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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-05
(45)【発行日】2024-12-13
(54)【発明の名称】円順列変異ハロアルカントランスフェラーゼ融合分子
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241206BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20241206BHJP
A01K 67/027 20240101ALI20241206BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20241206BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241206BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241206BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241206BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241206BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20241206BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20241206BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241206BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
A01H5/00 A
A01K67/027
C07K14/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N9/10
C12N15/54
C12N15/62 Z
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2021561901
(86)(22)【出願日】2020-04-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-04
(86)【国際出願番号】 EP2020060785
(87)【国際公開番号】W WO2020212537
(87)【国際公開日】2020-10-22
【審査請求日】2023-04-04
(31)【優先権主張番号】19169689.7
(32)【優先日】2019-04-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】19206641.3
(32)【優先日】2019-10-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】500449363
【氏名又は名称】マックス－プランク－ゲゼルシャフト ツール フェルデルンク デル ヴィッセンシャフテン エー．ファウ．
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(74)【代理人】
【識別番号】100181906
【弁理士】
【氏名又は名称】河村 一乃
(72)【発明者】
【氏名】ヒブロット，ジュリエン
(72)【発明者】
【氏名】ハッパーツ，マグナス
(72)【発明者】
【氏名】ジョンソン，カイ
(72)【発明者】
【氏名】ジョナス，ウィルヘルム
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／２１９９５３（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ａ０１Ｈ ５／００
Ａ０１Ｋ ６７／０２７
Ｃ０７Ｋ １４／００
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ ９／１０
Ｃ１２Ｎ １５／５４
Ｃ１２Ｎ １５／６２
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
モジュラーポリペプチドであって：－ 第１の部分エフェクター配列であり、
○ 配列番号００２又は配列番号００２と少なくとも９０％同一の配列を特徴とする、Ｎ末端の第１のエフェクター配列部分、
〇 配列番号００３、又は配列番号００３と少なくとも９０％同一の配列を特徴とする、Ｃ末端の第１のエフェクター配列部分、
〇 配列番号００５の配列からなる内部ｃｐＨａｌｏリンカーであり、前記内部ｃｐＨａｌｏリンカーは、Ｎ末端の第１のエフェクター配列部分のＣ末端をＣ末端の第１のエフェクター配列部分のＮ末端に接続する、前記内部ｃｐＨａｌｏリンカー、
を含むか、又はそれからなる、前記第１の部分エフェクター配列、
－ センサーモジュール配列であり、前記第１の部分エフェクター配列がこれに接続される、前記センサーモジュール配列、
－ 配列番号００６（ＰＥＰ１）及び配列番号００７（ＰＥＰ２）の配列から選択される配列からなる、第２の部分エフェクター配列であり、前記センサーモジュール配列がこれに接続される、前記第２の部分エフェクター配列、
を含み、
前記第１及び第２の部分エフェクター配列は共に、円順列変異ハロアルカンデハロゲナーゼを構成し、互いに近接する場合に、ハロゲンアルカン部分の共有結合をもたらすことができ、かつ、
－ 前記センサーモジュール配列は、
ａ． 分析物化合物の存在又は濃度に応じて、第１のコンフォメーションから第２のコンフォメーションへのコンフォメーション変化を受けることができる単一のセンサーポリペプチドであり、
前記第１の部分エフェクター配列が前記センサーモジュール配列（前記単一のセンサーポリペプチド）のＣ末端に結合され、かつ前記第２の部分エフェクター配列が前記センサーモジュール配列（前記単一のセンサーポリペプチド）のＮ末端に結合されている場合に、
・ 前記第１のコンフォメーションでは、前記第１及び第２の部分エフェクター配列が近接し（前記第１及び第２の部分エフェクター配列が触媒的に活性な実体を構成することをもたらす）、及び
・ 第２のコンフォメーションでは、前記第１及び第２の部分エフェクター配列は近接しない（前記第１及び第２の部分エフェクター配列が触媒的に不活性な実体を構成することをもたらす）、
前記単一のセンサーポリペプチド、
及び
ｂ． 第１のセンサーポリペプチド及び第２のセンサーポリペプチドを含むセンサーポリペプチド対であり、前記第１のセンサーポリペプチドは、ペプチド結合を介して、前記第１の部分エフェクター配列に共有結合し、かつ前記第２のセンサーポリペプチドは、前記第２の部分エフェクター配列に共有結合し、
前記第１のセンサーポリペプチド及び前記第２のセンサーポリペプチドは、特異的な分子間相互作用（タンパク質間結合）が可能であり、
かつ前記第１及び第２のセンサーポリペプチドは、別個のポリペプチド鎖の部分である、前記センサーポリペプチド対、
から選択される、センサーモジュール配列である、
前記モジュラーポリペプチド。
【請求項2】
前記第１の部分エフェクター配列及び前記第２の部分エフェクター配列は、互いに近接している場合、Ｎ－（１０－（２－カルボキシ－５－（（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）フェニル）－７－（ジメチルアミノ）－９，９－ジメチルアントラセン－２（９Ｈ）－イリデン）－Ｎ－メチルメタンアミニウムを基質として使用する蛍光偏向アッセイにおいて、１０２ｓ－１Ｍ－１の活性を特徴とする、請求項１に記載のモジュラーポリペプチド。
【請求項3】
前記第１の部分エフェクター配列及び前記第２の部分エフェクター配列は、互いに近接している場合、少なくとも０．５％の配列番号００１の活性を有する、請求項１に記載のモジュラーポリペプチド。
【請求項4】
前記第１の部分エフェクター配列は、ａ． 配列番号００４、又は
ｂ． 配列番号００４と少なくとも９０％同一の配列、又は
ｃ． リンカーによって配列番号００３に結合された配列番号００２からなるコンストラクトと少なくとも９０％同一の配列、
を含むか、又はそれからなり、
前記第１及び第２の部分エフェクター配列は共に、配列番号００７（ＰＥＰ２）を伴う配列番号００４の活性の少なくとも０．５％を特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載のモジュラーポリペプチド。
【請求項5】
－ 前記第１の部分エフェクター配列は、第１のモジュール間リンカー配列によって前記センサーモジュール配列に接続され、及び／又は－ 前記第２の部分エフェクター配列は、第２のモジュール間リンカー配列によって前記センサーモジュール配列に接続される、
請求項１～４のいずれか一項に記載のモジュラーポリペプチド。
【請求項6】
前記センサーモジュール配列は、センサーリンカー配列によって接続されるＮ末端の第１の部分センサー配列及びＣ末端の第２の部分センサー配列からなる単一のセンサーポリペプチドである、請求項１～５のいずれか一項に記載のモジュラーポリペプチド。
【請求項7】
前記第１の部分センサー配列及び前記第２の部分センサー配列は、カルモジュリン結合ペプチド及びカルモジュリンポリペプチドから選択され、前記第１の部分センサー配列は、カルモジュリンポリペプチドであり、かつ前記第２の部分センサー配列は、カルモジュリン結合ペプチドであり、
前記カルモジュリンポリペプチドは、配列番号００９（ＣａＭ）、又は配列番号００９（ＣａＭ）と少なくとも９０％同一であり、かつ同じ生物学的活性を有する配列であるか、又はそれを含み、かつ前記カルモジュリン結合ペプチドは、配列番号００８（Ｍ１３）であるか、又はそれを含み、
前記センサーモジュール配列は：
ａ． カルモジュリン結合ペプチドであるか、又はそれを含む第１のセンサーペプチドであり、前記カルモジュリン結合ペプチドは、配列番号００８（Ｍ１３）であるか、又はそれを含む、前記第１のセンサーペプチド、及び
ｂ． カルモジュリンポリペプチドであるか、又はそれを含む第２のセンサーポリペプチドであり、前記カルモジュリンポリペプチドは、配列番号００９（ＣａＭ）、又は配列番号００９（ＣａＭ）と少なくとも９０％同一であり、かつ同じ生物学的活性を有する配列であるか、又はそれを含む、前記第２のセンサーポリペプチド、
を含むセンサーポリペプチド対によって構成され、
前記第１のセンサーペプチドは、ペプチド結合を介して、前記第１の部分エフェクター配列に共有結合し、かつ前記第２のセンサーポリペプチドは前記第２の部分エフェクター配列に共有結合し、かつ前記第１及び前記第２のセンサーポリペプチドは、別個のポリペプチド鎖の部分であり、
前記第１の部分エフェクター配列は、２～６個のアミノ酸を有する第１のモジュラー間リンカー配列によって前記第１のセンサーペプチドのＣ末端に接続され、及び／又は前記第２の部分エフェクター配列は、２～６個のアミノ酸を有する第２のモジュラー間リンカーによって前記第２のセンサーポリペプチドのＮ末端に接続され、
前記第１のモジュラー間リンカー配列及び前記第２のモジュラー間リンカー配列は、ジペプチド又はトリペプチドであり、それらのアミノ酸構成要素は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｓ及びＴ残基から選択される、請求項６に記載のモジュラーポリペプチド。
【請求項8】
前記モジュラーポリペプチドは、配列番号０１０（ＳＰＬＴ１）又は配列番号０１０（ＳＰＬＴ１）と少なくとも９０％同一の配列からなるか、又はそれを含む第１のポリペプチド配列、及び配列番号０１１（ＳＰＬＴ２）又は配列番号０１１（ＳＰＬＴ２）と少なくとも９０％同一の配列からなるか、又はそれを含む第２のポリペプチド配列を特徴とし、前記第１のポリペプチド配列及び前記第２のポリペプチド配列は共に、少なくとも０．５％の配列番号０１０（ＳＰＬＴ１）と配列番号０１１（ＳＰＬＴ２）との組み合わせの活性を有する、請求項７に記載のモジュラーポリペプチド。
【請求項9】
前記センサーモジュール配列は、Ｎ末端からＣ末端へ、ａ． カルモジュリンポリペプチドであって、配列番号００９（ＣａＭ）、又は配列番号００９（ＣａＭ）と少なくとも９０％同一であり、かつ同じ生物学的活性を有する配列；
ｂ． ペプチドリンカーであって、ポリプロリン型剛性ヘリックスであり、ｎが１５～３５の整数から選択され、任意に１～４個のアミノ酸が隣接するＰｎプロリンポリペプチド；
ｃ． カルモジュリン結合ペプチド（第２の部分センサー配列）であって、配列番号００８（Ｍ１３）を含むか、又はそれからなる配列、
を含む単一のセンサーポリペプチドによって構成され、
前記モジュラーポリペプチドは、配列番号０１３（ＣＯＮＦ１）及び配列番号０１４（ＣＯＮＦ２）、又は少なくとも０．５％の配列番号０１３（ＣＯＮＦ１）の活性を有する配列番号０１４（ＣＯＮＦ２）又は配列番号０１３（ＣＯＮＦ１）と少なくとも９０％同一である配列から選択される配列を含むか、又はそれらからなる、請求項７又は８に記載のモジュラーポリペプチド。
【請求項10】
前記センサーモジュール配列は、ａ． グルタミン酸結合タンパク質のＮ末端部分であり、前記第１のセンサーポリペプチドは、配列番号０２０（ＧＬＴ１）、又は配列番号０２０（ＧＬＴ１）と少なくとも９０％同一である配列であるか、又はそれを含む、前記グルタミン酸結合タンパク質のＮ末端部分、及び
グルタミン酸結合タンパク質のＣ末端部分であり、前記第２のセンサーポリペプチドは、配列番号０２１（ＧＬＴ２）、又は配列番号０２１（ＧＬＴ２）と少なくとも９０％同一であり、かつ同じ生物学的活性を有する配列であるか、又はそれを含む、前記グルタミン酸結合タンパク質のＣ末端部分であり；
ここで、前記第１のセンサーポリペプチドと前記第２のセンサーポリペプチドとの組み合わせであって、該組み合わせは、配列番号０２０（ＧＬＴ１）と配列番号０２１（ＧＬＴ２）との組み合わせと同じ生物学的活性を有し、
又は
ｂ． ポリペプチドリンカーにより配列番号０２１（ＧＬＴ２）に結合した配列番号０２０（ＧＬＴ１）からなるコンストラクトと少なくとも９０％同一の配列であり、前記センサーモジュール配列は、配列番号０２２（ＧＬＴ３）、又は配列番号０２２（ＧＬＴ３）と少なくとも９０％同一であり、かつ同じ生物学的活性を有する配列であるか、又はそれを含む、前記配列、
を含むか、又はそれからなり、
前記モジュラーポリペプチドは、配列番号０２３（ＧＬＴＩＮＤ１）、又は配列番号０２３（ＧＬＴＩＮＤ１）と少なくとも９０％同一の配列からなるか、又はそれを含む第１のポリペプチド配列、及び配列番号０２４（ＧＬＴＩＮＤ２）、又は配列番号０２４（ＧＬＴＩＮＤ２）と少なくとも９０％同一の配列からなるか、又はそれを含む第２のポリペプチド配列を特徴とし、前記第１のポリペプチド配列及び前記第２のポリペプチド配列は共に、少なくとも０．５％の配列番号０２５（ＧＬＴＩＮＤ３）の活性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のモジュラーポリペプチド。
【請求項11】
前記センサーモジュール配列は：ａ． ＦＫＢＰ１２ポリペプチドであるか、又はそれを含む第１のセンサーポリペプチドであり、前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、配列番号０１５（ＦＫＢＰ）、又は配列番号０１５（ＦＫＢＰ）と少なくとも９０％同一であり、かつ同じ生物活性を有する配列であるか、又はそれを含む、前記第１のセンサーポリペプチド、及び
ｂ． ＦＲＢペプチドであるか、又はそれを含む第２のセンサーポリペプチドであり、前記ＦＲＢペプチドは、配列番号０１６（ＦＲＢ）、又は配列番号０１６（ＦＲＢ）と少なくとも９０％同一であり、かつ同じ生物活性を有する配列であるか、又はそれを含む、前記第２のセンサーポリペプチド、
を含むセンサーポリペプチド対によって構成され、
前記第１のセンサーポリペプチドは、ペプチド結合を介して、前記第１の部分エフェクター配列に共有結合し、かつ前記第２のセンサーポリペプチドは、前記第２の部分エフェクター配列に共有結合し、かつ前記第１及び前記第２のセンサーポリペプチドは、別個のポリペプチド鎖の部分であり、
前記第１の部分エフェクター配列は、２～９個のアミノ酸を有する第１のモジュラー間リンカー配列によって前記第１のセンサーポリペプチドのＣ末端に接続され、及び／又は前記第２の部分エフェクター配列は、２～９個のアミノ酸を有する第２のモジュラー間リンカーによって前記第２のセンサーポリペプチドのＮ末端に接続され、
前記第１のモジュール間リンカー配列及び前記第２のモジュール間リンカー配列はトリペプチドであり、そのアミノ酸構成要素がそれぞれ独立してＧ、Ｓ及びＴ残基から選択される、
請求項１～５のいずれか一項に記載のモジュラーポリペプチド。
【請求項12】
前記モジュラーポリペプチドは、配列番号０１７（ＲＡＰＩＮＤ１）、又は配列番号０１７（ＲＡＰＩＮＤ１）と少なくとも９０％同一の配列からなるか、又はそれを含む第１のポリペプチド配列、及び配列番号０１８（ＲＡＰＩＮＤ２）及び配列番号０１９（ＲＡＰＩＮＤ３）、又は配列番号０１８（ＲＡＰＩＮＤ２）と少なくとも９０％同一である配列から選択される第２のポリペプチド配列を特徴とし、前記第１及び前記第２のポリペプチド配列が共に、配列番号０１７（ＲＡＰＩＮＤ１）と配列番号０１８（ＲＡＰＩＮＤ２）との組み合わせの少なくとも５０％の活性を有する、請求項１１に記載のモジュラーポリペプチド。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のモジュラーポリペプチドをコードする、１つ又は複数の核酸。
【請求項14】
核酸の組み合わせであって、ａ． 第１の部分エフェクター配列をコードする第１の核酸配列であり、前記コードされた第１の部分エフェクター配列は、Ｎ末端からＣ末端へ、
ｉ． 配列番号００２、又は配列番号００２と少なくとも９０％同一の配列、
ｉｉ． 配列番号００５の配列からなるポリペプチドリンカー配列、
ｉｉｉ． 配列番号００３、又は配列番号００３と少なくとも９０％同一の配列、
を含む、前記第１の核酸；
ｂ． 配列番号００６（ＰＥＰ１）又は００７（ＰＥＰ２）を特徴とする第２の部分エフェクター配列をコードする、第２の核酸、
を含み、
前記第１及び前記第２の部分エフェクター配列は共に、円順列変異ハロアルカンデハロゲナーゼを構成し、互いに近接する場合に、ハロゲンアルカン部分の共有結合をもたらすことができる、前記核酸の組み合わせ。
【請求項15】
ａ． 請求項１３に記載の核酸、又はｂ． 請求項１４に記載の第１の核酸、及び請求項１４に記載の第２の核酸、
を含み、各核酸は、１つのプロモーター配列の制御下にある、核酸発現システム。
【請求項16】
請求項１５に記載の核酸発現システムを含む細胞であって、前記プロモーターは、前記細胞において作動可能である、前記細胞。
【請求項17】
請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載の核酸の組み合わせ、又は請求項１５に記載の核酸発現システムを含む非ヒトトランスジェニック動物又は植物。
【請求項18】
請求項１３～１５のいずれか一項に記載の核酸又は核酸発現システム、及びハロタグ７基質を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、環境刺激に応答してこの酵素活性を調節することができるハロアルカントランスフェラーゼ酵素活性を含むポリペプチド配列に関する。
【背景技術】
【0002】
経時的に生化学的プロセスを統合する方法は、科学的に非常に興味深いものである。これらの生化学的プロセスには、例えば、タンパク質間相互作用、代謝物濃度の変化、又はタンパク質の細胞内（再）局在化が包含される。現在、これらの生化学的プロセスは、主にオーダーメードのバイオセンサーを使用したリアルタイム蛍光顕微鏡を使用して研究されている。しかし、これらのアプローチにはいくつかの欠点がある。特に神経生物学では、ｉｎ ｖｉｖｏでの蛍光イメージングに必要な実験的セットアップが動物の動きを制限し、研究対象の挙動に影響を与える。腸や心臓などの臓器で発生する生化学的プロセスは、それらの固有の生理学的運動のために細胞レベルで解像するのが複雑となる。より一般的には、蛍光顕微鏡は限られた視野及び組織の深さに制限されている。機器、画像処理、及びバイオセンサーの設計が大幅に改善されたにもかかわらず、蛍光顕微鏡で完全な齧歯類の臓器の基本的な事象をｉｎ ｖｉｖｏで研究することは依然として不可能である。
【0003】
代替的アプローチは、後の時点で読み取ることができる生化学的プロセスの記録にある。この記録プロセスは「統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」として定義されている。それは、調査中の生化学的プロセスに応じて、時間の経過と共に不可逆的なマークが蓄積されることをもたらす。
【0004】
実験の「事後」評価は、ｉｎ ｖｉｖｏ研究に役立つだけでなく、細胞ベースのアッセイにも有益である。特に、まれにしか発生しない生化学的プロセスの場合、時間の経過に伴うシグナル統合により、信号対雑音比が向上するため、読み出しを改善することができる。ハイスループットのスクリーニングにおいて、シグナル統合は研究される現象のスナップショットを提供し、それによりリアルタイム顕微鏡を介して長時間の記録を置き換えることで、多重化を促進し、かつコストを削減することができる。最後に、蛍光基質を使用することで、下流の分析や治療のために、代謝／シグナルプロファイルに基づいて細胞集団を識別し、かつ最終的には選別することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記の最新技術に基づいて、本発明の目的は、経時的に生化学的プロセスを統合するための手段及び方法を提供することである。この目的は、本明細書の独立請求項の主題によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【0006】
自己標識タンパク質ハロタグ（Ｈａｌｏ Ｔａｇ）７に基づいて、本発明者らは、所与の生化学的プロセスに応答してクロロアルカン基質と不可逆的に反応するように操作されたタンパク質の化学遺伝学的なインテグレーター（ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）ファミリーを提供する。これらのインテグレーターは、生化学的プロセスに応答してコンフォメーションを変化させ、標識活性を引き起こすハロタグ７の分割円順列変異体（ｓｐｌｉｔ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｎｔ）からなる。典型的な実験では、記録ウィンドウは、化学遺伝学的なインテグレーターを（共有結合で）標識できるクロロアルカン基質の時間的存在によって定義される。パルスチェイス実験では、異なる標識基質を順次使用することができ、同じ生物学的サンプルでの異なる連続現象の研究の可能性を提供している。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒと９ｍｅｒペプチドとの間の親和性を測定するためのＩＴＣアッセイの図である：９ｍｅｒペプチド（３０ｍＭ）をｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒ（０．６ｍＭ）溶液に滴定した際の代表的な測定値。上段：２つの連結された測定値のベースラインを引いた後の生のＩＴＣデータ。下段：ΔＨを９ｍｅｒとｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒのモル比に対してプロットし（点）、１つの部位の結合モデルに当てはめた（線）。ペプチドの希釈熱は分析前に差し引いている。Ｋｄは独立した３回の測定から算出し、誤差は標準偏差を表す。
【図2】蛍光性ハロタグリガンドとハロタグ７Ｄ１０６Ａの親和性を示す図である。触媒作用のない（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｄｅａｄ）変異体ハロタグ７Ｄ１０６Ａを、ＦＰ結合アッセイにおいて２５ｎＭの５つの異なる蛍光ハロタグリガンドに対して滴定した（Ｈａｌｏ－カルボピロニン、Ｈａｌｏ－ＴＭＲ、Ｈａｌｏ－ＴＭＲ－アゼチジン、Ｈａｌｏ－Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｈａｌｏ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）。蛍光リガンドの構造を各グラフに示す。データは１つの部位の結合モデルに適合され、導出されたＫｄ値が表にまとめられている。０．１ｎＭ及び１ｎＭでのデータポイントは、いずれのタンパク質も添加していない値に対応するが、低濃度に配置され、対数目盛で表示される。すべての実験は３重に実施され、誤差バーと注釈付きの不確実性は標準偏差を表す。
【図3】ハロタグ７Ｄ１０６Ａに対する蛍光発生ハロタグリガンドの親和性を示す図である：触媒作用のない変異体ハロタグ７Ｄ１０６Ａを、蛍光強度に基づく結合アッセイにおいて、２５ｎＭの３つの異なる蛍光発生ハロタグリガンドに対して滴定した（Ｈａｌｏ－シリコンローダミン、Ｈａｌｏ－Ｊａｎｅｌｉａ Ｆｌｕｏｒ６４６及びＨａｌｏ－ＪａｎｅｌｉａＦｌｕｏｒ ６３５）。前記蛍光発生リガンドの構造を各グラフに示す。データを１つの部位の結合モデルに適合させ、導出されたＫｄ値をグラフに示す。蛍光発生基質の親和性が低いため、適合性を改善するために、完全に標識されたハロタグ７（完全な結合に類似する）に基づいて１０９ｎＭのデータポイントを推定した。１ｎＭのデータポイントは、いずれのタンパク質も添加していない値に対応するが、低濃度に配置され、対数目盛で表示される。すべての実験は３重に行われ、誤差バーと注釈付きの不確実性は標準偏差を表す。
【図4】ハロタグ７Ｄ１０６ＡとｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒＤ１０６Ａの蛍光基質結合との比較を示す図である：触媒作用のない変異体ハロタグ７Δ９ｍｅｒＤ１０６Ａ（青）を、ＦＰ結合アッセイにいて２５ｎＭの３つの異なる蛍光ハロタグリガンドに対して滴定した（Ｈａｌｏ－ＴＭＲ、Ｈａｌｏ－ＴＭＲ－アゼチジン、Ｈａｌｏ－カルボピロニン）。それぞれの蛍光リガンドの構造は、各グラフ上に示されている。データを１つの部位の結合モデルに適合させ、導出されたＫｄ値をグラフに示す。０．０１ｎＭ及び０．１ｎＭでのデータポイントは、いずれのタンパク質も添加していない値に対応するが、低濃度に配置され、対数目盛で表示される。データを、同じ蛍光色素分子（赤）のハロタグ７Ｄ１０６Ａ結合と比較した。結合親和性の違いは、Ｋｄ値の相対的な倍率変化によって示される。すべての実験は３重に行われ、誤差バーは標準偏差を表す。
【図5】ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒのバックグラウンド標識を示す図である：２μＭ蛍光リガンドの存在下でのｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒ（１μＭ）のバックグラウンド標識（３７℃にて）は、ゲル蛍光測定によって決定した。サンプルを変性させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとそれに続くゲル蛍光スキャンにより分析した（上；ゲルは薄暗いバンドを強調するために偽色で表されている）。強度は、それぞれの蛍光色素分子で標識されたハロタグ７に対して正規化した（下）。
【図6】Ｍ１３－ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒ及び９ｍｅｒ－ＣａＭリンカーの長さの最適化を示す図である：Ｍ１３－（ＧＧＳ）１－３－ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒ及び９ｍｅｒ－（ＧＧＳ）１－３－ＣａＭで構成される分割インテグレーターのすべての組み合わせを、カルシウム又はＥＧＴＡの存在下でＦＰカイネティックスアッセイで試験した。
【図7】分割ハロタグ７（ＣａＰｒｏＬａ）に基づく分子内カルシウムインテグレーターの一般的な概念を示す図である：（Ａ）：分子内カルシウムインテグレーターＣａＰｒｏＬａの基本的な構造の概略図（Ｎ末端からＣ末端）。（Ｂ）：分割カルシウムインテグレーターの２つの部分は、ＣａＭとＭ１３とをリンカードメインで接続して結合し、単鎖センサーを形成する。（Ｃ）：ＣａＰｒｏＬａのモデル化された構造：ハロタグ７（ＰＤＢ ４ＫＡＦ）の結晶構造とＧＣａＭＰ３（ＰＤＢ ３ＳＧ３）のＣａＭ－Ｍ１３ドメインが修飾され、ＣａＰｒｏＬａアーキテクチャに類似するように配置された。
【図8】異なるＭ１３－ＣａＭリンカーを使用したＣａＰｒｏＬａコンストラクトの性能を示す図である：以下の４つの条件下での異なるＣａＰｒｏＬａコンストラクトと分割インテグレーターのＦＰカイネティックス：カルシウムの存在下（赤）、カルシウムの非存在下（紫）、カルシウムの非存在下だが、１時間後にカルシウムを急増（スパイク）（シアン）、カルシウムの存在で、続いて反応を停止するためのＥＧＴＡを急増させ、続いて反応を再開するためのカルシウムを急増させた（緑色）。小さな矢印は、ＥＧＴＡとカルシウムのスパイクを示す。カルシウム（赤）の存在下での曲線を二次反応速度式に適合させて、速度定数を決定した。すべての実験は３重に実施した。ＧＧＴＧＧＳ：配列番号０２７。
【図9】異なるＭ１３－ＣａＭリンカーを有するＣａＰｒｏＬａコンストラクトのカルシウム応答性を示す図である：（Ａ）ＣａＰｒｏＬａコンストラクトの標識反応を、０ｎＭ～３９μＭの範囲の遊離カルシウム濃度でＦＰを介して観察した。曲線を二次反応速度式に適合し、初期反応速度をこの適合から計算した。（Ｂ）初期速度を遊離カルシウム濃度に対してプロットし（０ｎＭカルシウムを０．０１ｎＭに調整して対数目盛で表示）、４パラメーターロジスティックモデルをデータに適合させて、各コンストラクトのＥＣ５０を決定した。これらの実験は、エフェクター部分１とエフェクター部分２との間の分子内ΔｃｐＨａｌｏリンカーに関し、センサー－エフェクター間のモジュラー間リンカーには関するものではない。すべての実験は３重に実施され、誤差バーと注釈付きの不確実性は標準偏差を表す。ＧＧＳＧＧＴ：配列番号０２８．
【図10】第２世代ＣａＰｒｏＬａコンストラクトのＥＣ５０を示す図である：（Ａ）ＣａＰｒｏＬａ ２．１～２．３の標識反応を、１０ｎＭ～３．２μＭの範囲の遊離カルシウム濃度でＦＰを介して得た。曲線を二次反応速度式に適合し、初期反応速度をこの適合から計算した。（Ｂ）初期速度を遊離カルシウム濃度に対してプロットし、４つのパラメーターロジスティックモデルをデータに適合させて、各コンストラクトのＥＣ５０を決定した。すべての実験は３重に実施し、誤差バーと注釈付きの不確実性は標準偏差を表す。
【図11】２世代のＣａＰｒｏＬａコンストラクトの性能を示す図である：ＣａＰｒｏＬａ ２．１～２．３のＨａｌｏ－ＴＭＲを使用した蛍光偏光のカイネティックスアッセイは、カルシウムの存在下（赤）、カルシウムの非存在下（紫）、カルシウムの非存在下だが、１時間後にカルシウムを急増（スパイク）（シアン）、カルシウムの存在下で、反応を停止するためのＥＧＴＡを急増、続いてカルシウムを急増（緑）の４つの条件下で実行した。小さな矢印は、ＥＧＴＡとカルシウムのスパイクを示す。カルシウム（赤）の存在下での曲線を二次反応速度式に適合させて、速度定数を決定した。すべての実験は３重に実施した。
【図12】ゲルカイネティックスを介してアッセイされたＣａＰｒｏＬａ２．２のカルシウム依存性標識を示す図である：（Ａ）ＣａＰｒｏＬａ ２．２を、カルシウム又はＥＧＴＡの存在下でＨａｌｏ－ＣＰＹと共にインキュベートした。さまざまなインキュベーション時間の後にサンプルを採取し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとそれに続くゲル内蛍光スキャンにより分析した（ゲルは薄暗いバンドを強調するために偽色で表されている）。（Ｂ）蛍光強度を定量化し、完全に標識されたハロタグ７に対して正規化した。
【図13】分割ハロタグ性能を試験するためのモデルシステムを示す図である：左：ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのモデルシステムを説明するスキーム。ｃｐＨａｌｏΔと９ｍｅｒペプチドは、それぞれＦＫＢＰとＦＲＢとに融合され、この分割の補完性及び活性は、それらのラパマイシン依存性相互作用に依存することになる。右：モデルシステムの標識カイネティックスを、ラパマイシン（Ｒａｐ）の存在下又は非存在下での蛍光偏光アッセイによって追跡した。Ｈａｌｏ－ＴＭＲを基質として使用し、各実験を３重に実施した。
【図14】ＦＫＢＰ／ＦＲＢモデルシステムにおける異なる柔軟性リンカーの影響を示す図である：異なる柔軟性リンカーを使用してＦＫＢＰ及びＦＲＢに融合した分割ハロタグの標識カイネティックスを、ラパマイシンの存在下又は非存在下での蛍光偏光アッセイを介して観察した。Ｈａｌｏ－ＴＭＲを基質として使用し、各実験を３重に実施した。
【図15】分割システムの概略図を示す（センサーモジュールは２つのペプチド鎖に分割されており、それぞれがエフェクターシステムの部分に接続されている）。
【図16】ｃｐＨａｌｏΔの１０ｍｅｒ補完ペプチドに対するＡＬＡスキャンの標識カイネティックス研究を示す図である。ＡＲＥＴＦＱＡＦＲＴ：配列番号０２９
【図17】ｄＧｌｕＰｒｏＬａの標識化カイネティックスと、それに続く蛍光偏光を示す図である。技術的３重±標準誤差（ＳＥＭ）
【発明を実施するための形態】
【0008】
発明の概要
本発明は、２つの部分に分割（スプリット）された円順列変異ハロアルカントランスフェラーゼを含む融合タンパク質に関する。これらは、センサーポリペプチドモジュールが空間的に近接すると触媒的に活性であるが、そうでなければ触媒的に不活性である。
本発明は、２つの部分に分割（スプリット）された円順列変異ハロアルカントランスフェラーゼを含む融合タンパク質に関する。これらは、センサーポリペプチドモジュールが空間的に近接すると触媒的に活性であるが、そうでなければ触媒的に不活性である。
【0009】
特に、本発明は、
〇 配列番号００２又は配列番号００２と≧９０％同一の配列を特徴とするＮ末端の第１エフェクター配列部分、
〇 配列番号００３又は配列番号００３と≧９０％同一の配列を特徴とするＣ末端の第１エフェクター配列部分、
〇 内部ｃｐＨａｌｏリンカーが、前記Ｎ末端の第１エフェクター配列部分のＣ末端を前記Ｃ末端の第１エフェクター配列部分のＮ末端に接続する、１０～３５個のアミノ酸からなる前記内部ｃｐＨａｌｏリンカー、
を含む、センサーモジュール配列に接続される第１の部分エフェクター配列を含むモジュラーポリペプチドシステムに関し、
前記センサーモジュール配列は、配列番号００６（ＰＥＰ１）及び００７（ＰＥＰ２）、又は配列番号００７（ＰＥＰ２）と≧７５％同一の配列から選択される配列を含むか、又は本質的になる第２の部分エフェクター配列に接続され、
前記第１及び第２の部分エフェクター配列は、円順列変異ハロアルカンデハロゲナーゼを共に構成し、互いに近接すると、ハロゲンアルカン部分の共有結合をもたらすことができ、かつ前記センサーモジュールは、
ａ． 分析物化合物の存在又は濃度に応じて、第１のコンフォメーションから第２のコンフォメーションへのコンフォメーション変化を受けることができる単一のセンサーポリペプチドであり、
前記第１の部分エフェクター配列が前記センサーモジュール配列（前記単一のセンサーポリペプチド）のＣ末端に結合し、かつ前記第２の部分エフェクター配列が前記センサーモジュール配列（前記単一のセンサーポリペプチド）のＮ末端に結合している場合に、
・ 前記第１のコンフォメーションでは、前記第１及び第２の部分エフェクター配列が近接し（これは、前記第１及び第２の部分エフェクター配列が触媒的に活性な実体を構成することをもたらす）、かつ
・ 第２のコンフォメーションでは、前記第１及び第２の部分エフェクター配列は近接しない（これは、前記第１及び第２の部分エフェクター配列が触媒的に不活性な実体を構成することをもたらす）、
前記単一のセンサーポリペプチド、
及び
ｂ． 第１のセンサーポリペプチドと第２のセンサーポリペプチドとを含むセンサーポリペプチド対であり、前記第１のセンサーポリペプチドは、ペプチド結合を介して前記第１の部分エフェクター配列に共有結合し、かつ前記第２のセンサーポリペプチドは、前記第２の部分エフェクター配列に共有結合する、前記センサーポリペプチド対、
から選択され、
前記第１のセンサーポリペプチド及び前記第２のセンサーポリペプチドは、特異的な分子間相互作用（タンパク質間結合）が可能であり、
かつ前記第１のセンサーポリペプチド及び前記第２のセンサーポリペプチドは、別個のポリペプチド鎖の部分である。
〇 配列番号００２又は配列番号００２と≧９０％同一の配列を特徴とするＮ末端の第１エフェクター配列部分、
〇 配列番号００３又は配列番号００３と≧９０％同一の配列を特徴とするＣ末端の第１エフェクター配列部分、
〇 内部ｃｐＨａｌｏリンカーが、前記Ｎ末端の第１エフェクター配列部分のＣ末端を前記Ｃ末端の第１エフェクター配列部分のＮ末端に接続する、１０～３５個のアミノ酸からなる前記内部ｃｐＨａｌｏリンカー、
を含む、センサーモジュール配列に接続される第１の部分エフェクター配列を含むモジュラーポリペプチドシステムに関し、
前記センサーモジュール配列は、配列番号００６（ＰＥＰ１）及び００７（ＰＥＰ２）、又は配列番号００７（ＰＥＰ２）と≧７５％同一の配列から選択される配列を含むか、又は本質的になる第２の部分エフェクター配列に接続され、
前記第１及び第２の部分エフェクター配列は、円順列変異ハロアルカンデハロゲナーゼを共に構成し、互いに近接すると、ハロゲンアルカン部分の共有結合をもたらすことができ、かつ前記センサーモジュールは、
ａ． 分析物化合物の存在又は濃度に応じて、第１のコンフォメーションから第２のコンフォメーションへのコンフォメーション変化を受けることができる単一のセンサーポリペプチドであり、
前記第１の部分エフェクター配列が前記センサーモジュール配列（前記単一のセンサーポリペプチド）のＣ末端に結合し、かつ前記第２の部分エフェクター配列が前記センサーモジュール配列（前記単一のセンサーポリペプチド）のＮ末端に結合している場合に、
・ 前記第１のコンフォメーションでは、前記第１及び第２の部分エフェクター配列が近接し（これは、前記第１及び第２の部分エフェクター配列が触媒的に活性な実体を構成することをもたらす）、かつ
・ 第２のコンフォメーションでは、前記第１及び第２の部分エフェクター配列は近接しない（これは、前記第１及び第２の部分エフェクター配列が触媒的に不活性な実体を構成することをもたらす）、
前記単一のセンサーポリペプチド、
及び
ｂ． 第１のセンサーポリペプチドと第２のセンサーポリペプチドとを含むセンサーポリペプチド対であり、前記第１のセンサーポリペプチドは、ペプチド結合を介して前記第１の部分エフェクター配列に共有結合し、かつ前記第２のセンサーポリペプチドは、前記第２の部分エフェクター配列に共有結合する、前記センサーポリペプチド対、
から選択され、
前記第１のセンサーポリペプチド及び前記第２のセンサーポリペプチドは、特異的な分子間相互作用（タンパク質間結合）が可能であり、
かつ前記第１のセンサーポリペプチド及び前記第２のセンサーポリペプチドは、別個のポリペプチド鎖の部分である。
【0010】
本発明の第２の態様は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸に関する。あるいは、円順列変異ハロアルカントランスフェラーゼの２つの部分（第１の部分エフェクター配列及び第２の部分エフェクター配列）をコードする核酸が提供される。第１及び第２の部分エフェクターをコードするこれらの核酸配列は、未だ未解明の相互作用パートナー又はセンサーモジュールを用いて、分析物の濃度又はタンパク質間相互作用を感知できる他の融合タンパク質を作成するのに有用である。
【0011】
さらに、本発明は、本発明の融合タンパク質又はコードする核酸を含む発現システム、細胞、及びトランスジェニック非ヒト動物を提供する。同様に、トランスジェニック発現コンストラクトを迅速に構築するための核酸、及び適切な基質化合物を提供するキットも、本発明に包含される。
【0012】
発明の詳細な説明
用語と定義
本明細書の文脈における「蛍光色素」という用語は、可視又は近赤外のスペクトルで蛍光を発することができる低分子に関するものである。蛍光標識又は可視色を示す標識の例には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ペリジニンクロロフィル（ＰｅｒＣＰ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）、ｄｙｌｉｇｈｔ ｆｌｕｏｒ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）ＡＴＴＯ Ｄｙｅ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ、ジーゲン、ドイツ）、ＢＯＤＩＰＹ Ｄｙｅ（４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセンベースの色素）などを含むがこれらに限定されない。
用語と定義
本明細書の文脈における「蛍光色素」という用語は、可視又は近赤外のスペクトルで蛍光を発することができる低分子に関するものである。蛍光標識又は可視色を示す標識の例には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ペリジニンクロロフィル（ＰｅｒＣＰ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）、ｄｙｌｉｇｈｔ ｆｌｕｏｒ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）ＡＴＴＯ Ｄｙｅ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ ＧｍｂＨ、ジーゲン、ドイツ）、ＢＯＤＩＰＹ Ｄｙｅ（４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセンベースの色素）などを含むがこれらに限定されない。
【0013】
アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシル末端へ与えられる。配列位置の大文字は、１文字のコードのＬ－アミノ酸を指す（Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３編、ｐ．２１）。アミノ酸配列位置の小文字は、対応するＤ－又は（２Ｒ）－アミノ酸を指す。
【0014】
Ｊはイソロイシン又はロイシンである。
【0015】
本明細書の文脈における「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸がペプチド結合によって接続されている直鎖を形成する５０個以上のアミノ酸からなる分子を指す。ポリペプチドのアミノ酸配列は、（生理学的に見出されるとおり）タンパク質全体又はその断片のアミノ酸配列を表し得る。
【0016】
本明細書の文脈における「ペプチド」という用語は、最大５０個のアミノ酸、特に８～３０個のアミノ酸、より特に８～１５個のアミノ酸からなる分子に関連し、これらのアミノ酸は、ペプチド結合によって接続される直鎖を形成する。
【0017】
本明細書の文脈では、「配列の同一性」及び「配列の同一性の割合」という用語は、２つのアラインメントされた配列を比較することにより決定される値を指す。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ， Ａｄｖ．Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのｇｌｏｂａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎのｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）、又はこれらに限定されないが、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピュータによる実装によって実施することができる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）などで公開され利用可能である。
【0018】
アミノ酸配列の比較の一例として、デフォルトの設定：期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲の最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１，拡張１；組成調節：条件付組成スコアマトリックス調整を用いたＢＬＡＳＴＰアルゴリズムがある。核酸配列の比較の一例として、デフォルトの設定：期待閾値：１０；ワードサイズ：２８；クエリ範囲の最大一致：０；一致／不一致スコア：１．－２；ギャップコスト：線形を用いたＢＬＡＳＴＮアルゴリズムがある。特に明記しない限り、本明細書に記載されている配列同一性の値は、プログラムのＢＬＡＳＴスイート（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を用いて、タンパク質及び核酸の比較のためにそれぞれ上記の同定されたデフォルトパラメーターを使用して得られた値を指す。
【0019】
本明細書の文脈において「実質的に同じ活性を有する」という用語は、エフェクターポリペプチド対の活性、特に配列番号００４及び配列番号００７（ＰＥＰ２）の活性、すなわちハロアルカントランスフェラーゼ活性に関する。「実質的に同じ活性を有する」と認定されたポリペプチドは、必ずしも基準のポリペプチドと同じ量の活性を示す必要はなく、本発明の特定の場合では、基準ペプチドｃｐＨａｌｏに対する酵素回転数の減少が、特定の用途では実際に望ましい可能性がある。以下に述べるとおり、本発明によってカバーされるポリペプチドとカバーされないポリペプチドとを区別する目的で、本発明者らは、基質としてＨａｌｏ－ＣＰＹを用いて、実施例９で記載されるとおりの標準的なアッセイにおいて、１０２ｓ－１Ｍ－１の活性の閾値を提案している。
【0020】
活性の上記の定義が適用可能でない場合では、ハロアルカントランスフェラーゼ活性に関してバックグラウンドを超える３標準偏差が、「実質的に同じ活性を有する」ための基準閾値として取られるものとする。特定の実施形態では、少なくとも５標準偏差が基準閾値として使用される。特に特定の実施形態では、少なくとも１０標準偏差が基準閾値として使用される。
【0021】
本明細書の文脈において、「アミノ酸リンカー」という用語は、一本鎖ポリペプチドを生成するために、２つのポリペプチドを接続するために使用される可変長のポリペプチドを意味する。別段の定めがない限り、本明細書で規定する本発明の実施に有用なリンカーの例示的な実施形態は、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０又は５０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド鎖である。
【0022】
本明細書の文脈では、「Ｇｌｔｌ」という用語は、細菌のペリプラズムグルタミン酸結合タンパク質（Ｕｎｉ－Ｐｒｏｔ－ＩＤ：Ｈ４ＵＦＹ３）の略語である。
【0023】
本発明の第１の態様は、センサーポリペプチドモジュールによって再構成される、ハロタグ７活性を有する分割エフェクターポリペプチド配列を含むか、又はそれから本質的になる、モジュラー分析物センサーポリペプチドシステム（本明細書ではモジュラーポリペプチドともいう）に関する。
【0024】
モジュラー分析物センサーポリペプチドシステムは、配列番号００２、又は配列番号００２と少なくとも（≧）９０％同一（特に≧９３％、≧９５％、≧９７％又は≧９８％同一）の配列を特徴とするＮ末端の第１のエフェクター配列部分、配列番号００３、又は配列番号００３と少なくとも（≧）９０％同一（特に≧９３％、≧９５％、≧９７％又は≧９８％同一）の配列を特徴とするＣ末端の第１のエフェクター配列部分、及び１０～３５個のアミノ酸からなる内部ｃｐＨａｌｏリンカーを含むか、又はそれから本質的になる第１の部分エフェクターポリペプチド配列（ｃｐＨａｌｏΔ）を含むか、又はそれから本質的になる。
【0025】
内部ｃｐＨａｌｏリンカーは、Ｎ末端の第１のエフェクター配列部分のＣ末端をＣ末端の第１エフェクター配列部分のＮ末端に接続する。
【0026】
特定の実施形態において、ｃｐＨａｌｏリンカーは、１２～２０個のアミノ酸からなる。特定の実施形態において、ｃｐＨａｌｏリンカーは、特に約１５個のアミノ酸からなる。
【0027】
第１の部分エフェクターポリペプチド配列は、ペプチド鎖の部分として、そのＮ末端を介して、センサーモジュールポリペプチド配列に共有結合し、このセンサーモジュールポリペプチド配列は、ペプチド鎖の部分として第２の部分エフェクターペプチド配列に結合し、この第２の部分エフェクターペプチド配列は、ｃｐＨａｌｏΔの配列を補完し、かつハロアルカントランスフェラーゼ活性を再構成する。これは、配列番号００６（ＰＥＰ１）、及び００７（ＰＥＰ２）、又は配列番号００７（ＰＥＰ２）と少なくとも（≧）７５％同一（特に特に≧８０％、≧８５％、≧９０％、又は≧９５％同一）の配列から選択された配列を含むか、又はそれから本質的になる。
【0028】
第１及び第２の部分エフェクター配列は共に、円順列変異ハロアルカンデハロゲナーゼを構成し、互いに近接する場合に第１のエフェクター配列へのハロゲンアルカン部分の共有結合をもたらすことができる。
【0029】
本発明のモジュラー分析物センサーポリペプチドシステムの特定のバリエーションは、本明細書で提供される実施例よりも著しく少ない活性を示すように設計され得る。天然のハロタグ７及びその円順列変異形態は、非常に活性であり、一部の用途のために、より低い／より遅い活性が望ましい場合がある。一例では、長期間にわたるニューロン活性の記録であり、ここでは非常に活性なシステムが、システムを急速に過飽和にし、長期間にわたって展開する事象の記録を妨げる傾向がある可能性がある。
【0030】
本明細書で定義されるとおり、分割エフェクターモジュールとセンサーモジュール配列との組み合わせのための閾値では、実施例９に示されるような標準的なアッセイにおいて１０２ｓ－１Ｍ－１の最小活性が提供される。
【0031】
特定の実施形態において、配列番号００４と、又はリンカーによって結合された配列番号００２及び配列番号００３からなるコンストラクトと≧９０％同一である第１のエフェクター配列、及び第２の部分エフェクター配列からなる分割エフェクターモジュールの組み合わせは、配列番号００４の変異体が配列番号００７（ＰＥＰ２）と空間的に近接している場合、バックグラウンドシグナルより少なくとも３標準偏差（≧３Σ）値、特にバックグラウンドシグナルより≧５Σ又はさらに≧１０Σの値を特徴とする。
【0032】
配列同一性を計算する目的で、配列番号００２及び配列番号００３の寄与を秤量すべきであるが、この２つの配列を結合するリンカー分子は、得られるコンストラクトの機能に影響を与えることなく実質的に変えることができることが理解される。
【0033】
特定の実施形態では、配列番号００４と、又はリンカーによって結合された配列番号００２及び配列番号００３からなるコンストラクトと≧９０％同一である第１のエフェクター配列、及び第２の部分エフェクター配列からなる分割エフェクターモジュールの組み合わせは、配列番号００７（ＰＥＰ２）と空間的に近接する場合に、配列番号００４の少なくとも０．５％、特に≧１又は≧２％の活性を特徴とする。
【0034】
特定の実施形態において、配列番号００４と、又はリンカーによって結合された配列番号００２及び配列番号００３からなるコンストラクトと≧９０％同一である第１のエフェクター配列、及び第２の部分エフェクター配列からなる分割エフェクターモジュールの組み合わせは、配列番号００４が配列番号００７（ＰＥＰ２）と空間的に近接している場合に、配列番号００４の少なくとも５％の活性を特徴とする。
【0035】
特定の実施形態では、配列番号００４と、又はリンカーによって結合された配列番号００２及び配列番号００３からなるコンストラクトと≧９０％同一である第１のエフェクター配列、及び第２の部分エフェクター配列からなる分割エフェクターモジュールの組み合わせは、配列番号００７（ＰＥＰ２）と空間的に近接している場合、配列番号００４の少なくとも１５％、２５％、４０％、又はさらに５０％の活性を特徴とする。
【0036】
センサーモジュール（本明細書では、センサーモジュール配列ともいう）は、単一のセンサーポリペプチド及びセンサーポリペプチド対から選択される。
【0037】
センサーモジュールは、センサーモジュール配列に近接する分析物化合物の存在又は濃度に応じて、第１のコンフォメーションから第２のコンフォメーションへのコンフォメーション変化を受けることができる単一のセンサーポリペプチドであり得る。コンフォメーション変化は、分析物の不在、又は環境からのその除去によっても影響を受けることもある。第１の部分エフェクター配列がセンサーモジュール（単一のセンサーポリペプチド）のＣ末端に結合し、第２の部分エフェクター配列がセンサーモジュール（単一のセンサーポリペプチド）のＮ末端に結合される場合、第１のコンフォメーションでは、第１及び第２の部分エフェクター配列は近接し、言い換えれば、それらの近接性は、第１及び第２の部分エフェクター配列が触媒的に活性な実体を構成することをもたらす。
【0038】
対照的に、第２のコンフォメーションでは、第１の部分エフェクター配列がセンサーモジュールのＣ末端に結合し、第２の部分エフェクター配列が、センサーモジュール配列のＮ末端に結合される場合に、第１及び第２の部分エフェクター配列は近接しておらず、したがって、第１及び第２の部分エフェクター配列が触媒的に不活性な実体を構成することをもたらす。
【0039】
単一のセンサーポリペプチドのＣ末端は、直接ペプチド結合を介して、又はリンカーペプチドを介して、第１の部分エフェクター配列のＮ末端に共有結合し、単一のセンサーポリペプチドのＮ末端は、第２の部分エフェクター配列のＣ末端に共有結合している。
【0040】
代替的には、センサーモジュールは、第１のセンサーポリペプチド及び第２のセンサーポリペプチドを含むセンサーポリペプチド対であり得、ここで、直接ペプチド結合を介して、又はリンカーペプチドを介して、前記第１のセンサーポリペプチドのＣ末端は、第１の部分エフェクター配列のＮ末端に共有結合し、かつ前記第２のセンサーポリペプチドのＮ末端は、第２の部分エフェクター配列のＣ末端に共有結合しており、前記第１のセンサーポリペプチド及び前記第２のセンサーポリペプチドは、特異的な分子相互作用（タンパク間結合）が可能である。この代替では、第１と第２のセンサーポリペプチドとは、別個のポリペプチド鎖の部分である。
【0041】
第２の部分エフェクター配列は、近接する場合、第１の部分エフェクター配列を補完する。本発明者らは、Ｃ末端のスレオニン残基が異なる配列番号００６（ＰＥＰ１）及び００７（ＰＥＰ２）が、そうするのに最も効果的であることを見出した。これは、これらの部分配列の相互の親和性を高める目的で、又は他の目的のために、前記ペプチドのさらなる未来の展開を不可能にするものではない。ＰＥＰ２配列における１個の余分なスレオニンは、カルモジュリン／Ｍ１３センサーシステムとの組み合わせにおいて反応速度を大幅に増加させるが、ＦＫＰＢ／ＦＲＢセンサーシステムと組み合わせて使用した場合、あまり効果がない。
【0042】
当業者は、構造への個々の位置の寄与に応じて、第２の部分エフェクター配列の変異体も許容され得ることを理解するであろう。タンパク質と相互作用することが知られているＡｌａ１４５、Ａｒｇ１４６、Ｔｈｒ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｐｈｅ１５２、及びＡｒｇ１５３では、類似の化学的性質の残基（又はさらに類似性の低いもの）で置換可能である可能性が低い。溶媒により暴露されるアミノ酸（すなわち、Ｇｌｕ１４７、Ｇｌｎ１５０、Ａｌａ１５１、及びＴｈｒ１５４）は、まったく同じように維持するために先験的にはそれほど重要ではないであろう。本発明者の手によって、変異研究によりこれらの意見を確認した。位置Ａｌａ１５０は、修飾に耐性があることが明らかになり、位置Ａｒｇ１４６及びＴｈｒ１４８は、インテグレーター機能にとって重要であることが明らかになった（カルシウムシグナル統合の文脈において）。
【0043】
ペプチドはアルファヘリックス構造に折りたたまれる必要があるため、アルファヘリックス傾向のあるＡＡの表を使用してＡＡを階層化することができる。このような表は、Ｐａｃｅら、ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ、７５、４２２－４２７頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０００６－３４９５（９８）７７５２９－０で見ることができる。
【0044】
特定の実施形態において、第１の部分エフェクターポリペプチド配列及び第２の部分エフェクター配列は、互いに近接している場合、共に、配列番号００１の少なくとも０．５％、特に≧１％又は≧２％の生物学的活性を有する。特定の実施形態において、第１の部分エフェクターポリペプチド配列及び第２の部分エフェクター配列は、互いに近接している場合、実施例９に示されるとおり、標準アッセイにおいて少なくとも１０２ｓ－１Ｍ－１の活性を有する。
【0045】
前文の定義及び本明細書に含まれる他のそのような定義が包含する配列を定義する目的のための配列番号００１の活性とは、実施例９の蛍光偏光アッセイにおける配列の性能である。特に明記しない限り、前記活性は、生物学的活性の比較の目的で、Ｈａｌｏ－ＣＰＹ（以下の基質の表を参照）を使用して、実施例９に与えられた手順に従って測定される。
【0046】
特定の実施形態では、内部ｃｐＨａｌｏリンカーは、アミノ酸Ｇ、Ａ、Ｊ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｃ、Ｖ、Ｍを含むか、又はそれからなり、特に前記ｃｐＨａｌｏリンカーは、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔを含むか、又はそれからなる。
【0047】
特定の実施形態では、ｃｐＨａｌｏリンカーは、（ＧＧΣ）ｎであり、ｎは整数であり、かつｎ≧３（特にｎは４、５、６、７又は８）であり、Σは、Ｓ及びＴから選択される。
【0048】
特定の実施形態では、ｃｐＨａｌｏリンカーは、（ＧＧＳ）ｎであり、ｎは整数であり、かつｎ≧３（特にｎは４、５、６、７又は８）である。
【0049】
特定の実施形態では、ｃｐＨａｌｏリンカーは、（ＧＧＴ）ｎであり、ｎは整数であり、かつｎ≧３（特にｎは４、５、６、７又は８）である。
【0050】
特定の実施形態では、ｃｐＨａｌｏリンカーは、（ＧΣＧ）ｎ又は（ＧＧΣ）ｎであり、ｎは整数であり、かつｎ≧３（特にｎは４、５、６、７又は８）であり、各Σ は、Ｓ及びＴから独立して選択される。
【0051】
特定の実施形態では、ｃｐＨａｌｏリンカーは、（ΓΓΣ）ｎであり、ｎは整数であり、かつｎ≧３（特にｎは４、５、６、７又は８）であり、かつ各Γは、任意の他のΓから独立して、Ａ、Ｇ及びＶから選択され、かつ各 Σは、独立して、Ｓ及びＴから選択される。
【0052】
ｃｐＨａｌｏリンカーの長さ及び配列組成に関して、本発明者らの結果によれば、機能するためには、１０個、最適には１２個のアミノ酸に相当する長さを持つ任意のリンカーが期待される。ただし、予測される構造により、結果として得られるタンパク質の溶解性を妨げることが予期されるリンカーは例外である。本発明者らは、２５アミノ酸よりも長いリンカーの調査を行わないことを決定したが、そのような長さのリンカーが機能すると予期するべきでないという理由はない。
【0053】
リンカー配列を選択する際に重要視したのは、溶解性及び柔軟性であった。本明細書に開示される実施例のために選択される実際のｃｐＨａｌｏリンカー配列はＧＧＴＧＧＳＧＧＴＧＧＳＧＧＳ（配列番号００５）であるが、当業者は、本明細書の教示及びリンカー設計に関して利用可能な知識に基づいて、Ｃｈｅｎ ｅｔら，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６５（２０１３），１３５７－１３６９、及びＥｖｅｒｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００６，４５，１３１８３－１３１９２に例示されるとおり、組成及び長さにおいてこの配列を容易に変えることができる。
【0054】
特定の実施形態において、第１の部分エフェクターポリペプチド配列は、配列番号００４、又は配列番号００４と少なくとも（≧）９０％同一（特に≧９３％、≧９５％、≧９７％又は≧９８％同一）の配列を含むか、又は本質的にそれからなり、前記第１及び第２の部分エフェクター配列は共に、配列番号００７（ＰＥＰ２）と空間的に近接している配列番号００４の少なくとも１％の活性を特徴とする。
【0055】
特定の実施形態において、第１の部分エフェクターポリペプチド配列は、配列番号００４と少なくとも（≧）９０％同一（特に≧９３％、≧９５％、≧９７％又は≧９８％同一）の配列を含むか、又は本質的にそれからなり、前記第１及び第２の部分エフェクター配列は共に、配列番号００７（ＰＥＰ２）と空間的に近接している配列番号００４の≧５％、１０％、１７％又は３３％の活性を特徴とする。
【0056】
前記センサー及びエフェクターモジュールは互いに直接接続することができるが、構造のいくつかの調整を可能にするために、当業者は、リンカー配列を使用して前記モジュールを接続することができることを認識している。
【0057】
特定の実施形態において、第１の部分エフェクターポリペプチド配列は、第１のモジュラー間リンカーペプチド配列によってセンサーモジュールポリペプチド配列（本明細書ではセンサーモジュール配列とも呼ばれる）に接続され、及び／又は第２の部分エフェクターポリペプチド配列は、第２のモジュラー間リンカーポリペプチド配列によってセンサーモジュールポリペプチド配列に接続される。
【0058】
本発明者らは、ｎが整数であり、かつｎ≦４（特にｎは１、２又は３）であり、ΨがＧ、Ｓ及びＴから選択される、（ＧＧΨ）ｎを特徴とする特に有用な第１のモジュラー間リンカー配列を見出した。
【0059】
同様に、本発明者らは、ｎが整数であり、かつｎ≦４（特にｎは１、２又は３）であり、Ψ がＧ、Ｓ、及びＴから選択される、（ＧＧΨ）ｎを特徴とする特に有用な第２のモジュラー間リンカー配列を見出した。
【0060】
特定の実施形態では、第１及び／又は第２のモジュール間リンカーは、１つ又は２つのアミノ酸リンカーＧΨ、ΨＧ、 ΨΨ、 Ｇ、又はΨ 単独であり得、式中、Ψ はＧ、Ｓ及びＴから選択される。アラニンは、上記の配列においてＧ、Ｓ及びＴのうちの１つを置換することができるアミノ酸の一例である。
【0061】
対象の分析物の存在下で再構成された後に、バックグラウンド標識及びバックグラウンド上に顕著なシグナルないことを特に重要視する必要がある。センサーモジュールに応じて、当業者は、モジュール間リンカー配列を変えて、モジュールの所与の組み合わせに対してどの長さが最良の結果をもたらすかを試験することができるであろう。リンカーの長さではなく、配列組成に関して、上記のｃｐＨａｌｏリンカーについて例示的に提示された代替の配列はまた、モジュラー間リンカーにも適用される。
【0062】
特定の実施形態では、センサーモジュール配列は、センサーリンカー配列によって接続されたＮ末端の第１の部分センサー配列及びＣ末端の第２のセンサー配列からなる単一のセンサーポリペプチドである。
【0063】
特定の実施形態では、センサーモジュール配列は、オリゴプロリン配列、特にｎが１５～３５の間の整数であるＰｎ配列によって達成され得るような剛性（ｒｉｇｉｄ）センサーリンカー配列によって接続されたＮ末端の第１の部分センサー配列及びＣ末端の第２のセンサー配列からなる単一のセンサーポリペプチドである。
【0064】
特定の実施形態では、センサーリンカー配列は、前項で例示したようなポリプロリン配列であるが、（これに限定されないが）（ＧＧΨ）ｎ（ｎは整数であり、ｎは１、２、３から選択され、かつΨ はＧ、Ｓ、及びＴから選択される）のような柔軟性のあるモチーフの短い挿入を含む。同様に、前記挿入されたリンカーは、ＧΨ、ΨＧ、 ΨΨ、 Ｇ、又はΨ 単独のような短い長さを有していてもよい。本発明者らの手でうまくいった例としては、１５個のプロリン伸長の次にＧＧＳを２回繰り返し、再び１５個のプロリンが続くものである。そのような設計は、プロリンによって形成されたばねにおけるヒンジを容易にすることができる。本発明者らは、リンカー（ほとんどが剛性（ｒｉｇｉｄ）である）が特定の利点を提供するが、前記リンカー配列を、最終コンストラクトの活性を損なうことなく、広範囲の配列にわたって変化させることができることを観察した。繰り返しになるが、特定の用途では、なおバックグラウンドのノイズと明確に区別できる低い活性が、実際には非常に活性なコンストラクトよりも好ましい場合があることを覚えておく必要がある。Ｂｒｕｎら（Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１１，１３３（４０）１６２３５－１６２４２）は、本発明に適応可能なリンカーのバリエーションを教示している。前述のＣｈｅｎら，（ｉｂｉｄ．）及びＥｖｅｒｓら（ｉｂｉｄ．）を再度参照されたい。
【0065】
特定の実施形態では、第１の部分センサー配列及び第２の部分センサー配列は、カルモジュリン結合ペプチド及びカルモジュリンポリペプチドから選択される。
【0066】
特に特定の実施形態では、第１の部分センサー配列はカルモジュリンポリペプチドであり、第２の部分センサー配列はカルモジュリン結合ペプチドである。
【0067】
多数の異なるカルモジュリン変異体及び結合ペプチドが、とりわけいかに記載されるとおり存在する：Ｚｈａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１１ ｖｏｌ ３３３（６０５１）１８８８－９１ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０８５９２；Ｗｕら、２０１３ ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ ４（６）９６３－９７２ ｄｏｉ：１０．１０２１／ｃｎ４０００１２ｂ；Ｈｏｒｉｋａｗａら、２０１０ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ ２０１０年９月；７（９）：７２９－３２ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎＭｅｔｈ．１４８８；Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１３年７月１８日；４９９（７４５８）：２９５－３００、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３５４；Ｍｏｅｙａｅｒｔら、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８年１０月２５日；９（１）：４４４０ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０６９３５－２；Ｄａｎａら、２０１８ ｂｉｏＲｘｉｖ ４３４５８９；Ｇａｏら、２０１５ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．４０１６；Ｌｅｅら、２０１７ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３９０２；Ｍｉｎｄｅｒｅｒら、２０１２ ｄｏｉ：１０．１１１３／ｊｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１．２１９０１４；Ｄｅ Ｊｕａｎ－Ｓａｎｚら、２０１７ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１７．０１．０１０；Ｄｉｎｇら、２０１５ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３２６１及びＡｋｅｒｂｏｏｍら、２０１１、ｄｏｉ：１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．２６０１－１２．２０１２。
【0068】
特定の実施形態において、カルモジュリンポリペプチドは、配列番号００９（ＣａＭ）、又は配列番号００９（ＣａＭ）と少なくとも９０％同一であり、かつ実質的に同じ生物学的活性を有する配列であるか、又はそれを含み、カルモジュリン結合ペプチドは、配列番号００８（Ｍ１３）であるか、又はそれを含む。
【0069】
特定の実施形態では、センサーモジュールは、配列番号００８（Ｍ１３）によって例示されるカルモジュリン結合ペプチドであるか、又はそれを含む第１のセンサーペプチド、及びカルモジュリンポリペプチド、特に配列番号００９（ＣａＭ）、又は配列番号００９（ＣａＭ）と少なくとも９０％同一であり、かつ実質的に同じ活性を有する配列であるか、又はそれを含む第２のセンサーポリペプチドを含むセンサーポリペプチド対によって構成される。第１のセンサーペプチドは第１の部分エフェクター配列にペプチド結合を介して共有結合しており、かつ第２のセンサーポリペプチドは第２の部分エフェクター配列に共有結合しており、かつ第１のセンサーポリペプチドと第２のセンサーポリペプチドとは別々のポリペプチド鎖の部分となっている。
【0070】
特定の実施形態では、カルモジュリン結合ペプチドは、当技術分野で知られているカルモジュリン結合ペプチドのいずれかから選択される。同じように機能する、より長い変異体が報告されており、上記の引用文献を参照されたい。
【0071】
特に特定の実施形態において、第１の部分エフェクター配列は、２～６個のアミノ酸を有する第１のモジュラー間リンカー配列によって第１のセンサーペプチドのＣ末端に接続され、及び／又は第２の部分エフェクター配列は、２～６個のアミノ酸を有する第２のモジュラー間リンカーによって第２のセンサーポリペプチドのＮ末端に接続される。
【0072】
より特に特定の実施形態において、第１のモジュラー間リンカー配列及び第２のモジュラー間リンカー配列は、ジペプチド又はトリペプチドであり、それらのアミノ酸構成要素は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｓ及びＴ残基から選択される。
【0073】
特定の実施形態において、モジュラーポリペプチドは、配列番号０１０（ＳＰＬＴ１）又は配列番号０１０（ＳＰＬＴ１）と少なくとも９０％同一である配列からなるか、又は含む第１のポリペプチド配列、及び配列番号０１１（ＳＰＬＴ２）又は配列番号０１１（ＳＰＬＴ２）と少なくとも９０％同一の配列である第２のポリペプチド配列を特徴とし、前記第１及び第２のポリペプチド配列が共に、配列番号０１０（ＳＰＬＴ１）と配列番号０１１（ＳＰＬＴ２）との組み合わせの少なくとも０．５％、特に≧１％又は≧２％の活性を有する。特定の実施形態では、センサーモジュールは、Ｎ末端からＣ末端へ、
カルモジュリンポリペプチド、特に配列番号００９（ＣａＭ）、又は配列番号００９（ＣａＭ）と少なくとも９０％同一であり、かつ実質的に同じ活性を有する配列；
ペプチドセンサーリンカー配列、特にポリプロリン型剛性ヘリックス、より特に、ｎが１５～３５までの整数から選択され、任意に１～４個のアミノ酸が隣接するＰｎプロリンポリペプチド、又はＧ、Ｔ、Ｓ、Ａから選択される１～１０残基の短い柔軟なストレッチによって遮られたポリプロリン配列；
カルモジュリン結合ペプチド（第２の部分センサー配列）、特に配列番号００８（Ｍ１３）を含む又はそれからなる配列
を含む、単一センサーペプチドによって構成される。
カルモジュリンポリペプチド、特に配列番号００９（ＣａＭ）、又は配列番号００９（ＣａＭ）と少なくとも９０％同一であり、かつ実質的に同じ活性を有する配列；
ペプチドセンサーリンカー配列、特にポリプロリン型剛性ヘリックス、より特に、ｎが１５～３５までの整数から選択され、任意に１～４個のアミノ酸が隣接するＰｎプロリンポリペプチド、又はＧ、Ｔ、Ｓ、Ａから選択される１～１０残基の短い柔軟なストレッチによって遮られたポリプロリン配列；
カルモジュリン結合ペプチド（第２の部分センサー配列）、特に配列番号００８（Ｍ１３）を含む又はそれからなる配列
を含む、単一センサーペプチドによって構成される。
【0074】
特定の実施形態において、本発明のモジュラーポリペプチドは、配列番号０１３（ＣＯＮＦ１）及び配列番号０１４（ＣＯＮＦ２）、又は配列番号０１３（ＣＯＮＦ１）の少なくとも０．５％、特に≧１％又は≧２％の活性を有する配列番号０１４（ＣＯＮＦ２）又は配列番号０１３（ＣＯＮＦ１）と少なくとも９０％同一の配列から選択される配列を含むか、又はそれらからなる。
【0075】
特定の実施形態では、センサーモジュール配列は、以下を含むか、又は本質的にそれからなる：
ａ． グルタミン酸結合タンパク質のＮ末端部分であり、特に第１のセンサーポリペプチドが配列番号０２０（ＧＬＴ１）、又は配列番号０２０（ＧＬＴ１）と少なくとも９０％同一である配列であるか、又はそれを含む、前記グルタミン酸結合タンパク質のＮ末端部分、及び
グルタミン酸結合タンパク質のＣ末端部分であり、特に第２のセンサーポリペプチドが配列番号０２１（ＧＬＴ２）、又は配列番号０２１（ＧＬＴ２）と少なくとも９０％同一であり、かつ実質的に同じ生物学的活性を有し、特に細菌ペリプラズムグルタミン酸結合タンパク質、より特にＧｌｔｌ由来である配列であるか、又はそれを含む、前記グルタミン酸結合タンパク質のＣ末端部分；
ここで、第一のセンサーポリペプチドと第二のセンサーポリペプチドとの組み合わせが、配列番号０２０（ＧＬＴ１）と配列番号０２１（ＧＬＴ２）との組み合わせと実質的に同じ生物活性を有する；
又は
ｂ． ポリペプチドリンカーにより配列番号０２１（ＧＬＴ２）に結合した配列番号０２０（ＧＬＴ１）からなるコンストラクトと少なくとも（≧）９０％同一の配列であり、特にセンサーモジュールの配列が配列番号０２２（ＧＬＴ３）、又は配列番号０２２（ＧＬＴ３）と少なくとも９０％同一であり、かつ実質的に同じ生物学的活性を有する配列であるか、又はそれを含む、前記配列。
ａ． グルタミン酸結合タンパク質のＮ末端部分であり、特に第１のセンサーポリペプチドが配列番号０２０（ＧＬＴ１）、又は配列番号０２０（ＧＬＴ１）と少なくとも９０％同一である配列であるか、又はそれを含む、前記グルタミン酸結合タンパク質のＮ末端部分、及び
グルタミン酸結合タンパク質のＣ末端部分であり、特に第２のセンサーポリペプチドが配列番号０２１（ＧＬＴ２）、又は配列番号０２１（ＧＬＴ２）と少なくとも９０％同一であり、かつ実質的に同じ生物学的活性を有し、特に細菌ペリプラズムグルタミン酸結合タンパク質、より特にＧｌｔｌ由来である配列であるか、又はそれを含む、前記グルタミン酸結合タンパク質のＣ末端部分；
ここで、第一のセンサーポリペプチドと第二のセンサーポリペプチドとの組み合わせが、配列番号０２０（ＧＬＴ１）と配列番号０２１（ＧＬＴ２）との組み合わせと実質的に同じ生物活性を有する；
又は
ｂ． ポリペプチドリンカーにより配列番号０２１（ＧＬＴ２）に結合した配列番号０２０（ＧＬＴ１）からなるコンストラクトと少なくとも（≧）９０％同一の配列であり、特にセンサーモジュールの配列が配列番号０２２（ＧＬＴ３）、又は配列番号０２２（ＧＬＴ３）と少なくとも９０％同一であり、かつ実質的に同じ生物学的活性を有する配列であるか、又はそれを含む、前記配列。
【0076】
特定の実施形態において、モジュラーポリペプチドは、配列番号０２３（ＧＬＴＩＮＤ１）、又は配列番号０２３（ＧＬＴＩＮＤ１）と少なくとも９０％同一である配列からなるか、又はそれを含む第１のポリペプチド配列、及び配列番号０２４（ＧＬＴＩＮＤ２）又は配列番号０２４（ＧＬＴＩＮＤ２）と少なくとも９０％同一の配列である第２のポリペプチド配列を特徴とし、前記第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列は共に、少なくとも０．５％、特に≧１％又は≧２％の配列番号０２５（ＧＬＴＩＮＤ３）の活性を有する。
【0077】
特定の実施形態では、センサーモジュールは、以下を含むセンサーポリペプチド対によって構成される：
ＦＫＢＰ１２ポリペプチドであるか、又はそれを含む第１のセンサーポリペプチドであり、特にＦＫＢＰ１２ポリペプチドが配列番号０１５（ＦＫＢＰ）、又は配列番号０１５（ＦＫＢＰ）と少なくとも９０％同一であり、かつ本質的に同じ生物活性を有する配列であるか、又はそれを含む、前記第１のセンサーポリペプチド、及び
ＦＲＢペプチドであるか、又はそれを含む第２のセンサーポリペプチドであり、特にＦＲＢペプチドが配列番号０１６（ＦＲＢ）、又は配列番号０１６（ＦＲＢ）と少なくとも９０％同一であり、かつ本質的に同じ生物活性を有する配列であるか、又はそれを含む、前記第２のセンサーポリペプチド、
ここで、前記第１のセンサーポリペプチドは、ペプチド結合を介して、第１の部分エフェクター配列に共有結合しており、かつ第２のセンサーポリペプチドは第２の部分エフェクター配列に共有結合しており、かつ第１のセンサーポリペプチドと第２のセンサーポリペプチドとは別々のポリペプチド鎖の部分である。
ＦＫＢＰ１２ポリペプチドであるか、又はそれを含む第１のセンサーポリペプチドであり、特にＦＫＢＰ１２ポリペプチドが配列番号０１５（ＦＫＢＰ）、又は配列番号０１５（ＦＫＢＰ）と少なくとも９０％同一であり、かつ本質的に同じ生物活性を有する配列であるか、又はそれを含む、前記第１のセンサーポリペプチド、及び
ＦＲＢペプチドであるか、又はそれを含む第２のセンサーポリペプチドであり、特にＦＲＢペプチドが配列番号０１６（ＦＲＢ）、又は配列番号０１６（ＦＲＢ）と少なくとも９０％同一であり、かつ本質的に同じ生物活性を有する配列であるか、又はそれを含む、前記第２のセンサーポリペプチド、
ここで、前記第１のセンサーポリペプチドは、ペプチド結合を介して、第１の部分エフェクター配列に共有結合しており、かつ第２のセンサーポリペプチドは第２の部分エフェクター配列に共有結合しており、かつ第１のセンサーポリペプチドと第２のセンサーポリペプチドとは別々のポリペプチド鎖の部分である。
【0078】
特に特定の実施形態において、第１の部分エフェクター配列は、２～９個のアミノ酸を有する第１のモジュラー間リンカー配列によって第１のセンサーポリペプチドのＣ末端に接続され、及び／又は第２の部分エフェクター配列は、２～９個のアミノ酸を有する第２のモジュラー間リンカーによって第２のセンサーポリペプチドのＮ末端に接続される。
【0079】
より特に特定の実施形態において、第１のモジュラー間リンカー配列及び第２のモジュラー間リンカー配列は、トリペプチドであり、アミノ酸構成要素は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｓ及びＴ残基から選択される。
【0080】
特定の実施形態において、モジュラーポリペプチドは、配列番号０１７（ＲＡＰＩＮＤ１）又は配列番号０１７（ＲＡＰＩＮＤ１）と少なくとも９０％同一である配列からなるか、又はそれを含む第１のポリペプチド配列、及び配列番号０１８（ＲＡＰＩＮＤ２）及び配列番号０１９（ＲＡＰＩＮＤ３）又は配列番号０１８（ＲＡＰＩＮＤ２）と少なくとも９０％同一の配列から選択される第２のポリペプチド配列を特徴とし、前記第１及び第２のポリペプチド配列は共に、少なくとも０．５％、特に≧１％、又は≧２％の配列番号０１７（ＲＡＰＩＮＤ１）と配列番号０１８（ＲＡＰＩＮＤ２）との組み合わせの活性を有する。特に特定の実施形態では、第１及び第２のポリペプチド配列は共に、５％、１０％、１５％、２０％、又は３３％の配列番号０１７（ＲＡＰＩＮＤ１）と配列番号０１８（ＲＡＰＩＮＤ２）との組み合わせの活性を有する。
【0081】
本発明の別の態様は、本明細書の態様、実施形態、又は実施例のいずれかに記載されるとおり、本発明によるモジュラー分析物センサーポリペプチドをコードする１つの核酸配列又は複数の核酸配列に関する。
【0082】
本発明は、以下を含む核酸配列の組み合わせによって同様に具体化することができる：
－ 第１の部分エフェクターポリペプチド配列をコードする第１の核酸配列であり、前記コードされた第１の部分エフェクター配列は、Ｎ末端からＣ末端に、
－配列番号００２、又は配列番号００２と少なくとも（≧）９０％同一（特に≧９３％、≧９５％、≧９７％又は≧９８％同一）の配列、
－Ｇ、Ａ、Ｊ、Ｓ、Ｔから選択される１０～３５個（特に約１５個）のアミノ酸、より特に１２～２０個のアミノ酸を有するポリペプチドリンカー配列、
－配列番号００３、又は配列番号００３と少なくとも（≧）９０％同一（特に≧９３％、≧９５％、≧９７％、又は≧９８％同一）の配列、
を含む、前記第１の核酸配列；
－ 配列番号００６（ＰＥＰ１）、配列番号００７（ＰＥＰ２）、又は配列番号００６（ＰＥＰ１）と少なくとも（≧）９５％同一（特に≧９６％、≧９７％、≧９８％、又は≧９９％同一）の配列を特徴とする、第２の部分エフェクターペプチド配列をコードする第２の核酸配列、
ここで、前記第１及び第２の部分エフェクターポリペプチド配列は、共に、円順列変異ハロアルカンデハロゲナーゼを構成し、互いに近接している場合に、ハロゲンアルカン部分の共有結合をもたらすことができる。この場合も、本発明に包含されるとみなされる配列変異体を定義する目的で、センサーモジュール配列と組み合わせることができる分割エフェクターモジュールの組み合わせの閾値は、実施例９に記載されているとおり標準アッセイにおいて活性が１０２ｓ－１Ｍ－１である。
－ 第１の部分エフェクターポリペプチド配列をコードする第１の核酸配列であり、前記コードされた第１の部分エフェクター配列は、Ｎ末端からＣ末端に、
－配列番号００２、又は配列番号００２と少なくとも（≧）９０％同一（特に≧９３％、≧９５％、≧９７％又は≧９８％同一）の配列、
－Ｇ、Ａ、Ｊ、Ｓ、Ｔから選択される１０～３５個（特に約１５個）のアミノ酸、より特に１２～２０個のアミノ酸を有するポリペプチドリンカー配列、
－配列番号００３、又は配列番号００３と少なくとも（≧）９０％同一（特に≧９３％、≧９５％、≧９７％、又は≧９８％同一）の配列、
を含む、前記第１の核酸配列；
－ 配列番号００６（ＰＥＰ１）、配列番号００７（ＰＥＰ２）、又は配列番号００６（ＰＥＰ１）と少なくとも（≧）９５％同一（特に≧９６％、≧９７％、≧９８％、又は≧９９％同一）の配列を特徴とする、第２の部分エフェクターペプチド配列をコードする第２の核酸配列、
ここで、前記第１及び第２の部分エフェクターポリペプチド配列は、共に、円順列変異ハロアルカンデハロゲナーゼを構成し、互いに近接している場合に、ハロゲンアルカン部分の共有結合をもたらすことができる。この場合も、本発明に包含されるとみなされる配列変異体を定義する目的で、センサーモジュール配列と組み合わせることができる分割エフェクターモジュールの組み合わせの閾値は、実施例９に記載されているとおり標準アッセイにおいて活性が１０２ｓ－１Ｍ－１である。
【0083】
特定の実施形態において、分割エフェクターモジュールは、上記の実施例及び実施形態のとおり空間的近接性に有利な条件下で組み合わされる場合、配列番号００１の活性の少なくとも０．５％、特に≧１％又は≧２％を示す。特定の実施形態において、分割エフェクターモジュールは、上記の実施例及び実施形態のとおり空間的近接性に有利な条件下で組み合わされる場合、実施例９に示されるとおり、標準アッセイにおいて少なくとも１０２ｓ－１Ｍ－１の活性を有する。
【0084】
この組み合わせは、例えば、実験的センサーモジュールをコードする核酸を挿入するための核酸ベクターとして、又はエフェクターモジュールの補完される活性によって相互作用が調べられるコードされたペプチドのペアへの融合のために提供され得る。
【0085】
本発明の別の態様は、前述の態様による核酸配列、又は本明細書に記載のとおりの配列のエフェクターモジュール対をコードする核酸の組み合わせ（各核酸配列は、プロモーター配列の制御下にある）を含む核酸発現システムに関する。
【0086】
本発明の別の態様は、本明細書に開示されるとおりの核酸発現システム又は核酸配列を含む単離された細胞又はトランスジェニック非霊長類動物に関し、特に前記細胞においてプロモーターが作動可能である。
【0087】
同様に、本発明は、本明細書に開示されるとおりの核酸配列又は核酸発現システム、及びハロタグ７基質、特に蛍光色素に共有結合されるハロアルカン部分を含むキットによって具体化することができる。
【0088】
ハロタグシステムは、Ｌｏｓらによって最初に公開された（ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８Ｖｏ ３（６）３７３－３８２）。これは、Ｅｎｇｌａｎｄら．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１５，２６ ９７５－９８６で再考察されている。ハロタグシステム及びそこで有用な基質分子の一般的な態様を示す特許文献には、米国特許第８２０２７００Ｂ２号、米国特許第７８６７７２６号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７５６、米国特許第９９２７４３０Ｂ２号、米国特許第１０１６８３２３Ｂ２号及び米国特許第２０１４３２２７３８号が含まれ、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【0089】
本発明で使用することができる例示的な蛍光色素分子の基質には、以下の表に示される蛍光色素分子の基質化合物が含まれるが、これらに限定されない：
【0090】
【表1】
【0091】
単一の分離可能な特徴の代替がどこであれ、そのような代替は、本明細書に開示される本発明の別個の実施形態を形成するために自由に組み合わせることができることが理解されるべきである。
【0092】
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこから、さらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの例は、本発明を説明することを意図しているが、その範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【0093】
実施例１：分割ハロタグ７に基づくカルシウムシグナルインテグレーターの設計
ハロタグ７は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓのハロアルカンデヒドロゲナーゼＤｈａＡに由来する自己標識タンパク質であり、合成クロロアルカンリガンドと特異的に反応して共有結合する。分割システムを生成した。ここではハロタグ７の元の末端を、（ＧＧＳ／Ｔ）５リンカーを介して接続し、ｃｐＨａｌｏ１４１～１４５（ｃｐハロタグ７は位置１４１及び１４５で新しい末端を有する）及びｃｐＨａｌｏ１５６～１５４の円順列変異（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｎｔ：ＣＰ）部位の間のペプチドをハロタグ７タンパク質から切除した。これらの位置の間の部分を切除して、ｃｐＨａｌｏ１５６～１４１からなる分割体と、位置１４５～１５３／１５４までの短い９ｍｅｒペプチドを生成した。
ハロタグ７は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓのハロアルカンデヒドロゲナーゼＤｈａＡに由来する自己標識タンパク質であり、合成クロロアルカンリガンドと特異的に反応して共有結合する。分割システムを生成した。ここではハロタグ７の元の末端を、（ＧＧＳ／Ｔ）５リンカーを介して接続し、ｃｐＨａｌｏ１４１～１４５（ｃｐハロタグ７は位置１４１及び１４５で新しい末端を有する）及びｃｐＨａｌｏ１５６～１５４の円順列変異（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｎｔ：ＣＰ）部位の間のペプチドをハロタグ７タンパク質から切除した。これらの位置の間の部分を切除して、ｃｐＨａｌｏ１５６～１４１からなる分割体と、位置１４５～１５３／１５４までの短い９ｍｅｒペプチドを生成した。
【0094】
ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒ－９ｍｅｒペプチドのカップルは有望な予備的結果を示したため、カルシウムインテグレーターの第１のバージョンを、ＧＧＳリンカーを介してそれぞれＭ１３ペプチドとカルモジュリンタンパク質とに融合することによって設計した。カルシウム濃度が高くなると、カルモジュリンは最大４つのカルシウムイオンに結合し、Ｍ１３認識ペプチドへの親和性を大幅に高める大きなコンフォメーション変化をもたらす。結果として生じるカルモジュリンとＭ１３との結合は、９ｍｅｒペプチドによるｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒの補完化をもたらす。補完される場合、この酵素は活性を取り戻し、蛍光ハロタグ基質と反応することができ、永続的なマークを残すため、このシグナルを統合することができる。
【0095】
実施例２：ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒと９ｍｅｒペプチドとの間の親和性
等温滴定熱量測定
ｃｐＨａｌｏ＿９ｍｅｒと９ｍｅｒペプチドとの間の親和性を、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ：ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）を使用した標識なしのアプローチによって測定した。
等温滴定熱量測定
ｃｐＨａｌｏ＿９ｍｅｒと９ｍｅｒペプチドとの間の親和性を、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ：ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）を使用した標識なしのアプローチによって測定した。
【0096】
９ｍｅｒペプチドは、活性バッファー（ＨＥＰＥＳ ５０ｍＭ ｐＨ ７．３－ＮａＣｌ ５０ｍＭ）に約３０ｍＭで溶解し、そして強い温度依存様式で高濃度にてゲルを形成する。このペプチドの最大濃度は、０．６ｍＭのｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒに対して滴定された（図１）。異常に高いＫｄを確認するために、ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒの異なるバッチで実験を３回繰り返した。５．３＋／－１．５ｍＭのＫｄ値は、３回の独立した測定値から計算することができた。
【0097】
実施例３：ハロタグ７及びｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒに対する蛍光リガンドの親和性
本発明者らは、いくつかの代表的な蛍光ハロタグ基質を用いて実験を行うことを決定した。アラニンによる活性部位のアスパラギン酸１０６残基の交換により、自己標識反応の原因となる求核体を除去し、このタンパク質の触媒活性を排除した。ハロタグ７（ハロタグ７Ｄ１０６Ａ）及びｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒ（ｃｐＨａｌｏ＿９ｍｅｒＤ１０６Ａ）の触媒作用のない変異体を生成して、酵素反応により平衡が変位することなしに基質親和性を測定した。
本発明者らは、いくつかの代表的な蛍光ハロタグ基質を用いて実験を行うことを決定した。アラニンによる活性部位のアスパラギン酸１０６残基の交換により、自己標識反応の原因となる求核体を除去し、このタンパク質の触媒活性を排除した。ハロタグ７（ハロタグ７Ｄ１０６Ａ）及びｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒ（ｃｐＨａｌｏ＿９ｍｅｒＤ１０６Ａ）の触媒作用のない変異体を生成して、酵素反応により平衡が変位することなしに基質親和性を測定した。
【0098】
ハロタグ７による蛍光発生リガンドの結合は、蛍光の強力な増加を引き起こすために、ハロタグ７Ｄ１０６Ａに対する異なる蛍光基質の親和性をＦＰ結合アッセイで決定し（図２）、一方で蛍光発生シリコン－ローダミン由来基質の親和性を蛍光強度に基づく結合アッセイ（図３）により測定した。どちらの場合も、０μＭ～１００μＭの範囲のハロタグ７Ｄ１０６Ａ濃度を、２５ｎＭの色素に対して滴定した。ハロタグ７Ｄ１０６Ａは、Ｈａｌｏカルボピロニン（Ｈａｌｏ－ＣＰＹ）の６２２＋／－３．７ｎＭからＨａｌｏ－Ｊａｎｅｌｉａ Ｆｌｕｏｒ６３５の１７２．２＋／－８．２μＭの範囲の親和性でリガンドに結合する（表１）。観察された親和性は、異なる基質で記録された標識カイネティックスと一致している（データは示さず）。一般に、蛍光発生基質は、同じ範囲の親和性を特徴とするＨａｌｏ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を除いて、非蛍光発生基質よりもハロタグ７Ｄ１０６Ａに対する親和性が低くなる。さらに、シリコンローダミン誘導体内では、アゼチジン部分又は３－フルオロアゼチジン部分の存在が、結合親和性に影響を及ぼし、これはローダミン構造と比較してより顕著である。ハロタグ７に対して最高の親和性を示す蛍光ハロタグリガンドの親和性を、ＦＰ結合アッセイでｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒＤ１０６Ａを使用して試験し、結果をハロタグ７Ｄ１０６Ａを使用した測定値と比較した（図４、表１）。
【0099】
実施例４：ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒのバックグラウンド標識
タンパク質補完アッセイを十分に機能させるには、低いバックグラウンドを必要とする。したがって、本発明者らは、異なる蛍光色素分子（Ｈａｌｏ－ＴＭＲ、Ｈａｌｏ－ＣＰＹ及びＨａｌｏ－ＳｉＲ）によるｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒのバックグラウンド標識の程度を測定した。したがって、ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒを過剰の異なる蛍光リガンドと共にインキュベートした。
タンパク質補完アッセイを十分に機能させるには、低いバックグラウンドを必要とする。したがって、本発明者らは、異なる蛍光色素分子（Ｈａｌｏ－ＴＭＲ、Ｈａｌｏ－ＣＰＹ及びＨａｌｏ－ＳｉＲ）によるｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒのバックグラウンド標識の程度を測定した。したがって、ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒを過剰の異なる蛍光リガンドと共にインキュベートした。
【0100】
３７℃及び異なる時点での標識効率を、ゲル蛍光測定によって決定した（図５）。Ｈａｌｏ－ＴＭＲ及びＨａｌｏ－ＳｉＲでは、非常に低いバックグラウンド標識を観察した。Ｈａｌｏ－ＣＰＹはわずかに強いバックグラウンド標識を示し、２４時間後に最終的に２０％に達した。これらの発見は、蛍光リガンドの親和性と一致している（図４）。実際、Ｈａｌｏ－ＣＰＹはｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒに対して最も高い親和性を示し、２μＭでリガンドに対してある程度の親和性を示しており、実験の設定を考慮してもなお最低限残る標識をもたらす。
【0101】
実施例５：スプリットハロタグ７に基づくカルシウムシグナルインテグレーターの特性評価と最適化：リンカーの最適化
カルシウムインテグレーターの初期設計は、ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒとＭ１３ペプチド、及び９ｍｅｒペプチドとカルモジュリンとの融合からなる。両方の融合パートナーは、ＧＣａＭＰ６ｆのカルシウム感知ドメインから得られる。基質としてＨａｌｏ－ＴＭＲを使用した蛍光偏光によるカイネティックスは、カルシウムの非存在下ではバックグラウンドがなく、カルシウムの存在下で標識の２次速度定数は６．７＋／－０．５＊１０３ｓ－１Ｍ－１であることが明らかになった。
カルシウムインテグレーターの初期設計は、ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒとＭ１３ペプチド、及び９ｍｅｒペプチドとカルモジュリンとの融合からなる。両方の融合パートナーは、ＧＣａＭＰ６ｆのカルシウム感知ドメインから得られる。基質としてＨａｌｏ－ＴＭＲを使用した蛍光偏光によるカイネティックスは、カルシウムの非存在下ではバックグラウンドがなく、カルシウムの存在下で標識の２次速度定数は６．７＋／－０．５＊１０３ｓ－１Ｍ－１であることが明らかになった。
【0102】
最適なリンカーは、ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒを補完するために、９ｍｅｒペプチドを良好な距離と適切な方向とに配置するのに役立つべきである。したがって、分割の各部分の３つの変異体を、さまざまなリンカー長（（ＧＧＳ）１～３）で生成した。これらのコンストラクトにより、最適な組み合わせで機能するために、リンカーの長さのすべての組み合わせをスクリーニングすることができた。Ｍ１３－ｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒリンカーと９ｍｅｒ－カルモジュリンリンカーの両方で、リンカーの長さが増加すると、カルシウム誘導活性が大幅に低下することを観察した。興味深いことに、最初に選択した単一のＧＧＳリンカーは、カルシウムによる最速の標識速度を示し、２．５時間後に検出可能なバックグラウンドを示さないため、明らかに最高の性能を示した（図６）。
【0103】
実施例６：分割ハロタグ７に基づく分子内カルシウムインテグレーターの設計及び試験
本発明者らは、異なるリンカードメインを使用してカルモジュリンとＭ１３の間の２つのインテグレーターのコンパートメントを融合することにより、「ＣａＰｒｏＬａ」（カルシウム依存性タンパク質標識）と呼ばれる単純化された分子内カルシウムインテグレーターを設計した（図７）。以下のカルモジュリン－Ｍ１３リンカーを、この第１世代のＣａＰｒｏＬａコンストラクトに対して試験した：
・ 柔軟性ＧＧＴＧＧＳ（配列番号０２６）リンカー－（ＣａＰｒｏＬａ１．１）
・ 部分的に柔軟性で、部分的に剛性のＰｒｏ１５－（ＧＧＳ）２－Ｐｒｏ１５リンカー－（ＣａＰｒｏＬａ１．２）
・ 剛性Ｐｒｏ３０リンカー－（ＣａＰｒｏＬａ１．３）
・ Ｐｒｏ１５リンカーが隣接するＳＮＡＰタグドメイン－（ＣａＰｒｏＬａ１．４）
本発明者らは、異なるリンカードメインを使用してカルモジュリンとＭ１３の間の２つのインテグレーターのコンパートメントを融合することにより、「ＣａＰｒｏＬａ」（カルシウム依存性タンパク質標識）と呼ばれる単純化された分子内カルシウムインテグレーターを設計した（図７）。以下のカルモジュリン－Ｍ１３リンカーを、この第１世代のＣａＰｒｏＬａコンストラクトに対して試験した：
・ 柔軟性ＧＧＴＧＧＳ（配列番号０２６）リンカー－（ＣａＰｒｏＬａ１．１）
・ 部分的に柔軟性で、部分的に剛性のＰｒｏ１５－（ＧＧＳ）２－Ｐｒｏ１５リンカー－（ＣａＰｒｏＬａ１．２）
・ 剛性Ｐｒｏ３０リンカー－（ＣａＰｒｏＬａ１．３）
・ Ｐｒｏ１５リンカーが隣接するＳＮＡＰタグドメイン－（ＣａＰｒｏＬａ１．４）
【0104】
各コンストラクト及び分割システムを、以下の４つの異なる条件でＨａｌｏ－ＴＭＲを基質として使用するＦＰカイネティックスアッセイにおいて試験した（図８）：
・ 標識カイネティックス及び速度定数を決定するためのカルシウムの存在下（陽性実験）
・ バックグラウンド標識をアッセイするための、カルシウム非存在における、ＥＧＴＡの添加による確認（陰性実験）
・ 基質との長時間のインキュベーション後の活性を示すための、カルシウム非存在だが、１時間後にカルシウムを急増させる（スパイク）（スパイク実験）
・ センサーの可逆性を示すための、カルシウムの存在下において、続いてＥＧＴＡ急増で反応を停止し、次いでカルシウム急増で反応を再開させる（可逆性実験）
・ 標識カイネティックス及び速度定数を決定するためのカルシウムの存在下（陽性実験）
・ バックグラウンド標識をアッセイするための、カルシウム非存在における、ＥＧＴＡの添加による確認（陰性実験）
・ 基質との長時間のインキュベーション後の活性を示すための、カルシウム非存在だが、１時間後にカルシウムを急増させる（スパイク）（スパイク実験）
・ センサーの可逆性を示すための、カルシウムの存在下において、続いてＥＧＴＡ急増で反応を停止し、次いでカルシウム急増で反応を再開させる（可逆性実験）
【0105】
試験したすべての変異体は、カルシウムの存在下で３＊１０３ｓ－１Ｍ－１～５＊１０３ｓ－１Ｍ－１の範囲の同様の速度定数を示した。さらに、１時間後のカルシウムスパイクによる誘導及び可逆性実験は成功し、９ｍｅｒペプチドがｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒ構造に結合すると、（分子内システムでさえ）結合を解くことができ、優れたダイナミクスを提供することを示唆した。
【0106】
ただし、センサーのバックグラウンド標識には違いが見られる。分割インテグレーターは２時間にわたって検出可能なバックグラウンドを示さなかったが、ＣａＰｒｏＬａコンストラクトはさまざまな程度のバックグラウンド標識を示し、Ｍ１３－ＣａＭリンカーの剛性と相関していた。最小のバックグラウンドは、Ｐｒｏ３０リンカーとＰｒｏ１５－ＳＮＡＰ－Ｐｒｏ１５ドメインで観察された。
【0107】
実施例７：異なるＣａＰｒｏＬａコンストラクトのカルシウム応答性
ＣａＰｒｏＬａの第１の設計用に選択されたカルモジュリン－Ｍ１３ペアを、ＧＣａＭＰ６ｆから得た。構造的な状況に応じて、カルシウムに対するペアの応答性は変化することができる。カルモジュリン部分は、非常に複雑なアロステリック挙動で最大４つのカルシウム原子に結合する。ただし、センサーに組み込まれている場合、遊離カルシウム濃度に対するセンサー活性の単純な滴定は、センサーの応答範囲を表すＥＣ５０の同定につながる。
ＣａＰｒｏＬａの第１の設計用に選択されたカルモジュリン－Ｍ１３ペアを、ＧＣａＭＰ６ｆから得た。構造的な状況に応じて、カルシウムに対するペアの応答性は変化することができる。カルモジュリン部分は、非常に複雑なアロステリック挙動で最大４つのカルシウム原子に結合する。ただし、センサーに組み込まれている場合、遊離カルシウム濃度に対するセンサー活性の単純な滴定は、センサーの応答範囲を表すＥＣ５０の同定につながる。
【0108】
異なるＭ１３－ＣａＭリンカーを持つＣａＰｒｏＬａコンストラクトのカルシウム依存性を、カルシウム依存性ＥＣ５０を測定することによって特徴づけた。したがって、異なるカルシウム濃度での標識を、ＦＰカイネティックスアッセイでモニターした。ナノモル範囲で定義されたカルシウム濃度を達成するために、Ｋ２ＥＧＴＡ－ＣａＥＧＴＡ緩衝システムを使用した。カルシウム依存性ＥＣ５０を計算するために初期反応速度を決定した（図９）。測定されたＥＣ５０値は、低ナノモル範囲（１９ｎＭ～１４６ｎＭ）であり、Ｍ１３－ＣａＭリンカーの剛性に依存する。リンカーの剛性を高めると、ＥＣ５０が高くなる。比較のために、同じカルモジュリン－Ｍ１３のカップルを使用したＧＣａＭＰ６ｆは、３７５＋／－１４ｎＭのＥＣ５０を示す。
【0109】
実施例８：ＣａＰｒｏＬａコンストラクトのカルシウム応答性の調整
ニューロンの安静時カルシウム濃度は５０ｎＭ～１００ｎＭであると報告されている。結果として、第１世代のＣａＰｒｏＬａは、カルシウムに対して感受性が高すぎてニューロンで機能できないと考えられた。したがって、第２世代のＣａＰｒｏＬａは、特にＥＣ５０の増加に伴い、異なるカルシウム応答性を示す異なるコンストラクトを生成することを目的として設計した。
ニューロンの安静時カルシウム濃度は５０ｎＭ～１００ｎＭであると報告されている。結果として、第１世代のＣａＰｒｏＬａは、カルシウムに対して感受性が高すぎてニューロンで機能できないと考えられた。したがって、第２世代のＣａＰｒｏＬａは、特にＥＣ５０の増加に伴い、異なるカルシウム応答性を示す異なるコンストラクトを生成することを目的として設計した。
【0110】
カルモジュリン－Ｍ１３のカップルは高度に研究されており、カルシウム応答性を改変するために多数の変異が報告され、かつセンサーにおいて使用されている。したがって、本発明者らは、Ａｄｄｇｅｎｅに寄託されたカルシウムインテグレーターＣａＭＰＡＲＩ２の未だ公開されていないバージョン（Ｓｃｈｒｅｉｔｅｒ，Ｅ、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド、番号１０１０６１、番号１０１０６２及び番号１０１０６４）に基づいて設計を行うことを決定した。これらのＣａＭＰＡＲＩ２の変異体は、１１０ｎＭ～８２５ｎＭの範囲のＥＣ５０値で注釈が付けられており、同様の用途に設計されている。
【0111】
修飾されたＭ１３ペプチドのうち３つを、第２世代のＣａＰｒｏＬａコンストラクト（ＣａＰｒｏＬａ２．１～２．３）に実装した。これらのコンストラクトは、バックグラウンドが低いため、すべてＣａＰｒｏＬａ１．３（Ｐｒｏ３０Ｍ１３－ＣａＭリンカー）をベースにしている。新しいＣａＰｒｏＬａコンストラクトのＥＣ５０値は、上記のとおり決定した（図１０）。
【0112】
ＣａＰｒｏＬａ２．１～２．３のＥＣ５０値は、ＣａＭＰＡＲＩ２に注釈が付けられている値に匹敵する（表２）。ＣａＰｒｏＬａ２．１と２．２はどちらも、バージョン１．４よりも大幅に高いＥＣ５０を特徴とし、ニューロンのカルシウム波の統合に適している可能性がある（５００ｎＭ～１０μＭ）。
【0113】
第１世代と同様に、すべての新しいＣａＰｒｏＬａコンストラクトは、ＦＰカイネティックスの実験において、カルシウムが誘導されるカイネティックス、可逆性、及びバックグラウンド標識に関して試験した（図１１）。試験した３つのコンストラクトから、ＣａＰｒｏＬａ２．２のみが期待どおりに機能した。第１のＣａＰｒｏＬａ生成よりも少し遅いが（２．３＋／－０．０１４＊１０３ｓ－１Ｍ－１の速度定数）、４時間のインキュベーション中にバックグラウンドは観察されず、標識反応は可逆的であった。ＣａＰｒｏＬａ２．１、及び特に２．３は、わずかに遅いカイネティックス（約１＊１０３ｓ－１Ｍ－１）、及びさらに重要なことに、より高いバックグラウンド標識により劣っていた。しかし、ＥＣ５０の測定ではすべてのコンストラクトが良好に機能したため、実験的間違いを排除するためには、これらの実験を繰り返す必要がある。
【0114】
次いで、ＦＰアッセイで得られた結果を確認するために、ＣａＰｒｏＬａ２．２コンストラクトをゲル内蛍光法で試験した（図１２）。Ｈａｌｏ－ＣＰＹを基質としてゲル内蛍光測定を実施し、この蛍光色素分子では２時間後にバックグラウンドが顕著になり始めることを示した。より直接的な読み取り（ＦＰがいずれの結合を観察する）の性質により、これらの結果は細胞アッセイでの転移を促進するＣａＰｒｏＬａ ２．２の良好な機能を確認した。
【0115】
実施例９：ハロタグ７又はハロタグ７の円順列変異の性能を試験するための蛍光偏光に基づくアッセイ：
タンパク質の生産及び精製
精製タグ（Ｈｉｓタグ及び可能なＳｔｒｅｐタグ）に融合したタンパク質（ハロタグ７－ｃｐＨａｌｏ変異体又はＸ－ＰｒｏＬａ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＬｙｓＳ株で発現され、古典的ＩＭＡＣ（及び可能なＳｔｒｅｐ Ｔｒａｐアフィニティークロマトグラフィー法）を使用して精製される。バッファー交換及び濃縮の後、必要に応じて（ｃｐＨａｌｏ変異体の場合）、Ｎ末端のＨｉｓタグをＴＥＶ切断及び逆ＩＭＡＣ精製によって除去した。バッファーを適切なバッファー（例えば、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）に交換する。必要に応じて、同じバッファーでサイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに精製することができる。
タンパク質の生産及び精製
精製タグ（Ｈｉｓタグ及び可能なＳｔｒｅｐタグ）に融合したタンパク質（ハロタグ７－ｃｐＨａｌｏ変異体又はＸ－ＰｒｏＬａ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）－ｐＬｙｓＳ株で発現され、古典的ＩＭＡＣ（及び可能なＳｔｒｅｐ Ｔｒａｐアフィニティークロマトグラフィー法）を使用して精製される。バッファー交換及び濃縮の後、必要に応じて（ｃｐＨａｌｏ変異体の場合）、Ｎ末端のＨｉｓタグをＴＥＶ切断及び逆ＩＭＡＣ精製によって除去した。バッファーを適切なバッファー（例えば、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）に交換する。必要に応じて、同じバッファーでサイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに精製することができる。
【0116】
蛍光偏光アッセイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
１００μＬのタンパク質（４００ｎＭにて）を、１００μＬの蛍光ハロタグ基質（すなわちＨａｌｏ－ＣＰＹ）（１００ｎＭにて）と、９６ウェルプレート（黒色－結合しない－平底）にバッファー ５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．３、０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡにおいて混合して標識カイネティックスを実施した。蛍光偏光の増加を、適切なスペクトルフィルター／モノクロメーター（ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋ２０）を備えたマイクロプレートリーダーを使用して記録する。ｃｐＨａｌｏ変異体とハロタグ７のカイネティックスは通常非常に速いため、混合と測定開始との間のずれを最小限に抑えるために、内部インジェクターを備えたプレートリーダーを使用する必要がある。ただし、この装置を使用しても、１秒未満で完了する反応を観察することは不可能な場合がある。この場合、高いサンプリング速度で蛍光偏光を測定できるストップトフローセットアップが必要である（例：ＢｉｏＬｏｇｉｃＳＦＭ）。このような機器の感度が低下すると、蛍光基質及びタンパク質の濃度を上げる必要がある（つまり、１μＭの基質及び１０μＭのタンパク質を１：１で混合）。
１００μＬのタンパク質（４００ｎＭにて）を、１００μＬの蛍光ハロタグ基質（すなわちＨａｌｏ－ＣＰＹ）（１００ｎＭにて）と、９６ウェルプレート（黒色－結合しない－平底）にバッファー ５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．３、０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡにおいて混合して標識カイネティックスを実施した。蛍光偏光の増加を、適切なスペクトルフィルター／モノクロメーター（ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋ２０）を備えたマイクロプレートリーダーを使用して記録する。ｃｐＨａｌｏ変異体とハロタグ７のカイネティックスは通常非常に速いため、混合と測定開始との間のずれを最小限に抑えるために、内部インジェクターを備えたプレートリーダーを使用する必要がある。ただし、この装置を使用しても、１秒未満で完了する反応を観察することは不可能な場合がある。この場合、高いサンプリング速度で蛍光偏光を測定できるストップトフローセットアップが必要である（例：ＢｉｏＬｏｇｉｃＳＦＭ）。このような機器の感度が低下すると、蛍光基質及びタンパク質の濃度を上げる必要がある（つまり、１μＭの基質及び１０μＭのタンパク質を１：１で混合）。
【0117】
さらに、希釈及び蒸発の影響を考慮するために、いずれのタンパク質を含まない蛍光偏光の時間経過が常に記録され、かつデータから差し引かれる。得られたカイネティックスのデータを二次反応速度則（下の式を参照）に適合させて、二次速度定数（ｋ）を導き出す。誤差を推定するために、実験は少なくとも３重に実行する必要がある。異なる変異体を比較するには、すべてのアッセイを同じ濃度及び基質で実行する必要がある。
【0118】
【数1】
【0119】
Ｘ－ＰｒｏＬａ変異体のアッセイの概論
蛍光偏光アッセイは、Ｘ－ＰｒｏＬａ変異体の性能を試験するためにも使用される。一般的な手順は、上記と同じである。ただし、これらのコンストラクトはハロタグ７又はそのＣＰ変異体よりも遅いことが多いため、プレートリーダーアッセイで十分な場合がある。また、蛍光基質に加えて、センサーを活性化するそれぞれの代謝物／イオン／小分子も追加する必要がある。代謝物がある場合とない場合の標識カイネティックスを記録することにより、バックグラウンドを超えるシグナルを測定でき、異なる代謝物濃度を滴定することにより、Ｘ－ＰｒｏＬａのＥＣ５０値を導き出すことができる（ＥＣ５０は、標識の速度が標識の最大速度の半分になる濃度として定義される）。
蛍光偏光アッセイは、Ｘ－ＰｒｏＬａ変異体の性能を試験するためにも使用される。一般的な手順は、上記と同じである。ただし、これらのコンストラクトはハロタグ７又はそのＣＰ変異体よりも遅いことが多いため、プレートリーダーアッセイで十分な場合がある。また、蛍光基質に加えて、センサーを活性化するそれぞれの代謝物／イオン／小分子も追加する必要がある。代謝物がある場合とない場合の標識カイネティックスを記録することにより、バックグラウンドを超えるシグナルを測定でき、異なる代謝物濃度を滴定することにより、Ｘ－ＰｒｏＬａのＥＣ５０値を導き出すことができる（ＥＣ５０は、標識の速度が標識の最大速度の半分になる濃度として定義される）。
【0120】
実施例１０：タンパク質間アッセイシステム
本発明者らはさらに、単純なモデルシステムにおいてタンパク質間相互作用を標識するための本発明の分割ハロタグシステムの性能を試験した。本発明者らは、小分子薬物ラパマイシンの存在を条件とするタンパク質ＦＫＢＰとＦＲＢとの強い相互作用を使用した。分割ハロタグ断片をＦＫＢＰに融合した後、ＦＲＢ標識はラパマイシンの存在下でのみ観察され、これは我々の戦略がモデルシステムで機能することを示している（図１３）。 相互作用するタンパク質（ＦＫＢＰ／ＦＲＰ）と分割ハロタグ断片との間に異なる柔軟性リンカー（ＧＧＳを１～３倍）を配置して、リンカーの長さの影響を評価し、性能の高いリンカーの組み合わせを見出した（図１４）。すべてのリンカーの組み合わせでは、ノイズに対して少なくとも最小限のシグナルを出したが、特定の組み合わせ（ＦＫＢＰ－ＧＧＳｘ３－ｃｐＨａｌｏΔ及び９ｍｅｒ－ＧＧＳｘ１－ＦＲＢ）は明らかに優れた性能を示した。これらのアッセイは、センサーがタンパク質間相互作用を統合でき、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでのシグナル伝達経路の活性を記録するために使用できる可能性があることを示している。
本発明者らはさらに、単純なモデルシステムにおいてタンパク質間相互作用を標識するための本発明の分割ハロタグシステムの性能を試験した。本発明者らは、小分子薬物ラパマイシンの存在を条件とするタンパク質ＦＫＢＰとＦＲＢとの強い相互作用を使用した。分割ハロタグ断片をＦＫＢＰに融合した後、ＦＲＢ標識はラパマイシンの存在下でのみ観察され、これは我々の戦略がモデルシステムで機能することを示している（図１３）。 相互作用するタンパク質（ＦＫＢＰ／ＦＲＰ）と分割ハロタグ断片との間に異なる柔軟性リンカー（ＧＧＳを１～３倍）を配置して、リンカーの長さの影響を評価し、性能の高いリンカーの組み合わせを見出した（図１４）。すべてのリンカーの組み合わせでは、ノイズに対して少なくとも最小限のシグナルを出したが、特定の組み合わせ（ＦＫＢＰ－ＧＧＳｘ３－ｃｐＨａｌｏΔ及び９ｍｅｒ－ＧＧＳｘ１－ＦＲＢ）は明らかに優れた性能を示した。これらのアッセイは、センサーがタンパク質間相互作用を統合でき、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでのシグナル伝達経路の活性を記録するために使用できる可能性があることを示している。
【0121】
表１：触媒作用のない変異体ハロタグ７Ｄ１０６Ａ及びｃｐＨａｌｏΔ９ｍｅｒＤ１０６ＡのＫｄ値に対する蛍光リガンドの親和性は、非線形回帰から生じる標準誤差で与えられる。
【0122】
【表2】
【0123】
実施例１１：補完するペプチドの変異耐性のスキャン
実験手順
バッファー ５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００μＭ ＥＧＴＡ、０．５ｇ／ｌ ＢＳＡ、ｐＨ ７．３で実行された蛍光偏光によるカイネティックス。３７℃で平衡化した黒色の平底９６ウェルプレートで、１００μｌの４００ｎＭタンパク質及び１００ｎＭのＨａｌｏ－ＴＭＲをバッファーで混合。１００μｌの１０ｍＭ ＣａＣｌ２ をバッファーに注入して反応を開始。最終濃度：２００ｎＭ タンパク質、５０ｎＭ Ｈａｌｏ－ＴＭＲ、５ｍＭ ＣａＣｌ２。タンパク質を添加なしでバックグラウンドウェルの追加。平坦域（ｐｌａｔｅａｕ）に達するまで、蛍光偏光の読み出し。測定値からバックグラウンド値を差し引く。二次反応速度をフィッティングして、ｋ２ ａｐｐを得る。
実験手順
バッファー ５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００μＭ ＥＧＴＡ、０．５ｇ／ｌ ＢＳＡ、ｐＨ ７．３で実行された蛍光偏光によるカイネティックス。３７℃で平衡化した黒色の平底９６ウェルプレートで、１００μｌの４００ｎＭタンパク質及び１００ｎＭのＨａｌｏ－ＴＭＲをバッファーで混合。１００μｌの１０ｍＭ ＣａＣｌ２ をバッファーに注入して反応を開始。最終濃度：２００ｎＭ タンパク質、５０ｎＭ Ｈａｌｏ－ＴＭＲ、５ｍＭ ＣａＣｌ２。タンパク質を添加なしでバックグラウンドウェルの追加。平坦域（ｐｌａｔｅａｕ）に達するまで、蛍光偏光の読み出し。測定値からバックグラウンド値を差し引く。二次反応速度をフィッティングして、ｋ２ ａｐｐを得る。
【0124】
結果
ｃｐＨａｌｏΔの活性を補完することができる１０ｍｅｒペプチドの変異は、天然の配列と比較して、配列保存（％）に直接大きな影響を有する。したがって、本発明者らは、カルシウム飽和での全体的な標識カイネティックスに対するペプチド変異の影響を評価するために、すでに最適化されたＣａＰｒｏＬａコンストラクトの状況でペプチドに対してアラニンスキャンを実施した（図１６）。このアラニンスキャニングは、アラニンが存在する場合でも、各残基が１つずつアラニンに変異されたことを意味し、α－ヘリックスの状況で最も「特性保存的」であると発明者が考えるロイシンによって置き換えられた。
ｃｐＨａｌｏΔの活性を補完することができる１０ｍｅｒペプチドの変異は、天然の配列と比較して、配列保存（％）に直接大きな影響を有する。したがって、本発明者らは、カルシウム飽和での全体的な標識カイネティックスに対するペプチド変異の影響を評価するために、すでに最適化されたＣａＰｒｏＬａコンストラクトの状況でペプチドに対してアラニンスキャンを実施した（図１６）。このアラニンスキャニングは、アラニンが存在する場合でも、各残基が１つずつアラニンに変異されたことを意味し、α－ヘリックスの状況で最も「特性保存的」であると発明者が考えるロイシンによって置き換えられた。
【0125】
そして、標識カイネティックスの比較は次のことを示唆している：
－ Ａｌａ１４５のロイシンへの変異は、インテグレーターのカイネティックスに影響を与える。これは、この領域の疎水性パッキングが緊密であることから説明でき、ロイシンの扱いにくさが、このパッキングを破壊し、ペプチドがαヘリックスに折りたたまれる能力、及び／又は基質と相互作用する能力を低下することができる。
－ Ａｒｇ１４６、Ｇｌｕ１４７、及びＴｈｒ１４８のアラニンへの変異は、インテグレーターの機能に悪影響を与えなかった。本発明者らは、この位置では、αヘリックスを形成する能力が必須であるのみと仮定する。
－ Ｐｈｅ１４９及びＧｌｎ１５０の変異は、特に基質調節部位の疎水性の中心部（ｈｅａｒｔ）にかかわるフェニルアラニンの場合、インテグレーターのカイネティックスを劇的に低下させる。このＧｌｎはより表面に露出するが、領域をキャップしているようで、ペプチドの適切な折り畳みに役立つ。
－ ロイシンへのＡ１５１の変異は、親タンパク質と比較して、予想外に標識速度の増加をもたらした（約３倍）。したがって、本発明者らは、この位置での変異をさらに調査し、メチオニン変異が親タンパク質と同等に機能する一方で、他のすべての試験された修飾（Ｃｙｓ／Ｐｈｅ／Ｉｌｅ／Ｔｈｒ／Ｖａｌ）が活性に有害であると評価した。
－ Ｐｈｅ１５２及びＡｒｇ１５３の変異により、タンパク質の標識する能力が失われることになる。Ｐｈｅ１５２はタンパク質活性部位の疎水性の中心部の一部であるが、Ａｒｇ１５３は周囲の複数の残基と相互作用する。それらは最もおそらく両方ともペプチドの適切なα－ヘリックス折りたたみにとって重要である。
－ Ｔｈｒ１５４の変異はまた、タンパク質の標識速度の低下にもつながり、この残基は、隣接するα－ヘリックスの残基と相互作用することにより、ペプチドを適切な方向に固定するようである。
－ Ａｌａ１４５のロイシンへの変異は、インテグレーターのカイネティックスに影響を与える。これは、この領域の疎水性パッキングが緊密であることから説明でき、ロイシンの扱いにくさが、このパッキングを破壊し、ペプチドがαヘリックスに折りたたまれる能力、及び／又は基質と相互作用する能力を低下することができる。
－ Ａｒｇ１４６、Ｇｌｕ１４７、及びＴｈｒ１４８のアラニンへの変異は、インテグレーターの機能に悪影響を与えなかった。本発明者らは、この位置では、αヘリックスを形成する能力が必須であるのみと仮定する。
－ Ｐｈｅ１４９及びＧｌｎ１５０の変異は、特に基質調節部位の疎水性の中心部（ｈｅａｒｔ）にかかわるフェニルアラニンの場合、インテグレーターのカイネティックスを劇的に低下させる。このＧｌｎはより表面に露出するが、領域をキャップしているようで、ペプチドの適切な折り畳みに役立つ。
－ ロイシンへのＡ１５１の変異は、親タンパク質と比較して、予想外に標識速度の増加をもたらした（約３倍）。したがって、本発明者らは、この位置での変異をさらに調査し、メチオニン変異が親タンパク質と同等に機能する一方で、他のすべての試験された修飾（Ｃｙｓ／Ｐｈｅ／Ｉｌｅ／Ｔｈｒ／Ｖａｌ）が活性に有害であると評価した。
－ Ｐｈｅ１５２及びＡｒｇ１５３の変異により、タンパク質の標識する能力が失われることになる。Ｐｈｅ１５２はタンパク質活性部位の疎水性の中心部の一部であるが、Ａｒｇ１５３は周囲の複数の残基と相互作用する。それらは最もおそらく両方ともペプチドの適切なα－ヘリックス折りたたみにとって重要である。
－ Ｔｈｒ１５４の変異はまた、タンパク質の標識速度の低下にもつながり、この残基は、隣接するα－ヘリックスの残基と相互作用することにより、ペプチドを適切な方向に固定するようである。
【0126】
要約すると、Ａｌａ１４５、Ｐｈｅ１４９、Ｇｌｎ１５０、Ｐｈｅ１５２、及びＡｒｇ１５３は、ＣａＰｒｏＬａセンサーの状況において修飾しやすいものではないようである。一方、Ａｒｇ１４６、Ｇｌｕ１４７、及びＴｈｒ１４８の修飾では問題が少ない。最後に、Ａ１５１の修飾はなお活性の増加につながる可能性もあるが、修飾の性質に大きく依存する。
【0127】
実施例１２：ｃｐＨａｌｏΔ／Ｈ－ペプチドに基づくグルタミン酸インテグレーターの開発
実験手順
蛍光偏向カイネティック実験は、３７℃又は２２℃で黒い平底９６ウェルプレートにおいて実施した。バッファーの組成は、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｇ／Ｌ ＢＳＡ、ｐＨ ７．３であった。１５０μＬの４００ｎＭタンパク質及び２倍の最終濃度のグルタミン酸を３０分間平衡化し、１００μＬのＨａｌｏ－ＣＰＹをバッファーに注入して反応を開始した。試薬の最終濃度は、２００ｎＭのタンパク質及び５０ｎＭのＨａｌｏ－ＣＰＹであった。測定値が平坦域（ｐｌａｔｅａｕ）に達するまで、蛍光偏光を読み取った。Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ）で、曲線を単指数関数に適合した。グルタミン酸の飽和は１ｍＭで観察される。
実験手順
蛍光偏向カイネティック実験は、３７℃又は２２℃で黒い平底９６ウェルプレートにおいて実施した。バッファーの組成は、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｇ／Ｌ ＢＳＡ、ｐＨ ７．３であった。１５０μＬの４００ｎＭタンパク質及び２倍の最終濃度のグルタミン酸を３０分間平衡化し、１００μＬのＨａｌｏ－ＣＰＹをバッファーに注入して反応を開始した。試薬の最終濃度は、２００ｎＭのタンパク質及び５０ｎＭのＨａｌｏ－ＣＰＹであった。測定値が平坦域（ｐｌａｔｅａｕ）に達するまで、蛍光偏光を読み取った。Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ）で、曲線を単指数関数に適合した。グルタミン酸の飽和は１ｍＭで観察される。
【0128】
結果
本発明者らは、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）における主要な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸（ＧｌｕＰｒｏＬａ：グルタミン酸依存性タンパク質標識）のインテグレーターの生成を成功させた。ＧｌｕＰｒｏＬａは、グルタミン酸の既存のリアルタイム強度測定センサーであるｉＧｌｕＳｎＦＲのアーキテクチャを中心に設計されている。ｉＧｌｕＳｎＦＲは、細菌のペリプラズムグルタミン酸結合タンパク質Ｇｌｔｌに由来する。Ｇｌｔｌの柔軟なヒンジに円順列変異緑色蛍光タンパク質（ｃｐＧＦＰ：ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ ｐｅｒｍｕｔｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を挿入すると、蛍光強度の増加に伴ってグルタミン酸濃度の変化に応答する緑色蛍光センサーが得られた。ＧｌｔｌのＮ末端とＣ末端はＧｌｔｌの同じ面にあり、ｉＧｌｕＳｎＦＲの機構的研究では、これらの位置が相対距離及び／又は配向のグルタミン酸結合依存性変化を示すはずであることを示唆しているため、発明者らはこれらがＨ－ペプチド及びｃｐＨａｌｏΔへの融合に適した部位であると理由付けた。したがって、本発明者らは、Ｈ－ペプチド（配列番号００７（ＰＥＰ２））をｉＧｌｕＳｎＦＲのＮ末端に連結し、ｃｐＨａｌｏΔ（配列番号００４）をＣ末端に連結するＧｌｕＰｒｏＬａコンストラクトを作成した。本発明者らは、Ｈ－ペプチドとｉＧｌｕＳｎＦＲとの間及びｉＧｌｕＳｎＦＲとｃｐＨａｌｏΔとの間の柔軟なＧＧＴＧＧＳ（配列番号０２６）及び／又はＰｒｏ１０リンカーを有するコンストラクトの小さなファミリーをクローン化し精製した。すべてのコンストラクトは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ蛍光偏向アッセイによって決定されるとおり、グルタミン酸及び蛍光ハロタグ基質の存在下で標識を示した（例えば、図１７）。本発明者らは、グルタミン酸の存在下又は非存在下での相対的な標識カイネティックスが、リンカー組成を変えることによって調整できることを見出した。Ｈ－ペプチド／ｉＧｌｕＳｎＦＲ及びｉＧｌｕＳｎＦＲ／ｃｐＨａｌｏΔの両方の位置にＧＧＴＧＧＳ（配列番号０２６）配列を有するコンストラクトは、最も低い非特異的標識率を示した。本発明者らは、ｃｐＧＦＰに点変異（Ｇ６７Ａ）を導入した。この変異は、ｗｔＧＦＰの発色団形成を防ぎ、Ｇ６７Ａ変異（暗色の場合はｄＧｌｕＰｒｏＬａｓと呼ばれる）を持つｇＧｌｕＰｒｏＬａ（ｇは緑を表す）変異体もまた非蛍光性であることがわかった。ＧｌｕＰｒｏＬａ変異体は、グルタミン酸濃度に依存する標識を示した。ｄＧｌｕＰｒｏＬａ変異体は、親のｇＧｌｕＰｒｏＬａ配列よりも遅い標識カイネティックスを示したが、グルタミン酸に対して同じ親和性を維持していた。最良のコンストラクトは、標識カイネティックスの点で（すなわち活性）１５倍の違いを表す（図１７）。
本発明者らは、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）における主要な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸（ＧｌｕＰｒｏＬａ：グルタミン酸依存性タンパク質標識）のインテグレーターの生成を成功させた。ＧｌｕＰｒｏＬａは、グルタミン酸の既存のリアルタイム強度測定センサーであるｉＧｌｕＳｎＦＲのアーキテクチャを中心に設計されている。ｉＧｌｕＳｎＦＲは、細菌のペリプラズムグルタミン酸結合タンパク質Ｇｌｔｌに由来する。Ｇｌｔｌの柔軟なヒンジに円順列変異緑色蛍光タンパク質（ｃｐＧＦＰ：ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ ｐｅｒｍｕｔｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を挿入すると、蛍光強度の増加に伴ってグルタミン酸濃度の変化に応答する緑色蛍光センサーが得られた。ＧｌｔｌのＮ末端とＣ末端はＧｌｔｌの同じ面にあり、ｉＧｌｕＳｎＦＲの機構的研究では、これらの位置が相対距離及び／又は配向のグルタミン酸結合依存性変化を示すはずであることを示唆しているため、発明者らはこれらがＨ－ペプチド及びｃｐＨａｌｏΔへの融合に適した部位であると理由付けた。したがって、本発明者らは、Ｈ－ペプチド（配列番号００７（ＰＥＰ２））をｉＧｌｕＳｎＦＲのＮ末端に連結し、ｃｐＨａｌｏΔ（配列番号００４）をＣ末端に連結するＧｌｕＰｒｏＬａコンストラクトを作成した。本発明者らは、Ｈ－ペプチドとｉＧｌｕＳｎＦＲとの間及びｉＧｌｕＳｎＦＲとｃｐＨａｌｏΔとの間の柔軟なＧＧＴＧＧＳ（配列番号０２６）及び／又はＰｒｏ１０リンカーを有するコンストラクトの小さなファミリーをクローン化し精製した。すべてのコンストラクトは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ蛍光偏向アッセイによって決定されるとおり、グルタミン酸及び蛍光ハロタグ基質の存在下で標識を示した（例えば、図１７）。本発明者らは、グルタミン酸の存在下又は非存在下での相対的な標識カイネティックスが、リンカー組成を変えることによって調整できることを見出した。Ｈ－ペプチド／ｉＧｌｕＳｎＦＲ及びｉＧｌｕＳｎＦＲ／ｃｐＨａｌｏΔの両方の位置にＧＧＴＧＧＳ（配列番号０２６）配列を有するコンストラクトは、最も低い非特異的標識率を示した。本発明者らは、ｃｐＧＦＰに点変異（Ｇ６７Ａ）を導入した。この変異は、ｗｔＧＦＰの発色団形成を防ぎ、Ｇ６７Ａ変異（暗色の場合はｄＧｌｕＰｒｏＬａｓと呼ばれる）を持つｇＧｌｕＰｒｏＬａ（ｇは緑を表す）変異体もまた非蛍光性であることがわかった。ＧｌｕＰｒｏＬａ変異体は、グルタミン酸濃度に依存する標識を示した。ｄＧｌｕＰｒｏＬａ変異体は、親のｇＧｌｕＰｒｏＬａ配列よりも遅い標識カイネティックスを示したが、グルタミン酸に対して同じ親和性を維持していた。最良のコンストラクトは、標識カイネティックスの点で（すなわち活性）１５倍の違いを表す（図１７）。
【0129】
表２：ＣａＭ－Ｍ１３変異体を使用した第２世代ＣａＰｒｏＬａコンストラクトの概要、ＣａＭＰＡＲＩ２について報告されたＥＣ５０値、及びＣａＰｒｏＬａについて測定されたＥＣ５０
【表3】
【0130】
配列
ハロタグ７（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＱＳ７９２４２参照）；本発明の作成に採用されたｃｐバージョンは、この配列のＣ－末端の２７個のアミノ酸を含まない。
ハロタグ７（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＱＳ７９２４２参照）；本発明の作成に採用されたｃｐバージョンは、この配列のＣ－末端の２７個のアミノ酸を含まない。
【0131】
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】