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特許7598137放射線または放射線療法によって引き起こされた放射線誘発性バイスタンダ効果を防止および治療するための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-03
(45)【発行日】2024-12-11
(54)【発明の名称】放射線または放射線療法によって引き起こされた放射線誘発性バイスタンダ効果を防止および治療するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20241204BHJP
A61K 31/336 20060101ALI20241204BHJP
A61K 31/352 20060101ALI20241204BHJP
A61K 31/4025 20060101ALI20241204BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20241204BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241204BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241204BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20241204BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241204BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241204BHJP
A61K 51/02 20060101ALI20241204BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241204BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241204BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241204BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20241204BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20241204BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241204BHJP
C07K 16/40 20060101ALN20241204BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20241204BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61K31/336
A61K31/352
A61K31/4025
A61K31/7048
A61K31/7088
A61K31/7105
A61K31/711
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K48/00
A61K51/02 100
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 111
A61P43/00 121
C12N15/09 Z
C12Q1/6827 Z
G01N33/53 M ZNA
C07K16/40
C12N15/113 Z
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2020502226
(86)(22)【出願日】2018-07-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-09-10
(86)【国際出願番号】 US2018042569
(87)【国際公開番号】W WO2019018451
(87)【国際公開日】2019-01-24
【審査請求日】2021-07-16
【審判番号】
【審判請求日】2023-04-05
(31)【優先権主張番号】62/533,272
(32)【優先日】2017-07-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】508128082
【氏名又は名称】ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・コロラド、ア・ボデイー・コーポレイト
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】シュエ，ディン
(72)【発明者】
【氏名】ポン，ユ
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，マン
(72)【発明者】
【氏名】ジェン，リンジュン
(72)【発明者】
【氏名】リャン，シャン
(72)【発明者】
【氏名】リ，ハンツァン
(72)【発明者】
【氏名】ユ，ジャウ－ソン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ジェン－ティン
【合議体】
【審判長】松波 由美子
【審判官】伊藤 幸司
【審判官】岡山 太一郎
(56)【参考文献】
【文献】Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１４年、Ｖｏｌ．４８、Ｎｏ．１０、ｐｐ．１２４７－１２５５
【文献】ＯＮＣＯＬＯＧＹ ＬＥＴＴＥＲＳ、２０１３年、Ｖｏｌ．６、ｐｐ．４５３－４５９
【文献】近畿大医誌、２０１２年、Ｖｏｌ．３７、Ｎｏ．３－４、ｐｐ．１９３－２０２
【文献】ＲＡＤＩＯＩＳＯＴＯＰＥＳ、２００５年、Ｖｏｌ．５４、ｐｐ．２３－２５（（２５）－（２７））
【文献】茶研報、２０１２年、Ｖｏｌ．１１３、ｐｐ．１－９
【文献】ＮＡＴＵＲＥ、２０１７年７月１９日、Ｖｏｌ．５４７、ｐｐ．４５８－４６２、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２３２８４
【文献】ＲＡＤＩＯＴＨＥＲＡＰＹ ＡＮＤ ＯＮＣＯＬＯＧＹ、２０１１年１１月２５日、ＶＯＬ：１０４、ＰＡＧＥＳ：３９５－４００
【文献】Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１６年、Ｖｏｌ．５０、ｐｐ．１７９－２１３
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
放射線への曝露によって引き起こされた対象の非照射細胞における放射線誘発性バイスタンダ効果（ＲＩＢＥ）を治療するための治療薬であって、治療的に有効な量の剤を含み、前記治療的に有効な量の剤は、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）またはその相同体であるＣＰＲ－４のプロテアーゼ活性を阻害し、前記非照射細胞においてＲＩＢＥを抑制する、治療薬。
【請求項2】
薬学的に許容可能な担体をさらに含み、前記薬学的に許容可能な担体が、水性および／または非水性の薬学的に許容可能な担体である、請求項１に記載の治療薬。
【請求項3】
前記剤が、放射線療法の投与前に、前記放射線療法の投与と共に、または前記放射線療法の投与後に投与される、請求項２に記載の治療薬。
【請求項4】
前記剤が、抗癌剤治療と組み合わせて投与される、請求項２に記載の治療薬。
【請求項5】
前記抗癌剤治療が、外科手術および化学療法からなる群から選択される、請求項４に記載の治療薬。
【請求項6】
前記剤が、前記対象における細胞死もしくは細胞増殖を変更するか、ＤＮＡ損傷を低減するか、またはＤＮＡ修復を増加させる、請求項１に記載の治療薬。
【請求項7】
前記剤が、前記対象におけるＲＩＢＥを低減および／または防止する、請求項１に記載の治療薬。
【請求項8】
前記治療的に有効な量の剤が、前記対象において以下の効果の少なくとも１つを引き起こす、請求項１に記載の治療薬：前記対象における癌対象の放射線療法および／または化学療法の有効性を増加させる；
前記対象における放射線療法および／または化学療法に対する癌細胞の抵抗力を低減する；並びに
放射線療法に対する前記対象の耐性を増加させる。
【請求項9】
放射線への曝露によって引き起こされた対象の非照射細胞における放射線誘発性バイスタンダ効果（ＲＩＢＥ）を改善するための治療薬であって、タンパク質カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）もしくはその相同体であるＣＰＲ－４の活性または発現を阻害する治療的に有効な量のＣＴＳＢ阻害剤を含む、治療薬。
【請求項10】
前記治療薬が、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）合成阻害剤、核酸分子、抗体またはその生物学的に活性な断片、およびアプタマーからなる群から選択される、請求項９に記載の治療薬。
【請求項11】
前記治療薬が、Ｅ６４、ＣＡ０７４、ＣＡ０７４Ｍｅ、および／またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の治療薬。
【請求項12】
前記治療薬及び１以上の薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を含む、請求項１１に記載の治療薬。
【請求項13】
抗癌剤治療と共に投与される、請求項９に記載の治療薬。
【請求項14】
前記抗癌剤治療が、外科手術および化学療法からなる群から選択される、請求項１３に記載の治療薬。
【請求項15】
前記放射線療法前におよび／または前記放射線療法と共におよび／または前記放射線療法後に投与される、請求項９に記載の治療薬。
【請求項16】
前記対象における細胞死もしくは細胞増殖を変更するか、ＤＮＡ損傷を低減するか、またはＤＮＡ修復を増加させる、請求項９に記載の治療薬。
【請求項17】
対象におけるＲＩＢＥを治療および／または防止する、請求項９に記載の治療薬。
【請求項18】
前記治療的に有効な量の前記治療薬が、前記対象において以下の効果の少なくとも１つを引き起こす、請求項９に記載の治療薬：対象における癌対象の放射線療法の有効性を増加させる；
対象における癌対象の化学療法の有効性を増加させる；
対象における放射線療法および／または化学療法に対する癌細胞の抵抗力を低減する；並びに
放射線療法に対する前記対象の耐性を増加させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本国際ＰＣＴ出願は、２０１７年７月１７日に出願された、米国仮特許第６２／５３３，２７２号の利益および優先権を主張する。上で参照された出願の明細書および図の全体が、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府の利益
本発明は、国立保健研究所（ＮＩＨ）によって授与された許可番号Ｒ３５ ＧＭ１１８１８８の下で政府の支援により作製された。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
本発明は、国立保健研究所（ＮＩＨ）によって授与された許可番号Ｒ３５ ＧＭ１１８１８８の下で政府の支援により作製された。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【0003】
本発明的技術は、概して、放射線および放射線療法への曝露によって引き起こされた副作用を防止および緩和するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明は、ヒトおよび動物の両方において放射線誘発性バイスタンダ効果（ＲＩＢＥ）に関わる新規の分子成分および経路の同定、単離、および特徴付けを包含する。本発明的技術は、放射線または放射線療法によって引き起こされたＲＩＢＥを治療するための新規の治療組成物および治療、ならびに診断方法論の開発および適用のための方法およびシステムをさらに含む。
【背景技術】
【0004】
放射線誘発性バイスタンダ効果（ＲＩＢＥ）とは、被照射細胞または組織によって放出された因子が動物の他の部分に対して効果を及ぼし、他の効果の中でも特に、ゲノム不安定性、ストレス反応、および変更されたアポトーシスまたは細胞増殖を引き起こす、固有のプロセスを指す。ＲＩＢＥはまた、非照射細胞および組織に影響を与え、それらの損傷を引き起こし、結果としてあらゆる種類の有害な副作用（例えば、脱毛、疲労、皮膚障害、および低血球数）をもたらすからだけでなく、それがパラ分泌シグナル伝達を通して被照射細胞に影響を与え、放射線療法に対する癌細胞の抵抗力を引き起こし得るため、癌治療における放射線療法の効能および成功を判定する際の主要な因子である。これまでのところ、放射線および放射線療法によって引き起こされた副作用を低減または防止するための有効な方法はない。
【0005】
放射線防護において重要な意味を有するにもかかわらず、放射線安全および放射線療法、ＲＩＢＥ因子の分子同一性、およびそれらの作用機序は依然として不明である。ＲＩＢＥ因子の同定およびそれらがどのように作用しているかについての理解が、癌放射線療法および放射線防護における根本的な問題である。したがって、当該技術分野において、ＲＩＢＥに関わる分子成分およびシグナル伝達経路の同定および特徴付け、ならびに放射線および放射線療法への曝露によって引き起こされるＲＩＢＥを防止および／または緩和するための新規の組成物および治療についての実質的な必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、アポトーシス阻害および細胞増殖の増加、致死性、ストレス反応、ならびにゲノムのＤＮＡ損傷を含む、複数の典型的なＲＩＢＥ効果を誘導する主要なＲＩＢＥ因子として、カテプシンＢ相同体であるＣＰＲ－４を同定し、特徴とする。一実施形態では、本発明者らは、放射線が、ｐ５３／ＣＥＰ－１依存性機序を通したｃｐｒ－４転写、ならびにＣＰＲ－４タンパク質生成および分泌を増加させることを実証している。次に、分泌されたＣＰＲ－４は、老化、ストレス反応、新陳代謝からアポトーシスまで、複数の保存されたシグナル伝達経路にとって重要な意味を持つＤＡＦ－２インスリン／ＩＧＦレセプタの活性を調節することを通して直接または間接的のいずれかで、複数のＲＩＢＥ反応を誘導する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
別の実施形態では、本発明者らは、ヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の発現が照射に反応して上方調節され、それが、ヒト細胞中のＵＶ誘発性バイスタンダ効果にも関わることを実証している。好ましい実施形態では、本発明的技術は、放射線の曝露または放射線療法によって引き起こされる、ヒトにおけるＲＩＢＥを防止および／または緩和するための組成物、システム、方法、および治療的処置、ならびに診断方法論に関する。さらなる実施形態はまた、概して、他の動物系におけるカテプシンＢ、ならびにそれらのすべての相同体および変異体を対象とし得る。
【0008】
別の実施形態では、本発明者らは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＤＡＦ－２タンパク質の相同体である、ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）の発現が、ヒトおよび他の細胞におけるカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）誘発性ＲＩＢＥに関わっており、ＲＩＢＥのシグナル伝達経路が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓとヒトとの間に保存されることを実証している。好ましい実施形態では、本発明的技術は、ＩＮＳＲの発現または活性の変化を通して、放射線の曝露または放射線療法によって引き起こされたヒトにおけるＲＩＢＥを防止および／または緩和するための組成物、システム、方法、および治療的処置、ならびに診断方法論を含む。さらなる実施形態はまた、概して、他の動物系、ならびにそれらのすべての相同体および変異体におけるＩＮＳＲの発現および／または活性を変更することを対象にし得る。
【0009】
以下に記載のように、本発明は、放射線の曝露の効果、具体的にはＲＩＢＥと関連する疾患および状態の治療または防止のための、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドもしくはその断片のうちの１つ以上の発現または活性を変更するための組成物および方法を特徴とする。
【0010】
一態様では、本発明は、細胞に対するＲＩＢＥを含む放射線の曝露の効果を改善する方法であって、未治療の対照細胞に対して、被照射細胞を、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤と接触させ、それによって細胞に対する放射線の曝露の効果またはＲＩＢＥを改善することを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、細胞に対するＲＩＢＥを含む放射線の曝露の効果を改善する方法であって、未治療の対照細胞に対して、被照射細胞を、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤と接触させ、それによって細胞に対する放射線の曝露の効果またはＲＩＢＥを改善することを含む、方法を提供する。
【0011】
また別の態様では、本発明は、対象（例えば、哺乳動物の細胞、組織、または器官における）に対する放射線の曝露の効果を改善する方法であって、未治療の対照細胞に対して、対象に、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤を投与し、それによって細胞に対する放射線の曝露の効果、具体的にはＲＩＢＥを改善することを含む、方法を提供する。
【0012】
また別の態様では、本発明は、対象（例えば、哺乳動物の対象の細胞、組織、または器官における）に対する放射線の曝露の効果を改善する方法であって、未治療の対照対象に対して、対象に、対象におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼを含む、１つ以上のシグナル経路の発現または活性を選択的に変更する薬剤を投与し、それによって対象に対する放射線の曝露の効果、具体的にはＲＩＢＥを改善することを含む、方法を提供する。
【0013】
また別の態様では、本発明は、対象（例えば、哺乳動物の細胞、組織、または器官における）に対する放射線の曝露の効果を改善する方法であって、未治療の対照細胞に対して、対象に、対象におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤を投与し、それによって対象に対する放射線の曝露の効果、具体的にはＲＩＢＥを改善することを含む、方法を提供する。
【0014】
本発明の別の態様は、ＣＰＲ－４、ＣＴＳＢ、ＣＥＰ－１、ＤＡＦ－２、ｐ５３、インスリン／ＩＧＦレセプタ、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼ遺伝子またはそれらの相同体／オルソログのうちの１つ以上の発現を破壊、変更、および／または阻害するための組成物および方法を提供する。本発明の別の態様は、放射線の曝露の効果、具体的にはＲＩＢＥと関連する疾患および状態の治療または防止のための、ＣＰＲ－４、ＣＴＳＢ、ＣＥＰ－１、ＤＡＦ－２、ｐ５３、インスリン／ＩＧＦレセプタ、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼ遺伝子またはそれらの相同体／オルソログのうちの１つ以上の発現を破壊、変更、および／または阻害のための組成物および方法を提供する。様々な実施形態では、１つ以上の標的遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９、転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＡＮ）または亜鉛（Ｚｎ２＋）フィンガヌクレアーゼシステムを通して変更され得る。
【0015】
また別の実施形態では、本発明的技術は、診断目的、ならびに治療、薬物スクリーニングおよび患者／腫瘍の放射線療法の効能／感受性の目的、ならびに本明細書に記載の他の目的のために使用され得る１つ以上のマーカを含み得る。特定の実施形態では、これらのマーカは、患者、細胞、組織、腫瘍などにおける放射線感受性または放射線抵抗力を予測するためのマーカを含み得る。マーカは、ＣＰＲ－４、ＣＴＳＢ、ＣＥＰ－１、ＤＡＦ－２、ｐ５３、インスリン／ＩＧＦレセプタ、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼを含み得るがこれらに限定されない。
【0016】
本発明の別の態様は、放射線の曝露によって誘発されたＲＩＢＥを緩和し、かつ／またはこれに干渉する特異的ＣＴＳＢ阻害剤の使用を含み得る。好ましい一実施形態では、このような阻害剤には、１）ＣＡ０７４［Ｎ－（ｌ－３－トランス－プロピルカルバモイルオキシラン－２－カルボニル）－ｌ－イソロイシル－ｌ－プロリン］、ＣＴＳＢの選択的阻害剤、２）ＣＡ０７４メチルエステル（ＣＡ０７４Ｍｅ）、細胞内カテプシンＢ用膜透過性プロ阻害剤、および３）カテプシンＢを含む、広範囲のシステインペプチダーゼを不可逆的に阻害し得るエポキシドであるＥ６４が含まれ得る。一実施形態では、有効な量の前述のＣＴＳＢ阻害剤または誘導体のうちの１つ以上を、放射線療法前、中、または後に患者に投与し得る。本発明のさらなる態様は、ＲＩＢＥの新規阻害剤のための治療薬物スクリーニングのための方法およびシステムを含み得る。類似体、および本発明に含まれる他の化合物は、Ｅ－６４、Ｅ－６４ａ、Ｅ－６４ｂ、Ｅ－６４ｃ、Ｅ－６４ｄ、ＣＡ－０７４、ＣＡ－０７４ Ｍｅ、ＣＡ－０３０、ＣＡ－０２８、Ｚ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－ＦＭＫ、Ｈ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－ＮＨ２、Ｎ－（１－ナフタレニルスルホニル）－Ｉｌｅ－Ｔｒｐ－アルデヒド、Ｚ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ジアゾメチルケトン、Ｚ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－アルデヒド、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【0017】
一態様では、本発明は、放射線の曝露、具体的にはＲＩＢＥの治療のための医薬組成物（複数可）であって、参照細胞に対して、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する有効な量の１つ以上の薬剤を含有する、医薬組成物を提供する。
【0018】
別の態様では、本発明は、放射線の曝露、具体的にはＲＩＢＥの治療ための医薬組成物（複数可）であって、参照細胞に対して、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドまたはその断片のうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する有効な量の１つ以上の薬剤を含有する、医薬組成物を提供する。
【0019】
また別の態様では、本発明は、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドまたはその断片の発現または活性を選択的に変更する有効な量の薬剤を含有する、放射線の曝露、具体的にはＲＩＢＥを治療するためのキット、ならびに放射線の曝露、および具体的にはＲＩＢＥを治療するためのキットを使用するための指示を提供する。
【0020】
本明細書に描写されている態様のうちのいずれかの様々な実施形態では、薬剤は、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ核酸分子、またはＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼ核酸分子の少なくとも一部分に対して相補的な阻害性核酸分子である。
【0021】
本明細書に描写されている態様のうちのいずれかの様々な実施形態では、薬剤は、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ、またはＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドに選択的に結合する抗体またはその断片である。様々な実施形態では、抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。
【0022】
本明細書に描写されている態様のうちのいずれかの様々な実施形態では、薬剤は、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ、またはＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドに選択的に結合する小分子である。様々な実施形態では、小分子は、合成であり得る。
【0023】
本発明はまた、放射線の曝露の治療のための組成物および方法を提供する。以下に記載のように、本発明は、放射線の曝露の効果、具体的にはＲＩＢＥに関連する疾患および状態の治療または防止のための、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）ペプチドまたはその断片の活性を阻害する、治療的に有効な量の化合物ケルセチンまたはその類似体を投与するための組成物および方法を特徴とする。
【0024】
一態様では、本発明は、細胞に対するＲＩＢＥを含む放射線の曝露の効果を改善する方法であって、未治療の対照細胞に対して、被照射細胞を、細胞におけるカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）ペプチドまたはその断片の活性を阻害する、治療的に有効な量の化合物ケルセチンまたはその類似体と接触させ、それによって細胞に対する放射線の曝露の効果またはＲＩＢＥを改善することを含む、方法を提供する。
【0025】
別の態様では、本発明は、細胞に対するＲＩＢＥを含む放射線の曝露の効果を改善する方法であって、未治療の対照細胞に対して、照射されていない細胞を、細胞におけるカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）ペプチドまたはその断片の活性を阻害する、治療的に有効な量の化合物ケルセチンまたはその類似体と接触させ、それによって細胞に対する放射線の曝露の効果またはＲＩＢＥを改善することを含む、方法を提供する。
【0026】
また別の態様では、本発明は、対象（例えば、哺乳動物の対象の細胞、組織、または器官における）に対する放射線の曝露の効果を改善する方法であって、未治療の対照細胞に対して、対象に、対象におけるカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）ペプチドまたはその断片の活性を阻害する、治療的に有効な量の化合物ケルセチンまたはその類似体を投与し、それによって対象に対する放射線の曝露の効果、具体的にはＲＩＢＥを改善することを含む、方法を提供する。
【0027】
また別の態様では、本発明は、対象（例えば、哺乳動物の対象の細胞、組織、または器官における）に対する放射線の曝露の効果を改善する方法であって、対象に、治療的または診断的理由のためかを問わず、ある用量の放射線の投与前に、対象におけるカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）ペプチドまたはその断片の活性を阻害する、治療的に有効な量の化合物ケルセチンまたはその類似体を投与し、それによって対象に対する放射線の曝露の効果、具体的にはＲＩＢＥを改善することを含む、方法を提供する。
【0028】
また別の態様では、本発明は、対象（例えば、哺乳動物の対象の細胞、組織、または器官における）に対する放射線の曝露の効果を改善する方法であって、対象に、ある用量の放射線の投与後に、またはＲＩＢＥの症状が現れ始めたときに、対象におけるカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）ペプチドまたはその断片の活性を阻害する、治療的に有効な量の化合物ケルセチンまたはその類似体を投与し、それによって対象に対する放射線の曝露の効果、具体的にはＲＩＢＥを改善することを含む、方法を提供する。
【0029】
一態様では、本発明は、放射線の曝露、具体的にはＲＩＢＥの治療のための医薬組成物（複数可）であって、参照細胞に対して、細胞におけるカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）ペプチドのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に低減する有効な量の１つ以上の薬剤を含有する、医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、医薬組成物（複数可）は、治療的に有効な量の化合物ケルセチンもしくはその類似体および／または薬学的に許容可能な塩を含み得る。
【0030】
また別の態様では、本発明は、放射線の曝露、具体的にはＲＩＢＥを治療するためのキットであって、参照細胞に対して、細胞におけるカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）ペプチドのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に低減する有効な量の薬剤を含有する、キットを提供する。好ましい実施形態では、医薬組成物（複数可）は、治療的に有効な量の化合物ケルセチンもしくはその類似体および／または薬学的に許容可能な塩を含み得る。
【0031】
本発明的技術のさらなる実施形態は、以下を含み得るがこれらに限定されない。
１．放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法であって、患者に、タンパク質ＣＰＲ－４の活性または発現を阻害する治療的に有効な量の薬剤を投与することを含む、方法。
１．放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法であって、患者に、タンパク質ＣＰＲ－４の活性または発現を阻害する治療的に有効な量の薬剤を投与することを含む、方法。
【0032】
２．当該薬剤が、ＣＰＲ－４合成阻害剤、化学薬品、核酸分子、抗体またはその生物学的に活性な断片、およびアプタマーからなる群から選択される、条項１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0033】
３．当該核酸分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ構成物、ＤＮＡ酵素、およびＣＰＲ－４の発現または活性を特異的に阻害するリボザイムからなる群から選択される、条項２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0034】
４．当該抗体またはその生物学的に活性な断片が、ＣＰＲ－４に特異的に結合する抗体またはその生物学的に活性な断片を含む、条項２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0035】
５．当該アプタマーが、ＣＰＲ－４に特異的に結合するアプタマーを含む、条項２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0036】
６．当該薬剤が、医薬組成物において前記対象に投与される、条項１～５に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0037】
７．当該放射線治療が、抗癌剤治療と組み合わされる、条項１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0038】
８．抗癌剤治療が、外科手術および化学療法からなる群から選択される、条項７に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0039】
９．薬剤が、放射線療法の投与前に投与される、条項１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0040】
１０．薬剤が、放射線療法の投与と共に投与される、条項１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0041】
１１．放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法であって、患者に、細胞からのタンパク質ＣＰＲ－４の分泌を阻害する治療的に有効な量の薬剤を投与することを含む、方法。
【0042】
１２．当該薬剤が、ＣＰＲ－４合成阻害剤、核酸分子、抗体またはその生物学的に活性な断片、およびアプタマーからなる群から選択される、条項１１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0043】
１３．当該核酸分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ構成物、ＤＮＡ酵素、およびＣＰＲ－４の発現または活性を特異的に阻害するリボザイムからなる群から選択される、条項１２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0044】
１４．当該抗体またはその生物学的に活性な断片が、ＣＰＲ－４に特異的に結合し、当該細胞からの分泌を防止する抗体またはその生物学的に活性な断片を含む、条項１２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0045】
１５．当該アプタマーが、ＣＰＲ－４に特異的に結合し、当該細胞からの分泌を防止するアプタマーを含む、条項１２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0046】
１６．当該薬剤が、医薬組成物において対象に投与される、条項１１～１５に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0047】
１７．放射線治療が、抗癌剤治療と組み合わされる、条項１１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0048】
１８．抗癌剤治療が、外科手術および化学療法からなる群から選択される、条項１７に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0049】
１９．薬剤が、放射線療法の投与前に投与される、条項１１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0050】
２０．薬剤が、放射線療法の投与と共に投与される、条項１１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0051】
２１．放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法であって、患者に、タンパク質カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の活性または発現を阻害する治療的に有効な量の薬剤を投与することを含む、方法。
【0052】
２２．当該薬剤が、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）合成阻害剤、核酸分子、抗体またはその生物学的に活性な断片、およびアプタマーからなる群から選択される、条項２１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0053】
２３．当該核酸分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ構成物、ＤＮＡ酵素、およびカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の発現または活性を特異的に阻害するリボザイムからなる群から選択される、条項２２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0054】
２４．当該抗体またはその生物学的に活性な断片が、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）に特異的に結合する抗体またはその生物学的に活性な断片を含む、条項２２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0055】
２５．当該アプタマーが、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）に特異的に結合するアプタマーを含む、条項２２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0056】
２６．当該薬剤が、医薬組成物において対象に投与される、条項２１～２５に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0057】
２７．放射線治療が、抗癌剤治療と組み合わされる、条項２１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0058】
２８．抗癌剤治療が、外科手術および化学療法からなる群から選択される、条項２７に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0059】
２９．薬剤が、放射線療法の投与前に投与される、条項２１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0060】
３０．薬剤が、放射線療法の投与と共に投与される、条項２１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0061】
３１．放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法であって、患者に、タンパク質ＣＥＰ－１の活性または発現を阻害する治療的に有効な量の薬剤を投与することを含む、方法。
【0062】
３２．当該薬剤が、ＣＥＰ－１合成阻害剤、化学薬品、核酸分子、抗体またはその生物学的に活性な断片、およびアプタマーからなる群から選択される、条項３１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0063】
３３．当該核酸分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ構成物、ＤＮＡ酵素、およびＣＥＰ－１の発現または活性を特異的に阻害するリボザイムからなる群から選択される、条項３２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0064】
３４．当該抗体またはその生物学的に活性な断片が、ＣＥＰ－１に特異的に結合する抗体またはその生物学的に活性な断片を含む、条項３２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0065】
３５．当該アプタマーが、ＣＥＰ－１に特異的に結合するアプタマーを含む、条項３２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0066】
３６．当該薬剤が、医薬組成物において対象に投与される、条項３１～３５に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0067】
３７．放射線治療が、抗癌剤治療と組み合わされる、条項３１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0068】
３８．抗癌剤治療が、外科手術および化学療法からなる群から選択される、条項３７に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0069】
３９．薬剤が、放射線療法の投与前に投与される、条項３１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0070】
４０．薬剤が、放射線療法の投与と共に投与される、条項３１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0071】
４１．放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法であって、患者に、タンパク質ＤＡＦ－２の活性または発現を阻害する治療的に有効な量の薬剤を投与することを含む、方法。
【0072】
４２．当該薬剤が、ＤＡＦ－２合成阻害剤、核酸分子、抗体またはその生物学的に活性な断片、およびアプタマーからなる群から選択される、条項４１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0073】
４３．当該核酸分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ構成物、ＤＮＡ酵素、およびＤＡＦ－２の発現または活性を特異的に阻害するリボザイムからなる群から選択される、条項４２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0074】
４４．当該抗体またはその生物学的に活性な断片が、ＤＡＦ－２に特異的に結合する抗体またはその生物学的に活性な断片を含む、条項４２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0075】
４５．当該アプタマーが、ＤＡＦ－２に特異的に結合するアプタマーを含む、条項４２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0076】
４６．当該薬剤が、医薬組成物において対象に投与される、条項４１～４５に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0077】
４７．放射線治療が、抗癌剤治療と組み合わされる、条項４１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0078】
４８．抗癌剤治療が、外科手術および化学療法からなる群から選択される、条項４７に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0079】
４９．薬剤が、放射線療法の投与前に投与される、条項４１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0080】
５０．薬剤が、放射線療法の投与と共に投与される、条項４１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0081】
５１．放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法であって、患者に、タンパク質ＰＤＫ－１の活性または発現を阻害する治療的に有効な量の薬剤を投与することを含む、方法。
【0082】
５２．当該薬剤が、ＰＤＫ－１合成阻害剤、核酸分子、抗体またはその生物学的に活性な断片、およびアプタマーからなる群から選択される、条項５１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0083】
５３．当該核酸分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ構成物、ＤＮＡ酵素、およびＰＤＫ－１の発現または活性を特異的に阻害するリボザイムからなる群から選択される、条項５２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0084】
５４．当該抗体またはその生物学的に活性な断片が、ＰＤＫ－１に特異的に結合する抗体またはその生物学的に活性な断片を含む、条項５２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0085】
５５．当該アプタマーが、ＰＤＫ－１に特異的に結合するアプタマーを含む、条項５２に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0086】
５６．当該薬剤が、医薬組成物において対象に投与される、条項５１～５５に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0087】
５７．放射線治療が、抗癌剤治療と組み合わされる、条項５１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0088】
５８．抗癌剤治療が、外科手術および化学療法からなる群から選択される、条項５７に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0089】
５９．薬剤が、放射線療法の投与前に投与される、条項５１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0090】
６０．薬剤が、放射線療法の投与と共に投与される、条項５１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0091】
６１．放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法であって、少なくとも１つの細胞を、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤と接触させ、それによって細胞に対する放射線の曝露の効果を改善する工程を含む、方法。
【0092】
６２．放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法であって、細胞を、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤と接触させ、それによって細胞に対する放射線の曝露の効果を改善する工程を含む、方法。
【0093】
６３．放射線の曝露の効果が、直接的または間接的である、条項６１に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0094】
６４．細胞が、放射線に曝露されない、条項６３に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0095】
６５．細胞を、放射線に曝露された細胞または細胞の生成物と接触させる、条項６３に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0096】
６６．細胞が、放射線に曝露された細胞の近傍にあるか、またはその遠隔にあり、かつ細胞と直接接触していない、条項６３に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0097】
６７．細胞および放射線に曝露された細胞が、対象において存在している、条項６１に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0098】
６８．ヒトにおけるＲＩＢＥを改善する工程をさらに含む、条項６１に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0099】
６９．薬剤が、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼ核酸分子の少なくとも一部分に対して相補的な阻害性核酸分子である、条項６１に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0100】
７０．阻害性核酸分子が、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、他のＲＮＡｉ構成物、リボザイム、またはＤＮＡ生成物からなる群から選択される、条項６９に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0101】
７１．薬剤が、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ、またはＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドに選択的に結合する抗体またはその断片である、条項６１に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0102】
７２．抗体が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である、条項７１に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0103】
７３．当該方法が、ＲＩＢＥを低減する、条項６１に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0104】
７４．当該方法が、癌対象における放射線療法の有効性を増加させる、条項６１に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0105】
７５．当該方法が、化学療法に対する癌細胞の抵抗力を低減する、条項６１に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0106】
７６．少なくとも１つの細胞を、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤と接触させ、それによって細胞に対する放射線の曝露の効果を改善する工程を含む、放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0107】
７７．細胞を、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤と接触させ、それによって細胞に対する放射線の曝露の効果を改善する、放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0108】
７８．放射線の曝露の効果が、直接的または間接的である、条項７６に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0109】
７９．細胞が、放射線に曝露されない、条項７８に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0110】
８０．細胞を、放射線に曝露された細胞または細胞の生成物と接触させる、条項７８に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0111】
８１．細胞が、放射線に曝露された細胞の近傍にあるか、またはその遠隔にあり、かつ細胞と直接接触していない、条項７８に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0112】
８２．細胞および放射線に曝露された細胞が対象において存在している、条項７６に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0113】
８３．放射線の曝露の効果が、ＲＩＢＥを含む、条項７６に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0114】
８４．薬剤が、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼ核酸分子の少なくとも一部分に対して相補的な阻害性核酸分子である、条項７６に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0115】
８５．阻害性核酸分子が、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、他のＲＮＡｉ構成物、またはＤＮＡ生成物からなる群から選択される、条項８４に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0116】
８６．薬剤が、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ、またはＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドに選択的に結合する抗体またはその断片である、条項７６に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0117】
８７．抗体が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である、条項８６に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0118】
８８．当該方法が、ＲＩＢＥを低減する、条項７６に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0119】
８９．当該方法が、癌対象における放射線療法の有効性を増加させる、条項７６に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0120】
９０．当該方法が、癌対象における化学療法の有効性を増加させる、条項７６に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0121】
９１．当該方法が、化学療法に対する癌細胞の抵抗力を低減する、条項７６に記載の放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0122】
９２．対象における放射線の曝露の効果を改善する方法であって、対象に、対象におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤を投与し、それによって対象における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善することを含む、方法。
【0123】
９３．対象における放射線の曝露の効果を改善する方法であって、対象に、対象におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤を投与し、それによって対象における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善することを含む、方法。
【0124】
９４．対象における放射線の曝露の効果を改善する方法であって、対象に、対象におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼオリゴヌクレオチドのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤を投与し、それによって対象における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善することを含む、方法。
【0125】
９５．対象における放射線の曝露の効果を改善する方法であって、対象に、対象におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼリボヌクレオチドのうちの１つ以上の発現または活性を選択的に変更する薬剤を投与し、それによって対象における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善することを含む、方法。
【0126】
９６．放射線の曝露が、直接的または間接的である、条項９２に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0127】
９７．細胞が、放射線に曝露されない、条項９６に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0128】
９８．細胞を、放射線に曝露された細胞と接触させる、条項９６に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0129】
９９．細胞が、放射線に曝露された細胞の近傍にあるか、またはその遠隔にあり、かつ細胞と直接接触していない、条項９６に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0130】
１００．細胞および放射線に曝露された細胞が、対象において存在している、条項９８に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善するための方法。
【0131】
１０１．放射線の曝露の効果が、ＲＩＢＥを含む、条項９２に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0132】
１０２．薬剤が、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ核酸分子、またはＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼ核酸分子の少なくとも一部分に対して相補的な阻害性核酸分子である、条項９２に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0133】
１０３．阻害性核酸分子が、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、他のＲＮＡｉ構成物、またはＤＮＡ生成物からなる群から選択される、条項１０２に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0134】
１０４．薬剤が、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ、またはＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドに選択的に結合する抗体またはその断片である、条項９２に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0135】
１０５．抗体が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である、条項１０４に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0136】
１０６．当該方法が、ＲＩＢＥを低減する、条項９２に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0137】
１０７．当該方法が、癌対象における放射線療法の有効性を増加させる、条項９２に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0138】
１０８．当該方法が、癌対象における化学療法の有効性を増加させる、条項９２に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0139】
１０９．当該方法が、化学療法に対する癌細胞の抵抗力を低減する、条項９２に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0140】
１１０．放射線の曝露の治療のための医薬組成物であって、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドの発現または活性を選択的に変更させ、それによって対象における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善する、治療的に有効な量の１つ以上の薬剤を含む、医薬組成物。
【0141】
１１１．放射線の曝露の治療のための医薬組成物であって、細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタの発現または活性を選択的に変更させ、それによって対象における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善する、治療的に有効な量の１つ以上の薬剤を含む、医薬組成物。
【0142】
１１２．少なくとも１つの薬剤が、ＣＰＲ－４、ＣＴＳＢ、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ核酸分子、またはＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼ核酸分子の少なくとも一部分に対して相補的な阻害性核酸分子ｓｉＲＮＡである、条項１１０の医薬組成物。
【0143】
１１３．阻害性核酸分子が、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、他のＲＮＡｉ構成物、またはＤＮＡ生成物からなる群から選択される、条項１１２の医薬組成物。
【0144】
１１４．少なくとも１つの薬剤が、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドに選択的に結合する抗体またはその断片である、条項１１１の医薬組成物。
【0145】
１１５．抗体が、モノクローナルまたはポリクローナルである、条項１１４の医薬組成物。
【0146】
１１６．薬剤が、対象における細胞死を変更するか、ＤＮＡ損傷を低減するか、またはＤＮＡ修復を増加させる、条項１１０の医薬組成物。
【0147】
１１７．当該方法が、患者におけるＲＩＢＥを低減する、条項１１０の医薬組成物。
【0148】
１１８．組成物が、患者における癌対象における放射線療法の有効性を増加させる、条項１１０の医薬組成物。
【0149】
１１９．組成物が、患者における癌対象における化学療法の有効性を増加させる、条項１１０の医薬組成物。
【0150】
１２０．組成物が、化学療法患者における化学療法に対する癌細胞の抵抗力を低減する、条項１１０の医薬組成物。
【0151】
１２１．細胞におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ、またはＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドの発現または活性を選択的に変更する有効な量の薬剤、および放射線の曝露を治療するためのキットを使用するための指示を含む、放射線の曝露を治療するためのキット。
【0152】
１２２．薬剤が、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ核酸分子、またはＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼ核酸分子の少なくとも一部分に対して相補的な阻害性核酸分子である、条項１２１のキット。
【0153】
１２３．阻害性核酸分子が、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、他のＲＮＡｉ構成物、またはＤＮＡ生成物からなる群から選択される、条項１２２のキット。
【0154】
１２４．薬剤が、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼレセプタ、またはＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼペプチドに選択的に結合する抗体またはその断片である、条項１２１のキット。
【0155】
１２５．抗体が、モノクローナルまたはポリクローナルである、条項１２４のキット。
【0156】
１２６．当該方法が、患者におけるＲＩＢＥを低減する、条項１２１のキット。
【0157】
１２７．キットが、患者における放射線療法の有効性を増加させる、条項１２１のキット。
【0158】
１２８．キットが、患者における化学療法の有効性を増加させる、条項１２１のキット。
【0159】
１２９．キットが、患者における化学療法に対する癌細胞の抵抗力を低減する、条項１２１のキット。
【0160】
１３０．対象における放射線の曝露の効果を改善する方法であって、以下：ＣＰＲ－４、カテプシンＢ、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼのうちの１つ以上の発現を選択的に変更することを含む、方法。
【0161】
１３１．当該方法が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９システム、ＴＡＬＥＮシステム、または亜鉛フィンガヌクレアーゼシステムからなる群から選択されるシステムを通して、患者におけるＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼの発現を選択的に変更することを含む、条項１３０に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0162】
１３２．前記対象が、ヒトである、条項１３０に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0163】
１３３．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９を通してＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼの発現を選択的に変更する当該方法が、対象を、
－ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび単離核酸、ならびに
－ガイドＲＮＡが、細胞における標的核酸配列に対して相補的である、ガイドＲＮＡをコードするガイドＲＮＡおよび単離核酸のうちの少なくとも一方に、曝露する工程を含む、条項１３１に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
－ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび単離核酸、ならびに
－ガイドＲＮＡが、細胞における標的核酸配列に対して相補的である、ガイドＲＮＡをコードするガイドＲＮＡおよび単離核酸のうちの少なくとも一方に、曝露する工程を含む、条項１３１に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0164】
１３４．当該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ－９エンドヌクレアーゼである、条項１３３に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0165】
１３５．当該標的核酸配列が、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）ＰＤＫ－１、またはＰＤＫ１キナーゼにおける標的核酸配列を含む、条項１３４に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0166】
１３６．ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼにおける当該標的核酸配列が、生物学的活性と関連する標的配列を含む、条項１３５に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0167】
１３７．当該生物学的活性が、生物学的活性を誘発するＲＩＢＥを含む、条項１３６に記載の対象における放射線の曝露の効果を改善する方法。
【0168】
１３８．放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法であって、患者に、タンパク質を誘発するＲＩＢＥの活性または発現を変更する治療的に有効な量の薬剤を投与することを含む、方法。
【0169】
１３９．当該薬剤が、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の選択的阻害剤である、条項１３８に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0170】
１４０．カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の当該選択的阻害剤が、ＣＡ０７４［Ｎ－（ｌ－３－トランス－プロピルカルバモイルオキシラン－２－カルボニル）－ｌ－イソロイシル－ｌ－プロリン］である、条項１３９に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0171】
１４１．当該薬剤が、細胞内カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）のための膜透過性プロ阻害剤である、条項１３８に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0172】
１４２．当該細胞内カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）のための膜透過性プロ阻害剤が、ＣＡ０７４メチルエステルである、条項１４１に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0173】
１４３．当該薬剤が、システインペプチダーゼを阻害するエポキシドである、条項１３８に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0174】
１４４．システインペプチダーゼを阻害する当該エポキシドが、Ｅ６４である、条項１４３に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0175】
１４５．当該患者が、ヒトである、条項１３８～１４４に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0176】
１４６．当該方法が、以下：当該患者における放射線療法の有効性の増加、当該患者における化学療法の有効性の増加、当該患者における放射線療法に対する癌細胞の抵抗力の低減、患者における化学療法に対する癌細胞の抵抗力の低減、放射線療法に対する患者の耐性の増加のうちの１つ以上を示す、条項１３８～１４５に記載の放射線への曝露によって引き起こされた患者における放射線誘発性バイスタンダ効果を改善するための方法。
【0177】
１４７．ＲＩＢＥの治療のための医薬組成物であって、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の発現または活性を選択的に変更する有効量の１つ以上の薬剤を含む、医薬組成物。
【0178】
１４８．当該１つ以上の薬剤が、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の発現または活性を選択的に阻害および／または低減する、条項１４７に記載のＲＩＢＥの治療のための医薬組成物。
【0179】
１４９．当該薬剤が、Ｅ６４、ＣＡ０７４、ＣＡ０７４メチルエステル、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、条項１４８に記載のＲＩＢＥの治療のための医薬組成物。
【0180】
１５０．癌患者が放射線治療の投与に反応すると予測されるかどうかを判定するための方法であって、
患者からの細胞試料において、
ｉ．カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉ．ＣＰＲ－４遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉｉ．ＣＥＰ－１遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｖ．ｐ５３遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖ．ＤＡＦ－２遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉ．ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉ．ヒトＰＤＫ１キナーゼ遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉｉ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子の少なくとも一部分に対して完全に相補的なポリヌクレオチド、
ｉｘ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子によってコードされたポリペプチド、および
ｘ．ｉｘのポリペプチドの断片、からなる群から選択される、マーカ遺伝子または複数のマーカ遺伝子の遺伝子発現のレベルを検出することを含み、
マーカの発現レベルが、患者が放射線治療の投与に反応するかどうかを示す、方法。
患者からの細胞試料において、
ｉ．カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉ．ＣＰＲ－４遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉｉ．ＣＥＰ－１遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｖ．ｐ５３遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖ．ＤＡＦ－２遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉ．ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉ．ヒトＰＤＫ１キナーゼ遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉｉ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子の少なくとも一部分に対して完全に相補的なポリヌクレオチド、
ｉｘ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子によってコードされたポリペプチド、および
ｘ．ｉｘのポリペプチドの断片、からなる群から選択される、マーカ遺伝子または複数のマーカ遺伝子の遺伝子発現のレベルを検出することを含み、
マーカの発現レベルが、患者が放射線治療の投与に反応するかどうかを示す、方法。
【0181】
１５１．マーカまたは複数のマーカの存在が、放射線療法前、放射線療法中、および／または放射線療法後に、ポリペプチドの存在を検出することによって判定される、条項１５０の方法。
【0182】
１５２．当該患者が、ヒトである、条項１５０の方法。
【0183】
１５３．当該細胞試料が、非癌性細胞、癌細胞、前癌性細胞、組織、および器官からなる群から選択される、条項１５０の方法。
【0184】
１５４．癌患者が放射線治療の投与に反応すると予測されるかどうかを判定するための方法であって、
患者からの細胞試料において、
ｉ．カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉ．ＣＰＲ－４遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉｉ．ＣＥＰ－１遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｖ．ｐ５３遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖ．ＤＡＦ－２遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉ．ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉ．ヒトＰＤＫ１キナーゼ遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉｉ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子の少なくとも一部分に対して完全に相補的なポリヌクレオチド、
ｉｘ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子によってコードされたポリペプチド、および
ｘ．ｉｘのポリペプチドの断片、からなる群から選択される、マーカ遺伝子または複数のマーカ遺伝子の遺伝子発現のレベルを検出することを含み、
マーカの発現レベルが、患者がＲＩＢＥを発症しやすいかどうかを示す、方法。
患者からの細胞試料において、
ｉ．カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉ．ＣＰＲ－４遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉｉ．ＣＥＰ－１遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｖ．ｐ５３遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖ．ＤＡＦ－２遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉ．ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉ．ヒトＰＤＫ１キナーゼ遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉｉ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子の少なくとも一部分に対して完全に相補的なポリヌクレオチド、
ｉｘ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子によってコードされたポリペプチド、および
ｘ．ｉｘのポリペプチドの断片、からなる群から選択される、マーカ遺伝子または複数のマーカ遺伝子の遺伝子発現のレベルを検出することを含み、
マーカの発現レベルが、患者がＲＩＢＥを発症しやすいかどうかを示す、方法。
【0185】
１５５．マーカまたは複数のマーカの存在が、放射線療法前、放射線療法中、および／または放射線療法後に、ポリペプチドの存在を検出することによって判定される、条項１５３の方法。
【0186】
１５６．当該患者が、ヒトである、条項１５４の方法。
【0187】
１５７．当該細胞試料が、非癌性細胞、癌細胞、前癌性細胞、組織、および器官からなる群から選択される、条項１５４の方法。
【0188】
１５８．癌対象に投与される放射線治療の効能または有効性を評価する方法であって、
前記方法が、時間ｔｏに対象から得られた第１の試料中で測定されたマーカの発現レベルであって、前記マーカが、
ｉ．カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉ．ＣＰＲ－４遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉｉ．ＣＥＰ－１遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｖ．ｐ５３遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖ．ＤＡＦ－２遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉ．ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉ．ヒトＰＤＫ１キナーゼ遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉｉ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子の少なくとも一部分に対して完全に相補的なポリヌクレオチド、
ｉｘ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子によってコードされたポリペプチド、および
ｘ．ｉｘのポリペプチドの断片、からなる群から選択される、発現レベルと、
時間ｔ１に対象から得られた第２の試料中のマーカのレベルと、を比較することを含み、
第１の試料に対する第２の試料中のマーカのレベルの変化が、放射線治療が対象における癌を治療するために有効であるという指標である、方法。
前記方法が、時間ｔｏに対象から得られた第１の試料中で測定されたマーカの発現レベルであって、前記マーカが、
ｉ．カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉ．ＣＰＲ－４遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｉｉ．ＣＥＰ－１遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｉｖ．ｐ５３遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖ．ＤＡＦ－２遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉ．ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉ．ヒトＰＤＫ１キナーゼ遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｖｉｉｉ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子の少なくとも一部分に対して完全に相補的なポリヌクレオチド、
ｉｘ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子によってコードされたポリペプチド、および
ｘ．ｉｘのポリペプチドの断片、からなる群から選択される、発現レベルと、
時間ｔ１に対象から得られた第２の試料中のマーカのレベルと、を比較することを含み、
第１の試料に対する第２の試料中のマーカのレベルの変化が、放射線治療が対象における癌を治療するために有効であるという指標である、方法。
【0189】
１５９．時間ｔｏが、治療が対象に投与される前であり、時間ｔ１が、治療が対象に投与された後である、条項１５８の方法。
【0190】
１６０．当該患者が、ヒトである、条項１５８の方法。
【0191】
１６１．当該細胞試料が、非癌性細胞、癌細胞、前癌性細胞、組織、および器官からなる群から選択される、条項１５８の方法。
【0192】
１６２．癌対象に投与される放射線治療の効能または有効性を評価する方法であって、
当該方法が、時間ｔｏに対象から得られた第１の試料中で測定されたマーカの発現レベルであって、マーカが、
ｘｉ．カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｉｉ．ＣＰＲ－４遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｉｉｉ．ＣＥＰ－１遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｉｖ．ｐ５３遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｖ．ＤＡＦ－２遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｖｉ．ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｖｉｉ．ヒトＰＤＫ１キナーゼ遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｖｉｉｉ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子の少なくとも一部分に対して完全に相補的なポリヌクレオチド、
ｘｉｘ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子によってコードされたポリペプチド、および
ｘｘ．ｉｘのポリペプチドの断片、からなる群から選択される、発現レベルと、
時間ｔ１に対象から得られた第２の試料中のマーカのレベルと、を比較することを含み、
第１の試料に対する第２の試料中のマーカのレベルの変化が、患者がＲＩＢＥを発症しやすいかどうかについての指標である、方法。
当該方法が、時間ｔｏに対象から得られた第１の試料中で測定されたマーカの発現レベルであって、マーカが、
ｘｉ．カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｉｉ．ＣＰＲ－４遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｉｉｉ．ＣＥＰ－１遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｉｖ．ｐ５３遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｖ．ＤＡＦ－２遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｖｉ．ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｖｉｉ．ヒトＰＤＫ１キナーゼ遺伝子、またはその相同体もしくは変異体と少なくとも８５％の配列同一性を有するマーカ遺伝子、
ｘｖｉｉｉ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子の少なくとも一部分に対して完全に相補的なポリヌクレオチド、
ｘｉｘ．ｉ～ｖｉｉのマーカ遺伝子によってコードされたポリペプチド、および
ｘｘ．ｉｘのポリペプチドの断片、からなる群から選択される、発現レベルと、
時間ｔ１に対象から得られた第２の試料中のマーカのレベルと、を比較することを含み、
第１の試料に対する第２の試料中のマーカのレベルの変化が、患者がＲＩＢＥを発症しやすいかどうかについての指標である、方法。
【0193】
１６３．時間ｔｏが、治療が対象に投与される前であり、時間ｔ１が、治療が対象に投与された後である、条項１６２の方法。
【0194】
１６４．各々がより高い用量の放射線を含む、連続する放射線療法治療を比較することをさらに含む、条項１６３の方法。
【0195】
１６５．最適レベルの放射線を患者に投与することをさらに含み、最適レベルが、治療的に有効な用量であり、当該患者におけるＲＩＢＥ効果を誘導しないか、または制限されたＲＩＢＥ効果を誘導する、レベルである、条項１６４の方法。
【0196】
１６６．当該患者が、ヒトである、条項１６５の方法。
【0197】
１６７．当該細胞試料が、非癌性細胞、癌細胞、前癌性細胞、組織、および器官からなる群から選択される、条項１６２の方法。
【0198】
１６８．ＲＩＢＥの新規治療阻害剤のためのスクリーニングの方法であって、
ＲＩＢＥ誘発性遺伝子導入線形動物を作出することと、
当該遺伝子導入線形動物を、１つ以上の潜在的な治療標的化合物を含有する成長培地上に置くことと、
当該遺伝子導入線形動物の後代における胚致死性および／または幼虫停止を減少させる標的化合物を選択することによってＲＩＢＥを阻害する標的化合物を選択することと、を含む、方法。
ＲＩＢＥ誘発性遺伝子導入線形動物を作出することと、
当該遺伝子導入線形動物を、１つ以上の潜在的な治療標的化合物を含有する成長培地上に置くことと、
当該遺伝子導入線形動物の後代における胚致死性および／または幼虫停止を減少させる標的化合物を選択することによってＲＩＢＥを阻害する標的化合物を選択することと、を含む、方法。
【0199】
１６９．当該ＲＩＢＥ誘発性遺伝子導入線形動物を作出する工程が、Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙの遺伝子導入線形動物もしくはその同等物、またはＣ．ｅｌｅｇａｎｓのプロモータの制御下で、ＣＰＲ－４、ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙを発現する遺伝子導入線形動物もしくはその同等物を作出する工程を含む、条項１６８の方法。
【0200】
１７０．当該選択される潜在的な治療標的化合物が、局所照射試験を通してＲＩＢＥを阻害することがさらに確認される、条項１６８の方法。
【0201】
１７１．ＲＩＢＥの新規治療阻害剤のためのスクリーニングの方法であって、
ＲＩＢＥ誘発性遺伝子導入線形動物を作出することと、
１つ以上の潜在的な治療標的化合物を当該遺伝子導入線形動物に導入することと、
当該遺伝子導入線形動物および／またはその後代に対する局所照射試験を実施することと、を含む、方法。
ＲＩＢＥ誘発性遺伝子導入線形動物を作出することと、
１つ以上の潜在的な治療標的化合物を当該遺伝子導入線形動物に導入することと、
当該遺伝子導入線形動物および／またはその後代に対する局所照射試験を実施することと、を含む、方法。
【0202】
１７２．当該ＲＩＢＥ誘発性遺伝子導入線形動物を作出する工程が、Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙの遺伝子導入線形動物またはその同等物を作出する工程を含む、条項１７１の方法。
【0203】
１７３．当該遺伝子導入線形動物および／またはその後代を、
１つ以上の潜在的な治療標的化合物を含有する成長培地上に置く工程と、
当該遺伝子導入線形動物の後代における胚致死性および／または幼虫停止を減少させる標的化合物を選択することによってＲＩＢＥを阻害する標的化合物を選択する工程と、をさらに含む、条項１７１の方法。
１つ以上の潜在的な治療標的化合物を含有する成長培地上に置く工程と、
当該遺伝子導入線形動物の後代における胚致死性および／または幼虫停止を減少させる標的化合物を選択することによってＲＩＢＥを阻害する標的化合物を選択する工程と、をさらに含む、条項１７１の方法。
【0204】
１７４．当該ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（複数可）ＰＤＫ－１またはＰＤＫ１キナーゼペプチドが、相同体および／またはオルソログおよび／または変異体および／または断片を含む、本明細書に提示されるいずれかの条項に記載される新規組成物、方法、および／またはシステム。
【0205】
１７５．ＲＩＢＥの新規治療モジュレータのためのスクリーニングの方法であって、
動物モデルにおけるＲＩＢＥ誘発性遺伝子導入動物を作出することと、
当該遺伝子導入動物を、１つ以上の潜在的な治療標的化合物を含有する成長培地上に置くことと、
胚致死性、幼虫停止、ゲノムのＤＮＡ損傷、または当該遺伝子導入動物の後代における他のスコア化可能な表現型を含む、いくつかの表現型に影響を与える標的化合物を選択することによってＲＩＢＥに影響を与える標的化合物を選択することと、を含む、方法。
動物モデルにおけるＲＩＢＥ誘発性遺伝子導入動物を作出することと、
当該遺伝子導入動物を、１つ以上の潜在的な治療標的化合物を含有する成長培地上に置くことと、
胚致死性、幼虫停止、ゲノムのＤＮＡ損傷、または当該遺伝子導入動物の後代における他のスコア化可能な表現型を含む、いくつかの表現型に影響を与える標的化合物を選択することによってＲＩＢＥに影響を与える標的化合物を選択することと、を含む、方法。
【0206】
１７６．当該動物モデルが、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、または他の動物モデルからなる群から選択される、条項１７５に記載のＲＩＢＥの新規治療モジュレータのためのスクリーニングの方法。
【0207】
本発明の他の特徴および利点は、図、詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0208】
本特許出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面（複数可）を含む本特許出願公報のコピーは、必要な場合に、必要な料金を支払って特許庁により提供されるであろう。さらに、本開示の上記および他の態様、特徴、および利点は、添付の図と併せて得られる以下の詳細な説明からより良好に理解され、それらのうちのすべては、例示のみの方法によって与えられ、本開示される実施形態を限定するものではない。
【0209】
【図1】ＲＩＢＥ因子の同定。（１ａ）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＲＩＢＥアッセイの概略的提示。（１ｂ～ｃ）。ここで、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）Ｌ４幼虫を、トリプシンプロテアーゼ（５０ｎｇ／μＬ）（ｃ）で処理された、示された用量（ｂ）またはＵＶ－ＣＭ（１００Ｊ／ｍ２）で照射されたＮ２動物由来のＵＶ－ＣＭ中で培養した。４８時間後に生殖細胞の死骸をスコア化した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。スコア化された生殖腺腕の数を、バーの内側に示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、「ｎｓ」、有意でない、両側、不対のｔ検定。（１ｄ～ｅ）。質量分析による分析。濃縮された＞１０ｋＤのＵＶ－ＣＭおよびＵＶ－Ｃｔｒｌ画分を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）および染色した銀（ｄ）上で分解した。ＵＶ－ＣＭ（数でマークされた）に固有のバンドにおけるタンパク質の同一性を示す（ｅ）。（１ｆ）。ＣＰＲ－４：：フラグを、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ動物からＵＶ－ＣＭに分泌した。ＵＶ－ＣＭおよびＵＶ－Ｃｔｒｌ（１μｇ／μＬ）を、ＳＤＳＰＡＧＥ上で分解し、免疫ブロット法（ＩＢ）によって検出した。
【図2】ＲＩＢＥ因子としてのＣＰＲ－４の同定。（２ａ、２ｄ～ｅ）。示された菌株（ａ、ｅ）からの条件培地（０．１μｇ／μＬ）または２．８μＭの組み換えｔＣＰＲ－４タンパク質（ｄ）を使用して、図１ｂのｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物を処理した。（２ｂ～ｃ、２ｆ）。示された菌株（ｂ、ｆ）からの条件培地（０．１μｇ／μＬ）または２．８μＭのｔＣＰＲ－４タンパク質（ｃ）のプロテアーゼ活性。ｔＣＰＲ－４の免疫ブロット法の画像は、以下のｃである。（２ｇ）。ＣＰＲ－４：：フラグを、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ動物からのＩＲ－ＣＭに分泌した。ＳＤＳＰＡＧＥ上で分解されたＩＲ－ＣＭおよびＩＲ－Ｃｔｒｌ（１μｇ／μＬ）を、免疫ブロット法によって検出した。（２ｈ）。示された菌株における相対的なｃｐｒ－４ ｍＲＮＡのレベル（折り畳み構造の変化）を、疑似被照射試料（対照）のものと比較して、定量的なＲＴ－ＰＣＲによって判定した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．（ａ～ｆ、ｈ）である。スコア化された生殖腺腕の数を、バー（ａ、ｄ、ｅ）の内側に示し、他のアッセイ（ｂ、ｃ、ｆ、ｈ）について各群において、ｎ＝６である。＊＊＊Ｐ＜０．００１、「ｎｓ」、有意でない、両側、不対のｔ検定（ａ、ｄ、ｅ、ｈ）。
【図3】ＣＰＲ－４およびＤＡＦ－２は、局所ＵＶ照射（ＬＵＩ）モデルにおいてＲＩＢＥを媒介する。（３ａ）。ＲＩＢＥをアッセイするための動物内モデルの概略的提示。動物の咽頭領域に照射し、示されるように３つの曝露されていない領域におけるＲＩＢＥを分析した。（３ｂ～ｃ）。ＬＵＩを有するか、または有しない、Ｐｈｓｐ－４：：ｇｆｐ動物の代表的な画像（少なくとも２０個）。右上まで動物の尾。スケールバー、５０μｍ。（３ｄ）。異なる発生段階でのＬＵＩに対するＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐ反応のアッセイ。（３ｅ～ｇ）。ＬＵＩの２４時間後のＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐ反応（ｅ）、Ｆ１胚致死性（ｆ）、および後部生殖腺における生殖細胞の死骸（ｇ）について、示された菌株を分析した。ｅにおけるいくつかの実験およびｆにおけるすべての実験を、２５℃で行った。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。動物（ｄ、ｅ）、胚（ｆ）を有するプレート、またはスコア化された生殖腺腕（ｇ）の数を、バーの内側に示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、「ｎｓ」、有意でない、両側、不対のｔ検定（ｄ～ｇ）。
【図4】ＣＰＲ－４は、ＲＩＢＥをもたらすためにＤＡＦ－２を通して作用する。（４ａ～ｂ）。示された菌株のＬ４幼虫を、２．８μＭのｔＣＰＲ－４またはバッファ制御で４８時間処理した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。スコア化された生殖腺腕の数を、バーの内側に示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、「ｎｓ」、有意でない、両側、不対のｔ検定。
【図5】ＵＶまたはイオン化照射（ＩＲ）および精製されたｔＣＰＲ－４タンパク質から作出された条件培地は、胚致死性をもたらす。（５ａ）。疑似照射の対照と比較した、１００Ｊ／ｍ２ＵＶ照射または５００ＧｙのＩＲ後の野生型（Ｎ２）またはｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物の胚致死性割合。（５ｂ）。Ｎ２動物を使用して、ＵＶ－ＣＭ、ＵＶ対照、ＩＲ－ＣＭ、およびＩＲ対照を作出し、これらを使用して、胚致死性アッセイにおける曝露されていないＮ２動物を処理した。（５ｃ）。２．８μＭの組み換えｔＣＰＲ－４タンパク質（野生型または変異体）、０．２７μＭの組み換えヒトカテプシンＢ（ｒｈＣＴＳＢ）、またはバッファ制御を使用して、胚致死性アッセイにおけるＮ２動物を処理した。スコア化された胚の総数：ａの左バーから右バーまで、１７８１、８０５、１２４９、２６４５、５９６、および１８６２個の胚、ｂの左から右まで、２７２１、２４８４、８８０、および７４３、ならびにｃの左から右まで、９７９、８７５、９２９、９３９、９０７、および７７７。６つの独立したアッセイ（ａ、ｂのＵＶ－ＣｔｒｌおよびＵＶ－ＣＭ）および３つの独立したアッセイ（ｂ、ｃのＩＲ－ＣｔｒｌおよびＩＲ－ＣＭ）を各状態について行った。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、「ｎｓ」は、有意でない、両側、不対のｔ検定である。
【図6】ＲＩＢＥ因子の性質および供給源の特徴付け。（６ａ～ｂ）。リボヌクレアーゼ（１μｇ／μＬ）またはデオキシリボヌクレアーゼ（０．０１単位／μＬ）を含む１００Ｊ／ｍ２で照射されたＮ２動物から回収されたＵＶ－ＣＭおよびＵＶ－Ｃｔｒｌの治療は、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物に対するアポトーシス阻害効果を変更しなかった。ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）Ｌ４幼虫の４８時間の治療後に、生殖細胞の死骸をスコア化した。（６ｃ、６ｅ～ｇ）。ここで、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）Ｌ４幼虫を、ｃｅｄ－３（ｎ２４３３）動物（ｃ）、２５℃（ｅ）で成長したｇｌｐ－１（ｅ２１４１ｔｓ）動物、ホルムアルデヒドで処理されたＨＢ１０１細菌（ｆ）、およびＰｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグを供給されたＮ２動物、それぞれ、抗フラグを喪失したか、または喪失していないｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物から調製されたＵＶ－ＣＭおよびＵＶ対照（０．１μｇ／μＬ）で処理した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。スコア化された生殖腺腕の数を、（ａ～ｃ、ｅ～ｇ）の内側に示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、「ｎｓ」、有意でない、両側、不対のｔ検定。（６ｄ）。２５℃で成長したＮ２およびｇｌｐ－１（ｅ２１４１）成体動物の代表的な微分干渉（ＤＩＣ）画像（少なくとも１０）。複数の卵母細胞および受精卵を有するＮ２動物の生殖腺を、破線で示す。ｇｌｐ－１（ｅ２１４１）動物は、視認可能な生殖系列を有しなかった。スケールバーは、１００μｍを示す。（６ｈ）。抗フラグ喪失処理によるか、またはこれによらないＰｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物から調製されたＵＶ－ＣＭおよびＵＶ－Ｃｔｒｌにおける分泌されたＣＰＲ－４：：フラグの免疫ブロット分析。
【図7】ＲＩＢＥ因子としてのＣＰＲ－４の同定。（７ａ）。Ｎ２動物に由来するＵＶ－ＣＭおよびＵＶ－Ｃｔｒｌの完全な培地、＞１０ｋＤの画分、および＜１０ｋＤの画分を使用して、図１ｂのように、生殖細胞の死骸アッセイにおけるｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物を処理した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。スコア化された生殖腺腕の数を、バーの内側に示す。（７ｂ）。ＲＮＡｉのスクリーニングを通したＲＩＢＥ因子としてのＣＰＲ－４の同定。ＲＮＡｉで処理された動物から調製されたＵＶ－ＣｔｒｌおよびＵＶ－ＣＭを使用して、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物を処理した。ＵＶ－Ｃｔｒｌ治療下での平均的な生殖細胞の死骸の数をＵＶ－ＣＭ治療下でのそれから減算することによって、生殖細胞の死骸の減少数（ｙ軸）を計算した。候補遺伝子の中でも特に、ｅｆｔ－３、ｕｂｑ－２、およびａｃｔ－１のＲＮＡｉは、強力な胚致死性をもたらし、本発明者らは、それらのＵＶ－ＣＭを得ることができなかった。ｈｉｓ－１、ｈｉｓ－４、およびｈｉｓ－７１のＲＮＡｉは、部分的な胚致死性をもたらした。各ＲＮＡｉ実験において、２０個の生殖腺腕をスコア化した。（７ｃ）。ＵＶ－ＣＭへのＣＰＲ－４：：フラグの分泌は、同じＰｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ導入遺伝子を保有する被照射Ｎ２動物由来のそれと比較して、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグの単一コピー統合を保有する被照射ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物において、大きく減少した。示された菌株由来の濃縮されたＵＶ－ＣＭまたはＵＶ対照（１μｇ／μＬ）を、フラグエピトープに対する抗体を使用した免疫ブロット分析に供した。（７ｄ）。０．２７μＭの組み換えヒトカテプシンＢ（ｒｈＣＴＳＢ）または２．８μＭの組み換えｔＣＰＲ－４タンパク質のプロテアーゼ活性を、図２ｂのように測定した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である（各アッセイにおいて、ｎ＝６）。（７ｅ）。０．２７μＭのｒｈＣＴＳＢまたはバッファ制御を使用して、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物を処理した。ｒｈＣＴＳＢ緩衝液中に培養された動物は、ｔＣＰＲ－４緩衝液中におけるよりも成長が遅く、生殖細胞の死骸がより少なかった。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である（各アッセイにおいて、ｎ＝２１）。４８時間の治療後に、生殖細胞の死骸をスコア化した（ａ、ｂ、ｅ）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、「ｎｓ」、有意でない、両側、不対のｔ検定（ａ、ｅ）。
【図8】ＵＶ－ＣＭにおけるＣＰＲ－４の同一性を確認するために使用されたＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐからの代表的なＭＳ／ＭＳスペクトル。（８ａ）。ＳＤＳＰＡＧＥゲル（図１ｄ）におけるタンパク質バンド６のトリプシンペプチドを、ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐを使用して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＭＳ／ＭＳ分析によって同定され、ＣＰＲ－４のアミノ酸配列に合致したペプチドのアミノ線配列に、赤色で下線を引いている。（８ｂ）。ａで同定された２つのペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。Ｓｃａｆｆｏｌｄ３検索エンジンを使用して、観察された断片化イオンの特異的アミノ酸残基への割り当てを行い、検索結果をＭＳ／ＭＳスペクトルの下に示す。より低いケース「ｃ」は、トリプシンペプチド中のカルバミドメチル修飾システイン残基を示す。
【図9】ヒトおよびマウスのカテプシンＢおよびＣＰＲ－４のｃｐｒ－４欠失変異および配列アラインメント。（９ａ）。ｃｐｒ－４遺伝子構造およびｔｍ３７１８欠失の概略図。エキソンを青色のボックスとして図示し、イントロンおよび非翻訳領域を線として図示する。赤色のボックスは、４０６ｂｐ ｔｍ３７１８欠失によって削除されたｃｐｒ－４の領域を示す。緑色のボックスは、１２ｂｐ挿入を示す。（９ｂ）。ヒトカテプシンＢ、マウスカテプシンＢ、およびＣＰＲ－４の配列アラインメント。３つすべてのタンパク質において同一である残基に、ピンク色で陰影を付ける。２つの触媒残基に緑色で陰影を付け、これらは、それぞれ、求核試薬として機能するシステイン残基、および基質のペプチド結合の加水分解を促進するための一般塩基として作用する活性部位ヒスチジン残基である。
【図10】ＲＩＢＥを媒介する際の追加の遺伝子の役割の分析。（１０ａ）。局所ＵＶ照射アッセイ。図３に記載の頭部領域の局所照射の２４時間後のバイスタンダＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐ反応について、示された遺伝子型の動物を分析した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。スコア化された動物の数を、バーの内側に示す。（１０ｂ）。ｔＣＰＲ－４治療後の生殖細胞の死骸アッセイ。２．８μＭの組み換えｔＣＰＲ－４タンパク質またはバッファ制御を使用して、図４ａに記載の示された遺伝子型のＬ４幼虫を処理した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。スコア化された生殖腺腕の数を、バーの内側に示す。（１０ｃ）。Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｄａｆ－２（ｅ１７３０）、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物からのＵＶ－ＣＭおよびＵＶ－Ｃｔｒｌにおける分泌されたＣＰＲ－４：：フラグの免疫ブロット分析を、図１ｆのように行った。（１０ｄ）。生殖細胞の死骸アッセイ。ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）Ｌ４幼虫を、ｃから調製されたＵＶ－ＣＭおよびＵＶ対照（０．１μｇ／μＬ）で処理した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。スコア化された生殖腺腕の数を、バーの内側に示す。（１０ｅ）。生殖細胞の増殖アッセイ。Ｎ２およびｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）Ｌ４幼虫を、２．８μＭの組み換えｔＣＰＲ－４またはバッファ制御を含有するＳ培地中で４８時間処理した。生殖系列の有糸分裂ゾーンにおける核および中期の核の数をスコア化した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。ａ、ｂ、ｄ、ｅでは、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、「ｎｓ」、有意でない、両側、不対のｔ検定。
【図11】Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるｃｐｒ－４の発現パターン。（１１ａ～ｇ、および７ｉ）。示された発生段階でＰｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐの単一コピー統合を保有するＮ２動物（ａ～ｇ）またはｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物（ｉ）の代表的なＧＦＰおよびＤＩＣ画像（各々少なくとも１５個）。矢印は、ＧＦＰを示さないか、または非常に不鮮明なＧＦＰを示す胚およびＬ１幼虫を指し示す（ａ、ｂ）。スケールバー、１００μｍ。（１１ｈ）。同じＰｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐ導入遺伝子を保有するＬ４幼虫の代表的なＤＩＣ、ＧＦＰ、およびＤＩＣ／ＧＦＰの併合画像（少なくとも１５）（左欄）、および腸細胞におけるＧＦＰ発現を示す対応する１０倍の拡大画像（右欄）。ＧＦＰは、大部分が核内に見られた（矢印で示す）。スケールバー、それぞれ、１００μｍ（左）および１０μｍ（右）。（１１ｊ）。異なる発生段階のＰｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐおよびｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）、Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐ動物におけるＧＦＰ蛍光の強度を、ＩｍａｇｅＪのソフトウエアを使用して定量化した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。それぞれ、左バーから右バーへ、ｎ＝２８、２８、２４、３１、３０、３３、５２、５２、１９、２８、５２、５２、２４、および２５匹のスコア化された動物。同じ発生段階にある２つの異なる菌株間の差の有意性を、両側、不対のｔ検定によって判定した。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、「ｎｓ」、有意でない。（１１ｋ）。被照射ＵＶによって照射されたか、またはＩｍａｇｅＪを使用した疑似照射された同じ単一コピーのＰｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐ導入遺伝子を保有するＮ２およびｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物におけるＧＦＰ強度の定量化。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。それぞれ、左バーから右バーへ、ｎ＝３８、３７、３２、および３０匹のスコア化された動物。異なる状態間の差の有意性を、両側、不対のｔ検定によって判定した。＊＊＊Ｐ＜０．００１、「ｎｓ」、有意でない。
【図12】ＣＰＲ－４の咽頭の発現が、胚致死性、幼虫停止、および生殖細胞死の減少をもたらしている。（１２ａ～ｂ）。ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ（ａ）およびｔＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ（ｂ）の咽頭の発現を有する成体動物の代表的なＤＩＣおよびｍＣｈｅｒｒｙ画像（少なくとも１０個）。白色の破線は、咽頭の縁を強調している。矢尻は、ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ（ａ）を取り上げた、体腔細胞を含む細胞を示し、これらは、咽頭内で生成され、咽頭から分泌され、おそらく流体で満たされた体腔である擬体腔を通して動物の他の部位に運搬されたのであろう。弱い蛍光（カラーの矢尻で示されている）を有する２対の後部細胞の拡大画像を、対応するカラーを有する破線のボックス内に示す。スケールバー、１００μｍ。（１２ｃ）。Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ（野生型または変異体）またはＰｍｙｏ－２：：ｔＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子を保有する胚または幼虫における胚致死性および幼虫停止のパーセンテージをスコア化した。各構成物について、３つの独立した遺伝子導入株をスコア化した。スコア化された新たに孵化した遺伝子導入Ｌ１の幼虫の数、およびスコア化された遺伝子導入胚の数を、丸括弧で示す。ｃｐｒ－４ ＲＮＡｉで処理したときのＰｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子導入動物において見られる幼虫停止の増加をブロック分けし（表６）、これは、ｃｐｒ－４の発現を低減することが幼虫停止を防止することを示している。すべての動物が、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）およびｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）変異を保有する（ａ～ｃ）。（１２ｄ）。遺伝子導入動物における生殖細胞の死骸の定量化。示された導入遺伝子を保有するＬ４ ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物を、検査前の２４時間の間、一定のＮＧＭプレート上で成長させた。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。スコア化された生殖腺腕の数を、バーの内側に示す。遺伝子導入動物と非遺伝子導入動物との間の差の有意性を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって判定した。＊＊＊Ｐ＜０．００１、「ｎｓ」、有意でない。
【図13】カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）は、ヒト細胞におけるＵＶ誘発性バイスタンダ効果に関わる。（１３ａ）。カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の発現は、ＵＶ照射に反応して調節されない、２９３Ｔ細胞に、示された用量でＵＶを照射した。次に、２４時間後に細胞を回収し、それぞれ、抗ＣＴＳＢおよび抗ＧＡＰＤＨ（負荷制御）抗体を使用した、免疫ブロット分析に供した。（１３ｂ）。被照射２９３Ｔ細胞から回収されたＵＶ条件培地（ＵＶ－ＣＭ）は、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）発現が減少した２９３Ｔ細胞からのものよりも強力な生存促進活性を示す。制御ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）ｓｈＲＮＡを発現する２９３Ｔ細胞から回収されたＵＶ－Ｃｍを使用して、曝露されていないＨｕｈ７細胞を培養した。ＳＲＢアッセイを使用して、Ｈｕｈ７の生存のパーセンテージを測定した。免疫ブロット法によるカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）ノックダウンの効率を右に示した。
【図14】カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）は、ヒト細胞におけるＵＶ誘発性バイスタンダ効果に関わる。（１４ａ）。カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）ｓｈＲＮＡを発現する被照射Ｈｕｈ７細胞から回収されたＵＶ条件培地（ＵＶ－ＣＭ）におけるカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の有意な減少。示されたｓｈＲＮＡを発現するＨｕｈ７細胞に、ＵＶ（４００Ｊ／ｍ２）を照射した。次に、４８時間後にＵＶ－ＣＭを回収し、抗ＣＴＳＢ抗体を使用した免疫ブロット分析に供した。（１４ｂ）。被照射Ｈｕｈ７細胞から回収されたＵＶ－ＣＭは、同様に、細胞の生存を促進する。制御ｓｈＲＮＡまたはＣＴＳＢ ｓｈＲＮＡを発現するＨｕｈ７細胞から回収されたＵＶ－ＣＭを使用して、曝露されていないＨｕｈ７細胞を培養した。ＳＲＢアッセイ（方法）を使用して、Ｈｕｈ７細胞の生存のパーセンテージを測定した。免疫ブロット法によるＣＴＳＢ ｓｈＲＮＡノックダウンの効率を、右に示した。
【図15】ヒトインスリンレセプタは、ヒト細胞におけるＣＴＳＢ誘発性ＲＩＢＥを媒介するために重要である。ｓｈＣｔｒｌおよびｓｈＣＴＳＢを発現するＨｕｈ７細胞に、ＵＶ（４００Ｊ／ｍ２）を照射した。次に、４８時間後にＵＶ－ＣＭを回収し、これを使用して、ｓｈＣｔｒｌまたはｓｈＩＮＳＲを発現する曝露されていないＨｕｈ７細胞を処理した。ＳＲＢアッセイを使用して、Ｈｕｈ７細胞の生存のパーセンテージを測定した。Ｈｕｈ７細胞を、４８時間、ＰＬＫＯ．１－Ｃｔｒｌ（ｓｈＣｔｒｌ）およびＰＬＫＯ．１－ＣＴＳＢ（ｓｈＣＴＳＢ）プラズミドでトランスフェクトした。細胞を洗浄し、新たな培地に置き、ＵＶ放射線（４００Ｊ／ｍ２）に曝露した。さらに４８時間、被照射細胞を培養した。ＵＶ条件培地の上清を回収し、これを使用して、４８時間、ｓｈＣｔｒｌまたはｓｈＩＮＳＲを発現する曝露されていないＨｕｈ７細胞を培養した。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを行って、Ｈｕｈ７細胞の生存のパーセンテージを測定した。
【図16】異なるヒト細胞株は、ＵＶ照射に対して異なる基礎カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）発現レベルおよび異なる感受性を示す。（ａ～ｄ）。細胞に、示された用量でＵＶを照射し、４８時間後に回収し、それぞれ、抗ＣＴＳＢおよび抗ＧＡＰＤＨ（負荷制御）抗体を使用して、免疫ブロット分析に供した。細胞を６ｃｍのプレートに植え付け、完全な培地で一晩インキュベートした。付着性細胞をＰＢＳで一度洗浄し、１．５ｍｌのＰＢＳを補充し（細胞の乾燥を防ぐために）、ＵＶ架橋剤を使用して、示されたＵＶ用量で照射した。照射後、ＰＢＳを廃棄し、新たな完全な培地をプレートに加えた。４８時間後、付着性細胞および浮遊細胞を含むすべての細胞を回収し、溶解し、免疫ブロット分析に供した。
【図17】局所ＵＶ照射動物モデルにおけるヒトカテプシンＢブロックＲＩＢＥのいくつかの阻害剤。統合されたＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐ導入遺伝子を保有するｚｃＩｓ４Ｌ１の幼虫を、４８時間、それぞれ、ＤＭＳＯ（Ｍｏｃｋ）、１ｍＭのＣＡ０７４、ＣＡ０７４Ｍｅ、またはＥ６４で処理した。上記の図３に記載のように、被照射動物の後部の曝露されていない領域における局所ＵＶ照射（ＬＵＩ）に対するＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐバイスタンダ反応のアッセイを行った。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊Ｐ＜０．０５．両側、不対のｔ検定。
【図18】局所ＵＶ照射（ＬＵＩ）によって誘発された染色体ＤＮＡ損傷の阻害。ＤＮＡ損傷の指標であるＨＵＳ－１：：ＮｅｏＧｒｅｅｎ焦点を含む有糸分裂領域における生殖細胞のパーセンテージとして、染色体のＤＮＡ損傷を定量化する。各実験において、少なくとも１５匹の動物をスコア化した。幼虫段階２（Ｌ２）の動物を、薬物で処理した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．であり、ｎ．ｓ．、有意でない、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側、不対のｔ検定。
【図19】局所ＵＶ照射によって誘発された胚致死性の阻害。各実験において、１５００個を超える胚をスコア化した。Ｌ２動物を、薬物で処理した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．であり、ｎ．ｓ．は、有意でないことを示し、＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側、不対のｔ検定。
【図20】特異的抗体を使用した局所ＵＶ照射によって誘発された胚致死性の阻害。各実験において、７００個を超える胚をスコア化した。Ｌ２動物を、ＣＰＲ－４：：フラグタンパク質に対して標的化された抗フラグ抗体で処理した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．であり、ｎ．ｓ．、有意でない、＊＊Ｐ＜０．０１、両側、不対のｔ検定。
【図21】局所ＵＶ照射によって誘発されたストレス反応（Ｐｈｓｐ－４：：ｇｆｐ）の阻害。ストレス反応レポータであるＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐの統合された導入遺伝子からＧＦＰの蛍光強度を測定することによって、被照射動物の後部領域におけるストレス反応を定量化した。各実験において、少なくとも１５匹の動物をスコア化した。Ｌ２動物を、薬物で処理した。データは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．であり、ｎ．ｓ．、有意でない、＊Ｐ＜０．０５、両側、不対のｔ検定。
【図22】スクリーニングされた化合物の化学構造。
【図23】ケルセチンおよび複数のケルセチン類似体の化学構造。
【発明を実施するための形態】
【0210】
好ましい一実施形態では、本発明者らは、アポトーシス阻害および細胞増殖の増加、致死性、ならびにストレス反応を含む複数の典型的なＲＩＢＥ効果を誘発する第１のＲＩＢＥ因子として、ヒトカテプシンＢ相同体である新規および高度に保存されたシステインプロテアーゼＣＰＲ－４を同定した。例えば、哺乳動物において、カテプシンＢがリソソームから分泌されて、アポトーシスの調節を含む細胞外活性を与え、腫瘍性および炎症性疾患状態において役割を果たすことが観察されている。最近の研究ではまた、細胞外カテプシンＢが化学療法中に薬物誘発性アポトーシスに対する乳癌の抵抗力を高めることを示している。したがって、以下に考察される他のものの中でも特に、ＣＰＲ－４およびヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）は共に、放射線治療の効果を改善するための放射線治療および潜在的な治療標的前の、またはその後の結果の新規バイオマーカである。
【0211】
本発明者らは、さらに、誘発された放射線が、ｐ５３／ＣＥＰ－１依存性機序を通してｃｐｒ－４転写、ならびにＣＰＲ－４タンパク質生成および分泌を増加させることを実証している。次に、分泌されたＣＰＲ－４は、老化、ストレス反応、新陳代謝からアポトーシスまで、複数の保存されたシグナル伝達経路にとって重要な意味を持つＤＡＦ－２インスリン／ＩＧＦレセプタの活性を調節することを通して直接または間接的のいずれかで、複数のＲＩＢＥ反応を誘導する。より具体的には、本発明者らは、ＣＰＲ－４が、紫外線（ＵＶ）またはイオン化ガンマ線（ＩＲ）を照射された動物または細胞から分泌され、照射されていない動物における細胞死の阻害および胚致死性の増加をもたらす条件培地における主要な因子であることを示している。
【0212】
本発明者らは、ＣＰＲ－４が、被照射組織に対して遠位の曝露されていない部位にこれらの効果およびストレス反応を引き起こす、新規の機構を記載している。より具体的には、本発明者らは、放射線に反応して、ｐ５３腫瘍抑制因子の遺伝子相同体であるｃｅｐ－１によって調節されるＣＰＲ－４の経路活性を記載している。本発明者らは、さらに、インスリン様成長因子レセプタであるＤＡＦ－２およびその下流のＰＤＫキナーゼを通して作用し、ＲＩＢＥを与えるＣＰＲ－４の活性を記載している。本発明者らはまた、ヒト細胞におけるＲＩＢＥ反応にも関わるヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）システインプロテアーゼを記載している。具体的には、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の発現が、照射に反応して上方調節され、ヒト細胞におけるＵＶ誘発性バイスタンダ効果にも関わることを実証している。
【0213】
ヒトおよび動物系の両方におけるＲＩＢＥの新規伝達物質としてのカテプシンＢ、ＣＰＲ－４、ｐ５３、ｃｅｐ－１、ＤＡＦ－２、他のインスリン様成長因子レセプタ、ＰＤＫ－１キナーゼ、他のＰＤＫキナーゼ、および関連するシグナル変換経路の同定は、標的細胞の殺傷の効能を高め、放射線および放射線療法によって引き起こされる副作用を低減または防止することができる治療方法の開発のための新規標的および／まはマーカを提供し得る。
【0214】
このように、本発明的技術は、さらに、ヒトおよび他の動物におけるＲＩＢＥの増加をもたらす標的分子および分子径を阻害する新規組成物および治療方法の作出に関する。具体的には、本発明的技術は、ＲＩＢＥの伝達物質：カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＰＲ－４、ｐ５３、ＣＥＰ－１、ＤＡＦ－２、他のインスリン様成長因子レセプタ、ＰＤＫ－１キナーゼ、他のＰＤＫキナーゼ、およびこのような先代および後代のＲＩＢＥ伝達物質（以後、概して、標的、標的ペプチド、標的ポリヌクレオチド、標的オリゴヌクレオチド、標的ポリペプチド、標的分子（複数可）、マーカ、バイオマーカ、標的マーカと称される）を含む、それらの関連するシグナル変換経路のうちの１つ以上の同定および阻害を含む。さらなる実施形態は、さらに、上で同定されたＲＩＢＥ伝達物質の１つ以上の相同体または変位体の同定および阻害を含み得る。好ましい一実施形態では、本発明は、ケルセチン、イソケルセチン、および／または他のケルセチン類似体または誘導体によるカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、および／またはその相同体ＣＰＲ－４の同定および阻害である。
【0215】
これらの臨床および医薬用途、具体的には、ＲＩＢＥを治療および／または防止するための治療薬としてのケルセチン、イソケルセチンおよび／または他のケルセチン類似体または誘導体の使用は、標的細胞の殺傷の効能を高めることができ、放射線および放射線療法によって引き起こされた有害な副作用を低減または防止し得る。本発明の特定の他の実施形態は、標的細胞の殺傷の効能を高め、放射線および放射線療法によって引き起こされ、放射線防護のために使用される副作用を低減または防止することができる新規薬物のための迅速かつ有効なスクリーニングに対する診断用途を含み得る。このような用途は、ＲＩＢＥの危険があり得る癌に対する放射線治療を受けた人にとって特に有益であり得る。加えて、このような治療方法を使用して、計画された放射線療法のイベントの前に放射線に曝露された患者において予防的に、または放射線の曝露の危険が高い可能性がある事例において、ＲＩＢＥを直接治療することができる。
【0216】
好ましい一実施形態では、本発明は、さらに、ケルセチンおよび／またはケルセチン類似体／誘導体の活性成分を含むＲＩＢＥの治療および／または防止のための治療薬、より具体的には、以下に示す、以下の一般式（Ｉ）によって表されるケルセチンおよび／またはケルセチン類似体の活性成分、および／または薬学的に許容可能な塩または担体を含む、ＲＩＢＥのための治療薬に関し、式中、
－Ｒ１は、ゲンチオトリオース、グルコピラノース、Ｏ－アラビノフラノース、Ｏ－ジグルコピラノース、Ｏ－ガラクトピラノース、Ｏ－ガラクトシド－ガレート、Ｏ－ゲンチオビオース、Ｏ－グルコピラノース、Ｏ－グルクロニド、Ｏ－ネオヘスペリドース、Ｏ－ラムノピラノース、Ｏ－ルチノース、Ｏ－ソホロース、Ｏ－キシロピラノース、ＯＣＨ３、ＯＨ、ラムノゲンチオビオース、ラムノグルコース、または硫酸塩であり、
－Ｒ２は、ＯＨまたはＯ－グルコピラノースであり、
－Ｒ３は、ＯＣＨ３、ＯＨ、Ｏ－グルコピラリオース、Ｏ－グルクロノピラノース、またはグルコピラノースであり、
－Ｒ４は、ＯＣＨ３またはＯＨであり、
－Ｒ５は、ＯＣＨ３、ＯＨ、Ｏ－グルコピラノース、またはＯ－グルコースである。
－Ｒ１は、ゲンチオトリオース、グルコピラノース、Ｏ－アラビノフラノース、Ｏ－ジグルコピラノース、Ｏ－ガラクトピラノース、Ｏ－ガラクトシド－ガレート、Ｏ－ゲンチオビオース、Ｏ－グルコピラノース、Ｏ－グルクロニド、Ｏ－ネオヘスペリドース、Ｏ－ラムノピラノース、Ｏ－ルチノース、Ｏ－ソホロース、Ｏ－キシロピラノース、ＯＣＨ３、ＯＨ、ラムノゲンチオビオース、ラムノグルコース、または硫酸塩であり、
－Ｒ２は、ＯＨまたはＯ－グルコピラノースであり、
－Ｒ３は、ＯＣＨ３、ＯＨ、Ｏ－グルコピラリオース、Ｏ－グルクロノピラノース、またはグルコピラノースであり、
－Ｒ４は、ＯＣＨ３またはＯＨであり、
－Ｒ５は、ＯＣＨ３、ＯＨ、Ｏ－グルコピラノース、またはＯ－グルコースである。
【化1】
【0217】
一般式（Ｉ）によって表される本発明に含まれるケルセチン類似体／誘導体の中でも特に、よく知られている化合物は、（ｉ）Ｒ２～Ｒ５がＯＨであり、Ｒ１が変化する式Ｉの誘導体群であって、Ｒ１がＯＨであるケルセチン、Ｒ１がＯ－－Ｌ－アラビノフラノースであるアビキュラロシド、Ｒ１がＯ－アラビノピラノースであるキアザベリン、Ｒ１がＯ－β－Ｄ－ガラクトピラノースであるヒペロシド、Ｒ１がＯ－β－Ｄ－ガラクトピラノースであるイソヒペロシド、Ｒ１がＯ－グルコピラノースであるイソクエルシトリン、ＲｘがＯ－［β－Ｄ－グルコピラノシル－（１－４）－α－Ｌ－ラムノピラノース］であるムルチノサイドＡ、Ｒｘが（６－Ｏ－アセチル）－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１－４）－α－Ｌ－ラムノピラノースであるムルチノサイドＡアセテート、Ｒ１がＯ－－Ｌ－ラムノピラノースであるクエルシトリン、Ｒ１がＯ－β－Ｄ－ルチノースであるルチン、Ｒ１がＯ－（２”－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル）－α－Ｌ－ラムノピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－（２”－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル）－α－Ｌ－ラムノピラノシド、Ｒ１がＯ－（６”－Ｏ－ガロイル）－グルコピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－（６”－Ｏ－ガロイル）－グルコピラノシド、Ｒ１がＯ－（６’“－Ｏ－ｐ－クマロイル－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１－２）－α－Ｌ－ラムノピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－（６’“－Ｏ－ｐ－クマロイル－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１－２）－α－Ｌ－ラムノピラノシド）、ＲｘがＯ－Ｄ－グルコピラノシル－（１－６）－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１－４）－α－Ｌ－ラムノピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－Ｄ－グルコピラノシル－（１－６）－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１－４）－α－Ｌ－ラムノピラノシド、ＲｘがＯ－［２”－Ｏ－６’“－Ｏ－ｐ－（７”“－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル）クマロイル－β－Ｄ－グルコピラノシル］－α－Ｌ－ラムノピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－［２”－Ｏ－６’“－Ｏ－ｐ－（７““－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル）クマロイル－β－Ｄ－グルコピラノシル］－α－Ｌ－ラムノピラノシド、Ｒ１がＯ－［６’“－ｐ－クマロイル－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－（１－４）－ラムノピラノース］であるケルセチン－３－Ｏ－［６’“－ｐ－クマロイル－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－（１－４）－ラムノピラノシド］、ＲｘがＯ－［α－Ｌ－ラムノピラノシル（１－２）－α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１－６）－β－Ｄ－グルコピラノース］であるケルセチン－３－Ｏ－［α－Ｌ－ラムノピラノシル（１－２）－α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１－６）－β－Ｄ－グルコピラノシド］、Ｒ１がＯ－［α－ラムノピラノシル（１－４）α－Ｌ－ラムノピラノシル（１－６）β－Ｄ－ガラクトピラノース］であるケルセチン－３－Ｏ－［α－ラムノピラノシル（１－４）－Ｌ－ラムノピラノシル（１－６）β－Ｄ－ガラクトピラノシド］、Ｒ１がＯ－［α－ラムノピラノシル－（１－２）］－［β－グルコピラノシル－（１－６）］－β－Ｄ－ガラクトピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－［α－ラムノピラノシル－（１－２）］－［β－グルコピラノシル－（１－６）］－β－Ｄ－ガラクトピラノシド、ＲｘがＯ－［α－ラムノピラノシル－（１－４）－α－ラムノピラノシル－（１－６）－β－ガラクトピラノース］であるケルセチン－３－Ｏ－［α－ラムノピラノシル－（１－４）－α－ラムノピラノシル－（１－６）－β－ガラクトピラノシド］、Ｒ１がＯ－α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１－２）－β－Ｄ－ガラクトピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１－２）－β－Ｄ－ガラクトピラノシド、Ｒ＿＿がＯ－β－Ｄ－ジグルコピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－β－Ｄ－ジグルコピラノシド、Ｒ１がＯ－β－Ｄ－ガラクトシド－２”－ガレートであるケルセチン－３－Ｏ－β－Ｄ－ガラクトシド－２”－ガレート、Ｒ１がＯ－β－Ｄ－グルコピラノシド－（１－６）－β－Ｄ－ガラクトピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド－（１－６）－β－Ｄ－ガラクトピラノシド、ＲｘがＯ－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１－３）－α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１－６）－β－Ｄ－ガラクトピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－（１－３）－α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１－６）－β－Ｄ－ガラクトピラノシド、Ｒ１がＯ－β－Ｄ－グルクロニドであるケルセチン－３－Ｏ－β－Ｄ－グルクロニド、Ｒ１がＯ－β－Ｄ－キシロピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－β－Ｄ－キシロピラノシド、Ｒ１がＯ－ジグルコピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－ジグルコスピラノシド、Ｒ１がＯ－ゲンチオビオースであるケルセチン－３－Ｏ－ゲンチオビオシド、Ｒ１がＯ－グルコピラノシルガラクトピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－グルコピラノシルガラクトピラノシド、Ｒ１がＯ－ネオヘスペリドースであるケルセチン－３－Ｏ－ネオヘスペリドシド、ＲｘがＯ－ソホロースであるケルセチン－３－Ｏ－ソホロシド、Ｒ１がゲンチオトリオースであるケルセチン－３－ゲンチオトリオシド、ＲｘがＯＣＨ３であるケルセチン－３－メチルエーテル、Ｒ１がラムノゲンチオビオースであるケルセチン－３－ラムノゲンチオビオシド、Ｒｘがラムノグルコースであるケルセチン－３－ラムノグルコシド、およびＲｘが硫酸塩であるケルセチン－３－硫酸塩を含む、誘導体群、（ｉｉ）Ｒが－ＯＨであり、Ｒ２～Ｒ５のうちの３つの官能基が－ＯＨであり、残り１つの官能基が変化する式Ｉの誘導体群であって、Ｒ４がＯＣＨ３であるイソラムネチン、Ｒ３がＯ－β－Ｄ－グルコピラノースであるクエルシメリトリン、Ｒ３がＯＣＨ３であるラムネチン、Ｒ２がＯ－β－Ｄ－グルコピラノースであるケルセチン－５－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド、Ｒ３がＯ－β－Ｄ－グルクロノピラノースであるケルセチン－７－Ｏ－β－Ｄ－グルクロノピラノシド、およびＲ５がＯ－グルコースであるスピレアオシドを含む、誘導体群、（ｉｉｉ）Ｒｘ～Ｒ５のうちの３つの官能基がＯＨであり、残り２つの官能基が変化する式Ｉの誘導体群であって、Ｒ３およびＲ４がＯＣＨ３ケルセチン－３’であるラムナジン、Ｒ４およびＲ５がＯＣＨ３ケルセチン－３である４’－ジ－メチルエーテル、ＲｘおよびＲ４がＯＣＨ３である３’－ジメチルエーテル、ＲｘおよびＲ３がＯＣＨ３であるケルセチン－３、７－ジメチルエーテル、ＲｘがＯ－［２”－Ｏ－（６’“－Ｏ－ｐ－クマロイル）－β－Ｄ－グルコピラノシル］－α－Ｌ－ラムノピラノースであり、Ｒ３がＯ－β－Ｄ－グルコピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－［２”－Ｏ－（６’“－Ｏ－ｐ－クマロイル）－β－Ｄ－グルコピラノシル］－α－Ｌ－ラムノピラノシル－７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド、ＲｘがＯ－［２”－Ｏ－６’“－Ｏ－ｐ－（７”“－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル）クマロイル－β－Ｄ－グルコピラノシル］－α－Ｌ－ラムノピラノースであり、Ｒ３がＯ－β－Ｄ－グルコピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－［２”－Ｏ－６’“－Ｏ－ｐ－（７”“－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル）クマロイル－β－Ｄ－グルコピラノシル］－α－Ｌ－ラムノピラノシド－７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド、ＲｘがＯ－ルチノースであり、Ｒ３がＯ－β－Ｄ－グルコピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－ルチノシド－７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド、ＲがＯ－α－Ｌ－アラビノピラノシルであり、Ｒ３が”Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－α－Ｌ－アラビノピラノシル－７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド、Ｒ１がＯ－ソホロースであり、Ｒ３がＯ－β－Ｄ－グルコピラノースであるケルセチン－７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド－３－Ｏ－ソホロシド、ＲがＯ－ガラクトピラノースであり、Ｒ３がＯ－グルコピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－ガラクトピラノシル－７－Ｏ－ジグルコピラノシド、ＲｘがＯ－グルコピラノースであり、Ｒ３がＯ－グルコピラノースであるケルセチン－３－Ｏ－グルコピラノシル－７－ジグルコピラノシド、Ｒｘがグルコピラノースであり、Ｒ３がグルコピラノースであるケルセチン－３、７－ジグルコピラノシド、Ｒがゲンチオビオースであり、Ｒ３がグルコピラノースであるケルセチン－３－ゲンチオビオシル－７－グルコピラノシド、およびＲおよびＲ５がＯ－β－Ｄ－グルコピラノースであるケルセチン－３、４’－ジ－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド、ならびに（ｉｖ）３つを超える官能基が変化する式Ｉの誘導体群であって、Ｒｘ、Ｒ３、およびＲ５がＯＣＨ３であり、Ｒ２およびＲ４がＯＨであるケルセチン－３、４’，７－トリメチルエーテル、およびＲｘ、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５がＯＣＨ３であり、Ｒ２がＯＨであるケルセチン－３、３’、４’、７－テトラメチルエーテルを含む、誘導体群として分類される。
【0218】
好ましい一実施形態では、本発明は、さらに、ケルセチンの活性成分を含むＲＩＢＥのための治療薬、より具体的には、ヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の活性を有効に阻害する以下の式（ＩＩ）によって表されるケルセチンの活性成分を含むＲＩＢＥのための治療薬に関する。
【化2】
【0219】
別の好ましい実施形態では、本発明は、さらに、イソケルセチンの活性成分を含むＲＩＢＥのための治療薬、より具体的には、ヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の活性を有効に阻害する以下の式（ＩＩＩ）によって表されるイソケルセチン化合物の活性成分を含む、ＲＩＢＥのための治療薬に関する。
【化3】
【0220】
上記の一般式（Ｉ）のＲｘ～Ｒ５における同じＯＨ基を有するケルセチンは、自然界における４０００種を超える植物に見られるフェノール化合物であり、フィトエストロゲンのうちの１つとして知られている。それは、共鳴構造および３０２．３３ｇ／モルの分子量を有するＣＸ５ＨＸＯＯ７の分子式を有し、１９３６年の化学構造の同定によりビタミンＰとしても知られている。ケルセチンは、砂糖がβ結合を介して結合されるグリコシドであるルチンであり、クローバーの花、一般的なブタクサの花粉、ならびに様々な植物のさやおよび茎などの植物中に、ならびにタマネギ、ケール、ブロッコリー、レタス、トマト、およびリンゴにおいて広く分布している。ケルセチンは、毛細血管の壁一体性および毛細血管の抵抗力の維持において重要な役割を果たす（Ｇａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＩＩ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ，ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２８０：１－１５，１９８８；Ｈａｖｓｔｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３２：１１４１－１１４８，１９８３（そのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）のみならず、抗酸化活性、ビタミンＰの活性、紫外線吸収活性、抗高血圧活性、抗不整脈活性、抗炎症活性、抗アレルギー活性、抗コレステロール活性、肝毒性に対する抑制活性、および不妊に対する治療効果を有するものと評価されており、したがって、ケルセチンを、食品、医療および医薬製品、ならびに化粧品において広く使用することが期待され得る。しかしながら、ＲＩＢＥの防止および治療のためのケルセチンの使用についての報告は存在していない。ケルセチン誘導体の活性成分を含む本発明のＲＩＢＥのための治療薬を、本明細書に例示する。
【0221】
カテプシンＢの活性を阻害することができ、かつ／またはヒトにおけるＲＩＢＥを阻害もしくは調整することができる追加の化合物は、図２２または２３において同定されるものを含み得る。例えば、別の好ましい実施形態では、本発明は、さらに、Ｅ６４の活性成分を含むＲＩＢＥのための治療薬、より具体的には、ヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の活性を有効に阻害し得る以下の式（ＩＶ）によって表されるＥ６４化合物の活性成分を含むＲＩＢＥのための治療薬に関する。
【化4】
【0222】
別の好ましい実施形態では、本発明は、さらに、ＣＡ０７４の活性成分を含むＲＩＢＥのための治療薬、より具体的には、ヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の活性を有効に阻害し得る以下の式（Ｖ）によって表されるＣＡ０７４化合物の活性成分を含むＲＩＢＥのための治療薬に関する。
【化5】
【0223】
別の好ましい実施形態では、本発明は、さらに、ＣＡ０７４の活性成分を含むＲＩＢＥのための治療薬、より具体的には、ヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の活性を有効に阻害し得る以下の式（ＶＩ）によって表されるＣＡ０７４化合物の活性成分を含むＲＩＢＥのための治療薬に関する。
【化6】
【0224】
上述のように、ＲＩＢＥの防止および治療のための本明細書で同定された化合物または化合物の類似体のうちのいずれかの使用についての報告は存在していない。ケルセチン誘導体の活性成分を含む本発明のＲＩＢＥのための治療薬を、本明細書に例示する。類似体および／または誘導体（これらの用語は一般に相互変換可能である）も、特に本発明的技術に含まれる。
【0225】
ヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の活性に対するケルセチンおよびその類似体／誘導体の効果を評価するために、本発明者らは、ケルセチンおよびイソケルセチンの類似体の効果を比較し、ケルセチンおよびイソケルセチンの両方がＣＴＳＢの活性を阻害し、結果として、放射線の曝露に反応したＲＩＢＥの伝播を阻害および／または妨害することを発見した。
【0226】
好ましい実施形態では、ＲＩＢＥの治療、防止、または改善のための治療方法および／または組成物の一部として本明細書に記載の１つ以上のケルセチン、イソケルセチン、および／または他のケルセチン類似体／誘導体を、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、線維素グリコール酸カルシウム、デンプングリコール酸ナトリウムなどの崩壊剤、コーンスターチ、ラクトース、大豆油、結晶セルロース、マンニトールなどの賦形剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤、スクロース、果糖、ソルビトール、アスパルテームなどの甘味料、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、α－またはβ－シクロデキストリン、ビタミンＣ、クエン酸、白ろうなどの安定剤、パラオキシメタル安息香酸塩、パラオキシプロピル安息香酸塩、安息香酸ナトリウムなどの防腐剤、およびエチルバニリン、マスキング風味、フラボノメントール、ハーブ風味などの芳香族化合物を含む、薬学的に許容可能な賦形剤と混合して、錠剤、カプセル、軟カプセル、液体、軟膏、ピル、粉末、懸濁液、乳濁液、シロップ、座薬、または注射などの経口または非経口投与のための医薬製剤を調製し得る。本発明の医薬製剤の非経口投与のために、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内注射を用いることができる。非経口投与のために、ケルセチン誘導体を、水中で安定剤または緩衝液と混合して、アンプルまたはバイアルの単一用量の製剤として生成され得る溶液または懸濁液を調製し得る。
【0227】
一実施形態では、ＲＩＢＥの治療のための治療薬として、治療的に有効な量のケルセチン、イソケルセチン、またはそれらの類似体は、２～２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは８～１２ｍｇ／ｋｇであり得、これを、患者の年齢、性別、重症度、投与方法、または防止の目的に応じて、１日１回超、患者に投与し得る。しかしながら、代替的な実施形態は、０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ未満、または１００ｍｇ／ｋｇ超を含み得る。ケルセチンという用語は、本明細書で言及される場合、また具体的にはＲＩＢＥまたはＲＩＢＥ関連の症状／効果などの治療のための治療薬／化合物として考察された場合、ケルセチン、イソケルセチン、ケルセチンの類似体／誘導体、またはケルセチン、イソケルセチン、および／もしくはケルセチンの類似体／誘導体の混合物もしくは組み合わせ、または本明細書で同定された他の化合物を意味し得ることが留意されるべきである。
【0228】
本発明の組成物に含まれるＲＩＢＥの治療のための治療薬として、治療的に有効な量のケルセチン、イソケルセチン、またはそれらの類似体を、１人１日当たり、０．１～２０ｇ、好ましくは０．３～１０ｇの酵素で処理されたルチン摂取量をガイドとして使用して決定することができる。体重ｋｇ当たり、例えば、０．００２～４００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．００６～２００ｍｇ／ｋｇの摂取量を与えるために、前述の量を決定することもできる。代替的に、組成物の総重量に基づいて、０．００１～９５重量％、好ましくは０．０１～８０重量％の範囲にあるように、前述の量を決定することができる。
【0229】
本明細書で使用される専門用語は、実施形態を記載するためのものであり、限定することを意図していない。本明細書で使用される場合、単数形「１つ」、「および」、および「その」は、内容および文脈が別段明確に示していない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「標的分子」の参照は、２つ以上のそのような標的分子の組み合わせを含み得る。別段定義されない限り、すべての科学的および技術的用語は、それらが関連する技術分野において一般に使用されるものと同じ意味を有するものとして理解されるべきである。
【0230】
本明細書で使用される場合、生物学的マーカ（「バイオマーカ」または「マーカ」）は、通常の生物学的プロセス、病原性プロセス、またはＮＩＨ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（１９９８）と一致する治療的介入に対する薬理学的反応の指標として客観的に測定および評価される特性である。マーカはまた、特定の生物学的プロセスを示す特性のパターンまたは集合を含み得る。バイオマーカ測定は、特定の生体イベントまたはプロセスを示すように増加または減少することができる。加えて、バイオマーカ測定が、典型的に、特定の生物学的プロセスがないときに変化する場合、定数測定は、そのプロセスの発生を示し得る。
【0231】
本発明の標的分子またはマーカは、診断および予測の目的のために、ならびに治療、薬物スクリーニング、および患者の層別化の目的のために（例えば、評価のために患者を「サブセット」にグループ分けする）、ならびに本明細書に記載の他の目的のために使用することができる。
【0232】
本発明は、報告されたマーカと癌細胞の放射線感受性または放射線抵抗力との間の相関関係に依存するすべての組成物および方法を含む。このような方法は、癌患者または腫瘍が、放射線治療の投与に反応することが予測されるかどうかを判定するための方法、ならびに放射線治療の効能を評価するための方法を含む。追加の方法は、癌患者または腫瘍が、患者におけるＲＩＢＥ媒介効果、ならびにおそらく照射の場所、量、および種類に相関するＲＩＢＥ媒介効果のレベルまたは重症度を示すことによって、放射線治療の投与に反応することが予測されるかどうかを判定することを含み得る。このような診断情報を使用して、放射線治療の投与に反応することが予測される通常の曝露されていない細胞に対するＲＩＢＥを低減または改善しながら、例えば、癌細胞をより有効に治療または殺傷することができる。この診断活動は、生体内または生体外で行われ得る。
【0233】
対象に、ＣＴＳＢなどのバイオマーカの活性または発現を変更する治療的に有効な量の薬剤を投与することによって、放射線治療の効能を改善するための方法をさらに含む。この文脈において、「有効」という用語は、ＲＩＢＥの兆候もしくは症状を低減または緩和すること、ＲＩＢＥの臨床経過を改善すること、癌細胞の殺傷を高めること、またはＲＩＢＥの任意の他の客観的もしくは主観的標識を低減することを含むように広く理解されるべきである。異なる薬物、用量および送達経路を、異なる薬物投与状態を使用する方法を行うことによって評価することができる。マーカを、医薬組成物として、またはキットにおいて使用することもできる。マーカを使用して、それらの発現を調整する候補化合物をスクリーニングすることもできる。
【0234】
一実施形態では、本発明は、照射に反応する１つ以上のマーカの発現を利用する、ＲＩＢＥのための新規診断アッセイのための方法およびシステムを含み得る。この好ましい実施形態では、患者からの細胞および／または組織を、例えば、生検を通して抽出することができる。これらの細胞／組織は、本質的に癌性または非癌性であり得、患者の複数の異なる場所から採取され得る。これらの細胞を、可変レベルの放射線に曝露することができる。照射に反応するＣＴＳＢなどの１つ以上のマーカの発現レベルを、測定および定量化することができる。この測定は、ＲＩＢＥを発症しやすい細胞および／または患者、ＲＩＢＥ媒介マーカ／標的が曝露され、曝露され始めるポイントでの閾値、およびそれらが曝露されるレベルを実証し得る。図１６に実証されるように、この例において、治療における照射に反応するＣＴＳＢの発現のレベルは、放射線の曝露のレベル、ならびに細胞型に基づいて異なる発現を示した。この実施形態では、診断アッセイを、放射線療法前、中、および後に患者の細胞または組織に対して行って、放射線療法治療を最適化して、最大の癌細胞の殺傷を達成し、ＲＩＢＥなどの副作用を最小化することができる。例えば、ＲＩＢＥマーカ／伝達物質について高閾値を示す患者または癌細胞は、放射線療法に対するより高くより長い曝露に耐性がある可能性があり、その逆も含む。このように、放射線療法の手順をカスタマイズして、ＲＩＢＥおよび／または他の副作用に対する患者の持続可能性に合わせることができる。
【0235】
本発明的技術の特定の実施形態では、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢなどの標的または標識タンパク質は、「完全なタンパク質」または１つ以上のタンパク質断片を包含し得る。本発明の方法を使用して、列挙された分子の断片、ならびに列挙された分子全体を含有する分子、または少なくともそれらの重要な部分（例えば、測定された固有のエピトープ）、およびタンパク質の修飾形態を評価することができる。したがって、そのような断片、より大きい分子および修飾形態が、本発明の範囲内に含まれる。例えば、標的分子ＣＴＳＢ、ＣＰＲ－４、ｐ５３、ＣＥＰ－１、ＤＡＦ－２、他のインスリン様成長因子レセプタ、ＰＤＫ－１キナーゼ、他のＰＤＫキナーゼ、およびそれらの関連するシグナル変換経路は、標的タンパク質、タンパク質断片、エピトープ、触媒部位、シグナル伝達部位、局在化部位などを含み得る。
【0236】
本発明は、ＣＰＲ－４およびＣＴＳＢならびに癌細胞の放射線感受性（または放射線抵抗力）など、報告された標的分子間の相関関係に依存するすべての組成物および方法を含む。本発明は、ＣＰＲ－４およびＣＴＳＢならびに癌細胞の放射線感受性（または放射線抵抗力）など、報告された標的分子間の相関関係、ならびにＲＩＢＥの治療のための治療薬としての、ケルセチンまたはその類似体の投与に依存するすべての組成物および方法を含む。このような方法は、癌患者が、放射線治療の投与に反応することが予測されるかどうかを判定するための方法、および放射線治療の効能を評価するための方法を含む。さらなる実施形態は、癌患者が、ケルセチン、および／またはケルセチン類似体の投与に反応することが予測されるかどうかを判定するための方法、ならびにＲＩＢＥのための治療としての、ケルセチンおよび／またはケルセチン類似体の投与の効能を評価するための方法を含む。一実施形態では、ＣＴＳＢの発現は、放射線療法を受ける前の患者、または重度のＲＩＢＥを有し、おそらく化学療法に対する抵抗力を生じる患者における臨床結果の予測子であり得るように測定され、かつ／または特徴付けられ得る。対象に、ＣＴＳＢなどの１つ以上の標的分子の活性または発現を阻害する治療的に有効な量のケルセチン、イソケルセチンおよび／またはケルセチン類似体を投与することによって、放射線治療の効能を改善するための方法をさらに含む。
【0237】
対象に、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１、および／またはＰＤＫ１キナーゼなどの１つ以上の標的分子の活性または発現を変更する治療的に有効な量の薬剤を投与することによって、放射線治療の効能を改善するための方法をさらに含む。この文脈において、用語。この文脈において、「有効」または「治療的に有効」という用語は、ＲＩＢＥの兆候もしくは症状を低減または緩和すること、ＲＩＢＥの臨床経過を改善すること、またはＲＩＢＥの任意の他の客観的もしくは主観的標識を低減することを含むように広く理解されるべきである。また、癌の兆候もしくは症状を低減または緩和すること、疾患の臨床経過を改善すること、または低減疾患の任意の他の客観的もしくは主観的標識を低減すること、化学療法に対する癌細胞の抵抗力を減少させること、化学療法もしくは放射線療法治療のための通常の非標的細胞の耐性を増加させること、または化学療法および／もしくは放射線療法の有効性を増加させることを含む。異なる薬物、用量および送達経路を、異なる薬物投与状態を使用する方法を行うことによって評価することができる。分子標的はまた、医薬組成物として、またはキットにおいて使用することもできる。標的はまた、それらの発現を調製する候補化合物をスクリーニングするために使用することもできる。
【0238】
本発明のさらなる実施形態は、対象に、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）、ＰＤＫ－１および／またはＰＤＫ１キナーゼなどの１つ以上の標的分子の活性または発現を変更する治療的に有効な量の薬剤を投与することによって、化学療法の効能を改善するための方法を含む。この文脈において、「有効」という用語は、化学治療薬に対する患者の抵抗力を低減すること、癌の兆候もしくは症状を低減または緩和すること、患者の臨床経過を改善すること、または疾患の任意の他の客観的もしくは主観的標識を低減することを含むように広く理解されるべきである。異なる薬物、用量および送達経路を、異なる薬物投与状態を使用する方法を行うことによって評価することができる。分子標的はまた、医薬組成物として、またはキットにおいて使用することもできる。標的はまた、それらの発現を調製する候補化合物をスクリーニングするために使用することもできる。
【0239】
本出願で使用される場合、１つ以上の標的の発現もしくは活性を変更する、または変更すること、という用語は、ＣＴＳＢまたはＣＰＲ－４などの標的の発現または生物学的活性を低減することを含み得る。さらなる実施形態では、１つ以上の標的の発現もしくは活性を変更する、または変更すること、という用語は、ＣＴＳＢまたはＣＰＲ－４、またはシグナル経路における他の成分などの標的の発現もしくは生物学的活性の増加を含み得る。これらの実施形態では、活性または生物学的活性は、例えば、標的タンパク質またはｍＲＮＡの酵素活性を変更することを含み得る。さらなる実施形態は、標的タンパク質の活性が低減または増加されるような標的タンパク質の形状または構造を変更することを含み得る。またさらなる実施形態では、１つ以上の標的を変更する、または変更すること、という用語は、シグナル経路に関わる上流または下流の標的または他のレセプタまたは分子の減少または増加を含み得る。この実施形態では、標的の発現または活性を変更すると、１つ以上の対応するシグナル経路およびそれらの構成成分を増幅および／または抑制し得る。さらなる実施形態では、１つ以上の標的の発現もしくは活性を変更する、または変更すること、という用語は、他の分子またはレセプタとの結合親和性を増加または減少させること、ならびに分泌される標的の能力または細胞、組織、器官、または生物内のその移動の変化を含み得る。このような分泌の変更はまた、分泌依存分子および／またはシグナル経路および／または細胞／膜トランスポーターの選択的または一般的なブロッキングを通して達成され得る。
【0240】
本明細書に記載の標的分子は、皮膚検査、ダーモスコピー、リンパ節検査、胸部ｘ線、胸部、頭部、腹部、または骨盤のＣＴスキャン、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、および／または血清乳酸脱水素酵素血液検査などの癌の他の兆候、症状、および臨床試験と組み合わせて測定および／または使用されることが予測される。本明細書に特に列挙されていないものを含む、当該技術分野で知られている任意の他の標的と共に、本発明の標的分子の測定および／または使用は、本発明の範囲内に該当する。
【0241】
本明細書で使用される場合、「ＣＴＳＢ遺伝子発現」のレベルまたは「ＣＴＳＢタンパク質の発現レベル」などの「遺伝子発現」または「タンパク質の発現」という句は、試料中、細胞中、患者内に存在し、試料中に分泌され、細胞から分泌された遺伝子転写物またはタンパク質の量に関連する任意の情報、ならびに遺伝子またはタンパク質が生成さるか、または蓄積しているか、または分解される速度についての情報（例えば、レポータ遺伝子データ、核流出実験からのデータ、パルスチェイスデータなど）を含む。特定の種類のデータは、遺伝子およびタンパク質の両方発現に関するものと見られるであろう。例えば、細胞中のタンパク質のレベルは、タンパク質のレベルならびに転写のレベルを反映しており、このようなデータは、「遺伝子またはタンパク質の発現情報」という句によって含まれることが意図される。このような情報は、細胞当たりの量、無名の測定単位における対照遺伝子またはタンパク質に対する量などの形態で与えられる場合があり、「情報」という用語は、任意の特定の表現手段に限定されるべきではなく、関連する情報を提供する任意の表現を意味することが意図される。「発現レベル」という用語は、データが、遺伝子転写物の蓄積またはタンパク質の蓄積またはタンパク質の合成速度などを対象としているかに関わらず、遺伝子またはタンパク質の発現データに反映されているか、またはここから導き出せる分量を指す。
【0242】
本明細書で使用される場合、化合物は、本質的に関連する少なくとも１つの成分から分離された場合に「単離した」と称される。例えば、代謝産物は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および他の代謝産物を含む、汚染物質から分離された場合に単離したと考えられ得る。単離した分子は、合成によって調製されるか、またはそれらの自然環境から精製されるかのいずれかであり得る。当該技術分野で知られている標準的な定量化の方法論を用いて、本発明の分子を得、これらを単離することができる。
【0243】
本発明の標的分子またはタンパク質の相同体および対立遺伝子は、従来の技術によって同定され得る。本明細書で使用される場合、ポリペプチドに対する相同体は、同定されたポリペプチドと高程度の構造的類似性を有するヒトまたは他の動物由来のポリペプチドである。本明細書で同定されたポリペプチド標的のヒトおよび他の生物の相同体の同定は、当該技術分野の同定によく見られるものであろう。
【0244】
本明細書で同定された標的分子遺伝子によってコードされるポリペプチドは、単一のポリペプチドまたは複合ポリペプチドを反映し得る。したがって、別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のタンパク質標的分子の断片、前駆体、後代、または修飾形態であるポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、前述の断片、前駆体、後代、または修飾ポリペプチドを含むタンパク質標的分子を含む。本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「断片」は、ポリペプチドの配列の少なくとも５つの連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、または少なくとも３０個の連続したアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む、単一のアミノ酸または複数のアミノ酸残基を指す。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの「断片」は、ポリヌクレオチドの配列の少なくとも１５個の連続した核酸残基、少なくとも３０個の連続した核酸残基、少なくとも６０個の連続した核酸残基、または少なくとも９０％を有する核酸配列を含む、単一の核酸または核酸残基のポリマーを指す。いくつかの実施形態では、断片は、抗原性断片であり、断片のサイズは、抗体によって認識されるエピトープが直鎖状エピトープまたは構造エピトープであるかなどの因子によるであろう。したがって、いくつかの抗原性断片は、より長いセグメントからなり、他の抗原性断片は、より短いセグメント（例えば、ポリペプチドの最大全長の各整数を含む、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個以上のアミノ酸長）からなるであろう。当業者は、タンパク質の抗原性断片を選択するための方法に精通している。
【0245】
いくつかの実施形態では、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ、ＰＤＫ－１およびＰＤＫ１キナーゼなどの標的分子は、１つ以上の生物学的経路のメンバーである。本明細書で使用される場合、「前駆体」または「後代」という用語は、生物学的経路において標的ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの前または後に生じる分子を指す。したがって、いったんポリペプチド標的またはポリヌクレオチド標的が１つ以上の生物学的経路のメンバーとして同定されると、本発明は、生物学的経路の追加の前駆体または後代のメンバーを含み得る。このような生物学的経路およびそれらのメンバーの同定は、当該技術分野の範囲内にある。
【0246】
追加的に、本発明は、本発明の標的ポリペプチド分子と実質的に同様の配列を有するポリペプチドを含む。本明細書で使用される場合、２つのポリペプチドは、それらのアミノ酸間に、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、および好ましくは１００％の配列同一性がある場合、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが厳格なハイブリダイゼーション状態下で互いに安定した二本鎖を形成することができる場合に、「実質的な配列同一性」を有する。例えば、保存的アミノ酸置換がポリペプチド中で行われ、前述の標的ポリペプチドの機能的の同等の変異体を提供し得、すなわち、変異体は、ポリペプチドの機能的能力を保持し得るか、または保持しない場合がある。本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷またはサイズ特性を変更しないアミノ酸置換を指す。変異体は、そのような方法をまとめた参考文献において見られるような、当業者に知られているポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得る。
【0247】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さの核酸残基の単一ヌクレオチドまたはポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体を含有し得、二本鎖または一本鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾核酸（例えば、メチル化）、核酸類似体、または非天然に生じる核酸を含むことができ、非核酸残基によって中断され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、任意の配列の遺伝子、遺伝子断片、ｃＤＮＡ、単離ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、単離ＲＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、プライマ、プローブ、プラズミド、およびベクタを含む。天然であるか、または介入によるかに関わらず、修飾された核酸ポリマーが、定義内に含まれる。
【0248】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の標的ポリヌクレオチド分子と実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。２つのポリヌクレオチドは、それらのアミノ酸配列間に少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、もしくは少なくとも９９％の配列同一性がある場合、またはポリヌクレオチドが厳格なハイブリダイゼーション状態下で互いに安定した二本鎖を形成することができる場合に、「実質的な配列同一性」を有する。このような状態は、当該技術分野でよく知られている。ポリペプチドに関して上に記載のように、本発明は、対立遺伝子変異体であるポリヌクレオチド、ＳＮＰの結果、または遺伝暗号の退縮に固有の天然の材料に存在するものに対する代替的なコドンにおける結果を含む。
【0249】
本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、患者からの試料において、１つ以上の標的分子の遺伝子発現のレベルを検出することであって、標的の発現レベルが、患者が放射線治療の投与に反応し、かつ／またはＲＩＢＥプロセスに対していくぶん抵抗力があるかどうかを示す、検出することを含む。別の実施形態では、本方法は、患者からの試料において、ＣＴＳＢ活性などのタンパク質のレベルを検出することであって、標的の活性レベルが、患者が放射線治療の投与に反応し、かつ／またはＲＩＢＥプロセスに対していくぶん抵抗力があるかどうかを示す、検出することを含む。別の実施形態では、本方法は、患者からの試料において、ＣＴＳＢ遺伝子などの遺伝子配列を検出することであって、標的遺伝子の配列が、患者が放射線治療の投与に反応し、かつ／またはＲＩＢＥプロセスに対していくぶん抵抗力があるかどうかを示す、検出することを含む。
【0250】
例えば、一実施形態では、ＣＴＳＢタンパク質は、配列番号１を含み得る。
【化7】
【0251】
配列番号１はまた、このタンパク質の配列およびその少なくとも８０％の相同性を有するものを作出し得る核酸配列を含む、配列番号１のすべての相同体を含む。
【0252】
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、任意の体液または組織（例えば、血清、血漿、血液、脳脊髄液、尿、唾液、癌組織、健常な組織）由来の試料を含む。本明細書で使用される場合、「患者」、「対象」という用語は、「癌を有する対象または患者」および「癌患者または対象」「感放射線患者」「放射線治療を必要とする患者」を含み、「放射線に曝露された人」および「放射線に曝露され得る人」は、癌を罹患していると診断されたか、放射線療法を受けたか、現在放射線療法を受けているか、将来放射線療法を受け得るか、またはあるレベルの放射線に曝露されたか、または将来曝露され得る対象を指すことを意図している。「対象」は、対象となる任意の生物、一般に、マウス、線形動物、および好ましくはヒト対象などの哺乳動物の対象である。
【0253】
本発明の標的分子および治療組成物は、放射線の曝露および／または放射線療法から生じるＲＩＢＥプロセスを予測するために有用である。本発明の標的分子および治療組成物はまた、放射線療法が癌または他の疾患状態に対する有効な治療であり得るかどうかを判定するために有用である。本発明の標的分子および治療組成物は、限定されないが、膀胱癌、肺癌、頭頸部癌、神経膠腫、膠肉腫、悪性星状細胞腫、髄芽腫、肺癌、小細胞肺癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、脊索腫、咽頭癌、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、膵癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、精巣腫瘍、ウィルムス腫瘍、ユーイング腫瘍、膀胱癌、血管肉腫、皮肉腫、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺肉腫、嚢胞腺肉腫、気管支原性肺癌、髄様癌、肥満細胞腫、中皮腫、滑膜腫、黒色腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、乏突起神経膠腫、聴神経腫瘍、血管芽細胞腫、髄膜腫、松果体腫、上衣細胞腫、頭蓋咽頭腫、上皮癌、胚性癌腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、線維肉腫、粘液腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および白血病を含む、複数の癌の種類において放射線の結果を予測するために有用である。
【0254】
本発明はまた、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであるかどうかに関わらず、ＣＴＳＢなどの標的分子に特異的に結合する試薬、化合物、薬剤、または分子を包含する。本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、結合対（例えば、抗体および抗原またはアプタマーおよびその標的）間の相互作用を指す。いくつかの実施形態では、相互作用は、最大１０～６モル／リットル、最大１０～７モル／リットル、または最大１０～８モル／リットルの親和定数を有する。他の実施形態では、「特異的に結合する」という句は、あるタンパク質から別のタンパク質（例えば、抗体、その断片、または抗原に対する結合相手）への特異的結合を指し、任意の標準的なアッセイ（例えば、免疫アッセイ）によって測定される結合のレベルは、アッセイのための背景対照よりも統計的に有意に高い。例えば、免疫アッセイを行う場合、対照は、典型的に、抗体または抗原結合断片のみ（すなわち、抗原が存在しない場合）を含有する反応ウエル／チューブを含み、抗原が存在しない場合のその抗体または抗原結合断片によるある量の反応性（例えば、ウエルに対する非特異的結合）が背景にあると考えられる。結合は、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロットアッセイなど）を含む、当該技術分野における様々な標準的な方法を使用して測定され得る。
【0255】
本発明の標的のうちの１つ以上に結合し得る分子は、抗体、アプタマー、および抗体誘導体または断片を含む。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に存在するエピトープに結合することができる免疫グロブリン分子を指す。本用語は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体などの無傷の免疫グロブリン分子のみならず、二重特異的抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗特発性（抗ＩＤ）抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、融合タンパク質、および必要とされる特異性の抗原認識部位を含む前述の任意の改変も包含することを意図している。
【0256】
本明細書で使用される場合、アプタマーは、標的の結合、標的の触媒的な変化、標的または標的の機能的活性を改変／または変更する方法での標的との反応、自殺阻害剤におけるような標的への共有結合、標的と別の分子との間の反応の促進を含むがこれらに限定されない、標的に対する望ましい作用を有する非天然に生じる核酸分子またはペプチドである。一実施形態では、抗体、抗体誘導体もしくは断片、またはアプタマーは、１つ以上の標的分子の断片、修飾、前駆体または後代である成分に特異的に結合する。
【0257】
本発明の別の態様は、標的分子、標的に対して特異的な結合分子（例えば、抗体またはアプタマー）、標的の阻害剤、またはケルセチン、イソケルセチン、もしくはそれらの類似体の投与を通して、ＣＴＳＢなどの標的分子のレベルもしくは活性を増加または減少させ得る他の分子を含む組成物を提供する。このような組成物は、治療として使用するために製剤化された医薬組成物であり得る。代替的に、本発明は、前述の成分を含む標的分子の断片、修飾、前駆体、または後代である成分を含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、前述の抗体またはアプタマーを含む標的ポリペプチドまたは分子に特異的に結合する抗体またはアプタマーを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、標的分子のレベルは、合致した抗体対および化学蛍光検出を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡなどの標準的な免疫アッセイを使用して判定され得る。
【0258】
本発明の代替的な実施形態では、本方法は、患者、好ましくは癌患者に投与される放射線治療の効能または有効性を評価するために提供される。本方法は、特定の時間（ｔｏ）に対象由来の血清または組織などの第１の試料を採取し、生物学的試料における標的分子または前駆体もしくは後代のうちの少なくとも１つのレベルを測定し、測定されたレベルを、後の時間（ｔ１）に対象から得られた試料に対して測定されたレベルと比較することによって行われる。測定されたレベル間の差に応じて、標的レベルが、間隔（ｔｒｔｏ）にわたって増加、減少、または一定を維持したかどうかを見ることができる。その後の試料の採取および測定は、時間ｔ２～ｔｎの範囲にわたって所望の回数行うことができる。標的分子が一貫したレベルまたは活性のレベルを維持しているか、またはＲＩＢＥを示すと示されている判定前の閾値内にのみ上昇している場合、放射線治療は、ＲＩＢＥまたは有意なＲＩＢＥプロセスをもたらしておらず、放射線の曝露の量および／または持続時間は、増加または改変され得ることを示すであろう。一方、ＣＴＳＢ、ＲＩＢＥを示すと示されている上記の判定前閾値であるＣＴＳＢなどの標的分子レベルの増加は、ＲＩＢＥまたは有意なＲＩＢＥプロセスをもたらしているか、またはもたらすと予測され、放射線曝露の量および／または持続時間は減少または改変され得ることを示すであろう。
【0259】
別の態様では、本発明は、放射線治療または放射線の曝露後に、放射線治療に対する癌患者の反応を改善するか、ＲＩＢＥを防止するか、またはＲＩＢＥを緩和するための方法を提供する。本方法は、ＣＴＳＢおよびその任意の相同体または変異体の活性を阻害する、ケルセチン、イソケルセチンまたはそれらの類似体、および／またはＥ６４、ＣＡ０７４、またはＣＡ０７４Ｍｅおよびその類似体などの治療的に有効な量の少なくとも１つの薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、放射線治療の投与前に、すなわち、放射線治療の投与または開始前に、予防的に投与され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、放射線療法の投与と同時に、または同じ時間に、または検出可能なＲＩＢＥの発病時の放射線治療の後に投与され得る。
【0260】
本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ、ＰＤＫ－１、およびＰＤＫ１キナーゼおよび任意の相同体または変異体タンパク質および任意の相同体または変異体タンパク質などの標的分子の発現または活性を阻害し得る、単純または複雑な有機分子、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸分子などの化学的または生物学的分子を意味する。このような分子は、当該技術分野で知られている方法を使用して、商業的に購入され得るか、または合成され得る。薬剤として使用される好適な有機分子は、標的分子の活性を阻害することができる、合成または天然に生じる薬剤を含み得る。「薬剤」という用語はまた、化合物（複数可）ケルセチン、イソケルセチン、またはそれらの類似体／誘導体を意味し得る。
【0261】
いくつかの実施形態では、薬剤は、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。一態様では、タンパク質は、標的タンパク質またはポリペプチドの生物学的活性を減少させるのに有効な、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ、ＰＤＫ－１、およびＰＤＫ１キナーゼ、ならびに任意の相同体または変異体タンパク質などの標的タンパク質またはポリペプチドと特に反応する抗体である。例えば、標的タンパク質またはポリペプチドに由来する免疫原を使用することによって、例えば、ｃＤＮＡ配列に基づいて、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を、標準的なプロトコルによって作成することができる。
【0262】
マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳動物は、免疫原の形態の標的（例えば、ＣＰＲ－４、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、ＣＥＰ－１、ｐ５３、ＤＡＦ－２、インスリン／ＩＧＦレセプタ、ＰＤＫ－１、およびＰＤＫ１キナーゼ、ならびに任意の相同体または変異体タンパク質タンパク質またはポリペプチドまたは抗原反応を引き出すことができる抗原性断片、または融合タンパク質）により免疫付与することができる。タンパク質またはペプチドに対して免疫原性を付与するための技術は、担体または当該技術分野でよく知られている他の技術との接合を含む。ＣＰＲ－４などの標的タンパク質またはポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントが存在している場合に投与することができる。免疫付与の進捗は、血漿または血清における抗体力価の検出によって監視され得る。標準的なＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイを、抗原として免疫原と共に使用して、抗体のレベルを評価することができる。
【0263】
好ましい実施形態では、対象抗体は、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）などの哺乳動物の標的タンパク質またはポリペプチドの抗原性決定基に対して免疫特異的である。一例では、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢタンパク質もしくはポリペプチドの抗原性調製による動物の免疫付与の後に、抗ＣＰＲ－４または抗ＣＴＳＢ抗血清を得ることができ、必要に応じて、ポリクローナル抗ＣＰＲ－４または抗ＣＴＳＢ抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生成するために、抗体生成細胞（リンパ球）は、免疫付与動物から採取することができ、骨髄腫細胞などの免疫付与細胞による標準的な体細胞融合手順によって融合されて、ハイブリドーマ細胞を生じ得る。また、このような技術は、当該技術分野でよく知られている。ハイブリドーマ細胞は、このようなハイブリドーマ細胞を含む培地から単離された哺乳動物のＣＰＲ－４またはＣＴＳＢタンパク質もしくはポリペプチドおよびモノクローナル抗体と特に反応する抗体の生成のために免疫化学的にスクリーニングされ得る。
【0264】
特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、特定の実施形態では、本発明は、新規抗体を作出するための方法を利用可能にする。例えば、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢタンパク質もしくはポリペプチドに特異的に結合するモノクロ―ナル抗体を作出するための方法は、マウスに、検出可能な免疫反応を刺激するのに有効なＣＰＲ－４またはＣＴＳＢタンパク質もしくはポリペプチドを含むある量の免疫原性組成物を投与することと、マウスから抗体生成細胞（例えば、脾臓由来の細胞）を採取し、抗体生成細胞を骨髄腫細胞と融合させて、抗体生成ハイブリドーマを得ることと、抗体生成ハイブリドーマを試験して、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢタンパク質もしくはポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを同定することと、を含み得る。いったん採取されると、ハイブリドーマは、ハイブリドーマに由来する細胞が、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢタンパク質もしくはポリペプチドに特異的に結合するこのクローナル抗体を生成する培養条件において、細胞培養物に増殖され得る。モノクローナル抗体は、細胞培養物から精製され得る。抗体：抗原の相互作用の特異性に影響を与える１つの特性は、抗原に対する抗体の親和性である。所望の特異性は異なる親和性の範囲に到達し得るが、一般に好ましい抗体は、約１０～６、１０～７、１０～８、１０～９以下の親和性（解離定数）を有するであろう。
【0265】
いくつかの実施形態では、薬剤は、核酸分子であり得る。特定の態様では、核酸分子は、ＲＮＡｉ、リボザイム、アンチセンス、ＤＮＡ酵素、または標的発現または活性を操作する（典型的には、減少させる）ための他の核酸関連の組成物であり得る。これは、ＣＰＲ－４、ＣＴＳＢ、または任意の他の標的分子などの標的の変更された発現を単独でまたは組み合わせて含み得る。（好ましい実施形態は、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢを例示的なモデルとして使用し得るが、これは、標的本発明を含む多くの標的分子に対する限定ではないことが留意されるべきである。）本発明のいくつかの実施形態は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の手段によって、ＣＰＲ－４および／またはＣＴＳＢ遺伝子などの標的遺伝子のノックダウンに影響を与えるための材料および方法を使用する。ＲＮＡｉは、真核細胞において生じ得る配列特異的な転写後の遺伝子抑制のプロセスである。概して、このプロセスは、その配列と相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって誘発された特定の配列のｍＲＮＡの分解を伴う。任意の選択される遺伝子は、その遺伝子に対するｍＲＮＡのすべてまたは実質的な部分に対応するｄｓＲＮＡを導入することによって抑制され得る。長いｄｓＲＮＡが発現されたとき、リボヌクレアーゼＩＩＩによって、２１～２２長の塩基対のより短いｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドに最初に処理されるようである。
【0266】
したがって、ＲＮＡｉは、比較的短い相同なｄｓＲＮＡの導入または発現によって影響を受け得る。ＲＮＡｉに影響を与えるために使用される二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは、３０長未満の塩基対であり、より好ましくは、リボ核酸の約２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８または１７長の塩基対を含む。任意選択的に、本発明のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、３’張り出し端を含み得る。例示的な２－ヌクレオチド３’張り出しは、任意の種類のリボヌクレオチド残基から構成され得、さらに、ＲＮＡの合成費用を低くし、細胞培地中、かつトランスフェクト細胞内のｓｉＲＮＡのヌクレアーゼの抵抗力を高め得る、２’－デオキシチミジン残基から構成され得る（Ｅｌｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４－８を参照されたい）。
【0267】
５０、７５、１００、またはさらには５００塩基対以上のより長いｄｓＲＮＡはまた、本発明の特定の実施形態で利用され得る。ＲＮＡｉに影響を与えるためのｄｓＲＮＡの例示的な濃度は、約０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭ、１．５ｎＭ、２５ｎＭ、または１００ｎＭであるが、治療される細胞の性質、患者、患者による放射線の曝露のレベル、遺伝子標的、および当業者が容易に認識可能な他の因子に応じて、他の濃度を利用することができる。例示的なｄｓＲＮＡは、化学的に合成され得るか、または適切な発現ベクタを使用して生体外または生体内で生成され得る。例示的な合成ＲＮＡは、当該技術分野で知られている方法（例えば、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＲＮＡ ｐｈｏｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して化学的に合成された２１個のヌクレオチドＲＮＡを含む。
【0268】
合成オリゴヌクレオチドは、好ましくは、当該技術分野で知られている方法（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８－２００を参照されたい）を使用して、脱保護およびゲル精製される。より長いＲＮＡは、当該技術分野で知られているＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータなどのプロモータから転写され得る。生体外プロモータの顆粒の両方の可能な配向に置かれた単一のＲＮＡ標的は、所望の標的配列のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成するための標的の両方の鎖を転写するであろう。上記のＲＮＡ種のうちのいずれも、例えば、厳格なかつ／または生理的な条件下で、ＣＰＲ－４ ｍＲＮＡ、または特定の実施形態では、ＣＴＳＢ ｍＲＮＡおよびその相補体にハイブリダイズする核酸などの標的遺伝子に表される核酸配列の一部分を含むように設計されるであろう。
【0269】
オリゴヌクレオチドの設計に利用される特異的配列は、標的の発現された遺伝子メッセージ内に含まれるヌクレオチドの任意の連続した配列であり得る。当該技術分野で知られているプログラムおよびアルゴリズムを使用して、適切な標的配列を選択することができる。加えて、特定された一本鎖核酸配列の二次的な構造を予測するように設計されたプログラムを利用し、折り畳まれたｍＲＮＡの露出された一本鎖領域に生じる可能性が高いこれらの配列の選択を可能にする、最適な配列を選択することができる。適切なオリゴヌクレオチドを設計するための方法および組成物は、例えば、米国特許第６，２５１，５８８号に見られ得、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0270】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、一般に、リボヌクレオチドの配列内でタンパク質の合成を方向付けるための情報を含む直鎖状分子と考えられているが、研究は、大部分のｍＲＮＡに存在する二次的および三次的構造の数を明らかにした。ＲＮＡにおける二次的な構造要素は、同じＲＮＡ分子の異なる領域間のＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ型相互作用によって形成される。重要な二次的な構造要素は、分子内二本鎖領域、ヘアピンループ、二本鎖ＲＮＡにおける湾曲、および内部ループを含む。三次的構造要素は、二次的な構造要素が互いに、または一本鎖領域と接触するときに形成され、より複雑な三次元構造を生成する。何人かの研究者らは、多数のＲＮＡ二本鎖構造の結合エネルギーを測定し、ＲＮＡの二次的な構造を予測するのに使用され得る一連の法則を導き出した（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：７７０６（１９８９）、およびＴｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｒｎ．１７：１６７を参照されたい）。これらの法則は、ＲＮＡの構造要素の同定において、また、サイレンシングＲＮＡｉ、リボザイム、またはアンチセンス技術のための標的に対するｍＲＮＡの好ましいセグメントを表し得る一本鎖ＲＮＡ領域を同定するのに特に有用である。したがって、ｍＲＮＡ標的の好ましいセグメントは、ＲＮＡｉ媒介ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計のために、ならびに本発明の標的に関連する適切なリボザイムおよびハンマーヘッドリボザイム組成物の設計のために同定され得る。
【0271】
ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、付着性細胞株について、製造業者によって記載されるような当該技術分野において知られている、リポソームなどの担体組成物を使用した異種標的遺伝子によるトランスフェクトによって細胞に導入され得る。Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、内因性遺伝子を標的とするためのｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを実施し得る。ｈＧＦＰコードｐＡＤ３の共トランスフェクションの後に、哺乳動物の細胞株のための蛍光顕微鏡検査を使用して、トランスフェクション効率を確認し得る（Ｋｅｈｌｅｎｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｃｅｌｌ ＢｉｏＩ １４１：８６３－７４）。ｄｓＲＮＡの導入後に、いくつかのアッセイのうちのいずれかによって、ＲＮＡｉの有効性を評価し得る。これらは、新たなタンパク質合成が抑制された後、内因性プールの代謝回転に十分な時間後にＣＰＲ－４またはＣＴＳＢ遺伝子生成物を認識する抗体、リバース転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、およびノーザンブロット分析を使用して、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢなどの既存の標的ｍＲＮＡのレベルを判定する、ウェスタンブロット分析を含む。ＲＮＡｉ技術のさらなる組成物、方法、および用途は、米国特許出願第６，２７８，０３９号、同第５，７２３，７５０号、および同第５，２４４，８０５号（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。
【0272】
また、例えば、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子を使用して、対象のｍＲＮＡの翻訳および／または複数の動物系におけるＣＰＲ－４またはＣＴＳＢの発現を防止することができる（１９９０年１０月４日に公開された、例えば、ＰＣＴ国際公開第Ｗ０９０１１１３６４号；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２－１２２５、および米国特許第５，０９３，２４６号を参照されたい）。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断に触媒作用を及ぼすことができる酵素ＲＮＡ分子である。（検討のために、Ｒｏｓｓｉ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：４６９－４７１を参照されたい）。リボザイム作用の機構は、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のヌクレオチド鎖切断イベントを伴う。リボザイム分子の組成物は、好ましくは、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢ ｍＲＮＡに対して相補的な１つ以上の配列、およびｍＲＮＡ切断または機能的に同等な配列の原因となるよく知られている触媒配列を含む（例えば、米国特許第５，０９３，２４６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【0273】
部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムに加えて、ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡを破壊するためにも使用され得る。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって定められた場所で、ｍＲＮＡを切断する。好ましくは、標的ｍＲＮＡは、以下の配列の２つの塩基：５’－ｍＵＧ－３’を有する。ハンマーヘッドリボザイムの構成および生成は、当該技術分野でよく知られており、Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ（（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５－５９１により完全に記載されており、また、ＰＣＴ出願第Ｗ０８９／０５８５２号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ハンマーヘッドリボザイム配列は、転移ＲＮｍ（ｔＲＮＡ）などの安定なＲＮＡに埋め込んで、生体内の切断効率を増加させることができる（Ｐｅｒｒｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｍＵＳＡ，９２：６１７５－７９；ｄｅ Ｆｅｙｔｅｒ，ａｎｄ Ｇａｕｄｒｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７４，Ｃｈａｐｔｅｒ ４３，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ”，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．Ｃ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）。具体的には、ｔＲＮＡ融合リボザイムのＲＮＡポリメラーゼＨＩ媒介発現が、当該技術分野でよく知られている（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：２８４－９；Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９６１－５；ａｎｄ Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２：６１７ ２７；Ｋｏｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：１８６８－７７；Ｋｕｗａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：ｍ１８８６－９１；Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０６：４７３－４を参照されたい）。典型的には、所与の標的ｃＤＮＡ配列内に、いくつかの潜在的なハンマーヘッドリボザイム切断部位がある。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡ－－の５’端の近位に位置して、効率を増加させ、非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小限に抑えるように操作される。さらに、例えば、長い形態および短い形態の標的のＣ末端アミノ酸ドメインの異なる部分をコードする標的配列内に位置する任意の切断認識部位の使用は、一形態または他の形態の標的の選択的な標的化を可能にし、したがって、標的遺伝子生成物に対して選択的な効果を有する。遺伝子標的化リボザイムは、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢ ｍＲＮＡの少なくとも５長のうちのそれぞれ、好ましくはそれぞれ６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０長の連続したヌクレオチドである、２つの領域に対して相補的なハイブリダイズ領域を必然的に含有する。加えて、リボザイムは、標的センスｍＲＮＡを触媒的に切断する、高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を保有する。
【0274】
本発明は、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢ遺伝子をコードするセンスｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによってセンスｍＲＮＡにハイブリダイズし、それを切断し、そのため機能性ポリペプチド生成物を合成するように翻訳されることがもはやできない、リボザイムにも及ぶ。リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性の改善、標的化などのために）から構成され得、生体内で標的遺伝子を発現する細胞に送達されるべきである。送達の好ましい方法は、トランスフェクト細胞が、十分な量のリボザイムを生成して、内因性標的メッセージを破壊し、翻訳を阻害するように、強力な構成のｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモータの制御下で、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構成物を使用することを伴う。
【0275】
リボザイムは、アンチセンス分子と違って、触媒作用があるため、より低い細胞内濃度が、効率のために必要とされる。本発明のさらなる態様は、例えば、対象ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢ核酸の転写および／または翻訳を阻害することによって、発現を阻害するための単離された「アンチセンス」核酸の使用に関する。アンチセンス核酸は、従来の塩基対の相補性によって、または、例えば、ＤＮＡ二本鎖への結合の場合、二重螺旋の主要な溝における特異的相互作用を通して、潜在的な薬物標的に結合し得る。概して、これらの方法は、当該技術分野で一般に用いられる技術範囲を指し、オリゴヌクレオチド配列に対する特異的結合に依存する任意の方法を含む。
【0276】
本発明のアンチセンス構成物は、例えば、細胞中で転写されたとき、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢポリペプチドをコードする細胞性ｍＲＮＡの少なくとも固有の部分に対して相補的なＲＮＡを生成する、発現プラズミドとして送達され得る。代替的に、アンチセンス構成物は、生体外で作出され、細胞に導入されたとき、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢ核酸のｍＲＮＡおよび／またはゲノムの配列によりハイブリダイズによって発現の阻害をもたらす、オリゴヌクレオチドプローブである。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに対して抵抗力があり、したがって、生体内で安定している、修飾ヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための例示的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホロアミド酸、ホスホロチオエート、およびメチルホスホン酸類似体である（米国特許第５，１７６，９９６号、同第５，２６４，５６４号、および同第５，２５６，７７５号を参照されたい）。追加的に、アンチセンス治療において有効なオリゴマーを構築する一般的なアプローチは、例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８－９７６、およびＳｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２６５９－２６６８によって検討されている。
【0277】
アンチセンスアプローチは、ＣＰＲ－４またはＣＴＳＢポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の設計を伴う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を防止し得る。絶対相補性は、好ましいが、必要とされない。二本鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの一本鎖をそのように試験し得るか、または三重鎖形態をアッセイし得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存するであろう。一般に、ハイブリダイズ核酸が長いほど、より多くのＲＮＡとの塩基ミスマッチを含み得、さらに、安定した二本鎖（または場合によっては、三重鎖）を形成し得る。当業者は、ハイブリダイズされた複合体の融解点を判定するための標準的な手順の使用によって、許容範囲のミスマッチを確認し得る。ｍＲＮＡの５’末端に対して相補的なオリゴヌクレオチド、例えば、ＡＵＧ開始コドンを含む、ＡＵＧ開始コドンまでの５’］非翻訳配列が、翻訳の阻害に最も効率的に機能するはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に対して相補的な配列は、同様に、ｍＲＮＡの本博の阻害に有効であると示されている。
【0278】
したがって、遺伝子の非コード化領域である、５’または３’のいずれかの非翻訳に対して相補的なオリゴヌクレオチドを、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害するために、アンチセンスアプローチにおいて使用することができるであろう。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むはずである。ｍＲＮＡコード化領域に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳のより効率的でない阻害剤であるが、本発明に従って使用することもできるであろう。ｍＲＮＡの５’，３’またはコード化領域にハイブリダイズするように設計されるかどうかに関わらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６長のヌクレオチド、好ましくは、約１００未満、より好ましくは、約５０、２５、１７、または１０長未満のヌクレオチドであるはずである。
【0279】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物または誘導体またはそれらの修飾形態であり得る。オリゴヌクレオチドを、塩基部分、砂糖部分、またはリン酸骨格で修飾して、例えば、分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を改善することができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、宿主細胞レセプタを標的化するための）、または細胞膜にわたる運搬を促進する化合物（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３－６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８－６５２、１９８８年１２月１５日に公開された、ＰＣＴ公開第Ｗ０８８／０９８１０号を参照されたい）または血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日に公開された、ＰＣＴ公開第Ｗ０８９１１０１３４号を参照されたい）、ハイブリダイゼーショントリガ切断薬剤（例えば、Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８－９７６を参照されたい）または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９－５４９を参照されたい）などの他の追加の群を含み得る。このため、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショントリガ架橋剤、運搬薬剤、ハイブリダイゼーショントリガ切断剤などに接合され得る。
【0280】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシトリエチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、ＩＩＩ メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキオシン、偽ウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６－ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含み得る。
【0281】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２－フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むが限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾砂糖部分を含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、中性ペプチド様骨格も含有し得る。このような分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーと称され、例えば、Ｐｅｒｒｙ－Ｏ‘Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１４６７０ ａｎｄ ｉｎ Ｅｇｌｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６に記載されている。ＰＮＡオリゴマーの１つの利点は、ＤＮＡの中性骨格のために、培地のイオン強度から本質的に独立して相補的なＤＮＡに結合するそれらの能力である。また別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホルアミドチオエート、ホスホロアミド酸、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはそれらの類似体からなる群から選択され少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含む。
【0282】
本発明のさらなる態様は、ＣＰＲ－４遺伝子またはＣＴＳＢ遺伝子の発現を阻害するためのＤＮＡ酵素の使用に関する。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスおよびリボザイム技術の両方の機構的特徴のうちのいくつかを組み込む。ＤＮＡ酵素は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと非常に類似するように、特定の標的核酸配列を認識するが、リボザイムと非常に類似するように、触媒であり、標的核酸を特に切断するように設計される。現在、２つの塩基型のＤＮＡ酵素があり、これらのうちの両方が、ＳａｎｔｏｒｏおよびＪｏｙｃｅによって同定された（例えば、米国特許第６，１１０，４６２号を参照されたい）。１０－２３ＤＮＡ酵素は、２つのアームを接続するループ構造を含む。２つのアームは、特定の標的核酸配列を認識することによって特異性を提供し、ループ構造は、生理的状態下で触媒機能を提供する。簡単に言うと、標的核酸を特に認識および切断する理想的なＤＮＡ酵素を設計するために、当業者は、第１に、固有の標的配列を同定しなければならない。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて概説されるように、同じアプローチを使用して行うことができる。好ましくは、固有のまたは実質的な配列は、およそ１８～２２個のヌクレオチドのＧ／Ｃリッチである。高いＧ／Ｃ含量は、ＤＮＡ酵素と標的配列との間のより強力な相互作用を確保する助けとなる。ＤＮＡ酵素を合成する場合、メッセージに対して酵素を標的化する特異的アンチセンス認識配列は、ＤＮＡ酵素の２つのアームを含むように分割され、ＤＮＡ酵素ループは、２つの特異的アーム間に置かれる。ＤＮＡ酵素を作成および投与する方法は、例えば、米国特許第６，１１０，４６２号に見られ得る。同様に、生体外または生体内でのＤＮＡリボザイムの送達方法は、上に詳細に示すように、ＲＮＡリボザイムの送達方法を含む。追加的に、当業者であれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に、ＤＮＡ酵素を任意選択的に修飾して、安定性および分解に対する抵抗力を改善することができることを認識しているであろう。
【0283】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉ構成物は、例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成など、当該技術分野でよく知られているオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成のための当該技術分野で知られている任意の方法によって調製することができる。代替的に、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列の生体外および生体内転写によって作出することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモータなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを組み込む広く様々なベクタに組み込まれ得る。代替的に、アンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成物は、使用されるプロモータに応じて、細胞株に安定的に導入され得る。さらに、様々なよく知られている核酸分子に対する修飾は、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入され得る。可能性のある修飾は、オリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合ではなく、ホスホロチオエートまたは２’Ｏ－メチルの分子または使用の５’および／または３’末端に対するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の追加を含むがこれに限定されない。
【0284】
いくつかの実施形態では、薬剤は、アプタマーである。アプタマーは、特異的標的分子に結合する核酸またはペプチド分子である。アプタマーは、それに結合することによって標的分子の活性を阻害し得る。
【0285】
本発明のさらなる態様は、１つ以上の標的遺伝子を阻害、変更、破壊発現および／または置換するための組成物および方法を編集するＤＮＡの使用に関する。様々な実施形態では、１つ以上の標的遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９、ＴＡＬＡＮまたは亜鉛（Ｚｎ２＋）フィンガヌクレアーゼシステムを通して変更され得る。
【0286】
いくつかの実施形態では、遺伝子発現を変更するための薬剤は、ｃｐｒ－４、ｃｔｓｂ、またはそれらの任意の相同体／オルソログなどの１つ以上の標的遺伝子を標的化するように配列された適切なＲＮＡ分子と共に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９またはその機能的同等物である。例えば、本発明の一実施形態は、１つ以上の標的遺伝子の発現または活性を破壊、置換、または変更するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって利用される１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の導入を含み得る。
【0287】
この文脈において、遺伝子編集ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ－９技術は、ゲノム内の特定の場所で二本鎖切断を導入するために、細菌により送達されるタンパク質（Ｃａｓ９）および合成ガイドＲＮＡを使用するＲＮＡガイド遺伝子編集プラットフォームである。編集は、その合致するゲノムの配列とのハイブリダイゼーションを通して切り目を方向付ける、特に設計されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共に、Ｃａｓ９タンパク質により細胞または対象をトランスフェクトすることによって達成される。この技術を使用することによって、１つ以上の標的遺伝子における特定の遺伝子変化を導入することが可能である。いくつかの実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ－９を利用して、１つ以上の既存の野生型遺伝子を修飾形態と置換することができ、さらなる実施形態は、ｃｐｒ－４、またはｃｔｓｂなどの標的遺伝子の発現を変更、低減、増加、または不活性化する遺伝要素の追加を含み得る。
【0288】
いくつかの実施形態では、遺伝子の発現を変更するための薬剤は、亜鉛フィンガ、または亜鉛フィンガヌクレアーゼもしくは他の同等物である、本明細書で使用される「亜鉛フィンガヌクレアーゼ」または「亜鉛フィンガヌクレアーゼ」という用語は、亜鉛フィンガアレイを含む結合ドメインに接合された核酸切断ドメインを含むヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの切断ドメインである。亜鉛フィンガヌクレアーゼは、切断のために所与の核酸分子における事実上いかなる所望の配列を標的化するように設計することができ、複雑なゲノムの文脈において固有の部位に結合するように亜鉛フィンガ結合ドメインを設計する可能性は、例えば、治療効果のある標的化ゲノム変化を達成するために、生細胞における単一ゲノム部位の標的化切断を可能にする。所望のゲノム遺伝子座に対する二本鎖切断の標的化を使用して、非相同なＤＮＡ修復経路のエラーが生じやすい性質のために、遺伝子のコード化配列にフレームシフト変異を導入することができる。
【0289】
亜鉛フィンガヌクレアーゼは、当業者によく知られている方法によって対象となる部位を標的化するように作出することができる。例えば、所望の特異性を有する亜鉛フィンガ結合ドメインは、既知の特異性の個々の亜鉛フィンガモチーフを組み合わせることによって設計され得る。ＤＮＡに結合された亜鉛フィンガタンパク質Ｚｉｆ２６８の構造は、この分野における作業の大部分に情報を与え、６４個の可能な塩基対三重項の各々に対して亜鉛フィンガを得、次に、任意の所望の配列特異性を有するタンパク質を設計するためにこれらの分子亜鉛フィンガを混合および合致させるという概念が記載されている（ｐａｖｌｅｔｉｃｈ ＮＰ，Ｐａｂｏ Ｃｏｌｏ．（Ｍａｙ １９９１）．“Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ－ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｚｉｆ２６８－ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｔ ２．１ Ａ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２（５００７）：８０９－１７（その内容全体が本明細書に組み込まれる））。
【0290】
いくつかの実施形態では、３塩基対ＤＮＡ配列をそれぞれ認識する別個の亜鉛フィンガを組み合わせて、９塩基対～１８塩基対の範囲の長さの標的部位を認識する、３、４、５、または６フィンガアレイを作出する。いくつかの実施形態では、より長いアレイが企図される。他の実施形態では、６～８つのヌクレオチドを認識する２－フィンガモジュールを組み合わせて、４、６、または８亜鉛フィンガアレイを作出する。いくつかの実施形態では、細菌またはファージディスプレイを用いて、所望の核酸配列、例えば、長さ３～３０ｂｐの所望のヌクレアーゼ標的部位を認識する亜鉛フィンガドメインを発生させる。
【0291】
いくつかの実施形態では、亜鉛フィンガヌクレアーゼは、リンカ、例えば、ポリペプチドリンカを介して互いに融合、または別様に接合された亜鉛フィンガ結合ドメインおよび切断ドメインを含む。リンカの長さは、亜鉛フィンガドメインによって結合された核酸配列からの切り目の距離を決定する。より短いリンカを使用する場合、切断ドメインは、結合された核酸配列により近い核酸を切断し、より長いリンカは、切り目と結合された核酸配列との間により大きい距離をもたらすであろう。いくつかの実施形態では、亜鉛フィンガヌクレアーゼの切断ドメインは、結合された核酸を切断するために二量化しなければならない。いくつかのこのような実施形態では、二量体は、２つの単量体の異種二量体であり、その各々は、異なる亜鉛フィンガ結合ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、二量体は、ＦｏｋＩ切断ドメインに接合された亜鉛フィンガドメインＡを含む１つの単量体、およびＦｏｋＩ切断ドメインに接合された亜鉛フィンガドメインＢを含む１つの単量体を含み得る。この非制限的な例では、亜鉛フィンガドメインＡは、標的部位の片側で核酸配列に結合し、亜鉛フィンガドメインＢは、標的部位の他方の側で核酸配列に結合し、二量化したＦｏｋＩドメインは、亜鉛フィンガドメイン結合部位間で核酸を切断する。
【0292】
本明細書で使用される「亜鉛フィンガ」という用語は、折り畳み構造を安定化する１つ以上の亜鉛イオンの折り畳み構造および配位によって特徴付けられている小さい核酸結合タンパク質の構造モチーフを指す。亜鉛フィンガは、広く様々な異なるタンパク質構造を包含する（例えば、Ｋｌｕｇ Ａ，Ｒｈｏｄｅｓ Ｄ（１９８７）．“Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５２：４７３－８２（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。亜鉛フィンガは、特定の配列のヌクレオチドに結合するように設計することができ、一連の亜鉛フィンガの融合を含む亜鉛フィンガアレイは、事実上いずれの所望の標的配列にも結合するように設計され得る。このような亜鉛フィンガアレイは、例えば、核酸切断ドメインに接合された場合、タンパク質の、例えば、ヌクレアーゼの結合ドメインを形成し得る。Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２、Ｇａｇ ｋｎｕｃｋｌｅ、Ｔｒｅｂｌｅ ｃｌｅｆ、亜鉛リボン、Ｚｎ２／Ｃｙｓ６、およびＴＡＺ２ドメイン様モチーフを含むがこれらに限定されない、異なる種類の亜鉛フィンガモチーフが、当業者に知られている。（例えば、Ｋｒｉｓｈｎａ Ｓ Ｓ，Ｍａｊｕｍｄａｒ Ｉ，Ｇｒｉｓｈｉｎ Ｎ Ｖ（Ｊａｎｕａｒｙ ２００３）．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ：ｓｕｒｖｅｙ ａｎｄ ｓｕｍｍａｒｙ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（２）：５３２－５０を参照されたい）。典型的に、単一の亜鉛フィンガモチーフは、核酸分子の３または４つのヌクレオチドに結合する。したがって、２亜鉛フィンガモチーフを含む亜鉛フィンガドメインは、６～８つのヌクレオチドに結合し得、３亜鉛フィンガモチーフを含む亜鉛フィンガドメインは、９～１２個のヌクレオチドに結合し得、４亜鉛フィンガモチーフを含む亜鉛フィンガドメインは、１２～１６個のヌクレオチドに結合し得るなどである。任意の好適なタンパク質操作技術を用いて、亜鉛フィンガのＤＮＡ結合特異性を変更し、かつ／または３～３０長のヌクレオチドから事実上いずれの所望の標的配列にも結合するように新規亜鉛フィンガ融合を設計することができる（例えば、Ｐａｂｏ Ｃ Ｏ，Ｐｅｉｓａｃｈ Ｅ，Ｇｒａｎｔ ＲＡ（２００１）．“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｙｓ２Ｈ ｉｓ２ Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７０：３１３－３４０、Ｊａｍｉｅｓｏｎ Ａ Ｃ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ Ｃ，Ｐａｂｏ Ｃ Ｏ（２００３）．“Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２（５）：３６１－３６８、およびＬｉｕ Ｑ，Ｓｅｇａｌ Ｄ Ｊ，Ｇｈｉａｒａ Ｊ Ｂ，Ｂａｒｂａｓ Ｃ Ｆ（Ｍａｙ １９９７）．“Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｕｎｉｑｕｅ ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ”．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１１）（それらの各々内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0293】
操作された亜鉛フィンガアレイと核酸を切断するタンパク質ドメインとの間の融合を使用して、「亜鉛フィンガヌクレアーゼ」を作出することができる。亜鉛フィンガヌクレアーゼは、典型的に、核酸分子内で特定の標的部位に結合する亜鉛フィンガドメイン、および結合ドメインによって結合された標的部位内の、またはその近位の核酸分子を切断する核酸切断ドメインを含む。典型的な操作された亜鉛フィンガヌクレアーゼは、３～６つの個々の亜鉛フィンガモチーフを有する結合ドメイン、および９塩基対～１８塩基対の範囲の長さの結合標的部位を含む。より長い標的部位は、所与のゲノムにおいて固有の標的部位を結合および切断することが所望される状況において特に魅力的である。
【0294】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子を変更するための薬剤は、ＴＡＬＥＮシステムまたはその同等物である。本明細書で使用されるＴＡＬＥＮまたは「転写アクチベータ様要素ヌクレアーゼ」または「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ切断ドメイン、例えば、ＦｏｋＩドメインに対する転写アクチベータ様エフェクタＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼを指す。操作されたＴＡＬＥ構成物を作出するためのいくつかのモジュール式アセンブリが報告されている（Ｚｈａｎｇ，Ｆｅｎｇ；ｅｔ．ａｌ．（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１）．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１４９－５３、Ｇｅｉｂｌｅｒ，Ｒ．；Ｓｃｈｏｌｚｅ，Ｈ．；Ｈａｈｎ，Ｓ．；Ｓｔｒｅｕｂｅｌ，Ｊ．；Ｂｏｎａｓ，Ｕ．；Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｅ．；Ｂｏｃｈ，Ｊ．（２０１１），Ｓｈｉｕ，Ｓｈｉｎ－Ｈａｎ．ｅｄ．“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＤＮＡ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（５）：ｅ１９５０９、Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．；Ｄｏｙｌｅ，Ｅ．Ｌ．；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｍ．；Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．；Ｂａｌｌｅｒ，Ｊ．Ａ．；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ，Ｒ．；Ｅｌｓａｅｓｓｅｒ，Ｊ．；Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｊ．；Ｌａｈａｙｅ，Ｔ．（２０１１）．“Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥ－ｔｙｐｅ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｌｉ，Ｔ．；Ｈｕａｎｇ，Ｓ．；Ｚｈａｏ，Ｘ．；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｄ．Ａ．；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｓ．；Ｓｐａｌｄｉｎｇ，Ｍ．Ｈ．；Ｗｅｅｋｓ，Ｄ．Ｐ．；Ｙａｎｇ，Ｂ．（２０１１）．“Ｍｏｄｕｌａｒｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．、Ｗｅｂｅｒ，Ｅ．；Ｇｒｕｅｔｚｎｅｒ，Ｒ．；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．；Ｅｎｇｌｅｒ，Ｃ．；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．（２０１１）．Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ，Ｍｏｈａｍｍｅｄ．ｅｄ．“Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＴＡＬ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｂｙ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ”．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（５）：ｅ１９７２２（それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる））。
【0295】
当業者であれば、高度な特異性を有する事実上いずれのゲノムの配列をも標的化するようにＴＡＬＥヌクレアーゼを操作することができ、例えば、細胞のゲノム内のその標的配列を結合および切断するためのＴＡＬＥＮに好適な環境下で、本明細書に開示される方法または戦略を介してそれぞれのＴＡＬＥＮを送達することによって、細胞のゲノムを操作するために、このように操作されたヌクレアーゼを本発明の技術の実施形態において使用することができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、送達されたＴＡＬＥＮは、ＲＩＢＥなどの疾患または障害または生物学的プロセスと関連する遺伝子もしくは対立遺伝子、または１つ以上の標的遺伝子を標的化する。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮの対象への送達は、患者におけるＲＩＢＥを低減、改善、または除去するなど、対象に治療的利益を与える。
【0296】
いくつかの実施形態では、細胞、組織、器官、または生物の標的遺伝子は、本明細書に開示される戦略または方法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ－９、ＴＡＬＥＮ、または亜鉛フィンガヌクレアーゼ、または複数のこのようなヌクレアーゼもしくはそれらの組み合わせを介して、細胞に送達されたヌクレアーゼによって変更される。いくつかの実施形態では、一本鎖または二本鎖の切断は、ヌクレアーゼによってゲノム内の特定の部位に導入され、標的ゲノムの配列の破壊をもたらす。
【0297】
いくつかの実施形態では、標的ゲノムの配列は、標的遺伝子のコード化領域内の核酸配列である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼによって導入された鎖の切断は、コードされた遺伝子生成物の発現を損なう標的遺伝子内の変異をもたらす。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレアーゼと共に細胞に共送達される。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレアーゼ標的部位に隣接する配列と統一または相同な配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、ヌクレアーゼによって影響を受けた鎖の切断は、細胞性ＤＮＡ修復機構によって修復され、切断部位で細胞性ＤＮＡに共送達された核酸のすべてまたは一部を導入し、共送達された核酸またはその一部の標的化挿入をもたらす。いくつかの実施形態では、挿入は、所望されない対立遺伝子の破壊または修復をもたらす。いくつかの実施形態では、核酸は、過給タンパク質との会合によって共送達される。いくつかの実施形態では、過給タンパク質はまた、機能的エフェクタタンパク質、例えば、ヌクレアーゼに会合される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼの標的細胞への送達は、遺伝子の機能の臨床的または治療的に有益な変化をもたらす。
【0298】
いくつかの実施形態では、対象からの細胞を採取し、ヌクレアーゼまたは他のエフェクタタンパク質は、生体外で本明細書に提供されるシステムまたは方法によって細胞に送達される。いくつかの実施形態では、処理された細胞は、所望のヌクレアーゼ媒介ゲノム編集イベントにより影響を受けたこれらの細胞について選択される。いくつかの実施形態では、所望のゲノム変異または変化を保有する処理された細胞は、それらが採取された対象に戻される。
【0299】
本発明の薬剤の「治療的に有効な量」という用語は、癌または他の疾患状態を有する放射線治療に対する患者の反応の改善、放射線治療または放射線の曝露後のＲＩＢＥの低減、放射線または化学療法に対する癌の抵抗力の減少、放射線および化学療法の効能の改善、より高い用量の放射線治療に耐性があるための能力の増加に有効な量を意味する。このような量は、組成物が投与される対象の体重のキログラム当たり約０．００１～約５００ｍｇまたはさらには１０００ｍｇ以上の化合物を含み得る。治療的に有効な量は、当業者にとって満足な任意の投薬計画に従って投与され得る。
【0300】
例えば、ヒトに対して有効な用量は、７５ｋｇのヒトについて、１日当たり約３７５０ｍｇに翻訳する、約５０ｍｇ／ｋｇの体重の用量を含む。有効な量のケルセチンは、約１００ｍｇ／日（０．１ｇ／日）～約５００００ｍｇ／日（５０ｇ／日）、好ましくは約１０００ｍｇ／日～３００００ｍｇ／日、より好ましくは約１０００ｍｇ／日～約１５０００ｍｇ／日、さらにより好ましくは１０００ｍｇ／日～約５０００ｍｇ／日を含む。例示的な実施形態では、ケルセチンは、１００ｍｇ～２０００ｍｇ／日の用量でヒト対象に提供される。用量は、体重、健康状態、年齢、および個人に対する所望の効果に関連する。したがって、用量は、投与スケジュール、体重、年齢などに従って変化し得る。本明細書に記載の用量は、低体重の成人、例えば、１００ポンドの成人に対しても安全である。本明細書に記載の最高用量でいかなる毒性効果も知られている。しかしながら、本明細書に記載の用量は、好ましくは、より小さい体重を有する対象についてはより低い容量で、より大きい体重を有する対象についてのより高い用量で投与される。
【0301】
いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に、ケルセチン、イソケルセチン、またはそれらの類似体／誘導体、および／または好ましい実施形態では、Ｅ６４、ＣＡ０７４、またはＣＡ０７４Ｍｅ、およびそれらの類似体などの医薬組成物において投与される。したがって、動物、具体的にはヒトに生物学的に活性な薬剤を送達するための当該技術分野で一般に許容される、本発明の薬剤および薬学的に許容可能な担体を含有する医薬組成物も、本明細書に提供する。「薬学的に許容可能な」という句は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または妥当な利益／リスク比と同等の他の問題もしくは合併症を有せずに、人間および動物の組織と接触して使用するのに好適な、健全な医学的判断の範囲内にある、これらの化合物、材料、組成物、および／または用量形態を指すように本明細書で用いられる。
【0302】
好ましい実施形態では、ケルセチン、イソケルセチン、またはそれらの類似体／誘導体を含み得る薬剤は、薬学的に許容可能な塩またはプロドラッグの形態で投与され得る。「薬学的に許容可能な塩」という用語は、薬剤または親化合物が酸またはその塩基性塩を作成することによって改変される、本開示の薬剤または化合物の誘導体を指す。薬学的に許容可能な塩の例は、アミンなどの塩基性残基のミネラルもしくは有機酸塩、またはカルボン酸などの酸性残基のアルカリもしくは有機塩を含むがこれらに限定されない。薬学的に許容可能な塩は、従来の非毒性塩または非毒性の無機もしくは有機酸から形成された親化合物の第４級アンモニウム塩を含む。このような従来の非毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸ア、リン酸、硝酸などの無機酸由来のもの、および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、ｐａｍｏｌｃ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などの有機酸から調製された塩が含まれる。薬学的に許容可能な塩は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または妥当な利益／リスク比と同等の他の問題または合併症を有せずに、人間および動物の組織と接触して使用するのに好適なこれらの形態の薬剤である。
【0303】
薬学的に許容可能な塩の形態は、従来の化学的方法によって塩基または酸性部分を含有する薬剤から合成され得る。一般に、このような塩は、水または有機溶媒、または２つの混合物中に化学量論的量の適切な塩基または酸を有するこれらの薬剤の遊離塩または塩基形態を反応させることによって調製され、一般に、非水性培地様エーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルが好ましい。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５の１４１８頁に見られる。
【0304】
「プロドラッグ」は、このようなプロドラッグが哺乳動物の対象に投与された場合に、本発明の活性親薬物を生体内に放出する任意の共有結合担体を含むことが意図される。プロドラッグが多数の望ましい量の医薬品を向上させることが知られている（すなわち、溶解度、生物学的利用能、半減期、製造など）ため、本発明の薬剤は、プロドラッグ形態で送達され得る。したがって、本発明は、本請求される化合物のプロドラッグ、それらを送達する方法、およびそれらを含有する組成物を範囲とすることが意図される。
【0305】
本発明のプロドラッグは、ルーチン操作または生体内のいずれかで、活性薬剤に改変が切断される方法で薬物に存在する官能基を改変することによって調製される。プロドラッグは、アシル、ヒドロキシ、アミノ、またはスルフヒドリル基が、本発明のプロドラッグが哺乳動物の対象に投与されたときに切断されて、それぞれ、遊離アセチル、ヒドロキシル、遊離アミノ、または遊離スルフヒドリル基を形成する任意の基に結合される、本発明の薬剤を含む。プロドラッグの例は、本発明の薬剤におけるアルコールおよびアミン官能基のアセテート、ギ酸、および安息香酸誘導体を含むがこれらに限定されない。当業者であれば、キラル中心を有する薬剤のうちのいくつかが、光学的に活性なおよびラセミ形態で存在し得、またそのような形態で単離され得ることを理解するであろう。
【0306】
好ましい一実施形態では、本発明は、例えば、治療を必要とする患者に投与された後に、体内にケルセチンを放出するように生物学的に分解または破壊され得るプロドラッグとして作用することが可能なケルセチン類似体の医薬製剤を含み得る。したがって、本発明はまた、例えば、親の方法で（静脈内、筋肉内、および皮下を含む）または経口で、医学的または獣医学的治療の工程での任意の好適な方法で投与するために作成または製剤化されたプロドラッグを提供する、ケルセチン類似体または誘導体を含むか、または含有する医薬組成物を含む。おそらく互換性のある薬学的に許容可能な添加剤、担体、希釈剤、または賦形剤を提供する少なくとも１つの他の成分と共に、便宜的に単位用量形態で、治療的に有効な非毒性量のプロドラッグ化合物、または同等の治療的に有効な非毒性量の活性薬物化合物を含有または組み込む組成物は、一般に本明細書に記載の薬学の技術分野においてよく知られている方法のうちのいずれかによって調製され得る。
【0307】
本発明の「薬剤」という用語は、本明細書に記載の治療的に有用な特性を有する、任意のラセミ、光学的に活性な、位置異性または立体異性形態、それらのまたは混合物を包含することが理解されるべきである。光学的に活性な形態を調製する（例えば、ラセミ形態の分析によって、再結晶技術によって、光学的に活性な開始材料からの合成によって、キラル合成によって、またはキラル固定相を使用したクロマトグラフ分離によって）方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【0308】
本発明の範囲は、存在し得る様々な異性体のみならず、形成され得る異性体の様々な混合物を包含することも理解されるべきである。例えば、本発明の化合物が１つ以上のキラル中心を含有する場合、化合物は、エナンチオ選択的に合成され得るか、または鏡像異性体および／もしくはジアステレオマの混合物が調製および分離され得る。本発明の化合物、それらの開始材料、および／または中間体の分析は、例えば、ｔｈｅ ｆｏｕｒ－ｖｏｌｕｍｅ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｎｈａｔｔａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｒｉｖｅｒｄａｌｅ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ ｉｎ Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊｅａｎ Ｊａｃｑｕｅｓ，Ａｎｄｒｅ Ｃｏｌｌｅｔ ａｎｄ Ｓａｍｕｅｌ Ｈ．Ｗｉｌｅｎ；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１（その全体がこの参照により組み込まれる）に記載の既知の手順によって実施され得る。
【0309】
薬剤の分析は、一般に、分別再結晶、蒸留、またはクロマトグラフィによって分離可能な形態をもたらす、鏡像異性体的に純粋な部分の、化学的または酵素的のいずれかでの付着によるジアステレオマの物理的特性の差に基づいている。これらの薬剤の塩およびプロドラッグを含む、本発明の薬剤は、商業的に購入され得るか、または有機合成の当業者によく知られている方法でも調製され得る。分子の様々な部分に存在する機能性は、提案された試薬および反応と互換性がなければならないことが、有機合成の当業者によって理解されている。反応状態と互換性のある置換基に対するこのような制限は、当業者には容易に明らかであり、その場合、代替的な方法を使用しなければならない。
【0310】
薬学的に許容可能な担体は、決定し、合わせるのに十分に当業者の権限内であるいくつかの因子に従って製剤化される。これらには、限定されないが、薬剤の種類および性質、薬剤含有組成物が投与される対象、組成物の投与の意図される経路、および標的化される治療指標が含まれる。薬学的に許容可能な担体は、水性および非水性の両方の液体培地、ならびに様々な固形および半固形用量形態を含む。このような担体は、ケルセチンなどの活性薬剤、および／またはＥ６４、ＣＡ０７４、またはＣＡ０７４Ｍｅおよびそれらの類似体に加えて、いくつかの異なる成分および添加剤を含み得、そのような追加の成分は、当業者によく知られている様々な理由、例えば、活性薬剤の安定化のために製剤に含まれる。好適な薬学的に許容可能な担体、およびそれらの選択に関わる因子の記載は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５などの様々な容易に入手可能な供給源に見られる。投与は、例えば、様々な非経口手段によって行われ得る。非経口投与に好適な医薬組成物は、水性ブドウ糖および生理食塩水などの様々な水性媒体を含み、グリコール溶液は、有用な担体でもあり、好ましくは、活性薬剤の水溶性塩、好適な安定化化合物、必要に応じて、バッファ化合物を含有する。亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸などの抗酸化化合物は、単独または組み合わせのいずれかで、好適な安定化化合物であり、クエン酸およびその塩、ならびにＥＤＴＡも使用される。加えて、非経口溶液は、塩化ベンザルコニウム、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、およびクロロブタノールなどの防腐剤を含有し得る。
【0311】
代替的に、組成物は、カプセル、錠剤、および粉末などの固形用量形態において、またはエリキシル剤、シロップ、および／または懸濁液などの液体形態において、経口投与され得る。ゼラチンカプセルを使用して、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはセルロース誘導体を含むが限定されない、活性成分および好適な担体を含有し得る。同様の希釈剤を使用して、圧縮錠剤を作成し得る。錠剤およびカプセルの両方が、ある期間にわたって薬品を連続的に放出するために提供する徐放性製品として製造され得る。圧縮錠剤は、任意の不快な味を覆い隠すために糖衣または被膜され得るか、あるいは活性成分を空気から保護するか、または胃腸管における錠剤の選択的な崩壊を可能にするために使用され得る。
【0312】
本発明の好ましい製剤は、本質的に本発明の治療的に有効な量の薬剤、および薬学的に許容可能な担体からなる、非経口または経口投与に好適な単相性医薬組成物である。本発明の別の好ましい製剤は、本発明の薬剤の治療的に有効な量のプロドラッグ、および薬学的に許容可能な担体からなる単相性医薬組成物である。本発明の医薬組成物において用いられ得る好適な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆材料の使用によって、分散体の場合は必要とされる粒子経の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持され得る。これらの組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含有し得る。また、組成物中に、砂糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが望ましい場合がある。加えて、注射可能な剤形の持続的吸収は、ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含むことによってもたらされ得る。
【0313】
場合によっては、ケルセチンなどの薬剤の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注射からの薬剤の吸収の速度を落とすことが望ましい。これは、難水溶性の結晶または無定形材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。その場合、薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し、溶解速度は、次に、結晶径および結晶形態に依存し得る。代替的に、非経口投与された薬剤の吸収の遅延は、油ビヒクルにおいて薬剤を溶解または懸濁することによって達成される。
【0314】
注射可能なデポー形態は、ポリ乳酸－ポリグリコール酸などの生分解性ポリマーにおいて薬剤の酵素マイクロカプセルマトリクスを形成することによって作成される。薬剤とポリマーとの割合、および用いられる特定のポリマーの性質に依存して、薬剤の割合を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルソエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。デポー注射可能な製剤はまた、体組織と互換性のあるリポソームまたは微乳濁液において薬剤を封入することによって調製される。注射可能な材料は、細菌保持フィルタを通した濾過によって殺菌され得る。
【0315】
錠剤などの固形組成物を調製するために、主要な活性成分を、薬学的賦形剤を混合して、ケルセチン、イソケルセチンまたは類似体、ならびに／またはＥ６４、ＣＡ０７４、またはＣＡ０７４Ｍｅ、およびそれらの類似体などの薬剤の均一混合物を含有する固形予備製剤組成物を形成する。これらの予備製剤組成物を均一と称する場合、組成物が、錠剤、ピル、およびカプセルなどの等しく有効な単位用量形態に細分され得るように、活性成分は、組成物全体を通して等しく分散されることを意味する。次に、この固形予備製剤を、例えば、本発明の治療化合物０．１～約５００ｍｇ以上を含有する上に記載の種類の単位用量形態に細分する。経口投与に好適な製剤は、カプセル、カシェ、ピル、錠剤、粉末、顆粒の形態で、または水性もしくは非水性液体、または水中油型もしくは油中水型液体乳濁液における溶液または懸濁液として、あるいはエリキシル剤もしくはシロップとして、またはトローチ（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性塩基を使用して）などとして存在し得、それぞれが、活性成分として本発明の所定の量の薬剤を含有する。本発明の薬剤または薬剤はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与され得る。
【0316】
経口投与のための固形用量形態の薬剤（カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、粉末、顆粒など）において、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または以下：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤、（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシアなどの結合剤、（３）グリセロールなどの湿潤剤、（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ、またはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、（５）パラフィンなどの溶液緩染剤、（６）第４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、（７）例えば、ヘキサデシルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、（８）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの潤滑剤、ならびに（１０）着色料、のうちのいずれかなど、１つ以上の薬学的に許容可能な担体と混合される。カプセル、錠剤、およびピルの場合、医薬組成物は、緩衝剤も含み得る。同様の種類の固形組成物を、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用した、軟充填および高充填ゼラチンカプセルにおける充填剤として用いることができる。
【0317】
錠剤は、任意選択的に、１つ以上の付属の成分と共に圧縮または成形によって作成され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を使用して調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤で加湿された粉末状化合物を好適な機械で成形することによって作成され得る。錠剤、ならびに糖衣錠、カプセル、ピル、および顆粒などの他の固形用量形態の医薬組成物は、任意選択的に、腸溶性コーティングおよび医薬製剤化技術においてよく知られている他のコーティングなど、コーティングおよびシェルでスコア化または調製され得る。それらはまた、所望の放出プロファイル、他のポリマーマトリクス、リポソーム、および／または微粒子を提供するために、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な比率で使用して、活性成分の緩やかで制御された放出を提供するように製剤化され得る。それらは、例えば、細菌保持フィルタを通した濾過によって殺菌され得る。これらの組成物はまた、任意選択的に、不透明剤を含有してもよく、活性成分のみを、または優先的に胃腸管の特定の部分に、任意選択的に遅延方法で放出する組成物からなり得る。使用され得る埋め込み用組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。活性成分はまた、マイクロカプセル封入形態であり得る。錠剤またはピルは、長期の作用の利益をもたらす用量形態を提供するようにコーティングまたは別様に構成され得る。例えば、錠剤またはピルは、内部用量および外部用量成分を含み得、後者は前者の上で包装体の形態である。２つの成分は、胃における崩壊に抵抗するように機能する腸溶性層によって分離され得、内部成分が無傷で十二指腸へと通過するか、または放出を遅延させることを可能にし得る。このような腸溶性層またはコーティングのために様々な材料を使用することができ、そのような材料には、いくつかのポリマー酸、ならびにセラックニス、ヘキサデシルアルコール、およびセルロースアセテートなどの材料とポリマー酸の混合物が含まれる。
【0318】
薬剤の経口投与のための液体用量形態には、薬学的に許容可能な乳濁液、微乳濁液、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が含まれる。活性成分に加えて、液体用量形態は、例えば、水、またはエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（具体的には、綿の種子、ピーナッツ、コム（ｃｏｍ）、胚、オリーブ、ビーバー香およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などの他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤など、当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有し得る。不活性希釈剤に加えて、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、香味剤、着色剤、芳香剤、ならびに防腐剤などのアジュバントを含み得る。懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガント、ならびにそれらの混合物として懸濁剤と含有し得る。
【0319】
局所または経皮的投与のための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、点滴薬、および吸入剤が含まれる。活性成分は、薬学的に許容可能な担体と共に、かつ必要とされ得る任意の緩衝液または推進薬と共に、殺菌条件下で混合され得る。軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、活性成分に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有し得る。粉末およびスプレーは、活性成分に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有し得る。スプレーは、追加的に、フロンなどの通常の推進薬、ならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性の非置換炭化水素を含有し得る。経皮的パッチは、本発明の化合物の体への制御された送達を提供するという追加の利点を有する。このような用量形態は、１つ以上の薬剤を、エラストママトリックス材料などの適切な培地に溶解、分散、または別様に組み込むことによって作成され得る。
【0320】
吸収促進剤を使用して、皮膚にわたる化合物の流束を増加させることができる。そのような流束の速度は、速度制御膜を提供するか、またはポリマーマトリクスもしくはゲルにおいて化合物を分散させるかのいずれかによって制御することができる。医薬製剤は、さらに、吸入もしくは送気による投与のために、または経鼻もしくは眼球内投与のために好適なものを含む。吸入による上（経鼻）または下気道経路への投与のために、薬剤は、注入器、噴霧器もしくは加圧パック、またはエアゾールスプレーを送達するための他の便利な手段から便宜的に送達され得る。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスなどの好適な推進役を含み得る。加圧エアゾールの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。
【0321】
代替的に、吸入または送気による投与のために、組成物は、乾燥粉末、例えば、薬剤およびラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末塩基のうちの１つ以上の粉末混合物の形態を取り得る。粉末組成物は、例えば、カプセルもしくはカートリッジ、または、例えば、吸入器、注入器、または計量吸入器の助けを借りて粉末を投与し得るゼラチンまたはブリスタパックにおいて単位用量形態で提示され得る。鼻腔内投与のために、本発明の化合物は、プラスチック瓶噴霧器または計量吸入器の手段などによって、鼻点滴薬または液体スプレーの手段によって投与され得る。
【0322】
眼点滴薬または鼻点滴薬などの点滴薬は、１つ以上の分散剤、可溶化剤、または懸濁剤を含む、水性または非水性塩基と共に製剤化され得る。液体スプレーは、便宜的に、加圧パックから送達される。点滴薬は、単純な点眼器キャプ付き瓶の手段によって、または特に成形されたクロージャの手段により液体内容物を液滴で送達するように適合されたプラスチック瓶の手段によって、送達され得る。任意の製剤は、単位用量または複数用量の密封容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提示され得、使用の直前に、殺菌液体担体、例えば、注射のための水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存され得る。即時注射溶液および懸濁液は、上に記載の種類の殺菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【0323】
本発明によって提供される用量製剤は、単独または他の治療的に活性成分、および薬学的に許容可能な不活性賦形剤と組み合わせのいずれかで、本発明の治療化合物を含有し得る。用量製剤は、抗酸化物質、キレート薬剤、希釈剤、結合剤、潤滑剤／流動促進剤、崩壊剤、着色料、および放出改変ポリマーのうちの１つ以上を含有し得る。好適な抗酸化物質は、当該技術分野で知られている１つ以上の薬学的に許容可能な抗酸化物質の中から選択され得る。薬学的に許容可能な抗酸化物質の例には、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸ナトリウム、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、亜硫酸ナトリウム、クエン酸、リンゴ酸、およびアスコルビン酸を含む。抗酸化物質は、用量製剤の約０．００１重量％～約５重量％の濃度で本発明の用量製剤中に存在し得る。
【0324】
好適なキレート薬剤は、当該技術分野で知られている１つ以上のキレート薬剤の中から選択され得る。好適なキレート薬剤の例には、エデト酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、エデト酸、クエン酸、およびそれらの組み合わせが含まれる。キレート薬剤は、用量製剤の約０．００１重量％～約５重量％の濃度で存在し得る。典型的には、約２０重量％～約８０重量％の範囲内の量の、ラクトース、砂糖、トウモロコシデンプン、改質トウモロコシデンプン、マンニトール、ソルビトール、および／または材木セルロースおよび微結晶セルロースなどのセルロース誘導体などの好適な希釈剤。
【0325】
好適な結合剤の例には、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ユードラジット、エチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ポリビニルアルコール、プルラン、カルボマー、アルファ化デンプン、寒天、トラガント、アルギン酸ナトリウム、微結晶セルロースなどが含まれる。好適な崩壊剤の例には、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどが含まれる。濃度は、用量形態の０．１重量％～１５重量％で変化し得る。
【0326】
潤滑剤／流動促進剤の例には、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、水酸化ひまし油、脂肪酸のスクロールエステル、微結晶ワックス、ミツロウ、ハクロウなどが含まれる。濃度は、用量形態の０．１重量％～１５重量％で変化し得る。放出改変ポリマーを使用して、本発明の治療化合物を含有する延長放出製剤を形成することができる。放出改変ポリマーは、水溶性ポリマーまたは水不溶性ポリマーのいずれかであり得る。水溶性ポリマーの例には、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ビニルアセテートコポリマー、ポリエチレンオキシド、多糖類（アルギン酸、キサンタンガムなど）、メチルセルロース、およびそれらの混合物が含まれる。水不溶性ポリマーの例には、メタクリル酸、アクリル酸コポリマーなどのアクリル酸、エチルセルロースまたはセルロースアセテートなどのセルロース誘導体、ポリエチレン、および高分子量ポリビニルアルコールが含まれる。
【0327】
任意選択的に、本発明の治療方法、ならびにケルセチンおよび／またはＥ６４、ＣＡ０７４、またはＣＡ０７４Ｍｅ、およびそれらの類似体などの組成物を、他の抗癌剤治療およびＲＩＢＥ治療と組み合わせ得る。抗癌剤治療の例は、外科手術および化学療法、ならびに他の新規治療などの従来の癌治療を含む。このような他の抗癌剤治療は、放射線治療と共に追加的または相乗的に作用することが期待されるであろう。これは、癌のより良好な制御をもたらし、ならびに高用量の必要性を低減し、かつ／またはＲＩＢＥを低減することによってより高い容量の治療放射線を可能にし得る。例えば、広い範囲の従来の化合物が、抗癌活性を有すると示されている。これらの化合物は、固形腫瘍を縮小させるか、腫瘍転移およびさらなる成長を防止するか、または白血病または骨髄腫におけるいくつかの悪性細胞を減少させるための化学療法における医薬品として使用されている。
【0328】
化学療法が様々な種類の悪性腫瘍の治療に有効であるが、多数の抗癌化合物が、望ましくない副作用を誘発する。２つ以上の異なる治療が組み合されたとき、治療が相乗的に働き、治療の各々の用量の低減を可能にし、それによってより高い用量で各化合物によって生じる有害な副作用を低減し得ることが示されている。他の例では、治療の難しい悪性腫瘍は、２つ以上の異なる治療の組み合わせ治療に反応し得る。本発明の別の実施形態は、放射線治療に対する癌患者の反応を改善し、かつ／またはＲＩＢＥ効果を減少させるための薬品の調製において、ケルセチン、イソケルセチン、またはそれらの類似体など、記載されている組成物のうちのいずれかの使用に関する。
【0329】
「含む」という用語は、「含むが限定されない」という句を意味するように本明細書で使用され、これと互換的に使用される。「または」という用語は、文脈が別段明確に示していない限り、「および／または」という用語を意味するように本明細書で使用され、これと互換的に使用される。
【0330】
これより一般に記載される本発明は、単に本発明の実施形態の特定の態様の例示の目的のために含まれる、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。実施例は、当業者であれば、他の技術および方法が特許請求の範囲を満たし得、請求される発明の範囲から逸脱することなく用いられ得ることを上記の教示および以下の実施例から認識するため、本発明を限定することを意図していない。
【0331】
本発明は、本発明の範囲を限定するものと捉えられるべきではない以下の実施例にさらに例示される。
【実施例】
【0332】
実施例１：この実施例は、照射に反応して１つ以上のＲＩＢＥ因子の生成物および排出物を例示する。
本発明者らは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＵＶ誘発性損傷がよく特徴付けられているため、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓが、ＵＶ放射線を使用してＲＩＢＥを研究するための動物モデルとして機能することができるかどうかを試験した。液体Ｓ培地中に培養された野生型（Ｎ２）動物に、１００Ｊ／ｍ２ＵＶを照射するか、または疑似照射した。このＵＶ用量は、ＤＮＡ損傷修復に関わるＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｐ５３相同体ＣＥＰ－１において欠陥があるｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物において悪化させる有意な胚致死性（図５ａ）を誘発した。被照射および疑似被照射動物を培養するのに使用される培地は、それぞれ、「ＵＶ条件培地」（ＵＶ－ＣＭ）および「ＵＶ対照」（ＵＶ－Ｃｔｒｌ）と呼ばれ、曝露されていない動物（図１ａ）を処理するために使用された。ＵＶ－ＣＭで処理されたＮ２動物は、ＵＶ－Ｃｔｒｌ（免疫グロブリン５ｂ）で処理されたものと比較して、胚致死性の増加を示し、これは、ＵＶ－ＣＭが、曝露されていない動物における損傷を誘発する可能性がある物質を含有することを示している。ＵＶ－ＣＭはまた、１００Ｊ／ｍ２で最大死阻害活性に到達する、ＵＶ用量（図１ｂ）に依存する方法で、アポトーシスの検出を感作する多数の非飲み込みアポトーシス細胞を有する、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物における生殖細胞死を低減した。これらの結果は、曝露されていない細胞のアポトーシスの低減または生存の増加が、ＲＩＢＥの終点のうちの１つであるという公開された報告と一致している
本発明者らは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＵＶ誘発性損傷がよく特徴付けられているため、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓが、ＵＶ放射線を使用してＲＩＢＥを研究するための動物モデルとして機能することができるかどうかを試験した。液体Ｓ培地中に培養された野生型（Ｎ２）動物に、１００Ｊ／ｍ２ＵＶを照射するか、または疑似照射した。このＵＶ用量は、ＤＮＡ損傷修復に関わるＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｐ５３相同体ＣＥＰ－１において欠陥があるｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物において悪化させる有意な胚致死性（図５ａ）を誘発した。被照射および疑似被照射動物を培養するのに使用される培地は、それぞれ、「ＵＶ条件培地」（ＵＶ－ＣＭ）および「ＵＶ対照」（ＵＶ－Ｃｔｒｌ）と呼ばれ、曝露されていない動物（図１ａ）を処理するために使用された。ＵＶ－ＣＭで処理されたＮ２動物は、ＵＶ－Ｃｔｒｌ（免疫グロブリン５ｂ）で処理されたものと比較して、胚致死性の増加を示し、これは、ＵＶ－ＣＭが、曝露されていない動物における損傷を誘発する可能性がある物質を含有することを示している。ＵＶ－ＣＭはまた、１００Ｊ／ｍ２で最大死阻害活性に到達する、ＵＶ用量（図１ｂ）に依存する方法で、アポトーシスの検出を感作する多数の非飲み込みアポトーシス細胞を有する、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物における生殖細胞死を低減した。これらの結果は、曝露されていない細胞のアポトーシスの低減または生存の増加が、ＲＩＢＥの終点のうちの１つであるという公開された報告と一致している
【0333】
実施例２：この実施例は、被照射細胞によるが、他の因子にはよらずに作出されたタンパク質としてのＲＩＢＥ因子の同定を例示している。
本発明者らは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を破壊する酵素によりＵＶ－ＣＭを処理することによって、ＲＩＢＥ因子の性質を証明した。ＵＶ－ＣＭにおけるアポトーシス阻害活性は、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼの処理に対して抵抗力がある（図６ａ、ｂ）が、トリプシンプロテアーゼによって消し去られており（図１ｃ）、これは、ＲＩＢＥ因子がタンパク質であることを示唆している。細胞死の欠陥があるｃｅｄ－３（ｎ２４３３）動物から回収されたＵＶ－ＣＭ、生殖系列が欠乏しているｇｌｐ－１（ｅ２１４１）動物、または死細菌が供給されたＮ２動物は、死阻害活性を保持し（図６ｃ～ｆ）、これは、ＲＩＢＥ因子が、放射線によって誘発された細胞死の細菌または副産物によって作出された可能性の低い因子であり、生殖系列なしに作成され得ることを示している。
本発明者らは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を破壊する酵素によりＵＶ－ＣＭを処理することによって、ＲＩＢＥ因子の性質を証明した。ＵＶ－ＣＭにおけるアポトーシス阻害活性は、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼの処理に対して抵抗力がある（図６ａ、ｂ）が、トリプシンプロテアーゼによって消し去られており（図１ｃ）、これは、ＲＩＢＥ因子がタンパク質であることを示唆している。細胞死の欠陥があるｃｅｄ－３（ｎ２４３３）動物から回収されたＵＶ－ＣＭ、生殖系列が欠乏しているｇｌｐ－１（ｅ２１４１）動物、または死細菌が供給されたＮ２動物は、死阻害活性を保持し（図６ｃ～ｆ）、これは、ＲＩＢＥ因子が、放射線によって誘発された細胞死の細菌または副産物によって作出された可能性の低い因子であり、生殖系列なしに作成され得ることを示している。
【0334】
本発明者らは、１０ｋＤの分子量カットオフフィルタユニットを使用して、ＵＶ－ＣＭを、２つの画分、１つは１０ｋＤよりも大きい可能性が高いタンパク質を含有する画分、１つは１０ｋＤよりも小さいタンパク質を有する画分に分離した。ＲＩＢＥ活性は、＞１０ｋＤの画分に現れ（図７ａ）、これは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分解された（図１ｄ）。ＵＶ－ＣＭに固有のタンパク質バンドを、１９個のタンパク質が同定された（図１ｅ、図８、および表５）質量分析によって分析した。
【0335】
実施例３：この実施例は、ＲＩＢＥ因子としてのＣＰＲ－４の同定を例示している。
本発明者らは、１９個の遺伝子のうちの１つがＲＩＢＥの原因であるかどうかを検査するためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用した。ｃｐｒ－４ ＲＮＡｉで処理された動物からのＵＶ－ＣＭは、有意に低減されたＲＩＢＥ活性を示し、他の遺伝子のＲＮＡｉで処理された動物からのＵＶ－ＣＭは、ＲＩＢＥ活性を保持した（図７ｂ）。ｃｐｒ－４は、細胞外プロテアーゼとして作用するように分泌される、哺乳動物のカテプシンＢリソソームプロテアーゼの相同体をコードする。ｃｐｒ－４における欠失変異（ｔｍ３７１８）は、ＣＰＲ－４タンパク質の３分の１を除去し（図９ａ）、ＲＩＢＥ活性を消し去り、カルボキシル末端フラグタグ（Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ）を有するｃｐｒ－４ゲノムの断片を保有する単一コピー統合された導入遺伝子は、ＲＩＢＥをｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物に回復させる（図２ａ）ため、ＵＶ－ＣＭにおけるこのＲＩＢＥ活性のためにｃｐｒ－４が必要とされる。
本発明者らは、１９個の遺伝子のうちの１つがＲＩＢＥの原因であるかどうかを検査するためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用した。ｃｐｒ－４ ＲＮＡｉで処理された動物からのＵＶ－ＣＭは、有意に低減されたＲＩＢＥ活性を示し、他の遺伝子のＲＮＡｉで処理された動物からのＵＶ－ＣＭは、ＲＩＢＥ活性を保持した（図７ｂ）。ｃｐｒ－４は、細胞外プロテアーゼとして作用するように分泌される、哺乳動物のカテプシンＢリソソームプロテアーゼの相同体をコードする。ｃｐｒ－４における欠失変異（ｔｍ３７１８）は、ＣＰＲ－４タンパク質の３分の１を除去し（図９ａ）、ＲＩＢＥ活性を消し去り、カルボキシル末端フラグタグ（Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ）を有するｃｐｒ－４ゲノムの断片を保有する単一コピー統合された導入遺伝子は、ＲＩＢＥをｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物に回復させる（図２ａ）ため、ＵＶ－ＣＭにおけるこのＲＩＢＥ活性のためにｃｐｒ－４が必要とされる。
【0336】
実施例４：この実施例は、ＣＰＲ－４の分ピル、およびｃｅｐ－１依存性機序を通してＣＰＲ－４媒介ＲＩＢＥが誘発されることを例示している。
本発明者らは、ＵＶ照射時にＣＰＲ－４が培地に分泌されるかどうかを検査した。ＵＶ－ＣＭにおいては、ＣＰＲ－４：：フラグが検出されたが、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ動物からのＵＶ－Ｃｔｒｌには検出されなかった（図１ｆ）。Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物のＵＶ－ＣＭからのＣＰＲ－４：：フラグの免疫喪失が、そのＲＩＢＥ活性を無効にし（図６ｇ、ｈ）、これは、分泌されたＣＰＲ－４がＵＶ－ＣＭにおけるＲＩＢＥ因子であることを確認している。ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物からのＵＶ－ＣＭは、ＲＩＢＥ活性を喪失し（図２ａ）、ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ動物からのＵＶ－ＣＭは、ＣＰＲ－４：：フラグの有意に低減された分泌を示す（図７ｃ）ため、ＣＰＲ－４媒介ＲＩＢＥは、哺乳動物においていくつかの報告されたｐ５３依存性ＲＩＢＥのように、ｃｅｐ－１依存性機序を通して誘発される。
本発明者らは、ＵＶ照射時にＣＰＲ－４が培地に分泌されるかどうかを検査した。ＵＶ－ＣＭにおいては、ＣＰＲ－４：：フラグが検出されたが、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ動物からのＵＶ－Ｃｔｒｌには検出されなかった（図１ｆ）。Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物のＵＶ－ＣＭからのＣＰＲ－４：：フラグの免疫喪失が、そのＲＩＢＥ活性を無効にし（図６ｇ、ｈ）、これは、分泌されたＣＰＲ－４がＵＶ－ＣＭにおけるＲＩＢＥ因子であることを確認している。ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物からのＵＶ－ＣＭは、ＲＩＢＥ活性を喪失し（図２ａ）、ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ動物からのＵＶ－ＣＭは、ＣＰＲ－４：：フラグの有意に低減された分泌を示す（図７ｃ）ため、ＣＰＲ－４媒介ＲＩＢＥは、哺乳動物においていくつかの報告されたｐ５３依存性ＲＩＢＥのように、ｃｅｐ－１依存性機序を通して誘発される。
【0337】
実施例５：この実施例は、動物の１つ位置での局所ＵＶ照射（ＬＵＩ）が放射線に曝露されていない動物の他の領域におけるバイスタンダ効果を誘発し、この効果がＣＰＲ－４およびＣＥＰ－１の両方に依存することを例示している。
上述のように、ＲＩＢＥは、動物内のバイスタンダ効果を指すことが多い。本発明者らは、動物の頭部の局所ＵＶ照射（ＬＵＩ）が、放射線に曝露されていない動物の他の領域におけるバイスタンダ効果を誘発し得るかどうかを試験した（図３ａ）。本発明者らは、放射線にも反応するＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐ（ｚｃＩｓ４）であるストレス反応レポータを使用して、後部領域における強力なＧＦＰ発現を誘発する、放射の２４時間後のＬＵＩで処理されたｚｃＩｓ４動物の複数の曝露されていない領域におけるＧＦＰ発現の増加を観察した（図３ｂ、ｃ）。このバイスタンダ反応は、Ｌ４幼虫において最強である（図３ｄ）が、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）およびｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）変異体においては喪失されており（図３ｅ、図１０ａ）、これは、動物内ＲＩＢＥのためにｃｐｒ－４およびｃｅｐ－１の両方が必要とされることを示している。ＬＵＩはまた、曝露されていない後代における胚致死性の増加（図３ａ、ｆ）、およびｃｐｒ－４依存的に非照射後部生殖腺における生殖細胞死の低減（図３ａ、ｇ）をもたらし、これは、ＬＵＩ誘発性動物内ＲＩＢＥが、ＵＶ－ＣＭによって誘発された動物間ＲＩＢＥと同様であり、ＣＰＲ－４が真のＲＩＢＥ因子であることを示している。
上述のように、ＲＩＢＥは、動物内のバイスタンダ効果を指すことが多い。本発明者らは、動物の頭部の局所ＵＶ照射（ＬＵＩ）が、放射線に曝露されていない動物の他の領域におけるバイスタンダ効果を誘発し得るかどうかを試験した（図３ａ）。本発明者らは、放射線にも反応するＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐ（ｚｃＩｓ４）であるストレス反応レポータを使用して、後部領域における強力なＧＦＰ発現を誘発する、放射の２４時間後のＬＵＩで処理されたｚｃＩｓ４動物の複数の曝露されていない領域におけるＧＦＰ発現の増加を観察した（図３ｂ、ｃ）。このバイスタンダ反応は、Ｌ４幼虫において最強である（図３ｄ）が、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）およびｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）変異体においては喪失されており（図３ｅ、図１０ａ）、これは、動物内ＲＩＢＥのためにｃｐｒ－４およびｃｅｐ－１の両方が必要とされることを示している。ＬＵＩはまた、曝露されていない後代における胚致死性の増加（図３ａ、ｆ）、およびｃｐｒ－４依存的に非照射後部生殖腺における生殖細胞死の低減（図３ａ、ｇ）をもたらし、これは、ＬＵＩ誘発性動物内ＲＩＢＥが、ＵＶ－ＣＭによって誘発された動物間ＲＩＢＥと同様であり、ＣＰＲ－４が真のＲＩＢＥ因子であることを示している。
【0338】
実施例６：この実施例は、媒介ＲＩＢＥ活性を媒介する際のＣＰＲ－４およびその関与におけるカテプシンＢ様プロテアーゼ活性の同定を例示している。
本発明者らは、ＣＰＲ－４およびカテプシンＢが高度に保存されており、一般塩基１６として作用する活性部位システインおよびヒスチジン残基を含む、同一の触媒残基（図９ｂ）を有することを観察した。本発明者らは、ｚ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＡＭＣである、カテプシンＢ特異的蛍光発生的基質を使用して、Ｎ２動物から、ＵＶ－ＣＭにおけるカテプシンＢ様プロテアーゼ活性を検出したが、ＵＶ－Ｃｔｒｌには検出されなかった（図２ｂ）。この活性は、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物からのＵＶ－ＣＭには存在せず、ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物からのＵＶ－ＣＭにおいては有意に低減されたが、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物においては回復され、ＣＰＲ－４が、ｃｅｐ－１依存性機序を通してＵＶ－ＣＭにおいてこのカテプシンＢ様活性を与えることを確認した。
本発明者らは、ＣＰＲ－４およびカテプシンＢが高度に保存されており、一般塩基１６として作用する活性部位システインおよびヒスチジン残基を含む、同一の触媒残基（図９ｂ）を有することを観察した。本発明者らは、ｚ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＡＭＣである、カテプシンＢ特異的蛍光発生的基質を使用して、Ｎ２動物から、ＵＶ－ＣＭにおけるカテプシンＢ様プロテアーゼ活性を検出したが、ＵＶ－Ｃｔｒｌには検出されなかった（図２ｂ）。この活性は、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物からのＵＶ－ＣＭには存在せず、ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物からのＵＶ－ＣＭにおいては有意に低減されたが、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物においては回復され、ＣＰＲ－４が、ｃｅｐ－１依存性機序を通してＵＶ－ＣＭにおいてこのカテプシンＢ様活性を与えることを確認した。
【0339】
本発明者らは、さらに、組み換えＣＰＲ－４がＲＩＢＥ活性を繰り返すかどうかを見るために試験した。そのシグナルペプチド（残基１～１５）を欠く切頂ＣＰＲ－４である、ｔＣＰＲ－４は、組み換えヒトカテプシンＢ（ｒｈＣＴＳＢ）（図７ｄ）のプロテアーゼ活性と同様のプロテアーゼ活性を示した。保存された触媒残基を変更する変異である、Ｃ１０９ＡおよびＨ２８１Ａは、ｔＣＰＲ－４のプロテアーゼ活性を無効にした（図２ｃ）が、非触媒残基を変更する変異（Ｎ３０１Ａ）は、ｔＣＰＲ－４プロテアーゼ活性に影響を与えなかった。Ｎ２動物からのＵＶ－ＣＭと同様に、ｔＣＰＲ－４、ｔＣＰＲ－４（Ｎ３０１Ａ）、およびｒｈＣＴＳＢは、生殖細胞の死骸を低減し（図２ｄ、図７ｅ）、胚致死性を増加した（図５ｃ）が、ｔＣＰＲ－４（Ｈ２８１Ａ）およびｔＣＰＲ－４（Ｃ１０９Ａ）は、そのようにはならず、これは、ＣＰＲ－４プロテアーゼ活性が、そのＲＩＢＥ活性に対して重要な意味を持つことを示している。
【0340】
実施例７：この実施例は、ＣＰＲ－４が、異なる放射線供給源によって誘発された共通のＲＩＢＥ因子であることを例示している。
本発明者らは、異なる放射線供給源、イオン化放射線（ＩＲ－ＣＭ）、およびその疑似被照射対照（ＩＲ－Ｃｔｒｌ）によって照射された動物からの条件培地を試験した。Ｎ２またはＰｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物からのＩＲ－ＣＭは、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物における生殖細胞の死骸を低減したが、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）またはｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物からのＩＲ－ＣＭは、そのような活性を有しなかった（図２ｅ）。同様に、Ｎ２動物からのＩＲ－ＣＭは、胚致死性の増加（図４ｂ）をもたらし、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）またはｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物からのＩＲ－ＣＭにおいて喪失されたが、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物において回復された、カテプシンＢ様活性を含有したが、ＩＲ－Ｃｔｒｌはそうではなかった（図２ｆ）。さらに、分泌されたＣＰＲ－４：：フラグは、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ動物からのＩＲ－ＣＭにおいては検出されたが、ＩＲ－Ｃｔｒｌでは検出されなかった（図２ｇ）。したがって、ＣＰＲ－４は、異なる放射線供給源によって誘発された共通のＲＩＢＥ因子である。
本発明者らは、異なる放射線供給源、イオン化放射線（ＩＲ－ＣＭ）、およびその疑似被照射対照（ＩＲ－Ｃｔｒｌ）によって照射された動物からの条件培地を試験した。Ｎ２またはＰｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物からのＩＲ－ＣＭは、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物における生殖細胞の死骸を低減したが、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）またはｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物からのＩＲ－ＣＭは、そのような活性を有しなかった（図２ｅ）。同様に、Ｎ２動物からのＩＲ－ＣＭは、胚致死性の増加（図４ｂ）をもたらし、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）またはｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物からのＩＲ－ＣＭにおいて喪失されたが、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物において回復された、カテプシンＢ様活性を含有したが、ＩＲ－Ｃｔｒｌはそうではなかった（図２ｆ）。さらに、分泌されたＣＰＲ－４：：フラグは、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ動物からのＩＲ－ＣＭにおいては検出されたが、ＩＲ－Ｃｔｒｌでは検出されなかった（図２ｇ）。したがって、ＣＰＲ－４は、異なる放射線供給源によって誘発された共通のＲＩＢＥ因子である。
【0341】
本発明者らは、定量的なＲＴ－ＰＣＲ分析を使用して、Ｎ２動物におけるｃｐｒ－４遺伝子の転写が、疑似被照射対照と比較して、ＵＶまたはＩＲ照射後、およそ１．６倍上昇することを発見した（図２ｈ）。対照的に、ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物におけるｃｐｒ－４転写は、いずれの放射線によっても変更されなかった。これらの結果は、イオン化および非イオン化放射線が、ＣＥＰ－１依存性機序を通してｃｐｒ－４転写を増加させ、より多くのＣＰＲ－４タンパク質の合成およびＣＰＲ－４の分泌の増強をもたらすことを示している。
【0342】
実施例８：この実施例は、ＣＰＲ－４が、ｃｅｐ－１依存性機序を通して発現されることを例示している。
本発明者らは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とのｃｐｒ－４転写融合を保有する単一のコピー挿入導入遺伝子および核局在化シグナル（Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐ）を使用して、ｃｐｒ－４が発現される時間および場所を検査した。Ｎ２動物において、ＮＬＳ：：ＧＦＰ発現は、胚には検出されず、早期段階の幼虫（Ｌ１～Ｌ３）の腸には観察されず、Ｌ４幼虫段階でピークに達し、動物が成体期に入ると減少した（図７ａ～ｈ、ｊ）。同様の時空間のＮＬＳ：：ＧＦＰ発現パターンが、ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）、Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐ動物において観察された（図１１ｉ、ｊ）。ＵＶを照射した場合、Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐを保有するＮ２動物（ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物ではない）は、ＮＬＳ：：ＧＦＰ発現（図１１ｋ）の上昇を示さず、放射線が、ｃｅｐ－１依存性機序を通してｃｐｒ－４転写の増加を誘発したことを確認した。
本発明者らは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とのｃｐｒ－４転写融合を保有する単一のコピー挿入導入遺伝子および核局在化シグナル（Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐ）を使用して、ｃｐｒ－４が発現される時間および場所を検査した。Ｎ２動物において、ＮＬＳ：：ＧＦＰ発現は、胚には検出されず、早期段階の幼虫（Ｌ１～Ｌ３）の腸には観察されず、Ｌ４幼虫段階でピークに達し、動物が成体期に入ると減少した（図７ａ～ｈ、ｊ）。同様の時空間のＮＬＳ：：ＧＦＰ発現パターンが、ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）、Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐ動物において観察された（図１１ｉ、ｊ）。ＵＶを照射した場合、Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐを保有するＮ２動物（ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）動物ではない）は、ＮＬＳ：：ＧＦＰ発現（図１１ｋ）の上昇を示さず、放射線が、ｃｅｐ－１依存性機序を通してｃｐｒ－４転写の増加を誘発したことを確認した。
【0343】
実施例９：この実施例は、生体内で分泌されたＣＰＲ－４の長期にわたるシグナル伝達効果を例示している。
本発明者らは、生体内で分泌されたＣＰＲ－４の効果を調査するために、ｍｙｏ－２遺伝子プロモータの制御下で、特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓの咽頭においてＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙを発現する遺伝子導入Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ動物を作出した（図１２ａ）。分泌されたタンパク質について予測されるように、ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙは、咽頭において作成され、咽頭から分泌され、食細胞体腔細胞を含む、体全体の細胞によって採取された（矢尻、図１２ａ）。ＣＰＲ－４シグナルペプチドの除去は、遺伝子導入動物における咽頭からのｔＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ分泌をブロックした（図１２ｂ）。ＵＶ－ＣＭと同様に、ＩＲ－ＣＭまたはＬＵＩ処理、ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙの咽頭の発現は、胚致死性を増加させ、生殖細胞死を減少し、加えて、実質的な幼虫停止を引き起こし（図１２ｃ、ｄ）、これらは、ｔＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙまたは触媒的な不活性ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を発現する動物には見られないか、または有意に軽減された。ＣＰＲ－４の異所性発現からのこれらの結果は、ＲＩＢＥ因子としてのＣＰＲ－４の長期にわたるシグナル伝達を支持するためのさらなる証拠を提供している。
本発明者らは、生体内で分泌されたＣＰＲ－４の効果を調査するために、ｍｙｏ－２遺伝子プロモータの制御下で、特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓの咽頭においてＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙを発現する遺伝子導入Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ動物を作出した（図１２ａ）。分泌されたタンパク質について予測されるように、ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙは、咽頭において作成され、咽頭から分泌され、食細胞体腔細胞を含む、体全体の細胞によって採取された（矢尻、図１２ａ）。ＣＰＲ－４シグナルペプチドの除去は、遺伝子導入動物における咽頭からのｔＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ分泌をブロックした（図１２ｂ）。ＵＶ－ＣＭと同様に、ＩＲ－ＣＭまたはＬＵＩ処理、ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙの咽頭の発現は、胚致死性を増加させ、生殖細胞死を減少し、加えて、実質的な幼虫停止を引き起こし（図１２ｃ、ｄ）、これらは、ｔＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙまたは触媒的な不活性ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を発現する動物には見られないか、または有意に軽減された。ＣＰＲ－４の異所性発現からのこれらの結果は、ＲＩＢＥ因子としてのＣＰＲ－４の長期にわたるシグナル伝達を支持するためのさらなる証拠を提供している。
【0344】
実施例１０：この実施例は、非被照射細胞または動物におけるＣＰＲ－４によって媒介された様々なＲＩＢＥ効果を例示している。
本発明者らは、ＣＰＲ－４によって媒介された様々なＲＩＢＥ効果を考慮して、複数の細胞プロセスに影響を与える遺伝子の検査を通して、ＣＰＲ－４がいかにして曝露されていない細胞または動物に影響を与えるかを調査した。ｄａｆ－２活性の低減が寿命およびストレスへの抵抗力を増加させ、遺伝毒性および低酸素ストレスによって誘発された、胚、筋肉、および神経細胞死を減少させるため、ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタのＣ．ｅｌｅｇａｎｓオルソログをコードし、複数のシグナル伝達経路を調節する、ｄａｆ－２遺伝子を検査した。同様に、温度感受性変異（ｅ１３７０）による減少ｄａｆ－２機能の低減が、生理的生殖細胞死を減少させた（図４ａ）。興味深いことに、精製されたｔＣＰＲ－４は、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）、ｄａｆ－２（ｅ１３７０）変異体における生殖細胞死をさらに低減し（図４ａ）、これは、ｔＣＰＲ－４およびｄａｆ－２が、生殖細胞死に影響を与えるように同じ経路において作用することを示唆している。さらに、ｔＣＰＲ－４は、ＤＡＦ－２の鍵となる下流シグナル伝達成分であるＰＤＫ－１キナーゼに欠陥がある、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）、ｐｄｋ－１（ｓａ６８０）動物において生殖細胞死を低減しなかったが、ＤＡＦ－２の顆粒で作用する主要な転写因子のうちの１つであるＤＡＦ－１６を欠く、ｄａｆ－１６（ｍｕ８６）ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物においてはそうすることができなかった（図１０ｂ）．本発明者らは、ＬＵＩアッセイを使用して、ｄａｆ－２およびｐｄｋ－１の不活性化（ｄａｆ－１６は不活性化しない）が、後部の曝露されていない領域におけるＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐからのＧＦＰ発現の増加を防止し（図３ｅおよび図１０ａ）、ｄａｆ－２の喪失が、曝露されていない組織における胚致死性の増加および生殖細胞死の低減をブロックする、同様の結果を観察した（図３ｆ、ｇ）。ｄａｆ－２の喪失が、ＵＶ－ＣＭへのＣＰＲ－４の分泌またはＵＶ－ＣＭのアポトーシス阻害活性に影響を与えないと思われた（図１０ｃ、ｄ）ため、これらの結果は、分泌されたＣＰＲ－４が、曝露されていない細胞においてＲＩＢＥを生じさせるために、ＤＡＦ－２インスリン／ＩＧＦレセプタおよびＰＤＫ－１キナーゼを通して作用するが、ＤＡＦ－１６転写因子はそうではないモデルを支持している。
本発明者らは、ＣＰＲ－４によって媒介された様々なＲＩＢＥ効果を考慮して、複数の細胞プロセスに影響を与える遺伝子の検査を通して、ＣＰＲ－４がいかにして曝露されていない細胞または動物に影響を与えるかを調査した。ｄａｆ－２活性の低減が寿命およびストレスへの抵抗力を増加させ、遺伝毒性および低酸素ストレスによって誘発された、胚、筋肉、および神経細胞死を減少させるため、ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタのＣ．ｅｌｅｇａｎｓオルソログをコードし、複数のシグナル伝達経路を調節する、ｄａｆ－２遺伝子を検査した。同様に、温度感受性変異（ｅ１３７０）による減少ｄａｆ－２機能の低減が、生理的生殖細胞死を減少させた（図４ａ）。興味深いことに、精製されたｔＣＰＲ－４は、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）、ｄａｆ－２（ｅ１３７０）変異体における生殖細胞死をさらに低減し（図４ａ）、これは、ｔＣＰＲ－４およびｄａｆ－２が、生殖細胞死に影響を与えるように同じ経路において作用することを示唆している。さらに、ｔＣＰＲ－４は、ＤＡＦ－２の鍵となる下流シグナル伝達成分であるＰＤＫ－１キナーゼに欠陥がある、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）、ｐｄｋ－１（ｓａ６８０）動物において生殖細胞死を低減しなかったが、ＤＡＦ－２の顆粒で作用する主要な転写因子のうちの１つであるＤＡＦ－１６を欠く、ｄａｆ－１６（ｍｕ８６）ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物においてはそうすることができなかった（図１０ｂ）．本発明者らは、ＬＵＩアッセイを使用して、ｄａｆ－２およびｐｄｋ－１の不活性化（ｄａｆ－１６は不活性化しない）が、後部の曝露されていない領域におけるＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐからのＧＦＰ発現の増加を防止し（図３ｅおよび図１０ａ）、ｄａｆ－２の喪失が、曝露されていない組織における胚致死性の増加および生殖細胞死の低減をブロックする、同様の結果を観察した（図３ｆ、ｇ）。ｄａｆ－２の喪失が、ＵＶ－ＣＭへのＣＰＲ－４の分泌またはＵＶ－ＣＭのアポトーシス阻害活性に影響を与えないと思われた（図１０ｃ、ｄ）ため、これらの結果は、分泌されたＣＰＲ－４が、曝露されていない細胞においてＲＩＢＥを生じさせるために、ＤＡＦ－２インスリン／ＩＧＦレセプタおよびＰＤＫ－１キナーゼを通して作用するが、ＤＡＦ－１６転写因子はそうではないモデルを支持している。
【0345】
実施例１１：この実施例は、ＣＰＲ－４（ｔＣＰＲ－４）が、ＤＡＦ－２およびＣＥＰ－１を通して生殖細胞の増殖を促進することを例示している。
本発明者らは、ｄａｆ－２がまた、生殖細胞の増殖に影響を与えるため、ｔＣＰＲ－４処理が、生殖系列の有糸分裂領域におけるいくつかの核をスコア化することによって、生殖細胞の増殖を変更するかどうかを検査した。Ｎ２動物のｔＣＰＲ－４処理は、有糸分裂ゾーンにおいて、より多くの生殖細胞核およびより多くの中期核をもたらし（図４ｂ）、これは、刺激効果を示唆している。ｄａｆ－２活性の低減またはｃｅｐ－１の喪失は、ｔＣＰＲ－４によって誘発された生殖細胞の増殖の増加をブロックし（図４ｂおよび図１０ｅ）、これは、ｔＣＰＲ－４が、ＤＡＦ－２およびＣＥＰ－１を通して生殖細胞の増殖を促進することを示している。
本発明者らは、ｄａｆ－２がまた、生殖細胞の増殖に影響を与えるため、ｔＣＰＲ－４処理が、生殖系列の有糸分裂領域におけるいくつかの核をスコア化することによって、生殖細胞の増殖を変更するかどうかを検査した。Ｎ２動物のｔＣＰＲ－４処理は、有糸分裂ゾーンにおいて、より多くの生殖細胞核およびより多くの中期核をもたらし（図４ｂ）、これは、刺激効果を示唆している。ｄａｆ－２活性の低減またはｃｅｐ－１の喪失は、ｔＣＰＲ－４によって誘発された生殖細胞の増殖の増加をブロックし（図４ｂおよび図１０ｅ）、これは、ｔＣＰＲ－４が、ＤＡＦ－２およびＣＥＰ－１を通して生殖細胞の増殖を促進することを示している。
【0346】
実施例１２：この実施例は、ヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）が、ヒト細胞におけるＲＩＢＥ効果に関わることを例示している。
本発明者らは、ヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）システインプロテアーゼがまた、放射線誘発性バイスタンダ効果に関わるかどうかを調査するため、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて観察されるように、ＵＶ照射に反応してＣＴＳＢの発現が上方調節されるかどうかを最初に検査した。図１３Ａに示すように、ＣＴＳＢの発現は、用量依存的にＵＶ照射に反応して上方調節され、４００Ｊ／ｍ２で最大反応に到達する。次に、本発明者らは、ＣＴＳＢショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＣＴＳＢ）ノックダウン２９３Ｔ細胞を作出し、これらの細胞および制御ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｔｒｌ）２９３Ｔ細胞に、４００Ｊ／ｍ２でＵＶを照射した。次に、ＵＶ条件培地（ＵＶ－ＣＭ）を、被照射細胞から回収し（方法を参照されたい）、これを使用して曝露されていないＨｕｈ７細胞を培養した。本発明者らは、ｓｈＣｔｒｌ ２９３Ｔ細胞からのＵＶ－ＣＭが、ｓｈＣＴＳＢ ２９３Ｔ細胞から回収されたＵＶ－ＣＭよりも細胞の生存の促進において有意により強な活性を示すことを発見し、これは、ＣＴＳＢ発現の喪失が、細胞の生存の促進において放射線誘発性バイスタンダ効果を低減することを示している。本発明者らは、ｓｈＣｔｒｌ Ｈｕｈ７細胞およびｓｈＣＴＳＢ Ｈｕｈ７細胞から回収されたＵＶ－ＣＭと同様の結果を観察した（図２）。これらの結果は共に、カテプシンＢシステインプロテアーゼがまた、ヒト細胞におけるＵＶ誘発性バイスタンダ効果に関わることを示している。
本発明者らは、ヒトカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）システインプロテアーゼがまた、放射線誘発性バイスタンダ効果に関わるかどうかを調査するため、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて観察されるように、ＵＶ照射に反応してＣＴＳＢの発現が上方調節されるかどうかを最初に検査した。図１３Ａに示すように、ＣＴＳＢの発現は、用量依存的にＵＶ照射に反応して上方調節され、４００Ｊ／ｍ２で最大反応に到達する。次に、本発明者らは、ＣＴＳＢショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＣＴＳＢ）ノックダウン２９３Ｔ細胞を作出し、これらの細胞および制御ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｔｒｌ）２９３Ｔ細胞に、４００Ｊ／ｍ２でＵＶを照射した。次に、ＵＶ条件培地（ＵＶ－ＣＭ）を、被照射細胞から回収し（方法を参照されたい）、これを使用して曝露されていないＨｕｈ７細胞を培養した。本発明者らは、ｓｈＣｔｒｌ ２９３Ｔ細胞からのＵＶ－ＣＭが、ｓｈＣＴＳＢ ２９３Ｔ細胞から回収されたＵＶ－ＣＭよりも細胞の生存の促進において有意により強な活性を示すことを発見し、これは、ＣＴＳＢ発現の喪失が、細胞の生存の促進において放射線誘発性バイスタンダ効果を低減することを示している。本発明者らは、ｓｈＣｔｒｌ Ｈｕｈ７細胞およびｓｈＣＴＳＢ Ｈｕｈ７細胞から回収されたＵＶ－ＣＭと同様の結果を観察した（図２）。これらの結果は共に、カテプシンＢシステインプロテアーゼがまた、ヒト細胞におけるＵＶ誘発性バイスタンダ効果に関わることを示している。
【0347】
この実施形態では、２９３Ｔ細胞を、４８時間、それぞれ、ＰＬＫＯ．１－Ｃｔｒｌ（ｓｈＣｔｒｌ）およびＰＬＫＯ．１－ＣＴＳＢ（ｓｈＣＴＳＢ）プラズミドでトランスフェクトした。細胞を洗浄し、新たな培地に置き、ＵＶ放射線（４００Ｊ／ｍ２）に曝露した。さらに４８時間、被照射細胞を培養した。ＵＶ条件培地である上清を回収し、これを使用して、４８時間、曝露されていないＨｕｈ７細胞を培養した。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを行って、Ｈｕｈ７細胞の生存のパーセンテージを測定した。加えて、Ｈｕｈ７細胞を、４８時間、ＰＬＫＯ．１－Ｃｔｒｌ（ｓｈＣｔｒｌ）およびＰＬＫＯ．１－ＣＴＳＢ（ｓｈＣＴＳＢ）プラズミドでトランスフェクトした。細胞を洗浄し、新たな培地に置き、ＵＶ放射線（４００Ｊ／ｍ２）に曝露した。さらに４８時間、被照射細胞を培養した。ＵＶ条件培地である上清を回収し、これを使用して、４８時間、曝露されていないＨｕｈ７細胞を培養した。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを行って、Ｈｕｈ７細胞の生存のパーセンテージを測定した。
【0348】
実施例１３：この実施例は、生体外でカテプシンＢプロテアーゼ活性を阻害する化合物に対するスクリーニングを実証している。
本発明者らは、重要な意味を持つ放射線誘発性バイスタンダ効果（ＲＩＢＥ）の伝達物質である、システインプロテアーゼカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の活性を阻害し得る化合物を同定するために、システインプロテアーゼの阻害剤として知られているか、または潜在的な抗癌活性を有する、活性小分子の回収をスクリーニングした（下の表１を参照されたい）。これらには、３つのシステインプロテアーゼ阻害剤、Ｅ６４［Ｎ－［Ｎ－（Ｌ－３－トランス－ｃａｒｂｏｘｉｒａｎｅ－２－カルボニル）－Ｌ－ロイシル］－アグマチン］、ＣＴＳＢ（１）の選択的阻害剤である、ＣＡ０７４［Ｎ－（ｌ－３－トランス－プロピルカルバモイルオキシラン－２－カルボニル）－ｌ－イソロイシル－ｌ－プロリン］、および細胞内ＣＴＳＢに対する膜透過性阻害剤である、ＣＡ０７４メチルエステル（ＣＡ０７４Ｍｅ）が含まれる。本発明者らはまた、短鎖ポリペプチド、ＮＨ２－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－ＣＯＯＨ（ＲＬＡ）、このポリペプチドのセレニウムキレート、ＮＨ２－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－ＣＯＯＨ－Ｓｅ、ならびに癌細胞の増殖を阻害し、哺乳動物の細胞に対して低毒性を示すと報告されている、いくつかの抗癌化合物およびビタミンを試験した。
本発明者らは、重要な意味を持つ放射線誘発性バイスタンダ効果（ＲＩＢＥ）の伝達物質である、システインプロテアーゼカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の活性を阻害し得る化合物を同定するために、システインプロテアーゼの阻害剤として知られているか、または潜在的な抗癌活性を有する、活性小分子の回収をスクリーニングした（下の表１を参照されたい）。これらには、３つのシステインプロテアーゼ阻害剤、Ｅ６４［Ｎ－［Ｎ－（Ｌ－３－トランス－ｃａｒｂｏｘｉｒａｎｅ－２－カルボニル）－Ｌ－ロイシル］－アグマチン］、ＣＴＳＢ（１）の選択的阻害剤である、ＣＡ０７４［Ｎ－（ｌ－３－トランス－プロピルカルバモイルオキシラン－２－カルボニル）－ｌ－イソロイシル－ｌ－プロリン］、および細胞内ＣＴＳＢに対する膜透過性阻害剤である、ＣＡ０７４メチルエステル（ＣＡ０７４Ｍｅ）が含まれる。本発明者らはまた、短鎖ポリペプチド、ＮＨ２－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－ＣＯＯＨ（ＲＬＡ）、このポリペプチドのセレニウムキレート、ＮＨ２－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－ＣＯＯＨ－Ｓｅ、ならびに癌細胞の増殖を阻害し、哺乳動物の細胞に対して低毒性を示すと報告されている、いくつかの抗癌化合物およびビタミンを試験した。
【0349】
本発明者らは、１８個の生体活性小分子の回収から、ＣＴＳＢ阻害活性を示す１１個の化合物を同定した。（一般に図２２～２３を参照されたい）３つのシステインプロテアーゼ阻害剤、ＣＡ０７４Ｍｅ、ＣＡ０７４、およびＥ６４は、ＣＴＳＢプロテアーゼに対する最良の阻害効果を実証した（下の表２を参照されたい）。短鎖ポリペプチド（ＲＬＡ）およびそのセレニウムキレートは、ＣＴＳＢプロテアーゼ活性の８６％超を阻害する。いくつかのフラボノイド、アピゲニン［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－ヒドロキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン］、ケルセチン［２－（３，４－ジヒドロキシフェニル）－３，５，７－トリヒドロキシ－４Ｈ－クロメン－４－オン］、イソクエルシトリン［２－（３，４－ジヒドロキシフェニル）－５，７－ジヒドロキシ－３－［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－３，４，５－トリヒドロキシ－６－（ヒドロキシメチル）オキサン－２－イル］オキシクロメン－４－オン］、およびバイカレイン（５，６，７－トリヒドロキシ－２－フェニル－クロメン－４－オン）もまた、６５～８５％の阻害を達成し得る。タンニン酸、ポリフェノール（であるが、フラボノイドではない）は、６９．２９％の阻害を示している。表２にも示すように、興味深いことに、ビタミンＢ９としても知られている葉酸は、ＣＴＳＢアクチベータであることが分かり、ＣＴＳＢプロテアーゼの活性を、４倍超、増強させることができる。
【0350】
表３に示すように、本発明者らは、これらの化合物のうちのいくつかの最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）を判定した。Ｅ６４、ＣＡ０７４、およびＣＡ０７４Ｍｅは、２０ｎＭ以下の最良ＩＣ５０値を実証した。フラボノイド、ケルセチン、およびバイカレインは、それぞれ、１．８７μＭおよび０．８７μＭでＩＣ５０を有する。短鎖ポリペプチドＲＬＡは、他の化合物よりも有意に高いＩＣ５０を有する。一方、葉酸の最大半量の有効濃度（ＥＣ５０）は、１．２６μＭである。
【0351】
上述のように、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＣＴＳＢ相同体であるＣＰＲ－４は、ヒトＣＴＳＢと同様のプロテアーゼ活性および特性を示している。本発明者らは、生体外でＣＰＲ－４プロテアーゼ活性を阻害する際のこれらの化合物のうちのいくつかの活性をアッセイした。表４に示すように、システインプロテアーゼ阻害剤Ｅ６４は、ＣＰＲ－４プロテアーゼに対する最高の阻害活性（８９．５９％）を有し、短鎖ポリペプチドＲＬＡは、ＣＰＲ－４プロテアーゼ活性の８５．０３％を阻害する。フラボノイドケルセチンは、８０．６７％の阻害を示し、フラボノイドバイカレインは、４１．５４％の阻害を示している。
【0352】
実施例１４：この実施例は、カテプシンＢ阻害剤が、放射線誘発性バイスタンダ効果（ＲＩＢＥ）をブロックすることを実証している。
本発明者らは、上に記載の局所ＵＶ照射（ＬＵＩ）動物内ＲＩＢＥモデルを使用して、同定されたＣＴＳＢ阻害剤が、ＬＵＩによって誘発されたＲＩＢＥまたは副作用をブロックし得るかどうかを検査した。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて見られるいくつかの顕著なＲＩＢＥ効果は、後部生殖腺の曝露されていない生殖細胞における染色体ＤＮＡの損傷、曝露されていない胚の致死性の増加、および特に頭部領域にＬＵＩを受ける動物の曝露されていない後部領域におけるストレス反応の上昇である。ＬＵＩ処理への供与の前に、幼虫段階２（Ｌ２）動物を、最初に、４８時間、それぞれ、ＤＭＳＯ（Ｍｏｃｋ）、１０μＭのＣＡ０７４、ＣＡ０７４Ｍｅ、もしくはＥ６４、または２５０μＭのケルセチン、イソクエルシトリン、（図１９）、もしくは葉酸（図２０）で処理した。
本発明者らは、上に記載の局所ＵＶ照射（ＬＵＩ）動物内ＲＩＢＥモデルを使用して、同定されたＣＴＳＢ阻害剤が、ＬＵＩによって誘発されたＲＩＢＥまたは副作用をブロックし得るかどうかを検査した。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて見られるいくつかの顕著なＲＩＢＥ効果は、後部生殖腺の曝露されていない生殖細胞における染色体ＤＮＡの損傷、曝露されていない胚の致死性の増加、および特に頭部領域にＬＵＩを受ける動物の曝露されていない後部領域におけるストレス反応の上昇である。ＬＵＩ処理への供与の前に、幼虫段階２（Ｌ２）動物を、最初に、４８時間、それぞれ、ＤＭＳＯ（Ｍｏｃｋ）、１０μＭのＣＡ０７４、ＣＡ０７４Ｍｅ、もしくはＥ６４、または２５０μＭのケルセチン、イソクエルシトリン、（図１９）、もしくは葉酸（図２０）で処理した。
【0353】
ｈｕｓ－１：：ＮｅｏＧｒｅｅｎノックインを含有する動物において、ＬＵＩ動物の後部生殖腺の曝露されていない生殖細胞における染色体ＤＮＡ損傷のアッセイを実施した。ＤＮＡ損傷誘発性細胞周期の停止およびアポトーシスに対して、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ｈｕｓ－１が必要とされる。ＤＮＡ損傷の後、ＨＵＳ－１は、染色体の切断に対して特に局所化し、クロマチン上に明確な焦点を形成することが示されている。したがって、本発明者らは、照射によって誘発された染色体ＤＮＡ損傷の指標として機能する、ＬＵＩ動物におけるいくつかのＨＵＳ－１：：ＮｅｏＧｒｅｅｎ焦点について、曝露されていない有糸分裂生殖細胞を分析した。図２１に示すように、葉酸（ＣＴＳＢアクチベータ）を除く、同定された化合物による処理、または欠失（ｔｍ３７１８）を通したｃｐｒ－４遺伝子の遺伝子不活性化は、正のＨＵＳ－１焦点を有するいくつかの生殖細胞を強力に阻害し、これは、同定された化合物またはｃｐｒ－４遺伝子の不活性化が、ＬＵＩによって誘発された染色体ＤＮＡ損傷の副作用をブロックすることを示している。
【0354】
先に記載されているように、ＬＵＩ動物における曝露されていない胚の致死性の増加のアッセイを行った。図１９に示すように、ＬＵＩ処理後の野生型（ＷＴ）動物は、それらの曝露されていない後代における胚致死性の増加を示した。しかしながら、同定された化合物で前処理された動物において（ＣＴＳＢアクチベータである葉酸を除いて）、またはｃｐｒ－４遺伝子に欠陥のある動物において、ＬＵＩは、胚致死性の増加を誘発しなかった。これらの結果は、同定されたＣＴＳＢ阻害剤化合物またはｃｐｒ－４遺伝子の遺伝子不活性化が、局所照射によって誘発されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける胚致死性の増加の副作用を防止し得ることを示している。興味深いことに、そのカルボキシル末端に短いペプチドタグ（フラグタグ）を有する修飾ＣＰＲ－４タンパク質を発現する単一コピーｃｐｒ－４導入遺伝子を保有するｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物が、ＬＵＩ処理の前に抗フラグ抗体で前処理された場合、偽処理ではなく、抗体が、図２０に示すような局所照射によって誘発された胚致死性の増加の副作用を有効にブロックしており、これは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＲＩＢＥモデルが、放射線療法によって誘発された副作用を緩和することができる抗体薬物に対するスクリーニングに使用され得ることを示している。
【0355】
照射を含む、いくつかのストレス状態に反応し得る、ｈｓｐ－４遺伝子（Ｐｈｓｐ－４：：ｇｆｐ）のプロモータの制御下で、ＧＦＰレポータを発現する統合された導入遺伝子を保有する動物において、ＬＵＩ動物の曝露されていない後部領域におけるストレス反応の上昇のアッセイを行った。図２１に示すように、葉酸を除く、同定された化合物による処理、またはｃｐｒ－４遺伝子の欠失が、ＬＵＩ動物の後部の曝露されていない領域における、ＧＦＰ蛍光強度の増加によって示された、ストレス反応の増加の副作用を強力に阻害した。これらの結果は共に、同定されたＣＴＳＢ阻害剤が、例示的な真核性生物における照射によって誘発された様々な副作用をブロックし得ることを示している。これらの研究はまた、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＲＩＢＥモデルにおける同定された化合物の生体外での薬物スクリーニングおよび試験の組み合わせが、放射線療法によって誘発された副作用、または他のヒト疾患を緩和もしくは治療するために使用され得る、有効な小分子化合物または抗体薬物を同定するための強力なアプローチであることを示している。
【0356】
実施例１５：この実施例は、ヒトインスリンレセプタが、ＣＴＳＢ誘発性ＲＩＢＥを媒介するために重要であることを明らかにしている。
ヒト細胞中のＲＩＢＥにおける、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＤＡＦ－２タンパク質の相同体である、ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）の関与を調査した。本発明者らは、２つの異なるＩＮＳＲショートヘアピン型ＲＮＡレンチウイルスクローン（ｓｈＩＮＳＲ♯１および♯２）を使用して、ヒトＨｕｈ７細胞におけるＩＮＳＲ発現を減少させ、次に、ｓｈＣｔｒｌまたはｓｈＣＴＳＢのいずれかを発現した（図１４を参照されたい）疑似被照射Ｈｕｈ７細胞（ＵＶ－Ｃｔｒｌ）またはＵＶ照射（ＵＶ－ＣＭ）Ｈｕｈ７細胞から回収された条件培地により、これらのＩＮＳＲノックダウン細胞を処理した。ＩＮＳＲノックダウン（ｓｈＩＮＳＲ♯１および♯２）は、ｓｈＣｔｒｌまたはｓｈＣＴＳＢ Ｈｕｈ７細胞のいずれかから回収されたＵＶ－Ｃｔｒｌによる影響を受けなかった、Ｈｕｈ７細胞の生存を減少させると思われた。先の観察（図１３および１４）と一致して、ｓｈＣｔｒｌ Ｈｕｈ７細胞からのＵＶ－ＣＭは、ｓｈＣＴＳＢ Ｈｕｈ７細胞から回収されたＵＶ－ＣＭよりも、曝露されていないｓｈＣｔｒｌ Ｈｕｈ７細胞において細胞の生存を促進する際に有意に強力な活性を示し（図１５）、ＣＴＳＢが細胞の生存を促進することを確認した。しかしながら、ｓｈＩＮＳＲノックダウンは、ｓｈＣＴＳＢ Ｈｕｈ７細胞からのＵＶ－ＣＭと比較して、ｓｈＣｔｒｌ Ｈｕｈ７細胞からのＵＶ－ＣＭによって誘発された細胞の生存の増強をブロックした（図１５）。これらの結果は、インスリン／ＩＧＦレセプタがまた、ヒト細胞においてＣＴＳＢ誘発性ＲＩＢＥを媒介するために重要であり、ＲＩＢＥシグナル伝達経路が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓとヒトとの間に保存されることを示唆している。
ヒト細胞中のＲＩＢＥにおける、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＤＡＦ－２タンパク質の相同体である、ヒトインスリン／ＩＧＦレセプタ（ＩＮＳＲ）の関与を調査した。本発明者らは、２つの異なるＩＮＳＲショートヘアピン型ＲＮＡレンチウイルスクローン（ｓｈＩＮＳＲ♯１および♯２）を使用して、ヒトＨｕｈ７細胞におけるＩＮＳＲ発現を減少させ、次に、ｓｈＣｔｒｌまたはｓｈＣＴＳＢのいずれかを発現した（図１４を参照されたい）疑似被照射Ｈｕｈ７細胞（ＵＶ－Ｃｔｒｌ）またはＵＶ照射（ＵＶ－ＣＭ）Ｈｕｈ７細胞から回収された条件培地により、これらのＩＮＳＲノックダウン細胞を処理した。ＩＮＳＲノックダウン（ｓｈＩＮＳＲ♯１および♯２）は、ｓｈＣｔｒｌまたはｓｈＣＴＳＢ Ｈｕｈ７細胞のいずれかから回収されたＵＶ－Ｃｔｒｌによる影響を受けなかった、Ｈｕｈ７細胞の生存を減少させると思われた。先の観察（図１３および１４）と一致して、ｓｈＣｔｒｌ Ｈｕｈ７細胞からのＵＶ－ＣＭは、ｓｈＣＴＳＢ Ｈｕｈ７細胞から回収されたＵＶ－ＣＭよりも、曝露されていないｓｈＣｔｒｌ Ｈｕｈ７細胞において細胞の生存を促進する際に有意に強力な活性を示し（図１５）、ＣＴＳＢが細胞の生存を促進することを確認した。しかしながら、ｓｈＩＮＳＲノックダウンは、ｓｈＣＴＳＢ Ｈｕｈ７細胞からのＵＶ－ＣＭと比較して、ｓｈＣｔｒｌ Ｈｕｈ７細胞からのＵＶ－ＣＭによって誘発された細胞の生存の増強をブロックした（図１５）。これらの結果は、インスリン／ＩＧＦレセプタがまた、ヒト細胞においてＣＴＳＢ誘発性ＲＩＢＥを媒介するために重要であり、ＲＩＢＥシグナル伝達経路が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓとヒトとの間に保存されることを示唆している。
【0357】
実施例１６：この実施例は、異なるヒト細胞株が、ＵＶ照射とは異なる基礎ＣＴＳＢ発現レベルおよび異なる感受性を示すことを明らかにしている。
４つの異なるヒト不死化または癌細胞株（それぞれ、２９３Ｔ、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、およびＨＣＴ１１６）におけるＣＴＳＢの発現レベル、およびＵＶ照射に対するそれらの反応を検査した。ＵＶ照射の前に、２９３Ｔ（胚腎臓起源）およびＨｅｌａ（頸部腫瘍起源）細胞は、ＣＴＳＢをほとんど発現せず、ＨｅｐＧ２（肝臓癌起源）細胞は、低いＣＴＳＢ発現を示し、ＨＣＴ１１６（結腸癌起源）細胞は、高いＣＴＳＢ発現を示している（図１５）。異なる用量のＵＶを照射した後、ＨｅｌａおよびＨｅｐＧ２細胞は、およそ１００Ｊ／ｍ２で飽和状態に到達する、ＣＴＳＢ発現の強力な上方調節を示し、ＨＣＴ１１６細胞は、ＣＴＳＢ発現において明らかな変化を示さなかった（図１６）。２９３Ｔ細胞はまた、ＵＶ照射に反応してＣＴＳＢ発現の上方調節を示したが、ＣＴＳＢ発現レベルは、むしろ低かった（図１６）。
４つの異なるヒト不死化または癌細胞株（それぞれ、２９３Ｔ、Ｈｅｌａ、ＨｅｐＧ２、およびＨＣＴ１１６）におけるＣＴＳＢの発現レベル、およびＵＶ照射に対するそれらの反応を検査した。ＵＶ照射の前に、２９３Ｔ（胚腎臓起源）およびＨｅｌａ（頸部腫瘍起源）細胞は、ＣＴＳＢをほとんど発現せず、ＨｅｐＧ２（肝臓癌起源）細胞は、低いＣＴＳＢ発現を示し、ＨＣＴ１１６（結腸癌起源）細胞は、高いＣＴＳＢ発現を示している（図１５）。異なる用量のＵＶを照射した後、ＨｅｌａおよびＨｅｐＧ２細胞は、およそ１００Ｊ／ｍ２で飽和状態に到達する、ＣＴＳＢ発現の強力な上方調節を示し、ＨＣＴ１１６細胞は、ＣＴＳＢ発現において明らかな変化を示さなかった（図１６）。２９３Ｔ細胞はまた、ＵＶ照射に反応してＣＴＳＢ発現の上方調節を示したが、ＣＴＳＢ発現レベルは、むしろ低かった（図１６）。
【0358】
実施例１７：この実施例は、ブロックＲＩＢＥをブロックするカテプシンＢ阻害剤を同定している。
本発明者らは、局所ＵＶ照射（ＬＵＩ）動物内ＲＩＢＥモデル（上記の図３を参照されたい）を使用して、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の阻害剤がＬＵＩによって誘発されたＲＩＢＥに干渉し得るかどうかを検査した。本発明者らは、最初に、ＣＴＳＢの選択的阻害剤である、ＣＡ０７４［Ｎ－（ｌ－３－トランス－プロピルカルバモイルオキシラン－２－カルボニル）－ｌ－イソロイシル－ｌ－プロリン］、および細胞内カテプシンＢに対する膜透過性プロ阻害剤である、ＣＡ０７４メチルエステル（ＣＡ０７４Ｍｅ）を試験した。図１７に示すように、ＣＡ０７４またはＣＡ７４Ｍｅのいずれかによる処理は、頭部領域でＬＵＩにより処理された動物の後部の曝露されていない領域において、バイスタンダＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐ反応を無効にした。本発明者らは、カテプシンＢを含む、幅広い範囲のシステインペプチダーゼを不可逆的に阻害し得る、エポキシドであるＥ６４と同様の結果を観察した。これらの結果は、ヒトＣＴＳＢ阻害剤が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてＲＩＢＥをブロックすることができ、特定の実施形態では、ヒトにおけるＲＩＢＥを阻害し得ることを示している。
本発明者らは、局所ＵＶ照射（ＬＵＩ）動物内ＲＩＢＥモデル（上記の図３を参照されたい）を使用して、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）の阻害剤がＬＵＩによって誘発されたＲＩＢＥに干渉し得るかどうかを検査した。本発明者らは、最初に、ＣＴＳＢの選択的阻害剤である、ＣＡ０７４［Ｎ－（ｌ－３－トランス－プロピルカルバモイルオキシラン－２－カルボニル）－ｌ－イソロイシル－ｌ－プロリン］、および細胞内カテプシンＢに対する膜透過性プロ阻害剤である、ＣＡ０７４メチルエステル（ＣＡ０７４Ｍｅ）を試験した。図１７に示すように、ＣＡ０７４またはＣＡ７４Ｍｅのいずれかによる処理は、頭部領域でＬＵＩにより処理された動物の後部の曝露されていない領域において、バイスタンダＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐ反応を無効にした。本発明者らは、カテプシンＢを含む、幅広い範囲のシステインペプチダーゼを不可逆的に阻害し得る、エポキシドであるＥ６４と同様の結果を観察した。これらの結果は、ヒトＣＴＳＢ阻害剤が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてＲＩＢＥをブロックすることができ、特定の実施形態では、ヒトにおけるＲＩＢＥを阻害し得ることを示している。
【0359】
実施例１８：この実施例は、ＲＩＢＥの新規阻害剤のための治療薬物スクリーニングについての動物モデルとして、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを同定している。
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙの異所性咽頭の発現が、有意な胚致死性および幼虫停止を引き起こし（図９を参照されたい）、ヒトＣＴＳＢ阻害剤が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてＲＩＢＥをブロックする（図１７）ため、本発明者らは、ＲＩＢＥの新規阻害剤またはモジュレータに対するスクリーニングに対してこの特徴を利用することができる。一実施形態では、成体のＰｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子導入動物を、先に上に記載の（４４、４５）化合物または薬物を含有する線形動物の成長培地（ＮＧＭ）プレート上に置く可能性がある。Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子導入動物の後代において胚致死性および幼虫停止の両方を有意に阻害し得る化合物を、選択し、３重に再試験し得る。上に記載のＬＵＩアッセイを使用して、候補化合物のＲＩＢＥ阻害効果を確認し得る。
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙの異所性咽頭の発現が、有意な胚致死性および幼虫停止を引き起こし（図９を参照されたい）、ヒトＣＴＳＢ阻害剤が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてＲＩＢＥをブロックする（図１７）ため、本発明者らは、ＲＩＢＥの新規阻害剤またはモジュレータに対するスクリーニングに対してこの特徴を利用することができる。一実施形態では、成体のＰｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子導入動物を、先に上に記載の（４４、４５）化合物または薬物を含有する線形動物の成長培地（ＮＧＭ）プレート上に置く可能性がある。Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子導入動物の後代において胚致死性および幼虫停止の両方を有意に阻害し得る化合物を、選択し、３重に再試験し得る。上に記載のＬＵＩアッセイを使用して、候補化合物のＲＩＢＥ阻害効果を確認し得る。
【0360】
実施例１９：この実施例は、本発明の実施形態に関連する様々な方法および装置を明らかにしている。
菌株および培養条件。本発明者らは、別段明記されない限り、標準的な手順［３１］を使用して、２０℃でＣ．ｅｌｅｇａｎｓの菌株を培養した。本発明者らは、野生型菌株としてＮ２ Ｂｒｉｓｔｏｌ菌株を使用した。遺伝子分析において、以下の染色を使用した。ＬＧＩ、ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）、ｄａｆ－１６（ｍｕ８６）、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）、ＬＧＩＩ、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグの単一のコピー挿入、Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐの単一のコピー挿入、ＬＧＩＩＩ、ｄａｆ－２（ｅ１３７０）、ｇｌｐ－１（ｅ２１４１）、ＬＧＶ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）、ｚｃＩｓ４（Ｐｈｓｐ－４：：ｇｆｐ）、ＬＧＸ、ｐｄｋ－１（ｓａ６８０）。各単一のコピー挿入導入遺伝子を、使用される前、Ｎ２動物で少なくとも４回戻し交配した。
菌株および培養条件。本発明者らは、別段明記されない限り、標準的な手順［３１］を使用して、２０℃でＣ．ｅｌｅｇａｎｓの菌株を培養した。本発明者らは、野生型菌株としてＮ２ Ｂｒｉｓｔｏｌ菌株を使用した。遺伝子分析において、以下の染色を使用した。ＬＧＩ、ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）、ｄａｆ－１６（ｍｕ８６）、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）、ＬＧＩＩ、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグの単一のコピー挿入、Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐの単一のコピー挿入、ＬＧＩＩＩ、ｄａｆ－２（ｅ１３７０）、ｇｌｐ－１（ｅ２１４１）、ＬＧＶ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）、ｚｃＩｓ４（Ｐｈｓｐ－４：：ｇｆｐ）、ＬＧＸ、ｐｄｋ－１（ｓａ６８０）。各単一のコピー挿入導入遺伝子を、使用される前、Ｎ２動物で少なくとも４回戻し交配した。
【0361】
照射。線形動物の成長培地（ＮＧＭ）プレート上で、または液体培地を有するプラスチックチューブ中に成長した生体動物に、ＵＶ－架橋剤またはＣｏ６０放射線供給源を使用して、室温で照射した。ＵＶ照射の容量は、１００Ｊ／ｍ２であった。Ｃｏ６０照射の用量は、３３．３Ｇｙ／分の用量速度で５００Ｇｙであった。照射の直後に、プレートを、２０℃のインキュベータに戻した。条件培地を作出するために、照射後に、プラスチックチューブを２０℃のシェーカに置いた。疑似被照射対照を、すべての照射実験に使用した。
【0362】
被照射動物からの条件培地の作出。３つのＮＧＭプレート（直径６ｃｍ）から、餓死に近いＣ．ｅｌｅｇａｎｓ動物を洗浄し、食物供給源として豊富なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株ＨＢ１０１を使用して、２５０ｍＬのＳ培地中で６日間培養した（１００ｍＭのＮａＣｌ、５．８ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、４４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．０１３ｍＭのコレステロール、１ｍＭのクエン酸一水和物、９ｍＭのクエン酸三カリウム一水和物、０．０５ｍＭの二ナトリウムＥＤＴＡ、０．０２５ｍＭのＦｅＳＯ４、０．０１ｍＭのＭｎＣｌ２、０．０１ｍＭのＺｎＳＯ４、０．００１ｍＭのＣｕＳｏ４、１．５ｍＭのＣａＣｌ２、３ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１３ｍＭのアンピシリン、０．００７ｍＭの硫酸ストレプトマイシン、０．１６ｍＭのネオマイシン硫酸塩、および０．０２ｍＭのニスタチン）。大部分が成体である動物を、４℃で１０分間、沈殿によって得、Ｓ培地で３回洗浄した。本発明者らは、動物の密度を、Ｓ培地中におよそ２動物／μＬに調節し、それらを水晶プレート（蓋を有する）に移し、所望の用量を有するＵＶを使用してそれらを照射するか、または疑似照射した。ＩＲ照射について、同じ密度の動物を、１５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ遠心チューブに移し、５００Ｇｙ ＩＲを使用して照射するか、または疑似照射した。被照射または疑似被照射動物を、新たなＳ培地で洗浄し、ＨＢ１０１細菌を補充した６ｍＬのＳ培地中の１５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ遠心チューブに移し、一定の２００ｒｐｍの振とうで２４時間、２０℃のシェーカ中に成長させた。その後、本発明者らは、１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離によって動物および細菌を除去し、０．２２μｍのフィルタユニットで培地を濾過し、条件培地を得た。次に、条件培地を、１０ｋＤの限外濾過チューブ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５、ミリポア）を通過させることによって濃縮し、Ｓ培地を使用して、０．１μｇ／μＬの総タンパク質濃度に調節した。Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグからＵＶ－ＣＭおよびＵＶ－Ｃｔｒｌを作出するために、ｄａｆ－２（ｅ１７３０）、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物、動物を含有する餓死プレートを、３００個の新規のＮＧＭプレートに切り分け、これを、２日間、２０℃で置き、その後、もう１日２５℃に移行させた。ＵＶ－被照射または疑似被照射動物を、２４時間２５℃のシェーカで成長させて、ＵＶ－ＣＭおよびＵＶ－Ｃｔｒｌを得た。
【0363】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける局所照射。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬ４幼虫を、１０ｎＭのアジ化ナトリウムを有するアガロースパッド（２％）上に埋め込み、４０ｘ／０．９のＮＡ Ｐｌａｎ Ａｐｏ Ｌａｍｂｄａの対物レンズを有する倒立Ｔｉ－Ｅ顕微鏡上でＮｉｋｏｎ Ａ１レーザー走査型共焦点を使用して、頭部領域で照射した。取り付け時に、ＵＶの波長に非常に近い、４０５ｎｍのレーザー出力を、ファイバで２３．３２ｍＷで測定した。２．２マイクロ秒／画素に対して０．５８ミクロン×０．５８ミクロンの画素サイズを有する５１２×５１２で、６０％の４０５ｎｍのレーザー出力を使用して、照射を行った。本発明者らは、Ｔｈｏｒ ｌａｂｓ ｐｏｗｅｒ ｍｅｔｅｒ（ＰＭ１００Ｄ）および光センサ（Ｓ１４０Ｃ）を使用して、およそ０．２５～０．３０ｍＷになるように、試料平面で出力を測定した。これは、試料では、およそ０．７５～０．８９ｍＷ／ミクロン２に対応する。疑似照射の対照について、アガロースパッド上の動物からわずかに離れた領域に照射した。照射後、直後に、動物を、アガロースパッドから回収し、一定のＮＧＭプレートに移し、動物内バイスタンダ効果についてアッセイする前に、２４時間２０℃で、または２０時間２５℃で（胚致死性アッセイ）回復させた。３つのアッセイを実施して、曝露されていない領域の動物内バイスタンダ効果を監視した。それらは、後部生殖腺における生殖細胞死骸アッセイ、被照射動物のＦ１の後代の胚致死性アッセイ、および後部領域のＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐストレス反応アッセイである。Ｐｈｓｐ－４：：ｇｆｐストレス反応アッセイについて、ＬＵＩの後、２５℃で、ｄａｆ－２（ｅ１３７０ｔｓ）菌株および対応する対照菌株を使用した実験を行った。胚致死性アッセイについて、２５℃での２０時間の回復後、被照射または疑似被照射動物を、ＮＧＭプレート上に置き、２５℃で４時間、産卵させ、次に、新たなＮＧＭプレートに移した。さらに２回移した後、動物を処分した。孵化しなかったいくつかの卵（死んだ卵としてスコア化）および幼虫に成長したいくつかの卵をスコア化し、これらを使用して、胚致死性の割合を判定した。
【0364】
食物供給源としてホルムアルデヒドで処理された細菌。ＨＢ１０１細菌を、３．７％のホルムアルデヒドで１０分間処理し、Ｓ培地で３回洗浄し、遠心分離によって回収した。細菌を、抗生物質を含まず、細菌コロニーが観察されないプレート上に広げることによって、細胞死を評価した。細菌ペレットを、Ｓ培地に加えて、蠕虫を成長させた。
【0365】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）実験。細菌供給プロトコルを使用して、ＲＮＡｉ実験を行った。ＨＴ１１５細菌を、ｐＰＤ１２９．３６－ｃｐｒ－４で形質変換するか、またはそれぞれ、ｃｐｒ－４ ＲＮＡｉおよび対照ＲＮＡｉ実験において、ｐＰＤ１２９．３６プラズミドを使用した。他のＲＮＡｉ実験において使用された細菌クローンは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入したＲＮＡｉライブラリからのものである。液体培地中でＲＮＡｉ実験を行うために、ＲＮＡｉ細菌を有する３つのＮＧＭプレートを使用して、プレートがほとんど餓死するまで、３０匹の幼虫段階の４（Ｌ４）Ｎ２動物を供給した。次に、本発明者らは、プレートの外で動物を洗浄し、０．５ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）およびＲＮＡｉ細菌を含有する２５０ｍＬのＳ培地を有するガラスのフラスコにそれらを移し、もう１回作出するためにそれらを成長させた。条件培地を得るための手順は、上に記載のものと同様である。
【0366】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ動物を９６ウエルプレート中に成長させる。ＨＢ１０１細菌を、９６ウエルプレート中に、２．８μＭの組み換えｔＣＰＲ－４タンパク質（野生型または変異体）または０．２７μＭの組み換えヒトカテプシンＢを含有する、１００μＬの条件培地（０．１μｇ／μＬ）または１００μＬのＳ培地と混合した。およそ６０匹のＬ４幼虫を、プレートの各ウエルに移した。液体培地中で４８時間培養した後、生殖細胞の死骸および有糸分裂核の数について、これらの動物をスコア化した。
【0367】
条件培地の酵素処理。異なる酵素で条件培地を処理することによって、ＲＩＢＥ因子の性質を分析した。１μＬのデオキシリボヌクレアーゼ（１単位／μＬ、ＱＩＡＧＥＮ）、１μＬのリボヌクレアーゼ（１００μｇ／μＬ、ＱＩＡＧＥＮ）、または１μＬのトリプシン（５μｇ／μＬ、Ｓｉｇｍａ）を、３０℃で１時間、１００μＬの条件培地と混合した。次に、処理済みまたは未処理の条件培地を使用して、９６ウエルプレート中に２０℃で４８時間、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）動物を培養した。
【0368】
生殖細胞の死骸の定量化。上に記載の９６ウエルプレートの液体培地中に、Ｌ４動物を培養した。４８時間後、それらをＮＧＭプレートに移し、２０℃で１時間、回復させた。次に、２０ｍＭのＮａＮ３によって、動物を麻酔し、２％の寒天パッドに埋め込み、Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学下でスコア化した。咽頭にＣＰＲ－４を発現する遺伝子導入動物について、生殖細胞の死骸についてスコア化する前に、２０℃で２４時間、ＮＧＭプレート上でＬ４動物を成長させた。無傷の生殖腺の後部アームのみをスコア化した。すべての生殖細胞の死骸の定量化実験において、盲検試験を実施した。
【0369】
有糸分裂核の定量化。Ｌ４動物を、４８時間、液体培地における２．８μＭの精製されたｔＣＰＲ－４タンパク質で処理し、ＮＧＭプレートに移し、２０℃で１時間、回復させた。次に、それらを解剖し、先に記載されるプロトコル後に、それらの生殖腺を露出させた［２４］。解剖した生殖腺を固定し、ＤＡＰＩで染色した。ＤＡＰＩフィルタを有するＺｅｉｓｓ Ｎｏｍａｒｓｋｉ顕微鏡を使用して、各生殖腺の有糸分裂ゾーンにおける、いくつかの生殖核およびいくつかの中期核をスコア化した。
【0370】
ＧＦＰレポータを通したｃｐｒ－４の発現レベルの定量化。Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐ導入遺伝子の単一コピー挿入を使用して、照射の前後にｃｐｒ－４の発現レベルを判定した。中間段階のＬ４ Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐおよびｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）、Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐの幼虫に、１００Ｊ／ｍ２ＵＶを照射し、撮像前に２０℃で２時間、回復させた。Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学下で画像を補足することによって、動物のＧＦＰ発現パターンを記録した。すべての画像の曝露時間を、１００ｍｓに固定した。Ｉｍａｇｅ Ｊのソフトウエア（ＮＩＨ）を使用して、各動物におけるＧＦＰ蛍光の強度を定量化した。照射なしの異なる発生段階のｃｐｒ－４の発現レベル（胚、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４幼虫、Ｌ４後の２４時間および４８時間の成体）を、同じ方法を使用して判定した。
【0371】
胚致死性および幼虫停止アッセイ。直接照射によって引き起こされた胚致死性アッセイについて、１００Ｊ／ｍ２ＵＶまたは５００Ｇｙのガンマ線を照射した後、受胎した成体を、ＮＧＭプレート上に置き、２５℃で４時間、産卵させ、次に、プレートから除去した。液体培地における胚致死性アッセイについて、Ｌ４幼虫を、２０℃で４８時間、精製したタンパク質を含有する条件培地またはＳ培地中で培養し、液体培地から新たなＮＧＭプレートに移し、成体動物を除去する前に、２５℃で４時間、産卵させた。咽頭にＣＰＲ－４を発現する遺伝子導入動物における胚致死性アッセイについて、Ｌ４の２４時間後の遺伝子導入受胎成体を、ＮＧＭプレート上に置き、２５℃で４時間、産卵させ、次に、プレートから除去した。すべての場合において、ＮＧＭプレート上で２５℃で２４時間後に、孵化しなかったいくつかの卵（死んだ卵としてスコア化）および幼虫に成長したいくつかの卵をスコア化し、これらを使用して、胚致死性の割合を判定した。
【0372】
幼虫停止アッセイについて、受胎した遺伝子導入成体を、ＮＧＭプレート、対照ＲＮＡｉプレート、またはｃｐｒ－４ ＲＮＡｉプレート上に置き、２５℃で４時間、産卵させた。プレートを２０℃のインキュベータに戻す前に、孵化したいくつかの遺伝子導入の幼虫を、蛍光立体鏡下でスコア化した。３日後、成体段階に入らなかったいくつかの遺伝子導入動物をスコア化し、これらを使用して、幼虫停止の割合を判定した。
【0373】
分子生物学。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｃＤＮＡライブラリからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、完全な長さのｃｐｒ－４ ｃＤＮＡを増幅させた。ＳｉｇｎａｌＰ ３．０サーバを使用して、ＣＰＲ－４のシグナルペプチドを予測する。ｐＧＥＸ４Ｔ－２－ｔＣＰＲ－４プラズミドを構成するために、残基１６－３３６をコードするｃｐｒ－４ ｃＤＮＡの断片を、完全な長さのｃｐｒ－４ ｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅し、そのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位を通して、ＧＳＴコード化配列直後に挿入されたＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位ＬＥＶＬＦＱＧＰを有する、修飾ｐＧＥＸ４Ｔ－２ベクタにサブクローン化した。ｐＧＥＸ４Ｔ－２－ｔＣＰＲ－４（Ｃ１０９Ａ）、ｐＧＥＸ４Ｔ－２－ｔＣＰＲ－４（Ｈ２８１Ａ）、およびｐＧＥＸ４Ｔ－２－ｔＣＰＲ－４（Ｎ３０１Ａ）ベクタを作成するために、２工程ＰＣＲを使用して、そのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位を通して同じ修飾ｐＧＥＸ４Ｔ－２ベクタにサブクローン化された、示された変異を保有するｔＣＰＲ－４ ｃＤＮＡ断片を作出した。Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｐｍｙｏ－２：：ｔＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４（Ｃ１０９Ａ）：：ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４（Ｈ２８１Ａ）：：ｍＣｈｅｒｒｙ、およびＰｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４（Ｎ３０１Ａ）：：ｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクタを構成するために、２工程ＰＣＲ方法を使用して、完全な長さのＣＰＲ－４（Ｃ１０９Ａ）、ＣＰＲ－４（Ｈ２８１Ａ）、およびＣＰＲ－４（Ｎ３０１Ａ）をコードするｃＤＮＡ断片を、最初に、作出した。ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＰＲ－４（Ｃ１０９Ａ）：：ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＰＲ－４（Ｈ２８１Ａ）：：ｍＣｈｅｒｒｙ、およびＣＰＲ－４（Ｎ３０１Ａ）：：ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＤＮＡ断片を、同様に、ＰＣＲ増幅し、そのＮｈｅＩ部位を通して修飾ｐＣＦＪ９０ベクタ（Ａｄｄｇｅｎｅ）にサブクローン化した。
【0374】
単一のコピー統合導入遺伝子を作出するためのプラズミドｐＣＦＪ１５１－Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグを作成するために、ｃｐｒ－４プロモータ配列の４０１８ｂｐ、ｃｐｒ－４ゲノムのコード化配列の１１９６ｂｐ、およびｃｐｒ－４ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の２２６７ｂｐを含有する、ｃｐｒ－４ゲノムの断片（Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：ｕｔｒ）を、ＰｍｌＩおよびＢｓｓＨＩＩによる消化を通してフォスミドＷＲＭ０６１９ｂＨ１１から切除し、次に、そのＢｓｓＨＩＩ部位および鈍化ＡｖｒＩＩ部位を通して修飾ｐＣＦＪ１５１プラズミドにサブクローン化した。次に、このＰｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：ｕｔｒゲノムの断片を、ＡｆｌＩＩおよびＮｈｅＩ消化を通してプラズミドから切除し、そのＡｆｌＩＩおよびＮｈｅＩ部位を通してプラズミドｐＳＬ１１９０にサブクローン化した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ方法を通してｃｐｒ－４コード化領域の直後に、フラグタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を挿入した。修飾Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：ｆｌａｇ：：ｕｔｒゲノムの断片を、そのＡｆｌＩＩおよびＮｈｅＩ部位を通してｐＣＦＪ１５１にサブクローン化し、プラズミドｐＣＦＪ１５１－Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグを得た。
【0375】
単一のコピー挿入のためのプラズミドｐＳＬ１１９０－Ｐｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐ、ｃｐｒ－４プロモータを含有する４１１４ｂｐ断片、およびｃｐｒ－４コード化領域の第１の５８ｂｐを構成するために、ＮＬＳ：：ＧＦＰコード化配列およびｕｎｃ－５４ ３’ＵＴＲを含有する１７６７ｂｐ断片、ＬＧＩＩ ＭｏｓＩ部位（ｔｔＴｉ５６０５）の１３３７ｂｐの上流の相同な組み合わせ断片、およびＬＧＩＩ ＭｏｓＩ部位の１４１８ｂｐの下流の相同な組み合わせ断片を、Ｇｉｂｓｏｎ連結方法を使用して、そのＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位を通してｐＳＬ１１９０プラズミド骨格に連結させた。
【0376】
ｃｐｒ－４ ＲＮＡｉのためのプラズミドを構成するために、完全な長さのｃｐｒ－４ ｃＤＮＡ断片を、ＰＣＲ増幅し、そのＮｈｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉ部位を通してｐＰＤ１２９．３６ベクタにサブクローン化した。作出されたすべてのクローンを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【0377】
遺伝子導入動物。標準的なプロトコルを使用して、遺伝子導入動物を作出した。Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｐｍｙｏ－２：：ｔＣＰＲ－４：：ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４（Ｃ１０９Ａ）：：ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｐｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４（Ｈ２８１Ａ）：：ｍＣｈｅｒｒｙ、またはＰｍｙｏ－２：：ＣＰＲ－４（Ｎ３０１Ａ）：：ｍＣｈｅｒｒｙを、同時注射マーカとしてｐＴＧ９６プラズミド（２０ｎｇ／μＬで）と共に、２０ｎｇ／μＬ（生殖細胞の死骸の定量化のために）または２ｎｇ／μＬ（胚致死性および幼虫停止アッセイのために）で、ｃｅｄ－１（ｅ１７３５）、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物に注射した。ｐＴＧ９６プラズミドは、多数の細胞および大部分の発生段階で発現されるｓｕｒ－５：：ｇｆｐ翻訳融合を含有している［３７］。先に記載されている方法を使用して、単一のコピー挿入Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ導入遺伝子およびＰｃｐｒ－４：：ｎｌｓ：：ｇｆｐ導入遺伝子を作出した。
【0378】
分泌されたＣＰＲ－４：：フラグの免疫ブロット検出。１０ｋＤの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）遠心フィルタカラム（１μｇ／μＬの最終タンパク質濃度）を使用して、被照射Ｎ２、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３１７８）、ｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）、Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、またはＰｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｄａｆ－２（ｅ１３７０）、ｃｐｒ－４（ｔｍ３１７８）動物に由来する条件培地を濃縮した。１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上で濃縮状態の培地を分解させ、ＰＶＤＦ膜に移した。フラグタグに対するモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ３１６５、１：２０００の希釈）および西洋ワサビペルオキシダーゼと接合されたヤギ抗マウス二次的抗体（ＨＲＰ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７０５０４７、１：５０００希釈）を使用して、分泌されたＣＰＲ－４：：フラグを検出した。
【0379】
ＣＰＲ－４：：フラグの喪失。Ｐｃｐｒ－４：：ｃｐｒ－４：：フラグ、ｃｐｒ－４（ｔｍ３７１８）動物に由来するＵＶ－ＣＭまたはＵＶ－Ｃｔｒｌを、回転シェーカ上で４℃で一晩、２０μＬの総容積の抗フラグＭ２の親和性ゲル（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ２２２０）でインキュベートした。抗フラグビードを、２分間、１，００００ｒｐｍで遠心分離によってスピンダウンし、上清を回収し、抗フラグが枯渇した条件培地として使用した。
【0380】
タンパク質発現および精製。Ｎ末端ＧＳＴタグおよびＣ末端Ｈｉｓ６－タグを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）において、ｔＣＰＲ－４または変異体ｔＣＰＲ－４タンパク質（Ｃ１０９Ａ、Ｈ２８１Ａ、またはＮ３０１Ａ）を発現した。Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－０７５６－０１）を使用して、細菌の可溶性画分を精製し、室温で２時間、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼによって切断して、ＧＳＴタグを除去した。次に、Ｎｉ２＋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－５２６８－０１）を使用して、タンパク質をアフィニティ精製し、２５０ｍＭのイミダゾールを有するカラムから溶出した。５ｋＤのＭＷＣＯの遠心フィルタユニットを使用して、精製されたタンパク質を、２００ｎｇ／μＬの最終濃度に濃縮し、磁気攪拌により、４℃で４～６時間、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、および１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含有する透析緩衝液を使用して、２回透析した。透析後、不溶性凝集体を、高速遠心分離によって除去した。次に、タンパク質を、透析緩衝液で１００ｎｇ／μＬの最終濃度に希釈し、アリコートで－８０℃で保存した。正常化対照として既知の濃度を有するｔＣＰＲ－４－Ｈｉｓ６を使用して、抗Ｈｉｓ６免疫ブロット法によって精製されたタンパク質の濃度を判定した。
【0381】
質量分析による分析。銀で染色したゲルから切除された対象となるタンパク質バンドを、１％のフェリシアン化カリウムおよび１．６％のチオ硫酸ナトリウムによって染色し、２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中で１０ｍＭのＤＴＴおよび５５ｍＭのヨードアセトアミドによる還元およびアルキル化に供し、次に、３７℃で１６時間、トリプシン（２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中に２０μｇ／ｍＬ）でゲル内消化した。直鎖状イオントラップ質量分析計（ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、液体クロマトグラフィタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により、反応生成物を分析した。トラップカラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－Ｃ１８、０．３×５ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にわたって試料を搭載し、７５分間で、２～９５％のＨＰＬＣ緩衝液（０．１％のギ酸を含有する９９．９％のアセトニトリル）の勾配を有する分析カラム（ハウス内にパックされた、毛細血管のＲＰ１８カラム、Ｓｙｎｅｒｇｙ ｈｙｄｒｏ－ＲＰ、２．５μｍ、０．０７５×１００ｍｍ）上で、ペプチドを分離した。ＭＳ分析のために、本発明者らは、６つの最も豊富な前駆イオンについて、１つのＭＳスキャンと６つのＭＳ／ＭＳスキャンとの間で交互に行われるデータ依存手順を使用した。消化酵素トリプシンを想定した、ｓｐｒｏｔ＿２０１４０４１６データベース（カエノラブディティス・エレガンスについて選択される、３４６６エントリ）の検索において、結果として生じたスペクトルを使用した。２＋～３＋の電荷状態を有する２つの欠落した切断部位を可能にする、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ；ｖ．２．２．２ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。固定改変（システインのカルバミドメチル化）および可変改変（タンパク質Ｎ末端でのアセチル化、メチオニンの酸化、およびｐｙｒｏ－ＧｌｕへのＧｌｎ変更）の両方について、親イオン質量許容差を、１０ｐｐｍに設定し、断片イオン質量許容差を、０．５Ｄａに設定した。Ｍａｓｃｏｔ Ｄａｅｍｏｎによって生成されたＤＡＴファイルを、Ｓｃａｆｆｏｌｄ３検索エンジンを使用した検索に供した（ｖ．３．０６．０１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｓｏｆｔｗａｒｅ．ｃｏｍ）。ペプチドプロフェットアルゴリズム確率が＞９５％である少なくとも２つのペプチドを含有する、タンパク質の確率が＞９５％である場合、端確執の同定を許容する。
【0382】
生体外でのプロテアーゼ活性の測定。いくつかの改変と共に、先に記載されている方法に従って、ＣＰＲ－４酵素アッセイを行った。２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．８ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、および８ｍＭのＥＤＴＡを含有する、２×反応バッファ中に、カテプシンＢ特異的蛍光発生的基質、Ｚ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－７－アミノ－４－塩酸メチルクマリン（ｚ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、Ｐｅｐｔａｎｏｖａ、カタログ番号８８９３７－６１－５）を溶解した。アッセイについて、発光を測定する前に、２５℃で１０分間、１０μＬのタンパク質（１００ｎｇ／μＬ）または１０μＬの条件培地（１００ｎｇ／μＬ）を、１０μＬの２０μＭのｚ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＡＭＣでインキュベートした。酵素活性を、３８０ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長で二重発光蛍光光度計ＥｎＶｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）において２５℃の中間流速として判定し、キロ相対的蛍光ユニット（ｋＲＦＵ）における相対的な強度として発現させた。組み換えヒトカテプシンＢ（ｒｈＣＴＳＢ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、カタログ番号１０４８３－Ｈ０８Ｈ－１０）を、製造業者によって推奨される緩衝液［２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ、および０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ］中に溶解した。同じ手順を使用して、ＣＰＲ－４タンパク質またはｒｈＣＴＳＢタンパク質に固有のバッファ制御、または疑似被照射条件培地も測定した。背景対照として各実験において、Ｓ培地を使用した。
【0383】
ｃｐｒ－４転写レベルの定量的なＲＴ－ＰＣＲ分析。Ｎ２およびｃｅｐ－１（ｇｋ１３８）Ｌ４幼虫を、新たなＮＧＭプレートに移し、２０℃で２４時間培養した。それらを、１００Ｊ／ｍ２ＵＶもしくは５００Ｇｙガンマ線の照射または疑似照射に供した２時間後に、ＲＮＡｉｓｏキット（ＴａＫａＲａ、カタログ番号９１０８）を使用して、総ＲＮＡ抽出のために溶解した。ＩｍＰｒｏｍ－ＩＩ（商標）逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ３８００）を使用した逆転写（ＲＴ）において、単離した総ＲＮＡをテンプレートとして使用し、製造業者の指示に従って第１の鎖のｃＤＮＡを得た。
【0384】
ＲＯＸを有するｉＴａｑ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号１７２５１５１）を使用した、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システムを使用して、定量的なＰＣＲ分析を実施した。各ＰＣＲ反応は、２５μＬの最終容積中に、１２．５μＬのＢｉｏ－Ｒａｄ ｓｕｐｅｒｍｉｘ溶液、５０ｎＭのフォワードおよびリバースプライマ、および５μＬのｃＤＮＡ（１５０ｎｇ／μＬ）を含有した。９６ウエルの実時間ＰＣＲ検出システムに置かれた実時間ＰＣＲチューブ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号ＴＬＳ０８５１）において、増幅を行った。循環状態は、以下のとおりであった：変性のために、９５℃で３分間、その後、９５℃で２０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で２０秒を５０周期。最終周期後に、融解曲線分析を行い、各反応におけるプライマの特異性を検査した。ＰＣＲ反応を、３重に行い、３回の独立した実験を行った。成体におけるその非常に安定した発現レベルのために、内部参照として、ｐｍｐ－３の転写を使用した。Ｌｉｖａｋ法によってデータを分析した。ｃｐｒ－４を検出するためのプライマは、
５’－ＴＣＧＧＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴ－３’（フォワードプライマ）、および
５’－ＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＣＴＣＧＴＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴ－３’（リバースプライマ）である。
ｐｍｐ－３を検出するためのプライマは、
５’－ＧＴＴＣＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＣＡＴ－３’（フォワードプライマ）、および
５’ＡＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＡＧＡ－３’（リバースプライマ）である。
５’－ＴＣＧＧＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴ－３’（フォワードプライマ）、および
５’－ＧＧＴＡＧＡＡＧＴＣＣＴＣＧＴＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴ－３’（リバースプライマ）である。
ｐｍｐ－３を検出するためのプライマは、
５’－ＧＴＴＣＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＣＴＣＡＴ－３’（フォワードプライマ）、および
５’ＡＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＡＧＡ－３’（リバースプライマ）である。
【0385】
スクリーニングされた化合物と連結されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける局所照射。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬ４幼虫を、１０ｎＭのアジ化ナトリウムを有するアガロースパッド（２％）上に埋め込み、４０×／０．９のＮＡ Ｐｌａｎ Ａｐｏ Ｌａｍｂｄａ対物レンズを有する倒立Ｔｉ－Ｅ顕微鏡上で、Ｎｉｋｏｎ Ａ１レーザー走査型共焦点を使用して、頭部領域に照射した。取り付け時に、ＵＶの波長に非常に近い４０５ｎｍのレーザー出力を、ファイバで２３．３２ｍＷで測定した。２．２μｓ 画素－１に対して、０．５８μｍ×０．５８μｍの画素サイズを有する５１２×５１２の６０％４０５ｎｍのレーザー出力を使用して、照射を行った。本発明者らは、Ｔｈｏｒ ｌａｂｓ ｐｏｗｅｒ ｍｅｔｅｒ（ＰＭ１００Ｄ）および光センサ（Ｓ１４０Ｃ）を使用して、およそ０．２５～０．３０ｍＷになるように、試料平面で出力を測定した。これは、試料のおよそ０．７５～０．８９ｍＷ μｍ－２に対応している。疑似照射の対照について、アガロースパッド上の動物からわずかに離れた領域に照射した。照射後、直後に、動物を、アガロースパッドから回収し、一定のＮＧＭプレートに移し、動物内バイスタンダ効果についてアッセイする前に、２４時間２０℃で、または２０時間２５℃で（胚致死性アッセイ）回復させた。３つのアッセイを実施して、曝露されていない領域の動物内バイスタンダ効果を監視した。それらは、生殖腺におけるｈｕｓ－１：：ＮｅｏＧｒｅｅｎ染色体ＤＮＡ損傷アッセイ、被照射動物のＦ１の後代の胚致死性アッセイ、および後部領域におけるＰｈｓｐ－４：：ｇｆｐストレス反応アッセイである。
【0386】
生体外のＣＴＳＢまたはＣＰＲ－４プロテアーゼ活性の測定。カテプシンＢ特異的蛍光発生的基質、Ｚ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－７－アミノ－４－塩酸メチルクマリン（ｚ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、Ｐｅｐｔａｎｏｖａ、８８９３７－６１－５）を、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．８ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、および８ｍＭのＥＤＴＡを含有する２×反応バッファ中に溶解した。アッセイについて、５μＬのタンパク質（１００ｎｇ μｌ－１）および５μＬの化合物を、発光を測定する前に、３７℃で６０分間、１０μＬの２０μＭのｚ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＡＭＣでインキュベートした。３８０ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長の蛍光光度計Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａ ＭＡＸ Ｍ５において、３７℃の中間流速として酵素活性を判定した。脱イオン蒸留水を、各実験において背景対照として使用した。阻害率＝（化合物を含む対照ＯＤ－ＯＤ）／対照ＯＤ×１００％。少なくとも６つの異なる阻害剤濃度による阻害率の測定値によって、ＩＣ５０の値を判定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いる非直鎖状回帰によって、すべての動態パラメータを判定した。
【0387】
胚致死性アッセイ胚致死性アッセイのために、ＬＵＩ処理後に２５℃での２０時間の回復後、被照射または疑似被照射動物を、ＮＧＭプレート上に置き、２５℃で４時間、卵を孵化させ、次に、新たなＮＧＭプレートに移した。さらに２回移した後、動物を処分した。孵化しなかったいくつかの卵（死んだ卵としてスコア化）および幼虫に成長したいくつかの卵をスコア化し、これらを使用して、胚致死性の割合を判定した。抗体治療による胚致死性アッセイについて、Ｌ４幼虫を、ＮＧＭプレート上に置いて、ＬＵＩ処理後６時間、回復させ、２０℃で１２時間、１００倍に希釈した抗フラグＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ）を含有するＭ９緩衝液中で培養し、液体培地から新たなＮＧＭプレートに移し、２５℃で４時間、産卵させた。さらに２回移した後、動物を処分し、胚致死性の割合を、上記のようにスコア化した。
【0388】
ＨＵＳ－１：：ＮｅｏＧｒｅｅｎ染色体ＤＮＡ損傷アッセイｈｕｓ－１：：ネオグリーンノックインを保有する野生型動物を使用して、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの有糸分裂生殖細胞における染色体ＤＮＡ損傷を評価した。ＬＵＩ処理の後、被照射動物を、０．２ｍＭのＬｅｖａｍｉｓｏｌｅ（Ｓｉｇｍａ）における顕微鏡のスライド上に乗せ、Ｎｏｍａｒｓｋｉ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、単一のＳスタックにおけるＨＵＳ－１：：ＮｅｏＧｒｅｅｎ焦点をスコア化した。次に、ＨＵＳ－１：：ＮｅｏＧｒｅｅｎ焦点を有する有糸分裂生殖細胞のパーセンテージを判定した。
【0389】
当業者であれば、上に記載の実施形態に基づいて本発明のさらなる特徴および利点を理解するか、または単なるルーチン的な実験を使用して解明するであろう。したがって、本発明は、具体的に示され、記載されるものによって限定されない。すべての公報および参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0390】
参考文献
以下の参考文献の各々が参照により組み込まれる。
［１］Ｍｏｔｈｅｒｓｉｌｌ，Ｃ． ＆ Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｃ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔｓ：ｐａｓｔ ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１５５，７５９－７６７（２００１）．
［２］Ｐｒｉｓｅ，Ｋ．Ｍ． ＆ Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ９，３５１－３６０（２００９）．
［３］Ｒｚｅｓｚｏｗｓｋａ－Ｗｏｌｎｙ，Ｊ．，Ｐｒｚｙｂｙｓｚｅｗｓｋｉ，Ｗ．Ｍ． ＆ Ｗｉｄｅｌ，Ｍ．Ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔｓ，ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２５，１５６－１６４（２００９）．
［４］Ｓｔｅｒｇｉｏｕ，Ｌ．，Ｄｏｕｋｏｕｍｅｔｚｉｄｉｓ，Ｋ．，Ｓｅｎｄｏｅｌ，Ａ． ＆ Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｏ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＵＶ－Ｃ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１４，１１２９－１１３８（２００７）．
［５］Ｄｅｒｒｙ，Ｗ．Ｂ．，Ｐｕｔｚｋｅ，Ａ．Ｐ． ＆ Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｊ．Ｈ．Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｐ５３：Ｒｏｌｅ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｍｅｉｏｓｉｓ，ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，５９１－５９５（２００１）．
［６］Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｂ．，Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｕｌｔｏｎ，Ｓ． ＆ Ｇａｒｔｎｅｒ，Ａ．Ｔｈｅ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１，１７２２－１７２７（２００１）．
［７］Ｋｌｏｋｏｖ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｌｏｗ ｄｏｓｅ ＩＲ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＩＧＦ－１－ｓＣＬＵ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａ ｐ５３－ｒｅｐｒｅｓｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｃａｄｅ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ＴＧＦｂｅｔａ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｃｏｎｆｅｒ ａ ｐｒｏ－ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２，４７９－４９０（２０１３）．
［８］Ｋｏｔｕｒｂａｓｈ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ：Ｃｒａｎｉａｌ Ｘ－ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｅｌｅｖａｔｅｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ，ａｌｔｅｒｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐ５３ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｓｈｉｅｌｄｅｄ ｓｐｌｅｅｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．７０，５５４－５６２（２００８）．
［９］Ｓｕｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＷＮＴ１６Ｂ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１８，１３５９－１３６８（２０１２）．
［１０］Ｂｕｃｋ，Ｍ．Ｒ．，Ｋａｒｕｓｔｉｓ，Ｄ．Ｇ．，Ｄａｙ，Ｎ．Ａ．，Ｈｏｎｎ，Ｋ．Ｖ． ＆ Ｓｌｏａｎｅ，Ｂ．Ｆ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ－Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｈｕｍａｎ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ－Ｂ ｆｒｏｍ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ－Ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８２，２７３－２７８（１９９２）．
［１１］Ｐｏｏｌｅ，Ａ．Ｒ．，Ｔｉｌｔｍａｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｒｅｃｋｌｉｅｓ，Ａ．Ｄ． ＆ Ｓｔｏｋｅｒ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ ａｔ ｔｈｅ ｅｄｇｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｆｉｂｒｏａｄｅｎｏｍａｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２７３，５４５－５４７（１９７８）．
［１２］Ｌａｒｍｉｎｉｅ，Ｃ．Ｇ． ＆ Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ－ｌｉｋｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５，７５－８２（１９９６）．
［１３］Ｌｏｒｉｍｏｒｅ，Ｓ．Ａ．，Ｒａｓｔｏｇｉ，Ｓ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｄ．，Ｃｏａｔｅｓ，Ｐ．Ｊ． ＆ Ｗｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｇ．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐ５３ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ－ｔｙｐｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１７９，４０６－４１５（２０１３）．
［１４］Ｃａｌｆｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＩＲＥ１ ｃｏｕｐｌｅｓ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｌｏａｄ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃａｐａｃｉｔｙ ｂｙ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ＸＢＰ－１ ｍＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ ４１５，９２－９６（２００２）．
［１５］Ｂｅｒｔｕｃｃｉ，Ａ．，Ｐｏｃｏｃｋ，Ｒ．Ｄ．，Ｒａｎｄｅｒｓ－Ｐｅｈｒｓｏｎ，Ｇ． ＆ Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｅａｍ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｎｅｍａｔｏｄｅ．Ｊ Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．５０ Ｓｕｐｐｌ Ａ，Ａ４９－５４（２００９）．
［１６］Ｍｏｒｔ，Ｊ．Ｓ． ＆ Ｂｕｔｔｌｅ，Ｄ．Ｊ．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２９，７１５－７２０（１９９７）．
［１７］Ｓｈｏｒｅ，Ｄ．Ｅ． ＆ Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．Ａ ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２３，４０９－４２０（２０１３）．
［１８］Ｋｅｎｙｏｎ，Ｃ．Ｊ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｇｅｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，５０４－５１２（２０１０）．
［１９］Ｐｅｒｒｉｎ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ－１ ａｎｄ Ｒａｓ／ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２０，９７－１０７（２０１３）．
［２０］Ｓｃｏｔｔ，Ｂ．Ａ．，Ａｖｉｄａｎ，Ｍ．Ｓ． ＆ Ｃｒｏｗｄｅｒ，Ｃ．Ｍ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉｃ ｄｅａｔｈ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ ＤＡＦ－２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，２３８８－２３９１（２００２）．
［２１］Ｐａｒａｄｉｓ，Ｓ．，Ａｉｌｉｏｎ，Ｍ．，Ｔｏｋｅｒ，Ａ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｈ． ＆ Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．Ａ ＰＤＫ１ ｈｏｍｏｌｏｇ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ａｎｄ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｔｒａｎｓｄｕｃｅ ＡＧＥ－１ ＰＩ３ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｄｉａｐａｕｓｅ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，１４３８－１４５２（１９９９）．
［２２］Ｌｉｎ，Ｋ．，Ｄｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｒｏｄａｎ，Ａ． ＆ Ｋｅｎｙｏｎ，Ｃ．ｄａｆ－１６：Ａｎ ＨＮＦ－３／ｆｏｒｋｈｅａｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ｔｈａｔ ｃａｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ｄｏｕｂｌｅ ｔｈｅ ｌｉｆｅ－ｓｐａｎ ｏｆ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８，１３１９－１３２２（１９９７）．
［２３］Ｏｇｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｆｏｒｋ ｈｅａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＤＡＦ－１６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３８９，９９４－９９９（１９９７）．
［２４］Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｋｏｒｔａ，Ｄ．Ｚ．，Ｃａｐｕａ，Ｙ． ＆ Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｅ．Ｊ．Ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３７，６７１－６８０（２０１０）．
［２５］Ｐｉｎｋｓｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｇａｒｉｇａｎ，Ｄ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｍ． ＆ Ｋｅｎｙｏｎ，Ｃ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｏｆ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３，９７１－９７５（２００６）．
［２６］Ｎｉｋｊｏｏ，Ｈ． ＆ Ｋｈｖｏｓｔｕｎｏｖ，Ｉ．Ｋ．Ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ａｎｄ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｉｓｓｕｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｒｉｓｋ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ．Ｈｕｍ．Ｅｘｐ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２３，８１－８６（２００４）．
［２７］Ｍｏｔｈｅｒｓｉｌｌ，Ｃ． ＆ Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｃ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ：ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ？ Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ６，４４７－４５４（２００６）．
［２８］Ｒｅｃｋｌｉｅｓ，Ａ．Ｄ．，Ｔｉｌｔｍａｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｓｔｏｋｅｒ，Ｔ．Ａ． ＆ Ｐｏｏｌｅ，Ａ．Ｒ．Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ａｎｄ ｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｉｓｓｕｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０，５５０－５５６（１９８０）．
［２９］Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ． ＆ Ｋｉｒｓｃｈｋｅ，Ｈ．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ，Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｈ，ａｎｄ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８０ Ｐｔ Ｃ，５３５－５６１（１９８１）．
［３０］Ｓｈｒｅｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｂｌｕｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２５，２４６５－２４７９（２０１１）．
［３１］Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７７，７１－９４（１９７４）．
［３２］Ｆｒｏｋｊａｅｒ－Ｊｅｎｓｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｐｙ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４０，１３７５－１３８３（２００８）．
［３３］Ｔｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．，Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．Ｌ． ＆ Ｆｉｒｅ，Ａ．Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｓＲＮＡｓ ｃａｎ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｇｅｎｅ ２６３，１０３－１１２（２００１）．
［３４］Ｐｅｐｐｅｒ，Ａ．Ｓ．Ｒ．，Ｋｉｌｌｉａｎ，Ｄ．Ｊ． ＆ Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｅ．Ｊ．Ａ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｇｌｐ－１ ｍｕｔａｎｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｒ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６３，１１５－１３２（２００３）．
［３５］Ｂｅｎｄｔｓｅｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．，ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，＆ Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０，７８３－７９５（２００４）．
［３６］Ｍｅｌｌｏ，Ｃ．Ｃ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，Ｄ．，＆ Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｅ－Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｃ－Ｅｌｅｇａｎｓ － Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＥＭＢＯＪ．１０，３９５９－３９７０（１９９１）．
［３７］Ｇｕ，Ｔ．，Ｏｒｉｔａ，Ｓ． ＆ Ｈａｎ，Ｍ．Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＳＵＲ－５，ａ ｎｏｖｅｌ ｂｕｔ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＬＥＴ－６０ Ｒａｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｖｕｌｖａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８，４５５６－４５６４（１９９８）．
［３８］Ｐａｑｕｅｔ，Ｃ．，Ｓａｎｅ，Ａ．Ｔ．，Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ，Ｍ． ＆ Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｒ．Ｃａｓｐａｓｅ－ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｌｅａｋａｇｅ ａｎｄ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９，７８４－７９１（２００５）．
［３９］Ｈｏｏｇｅｗｉｊｓ，Ｄ．，Ｈｏｕｔｈｏｏｆｄ，Ｋ．，Ｍａｔｔｈｉｊｓｓｅｎｓ，Ｆ．，Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ，Ｊ． ＆ Ｖａｎｆｌｅｔｅｒｅｎ，Ｊ．Ｒ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｔ ｏｆ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｏｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．ＢＭＣ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９，９（２００８）．
［４０］Ｔｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．，Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．Ｌ． ＆ Ｆｉｒｅ，Ａ．Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｓＲＮＡｓ ｃａｎ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｇｅｎｅ ２６３，１０３－１１２（２００１）．
［４１］Ｓｕｍｉｙａ，Ｓ．，Ｙｏｎｅｄａ，Ｔ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｍ．，Ｙｏｋｏｏ，Ｃ．，Ｔａｍａｉ，Ｍ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｍ． ＆ Ｉｓｈｉｄａ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４０，２９９－３０３（１９９２）．
［４２］Ｂｕｔｔｌｅ，Ｄ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｍ．，Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ． ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．ＣＡ０７４ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ：Ａ ｐｒｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９９，３７７－３８０（１９９２）．
［４３］Ｇｏｕｒ－Ｓａｌｉｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｅ６４［ｔｒａｎｓ－ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ－ｌ－ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｏ－（４－ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）ｂｕｔａｎｅ］ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ２ ｓｕｂｓｉｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９９，３８９－３９２（１９９４）．
［４４］Ｋｏｋｅｌ，Ｄ．，Ｌｉ，Ｙ．Ｈ．，Ｑｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｘｕｅ，Ｄ．Ｔｈｅ ｎｏｎ－ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ａｎｄ ｐａｒａ－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２，３３８－３４５（２００６）．
［４５］Ｋｏｋｅｌ，Ｄ．ａｎｄ Ｘｕｅ，Ｄ．（２００６）．Ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｂｅｎｚｅｎｏｉｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ７，２０１０－２０１５（２００６）．
［４６］Ｈｏｆｍａｎｎ Ｅ Ｒ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｓ，Ｂｏｕｌｔｏｎ Ｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＨＵＳ－１ ｉｓ ａ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＬ－１．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２，１９０８－１９１８（２００２）．
［４７］Ｐｅｎｇ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｚｈｅｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ．５４７，４５８－４６２（２０１７）．
以下の参考文献の各々が参照により組み込まれる。
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［４］Ｓｔｅｒｇｉｏｕ，Ｌ．，Ｄｏｕｋｏｕｍｅｔｚｉｄｉｓ，Ｋ．，Ｓｅｎｄｏｅｌ，Ａ． ＆ Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｏ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＵＶ－Ｃ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１４，１１２９－１１３８（２００７）．
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［６］Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｂ．，Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｕｌｔｏｎ，Ｓ． ＆ Ｇａｒｔｎｅｒ，Ａ．Ｔｈｅ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｈｏｍｏｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１，１７２２－１７２７（２００１）．
［７］Ｋｌｏｋｏｖ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｌｏｗ ｄｏｓｅ ＩＲ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＩＧＦ－１－ｓＣＬＵ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａ ｐ５３－ｒｅｐｒｅｓｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｃａｄｅ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ＴＧＦｂｅｔａ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｃｏｎｆｅｒ ａ ｐｒｏ－ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２，４７９－４９０（２０１３）．
［８］Ｋｏｔｕｒｂａｓｈ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ：Ｃｒａｎｉａｌ Ｘ－ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｅｌｅｖａｔｅｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ，ａｌｔｅｒｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐ５３ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｓｈｉｅｌｄｅｄ ｓｐｌｅｅｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．７０，５５４－５６２（２００８）．
［９］Ｓｕｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＷＮＴ１６Ｂ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１８，１３５９－１３６８（２０１２）．
［１０］Ｂｕｃｋ，Ｍ．Ｒ．，Ｋａｒｕｓｔｉｓ，Ｄ．Ｇ．，Ｄａｙ，Ｎ．Ａ．，Ｈｏｎｎ，Ｋ．Ｖ． ＆ Ｓｌｏａｎｅ，Ｂ．Ｆ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ－Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｈｕｍａｎ Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ－Ｂ ｆｒｏｍ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ－Ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８２，２７３－２７８（１９９２）．
［１１］Ｐｏｏｌｅ，Ａ．Ｒ．，Ｔｉｌｔｍａｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｒｅｃｋｌｉｅｓ，Ａ．Ｄ． ＆ Ｓｔｏｋｅｒ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ ａｔ ｔｈｅ ｅｄｇｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｆｉｂｒｏａｄｅｎｏｍａｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２７３，５４５－５４７（１９７８）．
［１２］Ｌａｒｍｉｎｉｅ，Ｃ．Ｇ． ＆ Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ－ｌｉｋｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５，７５－８２（１９９６）．
［１３］Ｌｏｒｉｍｏｒｅ，Ｓ．Ａ．，Ｒａｓｔｏｇｉ，Ｓ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｄ．，Ｃｏａｔｅｓ，Ｐ．Ｊ． ＆ Ｗｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｇ．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐ５３ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ－ｔｙｐｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１７９，４０６－４１５（２０１３）．
［１４］Ｃａｌｆｏｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＩＲＥ１ ｃｏｕｐｌｅｓ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｌｏａｄ ｔｏ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｃａｐａｃｉｔｙ ｂｙ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ＸＢＰ－１ ｍＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ ４１５，９２－９６（２００２）．
［１５］Ｂｅｒｔｕｃｃｉ，Ａ．，Ｐｏｃｏｃｋ，Ｒ．Ｄ．，Ｒａｎｄｅｒｓ－Ｐｅｈｒｓｏｎ，Ｇ． ＆ Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｅａｍ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｎｅｍａｔｏｄｅ．Ｊ Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．５０ Ｓｕｐｐｌ Ａ，Ａ４９－５４（２００９）．
［１６］Ｍｏｒｔ，Ｊ．Ｓ． ＆ Ｂｕｔｔｌｅ，Ｄ．Ｊ．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２９，７１５－７２０（１９９７）．
［１７］Ｓｈｏｒｅ，Ｄ．Ｅ． ＆ Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．Ａ ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２３，４０９－４２０（２０１３）．
［１８］Ｋｅｎｙｏｎ，Ｃ．Ｊ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｇｅｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ ４６４，５０４－５１２（２０１０）．
［１９］Ｐｅｒｒｉｎ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ－１ ａｎｄ Ｒａｓ／ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２０，９７－１０７（２０１３）．
［２０］Ｓｃｏｔｔ，Ｂ．Ａ．，Ａｖｉｄａｎ，Ｍ．Ｓ． ＆ Ｃｒｏｗｄｅｒ，Ｃ．Ｍ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉｃ ｄｅａｔｈ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ ＤＡＦ－２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，２３８８－２３９１（２００２）．
［２１］Ｐａｒａｄｉｓ，Ｓ．，Ａｉｌｉｏｎ，Ｍ．，Ｔｏｋｅｒ，Ａ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｈ． ＆ Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．Ａ ＰＤＫ１ ｈｏｍｏｌｏｇ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ａｎｄ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｔｒａｎｓｄｕｃｅ ＡＧＥ－１ ＰＩ３ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｄｉａｐａｕｓｅ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３，１４３８－１４５２（１９９９）．
［２２］Ｌｉｎ，Ｋ．，Ｄｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｒｏｄａｎ，Ａ． ＆ Ｋｅｎｙｏｎ，Ｃ．ｄａｆ－１６：Ａｎ ＨＮＦ－３／ｆｏｒｋｈｅａｄ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ｔｈａｔ ｃａｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ｄｏｕｂｌｅ ｔｈｅ ｌｉｆｅ－ｓｐａｎ ｏｆ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８，１３１９－１３２２（１９９７）．
［２３］Ｏｇｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｆｏｒｋ ｈｅａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＤＡＦ－１６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３８９，９９４－９９９（１９９７）．
［２４］Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｋｏｒｔａ，Ｄ．Ｚ．，Ｃａｐｕａ，Ｙ． ＆ Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｅ．Ｊ．Ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３７，６７１－６８０（２０１０）．
［２５］Ｐｉｎｋｓｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｇａｒｉｇａｎ，Ｄ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｍ． ＆ Ｋｅｎｙｏｎ，Ｃ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ ｏｆ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３，９７１－９７５（２００６）．
［２６］Ｎｉｋｊｏｏ，Ｈ． ＆ Ｋｈｖｏｓｔｕｎｏｖ，Ｉ．Ｋ．Ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ａｎｄ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｉｓｓｕｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｒｉｓｋ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ．Ｈｕｍ．Ｅｘｐ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２３，８１－８６（２００４）．
［２７］Ｍｏｔｈｅｒｓｉｌｌ，Ｃ． ＆ Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｃ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ：ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ？ Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ６，４４７－４５４（２００６）．
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［２９］Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ． ＆ Ｋｉｒｓｃｈｋｅ，Ｈ．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ，Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｈ，ａｎｄ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８０ Ｐｔ Ｃ，５３５－５６１（１９８１）．
［３０］Ｓｈｒｅｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｂｌｕｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２５，２４６５－２４７９（２０１１）．
［３１］Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７７，７１－９４（１９７４）．
［３２］Ｆｒｏｋｊａｅｒ－Ｊｅｎｓｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｐｙ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４０，１３７５－１３８３（２００８）．
［３３］Ｔｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．，Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．Ｌ． ＆ Ｆｉｒｅ，Ａ．Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｓＲＮＡｓ ｃａｎ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｇｅｎｅ ２６３，１０３－１１２（２００１）．
［３４］Ｐｅｐｐｅｒ，Ａ．Ｓ．Ｒ．，Ｋｉｌｌｉａｎ，Ｄ．Ｊ． ＆ Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｅ．Ｊ．Ａ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｇｌｐ－１ ｍｕｔａｎｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｒ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６３，１１５－１３２（２００３）．
［３５］Ｂｅｎｄｔｓｅｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．，ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，＆ Ｂｒｕｎａｋ，Ｓ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０，７８３－７９５（２００４）．
［３６］Ｍｅｌｌｏ，Ｃ．Ｃ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，Ｄ．，＆ Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｅ－Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｃ－Ｅｌｅｇａｎｓ － Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＥＭＢＯＪ．１０，３９５９－３９７０（１９９１）．
［３７］Ｇｕ，Ｔ．，Ｏｒｉｔａ，Ｓ． ＆ Ｈａｎ，Ｍ．Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＳＵＲ－５，ａ ｎｏｖｅｌ ｂｕｔ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＬＥＴ－６０ Ｒａｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｖｕｌｖａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８，４５５６－４５６４（１９９８）．
［３８］Ｐａｑｕｅｔ，Ｃ．，Ｓａｎｅ，Ａ．Ｔ．，Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ，Ｍ． ＆ Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｒ．Ｃａｓｐａｓｅ－ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｌｅａｋａｇｅ ａｎｄ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９，７８４－７９１（２００５）．
［３９］Ｈｏｏｇｅｗｉｊｓ，Ｄ．，Ｈｏｕｔｈｏｏｆｄ，Ｋ．，Ｍａｔｔｈｉｊｓｓｅｎｓ，Ｆ．，Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ，Ｊ． ＆ Ｖａｎｆｌｅｔｅｒｅｎ，Ｊ．Ｒ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｔ ｏｆ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｏｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．ＢＭＣ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９，９（２００８）．
［４０］Ｔｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．，Ｃｏｕｒｔ，Ｄ．Ｌ． ＆ Ｆｉｒｅ，Ａ．Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｓＲＮＡｓ ｃａｎ ｐｒｏｄｕｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ．Ｇｅｎｅ ２６３，１０３－１１２（２００１）．
［４１］Ｓｕｍｉｙａ，Ｓ．，Ｙｏｎｅｄａ，Ｔ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｍ．，Ｙｏｋｏｏ，Ｃ．，Ｔａｍａｉ，Ｍ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｍ． ＆ Ｉｓｈｉｄａ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４０，２９９－３０３（１９９２）．
［４２］Ｂｕｔｔｌｅ，Ｄ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｍ．，Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ． ＆ Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．ＣＡ０７４ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ：Ａ ｐｒｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９９，３７７－３８０（１９９２）．
［４３］Ｇｏｕｒ－Ｓａｌｉｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｅ６４［ｔｒａｎｓ－ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ－ｌ－ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｏ－（４－ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）ｂｕｔａｎｅ］ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ２ ｓｕｂｓｉｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９９，３８９－３９２（１９９４）．
［４４］Ｋｏｋｅｌ，Ｄ．，Ｌｉ，Ｙ．Ｈ．，Ｑｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ Ｘｕｅ，Ｄ．Ｔｈｅ ｎｏｎ－ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ａｎｄ ｐａｒａ－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２，３３８－３４５（２００６）．
［４５］Ｋｏｋｅｌ，Ｄ．ａｎｄ Ｘｕｅ，Ｄ．（２００６）．Ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｂｅｎｚｅｎｏｉｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ７，２０１０－２０１５（２００６）．
［４６］Ｈｏｆｍａｎｎ Ｅ Ｒ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｓ，Ｂｏｕｌｔｏｎ Ｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＨＵＳ－１ ｉｓ ａ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＬ－１．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２，１９０８－１９１８（２００２）．
［４７］Ｐｅｎｇ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｍ，Ｚｈｅｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ．５４７，４５８－４６２（２０１７）．
【0391】
表
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】