンテージの算出には、最初に、ギャップペナルティを考慮して、最適なアライメントを作成することが要求される。そのようなアライメントを実施するのに適したコンピュータプログラムは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）である。配列比較を実施することができるソフトウエアの例として、以下に限定されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ－Ｃｈａｐｔｅｒ １８）が挙げられる。
【0229】
アライメント品質を同一性に関して測定することができるが、アライメントプロセスそれ自体は典型的に、オールオアナッシングのペア比較に基づかない。代わりに、化学的類似性又は進化的距離に基づいて、各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる数値換算類似性（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）スコアマトリックスが一般に使用される。一般に使用されるそのようなマトリックスの一例が、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡＳＴプログラムスイートのためのデフォルトマトリックス）である。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値、又は供給されていればカスタム比較表を使用する（更なる詳細については、ユーザマニュアルを参照）。これ以外にも、類似性のパーセンテージは、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ＆Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７－２４４）と類似するアルゴリズムに基づくＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）における多重アライメント特徴を使用して算出することができる。
【0230】
ソフトウエアが最適なアライメントを作成すれば、配列類似性のパーセンテージ、好ましくは配列同一性のパーセンテージを算出することが可能である。ソフトウエアは、典型的に、これを配列比較の一部として実行して、数的結果を生成する。
【0231】
一実施形態において、タンパク質（アミノ酸）配列に関する同一性の程度は、少なくとも５０個の連続アミノ酸にわたって、少なくとも１００個の連続アミノ酸にわたって、少なくとも１５０個の連続アミノ酸にわたって、少なくとも２００個の連続アミノ酸にわたって、又は少なくとも２５０個の連続アミノ酸にわたって求められる。
【0232】
一実施形態において、アミノ酸又はタンパク質配列に関する同一性の程度は、配列番号２の全配列にわたって求めることができる。
【0233】
一実施形態において、配列［ＭｅｔＡＰＲ変異型タンパク質の候補配列及び配列番号２］は、グローバルアライメントプログラムによってアラインされ、そして配列同一性は、候補配列の長さで割った、プログラムによって識別される正確なマッチ数を識別することによって算出される。
【0234】
一実施形態において、ＭｅｔＡＰＲ変異型タンパク質の候補配列と配列番号２との配列同一性の程度を：１）２つの配列を、任意の適切なアライメントプログラムによって、デフォルトのスコアリングマトリックス及びデフォルトのギャップペナルティを使用してアラインすることと、２）正確なマッチ数を同定することと（ここで、正確なマッチとは、アライメントプログラムがアライメントにおいて所定の位置上にある２つのアラインされた配列内の同一アミノ酸を同定した場合である）、３）正確なマッチ数を、候補配列の長さで割ることとによって求める。
【0235】
一実施形態において、グローバルアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いるＣＬＵＳＴＡＬ及びＢＬＡＳＴ、特にＣＬＵＳＴＡＬからなる群から選択され、配列同一性は、対象配列の長さで割った、プログラムによって識別される正確なマッチ数を識別することによって算出される。
【0236】
一実施形態において、グローバルアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いたＣＬＵＳＴＡＬであり、そして配列同一性は、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）で求められる［「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」ドロップダウンメニューを選択し、続いて「Ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」サブメニューを選択してから、「Ｃａｌｃｕｌａｔｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ／ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｆｏｒ ｔｗｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」メニュー項目を選択する］。
【0237】
一般的な組換えＤＮＡ方法論の技術
本発明は、特に示されない限り、当業者の能力の範囲内である生化学、分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡの従来技術を使用する。そのような技術は、文献に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ，１６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ，Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ，Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；及びＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照。これらのテキスト全般はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、特に示されない限り、当業者の能力の範囲内である生化学、分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡの従来技術を使用する。そのような技術は、文献に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ，１６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ，Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ，Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；及びＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照。これらのテキスト全般はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0238】
次に、本発明を実施例によってさらに説明する。実施例は、本発明を実施する際に当業者を補助するのに役立つはずであり、いかなる形であれ、本発明の範囲を制限することは意図されない。
【実施例】
【0239】
材料及び方法
細胞増殖及びファージ増殖
細菌株、ファージ、及びプラスミドを、表１に記載する。Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を、３７℃又は４２℃にて、０．５％ラクトース（ＬＭ１７）を補充したＭ１７培地（Ｏｘｏｉｄ，Ｎｅｐｅａｎ）中で増殖させた。必要であれば、ｐＮＺ１２３（Ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．１９８７）及び誘導体を含有するＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株の増殖及び選択用に、クロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ）を５μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えた。固形培地用に、アガー（ＬａｂＭａｔ，Ｑｕｅｂｅｃ）を１％の最終濃度まで加えた。３０μｇ／ｍＬカナマイシン及び２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを選択用に補充したルリアブロス（ＬＢ）中で、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を３７℃にて撹拌しながら増殖させた。ｐＮＺ１２３＋細胞を選択する場合には１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充した、Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ，Ｄｉｆｃｏ）中で、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＨＥＲ１５０３を３７℃、５％ＣＯ２にて増殖させた。以前に記載されるように（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ファージを増殖させた。
細胞増殖及びファージ増殖
細菌株、ファージ、及びプラスミドを、表１に記載する。Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を、３７℃又は４２℃にて、０．５％ラクトース（ＬＭ１７）を補充したＭ１７培地（Ｏｘｏｉｄ，Ｎｅｐｅａｎ）中で増殖させた。必要であれば、ｐＮＺ１２３（Ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．１９８７）及び誘導体を含有するＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株の増殖及び選択用に、クロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ）を５μｇ／ｍＬの最終濃度まで加えた。固形培地用に、アガー（ＬａｂＭａｔ，Ｑｕｅｂｅｃ）を１％の最終濃度まで加えた。３０μｇ／ｍＬカナマイシン及び２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを選択用に補充したルリアブロス（ＬＢ）中で、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を３７℃にて撹拌しながら増殖させた。ｐＮＺ１２３＋細胞を選択する場合には１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充した、Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ，Ｄｉｆｃｏ）中で、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＨＥＲ１５０３を３７℃、５％ＣＯ２にて増殖させた。以前に記載されるように（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ファージを増殖させた。
【0240】
バクテリオファージ非感受性ミュータント単離
バクテリオファージ非感受性ミュータント（ＢＩＭ）を、以前に記載されるように（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ソフトアガーオーバレイアッセイを用いて単離した。手短に言うと、野生型宿主Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１を、ファージＤＴ１でチャレンジした。細菌宿主を、ＬＭ１７中で４２℃にて、６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．６に達するまで増殖させた。続いて、３００μＬの培養体を、塩化カルシウム（１０ｍＭ）を補充した３ｍＬの溶融ＬＭ１７ソフトアガーに加えて、ファージＤＴ１を、０．１の感染多重度（ＭＯＩ）を達成するように加えた。プレートを、４２℃にて１６時間インキュベートした。結果として生じたコロニーを、ＬＭ１７＋１％アガー上にストリーキングして、ＣＲ１遺伝子座及びＣＲ３遺伝子座におけるスペーサー獲得の有無に関して、ＣＲ１遺伝子座についてプライマーＣＲ１－ｆｗｄ及びＣＲ１－ｒｅｖＬｏｎｇを、そしてＣＲ３遺伝子座についてプライマーＣＲ３－ｆｗｄ及びＣＲ３－ｒｅｖを用いてスクリーニングした（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。スペーサー獲得がＣＲＩＳＰＲアレイ内で検出されなかった場合、ＢＩＭをゲノム配列決定用に保存した。
バクテリオファージ非感受性ミュータント（ＢＩＭ）を、以前に記載されるように（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ソフトアガーオーバレイアッセイを用いて単離した。手短に言うと、野生型宿主Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１を、ファージＤＴ１でチャレンジした。細菌宿主を、ＬＭ１７中で４２℃にて、６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．６に達するまで増殖させた。続いて、３００μＬの培養体を、塩化カルシウム（１０ｍＭ）を補充した３ｍＬの溶融ＬＭ１７ソフトアガーに加えて、ファージＤＴ１を、０．１の感染多重度（ＭＯＩ）を達成するように加えた。プレートを、４２℃にて１６時間インキュベートした。結果として生じたコロニーを、ＬＭ１７＋１％アガー上にストリーキングして、ＣＲ１遺伝子座及びＣＲ３遺伝子座におけるスペーサー獲得の有無に関して、ＣＲ１遺伝子座についてプライマーＣＲ１－ｆｗｄ及びＣＲ１－ｒｅｖＬｏｎｇを、そしてＣＲ３遺伝子座についてプライマーＣＲ３－ｆｗｄ及びＣＲ３－ｒｅｖを用いてスクリーニングした（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。スペーサー獲得がＣＲＩＳＰＲアレイ内で検出されなかった場合、ＢＩＭをゲノム配列決定用に保存した。
【0241】
【表1】
【0242】
ＤＮＡ単離、配列決定、及びバイオインフォマティクス分析
以前に記載されるように（Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ＢＩＭのゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを用いて配列決定した。ライブラリを、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡサンプル調製キットにより、メーカーの説明書に従って調製して、ＭｉＳｅｑ試薬（２×２５０ｎｔ対形成末端）を用いて配列決定した。平均カバー率は、６．８～８０．１倍に及んだ。９つのＢＩＭのゲノムについて得たリードを、デフォルト設定のＮｏｖｏａｌｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍ）を用いて、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１ゲノム（Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）に対してアラインした。突然変異を、ＳＡＭＴｏｏｌｓ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）を用いてアライメントファイルから抽出した。自社のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて、細菌ゲノム内の突然変異をマッピングして、タンパク質配列に翻訳した。ＳＡＭＴｏｏｌｓによって提供されるスコアが最も高い突然変異を、第１であるとみなした。
以前に記載されるように（Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ＢＩＭのゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを用いて配列決定した。ライブラリを、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡサンプル調製キットにより、メーカーの説明書に従って調製して、ＭｉＳｅｑ試薬（２×２５０ｎｔ対形成末端）を用いて配列決定した。平均カバー率は、６．８～８０．１倍に及んだ。９つのＢＩＭのゲノムについて得たリードを、デフォルト設定のＮｏｖｏａｌｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍ）を用いて、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１ゲノム（Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）に対してアラインした。突然変異を、ＳＡＭＴｏｏｌｓ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）を用いてアライメントファイルから抽出した。自社のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて、細菌ゲノム内の突然変異をマッピングして、タンパク質配列に翻訳した。ＳＡＭＴｏｏｌｓによって提供されるスコアが最も高い突然変異を、第１であるとみなした。
【0243】
相補性アッセイ
Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ株を、配列番号１に示されるｍｅｔＡＰ対立遺伝子（ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ対立遺伝子）で補完した。第１に、配列番号１に示されるｍｅｔＡＰ対立遺伝子を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いてｐＮＺ１２３中にクローニングした。ベクターｐＮＺ１２３を、ＸｂａＩ（Ｒｏｃｈｅ）により、メーカーの説明書に従って線状化した。挿入物を、Ｑ５高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）により、プライマーＳＪＬ１５４及びＳＪＬ１５５で増幅させた。双方のプライマーは、線状化ベクターの３’末端及び５’末端をそれぞれ補完する３０ｎｔの拡張を有した。３：１の挿入／ベクター比をアセンブリに用いた。以前に記載されるように（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ用のマスター混合物を調製した。結果として生じた構築体を、メーカーの説明書に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＥＢ５α中に形質転換して、クローンを、１％アガー及び２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地上で選択した。１クローンを、ＣＨＵＬ ＣｅｎｔｅｒのＰｌａｔｅｆｏｒｍｅ ｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃａｇｅ ｅｔ ｄｅ Ｇｅｎｏｔｙｐａｇｅ ｄｅｓ Ｇｅｎｏｍｅｓでのサンガーシーケンシング（ＡＢＩ ３７３０ｘｌ）によって確認した。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出して、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中に形質転換した（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。１％アガー及び５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＬＭ１７上に形質転換混合物を広げることによって、クローンを選択した。
Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ株を、配列番号１に示されるｍｅｔＡＰ対立遺伝子（ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ対立遺伝子）で補完した。第１に、配列番号１に示されるｍｅｔＡＰ対立遺伝子を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いてｐＮＺ１２３中にクローニングした。ベクターｐＮＺ１２３を、ＸｂａＩ（Ｒｏｃｈｅ）により、メーカーの説明書に従って線状化した。挿入物を、Ｑ５高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）により、プライマーＳＪＬ１５４及びＳＪＬ１５５で増幅させた。双方のプライマーは、線状化ベクターの３’末端及び５’末端をそれぞれ補完する３０ｎｔの拡張を有した。３：１の挿入／ベクター比をアセンブリに用いた。以前に記載されるように（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ用のマスター混合物を調製した。結果として生じた構築体を、メーカーの説明書に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＥＢ５α中に形質転換して、クローンを、１％アガー及び２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地上で選択した。１クローンを、ＣＨＵＬ ＣｅｎｔｅｒのＰｌａｔｅｆｏｒｍｅ ｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃａｇｅ ｅｔ ｄｅ Ｇｅｎｏｔｙｐａｇｅ ｄｅｓ Ｇｅｎｏｍｅｓでのサンガーシーケンシング（ＡＢＩ ３７３０ｘｌ）によって確認した。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出して、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中に形質転換した（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。１％アガー及び５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＬＭ１７上に形質転換混合物を広げることによって、クローンを選択した。
【0244】
指向性突然変異誘発及びランダム突然変異誘発
所望の突然変異を有するｍｅｔＡＰ対立遺伝子を、プライマーＳＪＬ１２８及びＳＪＬ１３０（表２）を用いるＰＣＲによって増幅させた。５０μＬの少なくとも１０回のＰＣＲ反応をアッセイ毎に行って、自然形質転換に十分なＤＮＡを得た。全ての反応液をプールして、１．５ｍＬの９５％エタノール及び７５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えることによって析出させた。チューブを、２５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離した。ＤＮＡペレットを、１ｍＬの７０％エタノールで２回洗浄して、室温にて１０分間乾燥させて、微量のエタノールを除去した。最後に、ペレットを１５０μＬの水中に溶解させた。直鎖状ＤＮＡフラグメントを、自然形質転換（Ｇａｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）によってＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中に導入した。手短に言うと、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を、１ｍＬのＬＭ１７中で３７℃にて一晩増殖させた。培養体を１７，０００×ｇにて１分間遠心分離して、細菌細胞を合成培地（ＣＤＭ）で２回洗浄して、１ｍＬのＣＤＭ中に回収した。最終培養体を３０倍希釈して０．０５のＯＤ６００ｎｍを得て、３７℃にて７５分インキュベートしてから－２０℃にて保存した。形質転換用に、１μＭのペプチドＣｏｍＳ及び１μｇの直鎖状ＤＮＡを、３００μＬの自然コンピテント細胞に加えた。混合液を、３７℃にて３時間インキュベートした。細胞を段階希釈して、非選択ＬＭ１７アガー上に広げて、単離したコロニーを得た。所望の突然変異を有するクローンを検出するように具体的に設計したＰＣＲアプローチを用いて、コロニーをスクリーニングした。このプロトコルに用いたプライマーの１つは、その３’末端に所望の突然変異を含んだ。ゆえに、スクリーニングしたクローン中に突然変異が存在すれば、ＰＣＲ増幅は陽性のみであった。形質転換体をスクリーニングするのに用いたプライマーＳＪＬ１５４及びＳＪＬ１５５の配列を、表２に記載する。ランダム突然変異誘発のために、指向性突然変異誘発と同じプロトコルを用いたが、唯一の例外は、ＭｎＳＯ４を加えた（最終１０μＭ）こと、そしてファージＤＴ１を耐性クローンの選択に用いたことである。
所望の突然変異を有するｍｅｔＡＰ対立遺伝子を、プライマーＳＪＬ１２８及びＳＪＬ１３０（表２）を用いるＰＣＲによって増幅させた。５０μＬの少なくとも１０回のＰＣＲ反応をアッセイ毎に行って、自然形質転換に十分なＤＮＡを得た。全ての反応液をプールして、１．５ｍＬの９５％エタノール及び７５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えることによって析出させた。チューブを、２５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離した。ＤＮＡペレットを、１ｍＬの７０％エタノールで２回洗浄して、室温にて１０分間乾燥させて、微量のエタノールを除去した。最後に、ペレットを１５０μＬの水中に溶解させた。直鎖状ＤＮＡフラグメントを、自然形質転換（Ｇａｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）によってＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中に導入した。手短に言うと、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を、１ｍＬのＬＭ１７中で３７℃にて一晩増殖させた。培養体を１７，０００×ｇにて１分間遠心分離して、細菌細胞を合成培地（ＣＤＭ）で２回洗浄して、１ｍＬのＣＤＭ中に回収した。最終培養体を３０倍希釈して０．０５のＯＤ６００ｎｍを得て、３７℃にて７５分インキュベートしてから－２０℃にて保存した。形質転換用に、１μＭのペプチドＣｏｍＳ及び１μｇの直鎖状ＤＮＡを、３００μＬの自然コンピテント細胞に加えた。混合液を、３７℃にて３時間インキュベートした。細胞を段階希釈して、非選択ＬＭ１７アガー上に広げて、単離したコロニーを得た。所望の突然変異を有するクローンを検出するように具体的に設計したＰＣＲアプローチを用いて、コロニーをスクリーニングした。このプロトコルに用いたプライマーの１つは、その３’末端に所望の突然変異を含んだ。ゆえに、スクリーニングしたクローン中に突然変異が存在すれば、ＰＣＲ増幅は陽性のみであった。形質転換体をスクリーニングするのに用いたプライマーＳＪＬ１５４及びＳＪＬ１５５の配列を、表２に記載する。ランダム突然変異誘発のために、指向性突然変異誘発と同じプロトコルを用いたが、唯一の例外は、ＭｎＳＯ４を加えた（最終１０μＭ）こと、そしてファージＤＴ１を耐性クローンの選択に用いたことである。
【0245】
【表2】
【0246】
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）における指向性ｍｅｔＡＰ突然変異誘発
ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子を、所望の突然変異（ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ）を含有する２セットのプライマーによりＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＨＥＲ １５０３から増幅させた。２セットのプライマー（ＳＪＬ１６０及びＳＪＬ１６１並びにＳＪＬ１６２及びＳＪＬ１６３）は、２つの重なり合うアンプリコンを生成し、重なり合う領域に突然変異を有する。２つの断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製して、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）によって融合させた。続いて、ＰＣＲを、プライマーＳＪＬ１６０及びＳＪＬ１６３を用いてＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙサンプルに実行して、融合断片を増幅させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いた精製の後に、突然変異したｍｅｔＡＰアンプリコンを、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＨＥＲ １５０３中に、自然形質転換によって形質転換した；Ｂｉｏｍａｔｉｋからオーダーしたコンピテンス刺激ペプチド（ＣＳＰ）を、１μＭの濃度にて５００μｌのＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の指数関数的に増殖した培養体（０．１のＯＤ６００ｎｍ）に、１μｇの精製した突然変異ｍｅｔＡＰアンプリコンと共に加えた（Ｄｕｆｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。培養体を、５％ＣＯ２と３７℃にて一晩インキュベートしてから、０．７％アガーを補充したＢＨＩ中で病原性ファージＭ１０２ＡＤと混合して、１％アガーを補充したＢＨＩ上にプレーティングした。生き残っている誘導体中のｍｅｔＡＰ対立遺伝子を、プライマーＳＪＬ１６０及びＳＪＬ１６３を用いるＰＣＲによって増幅させて配列決定して、突然変異の存在を確認した。
ｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子を、所望の突然変異（ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ）を含有する２セットのプライマーによりＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＨＥＲ １５０３から増幅させた。２セットのプライマー（ＳＪＬ１６０及びＳＪＬ１６１並びにＳＪＬ１６２及びＳＪＬ１６３）は、２つの重なり合うアンプリコンを生成し、重なり合う領域に突然変異を有する。２つの断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製して、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）によって融合させた。続いて、ＰＣＲを、プライマーＳＪＬ１６０及びＳＪＬ１６３を用いてＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙサンプルに実行して、融合断片を増幅させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いた精製の後に、突然変異したｍｅｔＡＰアンプリコンを、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＨＥＲ １５０３中に、自然形質転換によって形質転換した；Ｂｉｏｍａｔｉｋからオーダーしたコンピテンス刺激ペプチド（ＣＳＰ）を、１μＭの濃度にて５００μｌのＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の指数関数的に増殖した培養体（０．１のＯＤ６００ｎｍ）に、１μｇの精製した突然変異ｍｅｔＡＰアンプリコンと共に加えた（Ｄｕｆｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。培養体を、５％ＣＯ２と３７℃にて一晩インキュベートしてから、０．７％アガーを補充したＢＨＩ中で病原性ファージＭ１０２ＡＤと混合して、１％アガーを補充したＢＨＩ上にプレーティングした。生き残っている誘導体中のｍｅｔＡＰ対立遺伝子を、プライマーＳＪＬ１６０及びＳＪＬ１６３を用いるＰＣＲによって増幅させて配列決定して、突然変異の存在を確認した。
【0247】
ＢＩＭ Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＨＥＲ １５０３：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑの相補性について、ＨＥＲ １５０３ Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のｍｅｔＡＰ対立遺伝子をｐＮＺ１２３中にクローニングした。ｐＮＺ１２３をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで線状化して、２つの部位間の２４塩基対を取り除き、そして結果として生じたプラスミドを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ｍｅｔＡＰ対立遺伝子を、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＨＥＲ １５０３から、プライマーＣＭ＿１４５及びＣＭ＿１４６を用いて増幅させて、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位が側面に位置する遺伝子を生成した。ＰＣＲサンプルを、ＱＩＡｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製して、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩによって切断して、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて線状化ｐＮＺ１２３中にライゲートした。ライゲーション中に用いた挿入／ベクターモル比は、３：１であった。ライゲートしたプラスミドを、メーカーの説明書に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＥＢ５α中に形質転換して、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充した固体ＬＢ培地上にプレーティングした。プライマーＣＭ＿１４５及びＣＭ＿１４６によるｍｅｔＡＰ対立遺伝子の増幅、並びに配列決定により、相補性プラスミド中にクローニングされた配列を確認した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いてプラスミドＤＮＡを抽出して、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＨＥＲ １５０３：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ中に形質転換した。株を、ＢＨＩ中で０．１のＯＤ６００ｎｍに達するまで増殖させて、５００μＬのアリコートを１μＭ ＣＳＰに曝して、１μｇの相補性プラスミドで形質転換した。５％ＣＯ２との３７℃にて２．５時間のインキュベーション期間の後に、培養体を、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充したＢＨＩ＋１％アガー上にプレーティングした。
【0248】
突然変異安定性試験
突然変異Ｈ２０６Ｑの安定性を試験するために、１０ｍＬのＭ１７培地（Ｎｕｔｒｉ－Ｂａｃｔ）中に、そして還元乳（１０％脱脂粉乳）中に、株Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１及びＤＧＣＣ７７９６、並びにそれらの各ミュータント［ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ及びＤＧＣＣ７７９６：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ］を接種した（１％）。株を、日中４２℃にてインキュベートした。続いて、１％の接種原を、フレッシュな培地又は乳に移して、夜間３７℃にてインキュベートした。おおよそ６０世代に相当する９回の移行（５日、４晩）の後に、１０コロニーを、４つの株の各々からランダムに選択して、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１及びＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６ＱについてファージＤＴ１（ｃｏｓ）、そしてＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＧＣＣ７７９６及びＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＧＣＣ７７９６：ＭｅｔＡＰＨ２０６ＱについてファージＤ４０９０（ｃｏｓ）及びＤ４２７４（ｐａｃ）に対する感受性を試験した。ｍｅｔＡＰ遺伝子及びＣＲ１の配列決定を、移行及び株の識別の後に、ＳＭＱ－３０１及びＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑコロニーについて、プライマーＳＪＬ１２８／ＳＪＬ１３０及びＣＲ１－ｆｗｄ／ＣＲ１－ｒｅｖにより行って、突然変異の存在を確認した。
突然変異Ｈ２０６Ｑの安定性を試験するために、１０ｍＬのＭ１７培地（Ｎｕｔｒｉ－Ｂａｃｔ）中に、そして還元乳（１０％脱脂粉乳）中に、株Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１及びＤＧＣＣ７７９６、並びにそれらの各ミュータント［ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ及びＤＧＣＣ７７９６：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ］を接種した（１％）。株を、日中４２℃にてインキュベートした。続いて、１％の接種原を、フレッシュな培地又は乳に移して、夜間３７℃にてインキュベートした。おおよそ６０世代に相当する９回の移行（５日、４晩）の後に、１０コロニーを、４つの株の各々からランダムに選択して、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１及びＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６ＱについてファージＤＴ１（ｃｏｓ）、そしてＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＧＣＣ７７９６及びＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＧＣＣ７７９６：ＭｅｔＡＰＨ２０６ＱについてファージＤ４０９０（ｃｏｓ）及びＤ４２７４（ｐａｃ）に対する感受性を試験した。ｍｅｔＡＰ遺伝子及びＣＲ１の配列決定を、移行及び株の識別の後に、ＳＭＱ－３０１及びＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑコロニーについて、プライマーＳＪＬ１２８／ＳＪＬ１３０及びＣＲ１－ｆｗｄ／ＣＲ１－ｒｅｖにより行って、突然変異の存在を確認した。
【0249】
実施例１
メチオニンアミノペプチダーゼをコードする遺伝子中の突然変異が、ファージに対する感受性を引き下げる
ファージＤＴ１に対する感受性が引き下げられているＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１のいくつかのＢＩＭを、表題「バクテリオファージ非感受性ミュータント単離」のセクションにおいて先に記載したプロトコルに従って単離した。９５％超のＢＩＭは、それらのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に、ファージＤＴ１ゲノムを標的化する新しいスペーサーを獲得していた。新しいスペーサーを獲得しなかった９つのＳＭＱ－３０１ ＢＩＭを選択して、ファージＤＴ１に対する感受性の引下げを実現する突然変異を細菌ゲノム中の他の場所に有していると推測した。これらの９つの非ＣＲＩＳＰＲ ＢＩＭのゲノムを配列決定した。これらの配列を、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１（Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）のゲノムと比較することによって、いくつかの突然変異を見出した。これらの突然変異の多くが、ファージ感染に潜在的に関与し得るが、同じ突然変異（Ｔ－＞Ｇ）が、９つのＢＩＭのうち３つのｍｅｔＡＰ遺伝子の位置６１８にて生じていた。この遺伝子は、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ）をコードしており、当該突然変異は、ＭｅｔＡＰタンパク質（Ｈ２０６Ｑ）内の位置２０６にて、ヒスチジンからグルタミンへのアミノ酸置換を誘導する。ＢＬＡＳＴ検索は、このヒスチジンが、分析した全てのＭｅｔＡＰタンパク質配列内に保存されていることを示した。Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＭｅｔＡＰタンパク質は、以前に研究されていないが、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）ＴＩＧＲ４のＭｅｔＡＰタンパク質との８９％の同一性及び９６％の類似性を共有し、これは、構造的なレベル（ＰＤＢ ４ＫＭ３）でも特徴付けられてきた（Ａｒｙａ ｅｔ ａｌ．２０１３）。
メチオニンアミノペプチダーゼをコードする遺伝子中の突然変異が、ファージに対する感受性を引き下げる
ファージＤＴ１に対する感受性が引き下げられているＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１のいくつかのＢＩＭを、表題「バクテリオファージ非感受性ミュータント単離」のセクションにおいて先に記載したプロトコルに従って単離した。９５％超のＢＩＭは、それらのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に、ファージＤＴ１ゲノムを標的化する新しいスペーサーを獲得していた。新しいスペーサーを獲得しなかった９つのＳＭＱ－３０１ ＢＩＭを選択して、ファージＤＴ１に対する感受性の引下げを実現する突然変異を細菌ゲノム中の他の場所に有していると推測した。これらの９つの非ＣＲＩＳＰＲ ＢＩＭのゲノムを配列決定した。これらの配列を、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１（Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）のゲノムと比較することによって、いくつかの突然変異を見出した。これらの突然変異の多くが、ファージ感染に潜在的に関与し得るが、同じ突然変異（Ｔ－＞Ｇ）が、９つのＢＩＭのうち３つのｍｅｔＡＰ遺伝子の位置６１８にて生じていた。この遺伝子は、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ）をコードしており、当該突然変異は、ＭｅｔＡＰタンパク質（Ｈ２０６Ｑ）内の位置２０６にて、ヒスチジンからグルタミンへのアミノ酸置換を誘導する。ＢＬＡＳＴ検索は、このヒスチジンが、分析した全てのＭｅｔＡＰタンパク質配列内に保存されていることを示した。Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＭｅｔＡＰタンパク質は、以前に研究されていないが、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）ＴＩＧＲ４のＭｅｔＡＰタンパク質との８９％の同一性及び９６％の類似性を共有し、これは、構造的なレベル（ＰＤＢ ４ＫＭ３）でも特徴付けられてきた（Ａｒｙａ ｅｔ ａｌ．２０１３）。
【0250】
実施例２
ｍｅｔＡＰ遺伝子中の突然変異が、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）において、ファージに対する感受性を引き下げる
ファージに対する感受性の引下げが、ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ突然変異に起因する（そしてゲノム中の他の突然変異に起因しない）ことを確認するために、ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑタンパク質をコードする対立遺伝子を増幅させて、自然コンピテンスを用いてＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１中に形質転換した。ファージによる選択はかなり有効であるが、ＣＲＩＳＰＲ ＢＩＭを、そして他の、ファージに対する感受性の引下げを付与する突然変異を選択する確率を大幅に増大させる。その代わりに、突然変異を有するＰＣＲ産物をゲノム中に統合した形質転換体を、ファージ選択の不在下で検出するＰＣＲ戦略を設計した。３’末端に所望の突然変異を有するＳＪＬ１５１と組み合わせたプライマーＳＪＬ１５０を用いて、細菌ゲノム内の突然変異を特異的に検出した。細菌細胞質内の形質転換由来の残留直鎖状ＤＮＡの潜在的存在に起因する偽陽性を回避するために、形質転換されたＤＮＡフラグメントのフランキングゲノム領域にマッチするプライマーを設計した。総計２８２クローンを、Ｈ２０６Ｑ ｍｅｔＡＰ対立遺伝子の統合の有無に関してスクリーニングして、所望のＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ突然変異を有する４つの陽性クローンを得た。これらのクローンの１つ、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑをランダムに選択して、そのファージ感受性をＥＯＰアッセイＩによって求めた。プラーク形成は、ファージ溶解液の種々の希釈液による細菌培養体に関して、目に見えなかった。このことは、かなり高いファージ耐性表現型を示している（ＥＯＰ１０－８、表３）。種々の実験条件を用いて、Ｈ２０６Ｑ ＭｅｔＡＰの効果を克服することとなるファージミュータントを単離することを試みたが、無益であった。インキュベーション温度を変え、嫌気性条件を用い、異なる濃度のグリシンを培地に加えて細菌細胞壁を弱め、アガーを、異なる濃度のアガロースで置き換え、そして液体培地中でのレスキュー実験を試みたが、ＢＩＭ ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ上で増殖することができるファージＤＴ１誘導体は得られなかった。
ｍｅｔＡＰ遺伝子中の突然変異が、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）において、ファージに対する感受性を引き下げる
ファージに対する感受性の引下げが、ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ突然変異に起因する（そしてゲノム中の他の突然変異に起因しない）ことを確認するために、ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑタンパク質をコードする対立遺伝子を増幅させて、自然コンピテンスを用いてＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１中に形質転換した。ファージによる選択はかなり有効であるが、ＣＲＩＳＰＲ ＢＩＭを、そして他の、ファージに対する感受性の引下げを付与する突然変異を選択する確率を大幅に増大させる。その代わりに、突然変異を有するＰＣＲ産物をゲノム中に統合した形質転換体を、ファージ選択の不在下で検出するＰＣＲ戦略を設計した。３’末端に所望の突然変異を有するＳＪＬ１５１と組み合わせたプライマーＳＪＬ１５０を用いて、細菌ゲノム内の突然変異を特異的に検出した。細菌細胞質内の形質転換由来の残留直鎖状ＤＮＡの潜在的存在に起因する偽陽性を回避するために、形質転換されたＤＮＡフラグメントのフランキングゲノム領域にマッチするプライマーを設計した。総計２８２クローンを、Ｈ２０６Ｑ ｍｅｔＡＰ対立遺伝子の統合の有無に関してスクリーニングして、所望のＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ突然変異を有する４つの陽性クローンを得た。これらのクローンの１つ、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑをランダムに選択して、そのファージ感受性をＥＯＰアッセイＩによって求めた。プラーク形成は、ファージ溶解液の種々の希釈液による細菌培養体に関して、目に見えなかった。このことは、かなり高いファージ耐性表現型を示している（ＥＯＰ１０－８、表３）。種々の実験条件を用いて、Ｈ２０６Ｑ ＭｅｔＡＰの効果を克服することとなるファージミュータントを単離することを試みたが、無益であった。インキュベーション温度を変え、嫌気性条件を用い、異なる濃度のグリシンを培地に加えて細菌細胞壁を弱め、アガーを、異なる濃度のアガロースで置き換え、そして液体培地中でのレスキュー実験を試みたが、ＢＩＭ ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ上で増殖することができるファージＤＴ１誘導体は得られなかった。
【0251】
【表3】
【0252】
実施例３
ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子との相補性により、ファージ感受性が回復する
ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子を、シャトル発現ベクターｐＮＺ１２３中にクローニングした。結果として生じた構築体を、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ中に形質転換して、突然変異をトランスで補完した。ファージＤＴ１に対する感受性は、プラスミドｐＮＺ１２３：ＭｅｔＡＰで補完した３つのＢＩＭのうち、２つについて回復した（表４）。これにより、ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ置換がファージ表現型を担っていることを確認した。注目すべきは、１つのＢＩＭ（＃３）について、ファージＤＴ１に対する感受性は、完全に回復されなかった（ＥＯＰ＝０．０２）。このことは、他の遺伝子内の突然変異が、ファージＤＴ１耐性におそらく関与していることを示唆している（表４）。また、突然変異ｍｅｔＡＰ遺伝子をｐＮＺ１２３中にクローニングして、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１中に形質転換した。ｐＮＺ１２３：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑを有する株と比較すると、ｐＮＺ１２３を有する株間でＥＯＰの差はなかった。このことは、突然変異が支配的な（ｄｏｍｉｎａｎｔ）表現型をもたらさないことを示唆している。
ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子との相補性により、ファージ感受性が回復する
ＳＭＱ－３０１のｍｅｔＡＰ遺伝子の対立遺伝子を、シャトル発現ベクターｐＮＺ１２３中にクローニングした。結果として生じた構築体を、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ中に形質転換して、突然変異をトランスで補完した。ファージＤＴ１に対する感受性は、プラスミドｐＮＺ１２３：ＭｅｔＡＰで補完した３つのＢＩＭのうち、２つについて回復した（表４）。これにより、ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ置換がファージ表現型を担っていることを確認した。注目すべきは、１つのＢＩＭ（＃３）について、ファージＤＴ１に対する感受性は、完全に回復されなかった（ＥＯＰ＝０．０２）。このことは、他の遺伝子内の突然変異が、ファージＤＴ１耐性におそらく関与していることを示唆している（表４）。また、突然変異ｍｅｔＡＰ遺伝子をｐＮＺ１２３中にクローニングして、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１中に形質転換した。ｐＮＺ１２３：ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑを有する株と比較すると、ｐＮＺ１２３を有する株間でＥＯＰの差はなかった。このことは、突然変異が支配的な（ｄｏｍｉｎａｎｔ）表現型をもたらさないことを示唆している。
【0253】
【表4】
【0254】
実施例４
ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ置換は、ｃｏｓ型ファージに対する範囲が広い
ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ置換によって提供される耐性がファージ依存性であるかを判定するために、ＳＭＱ－３０１に感染することもできるｃｏｓ型ファージＭＤ２を試験した。また、ファージＭＤ２を、Ｈ２０６Ｑ ＭｅｔＡＰによって厳格に阻害した。
ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ置換は、ｃｏｓ型ファージに対する範囲が広い
ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ置換によって提供される耐性がファージ依存性であるかを判定するために、ＳＭＱ－３０１に感染することもできるｃｏｓ型ファージＭＤ２を試験した。また、ファージＭＤ２を、Ｈ２０６Ｑ ＭｅｔＡＰによって厳格に阻害した。
【0255】
この突然変異が株依存性でないことを示すために、ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑを、指向性突然変異誘発を用いていくつかのＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株中に導入した。突然変異を、ｃｏｓ型ファージＮ１０３２、Ｎ１１１７、Ｎ１１１９、Ｎ１１６９、Ｎ１３５８、及びＮ３７８２に対して感受性であるＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＧＣＣ７８２株中に導入した。また、突然変異を、ｃｏｓ型ファージ、すなわち、Ｄ５６９１、Ｄ５９１３、Ｄ６０３７、及びＤ６２１５、並びにいくつかのｐａｃ型ファージ、すなわち、８５８、２９７２、Ｄ３２８８、４２５９、Ｄ４７５２、Ｄ４７５４、及びＤ９３９に対して感受性であるＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＧＣＣ７７１０株中に導入した。最後に、突然変異を、いくつかのｃｏｓ型ファージ、すなわち、Ｄ４０９０、Ｄ５８２１、Ｄ４８０７、及びＤ６１７９、並びにいくつかのｐａｃ型、すなわち、Ｄ２７６５、Ｄ４２７４、Ｄ５７８７、及びＤ５８７６に対して感受性であるＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＧＣＣ７７９６中に導入した。当該突然変異は、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＧＣＣ７７１０に感染するｃｏｓ型ファージに対してあまり有効でなかったが（ＥＯＰ１０－５）、試験した全てのｃｏｓ型ファージに対して耐性を与えた。Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＧＣＣ７７９６及びＤＧＣＣ７８２中へのｍｅｔＡＰＨ２０６Ｑ対立遺伝子の導入は、少なくとも１０－６のＥＯＰの引下げに至った。これは、検出限界（希釈１０－１の溶解ゾーン）に相当した。さらに、ファージミュータントを、当該アッセイから回収することはできなかった。他方では、試験したＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｐａｃ型ファージはいずれも、突然変異によって影響されなかった。このことは、この群のファージの複製にとってＭｅｔＡＰが重要でないことを示唆している。
【0256】
ＭｅｔＡＰ突然変異が、別の細菌種に対する感受性を引き下げるかを判定するために、ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑタンパク質をコードする対立遺伝子を、ｃｏｓ型ファージＭ１０２ＡＤに対して感受性であるＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）株ＨＥＲ １５０３中に導入した（Ｄｅｌｉｓｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＨＥＲ １５０３のｍｅｔＡＰ遺伝子は、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１の遺伝子と同じ長さ（８６１ｂｐ）を有する。２つのｍｅｔＡＰ遺伝子は、７４％の同一性を共有する一方、２つのメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰタンパク質）は、８５％の同一性を共有する。位置２０６にて見出されるヒスチジン残基は、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）中に存在する。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ゲノム中への（元のｍｅｔＡＰ対立遺伝子に代わる）ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑタンパク質をコードする対立遺伝子の挿入は、ファージＭ１０２ＡＤに対する感受性の引下げを実現した（ＥＯＰ＜１×１０－７、表５）。突然変異株の、元のｍｅｔＡＰ対立遺伝子との相補性により、ファージ感受性表現型が回復した（表５）。全体的に見て、これらのデータは、ファージ複製におけるＭｅｔＡＰの比較的広範囲にわたる役割を示唆している。
【0257】
【表5】
【0258】
実施例５
ＭｅｔＡＰ中の他の突然変異が、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げる
ｍｅｔＡＰ遺伝子中の他の突然変異が、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げることができるかを判定するために、エラープローンＰＣＲ増幅アプローチを用いた。結果として生じたＰＣＲ産物を、自然コンピテンスを用いて、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１中に形質転換した。抗生物質耐性マーカーを導入しなかったので、ファージＤＴ１を用いてクローンを選択した。陽性対照（ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ）による形質転換アッセイは、陰性対照（ＤＮＡなし）によるよりも多くのＢＩＭをもたらした。ＭｅｔＡＰタンパク質をコードする遺伝子を配列決定した。７つのミュータントが、ｍｅｔＡＰ遺伝子中に、アミノ酸の置換をもたらす突然変異を有していた。これらのミュータントのうちの６つについて、元のアミノ酸を、別のアミノ酸（Ｑ５７Ｋ、Ｌ１５３Ｐ、Ａ１６８Ｅ、Ｖ２２８Ｄ、Ｐ２３３Ｑ、及びＰ２３３Ｌ）によって置換した。別のミュータントについて、元のアミノ酸を、終止コドン（Ｇ２２６＊）によって置換した（表６）。
ＭｅｔＡＰ中の他の突然変異が、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げる
ｍｅｔＡＰ遺伝子中の他の突然変異が、ファージＤＴ１に対する感受性を引き下げることができるかを判定するために、エラープローンＰＣＲ増幅アプローチを用いた。結果として生じたＰＣＲ産物を、自然コンピテンスを用いて、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１中に形質転換した。抗生物質耐性マーカーを導入しなかったので、ファージＤＴ１を用いてクローンを選択した。陽性対照（ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ）による形質転換アッセイは、陰性対照（ＤＮＡなし）によるよりも多くのＢＩＭをもたらした。ＭｅｔＡＰタンパク質をコードする遺伝子を配列決定した。７つのミュータントが、ｍｅｔＡＰ遺伝子中に、アミノ酸の置換をもたらす突然変異を有していた。これらのミュータントのうちの６つについて、元のアミノ酸を、別のアミノ酸（Ｑ５７Ｋ、Ｌ１５３Ｐ、Ａ１６８Ｅ、Ｖ２２８Ｄ、Ｐ２３３Ｑ、及びＰ２３３Ｌ）によって置換した。別のミュータントについて、元のアミノ酸を、終止コドン（Ｇ２２６＊）によって置換した（表６）。
【0259】
これらの７つのミュータントについてのファージＤＴ１に対する感受性を再試験した。７つのミュータントは全て、ファージＤＴ１に対する感受性が引き下げられており、ＥＯＰは１×１０－６未満であった。耐性株を、ｐＮＺ１２３：ＭｅｔＡＰで補完すると、先で観察されたように、配列番号２に示されるＭｅｔＡＰは、ファージ感受性表現型を回復した。これにより、ＭｅｔＡＰタンパク質中のこれらの７つの突然変異はいずれも、ｃｏｓ型ファージに対する感受性を引き下げることを確認した。
【0260】
【表6】
【0261】
実施例６
ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ突然変異は安定している
産業用の発酵にとって重要な特徴の１つが、ファージ耐性表現型の安定性である。ゆえに、乳及びＬＭ１７中の、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１及びＤＧＣＣ７７９６、並びにそれらのミュータントの６０世代にわたる突然変異ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑの安定性を確認した。野生型株の選択したコロニーは全て、ファージ感受性のままであった一方、各ミュータント由来の１０個のコロニーは全て、ファージ耐性のままであった。このことは、突然変異ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑが安定していることを示している。
ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑ突然変異は安定している
産業用の発酵にとって重要な特徴の１つが、ファージ耐性表現型の安定性である。ゆえに、乳及びＬＭ１７中の、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＭＱ－３０１及びＤＧＣＣ７７９６、並びにそれらのミュータントの６０世代にわたる突然変異ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑの安定性を確認した。野生型株の選択したコロニーは全て、ファージ感受性のままであった一方、各ミュータント由来の１０個のコロニーは全て、ファージ耐性のままであった。このことは、突然変異ＭｅｔＡＰＨ２０６Ｑが安定していることを示している。
【0262】
結論
ここで、ｃｏｓ型ファージに対する感受性の引下げを、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のｍｅｔＡＰ遺伝子中の突然変異により獲得することができることが実証される。しかしながら、ｍｅｔＡＰ遺伝子において識別される突然変異はいずれも、ｐａｃ型ファージに対する感受性を引き下げない。最後に、ＭｅｔＡＰ Ｈ２０６Ｑ置換を克服したファージミュータントを単離することができないことにより、そのような突然変異は、ロバストな耐性表現型を提供することができることを確認した。
ここで、ｃｏｓ型ファージに対する感受性の引下げを、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のｍｅｔＡＰ遺伝子中の突然変異により獲得することができることが実証される。しかしながら、ｍｅｔＡＰ遺伝子において識別される突然変異はいずれも、ｐａｃ型ファージに対する感受性を引き下げない。最後に、ＭｅｔＡＰ Ｈ２０６Ｑ置換を克服したファージミュータントを単離することができないことにより、そのような突然変異は、ロバストな耐性表現型を提供することができることを確認した。
【0263】
先の本明細書中で言及した全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲及び精神から逸脱することのない、本発明の記載される方法及びシステムの種々の変更及び変形が、当業者に明らかであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学又は関連分野の当業者には明白である、本発明を実施するための記載した様式の種々の修飾が、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。
【配列表】