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特許7598854クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）誘導性腸炎症の治療のためのｍｉＲ－２７ａ－５ｐマイクロＲＮＡの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-04
(45)【発行日】2024-12-12
(54)【発明の名称】クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）誘導性腸炎症の治療のためのｍｉＲ－２７ａ－５ｐマイクロＲＮＡの使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/713 20060101AFI20241205BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241205BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20241205BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241205BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241205BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20241205BHJP
A61K 35/763 20150101ALI20241205BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20241205BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20241205BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20241205BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20241205BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20241205BHJP
A61K 47/56 20170101ALI20241205BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20241205BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20241205BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20241205BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20241205BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20241205BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20241205BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20241205BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20241205BHJP
C12N 15/869 20060101ALI20241205BHJP
【ＦＩ】
A61K31/713 ZNA
A61K48/00
A61P1/00
A61P31/04
A61K35/76
A61K35/761
A61K35/763
A61K9/127
A61K9/51
A61K9/107
A61K9/10
A61K47/54
A61K47/56
A61K47/60
A61K47/61
A61K47/59
C12N15/113 Z
C12N15/861 Z
C12N15/867 Z
C12N15/86 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/869 Z
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021525250
(86)(22)【出願日】2019-11-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-18
(86)【国際出願番号】 EP2019080748
(87)【国際公開番号】W WO2020094865
(87)【国際公開日】2020-05-14
【審査請求日】2022-09-05
(31)【優先権主張番号】1860380
(32)【優先日】2018-11-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(73)【特許権者】
【識別番号】520018392
【氏名又は名称】ユニベルシテ パリ－サクレー
(73)【特許権者】
【識別番号】504006434
【氏名又は名称】アシスタンス パブリック－ホピトー デ パリ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】カンサウ， イマッド
(72)【発明者】
【氏名】コベイシー， フセイン
(72)【発明者】
【氏名】ララゼ， セシル
(72)【発明者】
【氏名】マルヴォー， ジャン‐クリストフ
【審査官】池田 百合香
(56)【参考文献】
【文献】米国特許第１１２９３０６４（ＵＳ，Ｂ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００ ～ ３３／４４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
クロストリジウム・ディフィシル感染症に罹患している対象の腸病変の予防又は低減における使用のための医薬組成物であって、二本鎖ＲＮＡであるｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックを含み、
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列及びその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡであり、
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列における標的ｍＲＮＡに結合する部分であるシード配列における少なくとも５つの連続したヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項2】
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列及びその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、配列番号２及び３のヌクレオチド配列からなる二本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
クロストリジウム・ディフィシル感染症に罹患している対象の腸病変の予防又は低減における使用のための医薬組成物であって、
二本鎖ＲＮＡであるｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックを含み、
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、配列番号１と９０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列及びその相補配列からなる二本鎖ＲＮＡである、医薬組成物。
【請求項5】
クロストリジウム・ディフィシル感染症に罹患している対象の腸病変の予防又は低減における使用のための医薬組成物であって、
二本鎖ＲＮＡであるｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックを含み、
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、配列番号２及び３のヌクレオチド配列からなる二本鎖ＲＮＡである、医薬組成物。
【請求項6】
医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、その安定性及び／又はトランスフェクションを促進するベクター、マトリックス又は粒子に会合しているか又は含まれる、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記ベクターが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記粒子が、リポソーム（ＤＯＰＣ）、脂質ナノ粒子、ナノセル、シリカナノ粒子、及びエクソソームからなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記マトリックスが、中性脂質エマルジョン（ＮＬＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、及びポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、脂質、コレステロール、ＰＥＧ、シクロデキストリン、キトサン、ポリ（アミドアミン）又はポリ（プロピレンイミン）のデンドリマー、及びＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）からなる群から選択される化学分子にコンジュゲートされている、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記対象に静脈内投与されることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明者らは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によってされる炎症反応を強力に調節することができるｍｉＲＮＡを同定した。したがって、本発明者らは、感染した患者の腸に対するこの感染の悪影響を予防又は低減するために、このｍｉＲＮＡを医薬組成物に組み込むことを提案する。このマイクロＲＮＡはｍｉＲ－２７ａ－５ｐである。有利なことに、このｍｉＲＮＡは、マトリックスに会合させるか、粒子に組み込むか、又はベクターによって運ぶことができる。治療目的で感染した対象にこのｍｉＲＮＡを投与することができる。
【背景技術】
【0002】
クロストリジウム・ディフィシルは、先進工業国における抗生物質投与後の感染症の原因となる主要な腸内病原菌である［１、２］。抗生物質への曝露、入院、及び高齢は、Ｃ．ディフィシル感染症（ＣＤＩ）に関連する主な危険因子である［１］。ＣＤＩは、軽度の下痢から生命を脅かす重度の偽膜性腸炎までの範囲にわたり得る。
【0003】
近年のＣＤＩの発生率と重症度の上昇は、流行性クローン、特にリボタイプ０２７株の出現と一致している。この上昇は、ケア費用の上昇を伴っている［３、４］。推定によると、米国のＣＤＩに関連する治療費は年間３０億ドルであり、カナダでも同様の予測がある［５～８］。米国では、医療システムに対するＣＤＩの年間経済的負担は、急性期医療施設の超過費用で年間４８億ドル近くに上ると推定されている［３］。これらの費用のほとんどは、ＣＤＩの主要エピソードに起因しており、１症例あたり１２，６０７ドルの費用である［９］。ヨーロッパでは、欧州疾病予防管理センター（ＥＣＤＣ）により推定されたＤＣＩの管理コストは、年間４４億ドル近くである［１０］。１２年間で、ＣＤＩの超過費用は国によって２７～９３％増加した可能性がある［１１；３９］。フランスでは、超過費用の推定は、ＣＤＩの１症例あたり１，６６６ユーロから５，８６７ユーロまで変動する可能性がある［１２］。
【0004】
これらの高い費用は、主に患者の隔離及び長期間の入院の必要性に関連している。しかしながら、再発の費用、ＣＤＩ誘発有害事象（合併症）の費用、介護施設での介護費用、社会的費用がまだ定義されていないため、ＣＤＩの総負担は大幅に過小評価されがちである。このことは、コミュニティ（院外）ＣＤＩの場合にもあてはまる。
【0005】
Ｃ．ディフィシルＡ及びＢの細胞溶解性毒素（それぞれＴｃｄＡ及びＴｃｄＢとして知られる）は、ＣＤＩに関連する病理に直接寄与する［１３、１４］が、他の要因が、細菌の定着及び病原性に役割を果たす。これらの要因の中で、細菌に運動性と走化性を与える鞭毛［１５］は、自然免疫応答の細胞受容体Ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）［１６］との相互作用を介した、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）及びＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化によって、腸の炎症反応に役割を果たすと考えられている。この炎症誘発性反応では、ＮＦ－κＢ経路が優位な経路であるように思われる。さらに、インビボでのＣＤＩのマウスモデルにおいて、毒素はＣ．ディフィシル鞭毛と協力して作用して炎症反応を誘発するが、これは、腸の炎症反応における毒素及び鞭毛の相乗的役割を示唆している［１７］。腸の炎症の重症度は、ＣＤＩの臨床初見の重症度と相関している。
【0006】
自然免疫応答の細胞受容体シグナル伝達経路であるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の制御のさまざまなメカニズムが説明されている。これらのメカニズムの中で、ｍＲＮＡに対する特異的作用による遺伝子の転写後制御に関与する２１～２４ヌクレオチドの非コードＲＮＡ配列であるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）［１８］は、ＴＬＲ依存性経路を調節することにより自然応答の免疫調節因子としての役割を果たす。ＴＬＲの活性化によって発現が誘導されるｍｉＲＮＡは、シグナル伝達カスケードのエフェクターを阻害することにより炎症反応を調節する。それらは、エフェクター標的、炎症経路の転写因子、及びＴＬＲ自体の発現に作用する［１９、２０］。
【0007】
現在まで、ＴＬＲシグナル伝達経路、例えばＮＦ－ＫＢ経路を調節するｍｉＲＮＡを使用して、クロストリジウム・ディフィシル誘発性の腸の炎症反応を効果的に低減することが可能であることが実証又は示唆されたことはない。
【0008】
しかしながら、ｍｉＲＮＡは、正常組織に悪影響を及ぼさないことで知られる分子である。それらは今、特にがんの治療に効果的な次世代の薬物候補と考えられている（［４０］）。
【0009】
このことに関して、クロストリジウム・ディフィシル誘発性炎症反応を、例えばこの感染中に過剰活性化されたＮＦ－κＢ経路を十分に阻害することにより、強力に調節できるｍｉＲＮＡを同定することは非常に有利であろう。そのようなｍｉＲＮＡを医薬組成物に組み込むことにより、感染した患者の腸におけるこの細菌の有害な影響を予防又は低減することができる薬物を得ることが可能となるであろう。
【発明を実施するための形態】
【0010】
この推論に基づいて、本発明者らは、Ｃａｃｏ－２ヒト腸管上皮細胞モデル及びＣＤＩのマウスモデルにおいて、インビトロ及びインビボで、ＴＬＲ５－ＮＦ－κＢシグナル伝達経路に潜在的に関与するｍｉＲＮＡのパネルの発現を研究した。
【0011】
文献で「ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ」として知られているｍｉＲＮＡは、Ｃ．ディフィシル鞭毛によって刺激されるか、又は全菌体で感染されたＣａｃｏ－２細胞内で、時間経過とともに顕著に過剰発現するようであった（図１）。これらの結果は、このｍｉＲＮＡがＣ．ディフィシル鞭毛誘導反応において役割を果たすことを示している。さらに、Ｃ．ディフィシル又は非鞭毛変異体に感染した従来の微生物叢マウス又はＴＬＲ５ ＫＯマウス（ｔｌｒ５－／－）の盲腸におけるｍｉＲ－２７ａ－５ｐのインビボ発現の分析により、本ｍｉＲＮＡは野生型感染マウスの盲腸でも過剰発現した一方で、非鞭毛変異体感染マウスの盲腸又は野生株に感染したｔｌｒ５－／－ＫＯマウスの盲腸では、本ｍｉＲＮＡの発現の変化が観察されなかったことが、明らかになった（図４）。最後に、本ｍｉＲＮＡのミミック（「ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ－ミミック」）をＣＤＩのマウスモデルに静脈内投与し、組織損傷及び重度の臨床症状の原因となる宿主応答を研究した。この実験の結果は、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、このマウスモデルの感染中に細菌によって引き起こされる臨床的及び病理学的症状を顕著に軽減することを示す（図５及び６）。この結果は、本ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの、ＣＤＩ中の炎症反応の調節における、重要な役割の証左を提供する。
【0012】
より正確には、以下に示す結果全体は、Ｃ．ディフィシル鞭毛が、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの過剰発現を誘導し、炎症反応の程度を低下させ、その結果、Ｃ．ディフィシルの腸管感染中に観察される臨床症状を軽減することを示している。
【0013】
この研究は、Ｃ．ディフィシル毒素及び鞭毛によって誘導される炎症反応を低減し、この炎症によって引き起こされる粘膜損傷の予防（又は低減）における、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの主要な役割を強調している。したがって、本ｍｉＲＮＡは、ＣＤＩの臨床所見及び予後に影響を与える。
【0014】
この細菌を用いて感染の重度の悪影響を軽減するために、本発明者らは、本ｍｉＲＮＡを治療用組成物の有効成分として使用することを提案する。
【0015】
第１の態様では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル感染症に罹患している対象の腸病変の予防又は低減における使用のための、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックを含む医薬組成物に関する。
【0016】
本出願の文脈において、「ｍｉＲＮＡ」という用語は、マイクロＲＮＡを示すために使用される。これらは、２０～２５ヌクレオチドを有する短い非コードＲＮＡであり、標的ｍＲＮＡに結合し、その翻訳を阻害する。これらのｍｉＲＮＡは、二本鎖型（前駆体又は二重鎖）又は一本鎖型（成熟型、すぐに標的ｍＲＮＡに結合できるもの）であってもよい。
【0017】
「ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ」として知られるｍｉＲＮＡは、マウス及びヒトにおいて、同じ配列番号１（ＡＧＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＵＧＵＧＡＧＣＡ）を有する二本鎖ＲＮＡである。それは２００１年に同定され（［４１］）、大動脈細胞のＮＦ－κＢ経路（［４２］）及びがん（［４３］）に関与している。また、僧帽弁間質細胞においても同定されている（［４６］）。
【0018】
これらの異なる研究に関与する細胞メカニズムは、本発明者らによって観察された結果とは全く無関係である：２つの論文［４２］及び［４６］においては、ＴＬＲは関与していない。論文［４６］では、ＮＦ－κｂ経路は活性化されておらず、関与しているのはＪＮＫ及びＷｎｔ／Ｂ－カテニン経路である。
【0019】
さらに、同じｍｉＲＮＡが、所与の条件下及び所与の細胞型において所与の役割を有し、並びに別の細胞型において全く反対の役割を有する可能性があることは当該技術分野において周知である。例えば、ｍｉＲ－２７ａ自体は乳がんにおいて発癌性の役割を有し、前立腺がんでは腫瘍抑制因子の役割を有する場合がある（［４７］；［４８］）。本発明者とは対照的に、いくつかのチームは、ｍｉＲ－２７ａが活性化マクロファージにおいてＩＬ－１０媒介性炎症反応を増加させることさえ示唆している（［４９］）。ｍｉＲ－１４６ａは、考慮される細胞によっては反対の効果を有することも知られている（ＬＰＳ活性化単球上清によって刺激された内皮細胞における炎症誘発性効果［５０］又はＬＰＳ刺激血管内皮細胞における抗炎症効果［５１］）。
【0020】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック」は、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐのものと同一又は類似の配列を有し、同じ遺伝子標的を調節することが可能である任意の合成二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。好ましくは、この合成分子は、ＲＮａｓｅ及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）タンパク質に対する安定性を増加するために化学修飾を受けているという点で、天然のｍｉＲＮＡと異なる。
【0021】
前記化学修飾は、例えば、構造のさまざまな場所での、メチル化、ホスホロチオエート基の付加（リン酸基の非結合性酸素の硫黄原子による置換）、メチル基の付加（例えば、２’－Ｏ－メチル又は２’－Ｏ－メトキシエチル）である（［４４］）。
【0022】
本明細書で使用される場合、「類似配列」は、既知の天然ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ配列（例えば、配列番号１）と、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上のパーセント同一性を有する核酸配列を意味する。２つの核酸配列間の「パーセント同一性」は、ベストアラインメント（最適なアラインメント）の後に得られた、比較する２つの配列間の同一ヌクレオチドのパーセンテージを意味すると理解され、このパーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間の差異はそれらの全長に渡ってランダムに分布する。
【0023】
このパーセント同一性は、当業者によく知られている任意の配列分析方法によって計算することができる。パーセント同一性は、全体として比較される配列のグローバルアラインメントの後に決定することができる。マニュアル決定に加えて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）のアルゴリズムを使用して決定することもできる。ヌクレオチド配列については、Ｎｅｅｄｌｅソフトウェアなどの当業者に周知の任意のソフトウェアを使用して配列比較を行うことができる。使用されるパラメーターは以下のようであってもよい：「Ｇａｐ Ｏｐｅｎ」１０．０に等しい、「Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ」０．５に等しい、及びＥＤＮＡＦＵＬＬマトリックス（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）。このパーセンテージは、比較する配列のローカルアラインメント後に決定することもできる。マニュアルに加えて、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）のアルゴリズムを使用してこのパーセンテージを決定できる。好ましくは、本発明の文脈で定義されるパーセント同一性は、それらの全長に渡って比較される配列のグローバルアラインメントの手段によって決定される。
【0024】
好ましくは、「ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック」は、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの少なくとも５つ又は６つの連続したヌクレオチド［標的ｍＲＮＡに結合する部分］を含む合成二本鎖ＲＮＡ分子である。その場合、そのオリゴヌクレオチド配列の残りは、好ましくは、少なくとも７０％のｍｉＲＮＡの他の部分とのパーセント同一性を有する。
【0025】
さらにより好ましくは、前記「ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック」は、配列番号２（５’－ＡＧＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＵＧＵＧＡＣＣＣＣＣ－３’）の配列を有し、及び配列番号３（５’－ＧＧＧＧＧＵＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＵＡＡＧＣＣＣＵ－３’）（又はその補体）のコンパニオン配列を有する二本鎖ＲＮＡであり、番号Ｍ－００３０３－０２００ ＣＯＮｍｉＲ（登録商標）ミミックインビボの元でＲＩＢＯＸＸから販売されている。
【0026】
本発明の医薬組成物において、ｍｉＲＮＡミミックはネイキッドであり得る。ｍｉＲＮＡミミックはまた、その安定性及びトランスフェクタビリティ（標的細胞への侵入）を促進するために、正に帯電した化学分子若しくはナノ粒子（すなわち、直径１μｍ未満の粒子）と複合体を形成するか、又はカプセル、リポソームなどの保護材料で包むこともできる。
【0027】
これらの分子は同じ構造を有するため、ｓｉＲＮＡの輸送及び標的化を促進することが知られている任意の安定化手段を使用して、本発明のミミックの送達を容易にすることができる。そのような手段は、例えば、［４０］及び［４５］に記載されているものである。
【0028】
好ましい実施形態では、したがって、前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックは、その安定性及びトランスフェクタビリティを促進するベクター、マトリックス、又は粒子に会合している（又は含まれる）。
【0029】
ベクターによって運ばれる場合、前記ベクターは、好ましくは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクシニアウイルスなどから選択される組換えウイルスである。
【0030】
有利には、前記組換えウイルスは欠陥ウイルス、例えば欠陥ＡＡＶである。
【0031】
「欠陥ウイルス」という用語は、標的細胞内で複製することが不能なウイルスを指す。典型的には、欠陥ウイルスのゲノムは、感染した細胞における前記ウイルスの複製に必要な、少なくとも１つの配列を欠いている。これらの領域は、除去するか、機能しないようにさせるか、又は他の配列によって、特に目的のペプチドをコードする核酸によって置換することができる。それにもかかわらず、好ましくは、欠陥ウイルスは、ウイルス粒子のカプセル化に必要なそのゲノムの配列を依然として保持している。
【0032】
すでにｓｉＲＮＡを運搬するために使用されていることから、このベクターはバクテリオファージであってもよい。ＭＳ２、Ｐｈｉ２９などのバクテリオファージを本発明で使用することができる。
【0033】
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが粒子に会合している場合、後者はｓｉＲＮＡ輸送のためにすでに提案されているものであってもよい。それらは、例えば、リポソーム（ＤＯＰＣ）、脂質ナノ粒子、ナノセル（ＥｎＧｅｎｅＩＣ ＥＤＶタイプ）、シリカナノ粒子、エクソソームなどである可能性がある。
【0034】
より正確には、これらの粒子は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子であってもよく、好ましくはキトサンでコーティングされている。本発明のｍｉＲＮＡミミックは、ｓｉＲＮＡについて以前に実証されたように［３８］、イオン対形成によってその中に容易に吸着され得る。
【0035】
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックがマトリックスに埋め込まれている場合、前記マトリックスは、中性脂質エマルジョン（ＮＬＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）などであり得る。
【0036】
より正確には、前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックは、炎症反応を引き起こすことなく、任意の種類の核酸をインビボで異なる器官に効率的に輸送することがよく知られている「インビボｊｅｔＰＥＩ（登録商標）」などのカチオン性ポリマーと複合体を形成することができる。
【0037】
例えば、脂質、コレステロール、ＰＥＧ、シクロデキストリン、キトサン、デンドリマー（ポリ（アミドアミン）又はポリ（プロピレンイミン）の）、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）など）から選択される、目的のタンパク質又は化学分子と結合した本発明のミミックを投与することも可能である。
【0038】
本発明はまた、クロストリジウム・ディフィシル感染症に罹患している対象を治療するための方法に関する。これらの方法は、クロストリジウム・ディフィシルに感染した患者に本発明の医薬組成物を投与するステップを含む。
【0039】
最後に、本発明は、クロストリジウム・ディフィシルに感染した患者を治療するための薬物を製造するための、上記で定義された本発明のミミックの使用に関する。
【0040】
ＣＤＩの診断は、古典的に、ｉ）下痢、便中に粘液及び血液が存在する大腸炎、若しくは巨大結腸症、偽膜性大腸炎、腸穿孔などの合併症の発症の臨床像の疑い、又はｉｉ）便中の毒素又は細菌自体の検出（微生物培養、ＰＣＲ、ＧＤＨ検査）によって行われる。
【0041】
細胞毒性試験は遊離毒素の存在を検出するために使用され、毒素産生培養は細菌の存在を明らかにする。症状（下痢）の場合にこの感染を迅速に検出するために、現在、標準化された方法（酵素結合免疫吸着アッセイ、ＰＣＲ、等温増幅）が利用可能になった。
【0042】
特定の実施形態では、本発明の治療から利益を得る対象は、中等度から重度の形態のＣＤＩのうちの１つを有する対象である。例えば、これらは、脱水症を伴う重大で持続的な下痢（３日以上）、赤痢様形態（腹痛及び便中の血液及び粘液の存在を伴う）、結腸拡張（巨大結腸症）及び偽膜性大腸炎（しばしば内視鏡検査で検出される）を伴う形態を有する対象である。また、重度の形態でＣＤＩがしばしば現れる併存疾患（心臓病、糖尿病、肝消化器病変、外科的病変など）の患者にも発生することがある。
【0043】
これらの対象は、動物（家畜であってもなくとも、例えば猫、犬、馬）又は人間である可能性がある。好ましくは、これらの対象は乳児ではない。
【0044】
本明細書で使用される場合、「治療」は、治癒的（細菌誘導性腸病変の発症を少なくとも緩和又は停止することを目的とする）又は予防的（そのような病変の発症リスクを低減すること）のいずれかを意味する。
【0045】
本発明で使用される医薬組成物は、有効成分として、上記の核酸（任意選択で、粒子、ベクター、脂質などによって会合又は保護されている）を含む。本発明で使用される医薬組成物はまた、好ましくは、医薬的に許容される賦形剤を含む。
【0046】
本明細書において、「医薬的に許容される賦形剤」は、医薬組成物に含まれるが、２次反応を起こさず、例えば、活性化合物（複数可）の投与を容易にするか、体内でのその寿命及び／又はその有効性を増加させるか、溶けて溶解度を増加させるか、又はその保存性を改善する化合物（又は化合物の組み合わせ）を意味すると理解される。これらの医薬的に許容される賦形剤は周知であり、選択された活性化合物（複数可）の性質及び投与様式に応じて当業者によって適合されるであろう。
【0047】
好ましくは、本発明のミミックは、全身的に、特に静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内若しくは皮下、又は経口投与される。より好ましくは、本発明のミミックは経時的に分散して、数回投与される。
【0048】
本発明のミミックの最適な投与様式、投薬量及び剤形は、患者の年齢又は体重、患者の全身状態の重症度、治療の耐性及び観察された副作用など、患者に適合させた治療を確立する際に一般的に考慮される基準に従って決定することができる。
【0049】
活性成分は、任意選択で１つ又は複数の添加剤担体を含むマイクロカプセルとして製剤化することもできる。これらのマイクロカプセルの調製のために、活性成分は、一般に、適切な希釈剤、適切な安定剤、活性成分の持続的な放出を促進する作用剤、又は任意の他の種類の添加剤と組み合わせて、適切なポリマー（例えば、水溶性樹脂又は水不溶性樹脂）でその後コーティングされる中心コアを形成する。当業者に既知の技術が、この目的のために使用される。次に、得られたマイクロカプセルは、任意選択で適切な剤形単位で製剤化される。
【0050】
本発明のミミックはまた、リポソーム中に製剤化することができる。リポソームは、水性媒体中に分散し、同心円状の多層二重層ベシクルを自発的に形成するリン脂質から形成される。これらのベシクルは、通常、直径２５ｎｍ～４ｐｍであり、超音波処理されて、コアに水溶液を含む直径２００～５００Åのより小さな単層ベシクルを形成する。リポソームは、特定の細胞標的又は組織標的への薬物送達に特に有利である。この目的のために、脂質は、標的ペプチド（例えば、ホルモン）又は抗体などの標的分子に化学的に結合することができる。
【0051】
投与量は、考慮されるベクター／複合体、投与様式、感染の段階、並びに患者の年齢及び状態に依存して、当然異なる。一部の著者は、１０ｍｇ／ｋｇのｍｉＲＮＡの静脈内投与を使用している。より少ない用量を使用することもできる（例えば、１日あたり３～５ｍｇ／ｋｇ）。
【0052】
本発明のミミックがカチオン性ポリマー又は別の担体に会合している場合、反復注射で、単回投与又は複数回投与で、より高い用量（２５ｍｇ／ｋｇ）を使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0053】
【図1】図１は、フラジェリンＦｌｉＣ又はＣ．ディフィシルとインキュベートしたＣａｃｏ－２細胞によるｍｉＲ－２７ａ－５ｐ発現のキネティクスを示す図である。（Ａ）ＦｌｉＣと１２時間インキュベートしたＣａｃｏ－２細胞によるｍｉＲ－２７ａ－５ｐ発現のキネティクス。（Ｂ）細胞をＦｌｉＣとインキュベートするか、野生株Ｒ２０２９１（ＷＴ）又はその非鞭毛変異体（ＦｌｉＣ－）に１時間感染させた。ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの発現は、表１のオリゴヌクレオチドを用いたｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した。各ポイントのバーは、少なくとも３回の独立した実験の平均の標準偏差に対応する。
【図2】図２は、フラジェリンＦｌｉＣ又はＣ．ディフィシル株Ｒ２０２９１とインキュベートしたＣａｃｏ－２細胞におけるＮＦ－ｋＢ及びＭＡＰＫの特定の化学的阻害剤によるｍｉＲ－２７ａ－５ｐ過剰発現の阻害を示す図である。ＮＦ－κＢ及びＭＡＰＫ経路は、細胞刺激又は感染の１時間前に、細胞単層へ、２０μＭ ＢＭＳ ３４５５４１（ＩＫＫα阻害剤）、２０μＭ Ｕ０１２６（ＭＥＫ１／２阻害剤）、２０μＭ ＰＤ９８０５９（ＭＥＫ１阻害剤）、２０μＭ ＳＰ６００１２５（ＪＮＫ阻害剤）、又は３μＭ ＳＢ２０３５８０（ｐ３８阻害剤）を用いて阻害された。ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの発現は、１時間、細胞をＦｌｉＣ（Ａ）とインキュベートした後、又は野生株Ｒ２０２９１（ＷＴ）（Ｂ）に感染させた後に分析した。ｍｉＲＮＡの発現は、表１のオリゴヌクレオチドを使用したｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した。各ポイントのバーは、少なくとも３回の独立した実験の平均の標準偏差に対応する。
【図3-1】図３は、フラジェリンとインキュベートしたＣａｃｏ－２細胞におけるＮＦ－κＢ経路に対するｍｉＲ－２７ａ－５ｐの阻害効果を示す図である。Ｃａｃｏ－２細胞は、それぞれのｍｉＲ－２７ａミミック、ｍｉＲ－２７ａ阻害剤、及びそれぞれのオリゴヌクレオチドミミック及び阻害剤対照でトランスフェクトされた。ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの発現は、オリゴヌクレオチド５’－ＡＧＧＧＣＴＴＡＧＣＴＧＣＴＴＧＴＧＡＧ－３’（配列番号４）を用いたｑＲＴ－ＰＣＲによって測定された。（Ａ）。エフェクターＩκＢ－α分解シグナル伝達ＮＦ－κＢ経路の活性化をウエスタンブロットにより測定した（Ｂ）。
【図3-2】（Ｃ）炎症誘発性サイトカインＴＮＦα及びＩＬ－８ ｍＲＮＡ（オリゴヌクレオチド表２）の発現、並びに（Ｄ）ＥＬＩＳＡによる細胞培養上清中のＩＬ－８産生もまた測定した。各ポイントのバーは、少なくとも３回の独立した実験の平均±標準偏差である（＊ｐ＜０．０１）。
【図4】図４は、Ｃ．ディフィシル感染マウスの盲腸におけるｍｉＲ－２７ａ－５ｐ発現を示す図である。（Ａ）野生株Ｒ２０２９１（ＷＴ）又は同質遺伝子の非鞭毛変異体（ＦｌｉＣ－）に感染した従来型微生物叢を有するマウスの盲腸でｑＰＣＲによって測定されたｍｉｒ－２７ａ－５ｐ発現。３番目のグループは、ＷＴ株で感染させたｔｌｒ５－／－ＫＯマウスにおけるｍｉｒ－２７ａ－５ｐ発現に対応する。横バーはグループごとの平均である。（Ｂ）Ｒ２０２９１ ＷＴ株で感染させた通常飼育マウスの盲腸におけるｍｉｒ－２７ａ－５ｐ発現とＫＣ ｍＲＮＡ発現（ヒトＩＬ－８等価物、オリゴヌクレオチド表２）との相関。
【図5】図５は、ＣＤＩのマウスモデルにおけるｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック治療のプロトコルを示す図である。従来型微生物叢を有する４～５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスのグループは、Ｄ０感染の前に、Ｄ－６からＤ－３まで、飲料水に加えた抗生物質カクテルで前処置する（０．４ｍｇ／ｍＬカナマイシン、０．０３５ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、８５０Ｕ／ｍＬコリスチン、０．２１５ｍｇ／ｍＬメトロニダゾール及び０．０４５ｍｇ／ｍＬバンコマイシン）。Ｄ－１で、０．２ｍＬのクリンダマイシン溶液（１．２５ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内（ＩＰ）注射する。Ｄ０で、野生株の胞子１０５を含む０．５ｍＬの懸濁液（対照マウスの場合は０．５ｍＬの滅菌水）をマウスに強制経口投与することにより感染させる。その後、治療グループのマウスは、感染時、感染後８時間、及び２４時間に、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック／インビボ－ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）懸濁液を５０μｇ（すなわち、２５ｍｇ／ｋｇ）、３回静脈内投与される（１５０μＬを眼窩後方に注射）。動物の臨床状態を観察し、Ｄ２で盲腸分析のためにマウスを屠殺した。
【図6-1】図６は、Ｃ．ディフィシルに感染したマウスの盲腸の炎症を示す図である。従来型微生物叢（ｎ＝９～１０）を有するＣ５７ＢＬ／６マウスのグループを感染させ、ｍｉＲ－２７ａミミックで治療したか又は治療しなかった。盲腸は感染後のＤ２で収集された。（Ａ、Ｂ）対照マウス（非感染及びｍｉＲ－２７ａミミックで治療）
【図6-2】（Ｃ、Ｄ）野生型Ｒ２０２９１ ＷＴで感染させたマウス
【図6-3】（Ｅ、Ｆ）同じ株で感染させ、ｍｉＲ－２７ａミミックで治療したマウスの代表的な盲腸全体及び組織学的切片。
【図6-4】（Ｇ）各グループの個々のマウスについての組織学的炎症スコア（表３）。水平線は、各グループの平均スコアを表す（対照グループのスコア０は示さず）。赤い丸は、ＣＤＩの症状を示した３匹の動物を示す。（Ｈ）ＩκＢ－α及びアクチンに対する抗体を用いて明らかにされた盲腸溶解物から実行されたウエスタンブロット。写真は、１つの実験からの代表的なブロットを表す。Ｆｕｓｉｏｎソフトウェアを使用してバンド密度を測定し、ＩκＢ－α／アクチン比を計算した。陰性対照については、比率を１に正規化し、他のサンプルの比率は陰性対照に繰り越された。各点のバーは、動物の各グループの平均±標準偏差である。＊ｐ＜０．０５。
【実施例】
【0054】
材料及び方法
Ｉ．細菌株
動物モデルの感染には、Ｃ．ディフィシルの２つの株が使用された：野生株Ｒ２０２９１（ＮＡＰ１／０２７）及びフラジェリンｆｌｉＣ遺伝子が不活性化されたその同質遺伝子変異体（ΔＦｌｉＣ）である。この変異株は、挿入遺伝子不活性化からなるＣｌｏｓＴｒｏｎテクノロジー（Ｎ．Ｍｉｎｔｏｎ、ノッティンガム大学）を使用して構築された［２２］。両方の株は、栄養型又は胞子型として、－８０℃で凍結保存される。
Ｉ．細菌株
動物モデルの感染には、Ｃ．ディフィシルの２つの株が使用された：野生株Ｒ２０２９１（ＮＡＰ１／０２７）及びフラジェリンｆｌｉＣ遺伝子が不活性化されたその同質遺伝子変異体（ΔＦｌｉＣ）である。この変異株は、挿入遺伝子不活性化からなるＣｌｏｓＴｒｏｎテクノロジー（Ｎ．Ｍｉｎｔｏｎ、ノッティンガム大学）を使用して構築された［２２］。両方の株は、栄養型又は胞子型として、－８０℃で凍結保存される。
【0055】
ＩＩ．アフィニティークロマトグラフィーによる組換えＣ．ディフィシルＦｌｉＣタンパク質の精製
Ｃ．ディフィシル株Ｒ２０２９１（ＮＡＰ１／０２７）のフラジェリンＦｌｉＣは、以前に実験室で構築されたＮ末端ヒスチジンテイル（ＦｌｉＣ－Ｈｉｓ）を持つＦｌｉＣタンパク質をコードするプラスミドｐＥＴ２８を保有する大腸菌ＢＬ２１株で生産された。
Ｃ．ディフィシル株Ｒ２０２９１（ＮＡＰ１／０２７）のフラジェリンＦｌｉＣは、以前に実験室で構築されたＮ末端ヒスチジンテイル（ＦｌｉＣ－Ｈｉｓ）を持つＦｌｉＣタンパク質をコードするプラスミドｐＥＴ２８を保有する大腸菌ＢＬ２１株で生産された。
【0056】
５０μｇ／ｍＬカナマイシン（プラスミドの維持が可能）を含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）培地中での大腸菌ＢＬ２１ ｐＥＴ２８の前培養を、２Ｌの同じ培地で１：１００に希釈し、その後、３７℃で３時間インキュベートする。次に、ＦｌｉＣ－Ｈｉｓ合成の誘導は、１ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって行われる。３７℃で３時間インキュベートした後、培養物を４０００ｒｐｍで４℃、１５分間遠心分離する。次に、ペレットを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）及び５００μＬのプロテアーゼ阻害剤Ｐ－８４６５（Ｓｉｇｍａ）を含む５０ｍＬの溶解緩衝液に取り込む。溶解は４℃で１時間振とうしながら行った。次に、－８０℃で３回の凍結融解サイクルと、それに続く４５秒の５回の超音波処理サイクルを行って、細菌を溶解する。次に、４℃、１００００ｇで４０分間、懸濁液を遠心分離する。５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、８Ｍ尿素及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＬの平衡化緩衝液中に、ペレットを取り込む。１００００ｇで４０分間、懸濁液を遠心分離し、上清を回収して０．４５μｍフィルターでろ過し、あらかじめ２容量の超純水（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（登録商標））と３容量の平衡化緩衝液で洗浄した、２ｍＬのＣｏ＋＋二価陽イオンをロードした樹脂（Ｔａｌｏｎ（登録商標）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と４℃で１時間接触させる。次に、混合物をカラムにデポジットさせ、平衡化緩衝液で樹脂を３回洗浄し、その後、ＦｌｉＣ－Ｈｉｓタンパク質を４５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、８Ｍ尿素、２７０ｍＭ ＮａＣｌ及び１５０ｍＭイミダゾールを含む３ｍＬの溶出緩衝液で溶出する。次に、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｓｅｒ（登録商標）透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、溶出液を４℃でＰＢＳに対して透析し、分子量１００００Ｄａ未満の分子を透析させる。
【0057】
透析後、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、続いて０．２５％クーマシーブルー染色を行って、サンプルの純度を確認した。ゲル上に標準範囲のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）画分Ｖ（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ（登録商標））もデポジットさせ、バンドの密度を測定することにより、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて検量線を設定する。最後に、ＦｌｉＣ－Ｈｉｓの濃度は、１０μＬの溶出液をデポジットさせた後、組換えタンパク質に対応するバンドの密度を測定することによって決定され、検量線の式を使用して計算する。
【0058】
ＩＩＩ．細胞培養
Ｃａｃｏ－２（結腸腺癌）細胞株を使用した。これは、インビトロで腸管上皮をモデル化するために、最も広く使用されている細胞モデルの１つである。Ｃａｃｏ－２細胞は、ＴＬＲ５を含むいくつかのＴＬＲを発現するヒト腸管上皮細胞である。この株は、１５％の脱補体ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）で培養される。
Ｃａｃｏ－２（結腸腺癌）細胞株を使用した。これは、インビトロで腸管上皮をモデル化するために、最も広く使用されている細胞モデルの１つである。Ｃａｃｏ－２細胞は、ＴＬＲ５を含むいくつかのＴＬＲを発現するヒト腸管上皮細胞である。この株は、１５％の脱補体ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）で培養される。
【0059】
細胞株は、１０％ＤＭＳＯ（凍結防止剤）を補充したＦＣＳ中、－１２０℃の液体窒素凍結アンプルに保存される。解凍後、２５及び７５ｃｍ２フラスコで培養を行い、細胞がコンフルエントになったときに２回の継代培養を行う。Ｍａｌａｓｓｅｚ ｃｅｌｌを使用して細胞をカウントし、その後、新しいディッシュに分配する。培養細胞は、１０％ＣＯ２を含み、水蒸気で飽和した雰囲気下、３７℃のインキュベーター内で維持される。培地は、解凍後４８時間、その後、毎日交換する。マイコプラズマ汚染の検査は、細胞単層をＣａｒｎｏｙの固定液で固定し、その後、１：２０００に希釈したＨｏｅｃｈｓｔ試薬（Ｓｉｇｍａ）で染色することによって行われる。次に、細胞単層を蛍光顕微鏡で観察する。
【0060】
ＩＶ．細胞感染及び治療
Ｃａｃｏ－２細胞を、Ｃ．ディフィシルＲ２０２９１から精製された組換えＦｌｉＣ－Ｈｉｓタンパク質又はＣ．ディフィシル株と接触させる。２４ウェルプレートにウェルあたり５×１０５の細胞を播種し、その後、細胞をコンフルエンス後最大３日間、増殖させてから分極化に達せられる。細胞は、ＰＢＳで洗浄し、１５％の代わりに１％ＦＣＳを補充した０．５ｍＬのＤＭＥＭ培地を添加することにより、ＦｌｉＣとの接触前又はさまざまなＣ．ディフィシル株での感染前、４時間枯渇させて、シグナル伝達経路の活性化を回避させる。次に、細胞単層を１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＦｌｉＣ－Ｈｉｓタンパク質に１、２、４、６、８、１２、及び２４時間のインキュベーション時間、接触させた。ＦｌｉＣ－Ｈｉｓに接触していないＣａｃｏ－２細胞は、各研究時間の陰性対照である。インキュベーションキネティクスの最後に、各ウェルの培地を吸引し、細胞をＲＮＡ抽出のために直接溶解させる。各実験は、少なくとも３回独立して実行される。
Ｃａｃｏ－２細胞を、Ｃ．ディフィシルＲ２０２９１から精製された組換えＦｌｉＣ－Ｈｉｓタンパク質又はＣ．ディフィシル株と接触させる。２４ウェルプレートにウェルあたり５×１０５の細胞を播種し、その後、細胞をコンフルエンス後最大３日間、増殖させてから分極化に達せられる。細胞は、ＰＢＳで洗浄し、１５％の代わりに１％ＦＣＳを補充した０．５ｍＬのＤＭＥＭ培地を添加することにより、ＦｌｉＣとの接触前又はさまざまなＣ．ディフィシル株での感染前、４時間枯渇させて、シグナル伝達経路の活性化を回避させる。次に、細胞単層を１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＦｌｉＣ－Ｈｉｓタンパク質に１、２、４、６、８、１２、及び２４時間のインキュベーション時間、接触させた。ＦｌｉＣ－Ｈｉｓに接触していないＣａｃｏ－２細胞は、各研究時間の陰性対照である。インキュベーションキネティクスの最後に、各ウェルの培地を吸引し、細胞をＲＮＡ抽出のために直接溶解させる。各実験は、少なくとも３回独立して実行される。
【0061】
細胞をＣ．ディフィシルに感染させるために、野生型Ｒ２０２９１又はＣ．ディフィシルの非鞭毛変異株を、３７℃の嫌気性チャンバー内の液体ＢＨＩ培地で事前に増殖させる。細菌懸濁液を５０００ｒｐｍで４分間遠心分離し、その後、１０ｍＬのＰＢＳで洗浄する。５０００ｒｐｍで４分間さらに遠心分離した後、ペレットを５００μＬのＰＢＳ中に取り込み、２×１０９バクテリア／ｍＬのバクテリア懸濁液を生成する。２５０μＬの細菌懸濁液を細胞と、すなわち、５０細菌／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で接触させる。
【0062】
示される場合、ＮＦ－κＢ及びＭＡＰＫ経路は、細胞単層に２０μＭ ＢＭＳ ３４５５４１（ＩＫＫα阻害剤）（Ｓｉｇｍａ）、２０μＭ Ｕ０１２６（ＭＥＫ１／２阻害剤）、２０μＭ ＰＤ９８０５９（ＭＥＫ１阻害剤）、２０μＭ ＳＰ６００１２５（ＪＮＫ阻害剤）、又は３μＭ ＳＢ２０３５８０（ｐ３８阻害剤）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｏｚｙｍｅ）を添加することにより、細胞刺激又は感染の１時間前に化学的に阻害された。
【0063】
Ｖ．Ｃａｃｏ－２細胞におけるｍｉＲ－２７ａ－５ｐの過剰発現及び阻害
ｍｉＲ－２７ａ－５ｐは、２５ｎＭのＳｙｎ－ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックを使用して培養Ｃａｃｏ－２細胞で過剰発現したが、阻害は２５０ｎＭのＡｎｔｉ－ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐで達成された（両方ともＱｉａｇｅｎから購入した）。トランスフェクションの前に、Ｃａｃｏ－２細胞を２４ウェルプレートに６×１０４細胞／ウェルで播種し、製造業者の取扱説明書に従ってＨｉＰｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）でトランスフェクトした。細胞を通常の増殖条件下でトランスフェクション複合体とともにインキュベートし、トランスフェクションの４８時間後に採集した。ｍｉＳｃｒｉｐｔ阻害剤陰性対照及びｍｉＳｃｒｉｐｔ陰性対照（Ｑｉａｇｅｎ）を、それぞれ陰性及び陽性対照として使用した。トランスフェクション効率をモニターするために、ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｈｓ細胞死対照ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を全てのトランスフェクションで並行して細胞にトランスフェクションすることにより組み込み、少なくとも７５％のトランスフェクション効率を達成した。必要に応じて、細胞を精製フラジェリンＦｌｉＣで１時間刺激した。ｍｉＲ－２７ａ－５ｐのレベル並びにインターロイキン８（ＩＬ－８）及びＴＮＦα遺伝子の発現は、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）で分析し、ＩκＢタンパク質のレベルは、ウエスタンブロットで評価し、細胞上清中のＩＬ－８のレベルは、ＥＬＩＳＡでアッセイした。
ｍｉＲ－２７ａ－５ｐは、２５ｎＭのＳｙｎ－ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックを使用して培養Ｃａｃｏ－２細胞で過剰発現したが、阻害は２５０ｎＭのＡｎｔｉ－ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐで達成された（両方ともＱｉａｇｅｎから購入した）。トランスフェクションの前に、Ｃａｃｏ－２細胞を２４ウェルプレートに６×１０４細胞／ウェルで播種し、製造業者の取扱説明書に従ってＨｉＰｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）でトランスフェクトした。細胞を通常の増殖条件下でトランスフェクション複合体とともにインキュベートし、トランスフェクションの４８時間後に採集した。ｍｉＳｃｒｉｐｔ阻害剤陰性対照及びｍｉＳｃｒｉｐｔ陰性対照（Ｑｉａｇｅｎ）を、それぞれ陰性及び陽性対照として使用した。トランスフェクション効率をモニターするために、ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｈｓ細胞死対照ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を全てのトランスフェクションで並行して細胞にトランスフェクションすることにより組み込み、少なくとも７５％のトランスフェクション効率を達成した。必要に応じて、細胞を精製フラジェリンＦｌｉＣで１時間刺激した。ｍｉＲ－２７ａ－５ｐのレベル並びにインターロイキン８（ＩＬ－８）及びＴＮＦα遺伝子の発現は、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）で分析し、ＩκＢタンパク質のレベルは、ウエスタンブロットで評価し、細胞上清中のＩＬ－８のレベルは、ＥＬＩＳＡでアッセイした。
【0064】
ＶＩ．動物モデル
従来型微生物叢を持つＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃ．ディフィシル感染症（ＣＤＩ）の動物モデルとして使用した。４～５週齢の雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、滅菌アイソレーターで飼育し、照射された餌とオートクレーブ処理された水を給餌する。動物が到着したら、糞便を回収して、Ｃ．ディフィシルによる腸管定着がないことを確認する。
従来型微生物叢を持つＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃ．ディフィシル感染症（ＣＤＩ）の動物モデルとして使用した。４～５週齢の雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、滅菌アイソレーターで飼育し、照射された餌とオートクレーブ処理された水を給餌する。動物が到着したら、糞便を回収して、Ｃ．ディフィシルによる腸管定着がないことを確認する。
【0065】
この感染モデルにおいては、飲料水に加えた抗生物質カクテルで、マウスを４日間（Ｄ０感染前のＤ－６からＤ－３まで）前処置した。このカクテルは、０．４ｍｇ／ｍＬカナマイシン、０．０３５ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、８５０Ｕ／ｍＬコリスチン、０．２１５ｍｇ／ｍＬメトロニダゾール及び０．０４５ｍｇ／ｍＬバンコマイシンで構成されている。その後、治療を２日間中止した。感染の１日前（Ｄ－１）に、１．２５ｍｇ／ｍＬのクリンダマイシン溶液０．２ｍＬを腹腔内（ＩＰ）注射した。Ｄ０（感染）で、野生株又はΔＦｌｉＣ株の胞子１０５個を含む懸濁液０．５ｍＬを、マウスに強制経口投与し、一方で、対照マウスの強制経口投与は０．５ｍＬの滅菌水で行われた。
【0066】
マウスの治療に使用されるｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック溶液は、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック（Ｒｉｂｏｘｘ（登録商標）（ドイツ）により合成）をインビボトランスフェクション試薬であるインビボｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－トランスフェクション（登録商標）、フランス）と混合することにより調製された。凍結乾燥したｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックを滅菌ミリポア水に再懸濁した後、５０μｇのｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックを滅菌グルコース溶液（最終グルコース濃度５％）で希釈した；６μＬのインビボｊｅｔＰＥＩ試薬も滅菌グルコース溶液（最終グルコース濃度５％）で希釈し、その後、これら２つの溶液を容量対容量で混合した（ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックの最終濃度、０．３３μｇ／μＬ）。次に、感染及び治療グループに属するマウスを、感染時、感染後８時間及び２４時間に、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック／インビボｊｅｔＰＥＩ（登録商標）懸濁液を５０μｇの３回静脈内投与（すなわち、２５ｍｇ／ｋｇ）で治療した（１５０μＬを眼窩後方に注射）。
【0067】
感染後、マウスを２日間、観察下に置き、ＣＤＩ、下痢、毛の逆立ち、活動低下の臨床症状を記録した。潜在的な感染関連体重変化を観察するために、マウスの体重も毎日測定した。
【0068】
感染後のＤ２で、マウスを屠殺し、各マウスの盲腸を採集し、縦方向に切断して、細菌の計数に十分な量の盲腸内容物を回収した。次に、盲腸をＰＢＳで洗浄し、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ｑｉａｇｅｎ）に浸してＲＮＡを安定化し、組織学的研究用、別の全ＲＮＡの即時抽出用、最後のタンパク質抽出用（イムノブロット用）の３つの部分に切り分けた。
【0069】
ＶＩＩ．細菌の計数
採取した盲腸内容物を１０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ（ストック溶液）に懸濁した。栄養形態の計数のために、ＰＢＳ中での１：１０希釈範囲を実行した：１００（１ｍｇ／ｍＬ）、１０－１（０．１ｍｇ／ｍＬ）、１０－２（０．０１ｍｇ／ｍＬ）及び１０－３（０．００１ｍｇ／ｍＬ）。したがって、１００μＬの各希釈液を、３％の脱線維化ウマ血液及び０．４％のオキソイドサプリメント（１２５ｍｇのＤ－サイクロセリン及び４ｍｇのセフォキシチン）を補充した脳心臓インフュージョン（ＢＨＩ）寒天培地に接種した。胞子の計数のために、盲腸内容物を、ストック溶液を１容量の無水エタノールと１０分間インキュベートして栄養形態を殺すことによるアルコールショックに供した。得られた懸濁液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを１容量のＰＢＳに取り込んだ。次に、１：１０の希釈範囲を実行した：１００（１ｍｇ／ｍＬ）及び１０－１（０．１ｍｇ／ｍＬ）。ストック溶液と各希釈液を、Ｃ．ディフィシル胞子の発芽と計数のために、０．１％タウロコール酸（Ｓｉｇｍａ）を補充した同じ培地に接種した。培地を嫌気性制御雰囲気チャンバー（５％Ｈ２、５％ＣＯ２、９０％Ｎ２の雰囲気）中で、３７℃で４８時間培養した。
採取した盲腸内容物を１０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ（ストック溶液）に懸濁した。栄養形態の計数のために、ＰＢＳ中での１：１０希釈範囲を実行した：１００（１ｍｇ／ｍＬ）、１０－１（０．１ｍｇ／ｍＬ）、１０－２（０．０１ｍｇ／ｍＬ）及び１０－３（０．００１ｍｇ／ｍＬ）。したがって、１００μＬの各希釈液を、３％の脱線維化ウマ血液及び０．４％のオキソイドサプリメント（１２５ｍｇのＤ－サイクロセリン及び４ｍｇのセフォキシチン）を補充した脳心臓インフュージョン（ＢＨＩ）寒天培地に接種した。胞子の計数のために、盲腸内容物を、ストック溶液を１容量の無水エタノールと１０分間インキュベートして栄養形態を殺すことによるアルコールショックに供した。得られた懸濁液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを１容量のＰＢＳに取り込んだ。次に、１：１０の希釈範囲を実行した：１００（１ｍｇ／ｍＬ）及び１０－１（０．１ｍｇ／ｍＬ）。ストック溶液と各希釈液を、Ｃ．ディフィシル胞子の発芽と計数のために、０．１％タウロコール酸（Ｓｉｇｍａ）を補充した同じ培地に接種した。培地を嫌気性制御雰囲気チャンバー（５％Ｈ２、５％ＣＯ２、９０％Ｎ２の雰囲気）中で、３７℃で４８時間培養した。
【0070】
ＶＩＩＩ．ＲＮＡ抽出
ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）は、２００ヌクレオチド未満のサイズのＲＮＡ分子を抽出することができない大部分の市販キットとは異なり、Ｃａｃｏ－２株の細胞培養及びマウス盲腸組織からのｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡの抽出及び精製が可能であった。このキットを使用すると、フェノール／グアニジン混合物の使用に基づいてサンプルを溶解し、その後、シリカメンブレンカラムのおかげで全ＲＮＡを精製できる。
ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）は、２００ヌクレオチド未満のサイズのＲＮＡ分子を抽出することができない大部分の市販キットとは異なり、Ｃａｃｏ－２株の細胞培養及びマウス盲腸組織からのｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡの抽出及び精製が可能であった。このキットを使用すると、フェノール／グアニジン混合物の使用に基づいてサンプルを溶解し、その後、シリカメンブレンカラムのおかげで全ＲＮＡを精製できる。
【0071】
Ｃａｃｏ－２細胞からのＲＮＡ抽出においては、培地をウェルから吸引し、７００μＬのＱＩＡｚｏｌを添加した。溶解剤であるＱＩＡｚｏｌは、細胞溶解、ＲＮａｓｅの阻害、及び有機抽出による溶解物からのＤＮＡ及び細胞タンパク質の大部分の除去を可能にする、フェノール及びグアニジンチオシアン酸塩の単相溶液である。スクレーパーを用いて細胞単層をこすり取り、マイクロピペットを用いて溶解物を上下に数回ポンピングすることにより、溶解を継続する。溶解物の粘度を下げるために、その後、細胞を注射器と針で１０回上下にポンピングすることによって均質化した。
【0072】
屠殺したマウスから回収した盲腸は、ＱＩＡｚｏｌを添加した後、Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄ（登録商標）チューブ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で自動的にサンプルを均質化するために、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）を使用して溶解した。サンプルは、Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄ（登録商標）ビーズを速度６で４０秒間、同時に多方向に衝突させることにより、機械的に粉砕される。
【0073】
その後、溶解物を室温で５分間インキュベートして、核タンパク質複合体の解離を可能にした。次に、１４０μＬのクロロホルムをチューブに加え、１５秒間激しく振とうし、室温で３分間インキュベートした後、４℃で１２０００ｇ、１５分間遠心分離し、３つの相を形成させた：ＲＮＡを含む透明な水相（３５０μＬの容量）、ＤＮＡを含む白い中間相、及びタンパク質を含む赤い有機相。その後、水相を回収チューブに移し、そこに５２５μＬの無水エタノール（１．５容量）を加えて、ＲＮＡがカラムに結合するための適切な条件を確保した。このようにして得られた混合物を、回収チューブとつながったシリカ膜カラムに移した。カラムを室温で８０００ｇ以上、１５秒間、遠心分離し、上澄みを除去した。次に、７００μＬのＲＷＴ（登録商標）緩衝液を同じカラムに加え、８０００ｇ超で１５秒間、遠心分離することにより洗浄し、上清を除去した。次に、５００μＬのＲＰＥ（登録商標）緩衝液を用いて、８０００ｇ超で１５秒間遠心分離することにより、さらに２回の洗浄を行った。ＲＰＥ（登録商標）緩衝液で２回洗浄した後、８０００ｇ超で２分間、遠心分離を行い、確実にＲＮＡ溶出中にエタノールが存在しないようにした。４０μＬのＲＮａｓｅフリー水をカラムに加えた後、８０００ｇ超で１分間、遠心分離することにより、ＲＮＡ溶出を行った。
【0074】
最後に、抽出された全ＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）分光光度計（ＮＤ－２０００）を使用して、２μＬのサンプルをデポジットすることにより定量化した。この分析により、２６０及び２８０ｎｍでの吸光度比（Ａ２６０／Ａ２８０）及び２６０及び２３０ｎｍでの吸光度比（Ａ２６０／Ａ２３０）の計算も可能となり、各サンプルに存在する核酸の純度が評価できる。抽出された全ＲＮＡの純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）バイオアナライザーによる分析と、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）値の測定によっても評価された。
【0075】
ＩＸ．リアルタイムＰＣＲによるｍｉＲＮＡ発現の分析
ＩＸ．１．相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成
成熟ｍｉＲＮＡは天然には約２２ヌクレオチドで構成されており、ｍＲＮＡとは異なり、ポリアデニル化されていない。このため、ｃＤＮＡ合成は、ＲＴ性能及び成熟ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡへの選択的変換を可能にする「ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＨｉＳｐｅｃ」緩衝液を評価するため、逆転写酵素及びポリ（Ａ）－ポリメラーゼを含むｍｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＩＩ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）、核酸ミックス（ｄＮＴＰ、ｒＡＴＰ、オリゴｄＴプライマー及び内部対照のための合成ＲＮＡを含む）を使用して行われた。したがって、ポリアデニル化及び逆転写は同じチューブ内で並行して行われた。成熟ｍｉＲＮＡは、ポリ（Ａ）－ポリメラーゼによってポリアデニル化され、オリゴｄＴプライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写される。これらのプライマーは、３’縮重アンカー及びその５’末端にユニバーサルタグ配列を有し、ｑＰＣＲの間に成熟ｍｉＲＮＡの増幅を可能にする。ポリアデニル化とユニバーサルタグの添加を組み合わせることにより、ゲノムＤＮＡが検出されないことを確実にする。
ＩＸ．１．相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成
成熟ｍｉＲＮＡは天然には約２２ヌクレオチドで構成されており、ｍＲＮＡとは異なり、ポリアデニル化されていない。このため、ｃＤＮＡ合成は、ＲＴ性能及び成熟ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡへの選択的変換を可能にする「ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＨｉＳｐｅｃ」緩衝液を評価するため、逆転写酵素及びポリ（Ａ）－ポリメラーゼを含むｍｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＩＩ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）、核酸ミックス（ｄＮＴＰ、ｒＡＴＰ、オリゴｄＴプライマー及び内部対照のための合成ＲＮＡを含む）を使用して行われた。したがって、ポリアデニル化及び逆転写は同じチューブ内で並行して行われた。成熟ｍｉＲＮＡは、ポリ（Ａ）－ポリメラーゼによってポリアデニル化され、オリゴｄＴプライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写される。これらのプライマーは、３’縮重アンカー及びその５’末端にユニバーサルタグ配列を有し、ｑＰＣＲの間に成熟ｍｉＲＮＡの増幅を可能にする。ポリアデニル化とユニバーサルタグの添加を組み合わせることにより、ゲノムＤＮＡが検出されないことを確実にする。
【0076】
４μＬのＨｉＳｐｅｃ ５Ｘ ｍｉＳｃｒｉｐｔ緩衝液、２μＬの１０Ｘ ｍｉＳｃｒｉｐｔ核酸ミックス、及び２μＬの「ｍｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素」ミックスからなる混合物を、２μｇの全ＲＮＡに加え、ｃＤＮＡ合成を最終容量２０μＬで行った。３７℃で１時間、反応を行い、９５℃で５分間インキュベートすることにより、酵素を失活させた。サンプルを１：１０に希釈し、ＰＣＲ増幅前に－２０℃で保存した。
【0077】
ＩＸ．２．定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
使用したプライマーを表１に示す。ＣＦＸ９６サーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を用いて、ＰＣＲを行った。キットには、リバースプライマー（ユニバーサルプライマー）並びにｉｎｔｅｒｃａｌａｎｔ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）及びＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を含むマスターミックスが含まれる。ＰＣＲは、１μＬの希釈ｃＤＮＡテンプレート溶液、ＰＣＲ試薬（マスターミックス及びユニバーサルプライマー）からなる９μＬの混合物、及び０．５μＭの最終濃度の標的ｍｉＲＮＡに対応する各ｃＤＮＡの特異的プライマーを含む最終容量１０μＬで行った。サーマルプログラムには、調査した全ての標的について、最初の１５分間の９５℃でのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性化ステップと、それに続く１５秒間の、９４℃での変性、３０秒間、５５℃でのハイブリダイゼーション、３０秒間、７０℃での伸長を含む４０サイクルが含まれていた。増幅の後、融解ステップが続き、この融解ステップは、１分間、９５℃での変性、２分間、６５℃での鎖の再会合、その後、毎秒０．５℃の速度で９５℃に加熱することによりゆっくりと融解することからなり、各アンプリコンの融解温度（Ｔｍ）の決定を可能とした。
使用したプライマーを表１に示す。ＣＦＸ９６サーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を用いて、ＰＣＲを行った。キットには、リバースプライマー（ユニバーサルプライマー）並びにｉｎｔｅｒｃａｌａｎｔ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）及びＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を含むマスターミックスが含まれる。ＰＣＲは、１μＬの希釈ｃＤＮＡテンプレート溶液、ＰＣＲ試薬（マスターミックス及びユニバーサルプライマー）からなる９μＬの混合物、及び０．５μＭの最終濃度の標的ｍｉＲＮＡに対応する各ｃＤＮＡの特異的プライマーを含む最終容量１０μＬで行った。サーマルプログラムには、調査した全ての標的について、最初の１５分間の９５℃でのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性化ステップと、それに続く１５秒間の、９４℃での変性、３０秒間、５５℃でのハイブリダイゼーション、３０秒間、７０℃での伸長を含む４０サイクルが含まれていた。増幅の後、融解ステップが続き、この融解ステップは、１分間、９５℃での変性、２分間、６５℃での鎖の再会合、その後、毎秒０．５℃の速度で９５℃に加熱することによりゆっくりと融解することからなり、各アンプリコンの融解温度（Ｔｍ）の決定を可能とした。
【0078】
ＰＣＲの結果は、蛍光が蛍光光度計の検出しきい値を超えるために必要な増幅サイクル数に対応するサイクルしきい値（Ｃｔ）値で表される。得られた結果は、相対的発現として表した。
【0079】
【表1】
【0080】
サイトカイン遺伝子発現分析のためのｑＲＴ－ＰＣＲは、次の表２にリストされているオリゴヌクレオチドを使用して同じ条件下で行った。
【0081】
【表2】
【0082】
Ｘ．イムノブロットによるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化の分析
Ｘ．１．タンパク質抽出
盲腸組織片（約７０ｇ）を、セラミックビーズを含むＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）チューブ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）内の６００μＬの溶解緩衝液（６２ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％グリセロール、１．５％ＳＤＳ、０．２５％ブロモフェノールブルー）中に置いた。ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（登録商標）装置（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて機械的ホモジェナイズ下で組織を粉砕した。その後、サンプルは分析前に－２０℃で保存された。
Ｘ．１．タンパク質抽出
盲腸組織片（約７０ｇ）を、セラミックビーズを含むＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）チューブ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）内の６００μＬの溶解緩衝液（６２ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％グリセロール、１．５％ＳＤＳ、０．２５％ブロモフェノールブルー）中に置いた。ＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（登録商標）装置（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて機械的ホモジェナイズ下で組織を粉砕した。その後、サンプルは分析前に－２０℃で保存された。
【0083】
Ｘ．２．タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
サンプルを変性させた後（水浴中、１００℃で１０分間）、変性条件下の１２％ポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分離した（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。ウェルあたり８μＬのサンプルをデポジットした；５μＬの分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（登録商標）Ｐｌｕｓ前染色タンパク質ラダー、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）も各ゲルにデポジットした。泳動緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１％ＳＤＳ、１９２ｍＭグリシン）中、定電圧（２００Ｖ）で６０分間、泳動を行った。
サンプルを変性させた後（水浴中、１００℃で１０分間）、変性条件下の１２％ポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分離した（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。ウェルあたり８μＬのサンプルをデポジットした；５μＬの分子量マーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（登録商標）Ｐｌｕｓ前染色タンパク質ラダー、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）も各ゲルにデポジットした。泳動緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１％ＳＤＳ、１９２ｍＭグリシン）中、定電圧（２００Ｖ）で６０分間、泳動を行った。
【0084】
Ｘ．３．転写及びイムノブロット
ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンをメタノールで再生した後、タンパク質を３５０ｍＡで１時間、一定アンペア数で転写緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭグリシン）中で転写した。次に、ＩκＢ－αタンパク質による免疫染色を行い、続いて化学発光検出した。転写後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０と５％ミルクを補充したＴＢＳ（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）の混合物中で、メンブレンを１時間飽和させた。メンブレンを、ＩκＢ－αタンパク質（抗ＩｋＢ－α、ウサギＡｂ）又はアクチン（マウスＡｂ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標））に対する１次特異抗体（Ａｂ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。これらの抗体は、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０及び５％ＢＳＡを補充したＴＢＳで１：２０００に希釈した。次に、メンブレンを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＴＢＳで、１０分間３回洗浄した。次に、２次ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体（ＩｇＧ抗ウサギＨＲＰ結合抗体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標））又はマウスＡｂ（ＩｇＧ抗マウスＨＲＰ結合抗体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標））とともに、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。メンブレンを１０分間３回洗浄した後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ＴＭ Ｗｅｓｔｅｒｎ化学発光ＨＲＰ基質（登録商標）試薬とともに、１～５分間インキュベートした。メンブレンを染色し、アクチンでの正規化とともに、Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）機器（Ｖｉｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａ）を用いて画像を分析した。Ｆｕｓｉｏｎソフトウェアを使用してバンド密度を測定し、ＩκＢ－α／アクチン比を計算した。陰性対照の場合、比率は１に正規化され、他のサンプルの比率は各実験の陰性対照に繰り越された。
ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンをメタノールで再生した後、タンパク質を３５０ｍＡで１時間、一定アンペア数で転写緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭグリシン）中で転写した。次に、ＩκＢ－αタンパク質による免疫染色を行い、続いて化学発光検出した。転写後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０と５％ミルクを補充したＴＢＳ（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）の混合物中で、メンブレンを１時間飽和させた。メンブレンを、ＩκＢ－αタンパク質（抗ＩｋＢ－α、ウサギＡｂ）又はアクチン（マウスＡｂ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標））に対する１次特異抗体（Ａｂ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。これらの抗体は、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０及び５％ＢＳＡを補充したＴＢＳで１：２０００に希釈した。次に、メンブレンを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＴＢＳで、１０分間３回洗浄した。次に、２次ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体（ＩｇＧ抗ウサギＨＲＰ結合抗体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標））又はマウスＡｂ（ＩｇＧ抗マウスＨＲＰ結合抗体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（登録商標））とともに、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。メンブレンを１０分間３回洗浄した後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ＴＭ Ｗｅｓｔｅｒｎ化学発光ＨＲＰ基質（登録商標）試薬とともに、１～５分間インキュベートした。メンブレンを染色し、アクチンでの正規化とともに、Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）機器（Ｖｉｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａ）を用いて画像を分析した。Ｆｕｓｉｏｎソフトウェアを使用してバンド密度を測定し、ＩκＢ－α／アクチン比を計算した。陰性対照の場合、比率は１に正規化され、他のサンプルの比率は各実験の陰性対照に繰り越された。
【0085】
ＸＩ．組織学的分析
盲腸組織片をホルマリン溶液中に２４時間保存した後、７０％エタノールに移した。組織切片作製並びにヘマトキシリン及びエオシン染色は、Ｐａｒｉｓ Ｓａｃｌａｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ＩＰＳＩＴ（ＰＨＩＣ－ ３２ ｒｕｅ ｄｅｓ ｃａｒｎｅｔｓ、Ｃｌａｍａｒｔ ９２１４０、フランス）のクラマールマウス組織免疫病理学プラットフォームで行われた。
盲腸組織片をホルマリン溶液中に２４時間保存した後、７０％エタノールに移した。組織切片作製並びにヘマトキシリン及びエオシン染色は、Ｐａｒｉｓ Ｓａｃｌａｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ＩＰＳＩＴ（ＰＨＩＣ－ ３２ ｒｕｅ ｄｅｓ ｃａｒｎｅｔｓ、Ｃｌａｍａｒｔ ９２１４０、フランス）のクラマールマウス組織免疫病理学プラットフォームで行われた。
【0086】
スライド標本の顕微鏡分析は、ＮＤＰ Ｖｉｅｗ（登録商標）ソフトウェア（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を使用して行われた。炎症度のスコアは、粘膜下浮腫、炎症性浸潤、上皮病変、及び粘液細胞（杯細胞）の喪失に基づいて設立された。表３。
【0087】
【表3】
【0088】
ＸＩＩ．ＥＬＩＳＡによるサイトカインアッセイ
Ｃａｃｏ－２細胞培養上清中の炎症誘発性サイトカインＩＬ－８のレベルは、ヒトＩＬ－８ ＥＬＩＳＡキット（４Ａｂｉｏ、Ｃｈｉｎａ）を製造業者の取扱説明書に従って使用したＥＬＩＳＡによって評価された。検出限界は４ｐｇ／ｍＬであった。
Ｃａｃｏ－２細胞培養上清中の炎症誘発性サイトカインＩＬ－８のレベルは、ヒトＩＬ－８ ＥＬＩＳＡキット（４Ａｂｉｏ、Ｃｈｉｎａ）を製造業者の取扱説明書に従って使用したＥＬＩＳＡによって評価された。検出限界は４ｐｇ／ｍＬであった。
【0089】
ＸＩＩＩ．統計的検定
調査した変数の平均±標準偏差は、３回の反復試行から得られた；結果の統計分析は、マン－ホイットニー検定によって行った。ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５の値を統計的に有意であると考えた。
調査した変数の平均±標準偏差は、３回の反復試行から得られた；結果の統計分析は、マン－ホイットニー検定によって行った。ｐ＜０．０１又はｐ＜０．０５の値を統計的に有意であると考えた。
【0090】
結果：
Ｉ． Ｃ．ディフィシル及びそのフラジェリンＦｌｉＣによって誘発される炎症反応の制御に関与する可能性のあるｍｉＲＮＡのインシリコ検索
最近の研究結果は、Ｃ．ディフィシル及びそのフラジェリンＦｌｉＣが腸管上皮細胞及びマウス盲腸（ＣＤＩのマウスモデル）で炎症誘発性反応を誘導すること、及びＮＦ－κＢシグナル伝達経路が優位な経路であることを示している［１６、１７］。ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡに作用することによりシグナル伝達経路を制御できるため、これらの分子の役割は、ＣＤＩの間のフラジェリンＦｌｉＣとその特定の受容体ＴＬＲ５（先天性応答受容体）との相互作用によって誘導される炎症誘発性ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の調節において研究されている。
Ｉ． Ｃ．ディフィシル及びそのフラジェリンＦｌｉＣによって誘発される炎症反応の制御に関与する可能性のあるｍｉＲＮＡのインシリコ検索
最近の研究結果は、Ｃ．ディフィシル及びそのフラジェリンＦｌｉＣが腸管上皮細胞及びマウス盲腸（ＣＤＩのマウスモデル）で炎症誘発性反応を誘導すること、及びＮＦ－κＢシグナル伝達経路が優位な経路であることを示している［１６、１７］。ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡに作用することによりシグナル伝達経路を制御できるため、これらの分子の役割は、ＣＤＩの間のフラジェリンＦｌｉＣとその特定の受容体ＴＬＲ５（先天性応答受容体）との相互作用によって誘導される炎症誘発性ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の調節において研究されている。
【0091】
インシリコ検索は、ｍｉＲＧａｔｏｒ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、及びｍｉＲＷａｌｋデータベースで使用されるｍｉＲＮＡの３つの異なる標的予測アルゴリズムを使用して、行われた。これらのオンラインアルゴリズムは、目的のｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲ領域と、各ライブラリーに特異的なデータベースに存在するｍｉＲＮＡのシード配列との間の類似性の検索に基づいている。細菌鞭毛による刺激後のｍｉＲＮＡとＴＬＲ５シグナル伝達の異なるエフェクターとの関連を示す科学論文も考慮された。
【0092】
これらのインシリコ検索及び文献から選択された基準に基づいて、１１３のｍｉＲＮＡが選択された。これらのｍｉＲＮＡの中で、２０個ほどのｍｉＲＮＡ（表１）を試験して、Ｃ．ディフィシルフラジェリンＦｌｉＣと接触したＣａｃｏ－２細胞、より特には、接触の最初の数時間における発現キネティクスを評価した。試験したこれら全てのｍｉＲＮＡの中で、ｍｉＲＮＡ「ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ」は、特にインキュベーションの最初の数時間に、有意な過剰発現を示した（図１Ａ）。その過剰発現は、細胞が２時間のインキュベーションでＣ．ディフィシル株Ｒ２０２９１に感染したときに確認されたが、細胞が非鞭毛変異体に感染したときには、過剰発現は観察されなかった（図１Ｂ）。
【0093】
ＩＩ．ｍｉＲ－２７ａ－５ｐは、Ｃ．ディフィシル及びそのフラジェリンＦｌｉＣによって誘導されるＮＦ－κＢ炎症誘発性シグナル伝達経路において、役割を果たす。
ＮＦ－κＢ及びＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２、ｐ２８、及びＪＮＫ）シグナル伝達経路阻害が同定されたｍｉＲＮＡの発現に及ぼす影響を分析するために、これらの経路を、ＦｌｉＣ又は細菌による細胞の刺激の１時間前に、ＩＫＫα（ＮＦ－κＢ経路）、ＭＡＰＫ ＥＲＫ１／２、ｐ３８、及びＪＮＫの特異的阻害剤によって化学的に阻害した。細胞をＦｌｉＣ又はＲ２０２９１株と２時間インキュベートした後、ｍｉＲＮＡ－２７ａ－５ｐの発現が消失した（図２Ａ及びＢ）。ＩＫＫα阻害剤（ＢＭＳ ３４５５４１）を使用すると、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ発現のはるかに強力な（約４０倍）阻害が達成され、このｍｉＲＮＡが、Ｃ．ディフィシル及びそのフラジェリンによって誘導される炎症誘発性ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の制御に役割を果たすことが示される（図２Ａ及びＢ）。
ＮＦ－κＢ及びＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２、ｐ２８、及びＪＮＫ）シグナル伝達経路阻害が同定されたｍｉＲＮＡの発現に及ぼす影響を分析するために、これらの経路を、ＦｌｉＣ又は細菌による細胞の刺激の１時間前に、ＩＫＫα（ＮＦ－κＢ経路）、ＭＡＰＫ ＥＲＫ１／２、ｐ３８、及びＪＮＫの特異的阻害剤によって化学的に阻害した。細胞をＦｌｉＣ又はＲ２０２９１株と２時間インキュベートした後、ｍｉＲＮＡ－２７ａ－５ｐの発現が消失した（図２Ａ及びＢ）。ＩＫＫα阻害剤（ＢＭＳ ３４５５４１）を使用すると、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ発現のはるかに強力な（約４０倍）阻害が達成され、このｍｉＲＮＡが、Ｃ．ディフィシル及びそのフラジェリンによって誘導される炎症誘発性ＮＦ－κＢシグナル伝達経路の制御に役割を果たすことが示される（図２Ａ及びＢ）。
【0094】
ＩＩＩ．ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックは、Ｃ．ディフィシル及びそのフラジェリンＦｌｉＣによってインビトロで誘導される炎症誘発性ＮＦ－κＢシグナル伝達経路を阻害する。
以前の結果は、ＮＦ－κＢの活性化を介してＣ．ディフィシル及びそのフラジェリンＦｌｉＣによってその発現が誘導されるｍｉＲ－２７ａ－５ｐ（配列番号１＝ＡＧＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＵＧＵＧＡＧＣＡ）が、このＮＦ－κＢ経路の制御に役割を果たすことを実証している。ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの役割は、それがＮＦ－κＢ経路の活性化剤（炎症誘発性）であるか阻害剤（抗炎症性）であるかを明らかにするために特徴付けられた。この目的のために、異なる分子が使用された：このｍＲ－２７ａ－５ｐの活性を模倣する分子（オリゴヌクレオチド）（「ｍＲ－２７ａミミック」）又はその活性に拮抗する化学分子（「ｍｉＲ－２７ａ－阻害剤」＝抗－ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ）。
以前の結果は、ＮＦ－κＢの活性化を介してＣ．ディフィシル及びそのフラジェリンＦｌｉＣによってその発現が誘導されるｍｉＲ－２７ａ－５ｐ（配列番号１＝ＡＧＧＧＣＵＵＡＧＣＵＧＣＵＵＧＵＧＡＧＣＡ）が、このＮＦ－κＢ経路の制御に役割を果たすことを実証している。ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの役割は、それがＮＦ－κＢ経路の活性化剤（炎症誘発性）であるか阻害剤（抗炎症性）であるかを明らかにするために特徴付けられた。この目的のために、異なる分子が使用された：このｍＲ－２７ａ－５ｐの活性を模倣する分子（オリゴヌクレオチド）（「ｍＲ－２７ａミミック」）又はその活性に拮抗する化学分子（「ｍｉＲ－２７ａ－阻害剤」＝抗－ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ）。
【0095】
Ｃａｃｏ－２細胞にこれらの２つの分子、並びに対照オリゴヌクレオチド及び阻害剤をトランスフェクトした後、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの発現を細胞溶解後に測定した。図３Ａに示されるように、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ阻害剤は、ＦｌｉＣ刺激細胞におけるこのｍｉＲＮＡの発現を顕著に減少させたが、ｍｉＲ－２７ａミミックは高発現された。これらの２つの分子で細胞をトランスフェクトする効果は、ＮＦ－κＢ経路の活性化をシグナル伝達するエフェクターＩκＢ－αの分解、炎症誘発性サイトカインＴＮＦα及びＩＬ－８のｍＲＮＡの発現、並びに細胞培養上清中のＩＬ－８の産生に関して測定された。
【0096】
抗ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ（ｍｉＲ－２７ａ阻害剤）は、ＩκＢ－αの強い分解、ＴＮＦα及びＩＬ－８サイトカインｍＲＮＡの発現の増加、並びに培養上清中のＩＬ－８合成の増加を誘導するが（図３Ｂ、Ｃ及びＤ）、これは、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐがＮＦ－κＢ経路において阻害的役割を果たし、したがって、ＦｌｉＣ－ＴＬＲ５相互作用によって誘導されるシグナル伝達カスケードにおいて抗炎症的役割を果たしていることを示唆している。
【0097】
これらの観察結果と全く一致して、細胞をｍｉＲ－２７ａミミックでトランスフェクションすると、ＩκＢ－α分解の欠如、したがってＮＦ－κＢ活性化、サイトカインＴＮＦα及びＩＬ－８のｍＲＮＡ発現の強い阻害、並びに細胞上清におけるＩＬ－８合成の欠如に特徴付けられる抗炎症細胞応答を誘導した（図３Ｂ、Ｃ及びＤ）。これらの観察結果全体は、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐが、フラジェリン－ＴＬＲ５相互作用によってＮＦ－κＢ炎症誘発性経路が活性化された後に、この経路の阻害的役割を果たすことを示している。このｍｉＲＮＡは、ＴＬＲ５－ＮＦ－κＢシグナル伝達カスケードのフィードバックループに関与していると考えられる。
【0098】
ＩＶ．ＭｉＲ－２７ａ－５ｐは、Ｃ．ディフィシルに感染したマウスの盲腸において、インビボで高度に過剰発現する。
Ｃ．ディフィシル及びその鞭毛によって誘導される炎症の制御におけるｍｉＲ－２７ａ－５ｐの潜在的な役割に関するインビトロで行われた観察を確認するために、ＣＤＩのマウスモデルにおける感染の間におけるこのｍｉＲ－２７ａ－５ｐの発現を腸（盲腸）で分析した。
Ｃ．ディフィシル及びその鞭毛によって誘導される炎症の制御におけるｍｉＲ－２７ａ－５ｐの潜在的な役割に関するインビトロで行われた観察を確認するために、ＣＤＩのマウスモデルにおける感染の間におけるこのｍｉＲ－２７ａ－５ｐの発現を腸（盲腸）で分析した。
【0099】
従来型微生物叢を有する４～５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの２つのグループ（各グループでｎ＝１０）及びＣ５７ＢＬ／６ ｔｌｒ５－／－ＫＯマウスの１つのグループ（ＴＬＲ５を発現しない、ｎ＝１０）が形成された。腸内毒素症を生じさせる感染前の６日間の動物の抗生物質治療後（材料及び方法を参照）、従来型微生物叢マウスの１つのグループを野生型Ｃ．ディフィシルＲ２０２９１（ＷＴ）で胃内強制経口投与により感染させ、他を鞭毛の欠損した同質遺伝子変異体（ＦｌｉＣ－）で感染させた。ｔｌｒ５－／－ＫＯマウスの１つのグループもまた、ＷＴ株で感染させた。感染していないマウスのグループは、各グループの相対発現比を確立するための対照として役立った。動物の盲腸におけるｍｉＲ－２７ａ－５ｐ発現の分析により、非鞭毛変異体（ＦｌｉＣ－）で感染させたマウス及びＷＴ株で感染させたｔｌｒ５－／－ＫＯマウスで観察された発現と比較して、ＷＴ株で感染させた従来型微生物叢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの盲腸において、このｍｉＲＮＡがより高く発現することが示された（図４Ａ）。これらの結果は、ＴＬＲ５との相互作用を介してＣ．ディフィシル鞭毛が、マウス盲腸におけるｍｉＲ－２７－ａ－５ｐの発現の増加に役割を果たしていることを示しているが、これは、インビボで、以前に報告された鞭毛－ＴＬＲ５相互作用［１７］の結果としてのＮＦ－κＢ活性化が、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ発現と相関していることを示唆している。
【0100】
さらに、ヒトＩＬ－８と同等のマウスＫＣサイトカイン遺伝子ｍＲＮＡ発現の分析により、図４Ｂに示すように、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの発現増加との完全な相関関係が明らかになる。
【0101】
Ｖ． ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックは、ＣＤＩのマウスモデルにおいてインビボでの炎症の重症度を軽減する。
Ｃａｃｏ－２細胞においてｍｉＲ－２７ａ－５ｐによって誘導される抗炎症効果を考慮して、このｍｉＲＮＡのオリゴヌクレオチドミミック（ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック）のインビボ効果を分析した。このオリゴヌクレオチドは、ＣＤＩのマウスモデルに静脈内（ＩＶ）投与された（図５）。従来型微生物叢を有する４～５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つのグループ（各グループについてｎ＝９～１０）を試験した。腸内毒素症誘導性抗生物質治療後、感染していない動物の１つのグループを、感染時、感染後８時間、及び２４時間に、５０μｇ（すなわち、２５ｍｇ／ｋｇ）の３回投与で、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック／インビボｊｅｔＰＥＩ（登録商標）懸濁液を用いて静脈内治療した（１５０μＬを眼窩後方に注射）。動物の第２グループは、野生株Ｒ２０２９１で感染させたが、ｍｉＲミミックで治療せず、及び、第３グループもまたこのＣ．ディフィシル株で感染させたが、第１グループと同様にｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック／インビボｊｅｔＰＥＩ（登録商標）懸濁液で治療した。
Ｃａｃｏ－２細胞においてｍｉＲ－２７ａ－５ｐによって誘導される抗炎症効果を考慮して、このｍｉＲＮＡのオリゴヌクレオチドミミック（ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック）のインビボ効果を分析した。このオリゴヌクレオチドは、ＣＤＩのマウスモデルに静脈内（ＩＶ）投与された（図５）。従来型微生物叢を有する４～５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つのグループ（各グループについてｎ＝９～１０）を試験した。腸内毒素症誘導性抗生物質治療後、感染していない動物の１つのグループを、感染時、感染後８時間、及び２４時間に、５０μｇ（すなわち、２５ｍｇ／ｋｇ）の３回投与で、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック／インビボｊｅｔＰＥＩ（登録商標）懸濁液を用いて静脈内治療した（１５０μＬを眼窩後方に注射）。動物の第２グループは、野生株Ｒ２０２９１で感染させたが、ｍｉＲミミックで治療せず、及び、第３グループもまたこのＣ．ディフィシル株で感染させたが、第１グループと同様にｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミック／インビボｊｅｔＰＥＩ（登録商標）懸濁液で治療した。
【0102】
感染後、このＣＤＩモデルで期待されるように、感染させ、及びｍｉＲ－２７ａミミックで治療しないマウスは、ＣＤＩの臨床的兆候を示した：下痢、毛の逆立ち、感染後のＤ１及びＤ２での活動性低下（表４）。ｍｉＲ２７－ａミミックで治療された感染グループの１０匹の動物のうち３匹だけが下痢を発症したが、これは感染後Ｄ２であった。感染後のＤ２で、盲腸内容物の細菌数（コロニー形成単位－ＣＦＵ／ｇ）によって定量化された、感染動物の腸内定着率は、これら２つのグループ間の臨床症状の違いがマウスの低腸定着の結果である可能性を除いて、感染マウスのグループ（未治療のＷＴ及びＷＴ＋ｍｉＲ－２７ａミミック）間で全く同等であることに留意されたい。
【0103】
【表4】
感染後のＤ２で、野生型感染及び未治療の動物の盲腸の病理学的分析により、図６Ａ及び図６Ｃに示されるように、非感染マウス（陰性対照）の正常な盲腸と比較して、出血領域及び粘膜盲腸内容物を伴う炎症性充血の外観が示された。盲腸の炎症性の外観は、感染したマウスのｍｉＲ－２７ａミミック治療グループにおいて、大幅に減弱した（図６Ｅ）。盲腸切片の組織学的研究に関しては、期待したように、炎症性浸潤、上皮侵食、杯細胞の消失を伴う顕著な粘膜浮腫が、野生型感染及びｍｉＲ－２７ａミミック未治療マウスの盲腸に見られ、非感染マウスのスコア０と比較して、６～９の範囲の炎症スコアを有する（表３）（図６Ｇ）。対照的に、ｍｉＲ－２７－ａミミックで治療された感染動物のグループでは、１０匹中６匹のマウスが、炎症の証拠がほとんど又は全く無い盲腸を有しており、粘液を含まない正常な盲腸内容物であった（図６Ｅ）。これらの動物の炎症の組織学的スコアは６未満であり、主に細胞浸潤及び軽度から中等度の浮腫を示した（図６Ｆ及びＧ）。感染後Ｄ２で下痢を示したこの「感染及びミミック治療」グループの３匹のマウス（表４）は、感染及び未治療マウスに匹敵する高い炎症スコアを示し（図６Ｇ）、この感染モデルマウスにおけるｍｉＲ－２７ａ－５ｐの有効率は７０％をもたらした。
【0104】
感染後Ｄ２の盲腸組織におけるＮＦ－κＢ経路活性化の分析により、感染及び未治療マウスの盲腸では、非感染マウスと比べて、ＩκＢ－αの強い分解が明らかになったが、これは、臨床症状に関して、このＣＤＩモデルにおける通常の観察結果と一致している［１７］。対照的に、ｍｉＲ－２７ａミミックで治療した感染マウスの盲腸ではＩκＢ－αの活性化は検出されなかったが（図６Ｈ）、これは、このマウスモデルでは、細菌の感染に関連する臨床症状及び腸管の炎症現象が減少されるという以前の観察結果を補強するものである。
【0105】
［結論］
結論として、本研究は、Ｃ・ディフィシルの毒素及び鞭毛によって誘導される炎症反応を低減し、したがってこの炎症によって引き起こされる粘膜損傷を予防又は低減する、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの主要な役割を強調している。このｍｉＲＮＡは、Ｃ．ディフィシルの腸管感染中に鞭毛－ＴＬＲ５相互作用によって活性化されるＮＦ－κＢシグナル伝達経路を阻害することにより、ＣＤＩの臨床症状と予後に影響を与える。
結論として、本研究は、Ｃ・ディフィシルの毒素及び鞭毛によって誘導される炎症反応を低減し、したがってこの炎症によって引き起こされる粘膜損傷を予防又は低減する、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐの主要な役割を強調している。このｍｉＲＮＡは、Ｃ．ディフィシルの腸管感染中に鞭毛－ＴＬＲ５相互作用によって活性化されるＮＦ－κＢシグナル伝達経路を阻害することにより、ＣＤＩの臨床症状と予後に影響を与える。
【0106】
Ｃ．ディフィシル誘導性の炎症誘発性ＴＬＲ５－ＮＦ－κＢシグナル伝達経路を標的とする特定のｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックのインビボ効果が、ＣＤＩのマウスモデルにおいて実証された。この分子は、Ｃ．ディフィシルに感染したマウスの腸炎症反応を低減することにより、これらのマウスの有害反応を減少させることができる。これらの結果は、このｍｉＲＮＡを治療用組成物の有効成分として使用することにより、この細菌の感染の重度の悪影響を軽減することが可能であることを実証する。
さらなる実施形態は以下のとおりである。
［実施形態１］
クロストリジウム・ディフィシル感染症に罹患している対象の腸病変の予防又は低減における使用のための医薬組成物であって、二本鎖ＲＮＡであるｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックを含む、医薬組成物。
［実施形態２］
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、配列番号１に７０％を超えて類似するヌクレオチド配列を有する、実施形態１に記載の医薬組成物。
［実施形態３］
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、配列番号１のヌクレオチド配列を有する、実施形態１に記載の医薬組成物。
［実施形態４］
医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［実施形態５］
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、その安定性及び／又はトランスフェクションを促進するベクター、マトリックス又は粒子に会合しているか又は含まれる、実施形態１～４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［実施形態６］
前記ベクターが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される、実施形態５に記載の医薬組成物。
［実施形態７］
前記粒子が、リポソーム（ＤＯＰＣ）、脂質ナノ粒子、ナノセル、シリカナノ粒子、及びエクソソームからなる群から選択される、実施形態５に記載の医薬組成物。
［実施形態８］
前記マトリックスが、中性脂質エマルジョン（ＮＬＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、及びポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）からなる群から選択される、実施形態５に記載の医薬組成物。
［実施形態９］
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、脂質、コレステロール、ＰＥＧ、シクロデキストリン、キトサン、ポリ（アミドアミン）又はポリ（プロピレンイミン）のデンドリマー、及びＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）からなる群から選択される化学分子にコンジュゲートされている、実施形態１～４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［実施形態１０］
前記対象に静脈内投与されることを特徴とする、実施形態１～９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
さらなる実施形態は以下のとおりである。
［実施形態１］
クロストリジウム・ディフィシル感染症に罹患している対象の腸病変の予防又は低減における使用のための医薬組成物であって、二本鎖ＲＮＡであるｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックを含む、医薬組成物。
［実施形態２］
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、配列番号１に７０％を超えて類似するヌクレオチド配列を有する、実施形態１に記載の医薬組成物。
［実施形態３］
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、配列番号１のヌクレオチド配列を有する、実施形態１に記載の医薬組成物。
［実施形態４］
医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［実施形態５］
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、その安定性及び／又はトランスフェクションを促進するベクター、マトリックス又は粒子に会合しているか又は含まれる、実施形態１～４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［実施形態６］
前記ベクターが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される、実施形態５に記載の医薬組成物。
［実施形態７］
前記粒子が、リポソーム（ＤＯＰＣ）、脂質ナノ粒子、ナノセル、シリカナノ粒子、及びエクソソームからなる群から選択される、実施形態５に記載の医薬組成物。
［実施形態８］
前記マトリックスが、中性脂質エマルジョン（ＮＬＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、及びポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）からなる群から選択される、実施形態５に記載の医薬組成物。
［実施形態９］
前記ｍｉＲ－２７ａ－５ｐミミックが、脂質、コレステロール、ＰＥＧ、シクロデキストリン、キトサン、ポリ（アミドアミン）又はポリ（プロピレンイミン）のデンドリマー、及びＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）からなる群から選択される化学分子にコンジュゲートされている、実施形態１～４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［実施形態１０］
前記対象に静脈内投与されることを特徴とする、実施形態１～９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【0107】
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【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【配列表】