特許 7598938 抗原由来Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを細胞表面に提示するための融合抗体、及びこれを含む組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-04

(45)【発行日】2024-12-12

(54)【発明の名称】抗原由来Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを細胞表面に提示するための融合抗体、及びこれを含む組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20241205BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241205BHJP

   C12N 15/38 20060101ALI20241205BHJP

   C12N 15/34 20060101ALI20241205BHJP

   C12N 15/44 20060101ALI20241205BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20241205BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241205BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241205BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20241205BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20241205BHJP

   C07K 14/045 20060101ALI20241205BHJP

   C07K 14/05 20060101ALI20241205BHJP

   C07K 14/11 20060101ALI20241205BHJP

   C07K 14/165 20060101ALI20241205BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241205BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241205BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241205BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241205BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241205BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241205BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241205BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241205BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20241205BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20241205BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20241205BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20241205BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20241205BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20241205BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20241205BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20241205BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241205BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20241205BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241205BHJP

   C07K 14/74 20060101ALN20241205BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20241205BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C12N15/38

C12N15/34

C12N15/44

C12N15/50

C07K19/00

C07K16/28

C07K7/06

C07K7/08

C07K14/045

C07K14/05

C07K14/11

C07K14/165

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C12P21/02 C

A61K39/395 N

A61K39/12

A61K39/145

A61K39/215

A61P31/00

A61P31/12

A61P31/16

A61P31/20

A61P31/14

A61P35/00

A61P37/02

A61K47/68

C07K14/74

C12N5/0783

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2022547813

(86)(22)【出願日】2021-02-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-28

(86)【国際出願番号】 KR2021001571

(87)【国際公開番号】W WO2021158073

(87)【国際公開日】2021-08-12

【審査請求日】2022-09-28

(31)【優先権主張番号】10-2020-0014468

(32)【優先日】2020-02-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】515131404

【氏名又は名称】アジュ ユニバーシティー インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＡＪＯＵ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ－ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100194973

【弁理士】

【氏名又は名称】尾崎 祐朗

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヨンスン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジョンア

(72)【発明者】

【氏名】チョン，クンオク

(72)【発明者】

【氏名】イ，ソヨン

(72)【発明者】

【氏名】ソン，ミンジョン

【審査官】市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５１３０７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】Cell. Mol. Life Sci.，2018年，Vol. 75，pp.2887-2896

【文献】Biochem. Biophys. Res. Commun.，2018年，Vol. 503，pp.2510-2516

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞又は組織特異的細胞質浸透抗体に配列番号１３～１６、１８、１９、２１～２４、２６～３３、３５、及び３６からなる群から選択される配列を含むＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エ ピトープを含むペプチドが融合した融合抗体であって、前記抗体は、配列番号１の配列を有する重鎖及び配列番号２の配列を有する軽鎖を含む、融合抗体。

【請求項2】

細胞質浸透抗体によってＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを含むペプチドを標的細胞の細胞質に伝達して、標的細胞表面の抗原提示分子ＭＨＣ－Ｉ（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ＣｏｍｐｌｅｘクラスＩ）にＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープペプチドを提示することを特徴とする、請求項１に記載の融合抗体。

【請求項3】

前記細胞質浸透抗体によって細胞内に内在化した後にエンドソームを脱出して細胞質内に局在可能であることを特徴とする、請求項２に記載の融合抗体。

【請求項4】

前記標的細胞は、癌細胞、ウイルス又は病原性微生物感染細胞、肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌ）、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）、粘膜細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、筋肉細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ）、皮膚細胞（ｓｋｉｎ ｃｅｌｌｓ）、又は幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）であることを特徴とする、請求項２に記載の融合抗体。

【請求項5】

前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを含むペプチドは、ヒトに感染を起こすウイルス抗原由来であることを特徴とする、請求項１に記載の融合抗体。

【請求項6】

前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを含むペプチドは、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）、インフルエンザＡウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ，ＩＡＶ）、又はＣｏｖｉｄ－１９（ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－２，ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを含むペプチドであることを特徴とする、請求項５に記載の融合抗体。

【請求項7】

前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを含むペプチドは、細胞質浸透抗体の軽鎖及び重鎖のＮ末端又はＣ末端に１個以上が融合したことを特徴とする、請求項１に記載の融合抗体。

【請求項8】

前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを含むペプチドは、細胞質浸透抗体の重鎖Ｃ末端及び／又は軽鎖Ｃ末端に融合したことを特徴とする、請求項７に記載の融合抗体。

【請求項9】

前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを含むペプチド１個又は２個以上が細胞質浸透抗体の重鎖Ｃ末端に融合したことを特徴とする、請求項８に記載の融合抗体。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の融合抗体を含む、標的細胞表面にＴ細胞抗原エピトープを提示するための組成物。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか一項に記載の融合抗体を含む、癌、自己免疫疾患又は感染疾患の予防及び／又は治療用組成物。

【請求項12】

請求項１１に記載の組成物を含む、癌の治療又は予防用ワクチン。

【請求項13】

請求項１～９のいずれか一項に記載の融合抗体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。

【請求項15】

請求項１４に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項16】

請求項１５に記載の宿主細胞を培養し、生産された融合抗体を回収する段階を含むことを特徴とする融合抗体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）又はこれを含むペプチドを標的細胞（ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）の細胞質に伝達し、標的細胞表面の抗原提示分子ＭＨＣ－Ｉ（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ）にＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを展示（ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ）可能にする融合抗体、これを含む組成物、及びその用途に関する。

【0002】

より具体的に、本発明は、細胞又は組織特異的細胞質浸透能を持つ細胞質浸透抗体（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｓｏｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）に、抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが遺伝的に連結（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ）されて融合した融合抗体及びこれを含む組成物に関し、前記融合抗体は標的細胞の細胞質に伝達され、標的細胞表面の抗原提示分子ＭＨＣ－ＩにＴ細胞抗原エピトープを展示可能にする。

【0003】

前記抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）は、癌、自己免疫疾患などの疾病源であるタンパク質抗原を含むが、人に感染を起こし得るウイルス抗原由来のものが好ましい。

【0004】

本発明は、抗原由来Ｔ細胞抗原エピトープを標的細胞表面に提示させ、ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体を特異的に認知する細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ＣＤ８^＋ Ｔ ｃｅｌｌ，ＣＴＬ）が認知して標的細胞を殺傷可能にする融合抗体及びその組成物に関する。

【0005】

具体的に、前記融合抗体を用いてウイルス抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を癌細胞の細胞質に伝達して癌細胞表面にウイルスペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体を発現させ、癌細胞をウイルス感染細胞として認識させると、癌患者の体内に循環する抗ウイルス細胞傷害性Ｔ細胞が癌細胞をウイルス感染細胞として認識して殺傷し、結局終局には、融合抗体を癌を除去する用途に活用可能にすることに関する。

【背景技術】

【0006】

主組織適合性複合体（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）は、脊椎動物において外来分子を認識させるための細胞表面タンパク質をコードする遺伝子セットであり、免疫反応の対象物質をＴ細胞（Ｔ ｃｅｌｌｓ）抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）として認識させる抗原提示分子の役割を担う。ＭＨＣは、大きく、Ｉ型ＭＨＣ（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ＭＨＣ－Ｉ）とＩＩ型ＭＨＣ（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ＭＨＣ－ＩＩ）の２種類に分けられる。ヒトのＭＨＣ－ＩＩは、アルファ鎖（ａｌｐｈａ－ｃｈａｉｎ，α－ｃｈａｉｎ）、ベータ鎖（ｂｅｔａ－ｃｈａｉｎ，β－ｃｈａｉｎ）で構成された異型重合体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）構造である。ヒトのＭＨＣ－Ｉは、ヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）とベータ－２－マイクログロブリン（ｂｅｔａ－２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，β２ｍ）の異型重合体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）構造である。ヒトのＭＨＣ－Ｉ型は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃの３つの型の遺伝子があり、腫瘍細胞を含めて核を持つあらゆる細胞で発現する。ＭＨＣ－Ｉ型が提示する抗原はＣＤ８^＋Ｔ細胞と反応する。ＭＨＣ－ＩＩ型は、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲの遺伝子があり、このタンパク質は樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，ＤＣｓ）、マクロファージ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、Ｂ細胞（Ｂ ｃｅｌｌｓ）のような抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ，ＡＰＣｓ）に限って発現する。ＭＨＣ－ＩＩ型が提示する抗原はＣＤ４^＋Ｔ細胞と反応する。抗原提示細胞は、ＭＨＣ－ＩもＭＨＣ－ＩＩも発現させるが、抗原提示細胞でない細胞はＭＨＣ－Ｉのみを発現させる。

【0007】

適応免疫反応（Ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）において抗原はＢ細胞上の受容体分子（このミューノーグロブリン）及びＴ細胞上のＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＣＲ）によって認識される。Ｂ細胞とは違い、Ｔ細胞は、抗原が必ずＭＨＣに結合したペプチド形態、すなわち、ペプチド－ＭＨＣ複合体に提示されてこそ、抗原エピトープペプチドを認識することができる。このようなＴ細胞の抗原認識をＭＨＣ限定の抗原認識（ＭＨＣ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ＭＨＣ限定（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ））という。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ペプチド－ＭＨＣ－ＩＩ複合体を提示する抗原提示細胞と反応し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体を提示する細胞と反応する。

【0008】

腫瘍及びウイルス－感染細胞は、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ＣＴＬｓ）に対して細胞表面ＭＨＣ－Ｉ分子を用いてＴ細胞抗原ペプチド（８～１１個のアミノ酸残基）を提示できるが、これを、ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体という。ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞は、ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体に特異的なＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＣＲ）を用いて認識し結合させて効果器物質を分泌し、標的細胞を死滅させる。ウイルスに感染した細胞や腫瘍細胞は、抗原タンパク質が細胞内で翻訳されて存在する。この抗原は細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を経るが、すなわち、細胞質内のプロテアソーム（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）において小さなペプチド形態で分解された後、小胞体（ＥＲ）表面に存在するＴＡＰ（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）タンパク質によって、選択的に小胞体に入る。一方、ＭＨＣ－Ｉのα鎖ｍＲＮＡは、小胞体のリボソームで翻訳と同時に小胞体に入り、小胞体の膜に結合する。膜に結合したα鎖タンパク質は、小胞体においてβ－２－マイクログロブリン（Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）タンパク質と結合し、そこでペプチドエピトープと結合可能になる。その後、ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体は、ゴルジ体を通じて細胞膜に輸送されて細胞表面に複合体を提示し、それらの複合体はＣＤ８^＋Ｔ細胞のＴＣＲによって認識される。その結果、抗原を持つ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞によって殺される細胞媒介性免疫反応が誘導される。

【0009】

ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）分子は、炎症などの過程中に、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）、内皮細胞のような抗原提示細胞上で発現する。抗原提示細胞表面のＭＨＣ－ＩＩ分子は、典型的に、細胞内小胞内でＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する抗原由来ペプチドを提示する。細胞外部の組織や血液に存在する抗原は、ＭＨＣ－ＩＩ分子を発現させている細胞によって処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）され、ＣＤ４^＋ヘルパー（ＣＤ４^＋ｈｅｌｐｅｒ）Ｔ細胞によって認知される。抗原は、食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）及び細胞内取込み（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって植菌細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）に入い、取り込まれたタンパク質は、細胞内のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）で小さいペプチド形態で分解される。一方、ＭＨＣ－ＩＩのα鎖及びβ鎖タンパク質は発現しながらいずれも小胞体の膜に結合した状態で複合体を形成する。小胞体においてさらに、それらの複合体に不変鎖（ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ；Ｉｉ ｃｈａｉｎ）タンパク質がペプチド結合部位に結合し、その結果、小胞体においてＭＨＣ－ＩＩ分子は、ＭＨＣ－Ｉ分子に結合するペプチドエピトープとは結合しなくなる。ペプチドが結合していないＭＨＣ－ＩＩ分子は、細胞膜に輸送される中に、ペプチド断片が取り込まれているエンドサイトーシス小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ）と融合し、そこで不変鎖が解離し、抗原由来ペプチドと結合する。これは、ペプチド－ＭＨＣ－ＩＩ複合体は細胞表面に輸送され、ＣＤ４^＋Ｔ細胞に抗原を提示し、その結果、抗体生産のような体液性免疫反応が誘導される。このように作られた抗体は、結局、細胞外に存在する抗原と結合して抗原を除去する。

【0010】

抗原提示細胞のうち、樹状細胞は、未成熟状態のときに、食細胞作用及び受容体媒介細胞内取込み（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって抗原を捕獲して抗原を処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）後にＭＨＣ分子に抗原由来ペプチドを提示し、Ｔ細胞の認知を誘導する。抗原処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）過程中に樹状細胞は益々成熟し、周辺リンパ節に移動して無感作（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞に抗原を提示する。Ｔ細胞の活性には、樹状細胞の抗原提示の他、成熟した樹状細胞表面に発現する補助刺激因子（Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ；ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０など）と細胞癒着分子及び炎症促進サイトカインの刺激も必要である。樹状細胞は、このような信号によってＣＤ４^＋Ｔ細胞がＴヘルパー１（Ｔｈ１）細胞に分化するように誘導し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞も活性化させる。しかし、抗原提示細胞の補助刺激因子及び炎症促進サイトカイン刺激がないか、免疫抑制サイトカイン刺激を受けると、ＣＤ４^＋Ｔ細胞はＴｈ２細胞又は調節Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ，Ｔｒｅｇ）に分化する。

【0011】

また、樹状細胞は、元はＭＨＣ－ＩＩと結合してＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化させる外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）タンパク質由来のペプチドを細胞表面に提示するが、ＭＨＣ－Ｉによっても提示できる能力を有しており、これを交差提示（ｃｒｏｓｓ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）という。したがって、ＣＤ８^＋Ｔ細胞も交差刺激（ｃｒｏｓｓ ｐｒｉｍｉｎｇ）させることができる特徴を有する。したがって、樹状細胞は、現在まで知られた最も強力な抗原提示細胞であるといえる。

【0012】

近年、癌を治療するための免疫抗癌療法（Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）の一つとして、癌抗原（Ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ）を患者に投与して細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ＣＤ８^＋Ｔ ｃｅｌｌ，ＣＴＬ）を活性化させることによって癌細胞を除去する試みがあるが、これを治療用抗癌ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ）という。治療用抗癌ワクチンは、免疫原性の低くなった腫瘍に免疫原性を付与したり、腫瘍特異的なＴ細胞の活性を誘導したりするための手段である。一般に、抗癌免疫反応（Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が起きるには、免疫システムによって癌細胞を認知する過程が必要である。癌細胞表面の抗原提示分子（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ，ＭＨＣ－Ｉ）に癌抗原由来のペプチドが提示されていると、この複合体に特異的に結合できるＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＣＲ）を持つ細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ＣＴＬｓ）が癌細胞を認知し、癌細胞の死滅を誘導する。

【0013】

いままで癌ワクチンの開発は一般に、該当の癌細胞を直接使用する方法を用いたが、例えば細胞に基づく癌ワクチン開発初期段階には、免疫補助剤と混合された不活性化させた癌細胞全体又は癌細胞溶解物質が使用された。その後、改良された癌ワクチンが既存のワクチンに取って代わったが、それは、サイトカインと共同刺激分子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を暗号化する遺伝子を応用する。最近の癌ワクチンは抗原の種類及び抗原伝達方法によってＤＮＡワクチン、ペプチドワクチン、腫瘍細胞ワクチン、バクテリア或いはウイルス由来ベクターを利用するワクチン及び樹状細胞ワクチンに分類できる。

【0014】

ＤＮＡワクチンは、初期には所望の程度の免疫反応が誘導されるが、ワクチンの効力が経時減少する。これは、投与されたワクチンに対する抗体が次第に親和性を有し、結局には免疫反応が誘導され、投与されたＤＮＡワクチンが破壊されるわけである。

【0015】

樹状細胞に抗原を提示する方法として、一般に、ペプチド、タンパク質及び自己由来／同種異系の癌細胞と共に培養する方法が用いられている。短い合成ペプチド（８～１５個アミノ酸残基）は樹状細胞表面のＭＨＣ分子に直接結合するのに対し、長い合成ペプチド（２８～３５個アミノ酸残基）、タンパク質及び癌細胞は、ＭＨＣ分子に結合する前にペプチドで処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）される過程が必要である。短い合成ペプチドは、腫瘍関連抗原（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＡＡ）に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを臨床試験に使用しているが、患者のＨＬＡハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）を知らなければならなく、特定ＨＬＡハプロタイプに結合し得るペプチドでなる必要がある。長い合成ペプチドは、樹状細胞内で抗原処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）過程中に交差提示され得るので、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の他にＣＤ８^＋Ｔ細胞反応も誘導でき、より長期的にペプチドを提示できる長所がある。

【0016】

全体腫瘍或いは腫瘍細胞株の溶解物を癌ワクチンとして使用することも、様々な癌腫で用いられている。この方法の主要利点は、（１）互いに異なるハプロタイプであるＭＨＣ分子に様々なエピトープが提示され得るので、様々な抗原に対するＣＤ４^＋Ｔ細胞とＣＤ８^＋Ｔ細胞反応が誘導でき、（２）抗原処理過程によって持続して抗原由来エピトープを提示できるという点である。ただし、自己抗原を提示することもあり、患者から分離した癌細胞が必要であるという短所がある。

【0017】

バクテリア又はウイルスのベクターも抗原を搭載する癌ワクチンとして用いられている。このようなベクターを用いてＴＡＡを暗号化する遺伝子を挿入するか、安全性を高めるために毒性と複製関連タンパク質を暗号化する遺伝子を除去するか、或いは樹状細胞成熟を誘導するようにすることができる。しかし、患者遺伝子を組み込ませなければならず、ベクターに対する免疫反応が誘導されることもあるという短所がある。

【0018】

癌細胞が提示できる癌抗原由来ペプチドは、大きく、腫瘍関連抗原（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＡＡ）と腫瘍特異的抗原（Ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＳＡ）とに分類できる。ＴＡＡは、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＣＤ１９、メソテリンなどのように腫瘍細胞に過発現している抗原であるが、正常細胞や組織においてもある程度発現している抗原であり、また、ＣＥＡのような腫瘍胎児抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１のような癌／精巣抗原（ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ）も含まれる。ＴＳＡは、腫瘍細胞の遺伝的突然変異による突然変異タンパク質或いは腫瘍誘発ウイルス由来のタンパク質（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）である点から、腫瘍に非常に特異的なタンパク質である（ＫＲＡＳ変異（ｍｕｔａｎｔ）、ＨＰＶ１６Ｅ６／７など）。したがって、正常細胞には見られないが、患者によっては、癌細胞によって異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が高い特性がある。このような特性から、新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）とされる。樹状細胞ワクチンは一般に、このような抗原を標的にしてＭＨＣ分子に抗原を提示させようと試みている。ＴＡＡ特異的Ｔ細胞を用いた抗癌免疫治療は、多くの患者に共通する抗原である点で、幅広く適用できる標的であるが、ＴＡＡは自己抗原（ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎ）であるため、それに特異的な（ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ）ＣＤ４^＋或いはＣＤ８^＋Ｔ細胞レパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）は、中央免疫寛容（ｃｅｎｔｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）によって選択的に除去されている状態である。一方、新抗原特異的なＴ細胞は、ＴＡＡに比べて高い腫瘍特異性と高い免疫原性（すなわち、高い親和度を有するＴ細胞受容体を誘導）を有し、免疫寛容が欠如している。したがって、樹状細胞にＴＡＡと新抗原とを組み合わせて使用すれば、より効果的なＴ細胞反応が誘導できると予想される。最近では、これを用いた抗癌ワクチン開発がなされている。

【0019】

しかしながら、現在治療用抗癌ワクチン技術の限界は、患者個人別癌特異新抗原の同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と究明（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）段階の困難及び低い拡張性にある。すなわち、同種の腫瘍であっても患者個別の遺伝型及びタンパク質突然変異が非常に異なり、また、同一患者の腫瘍であってもそれを構成する癌細胞はそれぞれ突然変異が異なる（ｔｕｍｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）ため、それらのそれぞれの癌特異新抗原を同定し究明するには長時間、高費用がかかり、患者が持つ新抗原に合わせた作製（ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）をしなければならず、多数の患者に適用し難いという限界がある。

【0020】

ウイルスに感染した細胞を直接除去する効果器細胞はＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞であることから、ウイルス感染時にＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化は非常に重要である。一般に、ウイルス抗原タンパク質はリンパ節からＤＣのような抗原提示細胞に伝達され、処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）過程でＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープペプチドに分解された後、ＭＨＣ－Ｉに交差提示（ｃｒｏｓｓ－ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）によって提示されてよい。樹状細胞が提示しているウイルス由来ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体特異的な無感作ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、効果器Ｔ細胞として活性化される。ウイルスに感染した細胞のウイルス由来ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体は、効果器ＣＤ８^＋Ｔ細胞ＴＣＲによって認知され、その結果として分泌された効果器物質であるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、グランザイム－Ｂ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）及びパーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）によって感染した細胞は直ちに除去される。しかし、ウイルス抗原の刺激が持続するヒト免疫欠乏ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ；ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ；ＨＣＶ）のような慢性ウイルス感染（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、ウイルス特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の効果器機能が減少しつつ免疫関門受容体（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現が増加する疲弊したT細胞（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ）表現型を示す。また、疲弊したウイルス特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、弱化した増殖能によって細胞死滅してしまう結果を招く。

【0021】

しかしながら、ウイルス種類によって、慢性ウイルス感染であるにも拘わらず、疲弊したＴ細胞の表現型を示さないサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ；ＣＭＶ）と単純ヘルペスウイルス－１（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－１；ＨＳＶ－１）も存在する。かかるウイルス特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ウイルスに感染した細胞が除去された後にも欠如しなく、効果器記憶Ｔ細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）として血液中に非常に長期間に高い割合で存在し得る。このような特性を“記憶膨脹（ｍｅｍｏｒｙ ｉｎｆｌａｔｉｏｎ）”という（Ｏ’Ｈａｒａ，Ｗｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）。記憶膨張Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ２７－ＣＤ２８－である効果器－記憶表現型を有し、ＣＣＲ７マーカーの欠如とＣＸＣＲ３マーカーの発現のため、リンパ節にホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）せずに組織に留まる特性を有する。また、最近の報告によれば、癌患者の血液と腫瘍組織内にサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス及びインフルエンザＡウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ；ＩＡＶ）に特異的なＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－ＣＤ８^＋Ｔ細胞が存在していたし、ウイルス由来ペプチドの刺激後にＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αなどのようなサイトカインの発現があり、機能的に活性化され得ることを示した（Ｒｏｓａｔｏ，Ｗｉｊｅｙｅｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１９）。

【0022】

前述したウイルスのうち、ヒトサイトメガロウイルス（ｈｕｍａｎ ＣＭＶ）は、二本鎖ＤＮＡゲノムを有するべータ－ヘルペスウイルスで、一般的に腫瘍を誘発するウイルスではない。ＣＭＶは全世界の６０～８０％の人が感染しており、一生持続して感染することもある。健康な感染者には特別な症状がないが、免疫力の弱い（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）人には深刻な疾患を誘発することがある。ＣＭＶ特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞による免疫反応は、ＣＭＶ由来のｐｐ６５（６５ｋＤａ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）基質タンパク質及びＩＥ－１（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）タンパク質に集中して発生する（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４）。特に、健康なＣＭＶ感染者の血液内にはＭＨＣ－Ｉ分子の中でもＨＬＡ－Ａ＊０２：０１下位遺伝型とｐｐ６５タンパク質由来ペプチド配列４９５－５０３番の複合体を特異的に認知するＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度が、全体ＣＤ８^＋Ｔ細胞中の０．５～１１％も占めると報告されている（Ｓｃｈｍｉｔｔｎａｅｇｅｌ，Ｌｅｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．２０１５）。また、ＣＭＶ感染者が高齢であるほどＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度が非常に増加していることが知られている（Ｓｔａｒａｓ，Ｄｏｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．２００６）。

【0023】

ＭＨＣ－Ｉ分子は、アルファ鎖１、２、３及びべータ－２－マイクログロブリンからなり、アルファ鎖の種類によるＨＬＡ－Ａ ２個、ＨＬＡ－Ｂ ２個、ＨＬＡ－Ｃ ２個と、合計６個の異なる抗原提示分子が生成される。ＨＬＡ－Ａタンパク質のうちＨＬＡ－Ａ＊０２類型は、全世界人口の約２５～３０％程度であり、中でもＨＬＡ－Ａ＊０２：０１下位類型が３０～９０％も占め、最も一般的なＭＨＣ－Ｉ分子である（Ｌａｉ，Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．２０１７）。

【0024】

上に言及したように、一般に、ウイルスに感染した細胞を除去するためには、適応免疫反応を用いたウイルス由来ペプチドに特異的なＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞の活性化が必要である。この過程は、癌が発生した時に、癌由来ペプチド（ＴＡＡ或いはＴＳＡ）がＡＰＣのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子に提示され、ペプチド－ＭＨＣ複合体に特異的なＣＤ８^＋Ｔ及びＣＤ４^＋Ｔ細胞が活性化され、癌細胞死滅を誘導する適応免疫反応と非常に似ている。したがって、ウイルス特異的なＴ細胞を含め、非自己（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ）抗原に特異的なＴ細胞及びＴＳＡ特異的なＴ細胞を用いて癌治療に使用しようとする様々な研究があった。そのために、癌細胞を直接に死滅させるには細胞傷害性Ｔ細胞の活性化が必須であり、そのためにはペプチドエピトープをＭＨＣ－Ｉに提示させる過程が必要である。

【0025】

膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）の治療にＣＭＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を利用する試みがあるが、膠芽細胞腫でＣＭＶ抗原が発現するという諸報告があるためである。膠芽細胞腫患者の血液から分離したＰＢＭＣに存在するＣＭＶ特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ＣＭＶｐＲＮＡをトランスフェクションさせた自己樹状細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）をＡＰＣとして用いて試験管内で刺激させ、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を効果的に増幅させたし、自己膠芽細胞腫瘍細胞を試験管内で死滅させることが可能であった（Ｎａｉｒ，Ｄｅ Ｌｅｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４）。これは、一般のＭＨＣ－Ｉペプチド提示経路にしたがう提示方法であるといえるが、ＲＮＡによって細胞質に抗原が発現するように誘導するわけである。しかし、全抗原をコードするＲＮＡを用いて抗原の発現を誘導させる過程が必要であるため、患者の樹状細胞の分離と成熟過程の困難、ＲＮＡのトランスフェクションの低い効率性という欠点がある。

【0026】

樹状細胞は、交差提示によってＭＨＣ－Ｉ分子に外部タンパク質由来のＴ細胞抗原エピトープの提示が活発になされ得る。このような場合、樹状細胞に特異的に発現している受容体であるＣＤ４０、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＭＲ（Ｍａｎｎｏｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びＤＥＣ２０５を標的する抗体に伝達しようとするペプチドを様々な形態で融合させたタンパク質を構築し、ペプチド特異的ＣＤ８^＋又はＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化を誘導する試みがなされている。ＣＤ４０を標的する抗体にＨＰＶ１６Ｅ６及びＥ７タンパク質配列を融合させたタンパク質を用いてＴ細胞の活性化誘導及びＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７を発現させるマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を抑制する事例が報告されている（Ｙｉｎ，Ｄｕｌｕｃ ｅｔ ａｌ．２０１６）。また、抗ＤＮＡ ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）にオボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，ＯＶＡ）タンパク質由来マウスＭＨＣ－ＩであるＨ－２ＫｂのＴ細胞抗原エピトープ２５７－２６４番配列（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を含むタンパク質切片である２５０－２６４番配列を融合させて樹状細胞に交差提示させた事例もある（Ｐｈａｍ，Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．２０１２）。前記２つの方法は、樹状細胞によってペプチド特異的Ｔ細胞が活性化される過程が必要なため、免疫過程（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）がまずなされるべきであり、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に投与してこそ効果が得られる短所がある。

【0027】

癌細胞特異的受容体を標的して内在化可能な抗体のＦｃドメインＣ末端部分とシステイン残基を含むウイルス由来Ｔ細胞抗原エピトープペプチドを化学的反応によってチオエーテルリンカーで連結させた抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を用いてＴ細胞抗原エピトープを癌細胞のＭＨＣ－Ｉに伝達しようとする事例がある（Ｓｅｆｒｉｎ，Ｈｉｌｌｒｉｎｇｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．２０１９）。癌細胞表面受容体に結合して内在化された後にエンドソームに位置した抗体－ペプチド複合体は、エンドソームの還元性条件によってジスルフィド結合が還元され、ペプチドがエンドソーム内に解離して、エンドソーム内にリサイクルされていたＭＨＣ－Ｉ分子に結合しながら細胞表面にペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体が提示されるメカニズムを利用する。文献において、抗体－ＥＢＶ ＬＭＰ２４２６－４３４番ペプチド（ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ）複合体は癌細胞に処理された後、低い濃度によってもＥＢＶ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞存在下に癌細胞死滅を誘導できたし、マウス生体内移植した腫瘍の成長阻害も可能だった。また、ＥＢＶ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞のＰＤ－１発現とマウス生体内移植された腫瘍のＰＤ－Ｌ１発現による軽微な腫瘍成長阻害効果は抗ＰＤ－１抗体の併用投与によって克服できることを示した。しかし、前記方法は、エンドソームで解離したペプチドとＭＨＣ－Ｉが結合して細胞表面に提示されるものである。すなわち、前記方法は、Ｔ細胞抗原エピトープであるペプチドが細胞質には到達しない。したがって、一般のＭＨＣ－Ｉ提示経路に従わず、エピトープペプチド内にジスルフィド結合が可能なようにシステイン残基が存在しなければならないため、使用するエピトープペプチドの種類が非常に制限的であるという短所がある。また、前記方法は、細胞質に到達せず、細胞質内におけるプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）又はユビキチンプロテアソーム（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）による細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を経ることができないため、抗体に連結するペプチドエピトープは、ＭＨＣ－Ｉに直接結合するペプチド、すなわち、アミノ酸残基８～１１個で構成されたペプチドに限定される。これよりも長い長さのペプチド（１２個以上のアミノ酸残基を含むペプチド）は、エンドソームでＭＨＣ－Ｉに展示できない短所がある。また、この方法ではＴ細胞抗原エピトープペプチドは切断不可能な（ｎｏｎ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーを使用すればＭＨＣ－Ｉに提示されない。

【0028】

他の接近方式には、ＡＴＰＰ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）技術がある。この技術は、腫瘍表面抗原標的抗体に、ＣＭＶウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープペプチドであるＣＭＶｐ４９５－５０３番（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドを細胞内部エンドソーム環境（低いｐＨ、還元環境（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ））によって切断されるリンカー（ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）で連結して、腫瘍細胞表面にＴ細胞抗原エピトープペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体を展示させた事例である（ＷＯ２０１６／１２６６１１，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｈａｖｉｎｇ ａ ｐｌｕｒａｌｉｔｙ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ）。この方式は、抗体とペプチドを別個に準備し、化学的反応によって切断可能（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーで連結する。この接近方式は、抗体が癌細胞表面受容体に結合して内在化した後にエンドソームに位置した抗体－ペプチド複合体は、エンドソームの弱酸性又は還元性条件によってジスルフィド結合が還元され、ペプチドがエンドソーム内に解離してエンドソーム内にリサイクルされていたＭＨＣ－Ｉ分子に結合しながら細胞表面にペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体が提示されるメカニズムを利用する。しかし、前記方法は、細胞質に到達せず、細胞質内におけるユビキチンプロテアソームによる細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を経ることができないため、抗体に連結するペプチドエピトープは、ＭＨＣ－Ｉに直接結合するペプチド、すなわちアミノ酸残基８～１１個で構成されたペプチドに限定される。これよりも長い長さのペプチド（１２個以上のアミノ酸残基を含むペプチド）は、エンドソームにおいてＭＨＣ－Ｉに展示ができない短所がある。また、この方法ではＴ細胞抗原エピトープペプチドは切断不可能な（ｎｏｎ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ）リンカーを使用すればＭＨＣ－Ｉに提示されない。

【0029】

他の接近方式には、ＡＰＥＣｓ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｃｏｎｊｕａｔｅｓ）技術がある。この技術は、腫瘍表面抗原標的抗体にＣＭＶウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープであるＣＭＶｐ４９５－５０３番（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドを、腫瘍細胞表面に存在するか腫瘍細胞が発現させるタンパク質加水分解酵素によって切断可能なリンカー（ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）で連結して、腫瘍細胞表面にＴ細胞抗原エピトープ－ＭＨＣ－Ｉ複合体を展示させる事例である（ＷＯ２０１２／１２３７５５，Ｒｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）。この方式は、抗体が細胞内部に内在化することはなく、癌細胞表面に腫瘍表面抗原に結合した状態でタンパク質加水分解酵素（例えは、ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＭＭＰ）がリンカーを切ると、ペプチドが細胞表面のＭＨＣ－Ｉと結合することを利用した。しかし、前記方法は、細胞質に到達せず、細胞質内におけるユビキチンプロテアソームによる細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を経ることができないため、抗体に連結するペプチドエピトープは、ＭＨＣ－Ｉに直接結合するペプチド、すなわちアミノ酸残基８～１１個で構成されたペプチドに限定される。これよりも長い長さのペプチド（１２個以上のアミノ酸残基を含むペプチド）は、エンドソームでＭＨＣ－Ｉに展示されない短所がある。また、この方法では、Ｔ細胞抗原エピトープペプチドは、切断不可能なリンカーを使用すればＭＨＣ－Ｉに提示されない。また、様々なプロテアーゼを対象に加水分解を誘導することにより、プロテアーゼがエピトープペプチド自体を加水分解させ、Ｔ細胞抗原エピトープペプチドの損失を招くことがある。

【0030】

他の接近方式には、腫瘍表面抗原特異的な抗体（ＩｇＧ及びｓｃＦｖ形態）にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体をペプチドリンカーで連結して発現させたｐＭＨＣ－Ｉ－抗体フォーマットを構築した事例である（Ｓｃｈｍｉｔｔｎａｅｇｅｌ，Ｌｅｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．２０１５）。腫瘍微細環境では免疫逃避（ｉｍｍｕｎｅ ｅｓｃａｐｅ）機序によってＭＨＣ－Ｉ損失がおき、これを克服しようとする試みである。ｐＭＨＣ－Ｉ－抗体は腫瘍細胞表面に結合しながらペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体が存在するので、ＭＨＣ－Ｉ分子の損失が発生してもウイルス特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の認知が誘導できる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験においてウイルス特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の存在下に腫瘍細胞の死滅を誘導でき、マウス生体内で腫瘍成長抑制効果を示した。しかし、癌細胞がない時に、非特異的なＴＣＲ交差結合（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ）によるＴ細胞活性化を防止するために、異種二重体Ｆｃ（Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）技術を導入し、単一－ＭＨＣ－Ｉ－ＩｇＧを構築しなければならず、これを発現させるためには、ｐＭＨＣ－Ｉが結合した重鎖、ｐＭＨＣ－Ｉがない重鎖、及び軽鎖の３つの組換えプラスミドが必要であるという短所がある。一般の抗体に比べて発現量も大きく減少し、精製後にもオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）が多量存在することから、治療用抗体としての開発には不向きであった。また、前記方法は、Ｔ細胞抗原エピトープであるペプチドが細胞質には到達しない方式である。

【0031】

上述したように、既存の抗癌ワクチンは主に、樹状細胞表面のＭＨＣ分子に抗原由来ペプチドエピトープを提示してＴ細胞免疫反応を誘導する方向へと発展してきており、樹状細胞の抗原提示手段には、ＤＮＡ或いはＲＮＡワクチン、ペプチドワクチン、腫瘍細胞ワクチン及びウイルス由来ベクターを利用するワクチンなどの、様々な方法を用いてきた。しかし、抗原由来のＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）によって癌細胞表面のＭＨＣ－Ｉ分子に特異的に伝達した方法は現在まで報告されたことがない。

【0032】

また、既存の抗癌ワクチン技術は、患者によって非常に特異的な新抗原の同定及び究明に長時間、高費用がかかり、患者に合わせた作製（ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ）が必要なため、拡張性が低い限界がある。

【発明の概要】

【0033】

前記限界を克服するために、本発明は、患者別特異的新抗原同定及び究明段階を要求しない上に、患者に汎用し得るように、ウイルス由来抗原を標的細胞（ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）特異的に細胞質に伝達し、標的細胞表面の抗原提示分子ＭＨＣ－ＩにＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープが提示され得るようにする融合抗体及びこれを含む癌、自己免疫疾患又は感染性疾患の予防及び／又は治療用組成物を提供する。

【0034】

前記目的を達成するために、本発明は、抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを標的細胞の細胞質に伝達するために、細胞又は組織特異的細胞質浸透抗体（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｓｏｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）にＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが融合した融合抗体を提供する。

【0035】

本発明において、前記融合抗体は、細胞又は組織特異的細胞質浸透能を有する細胞質浸透抗体に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが遺伝的に連結（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ）されたものであり、標的細胞の細胞質にＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを伝達して、標的細胞表面の抗原提示分子ＭＨＣ－ＩにＴ細胞抗原エピトープを提示できることを特徴とするが、これに限定されない。

【0036】

特に、本発明に係る融合抗体は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを標的細胞の細胞質に伝達して、細胞質に伝達されたＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）によって処理され、究極的にＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを標的細胞表面の抗原提示分子ＭＨＣ－Ｉに提示可能にする。

【0037】

すなわち、本発明に係る融合抗体は、イムノグロブリン形態、好ましくは完全なイムノグロブリン形態で、腫瘍組織などの標的細胞表面に過発現する膜タンパク質受容体などに結合して内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後にエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）能力によって細胞質に位置し、細胞質内でタンパク質分解システムによって生成されたウイルス特異的エピトープが小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）に入ってＭＨＣ－Ｉと結合し、ゴルジ体（Ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を通じて分泌され、標的細胞表面において、Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチド、好ましくはウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドをＭＨＣ－Ｉに提示可能にする。

【0038】

本発明において、“ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ”と“Ｔ細胞抗原エピトープ”は実質的に同じ意味で使われ、ＭＨＣ－Ｉと結合して標的細胞の表面に展示されるペプチドエピトープを意味する。

【0039】

本発明に係る融合抗体は、例えば、細胞質浸透抗体にＣＭＶ ｐｐ６５などのウイルス抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが融合した形態であって、これを患者に投与すれば、標的細胞の細胞質に浸透し、細胞内抗原処理過程によって生成されたＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが細胞内小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）に入ってＨＬＡ－Ａ＊０２：０１と結合してＣＭＶ ｐｐ６５ペプチド／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体（ｐＭＨＣ）が形成され、このｐＭＨＣがゴルジ体を通じて分泌されながら標的細胞表面に提示され、これによって究極的に患者の体内に循環するＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＭＶ ｐｐ６５－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ（ＣＴＬ））が標的細胞をウイルス感染細胞として認識して殺傷することにより、結果として、標的細胞に起因した癌や自己免疫疾患、感染性疾患などを治療できる効果を奏する。

【0040】

本発明において、前記標的細胞は、癌細胞、ウイルス又は病原性微生物感染細胞などの人体内で除去されるべき正常でない細胞などの異常細胞（ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌ）の他、肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌ）、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）、粘膜細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、筋肉細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ）、皮膚細胞（ｓｋｉｎ ｃｅｌｌｓ）、幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）などの細胞も含む意味で使われる。

【0041】

また、本発明において、抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドはヒトに感染を起こし得るウイルス抗原由来のものが好ましく、ヒトに感染を起こしたが免疫力によって自然治癒されたものの、依然として人体内にはこのような抗原に対するＣＴＬ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）が形成されているウイルス抗原のＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドであることがより好ましい。

【0042】

このような抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）、又はエプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）由来であるＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが好ましい。

【0043】

前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）由来Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチド、例えばＣＭＶ ｐｐ６５であってよい。前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞ＣＭＶ ｐｐ６５抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、配列番号１３の配列を含む、或いは配列番号１３のＮ末端及び／又はＣ末端に１個～１６個のアミノ酸をさらに含むペプチドであってよい。配列番号１３のＮ末端及び／又はＣ末端に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個又は１６個のアミノ酸をさらに含むことができる。さらに含まれるアミノ酸の数は、Ｎ末端又はＣ末端の一側に含まれるか、Ｎ末端及びＣ末端の両方に含まれてよい。

【0044】

具体的に、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、配列番号１３～配列番号３６のうちいずれか一つのＣＭＶ、ＨＰＶ又はＥＢＶ特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドであることがより好ましく、最も好ましくは、配列番号２６の配列を有するＣＭＶ特異的エピトープであってよいが、これに限定されない。

【0045】

なお、本発明において、抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、腫瘍関連抗原（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＡＡ）と腫瘍特異的抗原（Ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＳＡ）由来であってよい。

【0046】

本発明の一実施例において、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、ＭＨＣ－Ｉに直接結合するＴ細胞抗原エピトープ（８～１１個アミノ酸残基で構成）、又はこれよりも長いペプチド（１２個以上のアミノ酸残基を含むペプチド）であってよく、例えば、配列番号１３～配列番号３６のうちいずれか一つの配列を有するペプチドであってよいが、これに限定されない。

【0047】

本発明に係る融合抗体は、前記Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが細胞質浸透抗体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の内部、すなわち、重鎖又は軽鎖の中間部分に挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ又はｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）されるか、Ｎ末端又はＣ末端に融合したことを特徴とするが、これに限定されない。

【0048】

また、本発明に係る前記Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、細胞質浸透抗体の内部、Ｎ末端又はＣ末端に１個以上、好ましくは１個～２０個、より好ましくは１個～６個、さらに好ましくは１個～４個が挿入又は結合、好ましくは融合したことを特徴とするが、これに限定されない。

【0049】

前記細胞質浸透抗体の内部、Ｎ末端又はＣ末端に１個以上挿入又は結合したＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、互いに同一のものであっても異なるものであってもよい。同一の２個以上のＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが細胞質浸透抗体の内部、Ｎ末端又はＣ末端に１個以上挿入又は結合する場合に、標的細胞表面の抗原提示分子ＭＨＣ－ＩにＴ細胞抗原エピトープを提示する効率を高めることができる。特に、異なった２個以上のＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが細胞質浸透抗体の内部、Ｎ末端又はＣ末端に１個以上挿入又は結合する場合に、多価ワクチン（ｍｕｌａｔｉｖａｌｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ）と類似に、広い治療スペクトラム（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を有し得るという長所がある。

【0050】

これによって、一側面において本発明に係る融合抗体は、前記Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが細胞質浸透抗体のヒンジ領域、重鎖可変領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン、軽鎖可変領域又は軽鎖不変領域ドメイン（ＣＬ）の中間部分に挿入された形態であってよいが、本発明に係る融合抗体において使用される前記Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、その大きさが大きくないので、細胞質浸透抗体の固有特性には別に影響を及ぼさない。

【0051】

さらに他の側面において、本発明に係る融合抗体は、前記Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが細胞質浸透抗体の重鎖又は軽鎖Ｃ末端に融合した形態であってよく（Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｆｕｓｅｄ ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）、好ましくは、ウイルス抗原由来エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体（ｖｉｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｆｕｓｅｄ ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）であってよいが、これに限定されない。

【0052】

また、本発明において、前記細胞又は組織特異的細胞質浸透抗体は、細胞内に内在化が可能なものであればいずれも使用可能であり、細胞内に内在化した後にエンドソームを脱出して細胞質内に位置し得るものがより好ましいが、これに限定されない。

【0053】

本発明において“ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ”又は“Ｔ細胞抗原エピトープ”は、８～１１個のアミノ酸残基で構成され、ＭＨＣ－Ｉに直接結合してペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体をなすペプチドであって、このペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体をＣＤ８^＋Ｔ－細胞がＴ細胞受容体を用いて認識可能にするペプチドを意味する。本発明において“ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを含むペプチド”又は“Ｔ細胞抗原エピトープを含むペプチド”は前記Ｔ細胞抗原エピトープを含み、そのＮ末端又はＣ末端に追加にアミノ酸残基を含むペプチドを意味し、２０個以上のアミノ酸残基を含む。

【0054】

本発明に係る融合抗体において、前記Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、細胞質浸透抗体の内部又は末端に、１個、２個、又は３個以上、より好ましくは１個が挿入又は融合したことを特徴とするが、これに限定されず、より好ましくは重鎖Ｃ末端に１個又は２個、より好ましくは１個が融合しているものが使用されてよい。

【0055】

本発明に係る融合抗体において、細胞質浸透抗体とＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、非切断リンカー、又はエンドソーム内で切断される特性を有するリンカーを介して抗体内部に挿入された又は末端に融合したことを特徴とし、前記リンカーはＧ４Ｓ又はＧＦＬＧを含むことが好ましいが、これに限定されない。

【0056】

また、本発明に係る融合抗体は、標的細胞特異的抗原を標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）する物質をさらに含むことができる。前記標的細胞特異的抗原を標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）する物質は、融合抗体と遺伝的融合（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ）、リンカー媒介結合、共有結合などの形態で結合してよいが、これに限定されない。

【0057】

本発明において、“標的細胞特異的抗原を標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）する物質”は、標的細胞表面に特異的に発現する抗原に特異的に結合することによって、本発明に係る融合抗体を標的細胞に特異的に選択的に内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）が誘導できる機能を有する物質を意味する。

【0058】

前記標的細胞特異的抗原を標的化する物質は、本発明に係る融合抗体を目標にする標的細胞に特異的に伝達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）する機能を担う物質であって、標的細胞特異的抗原に特異的に結合し得るリガンド（ｌｉｇａｎｄ）、オリゴペプチド（ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ）、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）又はその断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）又はアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）などであってよいが、これに限定されない。

【0059】

前記標的細胞特異的抗原は、標的細胞、例えば、腫瘍細胞や病原性ウイルス又は微生物から特異的に発現するか、過剰発現する受容体などであれば特に制限されず、好ましくは、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｈｅｒ１）、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、インテグリンαｖβ３、インテグリンαｖβ５、インテグリンαｖβ６、ＩＧＦＲ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）、メソテリン、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＭＵＣ１（ｍｕｃｉｎ １）、ＣＤ２０（Ｂ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ２０）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ１）、ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）、ＣＴＬＡ４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ＰＳＭＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、Ａｎｇ２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２）、ＰＤＧＦ－Ｒ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＶＥＧＦ－Ｒ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ニューロピリン、ｃ－Ｍｅｔ、病原性ウイルス特異的抗原、病原性微生物特異的抗原、肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）特異的抗原、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）特異的抗原、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌ）特異的抗原、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）特異的抗原、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）特異的抗原、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）特異的抗原、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）特異的抗原、粘膜細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）特異的抗原、筋肉細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ）特異的抗原、皮膚細胞（ｓｋｉｎ ｃｅｌｌｓ）特異的抗原、又は幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）特異的抗原からなる群から選ばれるいずれか一つであってよいが、これに限定されない。

【0060】

一実施例において、本発明では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に細胞質浸透能が与えられたｉｎＣＴ９９細胞質浸透抗体に基づいて重鎖定常領域のＣ末端にＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ（ＭＨＣ－Ｉに結合する８～１１個のアミノ酸残基で構成されたペプチド）とＴ細胞抗原エピトープのＮ末端側に追加にアミノ酸残基が含まれたＴ細胞抗原エピトープ及びＴ細胞抗原エピトープのＮ末端とＣ末端側に追加にアミノ酸残基が含まれたＴ細胞抗原エピトープを含むペプチドが融合した融合抗体を作製し、このような融合抗体を用いてＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープが標的細胞の表面に展示され得ることを確認した。

【0061】

一側面において、本発明は、本発明に係る融合抗体を含み、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを細胞質浸透抗体によって標的細胞の細胞質に位置させることを特徴とする、標的細胞表面にＴ細胞抗原エピトープを提示するための組成物を提供する。

【0062】

本発明に係る融合抗体を含む組成物は、ウイルス特異的エピトープを標的細胞表面の抗原提示分子ＭＨＣ－Ｉに提示可能にし、人体内に既に存在するウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）を刺激し、選択的に標的細胞を認識して除去できる。

【0063】

また、本発明は、本発明に係る融合抗体を含む癌又は感染疾患予防及び／又は治療用組成物を提供する。

【0064】

好ましい例として、前記標的細胞は癌細胞であってよく、これにより、本発明は、本発明に係る融合抗体を含む、癌の予防又は治療用組成物、すなわち汎用治療用抗癌ワクチンを提供する。

【0065】

具体的に、本発明に係る汎用治療用抗癌ワクチンは、ウイルス抗原由来ペプチドエピトープ融合抗体（ｖｉｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｆｕｓｅｄ ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）を用いて、癌細胞表面にウイルス特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを標的細胞表面の抗原提示分子ＭＨＣ－Ｉに展示させることによって、事前ウイルス露出によって癌患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を用いて癌細胞を選択的に除去できる。

【0066】

すなわち、人体に発生する癌を除去するものは免疫システムであり、中でも最も強力な癌細胞殺傷能力を示すものはＣＴＬである。それにもかかわらず腫瘍が発生することは、代表的に、癌細胞表面に癌特異新抗原を提示せず、ＣＴＬが活性化されないためであって、
これによって、本発明は、１）現抗癌ワクチン技術における最大の難題である癌特異抗原を同定／究明する過程を要求しない汎用可能な抗癌ワクチンを開発し、２）腫瘍患者の体内に既に活性化されたＣＴＬを用いて癌細胞を除去することはできないか、という疑問から始まった。そのために、平素時によく晒されるか、出生後にワクチン注射によって体内にＣＴＬが既に形成されたウイルス（ｖｉｒｕｓ）抗原に注目した。例えば、インフルエンザー（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウイルス又はサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）に感染しても、あまり問題なく健康を保ちつつ生きていくのは、人体内のウイルス特異的ＣＴＬが活性化され、感染した細胞を除去するためである。このようなＣＴＬは、人体内に記憶Ｔ細胞として存在するが、患者腫瘍組織の癌細胞がまるでウイルスに感染したように前記ウイルス特異的抗原を提示させることにより、ウイルス特異的ＣＴＬをリダイレクション（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）し、腫瘍を除去させる。すなわち癌細胞がウイルス感染細胞として認識されるようにする戦略である。

【0067】

本発明は、前記目的を達成するために、一つの例として、ＣＭＶ由来抗原を癌細胞細胞質に伝達し、細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）によってＣＭＶ由来抗原Ｔ細胞抗原エピトープペプチドがＭＨＣ－Ｉと結合することで、ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体が標的細胞、すなわち癌細胞表面に提示されるようにする。すなわち、ＣＭＶ由来抗原を汎用ワクチン、例えば、抗癌ワクチンとして開発する方法を提供する。

【0068】

本発明に係る抗癌ワクチンは、世界全体人口の６０～９０％がＣＭＶ感染を示し、感染者の相当数がＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を体内に有しているので、患者カスタマイズ型ではなく、汎用に使用されることが可能であり、波及性が大きいという長所がある。

【0069】

特に、ＣＭＶ抗原のうち、ｐｐ６５タンパク質由来ペプチド（４９５－５０３番アミノ酸残基）は、ヒト細胞のＭＨＣ－Ｉ遺伝子のうちＨＬＡ－Ａ＊０２：０１と複合体を形成して高い効率で感染細胞表面に提示されるが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＭＨＣ－Ｉ遺伝型は全世界人口の約１６％が有しており、汎用性が高い。

【0070】

具体的に、一般成人はＣＭＶに頻繁に感染し治癒されるので、常に活性化されたＣＴＬが存在する。ＣＭＶに感染した正常成人の血液にあるＣＴＬのうち、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＭＶ ｐｐ６５－ＣＴＬ）は約０．５～１１％と、非常に高い頻度で存在するが、先行文献において、人の血液からＣＭＶ ｐｐ６５－ＣＴＬを分離した後に、合成したＣＭＶ ｐｐ６５ペプチド抗原を癌細胞表面のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に結合させて抗原の提示された癌細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏ培養すると、ＣＭＶ ｐｐ６５－ＣＴＬが効率的に癌細胞死滅を誘導できることが報告されたことがある。また、ＣＭＶ ｐｐ６５抗原が発現する腫瘍をマウスに移植し、ヒト由来ＣＭＶ ｐｐ６５－ＣＴＬをマウスに注入した時（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、マウスで腫瘍成長が抑制されることが観察された。これは人体内の癌細胞にＣＭＶ ｐｐ６５抗原を提示すると、ＣＭＶ ｐｐ６５－ＣＴＬが認知して腫瘍を除去できることを示唆する。

【0071】

しかしながら、前記先行研究のＣＭＶ ｐｐ６５ペプチド研究は、治療用抗癌ワクチンへの可能性を示すだけで、人体内投与時に腫瘍特異性と細胞質侵透性が不在し、短い血液半減期などの問題から、実際臨床に適用し難い。実際患者に適用するには、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドを癌組織に分布させ、癌細胞細胞質内に効率的に伝達して、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって癌細胞表面に提示させ得る技術が必要であり、このような要求に、本発明に係る融合抗体及びこれを含む組成物が完壁に符合する。

【0072】

また、本発明は、イムノグロブリン形態、好ましくは完全なイムノグロブリン形態で腫瘍組織に過発現する細胞表面の膜タンパク質受容体に結合して内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後にエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）能力によって細胞質に位置し、細胞質内でタンパク質分解システムによって生成されたウイルス特異的エピトープが小胞体に入ってＭＨＣ－Ｉと結合し、ゴルジ体を通じて分泌されて標的細胞表面においてウイルス特異的エピトープをＭＨＣ－Ｉに提示させるＴ細胞抗原エピトープ、好ましくはウイルス抗原由来Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体を製造する方法を提供する。

【0073】

具体的に、本発明は、細胞質浸透抗体に融合した融合抗体に、ウイルス抗原由来Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチド、好ましくはサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ１６）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）特異的エピトープ又はエピトープを含むペプチドが融合した融合抗体を製造する方法を提供する。

【0074】

一側面において本発明は、ＣＭＶ由来抗原であるｐｐ６５及びＨＰＶ１６由来抗原Ｅ７のエピトープ又はこれを含むペプチド領域を様々な形態で断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）し、このうち、細胞質浸透抗体に融合し得る最適のＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ領域を同定する方法を提供し、
標的細胞表面に発現するウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープの効能を増加させるために、前記融合抗体に結合するウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドの配列及び長さの改良、互いに異なるペプチドの連結方法と、このような改良されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを含む融合抗体を提供する。

【0075】

また、本発明は、標的細胞表面に発現するウイルス抗原由来Ｔ細胞抗原エピトープをＭＨＣ－Ｉに効率的に提示するために、ウイルス抗原由来Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを抗体に融合させる時に使用されるペプチドリンカー及びリンカー改良方法を提供する。

【0076】

他の側面において、本発明は、本発明に係る融合抗体又はこれを含む組成物を用いて、癌又は腫瘍細胞の成長を抑制させる方法及び／又は癌又は腫瘍を予防又は治療する方法を提供する。

【0077】

また、本発明は、本発明に係る融合抗体又はこれを含む組成物を用いて自己免疫疾患又は感染性疾患を予防又は治療する方法を提供する。

【0078】

本発明は、また、本発明に係る融合抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、前記融合抗体をコードするポリヌクレオチド又はこれを含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0079】

他の側面において、本発明は、前記宿主細胞を培養し、生産された融合抗体を回収する段階を含むことを特徴とする融合抗体の製造方法を提供する。

【0080】

具体的に、本発明に係る融合抗体の製造方法は、例示的に、下記の段階を含むことができるが、これに限定されない。

【0081】

（１）細胞質浸透能を有する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１－ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３）が含まれた重鎖と前記重鎖のＣ末端にＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが融合したアミノ酸をコードする核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）がクローニングされた重鎖発現ベクターを製造する段階；
（２）前記細胞質浸透能を有するヒト抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖不変領域（ＣＬ）が含まれた軽鎖のアミノ酸をコードする核酸がクローニングされたエンドソーム脱出細胞質浸透軽鎖発現ベクターを製造する段階；
（３）前記製造された重鎖及び軽鎖発現ベクターをタンパク質発現用動物細胞に同時形質転換して、完全なイムノグロブリン形態の細胞質浸透抗体とヒトＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが融合した融合抗体を発現させる段階；及び
（４）前記発現した融合抗体を精製及び回収する段階。
本発明は、また、本発明に係る融合抗体を用いてＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを細胞質内部に伝達する方法を提供する。

【0082】

具体的に、本発明に係る融合抗体が前記細胞質浸透抗体によって細胞内に内在化した後にエンドソームを脱出して細胞質内に位置することによって、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを細胞質内部に伝達することを特徴とする方法を提供する。

【0083】

また、本発明は、標的細胞表面にＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを提示する方法を提供する。

【0084】

このような方法は、例えば、細胞又は組織特異的細胞質浸透抗体にＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが融合した融合抗体の形態で、ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はエピトープを含むペプチドを細胞質内部に伝達し、前記融合抗体が細胞質浸透抗体によって細胞内に内在化した後にエンドソームを脱出して細胞質内に位置することによって、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが標的細胞表面に提示されることを特徴とし得るが、これに限定されない。

【図面の簡単な説明】

【0085】

【図1】ｉｎＣＴ９９及びｉｎＣＴ９９†ウイルスエピトープ（ｖｉｒａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）融合抗体の模式図である。

【図2】陰性対照群抗体としてｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶとセツキシマブ†ＣＭＶ及びネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体の模式図であり、 図２Ａは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体のＶＬ－ＣＤＲ３に存在するエンドソーム脱出モチーフである^９２ＷＹＷ^９４を^９２ＡＡＡ^９４に突然変異させ、ＶＨ－ＣＤＲ３に存在するエンドソーム脱出モチーフである^９５ＷＹＷ^９８を^９５ＡＡＡ^９８に突然変異させたｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶの模式図であり、 図２Ｂは、セツキシマブ抗体の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）領域のＣ末端にＧ_４Ｓリンカーを介してウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを融合させたセツキシマブ†ＣＭＶの模式図であり、 図２Ｃは、ネシツムマブ抗体の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）領域のＣ末端にＧ_４Ｓリンカーを介してウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを融合させたネシツムマブ†ＣＭＶの模式図である。

【図3】ｉｎＣＴ９９抗体とｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ、ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ、ｉｎＣＴ９９†ＥＢＶ及びｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ、融合抗体を動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）で発現させるためのベクターの模式図であり、 図３Ａは、細胞質浸透抗体であるｉｎＣＴ９９抗体の重鎖定常部位にウイルス抗原由来エピトープペプチドが融合したｉｎＣＴ９９†ウイルスペプチド（ｖｉｒａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）融合抗体の重鎖発現ベクターの模式図であり、 図３Ｂは、ｉｎＣＴ９９抗体及びｉｎＣＴ９９†ウイルスペプチド融合抗体の軽鎖発現ベクターの模式図である。

【図4】対照群抗体であるセツキシマブ†ＣＭＶとネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体を動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）で発現させるためのベクターの模式図であり、 図４Ａは、セツキシマブ†ＣＭＶ融合抗体の重鎖発現ベクターの模式図であり、 図４Ｂは、セツキシマブ†ＣＭＶ融合抗体の軽鎖発現ベクターの模式図であり、 図４Ｃは、ネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体の重鎖発現ベクターの模式図であり、 図４Ｄは、ネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体の軽鎖発現ベクターの模式図である。

【図5】ｉｎＣＴ９９†ウイルスペプチド融合抗体を動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）で発現及び精製させた後、３μｇのタンパク質を還元性又は非還元性条件のＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、クマシ－ブルー染色を用いて大きさ及び組合せ形態で分析した結果であり、 図５Ａは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体に対する結果であり、 図５Ｂは、ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ融合抗体に対する結果であり、 図５Ｃ及び図５Ｄは、ｉｎＣＴ９９†ＥＢＶ融合抗体に対する結果である。

【図6】ヒト癌細胞株４種に対して週組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉの遺伝子型のうちＨＬＡ－Ａ２と癌細胞表面抗原のうちインテグリンανβ５／ανβ３の発現を流細胞分析機で分析した実験結果である。

【図7】Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体の発現ベクターの模式図、及び精製後の大きさ及び組合せ形態を分析した結果であり、 図７Ａは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体の発現ベクターの模式図であり、 図７Ｂは、Ｈ９、Ｈ９＃１とＨ９＃３８抗体を動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）で発現及び精製させた後、３μｇのタンパク質を還元性又は非還元性条件のＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、クマシ－ブルー染色を用いて大きさ及び組合せ形態で分析した結果であり、 図７Ｃは、Ｃ１－１７抗体を図７Ｂと同じ方法で分析した結果であり、 図７Ｄは、７－１とＬ２抗体を図７Ｂと同じ方法で分析した結果である。

【図8】ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の発現程度が異なる癌細胞株を用いてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体のペプチド／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体に対する結合能を流細胞分析機（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した実験結果であり、 図８Ａは、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドをバルスした癌細胞から、Ｈ９、Ｈ９＃１及びＨ９＃３８抗体のＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体に対する結合能を測定した結果であり、 図８Ｂは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を、Ｈ９＃１及びＨ９＃３８抗体を用いて分析した結果であり、 図８Ｃは、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドをバルスした癌細胞から、Ｃ１－１７抗体のＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体に対する結合能を測定した結果であり、 図８Ｄは、ＨＰＶ Ｅ１１－１９ペプチドをバルスした癌細胞から、７－１抗体のＨＰＶ Ｅ１１－１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体に対する結合能を測定した結果であり、 図８Ｅは、ＥＢＶ Ｌ２４２６－４３４（Ｃ４２６Ｓ）ペプチドをバルスした癌細胞から、Ｌ２抗体のＥＢＶ Ｌ２４２６－４３４（Ｃ４２６Ｓ）／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体に対する結合能を測定した結果である。

【図9】様々なｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体の細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能及び細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を流細胞分析機で分析した結果であり、 図９Ａは、４℃でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体の細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能を分析するための計画表であり、 図９Ｂは、３７℃でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を分析するための計画表であり、 図９Ｃは、様々なｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を図７Ａ及び図７Ｂの方法で処理した後、流細胞分析機で分析した結果であり、 図９Ｄは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体と対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３及びセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体を、上述した図９Ａ及び図９Ｂの方法で処理した後、流細胞分析機で分析した結果であり、 図９Ｅは、上述した図９Ｂの方法でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０融合抗体、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０抗体の３７℃で細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を評価した結果であり、 図９Ｆは、上述した図９Ｂの方法でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６融合抗体、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６とネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体の３７℃で細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を評価した結果である。

【図10】健康な血液供与者から採血した血液から分離した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を用いて染色して、ＨＬＡ－Ａ下位遺伝子型であるＨＬＡ－Ａ２の発現、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチド刺激前後のＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の比率及び表現型を分析した結果であり、 図１０Ａは、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のＨＬＡ－Ａ下位遺伝子型であるＨＬＡ－Ａ２の発現を流細胞分析機で分析した結果であり、 図１０Ｂは、ＨＬＡ－Ａ２遺伝子型を有する健康な血液供与者のＰＢＭＣをＴ細胞抗原エピトープであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドで刺激して１０～１４日間増幅させた後、リンパ球又はＣＤ８^＋Ｔ細胞中の、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の比率を流細胞分析機で分析した結果であり、 図１０Ｃは、図１０Ｂで増幅させたＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞の分化段階及び抗原の表現型を流細胞分析機で分析した結果である。

【図11】様々なｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を処理した癌細胞のＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による死滅効果をＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）アッセイで分析した結果であり、 図１１Ａは、ＬＤＨアッセイのための抗体及びＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の投与方法を示す計画表であり、 図１１Ｂは、ＬＤＨアッセイの結果を分析したグラフである。

【図12】ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ抗体及び対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶとセツキシマブ†ＣＭＶ及びネシツムマブ†ＣＭＶ抗体を癌細胞に処理した後、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果をＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）アッセイで分析した結果であり、 図１２Ａは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体と対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体を図１１Ａと同じ方法で処理後に、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果をＬＤＨアッセイで分析した結果であり、 図１２Ｂは、前記抗体を２４時間処理した後、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅誘導能をＬＤＨアッセイで分析するための計画表であり、 図１２Ｃは、図１２Ｂの方法でＬＤＨアッセイを行った後、その結果を分析したグラフであり、 図１２Ｄは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０と対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０抗体を図１１Ａと同じ方法で処理後に、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果をＬＤＨアッセイで分析した結果であり、 図１２Ｅは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６と対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６とネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体及びセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体を図１１Ａと同じ方法で処理後に、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果をＬＤＨアッセイで分析した結果である。

【図13】癌細胞にプロテアソーム阻害剤とゴルジ阻害剤を処理した後にｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を処理し、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ－ｇ分泌量をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）で定量した結果であり、 図１３Ａは、前記分析のための計画表であり、 図１３Ｂは、分析に用いられたＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の純度を流細胞分析機で分析した結果であり、 図１３Ｃは、プロテアソーム阻害剤とゴルジ阻害剤がｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３と対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３及びセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体によるＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ－ｇ分泌に及ぼす影響をＥＬＩＳＡで定量した結果であり、 図１３Ｄは、前記阻害がｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６、ｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６及びネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体によるＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ－ｇ分泌に及ぼす影響をＥＬＩＳＡで定量した結果である。

【図14】ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞を乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）に異種移植したＮＳＧマウスにおいてｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体のＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞成長抑制誘導効果を、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体と比較して測定した結果であり、 図１４Ａは、前記実験に対して腫瘍移植後の抗体とＩＬ－１５受容体の複合体分子の投与間隔、投与量、投与方法及びＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の投与間隔と方法を示す計画表であり、 図１４Ｂは、上記の図１４Ａの実験において日数によって各抗体投与群の腫瘍体積変化を示すグラフであり、 図１４Ｃは、図１４Ａの実験において抗体最終投与４８時間後にマウスを致死して腫瘍の重さを特定したグラフであり、 図１４Ｄは、図１４Ａの実験において抗体最終投与４８時間後にマウスを致死し腫瘍を摘出した後に取った写真であり、 図１４Ｅは、図１４Ａの実験結果において日数によって各抗体投与群の腫瘍体積変化を１個体のマウスごとに示すグラフである。

【図15】ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞を乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）に異種移植したＮＳＧマウスにおいてｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６融合抗体のＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞成長抑制誘導効果を、既存ＡＰＥＣｓ技術であるセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体と比較して測定した結果であり、 図１５Ａは、前記実験に対して腫瘍移植後の抗体とＩＬ－１５受容体の複合体分子の投与間隔、投与量、投与方法及びＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の投与間隔と方法を示す計画表であり、 図１５Ｂは、上記の図１５Ａの実験において日数によって各抗体投与群の腫瘍体積変化を示すグラフであり、 図１５Ｃは、図１５Ａの実験において抗体最終投与４８時間後にマウスを致死して腫瘍の重さを特定したグラフであり、 図１５Ｄは、図１５Ａの実験において抗体最終投与４８時間後にマウスを致死し腫瘍を摘出した後に取った写真であり、 図１５Ｅは、図１５Ａの実験結果において日数によって各抗体投与群の腫瘍体積変化を１個体のマウスごとに示すグラフである。

【図16】ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞を乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）に異種移植したＮＳＧマウスにおいてｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体のＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化効果を、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体と比較して測定した結果であり、 図１６Ａは、前記実験に対して腫瘍移植後の抗体の投与量、投与方法、及びＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の投与方法を示す計画表であり、 図１６Ｂは、ＮＳＧマウスに注射するために増幅したＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の比率を流細胞分析機で分析した実験結果であり、 図１６Ｃは、各投与群のマウスを致死して腫瘍浸潤リンパ球を分離し、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のうちＣＤ１０７の発現量とＣＤ６９とＩＦＮ－ｇを発現させるＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の比率を分析した結果である。

【図17】ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ Ｅ１１－１９及びｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ Ｅ１－１９融合抗体が細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を流細胞分析機で分析した結果であり、 図１７Ａは、３７゜Ｃで前記抗体が細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を分析するための計画表であり、 図１７Ｂは、様々な濃度の前記抗体を図１７Ａの方法で処理した後、流細胞分析機で分析した結果であり、 図１７Ｃは、前記抗体を図１７Ａの方法で時間別に処理した後、Ｔ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を流細胞分析機で分析した結果である。

【図18】様々なｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体の細胞表面Ｈ－２Ｋ ｂに対する結合能及び細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨ－２Ｋ ｂに提示する能力を流細胞分析機で分析し、ＯＶＡ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果をＬＤＨアッセイで分析した結果であり、 図１８Ａは、前記抗体を図９Ａ及び図９Ｂと同じ方法で処理後に、４℃でｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体の細胞表面Ｈ－２Ｋ^ｂに対する結合能と３７℃でｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体が細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨ－２Ｋ^ｂに提示する能力を流細胞分析機で分析した結果であり、 図１８Ｂは、Ｈ－２Ｋ^ｂを発現させるＭＣ３８細胞にｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４抗体を処理し、ＯＶＡ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の比率を別にして処理した後、癌細胞の死滅効果をＬＤＨアッセイで分析した結果である。

【図19】マウス大腸癌細胞株であるＭＣ３８細胞をＣ５７ＢＬ／６免疫担当（ｉｍｍｕｎoｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウスの背部に同種移植した後、ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体のＯＶＡ２５７－２６４特異的細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞成長抑制誘導効果を測定した結果であり、 図１９Ａは、前記実験に対して腫瘍移植後の抗体の投与間隔、投与量、投与方法及びＯＶＡ２５７－２６４特異的細胞傷害性Ｔ細胞の投与間隔と方法を示す計画表であり、 図１９Ｂは、上記の図１８Ａの実験において日数によって各抗体投与群の腫瘍体積変化を示すグラフであり、 図１９Ｃは、図１９Ｂの実験において各抗体投与群の腫瘍体積変化を１個体のマウスごとに示すグラフである。

【図20】ウイルス抗原由来エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体を用いて癌細胞表面にウイルス特異的エピトープを発現させ、腫瘍患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を用いて癌細胞を除去する汎用治療用抗癌ワクチンに対する作用機序を示す全般的な模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0086】

特に断らない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使われるものである。

【0087】

本発明は、抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを標的細胞の細胞質に伝達するために、細胞又は組織特異的細胞質浸透抗体（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｓｏｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）にＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが融合した融合抗体、及び前記融合抗体を含み、標的細胞表面にＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを提示するための組成物を提供する。

【0088】

本発明は、細胞質浸透抗体にＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが融合した形態でＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はエピトープを含むペプチドを細胞質内部に伝達する方法であって、前記細胞質浸透抗体によって細胞内に内在化した後にエンドソームを脱出して細胞質内に位置することによって、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを細胞質内部に伝達することを特徴とする方法に関する。

【0089】

本発明において“標的細胞”は、癌細胞、ウイルス又は病原性微生物感染細胞などの人体内で除去されるべき正常でない細胞などの異常細胞（ａｂｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌ）の他、肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌ）、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）、粘膜細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、筋肉細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ）、皮膚細胞（ｓｋｉｎ ｃｅｌｌｓ）及び幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）からなる群から選ばれてよいが、これに限定されるのではなく、人体内で疾患を誘発する異常に活性化された細胞であって、体内で除去又は治療されるべき細胞であればいずれも含まれる意味で解釈される。

【0090】

前記標的細胞は、好ましくは、癌細胞、ウイルス又は病原菌などであってよいが、これに限定されるのではなく、前記癌細胞は、例えば、膀胱癌、乳癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、甲状腺癌、子宮頸癌、中枢神経癌、膠芽腫、肝癌、皮膚癌、膵癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、食道癌、腎臓癌、肺癌、上皮癌、血液癌、前立腺癌又は軟組織肉腫細胞などを含むが、これに制限されない。

【0091】

また、前記ウイルス又は病原菌は、それによってウイルス又は病原菌の感染を原因とする病的状態である感染性疾患が誘発され得るものであればいずれも使用可能であり、例えば、Ｂ型及びＣ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）感染、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）感染、ウイルス性呼吸器疾患、インフルエンザーなどが含まれてよいが、これに制限されない。

【0092】

本発明に係る融合抗体は、標的細胞表面にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを発現させ、患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞毒性ＣＤ８^＋Ｔ細胞を用いて標的細胞を除去するようにする。

【0093】

すなわち、本発明に係る融合抗体は細胞又は組織特異的細胞質浸透が可能であり、細胞質浸透後に、細胞質内でタンパク質分解システムによって生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが小胞体に入ってＭＨＣ－Ｉと結合し、ゴルジ体を通じて分泌されて標的細胞表面にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを発現させ、腫瘍患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞毒性ＣＤ８^＋Ｔ細胞によって、ウイルス特異的エピトープを発現する標的細胞を除去する汎用治療用抗体として利用されてよい。

【0094】

また、本発明は、前記ウイルス抗原由来エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体を含む薬剤学的組成物及びこれを用いた疾病、特に癌の治療のための組成物及び治療方法を提供する。

【0095】

また、前記ウイルス抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体を含む癌治療のための薬剤学的組成物は、他の抗癌剤と併用治療のための用途に用いられてよく、前記他の抗癌剤は細胞毒性ＣＤ８^＋Ｔ細胞であることが好ましいが、これに限定されるのではなく、他の当該技術分野で使用可能ないかなる抗癌剤も併用治療のために使用されてよい。

【0096】

特に、ウイルス抗原由来エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体を含む癌治療のための薬剤学的組成物を細胞傷害性Ｔ細胞と併用治療のために使用する場合に、
細胞傷害性Ｔ細胞を刺激してサイトカイン分泌の増加；
細胞傷害性Ｔ細胞数の増加；
腫瘍付近へのリンパ球流入の増加、を誘導することを特徴とし得る。

【0097】

前記目的の細胞質浸透能を有する細胞質浸透抗体は、完全イムノグロブリン形態の抗体及びその切片であってよい（大韓民国特許登録第１０－１６０２８７０公報（完全なイムノグロブリン形態の抗体を細胞膜を透過して細胞質に位置させる方法及びその利用））。

【0098】

前記目的の細胞質浸透能を有する細胞質浸透抗体は、キメラ、ヒト、又はヒト化した抗体であってよい。

【0099】

前記目的の細胞質浸透能を有する細胞質浸透抗体は、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ，Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）及び／又は重鎖可変領域（ＶＨ，Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）に、エンドソーム脱出能（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ ａｂｉｌｉｔｙ）を有する完全イムノグロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体においてて、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び／又は重鎖可変領域（ＶＨ）のＮ末端に、標的細胞の表面膜タンパク質に特異的に結合する環状ペプチド（ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）が融合し、標的組織細胞の細胞質に浸透能を有する組織特異的細胞浸透抗体であってよい。

【0100】

前記目的の細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能は、抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域に含まれた下記構造によってエンドソーム酸性ｐＨ条件で抗体の特性変化を発生させることによるものであることを特徴とする組織特異的細胞質浸透抗体であってよい。すなわち、１）軽鎖可変領域（ＶＬ）及び／又は重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合領域３（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ３，ＣＤＲ３）配列にＷＹＷＸエンドソーム脱出能配列モチーフを含むが、Ｗはトリプトファン、Ｙはチロシン、Ｘはメチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、及びロイシン（Ｌ）からなる群から選ばれ、２）軽鎖可変領域（ＶＬ）及び／又は重鎖可変領域（ＶＨ）の１番目のアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）であることを特徴とする細胞質浸透抗体であってよい。

【0101】

前記目的の細胞質浸透能を有する細胞質浸透抗体ｉｎＣＴ９９抗体の重鎖と軽鎖の配列情報は、下記配列番号１の重鎖可変領域及び配列番号２の軽鎖可変領域配列を有するものでよいが、これに限定されず、本発明の目的に符合する細胞質浸透能及び／又はエンドソーム脱出能力を有するものであればいずれも使用可能である。

【0102】

【0103】

本明細書で提供する配列番号に明示された全ての抗体のアミノ酸残基番号は、Ｋａｂａｔ番号を使用した。

【0104】

また、本発明の一態様は、前記腫瘍組織特異性を付与するために、標的細胞、例えば、癌細胞に多く発現したインテグリンαｖβ３とαｖβ５を標的するｉｎ４環状ペプチドを軽鎖可変領域のＮ末端にＭＧＳＳＳＮリンカーを用いて融合させた。

【0105】

前記目的のｉｎ４環状ペプチドの配列情報は下記の通りである。

【0106】

【0107】

本発明で提供するＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが細胞又は組織特異的細胞質浸透抗体に融合した融合抗体は、標的細胞をターゲットとし、標的細胞表面のＭＨＣ－ＩにＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを提示するワクチンとして使用することができる。

【0108】

本発明で提供するＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープペプチド又はこのエピトープを含むペプチドが細胞又は組織特異的細胞質浸透抗体に融合した融合抗体は、癌細胞の他にもＭＨＣ－Ｉを発現するあらゆる核を有する細胞を標的にして開発され、標的細胞表面のＭＨＣ－ＩにＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを提示することができる。すなわち、本発明の細胞又は組織特異的細胞質浸透抗体が特定細胞又は組織を標的すると、癌細胞の他にも、ＭＨＣ－Ｉを発現するあらゆる核を有する細胞の細胞質にＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ抗原を伝達する方法を提供する。この場合、癌細胞の他に、細胞は肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌ）、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）、粘膜細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、筋肉細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ）、皮膚細胞（ｓｋｉｎ ｃｅｌｌｓ）、幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）などであっもよい。

【0109】

本発明は、細胞又は組織特異的な細胞質浸透能を有するｉｎＣＴ９９抗体に、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス１６（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ１６）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）特異的エピトープ又はエピトープを含むペプチドを融合させた抗体を製造する方法を提供する。

【0110】

“融合”は、機能又は構造が異なるか同一である２分子を一体化することであって、好ましくはリンカーペプチドによってなり得、このリンカーペプチドは、本発明の抗体各ドメイン、抗体、又はその切片の様々な位置で前記ウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドとの融合を中継できる。

【0111】

前記ウイルス特異的ＣＤ８^＋エピトープペプチド又はエピトープを含む長いペプチドは、ｉｎＣＴ９９重鎖のＣ末端にＧ_４Ｓリンカー又はＧＦＬＧリンカーを用いて融合させた。

【0112】

本発明で提供する抗体が、従来の技術であるＡＰＥＣｓ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）技術に比べて向上した抗癌効果を示すかを評価するために、ＡＰＥＣｓ技術に用いられたリンカーのうち代表的なＭＭＰ１４特異的リンカーを使用した。ＡＰＥＣｓ技術は、腫瘍表面抗原標的抗体にＣＭＶウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープであるＣＭＶｐ４９５－５０３番（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドを、腫瘍内に存在するか腫瘍細胞が発現するタンパク質加水分解酵素（プロテアーゼ）によって切断されるリンカー（ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）で連結して、腫瘍細胞表面にＴ細胞抗原エピトープ－ＭＨＣ－Ｉ複合体を展示させた事例である。

【0113】

前記目的を達成するための例示的なリンカーの配列情報は、下記の通りである。

【0114】

【0115】

前記ウイルス抗原由来ＣＤ８^＋エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体に融合するウイルス特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、１）アミノ酸９個のウイルス特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープのみをｉｎＣＴ９９抗体のＣ末端に融合させる群、２）ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープのＮ末端側に延長された切片形態を融合させる群、３）ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープのＣ末端側に延長された切片形態を融合させる群、４）ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープのＮ末端とＣ末端側の両方に延長された切片形態を融合させる群、を含む配列（配列番号１２－２９）である。このとき、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチド１個が抗体のＣ末端に直接融合してよい。

【0116】

従来は、抗体とＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープペプチド部分、すなわち、ＭＨＣ－Ｉに直接結合する８～１１個のアミノ酸残基で構成されたペプチドのみを、二硫化結合（Ｓ－Ｓ ｂｏｎｄ）による化学的結合（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を用いて連結した。すなわち、抗体とペプチドをそれぞれ別に準備し、リンカーペプチドが連結されて、特定環境でペプチドが切断される。ただし、本発明によれば、抗体重鎖Ｃ末端にＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープペプチドがシステイン（Ｃｙｓ）無しに遺伝的融合によって直接連結されるという相違がある。

【0117】

本発明では、細胞質浸透能のない陰性対照群抗体としてｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ抗体、セツキシマブ†ＣＭＶ及びネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体を使用した。

【0118】

ｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ抗体は、ｉｎＣＴ９９抗体のＶＬ－ＣＤＲ３に存在するエンドソーム脱出モチーフである^９２ＷＹＷ^９４が^９２ＡＡＡ^９４に突然変異しており、ＶＨ－ＣＤＲ３に存在するエンドソーム脱出モチーフである^９５ＷＹ^９５Ａが９５ＡＡＡ^９８に突然変異している。したがって、インテグリンαｖβ３とαｖβ５受容体に結合して内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）したｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ抗体はエンドソームを脱出できないため細胞質浸透がされず、細胞表面にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを提示することができない。

【0119】

セツキシマブ†ＣＭＶ融合抗体は、ＥＧＦＲを標的するセツキシマブ抗体の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）領域のＣ末端にＧ_４Ｓリンカーを介してウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを融合させて構築した。セツキシマブ†ＣＭＶ融合抗体はＥＧＦＲに結合して内在化した後にリソソームを経て分解されるため、細胞質浸透による細胞表面にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを提示する機能がない。

【0120】

ネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体は、ＥＧＦＲを標的するネシツムマブ抗体の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）領域のＣ末端にＧ_４Ｓリンカーを介してウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを融合させて構築した。ネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体はＥＧＦＲに結合して内在化した後にリソソームを経て分解されるため、細胞質浸透による細胞表面にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを提示する機能がない。

【0121】

本発明で提供する抗体が、従来の技術であるＡＰＥＣｓ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）技術に比べて向上した抗癌効果を示すかを評価するために、ＡＰＥＣｓ技術に使用された抗体のうち代表的なセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体を構築した。ＡＰＥＣｓ技術は、腫瘍表面抗原標的抗体に、ＣＭＶウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３番（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）ペプチドを、腫瘍内に存在するか腫瘍細胞が発現するタンパク質加水分解酵素（プロテアーゼ）によって切断されるリンカー（ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）で連結して、腫瘍細胞表面にＴ細胞抗原エピトープ－ＭＨＣ－Ｉ複合体を展示させた事例である。

【0122】

上述した対照群抗体であるセツキシマブとネシツムマブ抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域の配列情報は、下記の配列番号７～１０を用いた。

【0123】

【0124】

上述した対照群抗体であるセツキシマブとネシツムマブ抗体を製造するために使用されたヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域、軽鎖不変領域の配列情報は、下記の通りである。抗体依存的細胞毒性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）による癌細胞抑制活性を排除するために、重鎖ＣＨ２－ＣＨ３領域に２３４、２３５番目の残基リジン（Ｌｙｓｉｎｅ）をアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）に置換し、３２９番目のプロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）をグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）に置換してｈＩｇＧ１（ＡＡＧ）と命名した重鎖を使用した。

【0125】

【0126】

前記方法で製造されたｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体及び対照群抗体は、下記のように命名する。

【0127】

【0128】

前記方法で製造されたｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ、ｉｎＣＴ９９†ＥＢＶ融合抗体は、下記のように命名する。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のＴ細胞抗原エピトープＥＢＶ Ｌ２４２６－４３４の配列はＣＬＧＧＬＬＴＭＶであるが、ｉｎＣＴ９９抗体に融合時に、Ｃｙｓ残基によるオリゴマー形成を防止するために４２６番残基をＳｅｒ残基に置換したＥＢＶ Ｌ２４２６－４３４（Ｃ４２６Ｓ）の配列であるＳＬＧＧＬＬＴＭＶを使用した。

【0129】

【0130】

本発明においてＣＭＶウイルス抗原由来ＣＤ８^＋エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合したｉｎＣＴ†ＣＭＶ融合抗体を腫瘍細胞に処理した後、実際ＣＭＶウイルスエピトープがＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成して細胞表面にウイルスエピトープを提示するかを分析するＴＣＲ様（ＴＣＲ－ｌｉｋｅ）抗体は、前記表に記述されたＨ９である。

【0131】

また、本発明の一態様においてＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３とＨＬＡ－Ａ２の複合体に対する親和度が向上した抗体は、Ｈ９＃１、Ｈ９＃３８とＣ１－１７である。

【0132】

ＨＰＶウイルスエピトープとＨＬＡ－Ａ２の複合体を分析するＴＣＲ様（ＴＣＲ－ｌｉｋｅ）抗体は７－１であり、ＥＢＶウイルスエピトープとＨＬＡ－Ａ２の複合体を分析するＴＣＲ様（ＴＣＲ－ｌｉｋｅ）抗体はＬ２である。

【0133】

前記ＴＣＲ様（ＴＣＲ－ｌｉｋｅ）抗体を製造するために使用された重鎖可変領域、軽鎖可変領域、マウスＩｇＧ２ａ重鎖定常領域、マウスＩｇＧ２ａ軽鎖不変領域の配列は、下記の通りである。

【0134】

【0135】

【0136】

【0137】

従来抗体－Ｔ細胞抗原エピトープ融合体でＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープが切断されてＭＨＣ－Ｉに展示（ｄｉｓｐｌａｙ）される機序は、細胞内部又は外部環境（低いｐＨ、還元環境）によって切断可能リンカーが切断されてＴ細胞エピトープペプチドが露出され、エンドソーム又は細胞表面でＭＨＣ－Ｉに結合する過程、すなわち、細胞表面又はエンドソーム内でペプチド／ＭＨＣ－Ｉが結合し、細胞表面に提示される機序による。

【0138】

しかしながら、本発明によれば細胞質内に浸透した後に、抗原処理装置（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）（元の細胞機序）によって抗体－ペプチドが切断され、Ｔ細胞抗原エピトープ又はエピトープを含むペプチドが細胞質からＥＲに入ってＭＨＣ－Ｉと結合して提示される。すなわち、細胞質でＴ細胞抗原エピトープペプチドが発生し、これがＥＲに入ってＭＨＣ－Ｉと結合して細胞表面に提示される。すなわち、元の細胞で起きるペプチド／ＭＨＣ－Ｉ提示機序に従う。

【0139】

従来機序によれば、切断不可能なリンカーを使用する場合、Ｔ細胞抗原エピトープペプチドがＭＨＣ－Ｉに提示されなく、抗体にＴ細胞エピトープペプチド（ＭＨＣ－Ｉに実際に結合する８～１１個のアミノ酸残基で構成されたペプチド）よりも長い長さのペプチドを連結すればＭＨＣ－Ｉに提示されない。これは、細胞質の細胞内抗原処理過程を経ないためである。また、抗体に二硫化結合（Ｓ－Ｓ ｂｏｎｄ）で結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）するには、Ｔ細胞抗原エピトープ又はペプチドにシステインを必須に含まなければならないという問題がある。

【0140】

しかしながら、本発明によれば、元来細胞の抗原処理装置（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を利用するので、切断不可能／切断可能リンカー２個を使用してもよく、Ｔ細胞抗原エピトープペプチド（８～１１個アミノ酸残基）よりも長い長さのペプチドを融合させてもＭＨＣ－Ｉに提示され、遺伝的融合によってペプチド部分にシステインが必要でない。

【0141】

本発明の一態様では、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体を用いて癌又は腫瘍細胞の成長を抑制させる方法及び癌又は腫瘍を治療する方法を提供する。

【0142】

前記癌は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚又は眼球内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、膵癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝癌及び頭頸部癌からなる群から選ばれるものでよい。

【0143】

本発明の一態様では、前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体を用いて感染疾患を治療する方法を提供する。

【0144】

前記感染疾患は、ウイルス又は病原菌によってウイルス又は病原菌の感染を原因とする病的状態であって、例えば、Ｂ型及びＣ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）の感染及びウイルス性呼吸器疾患、インフルエンザーなどが含まれてよいが、これに制限されない。

【0145】

前記癌又は感染疾患の予防又は治療用薬学的組成物は、経口又は非経口で投与できる。非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。経口投与時に、タンパク質又はペプチドは消化することから、経口用組成物は活性薬剤をコートするか、胃における分解から保護されるように剤形化される必要がある。また、前記組成物は、活性物質を標的細胞に移動させ得る任意の装置によって投与されてよい。

【0146】

前記組成物が癌又は感染疾患の予防又は治療用薬学的組成物として製造される場合に、前記組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。前記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に一般に使用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。前記薬学的組成物は、前記成分の他にも、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。

【0147】

前記癌又は感染疾患の予防又は治療用薬学的組成物は、経口又は非経口で投与できる。非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。経口投与の際、タンパク質又はペプチドは消化することから、経口用組成物は活性薬剤をコートするか、胃における分解から保護されるように剤形化する必要がある。また、前記組成物は、活性物質を標的細胞に移動させ得る任意の装置によって投与されてよい。

【0148】

前記癌又は感染疾患の予防又は治療用薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々に処方できる。前記組成物の好ましい投与量は、成人基準で０．００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。用語“薬学的有効量”は、癌を予防又は治療するのに或いは血管新生による疾患の予防又は治療するのに十分な量を意味する。

【0149】

本発明は、前記細胞又は組織特異的細胞質浸透抗体；及び、前記抗体に結合したＴ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが融合した融合抗体をコードするポリヌクレオチド又は核酸を提供する。

【0150】

前記“ポリヌクレオチド（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）”又は“核酸”は、一本鎖又は二本鎖形態で存在するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの重合体である。ＲＮＡゲノム配列、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びこれから転写されるＲＮＡ配列を包括し、特に断らない限り、天然のポリヌクレオチドの類似体を含む。

【0151】

前記ポリヌクレオチドは、上述した細胞質浸透抗体とヒトＲＮＡ分解酵素が融合した形態の組換え免疫毒素をコードするヌクレオチド配列の他に、その配列に相補的な（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）配列も含む。前記相補的な配列は、完壁に相補的な配列の他、実質的に相補的な配列も含む。

【0152】

本発明に係るヌクレオチドは、変形されたものでよい。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失を含む。前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記ヌクレオチド配列と任意の他の配列を極力対応するようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも８０％の相同性、少なくとも９０％の相同性又は少なくとも９５％の相同性を示す配列であってよい。

【0153】

本発明の具体例において、腫瘍組織特異的細胞質浸透能を付与したヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）と細胞質浸透能を付与したヒト重鎖可変領域（ＶＨ）領域と重鎖定常領域のＣ末端にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを融合させたウイルス抗原由来エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体（ｖｉｒａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｆｕｓｅｄ ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）を製造する方法の例は、下記の通りである。

【0154】

１）前記細胞質浸透能を付与したヒト重鎖可変領域（ＶＨ）及びヒト重鎖定常領域（ＣＨ１－ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３）が含まれた重鎖のＣ末端にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを融合させた核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）をクローニングして、ウイルス抗原由来エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体の重鎖発現ベクターを製造する段階；
２）前記ヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）及びヒト軽鎖不変領域（ＣＬ）を含む軽鎖において軽鎖可変領域（ＶＬ）を細胞質に浸透するヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）及び腫瘍組織特異的細胞質浸透能を付与したヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）に置換された核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）をクローニングした細胞質浸透軽鎖発現ベクターを製造する段階；
３）前記製造された重鎖、軽鎖発現ベクターをタンパク質発現用動物細胞に同時形質転換して、腫瘍患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞によって認知され得るように標的細胞でウイルスエピトープを発現させることができる、ウイルス抗原由来エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体を発現させる段階；及び
４）前記発現した完全なイムノグロブリン形態の抗体を精製及び回収する段階。

【0155】

前記方法は、重鎖を発現するベクターと軽鎖を発現するベクターを用いて腫瘍組織特異的に細胞内部に浸透し、細胞質浸透後に細胞質内でタンパク質分解システムによって生成されたウイルス特異的エピトープが小胞体に入ってＭＨＣ－Ｉと結合し、ゴルジ体を通じて分泌されて標的細胞表面にウイルス特異的エピトープを発現させ、腫瘍患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞によって、ウイルス特異的エピトープを発現する標的細胞を除去する汎用治療用抗体を発現することができる。ベクターは、軽鎖と重鎖を一つのベクターで同時に発現させるベクターシステムも、それぞれ別のベクターで発現させるシステムも可能である。後者の場合、２つのベクターは同時形質転換（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）及び標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によって宿主細胞に導入されてよい。

【0156】

前記組換えベクターにおいて、本発明で提供する軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び軽鎖不変領域（ＣＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１－ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３）はプロモーターに作動的に連結されてよい。用語“作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”とは、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列間の機能的な結合を意味する。したがって、これによって、前記調節配列は前記他のヌクレオチド配列の転写及び／又は解読を調節できる。

【0157】

前記組換えベクターは、典型的に、クローニングのためのベクター又は発現のためのベクターとして構築されてよい。前記発現用ベクターは、当業界で植物、動物又は微生物で外来のタンパク質を発現させるのに使用される通常のものを使用できる。前記組換えベクターは、当業界に公知の様々な方法によって構築されてよい。

【0158】

前記組換えベクターは、原核細胞又は真核細胞を宿主にして構築されてよい。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合サイト及び転写／解読終結配列を含むことが一般である。真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞において作動する複製原点は、ｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点、ＣＭＶ複製原点及びＢＢＶ複製原点などを含むが、これに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びＨＳＶのｔｋプロモーター）が用いられてよく、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般に有する。

【0159】

本発明のさらに他の態様は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供できる。

【0160】

宿主細胞は、当業界に公知のいかなる宿主細胞も利用可能であり、原核細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルスサブチリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属の菌株、そしてサルモネラティフィムリウム、セラチアマルセッセンス及び様々なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞、例えば、ＳＰ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株などが用いられてよい。

【0161】

本発明のさらに他の態様は、前記宿主細胞を培養する段階を含む、細胞又は組織特異的に細胞内部に浸透し、細胞質浸透後に細胞質内でタンパク質分解システムによって生成されたウイルス特異的エピトープが小胞体に入ってＭＨＣ－Ｉと結合し、ゴルジ体を通じて分泌されて標的細胞表面にウイルス特異的エピトープを発現させ、腫瘍患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞によって、ウイルス特異的エピトープを発現する標的細胞を除去する汎用治療用抗体製造方法を提供することができる。

【0162】

前記組換えベクターの宿主細胞内への挿入は、当業界に広く知られた挿入方法を用いることができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ_２方法又は電気穿孔方法などを用いることができ、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム媒介形質感染法及び遺伝子ボンバードメントなどを用いることができるが、これに限定しない。Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物を利用する場合、生産性は動物細胞などに比べて高い方であるが、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）問題のため、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）なＩｇ形態の抗体生産には適当でないが、Ｆａｂ及びＦｖのような抗原結合断片の生産には使用可能である。

【0163】

前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を用いて、当業界に広く知られた方法によって容易に実施できる。例えば、前記選択標識が特定抗生剤耐性遺伝子である場合には、前記抗生剤が含まれている培地で形質転換体を培養することによって形質転換体を容易に選別できる。

【0164】

本発明は、細胞又は組織特異的な細胞質浸透能を付与した抗体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）領域のＣ末端にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを融合させたウイルス抗原由来エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体（ｖｉｒａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｆｕｓｅｄ ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）を用いて標的細胞表面にウイルス特異的エピトープを発現させ、患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を用いて標的細胞を除去する汎用治療用ワクチンを提供する。

【0165】

ウイルス特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドは、Ｆｃ、抗体又は抗体断片とリンカー媒介（ｌｉｎｋｅｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ）結合、化学的結合、遺伝的融合（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ）などによって連結されてよい。

【0166】

本発明において、“重鎖定常部位”は、抗体由来のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｄｏｍａｉｎ）を含む領域を意味する。ただし、ＩｇＥではＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン及びヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｄｏｍａｉｎ）を含む領域を意味する。

【0167】

重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はエプシロン（ε）のいずれか一つのアイソタイプから選択されてよい。サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖不変領域はカッパ又はラムダ型であってよい。

【0168】

“重鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片を全て意味する。また、“軽鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片を全て意味する。

【0169】

以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0170】

実施例１．細胞質浸透能を有するｉｎＣＴ９９及びｉｎＣＴ９９†ウイルスエピトープ融合抗体の構築
細胞質浸透抗体であるｉｎＣＴ９９に、Ｔ細胞抗原エピトープに該当するペプチド及びこれを含むタンパク質切片を融合させたｉｎＣＴ９９†ウイルスエピトープ融合抗体が、癌細胞にウイルス由来Ｔ細胞エピトープを提示してウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させることができるかを確認するために、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ、ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ及びｉｎＣＴ９９†ＥＢＶ融合抗体を構築した。

【0171】

図１は、ｉｎＣＴ９９及びｉｎＣＴ９９†ウイルスエピトープ融合抗体の模式図である。

【0172】

具体的に、本発明における“ｉｎＣＴ９９”は、以前腫瘍特異的な細胞質浸透能を付与するために、インテグリンαｖβ３とαｖβ５に特異性を有するｉｎ４環状ペプチドを細胞質浸透が可能なｈＴ４－５９４１ＶＬ軽鎖可変領域のＮ末端にＭＧＳＳＳＮリンカーを用いて遺伝工学的に融合させた軽鎖を使用した。また、重鎖は、細胞質浸透が可能なＲＴ２２－０１ＶＨ重鎖可変領域を含み、癌細胞表面のインテグリンに対する結合による抗体依存的細胞毒性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）による癌細胞抑制活性を排除するために、重鎖ＣＨ２－ＣＨ３領域に２３４、２３５番目の残基リジン（Ｌｙｓｉｎｅ）をアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）に置換し、３２９番目のプロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）をグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）に置換してＲＴ２２－０１（ＡＡＧ）と命名した重鎖を使用した。

【0173】

本発明における“ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ”は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｐｐ６５由来ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチド又はＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３のＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端とＣ末端の両方が延長されたペプチドがｉｎＣＴ９９抗体と融合したタンパク質を意味する。“ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ”は、ヒト乳頭腫ウイルス下位類型１６（ＨＰＶ１６）由来のＨＰＶ Ｅ１１－１９ペプチド又はＨＰＶ Ｅ１１－１９のＮ末端が延長されたペプチドがｉｎＣＴ９９抗体と融合したタンパク質を意味する。“ｉｎＣＴ９９†ＥＢＶ”は、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）ＬＭＰ２由来のＥＢＶ Ｌ２３５６－３６４ペプチド、ＥＢＶ Ｌ２４２６－４３４（Ｃ４２６Ｓ）ペプチド又はＥＢＶ Ｌ２４２６－４３４（Ｃ４２６Ｓ）ペプチドのＮ末端が延長されたペプチドがｉｎＣＴ９９抗体と融合したタンパク質を意味する。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のＴ細胞抗原エピトープＥＢＶ Ｌ２４２６－４３４の配列は、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶであるが、ｉｎＣＴ９９抗体に融合時にＣｙｓ残基によるオリゴマー形成を防止するために、４２６番残基をＳｅｒ残基に置換したＥＢＶ Ｌ２４２６－４３４（Ｃ４２６Ｓ）の配列であるＳＬＧＧＬＬＴＭＶを使用した。

【0174】

このとき、前記ウイルス特異的ＣＤ８^＋エピトープペプチド又はエピトープを含む長いペプチドは、ｉｎＣＴ９９重鎖のＣ末端にＧ_４Ｓリンカー（†）又はＧＦＬＧリンカー（‡）を用いて融合させた。

【0175】

実施例２．細胞質浸透能のないｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）、セツキシマブ及びネシツムマブにウイルス由来Ｔ細胞エピトープペプチド及びこれを含むタンパク質切片を融合させた融合抗体の構築
ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体の抗原提示機序及びＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＴＬの細胞死滅誘導機序を究明するために、陰性対照群抗体としてｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶとセツキシマブ†ＣＭＶ及びネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体をそれぞれ構築した。

【0176】

図２は、陰性対照群抗体としてｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶとセツキシマブ†ＣＭＶ及びネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体の模式図であり、
図２Ａは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体のＶＬ－ＣＤＲ３に存在するエンドソーム脱出モチーフである^９２ＷＹＷ^９４を^９２ＡＡＡ^９４に突然変異させ、ＶＨ－ＣＤＲ３に存在するエンドソーム脱出モチーフである^９５ＷＹ^９５Ａを９５ＡＡＡ^９８に突然変異させたｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶの模式図である。

【0177】

具体的に、本発明におけるｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ抗体は、ｉｎＣＴ９９抗体のＶＬ－ＣＤＲ３に存在するエンドソーム脱出モチーフである^９２ＷＹＷ^９４が^９２ＡＡＡ^９４に突然変異しており、ＶＨ－ＣＤＲ３に存在するエンドソーム脱出モチーフである^９５ＷＹ^９５Ａが９５ＡＡＡ^９８に突然変異している。したがって、インテグリンαｖβ３とαｖβ５受容体に結合して内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）したｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ抗体はエンドソームを脱出できないため細胞質浸透がされず、細胞表面にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを提示することができない。

【0178】

図２Ｂは、セツキシマブ抗体の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）領域のＣ末端にＧ_４Ｓリンカーを介してウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを融合させたセツキシマブ†ＣＭＶの模式図である。

【0179】

具体的に、本発明におけるセツキシマブ†ＣＭＶ融合抗体は、ＥＧＦＲを標的するセツキシマブにＣＭＶを融合させた抗体であって、ＥＧＦＲに結合して内在化した後にリソソームを経て分解されるため、細胞質浸透による細胞表面にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを提示する機能がない。

【0180】

図２Ｃは、ネシツムマブ抗体の重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）領域のＣ末端にＧ_４Ｓリンカーを介してウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドを融合させたネシツムマブ†ＣＭＶの模式図である。

【0181】

具体的に、本発明におけるネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体は、ＥＧＦＲを標的するネシツムマブにＣＭＶを融合させた抗体であって、ＥＧＦＲに結合して内在化した後にリソソームを経て分解されるため、細胞質浸透による細胞表面にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを提示する機能がない。

【0182】

実施例３．細胞質浸透能を有するｉｎＣＴ９９とｉｎＣＴ９９†ウイルスエピトープ融合抗体及び細胞質浸透能のない対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ、セツキシマブ†ＣＭＶ及びネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体の発現及び精製
ｉｎＣＴ９９†ウイルスエピトープ融合抗体が癌細胞にウイルス由来Ｔ細胞エピトープを提示してウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させることができるかを確認するために、ｉｎＣＴ９９抗体及びｉｎＣＴ９９抗体の重鎖領域のＣ末端にウイルス由来エピトープペプチド又はこのペプチドのＮ末端、Ｃ末端又はＮ末端とＣ末端の両方が延長されたペプチドが融合したｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ及びｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ融合抗体を構築して発現、精製させた。

【0183】

図３は、ｉｎＣＴ９９抗体とｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ、ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ、ｉｎＣＴ９９†ＥＢＶ及びｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ融合抗体を動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）で発現させるためのベクターの模式図であり、
図３Ａは、細胞質浸透抗体であるｉｎＣＴ９９抗体の重鎖定常部位にウイルス抗原由来エピトープペプチドが融合したｉｎＣＴ９９†ウイルスペプチド融合抗体の重鎖発現ベクターの模式図であり、
図３Ｂは、ｉｎＣＴ９９抗体及びｉｎＣＴ９９†ウイルスペプチド融合抗体の軽鎖発現ベクターの模式図である。

【0184】

具体的に、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３融合抗体の重鎖発現ベクターを取り上げて説明すれば、５’末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合したＲＴ２２－０１重鎖に基づいてＣ末端にＧ_４Ｓリンカーを用いて遺伝工学的にＣＭＶｐタンパク質の４９５番～５０３番アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と融合するように合成オリゴヌクレオチド（Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｋｏｒｅａ）をデザインし、ＤＮＡ切片をＰＣＲ手法で構築して、動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４にＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素でクローニングした。また、構築した前記ＣＭＶ融合重鎖に基づいて、ＣＭＶｐペプチドを含むタンパク質切片に該当する４８０番～５０３番アミノ酸配列を融合させるための合成オリゴヌクレオチドをデザインし、前記のようにクローニングした。

【0185】

図４は、対照群抗体であるセツキシマブ†ＣＭＶとネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体を動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）で発現させるためのベクターの模式図であり、
図４Ａは、セツキシマブ†ＣＭＶ融合抗体の重鎖発現ベクターの模式図であり、
図４Ｂは、セツキシマブ†ＣＭＶ融合抗体の軽鎖発現ベクターの模式図である。

【0186】

具体的に、セツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体の重鎖発現ベクターを取り上げて説明すれば、セツキシマブ抗体の重鎖定常領域のＣ末端にＣＭＶｐタンパク質由来のＴ細胞抗原エピトープペプチド及びこれを含むタンパク質切片を融合させたセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体を生産するための重鎖発現ベクターを構築するために、５’末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合したセツキシマブ重鎖に基づいてＣ末端にＧ_４Ｓリンカーを用いて遺伝工学的にＣＭＶｐタンパク質の４８０番～５０３番アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と融合するように合成オリゴヌクレオチド（Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｋｏｒｅａ）をデザインし、ＤＮＡ切片をＰＣＲ手法で構築して動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４にＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素でクローニングした。また、構築した前記ＣＭＶ融合重鎖に基づいて、ＣＭＶｐペプチドを含むタンパク質切片に該当する４８０番～５０３番アミノ酸配列を融合させるための合成オリゴヌクレオチドをデザインし、前記のようにクローニングした。既存ＡＰＥＣｓ技術の代表抗体であるセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３の構築のために、セツキシマブ重鎖のＣ末端にＧ_４ＳリンカーをＧ_４ＳＭＭＰ１４リンカー（Ｇ_４ＳＰＲＳＡＫＬＥＲ）に交替したＣＭＶ融合重鎖も合成オリゴヌクレオチドをデザインして前記のように構築した。

【0187】

図４Ｃは、ネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体の重鎖発現ベクターの模式図であり、
図４Ｄは、ネシツムマブ†ＣＭＶ融合抗体の軽鎖発現ベクターの模式図である。

【0188】

具体的に、ネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体の重鎖発現ベクターを取り上げて説明すれば、ネシツムマブ抗体の重鎖定常領域のＣ末端にＣＭＶ ｐｐ６５タンパク質由来のＴ細胞抗原エピトープペプチド及びこれを含むタンパク質切片を融合させたネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体を生産するための重鎖発現ベクターを構築するために、５’末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合したネシツムマブ重鎖に基づいてＣ末端にＧ_４Ｓリンカーを用いて遺伝工学的にＣＭＶｐタンパク質の４８０番～５０３番アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と融合するように合成オリゴヌクレオチド（Ｍａｃｒｏｇｅｎ，Ｋｏｒｅａ）をデザインし、ＤＮＡ切片をＰＣＲ手法で構築して動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４にＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素でクローニングした。また、構築した前記ＣＭＶ融合重鎖に基づいて、ＣＭＶｐペプチドを含むタンパク質切片に該当する４８０番～５０３番アミノ酸配列を融合させるための合成オリゴヌクレオチドをデザインし、前記のようにクローニングした。

【0189】

ｉｎＣＴ９９－ウイルスペプチド抗体及びｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）／セツキシマブ／ネシツムマブ－ウイルスペプチド抗体を一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いてタンパク質を発現及び精製し、収率を比較した。

【0190】

具体的に、振盪フラスコにおいて、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地で浮遊成長するＨＥＫ２９３Ｆ細胞をプラスミド及びポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，ＰＥＩ）の混合物にトランスフェクションした。振盪フラスコに２００ｍＬトランスフェクション時に、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を２．０×１０^６細胞／ｍｌの密度で培地１００ｍｌに播種し、１２０ｒｐｍ、８ ＣＯ_２、３７℃で培養した。抗体を生産するに適する重鎖と軽鎖プラスミドを１０ｍｌ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地に重鎖１２５μｇ、軽鎖１２５μｇの合計２５０μｇ（２．５μｇ／ｍｌ）で希釈及びフィルターしてＰＥＩ７５０μｇ（７．５μｇ／ｍｌ）を希釈した１０ｍｌの培地と混合した後、室温で１０分間反応させた。その後、反応させた混合培地を、先に１００ｍｌで播種した細胞に入れて４時間、１２０ｒｐｍ、８ ＣＯ_２で培養後、残り１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地を追加して６日間培養した。標準プロトコルを参照して採取した細胞培養上澄液からタンパク質を精製した。タンパク質Ａセファロースカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ）に抗体を適用し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。０．１Ｍグリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を用いてｐＨ３．０で抗体を溶離した後、１Ｍトリス（ｐＨ９．０）緩衝液を用いてサンプルを直ちに中和した。溶離した抗体分画は、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５ｍＭヒスチジン、１２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）緩衝液に交換しつつ３０Ｋ遠心分離フィルターチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて濃縮を行った。精製されたタンパク質は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ）内溶液を用いて５６２ｎｍ波長で吸光度を測定し、描かれた標準曲線に従ってその量を定量した。

【0191】

下表のように得られたｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ、ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ及びｉｎＣＴ９９†ＥＢＶ融合抗体及び対照群抗体の収率は、タンパク質切片の種類とその長さによって異なっている。

【0192】

【0193】

【0194】

図５は、ｉｎＣＴ９９†ウイルスペプチド融合抗体を動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）で発現及び精製させた後、３μｇのタンパク質を還元性又は非還元性条件のＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、クマシ－ブルー染色を用いて大きさ及び組合せ形態で分析した結果であり、
図５Ａは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体に対する結果であり、
図５Ｂは、ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ融合抗体に対する結果であり、
図５Ｃ及び図５Ｄは、ｉｎＣＴ９９†ＥＢＶ融合抗体に対する結果である。

【0195】

具体的には、上記で精製されたｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体とｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ融合抗体及びｉｎＣＴ９９†ＥＢＶ融合抗体３μｇを１２％非還元性条件でＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、クマシ－ブルー染色を用いて大きさ及び組合せ形態を分析した。

【0196】

その結果、非還元性条件で、ｉｎＣＴ９９は約１５０ｋＤａの分子量が確認されたし、還元性条件で重鎖５０ｋＤａの分子量及び軽鎖２５ｋＤａの分子量を示した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析から、発現精製された個別クローンが溶液状態で殆ど単一体として存在し、非還元性条件でｉｎＣＴ９９及びｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体クローンは、インテグリン標的環状ペプチドによる少量のオリゴマーを形成することを確認した。また、融合抗体の場合、還元性条件で重鎖に融合したタンパク質のため、５０ｋＤａ以上の分子量として観察された。しかし、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０６、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０７、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０８、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０９、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１１、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１２、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１３抗体の場合、一部の重鎖に融合したペプチドの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）が観察された。

【0197】

ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶとｉｎＣＴ９９†ＥＢＶ融合抗体の場合、発現精製された個別クローンが溶液状態で殆どが単一体として存在することを確認した。

【0198】

実施例４．ペプチド／ＭＨＣ－Ｉ複合体を検出するためのＴ細胞受容体様抗体の検証
本発明で使用されたｉｎＣＴ９９†ウイルスペプチド抗体は、ｉｎ４環状ペプチドがαｖβ３とαｖβ５を標的し、ＨＬＡ－Ａ２に結合するウイルスエピトープが融合しているため、前記抗体がウイルスエピトープを癌細胞の表面に提示するには、癌細胞は様々なＭＨＣ－Ｉ分子のうちＨＬＡ－Ａ２を発現しなければならなく、ｉｎ４環状ペプチドが標的するαｖβ３とαｖβ５が発現している必要がある。

【0199】

図６は、ヒト癌細胞株４種に対して週組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉの遺伝子型のうちＨＬＡ－Ａ２と癌細胞表面抗原のうちインテグリンανβ５／ανβ３の発現を流細胞分析機で分析した実験結果である。

【0200】

具体的に、各サンプル当たり２×１０^５個のＭａｌｍｅ－３Ｍ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＣＴ１１６、及びＬｏｖｏ細胞を準備した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ緩衝液、２％ ＦＢＳ）に抗ＨＬＡ－Ａ２抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）又は抗インテグリンανβ５抗体又は抗インテグリンανβ３抗体を１：１００に希釈して入れ、４℃で１時間反応させた。その後、各サンプルを１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的認知する抗体を１：６００に希釈して４℃条件で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に流細胞分析機で各細胞表面のタンパク質発現量を測定した。

【0201】

その結果、前記全ての細胞はインテグリンανβ５を発現し、インテグリンανβ３はＭａｌｍｅ－３Ｍ以外の３つの細胞株でほとんど発現しなかった。

【0202】

ＨＬＡ－Ａ２の発現は、Ｍａｌｍｅ－３Ｍが最も高く、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＣＴ１１６の順であった。Ｍａｌｍｅ－３Ｍは、ＨＬＡ－Ａ２の発現量が最も高かったが、成長速度が遅すぎるため、ＨＬＡ－Ａ２の発現量が相対的に高いＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を用いて主に実験を行った。ＨＬＡ－Ａ２遺伝型でないＬｏｖｏは、ＨＬＡ－Ａ２の発現が観察されなく、陰性対照群として用いられた。

【0203】

Ｔ細胞受容体様抗体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、細胞傷害性Ｔ細胞抗原エピトープペプチドとＭＨＣ－Ｉ複合体を認知して結合できるＴ細胞受容体と類似の特異性を有する単一クローン抗体である。一般に、分治療用抗体が細胞表面に発現したタンパク質を標的するか、抗体を細胞内発現して細胞内タンパク質を標的する戦略を取っているため、細胞内タンパク質が標的し難い。細胞内タンパク質は、プロテアソームによって８～１１個のアミノ酸からなるペプチドに分解された後に小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，ＥＲ）内に伝達され、ＭＨＣ－Ｉ、ベータ－２－マイクログロブリン（β２－Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）と複合体をなしてゴルジ（Ｇｏｌｇｉ）を通じて細胞表面に提示されるため、ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体を特異的に認知できる様々なＴ細胞受容体様抗体が報告された。そこで、ｉｎＣＴ９９†ウイルスペプチド融合抗体を用いて、Ｔ細胞抗原エピトープペプチドを含むウイルス及び癌抗原由来タンパク質を細胞内に伝達した後、細胞表面にペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体形態で提示されるかを確認するための実験のために、ペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体を特異的に認知できる様々なＴ細胞受容体様抗体を構築した。

【0204】

ＣＭＶウイルス抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープペプチドであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３とＨＬＡ－Ａ２の複合体を検出するＴＣＲ様（ＴＣＲ－ｌｉｋｅ）抗体は、Ｈ９である。しかし、Ｈ９抗体の親和度は３００ｎＭと報告されており、予備実験においてＨ９抗体は癌細胞においてｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体処理後に細胞表面に提示されるペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体を認知できなかった。したがって、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチド－ベータ－２－マイクログロブリン（β２－Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１をペプチドリンカーを介してＳＣＴ（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｔｒｉｍｅｒ）の形態で作ったタンパク質（Ｓｃｈｍｉｔｔｎａｅｇｅｌ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１６）を抗原として使用してＨ９抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列にライブラリーを与え、親和度を向上させた。Ｈ９抗体を用いた１次親和度向上実験においてＨ９＃１とＨ９＃３８を選定し、Ｈ９＃１を用いた２次親和度向上実験においてＣ１－１７を選定した。最終的に選ばれたＣ１－１７を構築、精製してｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体処理後に、細胞表面にＣＭＶペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体を提示する能力を分析するために利用した。

【0205】

ＨＰＶウイルスエピトープとＨＬＡ－Ａ２の複合体を分析するＴＣＲ様（ＴＣＲ－ｌｉｋｅ）抗体としては７－１を構築、精製して使用し、ＥＢＶウイルスエピトープとＨＬＡ－Ａ２の複合体を分析するＴＣＲ様（ＴＣＲ－ｌｉｋｅ）抗体としてはＬ２を構築、精製して使用した。

【0206】

図７は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体の発現ベクターの模式図及び精製後の大きさ及び組合せ形態を分析した結果であり、
図７Ａは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体の発現ベクターの模式図であり、
図７Ｂは、Ｈ９、Ｈ９＃１とＨ９＃３８抗体を動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）で発現及び精製させた後、３μｇのタンパク質を還元性又は非還元性条件のＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、クマシ－ブルー染色を用いて大きさ及び組合せ形態で分析した結果であり、
図７Ｃは、Ｃ１－１７抗体を図７Ｂと同じ方法で分析した結果であり、
図７Ｄは、７－１とＬ２抗体を図７Ｂと同じ方法で分析した結果である。

【0207】

具体的に、ＣＭＶ ｐｐ６５由来４９５－５０３番ペプチドとＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子の複合体であるＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を特異的に認知する単一クローン抗体であるＨ９、Ｈ９＃１とＨ９＃３８及びＣ１－１７クローンのヒト重鎖可変領域（ＶＨ）とヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列は、遺伝子合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）によって準備した。

【0208】

ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質由来１１－１９番ペプチドとＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝型がなす複合体であるＨＰＶ Ｅ１１－１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を特異的に認知する単一クローン抗体である７－１クローン（ＷＯ２０１６／１８２９５７，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＨＰＶ１６－Ｅ７ ｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）のヒト重鎖可変領域（ＶＨ）とヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列を遺伝子合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）によって準備した。

【0209】

ＥＢＶのＬＭＰ２タンパク質由来４２６－４３４番（ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ）ペプチド又はＳＬＧＧＬＬＴＭＶペプチドとＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝型がなす複合体を特異的に認知する単一クローン抗体であるＬ２クローン（ＷＯ２０１５／１９９６１８，Ｅｐｓｔｅｉｎ－ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ＬＭＰ２ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）は、抗原をマウスに免疫した後、ハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を作製して得たマウス単一クローン抗体である。Ｌ２抗体のヒト重鎖可変領域（ＶＨ）とヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列は、遺伝子合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）によって準備した。

【0210】

ＶＨ遺伝子を、重鎖定常領域がマウスイムノグロブリンＧ ２ａである重鎖にＰＣＲ手法を用いてＤＮＡ切片を作製し、ＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４にＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素でクローニングし、ＶＬ遺伝子を、軽鎖定常領域がマウスカッパ定常領域である軽鎖に前記と同じ方法でクローニングし、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体を構築した。これは、ｉｎＣＴ９９及びｉｎＣＴ９９融合抗体を処理した後、流細胞分析機（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）でペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体を分析する時、マウスＦｃ領域を認知する蛍光が連結された２次抗体を使用して、ｉｎＣＴ９９抗体のヒトＦｃ領域に結合することを防止し、Ｔ細胞受容体様抗体の結合のみを分析するためである。

【0211】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体はいずれも、動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）で発現及び精製させた。

【0212】

具体的に、振盪フラスコにおいて、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地で浮遊成長するＨＥＫ２９３Ｆ細胞をプラスミド及びポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，ＰＥＩ）の混合物にトランスフェクションした。振盪フラスコに１００ｍＬトランスフェクション時に、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を２．０×１０^６細胞／ｍｌの密度で培地５０ｍｌに播種し、１２０ｒｐｍ、８ ＣＯ_２、３７℃で培養した。抗体を生産するに適する重鎖と軽鎖プラスミドを１０ｍｌ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地に重鎖６２．５μｇ、軽鎖６２．５μｇの合計１２５μｇ（２．５μｇ／ｍｌ）で希釈及びフィルターし、ＰＥＩ ３７５μｇ（７．５μｇ／ｍｌ）を希釈した１０ｍｌの培地と混合した後、室温で１０分間反応させた。その後、反応させた混合培地を、先に５０ｍｌに播種した細胞に入れて４時間１２０ｒｐｍ、８ ＣＯ_２で培養後、残り５０ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地を追加して６日間培養した。標準プロトコルを参照して採取した細胞培養上澄液からタンパク質を精製した。タンパク質Ａセファロースカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ）に抗体を適用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。０．１Ｍグリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を用いてｐＨ３．０で抗体を溶離した後、１Ｍトリス（ｐＨ９．０）緩衝液を用いてサンプルを直ちに中和した。溶離した抗体分画はＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて２５ｍＭヒスチジン１２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）緩衝液に交換し、３０Ｋ遠心分離フィルターチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて濃縮を行った。精製されたタンパク質はＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ）内溶液を用いて５６２ｎｍ波長で吸光度を測定し、描かれた標準曲線に従ってその量を定量した。

【0213】

上記で精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体は３μｇを１２％非還元性条件でＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離し、クマシ－ブルー染色を用いて大きさ及び組合せ形態を分析した。

【0214】

その結果、非還元性条件でＨ９、Ｈ９＃１、Ｈ９＃３８、Ｃ１－１７、７－１とＬ２抗体はいずれも少量のオリゴマーを形成することを確認したが、殆どが単一体として存在することを確認した。

【0215】

図８は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の発現程度が異なる癌細胞株を用いてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体のペプチド／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体に対する結合能を流細胞分析機（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した実験結果であり、
図８Ａは、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドをバルスした癌細胞から、Ｈ９、Ｈ９＃１及びＨ９＃３８抗体のＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体に対する結合能を測定した結果である。

【0216】

具体的に、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の発現程度が異なるＭａｌｍｅ－３Ｍ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋＋）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋＋）、ＨＣＴ１１６（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋）、及びＬｏｖｏ（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－）、細胞を、３．０×１０^５細胞／ｍｌの密度で１０％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれたＲＰＭＩ培地に準備し、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドとＨＰＶ_Ｅ１１－１９ペプチドを含み、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１と複合体を形成できる様々な合成ペプチド（Ａｎｙｇｅｎ，Ｋｏｒｅａ）を５０μＭの濃度となるように入れ、５％ ＣＯ_２、３７℃で３時間反応させた。ペプチドを処理していない陰性対照群は、ＤＭＳＯを入れた。３時間後に１３００ｒｐｍで３分間遠心分離して、細胞に結合していないペプチドが含まれた上澄液を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に１３００ｒｐｍで３分間遠心分離して上澄液を除去した。各サンプル当たり１．５×１０^５個の細胞となるように準備し、上記で発現及び精製して得たＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を特異的に認知する単一クローン抗体であるＨ９、Ｈ９＃１及びＨ９＃３８抗体を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液にそれぞれ１０ｎＭの濃度となるように希釈して入れ、４℃で１時間反応させた。その後、各サンプルを１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７（赤色蛍光）が連結されたマウスＦｃを特異的認知するＦ（ａｂ’）_２抗体を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に１：１２００に希釈し、４℃組件で３０分間反応させた。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に流細胞分析機で分析した。

【0217】

その結果、Ｈ９の１次親和度向上で得られたＨ９＃１抗体は、５ｎＭの濃度を処理しても、５００ｎＭのＨ９抗体に比してＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体をよりよく認知した。したがって、Ｈ９＃１とＨ９＃３８抗体がＨ９抗体に比して、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が処理された癌細胞でＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体をよく認知できるかを検証しようとした。

【0218】

図８Ｂは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を、Ｈ９＃１及びＨ９＃３８抗体を用いて分析した結果である。

【0219】

具体的に、２４ウェルプレートに、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を、ウェル当たり２．０×１０^５細胞／ｍｌの密度で１０％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれたＲＰＭＩ培地に希釈して１２時間、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で培養した後、培地を除去し、ｉｎＣＴ９９、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３、ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ_Ｅ１－１９融合抗体を４μＭの濃度となるように５００μｌの培地に希釈し、１８時間、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で培養した。その後、培地を除去してＤＰＢＳで洗浄した後、ウェル当たり１００μｌのトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ）溶液を３分間３７℃で処理して細胞をプレートから剥がした。ウェル当たり１０％ ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ培地を１ｍｌずつ入れてトリプシン－ＥＤＴＡを中和させ、細胞を回収して１３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を除去した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液１ｍｌで洗浄し、遠心分離して上澄液を除去した。ウェル当たり細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液３００μｌで懸濁して６個のサンプルに分け、一つのサンプルは２次抗体単独対照群として使用した。各サンプルに、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液にＨ９＃１とＨ９＃３８の濃度が５０ｎＭとなるようにし、４℃で１時間反応させた。その後、各サンプルを１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７（赤色蛍光）が連結されたマウスＦｃを特異的認知するＦ（ａｂ’）_２抗体を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に１：６００に希釈し、４℃条件で３０分間反応させた。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に流細胞分析機で分析した。

【0220】

Ｈ９抗体は、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が細胞内抗原処理過程によって提示したＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を検出できなかったが、親和度が向上したＨ９＃１とＨ９＃３８クローンは、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を検出した。しかし、種々のｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体のＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体提示能を比較しながら測定するにはＨ９＃１抗体のＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体検出能が低いと判断され、２次親和度向上実験を行ったし、その結果、Ｃ１－１７抗体を得た。

【0221】

図８Ｃは、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドをバルスした癌細胞から、Ｃ１－１７抗体のＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体に対する結合能を測定した結果である。

【0222】

具体的な方法は、図８Ａに記述の通りであるが、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体のＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体提示能を測定しようとするには、少ない量のＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドが癌細胞表面にバルスされても検出できなければならず、バルシングに使用するＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３の濃度を５０ｍＭの代わりに４ｍＭに下げて実施した。

【0223】

その結果、Ｃ１－１７抗体は、癌細胞にＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドを４ｍＭ濃度のみバルスしても、Ｈ９抗体やＨ９＃１抗体に比してＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体をよく検出した。この検出能は、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ２：０１に特異的であるためＨＬＡ－Ａ２：０１が発現していないＬｏｖｏ細胞では検出能がないことが確認された。

【0224】

図８Ｄは、ＨＰＶ_Ｅ１１－１９ペプチドをバルスした癌細胞から、７－１抗体のＨＰＶ_Ｅ１１－１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体に対する結合能を測定した結果であり、
図８Ｅは、ＥＢＶ_Ｌ２４２６－４３４（Ｃ４２６Ｓ）ペプチドをバルスした癌細胞から、Ｌ２抗体のＥＢＶ_Ｌ２４２６－４３４（Ｃ４２６Ｓ）／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体に対する結合能を測定した結果である。

【0225】

具体的な方法は、図８Ａに記述の通りであるが、７－１とＬ２抗体のペプチド／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する特異性は既に文献に報告されたことがあるので、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の発現が相対的に高いＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のみを使用したし、７－１抗体の検出能を評価するためにはＨＰＶ_Ｅ１１－１９ペプチドをバルスし、Ｌ２抗体の検出能を評価するためにはＥＢＶ_Ｌ２４２６－４３４（Ｃ４２６Ｓ）ペプチドを使用した。

【0226】

その結果、７－１抗体とＬ２抗体はそれぞれ、ＨＰＶ_Ｐ１１－１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体とＥＢＶ_Ｌ２４２６－４３４（Ｃ４２６Ｓ）／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を特異的に検出することを確認した。

【0227】

実施例５．ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝型を有する癌細胞株においてｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体及び対照群抗体のＣＭＶＰ４９５－５０３エピトープ提示能評価
構築されたｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合するのか又は細胞内抗原処理過程によってＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を癌細胞表面に提示するのかを評価するために、構築された抗体を癌細胞に添加し、それぞれ４℃と３７℃で反応させた後、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体をＣ１－１７抗体を用いて検出した
図９は、様々なｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体の細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能及び細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を流細胞分析機で分析した結果であり、
図９Ａは、４℃でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体の細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能を分析するための計画表であり、
図９Ｂは、３７℃でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を分析するための計画表であり、
図９Ｃは、様々なｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を図７Ａ及び図７Ｂの方法で処理した後、流細胞分析機で分析した結果である。

【0228】

具体的に、図９Ａは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合するかを測定するための方法であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、３．０×１０^５細胞／ｍｌの密度で１０％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に準備し、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を４μＭの濃度となるように入れ、５％ ＣＯ_２、３７℃で３時間反応させた。この時、陽性対照群は、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドを４μＭ処理し、陰性対照群は、抗体を溶かしたヒスチジン緩衝液を入れた。３時間後に１３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、細胞に結合していない抗体及びペプチドが含まれている上澄液を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に１３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を除去した。各サンプル当たり１．５×１０^５個の細胞となるように準備し、上記で発現及び精製して得たＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を特異的に認知する単一クローン抗体であるＣ１－１７クローンを１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に４ｎＭの濃度となるように希釈して入れ、４℃で１時間反応させた。その後、各サンプルを１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７（赤色蛍光）が連結されたマウスＦｃを特異的認知するＦ（ａｂ’）_２抗体を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に１：１２００に希釈し、４℃条件で３０分間反応させた。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に、流細胞分析機及びｆｌｏｗ ｊｏで分析した。

【0229】

図９Ａの方法で実験した結果、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープペプチドのＮ末端のみが延長された融合抗体であるｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体は、陽性対照群であるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドを処理した群と類似に、細胞表面のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合することが確認できた。しかし、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープペプチドを融合させたｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体とＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープペプチドのＣ末端が延長されたペプチドを融合させたｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ Ｐ４９５－５０８抗体及びペプチドのＮ末端とＣ末端が両方とも延長されたペプチド（４９０－５０８、４８０－５０４、４８０－５０５、４８０－５０６、４８０－５０７、４８０－５０８、４８０－５０９、４８０－５１１、４８０－５１２、４８０－５１３、４８０－５１６、４８０－５１９）が融合抗体の場合にも、細胞表面のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能が無いことが確認できた。

【0230】

具体的に、図９Ｂは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が細胞内抗原処理過程によってＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を癌細胞表面に提示するかを評価するための方法であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１．５×１０^５細胞／ｍｌの密度で１０％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に準備し、２４ウェルプレートに１２時間付着させた後、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を４μＭの濃度となるように入れ、５％ ＣＯ_２、３７℃で１８時間反応させた。この時、陽性対照群は、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドを４μＭ処理し、陰性対照群は、抗体を溶かしたヒスチジン緩衝液を入れた。１８時間後に、抗体が処理された培地を回収し、１ｍｌ ＤＰＢＳで洗浄した後、イエローチップ（ｙｅｌｌｏｗ ｔｉｐ）で掻いて、底についたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を回収し、１ｍｌ ＤＰＢＳに懸濁させた後、１３００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞に結合していない抗体及びペプチドが含まれている上澄液を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に１３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を除去した。各サンプル当たり１．５×１０^５個の細胞となるように準備し、上記で発現及び精製して得たＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を特異的に認知する単一クローン抗体であるＣ１－１７クローンを、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に４ｎＭの濃度となるように希釈して入れ、４℃で１時間反応させた。その後、各サンプルを１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７（赤色蛍光）が連結されたマウスＦｃを特異的認知するＦ（ａｂ’）_２抗体を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に１：１２００に希釈し、４℃条件で３０分間反応させた。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に、流細胞分析機及びｆｌｏｗ ｊｏで分析した。

【0231】

その結果、陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ９９抗体は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の表面にＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を提示できなかった。しかし、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープペプチドのＮ末端のみ延長された融合抗体であるｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体とＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープペプチドのＮ末端とＣ末端が両方とも延長されたペプチドが融合した抗体のうちｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１１、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１９抗体は、細胞質浸透後に細胞内抗原処理過程によって生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープが細胞表面に提示され、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の表面にＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を提示することが分かった。

【0232】

ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープペプチドのＮ末端のみ延長された融合抗体であるｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体は、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合するか、細胞質浸透後に細胞内抗原処理過程によって生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープが細胞表面に提示されることもあった。ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体の癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能がＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドの癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能のためであるかを評価するために、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３及びセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体の、４℃で細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能と３７゜Ｃ細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を評価した。

【0233】

図９Ｄは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体と対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３及びセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体を、上述した図９Ａ及び図９Ｂの方法で処理した後、流細胞分析機で分析した結果である。

【0234】

図９Ａの方法でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体及びＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドの、４℃で癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能を測定した結果、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープペプチドのＮ末端のみ延長されたＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドは、９ｍｅｒ Ｔ細胞エピトープペプチドであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドに比して高い癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能を示した。また、ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドが融合したｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体はいずれも、４℃で癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能を示した。したがって、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体の癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能は、ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドの癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能のためであると解釈される。

【0235】

図９Ｂの方法でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体の３７℃で細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を評価した結果、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体は、３７℃で１８時間ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞に処理する間に内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後に分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）され、４℃で反応した時に比べて低いレベルのＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体が癌細胞表面から検出された。しかし、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体は、３７℃で１８時間ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞に処理する間に内在化した後に細胞内抗原処理過程によってＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を癌細胞表面に提示し、４℃でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体を処理した群又は３７℃で陽性対照群であるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドを処理した群と類似な程度のＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体が検出できた。したがって、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体は、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合することもあるが、殆どが、融合抗体の細胞質浸透後に、細胞内抗原処理過程に生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープが細胞表面に提示されることを確認した。

【0236】

ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合しなく、内在化した後に細胞内抗原処理過程によってＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を癌細胞表面に提示することを立証するために、４℃で癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能のない抗体であるｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０とｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６融合抗体に対する陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０、セツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０、ｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６、ネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体を用いて、３７℃で細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を評価した。

【0237】

図９Ｅは、上述した図９Ｂの方法でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０融合抗体、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０抗体の３７℃で細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を評価した結果であり、
図９Ｆは、上述した図９Ｂの方法でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６融合抗体、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体の３７℃で細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を評価した結果である。

【0238】

その結果、３７℃で１８時間ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞に処理する間に内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後に分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）なる対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０、セツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０、ｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６、セツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体はいずれも、Ｔ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力がなかった。これに対し、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０とｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６融合抗体は、３７℃で１８時間ＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞に処理する間にいずれも内在化した後、細胞内抗原処理過程によってＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を癌細胞表面に提示した。

【0239】

したがって、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体は、融合するＴ細胞抗原エピトープペプチドの種類によって、癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合することもあるが、癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合する能力のないＴ細胞抗原エピトープペプチドを融合させたｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体は、内在化した後、細胞内抗原処理過程によってＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を癌細胞表面に提示することを確認した。

【0240】

実施例６．ＨＬＡ－Ａ＊０２遺伝子型である血液供与者のＰＢＭＣのＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の比率及び表現型の分析
本発明における“ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞”は、ＣＭＶｐタンパク質由来の４９５－５０３番ペプチド－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を特異的に認知するＴ細胞受容体を発現させる細胞傷害性Ｔ細胞を意味する。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝型であるＣＭＶ感染経験がおる人の末梢血液単核細胞中には、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞が記憶Ｔ細胞の形態で人ごとに異なる割合で存在していると知られている。記憶Ｔ細胞は、表現型マーカーＣＤ４５ＲＯを発現し、ＣＤ６２リガンドの発現によって中心記憶Ｔ細胞（Ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ，ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ８^＋）及び効果器記憶Ｔ細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ，ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ６２Ｌ^－ＣＤ８^＋）に分類できる。ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、たいてい、効果器記憶Ｔ細胞に及び最終分化した効果器記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＥＭＲＡ）に分化しているため、２次的抗原露出時に速くグランザイムＢ、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）などのような効果器物質（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を生産することができる。また、共同刺激分子（Ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）であるＣＤ２７及びＣＤ２８は、ＣＤ２７^＋ＣＤ２８^＋である“初期（ｅａｒｌｙ）”表現型から、抗原刺激を受けてＣＤ２８とＣＤ２７の発現を順次に失いながら分化（活性化）が始まり、中間（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）、後期（ｌａｔｅ）段階へと進行する。またねＣＤ２８及びＣＤ２７発現の喪失と同時に、溶解の（ｌｙｔｉｃ）サイトカイン（パーフォリン、グランザイムＢ）の発現が高まる効果器表現型を有する。また、抗原の持続的な刺激の結果として疲弊（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）マーカーのうちＰＤ－１の発現が誘導され得るが、これは、ウイルス感染細胞及び癌細胞表面で発現するＰＤ－Ｌ１分子と結合によって抗原特異的な細胞の活性化を抑制する。また、恒常的増殖（Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）マーカーであるＣＤ１２７の発現によって抗原刺激無しにも持続の分裂能を有するかどうかが分かる。したがって、健康な血液供与者から得たＰＢＭＣに含まれたＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の比率及び表現型を実際に確認しようとした。

【0241】

図１０は、健康な血液供与者から採血した血液から分離した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を用いて染色してＨＬＡ－Ａ下位遺伝子型であるＨＬＡ－Ａ２の発現、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチド刺激前後のＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の比率及び表現型を分析した結果であり、
図１０Ａは、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のＨＬＡ－Ａ下位遺伝子型であるＨＬＡ－Ａ２の発現を流細胞分析機で分析した結果である。

【0242】

具体的に、人体由来物研究同意書に署名した健康な血液供与者から血液を３０ｍｌずつ採血し、血清（ｓｅｒｕｍ）を分離するために１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上層部の血清は、血球が混ざらないように別に取って－２０℃に保管しておいた。ＰＢＭＣを分離するために、５０ｍｌ試験管にＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１５ｍｌを満たした。血清を除去した血液は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と１：１に混ぜて振った後、３０ｍｌのみを取って丁寧に、Ｆｉｃｏｌｌが入っている試験管にＦｉｃｏｌｌと混ざらないように流し入れ、常温、７５０ｘｇ条件で２０分間、中断のない（ｎｏ ｂｒｅａｋ）状態で遠心分離した。その後、Ｆｉｃｏｌｌ上に形成されたバッフィーコート（白血球層）を回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び単球を含むＰＢＭＣを得た。９０％ ＦＢＳ、１０％ ＤＭＳＯ凍結溶液を用いてＰＢＭＣをバイアル当たりに５．０×１０^６～１．０×１０^７個に凍結コンテナに入れて凍結させた後、超低温凍結（－１９６℃液体窒素）させて保管した。ＰＢＭＣをサンプル当たりに２．０×１０^５個準備し、ＰＥが結合した抗ＨＬＡ－Ａ２抗体又はＰＥが結合した抗マウスＩｇＧ２ｂを１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に１：１００に希釈し、４℃条件で３０分間反応させた。その後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に流細胞分析機で分析した結果、６０人支援者の３３人である５５％が抗ＨＬＡ－Ａ２抗体で染色され、ＨＬＡ－Ａ＊０２遺伝子型を有することを確認した。

【0243】

図１０Ｂは、ＨＬＡ－Ａ２遺伝子型を有する健康な血液供与者のＰＢＭＣを、Ｔ細胞抗原エピトープであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドで刺激して１０～１４日間増幅させた後、リンパ球又はＣＤ８^＋Ｔ細胞中の、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の比率を流細胞分析機で分析した結果であり、
図１０Ｃは、図１０Ｂで増幅させたＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞の分化段階及び抗原の表現型を流細胞分析機で分析した結果である。

【0244】

具体的に、ＰＢＭＣをＴ細胞抗原エピトープであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドで刺激するために、超低温凍結保存されていた供与者のＰＢＭＣを３７℃水槽で迅速に溶かした後、１０％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に入れ、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上澄液を除去し、ＰＢＭＣを、２％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）が含まれているＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ、スイス）で洗浄した後、遠心分離して上澄液を除去した。ＰＢＭＣを２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように２％ヒト血清が添加されたＸ ｖｉｖｏ培地にＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチド（５μｇ／ｍｌ）濃度でバルス（ｐｕｌｓｉｎｇ）させて１４ｍｌ Ｕ底チューブ（ＳＰＬ）で５％ ＣＯ_２、３７℃条件で培養した。３日後にＵ底チューブを１５００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上澄液を除去し、組換えヒトインターロイキン－２（２００ＩＵ／ｍｌ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）と％ヒト血清が添加されたＸ ｖｉｖｏ培地を入れて懸濁させた後、２４ウェルプレートに２×１０^６ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ｗｅｌｌとなるようにシード（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。培養期間６日目から２日に１回ずつＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα（０．５ｎＭ）、ＩＬ－２（２００ＩＵ／ｍｌ）と２％ヒト血清が添加されたＸ ｖｉｖｏ培地に交替した。この時、細胞の密度は２．０×１０^６個／ウェルと保ちながら再懸濁してウェルを増やしつつ増幅させた。１０～１４日目になった時、増幅させた細胞のＣＭＶｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の比率及び表現型を確認するために、下記の方法でＦＡＣＳ染色を行った。

【0245】

各サンプル当たり５．０～７．０×１０^５個／５０μｌとなるように準備し、ＰＥが結合したＣＭＶ／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ペンタマー（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ，ＵＫ）を５μｌ入れ、常温で２０分間反応させた。その後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離して上澄液を除去した。サンプル当たりに１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を入れ、共同刺激分子を染色するために、ヒトＣＤ２８を認知するＦＩＴＣが結合した抗体（ｅ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ヒトＣＤ２７を認知するＡＰＣが結合した抗体（ｅ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びヒトＣＤ８を認知するＰｅｒＣＰ－ｅＦｌｕｏｒ７１０が結合した抗体（ｅ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。各抗体は、５μｌずつ入れて混ぜ、４℃条件で３０分間反応させた。その後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に１５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を除去した。細胞に２００μｌの固定溶液（４％パラホルムアルデヒド、ＰＢＳ緩衝液）を入れてよく混ぜた後、４℃条件で３０分間固定させた。その後、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に１５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を除去した。

【0246】

流細胞分析機で分析した結果、Ｔ細胞抗原エピトープであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドで刺激しなかったＰＢＭＣ中のＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋ＣＭＶ／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｐｅｎｔａｍｅｒ^＋）の比率は、０．０４～１．０１％であり、細胞傷害性Ｔ細胞中の、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の比率は、０．１４～５．３４％であった。ＰＢＭＣをＴ細胞抗原エピトープであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドで刺激した後、ＰＢＭＣ中のＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋ＣＭＶ／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ペンタマー＋）の比率は１．０～２５．６％と増加し、細胞傷害性Ｔ細胞中の、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の比率は３．４８～９０．８％と増加した。

【0247】

ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の細胞表現型を分析した結果、Ｔ細胞抗原エピトープであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドで刺激しなかったＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の記憶細胞表現型は、効果器記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＥＭ）又は最終分化（ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）効果器記憶Ｔ細胞（Ｔ_ＥＭＲＡ）であったが、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドで１０～１４日間刺激され後には直ちに活性化され、細胞毒性効果を示すＴ_ＥＭＲＡに分化したことを確認した。リンパ節にホーミングを誘導するＣＣＲ７の発現は低く、腫瘍や炎症組織へのホーミングを誘導するＣＸＣＲ３の発現が高かった。特徴的なことは、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞をＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドで１０～１４日間刺激した後には“疲弊した（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ）”表現型のマーカーであるＰＤ－１の発現が減少していることを確認した。したがって、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、Ｔ細胞抗原エピトープであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドで刺激する場合、直ちに活性化されて細胞毒性効果を示すＴ_ＥＭＲＡに分化して腫瘍組織にホーミングできるので、腫瘍細胞においてｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ抗体を用いてＣＭＶ Ｔ細胞抗原エピトープを提示する場合、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が腫瘍にホーミングして直ちに腫瘍細胞を死滅させることができることが分かる。

【0248】

実施例７．ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞を用いたｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が処理された癌細胞株の細胞死滅誘導能評価
腫瘍細胞においてｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ抗体を用いてＣＭＶ Ｔ細胞抗原エピトープを提示する場合、上記の図１０で増幅させたＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞によって腫瘍細胞が死滅するかを評価するために、様々なｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を処理したＭＤＡ－ＭＢ２３１乳癌細胞のＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞の死滅効果を、ＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）アッセイで分析した。ＬＤＨは細胞内に存在する酵素であって、細胞死滅後培養液で遊離される。

【0249】

図１１は、様々なｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を処理した癌細胞のＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による死滅効果を、ＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）アッセイで分析した結果であり、
図１１Ａは、ＬＤＨアッセイのための抗体及びＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の投与方法を示す計画表であり、
図１１Ｂは、ＬＤＨアッセイの結果を分析したグラフである。

【0250】

具体的に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（０．５×１０^４細胞／１００ｍｌ）を、１０％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に懸濁させ、９６ウェルプレートで１２時間付着させた後、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を０．２～１μＭの濃度となるように入れ、５％ ＣＯ_２、３７℃で培養した。１２時間後に培養上澄液を除去した後、実施例６でＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドでＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を増幅させたＰＢＭＣ（２．５×１０^４細胞／２００ｍｌ）を、効果器細胞：標的細胞の比率が５：１となるように、２％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に懸濁させて添加した。１７時間後に、細胞の最大ＬＤＨ放出制御（ｒｅｌｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％溶解（ｌｙｓｉｓ）基準値と決めるために、標的細胞のみあるウェルにトリトンＸ－１００が０．１％となるように入れた。ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を入れて１８時間後に、各ウェルの細胞培養液に存在するＬＤＨ（Ｌａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の量で細胞死滅程度を定量するために、５０μｌの細胞培養液を９６ウェル平底プレートに移し、ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（Ｉｏｄｏｎｉｔｒｏ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｖｉｏｌｅｔ）基質をウェル当たり５０μｌずつ入れ、３７℃条件で３０分間反応させた。発色が十分にされると、停止溶液をウェル当たり５０μｌずつ入れて反応を中止させ、マイクロプレートリーダを用いて４９０ｎｍでの吸光度を測定した。最大ＬＤＨ放出制御（ｒｅｌｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％細胞溶解として計算した値でグラフを示した。

【0251】

その結果、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の表面にＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を提示する能力が高かったｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１１、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１９抗体が、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の癌細胞死滅誘導効果が高かったし、中でもｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体が高いＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の癌細胞死滅効果を誘導した。

【0252】

実施例８．細胞質浸透能のないｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ、セツキシマブ†ＣＭＶ及びネシツムマブ†ＣＭＶ抗体を用いたｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ抗体の作用機序研究
ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ抗体が細胞質浸透後に細胞内抗原処理過程によってウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを癌細胞表面に提示し、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞によって癌細胞の死滅を誘導することを証明するために、内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後に分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）される対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶとセツキシマブ†ＣＭＶ又はネシツムマブ†ＣＭＶ抗体と共にＬＤＨアッセイを行った。

【0253】

図１２は、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ抗体及び対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶとセツキシマブ†ＣＭＶ及びネシツムマブ†ＣＭＶ抗体を癌細胞に処理した後、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果をＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）アッセイで分析した結果であり、
図１２Ａは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体と対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体を図１１Ａと同じ方法で処理後に、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果をＬＤＨアッセイで分析した結果である。

【0254】

具体的に、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープペプチドのＮ末端のみ延長された融合抗体であるｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３と内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後に分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）される対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体を前記実施例７の図１１Ａと同じ方法で処理後に、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果をＬＤＨアッセイで分析した。

【0255】

その結果、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３の他、内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後に分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）される対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体も、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果を誘導した。この実験において、ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドも、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果を誘導したので、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドの他、ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドも癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合してＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果を誘導することが分かる。したがって、ｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体のＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果を誘導する効果は、ｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）とセツキシマブの重鎖末端に融合したＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドが癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合してＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果を誘導したためと解釈される。

【0256】

対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体は、癌細胞に対する処理時間が長くなるほど内在化による分解が増加するため、培養液内に存在する抗体量の減少によって癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合した抗体の量が減少し、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果が減少することがある。この仮設を証明するために、前記抗体を２４時間処理した後、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅誘導能をＬＤＨアッセイで分析した。

【0257】

図１２Ｂは、前記抗体を２４時間処理した後、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅誘導能をＬＤＨアッセイで分析するための計画表であり、
図１２Ｃは、図１２Ｂの方法でＬＤＨアッセイを行った後、その結果を分析したグラフである。

【0258】

その結果、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体は、１００ｎＭの低い濃度でもＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅を４０％程度誘導したが、ｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体は、１ｍＭの高い濃度でもＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅誘導を２０％程度しか誘導しなかった。したがって、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体は、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合することもあるが、殆どが、融合抗体の細胞質浸透後に生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープが細胞表面に提示され、ＣＴＬによる癌細胞死滅を誘導することが確認された。

【0259】

Ｎ末端とＣ末端が延長されたペプチドが融合したｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ抗体のうち、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の癌細胞死滅誘導効果が高かったｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０とｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体が内在化した後、細胞内抗原処理過程によってＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を癌細胞表面に提示し、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の癌細胞死滅を誘導したことを立証するために、内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後に分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）される対照群抗体と共にＬＤＨアッセイを行った。

【0260】

図１２Ｄは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０と対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０抗体を図１１Ａと同じ方法で処理後に、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果をＬＤＨアッセイで分析した結果である。

【0261】

その結果、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０抗体は、濃度依存的なＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅を誘導したが、ｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０抗体は、５％未満のＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅を誘導した。対照群抗体のこのような効果は、抗体が内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後に細胞質に位置できず、リソソームを経由して分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）されたためと解釈される。また、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープペプチドのＮ末端及びＣ末端が延長されているたため、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合しないｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０融合抗体は、細胞質浸透後に生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープが細胞表面に提示され、ＣＴＬによる癌細胞死滅を誘導することが確認された。

【0262】

図１２Ｅは、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６と対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６とネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体及びセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体を図１１Ａと同じ方法で処理後に、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果をＬＤＨアッセイで分析した結果である。

【0263】

その結果、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体は、ｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０抗体のような傾向で濃度依存的なＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅を誘導したが、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６とネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体は、１００ｎＭの濃度でも５％未満のＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅を誘導した。これに対し、既存ＡＰＥＣｓ技術で使用した抗体であるセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体は、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体に比べて高いＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅を誘導した。これは、試験管内でＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞によって分泌されたＭＭＰ１４酵素がセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体のＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドの前部を切ってＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドを流離させ、Ｔ細胞エピトープペプチドがＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞の表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合することで、前記の効果を示したものと見なされる。

【0264】

前記結果をまとめると、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体は、細胞質浸透後に生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープが癌細胞表面に提示され、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅を誘導することが確認された。

【0265】

実施例９．細胞レベルで先導ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体の作用機序究明
ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体の抗原提示に対する予想作用機序は、癌細胞表面に発現したインテグリンに結合して内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後にエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｅｓｃａｐｅ）能力によって細胞質に位置し、細胞質内でタンパク質分解システムによって生成されたＣＭＶｐエピトープが小胞体に入ってＨＬＡ－Ａ＊０２と複合体を形成し、ゴルジ体を通じて分泌されて癌細胞表面にＴ細胞抗原エピトープであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドを提示するものである。

【0266】

ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体の作用機序が前記予想機序によるものであることを究明するために、プロテアソーム阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるＭＧ１３２とゴルジ阻害剤であるコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）を細胞に処理した後、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を処理し、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＴＬの活性化程度を、ＩＦＮ－ｇ分泌量をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）で測定して定量した。この実験において、ＭＧ１３２とコダゾールの処理によって２０％程度の癌細胞死滅が存在したため、癌細胞死滅誘導能は測定しなかった。

【0267】

図１３は、癌細胞にプロテアソーム阻害剤とゴルジ阻害剤を細胞に処理した後、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を処理し、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ－ｇ分泌量をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）で定量した結果であり、
図１３Ａは、前記分析のための計画表であり、
図１３Ｂは、分析に用いられたＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の純度を流細胞分析機で分析した結果であり、
図１３Ｃは、プロテアソーム阻害剤とゴルジ阻害剤がｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３と対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３及びセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体によるＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ－ｇ分泌に及ぼす影響を、ＥＬＩＳＡで定量した結果である。

【0268】

具体的に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（０．５×１０^４細胞／１００ｍｌ）を、１０％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に懸濁させ、９６ウェルプレートで１１時間付着させた後、プロテアソーム阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるＭＧ１３２（２０ｍＭ）とゴルジ阻害剤であるコダゾール（６．６ｍＭ）を入れ、１時間５％ ＣＯ_２を含有した３７℃培養器で培養した。１時間後、阻害剤が含まれている培地を回収し、新しい培地を入れて洗浄した後に、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体を１μＭの濃度となるように入れ、５％ ＣＯ_２、３７℃で培養した。１２時間後、培養上澄液を除去した後、実施例６でＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドでＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を増幅させたＰＢＭＣ（２．５×１０^４細胞／２００ｍｌ）を、効果器細胞：標的細胞比率が５：１となるように、２％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に懸濁させて添加した。２４時間後に、培養液内のＩＦＮ－γ濃度を測定するために、１００μｌの細胞培養液を回収した。

【0269】

培養液内のＩＦＮ－γ濃度を測定するために、ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にヒトＩＦＮ－γ捕獲抗体を１２時間コートした後、ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ）で洗浄後に、１％ ＢＳＡ（１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ）を入れ、１時間、室温で遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ）で洗浄後、血清を１％ ＢＳＡで１０倍希釈し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ）で洗浄後、ビオチンが結合したヒトＩＦＮ－γ検出抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で１時間結合させた。ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ）で洗浄後、アビジンが結合したＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で３０分間結合させた後、ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ）で洗浄後、ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｋｏｒｅａ）基質を入れ、マイクロプレートリーダを用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

【0270】

その結果、ＭＧ１３２又はコダゾール処理したＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞に、陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３を処理した時には、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌量に変化がなかった。ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体を処理した細胞のＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＴＬのＩＦＮ－γ分泌誘導能は、ＭＧ１３２よりはコダゾール処理によって大きく減少した。これは、細胞内で形成されたＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１と複合体がゴルジ体を通じて分泌され、癌細胞表面にＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗原が提示されることを立証するものである。Ｎ末端のみ延長されたＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープペプチドは、プロテアソームで分解されなくても小胞体でプロセシング（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）が可能なため、Ｎ末端のみ延長されたＣＭＶｐＴ細胞エピトープペプチドが融合したｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体は、プロテアソームではなく小胞体でプロセシングされた後、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１と複合体がゴルジ体を通じて分泌され、癌細胞表面にＣＭＶ特異的な抗原が提示されるものと見なされる。

【0271】

図１３Ｄは、前記阻害をｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６、ｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６及びネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体によるＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ－ｇ分泌に及ぼす影響をＥＬＩＳＡで定量した結果である。

【0272】

具体的に、阻害剤と抗体の処理方法は、上記の図１３Ａに記述した通りである。

【0273】

その結果、陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６とネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６は、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ－ｇ分泌誘導能がなく、ＭＧ１３２又はコダゾール処理した時も同じ傾向を示した。したがって、それらの対照群抗体は、細胞質浸透後に細胞内プロセシングによるウイルス特異的Ｔ細胞抗原生成機能がないことが確認できた。

【0274】

これに対し、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６融合抗体のＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ－ｇ分泌誘導能は、ＭＧ１３２とコダゾール処理によって大きく減少した。これは、細胞質内に位置したｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６融合抗体がプロテアソームによって分解され、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体がゴルジ体を通じて分泌されてＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗原を提示することを示している。

【0275】

実施例１０．ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体の生体内でＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍成長抑制能評価
前記実施例８でＣＭＶ Ｔ細胞エピトープであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドのＮ末端を延長したＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドも癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合し、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果を誘導することを証明した。その結果、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３の他、内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後に分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）される対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体も、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果を誘導した。生体内腫瘍においてもそれらの対照群抗体が癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合してＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による腫瘍形成抑制を誘導できるのか又はｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体と共に細胞質浸透後に生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープが細胞表面に提示されてこそＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による腫瘍形成抑制効果があるのかを評価するために、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１発現があるＭＤＡ－ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞株をマウスの乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）に移植したモデルを構築し、前記抗体の腫瘍形成抑制効果を評価した。

【0276】

図１４は、ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞を乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）に異種移植したＮＳＧマウスにおいてｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体のＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞成長抑制誘導効果を測定した結果であり、
図１４Ａは、前記実験に対して腫瘍移植後の抗体とＩＬ－１５受容体の複合体分子の投与間隔、投与量、投与方法及びＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の投与間隔と方法を示す計画表であり、
図１４Ｂは、上記の図１４Ａの実験において日数によって各抗体投与群の腫瘍体積変化を示すグラフであり、
図１４Ｃは、図１４Ａの実験において抗体最終投与４８時間後にマウスを致死して腫瘍の重さを特定したグラフであり、
図１４Ｄは、図１４Ａの実験において抗体最終投与４８時間後にマウスを致死し腫瘍を摘出した後に取った写真であり、
図１４Ｅは、図１４Ａの実験結果において日数によって各抗体投与群の腫瘍体積変化を１個体のマウスごとに示すグラフである。

【0277】

具体的に、ＭＤＡ－ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞株（５×１０^６細胞）をＤＰＢＳ７５ｍｌに懸濁した後、マトリゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）７５ｍｌと混合してＮＳＧマウスの乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）に移植した後、腫瘍の体積が１００～１２０ｍｍ^３（約２７日後）になった時、マウスを無作為配分（ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）した後、上述した抗体を２０ｍｇ／ｋｇ容量で３日に１回ずつ、腹腔注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。腫瘍細胞移植後２７日、３３日及び３９日目に、融合抗体を投与して６時間後にヒト由来ＣＭＶ ｐｐ６５特異的なＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬｓ，１×１０^７／２００ｍｌ／マウス）を静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。ＮＳＧマウス内でＣＭＶ ｐｐ６５特異的なＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞の増幅のために腫瘍を投与した日から、３日に１回ずつインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）とＩＬ－１５受容体の複合体（１５ｍｇ／２００ｍｌ）を腹腔注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。

【0278】

ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体の生体内腫瘍形成抑制効果を測定するために、陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３、セツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３及びｉｎＣＴ９９抗体と共に前記実験で比較した。その結果、ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドが、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にローデングされ、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ２３１癌細胞死滅を誘導した陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３、セツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体は、ＮＳＧマウス生体内でＭＤＡ－ＭＢ２３１腫瘍成長を抑制する効果がなかった。この結果は、腫瘍内に存在する抗体の量では、ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドが、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にローデングし難いためと解釈される。

【0279】

これに対し、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合することもあるが、殆どが、融合抗体の細胞質浸透後に生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原が癌細胞表面に提示され、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅を誘導するｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体は、前記対照群抗体に比べてＭＤＡ－ＭＢ２３１腫瘍成長を５０％程度抑制した。

【0280】

したがって、腫瘍内でウイルス特異的Ｔ細胞抗原を癌細胞表面に提示するためには、細胞質にＴ細胞抗原が融合した抗体を浸透させ、細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を用いて癌細胞の表面にウイルス特異的な抗原を提示することが重要であるといえる。

【0281】

実施例１１．ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６融合抗体の生体内でＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍成長抑制能評価
前記実施例８でＣＭＶ Ｔ細胞エピトープであるＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドのＮ末端とＣ末端を両方とも延長したＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６ペプチドが融合したｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体は、既存ＡＰＥＣｓ技術で使用した抗体であるセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体に比べて低いＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅を誘導した。しかし、癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接ローデングされ、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果を誘導した対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体は、実施例１０で生体内では腫瘍形成を抑制する効果がなかった。

【0282】

したがって、生体内でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体がセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体に比べてどれくらいの腫瘍形成抑制効果を示すかを比較するために、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１発現があるＭＤＡ－ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞株をマウスの乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）に移植したモデルを構築し、前記抗体の腫瘍形成抑制効果を評価した。

【0283】

図１５は、ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞を乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）に異種移植したＮＳＧマウスにおいて、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６融合抗体のＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞成長抑制誘導効果を、既存ＡＰＥＣｓ技術であるセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体と比較して測定した結果であり、
図１５Ａは、前記実験に対して腫瘍移植後の抗体とＩＬ－１５受容体の複合体分子の投与間隔、投与量、投与方法及びＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の投与間隔と方法を示す計画表であり、
図１５Ｂは、上記の図１５Ａの実験において日数によって各抗体投与群の腫瘍体積変化を示すグラフであり、
図１５Ｃは、図１５Ａの実験において抗体最終投与４８時間後にマウスを致死して腫瘍の重さを特定したグラフであり、
図１５Ｄは、図１５Ａの実験において抗体最終投与４８時間後にマウスを致死し腫瘍を摘出した後に取った写真であり、
図１５Ｅは、図１５Ａの実験結果において日数によって各抗体投与群の腫瘍体積変化を１個体のマウスごとに示すグラフである。

【0284】

具体的に、ＭＤＡ－ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞株（５×１０^６細胞）をＤＰＢＳ７５ｍｌに懸濁した後、マトリゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）７５ｍｌと混合してＮＳＧマウスの乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）に移植した後、腫瘍の体積が１００～１２０ｍｍ^３（約２７日後）になった時、マウスを無作為配分（ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）した後、上述した抗体を２０ｍｇ／ｋｇ容量で３日に１回ずつ、腹腔注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。腫瘍細胞移植後２７日、３３日及び３９日目に、融合抗体を投与して６時間後に、ヒト由来ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞毒性ＣＤ８^＋Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ，１×１０^７／２００ｍｌ／マウス）を静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。ＮＳＧマウス内でＣＭＶ ｐｐ６５特異的なＣＴＬの増幅のために腫瘍を投与した日から、３日に１回ずつインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）とＩＬ－１５受容体の複合体（１５ｍｇ／２００ｍｌ）を腹腔注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。

【0285】

ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体の生体材腫瘍形成抑制効果を測定するために、陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６、ネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６、ｉｎＣＴ９９抗体及びセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶｐ４９５－５０３を共に比較した。

【0286】

その結果、試験管内実験においてＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ２３１癌細胞死滅を誘導効果がなかったｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６、ネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体は、ＮＳＧマウスでもＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍形成を抑制する効果がなかった。しかし、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体は、約６０％程度のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍形成を抑制する効果を示した。特徴的なことは、試験管内実験においてｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体に比べてＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果を誘導する効果が高かったセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体は、生体内ではｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体に比べて低い腫瘍形成抑制効果を示し、特に３匹のマウスにおいてｉｎＣＴ９９対照群抗体処理群と類似な腫瘍の重さを示した。

【0287】

この結果は、前記実施例１０と同様、腫瘍内に存在する抗体の量では、ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドが癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にローデングし難いためと解釈される。

【0288】

したがって、腫瘍内でウイルス特異的Ｔ細胞抗原を癌細胞表面に提示するためには、細胞質に、Ｔ細胞抗原が融合した抗体を浸透させ、細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を用いて癌細胞の表面にウイルス特異的な抗原を提示することが重要であることを確認した。

【0289】

実施例１２．生体内でｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３融合抗体のＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞活性化効果検証
前記実施例１０で検証したｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体のＭＤＡ－ＭＢ２３１腫瘍成長抑制効果が、実際腫瘍内でＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化によるものかを検証した。そのために、腫瘍を移植したマウスに、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体とＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞を１回投与した後、活性化された細胞傷害性Ｔ細胞は、癌細胞を死滅させながら生成される脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７、サイトカインであるＩＦＮ－ｇ、及び活性化された細胞傷害性Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ６９の発現量を測定した。

【0290】

図１６は、ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞を乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）に異種移植したＮＳＧマウスにおいて、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶＰ Ｐ４８０－５０３融合抗体のＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化効果を、対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体と比較して測定した結果であり、
図１６Ａは、前記実験に対して腫瘍移植後の抗体の投与量、投与方法及びＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の投与方法を示す計画表であり、
図１６Ｂは、ＮＳＧマウスに注射するために増幅したＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の比率を流細胞分析機で分析した実験結果であり、
図１６Ｃは、各投与群のマウスを致死して腫瘍浸潤リンパ球を分離し、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のうちＣＤ１０７の発現量とＣＤ６９とＩＦＮ－ｇを発現させるＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の比率を分析した結果である。

【0291】

具体的に、ＭＤＡ－ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞株（５×１０^６細胞）をＤＰＢＳ７５ｍｌに懸濁した後、マトリゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）７５ｍｌと混合してＮＳＧマウスの乳房脂肪パッド（ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄ）に同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）に移植した後、腫瘍の体積が１００～１２０ｍｍ^３（約２７日後）になった時、マウスを無作為配分（ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）した後、上述した抗体を２０ｍｇ／ｋｇ容量で投与した。融合抗体を投与して６時間後に、ヒト由来ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞毒性ＣＤ８^＋Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ，１×１０^７／２００ｍｌ／マウス）を静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。２４時間後にマウスの腫瘍を摘出し、ペトリ皿で金網とコラゲナーゼ（１００μｇ／ｍｌ）を用いて粉砕した後、２％のＦＢＳが含まれている培地１０ｍｌを入れて５０ｇで５分間遠心分離し、実質組織を除去した。その後、赤血球溶血バッファー（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を１ｍｌ入れて赤血球を溶血させた後、ＰＢＳで洗浄して細胞混濁液を得た。腫瘍から分離した細胞を、ＰＥが結合したＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ペンタマーを入れて室温で１５分間染色し、冷たいＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、ＡＰＣが結合したＣＤ８を認知する抗体を入れて４℃で３０分間染色し、冷たいＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。ＣＤ６９とＣＤ１０７の発現量を測定するためには、ＦＩＴＣが結合したＣＤ６９とＣＤ１０７抗体を、ＡＰＣが結合したＣＤ８を認知する抗体と共に入れて染色した後、冷たいＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、流細胞分析機であるＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とＦｌｏｗ ｊｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ－ｇの発現を測定するためには、腫瘍から分離した細胞１０^６個を１ｍｌ培地に懸濁させて、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）を１Ｘとなるように培地に処理し、５時間、５％ ＣＯ_２、３７℃条件で培養した後、細胞内染色を行った。細胞内に存在するＩＦＮ－ｇの発現を測定するために、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞を固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）し透過（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）させた後、ＦＩＴＣが結合したＩＦＮ－ｇを認知する抗体を入れ、４℃で３０分間染色した後、透過バッファー（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を入れ、流細胞分析機であるＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とＦｌｏｗ ｊｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。

【0292】

脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７、サイトカインであるＩＦＮ－ｇ、及び活性化された細胞傷害性Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ６９の発現量を測定した結果、試験管内でＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドが癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にローデングされ、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ２３１癌細胞死滅を誘導していた陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３、セツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体は、ＮＳＧマウス生体内でＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＣＤ１０７、ＩＦＮ－ｇ及びＣＤ６９の発現を増加させる効果がなかった。しかし、ＮＳＧマウスにおいてＭＤＡ－ＭＢ２３１腫瘍成長を抑制する効果を示したｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体投与後、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＣＤ１０７の発現量が増加したし、ＩＦＮ－ｇ^＋ ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞及びＣＤ６９^＋ ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の比率が有意に増加した。

【0293】

したがって、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体のＮＳＧマウスでのＭＤＡ－ＭＢ２３１腫瘍成長抑制効果は、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化によるＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞の死滅によるものであるこが確認できた。

【0294】

前記の実施例の結果を整理し、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ抗体の作用機序を対照群抗体と比較すると、下表の通りである。

【0295】

【0296】

本発明において、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープのＮ末端のみ延長されたＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドが融合したｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体は、試験管内で癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にＴ細胞エピトープを直接ローデングすることもあるが、細胞質内でタンパク質分解システムによって生成されたＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープが癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示され、ＣＭＶ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞の死滅を誘導したし、ＮＳＧマウス生体内でＭＤＡ－ＭＢ２３１腫瘍成長を抑制する効果を示した。ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体の癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１へのＴ細胞エピトープの直接ローデングは、ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドが、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にローデングされる特性ためであり、その結果、陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３、セツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体も、試験管内で癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にＴ細胞エピトープを直接ローデングした。しかし、それらの対照群抗体は、ＮＳＧマウス生体内でＭＤＡ－ＭＢ２３１腫瘍成長を抑制する効果がなかった。この結果は、腫瘍内に存在する抗体の量では、ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドが、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にローデングされ難いためと解釈される。

【0297】

ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープのＮ末端とＣ末端の両方が延長されたＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０又はＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６ペプチドが融合したｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０抗体とｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体は、試験管内で癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にＴ細胞エピトープを直接ローデングしなく、細胞質内でタンパク質分解システムによって生成されたＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３Ｔ細胞エピトープが癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示され、ＣＭＶ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞の死滅を誘導した。特に、ｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体は、ＮＳＧマウス生体内でも、ＣＭＶ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ２３１腫瘍成長を抑制する効果を示した。これに対し、試験管内で陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０、セツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１０、ｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６、ネシツムマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体は、癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にＴ細胞エピトープを直接ローデングする能力がなく、その結果、ＣＭＶ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞の死滅を誘導できなかった。特徴的なことは、試験管内実験においてｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体に比べて、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果を誘導する効果が高かったセツキシマブ†ＭＭＰ１４－ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３抗体は、生体内ではｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５１６抗体に比べて低い腫瘍形成抑制効果を示した。この結果は、前記実施例１０のように、腫瘍内に存在する抗体の量では、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドが、癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にローデングされ難いためと解釈される。

【0298】

したがって、腫瘍内でウイルス特異的Ｔ細胞抗原を癌細胞表面に提示するためには、細胞質にＴ細胞抗原が融合した抗体を浸透させ、細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を用いて癌細胞の表面にウイルス特異的な抗原を提示することが重要であることを確認した。

【0299】

実施例１３．ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝型を有する癌細胞株においてｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ融合抗体のＨＰＶ_Ｅ１１－１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体提示能検証
前記実施例１～１２で、細胞質浸透抗体であるｉｎＣＴ９９に、ＣＭＶ Ｔ細胞抗原エピトープに該当するペプチド及びこれを含むタンパク質切片を融合させたｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ融合抗体が、癌細胞にＣＭＶ ｐｐ６５由来Ｔ細胞エピトープを提示して、ＣＭＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させ、腫瘍成長を抑制することを検証した。

【0300】

このようなｉｎＣＴ９９†ウイルスエピトープ抗体の効果が、ＨＰＶ１６由来抗原Ｅ７のエピトープ又はこれを含むペプチド領域を融合させたｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ抗体でも観察されるかを検証するために、ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ_Ｅ１１－１９及びｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ_Ｅ１－１９融合抗体を、前記実施例１と同一にして構築し、実施例３と同じ方法で精製した。正常供与者のＰＢＭＣには、ＨＰＶ１６由来抗原Ｅ７のエピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が存在しないので、前記抗体が腫瘍細胞内でＨＰＶ_Ｅ１１－１９抗原を癌細胞表面に提示するかを、ＨＰＶ_Ｅ１１－１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を認知するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体である７－１を用いて検証した。

【0301】

図１７は、ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ_Ｅ１１－１９及びｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ_Ｅ１－１９融合抗体が細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を流細胞分析機で分析した結果であり、
図１７Ａは、３７℃で前記抗体が細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を分析するための計画表であり、
図１７Ｂは、様々な濃度の前記抗体を図１７Ａの方法で処理した後、流細胞分析機で分析した結果であり、
図１７Ｃは、前記抗体を図１７Ａの方法で時間別に処理した後、Ｔ細胞抗原エピトープをＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示する能力を流細胞分析機で分析した結果である。

【0302】

具体的に、１２ウェルプレートにＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を、ウェル当たり１．８×１０^５細胞／ｍｌの密度で１０％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に希釈して１２時間、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で培養した後、培地を除去し、ｉｎＣＴ９９、ｉｎＣＴ９９－ＨＰＶ_Ｅ†１－１９、ｉｎＣＴ９９－ＨＰＶ_Ｅ†１１－１９融合抗体を４μＭ、２μＭ、１μＭ、０．５μＭ及び０．１μＭの濃度となるように４００μｌの培地に希釈して１２時間、３７℃、５％ ＣＯ_２条件で培養した。その後、培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した後、ウェル当たり１００μｌのトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ）溶液を３分間３７℃で処理して、細胞をプレートから剥がした。ウェル当たり１０％ ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ培地を１ｍｌずつ入れてトリプシン－ＥＤＴＡを中和させ、細胞を回収して１３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を除去した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液１ｍｌで洗浄し、遠心分離して上澄液を除去した。ウェル当たり細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液２００μｌに懸濁して２個のサンプルに分け、一つのサンプルは２次抗体単独対照群として使用した。各サンプルに、ＨＰＶ_Ｅ１１－１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を特異的に認知するＴ細胞受容体様抗体７－１クローンを１００μｌで２ｎＭの濃度となるようにＦＡＣＳ緩衝液に希釈して入れ、４℃で１時間反応させた。その後、各サンプルを１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、Ａｌｅｘａ６４７（赤色蛍光）が連結されたマウスＦｃを特異的認知するＦ（ａｂ’）_２抗体を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に１：１２００に希釈し、４℃条件で３０分間反応させた。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に流細胞分析機で分析した。

【0303】

その結果、ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ_Ｅ１１－１９及びｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ_Ｅ１－１９融合抗体の濃度依存的にＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞の表面にＨＰＶ_Ｅ１１－１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体が形成されたことを、ＴＣＲ様抗体の結合程度から確認できた。

【0304】

ｉｎＣＴ９９†ＨＰＶ融合抗体の処理時間によるペプチド－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体の形成程度を観察するために、上記の図１７Ｂで融合抗体の濃度とＨＰＶ_Ｅ１１－１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体形成効率が比例する結果を参考して、ｉｎＣＴ９９－ＨＰＶ_Ｅ†１－１９融合抗体を２μＭの濃度でＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞に処理した後、０．５～４８時間後に、癌細胞表面に提示されたＨＰＶ_Ｅ１１－１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を７－１抗体を用いて検出した。

【0305】

その結果、抗体の処理時間を１時間から１８時間まで増加させる場合、癌細胞表面に提示されたＨＰＶ_Ｅ１１－１９／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体が増加することを確認したし、１８時間以後には抗原提示能が減少することを観察した。

【0306】

以上の結果から、細胞質浸透抗体であるｉｎＣＴ９９にＣＭＶ Ｔ細胞抗原を含むペプチドの他、ＨＰＶのような他の種類のウイルス由来Ｔ細胞抗原を融合させても、ｉｎＣＴ９９†ウイルスエピトープ抗体が癌細胞表面に発現したインテグリンに結合して内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後にエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｅｓｃａｐｅ）能力によって細胞質に位置し、細胞質内でタンパク質分解システムによって生成されたウイルス由来エピトープが小胞体に入ってＨＬＡ－Ａ＊０２と複合体を形成し、ゴルジ体を通じて分泌されて癌細胞表面にＴ細胞抗原エピトープを提示することを立証した。

【0307】

実施例１４．ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体の腫瘍形成抑制効果検証
前記実施例１０－１２で観察されたｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ抗体の腫瘍成長抑制効果及びＣＭＶ ｐｐ６５特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化効果が、実際に免疫細胞を有する免疫担当（ｉｍｍｕｎoｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウスでも腫瘍成長抑制効果を誘導できるかを検証しようとした。そのために、マウス癌細胞ＭＨＣ－Ｉ抗原であるＨ－２Ｋ^ｂに対する結合能を有するオブアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）２５７－２６４番ペプチドのＮ末端が延長された２５０－２６４番ペプチドが細胞質浸透抗体であるｉｎＣＴ９９に融合したｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４抗体を構築し、ＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を認知するＯＶＡ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞であるＣＤ８ＯＶＡ１．３細胞による癌細胞死滅効果及び免疫担当マウスでの腫瘍成長抑制効果を検証した。

【0308】

本発明では、陰性対照群抗体として細胞質浸透能のないｉｎＣＴ（ＡＡＡ）† ＯＶＡ２５０－２６４抗体とＭＨＣ－Ｉ抗原であるＨ－２Ｋ^ｂに対する結合能のないＯＶＡ３２３－３３９ペプチドが融合したｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ３２３－３３９融合抗体を使用した。

【0309】

ｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４抗体は、ｉｎＣＴ９９抗体のＶＬ－ＣＤＲ３に存在するエンドソーム脱出モチーフである^９２ＷＹＷ^９４が^９２ＡＡＡ^９４に突然変異しており、ＶＨ－ＣＤＲ３に存在するエンドソーム脱出モチーフである^９５ＷＹ^９５Ａが９５ＡＡＡ^９８に突然変異している。したがって、インテグリンαｖβ３とαｖβ５受容体に結合して内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）したｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４抗体はエンドソームを脱出できないため細胞質浸透がされず、細胞表面にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを提示することができない。

【0310】

ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ３２３－３３９融合抗体はＭＨＣ－Ｉ抗原であるＨ－２Ｋ^ｂに対する結合能がないため、インテグリンαｖβ３とαｖβ５受容体に結合して内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後にエンドソームを脱出して細胞質浸透されても、小胞体に存在するＨ－２Ｋ^ｂに結合できず、ＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を癌細胞表面に提示できない。

【0311】

上述した抗体は、実施例１－３に記述の方法と同じ方法で構築した後に精製し、実験に使用した。

【0312】

動物実験をするに先立ち、ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体が癌細胞にウイルス由来Ｔ細胞エピトープを提示し、ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させることができるかを確認した。

【0313】

【0314】

図１８は、様々なｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体の細胞表面Ｈ－２Ｋ^ｂに対する結合能及び細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨ－２Ｋ^ｂに提示する能力を流細胞分析機で分析し、ＯＶＡ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果をＬＤＨアッセイで分析した結果であり、
図１８Ａは、前記抗体を図９Ａ及び図９Ｂと同じ方法で処理後に、４℃でｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体の細胞表面Ｈ－２Ｋ^ｂに対する結合能と、３７℃でｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体が細胞内抗原処理過程によってＴ細胞抗原エピトープをＨ－２Ｋ^ｂに提示する能力を、流細胞分析機で分析した結果である。

【0315】

４℃でｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体の細胞表面Ｈ－２Ｋ^ｂに対する結合能を分析するための具体的な方法には、ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体が癌細胞表面に発現したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合するかを測定するために、インテグリンαｖβ３とαｖβ５受容体を発現し、Ｈ－２Ｋ^ｂを発現させるＭＣ３８細胞を３．０×１０^５細胞／ｍｌの密度で１０％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に準備し、ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体及び陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４抗体とｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ３２３－３３９融合抗体を４μＭの濃度となるように入れ、５％ ＣＯ_２、３７℃で３時間反応させた。この時、陽性対照群は、ＯＶＡ２５７－２６４ペプチドを４μＭ処理し、陰性対照群は、抗体を溶かしたヒスチジン緩衝液を入れた。３時間後に、１３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、細胞に結合していない抗体及びペプチドが含まれている上澄液を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に１３００ｒｐｍで３分間遠心分離して上澄液を除去した。各サンプル当たり１．５×１０^５個の細胞となるように準備し、ＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を特異的に認知する単一クローン抗体である２５－Ｄ１．１６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に４ｎＭの濃度となるように希釈して入れ、４℃で１時間反応させた。その後、各サンプルを１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、ＰＥ蛍光が連結されたマウスＦｃを特異的認知するＦ（ａｂ’）_２抗体を、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に１：１２００に希釈して４℃条件で３０分間反応させた。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に流細胞分析機及びｆｌｏｗ ｊｏで分析した。

【0316】

その結果、ＯＶＡ２５７－２６４Ｔ細胞エピトープペプチドのＮ末端のみ延長されたペプチドを融合させた抗体であるｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４抗体と陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４抗体はいずれも、癌細胞表面のＨ－２Ｋ^ｂに直接結合することが確認できた。この結果は、ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３ペプチドの癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する結合能のため、ＣＭＶ_Ｐ４９５－５０３ペプチドのＮ末端が延長されたペプチドが融合したｉｎＣＴ９９†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体と対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体とセツキシマブ†ＣＭＶ_Ｐ４８０－５０３抗体が癌細胞表面ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に直接結合した結果と同じ傾向を示す。したがって、ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４抗体と陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４抗体の癌細胞表面のＨ－２Ｋ^ｂに対する直接的な結合能は、ＯＶＡ２５０－２６４ペプチドのＨ－２Ｋ^ｂに対する結合能のためと解釈される。

【0317】

３７℃でｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体が細胞内抗原処理過程によってＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を癌細胞表面に提示するかを評価するために、インテグリンαｖβ３とαｖβ５受容体を発現し、Ｈ－２Ｋ^ｂを発現させるＭＣ３８細胞を１．５×１０^５細胞／ｍｌの密度で、１０％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に準備し、２４ウェルプレートに１２時間付着させた後、ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体及び対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４とｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ３２３－３３９抗体を４μＭの濃度となるように入れ、５％ ＣＯ_２、３７℃で１８時間反応させた。この時、陽性対照群は、ＯＶＡ２５７－２６４ペプチドを４μＭ処理し、陰性対照群は、抗体を溶かしたヒスチジン緩衝液を入れた。１８時間後に、抗体が処理された培地を回収し、１ｍｌ ＤＰＢＳで洗浄した後、イエローチップで掻いて底についたＭＣ３８細胞を回収し、１ｍｌ ＤＰＢＳに懸濁させた後、１３００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞に結合していない抗体及びペプチドが含まれている上澄液を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に１３００ｒｐｍで３分間遠心分離して上澄液を除去した。各サンプル当たり１．５×１０^５個の細胞となるように準備し、ＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を特異的に認知する単一クローン抗体である２５－Ｄ１．１６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に４ｎＭの濃度となるように希釈して入れ、４℃で１時間反応させた。その後、各サンプルを１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、ＰＥ蛍光が連結されたマウスＦｃを特異的認知するＦ（ａｂ’）_２抗体を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に１：１２００に希釈し、４℃条件で３０分間反応させた。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後に流細胞分析機及びｆｌｏｗ ｊｏで分析した。

【0318】

その結果、陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ９９抗体、ｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４とｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ３２３－３３９抗体は、ＭＣ３８細胞の表面にＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を提示できなかった。しかし、ＯＶＡ２５７－２６４Ｔ細胞エピトープペプチドのＮ末端のみ延長されたペプチドを融合させた抗体であるｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４抗体は、細胞質浸透後に細胞内抗原処理過程によって生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープが細胞表面に提示され、ＭＣ３８細胞の表面にＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を提示することが分かった。

【0319】

したがって、腫瘍細胞でウイルス特異的Ｔ細胞抗原を癌細胞表面に提示するためには、細胞質にＴ細胞抗原が融合した抗体を浸透させて細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を用いて癌細胞の表面にウイルス特異的な抗原を提示することが重要であることを確認した。

【0320】

ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４抗体を癌細胞に処理した時、ＯＶＡ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅効果を誘導するかを測定した。

【0321】

図１８Ｂは、Ｈ－２Ｋ^ｂを発現させるＭＣ３８細胞にｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４抗体を処理し、ＯＶＡ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の比率を別にして処理した後、癌細胞の死滅効果をＬＤＨアッセイで分析した結果である。

【0322】

具体的な方法には、ＭＣ３８細胞（０．３×１０^４細胞／１００ｍｌ）を１０％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に懸濁させ、９６ウェルプレートで１２時間付着させた後、ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体及び対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４とｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ３２３－３３９抗体を１μＭの濃度となるように入れ、５％ ＣＯ_２、３７℃で培養した。１２時間後に培養上澄液を除去した後、ＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を認知するＯＶＡ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞であるＣＤ８ＯＶＡ１．３細胞を、効果器細胞：標的細胞比率が０．２：１、１：１及び５：１となるように２％ ＦＢＳと１％ ＡＢＡＭ抗生剤が含まれているＲＰＭＩ培地に懸濁させて添加した。１７時間後に、細胞の最大ＬＤＨ放出制御（ｒｅｌｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％溶解（ｌｙｓｉｓ）基準値と定めるために、標的細胞のみあるウェルに、トリトンＸ－１００が０．１％となるように入れた。ＣＤ８ＯＶＡ１．３細胞を入れて１８時間後に各ウェルの細胞培養液に存在するＬＤＨ（Ｌａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の量で細胞死滅程度を定量するために、５０μｌの細胞培養液を９６ウェル平底プレートに移し、ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（Ｉｏｄｏｎｉｔｒｏ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｖｉｏｌｅｔ）基質をウェル当たり５０μｌずつ入れ、３７℃条件で３０分間反応させた。発色が十分にされると、ＳＴＯＰ溶液をウェル当たり５０μｌずつ入れて反応を中止させ、マイクロプレートリーダを用いて４９０ｎｍでの吸光度を測定した。最大ＬＤＨ放出制御（ｒｅｌｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％細胞溶解として計算した値でグラフを示した。

【0323】

その結果、３７℃でＭＣ３８細胞の表面にＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を提示できなかった対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４とｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ３２３－３３９抗体は、ＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を認知するＯＶＡ２５７－２６４特異的な細胞傷害性Ｔ細胞であるＣＤ８ＯＶＡ１．３細胞によるＭＣ３８癌細胞の死滅を誘導する効果がなかった。しかし、ＭＣ３８細胞の表面にＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を提示したｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体は、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の数が増加するほどＭＣ３８癌細胞に対する死滅誘導効果が高かった。

【0324】

したがって、腫瘍細胞でウイルス特異的Ｔ細胞抗原を癌細胞表面に提示して抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞によって癌細胞を死滅させるためには、細胞質にＴ細胞抗原が融合した抗体を浸透させ、細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を用いて癌細胞の表面にウイルス特異的な抗原を提示することが重要であることを確認した。

【0325】

ＭＣ３８細胞の表面にＯＶＡ２５７－２６４／Ｈ－２Ｋ^ｂ複合体を提示し、ＯＶＡ特異的な細胞傷害性Ｔ細胞によって癌細胞死滅を誘導するｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体が、免疫担当（ｉｍｍｕｎoｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウスにおいても腫瘍形成抑制効果を示すかを検証した。

【0326】

図１９は、マウス大腸癌細胞株であるＭＣ３８細胞をＣ５７ＢＬ／６免疫担当（ｉｍｍｕｎoｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウスの背部に同種移植した後、ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４融合抗体のＯＶＡ２５７－２６４特異的細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞成長抑制誘導効果を測定した結果であり、
図１９Ａは、前記実験に対して腫瘍移植後の抗体の投与間隔、投与量、投与方法及びＯＶＡ２５７－２６４特異的細胞傷害性Ｔ細胞の投与間隔と方法を示す計画表であり、
図１９Ｂは、上記の図１９Ａの実験において日数によって各抗体投与群の腫瘍体積変化を示すグラフであり、
図１９Ｃは、図１９Ｂの実験において各抗体投与群の腫瘍体積変化を１個体のマウスごとに示すグラフである。

【0327】

具体的には、ＭＣ３８マウス大腸癌細胞株（２×１０^５細胞）をＤＰＢＳ１００ｍｌに懸濁した後、Ｃ５７ＢＬ／６免疫担当（ｉｍｍｕｎoｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウスの背部に同種移植した後、腫瘍の体積が１００～１２０ｍｍ^３（約１０日後）になった時、マウスを無作為配分（ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）した後、ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４抗体と陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４及びｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ３２３－３３９抗体を２０ｍｇ／ｋｇ容量で３日に１回ずつ、腹腔注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。腫瘍細胞移植後１０日目、１６日目に、融合抗体を投与して６時間後にＯＶＡ２５７－２６４特異的な細胞傷害性Ｔ細胞であるＣＤ８ＯＶＡ１．３細胞（１×１０^７／２００ｍｌ／マウス）を静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。

【0328】

ｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４抗体の生体材腫瘍形成抑制効果を測定するために、陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４及びｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ３２３－３３９抗体及びｉｎＣＴ９９抗体と共に前記実験で比較した。その結果、ＯＶＡ２５７－２６４ペプチドが癌細胞表面に発現したＨ－２Ｋ^ｂにローデングされる陰性対照群抗体であるｉｎＣＴ９９（ＡＡＡ）†ＯＶＡ２５０－２６４抗体は、Ｃ５７ＢＬ／６免疫担当（ｉｍｍｕｎoｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウス内でＭＣ３８種陽性場を抑制する効果がなかった。

【0329】

これに対し、癌細胞表面に発現したＨ－２Ｋ^ｂに直接結合することもあるが、殆どが融合抗体の細胞質浸透後に生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原が癌細胞表面に提示されてＯＶＡ２５７－２６４特異的細胞傷害性Ｔ細胞による癌細胞死滅を誘導するｉｎＣＴ９９†ＯＶＡ２５０－２６４抗体は、前記対照群抗体に比べてＭＣ３８腫瘍成長を５０％程度抑制した。

【0330】

したがって、腫瘍内でウイルス特異的Ｔ細胞抗原を癌細胞表面に提示するためには、細胞質にＴ細胞抗原が融合した抗体を浸透させ、細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を用いて癌細胞の表面にウイルス特異的な抗原を提示することが重要であるといえる。

【0331】

図２０は、ウイルス抗原由来エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体を用いて癌細胞表面にウイルス特異的エピトープを発現させ、腫瘍患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を用いて癌細胞を除去する汎用治療用抗癌ワクチンに対する作用機序を示す全般的な模式図である。

【0332】

結論的に、図２０に示すように、ウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープ又はそれを含むペプチドを融合させたウイルス抗原由来エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体（ｖｉｒａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｆｕｓｅｄ ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）は、腫瘍組織に過発現する細胞表面の膜タンパク質受容体に結合して内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）した後にエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）能力によって細胞質に位置し、細胞質内でタンパク質分解システムによって生成されたウイルス特異的エピトープが小胞体に入ってＭＨＣ－Ｉと結合し、ゴルジ体を通じて分泌されて癌細胞表面にウイルス特異的エピトープを発現させる。腫瘍患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス特異的エピトープを発現させる癌細胞を除去するので、ウイルス抗原由来エピトープペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体（ｖｉｒａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｆｕｓｅｄ ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）は汎用治療用抗癌ワクチンとして働き得る。

【産業上の利用可能性】

【0333】

本発明に係る融合抗体は、細胞又は組織特異的細胞質浸透が可能なので、細胞質浸透後に細胞質内でタンパク質分解システムによって生成されたウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープが小胞体に入ってＭＨＣ－Ｉと結合してウイルスペプチド／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体（ｐＭＨＣ）形成され、このｐＭＨＣがゴルジ体を通じて分泌されて細胞表面にウイルス特異的Ｔ細胞抗原エピトープを提示することができる。

【0334】

これにより、本発明に係る融合抗体又はこれを含む組成物は、標的細胞表面にウイルス特異的エピトープを発現させ、患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞毒性ＣＤ８^＋Ｔ細胞によってウイルス特異的エピトープを提示する標的細胞、例えば癌細胞を除去できるので、様々な癌腫に対して汎用治療用途に使用可能である。

【0335】

具体的に、本発明に係る融合抗体によってウイルス抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を癌細胞の細胞質に伝達して癌細胞表面にウイルスペプチド－ＭＨＣ－Ｉ複合体（ｐＭＨＣ）を癌細胞表面に発現させ、癌細胞がウイルス感染細胞として認識されると、癌患者の体内に循環する抗ウイルス細胞傷害性Ｔ細胞が癌細胞をウイルス感染細胞として認識して殺傷し、究極的には融合抗体は癌を除去する治療用に活用可能である。

【0336】

また、本発明で融合抗体は、腫瘍細胞の細胞質に抗原を伝達し、細胞質に伝達されたペプチドが細胞内抗原処理過程（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）によって切断されてＭＨＣ－Ｉに結合するペプチドが生成され、ＭＨＣ－Ｉに展示させることができるので、ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ（８～１１アミノ酸残基）及びこれを含むペプチド（１２個以上のアミノ酸残基含むペプチド）を細胞質に伝達することによって、究極的に標的細胞表面の抗原提示分子ＭＨＣ－ＩにＴ細胞抗原エピトープが展示されるようにできるので、様々な長さの抗原ペプチドを癌ワクチンなどの用途に使用することができる。

【0337】

本発明に係る融合抗体は、様々なウイルス、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス１６（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ１６）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）、インフルエンザー（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウイルス、Ｃｏｖｉｄ－１９（ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－２，ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルスなどの抗原由来ＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を標的細胞表面の抗原提示分子ＭＨＣ－Ｉに提示することができる。したがって、前記ウイルスに感染して免疫力を備えた癌患者に、ウイルス抗原を含む融合抗体を投与すると、癌細胞をウイルス感染細胞に変え、癌患者の体内に既に存在するウイルス特異的細胞毒性ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活用して（ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ）癌細胞を除去できるので、様々な癌腫に対して汎用治療用途に使用可能である。

【0338】

また、本発明で提供されるウイルス抗原由来Ｔ細胞抗原エピトープペプチド又はこれを含むペプチドが細胞質浸透抗体に融合した融合抗体は、それに含まれるＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープ又はこれを含むペプチドとして、癌患者に多く存在するウイルス特異的細胞毒性ＣＤ８^＋Ｔ細胞を利用できるように様々なウイルスエピトープが融合可能であり、腫瘍生長抑制能を極大化させることができる。

【0339】

また、本発明で提供されるＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープ又はこれを含むペプチドが細胞又は組織特異的細胞質浸透抗体に融合した融合抗体は、癌細胞のような標的細胞の他にも、ＭＨＣ－Ｉを発現するあらゆる核を有する細胞を標的にして開発され、標的細胞表面のＭＨＣ－ＩにＣＤ８^＋Ｔ細胞抗原エピトープを提示することができる。

【0340】

本発明に係るウイルス抗原由来ペプチドと細胞質浸透抗体が融合した融合抗体は、高い生産収率によって治療薬物としての開発が容易であり、単独薬物又は既存治療剤との併行治療によって効果的な抗癌活性を期待することができる。

【0341】

配列目録フリーテキスト

【0342】

電子ファイルとして添付。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20】

【配列表】

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