特許 7599192 幹細胞培養用培地、細胞産生タンパク質組成物、および骨芽前駆細胞または骨芽細胞への分化誘導方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-05

(45)【発行日】2024-12-13

(54)【発明の名称】幹細胞培養用培地、細胞産生タンパク質組成物、および骨芽前駆細胞または骨芽細胞への分化誘導方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0775 20100101AFI20241206BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20241206BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20241206BHJP

   C12P 21/00 20060101ALN20241206BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0775

C07K14/78

C12N5/077

C12P21/00 B

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2024519469

(86)(22)【出願日】2023-11-24

(86)【国際出願番号】 JP2023042255

【審査請求日】2024-03-28

(31)【優先権主張番号】P 2023101035

(32)【優先日】2023-06-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】512292315

【氏名又は名称】株式会社バイオ未来工房

(73)【特許権者】

【識別番号】523236618

【氏名又は名称】丸田 耕一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100181847

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 かおり

(72)【発明者】

【氏名】石塚 保行

(72)【発明者】

【氏名】丸田 耕一郎

【審査官】鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５２５４４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－１２０５２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０２２－０４３０１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１１１４７１６５１（ＣＮ，Ａ）

【文献】国際公開第２０２１／１３６７３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０２３／１０１６０３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／０７７５

Ｃ１２Ｎ ５／０７７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

６０～９０ｖｏｌ％の基礎培地と、
１０～４０ｖｏｌ％の生理食塩水と、
を含み、さらに、
１～１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２と、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、
０．５～８．０ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムと、
が添加されて構成される、幹細胞培養用培地。

【請求項2】

間葉系幹細胞を請求項１に記載の幹細胞培養用培地で１～１０日間培養し、
その後、有機溶媒でタンパク質成分を沈殿させ、
沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させる、
ことにより得られる、間葉系幹細胞または骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導するための、細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物。

【請求項3】

Ｉ型プロコラーゲンと
ヒアルロン酸と、
を含み、
前記Ｉ型プロコラーゲンにはカルシウムが結合している、
請求項２に記載のＣＰＰｓ組成物。

【請求項4】

１）間葉系幹細胞を培養容器に接着させた状態で、骨芽細胞分化誘導培地中で２～６日間培養して、コンフルエントまたはそれ以上まで増殖させることにより、または、
２）間葉系幹細胞を培養容器中に浮遊状態で静置して２～４日間冷蔵保存することにより、
間葉系幹細胞を骨芽前駆細胞に分化させ、その後、
前記骨芽前駆細胞を回収して培養容器に播種し、請求項２に記載のＣＰＰｓ組成物を添加した基礎培地で培養することにより、
前記骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化させる、骨芽細胞への分化誘導方法。

【請求項5】

前記間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、末梢血、臍帯、臍帯血、または歯髄由来である、請求項４に記載の骨芽細胞への分化誘導方法。

【請求項6】

１）間葉系幹細胞を培養容器に接着させた状態で、骨芽細胞分化誘導培地中で２～６日間培養して、コンフルエントまたはそれ以上まで増殖させることにより、または、
２）間葉系幹細胞を培養容器中に浮遊状態で静置して２～４日間冷蔵保存することにより、
間葉系幹細胞を骨芽前駆細胞に分化させ、
ａ）得られた骨芽前駆細胞を播種するのと同時に、請求項２に記載のＣＰＰｓ組成物を添加することにより、骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化させる、または、
ｂ）得られた骨芽前駆細胞を播種し、その後、請求項２に記載のＣＰＰｓ組成物を添加することにより、骨芽前駆細胞から骨芽細胞への分化を開始させる、
骨芽細胞への分化誘導方法（ヒトに対して行うものを除く）。

【請求項7】

前記間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、末梢血、臍帯、臍帯血、または歯髄由来である、請求項６に記載の骨芽細胞への分化誘導方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、幹細胞培養用培地、およびこれを用いて得られる細胞産生タンパク質組成物、およびこれを用いた骨芽細胞への分化誘導方法、並びに骨芽前駆細胞への分化誘導方法に関し、特に、幹細胞培養用培地を用いて得られた細胞産生タンパク質組成物により、間葉系幹細胞または骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導する方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

骨代謝は、骨を作る骨芽細胞と骨を吸収する破骨細胞のバランスで維持されている。骨芽細胞は間葉系幹細胞に由来し、破骨細胞は造形系の単球／マクロファージに由来すると考えられている。

【0003】

従来、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる方法としては、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を細胞増殖用培地を入れたディッシュやプレートで培養し、８０％以上コンフルエントな状態になった時点で、培地を骨芽細胞分化誘導培地に交換して、2週間培養するといった方法が知られている。また、骨芽細胞への分化誘導を評価する指標としては、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化誘導されることにより生じる石灰化を、アリザリンレッドのような色素でカルシウムを染色することにより評価する方法が知られている（例えば、特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開2005-124460号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、上記のような方法では、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化誘導されたことにより石灰化が生じているため、細胞をディッシュやプレートから剥離させることが難しく、分化させた骨芽細胞を、目的とする場所に再播種、投与、移植等を行うことができなかった。

【0006】

一方、骨芽細胞の前段階の分化状態である、骨芽前駆細胞の段階であることを、石灰化の開始を示す、ｎｏｄｕｌｅ（石灰化球）の形成で判断し、当該骨芽前駆細胞の段階で回収して再播種、投与、移植等を行った。しかしながら、この場合には、再播種、投与、移植先において、石灰化がみられず、さらに、骨芽前駆細胞から未分化の状態に戻ってしまった。
このことから、骨芽前駆細胞を、骨芽細胞分化誘導培地なしに再播種、投与、移植等を行っただけでは、骨芽細胞への分化が進まないということが分かった。

【0007】

また、再播種、投与、移植先において、骨芽細胞分化誘導培地を使用すれば、１０日程度で骨芽細胞への分化誘導を進めることができるものの、投与／移植先が特にｉｎ ｖｉｖｏである場合には、当該投与／移植先において、骨芽細胞分化誘導培地を１０日程度にわたって投与／補充することは困難である。

【0008】

間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導するには、デキサメサゾンやアスコルビン酸、β‐グリセロリン酸が必要であると考えられており、骨芽細胞分化誘導培地にはこれらが含まれている。
また、一般的に、骨芽細胞分化誘導培地には、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる強い作用があり、細胞毒性を示す成分は含まれていないものの、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が使用されている。ＦＢＳは、異種動物由来成分で、抗原性と人畜共通ウイルス感染のリスクがあり、上記投与／移植先において使用することは難しい。

【0009】

上記事情に鑑み、本発明者により更なる検討が進められた結果、骨芽細胞分化誘導培地に代えて使用可能であり、かつ、間葉系幹細胞から調製可能である、骨芽細胞分化誘導成分を含む細胞産生タンパク質（cell producing proteins、ＣＰＰｓ）を新規に知見し、本発明に至った。

【0010】

本発明は、上述した実情に鑑みてなされたものであり、間葉系幹細胞および骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導することを目的とする。より具体的には、骨芽細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分を用いて、間葉系幹細胞および骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化させることを可能にする、骨芽細胞への分化誘導方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、上記の知見に基づきなされたものであって、上記課題を有利に解決することを目的とするものであり、本発明の第１の態様は、
６０～９０ｖｏｌ％の基礎培地と、
１０～４０ｖｏｌ％の生理食塩水と、
を含み、さらに、
１～１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２と、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、
０．５～８．０ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムと、
が添加されて構成される、幹細胞培養用培地である。
このような幹細胞培養用培地によれば、間葉系幹細胞から細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物を作成することができ、当該ＣＰＰｓ組成物により、間葉系幹細胞および骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導することができる。
基礎培地としては、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、α‐ＭＥＭを使用することができる。上記幹細胞培養用培地の組成において、生理食塩水を加える目的は、上記基礎培地中のＣａ濃度を１０～４０％に下げることを目的とする。そのため、使用する基礎培地のＣａ濃度が４０～５０μｇ／ｍＬである場合には生理食塩水で希釈する必要はない。

【0012】

本発明の第２の態様は、
間葉系幹細胞を上記第１の態様に記載の幹細胞培養用培地で１～１０日間培養し、
その後、有機溶媒でタンパク質成分を沈殿させ、
沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させる、
ことにより得られる、間葉系幹細胞または骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導するための、細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物である。
このようなＣＰＰｓ組成物によれば、骨芽細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分を用いて、間葉系幹細胞および骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導することができる。

【0013】

また、上記第２の態様において、ＣＰＰｓ組成物は、Ｉ型プロコラーゲンとヒアルロン酸と、を含み、前記Ｉ型プロコラーゲンにはカルシウムが結合していることとしてもよい。
Ｉ型プロコラーゲンは、カルシウムとの複合体を形成することによって細胞の足場となり、かつ、細胞に対するカルシウムの供給を容易にすることができる。

【0014】

本発明の第３の態様は、
１）間葉系幹細胞を培養容器に接着させた状態で、骨芽細胞分化誘導培地中で２～６日間培養して、コンフルエントまたはそれ以上まで増殖させることにより、または、
２）間葉系幹細胞を培養容器中に浮遊状態で静置して２～４日間冷蔵保存することにより、
間葉系幹細胞を骨芽前駆細胞に分化させ、その後、
前記骨芽前駆細胞を回収して培養容器に播種し、上記第２の態様に記載のＣＰＰｓ組成物を添加した基礎培地で培養することにより、
前記骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化させる、骨芽細胞への分化誘導方法である。
このような骨芽細胞への分化誘導方法によれば、骨芽細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分を用いて、骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導することができる。
また、上記態様において、前記間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、末梢血、臍帯、臍帯血、または歯髄由来であることとしてもよい。

【0015】

本発明の第４の態様は、
１）間葉系幹細胞を培養容器に接着させた状態で、骨芽細胞分化誘導培地中で２～６日間培養して、コンフルエントまたはそれ以上まで増殖させることにより、または、
２）間葉系幹細胞を培養容器中に浮遊状態で静置して２～４日間冷蔵保存することにより、
間葉系幹細胞を骨芽前駆細胞に分化させる、
骨芽前駆細胞への分化誘導方法である。
このような骨芽前駆細胞への分化誘導方法によれば、再播種、投与、移植前に石灰化が生じることなく、再播種、投与、移植用の骨芽前駆細胞を準備することができる。
また、上記態様において、前記間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、末梢血、臍帯、臍帯血、または歯髄由来であることとしてもよい。

【0016】

本発明の第５の態様は、
上記第４の態様に記載の分化誘導方法により得られた骨芽前駆細胞を播種するのと同時に、上記第２の態様に記載のＣＰＰｓ組成物を添加することにより、骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化させる、または、
上記第４の態様に記載の分化誘導方法により得られた骨芽前駆細胞を播種し、その後、上記第２の態様に記載のＣＰＰｓ組成物を添加することにより、骨芽前駆細胞から骨芽細胞への分化を開始させる、
骨芽細胞への分化誘導方法である。
このような骨芽細胞への分化誘導方法によれば、再播種、投与、移植先において、所望のタイミングで、骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導させることができる。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、骨芽細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分を用いて、間葉系幹細胞および骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、Ａ：Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ染色の写真、Ｂ：ＯＤ４５０ｎｍでの吸光度の測定結果、Ｃ：Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ染色の顕微鏡拡大写真（×４０）である。

【図2】図２は、実施例２の結果を示す図である。

【図3】図３は、実施例２の結果を示す図である。

【図4】図４は、実施例２の結果を示す図である。

【図5】図５は、実施例２の結果を示す図である。

【図6】図６は、実施例３の結果を示す図である。

【図7】図７は、実施例７の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
（幹細胞培養用培地）
本発明の第１の態様に係る幹細胞培養用培地は、
６０～９０ｖｏｌ％の基礎培地と、
１０～４０ｖｏｌ％の生理食塩水と、
を含み、さらに、
１～１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２と、
０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、
０．５～８．０ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムと、
が添加されて構成される、幹細胞培養用培地であることを特徴とする。
上記幹細胞培養用培地を用いて培養された間葉系幹細胞から、後述する細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物が得られることを、本発明者は新規に知見した。
基礎培地としては、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、α‐ＭＥＭを使用することができる。上記幹細胞培養用培地の組成において、生理食塩水を加える目的は、上記基礎培地中のＣａ濃度を１０～４０％に下げることを目的とする。そのため、使用する基礎培地のＣａ濃度が４０～５０μｇ／ｍＬである場合には生理食塩水で希釈する必要はない。

【0020】

上記幹細胞培養用培地に添加される添加因子に関し、ＥＧＦは上皮成長因子（Epidermal Growth Factor）、ＦＧＦ－２は線維芽細胞増殖因子２（fibroblast growth factor 2）、ＰＤＧＦは血小板由来成長因子（Platelet-Derived Growth Factor）である。上記添加因子は、一般的には、細胞を増殖させるため等の目的で基礎培地への添加因子としてそれぞれ使用されるものである。
上記本発明の第１の態様に係る幹細胞培養用培地において、
ＥＧＦを１～１０ｎｇ／ｍＬ、
ＦＧＦ‐２を０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
ＰＤＧＦを０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
の範囲で添加すると、より効率よくＣＰＰｓ組成物を産生することができる。

【0021】

また、上記本発明の第１の態様に係る幹細胞培養用培地において、
０．１～１０．０μｇ／ｍＬトランスフェリン、および／または
０．２～２０．０μｇ／ｍＬインスリン、および／または
０．１～３．０ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム
をさらに添加することは、細胞の増殖性能を高める観点から好適である。

【0022】

幹細胞培養用培地の具体的は調製方法としては、例えば、
５００ｍＬ入りのＩＭＤＭから５０ｍＬから２００ｍLを除去し、等量の生理食塩水を添加して、５００ｍＬとし、これに抗生物質を５ｍＬ加え、
さらに、
ＥＧＦを１～１０ｎｇ／ｍＬ、
ＦＧＦ‐２を０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
ＰＤＧＦを０．５～５．０ｎｇ／ｍＬ、
トランスフェリンを０．１～１０．０μｇ／ｍＬ、
インスリンを０．２～２０．０μｇ／ｍＬ、
亜セレン酸ナトリウムを０．１～３．０ｎｇ／ｍＬ、
リン酸Ｌ－アスコルビルマグネシウムを０．５～８．０ｍＭ、
の範囲で添加して作製することができる。

【0023】

（細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物）
本発明の第２の態様に係るＣＰＰｓ組成物は、
間葉系幹細胞を上記第１の態様に記載の幹細胞培養用培地で１～１０日間培養し、
その後、有機溶媒でタンパク質成分を沈殿させ、
沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させる、
ことにより得られる、間葉系幹細胞または骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導するための、ＣＰＰｓ組成物であることを特徴とする。
このようなＣＰＰｓ組成物によれば、間葉系幹細胞および骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導することができる。さらに、このようなＣＰＰｓ組成物によれば、骨芽細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分、さらには、自己細胞由来の成分を用いて、間葉系幹細胞、骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導することができる。

【0024】

また、上記第２の態様において、ＣＰＰｓ組成物は、Ｉ型プロコラーゲンとヒアルロン酸と、を含み、前記Ｉ型プロコラーゲンにはカルシウムが結合していることとしてもよい。
ＣＰＰｓ組成物には、例えば、Ｉ型プロコラーゲンは３０～１００μｇ／ｍＬ含まれ、ヒアルロン酸は４９～１４０μｇ／ｍＬ含まれる。Ｉ型プロコラーゲンとカルシウムの結合割合は、例えば、３０～４５％、好適には、３５～４２％である。

【0025】

上記第２の態様において、間葉系幹細胞としては、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯Wharton's Jelly(ウォートンジェリー)由来間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞等を使用することができる。基礎培地としては、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、α‐ＭＥＭを使用することができる。培養期間は、１～１０日間であり、好適には、３～４日である。

【0026】

また、上記第２の態様において、「有機溶媒でタンパク質成分を沈殿」させる工程の後の「沈殿部分を分取して生理食塩水または基礎培地に溶解させる」工程においては、有機溶媒で沈殿させたタンパク質成分をｐＨ１の塩酸（例えば、１Ｎ ＨＣｌ）に懸濁して、ｖｏｒｔｅｘ（例えば、約１０分間）し、その後、（例えば、１．２Ｎ ＮａＯＨを用いて）中和することにより、ウイルス不活化処理を合わせて行うこととしてもよい。その場合には、中和した溶液を遠心分離し、得られた上清を細胞産生タンパク質（ＣＰＰｓ）組成物とする。

【0027】

ここで、本明細書では、「骨芽前駆細胞」とは、「石灰化の開始を示す、ｎｏｄｕｌｅ（石灰化球）が形成された（一部石灰化した）細胞であって、トリプシン－ＥＤＴＡで剥離できる状態の細胞」と定義する。
本発明者は、間葉系幹細胞を、後述する１）または２）の工程で短期間培養することにより、間葉系幹細胞を骨芽前駆細胞に分化誘導できることを新規に知見した。

【0028】

（間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導方法）
本発明の第３の態様に係る骨芽細胞への分化誘導方法は、
１）間葉系幹細胞を培養容器に接着させた状態で、骨芽細胞分化誘導培地中で２～６日間培養して、コンフルエントまたはそれ以上まで増殖させることにより、または、
２）間葉系幹細胞を培養容器中に浮遊状態で静置して２～４日間冷蔵保存することにより、
間葉系幹細胞を骨芽前駆細胞に分化させ、その後、
前記骨芽前駆細胞を回収して培養容器に播種し、上記第２の態様に記載のＣＰＰｓ組成物を添加した基礎培地で培養することにより、
前記骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化させる、ことを特徴とする。

【0029】

このような骨芽細胞への分化誘導方法によれば、骨芽細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分を用いて、骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導することができる。
また、上記第３の態様において、前記間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、末梢血、臍帯、臍帯血、または歯髄由来であることとしてもよい。

【0030】

上記第３の態様において、「ＣＰＰｓ組成物を添加した基礎培地」におけるＣＰＰｓ組成物の濃度は、２５～７５ｖｏｌ％であることが好ましく、５０ｖｏｌ％がより好ましい。
また、「冷蔵保存」とは、４～１０℃での保存を意味する。
また、「コンフルエントまたはそれ以上」における「それ以上」とは最大で約２００％の過増殖を意味する。
なお、本明細書において、「コンフルエント」とは、接着細胞が培養容器の接着面を覆いつくした状態、すなわち、１００％コンフルエントである状態を指す。

【0031】

（間葉系幹細胞の骨芽前駆細胞への分化誘導方法）
本発明の第４の態様は、
１）間葉系幹細胞を培養容器に接着させた状態で、骨芽細胞分化誘導培地中で２～６日間培養して、コンフルエントまたはそれ以上まで増殖させることにより、または、
２）間葉系幹細胞を培養容器中に浮遊状態で静置して２～４日間冷蔵保存することにより、
間葉系幹細胞を骨芽前駆細胞に分化させる、ことを特徴とする。
骨芽前駆細胞への分化誘導方法である。

【0032】

このような骨芽前駆細胞への分化誘導方法によれば、再播種、投与、移植前に石灰化が生じることなく、再播種、投与、移植用の骨芽前駆細胞を準備することができる。
また、上記第４の態様において、前記間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、末梢血、臍帯、臍帯血、または歯髄由来であることとしてもよい。

【0033】

上記第４の態様において、「冷蔵保存」とは、４～１０℃での保存を意味する。
また、「コンフルエントまたはそれ以上」における「それ以上」とは最大で２００％の過増殖を意味する。

【0034】

（骨芽前駆細胞の骨芽細胞への分化誘導方法）
本発明の第５の態様は、
上記第４の態様に記載の分化誘導方法により得られた骨芽前駆細胞を播種するのと同時に、上記第２の態様に記載のＣＰＰｓ組成物を添加することにより、骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化させる、または、
上記第４の態様に記載の分化誘導方法により得られた骨芽前駆細胞を播種し、その後、上記第２の態様に記載のＣＰＰｓ組成物を添加することにより、骨芽前駆細胞から骨芽細胞への分化を開始させる、
骨芽細胞への分化誘導方法である。

【0035】

このような骨芽細胞への分化誘導方法によれば、再播種、投与、移植先において、所望のタイミングで、骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導させることができる。特に、骨芽前駆細胞を播種した後に、ＣＰＰｓ組成物を添加する場合には、当該ＣＰＰｓ組成物を、骨芽細胞への分化を開始させるためのブースターとして使用することができる。
また、上記第５の態様において、「ＣＰＰｓ組成物」は、骨芽前駆細胞の培養に使用されている培地の２５～７５ｖｏｌ％となるように添加されることが好ましく、５０ｖｏｌ％がより好ましい。

【実施例】

【0036】

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0037】

（実施例１）幹細胞培養用培地およびＣＰＰｓ組成物の調製
５００ｍＬ入りの幹細胞増殖用ＢＳＣＭ－ＰＬ２培地（バイオ未来工房社製）に、抗生物質としてAntibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution（ナカライテスク社製、製品番号：02892‐54）を５ｍＬ加え、ＣＰＰｓ組成物を作成するための幹細胞培養用培地を準備した。
次に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に属する脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）（Lonza社製、製品番号：PT‐2501）４×１０^５cells/mLを、２％ヒト血清を含むＢＭＣＭ‐ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）を用いてＴ‐７５フラスコ（SARSTEDT社製、製品番号：83.3911.002）で９０％コンフルエントになるまで培養し、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製、製品番号：32777‐44）で剥離した。その後、ハイパーフラスコ（コーニング社製）に２×１０^６cells/mLで播種し、１％ヒト血清を含むＢＭＣＭ－ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）５６０ｍLでコンフルエントになるまで再度培養した。

【0038】

その後、幹細胞増殖用ＢＳＣＭ－ＰＬ２培地（バイオ未来工房社製）に培地を交換して、５日間培養し、培地を全量回収して新たな幹細胞培養用培地培地５６０ｍLを加え、５日間さらに培養した。この培地の全量回収と添加を細胞が剥離するまで継続し、このようにして回収した培養上清について、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）を行って細胞残渣を除去した。その後、８０％エタノールまたはアセトンによる有機溶媒沈殿法で、タンパク質画分を分離した。このタンパク質画分をＰＢＳ（－）（ナカライテスク社製、製品番号：07269‐84）に溶解させ、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）によって不溶画分を除去し、再度、８０％エタノールまたはアセトンで沈殿させた。

【0039】

この沈殿を１Ｎ塩酸（ナカライテスク社製、製品番号：18320‐15）１０ｍLで溶解し、室温、２，５００ｒｐｍで１０分間、ｖｏｒｔｅｘで撹拌し、１．２Ｎ苛性ソーダ（ナカライテスク社製、製品番号：31511‐05）で中和してウイルス不活化処理を行い、その後、遠心して不溶物を除去した。最後に、０．４５μｍのフィルター（Cytiva社製、製品番号：6900‐2504）を通して滅菌処理し、ＣＰＰｓ組成物を得た。

【0040】

（比較例１）対照培養上清（ＣＭ）の調製
次に、比較対照として、一般的な培養上清であるＣＭを以下のように調製した。
ＡＳＣ（Lonza社製、製品番号：PT‐2501）４×１０^５cells/mLを２％ヒト血清を含むＢＭＣＭ‐ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）を用いてＴ‐７５フラスコ（ARSTEDT社製、製品番号：83.3911.002）で９０％コンフルエントになるまで培養し、トリプシン‐ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製、製品番号：32777‐44）で剥離し、ハイパーフラスコ（コーニング社製）に１％ヒト血清を含むＢＭＣＭ－ＰＬ１培地（バイオ未来工房社製）５６０ｍLを用いてコンフルエントになるまで再度培養し、培養上清を回収した。その後、培養上清を遠心して不溶物を除去した。最後に、０．４５μｍのフィルター（Cytiva社製、製品番号：6900‐2504）を通して滅菌処理し、ＣＭを得た。

【0041】

（実施例２）接着培養による骨芽前駆細胞の調製
ＡＳＣ（Lonza社製、製品番号：PT‐2501）３×１０^５cells/mLを、間葉系幹細胞増殖用培地（株式会社フコク製、製品番号：FKCM 301T）１０ｍLを用いて１０ｃｍディッシュ（SARSTEDT社製、製品番号：83.3902）に２０～３０％コンフルエントになるように播種し、培養した。
次に、以下の（１）から（４）の培養条件でそれぞれ培養した後、培地を骨芽細胞分化誘導培地ＢＭＫ－Ｒ００８（株式会社バイオ未来工房製）に交換して、２、４、６日間それぞれ培養した。
培養条件（１）８０～９０％コンフルエントになるまで培養。
培養条件（２）８０～９０％コンフルエントになった状態で、ＩＭＤＭ（ナカライテスク社製、製品番号：11506‐05）に培地交換し、コンフルエントになるまで培養。
培養条件（３）コンフルエントになるまで培養。
培養条件（４）コンフルエントになった状態から２日間過増殖になるように培養。

【0042】

次に、１０ｃｍディッシュで培養したＡＳＣを剥離して回収し、上記ＩＭＤＭに懸濁して１×１０^５cells/mL/wellに調製し、２４ウェルプレート（SARSTEDT社製、製品番号：83.3922）に播種した。
翌日、４種類の培地：
培地（Ａ）ＩＭＤＭ、
培地（Ｂ）ＣＭ＋ＩＭＤＭ（混合比１：１）、
培地（Ｃ）ＣＰＰｓ組成物＋ＩＭＤＭ（混合比１：１）、
培地（Ｄ）骨芽細胞分化誘導培地（陽性対照）、
に交換し、培地交換しながら１～８日間まで培養した。ＣＭとＣＰＰｓ組成物は、上記（実施例１）と（比較例１）でそれぞれ調製したものを使用した。なお、上記混合比は体積比である。

【0043】

上記１～８日間の培養後に、Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ染色キットＢＭＫ－Ｒ００９（株式会社バイオ未来工房製）で、（１）～（４）の各ウェルを固定化して、石灰化結節（リン酸カルシウム）を染色し、リン酸カルシウムに結合した色素を５％ギ酸で抽出してＯＤ４５０ｎｍで吸光度を測定した。

【0044】

Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄで赤く染色された場合、ギ酸で溶出した上記色素のＯＤ４５０ｎｍでの吸光度は０．１００以上となる。その根拠となる実験を以下に示す。
上記培養条件（４）：「コンフルエント（１００％）になった状態から２日間過増殖になるように培養」し、その後、骨芽細胞分化誘導培地に交換して４日間培養した細胞を用いて、以下の培地でさらに３～８日間それぞれ培養した。
(a)ＣＭ＋ＩＭＤＭ（混合比１：１）
(b)ＣＰＰｓ組成物＋ＩＭＤＭ（混合比１：１）
(c)骨芽細胞分化誘導培地（陽性対照）

【0045】

結果を図１に示す。Ａ：Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ染色の写真（培養６日目）、Ｂ：ＯＤ４５０ｎｍでの吸光度の測定結果（左側の列からそれぞれ、培養３、６、８日目）、Ｃ：Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ染色の顕微鏡拡大写真（×４０）（培養６日目）である。
(a)については、図１のＡ(a)およびＣ(a)をみると、染色されていないことがわかる。このときの吸光度は、図１のＢ(a)に示されるように０．００９である。
(b)については、図１のＡ(b)およびＣ(b)をみると、nodule（石灰化球）が染まって石灰化が始まっていることがわかる。このときの吸光度は、図１のＢ(b)に示されるように０．１２１であり、Ｂ(a)の約１０倍である。
(c)は、陽性対象として、完全に石灰化が進んだ状態を示す。
上記の結果から、ＯＤ４５０ｎｍでの吸光度が０．１００以上で石灰化ありと判断し、間葉系幹細胞および骨芽前駆細胞が骨芽細胞へと分化誘導されたことの判断基準とした。

【0046】

図２～５の表のそれぞれに、上記培養条件（１）～（４）の結果のそれぞれを示す。
培養条件（１）と（２）では、陽性対象の培地（Ｄ）以外は殆ど石灰化されず、骨芽細胞への分化誘導がみられなかった（図２、図３）。
一方、培養条件（３）では、コンフルエントで骨芽分化に交換して２日と４日後に剥離してプレートに播種し、培地（Ｃ）：ＣＰＰｓ組成物＋ＩＭＤＭに交換した場合、８日後に石灰化が生じ、また、コンフルエントで骨芽細胞分化誘導培地に交換して６日後に剥離してプレートに播種し、培地（Ｃ）に交換した場合、３日後と８日後に石灰化が生じ、骨芽細胞に分化誘導されたことが確認された（図４）。
さらに、培養条件（４）では、コンフルエントから２日間過増殖にし、その後、骨芽細胞分化誘導培地に交換して４日と６日後に剥離して、プレートに播種し、培地（Ｃ）に交換した場合、６～８日後、１～８日後にそれぞれ石灰化が生じ、骨芽細胞に分化誘導されたことが確認された（図５）。

【0047】

図２～５の表に示されるように、陽性対象の培地（Ｄ）で培養した場合は、プレートに播種して３日後には、石灰化が生じていたが、培地（Ａ）：ＩＭＤＭおよび培地（Ｂ）：ＣＭ＋ＩＭＤＭで培養した場合は、培養条件（１）～（４）のいずれにおいても、石灰化が全く生じなかった。これに対し、培地（Ｃ）：ＣＰＰｓ組成物＋ＩＭＤＭで培養した場合には、上記のように、培養条件（３）および（４）において、培養期間に応じて石灰化が促進され、骨芽細胞に分化誘導することができた。
このことから、培養条件（３）および（４）により、骨芽前駆細胞へと分化誘導された細胞が、（Ｃ）ＣＰＰｓ組成物＋ＩＭＤＭでの培養により、さらに骨芽細胞へと分化誘導されたと考えられる。

【0048】

（実施例３）浮遊静置による骨芽前駆細胞の調製
次にＭＳＣを培養容器に接着させることなく、浮遊静置状態で、骨芽前駆細胞に分化させる方法について検討した。
ＡＳＣ（Lonza社製、製品番号：PT‐2501）１×１０^６cells/mLを間葉系幹細胞増殖用培地ＦＫＣＭ ３０１Ｔ（フコク製）４０ｍLを用いてＴ－１７５フラスコ（SARSTEDT社製、製品番号：83.3912.002）で培養し、１．７×１０^６ｃｅｌｌｓを、実施例２で使用した４種類の培地：
培地（Ａ）ＩＭＤＭ、
培地（Ｂ）ＣＭ＋ＩＭＤＭ（混合比１：１）、
培地（Ｃ）ＣＰＰｓ組成物＋ＩＭＤＭ（混合比１：１）、
培地（Ｄ）骨芽細胞分化誘導培地（陽性対照）、
とともに、４本の１５ｍＬチューブ（SARSTEDT社製、製品番号：62.554.5.2）にそれぞれ４ｍL加えて混和し、２日間、４日間、およびび６日間、ぞれぞれ、浮遊状態で冷蔵保存（４～５℃）にて静置した。なお、上記混合比は体積比である。

【0049】

それぞれの冷蔵保存期間の経過後に、各チューブから１０μＬをサンプリングして、血球計算盤（エルマ販売社製、製品番号：4025）を用いて生細胞数を測定した。その後、４本の各チューブ培地を遠心分離して除去し、ＩＭＤＭ（ナカライテスク社製、製品番号：11506‐05）に懸濁し、その後、４８ウェルプレート（SARSTEDT社製、製品番号：83.3923）に播種した。

【0050】

上記生細胞数の測定によりカウントされたＡＳＣの生細胞（生存）率は、２日目８４～８９％、４日目８８～９３％、６日目７９～９１％であった。上記４８ウェルプレートに播種し、接着させた翌日、４種類の上記培地（Ａ）～（Ｄ）の培地にそれぞれ交換した。このように、１６通りの条件で培養を行い、４日後と８日後に、実施例２と同様にしてＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ染色を行った。

【0051】

その結果を図６の表に示す。浮遊状態での冷蔵保存期間が２日間と４日間の場合は、（Ｃ）：ＣＰＰｓ組成物＋ＩＭＤＭで培養８日後に石灰化がみられた。しかしながら、浮遊状態での冷蔵保存期間が６日間の場合は、石灰化がみられたのは培地（Ｄ）：骨芽細胞分化誘導培地（陽性対照）のみであった。培地（Ａ）：ＩＭＤＭと培地（Ｂ）：ＣＭ＋ＩＭＤＭでは、どの培養条件においても、石灰化は全くみられなかった。
上記の結果から、短期間の浮遊状態での冷蔵保存後により、ＡＳＣが骨芽前駆細胞に分化誘導され、その後、ＣＰＰｓ組成物を加えた培地で培養することにより、骨芽前駆細胞が骨芽細胞に分化誘導されたと考えられる。また、浮遊状態での冷蔵保存時における培地は、ＣＰＰｓ組成物を加えていなくても、その後の骨芽細胞への分化誘導に影響がないことがわかった。

【0052】

（実施例４）浮遊静置による骨芽前駆細胞への分化誘導の検証
浮遊状態での冷蔵保存の工程を行わずに、実施例２で使用した４種類の培地：
培地（Ａ）ＩＭＤＭ、
培地（Ｂ）ＣＭ＋ＩＭＤＭ（混合比１：１）、
培地（Ｃ）ＣＰＰｓ組成物＋ＩＭＤＭ（混合比１：１）、
培地（Ｄ）骨芽細胞分化誘導培地（陽性対照）、
０．５ｍL/well入りの２４ウェルプレート（SARSTEDT社製、製品番号：83.3922）に、ＡＳＣ（Lonza社製、製品番号：PT-2501）２×１０^５cells/mLを播種し、７～１１日間培養した後、実施例２と同様にＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ染色を行った。なお、上記混合比は体積比である。その結果を表１に示す。陽性対照の培地（Ｄ）のみ石灰化し、培地（Ａ）～（Ｃ）は、石灰化がみられなかった。このことから、ＣＰＰｓ組成物を添加した基礎培地で培養する前に、浮遊状態での冷蔵保存の工程（培養容器中に浮遊状態で静置して２～４日間冷蔵保存する工程）は、骨芽細胞への分化誘導を行うために、必須の工程の１つであることがわかる。

【0053】

【表1】

【0054】

（実施例５）ＣＰＰｓ組成物の分析１
ＣＰＰｓ組成物の特徴を確認するために、I型コラーゲン濃度、ヒアルロン酸濃度、およびコラーゲンとＣａを測定し、対照培養上清（ＣＭ）と比較検討した。
ＣＰＰｓ中のI型コラーゲン濃度について、ＥＬＩＳＡ（ヒトコラーゲンタイプ１ ＥＬＩＳＡ（エーセル社製、製品番号：EC1-E105）に相当するものを作成）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定（羊土社、タンパク質実験ノート下改定第４版に準じて実施）すると、６０～１００μｇ／ｍＬであり、平均８０μｇ／ｍＬであった。
ＣＰＰｓ中のヒアルロン酸濃度について、ヒアルロン酸定量キット（コスモ・バイオ株式会社製、製品番号：HA‐96KIT）を使用して測定したところ、１４０μｇ／ｍＬであった。
ＣＰＰｓ中のＴＧＦ－β１について、ヒトＴＧＦ－β１ ＥＬＩＳＡ キット（Bioss Inc.製、製品番号：BSKH1021）を使用して測定したところ、３８４～８１０ｐｇ／ｍＬであった。
ＣＭについても同様の測定を行い、比較した。その結果を表２に示す。

【0055】

【表2】

【0056】

ＣＰＰｓ組成物と、一般的な培養上清であるＣＭを比較すると、ＣＰＰｓ組成物のI型コラーゲン濃度は、約４２倍、ヒアルロン酸濃度は約５０倍、そしてＴＧＦ－β１は最大３．１倍であり、ＣＰＰｓ組成物には、これらの成分が豊富に含まれていることがわかった。

【0057】

また、これまでの結果から、ＣＰＰｓ組成物には、骨芽細胞分化誘導培地と同様に、石灰化促進活性の作用があるのは明らかであることから、石灰化に必須であるとされる、I型コラーゲンとＣａが含まれている可能性が高いと考えられた。上記実施例５では、I型コラーゲン濃度が高いことが確認されたため、ＣＰＰｓ組成物のＣａ濃度を、メタロアッセイカルシウム測定（ＯＣＰＣ）（メタロジェニクス株式会社製、製品番号：ＣＡ３０Ｍ）で測定すると４０μｇ／ｍＬであった。しかしながら、ＣＰＰｓ組成物の調製時において、Ｃａは有機溶媒で沈殿せず、沈殿したタンパク質をウイルス不活化処理するために使用した塩酸と苛性ソーダはＣａを含有していないことから、ＣＰＰｓ組成物のＣａ濃度は、計算上、ほぼ０μｇ／ｍＬになるはずである。
このことから、ＣＰＰｓ組成物中のI型コラーゲンにＣａが結合していることが予測された。

【0058】

（実施例６）ＣＰＰｓ組成物の分析２
上記予測を確認するために、以下の測定を行った。
まず、非特的なＣａ吸着の影響を取り除くために、ＣＰＰｓ組成物１０ｍＬを遠心濃縮器（ＣＯＲＮＩＮＧ製、Ｓｐｉｎ－Ｘ ＵＦ２０）で、約１．７ｍＬにまで濃縮した。上記メタロアッセイカルシウム測定により上記濃縮試料についてＣａ濃度を測定すると１７４μｇであった。
その後、上記濃縮試料に生理食塩水１０．３ｍＬを添加して、上記遠心濃縮器で１．５μＬまで濃縮し、ろ液と濃縮液のＣａ（カルシウム）濃度を測定したところ、それぞれ、
ろ液（１０．５ｍｌ）のＣａ濃度：４．１μｇ／ｍＬ、
濃縮液（１．５ｍｌ）のＣａ濃度：３８．８μｇ／ｍＬ、
であった。
一方、これらのI型コラーゲン濃度を上記ＥＬＩＳＡにより測定すると、
ろ液のI型コラーゲン濃度：０．１μｇ／ｍＬ以下、
濃縮液のI型コラーゲン濃度：３６０μｇ／ｍＬ、
であった。
以上の結果から、濃縮液におけるI型コラーゲン濃度とＣａ濃度に相関性があり、I型コラーゲンとＣａの挙動が一致していることがわかる。すなわち、Ｃａの大半はろ過されずに濃縮液側に残っていることから、ＣＰＰｓ組成物におけるI型コラーゲンに、培地中のＣａが結合していることが示された。

【0059】

（実施例７）ＣＰＰｓ組成物の分析３
ＣＰＰｓ組成物について、I型アテロコラーゲン（第一ファインケミカル社製、製品番号：Y‐1）とともに、１０％ゲルのＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動後、ニトロセルロース膜に転写させて、ウエスタンブロッティング（Western Blotting）を行った（羊土社、タンパク質実験ノート下改定第４版に準じて実施）。結果を図７に示す。図７のＡはＣＢＢ染色（ナカライテスク社製、製品番号：04543‐51）の結果であり、図７のＢは抗Procollagen 1C-Terminal Propeptide（抗ＰＩＣＰ）抗体（Cloud-Clone Crop社製、製品番号：PAA570Hu08）と反応させて得られた泳動パターンである。
図７のＡ（b）に示されるように、I型アテロコラーゲンは、ＣＢＢ染色で約１２０ｋＤａ（質量）の２本鎖として示されたが、プロペプチドのＣ末端を標識する抗ＰＩＣＰ抗体には反応せず、図７のＢ（b）に示されるように、バンドは検出されなかった。
一方、図７の（c）および（d）で示されるＣＰＰｓ組成物は、約１２０～２００ｋＤａで少なくとも５つのバンド（５本鎖）が検出されている。この結果から、ＣＰＰｓ組成物のI型コラーゲンにはプロコラーゲン（コラーゲン前駆体）が含まれていることが示された。
ＣＰＰｓ組成物に含まれる上記プロコラーゲンは、カルシウムとの複合体を形成することによって細胞の足場となり、かつ、細胞に対するカルシウムの供給を容易にすることができる。

【0060】

このような特徴を有するＣＰＰｓ組成物によれば、骨芽前駆細胞と同時にＣＰＰｓ組成物を局所投与する、または、ブ－スターとして追ってＣＰＰｓ組成物を投与することにより、所望のタイミングで骨芽細胞への分化誘導を行うことができる。また、骨芽細胞分化誘導培地を使用せずに、間葉系幹細胞から得られた成分、さらには、自己細胞由来の成分を用いて、間葉系幹細胞、骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導することができる。

【要約】

間葉系幹細胞および骨芽前駆細胞を骨芽細胞に分化誘導する。６０～９０ｖｏｌ％の基礎培地と、１０～４０ｖｏｌ％の生理食塩水と、を含み、さらに、１～１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦと、０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２と、０．２～２０．０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦと、０．５～８．０ｍＭのリン酸アスコルビルマグネシウムと、が添加されて構成される、幹細胞培養用培地を提供する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】