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特許7599425トランスフェリン受容体結合分子、そのコンジュゲート、及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-05
(45)【発行日】2024-12-13
(54)【発明の名称】トランスフェリン受容体結合分子、そのコンジュゲート、及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20241206BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241206BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241206BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20241206BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241206BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241206BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241206BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241206BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241206BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241206BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20241206BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241206BHJP
A61K 51/08 20060101ALI20241206BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20241206BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241206BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C07K16/28
C07K19/00
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K47/64
A61P35/00
A61K51/08 200
G01N33/53 D
C12N15/13 ZNA
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021540103
(86)(22)【出願日】2020-01-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-15
(86)【国際出願番号】 EP2020050318
(87)【国際公開番号】W WO2020144233
(87)【国際公開日】2020-07-16
【審査請求日】2022-12-09
(31)【優先権主張番号】19305031.7
(32)【優先日】2019-01-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】512269708
【氏名又は名称】ヴェクト－オール
【氏名又は名称原語表記】ＶＥＣＴ－ＨＯＲＵＳ
(73)【特許権者】
【識別番号】513210666
【氏名又は名称】ユニベルシテ デクス マルセイユ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ Ｄ‘ＡＩＸ－ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ
(73)【特許権者】
【識別番号】506316557
【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】コーエン， ロミー
(72)【発明者】
【氏名】ダヴィド， マリオン
(72)【発明者】
【氏名】クレストシャティスキ， ミシェル
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０３１４２４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５３３１３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００２／０５７４４５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１４－５００８６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５０１８８１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １６／００
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｐ ２１／００
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の式で表され、１ｎＭ～１μＭの間に含まれる親和性（Ｋｄ）でヒト及び非ヒト動物の両方のＴｆＲに結合し、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の組み合わせは、配列番号１、２及び３、又は配列番号５、６及び７、又は配列番号９、１０及び１１、又は配列番号１３、１４及び１５、又は配列番号１７、２及び３、又は配列番号１９、２及び３、又は配列番号１、２１及び３、又は配列番号１、２３及び３、又は配列番号１、２及び２５、又は配列番号１、２及び２７、又は配列番号１、２及び２９、又は配列番号１、２及び３１、又は配列番号１、２及び３３、配列番号６７、２及び３、又は配列番号６９、２及び３、又は配列番号１、７１及び３、又は配列番号１、７３及び３、又は配列番号１、７５及び３、又は配列番号１、２及び７７、又は配列番号１、２及び７９、又は配列番号１、２及び８１、又は配列番号１、２及び８３、又は配列番号１、２及び８５のアミノ酸配列の組み合わせを含む、ＶＨＨ分子。
【請求項2】
前記ＶＨＨ分子は血液脳関門を横断する、請求項１に記載のＶＨＨ分子。
【請求項3】
前記分子のヒトＴｆＲへの結合はトランスフェリンの結合と競合しない、請求項１又は２に記載のＶＨＨ分子。
【請求項4】
ヒト化された、請求項１～３のいずれか１項に記載のＶＨＨ分子。
【請求項5】
配列ＬＱＲのＱタグ及び／又はＧｌｙリンカー配列及び／又は配列番号５１の配列をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のＶＨＨ分子。
【請求項6】
配列番号５１の配列を含み、
配列番号４、８、１２、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８７、８８、８９、９０、９１、及び９２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、又は該アミノ酸配列からなる、請求項５に記載のＶＨＨ分子。
【請求項7】
少なくとも１つの分子をコンジュゲートした、請求項１～６のいずれか１項に記載のＶＨＨ分子。
【請求項8】
少なくとも１つの分子又は足場をコンジュゲートし、前記少なくとも１つの分子は、活性化合物、ウイルス若しくはウイルス様粒子、又は安定化基である、請求項１～７のいずれか１項に記載の１つ以上のＶＨＨ分子を含む、キメラ薬剤。
【請求項9】
前記活性化合物は、治療用薬剤、診断用薬剤、又はイメージング剤である、請求項８に記載のキメラ薬剤。
【請求項10】
請求項８又は９に記載のキメラ薬剤を含む医薬組成物又は診断用組成物。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか１項に記載のＶＨＨ分子、又は請求項８又は９に記載のキメラ薬剤をコードする核酸であって、前記分子はアミノ酸配列を含む、核酸。
【請求項12】
プロモーターに作動可能に連結された、請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項13】
請求項１１に記載の核酸、又は請求項１２に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項14】
請求項１３に記載の宿主細胞を、前記核酸の発現を可能にする条件下で培養することを含む、ＶＨＨ分子又はそのコンジュゲートを作製する方法。
【請求項15】
請求項１～７のいずれか１項に記載の１つ以上のＶＨＨ分子を、少なくとも１つの分子に、共有結合又は非共有結合でコンジュゲートすることを含む、請求項８又は９に記載のキメラ薬剤を作製する方法。
【請求項16】
治療用薬剤、診断用薬剤、又はイメージング剤を製造するための、請求項１～７のいずれか１項に記載のＶＨＨ分子、請求項８又は９に記載のキメラ薬剤、又は請求項１０に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合分子及びその使用に関する。本発明は、特に、血液脳関門（ＢＢＢ）などの細胞膜表面においてＴｆＲに結合するラクダ重鎖のみ（ＶＨＨ）の分子の可変ドメイン、及び、例えば中枢神経の細胞又はがんなどのＴｆＲ発現組織若しくは器官に医薬上又は診断上の対象の分子を輸送するための、その使用に関する。
【背景技術】
【0002】
グローバルインダストリーアナリストによれば、中枢神経系（ＣＮＳ、脳及び脊髄）病態を処置する薬剤の世界的市場は、２０１５年におおよそ１０００億ドルであったとされ、この額のうちのおおよそ９０億ドルが薬剤送達技術から生まれた製品に相当した（非特許文献１）。このように、今日、神経病学は、心血管医薬及び腫瘍学とともに、三大治療領域のうちの１つとされる。全世界においてＣＮＳ障害及び病態罹患者数は心血管疾患又はがん罹患者数より多いものの、神経病学は未開拓市場である。これは、ＣＮＳ病態を処置するための可能性のある薬剤の９８％がＢＢＢを横断しないということによって説明される（非特許文献２）。
【0003】
実際に、脳は、ＢＢＢ及び血液脳脊髄液関門（ＢＣＳＦＢ）の２つの主要な生理的バリアシステムがあることで、毒性の可能性がある物質から保護されている。ＢＢＢは、血漿リガンド取り込みの主要経路と考えられている。その表面積は、ＢＣＳＦＢのものよりおおよそ５０００倍大きい。ＢＢＢの構成血管の全長は、おおよそ６００ｋｍである。大脳皮質各１ｃｍ３が、血管１ｋｍ相当を含有する。ＢＢＢの総表面積は、２０ｍ２と概算される（非特許文献３）。このように、ＢＢＢを構成する大脳内皮は、血液と神経組織との間の大きな潜在的交換面に相当する。しかしながら、この大脳内皮は、その特異的性質のため、ＣＮＳ障害を処置する薬剤の使用にとって大きな障害ともなる。
【0004】
実際に、ＢＢＢは、他の器官の血管系を構成する有窓内皮細胞には見られない特有の性質を示す脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）から構成される。ＢＣＥＣは密着結合を形成し、基底膜、星状膠細胞終足、周皮細胞、小膠細胞及びニューロン細胞に取り囲まれており、これらは、ともに極めて選択性の高いバリアを構成し、血液と脳との間の分子交換を制御し、脳の恒常性を維持し、また極めて有効に毒素及び病原体から脳を保護するものである。難点は、ＢＢＢがまた薬剤及びイメージング剤を含む大部分の分子に対して不透過性であることである。原則として、おおよそ４５０から６００ダルトンの少数の小さな親油性分子しか（薬物候補の２％しか）ＢＢＢを横断できず、ＣＮＳ障害処置のインビトロ研究及び動物研究で有望な結果を示す治療用ペプチド、タンパク質、抗体など、すべてではないが大部分の高分子量の分子が、ＢＢＢを横断しない。
【0005】
このように、ＢＢＢは、ＣＮＳ障害を処置する新規療法の開発の際に克服すべき大きな障害と考えられている（非特許文献４）。ＣＮＳ病態を処置、診断、又はイメージングするための分子検出に関連する優先される研究の１つは、ＢＢＢを横断する活性物質の通過を可能にする／増加させる方法の開発である。
【0006】
ＢＢＢを避ける一手法として、ＣＮＳ（例えば、脳室内、脳内、若しくは髄腔内）に直接注射することで薬剤を投与すること、又はＢＢＢを崩壊させることがある。しかしながら、そうした高侵襲の手法は難点があり（費用、短時間の作用など）、リスクの可能性がある。
【0007】
活性物質に脂肪基若しくは親油基を付加すること（経細胞親油性拡散、ＴＬＤ）、又はリポソームの使用に基づく、薬理的方法が考えられている（非特許文献５）。しかしながら、脂肪基若しくは親油基の付加又はリポソームの使用は、ＢＢＢを横断するためにあまり有効ではない、４５０ダルトンの至適限度を超える大きい分子量で非特異的な複合体をもたらすことがある（非特許文献６；非特許文献７）。
【0008】
タンパク質治療剤を脳に送達するのに評価される方法のなかでも、ＢＢＢを横断する天然栄養素及び内因性リガンドの輸送に関与する細胞機構をハイジャックすることが、最も安全で有効であると認められる（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｓｈｕｓｔａ，２００７；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ＢＢＢを横断する高分子の輸送は、受容体媒介経細胞輸送（ＲＭＴ）によって容易になり得、これは、ＢＣＥＣが発現する受容体とのリガンドの結合、エンドサイトーシスによる内部移行、細胞内輸送及びソーティングエンドソームにおける受容体からの解離、その後のＢＢＢの反管腔側における放出に関与する、生理学的プロセスである（Ｔｕｍａ ａｎｄ Ｈｕｂｂａｒｄ，２００３；Ｘｉａｏ ａｎｄ Ｇａｎ，２０１３）。これに関して、特許文献１及び特許文献２は、ＢＢＢを通って薬剤又は他の分子を輸送することを可能にする、ＬＤＬ受容体に高親和性を有する種々のペプチドを公開している。
【0009】
ＢＢＢを横断して薬剤を輸送するために研究されている他の受容体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）であり、これは、そのリガンドのトランスフェリン（Ｔｆ）による脳への鉄輸送に関与する（Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。この受容体は、血液細胞や肺においても豊富である（Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｇｅｒｈａｒｄｔ，１９９２）が、脳内皮に高発現することが示されている（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。輸送体としてのＴｆの使用が研究されている（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）ものの、この分子の輸送機序は、飽和性で内因性Ｔｆと競合する。脳送達のベクターとして、ラットのＴｆＲを標的とするＯＸ２６抗体（Ｍｏｏｓ ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ，２００１；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｕｌｂｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００９）、又は８Ｄ３（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，２０１５；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，２００５；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、及びマウスのＴｆＲを標的とするＲ１７－２１７（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，２０１５；Ｕｌｂｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００９）抗体を含む抗ＴｆＲモノクローナル抗体が研究されている（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７も参照）。しかしながら、これら抗体の難点には、前臨床研究又は臨床研究を妨げる、異種間反応性がないこと、及び特にヒトＴｆＲに結合しないことを含む。また、ＢＢＢを横断して薬剤を有効に輸送するそうした抗体の機能は、未だ議論されるところである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【文献】国際公開第２０１０／０４６５８８号
【文献】国際公開第２０１１／１３１８９６号
【文献】国際公開第２０１２／０７５０３７号
【文献】国際公開第２０１３／１７７０６２号
【文献】国際公開第２０１２／７５０３７号
【文献】国際公開第２０１６／０７７８４０号
【文献】国際公開第２０１６／２０８６９５号
【非特許文献】
【0011】
【文献】Ｊａｉｎ，Ｊａｉｎ ＰｈａｒｍａＢｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｐｏｒｔ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ＣＮＳ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，２００８
【文献】Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｍｏｌ．Ｉｎｔｅｒｖ．，２００３，３，９０－１０５
【文献】Ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，２００７，４６（７），５５３－５７６
【文献】Ｎｅｕｗｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．，２００８，７，８４－９６
【文献】Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，４５９－４８６
【文献】Ｌｅｖｉｎ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９８０，２３，６８２－６８４
【文献】Ｓｃｈａｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，１９８９，５，７３－７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
したがって、この分野の進歩にもかかわらず、ＣＮＳへの薬剤の到達を高めることができる、さらに有効な方法及び薬剤が本技術分野において求められている。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、ＢＢＢを横断して分子を有効に輸送するために使用可能な新しい結合分子を提供する。より具体的には、本発明は、ヒト及び非ヒトの両方のＴｆＲに結合するとともに、経細胞輸送を介して薬剤をＣＮＳに送達可能なＶＨＨ分子を開示する。本発明は、この発明のＶＨＨ分子が事実上ＣＮＳを通って遊走し、コンジュゲート薬剤又はイメージング剤をインビボで送達することができることを示す。このように、そうしたＶＨＨは、治療又は診断の手法に使用する有用な分子に相当する。
【0014】
したがって、本発明の目的は、ヒト及び非ヒトのＴｆＲに結合するＶＨＨ分子に関する。
【0015】
本発明のさらなる目的は、実質的に同様の親和性でヒト及び非ヒト（例えば、マウス又はラットなどのげっ歯動物）の両方のＴｆＲに結合するＶＨＨ分子に関する。
【0016】
本発明のさらなる目的は、ヒト及び非ヒトのＴｆＲに結合するとともに、ヒト血液脳関門（「ＢＢＢ」）を横断可能なＶＨＨ分子である。
【0017】
本発明の好ましいＶＨＨは、ヒト及びマウスの両方のＴｆＲに結合し、ヒトＢＢＢを横断可能であり、１０μＭより小さい、好ましくは０．１ｎＭ～１０μＭの間に含まれるＴｆＲに対する親和性（Ｋｄ）を有する。
【0018】
また、本発明は、少なくとも１つの分子又は足場とコンジュゲートした、上述のような１つ以上のＶＨＨを含むキメラ薬剤（本明細書において区別なく「コンジュゲート」とも呼ばれる）にも関する。ＶＨＨとコンジュゲートする分子は、例えば、薬剤、ウイルス、診断用薬剤、トレーサーなどの医薬に有用な任意の活性化合物であってもよい。また、キメラ薬剤は、該活性化合物に加えて又はその代わりに、安定化基（例えば、Ｆｃ又はＩｇＧ）を含ませて、ＶＨＨ又はコンジュゲートの血漿中の半減期を長くしてもよい。このように、本発明の特定のキメラ薬剤は、任意の順序の少なくとも１つのＶＨＨ、安定化基、及び活性化合物を含む（例えば、コンジュゲートＶＨＨ－Ｆｃ－治療用薬剤）。
【0019】
さらに、本発明は、上述のようなキメラ薬剤と、任意で適切な賦形剤とを含む医薬用又は診断用組成物を提供する。
【0020】
さらに、本発明は、上述のようなＶＨＨ又はキメラ薬剤をコードする核酸、ベクター、及び宿主細胞を提供する。
【0021】
また、本発明は、核酸の発現を可能にする条件下で上述のような宿主細胞を培養することを含む、ＶＨＨ又はキメラ薬剤を作製する方法も提供する。
【0022】
さらに、本発明は、１つ以上の上述のようなＶＨＨを分子又は薬剤又は足場に共有結合又は非共有結合でコンジュゲートすることを含む、キメラ薬剤を作製する方法を提供する。
【0023】
本発明の他の目的は、医薬又は診断用薬剤として使用する、上述のようなＶＨＨ分子又はキメラ薬剤に関する。
【0024】
本発明の他の目的は、対象物質の生物学的活性及び／又はＣＮＳ送達を増大するための、上述のようなＶＨＨ分子の使用に関する。
【0025】
本発明の他の目的は、ＢＢＢを横断する分子の通過を向上させる又は可能にするための、該分子を上述のようなＶＨＨにカップリングすることを含む、方法に関する。
【0026】
本発明の他の目的は、対象における病態を処置するための、上述のようなコンジュゲートを該対象に投与することを含む、方法である。
【0027】
本発明の他の目的は、対象において特定の細胞型、標的組織又は器官をイメージングするための、上述のようなコンジュゲートを該対象に投与することを含む、方法である。
【0028】
本発明の他の目的は、対象における病態を薬剤で処置するための改善した方法であって、その改善は該薬剤を上述のようなＶＨＨ分子にカップリングすることにある。
【0029】
本発明は、任意の哺乳動物、特に任意のヒトに使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】図１は、ＢＢＢにおけるＴｆＲ発現を示す。マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ、アカゲザル）の脳微小血管（ＢＭＶ）及び脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の膜画分に対して、ウエスタンブロットを行った。ロードしたタンパク質量を図の下に示す。ｎ－ｄは未消化、ｄｉｇは消化を示す。
【図2】図２は、ヒト又はマウスのＴｆＲを発現するＣＨＯ細胞株の検証を示す。（Ａ）ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞株の作製に使用するプラスミドコンストラクトのマップを示す。（Ｂ）Ｔｆ－Ａｌｅｘａ６４７（２５０μｇ／ｍｌ、赤色）と共に３７℃で１時間インキュベートしたＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞（緑色）の代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。細胞核を０．５μｇ／ｍＬのヘキスト＃３３３４２（青色）で標識した。統合画像において共標識は黄色で現れている。（Ｃ）ウサギ抗ＴｆＲ抗体（１／１０００）又はマウス抗ＧＦＰ抗体（１／１０００）を使用し、その後にＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ又は抗マウス２次抗体（１／１００００）を使用して、ＣＨＯ野生型と比較した、ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ及びｍＴｆＲ－ＥＧＦＰを発現するＣＨＯ細胞の細胞膜調製物におけるウエスタンブロットを示す。
【図3】図３は、ｈＴｆＲ及びｍＴｆＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＶＨＨ Ａ及びＶＨＨ Ｚの細胞表面結合及びエンドサイトーシスを示す。２０μｇ／ｍｌのＶＨＨ Ａ（Ａ、Ｂ）及びコントロールＶＨＨ Ｚ（Ｃ、Ｄ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、ＰＦＡ固定後、及びその後の細胞膜のトリトンＸ－１００透過処理あり又はなしで、マウス抗ｃＭｙｃ（１／１０００）及びＡｌｅｘａ５９４コンジュゲート抗マウス２次抗体（１／８００、赤色）によって検出した、ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞及びＣＨＯ－ｍＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞（緑色）の代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。細胞核を０．５μｇ／ｍｌのヘキスト＃３３３４２（青色）で標識した。統合画像において共標識は黄色／橙色で現れている。
【図4】図４は、ｈＴｆＲ及びｍＴｆＲ発現ＣＨＯ細胞株におけるＶＨＨの見かけのＫｄ測定を示す。（Ａ）ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞及びＣＨＯ－ｍＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、種々の濃度のＶＨＨと共に４℃で１時間インキュベートし、マウス抗６Ｈｉｓ（１／１０００）及びＡｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス２次抗体（１／２００又は１／４００）によって検出した。フローサイトメトリーを使用して、測定を行った。各点の蛍光強度比を対応するＥＧＦＰ信号（受容体発現）でノーマライズし、任意単位を得た。データを、３つの独立実験における平均値±ＳＥＭとして表す。（Ｂ）選択ＶＨＨの、分子量（Ｄａ）、理論ｐＩ、ヒトＴｆＲにおける見かけのＫｄ（ｎＭ）、マウスＴｆＲにおける見かけのＫｄ（ｎＭ）の特徴を示す。データを、３つの独立実験における平均値±ＳＥＭとして表す。ＮＢは結合なしである。
【図5】図５は、ＶＨＨとＴｆとの競合アッセイを示す。（Ａ）競合テストの原理を示す。第１ステップにおいて、ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、希釈系列の競合物と共に、４℃で１時間インキュベートした。次に、ＥＣ９０のトレーサーを添加し、４℃で１時間インキュベートした。その後、トレーサーを適切な顕色系で検出した。フローサイトメトリーを使用して、測定を行った。各点の蛍光強度比を対応するＥＧＦＰ信号（受容体発現）でノーマライズし、任意単位を得た。（Ｂ）ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、競合物（Ｔｆ）と共にインキュベートした。その後、ＥＣ９０のトレーサー（ＶＨＨ）を添加して、マウス抗ｃＭｙｃ抗体（１／５０）及びＡｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス２次抗体（１／２００）によって検出した。（Ｃ）ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、競合物（ＶＨＨ）と共にインキュベートした。その後、ＥＣ９０のトレーサー（Ｔｆ－Ａｌｅｘａ６４７）を添加して、直接検出した。データを、３つの独立実験における平均値±ＳＥＭとして表す。
【図6】図６は、ＶＨＨコンジュゲーション方法を示す。化学コンジュゲーション又は組換え融合のいずれかを使用して、非網羅的にペプチド、ｓｉＲＮＡ、色素、ナノ粒子（ＮＰ）、リポソーム、イメージング剤、及び抗体を含む、あらゆる種類の分子をベクター化するように、ＶＨＨを使用可能である。さらに、分子を一価（ＶＨＨ）又は多価（ＶＨＨｎ）のコンジュゲートとしてベクター化するように、ＶＨＨを使用可能である。
【図7】図７は、ｈＴｆＲ及びｍＴｆＲ発現ＣＨＯ細胞におけるＶＨＨ Ａ－Ｆｃ及びＶＨＨ Ｚ－Ｆｃ融合タンパク質の細胞表面結合及びエンドサイトーシスを示す。５０ｎＭのＶＨＨ Ａ－Ｆｃ（Ａ、Ｂ）及びコントロールＶＨＨ Ｚ－Ｆｃ（Ｃ、Ｄ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、ＰＦＡ固定後、及びその後の細胞膜のトリトンＸ－１００透過処理あり又はなしで、Ａｌｅｘａ５９４コンジュゲート抗ｈＦｃ抗体（１／１０００、赤色）によって検出した、ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞及びＣＨＯ－ｍＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞（緑色）の代表的な共焦点顕微鏡写真を示す。細胞核を０．５μｇ／ｍｌのヘキスト＃３３３４２（青色）で標識した。統合画像において共標識は黄色／橙色で現れている。
【図8】図８は、ｈＴｆＲ及びｍＴｆＲ発現ＣＨＯ細胞株におけるＶＨＨ－Ｆｃ及びＦｃ－ＶＨＨの見かけのＫｄ測定を示す。（Ａ）ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞及びＣＨＯ－ｍＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、種々の濃度のＶＨＨ－Ｆｃ及びＦｃ－ＶＨＨと共に４℃で１時間インキュベートし、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗ｈＦｃ抗体（１／４００）によって検出した。フローサイトメトリーを使用して、測定を行った。各点の蛍光強度比を対応するＥＧＦＰ信号（受容体発現）でノーマライズし、任意単位を得た。データを、３つの独立実験における平均値±ＳＥＭとして表す。（Ｂ）選択ＶＨＨ－Ｆｃ及びＦｃ－ＶＨＨの、分子量（Ｄａ）、ヒトＴｆＲにおける見かけのＫｄ（ｎＭ）、マウスＴｆＲにおける見かけのＫｄ（ｎＭ）の特徴を示す。データを、３つの独立実験における平均値±ＳＥＭとして表す。ＮＢは、コントロールＶＨＨ（ＶＨＨ Ｚ）に対する結合なしである。
【図9】図９は、インビトロのＢＢＢモデルにおけるＶＨＨ Ａ－Ｆｃ及びＶＨＨ Ｂ－Ｆｃ融合タンパク質の取り込み及び輸送を示す。（Ａ）生細胞において２時間、２００ｎＭのＴｆ－Ａｌｅｘａ６４７（赤色）と共にインキュベートし、ＰＦＡ固定、及び細胞膜のトリトンＸ－１００透過処理後に、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ｆＦｃ抗体（１／５０、緑色）によって検出した、５００ｎＭのＶＨＨ Ａ－Ｆｃ及びＶＨＨ Ｂ－Ｆｃの取り込みのためプロービングしたラット脳微小血管内皮細胞（ｒＢＭＥＣ）単層の代表的な顕微鏡写真を示す。細胞核を０．５μｇ／ｍｌのヘキスト＃３３３４２（青色）で標識した。統合画像において共標識は黄色で現れている。（Ｂ）上部コンパートメント（１）のＩＶ型コラーゲン／フィブロネクチン被覆フィルターに播種した初代ｒＢＭＥＣ、及び下部コンパートメント（２）の初代星状膠細胞を含む共培養システムである、インビトロのＢＢＢモデルの模式図を示す。（Ｃ、Ｄ）管腔側（上部）コンパートメントから反管腔側（下部）コンパートメントへとｒＢＭＥＣ単層を横断するＶＨＨ Ａ－Ｆｃ、ＶＨＨ Ｂ－Ｆｃ、及びＶＨＨ Ｚ－Ｆｃ融合タンパク質の輸送を示す。（Ｃ）ＶＨＨ Ａ－Ｆｃ、ＶＨＨ Ｂ－Ｆｃ、及びＶＨＨ Ｚ－Ｆｃを、管腔側コンパートメントにおいて１０ｎＭで２４時間インキュベートし、反管腔側コンパートメントへの輸送を評価した（２４ｈｒｓと表示）。その後、ＶＨＨ－Ｆｃ溶液を含むインサートを、反管腔側コンパートメントへのさらなる４８時間の輸送間隔（＋４８ｈｒｓと表示）を得るため、新しい輸送バッファーを含有する別の９６ウェルプレートに移した。（Ｄ）（Ｃ）に記載する実験の動態的表示を示す（７２時間の輸送は２４時間と４８時間との輸送間隔の合計である）。自社製抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、反管腔側コンパートメントにおけるＦｃフラグメントの含有量を定量化した。吸光度単位をインサート毎フェムトモルに変換した（９６ウェルプレートのインサートおいて０．１４３ｃｍ２の表面積）。各コンジュゲートに対して、少なくとも１２個のインサートにおける３つの独立実験を評価した。データを平均値±ＳＥＭとして表す（＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【図10】図１０は、注射後（ｐ．ｉ．）２時間及び２４時間での野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＶＨＨ－Ｆｃ融合タンパク質の分布を示す。ＶＨＨ Ａ－Ｆｃ、ＶＨＨ Ａ－Ｆｃ－Ａｇｌｙ、及びＶＨＨ Ｚ－Ｆｃ融合物を５ｍｇ／ｋｇで尾静脈に注射し、血漿採取後、マウスを注射後２時間又は２４時間において生理食塩水で灌流した。また、注射後１５分及び６時間において後眼窩サンプリングを用いて中間血漿サンプルを採取した。脳を処理して、脳実質を毛細血管から単離した。各組織のＶＨＨ－Ｆｃ量を、自社製の抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価した。データを、血漿（Ａ）、実質（Ｂ）、及び微小血管（Ｃ）におけるＶＨＨ－Ｆｃ濃度の平均値±ＳＥＭとして、又は実質対血漿比（Ｄ）、及び微小血管対血漿比（Ｅ）の平均値±ＳＥＭによって表す（時点毎グループ毎４＜ｎ＜１２、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【図11】図１１は、ｈＴｆＲ及びｍＴｆＲを安定的に発現するＣＨＯ細胞株におけるＶＨＨ Ａ１～Ａ９の見かけのＫｄ測定を示す。（Ａ）ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞及びＣＨＯ－ｍＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、種々の濃度のＶＨＨと共に４℃で１時間インキュベートし、マウス抗６Ｈｉｓ（１／１０００）及びＡｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス２次抗体（１／４００）によって検出した。フローサイトメトリーを使用して、測定を行った。各点の蛍光強度比を対応するＥＧＦＰ信号（受容体発現）でノーマライズし、任意単位を得た。データを、３つの独立実験における平均値±ＳＥＭとして表す。（Ｂ）ＶＨＨの、分子量（Ｄａ）、理論ｐＩ、ヒトＴｆＲにおける見かけのＫｄ（ｎＭ）、マウスＴｆＲにおける見かけのＫｄ（ｎＭ）の特徴を示す。データを、３つの独立実験における平均値±ＳＥＭとして表す。ＮＢは結合なし、ＬＢは低結合である。
【図12】図１２は、ｈＴｆＲ及びｍＴｆＲを安定的に発現するＣＨＯ細胞株におけるＶＨＨ Ａ１０～Ａ１９の見かけのＫｄ測定を示す。（Ａ）ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞及びＣＨＯ－ｍＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、種々の濃度のＶＨＨと共に４℃で１時間インキュベートし、マウス抗６Ｈｉｓ（１／１０００）及びＡｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス２次抗体（１／４００）によって検出した。フローサイトメトリーを使用して、測定を行った。各点の蛍光強度比を対応するＥＧＦＰ信号（受容体発現）でノーマライズし、任意単位を得た。データを、３つの独立実験における平均値±ＳＥＭとして表す。（Ｂ）ＶＨＨの、分子量（Ｄａ）、理論ｐＩ、ヒトＴｆＲにおける見かけのＫｄ（ｎＭ）、マウスＴｆＲにおける見かけのＫｄ（ｎＭ）の特徴を示す。データを、３つの独立実験における平均値±ＳＥＭとして表す。ＮＢは結合なしである。
【図13】図１３は、ｈＴｆＲ及びｍＴｆＲ発現ＣＨＯ細胞株における１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ融合物の見かけのＫｄ測定を示す。（Ａ）ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞及びＣＨＯ－ｍＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、種々の濃度の１３Ｃ３融合物と共に４℃で１時間インキュベートし、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス抗体（１／４００）によって検出した。フローサイトメトリーを使用して、測定を行った。各点の蛍光強度比を対応するＥＧＦＰ信号（受容体発現）でノーマライズし、任意単位を得た。データを、３つの独立実験における平均値±ＳＥＭとして表す。（Ｂ）１３Ｃ３融合物の、分子量（Ｄａ）、ヒトＴｆＲにおける見かけのＫｄ（ｎＭ）、マウスＴｆＲにおける見かけのＫｄ（ｎＭ）の特徴を示す。データを、３つの独立実験における平均値±ＳＥＭとして表す。ＮＢは結合なし、ＬＢは低結合である。
【図14】図１４は、注射後（ｐ．ｉ．）２時間及び６時間での野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける１３Ｃ３モノクローナル抗体及び１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ融合物の分布を示す。１３Ｃ３、１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ、及び１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ１を、３５ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇで尾静脈に注射し、マウスを生理食塩水で注射後２時間又は６時間において灌流した。脳を処理して、脳実質を毛細血管から単離した。各組織／コンパートメントにおける１３Ｃ３及び１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ／Ａ１の量を、認定のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）直接被覆（Ａβ）免疫測定法を使用して評価した（％ＣＶ＜２０％及び回収±３０％）。データを、全脳（Ａ）及び実質（Ｂ）における１３Ｃ３及び１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ／Ａ１濃度の平均値±ＳＥＭとして表す（時点毎グループ毎１＜ｎ＜４、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１）。
【図15】図１５は、ＶＨＨ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートのインビトロにおける遺伝子サイレンシング活性を示す。（Ａ）ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１及びＶＨＨ Ｂ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートはｈＴｆＲに結合する。ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、示した種々の濃度の化合物と共に４℃で１時間インキュベートした。１次マウス抗６Ｈｉｓ（１／１０００）及びＡｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス２次抗体（１／４００）を使用してＶＨＨの検出を行った。フローサイトメトリーを使用して、ＶＨＨに関連する細胞表面信号の測定を行った。結果を、バックグラウンド蛍光強度に対する試験化合物のＡｌｅｘａ６４７関連蛍光強度の比として表す。（Ｂ）ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートは遺伝子サイレンシング作用を示す。ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞に、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、２５ｎＭの示した化合物を３７℃で７２時間遺伝子導入した。その後、ＥＧＦＰタンパク質に関連する全蛍光度が、フローサイトメトリーを使用して定量化され、未処理（コントロール）の細胞のものに対して適正化した（１００％に設定）。＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートは、サイトゾルに直接送達すると、ピコモル濃度範囲の内因性遺伝子サイレンシング活性を示す。ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞に、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、種々の濃度のＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートを３７℃で１２０時間遺伝子導入した。その後、ＥＧＦＰタンパク質に関連する全蛍光度が、フローサイトメトリーを使用して定量化され、未処理（コントロール）の細胞のものに対して適正化した（１００％に設定）。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（実線）を使用して非線形回帰を用いて当てはめて、ＩＣ５０（ＧＦＰタンパク質レベルを５０％低下させる濃度）及び最大作用（底部プラトー）を推定した。（Ｄ）ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートは、特異的且つ有効なＴｆＲ媒介遺伝子サイレンシングを誘発する。ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、１μＭの示した化合物と共に３７℃で１２０時間インキュベートした。（Ｂ）に記載するようにデータを処理して分析した。未処理細胞に対して＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｅ）ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートのｈＴｆＲ媒介結合及び取り込みにより、ナノモル濃度でサイトゾルへの送達及びその後の遺伝子サイレンシングが可能となる。ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、種々の濃度のＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートと共に３７℃で１２０時間インキュベートした。その後、ＥＧＦＰタンパク質に関連する全蛍光度が、フローサイトメトリーを使用して定量化され、未処理（コントロール）の細胞のものに対して適正化した（１００％に設定）。（Ｃ）に記載するようにデータを処理して分析した。（Ｆ）ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートの遺伝子サイレンシング作用は、遊離型ＴｆＲ結合ＶＨＨ Ａ及びＢの過剰量と共にインキュベートすることで阻害されるが、関連のないＶＨＨ Ｚではそうでない。ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、単独の、又は１００×過剰量の遊離型ＶＨＨ Ａ、Ｂ、若しくはＺの存在下の３０ｎＭのＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１と共に３７℃で１２０時間インキュベートした。（Ｃ）に記載するようにデータを処理して分析した。（Ｇ）短時間の６時間パルスのＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートへの細胞の暴露は、有効な遺伝子サイレンシングを誘発するために十分なものである。ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、種々の濃度のＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートと共に短時間の６時間パルスの間インキュベートし、その後リガンド非含有培地において最大１２０時間追跡した。（Ｂ）に記載するようにデータを処理して分析した。（Ｈ）ＶＨＨ Ｂ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートの遺伝子サイレンシング作用はＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１で観察したものと同様であった。ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、３０ｎＭ（ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１で得たＩＣ５０に基づく飽和濃度）のＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１又はＶＨＨ Ｂ－ｓｉＧＦＰｓｔ１と共に３７℃で１２０時間インキュベートした。（Ｃ）に記載するようにデータを処理して分析した。
【図16】図１６は、膠芽腫腫瘍の皮下マウスモデルにおけるＶＨＨ Ａ－６８ＧａバイオコンジュゲートのＰＥＴイメージングを示す。（Ａ）ＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡ及びＶＨＨ Ａ－６８Ｇａバイオコンジュゲートは、コンジュゲートしていないＶＨＨ Ａ化合物ほど有効にｈＴｆＲに結合する。ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞を、示した種々の濃度の化合物と共に４℃で１時間インキュベートした。１次マウス抗６Ｈｉｓ（１／１０００）及びＡｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス２次抗体（１／４００）を使用してＶＨＨの検出を行った。フローサイトメトリーを使用して、ＶＨＨに関連する細胞表面信号の測定を行った。結果を、バックグラウンド蛍光強度に対する試験化合物のＡｌｅｘａ６４７関連蛍光強度の比として表す。（Ｂ）Ｕ８７－ＭＧ細胞の移植後の２８日目にＶＨＨ Ａ－６８Ｇａを投与したマウスのＰＥＴイメージングを示す（注射後２時間）。膠芽腫腫瘍を矢状図において丸で示す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明は、ＢＢＢを横断して、治療用薬剤、イメージング剤、又は診断用薬剤などの分子を輸送するために使用可能な新しいＴｆＲ結合剤を提供する。より具体的には、本発明は、ＴｆＲに結合する改善したＶＨＨ分子、及びその使用を開示する。
【0032】
ＴｆＲは、トランスフェリンリガンドによって輸送される鉄の取り込み、及び細胞増殖の調節に関与する（Ｎｅｃｋｅｒｓ ａｎｄ Ｔｒｅｐｅｌ １９８６，Ｐｏｎｋａ ａｎｄ Ｌｏｋ １９９９）。ＴｆＲ１受容体と主に肝臓で発現する相同性ＴｆＲ２受容体との、２種類のトランスフェリン受容体がある。本発明の文脈では、ＴｆＲという用語はＴｆＲ１相同体を指すように用いる。
【0033】
ＴｆＲは、２つのジスルフィド架橋によって結合する２つの同一の９０ｋＤａのサブユニットからなるＩＩ型ホモ二量体膜貫通糖タンパク質である（Ｊｉｎｇ ａｎｄ Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ １９８７， ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。各単量体が、ＹＴＲＦ（チロシン－スレオニン－アルギニン－フェニルアラニン）内部移行モチーフを含む６１個のアミノ酸の細胞質Ｎ末端の短ドメイン、２７個のアミノ酸の単一疎水性膜貫通部分、トリプシン切断部位及びトランスフェリン結合部位を含む６７０個のアミノ酸の大きなＣ末端細胞外ドメインを有する（Ａｉｓｅｎ，２００４）。各サブユニットは、トランスフェリン分子に結合可能である。細胞外ドメインは、１つのＯ－型糖鎖付加部位、及び３つのＮ－型糖鎖付加部位を有し、後者は、適切なフォールディング及び細胞表面への受容体の輸送に特に重要である（Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。また、膜内ドメインにおいてパルミトイル化部位も存在し、これは、おそらく受容体を固定してそのエンドサイトーシスを可能にするものである（Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｏｍａｒｙ ａｎｄ Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，１９８１）。さらに、細胞内リン酸化部位が存在し、その機能は不明であり、エンドサイトーシスにおける役割はない（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。
【0034】
ＴｆＲ受容体は、健常でも腫瘍性でも高増殖細胞によって高レベルで発現される（Ｇａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。数多くの研究により、健常な細胞と比較して、がん細胞における高レベルのＴｆＲ発現が示されている。このように、乳がん（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１）、神経膠腫（Ｐｒｉｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、肺腺がん（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、慢性リンパ性白血病（Ｄａｓ Ｇｕｐｔａ ａｎｄ Ｓｈａｈ，１９９０）、又は非ホジキンリンパ腫（Ｈａｂｅｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，１９８３）などの病態は、腫瘍悪性度、及び疾患のステージ又は予後に関連するＴｆＲ発現の増大を示している。
【0035】
このように、ＴｆＲヘの薬剤標的化は、がん処置、及びＢＢＢ横断に適切とすることができる。
【0036】
高レベルのｈＴｆＲ及びｍＴｆＲを発現する細胞からの精製膜調製物を使用して、ヒト及び非ヒトの両方のＴｆＲに結合するＶＨＨ分子を生成して選択した。これらのＶＨＨ分子は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域又は薬剤（抗体、ｓｉＲＮＡなど）又はイメージング剤に融合させると、ＴｆＲ結合能力を保持して、インビトロのＢＢＢモデルを横断して遊走し、インビボにおける脳標的特性を示した。また、これらのＶＨＨ分子は、ｓｉＲＮＡ又はＮＯＤＡＧＡ足場に融合させると、ＴｆＲ結合能力を保持し、インビボにおける有効な細胞及び器官への送達を行うことを示した。ＶＨＨ分子は、ＴｆＲ結合に続いて適切なエンドサイトーシスを行うように、適切なレベルの親和性及び特異性を示す。したがって、本発明は、薬剤標的化において有用な薬剤に相当する新しいＴｆＲ結合分子を提供する。
【0037】
このように、本発明の目的は、ヒト及び非ヒト（例えばラット又はマウスなどのげっ歯動物）の両方のＴｆＲに結合するＶＨＨ分子に関する。好ましくは、ＶＨＨは、ヒトＢＢＢを横断する、又はがんなどのＴｆＲ発現組織に結合することができる。また、本発明は、そうしたＶＨＨを含むキメラ薬剤、その製造、それを含む組成物、及びその使用に関する。
【0038】
＜ＶＨＨ分子＞
ＶＨＨ分子は、自然に軽鎖を欠いている重鎖のみのラクダ抗体の可変ドメインに相当する。ＶＨＨは、約１５ｋＤａの極めて小さいサイズを有する。これは、単一ドメインを用いてその同族の抗原に結合可能な単鎖分子を含む。ＶＨＨの抗原結合表面は、通常平坦又は凹状である普通の抗体のものよりも通常凸状である（又は突出する）。より具体的には、ＶＨＨは、それらの配列及び構造は保存されるものとして規定される４つのフレームワーク領域（又はＦＲ）、及び抗原結合に関与して抗原特異性を与える配列内容及び構造配座の両方において高可変性を示す３つの相補性決定領域（又はＣＤＲ）、から構成される。通常のヒト抗体のＶＨと比較して、ＶＨＨのＦＲ２領域及び相補性決定領域（又はＣＤＲ）においてはわずかなアミノ酸が置換されている。例えば、ＦＲ２領域における高保存性疎水性アミノ酸（Ｖａｌ４７、Ｇｌｙ４９、Ｌｅｕ５０、及び／又はＴｒｐ５２など）は、親水性アミノ酸（Ｐｈｅ４２、Ｇｌｕ４９、Ａｒｇ５０、Ｇｌｙ５２）に置換されることがあり、全体構造をより親水性にして、高安定性、溶解性、及び凝集耐性に寄与する。
ＶＨＨ分子は、自然に軽鎖を欠いている重鎖のみのラクダ抗体の可変ドメインに相当する。ＶＨＨは、約１５ｋＤａの極めて小さいサイズを有する。これは、単一ドメインを用いてその同族の抗原に結合可能な単鎖分子を含む。ＶＨＨの抗原結合表面は、通常平坦又は凹状である普通の抗体のものよりも通常凸状である（又は突出する）。より具体的には、ＶＨＨは、それらの配列及び構造は保存されるものとして規定される４つのフレームワーク領域（又はＦＲ）、及び抗原結合に関与して抗原特異性を与える配列内容及び構造配座の両方において高可変性を示す３つの相補性決定領域（又はＣＤＲ）、から構成される。通常のヒト抗体のＶＨと比較して、ＶＨＨのＦＲ２領域及び相補性決定領域（又はＣＤＲ）においてはわずかなアミノ酸が置換されている。例えば、ＦＲ２領域における高保存性疎水性アミノ酸（Ｖａｌ４７、Ｇｌｙ４９、Ｌｅｕ５０、及び／又はＴｒｐ５２など）は、親水性アミノ酸（Ｐｈｅ４２、Ｇｌｕ４９、Ａｒｇ５０、Ｇｌｙ５２）に置換されることがあり、全体構造をより親水性にして、高安定性、溶解性、及び凝集耐性に寄与する。
【0039】
本発明におけるＶＨＨ分子は、重鎖のみの抗体（ＨｃＡｂ）の抗原結合ドメインを含む（又はそれからなる、又は実質的にそれからなる）ポリペプチドである。
【0040】
発明者等は、適切な特性を有するＶＨＨ分子を生成するため、ＴｆＲ免疫原によるラマの免疫化によって作製したＶＨＨのライブラリから７００を超えるＴｆＲ結合ＶＨＨを試験した。発明者等は、結合性及び特異性ためのクローンの分析後、さらに、必要な親和性、特異性、及び異種間結合性を有する約１００個のクローンを選択した。該クローンをすべてシーケンシングし、その構造を分析及び比較した。さらに、制御／向上した結合特性を有するＶＨＨを突然変異誘発によって作製した。該当するドメイン及び好ましいＶＨＨの配列を、実験の項及び配列表に記載する。また、ＶＨＨ及びそのコンジュゲートの特性を実験の項に示す。
【0041】
本発明のＶＨＨ分子は、典型的に、
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の式を含む又はその式からなり、
式中、ＦＲｎはフレームワーク領域を指し、ＣＤＲｎは相補性決定領域を指す。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の式を含む又はその式からなり、
式中、ＦＲｎはフレームワーク領域を指し、ＣＤＲｎは相補性決定領域を指す。
【0042】
特定の実施形態では、本発明のＶＨＨ分子は、配列番号１、５、９、１３、１７、１９、６７、若しくは６９から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるＣＤＲ１ドメイン、又は、その長さ全体において前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有するとともに、ＴｆＲ結合能力を保持するその変異体を含む。本発明の好ましいＶＨＨ分子は、配列番号１、５、９、１３、１７、１９、６７、若しくは６９から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１ドメイン、又は、多くて１個のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む。
【0043】
アミノ酸（又は核酸）配列同士の間の「％同一性」は、本技術分野においてそれ自体既知である技術によって決定することができる。典型的に、２つの核酸又はアミノ酸配列間の％同一性は、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されるＧＡＰなどのコンピュータープログラム（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９６，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ ５３７１１）によって決定する（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８，４４３－４５３）。２つの配列間の％同一性は、該配列の長さ全体における同一性を指す。
【0044】
本発明のＶＨＨ分子の特定の例は、配列番号１、５、９、１３、１７、１９、６７、又は６９を含む又は実質的にそれからなるＣＤＲ１配列を含む。
【0045】
さらなる特定の実施形態では、本発明のＶＨＨ分子は、配列番号２、６、１０、１４、２１、２３、７１、７３、若しくは７５から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるＣＤＲ２ドメイン、又は、その長さ全体において前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは８５％のアミノ酸同一性を有するとともに、ＴｆＲ結合能力を保持するその変異体を含む。本発明の好ましいＶＨＨ分子は、配列番号２、６、１０、１４、２１、２３、７１、７３、若しくは７５から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２ドメイン、又は、多くて１個のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む。
【0046】
本発明のＶＨＨ分子の特定の例は、配列番号２、６、１０、１４、２１、２３、７１、７３、若しくは７５を含む又は実質的にそれからなるＣＤＲ２配列を含む。
【0047】
さらなる特定の実施形態では、本発明のＶＨＨ分子は、配列番号３、７、１１、１５、２５、２７、２９、３１、３３、７７、７９、８１、８３、若しくは８５から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるＣＤＲ３ドメイン、又は、その長さ全体において前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは８５％のアミノ酸同一性を有するとともに、ＴｆＲ結合能力を保持するその変異体を含む。本発明の好ましいＶＨＨ分子は、配列番号３、７、１１、１５、２５、２７、２９、３１、３３、７７、７９、８１、８３、若しくは８５から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３ドメイン、又は、多くて１個のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む。
【0048】
本発明のＶＨＨ分子の特定の例は、配列番号３、７、１１、１５、２５、２７、２９、３１、３３、７７、７９、８１、８３、又は８５を含む又は実質的にそれからなるＣＤＲ３配列を含む。
【0049】
さらなる特定の実施形態では、本発明のＶＨＨ分子は、
配列番号１、５、９、１３、１７、１９、６７、若しくは６９から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるＣＤＲ１ドメイン、又は、その長さ全体において前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するその変異体と、
配列番号２、６、１０、１４、２１、２３、７１、７３、若しくは７５から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるＣＤＲ２ドメイン、又は、その長さ全体において前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するその変異体と、
配列番号３、７、１１、１５、２５、２７、２９、３１、３３、７７、７９、８１、８３、若しくは８５から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるＣＤＲ３ドメイン、又は、その長さ全体において前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するその変異体とを含み、
前述のＶＨＨはＴｆＲ結合能力を有する。
配列番号１、５、９、１３、１７、１９、６７、若しくは６９から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるＣＤＲ１ドメイン、又は、その長さ全体において前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも７５％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するその変異体と、
配列番号２、６、１０、１４、２１、２３、７１、７３、若しくは７５から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるＣＤＲ２ドメイン、又は、その長さ全体において前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するその変異体と、
配列番号３、７、１１、１５、２５、２７、２９、３１、３３、７７、７９、８１、８３、若しくは８５から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるＣＤＲ３ドメイン、又は、その長さ全体において前述の配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するその変異体とを含み、
前述のＶＨＨはＴｆＲ結合能力を有する。
【0050】
好ましい実施形態では、本発明のＶＨＨ分子は、
配列番号１、５、９、１３、１７、１９、６７、若しくは６９から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１ドメイン、又は、多くて１個のアミノ酸修飾を有するその変異体と、
配列番号２、６、１０、１４、２１、２３、７１、７３、若しくは７５から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２ドメイン、又は、多くて１個のアミノ酸修飾を有するその変異体と、
配列番号３、７、１１、１５、２５、２７、２９、３１、３３、７７、７９、８１、８３、若しくは８５から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３ドメイン、又は、多くて１個のアミノ酸修飾を有するその変異体とを含む。
配列番号１、５、９、１３、１７、１９、６７、若しくは６９から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１ドメイン、又は、多くて１個のアミノ酸修飾を有するその変異体と、
配列番号２、６、１０、１４、２１、２３、７１、７３、若しくは７５から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２ドメイン、又は、多くて１個のアミノ酸修飾を有するその変異体と、
配列番号３、７、１１、１５、２５、２７、２９、３１、３３、７７、７９、８１、８３、若しくは８５から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３ドメイン、又は、多くて１個のアミノ酸修飾を有するその変異体とを含む。
【0051】
より好ましい実施形態では、本発明のＶＨＨ分子は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のドメインは、それぞれ、
配列番号１、２、及び３、又は
配列番号１７、２、及び３、又は
配列番号１９、２、及び３、又は
配列番号６７、２、及び３、又は
配列番号６９、２、及び３、又は
配列番号１、２１、及び３、又は
配列番号１、２３、及び３、又は
配列番号１、７１、及び３、又は
配列番号１、７３、及び３、又は
配列番号１、７５、及び３、又は
配列番号１、２、及び２５、又は
配列番号１、２、及び２７、又は
配列番号１、２、及び２９、又は
配列番号１、２、及び３１、又は
配列番号１、２、及び３３、又は
配列番号１、２、及び７７、又は
配列番号１、２、及び７９、又は
配列番号１、２、及び８１、又は
配列番号１、２、及び８３、又は
配列番号１、２、及び８５、又は
配列番号５、６、及び７、又は
配列番号９、１０、及び１１、又は
配列番号１３、１４、及び１５、又は
上述のようなその変異体を含む又はそれらからなる。
配列番号１、２、及び３、又は
配列番号１７、２、及び３、又は
配列番号１９、２、及び３、又は
配列番号６７、２、及び３、又は
配列番号６９、２、及び３、又は
配列番号１、２１、及び３、又は
配列番号１、２３、及び３、又は
配列番号１、７１、及び３、又は
配列番号１、７３、及び３、又は
配列番号１、７５、及び３、又は
配列番号１、２、及び２５、又は
配列番号１、２、及び２７、又は
配列番号１、２、及び２９、又は
配列番号１、２、及び３１、又は
配列番号１、２、及び３３、又は
配列番号１、２、及び７７、又は
配列番号１、２、及び７９、又は
配列番号１、２、及び８１、又は
配列番号１、２、及び８３、又は
配列番号１、２、及び８５、又は
配列番号５、６、及び７、又は
配列番号９、１０、及び１１、又は
配列番号１３、１４、及び１５、又は
上述のようなその変異体を含む又はそれらからなる。
【0052】
本発明の好ましいＶＨＨ分子は、以下に規定するようなＦＲドメインを含む。
【0053】
特定の実施形態では、ＦＲ１ドメインは、以下に示すような配列番号３５、又は、その長さ全体においてこの配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するその変異体を含む又はそれからなる。
Ｅ〔ＶＱＬ〕ＶＥ〔ＳＧＧ〕ＧＬ〔Ｖ〕ＱＰ〔Ｇ〕Ｇ〔ＳＬＫＬ〕Ｓ〔ＣＡ〕Ａ〔Ｓ〕（配列番号３５）
Ｅ〔ＶＱＬ〕ＶＥ〔ＳＧＧ〕ＧＬ〔Ｖ〕ＱＰ〔Ｇ〕Ｇ〔ＳＬＫＬ〕Ｓ〔ＣＡ〕Ａ〔Ｓ〕（配列番号３５）
【0054】
より好ましくは、亀甲括弧のアミノ酸残基が存在して、他の位置においてのみ可変する。
特定の実施形態では、１番目のＥはＱで置換してもよい。
特定の実施形態では、５番目のＶはＱで置換してもよい。
特定の実施形態では、６番目のＥはＱで置換してもよい。
特定の実施形態では、１０番目のＧはＫ又はＡで置換してもよい。
特定の実施形態では、１１番目のＬはＶ又はＥで置換してもよい。
特定の実施形態では、２３番目のＡはＶ又はＴで置換してもよい。
特定の実施形態では、１番目のＥはＱで置換してもよい。
特定の実施形態では、５番目のＶはＱで置換してもよい。
特定の実施形態では、６番目のＥはＱで置換してもよい。
特定の実施形態では、１０番目のＧはＫ又はＡで置換してもよい。
特定の実施形態では、１１番目のＬはＶ又はＥで置換してもよい。
特定の実施形態では、２３番目のＡはＶ又はＴで置換してもよい。
【0055】
より好ましくは、ＦＲ１は、この配列に関して太字ではないアミノ酸残基において多くて４個のアミノ酸修飾、さらにより好ましくは多くて３個のアミノ酸修飾、さらにより好ましくは多くて２個のアミノ酸修飾を含む。
【0056】
さらなる特定の実施形態では、ＦＲ１は、以下に記載するアミノ酸配列のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳ（配列番号３６）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号３７）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳ（配列番号３８）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＥＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳ（配列番号３９）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳ（配列番号３６）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号３７）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳ（配列番号３８）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＥＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳ（配列番号３９）
【0057】
特定の実施形態では、本発明のＶＨＨ分子は、以下に示すような配列番号４０、又は、その長さ全体においてこの配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、若しくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するその変異体を含む又はそれからなるＦＲ２ドメインを含む。
ＭＲ〔Ｗ〕Ｙ〔Ｒ〕ＱＡ〔ＰＧＫ〕Ｑ〔ＲＥ〕Ｌ〔ＶＡ〕Ｔ（配列番号４０）
ＭＲ〔Ｗ〕Ｙ〔Ｒ〕ＱＡ〔ＰＧＫ〕Ｑ〔ＲＥ〕Ｌ〔ＶＡ〕Ｔ（配列番号４０）
【0058】
より好ましくは、亀甲括弧のアミノ酸残基が存在して、他の位置においてのみ可変する。
特定の実施形態では、１番目のＭはＩ又はＶで置換してもよい。
特定の実施形態では、２番目のＲはＧで置換してもよい。
特定の実施形態では、４番目のＹはＦで置換してもよい。
特定の実施形態では、６番目のＱはＲで置換してもよい。
特定の実施形態では、７番目のＡはＲで置換してもよい。
特定の実施形態では、１１番目のＱはＥで置換してもよい。
特定の実施形態では、１４番目のＬはＦ又はＷで置換してもよい。
特定の実施形態では、１７番目のＴはＧ又はＳで置換してもよい。
特定の実施形態では、１番目のＭはＩ又はＶで置換してもよい。
特定の実施形態では、２番目のＲはＧで置換してもよい。
特定の実施形態では、４番目のＹはＦで置換してもよい。
特定の実施形態では、６番目のＱはＲで置換してもよい。
特定の実施形態では、７番目のＡはＲで置換してもよい。
特定の実施形態では、１１番目のＱはＥで置換してもよい。
特定の実施形態では、１４番目のＬはＦ又はＷで置換してもよい。
特定の実施形態では、１７番目のＴはＧ又はＳで置換してもよい。
【0059】
より好ましくは、ＦＲ２は、この配列に関して太字ではないアミノ酸残基において多くて６個のアミノ酸修飾、さらにより好ましくは多くて５個、多くて３個のアミノ酸修飾、さらにより好ましくは多くて２個のアミノ酸修飾を含む。
【0060】
特定の実施形態では、本発明のＶＨＨ分子は、ＦＲ２ドメインにおいて、Ｐｈｅ４２、Ｇｌｕ４９、Ａｒｇ５０、又はＧｌｙ５２のアミノ酸の少なくとも１つを含む。
【0061】
さらなる特定の実施形態では、ＦＲ２は、以下に記載するアミノ酸配列のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。
ＩＲＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＧ（配列番号４１）
ＭＲＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＷＶＡＧ（配列番号４２）
ＭＧＷＦＲＲＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＳ（配列番号４３）
ＶＲＷＹＲＱＲＰＧＫＱＲＥＷＶＡＧ（配列番号４４）
ＩＲＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＧ（配列番号４１）
ＭＲＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＷＶＡＧ（配列番号４２）
ＭＧＷＦＲＲＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＳ（配列番号４３）
ＶＲＷＹＲＱＲＰＧＫＱＲＥＷＶＡＧ（配列番号４４）
【0062】
特定の実施形態では、本発明のＶＨＨ分子は、以下に示すような配列番号４５、又は、その長さ全体においてこの配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するその変異体を含む又はそれからなるＦＲ３ドメインを含む。
ＹＹＡＤ〔Ｓ〕Ｖ〔Ｋ〕Ｇ〔ＲＦ〕Ｔ〔Ｉ〕Ｓ〔ＲＤＮＡ〕Ｋ〔Ｎ〕Ｔ〔Ｖ〕Ｙ〔ＬＱ〕ＭＮＳ〔ＬＫ〕ＰＥ〔ＤＴＡ〕Ｖ〔Ｙ〕Ｙ〔Ｃ〕（配列番号４５）
ＹＹＡＤ〔Ｓ〕Ｖ〔Ｋ〕Ｇ〔ＲＦ〕Ｔ〔Ｉ〕Ｓ〔ＲＤＮＡ〕Ｋ〔Ｎ〕Ｔ〔Ｖ〕Ｙ〔ＬＱ〕ＭＮＳ〔ＬＫ〕ＰＥ〔ＤＴＡ〕Ｖ〔Ｙ〕Ｙ〔Ｃ〕（配列番号４５）
【0063】
より好ましくは、亀甲括弧のアミノ酸残基が存在して、他の位置においてのみ可変する。
特定の実施形態では、１番目のＹはＮで置換してもよい。
特定の実施形態では、２番目のＹはＡで置換してもよい。
特定の実施形態では、３番目のＡはＰ又はＩで置換してもよい。
特定の実施形態では、４番目のＤはＳで置換してもよい。
特定の実施形態では、１番目のＹはＮで置換してもよい。
特定の実施形態では、２番目のＹはＡで置換してもよい。
特定の実施形態では、３番目のＡはＰ又はＩで置換してもよい。
特定の実施形態では、４番目のＤはＳで置換してもよい。
【0064】
より好ましくは、ＦＲ３は、この配列に関して太字ではないアミノ酸残基において多くて７個のアミノ酸修飾、さらにより好ましくは多くて６個、多くて３個のアミノ酸修飾、さらにより好ましくは多くて２個のアミノ酸修飾を含む。
【0065】
さらなる特定の実施形態では、ＦＲ３は、以下に記載するアミノ酸配列のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有する。
ＮＹＡＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＹＬＱＩＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４６）
ＮＹＰＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＩＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４７）
ＹＡＩＳＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４８）
ＮＹＰＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＩＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４９）
ＮＹＡＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＹＬＱＩＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４６）
ＮＹＰＤＳＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＩＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４７）
ＹＡＩＳＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＴＶＦＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４８）
ＮＹＰＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＩＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号４９）
【0066】
特定の実施形態では、本発明のＶＨＨ分子は、以下に示すような配列番号５０、又は、その長さ全体においてこの配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するその変異体を含む又はそれからなるＦＲ４ドメインを含む。
Ｗ〔Ｇ〕Ｑ〔ＧＴＱＶＴ〕Ｖ〔Ｓ〕Ｓ（配列番号５０）
Ｗ〔Ｇ〕Ｑ〔ＧＴＱＶＴ〕Ｖ〔Ｓ〕Ｓ（配列番号５０）
【0067】
より好ましくは、亀甲括弧のアミノ酸残基が存在して、他の位置においてのみ可変する。
【0068】
より好ましくは、ＦＲ４は、この配列に関して太字ではないアミノ酸残基において多くて４個のアミノ酸修飾、さらにより好ましくは多くて３個のアミノ酸修飾、さらにより好ましくは多くて２個のアミノ酸修飾を含む。
【0069】
ＦＲ４配列の特定の例は配列番号５０である。
【0070】
本発明のＴｆＲ結合ＶＨＨ分子の特定の例は、配列番号４（ＶＨＨＡ）、８（ＶＨＨＢ）、１２（ＶＨＨＣ）、１６（ＶＨＨＤ）、１８（ＶＨＨＡ１）、２０（ＶＨＨＡ２）、２２（ＶＨＨＡ３）、２４（ＶＨＨＡ４）、２６（ＶＨＨＡ５）、２８（ＶＨＨＡ６）、３０（ＶＨＨＡ７）、３２（ＶＨＨＡ８）、３４（ＶＨＨＡ９）、６８（ＶＨＨＡ１０）、７０（ＶＨＨＡ１１）、７２（ＶＨＨＡ１２）、７４（ＶＨＨＡ１３）、７６（ＶＨＨＡ１４）、７８（ＶＨＨＡ１５）、８０（ＶＨＨＡ１６）、８２（ＶＨＨＡ１７）、８４（ＶＨＨＡ１８）、８６（ＶＨＨＡ１９）、８７（ＶＨＨＡ２０）、８８（ＶＨＨＡ２１）、８９（ＶＨＨＡ２２）、９０（ＶＨＨＡ２３）、９１（ＶＨＨＡ２４）、及び９２（ＶＨＨＡ２５）のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる分子であり、ｘは０である。
【0071】
特定の実施形態では、本発明のＶＨＨはヒト化される。
【0072】
ヒト化において、１つ以上のＦＲ及び／又はＣＤＲドメインを１つ以上のアミノ酸置換によって（さらに）修飾してもよい。
【0073】
これについて、特定の実施形態では、ＶＨＨは、ＦＲ１ドメインの修飾（例えばアミノ酸置換）によってヒト化される。ＦＲ１における典型的なヒト化位置は、１９Ｒ及び２３Ａ、又はその両方から選択される（例えば配列番号３５～３９又はその変異体のいずれか１つに関する）。ゆえに、そうしたヒト化ＦＲ１の特定の例は、Ｋ１９及び／又はＶ２３をそれぞれ１９Ｒ及び２３Ａに修飾した、配列番号３６を含む。
【0074】
他の特定の実施形態では、ＶＨＨは、ＣＤＲ１ドメインの修飾によってヒト化される。ＣＤＲ１における典型的なヒト化位置は、（例えば配列番号１、５、９、１３、１７、１９、６７、若しくは６９又はその変異体のいずれか１つに関して）８Ａである。
【0075】
他の特定の実施形態では、ＶＨＨは、ＦＲ２ドメインの修飾によってヒト化される。ＦＲ２における典型的なヒト化位置は、１Ｍ、２Ｓ若しくは２Ｈ、４Ｖ、１１Ｇ、１２Ｌ、１４Ｗ、又はそれらの組合せから選択される（例えば配列番号４０～４４又はその変異体のいずれか１つに関する）。ゆえに、そうしたヒト化ＦＲ２の特定の例は、Ｉ１、Ｒ２、Ｙ４、Ｑ１１、Ｒ１２、及びＦ１４の１つ以上又はすべてをそれぞれ１Ｍ、２Ｓ又は２Ｈ、４Ｖ、１１Ｇ、１２Ｌ、及び１４Ｗに修飾した、配列番号４１を含む。
【0076】
他の特定の実施形態では、ＶＨＨは、ＣＤＲ２ドメインの修飾によってヒト化される。ＣＤＲ２における典型的なヒト化位置は、（例えば配列番号２、６、１０、１４、２１、２３、７１、７３、７５又はその変異体のいずれか１つに関して）１Ｉである。
【0077】
他の特定の実施形態では、ＶＨＨは、ＦＲ３ドメインの修飾によってヒト化される。ＦＲ３における典型的なヒト化位置は、６Ｖ、１７Ａ、２０Ｔ、２１Ｌ、２５Ｍ、２６Ｎ、２９Ｒ、又はそれらの組合せから選択される（例えば配列番号４５～４９又はその変異体のいずれか１つに関する）。ゆえに、そうしたヒト化ＦＲ３の特定の例は、Ｍ６、Ｔ１７、Ａ２０、Ｖ２１、Ｉ２５、Ｄ２６、及びＫ２９の１つ以上又はすべてをそれぞれ６Ｖ、１７Ａ、２０Ｔ、２１Ｌ、２５Ｍ、２６Ｎ、及び２９Ｒに修飾した、配列番号４６を含む。
【0078】
他の特定の実施形態では、ＶＨＨは、ＣＤＲ３ドメインの修飾によってヒト化される。ＣＤＲ３における典型的なヒト化位置は、（例えば配列番号３、７、１１、１５、２５、２７、２９、３１、３３、７７、７９、８１、８３、８５又はその変異体のいずれか１つに関して）１Ａ又は２Ｒ、又はその両方である。
【0079】
さらなる特定の実施形態では、ＦＲ１及び／又はＦＲ２及び／又はＦＲ３及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３ドメインはヒト化される。
【0080】
本発明のヒト化ＴｆＲ結合ＶＨＨ分子の特定の例は、配列番号８７（ＶＨＨＡ２０）、８８（ＶＨＨＡ２１）、８９（ＶＨＨＡ２２）、９０（ＶＨＨＡ２３）、９１（ＶＨＨＡ２４）、及び９２（ＶＨＨＡ２５）のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる分子であり、ｘは０である。
【0081】
さらなる特定の実施形態では、ＶＨＨ分子は、例えば精製、カップリングなどに適した１つ又は複数のタグをさらに含んでもよい。そうしたタグの例は、Ｈｉｓタグ（例えばＨｉｓ６）、Ｑタグ（ＬＱＲ）、又はｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を含む。典型的に、１つ又は複数のタグはＶＨＨのＣ末端に位置する。
【0082】
例として、ＶＨＨは、ＡＡＡ（ＥＱＫＬＩＳ〔Ｅ〕ＥＤＬ）ＮＧＡ〔Ａ〕［ＨＨＨＨＨＨ］ＧＳ（配列番号５１）であるさらなる配列をＣ末端に含むことができ、丸括弧はｍｙｃタグであり、角括弧はＨｉｓタグである（残りの残基はリンカーである、又はクローニングに起因する）。
【0083】
本発明のそうしたタグ付きＴｆＲ結合ＶＨＨ分子の特定の例は、配列番号４（ＶＨＨＡ）、８（ＶＨＨＢ）、１２（ＶＨＨＣ）、１６（ＶＨＨＤ）、１８（ＶＨＨＡ１）、２０（ＶＨＨＡ２）、２２（ＶＨＨＡ３）、２４（ＶＨＨＡ４）、２６（ＶＨＨＡ５）、２８（ＶＨＨＡ６）、３０（ＶＨＨＡ７）、３２（ＶＨＨＡ８）、３４（ＶＨＨＡ９）、６８（ＶＨＨＡ１０）、７０（ＶＨＨＡ１１）、７２（ＶＨＨＡ１２）、７４（ＶＨＨＡ１３）、７６（ＶＨＨＡ１４）、７８（ＶＨＨＡ１５）、８０（ＶＨＨＡ１６）、８２（ＶＨＨＡ１７）、８４（ＶＨＨＡ１８）、８６（ＶＨＨＡ１９）、８７（ＶＨＨＡ２０）、８８（ＶＨＨＡ２１）、８９（ＶＨＨＡ２２）、９０（ＶＨＨＡ２３）、９１（ＶＨＨＡ２４）、及び９２（ＶＨＨＡ２５）のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる分子であり、ｘは１である。
【0084】
他の例として、本発明のＶＨＨは、好ましくはＶＨＨのＣ末端に位置する配列ＬＱＲのＱタグを含んでもよい。
【0085】
さらなる例として、本発明のＶＨＨは、好ましくはＶＨＨのＣ末端に位置するＧｌｙリンカーを含んでもよい。Ｇｌｙリンカーは、例えば２～７個のＧｌｙ残基、３～６個などのＧｌｙ残基のＧｌｙリピートを含んでもよい。Ｇｌｙリンカーの特定の例は、Ｇｌｙ３、Ｇｌｙ４、Ｇｌｙ５、又はＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙ５を含む。
【0086】
特定の実施形態では、本発明のＶＨＨは、好ましくはＣ末端に位置するＧｌｙリンカー及びＱタグを含んでもよい。そうしたＶＨＨのより具体的な例は、ＶＨＨ－Ｇｌｙリンカー－Ｑタグの構造を含み、Ｇｌｙリンカーは２～６個のＧｌｙ残基を含み、ＱタグはＬＱＲを含む又はそれからなる。
【0087】
例として、ＶＨＨは、〔ＧＧＧ〕（ＬＱＲ）であるさらなる配列をＣ末端に含むことができ、丸括弧はＱタグであり、亀甲括弧はＧｌｙリンカーである。
【0088】
さらなる特定の実施形態では、本発明のＶＨＨは、Ａｌａリンカー、Ｈｉｓタグ、Ｇｌｙリンカー、及びＱタグを含んでもよい。好ましくは、リンカー及びタグは、ＶＨＨのＣ末端に位置する。他の実施形態では、Ｑタグは少なくとも、ＶＨＨのＮ末端に位置することができる。そうしたＶＨＨのより具体的な例は、ＶＨＨ－Ａｌａリンカー－Ｈｉｓタグ－Ｇｌｙリンカー－Ｑタグの構造を含み、Ａｌａリンカーは３個の残基を含み、Ｈｉｓタグは２～７個のＨｉｓ残基を含み、Ｇｌｙリンカーは２～６個のＧｌｙ残基を含み、ＱタグはＬＱＲを含む又はそれからなる。
【0089】
例として、ＶＨＨは、〔ＡＡＡ〕［ＨＨＨＨＨＨ］〔ＧＧＧ〕（ＬＱＲ）であるさらなる配列をＣ末端に含むことができ、丸括弧はＱタグであり、亀甲括弧はＡｌａリンカー及びＧｌｙリンカーであり、角括弧はＨｉｓタグである。
【0090】
本発明のＴｆＲ結合ＶＨＨ分子のさらなる特定の例は、上述のようなＶＨＨのヒト及び非ヒトのＴｆＲへの結合を競合的に阻害するＶＨＨ分子である。「競合的に阻害する」という用語は、ＶＨＨが、インビトロ又はインビボで、そうした基準ＶＨＨのＴｆＲへの結合を減少又は阻害又は置換することができることを示す。競合アッセイは、例えば競合ＥＬＩＳＡ又は他の結合アッセイなどの標準的技術を使用して行うことができる。典型的に、競合性結合アッセイは、任意で固体基質に結合した、ＴｆＲを発現する組換え細胞又は膜調製物、非標識試験用ＶＨＨ（又はこれを発現するファージ）、及び標識基準ＶＨＨ（又はこれを発現するファージ）に関与する。競合性阻害は、試験用ＶＨＨの存在下で結合する標識ＶＨＨの量を判定することで測定する。通常、試験用ＶＨＨは、基準ＶＨＨの量の約５～５００倍など、過剰に存在する。典型的に、ＥＬＩＳＡでは、試験用ＶＨＨは１００倍過剰である。過剰に存在する試験用ＶＨＨが、基準ＶＨＨのＴｆＲに対する結合の少なくとも７０％を阻害又は置換すると、該基準ＶＨＨを競合的に阻害すると考えられる。好ましい競合ＶＨＨは、共通のアミノ酸残基を有するエピトープに結合する。
【0091】
実験の項で示すように、ＶＨＨ分子は、インビトロ及びインビボでＴｆＲに結合することができる。これは、０．１ｎＭ～１０μＭ、特に１μＭ～１ｎＭの間に含まれる明らかなＫｄにより、十分な親和性を示す。さらに、この分子のすべてがヒト及びマウスの両方のＴｆＲに結合する。その上、本発明の前述のＶＨＨのヒトＴｆＲ受容体への結合は、内因性のＴｆＲリガンドのトランスフェリンの結合と競合せず、ゆえに該リガンドの通常の機能に影響しない。そうしたＶＨＨ分子で作製したコンジュゲートは、インビトロでＴｆＲに結合し、インビボでＢＢＢを横断してＣＮＳに輸送されることがさらに示され、経細胞輸送を示している。このように、そうしたＶＨＨは、薬剤送達又は標的化において強力な薬剤に相当する。
【0092】
本発明のＶＨＨは、当業者に既知の任意の技術（化学的、生物学的又は遺伝子的合成等）によって合成可能である。これは、そのまま保管、又は対象物質若しくは任意の許容される賦形剤の存在下で製剤化可能である。
【0093】
化学合成では、天然及び非天然のアミノ酸、例えばそれらの天然相同体（いわゆる外来（ｅｘｏｔｉｃ）の、すなわち非コードアミノ酸）のものとは疎水性及び立体障害が異なる側鎖を有するＤエナンチオマー及び残基、又はメチレン（－ＣＨ２－）基又はホスフェート（－ＰＯ２－）基、第２級アミン（－ＮＨ－）又は酸素（－Ｏ－）又はＮ－アルキルペプチドの挿入をとりわけ含み得る１つ以上のペプチド様結合を含むＶＨＨ配列を導入可能な市販の構築物が使用される。
【0094】
合成時、１つ以上の脂質層又は脂質二重層から構成されるリポソーム、又はナノ粒子のものなどの脂質膜内に、本発明のＶＨＨを導入することができるように、例えば、Ｎ末端若しくはＣ末端の位置、又は側鎖に、脂質（又はリン脂質）誘導体又はリポソーム若しくはナノ粒子構成物を入れるなど、種々の化学修飾を導入することができる。
【0095】
また、本発明のＶＨＨは、以下にさらに記載するように、それをコードする核酸配列から得ることもできる。
【0096】
＜コンジュゲート＞
本発明のさらなる目的は、対象の少なくとも１つの分子又は足場とコンジュゲートした、上述のような１つ以上のＶＨＨ分子を含むコンジュゲート（本明細書において区別なく「キメラ薬剤」とも呼ばれる）に関する。
本発明のさらなる目的は、対象の少なくとも１つの分子又は足場とコンジュゲートした、上述のような１つ以上のＶＨＨ分子を含むコンジュゲート（本明細書において区別なく「キメラ薬剤」とも呼ばれる）に関する。
【0097】
対象の分子は、医薬又は薬剤、診断用薬剤、イメージング分子、トレーサーなどの任意の分子であってもよい。対象のコンジュゲート分子の例は、化学低分子などの任意の化学成分（抗生物質、抗ウイルス剤、免疫調節剤、抗悪性腫瘍剤、抗炎症剤、アジュバントなど）；ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質（酵素、ホルモン、神経栄養因子、神経ペプチド、サイトカイン、アポリポタンパク質、成長因子、抗原、抗体若しくは抗体の一部、アジュバントなど）；核酸（例えばコード遺伝子を含む、ヒト、ウイルス、動物、真核生物若しくは原核生物、植物、若しくは合成起源などのＲＮＡ若しくはＤＮＡ、リボザイムなどの阻害性核酸、アンチセンス、干渉性核酸、全ゲノム若しくはその一部、プラスミドなど）；脂質、ウイルス、マーカー、又はトレーサーなどを含むが、これらに限定されない。一般的に、「対象の分子」は、化学化合物、生化学化合物、天然化合物、又は合成化合物の任意の薬剤有効成分とし得る。一般的に、「化学低分子」という用語は、１０００ダルトン、典型的には３００ダルトン～７００ダルトンの最大分子量を有する、医薬上の対象の分子を指す。
【0098】
コンジュゲート化合物は、典型的に、好ましくは脳などのＣＮＳの神経学的、感染性、又はがん性の病態の処置又は検出に適する、医薬（低分子薬剤、核酸、若しくはポリペプチド、例えば抗体若しくはそのフラグメントなど）、又はイメージング剤である。
【0099】
また、キメラ薬剤は、前述の対象の化合物に加えて又はその代わりに、安定化基を含ませて、ＶＨＨ又はコンジュゲートの血漿中の半減期を長くしてもよい。このように、本発明の特定のキメラ薬剤は、任意の順序の少なくとも１つのＶＨＨ、安定化基、及び活性化合物を含む。
【0100】
安定化基は、ある程度の血漿中の半減期（例えば、少なくとも１時間）を有すること、及び実質的に有害な生物学的活性を有しないことが知られる任意の基であってもよい。そうした安定化基の例は、例えば、免疫グロブリン若しくはその変異体のＦｃフラグメント、アルブミン、ＨＳＡなどの大型のヒト血清タンパク質、又はＩｇＧ若しくはＰＥＧ分子を含む。特定の実施形態では、安定化基はヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントである。より好ましくは、安定化基はＩｇＧ１の脱グリコシル化Ｆｃフラグメントである。
【0101】
ＶＨＨは、安定化基のＮ末端又はＣ末端、又はその両方をコンジュゲートしてもよい。安定化基がＦｃフラグメントであるとき、コンジュゲーションは典型的に遺伝子融合によるものである。生じるタンパク質は、安定化基の性質に応じて、単量体物質にとどまる、又は多量体物質となり得る。Ｆｃフラグメントの場合、融合タンパク質Ｆｃ－ＶＨＨ又はＶＨＨ－Ｆｃは通常ホモ二量体を形成する。
【0102】
本発明のコンジュゲート化合物において、カップリングは、コンジュゲートする成分の化学的性質、障害、及び数を考慮して、任意の許容される結合手段によって行うことができる。つまり、カップリングは、生理学的媒体において又は細胞内において、切断可能又は切断可能でない、１つ以上の共有結合、イオン結合、水素結合、疎水結合、又はファンデルワールス結合によって行うことができる。さらに、カップリングは、種々の反応性基で、とりわけ１つ以上の末端及び／又は１つ以上の内部若しくは側方の反応性基で行うことができる。また、カップリングは遺伝子工学を用いて行うこともできる。
【0103】
相互作用は十分に強力なものであって、ＶＨＨがその作用部位に到達してしまう前に活性物質から解離しないことが好ましい。この理由のため、本発明の好ましいカップリングは共有結合性カップリングであるが、非共有結合性カップリングも使用してよい。対象の化合物は、その末端の一方（Ｎ末端若しくはＣ末端）、又はその配列の構成アミノ酸の１つにおける側鎖のいずれかにおいてＶＨＨにカップリング可能である（Ｍａｊｕｍｄａｒ ａｎｄ Ｓｉａｈａａｎ，Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．，Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）。対象の化合物は、ＶＨＨと直接的に、又はリンカー若しくはスペーサーによって非直接的にカップリングすることができる。スペーサーを使用する又は使用しない共有結合性化学カップリングの手段は、例えば、エステル、アルデヒド又はアルキル若しくはアリール酸によるアルキル、アリール、又はペプチド基、無水物、スルフヒドリル、又はカルボキシル基、臭化シアン若しくは塩化シアン、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミドエステル、又はハロゲン化スルホニルから誘導される基を含む、二官能性又は多官能性物質から選択されるものを含む。
【0104】
本発明のＶＨＨを分子又は足場にコンジュゲートするための例の方法を図６に開示する。
【0105】
特定の実施形態では、カップリング（又はコンジュゲーション）は遺伝子融合によるものである。そうした方法は、カップリング分子がペプチド又はポリペプチドであるときに使用可能である。そうした場合、該分子に融合するＶＨＨをコードする核酸分子は、コンジュゲートを作製するため、任意の適切な発現系において調製及び発現される。
【0106】
他の特定の実施形態では、カップリング（又はコンジュゲーション）は酵素反応によるものである。特に、トランスグルタミナーゼ酵素（ＴＧａｓｅ）を用いて、ＶＨＨに部位特異的コンジュゲーションを行うことができる。ＴＧａｓｅは、（ｉ）ＴＧａｓｅによって特異的に認識されるタグ配列（すなわちＱタグ）に挿入したグルタミン残基の側鎖と（ｉｉ）アミノ官能基を持つドナー基質との間の安定的なイソペプチド結合の形成を触媒する。これについて、発明者らは、ＴＧａｓｅによって認識されるとともに、本発明のＶＨＨを任意の対象の分子、特に化学薬剤又は物質とカップリングするために使用し得る特定のタグ配列（「Ｑタグ」と呼称する）を開発した。この目的で、以下のタグを（典型的にそのＣ末端に）タンデムに付加するように、ＶＨＨを遺伝子融合によって調製する。該タグは、まず任意のトリアラニン、そして任意のＨｉｓタグ、任意の低分子トリグリシンリンカー、そして最後にＱ－タグである。トリグリシンリンカーは、Ｑタグを離間させて、ＴＧａｓｅがより良好にグルタミンにアクセスできるようにする一方、Ｈｉｓタグは、ＶＨＨ及びそのさらなる機能化タイプを精製しやすくすることを狙いとする。
【0107】
開発されている一般的なコンジュゲーション方法は、以下を含むプロセスに基づく収束型合成である。
１） 対象の分子にさらにコンジュゲーションするため、反応性部分をＶＨＨのＱタグのグルタミンに導入する。この目的において、一方がＴＧａｓｅに対する適切な一級アミン基であり、もう一方が直交型反応性部分である、２つの異なる反応性末端を有するヘテロ二官能性リンカーをＴＧａｓｅによってプロセスすることができる。そうした直交型の反応性基の代表的な例は、アジド、ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）又はＢＣＮ（ビシクロ［６．１．０］ノニン）などの拘束アルキン、テトラジン、ＴＣＯ（トランス－シクロオクテン）、遊離又は保護チオールなどを含む。
２） ＶＨＨのＱタグに取り入れたものと相補的な反応性部分を対象の分子に導入する。そうした直交型の反応性基の代表的な例は、アジド、ＤＢＣＯ又はＢＣＮなどの拘束アルキン、テトラジン、ＴＣＯ、遊離又は保護チオールなどを含む。
３） その相補反応性基により、機能化ＶＨＨ及び分子の両方のコンジュゲーションを行う。
１） 対象の分子にさらにコンジュゲーションするため、反応性部分をＶＨＨのＱタグのグルタミンに導入する。この目的において、一方がＴＧａｓｅに対する適切な一級アミン基であり、もう一方が直交型反応性部分である、２つの異なる反応性末端を有するヘテロ二官能性リンカーをＴＧａｓｅによってプロセスすることができる。そうした直交型の反応性基の代表的な例は、アジド、ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）又はＢＣＮ（ビシクロ［６．１．０］ノニン）などの拘束アルキン、テトラジン、ＴＣＯ（トランス－シクロオクテン）、遊離又は保護チオールなどを含む。
２） ＶＨＨのＱタグに取り入れたものと相補的な反応性部分を対象の分子に導入する。そうした直交型の反応性基の代表的な例は、アジド、ＤＢＣＯ又はＢＣＮなどの拘束アルキン、テトラジン、ＴＣＯ、遊離又は保護チオールなどを含む。
３） その相補反応性基により、機能化ＶＨＨ及び分子の両方のコンジュゲーションを行う。
【0108】
そうしたコンジュゲーション方法は、本発明のさらなる目的に相当する。特に、本発明の目的は、ＴＧａｓｅカップリング反応を介して上述のようなＱタグを使用して２つの分子をカップリングする方法にある。本発明のさらなる目的は、Ｑタグを含むＶＨＨである。本発明のさらなる目的は、Ｇｌｙリンカーなどのリンカー、及びＱタグを含むＶＨＨ分子である。本発明の好ましいＶＨＨは、
ＶＨＨ－リンカー－Ｈｉｓｍ－リンカー－ＬＱＲの構造を有し、
式中、ＶＨＨは任意のＶＨＨ分子であり、
リンカーは、Ａｌａ又はＧｌｙリンカーなどの任意の分子リンカーであり（好ましくは２つのリンカーは異なる）、
ｍは０～６の整数である。
ＶＨＨ－リンカー－Ｈｉｓｍ－リンカー－ＬＱＲの構造を有し、
式中、ＶＨＨは任意のＶＨＨ分子であり、
リンカーは、Ａｌａ又はＧｌｙリンカーなどの任意の分子リンカーであり（好ましくは２つのリンカーは異なる）、
ｍは０～６の整数である。
【0109】
特定の実施形態では、本発明は、化学成分と共有結合したＶＨＨを含むコンジュゲートに関する。そうしたコンジュゲートの好ましい変異体は１つのＶＨＨと１つの化学成分とを含む。
【0110】
他の特定の実施形態では、本発明は、核酸と共有結合したＶＨＨを含むコンジュゲートに関する。核酸は、アンチセンスオリゴ、リボザイム、アプタマー、ｓｉＲＮＡなどとしてもよい。そうしたコンジュゲートの好ましい変異体は１つのＶＨＨと１つの核酸分子とを含む。
【0111】
他の特定の実施形態では、本発明は、ペプチドと共有結合したＶＨＨを含むコンジュゲートに関する。ペプチドは、活性分子、ベイト、タグ、リガンドなどとしてもよい。そうしたコンジュゲートの好ましい変異体は１つのＶＨＨと１つのペプチドとを含む。
【0112】
他の実施形態では、本発明は、色素と共有結合したＶＨＨを含むコンジュゲートに関する。
【0113】
他の実施形態では、本発明は、ナノ粒子又はリポソームと共有結合したＶＨＨを含むコンジュゲートに関する。ナノ粒子又はリポソームは、活性剤をロードする又は活性剤で機能化してもよい。そうしたコンジュゲートの好ましい変異体は、各ナノ粒子又はリポソームにカップリングした複数のＶＨＨ分子を含む。
【0114】
さらなる実施形態では、コンジュゲートは、１つ又は複数のＶＨＨ分子をカップリングした抗体又はそのフラグメントを含む。典型的に、ＶＨＨ分子は、重鎖若しくは軽鎖、若しくはその両方のＣ末端若しくはＮ末端、又はＦｃフラグメントのＣ末端若しくはＮ末端にカップリングされる。
【0115】
また、本発明は、好ましくは化学、生化学、若しくは酵素経路によって、又は遺伝子工学によって、ＶＨＨと分子又は足場とをカップリングするステップを含むことを特徴とする、上述のようなコンジュゲート化合物を調製する方法にも関する。
【0116】
本発明のキメラ薬剤において、複数のＶＨＨが存在するとき、それらは同じ又は異なる結合特異性を有してもよい。
【0117】
＜核酸、ベクター、及び宿主細胞＞
本発明のさらなる態様は、上述のようなＶＨＨ、又は（コンジュゲート部分がアミノ酸配列であるとき）そのコンジュゲートをコードする核酸に関する。核酸は１本鎖又は２本鎖とし得る。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ若しくはｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、又はそれらの混合物とすることができる。これは、一本鎖形態又は２本鎖形態又はその２つの混合とすることができる。これは、例えば修飾結合、修飾プリン塩基若しくはピリミジン塩基、又は修飾糖を含む、修飾ヌクレオチドを含むことができる。これは、化学合成、組換え、及び／又は突然変異誘発を含む、当業者に既知の任意の方法によって調製することができる。本発明における核酸は、本発明におけるＶＨＨ分子のアミノ酸配列から推定することができ、コドン使用は、核酸を転写する宿主細胞に応じて適応させることができる。これらのステップは、当業者に既知である方法にしたがって行うことができ、その一部はＳａｍｂｒｏｏｋ等の参照マニュアルに記載されている。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）
本発明のさらなる態様は、上述のようなＶＨＨ、又は（コンジュゲート部分がアミノ酸配列であるとき）そのコンジュゲートをコードする核酸に関する。核酸は１本鎖又は２本鎖とし得る。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ若しくはｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、又はそれらの混合物とすることができる。これは、一本鎖形態又は２本鎖形態又はその２つの混合とすることができる。これは、例えば修飾結合、修飾プリン塩基若しくはピリミジン塩基、又は修飾糖を含む、修飾ヌクレオチドを含むことができる。これは、化学合成、組換え、及び／又は突然変異誘発を含む、当業者に既知の任意の方法によって調製することができる。本発明における核酸は、本発明におけるＶＨＨ分子のアミノ酸配列から推定することができ、コドン使用は、核酸を転写する宿主細胞に応じて適応させることができる。これらのステップは、当業者に既知である方法にしたがって行うことができ、その一部はＳａｍｂｒｏｏｋ等の参照マニュアルに記載されている。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）
【0118】
そうした核酸配列の具体的な例は、配列番号５２～６４及び配列番号９５～１１０のいずれか１つを含む配列、及びそれらの相補的配列、並びに任意のタグコード部分を有しないそれらのフラグメントを含む。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３をコードするドメインを下線で示す。タグコード部分は太字で示す。
【0119】
また、本発明は、任意で調節配列（例えば、プロモーター、ターミネーターなど）の制御下における、そうした核酸を含むベクターに関する。ベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージミド、人工染色体などとすることができる。特に、ベクターは、調節領域、すなわち１つ以上の制御配列を含む領域と作動可能に連結された本発明の核酸を含むことができる。任意で、ベクターは、複数の調節領域と作動可能に連結された本発明の複数の核酸を含むことができる。
【0120】
「制御配列」という用語は、コード領域による発現に必要な核酸配列を意味する。制御配列は内因性又は異種とすることができる。既知であり当業者が現在使用している制御配列が好ましい。そのような制御配列は、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターを含むがこれらに限定されない。
【0121】
「作動可能に連結された」という用語は、制御配列がコード領域による発現を制御するように、制御配列がコード配列に対して適切な位置に配置された構成を意味する。
【0122】
本発明は、宿主細胞を形質転換、遺伝子導入、又は形質導入するための本発明における核酸又はベクターの使用にさらに関する。
【0123】
また、本発明は、本発明の１つ若しくは複数の核酸及び／又は本発明の１つ若しくは複数のベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【0124】
また、「宿主細胞」という用語は、複製時に生じた突然変異により、親宿主細胞とは同じではない、該親宿主細胞の任意の子孫も含む。適切な宿主細胞は、原核生物（例えば細菌）又は真核生物（例えば酵母、植物、昆虫、若しくは哺乳動物細胞）とすることができる。そうした細胞の具体的な例は、大腸菌株、ＣＨＯ細胞、サッカロマイセス株、植物細胞、ｓｆ９昆虫細胞などを含む。
【0125】
＜使用＞
本発明のＶＨＨ分子はＴｆＲに結合可能であり、ゆえに分子をＴｆＲ発現細胞又は器官に標的化／送達することができる。
本発明のＶＨＨ分子はＴｆＲに結合可能であり、ゆえに分子をＴｆＲ発現細胞又は器官に標的化／送達することができる。
【0126】
本発明の文脈内において、結合は好ましくは特異的であり、ＴｆＲへの結合は、同じ種の任意の他の抗原への結合よりも高親和性で生じる。本発明の好ましいＶＨＨ分子は、ヒトのＴｆＲ１及びマウス又はラットのＴｆＲに結合する。より好ましくは、ＶＨＨ分子は、実質的に同様の親和性でヒト及びマウスの受容体に結合する。
【0127】
このように、本発明は、少なくとも１つの本発明のＶＨＨに化合物をカップリングすることを含む、該化合物をＴｆＲ発現細胞又は器官に／ＴｆＲ発現細胞又は器官を介して標的化／送達する方法に関する。
【0128】
本発明は、化合物をＴｆＲ発現細胞又は器官に／ＴｆＲ発現細胞又は器官を介して輸送するためのベクターとしての、上述のようなＶＨＨの使用にさらに関する。
【0129】
また、本発明は、ＢＢＢを横断することができる薬剤を調製するための、上述のようなＶＨＨの使用に関する。
【0130】
また、本発明は、本発明のＶＨＨに分子をカップリングすることを含む、ＢＢＢを横断する該分子の通過を可能にする又は向上させる方法に関する。
【0131】
本発明のＶＨＨは、低分子薬剤、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、脂質、核酸、ウイルス、リポソームなどの任意の化合物を輸送又は送達するために使用することができる。
【0132】
また、本発明は、上述のような少なくとも１つのＶＨＨ又はＶＨＨ－薬剤コンジュゲートと、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物にも関する。
【0133】
また、本発明は、上述のようなＶＨＨ又はＶＨＨ－診断用若しくは医療用イメージング剤コンジュゲート化合物を含むことを特徴とする診断用組成物にも関する。
【0134】
コンジュゲートを任意の薬学的に許容される塩の形態で使用することができる。「薬学的に許容される塩」という表現は、例えば、非限定的に、薬学的に許容される塩基又は酸付加塩、水和物、エステル、溶媒和物、前駆体、代謝産物又は立体異性体、対象の少なくとも１つの物質をロードした前述のベクター又はコンジュゲートを指す。
【0135】
「薬学的に許容される塩」という表現は、遊離塩基を適切な有機酸又は無機酸と反応させることによって一般に調製することができる非毒性塩を指す。これらの塩は、遊離塩基の生物学的有効性及び特性を保持する。そうした塩の代表的な例は、水溶性及び水不溶性塩、例えば、酢酸塩、Ｎ－メチルグルカミンアンモニウム、アムソナート（４，４－ジアミノスチルベン－２，２’－ジスルホン酸塩）、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化水素酸塩、ブロミド、酪酸塩、カムシラート、炭酸塩、塩酸塩、クロリド、クエン酸塩、クラブラン酸塩、ジクロルヒドラート、二リン酸塩、エデト酸塩、エデト酸カルシウム、エジシラート、エストラート、エシラート、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨージド、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシラート、メチルブロミド、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムカート、ナプシル酸塩、硝酸塩、３－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩（１，１－メチレン－ビス－２－ヒドロキシ－３－ナフトエ酸塩、又はエンボン酸塩）、パントテン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリチル酸塩、スラマート、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシラート、トリエチオジド、トリフルオロ酢酸塩及び吉草酸塩を含む。
【0136】
本発明の組成物は、有利には、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。薬学的に許容される担体は、各投与モードに対応して従来より使用される担体から選択することができる。想定される投与モードに対応して、化合物は固体形態、半固体形態、又は液体形態とすることができる。固体組成物、例えば錠剤、ピル、纏まっていない又はゼラチンカプセル内に含められた粉末又は顆粒については、活性物質を、ａ）希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／若しくはグリシン、ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム若しくはカルシウム塩、及び／若しくはポリエチレングリコール、ｃ）結合剤、例えば、ケイ酸マグネシウム及びケイ酸アルミニウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／若しくはポリビニルピロリドン、ｄ）崩壊剤、例えば、デンプン、カンテン、アルギン酸若しくはそのナトリウム塩、若しくは発泡性混合物、並びに／又は、ｅ）吸着剤、色素、着香剤及び甘味料と組み合わせることができる。賦形剤は、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム及び医薬品質の類似体とすることができる。半固体組成物、例えば坐剤については、賦形剤は、例えば、エマルジョン若しくは油性懸濁液、又はポリアルキレングリコール、例えばポリプロピレングリコール系のものとすることができる。液体組成物、特に、注射剤又はソフトカプセル内に含めるものは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノール、油及びそれらの類似体などの薬学的に純粋な溶媒への活性物質の溶解、分散などによって調製することができる。
【0137】
本発明の組成物又はコンジュゲートを、任意の適する経路によって投与することができ、非限定的に、例えば、皮下、静脈内、若しくは筋肉内の経路を介して注射することができる製剤の形態などで非経口経路によって、例えばコーティング錠若しくは素錠、ゼラチンカプセル、粉末、ペレット、懸濁液若しくは経口溶液の形態（１つのそのような経口投与形態は、即時放出を伴う場合もあり、若しくは長期若しくは遅延放出を伴う場合もある）などで経口経路（若しくはｐｅｒ ｏｓで）によって、例えば坐剤の形態などで直腸経路によって、例えばパッチ、ポマード若しくはゲルの形態などで局所経路によって、特に経皮経路によって、例えばエアロゾル及びスプレー形態などで鼻腔内経路によって、経舌経路によって、又は、眼内経路によって投与することができる。
【0138】
医薬組成物は、典型的に、本発明のＶＨＨ又はコンジュゲートの有効用量を含む。本明細書に記載するとき「治療有効用量」は、所与の条件及び投与スケジュールにおいて治療効果をもたらす用量を指す。これは、典型的に、疾患又は病的状態に随伴する症状の一部を明らかに改善するように投与する、活性物質の平均用量である。例えば、脳の又は他の組織のがん、ＣＮＳの病態、病変、又は障害を処置する際、前述の疾患又は障害の原因又は症状の１つを少なくする、予防する、遅延させる、取り除く、又は停止させる活性物質の用量が、治療に有効とし得る。活性物質の「治療有効用量」は、必ずしも疾患又は障害を治癒するとは限らないが、その出現を遅延する、妨げる、若しくは予防する、又はその症状を抑える、又はその期間を変える若しくは例えばあまり重症でなくする、又は患者の回復を速めるように、この疾患又は障害を処置し得る。
【0139】
特に人に対する「治療有効用量」は、活性物質の活性／効力、その投与回数、その投与経路、その毒性、その排泄速度及び代謝、薬の組合せ／相互作用、並びに予防又は治癒ベースで処置する疾患（又は障害）の重症度、並びに患者の年齢、体重、総合的健康状態、性別及び／又は食事を含む、種々の要因によって決まることとなることが、理解される。
【0140】
カップリングさせる物質に応じて、本発明のコンジュゲート及び組成物を、非常に多数の病態、とりわけ、ＣＮＳを罹患させる病態、感染性病態、又はがん、の処置、予防、診断、又はイメージングに使用することができる。本発明のＶＨＨは、ＴｆＲ発現細胞、特に、とりわけがん細胞、神経若しくは非神経組織などの該受容体を著しく発現する細胞を標的化する、並びに／又は、細胞膜、とりわけＣＮＳの生理学的バリアの細胞膜、及びより具体的にはがん神経組織の血液－腫瘍バリア（ＢＴＢ）の細胞膜を横断する機能を有する。ＴｆＲは、骨髄、胎盤などの器官、及び消化管において豊富である。また、ＴｆＲは脳内皮細胞において高発現するが、他の組織の血管を覆う内皮細胞ではそうではない。ＴｆＲ発現は、ラット、マウス、ブタ、及び非ヒト霊長類の精製した脳微小血管及び培養した内皮細胞における形質膜で確認されている。
【0141】
これに関して、本発明は、ＣＮＳ病態又は障害、脳腫瘍又は他のがん細胞、及び脳又は他の組織の細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌感染性病態を処置又は予防するための、上述のような医薬コンジュゲート又は組成物の使用に関する。
【0142】
また、本発明は、ＣＮＳ病態又は障害、脳腫瘍又は他のがん細胞、及び脳又は他の組織の細菌、ウイルス、寄生虫又は真菌感染性病態を診断、イメージング又は処置するために使用する、上述のようなＶＨＨ、コンジュゲート、又は組成物に関する。
【0143】
また、本発明は、脳腫瘍又は他の種類のがんを、処置、イメージング、及び／又は診断するために使用する、上述のようなＶＨＨ、コンジュゲート、又は組成物にも関する。
【0144】
本発明は、非限定的にアルツハイマー病、パーキンソン病、卒中、クロイツフェルト－ヤコブ病、ウシ海綿状脳症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症などの、神経変性病態を処置、イメージング、及び／又は診断するために使用する、上述のようなＶＨＨ、コンジュゲート、又は組成物にも関する。
【0145】
また、本発明は、非限定的に、てんかん、片頭痛、脳炎、ＣＮＳ疼痛などの神経性病態を処置、イメージング、及び／又は診断するために使用する、上述のようなＶＨＨ、コンジュゲート、又は組成物にも関する。
【0146】
また、本発明は、非限定的に、リソソーム蓄積症、ファーバー病、ファブリー病、ガングリオシドーシスＧＭ１及びＧＭ２、ゴーシェ病、様々なムコ多糖症などの希少疾患を処置、イメージング、及び／又は診断するために使用する、上述のようなＶＨＨ、コンジュゲート、又は組成物にも関する。
【0147】
また、本発明は、非限定的に、うつ、自閉症、不安、統合失調症などの精神神経性病態を処置、イメージング、及び／又は診断するために使用する、上述のようなＶＨＨ、コンジュゲート、又は組成物にも関する。
【0148】
また、本発明は、非限定的に、膠芽腫、膵がん、卵巣がん、肝細胞がんなどのがんを処置、イメージング、及び／又は診断するために使用する、上述のようなＶＨＨ、コンジュゲート、又は組成物にも関する。
【0149】
また、本発明は、上述のようなＶＨＨ、コンジュゲート、又は組成物にも関し、コンジュゲート薬剤は組換えウイルスなどのウイルス又はウイルス様粒子である。本発明は、実際に、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなど、又はウイルス様粒子などの遺伝子治療に使用する組換え（例えば、複製欠損性又は減縮性）ウイルスの脳又はがん又は任意のＴｆＲ豊富組織への送達を増加させるために使用することができる。ウイルス又はＶＬＰとのカップリングは、例えばウイルスのカプシドタンパク質へのカップリングによって、行うことができる。
【0150】
また、本発明は、処置を必要とする対象に本発明のＶＨＨ、コンジュゲート、又は組成物を投与することによって、上述の病状又は疾患のいずれかを処置する方法に関する。
【0151】
また、本発明は、上述の病状又は疾患のいずれかを処置する医薬の製造のための本発明のＶＨＨ、コンジュゲート、又は組成物の使用に関する。
【0152】
本発明の他の態様及び有利性は、本質的に例示のみであるとともに本願の範囲を限定することのない以下の実施例を以て明白になる。
【実施例】
【0153】
＜実施例Ｉ＞
ＢＢＢにおけるＴｆＲ発現の検証
様々な種の脳内皮における細胞膜のＴｆＲ発現プロファイルを分析した。ラット、マウス、ブタ、及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ、アカゲザル）からの消化又は未消化の脳微小血管（ＢＭＶ）及び脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の初代培養（ｐｒｉｍｏｃｕｌｔｕｒｅ）の膜抽出物を調製するため、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）細胞分画プロテオーム抽出キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した（図１）。
ＢＢＢにおけるＴｆＲ発現の検証
様々な種の脳内皮における細胞膜のＴｆＲ発現プロファイルを分析した。ラット、マウス、ブタ、及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ、アカゲザル）からの消化又は未消化の脳微小血管（ＢＭＶ）及び脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の初代培養（ｐｒｉｍｏｃｕｌｔｕｒｅ）の膜抽出物を調製するため、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）細胞分画プロテオーム抽出キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した（図１）。
【0154】
製造者の指示に従ってＢｉｏＲａｄのＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、膜抽出物を定量化した。膜タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって４～１２％ポリアクリルアミドゲル上に分離して、ニトロセルロース膜（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に移動させた。タンパク質を、ＴｆＲに対する１次抗体でプローブしてから（Ｇｅｎｅｔｅｘ ＧＴＸ１０２５９６；１／１０００）、１／１００００に希釈したＨＲＰ－コンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ２次抗体でプローブした（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。最後に、化学発光を使用してタンパク質を検出した。
【0155】
図１に示すように、ＴｆＲは、ラット、マウス、ブタ、及び非ヒト霊長類の消化及び未消化の脳微小血管にて発現する。また、ＴｆＲは、マウス、ラット及びブタの脳内皮細胞にて発現する（脳微小血管の１０μｇ又は５μｇに対して、脳微小血管内皮細胞ではたった１μｇの膜タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードしたことに留意）。ＴｆＲ発現は、ＮＨＰの消化脳微小血管において高まる。
【0156】
これらのデータは、ＴｆＲがインビボで適用する分子の設計において有効な標的に相当することを示す。
【0157】
＜実施例ＩＩ＞
ヒト及びマウスのＴｆＲを安定発現するＣＨＯ細胞株の作製
ＴｆＲ結合ＶＨＨの同定及び特性評価の必要条件は、恒常的且つ高速にｈＴｆＲ及びｍＴｆＲを発現する安定的な細胞株の真核生物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＨＯ）における株化であった。これらの細胞株を、ｉ）その自然の構成において、細胞表面に発現する受容体に結合する薬剤の同定及び特性評価、及びｉｉ）受容体がそうした薬剤をエンドサイトーシスによって内在化できるかの試験に使用した。
ヒト及びマウスのＴｆＲを安定発現するＣＨＯ細胞株の作製
ＴｆＲ結合ＶＨＨの同定及び特性評価の必要条件は、恒常的且つ高速にｈＴｆＲ及びｍＴｆＲを発現する安定的な細胞株の真核生物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＨＯ）における株化であった。これらの細胞株を、ｉ）その自然の構成において、細胞表面に発現する受容体に結合する薬剤の同定及び特性評価、及びｉｉ）受容体がそうした薬剤をエンドサイトーシスによって内在化できるかの試験に使用した。
【0158】
これらの細胞株の作製のため、データベースで利用可能な配列情報（受託番号ＮＭ＿００３２３４．３）を使用して、ｈＴｆＲをコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＲＴ－ＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅に必要なプライマーを選択し（以下の表を参照）、これは、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）におけるクローニングに必要な制限部位（ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ）をその末端に含む（太字）（図２－Ａ）。
【表1】
【0159】
ヒトの脳から調製した全ＲＮＡを、ｈＴｆＲをコードするｃＤＮＡフラグメントのＲＴ－ＰＣＲ増幅に使用した。増幅後、ＰＣＲ産生物をＥｃｏＲＩ－ＳａｌＩ制限酵素によって消化し、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にライゲーションし、同じ制限酵素によって消化した。真核生物細胞に遺伝子導入した後、このベクターにより、そのＮ末端において、すなわちその細胞内ドメインの末端においてＥＧＦＰに融合したｈＴｆＲがＣＭＶプロモーターの制御下において発現可能となる。コンピテントな大腸菌ＤＨ５α細菌を形質転換し、単離コロニーを得て、プラスミドＤＮＡを調製した後、検証のため、コンストラクトの両鎖を完全にシーケンシングした。
【0160】
ＥＧＦＰに融合したｍＴｆＲをコードするプラスミドを、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（プラスミド参照番号：ＥＸ－Ｍｍ０５８４５－Ｍ２９）から購入した。
【0161】
ＣＨＯ－Ｋ１細胞に一時的に遺伝子導入し、限界希釈及び抗生剤（Ｇ４１８）に対する抵抗によって安定的な遺伝子導入体を選択することに使用した。これらの細胞株を、選択圧力を維持しながら増幅した。
【0162】
Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートトランスフェリン（Ｔｆ－Ａｌｅｘａ６４７）を使用して固定（ＰＦＡ）細胞株における免疫細胞化学法を行った後に撮影した共焦点顕微鏡写真により、図２－Ｂにおいて、ＥＧＦＰ（緑色）とＴｆ－Ａｌｅｘａ６４７（赤色）とが共に局在化し、ゆえに良好に発現すること及び受容体が機能的結合することを確認する。
【0163】
予想されたサイズの受容体が膜に発現することを、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ細胞分画プロテオーム抽出キットで抽出した細胞膜においてウエスタンブロットによって確認した。抗体をＧＦＰ又はＴｆＲに対して作製した。ＥＧＦＰとｈ／ｍＴｆＲとを合わせたサイズ（１７０ｋＤａ）に対応するタンパク質を、抗ＧＦＰ抗体及び抗ＴｆＲ抗体によって認識した（図２－Ｃ）。ＣＨＯ Ｋ１野生型（ＷＴ）細胞株を負のコントロールとして使用し、抗体はタンパク質を検出しなかった。
【0164】
これらのデータにより、ＣＨＯ細胞株の細胞表面における機能的受容体の発現を確認した。
【0165】
＜実施例ＩＩＩ＞
ＴｆＲを結合するＶＨＨの生成
ラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）を、対象のヒト及びマウス受容体を発現する安定ＣＨＯ細胞株の膜調製物で４回皮下において免疫した。上述のようにＶＨＨライブラリ作製を行った（Ａｌｖａｒｅｚ－Ｒｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｅｈａｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。短時間で、ＶＨＨをコードするｍＲＮＡを、フィコール密度勾配によって単離した末梢血単核細胞の全ＲＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅して、ｐＨＥＮ１ファージミドにクローニングした。反復選択により、細胞表面に発現するＴｆＲに強力な親和性を示すＶＨＨを提示するファージを単離できた。
ＴｆＲを結合するＶＨＨの生成
ラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）を、対象のヒト及びマウス受容体を発現する安定ＣＨＯ細胞株の膜調製物で４回皮下において免疫した。上述のようにＶＨＨライブラリ作製を行った（Ａｌｖａｒｅｚ－Ｒｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｅｈａｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。短時間で、ＶＨＨをコードするｍＲＮＡを、フィコール密度勾配によって単離した末梢血単核細胞の全ＲＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅して、ｐＨＥＮ１ファージミドにクローニングした。反復選択により、細胞表面に発現するＴｆＲに強力な親和性を示すＶＨＨを提示するファージを単離できた。
【0166】
全部で、７００を超えるクローンを、ＴｆＲに結合する能力についてスクリーニングし、約１００のクローンをシーケンシングした。
【0167】
結合特性（マウス及びヒトの両方の細胞株に対する）、細胞浸透特性、及び輸送特性が向上したＶＨＨを得た。例のＶＨＨは、ＶＨＨ Ａ、ＶＨＨ Ｂ、ＶＨＨ Ｃ、ＶＨＨ Ｄである（配列リストも参照）。これらのＶＨＨは、コントロールＣＨＯ細胞株の細胞に結合しない。
【0168】
さらに、適切な、向上した結合特性を有するＴｆＲ結合ＶＨＨを、部位特異的突然変異誘発によって生成した。より具体的には、ＶＨＨ Ａの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、及び３に１つのアラニン置換を導入するように、部位特異的突然変異誘発を行い、ＶＨＨ Ａ１～Ａ９を生じた。ＶＨＨ Ａ１及びＡ２はＣＤＲ１において、ＶＨＨ Ａ３及びＡ４はＣＤＲ２において、ＶＨＨ Ａ５～Ａ９はＣＤＲ３において突然変異させた。さらにまた、一部のＣＤＲアミノ酸を構造的に近いアミノ酸で置換することで、１つの部位特異的突然変異誘発を行った。ＶＨＨ Ａ１０～Ａ１９が得られ、ＶＨＨ Ａ１０及びＡ１１はＣＤＲ１において、ＶＨＨ Ａ１２～Ａ１４はＣＤＲ２において、ＶＨＨ Ａ１５～Ａ１９はＣＤＲ３において突然変異させた。
【0169】
さらに、ヒト化ＴｆＲ結合ＶＨＨを、例えば、免疫原性を回避することによってインビボでの有効性を向上させるため生成し、ＶＨＨ Ａ２０～Ａ２５とした。
【0170】
さらに、精製及び／又はカップリングをしやすくするため、タグ付きＶＨＨ分子を作製した。
【0171】
これらの各ＶＨＨのアミノ酸配列を配列表に記載する。
【0172】
＜実施例ＩＶ＞
本発明の精製ＶＨＨの結合及びエンドサイトーシス
選択したＶＨＨ分子のＴｆＲに結合する能力、及びエンドサイトーシスされる能力を確認するため、マウス抗－ｃＭｙｃ１次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、その後のＡｌｅｘａ５９４－コンジュゲートロバ抗マウス２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して検出される、ＥＧＦＰに融合するＴｆＲを発現するＣＨＯ生細胞株におけるＶＨＨのインキュベーションに関わる免疫細胞化学的実験を行って、共焦点顕微鏡で観察した。ＶＨＨ Ａによって得られた結果を例として示す。
本発明の精製ＶＨＨの結合及びエンドサイトーシス
選択したＶＨＨ分子のＴｆＲに結合する能力、及びエンドサイトーシスされる能力を確認するため、マウス抗－ｃＭｙｃ１次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、その後のＡｌｅｘａ５９４－コンジュゲートロバ抗マウス２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して検出される、ＥＧＦＰに融合するＴｆＲを発現するＣＨＯ生細胞株におけるＶＨＨのインキュベーションに関わる免疫細胞化学的実験を行って、共焦点顕微鏡で観察した。ＶＨＨ Ａによって得られた結果を例として示す。
【0173】
図３に示すように、ＶＨＨは、ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ（図３－Ｂ）及びＣＨＯ－ｍＴｆＲ－ＥＧＦＰ（図３－Ａ）細胞株に結合し、トリトン透過処理を使用して示すように、エンドサイトーシスによって取り込まれて細胞内に蓄積し、これはコントロールＶＨＨ（ＶＨＨ Ｚ）ではそうではない（図３－Ｃ、図３－Ｄ）。
【0174】
＜実施例Ｖ＞
結合親和性の測定
フローサイトメトリーを使用して、ＴｆＲに対する親和性を有するＶＨＨの結合特性を試験し、見かけの親和性（Ｋｄ ａｐｐ）を測定した。９６ウェルプレートにおいて、２－３×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを用いて、４℃で振とうさせながら、すべての実験を行った。ＥＧＦＰに融合するＴｆＲを発現するＣＨＯ細胞株、又はＣＨＯ野生型細胞は、非特異的結合を退けるため、ＰＢＳ／ＢＳＡ２％溶液で３０分間飽和させ、その後、２μＭ～１ｐＭの範囲の濃度の精製ＶＨＨとともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡ２％内での１回の洗浄後、細胞を、抗６Ｈｉｓタグ抗体（マウス）とともに１時間インキュベートし、ＰＢＳ／ＢＳＡ２％で２回洗浄し、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス２次抗体とともに４５分間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡ２％内での最後の２回の洗浄後、細胞を、ＰＢＳ／ＰＦＡ２％で１５分間のインキュベーションによって、固定するか又は固定せず、ＰＢＳで１回洗浄して、最後にＰＢＳに再懸濁した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）又はＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、蛍光レベルを評価した。
結合親和性の測定
フローサイトメトリーを使用して、ＴｆＲに対する親和性を有するＶＨＨの結合特性を試験し、見かけの親和性（Ｋｄ ａｐｐ）を測定した。９６ウェルプレートにおいて、２－３×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを用いて、４℃で振とうさせながら、すべての実験を行った。ＥＧＦＰに融合するＴｆＲを発現するＣＨＯ細胞株、又はＣＨＯ野生型細胞は、非特異的結合を退けるため、ＰＢＳ／ＢＳＡ２％溶液で３０分間飽和させ、その後、２μＭ～１ｐＭの範囲の濃度の精製ＶＨＨとともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡ２％内での１回の洗浄後、細胞を、抗６Ｈｉｓタグ抗体（マウス）とともに１時間インキュベートし、ＰＢＳ／ＢＳＡ２％で２回洗浄し、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス２次抗体とともに４５分間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡ２％内での最後の２回の洗浄後、細胞を、ＰＢＳ／ＰＦＡ２％で１５分間のインキュベーションによって、固定するか又は固定せず、ＰＢＳで１回洗浄して、最後にＰＢＳに再懸濁した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）又はＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、蛍光レベルを評価した。
【0175】
細胞をコントロールＶＨＨ（ＶＨＨ Ｚ）とともにインキュベートしたコントロール条件では、非特異的標識は存在しなかった。試験したすべてのＶＨＨは、信号の濃度依存的変化をもたらし、対象の受容体に対する結合を確認した（図４－Ａ）。ＣＨＯ野生型コントロール細胞の標識は、試験したすべてのＶＨＨで検出しなかった（図示せず）。ＶＨＨのＫｄ ａｐｐは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した（図４－Ｂ）。Ｋｄ ａｐｐは、すべてのＶＨＨで同じ範囲にあり、これは、ｍＴｆＲにおいて７．５ｎＭ（ＶＨＨ Ｂ）から５６ｎＭ（ＶＨＨ Ｄ）、及びｈＴｆＲにおいて１．６ｎＭ（ＶＨＨ Ｂ）から２．７ｎＭ（ＶＨＨ Ａ）の範囲であった。
【0176】
＜実施例ＶＩ＞
ＴｆＲに親和性を有する精製ＶＨＨと天然リガンドとの競合アッセイ
選択したＶＨＨが、受容体に結合するために、ＴｆＲ天然リガンドのトランスフェリン（Ｔｆ）と競合する能力を評価するため、フローサイトメトリー実験を使用して競合アッセイを行った。第１ステップにおいて、希釈系列の競合物を、ＥＧＦＰに融合した対象の受容体を発現するＣＨＯ細胞において４℃で１時間インキュベートした。次に、ＥＣ９０のトレーサーを添加し、さらに１時間インキュベートし、適切な顕色系で検出した（図５）。
ＴｆＲに親和性を有する精製ＶＨＨと天然リガンドとの競合アッセイ
選択したＶＨＨが、受容体に結合するために、ＴｆＲ天然リガンドのトランスフェリン（Ｔｆ）と競合する能力を評価するため、フローサイトメトリー実験を使用して競合アッセイを行った。第１ステップにおいて、希釈系列の競合物を、ＥＧＦＰに融合した対象の受容体を発現するＣＨＯ細胞において４℃で１時間インキュベートした。次に、ＥＣ９０のトレーサーを添加し、さらに１時間インキュベートし、適切な顕色系で検出した（図５）。
【0177】
ＴｆＲ結合ＶＨＨをトレーサー（図５－Ｂ）及び競合物（図５－Ｃ）として使用した。すべての条件において、ＶＨＨとリガンドＴｆとの間に競合は存在せず、ＶＨＨがＴｆのものとは異なるエピトープでＴｆＲに結合することを示唆した。
【0178】
＜実施例ＶＩＩ＞
ＶＨＨ Ａ１～Ａ１９の結合親和性の測定
フローサイトメトリーを使用して、ＴｆＲに対するＶＨＨ Ａ１～Ａ１９の結合特性を試験し、見かけの親和性（Ｋｄ ａｐｐ）を測定した。９６ウェルプレートにおいて、２×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを用いて、４℃で振とうさせながら、すべての実験を行った。ＥＧＦＰに融合したｈＴｆＲ若しくはｍＴｆＲを安定的に発現するＣＨＯ細胞株、又はＣＨＯ野生型細胞は、非特異的結合を退けるため、ＰＢＳ／ＢＳＡ２％溶液で３０分間飽和させ、その後、５０μＭ～５ｐＭの範囲の濃度の精製ＶＨＨとともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡ２％内での１回の洗浄後、細胞を、抗６Ｈｉｓタグ抗体（マウス）とともに１時間インキュベートし、ＰＢＳ／ＢＳＡ２％で２回洗浄し、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス２次抗体とともに４５分間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡ２％内での最後の２回の洗浄後、細胞を、ＰＢＳ／ＰＦＡ２％で１５分間のインキュベーションによって固定し、ＰＢＳで１回洗浄して、最後にＰＢＳに再懸濁し、４℃で保管した。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、蛍光レベルを評価した。
ＶＨＨ Ａ１～Ａ１９の結合親和性の測定
フローサイトメトリーを使用して、ＴｆＲに対するＶＨＨ Ａ１～Ａ１９の結合特性を試験し、見かけの親和性（Ｋｄ ａｐｐ）を測定した。９６ウェルプレートにおいて、２×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを用いて、４℃で振とうさせながら、すべての実験を行った。ＥＧＦＰに融合したｈＴｆＲ若しくはｍＴｆＲを安定的に発現するＣＨＯ細胞株、又はＣＨＯ野生型細胞は、非特異的結合を退けるため、ＰＢＳ／ＢＳＡ２％溶液で３０分間飽和させ、その後、５０μＭ～５ｐＭの範囲の濃度の精製ＶＨＨとともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡ２％内での１回の洗浄後、細胞を、抗６Ｈｉｓタグ抗体（マウス）とともに１時間インキュベートし、ＰＢＳ／ＢＳＡ２％で２回洗浄し、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス２次抗体とともに４５分間インキュベートした。ＰＢＳ／ＢＳＡ２％内での最後の２回の洗浄後、細胞を、ＰＢＳ／ＰＦＡ２％で１５分間のインキュベーションによって固定し、ＰＢＳで１回洗浄して、最後にＰＢＳに再懸濁し、４℃で保管した。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、蛍光レベルを評価した。
【0179】
ＶＨＨ Ａ１～Ａ１９はすべて、両細胞株において信号の濃度依存的変化をもたらし（ＶＨＨ Ａ１２を除く）、対象の受容体に対するその有効な結合を確認した（図１１、図１２）。ＶＨＨ Ａ、ＶＨＨ Ａ１～Ａ４、及びＶＨＨ Ａ１０～Ａ１５が、ｈＴｆＲ及びｍＴｆＲ発現細胞株の両方において同様のＢｍａｘ（曲線のプラトー）を示す一方、ＶＨＨ Ａ６～Ａ９、及びＶＨＨ Ａ１６～Ａ１９は、両方の細胞株においてわずかに低いものから大きく低いＢｍａｘまで示し、またわずかな曲線変化から大きな曲線変化まで示した。ＶＨＨ Ａ１２のみが、他のＶＨＨ Ａｘと比較して、ｈＴｆＲ発現細胞株において、より低いＢｍａｘ及び大きい曲線変化を示した。ＣＨＯ野生型コントロール細胞の標識は、試験したすべてのＶＨＨで検出しなかった（図示せず）。
【0180】
ＶＨＨのＫｄ ａｐｐは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した（図１１－Ｂ、図１２－Ｂ）。ヒトＴｆＲへの結合に関して、ＶＨＨ Ａ、Ａ１～Ａ４、Ａ６、Ａ９～Ａ１１、及びＡ１３～Ａ１７はすべて、約３～４ｎＭという同様のＫｄ ａｐｐを示した。その反面、ＶＨＨ Ａ５、Ａ８、Ａ１８、及びＡ１９は、９．２～２５ｎＭという、わずかに低い親和性を示す一方、ＶＨＨ Ａ７及びＡ１２はそれぞれ、２５５ｎＭ及び３６３ｎＭという、大きく低い親和性を示した。
【0181】
マウスＴｆＲへの結合に関して、ＶＨＨ Ａ及びＡ９は、約５０ｎＭという同様のＫｄ ａｐｐを示した。他のすべてのＶＨＨ Ａは、１３１～２５９ｎＭという、わずかに低い親和性を示し、それぞれ６０４ｎＭ、４２７ｎＭ及び４１６ｎＭという、顕著に低い親和性を示すＶＨＨ Ａ５、Ａ８、及びＡ１８は例外である。
【0182】
＜実施例ＶＩＩＩ＞
ＴｆＲに親和性を有する精製ＶＨＨ－Ｆｃ融合分子の結合及びエンドサイトーシス、並びに親和性測定
本発明の抗ＴｆＲＶＨＨ分子をＩｇＧＦｃフラグメントに融合した。融合タンパク質を作製するため、ＶＨＨをコードするＤＮＡフラグメント（タグなし）をＰＣＲによって増幅して、そのＮ末端又はＣ末端にＶＨＨを含むヒトＩｇＧ１－Ｆｃフラグメントをコードするように、ｐＩＮＦＵＳＥ－ＩｇＧ１－Ｆｃ２ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）にクローニングした。製造者の指示に従ってＥｘｐｉ２９３（登録商標）発現系を使用して（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、融合タンパク質を調製した。遺伝子導入後７２時間で、上清を回収して、タンパク質Ａ ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。自社製の抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡを使用して精製融合タンパク質を定量化した。
ＴｆＲに親和性を有する精製ＶＨＨ－Ｆｃ融合分子の結合及びエンドサイトーシス、並びに親和性測定
本発明の抗ＴｆＲＶＨＨ分子をＩｇＧＦｃフラグメントに融合した。融合タンパク質を作製するため、ＶＨＨをコードするＤＮＡフラグメント（タグなし）をＰＣＲによって増幅して、そのＮ末端又はＣ末端にＶＨＨを含むヒトＩｇＧ１－Ｆｃフラグメントをコードするように、ｐＩＮＦＵＳＥ－ＩｇＧ１－Ｆｃ２ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）にクローニングした。製造者の指示に従ってＥｘｐｉ２９３（登録商標）発現系を使用して（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、融合タンパク質を調製した。遺伝子導入後７２時間で、上清を回収して、タンパク質Ａ ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。自社製の抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡを使用して精製融合タンパク質を定量化した。
【0183】
共焦点顕微鏡で撮影される、Ａｌｅｘａ５９４－コンジュゲート抗ｈＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して検出される、生細胞におけるＶＨＨ－Ｆｃ融合タンパク質のインキュベーションに関わる、ＥＧＦＰに融合するＴｆＲを発現するＣＨＯ細胞株における免疫細胞化学的実験を行って、融合タンパク質が標的の対象受容体に結合する能力を確認した。
【0184】
本発明のコンジュゲートが細胞に結合してエンドサイトーシスされることができるということを、この結果は示している（図７）。細胞におけるコントロールＶＨＨ－Ｆｃコンジュゲート（ＶＨＨ Ｚ－Ｆｃ）の結合は観察されず、この相互作用の特異性を示した。
【0185】
ＴｆＲに親和性を有するＶＨＨ－Ｆｃ及びＦｃ－ＶＨＨ融合タンパク質の結合特性を、フローサイトメトリー実験において試験し、見かけの親和性（Ｋｄ ａｐｐ）を測定した。９６ウェルプレートにおいて、２－３×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを用いて、４℃で振とうさせながら、すべての実験を行った。ＥＧＦＰに融合する対象の受容体を発現するＣＨＯ細胞株、又はＣＨＯ野生型細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ２％で飽和させ、その後、３５０ｎＭ～０.０３ｐＭの範囲の濃度の精製ＶＨＨ－Ｆｃ又はＦｃ－ＣＨＨとともに１時間インキュベートした。洗浄後、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗ｈＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに、細胞を１時間インキュベートした。最後に３回洗浄し、細胞をＰＢＳに再懸濁した後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して蛍光を直ちに測定し、結果をＭＡＣＳＱｕａｎｔソフトウェアで分析した。
【0186】
すべてのＶＨＨ－Ｆｃ及びＦｃ－ＶＨＨ融合タンパク質は、信号の濃度依存的変化をもたらし、対象の受容体に対する結合を確認した。ＶＨＨ－Ｆｃ及びＦｃ－ＶＨＨのＫｄ ａｐｐは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した（図８－Ｂ）。ほぼすべてのＶＨＨのＫｄ ａｐｐは、Ｆｃフラグメントとのコンジュゲートにより大幅に向上し、Ｋｄ ａｐｐはＴｆＲ結合ＶＨＨ－Ｆｃ及びＦｃ－ＶＨＨにおいて０．４４ｎＭ～５１ｎＭの範囲であった。
【0187】
＜実施例ＩＸ＞
インビトロのＢＢＢモデルにおける本発明のＶＨＨのエンドサイトーシス及び輸送
ラット又はマウスの脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）及びラット又はマウスの星状膠細胞を使用し、共培養モデルを設定した。ＢＭＥＣを横断する数多くの分子、とりわけ薬理的物質の受動通過又は能動輸送を評価し、外挿法によってインビボでＣＮＳ組織に達するその能力を評価するため、この種類のインビトロＢＢＢモデルを使用した。現在開発されている様々なモデル（ウシ、ブタ、ネズミ、ヒト）は、脳内皮特有の超微細構造特性、とりわけ密着結合、開窓がないこと、親水性分子に対する透過性が低いこと、及び高い電気抵抗を有する。さらに、これらのモデルは、ＢＢＢを横断するその特性についてインビトロとインビボとで評価を行った種々の分子に対して取得した測定結果間における確かな相関性を示している。現在のところ、取得したすべてのデータは、これらのインビトロＢＢＢモデルが、細胞培養実験に関連する有利性を保持しながらも、インビボに存在する細胞環境における複雑性のいくつかを再現することで、インビボの状態を模倣することを示す。
インビトロのＢＢＢモデルにおける本発明のＶＨＨのエンドサイトーシス及び輸送
ラット又はマウスの脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）及びラット又はマウスの星状膠細胞を使用し、共培養モデルを設定した。ＢＭＥＣを横断する数多くの分子、とりわけ薬理的物質の受動通過又は能動輸送を評価し、外挿法によってインビボでＣＮＳ組織に達するその能力を評価するため、この種類のインビトロＢＢＢモデルを使用した。現在開発されている様々なモデル（ウシ、ブタ、ネズミ、ヒト）は、脳内皮特有の超微細構造特性、とりわけ密着結合、開窓がないこと、親水性分子に対する透過性が低いこと、及び高い電気抵抗を有する。さらに、これらのモデルは、ＢＢＢを横断するその特性についてインビトロとインビボとで評価を行った種々の分子に対して取得した測定結果間における確かな相関性を示している。現在のところ、取得したすべてのデータは、これらのインビトロＢＢＢモデルが、細胞培養実験に関連する有利性を保持しながらも、インビボに存在する細胞環境における複雑性のいくつかを再現することで、インビボの状態を模倣することを示す。
【0188】
例えば、インビトロのラットＢＢＢモデルは、ＢＭＥＣ及び星状膠細胞の共培養を利用する（Ｍｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．８８，ｅ５１２７８）。細胞培養の前に、ＢＭＥＣの接着性を最適にし、基底膜の状態を作るため、膜インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、９６ウェルプレート又は１２ウェルプレートにおいて１．０μｍの有孔性）を、その上部においてＩＶ型コラーゲン及びフィブロネクチンで処理した。混合星状膠細胞の初代培養物を、新生仔のラット大脳皮質から得た。短時間で、髄膜を取り除いて、皮質小片を機械的に解離し、その後トリプシン溶液内で酵素的に解離させた。解離させた細胞を、細胞培養フラスコ内において、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭを含有するグリア細胞培地（ＧＣＭ）内に播種し、後に使用するため液体窒素内で凍結した。ＢＭＥＣの初代培養物を、５～６週齢のウィスターラットから調製した。短時間で、皮質小片を機械的に解離し、その後コラゲナーゼ／ディスパーゼ溶液内で酵素的に解離させた。消化した組織を、２５％ウシ血清アルブミン内で密度依存性遠心分離によって分離した。微小血管のペレットを、事前にＩＶ型コラーゲン及びフィブロネクチン被覆した培養フラスコにおいて、２０％ウシ乏血小板血漿由来血清及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）２ｎｇ／ｍｌを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２を含有する内皮細胞培地（ＥＣＭ）内に播種した。共培養確立の５日前に、星状膠細胞を解凍して、１２ウェルプレート又は９６ウェルプレートにプレーティングした（反管腔側コンパートメント）。そして、共培養におけるフィルターの上部面にＢＭＥＣを分布させた（管腔側コンパートメント）。これらの条件下で、インビトロモデルが分化し、３日内に接合部関連タンパク質を発現して、さらに３日間最適に分化を維持した。
【0189】
ＢＢＢにおける、ＩｇＧ１抗体のヒトＦｃフラグメントにコンジュゲートした本発明のＶＨＨ（ＶＨＨ－Ｆｃ）の結合／取り込みを、上述のインビトロのラットモデルにおいて検証した（図９）。ＶＨＨ Ａ－Ｆｃ又はＶＨＨ Ｂ－Ｆｃを、Ｔｆ－Ａｌｅｘａ６４７とともに、生細胞ｒＢＭＥＣ単層において３７℃で２時間、共にインキュベートした（図９Ａ）。このように共にインキュベートした後、細胞単層を十分洗浄し、ＰＦＡ４％で固定した。細胞単層を、０．１％トリトンＸ－１００溶液で透過処理した。ヒトＦｃフラグメントに対する抗体による免疫染色を使用して、ＶＨＨ－Ｆｃを検出した。そして、Ｔｆ－Ａ６４７とＶＨＨ Ａ－Ｆｃ又はＶＨＨ Ｂ－Ｆｃの蛍光信号が共に局在化することを評価するため、共焦点顕微鏡観察を用いた（図９Ａ）。
【0190】
結果は、このように２時間共にインキュベートした後、ＶＨＨ Ａ－Ｆｃ又はＶＨＨ Ｂ－Ｆｃは即座にエンドサイトーシスされ、ほぼ完全にＴｆ－Ａｌｅｘａ６４７と共に局在化した。
【0191】
異なるＴｆＲリガンドと共に局在化するというこの分析（ＶＨＨ Ａ－Ｆｃ、ＶＨＨ Ｂ－Ｆｃ、及びＴｆ－Ａ６４７）は、その標的受容体に対する本発明のＶＨＨの特異性を裏付けた。
【0192】
ｒＢＭＥＣ単層を横断して反管腔側コンパートメントに輸送するため、ＶＨＨ－Ｆｃを、培養系の管腔側コンパートメントにおいて１０ｎＭで２４時間から７２時間インキュベートした（図９－Ｃ、図９－Ｄ）。実験前に、ｒＢＭＥＣ単層を含有するフィルターインサートを、新しい輸送バッファー（管腔側コンパートメントにおいて７５μｌ、及び反管腔側コンパートメントにおいて２５０μｌ）を含有する９６ウェルプレートに配置した。インビトロにおけるＢＢＢの完全性、及び内皮細胞に対して毒性がないことを評価するため、ＶＨＨ－Ｆｃを、ＢＢＢを横断しない蛍光性低分子であるルシファーイエロー（ＬＹ）と共にインキュベートした。インキュベーションの２４時間後、インサートを、さらなる４８時間の間隔を得るため、新しい輸送バッファーを含有する別の９６ウェルプレートに移した。輸送の終わりに、反管腔側コンパートメントに蓄積したＬＹを蛍光分光光度法によって定量化し、結果を１０－３ｃｍ／ｍｉｎにおける内皮表面透過性（又はＰｅ）として表した。ＬＹのＰｅ値が０．６×１０－３ｃｍ／ｍｉｎより大きい場合、インビトロのバリアは「透過性」又は「解放」と考えられた。また、オーム計によって測定し、ｏｈｍ．ｃｍ２で表される経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）も、ＢＢＢを横断する通過試験時にインビトロにおけるＢＢＢ完全性を測定することができる。品質しきい値を＞４００ｏｈｍ．ｃｍ２に設定する。行った実験は、ＶＨＨ－Ｆｃに毒性のないこと、及びＢＢＢの透過特性において有害な作用のないことを示す（図示せず）。インプット（Ｔ０）における本発明のＶＨＨ－ＦｃのＦｃフラグメント、輸送実験の終わりにおける管腔側コンパートメント（Ｔ７２、産生物回収）、及び反管腔側コンパートメント（２４時間及び＋４８時間の輸送間隔）の含有量を、自社製の抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡアッセイを０．５～５０フェムトモルの感度で使用して定量化した。吸光度単位をインサート毎フェムトモルに変換した（９６ウェルプレートのインサートおいて０．１４３ｃｍ２の表面積）。
【0193】
この結果は、ＶＨＨ Ｂ－Ｆｃ及びＶＨＨ Ａ－ＦｃコンジュゲートがＶＨＨ Ｚ－Ｆｃ（負のコントロール）より、２４時間で約１０倍、及び７２時間で５倍多く輸送されることを示す。この輸送は、２４時間～７２時間で明らかな飽和に達し、特異性で飽和性の受容体媒介プロセスの関与をさらに示唆した（図９－Ｄ）。
【0194】
＜実施例Ｘ＞
インビボにおけるＶＨＨ－Ｆｃコンジュゲートの薬物動態的取り込み及び器官への取り込み
インビボにおいて対象の受容体が豊富な器官を標的とする本発明のＶＨＨ－Ｆｃコンジュゲートの可能性を評価するため、コンジュゲートＶＨＨ Ａ－Ｆｃ、ＶＨＨ Ａ－Ｆｃ－Ａｇｌｙ、及びＶＨＨ Ｚ－Ｆｃを５ｍｇ／ｋｇで尾静脈に注射し、マウスを生理食塩水で様々な時間灌流した。血漿と脳とを採取した。脳を毛細血管枯渇法（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって処理して、脳実質を毛細血管から単離した。血漿、脳実質、及び微小血管におけるＶＨＨ－Ｆｃ量を、自社製の抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を濃度（ｎＭ）として、又は器官対血漿比によって示す（図１０）。
インビボにおけるＶＨＨ－Ｆｃコンジュゲートの薬物動態的取り込み及び器官への取り込み
インビボにおいて対象の受容体が豊富な器官を標的とする本発明のＶＨＨ－Ｆｃコンジュゲートの可能性を評価するため、コンジュゲートＶＨＨ Ａ－Ｆｃ、ＶＨＨ Ａ－Ｆｃ－Ａｇｌｙ、及びＶＨＨ Ｚ－Ｆｃを５ｍｇ／ｋｇで尾静脈に注射し、マウスを生理食塩水で様々な時間灌流した。血漿と脳とを採取した。脳を毛細血管枯渇法（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって処理して、脳実質を毛細血管から単離した。血漿、脳実質、及び微小血管におけるＶＨＨ－Ｆｃ量を、自社製の抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡを用いて測定した。結果を濃度（ｎＭ）として、又は器官対血漿比によって示す（図１０）。
【0195】
ＴｆＲ結合コンジュゲートＶＨＨ Ａ－Ｆｃ及びＶＨＨ Ａ－Ｆｃ－Ａｇｌｙは、注射後２時間で有意な脳への標的化を示し、コントロールＶＨＨ Ｚ－Ｆｃでは０．０７ｎＭであるのに対して、それぞれＶＨＨ Ａ－Ｆｃ及びＶＨＨ Ａ－Ｆｃ－Ａｇｌｙでは脳実質において０．２５及び０．３２ｎＭの濃度である（図１０－Ｂ）。実質対血漿比を見ると、特に、ＶＨＨ Ａ－Ｆｃ－Ａｇｌｙがなお脳実質において測定可能である一方、血漿では８ｎＭが存在するのみである、注射後２４時間において明らかな有利性が認められる。微小血管では、ＶＨＨ Ａ－Ｆｃ及びＶＨＨ Ａ－Ｆｃ－Ａｇｌｙは、注射後２時間においてＶＨＨ Ｚ－Ｆｃを有意に超えて蓄積し、それぞれ９倍及び５倍高い濃度である。さらに、微小血管におけるＶＨＨ Ａ－Ｆｃ濃度は、注射後２４時間においてなお、ＶＨＨ Ｚ－Ｆｃより３倍高い（図１０－Ｃ）。これらの結果は、微小血管対血漿比を見て確認した（図１０－Ｅ）。これらの結果は、本発明のＴｆＲ標的ＶＨＨが、有効に送達する、又は薬剤、とりわけタンパク質カーゴの薬物動態特性を向上させるために、使用可能であることを示す。
【0196】
＜実施例ＸＩ＞
ＶＨＨに融合した治療用抗体の設計及び作製
本発明の抗ＴｆＲ ＶＨＨ Ａ、Ａ１、Ａ５、Ａ６、Ａ７、及びＡ８（タグなし）を、βアミロイドペプチドのプロトフィブリル形態に高特異的親和性を有するマウスＩｆＧ１ １３Ｃ３モノクローナル抗体と融合させた（ＷＯ２００９／０６５０５４）。１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ融合タンパク質を作製するため、選択したＶＨＨをコードするＤＮＡフラグメントを合成し、抗体重鎖Ｃ末端アミノ酸残基に融合させた、選択したＶＨＨ配列をそのＣ末端に含む１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨコンジュゲートをコードするように、１３Ｃ３重鎖（ＨＣ）ベクターにクローニングした。別の実験一式では、選択したＶＨＨをコードするＤＮＡフラグメントを、抗体軽鎖Ｃ末端アミノ酸残基に融合させた、選択したＶＨＨ配列をそのＣ末端に含む１３Ｃ３ ＬＣ ＶＨＨコンジュゲートをコードするように、１３Ｃ３軽鎖（ＬＣ）ベクターにクローニングした。
ＶＨＨに融合した治療用抗体の設計及び作製
本発明の抗ＴｆＲ ＶＨＨ Ａ、Ａ１、Ａ５、Ａ６、Ａ７、及びＡ８（タグなし）を、βアミロイドペプチドのプロトフィブリル形態に高特異的親和性を有するマウスＩｆＧ１ １３Ｃ３モノクローナル抗体と融合させた（ＷＯ２００９／０６５０５４）。１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ融合タンパク質を作製するため、選択したＶＨＨをコードするＤＮＡフラグメントを合成し、抗体重鎖Ｃ末端アミノ酸残基に融合させた、選択したＶＨＨ配列をそのＣ末端に含む１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨコンジュゲートをコードするように、１３Ｃ３重鎖（ＨＣ）ベクターにクローニングした。別の実験一式では、選択したＶＨＨをコードするＤＮＡフラグメントを、抗体軽鎖Ｃ末端アミノ酸残基に融合させた、選択したＶＨＨ配列をそのＣ末端に含む１３Ｃ３ ＬＣ ＶＨＨコンジュゲートをコードするように、１３Ｃ３軽鎖（ＬＣ）ベクターにクローニングした。
【0197】
製造者の指示に従ってＥｘｐｉ２９３発現系を使用して（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、融合タンパク質を作製した。遺伝子導入後７２時間で、上清を回収して、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）タンパク質Ｇ高性能カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。２８０ｎｍ吸光度測定を使用して精製融合タンパク質を定量化した。
【0198】
１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨＡコンジュゲートのアミノ酸配列を配列番号９３として示す。
〔ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＲＰＧＶＳＶＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＫＱＳＨＡＫＳＬＥＷＩＧＶＩＳＴＫＹＧＫＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＭＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＡＲＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＡＲＧＤＤＧＹＳＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ〕（ＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧ〔ＧＧＧＧ〕）［ＭＡ］ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳＧＴＤＦＳＩＮＦＩＲＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＧＦＴＡＴＧＮＴＮＹＡＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＹＬＱＩＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＬＤＫＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［ＡＡＡ］
亀甲括弧は１３Ｃ３可変重鎖配列であり、丸括弧は１３Ｃ３定常重鎖配列であり、亀甲括弧及び丸括弧はＧｌｙリンカーであり、角括弧のＭＡ及びＣ末端ＡＡＡ残基はクローニング由来であり、任意で取り除くことができる。残りの部分はＶＨＨである。
〔ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＲＰＧＶＳＶＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＫＱＳＨＡＫＳＬＥＷＩＧＶＩＳＴＫＹＧＫＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＭＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＡＲＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＡＲＧＤＤＧＹＳＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ〕（ＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧ〔ＧＧＧＧ〕）［ＭＡ］ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳＧＴＤＦＳＩＮＦＩＲＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＧＦＴＡＴＧＮＴＮＹＡＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＹＬＱＩＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＬＤＫＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［ＡＡＡ］
亀甲括弧は１３Ｃ３可変重鎖配列であり、丸括弧は１３Ｃ３定常重鎖配列であり、亀甲括弧及び丸括弧はＧｌｙリンカーであり、角括弧のＭＡ及びＣ末端ＡＡＡ残基はクローニング由来であり、任意で取り除くことができる。残りの部分はＶＨＨである。
【0199】
１３Ｃ３－ＬＣ－ＶＨＨＡコンジュゲートのアミノ酸配列を配列番号９４として示す。
〔ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＧＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＮＴＦＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫ〕ＬＥＩＫＲ（ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ〔ＳＧＳＧＧＧＧＧ〕）［ＭＡ］ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳＧＴＤＦＳＩＮＦＩＲＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＧＦＴＡＴＧＮＴＮＹＡＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＹＬＱＩＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＬＤＫＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［ＡＡＡ］
亀甲括弧は１３Ｃ３可変カッパ軽鎖配列であり、ＦＧＧＧＴＫはＪ領域であり、ＬＥＩＫＲは複数のクローニング部位であり、丸括弧は１３Ｃ３定常カッパ軽鎖配列であり、亀甲括弧及び丸括弧はＧｌｙリンカーであり、角括弧のＭＡ及びＣ末端ＡＡＡ残基はクローニング由来であり、任意で取り除くことができる。残りの部分はＶＨＨである。
〔ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＧＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＮＴＦＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫ〕ＬＥＩＫＲ（ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ〔ＳＧＳＧＧＧＧＧ〕）［ＭＡ］ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳＧＴＤＦＳＩＮＦＩＲＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡＧＦＴＡＴＧＮＴＮＹＡＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＡＶＹＬＱＩＤＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＭＬＤＫＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［ＡＡＡ］
亀甲括弧は１３Ｃ３可変カッパ軽鎖配列であり、ＦＧＧＧＴＫはＪ領域であり、ＬＥＩＫＲは複数のクローニング部位であり、丸括弧は１３Ｃ３定常カッパ軽鎖配列であり、亀甲括弧及び丸括弧はＧｌｙリンカーであり、角括弧のＭＡ及びＣ末端ＡＡＡ残基はクローニング由来であり、任意で取り除くことができる。残りの部分はＶＨＨである。
【0200】
結合親和性の測定
フローサイトメトリーを使用して、ＴｆＲに対する本発明の１３Ｃ３コンジュゲートの結合特性を試験し、見かけの親和性（Ｋｄ ａｐｐ）を測定した。すべての実験は、実施例ＶＩＩに記載するものと同じ条件で行い、１３Ｃ３コンストラクトを１５μＭ～７ｐＭの範囲の濃度でインキュベートし、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス抗体で検出した。
フローサイトメトリーを使用して、ＴｆＲに対する本発明の１３Ｃ３コンジュゲートの結合特性を試験し、見かけの親和性（Ｋｄ ａｐｐ）を測定した。すべての実験は、実施例ＶＩＩに記載するものと同じ条件で行い、１３Ｃ３コンストラクトを１５μＭ～７ｐＭの範囲の濃度でインキュベートし、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗マウス抗体で検出した。
【0201】
すべての１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ融合タンパク質は、ｈＴｆＲ及びｍＴｆＲ発現細胞株の両方において信号の濃度依存的変化をもたらし、受容体に対する結合を確認した（図１３）。すべての１３Ｃ３融合タンパク質は、同じｈＴｆＲ結合プロファイルを示し、わずかに低いＢｍａｘを示すＶＨＨ Ａ７融合物は例外であった。すべての融合タンパク質は、ｍＴｆＲにおいて異なる結合プロファイル示し、１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ１融合物は１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａよりも１／２倍低いＢｍａｘを示す一方、Ａ５～Ａ８の１３Ｃ３融合物は非常に低いＢｍａｘを示した。
【0202】
１３Ｃ３融合物のＫｄ ａｐｐは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した（図１３－Ｂ）。ｈＴｆＲに対する親和性は、約１０～２０ｎＭのＫｄ ａｐｐとして、すべての融合物で同様であった。Ｂｍａｘが異なる反面、ＶＨＨ Ａ、Ａ１、及びＡ６ １３Ｃ３ ＨＣ融合物は、１０～２０ｎＭという、同様の親和性を示す一方、１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ８及び１３Ｃ３－ＬＣ－ＶＨＨ Ａ融合物はそれぞれ、３１５ｎＭ及び１０６ｎＭという、低い親和性を示した。
【0203】
＜実施例ＸＩＩ＞
インビボにおける１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ及び１３Ｃ３－ＬＣ－ＶＨＨ融合物の脳への取り込み
抗体の脳への取り込みを促進する本発明のＶＨＨの可能性を評価するため、１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ及び１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ１コンジュゲート、又はベクター化していない１３Ｃ３を、３５ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇの用量でＣ５７Ｂｌ６マウスの尾静脈に注射した。マウスを生理食塩水で様々な時間灌流した。注射後（ｐ．ｉ．）２時間及び６時間の時点で脳を採取した。マウスの脳の半分を、毛細血管枯渇法によって脳実質から毛細血管網を単離するように処理し、これは、再懸濁した半分の脳のホモジネートの２０％デキストラン溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に対して遠心分離し、実質画分を回収することに基づく。マウスの脳の第２の半分を、全脳定量化のため直接処理（ホモジナイズ及び溶解）した。全脳及び脳実質における１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨコンジュゲートの量を、自社内認定のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）直接被覆（Ａβ）免疫測定法を使用して測定した。（ＣＶ＜２０％、及び回収±３０％）結果を濃度（ｎＭ）として示す（図１４）。
インビボにおける１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ及び１３Ｃ３－ＬＣ－ＶＨＨ融合物の脳への取り込み
抗体の脳への取り込みを促進する本発明のＶＨＨの可能性を評価するため、１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ及び１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ１コンジュゲート、又はベクター化していない１３Ｃ３を、３５ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇの用量でＣ５７Ｂｌ６マウスの尾静脈に注射した。マウスを生理食塩水で様々な時間灌流した。注射後（ｐ．ｉ．）２時間及び６時間の時点で脳を採取した。マウスの脳の半分を、毛細血管枯渇法によって脳実質から毛細血管網を単離するように処理し、これは、再懸濁した半分の脳のホモジネートの２０％デキストラン溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に対して遠心分離し、実質画分を回収することに基づく。マウスの脳の第２の半分を、全脳定量化のため直接処理（ホモジナイズ及び溶解）した。全脳及び脳実質における１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨコンジュゲートの量を、自社内認定のＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）直接被覆（Ａβ）免疫測定法を使用して測定した。（ＣＶ＜２０％、及び回収±３０％）結果を濃度（ｎＭ）として示す（図１４）。
【0204】
結果は、コントロールのベクター化していない１３Ｃ３抗体と比較して、ＴｆＲ結合コンジュゲート１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ及び１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ１が注射後２時間及び６時間で有意な脳への取り込みの有利性を示したことを表す（図１４－Ａ）。１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ及び１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ１の全脳濃度は８であり、それぞれ注射後６時間においてベクター化していない１３Ｃ３抗体のものより５倍重大である。
【0205】
１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ及び１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ１によるＢＢＢの横断は、注射後６時間で、微小毛細血管網を除いた脳実質において測定した濃度が、それぞれベクター化していない１３Ｃ３のものより１０倍及び９倍重大であるということから確認した。
【0206】
さらなる脳への取り込みにおける研究により、１３Ｃ３－ＨＣ－ＶＨＨ Ａ及び１３Ｃ３－ＬＣ－ＶＨＨ Ａ（軽鎖ベクター化タイプ）が７０ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇの用量でＢＢＢ横断を示し、実質への蓄積が注射後４時間においてベクター化していない１３Ｃ３抗体よりもそれぞれ６倍及び５倍多いことをさらに確認した。
【0207】
＜実施例ＸＩＩＩ＞
ＶＨＨ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成
ヌクレアーゼに対する高耐性を持つため化学修飾を含む抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ、すなわちｓｉＧＦＰｓｔ１を、タグ付きＶＨＨ Ａにコンジュゲートして、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートを作製した。同じコンジュゲーション方法を使用して、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１コンジュゲートと同じ構造及びサイズを有するがＴｆＲ標的化能力を有しないように、負のコントロールとして関連のないＶＨＨ ＺにｓｉＧＦＰｓｔ１をコンジュゲートした。
ＶＨＨ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成
ヌクレアーゼに対する高耐性を持つため化学修飾を含む抗ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ、すなわちｓｉＧＦＰｓｔ１を、タグ付きＶＨＨ Ａにコンジュゲートして、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートを作製した。同じコンジュゲーション方法を使用して、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１コンジュゲートと同じ構造及びサイズを有するがＴｆＲ標的化能力を有しないように、負のコントロールとして関連のないＶＨＨ ＺにｓｉＧＦＰｓｔ１をコンジュゲートした。
【0208】
コンジュゲーション方法は、ｉ）アジドリンカーを部位特異的に導入するＶＨＨ、及びｉｉ）アジド官能基に相補的な拘束アジド部分を導入するｓｉＧＦＰｓｔ１の並行修飾を伴う収束型合成に関与するものであった。最終ステップにおいて、銅フリーのクリック反応を用いて、機能化ＶＨＨ－アジド及びアルキン－ｓｉＧＦＰｓｔ１前駆物質の両方を互いに結合する。
【0209】
ＶＨＨ－アジドの合成
細菌トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）に基づくライゲーション方法を用いて、ＶＨＨとの部位特異的コンジュゲーションを行った。ＢＴＧ酵素は、該ＢＴＧ酵素によって特異的に認識されるタグ配列（すなわちＱタグ）に挿入したグルタミン残基とアミノ官能基を持つ基質との間のイソペプチド結合の形成を触媒する。導入されるアミノ官能基を持つ基質は、ＢＴＧ酵素の基質であることが判明しているアミノ部分を一端に含み、銅フリーのクリックケミストリーによってｓｉＧＦＰｓｔ１にコンジュゲートするためのアジド部分を他端に含むヘテロ二官能性リンカーであった。
細菌トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）に基づくライゲーション方法を用いて、ＶＨＨとの部位特異的コンジュゲーションを行った。ＢＴＧ酵素は、該ＢＴＧ酵素によって特異的に認識されるタグ配列（すなわちＱタグ）に挿入したグルタミン残基とアミノ官能基を持つ基質との間のイソペプチド結合の形成を触媒する。導入されるアミノ官能基を持つ基質は、ＢＴＧ酵素の基質であることが判明しているアミノ部分を一端に含み、銅フリーのクリックケミストリーによってｓｉＧＦＰｓｔ１にコンジュゲートするためのアジド部分を他端に含むヘテロ二官能性リンカーであった。
【0210】
ＢＴＧコンジュゲーションプロトコル
３－アジド－１－プロパンアミン（２０．ｅｑ／Ｇｌｎ）をＰＢＳ（１×）に溶解して、自社で作製したＱタグ付きＶＨＨに添加した。その後、ＢＴＧ（Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を混合物（０．１Ｕ／ｎｍｏｌのＧｌｎ）に導入し、これを３７℃で一晩反応させた。製造者の指示に従ってＰｒｏｔｉｎｏ Ｎｉ－ｉｄａ１０００充填カラムにおけるクロマトグラフィーを行うことによって、粗混合物の精製を行って、出発物質の過剰量からのＶＨＨ－アジド、及び潜在的な副生成物を単離した。吸光度を２８０ｎｍで読み取り、精製ＶＨＨ－アジドコンストラクト量、つまりコンジュゲーション産生量を計算した（７０～８０％範囲）。
３－アジド－１－プロパンアミン（２０．ｅｑ／Ｇｌｎ）をＰＢＳ（１×）に溶解して、自社で作製したＱタグ付きＶＨＨに添加した。その後、ＢＴＧ（Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を混合物（０．１Ｕ／ｎｍｏｌのＧｌｎ）に導入し、これを３７℃で一晩反応させた。製造者の指示に従ってＰｒｏｔｉｎｏ Ｎｉ－ｉｄａ１０００充填カラムにおけるクロマトグラフィーを行うことによって、粗混合物の精製を行って、出発物質の過剰量からのＶＨＨ－アジド、及び潜在的な副生成物を単離した。吸光度を２８０ｎｍで読み取り、精製ＶＨＨ－アジドコンストラクト量、つまりコンジュゲーション産生量を計算した（７０～８０％範囲）。
【0211】
最終ＶＨＨ－アジドを、ＬＣＭＳ分析によって特性評価し、その同一性及び純度をチェックした。
【0212】
アルキン－ｓｉＧＦＰｓｔ１の合成
クリックケミストリーによるＶＨＨ－アジドとのコンジュゲーションに必要なアルキン部分によるさらなる機能化を可能にするようにセンス鎖において３’アミン修飾（Ｎ６－ｓｉＧＦＰｓｔ１）を有する、ｓｉＧＦＰｓｔ１をＤｈａｒｍａｃｏｎから購入した。
クリックケミストリーによるＶＨＨ－アジドとのコンジュゲーションに必要なアルキン部分によるさらなる機能化を可能にするようにセンス鎖において３’アミン修飾（Ｎ６－ｓｉＧＦＰｓｔ１）を有する、ｓｉＧＦＰｓｔ１をＤｈａｒｍａｃｏｎから購入した。
【0213】
ｓｉＧＦＰｓｔ１機能化プロトコル
Ｎ６－ｓｉＧＦＰｓｔ１（１ｅｑ）をＮａＢ（０．０９Ｍ、ｐＨ８．５）コンジュゲーションバッファーに溶解して、０．３～０．８ｍＭの最終濃度を得た。その後、この溶液にＤＢＣＯ－ＮＨＳ（２０ｅｑ、ＤＭＳＯ）を添加した。反応混合物を室温で２時間かく拌した。冷無水エタノール内で沈澱させることによって、アルキン－ｓｉＧＦＰｓｔ１を精製した。吸光度を２６０ｎｍで読み取り、精製アルキン－ｓｉＧＦＰｓｔ１コンストラクト量、つまりコンジュゲーション産生量を計算した（４０～５０％範囲）。
Ｎ６－ｓｉＧＦＰｓｔ１（１ｅｑ）をＮａＢ（０．０９Ｍ、ｐＨ８．５）コンジュゲーションバッファーに溶解して、０．３～０．８ｍＭの最終濃度を得た。その後、この溶液にＤＢＣＯ－ＮＨＳ（２０ｅｑ、ＤＭＳＯ）を添加した。反応混合物を室温で２時間かく拌した。冷無水エタノール内で沈澱させることによって、アルキン－ｓｉＧＦＰｓｔ１を精製した。吸光度を２６０ｎｍで読み取り、精製アルキン－ｓｉＧＦＰｓｔ１コンストラクト量、つまりコンジュゲーション産生量を計算した（４０～５０％範囲）。
【0214】
最終アルキン－ｓｉＧＦＰｓｔ１を分析ＨＰＬＣによって特性評価し、同一性及び純度をチェックした。
【0215】
ＶＨＨＨ－ｓｉＧＦＰｓｔ１の合成
ＶＨＨ－アジド及びアルキン－ｓｉＧＦＰｓｔ１前駆物質の両方を、銅フリーのクリックケミストリー反応によって最後にコンジュゲートして、最終コンジュゲートＶＨＨ－ｓｉＧＦＰｓｔ１を得た。
ＶＨＨ－アジド及びアルキン－ｓｉＧＦＰｓｔ１前駆物質の両方を、銅フリーのクリックケミストリー反応によって最後にコンジュゲートして、最終コンジュゲートＶＨＨ－ｓｉＧＦＰｓｔ１を得た。
【0216】
ＶＨＨ－ＧＦＰｓｔ１コンジュゲーションプロトコル
アルキン－ｓｉＧＦＰｓｔ１（２ｅｑ．）をＰＢＳ（１×）に溶解して、ＶＨＨ－アジド（１ｅｑ．、ＰＢＳ（１×）内で１００μＭ範囲の最終濃度）に添加した。反応混合物を室温で一晩かく拌させた。最終コンジュゲートを、まずＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにおいてゲル濾過クロマトグラフィーによって精製し、次にＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター（１０Ｋ）を使用して濃縮した。吸光度を２６０ｎｍで読み取り、精製ＶＨＨ－ｓｉＧＦＰｓｔ１コンストラクト量、つまりコンジュゲーション産生量を計算した（３０％範囲の全産生量）。
アルキン－ｓｉＧＦＰｓｔ１（２ｅｑ．）をＰＢＳ（１×）に溶解して、ＶＨＨ－アジド（１ｅｑ．、ＰＢＳ（１×）内で１００μＭ範囲の最終濃度）に添加した。反応混合物を室温で一晩かく拌させた。最終コンジュゲートを、まずＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにおいてゲル濾過クロマトグラフィーによって精製し、次にＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター（１０Ｋ）を使用して濃縮した。吸光度を２６０ｎｍで読み取り、精製ＶＨＨ－ｓｉＧＦＰｓｔ１コンストラクト量、つまりコンジュゲーション産生量を計算した（３０％範囲の全産生量）。
【0217】
最終ＶＨＨ－ｓｉＧＦＰｓｔ１（ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１及びＶＨＨ Ｚ－ｓｉＧＦＰｓｔ１）を、分析ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びアガロースゲル電気泳動によって特性評価し、その同一性及び純度をチェックした。
【0218】
＜実施例ＸＩＶ＞
ＶＨＨ－ｓｉＲＮＡバイオコンジュゲートのインビトロにおける遺伝子サイレンシング活性
治療用核酸、特にｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチドの特異的細胞標的化及び有効な細胞内送達は未だ大きな課題である。多価親水性オリゴマーであるこの分子の構造的及び物理化学的特徴により、支援がないと、いずれの細胞内コンパートメントにも入ることができない。本発明のＶＨＨは、細胞膜を横断して低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を輸送して、サイトゾルにアクセスするために使用した。
ＶＨＨ－ｓｉＲＮＡバイオコンジュゲートのインビトロにおける遺伝子サイレンシング活性
治療用核酸、特にｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチドの特異的細胞標的化及び有効な細胞内送達は未だ大きな課題である。多価親水性オリゴマーであるこの分子の構造的及び物理化学的特徴により、支援がないと、いずれの細胞内コンパートメントにも入ることができない。本発明のＶＨＨは、細胞膜を横断して低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を輸送して、サイトゾルにアクセスするために使用した。
【0219】
第１に、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１及びＶＨＨ Ｂ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートの見かけのｈＴｆＲ結合親和性（Ｋｄ ａｐｐ）を、同じＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＧＦＰ細胞において２μＭ～３０ｐＭの範囲の濃度を４℃で１時間添加することによって、実施例ＶＩＩに記載するように（ＶＨＨ Ａ１～Ａ１９の結合親和性の測定）評価した。抗６Ｈｉｓ免疫細胞化学法によって、細胞表面結合分子の定量化を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、実験データを非線形回帰に当てはめた。これまでに遊離型のＶＨＨ Ａ及びＶＨＨ Ｂによって示したように、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１及びＶＨＨ Ｂ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートは、細胞表面の標的ｈＴｆＲに対して、濃度依存的且つ飽和性の結合を示し、Ｋｄ ａｐｐ値はコンジュゲートしていないＶＨＨ Ａ及びＶＨＨ Ｂと同じく低いナノモル濃度の範囲であった（図１５Ａ）。コントロールのＶＨＨ Ｚでは、有意な結合は観察されなかった。これにより、つまり、ＶＨＨ Ａ及びＶＨＨ ＢのｓｉＲＮＡとのカップリングが、ｈＴｆＲに対して特異的且つ有効に結合する能力を変えないことを裏付けた。
【0220】
第２に、ＶＨＨ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートの内因性サイレンシング活性を、サイトゾルに直接送達するためにＤｈａｒｍａｆｅｃｔ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して２５ｎＭでコンジュゲートを遺伝子導入することによって、ＥＧＦＰに融合したＴｆＲを安定的に発現するＣＨＯ生細胞株（ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞）において評価した。ＧＦＰの全細胞量を、フローサイトメトリーを使用して遺伝子導入後７２時間で定量化した。この結果により、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１コンジュゲートが、コンジュゲートしていないｓｉＧＦＰｓｔ１又はコントロールのＶＨＨ Ｚ－ｓｉＧＦＰｓｔ１コンジュゲートと同じ範囲において、ＧＦＰタンパク質レベルを約８５％低下させたことを示す（図１５Ｂ）。これにより、ＶＨＨ Ａ又はＺのいずれかのカップリングが、ＲＩＳＣロードを受けて、サイレンシング活性を示すｓｉＲＮＡを妨害しないことを裏付ける。別の実験一式では、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１コンジュゲートを１０ｎＭ～１ｐＭの範囲の濃度でＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＥＧＦＰ細胞に遺伝子導入し、ＧＦＰの全細胞量を、フローサイトメトリーを使用して遺伝子導入後１２０時間で定量化した。これにより、ＧＦＰタンパク質レベルの濃度依存的低下をもたらし、ＩＣ５０は５０．４ｐＭであり、この条件での最大サイレンシング効率は－９０．２％であった（図１５Ｃ）。
【0221】
第３に、ｓｉＧＦＰｓｔ１とコンジュゲートしたとき、ｈＴｆＲ媒介エンドサイトーシスを誘発し、その後、薬理的量で標的細胞のサイトゾルに送達する、ＶＨＨ Ａの能力を評価した。ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１又はコントロールのＶＨＨ Ｚ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートを、１μＭでＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＧＦＰ細胞において３７℃で１２０時間インキュベートして、ｍＲＮＡ転写及びタンパク質レベルにおいて、自由な取り込み、サイトゾルへの送達、及び遺伝子サイレンシングを可能にした。これにより、ＴｆＲ結合ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートでは、有意なＧＦＰタンパク質レベルの約－７０％の低下をもたらす一方、コントロールのＶＨＨ Ｚ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートでは、サイレンシングは観察されなかった（図１５Ｄ）。次に、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートを、３μＭ～１０ｐＭの範囲の濃度でＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＧＦＰ細胞において１２０時間インキュベートした。これにより、ＧＦＰタンパク質レベルの濃度依存的低下をもたらし、ＩＣ５０は２．７３±０．２３ｎＭであり、この条件での最大サイレンシング効率は－６１．６±２．９％であった（図１５Ｅ）。これにより、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートの細胞表面ｈＴｆＲとの結合及びその後のエンドサイトーシスが、薬理的量でサイトゾルへの送達を可能にし、ＩＣ５０はバイオコンジュゲートのｈＴｆＲ結合親和性と同じナノモル濃度の範囲であることを示す。
【0222】
第４に、ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＧＦＰ細胞における自由な取り込みの際に観察したＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートのサイレンシング作用におけるｈＴｆＲの関与を競合アッセイにて確認した。この実験では、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１を、単独で、又は１００×過剰量の遊離型ＶＨＨ Ａ、Ｂ、若しくはＺの存在下で、先の実験から定めた、３０ｎＭの飽和濃度において３７℃で１２０時間インキュベートした。結果は、ＧＦＰタンパク質レベルの約６０％の低下が、遊離型ＶＨＨ Ａ又はＶＨＨ Ｂの存在下でほぼ完全に抑制されることを示した（ＧＦＰタンパク質レベルはそれぞれコントロールレベルの８５％及び９６％に保たれた）。重要な点は、関連のないＶＨＨ Ｚの過剰量を用いたとき競合が観察されなかったということである（図１５Ｆ）。これにより、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートのサイレンシング作用が実際にｈＴｆＲ媒介の細胞取り込み、及びその後の細胞質への送達によるものであることを明確に裏付けた。
【0223】
第５に、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートのＴｆＲ媒介ＧＦＰサイレンシング作用を、パルスチェイス法を用いて評価した。ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＧＦＰ細胞を、３００ｎＭ～１ｐＭの範囲の濃度のＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１に、短時間（６時間）暴露し、その後、リガンド非含有培地において最大で全１２０時間追跡した。この実験により、これまでに連続的な１２０時間のインキュベーションによって観察されたサイレンシング作用に対する、早期の細胞取り込みの寄与を評価することができた。連続的なインキュベーションを用いて観察したように、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートはまた、ＧＦＰタンパク質レベルの濃度依存的低下をもたらし、ＩＣ５０は同様の１．２４ｎＭであり、最大サイレンシング効率は－５４．２％であった（図１５Ｇ）。この結果は、これまでに１２０時間の連続インキュベーションの際に観察した作用の大部分が、最初の６時間内における、有効なＴｆＲ媒介の取り込みによるものであったことを示唆する。この発見は特に興味深いものであり、これは、インビボにおけるそうしたバイオコンジュゲートの血漿薬物動態プロファイルは、通常、静脈内又は皮下へのボーラス注射によって投与したとき、数時間のみ、治療レベルで組織に暴露することができるためである。ゆえに、本明細書に記載するＴｆＲ標的ＶＨＨは、インビボにおける標的化された有効な遺伝子サイレンシングのための実施可能なツールに相当する。
【0224】
最後に、ｈＴｆＲ媒介エンドサイトーシス及びその後の遺伝子サイレンシングを誘発するＶＨＨ Ｂの能力を、ＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＧＦＰ細胞において３０ｎＭでＶＨＨ Ｂ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートを１２０時間インキュベートすることによって評価した。結果は、ＶＨＨ Ａ－ｓｉＧＦＰｓｔ１バイオコンジュゲートで得られたものと同様のＧＦＰレベルの約－６０％の低下を示し、これらのＶＨＨが同様のＴｆＲ標的化及び細胞内送達の可能性を表すことを裏付けた（図１５Ｈ）。
【0225】
発明者等の知る限り、標的化リガンドとして３分枝型ＧａｌＮＡｃを用いるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を介した受容体媒介の肝細胞取り込みは、ナノモル濃度で特異的且つ有効な遺伝子サイレンシングを誘発することができる唯一のリガンド／受容体システムである。しかしながら、ＡＳＧＰＲはインビボでは排他的に肝細胞に発現されることから、治療用核酸によるインビボの治療用途におけるこのシステムの使用は肝臓の標的に限定される。ゆえに、本発明は、ナノモル濃度のｓｉＲＮＡなどの治療用核酸で、ＴｆＲを発現する肝臓器官及び組織外に標的化及び細胞質内送達を行うための新たなリガンド／受容体システムを提供することとなる。
【0226】
＜実施例ＸＶ＞
ＶＨＨ－ＮＯＤＡＧＡコンジュゲートの合成
Ｑタグ付きＶＨＨ Ａの設計
この実施例では、そのＣ末端に導入したＡｌａリンカー、Ｈｉｓタグ、Ｇｌｙリンカー及びＱタグ（ＡＡＡ－Ｈｉｓタグ－ＧＧＧ－ＬＱＲ配列）を伴うＶＨＨ ＡをコードするＤＮＡフラグメントを合成し、ｐＨＥＮ１ベクターにクローニングした。
ＶＨＨ－ＮＯＤＡＧＡコンジュゲートの合成
Ｑタグ付きＶＨＨ Ａの設計
この実施例では、そのＣ末端に導入したＡｌａリンカー、Ｈｉｓタグ、Ｇｌｙリンカー及びＱタグ（ＡＡＡ－Ｈｉｓタグ－ＧＧＧ－ＬＱＲ配列）を伴うＶＨＨ ＡをコードするＤＮＡフラグメントを合成し、ｐＨＥＮ１ベクターにクローニングした。
【0227】
ＶＨＨ Ａ－アジドのＢＴＧに基づく調製物
３－アジド－１－プロパンアミン（２０．ｅｑ／Ｇｌｎ）をＰＢＳ（１×）に溶解して、自社で作製したＬＱＲタグ付きＶＨＨ Ａに添加した。ＢＴＧ（Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を混合物（０．１Ｕ／ｎｍｏｌのＧｌｎ）に導入した。その後、反応混合物を３７℃で一晩反応させた。製造者の指示に従ってＰｒｏｔｉｎｏ Ｎｉ－ｉｄａ１０００充填カラムにおけるクロマトグラフィーを行うことによって、粗混合物の精製を行って、出発物質の過剰量からのＶＨＨ Ａ－アジド、及び潜在的な副生成物を単離した。吸光度を２８０ｎｍで読み取り、精製ＶＨＨ Ａ－アジドコンストラクト量、つまりコンジュゲーション産生量を計算した（７０～８０％範囲）。最終ＶＨＨ Ａ－アジドを、ＬＣＭＳ分析によって特性評価し、その同一性及び純度をチェックした。
３－アジド－１－プロパンアミン（２０．ｅｑ／Ｇｌｎ）をＰＢＳ（１×）に溶解して、自社で作製したＬＱＲタグ付きＶＨＨ Ａに添加した。ＢＴＧ（Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を混合物（０．１Ｕ／ｎｍｏｌのＧｌｎ）に導入した。その後、反応混合物を３７℃で一晩反応させた。製造者の指示に従ってＰｒｏｔｉｎｏ Ｎｉ－ｉｄａ１０００充填カラムにおけるクロマトグラフィーを行うことによって、粗混合物の精製を行って、出発物質の過剰量からのＶＨＨ Ａ－アジド、及び潜在的な副生成物を単離した。吸光度を２８０ｎｍで読み取り、精製ＶＨＨ Ａ－アジドコンストラクト量、つまりコンジュゲーション産生量を計算した（７０～８０％範囲）。最終ＶＨＨ Ａ－アジドを、ＬＣＭＳ分析によって特性評価し、その同一性及び純度をチェックした。
【0228】
市販のアルキン－ＮＯＤＡＧＡに対するコンジュゲートＶＨＨ Ａ－アジドのクリックケミストリー反応
ＶＨＨ Ａ－アジド（１ｅｑ．）を、ＰＢＳ内で室温においてヘテロ二官能性ＮＯＤＡＧＡ－ＢＣＮ（５ｅｑ．）（Ｃｈｅｍａｔｅｃｈ，Ｄｉｊｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）と反応させた。反応をＬＣＭＳによってモニターした。反応完了後、製造者の指示に従ってＰｒｏｔｉｎｏ Ｎｉ－ｉｄａ１０００充填カラムにおけるクロマトグラフィーを行うことによって、最終コンジュゲートを精製して、出発物質の過剰量からのＶＨＨ Ａ－アジド、及び潜在的な副生成物を単離した。吸光度を２８０ｎｍで読み取り、精製ＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡコンストラクト量、つまりコンジュゲーション産生量を計算した（５０～６０％範囲）。最終ＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡを、ＬＣＭＳ分析によって特性評価し、その同一性及び純度をチェックした。
ＶＨＨ Ａ－アジド（１ｅｑ．）を、ＰＢＳ内で室温においてヘテロ二官能性ＮＯＤＡＧＡ－ＢＣＮ（５ｅｑ．）（Ｃｈｅｍａｔｅｃｈ，Ｄｉｊｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）と反応させた。反応をＬＣＭＳによってモニターした。反応完了後、製造者の指示に従ってＰｒｏｔｉｎｏ Ｎｉ－ｉｄａ１０００充填カラムにおけるクロマトグラフィーを行うことによって、最終コンジュゲートを精製して、出発物質の過剰量からのＶＨＨ Ａ－アジド、及び潜在的な副生成物を単離した。吸光度を２８０ｎｍで読み取り、精製ＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡコンストラクト量、つまりコンジュゲーション産生量を計算した（５０～６０％範囲）。最終ＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡを、ＬＣＭＳ分析によって特性評価し、その同一性及び純度をチェックした。
【0229】
＜実施例ＸＶＩ＞
膠芽腫腫瘍の皮下マウスモデルにおけるＶＨＨ－６８ＧａバイオコンジュゲートのＰＥＴイメージング
膠芽腫は最も多い原発性悪性脳腫瘍であり、ヒト原発性膠芽腫細胞株のＵ８７細胞株は高ＴｆＲレベルを発現することが知られている。本発明のＶＨＨが膠芽腫を標的とすることを評価するため、放射能標識したＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡバイオコンジュゲートを、これまでに膠芽腫細胞を移植したマウス（異種移植モデル）の静脈内に投与し、ＰＥＴスキャンイメージングを行った。
膠芽腫腫瘍の皮下マウスモデルにおけるＶＨＨ－６８ＧａバイオコンジュゲートのＰＥＴイメージング
膠芽腫は最も多い原発性悪性脳腫瘍であり、ヒト原発性膠芽腫細胞株のＵ８７細胞株は高ＴｆＲレベルを発現することが知られている。本発明のＶＨＨが膠芽腫を標的とすることを評価するため、放射能標識したＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡバイオコンジュゲートを、これまでに膠芽腫細胞を移植したマウス（異種移植モデル）の静脈内に投与し、ＰＥＴスキャンイメージングを行った。
【0230】
ＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡの放射能標識及び結合親和性検証
まず、６８Ｇａ塩化物を使用してＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡを放射能標識した。市販のＴｉＯ２系６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレーター（Ｏｂｎｉｎｓｋ）を使用して、ガリウムを６８Ｇａ３＋形態で得た。４００μＬの酢酸アンモニウムバッファ内（１Ｍ、ｐＨ６）において２５℃で１０分間、６０μｇのＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡを７４～１４８ＭＢｑ（２～４ｍＣｉ）の６８Ｇａと反応させることで、放射能標識反応を行った。得られたＶＨＨ Ａ－６８Ｇａ放射化学純度（ＲＰＣ）は＞９５％であった。
まず、６８Ｇａ塩化物を使用してＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡを放射能標識した。市販のＴｉＯ２系６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレーター（Ｏｂｎｉｎｓｋ）を使用して、ガリウムを６８Ｇａ３＋形態で得た。４００μＬの酢酸アンモニウムバッファ内（１Ｍ、ｐＨ６）において２５℃で１０分間、６０μｇのＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡを７４～１４８ＭＢｑ（２～４ｍＣｉ）の６８Ｇａと反応させることで、放射能標識反応を行った。得られたＶＨＨ Ａ－６８Ｇａ放射化学純度（ＲＰＣ）は＞９５％であった。
【0231】
放射能標識後、ＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡ及びＶＨＨ Ａ－６８Ｇａバイオコンジュゲートの見かけのｈＴｆＲ結合親和性（Ｋｄ ａｐｐ）を、同じＣＨＯ－ｈＴｆＲ－ＧＦＰ細胞において２μＭ～３０ｐＭの範囲の濃度を４℃で１時間添加することによって、実施例ＶＩＩに記載するように（ＶＨＨ Ａ１～Ａ１９の結合親和性の測定）評価した。抗６Ｈｉｓ免疫細胞化学法によって、細胞表面結合ＶＨＨ Ａバイオコンジュゲートの定量化を行い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、実験データを非線形回帰に当てはめた。ＶＨＨ Ａ－ＮＯＤＡＧＡ及びＶＨＨ Ａ－６８Ｇａバイオコンジュゲートは、細胞表面の標的受容体ｈＴｆＲに対して、濃度依存的且つ飽和性の結合を示し、Ｋｄ ａｐｐ値はコンジュゲートしていないＶＨＨ Ａと同じく低いナノモル濃度の範囲であった（図１６Ａ）。コントロールのＶＨＨ Ｚでは、有意な結合は観察されなかった。これにより、ＶＨＨ ＡのＮＯＤＡＧＡリガンドとのカップリング及び放射能標識プロトコルが、ｈＴｆＲに対して特異的に結合する能力を変えないことを裏付けた。
【0232】
＜ＰＥＴスキャンイメージング＞
エクスマルセイユ倫理規定（規定１４）により承認されているプロトコルに従って動物の研究を行った。４週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの雌をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社から入手した。５０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含有する１００μＬの完全培地内のＵ８７－ＭＧ細胞（２×１０６）を、マウス（ｎ＝６）に肩間から皮下移植した。移植後２８日目において（腫瘍が３００～７００ｍｍ３の間に含まれる体積に達したとき）、５±１ＭＢｑのＶＨＨ Ａ－６８Ｇａの単回の静脈内ボーラス投与量を動物に投与した。投与後、膠芽腫がん異種移植の体内分布及び他の組織がＰＥＴイメージングを使用して評価された。
エクスマルセイユ倫理規定（規定１４）により承認されているプロトコルに従って動物の研究を行った。４週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの雌をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社から入手した。５０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含有する１００μＬの完全培地内のＵ８７－ＭＧ細胞（２×１０６）を、マウス（ｎ＝６）に肩間から皮下移植した。移植後２８日目において（腫瘍が３００～７００ｍｍ３の間に含まれる体積に達したとき）、５±１ＭＢｑのＶＨＨ Ａ－６８Ｇａの単回の静脈内ボーラス投与量を動物に投与した。投与後、膠芽腫がん異種移植の体内分布及び他の組織がＰＥＴイメージングを使用して評価された。
【0233】
３匹のマウスで２時間、別の３匹のマウスで注射後（ｐ．ｉ．）２時間において、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを得た。ＰＥＴ及びＰＥＴ／ＣＴ研究をマイクロＰＥＴ／マイクロＣＴげっ歯動物モデルスキャナー（ｎａｎｏＰＥＴ／ＣＴ，Ｍｅｄｉｓｏ）で行った。麻酔を５％イソフルランで誘導し、１．５％で維持した。画質を向上させるために、静止ＰＥＴ放出スキャン毎に（エネルギーウィンドウ：４００～６００ｋｅＶ、時間：１ＦＯＶにつき２０分）、マウスにつき２千万の同時計数イベントを得た。２モダリティ様式のＰＥＴ／ＣＴでは、ＣＴイメージ（３５ｋＶｐ、３５０ｎｓの露出時間、中ズーム）を得て、対応するＰＥＴスキャンに解剖学的な位置合わせと減弱補正とを適用した。
【0234】
ＶＨＨ Ａ－６８Ｇａを注射した動物のイメージング画像は腫瘍部位における有意な蓄積を示し（図１６Ｂ、１．４６％のＩＤ／ｇ）、良好な腫瘍／筋肉比（４．０）を示した。このように、実験では、２８日目においてＶＨＨ Ａ－６８Ｇａによる膠芽腫がんの明らかな選択的イメージング及び標識化を示し、これは、既知であるＴｆＲの高発現レベルに一致する。
【0235】
【表2】
【表3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A-C】
【図15D-F】
【図15G-H】
【図16】
【配列表】