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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-06
(45)【発行日】2024-12-16
(54)【発明の名称】繁殖のための新規な過排卵誘起方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20241209BHJP
A61P 15/08 20060101ALI20241209BHJP
A01K 67/02 20060101ALI20241209BHJP
C07K 16/26 20060101ALN20241209BHJP
C12N 5/16 20060101ALN20241209BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20241209BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N ZNA
A61P15/08
A01K67/02
C07K16/26
C12N5/16
C12P21/08
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2022069228
(22)【出願日】2022-04-20
(65)【公開番号】P2022167834
(43)【公開日】2022-11-04
【審査請求日】2024-08-14
(31)【優先権主張番号】P 2021072666
(32)【優先日】2021-04-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和３年４月２３日、第６８回日本実験動物学会総会抄録集にて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和３年５月１９日～５月２８日、第６８回日本実験動物学会総会（オンデマンド配信）にて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和３年９月５日、日本実験動物技術者協会総会 第５５回総会抄録集にて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和３年９月２１日、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．６７，Ｓｕｐｐｌ．，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０２１、第１１４回日本繁殖生物学会 大会講演要旨掲載号にて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和３年９月２３日、第１１４回日本繁殖生物学会大会（ＷＥＢ開催）にて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和３年１０月１４日～１０月１６日、日本実験動物技術者協会総会 第５５回総会（ＷＥＢ配信）にて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和４年４月２日、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｉｏａｃ０６８（Ｏｎｌｉｎｅ公開）にて発表（公開アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｂｉｏｌｒｅ／ｉｏａｃ０６８）
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-03503
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小倉 淳郎
(72)【発明者】
【氏名】持田 慶司
(72)【発明者】
【氏名】長谷川 歩未
【審査官】池上 文緒
(56)【参考文献】
【文献】特開平１０－０７２３７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】中原 達夫，牛の性周期同調，農林省家畜衛生試験場研究報告，1971年，第62号，Pages 174-188
【文献】Kelly E. Mayo et al.，Inhibin A-subunit cDNAs from porcine ovary and human placenta，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1986年，Vol.83, No.16，Pages 5849-5853
【文献】Jie Zhu et al.，Inhibin α-Subunit N Terminus Interacts with Activin Type IB Receptor to Disrupt Activin Signaling，The Journal of Biological Chemistry，2012年，Vol.287, No.11，Pages 8060-8070
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ｃ０７Ｋ １６／２６
Ａ０１Ｋ ６７／０２
Ｃ１２Ｎ ５／１６
Ｃ１２Ｎ ５／０７５
Ａ６１Ｐ １５／０８
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起する方法であって、雌の非ヒト哺乳動物に抗インヒビン抗体を投与することを含み、抗インヒビン抗体の投与時及び投与後において、性腺刺激ホルモンによる処置を含まず、
前記抗インヒビン抗体が抗インヒビンモノクローナル抗体であり、
前記抗インヒビン抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合するものであり、
前記抗インヒビン抗体が、マウスを用いた過排卵テストにおいて１５～４０個／個体の過排卵を誘起するものである、
前記方法。
【請求項2】
前記抗インヒビンモノクローナル抗体が、ＮＩＴＥ Ｐ－０３５０３の受託番号が付与されたハイブリドーマにより産生される抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
雌の非ヒト哺乳動物が、性周期を同期化させた雌の非ヒト哺乳動物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
性周期の同期化が、プロゲステロン、プロスタグランジンＦ２α、及びＬＨ－ＲＨ化合物からなる群から選ばれるいずれか１以上による処置で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
非ヒト哺乳動物の繁殖方法であって、請求項１又は２に記載の方法により非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起し、前記非ヒト哺乳動物を人工授精又は交配させて産子を得ることを含む、前記繁殖方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗インヒビン抗体を使用した新規な過排卵誘起方法、及び前記方法を利用した非ヒト哺乳動物の繁殖方法に関する。
【背景技術】
【0002】
繁殖能力を高めるための研究は、古くから家畜を中心に行われており、繁殖と選抜を繰り返すことで、高い繁殖能力と良好な成長を持つ品種が主流となっている。しかし、胎児数の増加は必然的に母体への負担を増加させ、その結果、仔の成長や出生後の蘇生率が悪くなったり、離乳率が低下する傾向がある。標準的な過排卵処置である、馬絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の投与は、排卵数は多くなるが、処置個体の妊娠率が低下し、産子数の増加にはつながらないことが報告されている（非特許文献１など）。
【0003】
動物種や系統毎の排卵数や産子数は、内因性の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌量によって調節されている。内因性ＦＳＨの分泌はインヒビンによってフィードバック制御されるが、インヒビンに対する抗血清（ＡＩＳ）を使用して過排卵を誘起する方法が知られている（特許文献１、及び非特許文献２～４）。また、ＡＩＳをｅＣＧと同時投与することで、良好な成績が得られることも報告されている（特許文献２及び非特許文献５）。しかし、ＡＩＳとｅＣＧの同時投与は、系統による効果の相違が大きく、また高週齢では効果がないという問題がある。
【0004】
発明者らは、性周期を同期化したマウスにＡＩＳ処置とｈＣＧによる処置を行うことで、多くの系統において、ｅＣＧ／ｈＣＧを用いた従来法よりも多くの正常卵子が得られること、また高齢マウスにおいても２倍以上の卵子が得られることを報告している（非特許文献６）。しかし、抗血清の利用は、均一性の問題やＳＰＦマウスに適用できないなどの制限がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開平８－２２９６２４号公報
【文献】特開２０１６－１５５７９３号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ito et al., Relationships between numbers of ovulated ova and implantation sites in mice following superovulation treatment. Jap J Anim Reprod 1974; 19: 153-159.
【文献】Wang et al., Superovulation, fertilization and in vitro embryo development in mice after administration of an inhibin-neutralizing antiserum. Reproduction 2001; 122:809-816.
【文献】Hasegawa et al. Efficient production of offspring from Japanese wild-derived-strains of mice (Mus musculus molossinus) by improved assisted reproductive technologies. Biol Reprod 2012; 86:167.
【文献】Mochida et al., Devising assisted reproductive technologies for wild-derived strains of mice: 37 strains from five subspecies of Mus musculus. PLoSOne 2014; 9:e114305.
【文献】Takeo and Nakagata, Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoSOne 2015; 10:e0128330.
【文献】Hasegawa et al., Ogura A. High-yield superovulation in adult mice by anti-inhibin serum treatment combined with estrus cycle synchronization. Biol Reprod 2016; 94:1-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の課題は、改良された過排卵誘起方法と、それを利用した動物の繁殖方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
発明者らは、抗インヒビン抗体を作製し、性周期を同期化させたマウスに投与して、妊娠への影響を調べた。その結果、抗インヒビン抗体投与後にｈＣＧを投与せずに排卵させることで、着床前後の発生阻害を防止し、正常な妊娠・出産の確立を向上できることを見いだした。とくに、過排卵効果が適正な範囲にある抗インヒビン抗体、特に抗インヒビンモノクローナル抗体を使用することで、より高い妊娠率及び産子数を実現できることを見出した。
【0009】
本発明は上記知見に基づくものであり、以下の［１］～［１６］に関する。
［１］非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起する方法であって、雌の非ヒト哺乳動物に抗インヒビン抗体を投与することを含み、抗インヒビン抗体の投与時及び投与後において、馬絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のいずれによる処置も含まないことを特徴とする、前記方法。
［２］非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起する方法であって、雌の非ヒト哺乳動物に抗インヒビン抗体を投与することを含み、前記抗インヒビン抗体が抗インヒビンモノクローナル抗体である、前記方法。
［３］前記抗インヒビン抗体の投与時において、馬絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）による処置を含まない、［２］に記載の方法。
［４］抗インヒビン抗体の投与時及び投与後において、馬絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のいずれによる処置も含まない、［２］に記載の方法。
［５］抗インヒビンモノクローナル抗体が、ＮＩＴＥ Ｐ－０３５０３の受託番号が付与されたハイブリドーマにより産生される抗体である、［２］に記載の方法。
［６］雌の非ヒト哺乳動物が、性周期を同期化させた雌の非ヒト哺乳動物である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］性周期の同期化が、プロゲステロン、プロスタグランジンＦ２α、及びＬＨ－ＲＨ化合物、並びにこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれか１以上による処置で行われる、［６］に記載の方法。
［８］抗インヒビン抗体が、マウスを用いた過排卵テストにおいて４０個／個体以下の過排卵を誘起するものである、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［９］抗インヒビン抗体が、マウスを用いた過排卵テストにおいて１５～４０個／個体の過排卵を誘起するものである、［８］に記載の方法。
［１０］抗インヒビン抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として作製されたものである、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［１１］非ヒト哺乳動物の繁殖方法であって、［１］～［５］のいずれかに記載の方法により非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起し、前記非ヒト哺乳動物を人工授精又は交配させて産子を得ることを含む、前記繁殖方法。
［１２］抗インヒビンモノクローナル抗体の作製方法であって、非ヒト哺乳動物をインヒビン又はその断片を含むペプチドで免疫してハイブリドーマを取得し、前記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を含む試料を雌マウスに投与して過排卵テストを実施し、１５～４０個／個体の過排卵を誘起する抗インヒビンモノクローナル抗体を目的の抗体として選択することを含む、前記方法。
［１３］前記ペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである、［１２］に記載の抗インヒビンモノクローナル抗体の作製方法。
［１４］抗インヒビンモノクローナル抗体を含む、非ヒト哺乳動物の繁殖用試薬。
［１５］抗インヒビンモノクローナル抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを抗原とし、マウスを用いた過排卵テストにおいて１５～４０個／個体の過排卵を誘起するものである、［１４］に記載の試薬。
［１６］抗インヒビンモノクローナル抗体が、ＮＩＴＥ Ｐ－０３５０３の受託番号が付与されたハイブリドーマにより産生される抗体である、［１４］に記載の試薬。
［１］非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起する方法であって、雌の非ヒト哺乳動物に抗インヒビン抗体を投与することを含み、抗インヒビン抗体の投与時及び投与後において、馬絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のいずれによる処置も含まないことを特徴とする、前記方法。
［２］非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起する方法であって、雌の非ヒト哺乳動物に抗インヒビン抗体を投与することを含み、前記抗インヒビン抗体が抗インヒビンモノクローナル抗体である、前記方法。
［３］前記抗インヒビン抗体の投与時において、馬絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）による処置を含まない、［２］に記載の方法。
［４］抗インヒビン抗体の投与時及び投与後において、馬絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のいずれによる処置も含まない、［２］に記載の方法。
［５］抗インヒビンモノクローナル抗体が、ＮＩＴＥ Ｐ－０３５０３の受託番号が付与されたハイブリドーマにより産生される抗体である、［２］に記載の方法。
［６］雌の非ヒト哺乳動物が、性周期を同期化させた雌の非ヒト哺乳動物である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］性周期の同期化が、プロゲステロン、プロスタグランジンＦ２α、及びＬＨ－ＲＨ化合物、並びにこれらの誘導体からなる群から選ばれるいずれか１以上による処置で行われる、［６］に記載の方法。
［８］抗インヒビン抗体が、マウスを用いた過排卵テストにおいて４０個／個体以下の過排卵を誘起するものである、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［９］抗インヒビン抗体が、マウスを用いた過排卵テストにおいて１５～４０個／個体の過排卵を誘起するものである、［８］に記載の方法。
［１０］抗インヒビン抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として作製されたものである、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［１１］非ヒト哺乳動物の繁殖方法であって、［１］～［５］のいずれかに記載の方法により非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起し、前記非ヒト哺乳動物を人工授精又は交配させて産子を得ることを含む、前記繁殖方法。
［１２］抗インヒビンモノクローナル抗体の作製方法であって、非ヒト哺乳動物をインヒビン又はその断片を含むペプチドで免疫してハイブリドーマを取得し、前記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を含む試料を雌マウスに投与して過排卵テストを実施し、１５～４０個／個体の過排卵を誘起する抗インヒビンモノクローナル抗体を目的の抗体として選択することを含む、前記方法。
［１３］前記ペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドである、［１２］に記載の抗インヒビンモノクローナル抗体の作製方法。
［１４］抗インヒビンモノクローナル抗体を含む、非ヒト哺乳動物の繁殖用試薬。
［１５］抗インヒビンモノクローナル抗体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを抗原とし、マウスを用いた過排卵テストにおいて１５～４０個／個体の過排卵を誘起するものである、［１４］に記載の試薬。
［１６］抗インヒビンモノクローナル抗体が、ＮＩＴＥ Ｐ－０３５０３の受託番号が付与されたハイブリドーマにより産生される抗体である、［１４］に記載の試薬。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、抗インヒビン血清（ＡＩＳ）やｅＣＧ／ｈＣＧを利用した過排卵誘起方法に比べて、正常な卵子が数多く得られ、着床数・産子数が改善される。また、抗インヒビンモノクローナル抗体は均一性が高いため、安定した効果が得られ、動物個体を用いる必要もなく、微生物学的問題もないため、ＳＰＦ動物にも利用できる。本発明の方法は、高齢動物においても有効であり、多くの系統において効果が期待できるため、従来法より汎用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1-1】ブタ、ウシ、ヒト及びラットのインヒビンαサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントである。
【図1-2】ブタ、ウシ、ヒト及びラットのインヒビンβＡサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントである。
【図1-3】ブタ、ウシ、ヒト及びラットのインヒビンβＢサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントである。
【図2-1】ＡＩＭＡ注入後の過排卵テストによるスクリーニング試験の結果を示すグラフである。クローンごとに１－２匹の雌から採取した卵子の数（数／個体）を灰色のバーで示した。黒いバーは標準的な過排卵法（ｅＣＧ）の結果を示す。
【図2-2】＃１４と＃１９のクローンからのＡＩＭＡの過排卵テストの結果を示す。各ＡＩＭＡを注入した雌から採取した卵子の数を示すグラフである。プロゲステロン注射で性周期を同期化した後、＃１４と＃２９クローンのＡＩＭＡをそれぞれ２匹の雌に注射した。
【図3】マウスの過排卵処理の実験スキームである。ｅＣＧとｈＣＧ又はＧｎＲＨを用いた過排卵を行う処置（Ａ）と、プロゲステロン（Ｐ４）注射による性周期の同期化後に、ＡＩＳ又はＡＩＭＡを注射する処置（Ｂ）を模式的に示した。処置した雌は、それぞれ３日目（Ａ）、４日目（Ｂ）に雄と交配し、４日目（Ａ）と５日目から８日目（Ｂ）に膣栓の存在を観察した。なお、ＡＩＳ投与群の一部には６日目（＊）にＧｎＲＨを投与した。
【図4】雄との連続交配による交配率の分布を示すグラフである。雌にプロゲステロン（Ｐ４）を注射し、１／４ＡＩＳ／ＧｎＲＨ（Ａ）又は１／４ＡＩＳ（Ｂ）又は１／６ＡＩＳ（Ｃ）又はＡＩＭＡ（Ｄ）を投与した。棒グラフ内の値は、交配した雌の総数のうち、膣栓があった雌の数である。
【図5-1】（Ａ，Ｂ）着床数と蘇生した仔の数を示すグラフである（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１（Ｍａｎｎ－ｗｈｉｔｅｙ Ｕ検定））。
【図5-2】（Ｃ）処置後、および過剰数の胚移植後の、帝王切開時の仔の平均体重（Ｍａｎｎ－ｗｈｉｔｅｙ Ｕ検定）を示すグラフである。（Ｄ）着床数と仔の累積数を示すグラフである。アスタリスクは、全体に対する着床部位の数の比率が有意に高い場合を示す（Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定）。（Ｅ）出生体重の範囲別の蘇生した仔の割合を示すグラフである。（Ｆ）各処置後の全仔の出生体重の分布を示すグラフである。
【図6】数回の処置を行った後の、処置した雌１匹あたりの蘇生した仔の総数（１個体あたりの平均数）を示すグラフである。
【図7】高齢マウスにおける、ＡＩＭＡ処置による着床数及び生存産子数を示すグラフである。
【図8】ＩＣＲマウスにおける、ＡＩＭＡ処置による生存産子数を示すグラフである。
【図9】シリアンハムスターにおける、ＡＩＭＡ処置、ＡＩＳ処置及び無処置マウスのｉ－ＧＯＮＡＤ処理後の平均生存産子数を示すグラフである。図中のアスタリスクは、対照群とＡＩＭＡ投与群の産子数のＭａｎｎ－ｗｈｉｔｅｙ Ｕ検定において、Ｐ＜０．０５となったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
１．インヒビン
インヒビンは、雌の卵巣又は雄の精巣より分泌される性腺ホルモンの一種である。インヒビンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の働きでその分泌が促進される一方で、下垂体前葉ではアクチビンアンタゴニストとして作用して、ＦＳＨの分泌を抑制することが知られる。インヒビンは、α鎖及びβ鎖で構成され、これらがサブユニットとしてジスルフィド結合で共有結合している。βサブユニットには、βＡサブユニットとβＢサブユニットの２種類があり、それぞれαサブユニットと結合してインヒビンＡ及びインヒビンＢを構成する。インヒビンの構造は、動物種による種差が小さい、すなわち、種間の配列同一性が高いことが知られる。図１－１に、ブタ、ウシ、ヒト及びラットのインヒビンαサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントを示す。配列番号２はブタのインヒビンαサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿９９９３５４．１）、配列番号３はウシのインヒビンαサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿７７６５１９．２）、配列番号４はヒトのインヒビンαサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００２１８２．１）、配列番号５はラットのインヒビンαサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０３６７２２．１）のアミノ酸配列を示す。図１－２に、インヒビンβＡサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントを示す。配列番号６はブタのインヒビンβＡサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿９９９１９３．１）、配列番号７はウシのインヒビンβＡサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿７７６７８８．１）、配列番号８はヒトのインヒビンβＡサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００２１８２．１）、配列番号９はラットのインヒビンβＡサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０５８８２４．１）のアミノ酸配列を示す。図１－３に、インヒビンβＢサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントを示す。配列番号１０はブタのインヒビンβＢサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１１５８３１４．１）、配列番号１１はウシのインヒビンβＢサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿７８９８２２．２）、配列番号１２はヒトのインヒビンβＢサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００２１８４．２）、配列番号１３はラットのインヒビンβＢサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿５４２９４９．１）のアミノ酸配列を示す。表１に、ブタのインヒビンの各サブユニットのアミノ酸配列に対する、他種の相当するアミノ酸配列の配列同一性を示す。表１に示す通り、インヒビンのβサブユニットは種間のアミノ酸配列の配列同一性が非常に高く、αサブユニットにおいても８０％超の配列高い同一性が見られる。
インヒビンは、雌の卵巣又は雄の精巣より分泌される性腺ホルモンの一種である。インヒビンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の働きでその分泌が促進される一方で、下垂体前葉ではアクチビンアンタゴニストとして作用して、ＦＳＨの分泌を抑制することが知られる。インヒビンは、α鎖及びβ鎖で構成され、これらがサブユニットとしてジスルフィド結合で共有結合している。βサブユニットには、βＡサブユニットとβＢサブユニットの２種類があり、それぞれαサブユニットと結合してインヒビンＡ及びインヒビンＢを構成する。インヒビンの構造は、動物種による種差が小さい、すなわち、種間の配列同一性が高いことが知られる。図１－１に、ブタ、ウシ、ヒト及びラットのインヒビンαサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントを示す。配列番号２はブタのインヒビンαサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿９９９３５４．１）、配列番号３はウシのインヒビンαサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿７７６５１９．２）、配列番号４はヒトのインヒビンαサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００２１８２．１）、配列番号５はラットのインヒビンαサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０３６７２２．１）のアミノ酸配列を示す。図１－２に、インヒビンβＡサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントを示す。配列番号６はブタのインヒビンβＡサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿９９９１９３．１）、配列番号７はウシのインヒビンβＡサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿７７６７８８．１）、配列番号８はヒトのインヒビンβＡサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００２１８２．１）、配列番号９はラットのインヒビンβＡサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０５８８２４．１）のアミノ酸配列を示す。図１－３に、インヒビンβＢサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントを示す。配列番号１０はブタのインヒビンβＢサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１１５８３１４．１）、配列番号１１はウシのインヒビンβＢサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿７８９８２２．２）、配列番号１２はヒトのインヒビンβＢサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００２１８４．２）、配列番号１３はラットのインヒビンβＢサブユニット（ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿５４２９４９．１）のアミノ酸配列を示す。表１に、ブタのインヒビンの各サブユニットのアミノ酸配列に対する、他種の相当するアミノ酸配列の配列同一性を示す。表１に示す通り、インヒビンのβサブユニットは種間のアミノ酸配列の配列同一性が非常に高く、αサブユニットにおいても８０％超の配列高い同一性が見られる。
【0013】
【表1】
【0014】
本明細書において、「インヒビン」とは、配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するβＡサブユニット又は配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するβＢサブユニットとを有し、かつ、アクチビンアンタゴニストとしての機能を有するタンパク質を指す。
【0015】
本明細書において「配列同一性」は、BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）やFASTA（http://www.genome.jp/tools/fasta/）によるタンパク質又は遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる（Zheng Zhang et al., 2000, J. Comput. Biol., Vol. 7, p. 203-214; Altschul S. F. et al., 1990, Journal of Molecular Biology, Vol. 215, p. 403-410; Pearson W. R. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Vol. 85, p. 2444-2448）。
【0016】
２．非ヒト哺乳動物の過排卵誘起方法
本発明は、非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起する方法であって、雌の非ヒト哺乳動物に抗インヒビン抗体を投与することを特徴とし、動物に過剰な負担をかけない条件下で過排卵を誘起する。具体的な実施形態は下記のとおりである。
本発明は、非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起する方法であって、雌の非ヒト哺乳動物に抗インヒビン抗体を投与することを特徴とし、動物に過剰な負担をかけない条件下で過排卵を誘起する。具体的な実施形態は下記のとおりである。
【0017】
第１の実施形態において、本発明の方法は、雌の非ヒト哺乳動物に抗インヒビン抗体を投与することを含み、抗インヒビン抗体の投与時及び投与後において、馬絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のいずれによる処置も含まないことを特徴とする。
【0018】
インヒビン抗血清（ＡＩＳ）を用いた従来の過排卵誘起方法では、ｅＣＧをＡＩＳと同時投与したり、ＡＩＳ投与後にｈＣＧを投与することで排卵を誘起していた。本発明では、抗インヒビン抗体の投与時及び投与後にｅＣＧやｈＣＧを使用しないことを特徴とする。抗インヒビン抗体を投与した雌の非ヒト哺乳動物は、必要であれば、雄と同居させることで、ｗｈｉｔｔｅｎ効果を利用して排卵を促してもよい。ｈＣＧを使用しない方法は、着床前後の発生阻害を回避できるため、後述する繁殖方法において好適である。
【0019】
雌の非ヒト哺乳動物は性周期を同期化させた動物を使用することが好ましい。性周期を同期化する方法は特に限定されず、例えば、プロゲステロン、プロスタグランジンＦ２α、及びＬＨ－ＲＨ化合物（Honda et al., 2019, Scientific Report）などのこれらの誘導体等を用いて実施することができる。
【0020】
抗インヒビン抗体の投与のタイミングは、特に限定されない。好ましくは、同期化処置完了後２４時間～７２時間後、より好ましくは４０時間～５６時間後、例えばプロゲステロン投与の場合であれば、２回のプロゲステロン投与完了から約４８時間後に抗インヒビン抗体を投与する。
【0021】
本発明の抗インヒビン抗体は、マウスを用いた過排卵テストにおいて４０個／個体以下の過排卵を誘起するものであることが好ましく、１５～４０個／個体の過排卵を誘起するものがより好ましい。従来の抗血清（ＡＩＳ）の排卵数は４０個／個体、あるいは５０個／個体を超える。本発明では、排卵数が多すぎない抗体を使用することで、妊娠への影響が少なく、産子数を増大することができる。
【0022】
本明細書において、「過排卵テスト」とは、下記の方法で実施するテストを指す。すなわち、無作為に選んだ成熟雌マウスに対して、２ｍｇ／匹のプロゲステロンを２４時間間隔で２日間投与し、その４８時間後に試験対象の抗体を０．５ｍｇ／匹投与し、その４８時間後に５ＩＵ／匹のｈＣＧを投与する。ｈＣＧ投与の１６時間後に卵管から卵子を採取して排卵数を評価する方法である。過排卵テストに使用するマウスは、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓであれば特に限定されず、入手容易な種をいずれも使用できる。例えば、ＩＣＲマウスや交雑系マウス等を使用することができる。
【0023】
抗インヒビン抗体は、インヒビン又はその断片を免疫原として、当該分野で公知の方法により作製することができる。インヒビンは、上記の通り、種間のアミノ酸配列同一性が高いため、得られる抗インヒビン抗体は、抗原と異なる種に由来するインヒビンに対しても交差反応しやすい。そのため、抗体産生に使用する免疫原としてのインヒビンの由来は、必ずしも該抗体を投与する対象と同じ種の動物である必要はない。免疫原としてのインヒビンは、特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ヒトなど、いずれの哺乳動物由来のインヒビンを使用してもよい。免疫原としてインヒビンの断片を使用する場合、使用する断片ペプチドは、インヒビン分子の表面に露出している部分のアミノ酸配列を含むことが好ましい。例えば、配列番号１で示されるブタインヒビン由来のアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として使用することができる（Mayo et al., PNAS 1986, Vol. 83, pp. 5849-5853）。
【0024】
抗インヒビン抗体は、好適には抗インヒビンモノクローナル抗体である。抗インヒビンモノクローナル抗体は、後述する抗インヒビンモノクローナル抗体の作製方法に記載の方法を用いて、新たに作製したモノクローナル抗体であってもよい。
【0025】
より好適には、抗インヒビンモノクローナル抗体は、ＮＩＴＥ Ｐ－０３５０３の受託番号が付与されたハイブリドーマにより産生される抗体である。ＮＩＴＥ Ｐ－０３５０３の受託番号が付与されたハイブリドーマは、２０２１年８月３日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、ＮＩＴＥ Ｐ－０３５０３の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。当該ハイブリドーマは、後述する抗インヒビンモノクローナル抗体の作製方法に記載の方法を用いて、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドをラットに免疫して得られた脾細胞より調製されたハイブリドーマである。
【0026】
抗インヒビン抗体は、インヒビンのαサブユニット、βサブユニット（βＡサブユニット又はβＢサブユニット）のいずれに結合する抗体であってもよいが、好ましくはαサブユニットの表面に露出する部分に結合する抗体であることが好ましい。例えば、配列番号１の２～２７番目のアミノ酸配列を有するブタインヒビンαサブユニットの部分ペプチドに結合する抗体とすることができる。あるいは、配列番号１４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む部分ペプチドに結合する抗体とすることができる。配列番号１４のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、特に他種動物由来のインヒビンの対応する部分との配列同一性が高い部分（７～２４番目のアミノ酸）である。
【0027】
第２の実施形態において、本発明の方法は、雌の非ヒト哺乳動物に抗インヒビンモノクローナル抗体を投与することを含む。雌の非ヒト哺乳動物は性周期を同期化させた動物を使用することが好ましい。性周期を同期化する方法は前述した方法を用いることができる。
【0028】
第２の実施形態において、抗インヒビンモノクローナル抗体の投与時にはｅＣＧを同時投与しないことが好ましく、抗インヒビンモノクローナル抗体の投与時及び投与後には、ｅＣＧやｈＣＧのいずれによる処置も含まないことがより好ましい。
【0029】
本発明の過排卵誘起方法は、マウス、ラット、マーモセット、ハムスター、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジなど、ヒト以外のいずれの哺乳動物にも適用できる。哺乳動物であれば特に限定されず、自然排卵動物(マウス、ラット、ハムスター、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、霊長類等)であっても、交尾排卵動物（ウサギ、ネコ、フェレット等）であってもよい。特に自然排卵動物とすることが好ましい。マウス、ラット、ハムスター等の不完全性周期動物であってもよい。自然排卵動物は、性周期が明瞭であるため、卵胞が発育するタイミングで抗インヒビンモノクローナル抗体を投与して、より効率よく排卵数を増加させることができる。一方、交尾排卵動物の場合は、性周期が不明瞭であるため、投与のタイミングが分かりづらく１回投与では過排卵を生じさせることが難しいが、複数回投与することで、過排卵を生じさせることが可能である。
【0030】
例えば、マウスの場合、対象とする系統は特に限定されず、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、ＩＣＲ、Ｂ６Ｄ２Ｆ１、Ａ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ、ＤＢＡ／２、ＦＶＢ、Ｂ６Ｃ３Ｆ１、ＮＯＤ、ＣＢＡなどいずれの系統であってもよい。
【0031】
例えば、ラットの場合、対象とする系統は特に限定されず、Ｆ３４４、Ｗｉｓｔａｒ、ＢＮ、ＳＤ、ＬＥ、ＴＨＡなどいずれの系統であってもよい。
【0032】
例えば、ハムスターの場合、対象とする種は特に限定されず、シリアンハムスター、チャイニーズハムスター、ジャンガリアンハムスターなどいずれの種であってもよい。
【0033】
３．非ヒト哺乳動物の繁殖方法
本発明は、上記した過排卵誘起方法を利用した、非ヒト哺乳動物の繁殖方法も提供する。本発明の繁殖方法は、上述した方法により非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起し、当該非ヒト哺乳動物を人工授精又は交配させて産子を得ることを含む。好ましくは、非ヒト哺乳動物は自然交配により産子を得る。
本発明は、上記した過排卵誘起方法を利用した、非ヒト哺乳動物の繁殖方法も提供する。本発明の繁殖方法は、上述した方法により非ヒト哺乳動物において過排卵を誘起し、当該非ヒト哺乳動物を人工授精又は交配させて産子を得ることを含む。好ましくは、非ヒト哺乳動物は自然交配により産子を得る。
【0034】
人工授精の場合には、例えば、抗インヒビンモノクローナル抗体の投与から４０～７２時間後に精管結紮した雄と同居する。交配が確認された又は確認されるであろう雌へ、抗インヒビンモノクローナル抗体の投与後４０～９０時間の間に精子液を経腟もしくは経子宮もしくは開腹手術により卵管内へ直接注入することにより妊娠させて産子を得る。
【0035】
自然交配の場合には、抗インヒビンモノクローナル抗体を投与後の雌を雄と同居させればよい。
【0036】
本発明の方法では、ホルモン投与による過排卵処置に比べて、正常な卵子が数多く得られ、母体に過剰な負担がかからないため、着床率も高く、生存産子数も多い。得られる仔は正常体重を有し、生存率が高く、成長もよい。
【0037】
４．抗インヒビンモノクローナル抗体の作製方法
本発明は、本発明で使用される抗インヒビンモノクローナル抗体の作製方法も提供する。前記方法は、非ヒト哺乳動物をインヒビン又はその断片を含むペプチドで免疫してハイブリドーマを取得し、前記ハイブリドーマが産生する抗インヒビンモノクローナル抗体を含む試料（例えば、ハイブリドーマの培養上清又はマウスへの移植による腹水）を雌マウスに投与して過排卵テストを実施し、１５～４０個／個体の過排卵を誘起する抗インヒビンモノクローナル抗体を目的の抗体として選択することを含む。
本発明は、本発明で使用される抗インヒビンモノクローナル抗体の作製方法も提供する。前記方法は、非ヒト哺乳動物をインヒビン又はその断片を含むペプチドで免疫してハイブリドーマを取得し、前記ハイブリドーマが産生する抗インヒビンモノクローナル抗体を含む試料（例えば、ハイブリドーマの培養上清又はマウスへの移植による腹水）を雌マウスに投与して過排卵テストを実施し、１５～４０個／個体の過排卵を誘起する抗インヒビンモノクローナル抗体を目的の抗体として選択することを含む。
【0038】
ハイブリドーマは、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497）に従って、インヒビン又はその断片を免疫原として非ヒト哺乳動物（例えば、前述した非ヒト哺乳動物、好ましくはウサギ、マウス又はラットなどの齧歯類、好ましくはラット）を免疫し、得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立することができる。
【0039】
得られたハイブリドーマは、ＥＬＩＳＡを用いてインヒビンへの結合性を評価するとともに、上述したマウスを用いた過排卵テストを実施し、約１５～４０個／個体の過排卵を誘起するものを選択する。
【0040】
免疫原として使用するペプチドは、インヒビン又はその断片を含むペプチドであれば特に限定されないが、インヒビンの断片を使用する場合は、特に、インヒビン分子の表面に露出している部分のアミノ酸配列を含むことが好ましい。インヒビン又はその断片の由来は特に限定されず、いずれの哺乳動物由来のインヒビン又はその断片を使用してもよい。このような免疫原としては、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。配列番号１の２番目から２７番目のアミノ酸配列を有するペプチド、すなわち、ブタインヒビン由来のアミノ酸配列を含むペプチドであり、配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の２３１番目から２５６番目に相当するアミノ酸配列のＮ末端にシステインを付加した配列である。また、免疫原は、配列番号３のアミノ酸配列の２３４番目から２５９番目、配列番号４のアミノ酸配列の２３３番目から２５８番目、またが配列番号５のアミノ酸配列の２３４番目から２５９番目のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。あるいは、免疫原は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列と９０％以上、特に９４％以上又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む部分ペプチドとすることができる。
【0041】
５．繁殖用試薬（過排卵誘起用試薬）
上記のようにして作製された抗インヒビンモノクローナル抗体は、非ヒト哺乳動物の繁殖用試薬、あるいは、非ヒト哺乳動物の過排卵誘起用試薬として使用され、本発明はそのような非ヒト哺乳動物の繁殖用試薬又は過排卵誘起用試薬（以下、本発明の試薬）も提供する。
上記のようにして作製された抗インヒビンモノクローナル抗体は、非ヒト哺乳動物の繁殖用試薬、あるいは、非ヒト哺乳動物の過排卵誘起用試薬として使用され、本発明はそのような非ヒト哺乳動物の繁殖用試薬又は過排卵誘起用試薬（以下、本発明の試薬）も提供する。
【0042】
本発明の試薬の剤形は特に限定されないが、例えば、点滴を含む注射剤、経膣投与剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。
【0043】
本発明の試薬の投与量は、対象とする動物によって適宜決定される。例えば、マウスの場合であれば、通常は０．２５～１．０ｍｇ／雌で投与する。
【0044】
本発明の試薬は、抗インヒビンモノクローナル抗体のほかに、薬理学的に許容しうる担体を含んでいてもよい。例えば、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、等張化剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【0045】
希釈剤としては、精製水、生理的食塩水、リン酸緩衝液などが挙げられる。
【0046】
溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
【0047】
懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
【0048】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素などが挙
げられる。
げられる。
【0049】
安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のアミノ酸類などが挙げられる。
【0050】
防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
【0051】
緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
【0052】
湿潤剤としては、例えばプロピレングリコールモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ジエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテルが挙げられる。
【0053】
本発明の試薬は、モノクローナル抗体を有効成分とするため、従来の抗血清に比べて、動物個体を用いる必要がなく、微生物学的にクリーンで、均一性が高く、安価に製造できる。また、高齢動物においても有効で、多くの系統での安定した効果が得られる。さらに、抗血清（４８時間投与間隔）より長い７２時間間隔投与が可能になるため、作業面での利点も大きい。
【0054】
６．本発明の利用
本発明は、ＺＦＮ、Ｔａｌｅｎ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などを利用したゲノム編集技術や他の遺伝子改変技術と組み合わせることで、得られる子孫数を増大することができ、より効率的な遺伝子改変が可能になる。実験動物におけるゲノム編集としては、例えば、マウスの場合は、受精卵にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集試薬を注入した後、これを培養して形成した胚を雌個体に移植して出産させる手法がとられる。この方法に本発明を組合せることで、雌マウスの排卵数が増大するため、より効率よく受精卵を取得することが可能である。一方、例えば、シリアンハムスターは、受精卵が実験環境において脆弱であるため、胚培養・胚移植といった手法をとることが困難である。このような動物に対しては、受精卵をｉｎ ｖｉｔｒｏで操作することなく、受精卵を含む卵管内に直接ゲノム編集試薬を注入し、卵管ごと電気穿孔を行ってゲノム編集を行い、その後出産させる手法をとりうる（ｉ－ＧＯＮＡＤ法）。この方法に本発明を組合せることで、産子数が増大するため、より効率よくゲノム編集された仔を取得することが可能である。とくに、本発明は、母体に負担が少ない方法であるため、組み合わせる技術の効果に影響を与えることなく、その効率を向上させることが可能である。
本発明は、ＺＦＮ、Ｔａｌｅｎ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などを利用したゲノム編集技術や他の遺伝子改変技術と組み合わせることで、得られる子孫数を増大することができ、より効率的な遺伝子改変が可能になる。実験動物におけるゲノム編集としては、例えば、マウスの場合は、受精卵にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集試薬を注入した後、これを培養して形成した胚を雌個体に移植して出産させる手法がとられる。この方法に本発明を組合せることで、雌マウスの排卵数が増大するため、より効率よく受精卵を取得することが可能である。一方、例えば、シリアンハムスターは、受精卵が実験環境において脆弱であるため、胚培養・胚移植といった手法をとることが困難である。このような動物に対しては、受精卵をｉｎ ｖｉｔｒｏで操作することなく、受精卵を含む卵管内に直接ゲノム編集試薬を注入し、卵管ごと電気穿孔を行ってゲノム編集を行い、その後出産させる手法をとりうる（ｉ－ＧＯＮＡＤ法）。この方法に本発明を組合せることで、産子数が増大するため、より効率よくゲノム編集された仔を取得することが可能である。とくに、本発明は、母体に負担が少ない方法であるため、組み合わせる技術の効果に影響を与えることなく、その効率を向上させることが可能である。
【実施例】
【0055】
以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0056】
実施例１：マウスにおける過排卵誘起及び産子数増大
１．材料と方法
動物
標準近交系マウスであるＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌ（Ｂ６；日本クレア社）の１０～１３週齢の雌と１１～６４週齢の雄を、すべての過排卵および交配実験に使用した。また、胚移植実験のための偽妊娠雌マウスの調製には、１０～２０週齢のＩＣＲ（日本クレア社）の雌マウスと、３～１２ヶ月齢の精管切除雄マウスを用いた。
１．材料と方法
動物
標準近交系マウスであるＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌ（Ｂ６；日本クレア社）の１０～１３週齢の雌と１１～６４週齢の雄を、すべての過排卵および交配実験に使用した。また、胚移植実験のための偽妊娠雌マウスの調製には、１０～２０週齢のＩＣＲ（日本クレア社）の雌マウスと、３～１２ヶ月齢の精管切除雄マウスを用いた。
【0057】
抗インヒビンモノクローナル抗体（ＡＩＭＡ）の作製
成熟した雌のラット（Ｗｉｓｔａｒ；日本クレア）にブタのインヒビンαサブユニットのペプチド抗原（前掲Mayo et al., PNAS 1986, Vol. 83, pp. 5849-5853）にＣｙｓを付加したもの（２７ＡＡ（配列番号１））を注射して免疫し、その脾臓細胞を骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）と融合してハイブリドーマを作製した。これらの細胞の上清液中のモノクローナル抗体を、ペプチド抗原を用いたＥＬＩＳＡと過排卵試験の両方で評価した。最後に、選択したクローン細胞を増殖させ、凍結保存した。生理食塩水に溶解した５×１０６個／ｍＬの細胞をヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ、日本クレア）に腹腔内投与し、１～２ヶ月後に腹水を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｃｙｔｉｖａ）で精製した後、ＡＩＭＡ（５．０ｍｇ／ｍＬ）として過排卵実験に使用した。
成熟した雌のラット（Ｗｉｓｔａｒ；日本クレア）にブタのインヒビンαサブユニットのペプチド抗原（前掲Mayo et al., PNAS 1986, Vol. 83, pp. 5849-5853）にＣｙｓを付加したもの（２７ＡＡ（配列番号１））を注射して免疫し、その脾臓細胞を骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）と融合してハイブリドーマを作製した。これらの細胞の上清液中のモノクローナル抗体を、ペプチド抗原を用いたＥＬＩＳＡと過排卵試験の両方で評価した。最後に、選択したクローン細胞を増殖させ、凍結保存した。生理食塩水に溶解した５×１０６個／ｍＬの細胞をヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ、日本クレア）に腹腔内投与し、１～２ヶ月後に腹水を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｃｙｔｉｖａ）で精製した後、ＡＩＭＡ（５．０ｍｇ／ｍＬ）として過排卵実験に使用した。
【0058】
過排卵処置後のＭＩＩ期卵子の採取
標準的な過排卵法として、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスに５ＩＵの馬絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ、ＰＭＳＡ；日本全薬工業）を夕方に腹腔内投与した後、４８時間後に５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、ゴナトロピン；あすか製薬）を注射した。もう一方の投与群では、プロゲステロン（Ｐ４、Ｐｒｏｇｅｈｏｒｍｏｎ；持田製薬）２ｍｇ（雌１匹あたり０．０８ｍＬ）を１日１回夕方に２日間（１日目、２日目とする）皮下投与し、雌の発情周期を同期化した。４日目にｅＣＧの代わりにＡＩＳ（それぞれ１／１、１／２、１／４、１／８濃度に希釈）又はＡＩＭＡ（雌１匹あたり０．５ｍｇ／０．１ｍＬ）又は生理食塩水（コントロール）を投与した。ＡＩＳ又はＡＩＭＡの投与から４８時間後に５ＩＵ／匹のｈＣＧを投与した。ｈＣＧの投与から１６～１７時間後に、８０μＬの体外受精用培地（ｍＨＴＦ）を用いて投与針で雌の卵管膨大部を穿刺し、成熟したＭＩＩ期の卵子を採取した。形態学的に正常な卵子と異常な卵子をそれぞれ実体顕微鏡でカウントした。
標準的な過排卵法として、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスに５ＩＵの馬絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ、ＰＭＳＡ；日本全薬工業）を夕方に腹腔内投与した後、４８時間後に５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、ゴナトロピン；あすか製薬）を注射した。もう一方の投与群では、プロゲステロン（Ｐ４、Ｐｒｏｇｅｈｏｒｍｏｎ；持田製薬）２ｍｇ（雌１匹あたり０．０８ｍＬ）を１日１回夕方に２日間（１日目、２日目とする）皮下投与し、雌の発情周期を同期化した。４日目にｅＣＧの代わりにＡＩＳ（それぞれ１／１、１／２、１／４、１／８濃度に希釈）又はＡＩＭＡ（雌１匹あたり０．５ｍｇ／０．１ｍＬ）又は生理食塩水（コントロール）を投与した。ＡＩＳ又はＡＩＭＡの投与から４８時間後に５ＩＵ／匹のｈＣＧを投与した。ｈＣＧの投与から１６～１７時間後に、８０μＬの体外受精用培地（ｍＨＴＦ）を用いて投与針で雌の卵管膨大部を穿刺し、成熟したＭＩＩ期の卵子を採取した。形態学的に正常な卵子と異常な卵子をそれぞれ実体顕微鏡でカウントした。
【0059】
過排卵処置後の交配試験
交配試験は、ｅＣＧ／ｈＣＧ注射群では、雌マウスにｅＣＧを５ＩＵ、ｈＣＧを５ＩＵ又は１ＩＵ、あるいはゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニスト（酢酸ブセレリン：和光純薬工業）を０．６ｍｇ、４８時間間隔で夕方に腹腔内注射し、性経験のある雄のケージに入れた。ＡＩＳおよびＡＩＭＡ注射群では、プロゲステロン ２ｍｇを１日１回夕方に２日間（１日目、２日目）皮下投与して発情周期を同期化した。その後、４日目にＡＩＳ（１／４および１／６希釈液）又はＡＩＭＡ（雌１匹あたり０．５ｍｇ／０．１ｍＬ）をマウスの腹腔内に注射した後、４８時間の間隔でＧｎＲＨなし又はＧｎＲＨありの注射を行った。その後、４日目に雌と雄を交配させた。交尾のタイミングを把握するために、毎朝４日間、膣栓が見つかるまで膣栓の有無を観察した。
交配試験は、ｅＣＧ／ｈＣＧ注射群では、雌マウスにｅＣＧを５ＩＵ、ｈＣＧを５ＩＵ又は１ＩＵ、あるいはゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニスト（酢酸ブセレリン：和光純薬工業）を０．６ｍｇ、４８時間間隔で夕方に腹腔内注射し、性経験のある雄のケージに入れた。ＡＩＳおよびＡＩＭＡ注射群では、プロゲステロン ２ｍｇを１日１回夕方に２日間（１日目、２日目）皮下投与して発情周期を同期化した。その後、４日目にＡＩＳ（１／４および１／６希釈液）又はＡＩＭＡ（雌１匹あたり０．５ｍｇ／０．１ｍＬ）をマウスの腹腔内に注射した後、４８時間の間隔でＧｎＲＨなし又はＧｎＲＨありの注射を行った。その後、４日目に雌と雄を交配させた。交尾のタイミングを把握するために、毎朝４日間、膣栓が見つかるまで膣栓の有無を観察した。
【0060】
対照群として、Ｃ５７ＢＬ／６の雌の膣の外観を調べ、膣に隙間があり、膣の周囲の組織が赤ピンクに腫れている雌を発情前期とした。これらの雌を一晩雄とペアにし、翌朝（１日目）に膣栓の有無を観察した。見た目で妊娠していると判断できる雌には、自然分娩を避けるため、１８日目と１９日目の夕方にプロゲステロン ２ｍｇを皮下注射した。２０日目の朝に、これらの雌を帝王切開して着床と胎仔の数と異常の有無を調べた。帝王切開時に生きていた胎仔を生存産子とし、蘇生過程で肺が白くなり、呼吸がリズミカルになった胎仔を蘇生産子とした。また、授乳前の健康状態を評価するために、仔の体重を測定した。
【0061】
体外受精
体外受精で作製した過剰数の胚を移植し、最大産子数を確認することを試みた。体外受精は以下のようにして行った。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、上述したようにＡＩＳ／ｈＣＧ注射を用いて過排卵を行い、ｈＣＧ注射の１６－１７時間後に、雌の卵管からＭＩＩ期の卵子を採取し、ヒポタウリン（０．１１ｍｇ／ｍＬ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と０．３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ， Ｃａｌｉｂｏｃｈｅｍ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を含むＨＴＦ培地を添加し、１．２５ｍＭの還元型グルタチオンを加えた。雄マウスの精巣上体尾部から採取した精子を、ＢＳＡの代替として１ｍｇ／ｍＬポリビニルアルコール［ＰＶＡ］と０．４ｍＭメチル－βシクロデキストリンおよびを含むＨＴＦ培地に懸濁し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ中で約６０分間培養した。媒精の際には、事前に培養した精子を２００～４００精子／μＬの終濃度で、卵母細胞を含む８０μＬの受精液に移した。３－４時間後、卵母細胞をＣＺＢ培養液に移し、一晩培養した。翌日、２細胞期の胚をカウントし、ガラス化により保存した。
体外受精で作製した過剰数の胚を移植し、最大産子数を確認することを試みた。体外受精は以下のようにして行った。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、上述したようにＡＩＳ／ｈＣＧ注射を用いて過排卵を行い、ｈＣＧ注射の１６－１７時間後に、雌の卵管からＭＩＩ期の卵子を採取し、ヒポタウリン（０．１１ｍｇ／ｍＬ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と０．３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ， Ｃａｌｉｂｏｃｈｅｍ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を含むＨＴＦ培地を添加し、１．２５ｍＭの還元型グルタチオンを加えた。雄マウスの精巣上体尾部から採取した精子を、ＢＳＡの代替として１ｍｇ／ｍＬポリビニルアルコール［ＰＶＡ］と０．４ｍＭメチル－βシクロデキストリンおよびを含むＨＴＦ培地に懸濁し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ中で約６０分間培養した。媒精の際には、事前に培養した精子を２００～４００精子／μＬの終濃度で、卵母細胞を含む８０μＬの受精液に移した。３－４時間後、卵母細胞をＣＺＢ培養液に移し、一晩培養した。翌日、２細胞期の胚をカウントし、ガラス化により保存した。
【0062】
ガラス化による胚の凍結保存
前述のように、高浸透圧ガラス化（ＨＯＶ）溶液を用いて、２細胞の胚を凍結保存した。簡単に説明すると、室温で少量の培地を入れた滅菌ガラスキャピラリー（直径φ１００～１２０ｍ）を用いて、約２０～３０個の胚を５０μＬの平衡溶液（ＰＢ１中の５％ジメチルスルホキシドと５％エチレングリコール）の表面に置いた。３分後、底に沈んだ胚を拾い上げ、５０μＬのガラス化液（ＰＢ１に４２．５％（ｖ／ｖ）エチレングリコール、１７．３％（ｗ／ｖ）フィコール、１．０Ｍスクロースを加えた）を入れたクライオチューブ（ＭＳ－４５０１；住友ベークライト株式会社）に移した。１分後、クライオチューブを－１９６℃の液体窒素（ＬＮ２）に入れた。胚移植当日、クライオチューブを回収し、キャップを素早く外してＬＮ２を蒸発させた。チューブを室温で２分間放置した後、室温で８５０μＬの０．７５Ｍスクロース－ＰＢ１を静かに加えた。４分後、チューブ内の溶液を穏やかなピペッティングで５回混合した。その後、溶液の全量を空のプラスチックディッシュに移した。１～３分後、胚を回収し、０．２５Ｍスクロース－ＰＢ１に移した。１～３分間平衡化した後、回収した胚をさらに０．２５Ｍスクロース－ＰＢ１で洗浄し、ＣＺＢ培地に移した。正常な形態（すなわち、無傷の細胞膜と明瞭な細胞質）を有する胚は、生存とみなした。生存胚は、胚移植まで（＜３時間）、３７℃の加湿空気中５％ＣＯ２下で培養した。
前述のように、高浸透圧ガラス化（ＨＯＶ）溶液を用いて、２細胞の胚を凍結保存した。簡単に説明すると、室温で少量の培地を入れた滅菌ガラスキャピラリー（直径φ１００～１２０ｍ）を用いて、約２０～３０個の胚を５０μＬの平衡溶液（ＰＢ１中の５％ジメチルスルホキシドと５％エチレングリコール）の表面に置いた。３分後、底に沈んだ胚を拾い上げ、５０μＬのガラス化液（ＰＢ１に４２．５％（ｖ／ｖ）エチレングリコール、１７．３％（ｗ／ｖ）フィコール、１．０Ｍスクロースを加えた）を入れたクライオチューブ（ＭＳ－４５０１；住友ベークライト株式会社）に移した。１分後、クライオチューブを－１９６℃の液体窒素（ＬＮ２）に入れた。胚移植当日、クライオチューブを回収し、キャップを素早く外してＬＮ２を蒸発させた。チューブを室温で２分間放置した後、室温で８５０μＬの０．７５Ｍスクロース－ＰＢ１を静かに加えた。４分後、チューブ内の溶液を穏やかなピペッティングで５回混合した。その後、溶液の全量を空のプラスチックディッシュに移した。１～３分後、胚を回収し、０．２５Ｍスクロース－ＰＢ１に移した。１～３分間平衡化した後、回収した胚をさらに０．２５Ｍスクロース－ＰＢ１で洗浄し、ＣＺＢ培地に移した。正常な形態（すなわち、無傷の細胞膜と明瞭な細胞質）を有する胚は、生存とみなした。生存胚は、胚移植まで（＜３時間）、３７℃の加湿空気中５％ＣＯ２下で培養した。
【0063】
胚移植
精管切除したＩＣＲ雄との交配後、凍結融解した１４個又は７個の２細胞胚を、第１日目の偽妊娠ＩＣＲ雌の各卵管に移植した。自然分娩を避けるため、１８日目と１９日目の夕方に、すべてのレシピエント雌に２ｍｇのＰ４を皮下注射した。２０日目の朝、レシピエントの雌を帝王切開し、胎仔の数と生存性を調べた。
精管切除したＩＣＲ雄との交配後、凍結融解した１４個又は７個の２細胞胚を、第１日目の偽妊娠ＩＣＲ雌の各卵管に移植した。自然分娩を避けるため、１８日目と１９日目の夕方に、すべてのレシピエント雌に２ｍｇのＰ４を皮下注射した。２０日目の朝、レシピエントの雌を帝王切開し、胎仔の数と生存性を調べた。
【0064】
統計解析
統計解析を行い、対照データと治療群を比較した。卵子数、産子数、着床数、蘇生仔数は、Ｍａｎｎ－ｗｈｉｔｅｙ Ｕ検定を用いて解析した。妊娠、着床、蘇生した仔の割合は、Ｆｉｓｈｅｒ正確確率検定を用いて分析した。確率がＰ＜０．０５の場合、統計的に有意とした。
統計解析を行い、対照データと治療群を比較した。卵子数、産子数、着床数、蘇生仔数は、Ｍａｎｎ－ｗｈｉｔｅｙ Ｕ検定を用いて解析した。妊娠、着床、蘇生した仔の割合は、Ｆｉｓｈｅｒ正確確率検定を用いて分析した。確率がＰ＜０．０５の場合、統計的に有意とした。
【0065】
２．結果
ＡＩＭＡの作製と過排卵テスト
４０クローンのハイブリドーマから抽出した細胞上清の各サンプルについて、＃４０のサンプル以外は、過排卵テストに供した（図２－１）。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスにプロゲステロン（Ｐ４、Ｐｒｏｇｅｈｏｒｍｏｎ；持田製薬）２ｍｇ／匹（０．０８ｍＬ）を１日１回夕方に２日間皮下投与した。４日目に各サンプル０．５ｍｇ／匹（０．１ｍＬ）を投与した。サンプルの投与から４８時間後に５ＩＵ／匹のｈＣＧを投与し、ｈＣＧの投与から１６～１７時間後に、８０μＬのｍＨＴＦを用いて投与針で雌の卵管膨大部を穿刺し、成熟したＭＩＩ期の卵子を採取し、卵子数を実体顕微鏡でカウントした。各サンプルについて、得られた卵子数を図２－１に示す。併せて、サンプルに代えてｅＣＧ７．５ＩＵ／匹を投与して得られた卵子数も示す。
ＡＩＭＡの作製と過排卵テスト
４０クローンのハイブリドーマから抽出した細胞上清の各サンプルについて、＃４０のサンプル以外は、過排卵テストに供した（図２－１）。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスにプロゲステロン（Ｐ４、Ｐｒｏｇｅｈｏｒｍｏｎ；持田製薬）２ｍｇ／匹（０．０８ｍＬ）を１日１回夕方に２日間皮下投与した。４日目に各サンプル０．５ｍｇ／匹（０．１ｍＬ）を投与した。サンプルの投与から４８時間後に５ＩＵ／匹のｈＣＧを投与し、ｈＣＧの投与から１６～１７時間後に、８０μＬのｍＨＴＦを用いて投与針で雌の卵管膨大部を穿刺し、成熟したＭＩＩ期の卵子を採取し、卵子数を実体顕微鏡でカウントした。各サンプルについて、得られた卵子数を図２－１に示す。併せて、サンプルに代えてｅＣＧ７．５ＩＵ／匹を投与して得られた卵子数も示す。
【0066】
上記のテストでＭＩＩ期卵子数が多かったマウスについて、ハイブリドーマ細胞の＃１４と＃２９から得られたサンプルを１／２倍量（０．０５ｍＬ）、１倍量（０．１ｍＬ）、２倍量（０．２ｍＬ）にして、再度過排卵テストを行った（図２－２）。その結果、＃２９から得られたサンプルが、１／２倍量でも３１．３個の卵子が得られ、投与量に関わらず安定して卵子を得ることができた。＃２９のサンプルを選択して、ＡＩＭＡとして以下の実験に使用した。＃２９のハイブリドーマは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに国際寄託し、２０２１年８月３日付でＮＩＴＥ Ｐ－０３５０３の受託番号が付与された。
【0067】
様々な処置による過排卵試験の結果
標準的な過排卵法としてｅＣＧおよびｈＣＧを投与したところ、雌１匹あたりの形態学的に正常な平均排卵数は１７．１個で、雌の排卵率は８９％（３３／３７）であった（表２）。一方、プロゲステロンを投与して性周期を同期化し（表中、２Ｐ４）、その４８時間後に希釈ＡＩＳ又はＡＩＭＡ、更にｈＣＧを４８時間後に投与したところ、ＡＩＳと１／２希釈ＡＩＳで最も多くの正常卵子（５１～５２個）が得られた。ＡＩＭＡでは２４．６個の正常卵子が得られたが、これは１／４倍のＡＩＳと同様であり、異常卵子はほとんど観察されなかった。性周期同期群のコントロールとして、生理食塩水を投与した場合の卵子数は６．２個であった。
標準的な過排卵法としてｅＣＧおよびｈＣＧを投与したところ、雌１匹あたりの形態学的に正常な平均排卵数は１７．１個で、雌の排卵率は８９％（３３／３７）であった（表２）。一方、プロゲステロンを投与して性周期を同期化し（表中、２Ｐ４）、その４８時間後に希釈ＡＩＳ又はＡＩＭＡ、更にｈＣＧを４８時間後に投与したところ、ＡＩＳと１／２希釈ＡＩＳで最も多くの正常卵子（５１～５２個）が得られた。ＡＩＭＡでは２４．６個の正常卵子が得られたが、これは１／４倍のＡＩＳと同様であり、異常卵子はほとんど観察されなかった。性周期同期群のコントロールとして、生理食塩水を投与した場合の卵子数は６．２個であった。
【0068】
【表2】
【0069】
各種処置後の交配テストの結果
膣外観の色の変化を観察して発情前期の雌を性経験のある雄と同居させたところ、３２％が翌日に交配確認され、妊娠率は１００％であった（表３）。ｅＣＧ／ｈＣＧ投与群では、交配率は６０～６３％であったが、妊娠率は４０～５０％と低い傾向であった（図３Ａ）。また、ｈＣＧの代わりにＧｎＲＨを投与した群では、交配率が有意に高かった。発情周期を同期させた後、ＡＩＭＡ又はＡＩＳの１／４希釈液を投与した後に雄と同居した場合、交配率は合計４日間で７１～１００％に向上した（図３Ｂ）。交配のタイミングは６～８日目に分布しており、ＡＩＳ群では７日目が最も多く、ＡＩＭＡ群では７日目から８日目が最も多かった（図４）。
膣外観の色の変化を観察して発情前期の雌を性経験のある雄と同居させたところ、３２％が翌日に交配確認され、妊娠率は１００％であった（表３）。ｅＣＧ／ｈＣＧ投与群では、交配率は６０～６３％であったが、妊娠率は４０～５０％と低い傾向であった（図３Ａ）。また、ｈＣＧの代わりにＧｎＲＨを投与した群では、交配率が有意に高かった。発情周期を同期させた後、ＡＩＭＡ又はＡＩＳの１／４希釈液を投与した後に雄と同居した場合、交配率は合計４日間で７１～１００％に向上した（図３Ｂ）。交配のタイミングは６～８日目に分布しており、ＡＩＳ群では７日目が最も多く、ＡＩＭＡ群では７日目から８日目が最も多かった（図４）。
【0070】
蘇生した仔の大きさと数への影響
無処置の対照群では、雌１匹あたりの産子数（リターサイズ）は８．６で、着床数に対する産子率（９７％、６２／６４）、帝王切開による蘇生率（１００％）も非常に高かった（表３、図５）。一方、ｅＣＧ／ｈＣＧ投与群では着床数は増加せず、雌１匹あたりの生存産子数は０．５～５匹と低かった（図５Ｂ）。ｈＣＧの代わりにＧｎＲＨを投与した場合、ｅＣＧ、ＡＩＳともに交配率は高かったが、帝王切開後の蘇生率が低下し、蘇生した仔の数も少ない傾向にあった（図５Ｂ）。ＡＩＳ群では、着床数は多かったものの、生存している仔の数は対照群を上回らなかった（図５Ａ、Ｂ）。一方、ＡＩＭＡ群では、着床数と生存産子の数が対照群に比べて有意に多く（それぞれ１６．３個、１１．９個）、これらの仔は形態的にも正常であった（図５Ａ、Ｂ）。追加実験として、雌にＡＩＭＡの半量（０．２５ｍｇ）を投与したところ、交配率（７９％）、着床数（１３．８個）、生存産子数（１１．３匹）を含む結果の効率は同等であった。
無処置の対照群では、雌１匹あたりの産子数（リターサイズ）は８．６で、着床数に対する産子率（９７％、６２／６４）、帝王切開による蘇生率（１００％）も非常に高かった（表３、図５）。一方、ｅＣＧ／ｈＣＧ投与群では着床数は増加せず、雌１匹あたりの生存産子数は０．５～５匹と低かった（図５Ｂ）。ｈＣＧの代わりにＧｎＲＨを投与した場合、ｅＣＧ、ＡＩＳともに交配率は高かったが、帝王切開後の蘇生率が低下し、蘇生した仔の数も少ない傾向にあった（図５Ｂ）。ＡＩＳ群では、着床数は多かったものの、生存している仔の数は対照群を上回らなかった（図５Ａ、Ｂ）。一方、ＡＩＭＡ群では、着床数と生存産子の数が対照群に比べて有意に多く（それぞれ１６．３個、１１．９個）、これらの仔は形態的にも正常であった（図５Ａ、Ｂ）。追加実験として、雌にＡＩＭＡの半量（０．２５ｍｇ）を投与したところ、交配率（７９％）、着床数（１３．８個）、生存産子数（１１．３匹）を含む結果の効率は同等であった。
【0071】
【表3】
【0072】
胚移植による最大産子数の検討
Ｃ５７ＢＬ／６の母体で発育する仔の最大数を知るために、過剰数の胚の移植を試みた。体外受精で作製した２細胞期の胚をガラス化して回収後に移植したところ、１卵管あたり７個の胚を移植した場合（１４個／個体）、出生率は６８％、生存産子数は雌１匹あたり９．６匹であった（表４）。１卵管あたり１４個と過剰数の胚（２８個／個体）を移植した場合、出生率は５１％、生存産子数は１３．３匹であった（表４、図５）。この生存産子数は、ＡＩＭＡを投与した場合の１１．９匹と同等であった。
Ｃ５７ＢＬ／６の母体で発育する仔の最大数を知るために、過剰数の胚の移植を試みた。体外受精で作製した２細胞期の胚をガラス化して回収後に移植したところ、１卵管あたり７個の胚を移植した場合（１４個／個体）、出生率は６８％、生存産子数は雌１匹あたり９．６匹であった（表４）。１卵管あたり１４個と過剰数の胚（２８個／個体）を移植した場合、出生率は５１％、生存産子数は１３．３匹であった（表４、図５）。この生存産子数は、ＡＩＭＡを投与した場合の１１．９匹と同等であった。
【0073】
【表4】
【0074】
仔の体重の評価
出生時の仔の体重は、すべての処置群で対照群に比べて有意に低かった（図５Ｃ）。ＡＩＭＡ投与群では、過剰数の胚を移植した場合の仔の体重と同等であった。着床後の発生率は、ＡＩＳ群と胚移植群において発生しない確率が高い傾向にあった（図５Ｄ）。また、生まれた全仔の体重と蘇生失敗率を調べたところ、体重が０．８ｇ未満の仔の約２／３が蘇生に失敗していた（図５Ｅ）。各処置群で生まれた全産子の体重比を調べたところ、着床後の発生率が有意に低い群（ｅＣＧ／ｈＣＧ（１ＩＵ）、２Ｐ４－１／４ＡＩＳ／ＧｎＲＨ、２Ｐ４－１／４ＡＩＳ、２Ｐ４－１／６ＡＩＳ）では、２０％以上の仔が０．８ｇ未満であった（図５Ｆ）。処置した雌１匹あたりの産子数を比較すると、ＡＩＳ群とＡＩＭＡ群では対照群よりも産子数が増加し、ＡＩＭＡは対照群の２．４倍の効果があった（図６）。
出生時の仔の体重は、すべての処置群で対照群に比べて有意に低かった（図５Ｃ）。ＡＩＭＡ投与群では、過剰数の胚を移植した場合の仔の体重と同等であった。着床後の発生率は、ＡＩＳ群と胚移植群において発生しない確率が高い傾向にあった（図５Ｄ）。また、生まれた全仔の体重と蘇生失敗率を調べたところ、体重が０．８ｇ未満の仔の約２／３が蘇生に失敗していた（図５Ｅ）。各処置群で生まれた全産子の体重比を調べたところ、着床後の発生率が有意に低い群（ｅＣＧ／ｈＣＧ（１ＩＵ）、２Ｐ４－１／４ＡＩＳ／ＧｎＲＨ、２Ｐ４－１／４ＡＩＳ、２Ｐ４－１／６ＡＩＳ）では、２０％以上の仔が０．８ｇ未満であった（図５Ｆ）。処置した雌１匹あたりの産子数を比較すると、ＡＩＳ群とＡＩＭＡ群では対照群よりも産子数が増加し、ＡＩＭＡは対照群の２．４倍の効果があった（図６）。
【0075】
３．考察
ＡＩＭＡの使用によりマウスの産子数を増加させ得ることが確認された。標準的なｅＣＧ／ｈＣＧ処置では、妊娠率が低く、着床数も増加せず、胎児の体重も軽いことが知られている。一方、ｅＣＧの代わりにＡＩＳを投与した場合、より多くの正常な卵子が得られ、交配率及び妊娠率・着床数も増加するが、排卵数が多いほど、仔の出生体重は低くなり、生存率も増加しない。これに対し、ＡＩＭＡ処置は交配率や着床数、産子数の改善に加えて、胎仔の体重、蘇生率、離乳率から、母体への過剰な負担がないことが示唆される。以上のことから、ＡＩＭＡは既存の過排卵試薬とは異なり、着床や妊娠への悪影響が少なく、繁殖用の試薬として有効であり、近交系マウスや繁殖がうまく進まないケースへの応用が期待される。
ＡＩＭＡの使用によりマウスの産子数を増加させ得ることが確認された。標準的なｅＣＧ／ｈＣＧ処置では、妊娠率が低く、着床数も増加せず、胎児の体重も軽いことが知られている。一方、ｅＣＧの代わりにＡＩＳを投与した場合、より多くの正常な卵子が得られ、交配率及び妊娠率・着床数も増加するが、排卵数が多いほど、仔の出生体重は低くなり、生存率も増加しない。これに対し、ＡＩＭＡ処置は交配率や着床数、産子数の改善に加えて、胎仔の体重、蘇生率、離乳率から、母体への過剰な負担がないことが示唆される。以上のことから、ＡＩＭＡは既存の過排卵試薬とは異なり、着床や妊娠への悪影響が少なく、繁殖用の試薬として有効であり、近交系マウスや繁殖がうまく進まないケースへの応用が期待される。
【0076】
実施例２：高齢マウスに対する効果
４０～５０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスを用いて、ｅＣＧ／ｈＣＧによる標準法とＡＩＭＡ処置による効果を比較した。結果を下表及び図７に示す。
４０～５０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスを用いて、ｅＣＧ／ｈＣＧによる標準法とＡＩＭＡ処置による効果を比較した。結果を下表及び図７に示す。
【0077】
【表5】
【0078】
表５及び図７に示すとおり、高齢マウスにおいても、ＡＩＭＡは標準法に比較して交配率、妊娠率、着床数、生存産子数の良好な改善を示した。
【0079】
実施例３：ＩＣＲマウスにおける産子数の増大
ＩＣＲマウスに対するＡＩＭＡの産子数に対する効果を、実施例１と同様の条件で検討した。結果を図８に示す。ＡＩＭＡの投与により、通常のＩＣＲマウスよりも産子数が有意に増加することが確認できた。
ＩＣＲマウスに対するＡＩＭＡの産子数に対する効果を、実施例１と同様の条件で検討した。結果を図８に示す。ＡＩＭＡの投与により、通常のＩＣＲマウスよりも産子数が有意に増加することが確認できた。
【0080】
実施例４：Ａ系統マウスにおける産子数の増大
Ａ系統マウスに対するＡＩＭＡの産子数に対する効果を、実施例１と同様の条件で検討した。結果を表６に示す。ＡＩＭＡの投与により、通常のＡ系統マウスよりも産子数が有意に増加することが確認できた。
Ａ系統マウスに対するＡＩＭＡの産子数に対する効果を、実施例１と同様の条件で検討した。結果を表６に示す。ＡＩＭＡの投与により、通常のＡ系統マウスよりも産子数が有意に増加することが確認できた。
【0081】
【表6】
【0082】
実施例５：ＡＩＭＡ投与のＦ３４４ラット産子数への影響
発情後期又は休止期の８週齢以上の雌のラットＦ３４４／Ｊｃｌ １０匹に、それぞれ０．２ｍＬ／匹のＡＩＭＡを腹腔内投与した（１日目）。２日目に雄のラット Ｆ３４４／Ｊｃｌと同居させて交配を行った。翌日より毎朝膣栓の確認を行い、膣栓が確認できた個体は雄個体と分離した。妊娠が確認された個体は８匹であった。膣栓確認１９日目から２１日目まで毎日プロゲステロンを０．５ｍＬ／匹皮下投与して、安楽死させた後、帝王切開により産子を確認した。結果を表７に示す。表中の対照は、通常のＦ３４４ラットの産子数を示す。ＡＩＭＡの投与により、通常のＦ３４４ラットよりも産子数が２倍近く増加することが確認できた。
発情後期又は休止期の８週齢以上の雌のラットＦ３４４／Ｊｃｌ １０匹に、それぞれ０．２ｍＬ／匹のＡＩＭＡを腹腔内投与した（１日目）。２日目に雄のラット Ｆ３４４／Ｊｃｌと同居させて交配を行った。翌日より毎朝膣栓の確認を行い、膣栓が確認できた個体は雄個体と分離した。妊娠が確認された個体は８匹であった。膣栓確認１９日目から２１日目まで毎日プロゲステロンを０．５ｍＬ／匹皮下投与して、安楽死させた後、帝王切開により産子を確認した。結果を表７に示す。表中の対照は、通常のＦ３４４ラットの産子数を示す。ＡＩＭＡの投与により、通常のＦ３４４ラットよりも産子数が２倍近く増加することが確認できた。
【0083】
【表7】
【0084】
実施例６：ＡＩＭＡ投与のシリアンハムスター産子数への影響
発情後期の雌のシリアンハムスター８匹に、０．２５ｍＬ／匹のＡＩＭＡを腹腔内投与した（１日目）。発情後期は、膣からの粘液の分泌の有無により判定した。３日目に同数の雄のシリアンハムスターと同居させ、交配させた。４日目に交配を確認した後、雄と分離した。交配確認１５日目に安楽死させた後、帝王切開により産子を確認した。結果を表８に示す。表中の対照は、ＡＩＭＡに代えて生理食塩水を投与した以外は同様の処置を行ったシリアンハムスターの結果を示す。ＡＩＭＡ投与群と対照群を比較して、ＡＩＭＡ投与群で平均産子数が多い傾向にあった。
発情後期の雌のシリアンハムスター８匹に、０．２５ｍＬ／匹のＡＩＭＡを腹腔内投与した（１日目）。発情後期は、膣からの粘液の分泌の有無により判定した。３日目に同数の雄のシリアンハムスターと同居させ、交配させた。４日目に交配を確認した後、雄と分離した。交配確認１５日目に安楽死させた後、帝王切開により産子を確認した。結果を表８に示す。表中の対照は、ＡＩＭＡに代えて生理食塩水を投与した以外は同様の処置を行ったシリアンハムスターの結果を示す。ＡＩＭＡ投与群と対照群を比較して、ＡＩＭＡ投与群で平均産子数が多い傾向にあった。
【0085】
【表8】
【0086】
実施例７：シリアンハムスターを用いたｉ－ＧＯＮＡＤ法によるゲノム編集マウスの産子数へのＡＩＭＡ投与の影響
実施例６と同様にして、雌のシリアンハムスターにＡＩＭＡを投与し、雄と交配させた。交配が確認された各雌個体について、卵管にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集試薬を注入し、電気穿孔を行った（ｉ－ＧＯＮＡＤ法：詳細な条件はGurumurthy C.B., et al., Nature protocol, 2019, Vol. 14, pp.2452-2482を参照）。上記処理後に自然分娩させ、分娩から２－３日後に、出生仔数を確認した。結果を表９及び図９に示す。表及び図中の「ＡＩＳ」は、ＡＩＭＡに代えてＡＩＳ ０．２ｍＬを投与した群、対照はＡＩＭＡ、ＡＩＳの投与を行わなかった群の結果を示す。図中のアスタリスクは、対照群とＡＩＭＡ投与群の産子数のＭａｎｎ－ｗｈｉｔｅｙ Ｕ 検定において、Ｐ＜０．０５となったことを示す。実際は図中に示す通りＰ＝０．０４となった。表９及び図９に示す通り、ＡＩＭＡ投与群で、ｉ－ＧＯＮＡＤ処理後の産子数が、対照群よりも有意に多くなることが確認された。これにより、ゲノム編集した実験動物の取得において、ＡＩＭＡによる産子数増加効果が有用であることが示された。
実施例６と同様にして、雌のシリアンハムスターにＡＩＭＡを投与し、雄と交配させた。交配が確認された各雌個体について、卵管にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集試薬を注入し、電気穿孔を行った（ｉ－ＧＯＮＡＤ法：詳細な条件はGurumurthy C.B., et al., Nature protocol, 2019, Vol. 14, pp.2452-2482を参照）。上記処理後に自然分娩させ、分娩から２－３日後に、出生仔数を確認した。結果を表９及び図９に示す。表及び図中の「ＡＩＳ」は、ＡＩＭＡに代えてＡＩＳ ０．２ｍＬを投与した群、対照はＡＩＭＡ、ＡＩＳの投与を行わなかった群の結果を示す。図中のアスタリスクは、対照群とＡＩＭＡ投与群の産子数のＭａｎｎ－ｗｈｉｔｅｙ Ｕ 検定において、Ｐ＜０．０５となったことを示す。実際は図中に示す通りＰ＝０．０４となった。表９及び図９に示す通り、ＡＩＭＡ投与群で、ｉ－ＧＯＮＡＤ処理後の産子数が、対照群よりも有意に多くなることが確認された。これにより、ゲノム編集した実験動物の取得において、ＡＩＭＡによる産子数増加効果が有用であることが示された。
【0087】
【表9】
【0088】
インヒビンは、図１、表１等に示す通り、動物種間でのアミノ酸配列の同一性が非常に高いことから、ＡＩＭＡは多様な動物種のインヒビンと反応可能であり、多様な動物種において機能し得る。実施例５～７において、ＡＩＭＡが多動物種において産子数を増大させることが可能であることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【0089】
本発明によれば、より多くの正常な卵子が得られ、産子数が改善される。本発明の過排卵誘起方法及び繁殖方法は、実験動物や家畜、特に従来繁殖がうまくいかった系統における繁殖率の改善に有用である。
【0090】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】