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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-04
(45)【発行日】2024-12-12
(54)【発明の名称】マイクロプレート
(51)【国際特許分類】
C12M 3/00 20060101AFI20241205BHJP
【ＦＩ】
C12M3/00 A
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2020180625
(22)【出願日】2020-10-28
(65)【公開番号】P2022071581
(43)【公開日】2022-05-16
【審査請求日】2023-10-18
(73)【特許権者】
【識別番号】000158208
【氏名又は名称】ＡＧＣテクノグラス株式会社
(72)【発明者】
【氏名】三輪 達明
【審査官】戸来 幸男
(56)【参考文献】
【文献】登録実用新案第３２１４８７６（ＪＰ，Ｕ）
【文献】登録実用新案第３２１５９１８（ＪＰ，Ｕ）
【文献】国際公開第２０１９／１２１９８４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１９／０３４５４４０（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０
Ｇｏｏｇｌｅ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数のウェルを有するマイクロプレートであって、前記ウェルの底面に複数の微細ウェルが形成されており、
平面視で前記微細ウェルの開口の平均直径をＤ（μｍ）とし、前記ウェルの底面における
ウェル側壁から幅が１．５×Ｄ（μｍ）の環状の領域を周縁領域としたとき、
前記周縁領域の面積に対する、前記周縁領域内に存在する欠けのない前記微細ウェルの開口面積の合計の割合が３０％以上である、マイクロプレート。
【請求項2】
前記周縁領域内に存在する前記微細ウェルの総数に対する、前記周縁領域において欠けがない前記微細ウェルの数の割合が２０％以上である、請求項１に記載のマイクロプレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マイクロプレートに関する。
【背景技術】
【0002】
生命現象を解明する基礎研究、創薬研究等においては、培養細胞が広く利用されている。特に３次元培養で得られる細胞が凝集した３次元細胞塊（スフェロイド）は、生体内と同様に立体的な構造を有しているため、２次元培養で得た細胞に比べて試験精度が向上することが期待されている。３次元培養に用いる培養容器としては、例えば、マイクロプレートの各ウェルの底面や、ディッシュの底面等に孔径１００～１，０００μｍの微細ウェル（マイクロウェル）が多数形成された微細加工容器が知られている（特許文献１～３）。微細加工容器に細胞を播くと、各微細ウェルの中で細胞が会合し、細胞塊を形成する。
【0003】
細胞の品質を均一にするには細胞塊のサイズを均一にする必要がある。通常、培養容器の底面には微細ウェルが規則的なパターンで均等に配置される（例えば特許文献１、２）。例えば、正四角形を隙間なく並べたときの各頂点に微細ウェルを均等に配置するパターンや、正六角形を隙間なく並べたときの各頂点と中央に微細ウェルを均等に配置するパターンが採用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２０１７／０４７７３５号
【文献】登録実用新案第３１３９３５０号公報
【文献】特許第６３７９５２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかし、発明者等が検討したところ、マイクロプレートでは、各ウェルにおいて従来のような微細ウェルを規則的なパターンで均等に配置しても、各ウェルで得られる細胞塊のサイズが不均一になる傾向があることが分かった。
【0006】
本発明は、各ウェルで均一なサイズの細胞塊を形成できるマイクロプレートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、以下の態様を有する。
［１］複数のウェルを有するマイクロプレートであって、
前記ウェルの底面に複数の微細ウェルが形成されており、
平面視で前記微細ウェルの開口の平均直径をＤ（μｍ）とし、前記ウェルの底面におけるウェル側壁から幅が１．５×Ｄ（μｍ）の環状の領域を周縁領域としたとき、
前記周縁領域の面積に対する、前記周縁領域内に存在する欠けのない前記微細ウェルの開口面積の合計の割合が３０％以上である、マイクロプレート。
［２］前記周縁領域内に存在する前記微細ウェルの総数に対する、前記周縁領域において欠けがない前記微細ウェルの数の割合が２０％以上である、［１］のマイクロプレート。
［３］前記ウェルの底面に形成される前記微細ウェルの総数をｎとしたとき、前記ウェルの培養領域の面積に対する、前記微細ウェルの開口面積の合計の面積比が、０．６６３２×ｎ－０．９５～０．６６３２×ｎ－１である、［１］又は［２］のマイクロプレート。
［１］複数のウェルを有するマイクロプレートであって、
前記ウェルの底面に複数の微細ウェルが形成されており、
平面視で前記微細ウェルの開口の平均直径をＤ（μｍ）とし、前記ウェルの底面におけるウェル側壁から幅が１．５×Ｄ（μｍ）の環状の領域を周縁領域としたとき、
前記周縁領域の面積に対する、前記周縁領域内に存在する欠けのない前記微細ウェルの開口面積の合計の割合が３０％以上である、マイクロプレート。
［２］前記周縁領域内に存在する前記微細ウェルの総数に対する、前記周縁領域において欠けがない前記微細ウェルの数の割合が２０％以上である、［１］のマイクロプレート。
［３］前記ウェルの底面に形成される前記微細ウェルの総数をｎとしたとき、前記ウェルの培養領域の面積に対する、前記微細ウェルの開口面積の合計の面積比が、０．６６３２×ｎ－０．９５～０．６６３２×ｎ－１である、［１］又は［２］のマイクロプレート。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、各ウェルで均一なサイズの細胞塊を形成できるマイクロプレートを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】実施形態のマイクロプレートの平面図である。
【図3】各ウェルの底面に形成された微細ウェルのパターンの一例を示した平面図である。
【図5】ウェル底面に形成される微細ウェルの総数ｎを横軸、面積比Ｓを縦軸として、０．６６３２×ｎ－０．９５と０．６６３２×ｎ－１の曲線をそれぞれ示したグラフである。
【図6】各ウェルの底面に形成された微細ウェルのパターンの他の例を示した平面図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書における用語の意味及び定義は以下である。
「～」で表される数値範囲は、～の前後の数値を下限値及び上限値とする数値範囲を意味する。
「微細ウェルの開口端」とは、微細ウェルの周囲の最上部を全周にわたって結んだ境界線である。微細ウェルの周囲に平坦面がある場合、その平坦面と微細ウェルの落ち込みとの境界線が微細ウェルの開口端である。
「微細ウェルの開口形状」とは、微細ウェルの開口端の平面視形状である。
「微細ウェルの開口の直径」とは、微細ウェルの開口端の平面視での形の直径であり、開口端の平面視形状が正円でない場合はその平面視形状に対する外接円の直径とする。
「微細ウェルの開口面積」とは、微細ウェルの開口端の平面視での形の面積である。
「微細ウェルの深さ」は、微細ウェルの周囲の最上部に対して上方から接点が最も多くなるように接する面を基準面としたときの、微細ウェルの最深部と基準面との距離である。
「ウェルの底面における周縁領域の面積」とは、ウェル底面における周縁領域の平面視での形の面積である。
「周縁領域内に存在する微細ウェル」とは、平面視で、微細ウェル全体が周縁領域内に存在している微細ウェルである。ウェルの底面において、一部が周縁領域内に存在し、残部が周縁領域よりも内側の領域に存在する微細ウェルは、「周縁領域内に存在する微細ウェル」には含まれない。
「ウェルの培養領域の面積」とは、ウェル底面のウェル側壁で囲まれた領域の平面視での形の面積である。
「～」で表される数値範囲は、～の前後の数値を下限値及び上限値とする数値範囲を意味する。
「微細ウェルの開口端」とは、微細ウェルの周囲の最上部を全周にわたって結んだ境界線である。微細ウェルの周囲に平坦面がある場合、その平坦面と微細ウェルの落ち込みとの境界線が微細ウェルの開口端である。
「微細ウェルの開口形状」とは、微細ウェルの開口端の平面視形状である。
「微細ウェルの開口の直径」とは、微細ウェルの開口端の平面視での形の直径であり、開口端の平面視形状が正円でない場合はその平面視形状に対する外接円の直径とする。
「微細ウェルの開口面積」とは、微細ウェルの開口端の平面視での形の面積である。
「微細ウェルの深さ」は、微細ウェルの周囲の最上部に対して上方から接点が最も多くなるように接する面を基準面としたときの、微細ウェルの最深部と基準面との距離である。
「ウェルの底面における周縁領域の面積」とは、ウェル底面における周縁領域の平面視での形の面積である。
「周縁領域内に存在する微細ウェル」とは、平面視で、微細ウェル全体が周縁領域内に存在している微細ウェルである。ウェルの底面において、一部が周縁領域内に存在し、残部が周縁領域よりも内側の領域に存在する微細ウェルは、「周縁領域内に存在する微細ウェル」には含まれない。
「ウェルの培養領域の面積」とは、ウェル底面のウェル側壁で囲まれた領域の平面視での形の面積である。
【0011】
以下、本発明のマイクロプレートの実施形態の一例を示し、図面に基づいて説明する。なお、以下の説明において例示される図の寸法等は一例であって、本発明はそれらに必ずしも限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することが可能である。
【0012】
【0013】
マイクロプレート１におけるウェル１２の配置パターンは、特に限定されず、例えば、マトリックス状、千鳥状を例示できる。ウェル１２の平面視の開口形状は、円形には限定されず、例えば、矩形であってもよい。
マイクロプレート１が有するウェル１２の数は、特に限定されず、例えば、６～３８４個が挙げられる。
マイクロプレート１が有するウェル１２の数は、特に限定されず、例えば、６～３８４個が挙げられる。
【0014】
ウェル１２の開口の平均直径は、３．２～１５．９ｍｍが好ましく、６．０～７．０ｍｍがより好ましい。ウェル１２の開口の平均直径が前記範囲の下限値以上であれば、微細ウェルを配置できない領域が小さくなり、多くの微細ウェルを効率良く配置できる。ウェル１２の開口の平均直径が前記範囲の上限値以下であれば、正六角形を隙間なく並べたときの各頂点と中央に微細ウェルを均等に配置する等、微細ウェルを規則的に配置する場合との違いが大きくなるため、本発明の効果が得られやすい。
なお、ウェル１２の開口形状が正円でない場合、ウェル１２の開口の直径は、ウェル１２の開口形状の外接円の直径とする。
なお、ウェル１２の開口形状が正円でない場合、ウェル１２の開口の直径は、ウェル１２の開口形状の外接円の直径とする。
【0015】
ウェル１２の平均深さは、６．０～１２．０ｍｍが好ましく、５．７～１０．８ｍｍがより好ましい。ウェル１２の平均深さが前記範囲の下限値以上であれば、溶液を加える、吸引する等の操作性に優れる。ウェル１２の平均深さが前記範囲の上限値以下であれば、十分な量の溶液を加えられる。
【0016】
【0017】
各ウェル１２において、ウェル１２の深さ方向の上方から見た平面視で微細ウェル２０の開口の平均直径をＤ（μｍ）とし、ウェル１２の底面１４におけるウェル側壁１６から幅が１．５×Ｄ（μｍ）の円環状の領域を周縁領域Ｂとする。ただし、微細ウェル２０の開口の平均直径Ｄは、ウェル１２内の周縁領域Ｂの内側の領域Ｃの任意の１０個の微細ウェル２０の直径を測定して平均した値である。微細ウェルの開口の直径の測定は、平面観察像によって実施できる。
【0018】
マイクロプレート１の各ウェル１２では、周縁領域Ｂの面積に対する、周縁領域Ｂ内に存在する欠けのない微細ウェル２０の開口面積の合計の割合Ｑが２０％以上である。ただし、「欠けがない微細ウェル」とは、平面視で微細ウェルの開口形状にウェル側壁との接触による部分的な欠落がなく、型崩れがない微細ウェルである。割合Ｑが前記下限値以上であれば、開口形状に型崩れのない均一なサイズの微細ウェル２０が周縁領域Ｂに十分に配置される。そのため、ウェル１２の底面１４のウェル側壁１６近傍を有効活用し、均一なサイズの細胞塊を効率良く形成できる。
この例では、図３に示すように、周縁領域Ｂに沿って３０個の微細ウェル２０が隙間なく配列されている。
この例では、図３に示すように、周縁領域Ｂに沿って３０個の微細ウェル２０が隙間なく配列されている。
【0019】
割合Ｑは、３０％以上が好ましく、３６％以上がより好ましく、４４％以上がさらに好ましい。割合Ｑが前記範囲の下限値以上であれば、ウェル１２の底面１４のウェル側壁１６近傍をさらに有効活用し、均一なサイズの細胞塊をさらに効率良く形成でき、かつ細胞塊のサイズを均一にすることができる。
【0020】
微細ウェル２０の開口の平均直径Ｄは、１００～２０００μｍが好ましく、２００～１４００μｍがより好ましく、４００～８００μｍがさらに好ましい。微細ウェル２０の開口の平均直径Ｄが前記範囲の下限値以上であれば、細胞塊のサイズが小さくなり過ぎることを抑制しやすい。微細ウェル２０の開口の平均直径Ｄが前記範囲の上限値以下であれば、微細ウェルと微細ウェルの隙間を小さくできる。その結果、形成される細胞塊の数が多くなる。
【0021】
微細ウェル２０の開口面積は、７８５０～３１４００００μｍ２が好ましく、３１４００～１５３８６００μｍ２がより好ましく、１２５６００～５０２４００μｍ２がさらに好ましい。微細ウェル２０の開口面積が前記範囲の下限値以上であれば、細胞塊のサイズが小さくなり過ぎることを抑制しやすい。微細ウェル２０の開口面積が前記範囲の上限値以下であれば、微細ウェルと微細ウェルの隙間を小さくできる。その結果、形成される細胞塊の数が多くなる。
【0022】
微細ウェル２０の平均深さＨ（図４）は、５０～１０００μｍが好ましく、１００～８００μｍがより好ましく、２００～６００μｍがさらに好ましい。微細ウェル２０の平均深さＨが前記範囲の下限値以上であれば、細胞塊が微細ウェルの中から飛び出し難く、安定して保持される。微細ウェル２０の平均深さＨが前記範囲の上限値以下であれば、培地を添加した時に微細ウェルに泡が発生し難く、発生したとしても除き易い。なお、微細ウェルの平均深さＨは、任意の１０個の微細ウェルについて、微細ウェルの深さ（基準面ｋと微細ウェルの最深部との距離）を測定して平均した値である。微細ウェルの深さの測定は、３次元測定器による測定や、シリコンゴム等で微細ウェルの型取りしたものの高さを測定することによって実施できる。
【0023】
周縁領域Ｂ内に存在する微細ウェル２０の総数に対する、周縁領域Ｂにおいて欠けがない微細ウェル２０の数の割合Ｐは、２０％以上が好ましい。割合Ｐが前記下限値以上であれば、開口形状に型崩れのない均一なサイズの微細ウェル２０が周縁領域Ｂにさらに効率良く配置されるため、ウェル１２の底面１４のウェル側壁１６近傍をさらに有効活用できる。
割合Ｐは、２３～１００％が好ましく、２５～１００％がより好ましい。
割合Ｐは、２３～１００％が好ましく、２５～１００％がより好ましい。
【0024】
ウェル１２の底面１４における周縁領域Ｂよりも内側の領域Ｃにおける微細ウェル２０の配置は、特に限定されず、例えば、できるだけ多くの微細ウェル２０を配置できるように適宜設定すればよい。領域Ｃの微細ウェルの配置では、隙間なく並べた正四角形の各頂点や、隙間なく並べた正六角形の各頂点と中央などの規則的なパターンを採用すると、領域Ｃの周縁領域Ｂとの境界近傍に微細ウェル２０を配置できない程度の大きさの平坦面が多く残る。平坦面が多いと、平坦面に残存した細胞によってサイズが不均一な細胞塊が形成されやすくなる。そのため、領域Ｃでは規則的なパターンとはせず、不規則でもできるだけ平坦面が残らないように各微細ウェルを配置するのが良い。
【0025】
例えば、図３に示すように、領域Ｃの中央部分（ウェル１２の底面１４の中央部分）においては、平面視で領域Ｃの中心に微細ウェル２０を配置し、その周囲に６つの微細ウェル２０を正六角形の各頂点に位置するように配置する。領域Ｃの中央部分ではこの配置が最密充填の点で好ましい。領域Ｃにおける中央部分よりも外側部分は、このような規則的なパターンを崩し、できるだけ平坦面が残らない範囲で各微細ウェルを密に配置する。なお、ウェル１２の底面１４における領域Ｃの微細ウェルの配置は、このような配置には限定されない。
【0026】
円、四角形、三角形等の内部への円の配置に関しては、円を最密に充填する円パッキング問題のための最適な円の配置や各種アルゴリズムが知られている（例えば、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｈｙｄｒａ．ｎａｔ．ｕｎｉ－ｍａｇｄｅｂｕｒｇ．ｄｅ／ｐａｃｋｉｎｇ／ｃｃｉ／＞で開示されているＴｈｅ ｂｅｓｔ ｋｎｏｗｎ ｐａｃｋｉｎｇｓ ｏｆ ｅｑｕａｌ ｃｉｒｃｌｅｓ ｉｎ ａ ｃｉｒｃｌｅ等）。微細ウェル２０の数や開口面積を決定する際には、このようなアルゴリズムを利用してもよい。微細ウェルの開口形状が正円でない場合も、その開口形状に対する外接円を考えてこのようなアルゴリズムを利用してもよい。
【0027】
ウェル１２の底面１４に形成される微細ウェル２０の総数をｎとすると、ウェル１２の培養領域の面積に対する微細ウェル２０の開口面積の合計の面積比Ｓは、０．６６３２×ｎ－０．９５～０．６６３２×ｎ－１が好ましい。前記面積比Ｓが前記範囲内であれば、ウェル１２の底面１４の全体を有効活用してサイズが均一な細胞塊を効率良く形成できる。
【0028】
前記面積比Ｓは、ウェル１２の底面１４に形成する微細ウェル２０の総数と、各微細ウェル２０の開口面積を調節することで調節できる。図５は、横軸をウェル１２の底面１４に形成される微細ウェル２０の総数ｎ、縦軸を面積比Ｓとして、０．６６３２×ｎ－０．９５と０．６６３２×ｎ－１の曲線をそれぞれ示したグラフである。このグラフ中の０．６６３２×ｎ－０．９５の曲線と０．６６３２×ｎ－１の曲線との間の領域内で、微細ウェル２０の総数ｎと微細ウェル２０の開口面積を調節することが好ましい。
【0029】
プレート本体１０の材質としては、合成樹脂を例示できる。
合成樹脂としては、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコーン樹脂を例示できる。なかでも、透明性高く、薬剤吸着性が低いという点から、ポリスチレン樹脂が好ましい。プレート本体１０を構成する合成樹脂は、１種でもよく、２種以上でもよい。
合成樹脂としては、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコーン樹脂を例示できる。なかでも、透明性高く、薬剤吸着性が低いという点から、ポリスチレン樹脂が好ましい。プレート本体１０を構成する合成樹脂は、１種でもよく、２種以上でもよい。
【0030】
マイクロプレート１の製造方法は、特に限定されない。プレート本体１０は、例えば、射出成形法によって成形できる。
微細ウェル２０を形成する方法としては、例えば、レーザ照射を例示できる。ウェル１２の底面１４にレーザ光が照射されると、底面１４を構成する合成樹脂が溶解及び気化して、非常に滑らかな表面を持つ微細ウェル２０が形成される。微細ウェル２０の開口周辺には、溶解した合成樹脂が盛り上がって土手部が形成されてもよい。
微細ウェル２０を形成する方法としては、例えば、レーザ照射を例示できる。ウェル１２の底面１４にレーザ光が照射されると、底面１４を構成する合成樹脂が溶解及び気化して、非常に滑らかな表面を持つ微細ウェル２０が形成される。微細ウェル２０の開口周辺には、溶解した合成樹脂が盛り上がって土手部が形成されてもよい。
【0031】
底面に微細ウェルが形成されたウェルの製造方法としては、特に限定されず、ウェルの底面にレーザ照射して微細ウェルを形成する方法、微細ウェルを形成した基材をウェル底面に取り付ける方法、下端に開口を有する筒部の底に、微細ウェルを形成した基材を取り付けてウェル底面を形成する方法を例示できる。
【0032】
レーザ光源としては、特に限定されず、ＣＯ２レーザを例示できる。微細ウェル２０の配置及びサイズは、レーザ光の照射位置や出力等の照射条件を調節することによって調節できる。
レーザ出力は、例えば、１～１００Ｗとできる。レーザ照射速度は、例えば、５００～１００００ｍｍ／分とできる。レーザ出力及びレーザ照射速度を変えずにレーザ照射を行うことで、各微細ウェル２０のサイズを均一にできる。
レーザ出力は、例えば、１～１００Ｗとできる。レーザ照射速度は、例えば、５００～１００００ｍｍ／分とできる。レーザ出力及びレーザ照射速度を変えずにレーザ照射を行うことで、各微細ウェル２０のサイズを均一にできる。
【0033】
微細ウェル２０の表面には、細胞の接着を抑制する低接着コート膜や、細胞を接着させる易接着コート膜を形成してもよい。易接着コート膜としては、例えば、コラーゲンやゼラチンが使用される。低接着コート膜が形成されることで、微細ウェル２０から細胞塊を取り出しやすくなる。低接着コート膜は、例えば、細胞接着抑制剤を塗布することによって形成できる。細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等）、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、フッ素含有化合物、ポリエチレングリコールを例示できる。細胞接着抑制剤としては、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
なお、プレート本体１０をシリコーン樹脂等の細胞接着抑制効果のある樹脂で成形すれば、低接着コート膜を形成しなくても微細ウェルの表面に細胞が接着することを抑制できる。
なお、プレート本体１０をシリコーン樹脂等の細胞接着抑制効果のある樹脂で成形すれば、低接着コート膜を形成しなくても微細ウェルの表面に細胞が接着することを抑制できる。
【0034】
以下、マイクロプレート１の作用効果について説明する。
従来のマイクロプレートでは、各ウェルにおいて、微細ウェルが規則的なパターンで均等に配置されていた。しかし、このように規則的なパターンで微細ウェルを配置すると、ウェルの底面におけるウェル側壁近傍では、微細ウェルがウェル側壁に接触して部分的に欠落し、型崩れしたサイズの小さい微細ウェルが生じる。これにより、ウェル側壁近傍の微細ウェルで形成される細胞塊のサイズが小さくなるため、ウェルから得られる細胞塊のサイズが不均一になる。また、ウェル側壁近傍の微細ウェルの型崩れを抑制するためにウェル側壁近傍に微細ウェルを形成しないと、ウェルの底面の周縁領域に広い平坦面が形成される。広い平坦面があると、その平坦面上でサイズが不均一な細胞塊が多く形成される。
従来のマイクロプレートでは、各ウェルにおいて、微細ウェルが規則的なパターンで均等に配置されていた。しかし、このように規則的なパターンで微細ウェルを配置すると、ウェルの底面におけるウェル側壁近傍では、微細ウェルがウェル側壁に接触して部分的に欠落し、型崩れしたサイズの小さい微細ウェルが生じる。これにより、ウェル側壁近傍の微細ウェルで形成される細胞塊のサイズが小さくなるため、ウェルから得られる細胞塊のサイズが不均一になる。また、ウェル側壁近傍の微細ウェルの型崩れを抑制するためにウェル側壁近傍に微細ウェルを形成しないと、ウェルの底面の周縁領域に広い平坦面が形成される。広い平坦面があると、その平坦面上でサイズが不均一な細胞塊が多く形成される。
【0035】
これに対して、マイクロプレート１では、ウェル１２において、割合Ｑが特定の値以上となるように周縁領域Ｂの微細ウェル２０の配置を制御する。これにより、ウェル１２の底面１４全体の微細ウェル２０の配置は不均等になるものの、開口形状に型崩れのない均一なサイズの微細ウェル２０が周縁領域Ｂに十分に配置される。すなわち、ウェル１２の底面１４に微細ウェル２０を規則的なパターンで均等に配置するよりも、周縁領域Ｂに微細ウェル２０を十分に配置することを優先する。これにより、ウェル１２の底面１４のウェル側壁１６近傍に型崩れしたサイズが小さい微細ウェル２０が生じにくく、かつ広い平坦面の形成も抑制できる。そのため、ウェル１２の底面１４のウェル側壁１６近傍を有効活用して、均一なサイズの細胞塊を効率良く形成できる。
【0036】
なお、本発明のマイクロプレートは、前記したマイクロプレート１には限定されない。例えば、マイクロプレート１では周縁領域Ｂに沿って微細ウェル２０が隙間なく配置されていたが、割合Ｑの条件を満たす範囲であれば、図６に示すように、周縁領域Ｂに配置される微細ウェル２０同士の間には隙間が形成されていてもよい。
【0037】
その他、本発明の趣旨に逸脱しない範囲で、前記実施形態における構成要素を周知の構成要素に置き換えることは適宜可能であり、また、前記した変形例を適宜組み合わせてもよい。
【実施例】
【0038】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［実施例１］
ポリスチレン樹脂を用い、射出成形によって開口の直径が６．４５ｍｍ、深さが６．００ｍｍのウェルを有するプレート本体を成形した。次いで、照射スポットの形状が直径１２０μｍの円形であるレーザ照射装置を用いてＣＯ２レーザを照射し、図３に例示した配置パターンでウェルの底面に１１８個の微細ウェルを形成し、マイクロプレートを作製した。微細ウェルの平均直径Ｄは４４６μｍ、平均開口面積は１５７０００μｍ２、割合Ｑは３６．３％、割合Ｐは２５．４％であった。
［実施例１］
ポリスチレン樹脂を用い、射出成形によって開口の直径が６．４５ｍｍ、深さが６．００ｍｍのウェルを有するプレート本体を成形した。次いで、照射スポットの形状が直径１２０μｍの円形であるレーザ照射装置を用いてＣＯ２レーザを照射し、図３に例示した配置パターンでウェルの底面に１１８個の微細ウェルを形成し、マイクロプレートを作製した。微細ウェルの平均直径Ｄは４４６μｍ、平均開口面積は１５７０００μｍ２、割合Ｑは３６．３％、割合Ｐは２５．４％であった。
【0039】
［実施例２］
ウェルの底面に図６に例示した配置パターンで１２２個の微細ウェルを形成した。ガラス基板に穴あけ加工をした後、底が空いているウェルプレートと貼り付けて作製した。微細ウェルの平均直径Ｄは４９０μｍ、平均開口面積は１８８９４７μｍ２、割合Ｑは４５．１％、割合Ｐは２５．４％であった。
ウェルの底面に図６に例示した配置パターンで１２２個の微細ウェルを形成した。ガラス基板に穴あけ加工をした後、底が空いているウェルプレートと貼り付けて作製した。微細ウェルの平均直径Ｄは４９０μｍ、平均開口面積は１８８９４７μｍ２、割合Ｑは４５．１％、割合Ｐは２５．４％であった。
【0040】
［比較例１］
ウェルの底面におけるウェル側壁から幅約４００μｍの領域を平坦面として残し、その内側の領域に、規則的なパターンで均等にウェル側壁まで８８個の微細ウェルを形成した以外は、実施例１と同様にしてマイクロプレートを作製した。微細ウェルの平均直径Ｄは４４０μｍ、平均開口面積は１５２０００μｍ２、割合Ｑは１９．３％、割合Ｐは１５．９％であった。
ウェルの底面におけるウェル側壁から幅約４００μｍの領域を平坦面として残し、その内側の領域に、規則的なパターンで均等にウェル側壁まで８８個の微細ウェルを形成した以外は、実施例１と同様にしてマイクロプレートを作製した。微細ウェルの平均直径Ｄは４４０μｍ、平均開口面積は１５２０００μｍ２、割合Ｑは１９．３％、割合Ｐは１５．９％であった。
【0041】
［比較例２］
ウェルの底面に、隙間なく並べた正六角形の各頂点と中央に微細ウェルが配置されるように、隙間なく並べた正六角形の各頂点と中央に微細ウェルが配置されるように規則的なパターンで均等に９４個の微細ウェルを形成した。９４個の微細ウェルとは別に、ウェル側壁と重なって欠けている微細ウェルの数は２３個であった。微細ウェルの平均直径Ｄは５３０μｍ、開口面積は２２１０００μｍ２、割合Ｑは２９．３％、割合Ｐは１９．１％であった。
ウェルの底面に、隙間なく並べた正六角形の各頂点と中央に微細ウェルが配置されるように、隙間なく並べた正六角形の各頂点と中央に微細ウェルが配置されるように規則的なパターンで均等に９４個の微細ウェルを形成した。９４個の微細ウェルとは別に、ウェル側壁と重なって欠けている微細ウェルの数は２３個であった。微細ウェルの平均直径Ｄは５３０μｍ、開口面積は２２１０００μｍ２、割合Ｑは２９．３％、割合Ｐは１９．１％であった。
【0042】
［培養試験１］
実施例１、比較例１で得たマイクロプレートを用い、各ウェルに緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）標識Ａ５４９細胞を１ウェルあたりの細胞数が５０００個となるように播種し、３７℃、５％炭酸ガス、飽和水蒸気雰囲気下の条件で４日間培養した。その後、蛍光顕微鏡ＩＸ７３（オリンパス社製）を用いてＧＦＰチャンネルの蛍光イメージを取得し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（ＩｍａｇｅＪ）によって細胞塊のサイズ（面積）の均一性を以下の基準で評価した。結果を表１に示す。
（評価基準）
○：細胞塊のサイズの変動係数が２０％以下。
△：細胞塊のサイズの変動係数が２０％超、５０％以下。
×：細胞塊のサイズの変動係数が５０％超、もしくは細胞塊のサイズの最大値を平均値で割った値が４以上。
実施例１、比較例１で得たマイクロプレートを用い、各ウェルに緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）標識Ａ５４９細胞を１ウェルあたりの細胞数が５０００個となるように播種し、３７℃、５％炭酸ガス、飽和水蒸気雰囲気下の条件で４日間培養した。その後、蛍光顕微鏡ＩＸ７３（オリンパス社製）を用いてＧＦＰチャンネルの蛍光イメージを取得し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（ＩｍａｇｅＪ）によって細胞塊のサイズ（面積）の均一性を以下の基準で評価した。結果を表１に示す。
（評価基準）
○：細胞塊のサイズの変動係数が２０％以下。
△：細胞塊のサイズの変動係数が２０％超、５０％以下。
×：細胞塊のサイズの変動係数が５０％超、もしくは細胞塊のサイズの最大値を平均値で割った値が４以上。
【0043】
［培養試験２］
比較例２で得たマイクロプレートを用い、各ウェルにＨｅｐＧ２細胞を１ウェルあたりの細胞数が５００００個となるように播種し、３７℃、５％炭酸ガス、飽和水蒸気雰囲気下の条件で２日間培養した。その後、細胞塊を生死細胞染色液Live/Dead Cell Staining Kit II（PromoCell社製）を用いて細胞を蛍光染色した後、蛍光顕微鏡ＩＸ７３（オリンパス社製）を用いて蛍光イメージを取得し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（ＩｍａｇｅＪ）によって細胞塊のサイズ（面積）の均一性を培養試験１と同じ基準で評価した。結果を表１に示す。
比較例２で得たマイクロプレートを用い、各ウェルにＨｅｐＧ２細胞を１ウェルあたりの細胞数が５００００個となるように播種し、３７℃、５％炭酸ガス、飽和水蒸気雰囲気下の条件で２日間培養した。その後、細胞塊を生死細胞染色液Live/Dead Cell Staining Kit II（PromoCell社製）を用いて細胞を蛍光染色した後、蛍光顕微鏡ＩＸ７３（オリンパス社製）を用いて蛍光イメージを取得し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（ＩｍａｇｅＪ）によって細胞塊のサイズ（面積）の均一性を培養試験１と同じ基準で評価した。結果を表１に示す。
【0044】
【表1】
【符号の説明】
【0045】
１…マイクロプレート、１０…プレート本体、１２…ウェル、１４…底面、１６…ウェル側壁、２０…微細ウェル、Ｂ…周縁領域。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】