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特許7599085抗癌活性を有するラクトバチルス・プランタルム微生物、それを含む組成物、及びそれを利用した癌の予防方法または治療方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-05
(45)【発行日】2024-12-13
(54)【発明の名称】抗癌活性を有するラクトバチルス・プランタルム微生物、それを含む組成物、及びそれを利用した癌の予防方法または治療方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20241206BHJP
A61K 35/747 20150101ALI20241206BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241206BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20241206BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
C12N1/20 E
A61K35/747
A61P35/00
A23L33/135
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2023513957
(86)(22)【出願日】2021-08-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-26
(86)【国際出願番号】 KR2021010524
(87)【国際公開番号】W WO2022045636
(87)【国際公開日】2022-03-03
【審査請求日】2023-04-24
(31)【優先権主張番号】10-2020-0110598
(32)【優先日】2020-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCTC KCTC14283BP
(73)【特許権者】
【識別番号】521415859
【氏名又は名称】株式会社 リビオム
【氏名又は名称原語表記】ＬＩＶＥＯＭＥ Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】７Ｆ，１１４，Ｃｅｎｔｒａｌ ｔｏｗｎ－ｒｏ，Ｙｅｏｎｇｔｏｎｇ－ｇｕ，Ｓｕｗｏｎ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】キム， ヨンヒョン
(72)【発明者】
【氏名】クォン， ドヒョン
(72)【発明者】
【氏名】パク， グァンソ
(72)【発明者】
【氏名】ドン， ヘジン
(72)【発明者】
【氏名】チャン， ヘジョン
(72)【発明者】
【氏名】ソン， ジユン
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】韓国登録特許第１０－１３９８２４９（ＫＲ，Ｂ１）
【文献】国際公開第２０１８／２２２９６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Microbiology and Immunology，2014年，vol.58，pp.492-502
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗腫瘍活性を有する、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＬＭＴ１７－３１（受託番号ＫＣＴＣ－１４２８３ＢＰ）微生物。
【請求項2】
有効成分として、請求項１に記載の微生物またはその培養物を含む、癌を予防または治療するための薬剤学的組成物。
【請求項3】
前記癌は、固形癌である、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
免疫チェックポイント抑制剤と共に投与するためのものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項5】
前記免疫チェックポイント抑制剤は、ＣＴＬＡ４抑制剤、ＰＤ－１抑制剤またはＰＤ－Ｌ１抑制剤である、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
有効成分として、請求項１に記載の微生物またはその培養物を含む、癌を予防または改善するための食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗癌活性を有するラクトバチルス・プランタルム微生物、それを含む組成物、及びそれを利用した癌予防または治療に関する。
【背景技術】
【0002】
ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）は、ラクトバチルス属に属し、発酵食品製品及び嫌気性植物材料において折々発見される。該ラクトバチルス・プランタルムは、グラム陽性の桿状バクテリアである。該ラクトバチルス・プランタルムは、丸い終端を有し、真っ直ぐであって、一般的に、０．９～１．２μｍ幅、３～８μｍ長を有する棒状（rod）である。該ラクトバチルス・プランタルムは、ｐＨ３．４ないし８．８において成長し、温度１２℃ないし４０℃で成長することができる。
【0003】
ラクトバチルス・プランタルムは、抗酸化活性、腸透過性（intestinal permeability）を維持するように一助となる。また、該ラクトバチルス・プランタルムは、過敏性大腸カタル（ＩＢＳ）を治療するのに効果がある。例えば、韓国特許公開１０－２０１１－００００８７１は、抗酸化活性を有するラクトバチルス・プランタルムＨＹ７７１１を開示する。
【0004】
なお、癌治療において、免疫抗癌剤は、免疫活性化を介し、癌細胞を攻撃するメカニズムであるが、対象患者における２０ないし３０％しか反応いないので、効率的な免疫抗癌剤を求める要求が依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
一態様は、抗腫瘍活性を有するラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＬＭＴ１７－３１（受託番号ＫＣＴＣ－１４２８３ＢＰ）微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を提供する。
【0006】
他の態様は、有効成分として、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を含む癌を予防または治療するための薬剤学的組成物を提供する。
他の態様は、有効成分として、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を含む癌を予防または改善するための食品組成物を提供する。
他の態様は、癌を治療するのに有効な量の前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を個体に投与する段階を含む個体の癌を予防または治療する方法を提供する。
他の態様は、有効成分として、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を含む癌を予防または改善するための食品組成物を提供する。
他の態様は、癌を治療するのに有効な量の前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を個体に投与する段階を含む個体の癌を予防または治療する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
第１態様は、抗腫瘍活性を有するラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＬＭＴ１７－３１（受託番号ＫＣＴＣ－１４２８３ＢＰ）微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を提供する。
【0008】
前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物は、腫瘍成長を抑制することができる。本明細書において、用語「癌（cancer）」及び「腫瘍（tumor）」は、相互交換可能に使用される。前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物は、腫瘍内免疫細胞のレベルを上昇させることができる。前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物は、腫瘍内ＣＤ８Ｔ細胞のレベルを上昇させることができる。前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物は、免疫細胞の腫瘍内への浸潤を増大させることができる。前記免疫細胞は、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹枝状細胞、大食細胞、好中球でもある。前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物は、免疫細胞を活性化させることができる。前記活性化は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物が抗腫瘍活性を有するサイトカインまたは酵素の生産、分泌または生産及び分泌を促進させるものでもある。前記サイトカインまたは酵素は、インターフェロンガンマ及びグランザイムＢのうち１以上でもある。前記微生物は、耐酸性、耐胆汁性及び腸内定着性にすぐれている。前記微生物は、マッコリ（makgeolli）から分離された。
【0009】
前記耐酸性は、ＭＲＳ培地において、ｐＨ２．５及び３７℃において２時間培養した場合、生存率が、４０％以上、４５％以上、５０％以上、６０％以上、８０ないし９０％、８０％ないし９５％、８５％ないし９０％、または９０ないし９５％でもある。
【0010】
前記耐胆汁酸性は、０．３％胆汁酸含有ＭＲＳ培地において、３７℃において２時間培養した場合、生存率が６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、７５ないし９０％、７５ないし９５％、８０ないし９０％、８０％ないし９５％、８５％ないし９０％、または９０ないし９５％でもある。
【0011】
前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物は、ＣＤ８Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を促進させることができる。前記促進は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物が存在しない場合に比べ、腫瘍内Ｔ細胞数に対するＣＤ８Ｔ細胞数の百分率を、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、１００％以上、５％ないし１００％、１０％ないし１００％、２０％ないし１００％、３０％ないし１００％、４０％ないし１００％、５０％ないし１００％、６０％ないし１００％、７０％ないし１００％、８０％ないし１００％、または９０％ないし１００％上昇させるものでもある。
【0012】
前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物は、腫瘍浸潤ＣＤ８Ｔ細胞のインターフェロンガンマ及びグランザイムＢのうち１以上の生産、分泌、または生産及び分泌を促進させることができる。前記促進は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物が存在しない場合に比べ、ＣＤ８Ｔ細胞において、インターフェロンガンマを生産する細胞の百分率を、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、１００％以上、５％ないし１００％、１０％ないし１００％、２０％ないし１００％、３０％ないし１００％、４０％ないし１００％、５０％ないし１００％、６０％ないし１００％、７０％ないし１００％、８０％ないし１００％、または９０％ないし１００％上昇させるものでもある。また、前記促進は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物が存在しない場合に比べ、ＣＤ８Ｔ細胞において、グランザイムＢを生産する細胞の百分率を、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、１００％以上、５％ないし１００％、１０％ないし１００％、２０％ないし１００％、３０％ないし１００％、４０％ないし１００％、５０％ないし１００％、６０％ないし１００％、７０％ないし１００％、８０％ないし１００％、または９０％ないし１００％上昇させるものでもある。
【0013】
前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物は、ＣＤ８Ｔ細胞による、腫瘍成長の抑制を行わせることができる/。前記抑制は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物が存在しない場合に比べ、腫瘍の大きさを、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、１００％以上、５％ないし１００％、１０％ないし１００％、２０％ないし１００％、３０％ないし１００％、４０％ないし１００％、５０％ないし１００％、６０％ないし１００％、７０％ないし１００％、８０％ないし１００％、または９０％ないし１００％低減させるものでもある。
【0014】
第２態様は、有効成分として、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を含む癌を予防または治療するための薬剤学的組成物を提供する。
前記薬剤学的組成物において、前記癌は、固形癌でもある。前記癌は、内臓に位置しない固形癌でもある。前記癌は、転移癌でもある。前記癌の非制限的な例は、乳癌、肺癌、頭部癌または頸部癌、大腸癌、食道癌、喉頭癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、骨癌、皮膚癌、皮膚黒色腫または眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門付近癌、結腸癌、乳癌、喇叭管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状線癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌または輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、ＣＮＳ腫瘍、一次ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫及び脳下垂体腺腫を含むものでもあるが、それらに制限されるものではない。
前記薬剤学的組成物において、前記癌は、固形癌でもある。前記癌は、内臓に位置しない固形癌でもある。前記癌は、転移癌でもある。前記癌の非制限的な例は、乳癌、肺癌、頭部癌または頸部癌、大腸癌、食道癌、喉頭癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、骨癌、皮膚癌、皮膚黒色腫または眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門付近癌、結腸癌、乳癌、喇叭管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、膣癌腫、陰門癌腫、ホジキン病、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状線癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌または輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、ＣＮＳ腫瘍、一次ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫及び脳下垂体腺腫を含むものでもあるが、それらに制限されるものではない。
【0015】
前記薬剤学的組成物において、前記組成物は、癌の成長を抑制するためのものでもある。
前記薬剤学的組成物において、前記組成物は、免疫チェックポイント抑制剤と共に投与するためのものでもある。前記免疫チェックポイント抑制剤は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物の投与前、投与と同時、または投与後に投与するためのものでもある。
前記薬剤学的組成物において、前記組成物は、免疫チェックポイント抑制剤と共に投与するためのものでもある。前記免疫チェックポイント抑制剤は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物の投与前、投与と同時、または投与後に投与するためのものでもある。
【0016】
前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＩＤＯ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体及び抗Ｂ７Ｈ６抗体、並びにその抗原結合断片によってなる群のうちから選択される１以上でもある。さらに具体的には、免疫チェックポイント抑制剤は、イピリムマブ（Ipilimumab）（ヤーボイ登録商標（BMS／ONO））、トレメリムマブ（Tremelimumab）（アストラゼネカ）、アテゾリズマブ（atezolizumab）（テセントリク登録商標（ロシュ））、ニボルマブ（nivolumab）（オプジーボ登録商標（BMS／ONO））、ペムブロリズマブ（Pembrolizumab）（キトイルーダ登録商標（MSD））、アベルマブ（Avelumab）（バベンチオ登録商標（ファイザー／ドイツ・メルク））、デュルバルマブ（Durvalumab）（インフィンジ登録商標（アストラゼネカ／メディミューン））、及びその抗原結合断片のうちから選択される１以上でもあるが、それらに制限されるものではない。
【0017】
前記薬剤学的組成物において、前記組成物は、化学治療剤と共に投与するためのものでもある。前記化学治療剤は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物の投与前、投与と同時、または投与後に投与するためのものでもある。
【0018】
前記化学治療剤の非制限的な例は、アルキル化剤、ニトロソウレアーゼ、抗代謝物質、抗癌抗生物質、植物起源アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン薬物、ホルモン拮抗剤、白血球減少症（例：好中球減少症）治療薬物、血小板減少症治療薬物、抗嘔吐剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖タンパク質阻害剤、白金錯体誘導体、他の免疫治療薬物、及び他の抗癌薬物を含む。併用投与されうる例示的な細胞毒性剤は、抗微細小管作用剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗代謝物質、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、インターカレーティング剤、信号伝達経路を妨害しうる作用剤、アポトーシスを促進させる作用剤、プロテアソーム阻害剤、及び放射線（例：局所または全身への放射線）の照射を含む。さらなる治療剤の非制限的な例は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣作用剤、合成薬物、無機分子及び有機分子を含むが、それらに制限されるものではない。
【0019】
前記薬剤学的組成物において、前記組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含むものでもある。前記担体は、安定化剤、賦形剤、希釈剤または補助剤でもある。前記担体は、例えば、薬剤学的投与に適し、特に、経口投与に適する任意及び全ての水性及び非水性の溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝剤（例：リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液）、水、懸濁液、エマルジョン（例：オイル／水エマルジョン）、多様な類型の湿潤剤、リポソーム、分散媒及びコーティング剤でもある。薬剤学的組成物において、そのような媒質及び作用剤の用途は、当該分野に周知されており、そのような担体を含む組成物は、周知の一般的な方法によっても剤形化される。
【0020】
前記組成物は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を、「治療学的有効量」で含むものでもある。前記組成物において、「治療学的有効量」は、１回または２回以上の投与時、治療を必要とする個体に投与される場合、治療効果を示すのに十分な量を意味する。用語「治療」は、個体、例えば、ヒトを含む哺乳類において、癌疾患、または癌の医学的症状を治療することを意味し、それは次を含む：癌疾患、または癌の医学的症状の緩和；癌疾患、または癌の医学的症状の抑制、すなわち、個体において、疾患または医学的症状の進行を遅らせたり、停止させること；あるいは個体において、癌疾患、または癌の医学的症状を軽減させたりすること。前記「有効量」は、当業者が適切に選択することができる。前記「有効量」は、組成物重量につき、０．０１ないし５０重量％、または０．１ないし２０重量％でもある。また、前記組成物は、組成物重量基準で、１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ以上、１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ以上、１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ以上、１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ以上に投与することができる。例えば、細菌菌株を、１ｘ１０１５ＣＦＵ／ｇ以下、１ｘ１０１４ＣＦＵ／ｇ以下、１ｘ１０１３ＣＦＵ／ｇ以下、１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ以下に投与することができる。例えば、１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇないし１ｘ１０１５ＣＦＵ／ｇ、１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇないし１ｘ１０１４ＣＦＵ／ｇ、１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇないし１ｘ１０１３ＣＦＵ／ｇ、１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇないし１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇないし１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇの細菌菌株を含むものでもある。
【0021】
前記組成物は、経口投与されうる。従って、前記組成物は、錠剤、カプセル剤、水性液剤、乾燥シロップ剤または懸濁液剤のような多様な形態にも製剤化される。経口用錠剤の場合、ラクトース、とうもろこし澱粉のような賦形剤、及びステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤が通常加えられうる。経口投与用カプセル剤の場合、ラクトース及び／または乾燥とうもろこし澱粉が希釈剤として使用されうる。経口用水性懸濁液剤が必要である場合、活性成分を、乳化剤及び／または懸濁化剤と結合させることができる。必要な場合、特定甘味剤及び／または香味剤を加えることができる。一具体例において、前記組成物は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を、胃液のような酸性で安定化させうる剤形でもある。例えば、前記組成物は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物が、内部に含まれているカプセル剤、または前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物が、被膜にコーティングされた錠剤でもある。
【0022】
第３態様は、有効成分として、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を含む癌を予防または改善するための食品組成物を提供する。
【0023】
前記組成物は、食品学的に許容可能な担体を含むものでもある。前記担体は、安定化剤、賦形剤、希釈剤または補助剤でもある。前記担体は、例えば、薬剤学的投与に適し、特に、経口投与に適する任意及び全ての水性及び非水性の溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝剤（例：リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液）、水、懸濁液、エマルジョン（例：オイル／水エマルジョン）、多様な類型の湿潤剤、リポソーム、分散媒及びコーティング剤でもある。薬剤学的組成物において、そのような媒質及び作用剤の用途は、当該分野に周知されており、そのような担体を含む組成物は、周知の一般的な方法によっても剤形化される。
【0024】
前記食品は、乳製品、豆製品、野菜及び果実の製品、または食品添加剤でもある。前記乳製品は、発酵乳、バター、チーズまたは粉ミルクでもある。前記食品は、健康機能食品でもある。前記健康機能食品は、癌予防用または癌改善用の健康機能食品でもある。前記食品は、また飲料類、菓子類、ダイエットバー、チョコレート、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類でもある。
前記食品は、食品製造時、一般的に添加される成分を含むものでもあるし、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。
食品製造に使用される炭水化物は、モノサッカライド（例：ブドウ糖、果糖など）；ジサッカライド（例：マルトース、スクロース、オリゴ糖など）；及びポリサッカライド（例：デキストリン、シクロデキストリンのような一般的な糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールのような糖アルコールでもある。また、香味剤として、天然香味剤、及びサッカリン及びアスパルテームのような合成香味剤を使用することができる。該天然香味剤は、ソーマチン、レバウジオシドＡ及びグリシルヒジンのようなステビア抽出物でもある。健康機能食品は、摂取する場合、健康上、特定効果をもたらすものを意味する。
前記食品は、食品製造時、一般的に添加される成分を含むものでもあるし、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。
食品製造に使用される炭水化物は、モノサッカライド（例：ブドウ糖、果糖など）；ジサッカライド（例：マルトース、スクロース、オリゴ糖など）；及びポリサッカライド（例：デキストリン、シクロデキストリンのような一般的な糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールのような糖アルコールでもある。また、香味剤として、天然香味剤、及びサッカリン及びアスパルテームのような合成香味剤を使用することができる。該天然香味剤は、ソーマチン、レバウジオシドＡ及びグリシルヒジンのようなステビア抽出物でもある。健康機能食品は、摂取する場合、健康上、特定効果をもたらすものを意味する。
【0025】
前記組成物において、前記微生物は、組成物重量につき、０．０１ないし５０重量％、または０．１ないし２０重量％でもある。また、前記組成物は、組成物重量基準で、１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇ以上、１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇ以上、１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇ以上、１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇ以上に投与することができる。例えば、細菌菌株を、１ｘ１０１５ＣＦＵ／ｇ以下、１ｘ１０１４ＣＦＵ／ｇ以下、１ｘ１０１３ＣＦＵ／ｇ以下、１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ以下に投与することができる。例えば、１ｘ１０６ＣＦＵ／ｇないし１ｘ１０１５ＣＦＵ／ｇ、１ｘ１０７ＣＦＵ／ｇないし１ｘ１０１４ＣＦＵ／ｇ、１ｘ１０８ＣＦＵ／ｇないし１ｘ１０１３ＣＦＵ／ｇ、１ｘ１０９ＣＦＵ／ｇないし１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇ、１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｇないし１ｘ１０１２ＣＦＵ／ｇの細菌菌株を含むものでもある。
【0026】
第４態様は、癌を治療するのに有効な量の前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物を個体に投与する段階を含む個体の癌を予防または治療する方法を提供する。
前記個体は、哺乳動物でもある。前記哺乳動物は、ヒト、またはヒトを除いた哺乳動物でもある。前記投与は、経口投与するものでもある。
前記「癌を治療するのに有効な量」は、癌を予防または治療するのに有効な量を示す。前記「癌を治療するのに有効な量」は、体重ｋｇ当たり、０．０１ｍｇないし２００ｍｇの前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物、または体重ｋｇ当たり０．１ｍｇないし４００ｍｇの微生物、あるいはその培養物またはその抽出物でもある。また、前記「癌を治療するのに有効な量」は、個体当たり、１ｘ１０６ＣＦＵ以上、１ｘ１０７ＣＦＵ以上、１ｘ１０８ＣＦＵ以上、１ｘ１０９ＣＦＵ以上に投与することができる。例えば、細菌菌株を、１ｘ１０１５ＣＦＵ以下、１ｘ１０１４ＣＦＵ以下、１ｘ１０１３ＣＦＵ以下、１ｘ１０１２ＣＦＵ以下に投与することができる。例えば、細菌菌株を、１ｘ１０６ＣＦＵないし１ｘ１０１５ＣＦＵ、１ｘ１０７ＣＦＵないし１ｘ１０１４ＣＦＵ、１ｘ１０８ＣＦＵないし１ｘ１０１３ＣＦＵ、１ｘ１０９ＣＦＵないし１ｘ１０１２ＣＦＵ、１ｘ１０１０ＣＦＵないし１ｘ１０１２ＣＦＵで投与することができる。例えば、有効成分である細菌菌株を、一日２回ないし数回に分けて投与することができる。
前記個体は、哺乳動物でもある。前記哺乳動物は、ヒト、またはヒトを除いた哺乳動物でもある。前記投与は、経口投与するものでもある。
前記「癌を治療するのに有効な量」は、癌を予防または治療するのに有効な量を示す。前記「癌を治療するのに有効な量」は、体重ｋｇ当たり、０．０１ｍｇないし２００ｍｇの前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物、または体重ｋｇ当たり０．１ｍｇないし４００ｍｇの微生物、あるいはその培養物またはその抽出物でもある。また、前記「癌を治療するのに有効な量」は、個体当たり、１ｘ１０６ＣＦＵ以上、１ｘ１０７ＣＦＵ以上、１ｘ１０８ＣＦＵ以上、１ｘ１０９ＣＦＵ以上に投与することができる。例えば、細菌菌株を、１ｘ１０１５ＣＦＵ以下、１ｘ１０１４ＣＦＵ以下、１ｘ１０１３ＣＦＵ以下、１ｘ１０１２ＣＦＵ以下に投与することができる。例えば、細菌菌株を、１ｘ１０６ＣＦＵないし１ｘ１０１５ＣＦＵ、１ｘ１０７ＣＦＵないし１ｘ１０１４ＣＦＵ、１ｘ１０８ＣＦＵないし１ｘ１０１３ＣＦＵ、１ｘ１０９ＣＦＵないし１ｘ１０１２ＣＦＵ、１ｘ１０１０ＣＦＵないし１ｘ１０１２ＣＦＵで投与することができる。例えば、有効成分である細菌菌株を、一日２回ないし数回に分けて投与することができる。
【0027】
前記方法は、免疫チェックポイント抑制剤と共に投与する段階を含むものでもある。前記免疫チェックポイント抑制剤は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物の投与前、投与と同時、または投与後に投与するものでもある。
前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＩＤＯ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体及び抗Ｂ７Ｈ６抗体、並びにその抗原結合断片によってなる群のうちから選択される１以上でもある。さらに具体的には、免疫チェックポイント抑制剤は、イピリムマブ（Ipilimumab）（ヤーボイ登録商標（BMS／ONO））、トレメリムマブ（Tremelimumab）（アストラゼネカ）、アテゾリズマブ（atezolizumab）（テセントリク登録商標（ロシュ））、ニボルマブ（nivolumab）（オプジーボ登録商標（BMS／ONO））、ペムブロリズマブ（Pembrolizumab）（キトイルーダ登録商標（MSD））、アベルマブ（Avelumab）（バベンチオ登録商標（ファイザー／ドイツ・メルク））、デュルバルマブ（Durvalumab）（インフィンジ登録商標（アストラゼネカ／メディミューン））、及びその抗原結合断片のうちから選択される１以上でもあるが、それらに制限されるものではない。
前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＩＤＯ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体及び抗Ｂ７Ｈ６抗体、並びにその抗原結合断片によってなる群のうちから選択される１以上でもある。さらに具体的には、免疫チェックポイント抑制剤は、イピリムマブ（Ipilimumab）（ヤーボイ登録商標（BMS／ONO））、トレメリムマブ（Tremelimumab）（アストラゼネカ）、アテゾリズマブ（atezolizumab）（テセントリク登録商標（ロシュ））、ニボルマブ（nivolumab）（オプジーボ登録商標（BMS／ONO））、ペムブロリズマブ（Pembrolizumab）（キトイルーダ登録商標（MSD））、アベルマブ（Avelumab）（バベンチオ登録商標（ファイザー／ドイツ・メルク））、デュルバルマブ（Durvalumab）（インフィンジ登録商標（アストラゼネカ／メディミューン））、及びその抗原結合断片のうちから選択される１以上でもあるが、それらに制限されるものではない。
【0028】
前記方法は、また化学治療剤と共に投与する段階を含むものでもある。前記化学治療剤は、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物の投与前、投与と同時、または投与後に投与するものでもある。
前記化学治療剤の非制限的な例は、アルキル化剤、ニトロソウレアーゼ、抗代謝物質、抗癌抗生物質、植物起源アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン薬物、ホルモン拮抗剤、白血球減少症（例：好中球減少症）治療薬物、血小板減少症治療薬物、抗嘔吐剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖タンパク質阻害剤、白金錯体誘導体、他の免疫治療薬物、及び他の抗癌薬物を含む。併用投与されうる例示的な細胞毒性剤は、抗微細小管作用剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗代謝物質、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、インターカレーティング剤、信号伝達経路を妨害しうる作用剤、アポトーシスを促進させる作用剤、プロテアソーム阻害剤、及び放射線（例：局所または全身への放射線）の照射を含む。さらなる治療剤の非制限的な例は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣作用剤、合成薬物、無機分子及び有機分子を含むが、それらに制限されるものではない。
前記化学治療剤の非制限的な例は、アルキル化剤、ニトロソウレアーゼ、抗代謝物質、抗癌抗生物質、植物起源アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン薬物、ホルモン拮抗剤、白血球減少症（例：好中球減少症）治療薬物、血小板減少症治療薬物、抗嘔吐剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖タンパク質阻害剤、白金錯体誘導体、他の免疫治療薬物、及び他の抗癌薬物を含む。併用投与されうる例示的な細胞毒性剤は、抗微細小管作用剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗代謝物質、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、インターカレーティング剤、信号伝達経路を妨害しうる作用剤、アポトーシスを促進させる作用剤、プロテアソーム阻害剤、及び放射線（例：局所または全身への放射線）の照射を含む。さらなる治療剤の非制限的な例は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣作用剤、合成薬物、無機分子及び有機分子を含むが、それらに制限されるものではない。
【発明の効果】
【0029】
一態様による抗腫瘍活性を有するラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＬＭＴ１７－３１（受託番号ＫＣＴＣ－１４２８３ＢＰ）微生物、あるいはその培養物またはその抽出物によれば、癌を予防または治療するのに使用されうる。
他の態様による癌を予防または治療するための薬剤学的組成物によれば、癌を予防または治療するのに使用されうる。
他の態様による癌を予防または改善するための食品組成物によれば、癌を予防したり改善させたりすることができる。
他の態様による個体の癌を予防または治療する方法によれば、癌を効率的に予防したり治療したりすることができる。
他の態様による癌を予防または治療するための薬剤学的組成物によれば、癌を予防または治療するのに使用されうる。
他の態様による癌を予防または改善するための食品組成物によれば、癌を予防したり改善させたりすることができる。
他の態様による個体の癌を予防または治療する方法によれば、癌を効率的に予防したり治療したりすることができる。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】選抜されたラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株と、標準菌株であるＫＣＴＣ３１０８菌株との代表的光学顕微鏡写真を示した図である。
【図2A】ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍サイズを測定した結果を示した図である。
【図2B】ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍サイズを測定した結果を示した図である。
【図3A】ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍に浸潤されたＣＤ８Ｔ細胞、及びそれによるサイトカイン分泌を分析した結果を示した図である。
【図3B】ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍に浸潤されたＣＤ８Ｔ細胞、及びそれによるサイトカイン分泌を分析した結果を示した図である。
【図3C】ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍に浸潤されたＣＤ８Ｔ細胞、及びそれによるサイトカイン分泌を分析した結果を示した図である。
【図3D】ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍に浸潤されたＣＤ８Ｔ細胞、及びそれによるサイトカイン分泌を分析した結果を示した図である。
【図3E】ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍に浸潤されたＣＤ８Ｔ細胞、及びそれによるサイトカイン分泌を分析した結果を示した図である。
【図3F】ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍に浸潤されたＣＤ８Ｔ細胞、及びそれによるサイトカイン分泌を分析した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0031】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲が、それら実施例に限定されるものではない。
【0032】
実施例１：ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＬＭＴ１７－３１菌株の分離及び同定
１．ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）菌株の分離
マッコリ（makgeolli）試料から、ラクトバチルス・プランタルム菌株を分離した。まず、試料を、ＭＲＳ培地（Difco（米国））に塗抹し、３０℃において、嫌気培養した。試料の前処理方法は、無菌状態で試料を取り、０．８５％ ＮａＣｌ溶液１８０ｍｌで希釈し、ストマッカ（stomacher）で５分間マッコリ原液を均質化させた。均質化された試料を、滅菌された０．８５％ ＮａＣｌ溶液９ｍｌが入っているチューブに段階的に希釈し、マッコリ試料を準備した。該試料を、ＭＲＳ平板培地（Difco（米国））に塗抹し、３７℃において２日間ないし３日間培養し、現れたコロニーを、形態別及び色別に区別し、さらに純粋分離した。
１．ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）菌株の分離
マッコリ（makgeolli）試料から、ラクトバチルス・プランタルム菌株を分離した。まず、試料を、ＭＲＳ培地（Difco（米国））に塗抹し、３０℃において、嫌気培養した。試料の前処理方法は、無菌状態で試料を取り、０．８５％ ＮａＣｌ溶液１８０ｍｌで希釈し、ストマッカ（stomacher）で５分間マッコリ原液を均質化させた。均質化された試料を、滅菌された０．８５％ ＮａＣｌ溶液９ｍｌが入っているチューブに段階的に希釈し、マッコリ試料を準備した。該試料を、ＭＲＳ平板培地（Difco（米国））に塗抹し、３７℃において２日間ないし３日間培養し、現れたコロニーを、形態別及び色別に区別し、さらに純粋分離した。
【0033】
２．ラクトバチルス・プランタルム菌株の同定
（１）形態学的特性の分析
選抜されたラクトバチルス・プランタルム菌株をＭＲＳ平板培地（Difco（米国））で培養し、コロニー形態を観察した。選抜されたラクトバチルス・プランタルム菌株、及びラクトバチルス・プランタルム標準菌株であるＫＣＴＣ３１０８のＭＲＳ平板培地におけるコロニー形態は、下記表１に示した。
（１）形態学的特性の分析
選抜されたラクトバチルス・プランタルム菌株をＭＲＳ平板培地（Difco（米国））で培養し、コロニー形態を観察した。選抜されたラクトバチルス・プランタルム菌株、及びラクトバチルス・プランタルム標準菌株であるＫＣＴＣ３１０８のＭＲＳ平板培地におけるコロニー形態は、下記表１に示した。
【表1】
【0034】
図１は、選抜されたラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株と、標準菌株であるＫＣＴＣ３１０８菌株との代表的光学顕微鏡写真を示したものである。図１に示されているように、ＬＭＴ１７－３１菌株は、棒型棹菌であり、典型的なラクトバチルス属の性状と類似していた。
【0035】
（２）１６Ｓ ｒＤＮＡ分析
分離されたＬＭＴ１７－３１菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を分析した。前記増幅は、ＬＭＴ１７－３１菌株ゲノムＤＮＡをテンプレートにし、配列番号１のオリゴヌクレオチド（（株）マクロジェン）と、配列番号２のオリゴヌクレオチド（（株）マクロジェン）とをプライマーセットにしたＰＣＲを行ってなされた。分離されたＬＭＴ１７－３１菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号３に示されている。確認された１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＮＣＢＩ blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を使用して公知された１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列と比較した。その結果、ＬＭＴ１７－３１の１６Ｓ ｒＤＮＡは、ラクトバチルス・プランタルム種と、配列同一性が１００％であった。また、系統樹分析結果、ＬＭＴ１７－３１は、ラクトバチルス・プランタルム種と同じであった。その結果、ＬＭＴ１７－３１菌株は、新たなラクトバチルス・プランタルム種に属する新たな菌株と確認された。
分離されたＬＭＴ１７－３１菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を分析した。前記増幅は、ＬＭＴ１７－３１菌株ゲノムＤＮＡをテンプレートにし、配列番号１のオリゴヌクレオチド（（株）マクロジェン）と、配列番号２のオリゴヌクレオチド（（株）マクロジェン）とをプライマーセットにしたＰＣＲを行ってなされた。分離されたＬＭＴ１７－３１菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号３に示されている。確認された１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＮＣＢＩ blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を使用して公知された１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列と比較した。その結果、ＬＭＴ１７－３１の１６Ｓ ｒＤＮＡは、ラクトバチルス・プランタルム種と、配列同一性が１００％であった。また、系統樹分析結果、ＬＭＴ１７－３１は、ラクトバチルス・プランタルム種と同じであった。その結果、ＬＭＴ１７－３１菌株は、新たなラクトバチルス・プランタルム種に属する新たな菌株と確認された。
【0036】
本発明者らは、ＬＭＴ１７－３１乳酸菌を、「ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１」（寄託番号：ＫＣＴＣ １４２８３ＢＰ）と命名し、それを韓国生命工学研究院所在韓国細胞株銀行（ＫＣＴＣ：KoreanCollection forType Cultures）に２０２０年８月２６日付けで寄託した。
【0037】
実施例２：ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の生理活性特性の分析
１．ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の糖発酵特性
選抜されたＬＭＴ１７－３１菌株の糖代謝特性を、ＡＰＩ ５０ ＣＨＬ kit（bioMerieuxBioMetrieux（フランス））を、供給会社の実験方法によって使用して確認した。表２は、確認されたＬＭＴ１７－３１菌株の糖発酵特性を示したものである。
１．ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の糖発酵特性
選抜されたＬＭＴ１７－３１菌株の糖代謝特性を、ＡＰＩ ５０ ＣＨＬ kit（bioMerieuxBioMetrieux（フランス））を、供給会社の実験方法によって使用して確認した。表２は、確認されたＬＭＴ１７－３１菌株の糖発酵特性を示したものである。
【表2】
【0038】
２．ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の安定性評価
（１）耐酸性の調査
ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の耐酸性を評価するために、以下の方法で実験を実施した。ＬＭＴ１７－３１菌株を、滅菌されたＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃において１６時間培養した。次に、ＨＣｌでｐＨ２．５に調整し、滅菌されたＭＲＳ液体培地に、前記菌株１％を接種し、３７℃において２時間培養した。菌株接種直後と、その２時間培養後との試料を回収し、ＭＲＳ液体培地に希釈し、ＭＲＳ平板培地に塗抹した後、３７℃において２４時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、菌数を測定した。
表３に示されているように、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株は、ｐＨ２．５の酸性に対し、４４．２％耐酸性を示し、標準菌株ＫＣＴＣ３１０８は、６７．１％の耐酸性を有していた。
（１）耐酸性の調査
ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の耐酸性を評価するために、以下の方法で実験を実施した。ＬＭＴ１７－３１菌株を、滅菌されたＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃において１６時間培養した。次に、ＨＣｌでｐＨ２．５に調整し、滅菌されたＭＲＳ液体培地に、前記菌株１％を接種し、３７℃において２時間培養した。菌株接種直後と、その２時間培養後との試料を回収し、ＭＲＳ液体培地に希釈し、ＭＲＳ平板培地に塗抹した後、３７℃において２４時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、菌数を測定した。
表３に示されているように、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株は、ｐＨ２．５の酸性に対し、４４．２％耐酸性を示し、標準菌株ＫＣＴＣ３１０８は、６７．１％の耐酸性を有していた。
【表3】
【0039】
（２）耐胆汁性の調査
胆汁酸が、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の成長に及ぼす影響を確認するために、以下の方法で実験を実施した。選抜された菌株を、滅菌されたＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃において２４時間培養した。腸管内の胆汁酸塩濃度が０．１％前後であることを勘案し、０．３％の胆汁酸塩（bile salts）（Sigma（米国））が含有されたＭＲＳ液体培地に、前記菌株を１％を接種し、３７℃において２時間培養した。菌株接種直後と、その２時間培養後との試料を回収し、ＭＲＳ液体培地に希釈し、ＭＲＳ平板培地に塗抹した後、３７℃において２４時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、生存菌株細胞数を測定した。対照群として、０．３％の胆汁塩酸が含有されていないＭＲＳ液体培地において、同一に培養を進め、生存菌株細胞数を測定した。表４は、耐胆汁酸塩を測定した結果である。
表４に示されているように、ＬＭＴ１７－３１菌株は、腸内実際濃度と類似した０．１％よりさらに高い０．３％において、６６．４％の生存率を維持したために、ＬＭＴ１７－３１菌株は、人体や動物の腸内でも、十分に生存することができる根拠にもなる。
胆汁酸が、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の成長に及ぼす影響を確認するために、以下の方法で実験を実施した。選抜された菌株を、滅菌されたＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃において２４時間培養した。腸管内の胆汁酸塩濃度が０．１％前後であることを勘案し、０．３％の胆汁酸塩（bile salts）（Sigma（米国））が含有されたＭＲＳ液体培地に、前記菌株を１％を接種し、３７℃において２時間培養した。菌株接種直後と、その２時間培養後との試料を回収し、ＭＲＳ液体培地に希釈し、ＭＲＳ平板培地に塗抹した後、３７℃において２４時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、生存菌株細胞数を測定した。対照群として、０．３％の胆汁塩酸が含有されていないＭＲＳ液体培地において、同一に培養を進め、生存菌株細胞数を測定した。表４は、耐胆汁酸塩を測定した結果である。
表４に示されているように、ＬＭＴ１７－３１菌株は、腸内実際濃度と類似した０．１％よりさらに高い０．３％において、６６．４％の生存率を維持したために、ＬＭＴ１７－３１菌株は、人体や動物の腸内でも、十分に生存することができる根拠にもなる。
【表4】
【0040】
（３）腸内定着性の調査
ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の腸内細胞定着力程度を評価するために、韓国細胞株銀行から購入したヒト直腸上皮細胞である腺癌腫細胞（human e pithelialcolorectal adenocarcinomacell）Caco－２細胞株（ＫＣＬＢ ３００３７．１）を使用した。該Caco－２細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（Gibco（米国））が含まれたＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）（Gibco（米国））において、５％ ＣＯ２、３７℃条件で、７ｘ１０４cell／１００μｌになるように分注し、９６ウェルプレート（Corning（米国））に、細胞単一層が形成されるように培養した。
ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の腸内細胞定着力程度を評価するために、韓国細胞株銀行から購入したヒト直腸上皮細胞である腺癌腫細胞（human e pithelialcolorectal adenocarcinomacell）Caco－２細胞株（ＫＣＬＢ ３００３７．１）を使用した。該Caco－２細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（Gibco（米国））が含まれたＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）（Gibco（米国））において、５％ ＣＯ２、３７℃条件で、７ｘ１０４cell／１００μｌになるように分注し、９６ウェルプレート（Corning（米国））に、細胞単一層が形成されるように培養した。
【0041】
なお、ＭＲＳ液体培地において培養されたＬＭＴ１７－３１菌株をＰＢＳで洗浄した後、抗生物質が添加されていないＤＭＥＭ培地に懸濁し、細胞単一層が構成されたCaco－２細胞に、ＬＭＴ１７－３１菌株の量が、１ｘ１０７ＣＦＵになるように添加し、５％ ＣＯ２、３７℃条件で２時間培養した。Caco－２細胞に付着することができていない細胞を除去するために、ＰＢＳで５回洗浄し、１００μｌの０．１％トリトンＸ－１００に付着した細胞を引き離した後、それをＭＲＳ固体培地に塗抹した。３７℃において２４時間培養した後、平板培地の上のコロニー数を係数し、ＬＭＴ１７－３１菌株の腸内定着性を調査した。
【0042】
表５は、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の腸内上皮細胞に付着した数を示したものである。表５に示されているように、本発明の新規ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株は、約２％、そして比較菌株ラクトバチルス・プランタルムＫＣＴＣ３１０８は、約１％の腸上皮皮細胞であるCaco－２に定着力があることを確認した。
【表5】
【0043】
実施例３：ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の抗腫瘍効能評価
１．マウスの腫瘍モデル誘導、及びラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の投与
マウス腫瘍誘導モデルに使用されたＣ５７ＢＬ／６マウス（雄（２０～２２ｇ））は、（株）オリエントバイオから購入し、実験開始前の１週間、環境に適応させた。マウスの背皮下組織に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腸癌に由来するＭＣ３８細胞２．５ｘ１０５個を注入し、腫瘍注入１週間後、腫瘍サイズ（５０～７０ｍｍ３）を基に、群分離を行った。群分離後２週間、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、２日に１回、ゾンデ（Sonde）を利用し、マウス当たり１ｘ１０９ＣＦＵ菌株含有ＰＢＳを経口投与し、陽性対照群としては、抗ＰＤ１抗体（クローン番号：ＲＭＰ１－１４（製造社：Bioxcell）（製品名：InvivoMAb anti-mouse PD-1）を、週２回マウス重さ１ｋｇ当たり１０ｍｇ腹腔投与した。陰性対照群としては、ＰＢＳを経口投与した。実験群構成は、各群当たり８匹ずつ、総４群であり、表６のように構成した。
１．マウスの腫瘍モデル誘導、及びラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株の投与
マウス腫瘍誘導モデルに使用されたＣ５７ＢＬ／６マウス（雄（２０～２２ｇ））は、（株）オリエントバイオから購入し、実験開始前の１週間、環境に適応させた。マウスの背皮下組織に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腸癌に由来するＭＣ３８細胞２．５ｘ１０５個を注入し、腫瘍注入１週間後、腫瘍サイズ（５０～７０ｍｍ３）を基に、群分離を行った。群分離後２週間、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、２日に１回、ゾンデ（Sonde）を利用し、マウス当たり１ｘ１０９ＣＦＵ菌株含有ＰＢＳを経口投与し、陽性対照群としては、抗ＰＤ１抗体（クローン番号：ＲＭＰ１－１４（製造社：Bioxcell）（製品名：InvivoMAb anti-mouse PD-1）を、週２回マウス重さ１ｋｇ当たり１０ｍｇ腹腔投与した。陰性対照群としては、ＰＢＳを経口投与した。実験群構成は、各群当たり８匹ずつ、総４群であり、表６のように構成した。
【表6】
【0044】
マウスにＭＣ３８腫瘍細胞株投入後２３日まで、腫瘍サイズを測定し、その後、二酸化炭素を利用し、マウスを犠牲にし、腫瘍を摘出し、腫瘍浸潤免疫細胞分析を行った。分析結果は、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ及び図３Ｆに記載されている。図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ及び図３Ｆは、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍に浸潤されたＣＤ８Ｔ細胞、及びそれによるサイトカイン分泌を分析した結果を示したものである。ＭＣ３８腫瘍細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにジメチルヒドラジンを皮下注射して誘導されたマウス結腸腺癌細胞（mouse colon adenocarcinoma cell）である。本実施例に使用されたマウス腫瘍誘導モデルは、ＭＣ３８腫瘍細胞が皮下組織に移植されたものであるので、経口投与された菌の効果が、皮下組織の癌成長抑制を示すことができるということを示すものであり、菌の影響が腸と関連する癌だけではなく、多様な固形癌腫にも作用しうるということを示す。
【0045】
２．ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株投与による抗腫瘍効能評価
図２Ａ及び図２Ｂは、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍サイズを測定した結果を示した図面である。前記投与は、セクション１によって行われた。具体的には、腫瘍の大きさは、腫瘍細胞株注入７日後から２３日まで、週２回ずつ測定した。正確な腫瘍の大きさを測定するために、バーニアノギスを利用し、腫瘍の長軸と短軸とを測定し、長軸ｘ（短軸）２／２の公式でもって、腫瘍サイズを計算した。図２Ａ及び図２Ｂにおいて、対照群（control）は、陰性対照群であり、ＰＢＳを投与したものであり、ａＰＤ１は、陽性対照群であり、抗ＰＤ１抗体を投与したものであり、ＬＭＴ１７－３１は、実験群であり、ＬＭＴ１７－３１を投与したものでありで、ＬＭＴ１７－３１＋ａＰＤ１は、ＬＭＴ１７－３１と抗ＰＤ１抗体とを投与したものである。図２Ａは、細胞注入後経過日数による腫瘍サイズを示したものであり、図２Ｂは、細胞注入後、２３日目の腫瘍サイズを示したものである。図２Ａにおいて、横軸は、腫瘍サイズを測定した日であり、腫瘍細胞投与後の経過日を示す。図２Ｂにおいて、棒は、細胞注入後２３日目の各個体別腫瘍サイズをいずれも表したものである。図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、ＬＭＴ１７－３１菌株単独投与群と、ＬＭＴ１７－３１菌株と抗ＰＤ１抗体との併用投与群のいずれもにおいて、統計学的に有意な腫瘍成長阻害（tumor growth inhibition）が観察された。
図２Ａ及び図２Ｂは、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍サイズを測定した結果を示した図面である。前記投与は、セクション１によって行われた。具体的には、腫瘍の大きさは、腫瘍細胞株注入７日後から２３日まで、週２回ずつ測定した。正確な腫瘍の大きさを測定するために、バーニアノギスを利用し、腫瘍の長軸と短軸とを測定し、長軸ｘ（短軸）２／２の公式でもって、腫瘍サイズを計算した。図２Ａ及び図２Ｂにおいて、対照群（control）は、陰性対照群であり、ＰＢＳを投与したものであり、ａＰＤ１は、陽性対照群であり、抗ＰＤ１抗体を投与したものであり、ＬＭＴ１７－３１は、実験群であり、ＬＭＴ１７－３１を投与したものでありで、ＬＭＴ１７－３１＋ａＰＤ１は、ＬＭＴ１７－３１と抗ＰＤ１抗体とを投与したものである。図２Ａは、細胞注入後経過日数による腫瘍サイズを示したものであり、図２Ｂは、細胞注入後、２３日目の腫瘍サイズを示したものである。図２Ａにおいて、横軸は、腫瘍サイズを測定した日であり、腫瘍細胞投与後の経過日を示す。図２Ｂにおいて、棒は、細胞注入後２３日目の各個体別腫瘍サイズをいずれも表したものである。図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、ＬＭＴ１７－３１菌株単独投与群と、ＬＭＴ１７－３１菌株と抗ＰＤ１抗体との併用投与群のいずれもにおいて、統計学的に有意な腫瘍成長阻害（tumor growth inhibition）が観察された。
【0046】
３．腫瘍浸潤免疫細胞分析及び免疫細胞の機能性評価
腫瘍浸潤免疫細胞であるＣＤ８Ｔ細胞は、重要な抗癌反応の指標であり、ＣＤ８Ｔ細胞が分泌するインターフェロンガンマ（Interferon gamma）とグランザイムＢ（Granzyme B）は、免疫細胞の活性能を示す機能性サイトカインである。図３は、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍に浸潤されたＣＤ８Ｔ細胞、及びそれによるサイトカイン分泌を分析した結果を示したものである。投与は、セクション１によって遂行された。投与２３日後、腫瘍を摘出した。摘出された腫瘍は、５０μｇ／ｍｌリベラーゼ（Liberase）と４０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉとが含まれたＲＰＭＩ１６４０培地と細胞ストレーナ（cell strainer）とを利用し、単一細胞に分離した。Ｔ細胞のインターフェロンガンマ生成様相を観察するために、分離された細胞は、１０％ ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ１６４０培地において、５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（Phorbol 12-myristate 13-acetate）と５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（ionomycin）とで４時間刺激した。ＰＭＡとイオノマイシンとの物質は、Ｔ細胞が活性化されるように信号的刺激を与える物質であり、実際抗原によるＴ細胞の活性メカニズムのような役割を行い、免疫反応が起こるような環境を作る。イオノマイシンは、Ｃａ２＋イオノフォア（ionophore）であり、ＰＫＣ（protein kinase C）を増加させ、ＰＭＡの場合は、ＰＫＣをリン酸化（phosphorylation）させることにより、ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞とをターゲットすることができるように、相乗作用させる（synergize）役割を行う。刺激後、免疫細胞分析及びインターフェロンガンマ生成確認のために、表７の抗体で細胞を染色し、ＣＡＮＴＯ ＩＩ流細胞分析装備を利用して分析した。
腫瘍浸潤免疫細胞であるＣＤ８Ｔ細胞は、重要な抗癌反応の指標であり、ＣＤ８Ｔ細胞が分泌するインターフェロンガンマ（Interferon gamma）とグランザイムＢ（Granzyme B）は、免疫細胞の活性能を示す機能性サイトカインである。図３は、ラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１７－３１菌株を、腫瘍を有するマウスに投与した後、腫瘍に浸潤されたＣＤ８Ｔ細胞、及びそれによるサイトカイン分泌を分析した結果を示したものである。投与は、セクション１によって遂行された。投与２３日後、腫瘍を摘出した。摘出された腫瘍は、５０μｇ／ｍｌリベラーゼ（Liberase）と４０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉとが含まれたＲＰＭＩ１６４０培地と細胞ストレーナ（cell strainer）とを利用し、単一細胞に分離した。Ｔ細胞のインターフェロンガンマ生成様相を観察するために、分離された細胞は、１０％ ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ１６４０培地において、５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（Phorbol 12-myristate 13-acetate）と５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（ionomycin）とで４時間刺激した。ＰＭＡとイオノマイシンとの物質は、Ｔ細胞が活性化されるように信号的刺激を与える物質であり、実際抗原によるＴ細胞の活性メカニズムのような役割を行い、免疫反応が起こるような環境を作る。イオノマイシンは、Ｃａ２＋イオノフォア（ionophore）であり、ＰＫＣ（protein kinase C）を増加させ、ＰＭＡの場合は、ＰＫＣをリン酸化（phosphorylation）させることにより、ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞とをターゲットすることができるように、相乗作用させる（synergize）役割を行う。刺激後、免疫細胞分析及びインターフェロンガンマ生成確認のために、表７の抗体で細胞を染色し、ＣＡＮＴＯ ＩＩ流細胞分析装備を利用して分析した。
【表7】
【0047】
図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃは、それぞれ腫瘍浸潤Ｔ細胞におけるＣＤ８Ｔ細胞の百分率、ＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＦＮγ発現細胞の百分率、及びＣＤ８Ｔ細胞におけるグランザイムＢ発現細胞の百分率を示し、図３Ｄ、図３Ｅ及び図３Ｆは、それぞれ腫瘍浸潤された全体ＣＤ８Ｔ細胞の数、ＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＦＮγ発現細胞の数、及びＣＤ８Ｔ細胞におけるグランザイムＢ発現細胞の数を示したものである。図３に示されているように、ＰＢＳ処理群対比で、ＬＭＴ１７－３１投与群と、抗ＰＤ１抗体とＬＭＴ１７－３１との併用投与群途において、有意であるように、腫瘍浸潤ＣＤ８Ｔ細胞の比率と数とが増大した。また、活性因子であるインターフェロンガンマとグランザイムＢとを生成するＣＤ８Ｔ細胞の比率と数とにおいても、ＰＢＳ対照群対比で、ＬＭＴ１７－３１処理群と、抗ＰＤ１抗体とＬＭＴ１７－３１との併用処理群とにおいて、有意に増大した。
【0048】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【配列表】