特許 7599725 クローン免疫グロブリン（ＩＧ）／Ｔ細胞受容体（ＴＲ）遺伝子再構成を正確に評価するための手段

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-06

(45)【発行日】2024-12-16

(54)【発明の名称】クローン免疫グロブリン（ＩＧ）／Ｔ細胞受容体（ＴＲ）遺伝子再構成を正確に評価するための手段

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6876 20180101AFI20241209BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20241209BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALN20241209BHJP

   C12M 1/34 20060101ALN20241209BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6876 Z

C12N15/11 Z ZNA

C12Q1/6869 Z

C12M1/34 Z

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2022504025

(86)(22)【出願日】2020-03-18

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-27

(86)【国際出願番号】 NL2020050181

(87)【国際公開番号】W WO2020190138

(87)【国際公開日】2020-09-24

【審査請求日】2023-03-14

(31)【優先権主張番号】19163837.8

(32)【優先日】2019-03-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】521435282

【氏名又は名称】スティヒティング ユーロクローナリティ

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100147924

【弁理士】

【氏名又は名称】美恵 英樹

(72)【発明者】

【氏名】ブルッヘマン、モニカ ウルスラ ヘルガ

(72)【発明者】

【氏名】コトロバ、ミヒャエラ

(72)【発明者】

【氏名】クネヒト、ヘンリク

(72)【発明者】

【氏名】ダルゼンタス、ニコラオス

(72)【発明者】

【氏名】カッツァニーガ、ジョバンニ

(72)【発明者】

【氏名】ダビ、フレデリック ベルナール ルイ

(72)【発明者】

【氏名】ファン ドンゲン、ヤコーブス ヨハンネス マリア

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア－サンス、ラモン

(72)【発明者】

【氏名】ゴンザレス デ カストロ、ダビド

(72)【発明者】

【氏名】フルネン、パトリシア ヨハンナ テオドラ アンネリーセ

(72)【発明者】

【氏名】ヒュンメル、ミハエル アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】マッキンタイア－デビ、エリザベス アンネ

(72)【発明者】

【氏名】スタマトプーロス、コンスタンチノス

(72)【発明者】

【氏名】ポット、クリスチーネ

(72)【発明者】

【氏名】トルカ、ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ランゲラク、アントニー ヴィレム

【審査官】團野 克也

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５２３５４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／０７５９３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２０８９８４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】BMC Bioinformatics，2017年，18:516

【文献】Blood，2012年，Vol.120, No.26，pp.5173-5180

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

ＩＰＣ Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＤＢ名 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ

／ＥＭＢＡＳＥ／ＣＡＰｌｕｓ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

クローン免疫グロブリン（ＩＧ）／Ｔ細胞受容体（ＴＲ）遺伝子再構成を評価するための量的および質的な標準として使用される組成物であって、
前記組成物は、９種の培養細胞株のセットから単離されたゲノムＤＮＡの混合物を含み、前記セットは、Ｂ細胞株であるＡＬＬ／ＭＩＫ、Ｒａｊｉ、ＲＥＨ、ＴＭＭ、ＴＯＭ－１、ＷＳＵ－ＮＨＬ、ならびにＴ細胞株であるＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ２９９、およびＭＯＬＴ－１３を含むか、または前記セットの１以上の細胞株が、同一の免疫グロブリン（ＩＧ）／Ｔ細胞受容体（ＴＲ）遺伝子再構成を含む１種以上の他の細胞株に置き換えられる、組成物。

【請求項2】

Ｂ細胞株であるＡＬＬ／ＭＩＫ、Ｒａｊｉ、ＲＥＨ、ＴＭＭ、ＴＯＭ－１、ＷＳＵ－ＮＨＬ、ならびにＴ細胞株であるＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ２９９およびＭＯＬＴ－１３から単離されたゲノムＤＮＡの混合物を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記細胞株の各々の実質的に等量のゲノムＤＮＡを含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物を含む第１の容器、および健康なヒト胸腺、健康なヒト扁桃腺、および健康なヒト末梢血単核球から単離された、実質的に等モル量のゲノムＤＮＡからなる組成物を含む第２の容器を含む、クローン免疫グロブリン（ＩＧ）／Ｔ細胞受容体（ＴＲ）遺伝子再構成を評価するための診断キット。

【請求項5】

前記第２の容器は、各組織について、３～１０の異なるヒト個体から得られた前記ゲノムＤＮＡを含む、請求項４に記載のキット。

【請求項6】

ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成のアンプリコンベースの次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のためのプライマーのセットをさらに含む、請求項４または５に記載のキット。

【請求項7】

ＩＧＨ－ＶＪ、ＩＧＨ－ＤＪ、ＩＧＫ－ＶＪ－Ｋｄｅ、ＴＲＢ－ＶＪ、ＴＲＢ－ＤＪ、ＴＲＧ、およびＴＲＤからなる群から選択される前記ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成の１以上を検出するためのプライマーセットを含む、請求項６に記載のキット。

【請求項8】

配列番号３から２９８のいずれか１つに示されたヌクレオチド配列を有するプライマーから選択される１以上のプライマーを含む、請求項６または７に記載のキット。

【請求項9】

ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成を検出するアッセイのための、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物、または請求項４～８のいずれか１項に記載のキット。

【請求項10】

前記アッセイは、クローン性の検出のため、微小残存病変（ＭＲＤ）マーカーの同定および／もしくはＭＲＤのモニタリングのため、ならびに／またはリンパ系腫瘍における（クローン）免疫レパートリーの解析のためのアッセイである、請求項９に記載の組成物またはキット。

【請求項11】

サンプル調製、ＰＣＲおよび／またはライブラリー構築、シークエンシングおよびバイオインフォーマティクス解析のステップを含む、ＮＧＳを用いた、少なくとも１つの生体サンプルにおけるＩＧ／ＴＲを検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法によって、前記少なくとも１つの生体サンプルに添加される請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項12】

前記少なくとも１つの生体サンプルは、臨床的なサンプルである、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記臨床的なサンプルは、悪性リンパ増殖の診断を支持もしくは除外するためのクローン性の検出のためのサンプル、または、ＭＲＤマーカー同定もしくはＭＲＤモニタリング解析、またはクローン免疫レパートリー解析のために採取されたサンプルである、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

前記方法の少なくとも一部がマイクロ流体デバイスを用いて行われる、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫学、免疫遺伝学、および臨床診断学の分野に関する。特に、臨床、診断、および／または研究において、クローン免疫グロブリン（ＩＧ）／Ｔ細胞受容体（ＴＲ）遺伝子再構成を評価するための手段および方法に関する。

【背景技術】

【0002】

適応免疫系の細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞）による特異的な抗原認識は、それぞれ骨髄および胸腺における免疫発達中に独自に形成される受容体（免疫グロブリン、ＩＧ、およびＴ細胞受容体、ＴＲ）を通じて仲介される。ＩＧ／ＴＲ遺伝子座の組み換えを通じて、ＩＧ／ＴＲ受容体特有の多様な（ポリクローナル）レパートリーが作られる。ある自己免疫疾患では、このレパートリーが偏っており（オリゴクローナル）、一方、リンパ系悪性腫瘍では、受容体はほぼ同一である（モノクローナル）（非特許文献１～７）。したがって、ＩＧ／ＴＲ再構成は、臨床、診断、および研究での応用のための免疫細胞の研究のための、独自の遺伝子バイオマーカー（分子シグネチャー）を形成する（非特許文献８～１１）。古典的に、免疫遺伝学的な解析方法は、主に断片の解析、およびサンガー法によるシークエンシングがほとんどである。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）の導入により、ＩＧ／ＴＲ再構成のより深い解析が可能になり、主な免疫遺伝学的応用：クローン性評価、微小残存病変（ＭＲＤ）検出、レパートリー解析に強い影響を与えている（非特許文献１２～２９）。

【0003】

クローンＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成の同定および評価は、リンパ系悪性腫瘍の診断および追跡のための、広く使用されるツールである（非特許文献３０～３５）。ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成のＮＧＳは、患者特異的なリアルタイム定量（ＲＱ）－ＰＣＲアッセイの面倒な設計を避け、１回の配列決定で多数の再構成および再構成型をシークエンシングできるため、臨床試験室では人気が高まっている。したがって、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、および他のリンパ系悪性腫瘍の診断および追跡におけるＩＧ／ＴＲ再構成のハイスループットなプロファイリングのためのいくつかの方法が既に説明されている（非特許文献１６、１７、２３、２４、３６、３７）。

【0004】

ＩＧ／ＴＲ ＮＧＳの潜在的な応用例は、様々なリンパ系悪性腫瘍（主にＡＬＬ、ＣＬＬ、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫）において、微小残存病変（ＭＲＤ）のその後の解析のための診断サンプル中のクローンＩＧ／ＴＲマーカーの同定だけでなく、実際のＭＲＤ解析自体でもある。さらに、リンパ増殖性障害の診断プロセスにおいて、クローン性診断法に適用することができる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ｔｏｎｅｇａｗａ Ｓ． Ｓｏｍａｔｉｃ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ １９８３； ３０２： ５７５－５８１．

【文献】Ｄａｖｉｓ ＭＭ， Ｂｊｏｒｋｍａｎ ＰＪ． Ｔ－ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ １９８８； ３３４： ３９５－４０２．

【文献】Ｓｃｈｌｉｓｓｅｌ ＭＳ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３； ３： ８９０－８９９．

【文献】Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ， Ｌｅｆｒａｎｃ Ｇ． Ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｃｔｓｂｏｏｋ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００１．

【文献】Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ， Ｌｅｆｒａｎｃ Ｇ． Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆａｃｔｓｂｏｏｋ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００１．

【文献】Ｍｏｎｒｏｅ ＪＧ， Ｄｏｒｓｈｋｉｎｄ Ｋ． Ｆａｔｅ Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｉｎ： Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ２００７， ｐｐ １－５０．

【文献】ｖｏｎ Ｂｏｅｈｍｅｒ Ｈ， Ｍｅｌｃｈｅｒｓ Ｆ． Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１０； １１： １４－２０．

【文献】Ｅｖａｎｓ ＰＡＳ， Ｐｏｔｔ Ｃ， Ｇｒｏｅｎｅｎ ＰＪＴＡ， Ｓａｌｌｅｓ Ｇ， Ｄａｖｉ Ｆ， Ｂｅｒｇｅｒ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ Ｂ－ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ ｂｙ ｕｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｓ． Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＢＩＯＭＥＤ－２ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ａｃｔｉｏｎ ＢＨＭ４－ＣＴ９８－３９３６． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００７； ２１： ２０７－２１４．

【文献】Ｂｒuｇｇｅｍａｎｎ Ｍ， Ｗｈｉｔｅ Ｈ， Ｇａｕｌａｒｄ Ｐ， Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｎｚ Ｒ， Ｇａｍｅｉｒｏ Ｐ， Ｏｅｓｃｈｇｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ． Ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｉｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＢＩＯＭＥＤ－２ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ａｃｔｉｏｎ ＢＨＭ４ ＣＴ９８－３９３６． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００７； ２１： ２１５－２２１．

【文献】Ｌａｎｇｅｒａｋ ＡＷ， Ｇｒｏｅｎｅｎ ＰＪＴＡ， Ｂｒuｇｇｅｍａｎｎ Ｍ， Ｂｅｌｄｊｏｒｄ Ｋ， Ｂｅｌｌａｎ Ｃ， Ｂｏｎｅｌｌｏ Ｌ ｅｔ ａｌ． ＥｕｒｏＣｌｏｎａｌｉｔｙ／ＢＩＯＭＥＤ－２ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｉｇ／ＴＣＲ ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２； ２６： ２１５９－２１７１．

【文献】ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ＪＪＭ， ＬａｎｇｅｒａｋＡＷ， Ｂｒuｇｇｅｍａｎｎ Ｍ， Ｅｖａｎｓ ＰＡ， Ｈｕｍｍｅｌ Ｍ， Ｌａｖｅｎｄｅｒ ＦＬ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｕｓｐｅｃｔ ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ： ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＢＩＯＭＥＤ－２ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ａｃｔｉｏｎ ＢＭＨ４－ＣＴ９８－３９３６． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００３； １７： ２２５７－２３１７．

【文献】Ｂｏｙｄ ＳＤ， Ｍａｒｓｈａｌｌ ＥＬ， Ｍｅｒｋｅｒ ＪＤ， Ｍａｎｉａｒ ＪＭ， Ｚｈａｎｇ ＬＮ， Ｓａｈａｆ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｌｏｎａｌｉｔｙ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ＶＤＪ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２００９； １： １２ｒａ２３．

【文献】ＤｅＫｏｓｋｙ ＢＪ， Ｉｐｐｏｌｉｔｏ ＧＣ， Ｄｅｓｃｈｎｅｒ ＲＰ， Ｌａｖｉｎｄｅｒ ＪＪ， Ｗｉｎｅ Ｙ， Ｒａｗｌｉｎｇｓ ＢＭ ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｉｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３； ３１： １６６－１６９．

【文献】Ｆｒｅｅｍａｎ ＪＤ， Ｗａｒｒｅｎ ＲＬ， Ｗｅｂｂ ＪＲ， Ｎｅｌｓｏｎ ＢＨ， Ｈｏｌｔ ＲＡ． Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ－ｃｈａｉｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２００９； １９： １８１７－１８２４．

【文献】Ｇａｗａｄ Ｃ， Ｐｅｐｉｎ Ｆ， Ｃａｒｌｔｏｎ ＶＥＨ， Ｋｌｉｎｇｅｒ Ｍ， Ｌｏｇａｎ ＡＣ， Ｄａｖｉｄ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｍａｓｓｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ Ｂ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｍａｓｓｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ Ｂ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． ２０１２； １２０： ４４０７－４４１７．

【文献】Ｌｏｇａｎ ＡＣ， Ｇａｏ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｃ， Ｓａｈａｆ Ｂ， Ｊｏｎｅｓ ＣＤ， Ｍａｒｓｈａｌｌ ＥＬ ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＶＤＪ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０１１； １０８： ２１１９４－２１１９９．

【文献】Ｌｏｇａｎ ＡＣ， Ｚｈａｎｇ Ｂ， Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ Ｂ， Ｃａｒｌｔｏｎ Ｖ， Ｚｈｅｎｇ Ｊ， Ｍｏｏｒｈｅａｄ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＩＧＨ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｌａｐｓｅ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１３； ２７： １６５９－１６６５．

【文献】Ｒｏｂｉｎｓ ＨＳ， Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＳＫ， Ｃａｍｐｒｅｇｈｅｒ ＰＶ， Ｔｕｒｔｌｅ ＣＪ， Ａｎｄｒｉｅｓｅｎ Ｊ， Ｒｉｄｄｅｌｌ ＳＲ ｅｔ ａｌ． Ｏｖｅｒｌａｐ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｓｉｚｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ． Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０； ２： ４７ｒａ６４－４７ｒａ６４．

【文献】Ｗａｎｇ Ｅ， Ｂａｂｒｚａｄｅｈ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２０１０； １０７： １５１８－１５２３．

【文献】Ｗｕ Ｄ， Ｓｈｅｒｗｏｏｄ Ａ， Ｆｒｏｍｍ ＪＲ， Ｗｉｎｔｅｒ ＳＳ， Ｄｕｎｓｍｏｒｅ ＫＰ， Ｌｏｈ ＭＬ ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ ２０１２； ４： １３４ｒａ６３．

【文献】Ｗｕ Ｙ－Ｃ， Ｋｉｐｌｉｎｇ Ｄ， Ｌｅｏｎｇ ＨＳ， Ｍａｒｔｉｎ Ｖ， Ａｄｅｍｏｋｕｎ ＡＡ， Ｄｕｎｎ－Ｗａｌｔｅｒｓ ＤＫ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ＩｇＭ ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ ｓｗｉｔｃｈｅｄ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ－ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ． Ｂｌｏｏｄ ２０１０； １１６： １０７０－１０７８．

【文献】Ｂａｒｔｒａｍ Ｊ， Ｇｏｕｌｄｅｎ Ｎ， Ｗｒｉｇｈｔ Ｇ， Ａｄａｍｓ Ｓ， Ｂｒｏｏｋｓ Ｔ， Ｅｄｗａｒｄｓ Ｄ ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｌｏｎａｌ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ． Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ２０１８； １０３： ｅ１１０－ｅ１１４．

【文献】Ｆａｈａｍ Ｍ， Ｚｈｅｎｇ Ｊ， Ｍｏｏｒｈｅａｄ Ｍ， Ｃａｒｌｔｏｎ ＶＥ， Ｓｔｏｗ Ｐ， Ｃｏｕｓｔａｎ－Ｓｍｉｔｈ Ｅ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｅｐ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｂｌｏｏｄ ２０１２； １２０： ５１７３－５１８０．

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【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ＮＧＳアッセイ、特にアンプリコンに基づくものには、大きな課題があることが分かっている。たとえば、複数のプライマーが同一の反応条件下でアニーリングする必要がある一方、サンプル調製、ライブラリー構築、シークエンシングおよびバイオインフォーマティクス等の多くの技術的変数が導入される可能性があり、不正確な結果をもたらす可能性がある（非特許文献３８）。残念なことに、科学的に制御された多施設での標準化および検証はまだ不足している。特に臨床の環境では、ＮＧＳアッセイの各構成要素の実験プロトコールおよび品質管理（ＱＣ）の標準化のための戦略が強く求められている。

【0007】

標準試料は、ＮＧＳ技術を臨床に導入する前に、試験結果の分析的妥当性を確保するために、ウェットラボおよびｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのＮＧＳプロセスの評価に不可欠である（非特許文献２９、３９、４０）。参照ＤＮＡ材料は、シークエンシングをして、質的および量的な特性を測定するために使用できる、再編集の安定的なソースであるべきである。しかし、本発明者らは、これまでに公表されている標準品は、（１）すべてのＩＧ／ＴＲ遺伝子座を網羅しておらず、（２）配列決定の品質またはサンプルおよびプライマーの性能を報告していない、かつ／または（３）ネイティブゲノムＤＮＡの複雑さを反映していない可能性がある合成コンストラクトである（非特許文献２３、４１、４２）ため、範囲および有用性が限られていることを認識した。

【0008】

したがって、彼らは、ＩＧ／ＴＲの配列データの免疫プロファイル、特に、大量の免疫遺伝学的データを処理し、アノテーションを行うことができ、ＱＣを含む複数の関連統計を算出し、結果を複数の相互接続された視覚化の形で提示することができるウェブベースのインタラクティブな計算プラットフォームであるＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ（非特許文献４３）について、現行のシステムで容易に統一することのできる、改善されたタイプの品質管理を提供することを目的とした。さらに具体的には、彼らは、サンプルに直接加えてライブラリー調製とシークエンシングを同時に行うことができ、加えたサンプルと同一の下流の技術的変数に供されるチューブ内での量的および質的な標準として機能する組成物を提供することを模索した。さらに、彼らは、プライマーの使用を追跡し、保存されている参照プロファイルと比較することにより、配列決定中のすべての型のＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成について、性能の偏りまたは異常な増幅シフトを一律に評価することができる組成物を提供することを目的とした。

【課題を解決するための手段】

【0009】

そのためにも、ユーロクローナリティ－ＮＧＳワーキンググループの本発明者らは、ＩＧ／ＴＲの利用のためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよびバイオインフォーマティクスの開発、標準化、および検証のために協力した。これは、２つの新規の型の品質管理、ＩＧ／ＩＲ遺伝子再構成が明確に定義されたヒトＢ細胞株およびＴ細胞株に基づくチューブ内集中品質管理／数量管理（ｃＩＴ－ＱＣ）、ならびにＩＧ／ＴＲ遺伝子の全レパートリーを代表するリンパ系試料の標準化された混合物に基づくポリターゲット集中品質管理（ｃＰＴ－ＱＣ）の提供をもたらした。

【0010】

したがって、第１の観点では、本発明は、９種の培養細胞株のセットから単離したゲノムＤＮＡの混合物を含む組成物（本明細書では「チューブ内集中品質管理／数量管理（ｃＩＴ－ＱＣ）」ともいう）を提供し、前記セットは、Ｂ細胞株であるＡＬＬ／ＭＩＫ（Ｂ細胞前駆細胞型ＡＬＬ）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、ＲＥＨ（Ｂ前駆細胞型ＡＬＬ）、ＴＭＭ（ＣＭＬ－ＢＣ／ＥＢＶ＋Ｂ－ＬＣＬ）、ＴＯＭ－１（Ｂ前駆細胞型ＡＬＬ）、ＷＳＵ－ＮＨＬ（Ｂ細胞リンパ腫）；および３種のＴ細胞株：ＪＢ６（ＡＬＣＬ）、Ｋａｒｐａｓ２９９（ＡＬＣＬ）、およびＭＯＬＴ－１３（Ｔ－ＡＬＬ）を含むか、または前記セットの１以上の細胞株が、同一の免疫グロブリン（ＩＧ）／Ｔ細胞受容体（ＴＲ）遺伝子再構成、すなわち同一のＩＧ／ＴＲ再構成プロファイルを含む１種以上の他の細胞株に置き換えられる。

【0011】

第２の観点では、本発明は、健康なヒト胸腺、健康なヒト扁桃腺、および健康なヒト末梢血単核球から単離した、実質的に等モル量のゲノムＤＮＡからなる組成物（本明細書では「ポリターゲット集中品質管理（ｃＰＴ－ＱＣ）」ともいう）を提供する。

【0012】

本発明による組成物は、当分野で未知であるか、または提案されていない。米国特許出願公開第２０１８／２０８９８４号明細書は、１つのプライマーセットを使用した次世代シークエンシングを用いたＩＧ／ＴＲ再構成の検出方法に関する。Ｔ細胞株であるＪＢ６、およびＭＯＬＴ－１３のＴＣＲ配列を含む既知の対立遺伝子を含むプラスミドのセットが対照として使用される。しかし、ｃＤＮＡを用いた米国特許出願公開第２０１８／２０８９８４号明細書の対照サンプルは、不完全なＴＲおよびＩＧ再構成はｍＲＮＡ分子に転写されないため、包含されない。このような不完全なＴＲおよびＩＧ再構成は、クローン性の検出およびＭＲＤ評価のための補完的なターゲットであるため、本発明では明確なターゲットとしている。たとえば、本発明の対照組成物と異なり、米国特許出願公開第２０１８／２０８９８４号明細書は、再構成ＴＲＢＤ－Ｊ、ＴＲＤＶ－Ｄ、ＴＲＤＤ－Ｄ、ＴＲＤＤ－Ｊ、ＩＧＫ－Ｋｄｅ、およびＩＧＨＤ－Ｊの同定および定量をすることができない。

【0013】

Ｂｅｃｃｕｔｔｉら（ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１８，ｎｏ． １，２０１７，ｐａｇｅｓ１－１２）は、ＮＧＳを用いたＩＧ／ＴＲ再構成の検出方法に関する。バフィーコート（末梢血単核球を含む）から単離したＤＮＡを対照として使用する。Ｂｅｃｃｕｔｔｉらは、ＰＢＭＣではみられない本質的な再構成を含むために、ポリターゲット品質管理組成物中の扁桃腺および胸腺のゲノムＤＮＡを含むことを提案していることは言うまでもなく、さらなる組織源からのＤＮＡの使用については沈黙している。

【0014】

本明細書で提供されるｃＩＴ－ＱＣ組成物は、多くの独特かつ有利な特性を有する。第１に、選択されたわずか９種の細胞株のセットが合計４６の再構成を有し、可能な限り少ない細胞株の代表であって、一方、少なくとも３つの再構成により各ターゲットをカバーしており、したがって、系統に関連するものだけでなく、系統横断的な再構成を有するＡＬＬ細胞も検出することができる。第２に、サンガー法シークエンシングおよび／またはアンプリコンベースのＮＧＳで再構成を明確に検出できる。第３に、ＩＧＨ遺伝子再構成の様々な領域は未変異であり、プライマーのアニーリングの問題をただちに回避する。４６の再構成のすべてのリストを表１に示す。

【0015】

ゲノムＤＮＡの使用により、本発明の組成物は、ＰＣＲアッセイを汚染する深刻な脅威をもたらすことが知られているプラスミドの使用を明確に回避する。さらに、ゲノムＤＮＡは、アッセイの対象であり、ゲノムＤＮＡも含む患者のサンプルを最適に表すために選択された。

【0016】

ゲノムＤＮＡは、当分野で知られる確立された抽出プロトコールを用いて、細胞株から容易に単離される。ある実施形態では、ＤＮＡはフェノール－クロロホルム抽出プロトコールを用い、その後のエタノール沈殿、およびトリスエチレンジアミン四酢酸（ＴＥ）バッファーへの溶出により得る。組成物は、使用前に液体で再構成するための乾燥（たとえば、凍結乾燥）形態が適している。

【0017】

【表1】

【0018】

好適な態様では、組成物は、選択された培養細胞株のセットから単離されたほぼ等量のゲノムＤＮＡの混合物を含む。たとえば、ｃＩＴ－ＱＣ組成物は、各細胞株の少なくとも４０細胞コピー、好ましくは少なくとも５０細胞コピーのＤＮＡを有する試験サンプルを提供するために配合される。対照サンプル中に含まれる細胞の最大コピー数はないが、非常に多くの量のゲノムＤＮＡは、アッセイのシークエンシング能力を大幅に消費する可能性がある。ある実施形態では、ｃＩＴ－ＱＣ組成物は、選択された培養細胞株のセットの細胞株ＤＮＡコピーをほぼ同数含み、１反応あたり各細胞株の２０～５０細胞コピーのゲノムＤＮＡを含む溶液を再構築する（ために配合される）。

【0019】

本明細書で提供されるｃＩＴ－ＱＣ組成物における使用のためのＢ細胞株およびＴ細胞株は、任意の適切な（市販の）ソースから得ることができる。たとえば、Ｒａｊｉ細胞株 はＤＳＭＺＡＣＣ３１９であり、ＲＥＨ細胞株はＤＳＭＺＡＣＣ２２であり、ＴＭＭ細胞株はＤＳＭＺＡＣＣ９５であり、ＴＯＭ－１細胞株はＤＳＭＺＡＣＣ５７８であり、ＷＳＵ－ＮＨＬ細胞株はＤＳＭＺＡＣＣ５８であり、Ｋａｒｐａｓ２９９細胞株はＤＳＭＺＡＣＣ３１であり、かつ／またはＭＯＬＴ－１３細胞株はＤＳＭＺＡＣＣ４３６である。もちろん、表１に示す１以上の細胞株を、同じ再構成を含む（または備える）成長が良い特性を有する別の細胞株に置き換えることもできる。したがって、表１に示す４６の再構成型のプロファイルを合わせてカバーする培養細胞株のセットから単離されるゲノムＤＮＡの混合物を含む組成物も含まれる。特に、本発明は、９種の培養細胞株のセットから単離されたゲノムＤＮＡの混合物を含む組成物を提供し、前記セットは、Ｂ細胞株であるＡＬＬ／ＭＩＫ（Ｂ細胞前駆細胞型ＡＬＬ）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、ＲＥＨ（Ｂ前駆細胞型ＡＬＬ）、ＴＭＭ（ＣＭＬ－ＢＣ／ＥＢＶ＋Ｂ－ＬＣＬ）、ＴＯＭ－１（Ｂ前駆細胞型ＡＬＬ）、ＷＳＵ－ＮＨＬ（Ｂ細胞リンパ腫）；およびＴ細胞株：ＪＢ６（ＡＬＣＬ）、Ｋａｒｐａｓ２９９（ＡＬＣＬ）、およびＭＯＬＴ－１３（Ｔ－ＡＬＬ）を含むか、または前記セットの１以上の細胞株が、同一の免疫グロブリン（ＩＧ）／Ｔ細胞受容体（ＴＲ）遺伝子再構成を含む１種以上の他の（すなわち、列挙した９種の細胞株とは異なる）細胞株に置き換えられる。そのような「同等の」細胞型には、表1に示すものと同じ遺伝子再構成、または同じ型のＩＧ／ＴＲ再構成、すなわち異なるＣＤＲ３が少なくとも含まれる。好ましい態様では、組成物には、Ｂ細胞株であるＡＬＬ／ＭＩＫ、ＲＥＨ、およびＴＯＭ－１から単離されたゲノムＤＮＡが含まれ、各々には系統横断的なＴＲ再構成が含まれる。

【0020】

好ましい実施形態では、組成物は、Ｂ細胞株であるＡＬＬ／ＭＩＫ、Ｒａｊｉ、ＲＥＨ、ＴＭＭ、ＴＯＭ－１、ＷＳＵ－ＮＨＬ、ならびにＴ細胞株であるＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ２９９、およびＭＯＬＴ－１３から単離された、好ましくはほぼ等量のゲノムＤＮＡの混合物からなる。

【0021】

さらなる態様では、本発明は、主に、健康なヒト胸腺、健康なヒト扁桃腺、および健康なヒト末梢血単核球（ＰＢ－ＭＮＣ）から単離された、等モル量のゲノムＤＮＡから本質的になるｃＰＴ－ＱＣ組成物を提供する。言い換えると、これは、１／３胸腺、１／３扁桃腺、１／３末梢血単核球ＤＮＡの等モル混合物からなる。本明細書で使用される場合、「健康な」という用語は、悪性免疫基礎疾患または障害を患っていないことがわかっている、または推定されるヒト対象から得た組織をいう。ある態様では、胸腺は、手術のために心臓に到達することが物理的に不可能なため、幼い子供から切除して得られる。

【0022】

各組織について、ゲノムＤＮＡは多くの異なるヒト個体から得るのが好ましい。たとえば、各組織について、３～１０人のヒト対象のＤＮＡが使用される。この組成物は「標準化されたリンパ球標本」を表すため、試料と一緒に処理される別のサンプルとして使用されるのが適切であり、試験される通常のサンプルと本質的に同量のＤＮＡを提供するために配合されるのが好ましい。典型的には、５０～２００ｎｇの範囲が好ましい。特定の態様では、組成物は乾燥、たとえば凍結乾燥される。

【0023】

本明細書で使用される場合、「ほぼ等量」または「本質的に等量」という表現は、ゲノムＤＮＡの混合物中の細胞株／リンパ系組織サンプルがそれぞれ当量であるという目的を反映している。

【0024】

また、本発明は、（１）本発明の「チューブ内集中品質管理／数量管理」（ｃＩＴ－ＱＣ）組成物を含む容器、および／または（２）本明細書で開示される「ポリターゲット集中品質管理」（ｃＰＴ－ＱＣ）組成物を含む容器を含む診断キットも提供する。ある実施形態では、キットには、本明細書で開示されるｃＩＴ－ＱＣ組成物が少なくとも含まれる。別の実施形態では、キットには、本発明のｃＰＴ－ＱＣ組成物が少なくとも含まれる。ｃＰＴ－ＱＣ組成物は、１以上のさらなる有用な品質管理組成物と共にパッケージ化されていてもよい。たとえば、クローンＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成を評価する場合に両方の品質管理をアッセイの性能をモニターするために使用することができるように、さらなる品質管理組成物は、表１に示す４６の再構成型のプロファイルを合わせてカバーする培養細胞株のセットから単離されたゲノムＤＮＡの混合物を含み得る。

【0025】

好ましくは、キットは、本明細書で開示されるｃＩＴ－ＱＣ組成物とｃＰＴ－ＱＣ組成物の両方を含む。キットは、ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成を検出するために、ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成のアンプリコンベースのＮＧＳのためのプライマーセット等の１以上の薬剤を有利にさらに含み得る。特定の実施形態では、診断キットには、本明細書で提供されるＱＣ組成物の一方または両方に加えて、ＩＧＨ－ＶＪ、ＩＧＨ－ＤＪ、ＩＧＫ－ＶＪ－Ｋｄｅ、ＴＲＢ－ＶＪ、ＴＲＢ－ＤＪ、ＴＲＤ、およびＴＲＧからなる群から選択される１以上のＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成を検出するための１以上のプライマーセットが含まれる。特に好ましいプライマー、たとえば、ＱＣ組成物と組み合わせた使用のためのものは、図５または表３に示すプライマー等のＮＧＳに基づく検出のために最適なものである。

【0026】

本発明は、図５に示すプライマーから選択される２以上のプライマーを含む、ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成のアンプリコンベースの次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のためのプライマーセットも提供する。好ましくは、セットには、ＩＧＨ－ＶＪ、ＩＧＨ－ＤＪ、ＩＧＫ－ＶＪ－Ｋｄｅ、ＴＲＢ－ＶＪ、ＴＲＢ－ＤＪ、ＴＲＤ、およびＴＲＧからなる群から選択される1以上、好ましくは２以上、最も好ましくは３以上のＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成を検出するための少なくとも２つのプライマーを含む。特定の態様では、プライマーセットは、ＩＧＨ－ＶＪ、ＩＧＨ－ＤＪ、ＩＧＫ－ＶＪ－Ｋｄｅ、ＴＲＢ－ＶＪ、ＴＲＢ－ＤＪ、ＴＲＤ、およびＴＲＧ遺伝子再構成の各々を検出するためのプライマーを含む。

【0027】

図５のプライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列（Ｍ１３フォワード配列Ｍ１３フォワードプライマー（－２０）：ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ；および／またはＴ７ユニバーサルプライマー：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ）、または標的配列にハイブリダイズしない当分野で知られるユニバーサルプライマー配列、および／または他のアダプター配列もしくはバーコード配列を含み得る。

【0028】

特定の態様では、本発明のプライマーは、フォワードまたはリバースＭ１３配列を含む。ある実施形態では、図５のプライマー配列は、５’末端にユニバーサルＭ１３テール、好ましくは配列ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴが含まれる。別の実施形態では、図５のプライマー配列は、Ｔ７プロモーターの配列を備える。特定の態様では、本発明は、表３に示すプライマーから選択される２以上のプライマーセットを提供する。

【0029】

本発明の新規なＱＣ組成物の提供は、品質管理および定量戦略に重要な意味がある。本明細書で以下に説明するように、ｃＰＴ－ＱＣ組成物は、シークエンスプロファイルに検出可能な変化をもたらすので、結果の再現性をモニターするため、ならびにプライマーの乱れおよびウェットラボプロトコールにおける他の偏りを見極めるために価値のあるツールである。各シークエンスにｃＰＴ－ＱＣを加えることで、シークエンス後にプライマーおよびアッセイ性能をチェックすることができる。ｃＰＴ－ＱＣデータの解析により、多重ＩＧ／ＴＲプライマーセット中の１つのプライマーの濃度の偶発的な偏りを検出することができ、１つのプライマーの性能低下を追跡することができ、ＩＧ／ＴＲ解析の結果を評価することができる。

【0030】

さらに、ｃＩＴ－ＱＣの利点および多様な有用性を示す。プラスミドまたは合成参照鋳型と対照的に、ｃＩＴ－ＱＣ細胞株は多量のゲノムＤＮＡのソースであり、市販されているため、対照として使用するのに特に適している。ｃＩＴ－ＱＣ再構成は、８つのプライマーセットすべてで増幅可能な再構成型の２／３を表しており、したがって、多くの問題、最も明らかな過剰／過少増幅だけでなく、生物情報の誤認を強調する機会を提供する。さらに、ｃＩＴ－ＱＣ再構成は、ＰＣＲの安定性のために、患者の免疫レパートリーに影響を与えずに（ｃＩＴ－ＱＣ再構成は生物情報学的に同定され、デフォルトで結果から除外されるため）、バフィーコートＤＮＡに置き換えることができる。

【0031】

ｃＩＴ－ＱＣは、リード数から細胞数への変換が可能であり、これは臨床使用で最も重要である。ＭＲＤマーカーの同定のために解析される診断材料は、サンプルのクローン構成を反映していない大量の特定のクロノタイプを示す可能性がある。たとえば、診断サンプルが、標的となる再構成を有していないリンパ系悪性腫瘍により高度に浸潤している場合、（少数の）残存リンパ系細胞が検出可能な全範囲の再構成を生成するであろう。このような状況では、少数の生理的Ｂ細胞またはＴ細胞クローンは、白血病マーカーを有するクローンとして誤認される場合がある。

【0032】

マーカーの同定における使用に加え、形成不全の追跡サンプルにおけるＢ細胞およびＴ細胞の枯渇として例示されるように、ｃＩＴ－ＱＣは、特に、ポリクローナル遺伝子再編集のバックグラウンドを最小限にするＢ細胞またはＴ細胞指向型療法が適用された場合の治療中または治療後のサンプルにおけるＭＲＤの定量化に最適である。正規化をせずに、白血病特異的なリード数対アノテーションされた全リード数の比により相対腫瘍負荷を算出する場合、商は、特定の型の再構成を有する細胞間のみでのマーカーの頻度（たとえば、Ｂ細胞が存在する全プール中のＩＧ再構成）を反映し、したがって実際の腫瘍の負荷を過大に評価し得る（非特許文献４４）。

【0033】

さらに、ＱＣプロトコールは、容易にＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅに埋め込むことができるが、これは利用者に報告とメッセージを通知し、たとえば、ＱＣに失敗したサンプルを分析に戻し含めることができる。この論理は、「失敗」というフラグは前もって定義されたＱＣ基準を満たさなかったことを知らせるが、必ずしもデータが完全に間違っていることを示すものではないということである。しかし、フラグがついたデータは、使い道または問題点に応じて、常に注意して使用すべきである。

【0034】

したがって、本発明は、ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成の検出のためのアッセイにおける、本明細書に上記された発明に従った組成物、またはキットの使用にも関する。当業者は、多様な応用を認識し、正しく評価するであろう。ほんの一例として、アッセイは臨床診断アッセイであり、好ましくはクローン性を検出するため、ＭＲＤマーカーを同定および／またはＭＲＤモニタリングするため、ならびにリンパ性悪性疾患における（クローン）免疫レパートリーを解析するためのアッセイである。

【0035】

さらなる実施形態は、サンプル調製、ＰＣＲおよび／またはライブラリー構築、シークエンシング、およびバイオインフォーマティクス解析の従来のステップを含むが、少なくとも１つのＱＣ組成物が用いられることを特徴とする、ＮＧＳを用いた、少なくとも１つの生体サンプルにおけるＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法に関する。たとえば、少なくとも１つの生体サンプルに、たとえば、少なくとも４０細胞コピーの各細胞株のＤＮＡをもたらす量のｃＩＴ－ＱＣ組成物を添加する。チューブ内での品質管理および数量管理としてのそのような使用により、リード数から細胞相関数への変換が可能となるが、これは臨床使用で最も重要である。

【0036】

あるいは、またはさらに、ｃＰＴ－ＱＣ組成物は、少なくとも１つの生体「試験」サンプルと並行して、別のサンプルに添加され、シークエンス後にプライマーおよびアッセイ性能をチェックするための外部参照としてはたらく。

【0037】

典型的には、少なくとも１つの生体サンプルは、臨床的に適切なサンプルである。ある態様では、悪性リンパ増殖の診断を支持または除外するためのクローン性の検出のためのサンプルである。別の態様では、ＭＲＤマーカー同定もしくはＭＲＤモニタリング解析、または（クローン）免疫レパートリー解析のために採取されたサンプルである。

【0038】

本明細書で提供される方法は、当分野で知られる標準の手段およびプロトコールを用いて行うことができる。ある実施形態では、方法の少なくとも一部は、マイクロ流体技術を用いて行うことができる。たとえば、サンプル調製、ＰＣＲ、ライブラリー構築、および／またはシークエンシングは、１以上の予め入れられた薬剤を含むマイクロ流体デバイスで行われる。本発明の方法における使用のために特に好ましくは、ＣＤまたはＤＶＤを含む単一のプラットフォームで分離、混合、反応、およびナノサイズの分子の検出等のプロセスを統合するために使用されるｌａｂ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ技術のタイプの、遠心マイクロ流体ディスクシステム（当分野では「遠心マイクロ流体バイオチップ」または「遠心マイクロ流体バイオディスク」としても知られる）である。遠心マイクロ流体構造には、バルブ、容積計測、混合、および流れの切り替えを含む様々な典型的なユニットがある。これらのタイプのユニットは、様々な方法で使用され得る構造を作ることができる。分子が薬剤と反応する前に、反応のために分子を調製する必要がある。最も典型的には、遠心力による分離である。血液の場合、たとえば、血漿からの血球の沈殿は、バイオディスクを数分間回転することにより達成できる。分離後、以降のプロセスのためにゲノム材料およびプロテオーム材料を放出するために、すべての分子診断アッセイで細胞／バイアル溶解ステップが必要である。典型的な溶解方法には、科学的方法および物理的方法が含まれる。科学的溶解方法は、最も単純な方法であり、化学的な界面活性剤または酵素を使用して膜を壊す。物理的溶解は、ディスク上のビーズ破砕システムを用いて行うことができる。溶解は、ビーズと細胞の間の衝突および剪断、ならびに溶解チャンバーの壁に沿った摩擦剪断を通じて起こる。

【0039】

ある態様では、ディスクは、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ、および／またはライブラリー作成を自動化および統合するために予め入れられた薬剤を含む。たとえばｔａｎｇらの総説（非特許文献４５）を参照されたい。

【0040】

本発明の方法における使用のための代表的なディスクは、国際公開第２０１３／１２４２５８号、国際公開第２０１４／１９８７０３号、国際公開第２０１５／１８９２８０号、国際公開第２０１５／０５１９５０号、および国際公開第２０１７／１９１０３２号等の、Ｈａｈｎ Ｓｃｈｉｃｋａｒｄ名義の特許出願に開示されているような特定の特徴を１つ以上有するものが含まれる。

【0041】

本発明の方法では、バイオインフォーマティクス解析は、有利なことに、ウェブベースのインタラクティブアプリケーションの使用を含む。たとえば、バイオインフォーマティクス解析には、生データの前処理、プライマー配列解析、免疫遺伝学的アノテーション、結果の後処理、ｃＩＴ－ＱＣの解析と使用（マーカーの定量を含む）、ｃＰＴ－ＱＣの解析と使用（予め解析され蓄積されている参照データセットとの比較を含む）、結果の報告／結果へのアクセス／結果の可視化のために、専用バイオインフォーマティクスアプリケーション（ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ、または同等物等）の使用が含まれる。

【0042】

本発明は２つの参照／ＱＣ標準の応用を示すが、これにより、マーカーの同定において高い再現性、正確性、および精度を有するＩＧ／ＴＲ ＮＧＳデータの標準解析（たとえば、本明細書で開示されるＮＧＳプライマーセットを用いて）が可能になる。ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅでは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに付随する完全なｉｎ ｓｉｌｉｃｏの解決法を提供し、これは、リンパ系悪性腫瘍における有効なマーカー同定に必要なすべての品質基準と定量化の概念を含むＩＧ／ＴＲ配列の解析を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1(1-2)】研究設計。

【図1(2-2)】ｃＩＴ－ＱＣおよびｃＰＴ－ＱＣの開発および応用のワークフロー、ならびに９６穴プレートによる試験データセットの概略図。

【図2(1-2)】マーカー同定における品質管理および定量のためのＳＯＰの概略図。ライブラリー調製、ＰＣＲ＆ＮＧＳ。

【図2(2-2)】ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅを用いたバイオインフォーマティクス。

【図3】試験データセットにおけるｃＩＴ－ＱＣとマーカーの関係のプロット。Ａ：ｃＩＴ－ＱＣとマーカー間の％リード率の関係（％）。ｃＩＴ－ＱＣでの％の分母はジャンクションがあるリードであり、マーカーでの％の分母は、ｃＩＴ－ＱＣのリードを除いたジャンクションがある「使用可能な」リードと呼んでいるものである。これにより合計が１００％を超える。Ｂ：細胞の割合に正規化する前後のマーカーの量。^＊正規化により値が１００％を超える場合がある。

【図4(1-4)】ＡＬＬにおけるマーカー同定のためのＩＧ／ＴＲ ＮＧＳアッセイの多施設検証のためのワークフローの概略図。ＩＧおよびＴＲ遺伝子再構成は、多重ＰＣＲアッセイを用いた２ステップアプローチで増幅される。各参画研究室は、ＡＬＬを有する１０人の患者でＮＧＳベースのＩＧ／ＴＲ ＭＲＤマーカー同定を行った。本発明のポリターゲット集中品質管理（ｃＰＴ－ＱＣ）組成物を使用してプライマー性能をモニターし、ライブラリー特異的な品質管理および較正機能として、本発明のチューブ内集中品質管理／数量管理（ｃＩＴ－ＱＣ）を各サンプルに添加した。９６穴フォーマットでピペッティングをした。データ解析は、ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅを使用して行った。

【図4(2-4)】ＡＬＬにおけるマーカー同定のためのＩＧ／ＴＲ ＮＧＳアッセイの多施設検証のためのワークフローの概略図。ＩＧおよびＴＲ遺伝子再構成は、多重ＰＣＲアッセイを用いた２ステップアプローチで増幅される。各参画研究室は、ＡＬＬを有する１０人の患者でＮＧＳベースのＩＧ／ＴＲ ＭＲＤマーカー同定を行った。本発明のポリターゲット集中品質管理（ｃＰＴ－ＱＣ）組成物を使用してプライマー性能をモニターし、ライブラリー特異的な品質管理および較正機能として、本発明のチューブ内集中品質管理／数量管理（ｃＩＴ－ＱＣ）を各サンプルに添加した。９６穴フォーマットでピペッティングをした。データ解析は、ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅを使用して行った。

【図4(3-4)】ＡＬＬにおけるマーカー同定のためのＩＧ／ＴＲ ＮＧＳアッセイの多施設検証のためのワークフローの概略図。ＩＧおよびＴＲ遺伝子再構成は、多重ＰＣＲアッセイを用いた２ステップアプローチで増幅される。各参画研究室は、ＡＬＬを有する１０人の患者でＮＧＳベースのＩＧ／ＴＲ ＭＲＤマーカー同定を行った。本発明のポリターゲット集中品質管理（ｃＰＴ－ＱＣ）組成物を使用してプライマー性能をモニターし、ライブラリー特異的な品質管理および較正機能として、本発明のチューブ内集中品質管理／数量管理（ｃＩＴ－ＱＣ）を各サンプルに添加した。９６穴フォーマットでピペッティングをした。データ解析は、ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅを使用して行った。

【図4(4-4)】ＡＬＬにおけるマーカー同定のためのＩＧ／ＴＲ ＮＧＳアッセイの多施設検証のためのワークフローの概略図。ＩＧおよびＴＲ遺伝子再構成は、多重ＰＣＲアッセイを用いた２ステップアプローチで増幅される。各参画研究室は、ＡＬＬを有する１０人の患者でＮＧＳベースのＩＧ／ＴＲ ＭＲＤマーカー同定を行った。本発明のポリターゲット集中品質管理（ｃＰＴ－ＱＣ）組成物を使用してプライマー性能をモニターし、ライブラリー特異的な品質管理および較正機能として、本発明のチューブ内集中品質管理／数量管理（ｃＩＴ－ＱＣ）を各サンプルに添加した。９６穴フォーマットでピペッティングをした。データ解析は、ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅを使用して行った。

【図5A-1】再編集およびプライマーセットの一覧図、および調査した各遺伝子座のジャンクションヌクレオチド長を示すヒストグラム。５Ａ－１は、ＩＧＨ－ＶＪおよびＩＧＨ－ＤＪの再構成の一覧図である。ＶＨファミリープライマー、ＤＨファミリープライマー、およびコンセンサスＪＨプライマーの相対的な位置は、関連するＲＳＳの最上流（－）または最下流（＋）の５’ヌクレオチドによる。

【図5A-2】ＢＣＰ－ＡＬＬ患者、ｃＰＴ－ＱＣ、ＢＣ、胸腺、および扁桃腺の完全なＩＧＨ再構成（ＩＧＨ－ＶＪチューブ）のジャンクションヌクレオチド長を示すヒストグラムである。バーはＶ－Ｊ遺伝子の組み合わせに従って彩色されている。

【図5A-3】ＢＣＰ－ＡＬＬ患者、ｃＰＴ－ＱＣ、ＢＣ、胸腺、および扁桃腺の不完全なＩＧＨ再構成（ＩＧＨ－ＤＪチューブ）のジャンクションヌクレオチド長を示すヒストグラムである。バーはＤ－Ｊ遺伝子の組み合わせに従って彩色されている。

【図5B-1】ＩＧＫ－ＶＪ再構成および２タイプのＫｄｅ再構成（Ｖ－ＫｄｅおよびイントロンＲＳＳ－Ｋｄｅ）の一覧図である。ＶＫ、ＪＫ、Ｋｄｅ、およびイントロンＲＳＳ（ＩＮＴＲ）プライマーの相対的な位置は、関連するＲＳＳの最上流（－）または最下流（＋）の５’ヌクレオチドによる。

【図5B-2】Ｂ－ＡＬＬ患者、ｃＰＴ－ＱＣ、ＢＣ、胸腺、および扁桃腺のＩＧＫ－ＶＪおよびＩＧＫ－Ｖ－Ｋｄｅ再構成（ＩＧＫ－ＶＪ－Ｋｄｅチューブ）のジャンクションヌクレオチド長を示すヒストグラムである。バーはＶ－Ｊ－Ｋｄｅ遺伝子の組み合わせに従って彩色されている。

【図5B-3】ＢＣＰ－ＡＬＬ患者、ｃＰＴ－ＱＣ、ＢＣ、胸腺、および扁桃腺のイントロン－Ｋｄｅ再構成（イントロン－Ｋｄｅチューブ）のジャンクションヌクレオチド長を示すヒストグラムである。

【図5C-1】ＴＲＢ－ＶＪ再構成およびＤＪ再構成の一覧図である。ＴＲＢ Ｖファミリープライマー、ＴＲＢ Ｄプライマー、およびＴＲＢプライマーの相対的な位置は、関連するＲＳＳの最上流（－）または最下流（＋）の５’ヌクレオチドによる。

【図5C-2】Ｔ－ＡＬＬ患者、ｃＰＴ－ＱＣ、ＢＣ、胸腺、および扁桃腺の完全なＴＲＢ再構成（ＴＲＢ－ＶＪチューブ）のジャンクションヌクレオチド長を示すヒストグラムである。バーはＶ－Ｊ遺伝子の組み合わせに従って彩色されている。

【図5C-3】Ｔ－ＡＬＬ患者、ｃＰＴ－ＱＣ、ＢＣ、胸腺、および扁桃腺の不完全なＴＲＢ再構成（ＴＲＢ－ＤＪチューブ）のジャンクションヌクレオチド長を示すヒストグラムである。バーはＤ－Ｊ遺伝子の組み合わせに従って彩色されている。

【図5D-1】ＴＲＧ Ｖ－Ｊ再構成およびＴＲＧ ＶおよびＴＲＧ Ｊプライマーの相対的な位置の一覧図である。ＴＲＧ ＶプライマーおよびＴＲＧ Ｊプライマーの相対的な位置は、関連するＲＳＳの最上流（－）または最下流（＋）の５’ヌクレオチドによる。

【図5D-2】Ｔ－ＡＬＬ患者、ｃＰＴ－ＱＣ、ＢＣ、胸腺、および扁桃腺のＴＲＧ再構成（ＴＲＧチューブ）のジャンクションヌクレオチド長を示すヒストグラムである。バーはＶ－Ｊ遺伝子の組み合わせに従って彩色されている。

【図5E-1】ＶＤ、ＪＤ、ＤＤ、およびＪＡ２９プライマーの位置を示す、ＶＤ－ＪＤ、ＤＤ－ＪＤ、ＤＤ－ＤＤ、およびＶＤ－ＤＤ、ＶＤ－ＪＡ２９再構成の一覧図であり、全て１つのチューブ内に合わせられている。Ｖｄ、Ｄｄ、およびＪｄプライマーの相対的な位置は、関連するＲＳＳの最上流（－）または最下流（＋）の５’ヌクレオチドによる。

【図5E-2】Ｔ－ＡＬＬ患者、ｃＰＴ－ＱＣ、ＢＣ、胸腺、および扁桃腺のＴＲＤ再構成（ＴＲＤチューブ）のジャンクションヌクレオチド長を示すヒストグラムである。バーはＶ－Ｄ－Ｊ遺伝子の組み合わせに従って彩色されている。

【図6】ＡＬＬにおけるＭＲＤマーカー同定のための多施設検証の結果である。左側のカラム：サンガー法シークエンシングにより同定されたインデックス配列。右側のカラム：ＮＧＳにより同定されたインデックス配列。カラムの最も暗い色の部分は、両方法により同定されたクローン配列を反映し、最も明るい色の部分は、それぞれの方法によってのみ同定された配列である。中間の色の部分は、両方法により同定されたクローン配列であるが、ＮＧＳでは正規化後に５％未満であったものである。

【発明を実施するための形態】

【0044】

（実施例１：チューブ内集中品質管理／数量管理（ｃＩＴ－ＱＣ）の設計および生産）

【0045】

ソースおよび方法
米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；ｗｗｗ．ｌｇｃｐｒｏｍｏｃｈｅｍ－ａｔｃｃ．ｃｏｍ、マナッサス、ＶＡ、米国）およびドイツ微生物・細胞培養コレクション有限会社（ＤＳＭＺ；ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ、ブラウンシュワイク、ドイツ）から、合計で５９のヒトＢリンパ系細胞株（ｎ＝３０）およびＴリンパ系細胞株（ｎ＝２９）を得た。フェノール－クロロホルム抽出プロトコールを用いて培養細胞株からＤＮＡを単離し、続いてエタノール沈殿およびトリスエチレンジアミン四酢酸（ＴＥ）バッファーへの溶出を行った。あるいは、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ＭＯ、米国）で、メーカーのプロトコールに従ってＤＮＡを単離した。

【0046】

細胞株特異的なクローンＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成の同定
５９細胞株の各々は、各細胞株からの１００ｎｇのＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＱｕｂｉｔ３．０で定量）で、バフィーコート（ＢＣ）を添加せずに、前述のユーロクローナリティ－ＮＧＳアッセイを用いてクローンＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成のスクリーニングを行った。1サンプル当たり少なくとも２０００リードとなるように、ライブラリー当たり７ｐＭの終濃度で、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、サンディエゴ、ＣＡ、米国）でペアエンドシークエンシング（２×２５０ｂｐ）を行った。低複雑性のライブラリーの問題を避けるために、１０％ＰｈｉＸコントロールを各配列決定に加えた。

【0047】

細胞株特異的なクローンＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成の検証
さらなる方法を用いて、ＮＧＳアンプリコン同定の細胞株再構成を検証した。
１．ユーロクローナリティ－ＮＧＳワーキンググループで確立された、ＩＧ／ＴＲ遺伝子座のＶ、Ｄ、およびＪコード遺伝子をカバーする、キャプチャーベースのプロトコール；要するに、細胞株ＤＮＡを断片化し、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒｐｌｕｓ ＫｉｔおよびＬｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、プレザントン、ＣＡ、米国）で処理し；Ｗｒｅｎら（非特許文献３７）に基づいて開発されたカスタムＳｅｑＣａｐ ＥＺ Ｃｈｏｉｃｅ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、プレザントン、ＣＡ、米国）でライブラリーのハイブリダイゼーションを行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑで２×１５０ｂｐのペアエンドシークエンシングを行った。
２．ＢＩＯＭＥＤ－２プロトコールに従った多重増幅およびサンガーシークエンシング：ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＸＣＥＬ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（非特許文献１１、４６）で断片サイズおよびクローン性を確認した。クローンＰＣＲ産物にヘテロ二本鎖分析を行い、ＡＢＩ３１３０またはＡＢＩ３５００プラットフォーム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ、米国）のいずれかでシークエンスした。

【0048】

異なる方法で得られたすべての細胞株のＩＧ／ＴＲ再構成プロファイルを比較した。

【0049】

ヒトＢ細胞株およびＴ細胞株の細胞株特異的な遺伝子再構成のｄｄＰＣＲによる検証
３つの方法間での結果の食い違いについて、それぞれの再構成を検証するために、ＩＧ／ＴＲ対立遺伝子特異的なＰＣＲアッセイを、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（ＱＸ２００ＴＭ Ｄｒｏｐｌｅｔ ＤｉｇｉｔａｌＴＭ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で設計した。ｄｄＰＣＲによるＩＧ／ＴＲ再構成の絶対的な定量は、２つの異なる量のｇＤＮＡ（５０ｎｇ、１００ｎｇ）を用いて行われた。各々の実験には、ポリクローナルバフィーコートＢＣ対照および鋳型なしの対照が含まれた。

【0050】

クローンＩＧ／ＴＲ再構成のための対立遺伝子特異的なプライマーおよび定量のためのプローブは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈにより合成された。全てのプライマーは脱塩精製され、一方、５’－ＦＡＭ／３’－ＴＡＭＲＡレポーター色素を有する加水分解プローブはＨＰＬＣ精製された。すべてのオリゴヌクレオチドはＴＥバッファーに再懸濁し、総鎖濃度Ｃｔ＝１００μＭとし、使用するまで－２０℃で保存した。

【0051】

１０μＬの２×ｄｄＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、ＣＡ）、事前にＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）で定量した試験する２つの異なる量の細胞株ｇＤＮＡ（５０ｎｇ／５００ｎｇ）、それぞれ終濃度が３００ｎｍｏｌ／Ｌのフォワードプライマー（ＦＰ）およびリバースプライマー（ＲＰ）、ならびにＦＡＭを付したプローブ（１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を用いて２０μＬの容量でｄｄＰＣＲ反応を調製した。ドロップレットは、２０μＬの反応混合物および７０μＬのプローブ用ドロップレット生成オイル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ＱＸ２００ドロップレット生成装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）により生成され、ＤＧ８カートリッジ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）の適切な穴上に配置される。約４５μＬのドロップオイル混合物（１２，０００～２０，０００ドロップ）を９６穴プレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移し、次の増幅プロトコールでＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｄｙａｄ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ上に配置された：９５℃で１０分間、続いて、９４℃で３０秒間変性、６０℃で１分間アニーリング、６０℃で１分間伸長を４０サイクル。ＰＣＲ産物はＱＸ２００ドロップレットリーダーに送り込まれ、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．２ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により解析された。

【0052】

細胞株混合物の調製
初めに、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）により、選択したＢ細胞株およびＴ細胞株のＤＮＡの定量を行った。１μＬのＤＮＡあたりの細胞数を正確に測定するために、５０～２００ｎｇ ＤＮＡ／細胞株を使用したｄｄＰＣＲに基づくアルブミンハウスキーピング遺伝子の定量により、定量値を再確認した。アルブミンの定量のためのプライマーおよびプローブはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈにより合成された。上述のプロトコールに従い、各細胞株につき２回繰り返して、ｄｄＰＣＲを行った。ＰＣＲの完了後、２０μＬの反応容量あたりの細胞株のコピー数に関して、サンプルをドロップレットリーダーで解析した。ｄｄＰＣＲからの値に基づき、細胞株ＤＮＡをＴＥバッファーで希釈して４００コピー／μＬにした。その後、別途のｄｄＰＣＲ定量を行い、各細胞株ＤＮＡの希釈の確認を再度行った。インプット量として、２つの異なる容量の細胞株の希釈液（０．５μＬ ＤＮＡ［２００コピー］および２μＬ ＤＮＡ［８００コピー］）を使用した。適切な定量値で、細胞株ＤＮＡをさらに希釈して混合し、２μＬのＤＮＡ混合物中に各細胞株が４０コピー存在するようにした。この混合物をｃＩＴ－ＱＣとして各サンプルに加え、シークエンス前に同時のライブラリー調製に供した。

【0053】

ｃＩＴ－ＱＣの実行
バイオインフォーマティクス的には、ｃＩＴ－ＱＣリードは、数値計算であって不正確な可能性のあるアライメントベースのアプローチを回避し、配列の変化を許容する、極めて高速な免疫遺伝学的なアノテーションベースのアプローチを用いて同定される。ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅでは、「スパイクイン」という用語もｃＩＴ－ＱＣを指す用語として使用される。

【0054】

ＱＣに関しては、ｃＩＴ－ＱＣ再構成あたり少なくとも１つのリードの同定、および少なくとも使用した総細胞数と同数の総ｃＩＴ－ＱＣリードの同定が必要であり、そうでなければ、サンプルに「ＱＣ失敗」のタグがつけられる（ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅでの使用方法について以下を参照）。定量化係数－総ｃＩＴ－ＱＣ細胞数を総リード数で割って算出－は保存され、任意のケースに適用されるため、ユーザーはサンプルを解析することができる。

【0055】

定量は、定量化係数を適用してクロノタイプのリード数を細胞数に変換し、総インプット細胞に対する相対存在量を算出することに基づく。

【0056】

（実施例２：ポリターゲット集中品質管理（ｃＰＴ－ＱＣ）の設計および生産）

【0057】

ソースおよび方法
健康なヒト胸腺、健康なヒト扁桃腺、および健康なヒト末梢血単核球から単離したゲノムＤＮＡからなるｃＰＴ－ＱＣ組成物を調製した（ＤＮＡ量は１：１：１の比で混合）。そのために、組織の切断および細分化後に、またはフィコール密度血液分離後に得られた細胞懸濁液で、（半）自動化ゲノムＤＮＡ抽出を行った。

【0058】

ｃＰＴ－ＱＣ組成物は、調査サンプルと一緒にＮＧＳライブラリー調製に用いるのに適している。ユーロクローナリティ－ＮＧＳアッセイでは、１回のランあたり、１つのｃＰＴ－ＱＣサンプルを８つのチューブで増幅する。

【0059】

ｃＰＴ－ＱＣの実行
８つのｃＰＴ－ＱＣチューブの各々のリードにおいて、プライマーはバイオインフォーマティクス的に同定され、その存在量を保存されたｃＰＴ－ＱＣ参照結果と比率の検定を用いて比較した。

【0060】

保存された参照結果は、ｃＰＴ－ＱＣサンプルの解析からのＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅのアウトプットである。これらの結果は、技術的なばらつきを調整するために各研究室で繰り返し実行して確認すべきである。ユーザーにより不用意にバイオインフォーマティクス解析が損なわれないことを確実にするために、生データではなく結果が保存され、これは、新しいランとの互換性を確実にするために、ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅの主要なリリースごとに結果が更新されることを意味する。

【0061】

特定のプライマーまたは特定のプライマーセットの存在量の問題は、対応するｃＰＴ－ＱＣサンプルおよび同じライマーセットのすべてのユーザーサンプルを「ＱＣ失敗」としてタグ付けするために使用される。

【0062】

反復試行
このタイプのＱＣでは再現性が重要であり、ｃＰＴ－ＱＣが反復試行される。５’プライマーの相対的存在量を、比率の検定を用いて比較した。

【0063】

プライマー摂動による実行
プライマー性能の問題を検出するためのｃＰＴ－ＱＣの有用性を評価するために、プライマー濃度の摂動を人為的に作り、プライマーのピペッティングの失敗、または誤ったプライマー濃度のピペッティングを模した。

【0064】

まず、５’プライマーの使用をｃＰＴ－ＱＣサンプルで解析し、２つのプライマーしか有しないイントロン－Ｋｄｅプライマーセットは抜かして、異なる存在量の２つのプライマーを各プライマーセットから選択した；ＩＧＨ－ＶＪ－ＦＲ１－Ｍ－１、ＩＧＨ－Ｖ－ＦＲ１－Ｏ－１；ＩＧＨ－Ｄ－Ｂ－１、ＩＧＨ－Ｄ－Ｅ－１；ＩＧＫ－Ｖ－Ｇ－１、ＩＧＫ－Ｖ－Ｉ－１；ＴＲＢ－Ｖ－ＡＤ－１、ＴＲＢ－Ｖ－Ｇ－１；ＴＲＢ－Ｄ－Ａ－１、ＴＲＢ－Ｄ－Ｂ－１；ＴＲＧ－Ｖ－Ｆ－１、ＴＲＧ－Ｖ－Ｅ－１；ＴＲＤ－Ｄ－Ａ－１、ＴＲＤ－Ｖ－Ｂ－１。それらのプライマーは、プライマープールから完全に除く、濃度を１０％に減少させる、および２００％に増加させることにより摂動させた。５’プライマーの相対的存在量は、比率の検定を用いて、これらの摂動させたセットおよびｃＰＴ－ＱＣと比較した。

【0065】

試験データセットの作成
前述のコンセプトおよび機能性を評価および紹介するために、以下のサンプルからなるデータセットを作成した。
１．白血病細胞の含有量が高い４つの診断用骨髄Ｂ－／Ｔ－ＡＬＬサンプル（日常的な細胞形態学的に評価で白血病の浸潤が６０～８０％）。
２．Ｂ／Ｔ細胞標的治療後のＢ／Ｔ細胞形成不全の患者の４つのサンプル。Ｂ細胞形成不全の２つのサンプルはリツキシマブ（抗ＣＤ２０）治療後のＣＬＬサンプルであり、Ｔ細胞形成不全の２つのサンプルは、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）治療後のＴ－ＰＬＬ（前リンパ球性白血病）サンプルである。これらのすべてのサンプルにおいて、フローサイトメトリーにより系統特異的な形成不全を確認した。
３．すべてのＩＧ／ＴＲプライマーセットのためのｃＰＴ－ＱＣであるが、ＴＲＢ－ＶＪプライマーセットの結果は、上述の検証実験での摂動結果と入れ替えられている。一般的なＱＣの機能性を紹介するために、診断サンプルの１つから１０００未満のランダムなリードを人為的に選択した。

【0066】

方法論
診断サンプルおよびｃＰＴ－ＱＣをすべてのプライマーセットと共にランする一方、形成不全の追跡サンプルは、対応するプライマーセット、すなわち、Ｂ細胞形成不全のサンプルのためのＩＧセット、およびＴ細胞形成不全のサンプルのためのＴＲセット（図１、試験データセットに示す）と共にのみランする。さらに、追跡サンプルは、ｃＩＴ－ＱＣ組成物の添加が、免疫遺伝学的プロファイルを損なうことなく、シークエンシングのためのサンプルの安定化に十分であるか否かを試験するために、バフィーコート（ＢＣ）を添加せずにランした。この目的のために、図２に可視化したプロトコールに従った。

【0067】

ｃＰＴ－ＱＣを用いたプライマー性能評価
ｃＰＴ－ＱＣ、ＢＣ、それらの複製、およびプライマー摂動を伴うライブラリーに適用された５’プライマーの相対的存在量の比率の検定は、摂動されていないプライマーと摂動されたプライマーのセット間でｐ値に明らかな違いがあることを示した。言い換えると、摂動されたプライマーの存在量の差異のｐ値が顕著に低い。表２は、結果を簡略化して表したものであり、プライマーの通常の挙動を示すか、または異常な挙動を検討するために、プライマーセットあたりの摂動されたプライマー、および少なくとも１つの他の摂動されていないプライマーの存在量に焦点を当てたものである。すべてのプライマーセットにおける５’プライマーの存在量の割合。上側のグループのプライマーは摂動されており、下側のグループは摂動されていないままの選択されたプライマーであり、プライマーセットごとにアルファベット順に選択された１つ、さらにプライマーの挙動が議論の対象となる２例である（テキスト参照）。結果：ｃＰＴ－ＱＣ反復試行（３番目のカラム）；対プライマー除外サンプル（「０％」、４番目のカラム）、対プライマーを１０％に減少させたサンプル（５番目のカラム）、対プライマーを２００％に増加させたサンプル（６番目のカラム）を示す。比率の検定につながった割合の変化（個別に＋／－として示す）。

【0068】

ｐ値の閾値が１ｅ－２００の場合、ｃＰＴ－ＱＣでフラグ付けされるプライマーはなく、アッセイの再現性が協調される一方、摂動シナリオでは、すべての摂動されたプライマーがフラグ付けされる。実際、摂動比較で複数のゼロ値（いくつかの例外を除き主に２００％摂動）と比較して、通常のサンプルで最も低いＰ値は、ＴＲＤ－Ｖ－Ａ－１プライマーの７．８６ｅ－１４２である（表２）。存在量の有意な変化は、それらのプライマーが他のプライマーの摂動により間接的に影響されたという最も可能性の高い説明で、別の細胞でも見られた。つまり、当初の存在量のプライマーが除かれた場合に、ＩＧＨ－ＶＪ－ＦＲ１－Ｍ－１が摂動された場合のＩＧＨ－Ｖ－ＦＲ１－Ｄ－１のように、特にそれらのプライマーが遺伝子の部分的に重複するリストを増幅するため、あるプライマーが「引き継ぐ」。

【0069】

ＡＲＲｅｓＴ／ＩｎｔｅｒｒｏｇａｔｅにおけるＱＣ側面の評価
ｃＰＴ－ＱＣとｃＩＴ－ＱＣの両方に基づくｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの品質管理の情報は、ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅで入手可能であり、「ＱＣ失敗」のサンプルは、ユーザーが意図せずに使用することを警告し、防ぐため、規定設定で除外されている。しかし、ユーザーにはそれらを解析に戻し含めるオプションが通知され、選択肢を有する。

【0070】

一般的な品質管理はサンプルにも行われ、特に生のリード数が少ないこと、およびジャンクションが同定されたリードの割合が少ないことをチェックする。そのようなサンプルも、「ＱＣ失敗」としてタグ付けされる。

【0071】

【表2】

【0072】

（実施例３：マーカーの同定および定量）
リンパ球亜群の存在量は、リンパ系腫瘍の患者のサンプルではわからないことが多い。さらに、ＩＧ／ＴＲ ＮＧＳは再構成の相対的な表現のみを反映するため、シークエンシングのリードをインプットＤＮＡ細胞に対して正規化することができるであろう較正機能を確立することが重要であった。これは、少数のリンパ系細胞にのみ存在する再構成をもっぱらカバーするチューブ（特にＴＲＤおよびイントロン－Ｋｄｅチューブ）では特に重要である。ＴＲＤ遺伝子は、正常のＢ細胞では再構成されておらず、ほとんどのＴＲαβ細胞では削除されている。したがって、特に小児期に正常のＴＣＲγδＴ細胞レパートリーが著しく偏っている場合、オリゴクローナルＴＣＲγδＴ細胞は、ＴＲＤ ＮＧＳアッセイでは優勢なクローン型を生み出し得る。ここで、ｃＩＴ－ＱＣに基づく存在量の修正が、少数のＴＣＲγδＴ細胞群からの（少数の）クローンＴＲＤ再構成を、さらなるＭＲＤ解析のマーカーとなるであろう白血病性の再構成として誤認定するのを避けるために最も重要である。

【0073】

試験データセットの解析は、マーカーの同定および定量におけるｃＩＴ－ＱＣの有用性を示した。ｃＩＴ－ＱＣなしで、単にリード数に基づいた場合、診断サンプルおよび形成不良サンプルの両方とも、オリゴクローナルであるようである（図３）。しかし、全ての形成不良サンプルおよびいくつかの診断サンプルにおいて、非常に限られた数のｃＩＴ－ＱＣ細胞（１２０～１４４、プライマーセットあたりのｃＩＴ－ＱＣ再構成の数による）からの非常に多くのリード数は、それらのサンプル中に、特定のＩＧ／ＴＲ遺伝子座の再構成を有する患者に関するインプット細胞が限定された数であることを、間接的であるが明らかに示している。別の見方では、ｃＩＴ－ＱＣの総リード率は、これらのサンプルにおける再構成のものよりかなり高く、これは、ｃＩＴ－ＱＣ細胞の数も患者に関するインプット細胞の数より多いことを示唆している。実際、ｃＩＴ－ＱＣでの定量後、細胞の存在量はクローン性を示す閾値よりも大きく下回る。一方、想定した通り、診断サンプルでは、ｃＩＴ－ＱＣ配列は少数である。したがって、ｃＩＴ－ＱＣでは、ある再構成の存在量をより正確に決定し、細胞の存在量に再計算することができる。

【0074】

さらに、５つの熟練したユーロＭＲＤ ＡＬＬ参考研究室が、５０の診断ＡＬＬサンプルでＩＧ／ＴＲ ＮＧＳを行い、結果を、日常的なＩＧ／ＴＲサンガーシークエンシングでの結果と比較した。ｃＰＴ－ＱＣ組成物を使用してプライマー性能をモニターし、ライブラリー特異的な品質管理および較正機能として、各サンプルにｃＰＴ－ＱＣを添加した。サンガーシークエンシングでは２４８（平均５．０／サンプル、０～１４の範囲）であったのに対し、ＮＧＳは２５９（平均５．２／サンプル、０～１４の範囲）のクローン配列を同定した。サンガーとＮＧＳの全体的な一致は、非検出のライブラリーを含めて、７８％であった。

【0075】

（実施例４：ＡＬＬにおけるＭＲＤマーカーの同定のためのＩＧ／ＴＲ ＮＧＳアッセイの開発および多施設検証
本実施例は、バイオインフォーマティクス、および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）におけるＭＲＤマーカー同定のための検証を含む、ＩＧ／ＴＲアッセイの開発および設計を説明する。５つのユーロＭＲＤ ＡＬＬ ＭＲＤ参考研究室が、５０の診断ＡＬＬサンプルでＩＧ／ＴＲ ＮＧＳを行い、結果を、日常的なＩＧ／ＴＲマーカーのスクリーニング、およびサンガーシークエンシングでの結果と比較した。ｃＰＴ－ＱＣ組成物を使用してプライマー性能をモニターし、ライブラリー特異的な品質管理および較正機能として、各サンプルにｃＰＴ－ＱＣ組成物を添加した。検証研究の全体的なワークフローを図４に示す。

【0076】

（材料および方法）
アッセイ設計の基本コンセプト
ＤＮＡレベルでのＩＧ／ＴＲ配列解析のための、すべてのリンパ系腫瘍に適用できる普遍的なアンプリコンベースのＮＧＳアプローチを開発することを目的として、ＩＧ重鎖（ＩＧＨ）、ＩＧカッパ（ＩＧＫ）、ＴＲベータ（ＴＲＢ）、ＴＲガンマ（ＴＲＧ）、およびＴＲデルタ（ＴＲＤ）について、適用できる限り完全および不完全な再構成を含む複数のＩＧ／ＴＲ遺伝子座についてのアッセイを設計した。ＩＧラムダ（ＩＧＬ）は、他のＩＧ遺伝子座に対する相補性が限定されているため、および多様性が少ないため、除外した。ＴＲアルファ（ＴＲＡ）は、そのかなりの複雑さのためにＤＮＡレベルでの合理的な多重ＰＣＲ法を妨害するため、除外した。

【0077】

ＩＧＨ遺伝子座は２ステップで再構成されている（図５Ａ）。１つのＩＧＨ－Ｄ遺伝子とＩＧＨ－Ｊ遺伝子の最初の結合の後、ＩＧＨ－Ｖ遺伝子が不完全なＩＧＨ－ＤＪ再構成に結合し、完全なＩＧＨ－ＶＪ再構成となる。完全なＩＧＨ再構成の増幅のために、ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３領域に位置するプライマーを設計したが、ここで我々はＡＬＬにおけるマーカー同定のためのＦＲ１アッセイについて説明する。ＩＧＨ－ＤＪ再構成は別の多重ＰＣＲ反応で増幅する。ＩＧＫ軽鎖の遺伝子座は、機能的なＩＧＫＶおよびＩＧＫＪ遺伝子と、ＩＧＫＶ遺伝子に再構成することができるいわゆるカッパ削除エレメント（Ｋｄｅ）、またはＩＧＫ対立遺伝子の機能的な不活性化をもたらすＩＧＫＪ－ＩＧＫＣイントロン中の組換えシグナル配列（ＲＳＳ）から構成される（図５Ｂ）。ＩＧＫＶフォワードプライマーは、１度の多重反応においてＩＧＫＪおよびＫｄｅリバースプライマーと組み合わせて使用するために設計されており、フォワードイントロンＲＳＳプライマーとリバースＫｄｅプライマーで第２のＰＣＲが開発された。

【0078】

ＴＲＢの遺伝子座も、最初の不完全なＴＲＢ－ＤＪ再構成の構成と、それに続く完全なＴＲＢ－ＶＪ再構成の２ステップのプロセスを特徴とする。不完全および完全なＴＲＢ再構成は、２つの別々な多重ＰＣＲ反応において検出されるように設計された（図５Ｃ）。ＴＲＧ遺伝子座再構成は、限られた数のＴＲＧＶおよびＴＲＧＪ遺伝子を有するワンステップのＶＪ組換えであるため、１度の多重アッセイを開発することができた（図５Ｄ）。最後に、ＴＲＤ遺伝子座では、完全なＶＪ再構成の前に、ＤＤ、ＶＤ、およびＤＪ再構成が起こる。さらに、あるＴＲ遺伝子がＴＲＤＪおよびＴＲＡＪを再構成することができ、通常ＴＲＡＪ２９を有するＴＲＤＶ－ＴＲＡＪ再構成も起こり得る。これらの再構成はすべて、１度の多重ＰＣＲアッセイで増幅するように設計されている（図５Ｅ）。バイオインフォーマティクスのプラットフォームであるＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ（非特許文献４３）は、多面的な活性を促進するためにユーロクローナリティ－ＮＧＳワーキンググループ内で既に新規に開発されているが、以下に説明するように、本研究のためにさらに適合された。

【0079】

プライマー設計およびプライマー性能の技術的検証
プライマーは遺伝子特異的に設計したが、対立遺伝子の異型がある場合には、多重化を促進するように縮重プライマーを設計した。同様の理由で、プライマーの中央または５’末端の１つのミスマッチは許容される。表３は、図５のヌクレオチド配列およびさらなるアダプター配列（フォワードまたはリバース）を含むプライマー配列を示す。当業者は、実施例が単なる例示であり、実施例の具体的な方法の多くのバリエーションが可能であることを認識するであろう。たとえば、実施例で使用されるようなプライマーの一部としてM１３配列を使用する必要はない。これは、任意の他の既知のＤＮＡ配列に置き換えることができる。

【0080】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【表3-7】

【0081】

プライマー３（非特許文献３１）、プライマーデジタル（ＰｒｉｍｅｒＤｉｇｉｔａｌ Ｌｔｄ、ヘルシンキ、フィンランド）、ＭＦＥｐｒｉｍｅｒ－２．０（非特許文献３２）、およびオリゴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ， Ｉｎｃ．、コロラド、米国）を使用して、プライマーの特異性および多重性を確認した。プライマーの設計基準は、全ての遺伝子座について、以下に従った：プライマー融解温度を５７～６３℃とする；最終アンプリコンが比較可能なサイズになるようにする；プライマー長を２０～２４ｎｔとする；プライマーダイマーの回避；生殖系配列からより大きなヌクレオチドが削除される再配列のために検出されないのを避けるために、３’プライマー末端とジャンクション領域の最小距離を、好ましくは１０～１５ｂｐ超とする；１塩基多型が知られている領域を避けて、同一のプライマーがＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子それぞれの全ての対立遺伝子にアニーリングできるようにする；好ましくは、再構成されることが知られているすべてのＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子と、ＩＧＫのイントロンＲＳＳおよびＫｄｅ領域を標的とする。

【0082】

ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの設計に続いて、プライマーはまず、原発性の患者のサンプルまたは定義された再構成を有する細胞株を使用して、単一および多重の反応で試験した。そのようなサンプルが入手できない場合は、健康な扁桃腺または単核のＤＮＡサンプルを使用した。その後、再構成された細胞株、および多くの異なるＶ、Ｄ、および／またはＪ遺伝子をカバーする定義された再構成を有する診断サンプルの混合物から、オリゴクローナルな鋳型プールを作製した。あるいは、いくつかの遺伝子座について、可能な限り多くの異なる再構成をカバーするプラスミドのプールを作製した。これらの多標的プールにより、反応条件および／またはプライマー濃度を良好に調整して、比較可能な増幅効率を評価することができる。この反復の試験プロセスにより、プライマーが余分であるとわかった場合には、プライマーの削減ももたらす。さらに、限られた数のモノクローナルおよびポリ／オリゴクローナルのサンプル、ならびに異なるシークエンシングプラットフォームでの多施設試験が行われ、プライマーミックスおよびプロトコールのロバスト性の評価を行うことができた。

【0083】

プラットフォームに依存しないことを目的としたアッセイが設計されたため、２ステップＰＣＲが採用され、多数のバーコードが必要となる場合であっても、シークエンスアダプターを切り替えて、プライマーの総数を減らすことができた。また、現在のシークエンサーでシークエンシング可能な最大リード長を基準に最大アンプリコン長を定義した。ＰＣＲ条件は、すべての反応に共通の最適条件を見つけることを目的に最適化されており、したがって、並行したライブラリー調整が可能である。第１および第２回ＰＣＲにおける多様なＰＣＲサイクル数、種々のポリメラーゼ、およびいくつかのライブラリー調整方法を試験し、比較した。

【0084】

本研究は、もっぱらＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑで行ったが、同じＰＣＲパネルの適応性をＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、単一施設で試験し、ワンステップのＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ＰＣＲ法も単一施設で試験した。

【0085】

ＡＬＬにおけるＭＲＤマーカーの同定のためのアッセイの多施設検証
ユーロクローナリティ－ＮＧＳを熟練した５つの研究室が、ＡＬＬにおけるＩＧ／ＴＲマーカー同定のための最適化されたアッセイを、標準技術と比較して、ロバスト性および適応性を試験した。すべての研究室（ブリストル／ロンドン、パリ、モンツァ、プラハ、およびキール）は、ユーロＭＲＤコンソーシアムのメンバーであり、ＡＬＬ ＭＲＤ解析の参考研究室である。各参画研究室は、ＢまたはＴ系統のＡＬＬを有する１０人の患者で、ＮＧＳベースのＩＧ／ＴＲ ＭＲＤマーカーの同定を行った。主要な標準作業手順は、すべての研究室で厳密に守られた。本研究は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ （２×２５０ｂｐ ｖ２キット）を用いて行われた。ＮＧＳ解析は、標準ガイドライン（非特許文献１１）に従った従来のＰＣＲおよびクローン産物のサンガーシークエンシングと完全に並行して行われた。２つの方法間で不明な矛盾する結果である場合の一部について、それぞれのクローン再構成が白血病の大部分を表しているか否かを明らかにするために、対立遺伝子特異的なＰＣＲ解析（デジタルドロップレットＰＣＲまたはリアルタイム定量ＰＣＲのいずれか）を設計した。ユーロＭＲＤガイドラインを使用して、対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイ（非特許文献３３、３４）を設計し、解釈した。

【0086】

（結果）
プライマー設計およびプライマー性能の技術的検証
試験および検証の段階の結果に基づき、最終的なＩＧ／ＴＲプライマーミックスは、９２のフォワードプライマーおよび３０のリバースプライマー（後者の１５個は異なるチューブのペアで使用する）の８つのチューブからなる。プライマーの位置および配列を図５および表３に示す。

【0087】

品質管理組成物の実施
強い増幅、ライブラリー調整、およびシークエンシングの品質管理は、これらの複合アッセイに最も重要である。同一の反応条件下で異なるプライマーが機能する必要がある一方、サンプルの特性および配列によりさらなるばらつきが導入され得る。プライマー性能は長期的にモニターする必要があり、クローンの存在量を正確に推定するために、入力分子あたりのシークエンスリード数に補正することが重要である。

【0088】

これらの問題を解決するために、２種類の品質管理組成物を含めた：（ｉ）実施例１のｃＩＴ－ＱＣをライブラリーコントロールおよび較正機能として各チューブに添加し、かつ（ｉｉ）実施例２のｃＰＴ－ＱＣを並行してランし、一般的なプライマー性能およびシークエンシングをモニターした。

【0089】

研究室プロトコール
プライマーは、ユニバーサルおよびＴ７リンカー配列が末尾に付加されており、８つのチューブ（ＩＧＨ－ＶＪ、ＩＧＨ－ＤＪ、ＩＧＫ－ＶＪ－Ｋｄｅ、イントロン－Ｋｄｅ、ＴＲＢ－ＶＪ、ＴＲＢ－ＤＪ、ＴＲＧ、ＴＲＤ）に分けられている。ＰＣＲプロトコールを表４にまとめた。各々は、最終反応量５０μｌで、１００ｎｇの診断ＤＮＡおよび１０ｎｇのポリクローナルＤＮＡを用いて、２ステップＰＣＲによりシークエンシングライブラリーを調製した。ｃＩＴ－ＱＣのために、９の異なる各細胞株の４０細胞相当量のゲノムＤＮＡをすべてのサンプルに加えた。ＭｇＣｌ_２は終濃度１．５ｍＭで使用することを想定していたが、いくつかのチューブについては最適化が必要であった。したがって、第１回ＰＣＲのためのマスターミックスはチューブ特異的であったが、温度プロファイルはすべてのチューブで一定であった。

【0090】

第１回ＰＣＲの後、ゲル電気泳動を行ってすべての標的がうまく増幅していることを確認した。第２回ＰＣＲの前に、ＴＲＢについて特異的なＰＣＲ産物のゲル抽出を行った。

【0091】

ＴＲＢを除き、アンプリコンが非常に少なくない限り、全ての第１回ＰＣＲのＰＣＲ産物を１：５０に希釈した。ＴＲＢのＰＣＲ産物、およびアンプリコンが少ないＰＣＲ産物
は、希釈せずに使用した。第２回ＰＣＲのマスターミックスおよび温度プロファイルは、全てのチューブについて同じであった（表４）。第２回ＰＣＲのプライマーには、シークエンスアダプターおよびシークエンスインデックス（バーコード）が含まれていた。各ライブラリーについて、フォワードインデックスおよびリバースインデックスの特有の組み合わせを使用した。第２回ＰＣＲにおいて、希釈していないＴＲＢのＰＣＲ産物３μｌ、ならびに希釈したＩＧＨ、ＩＧＫ、ＴＲＧ、およびＴＲＤの１：５０ＰＣＲ産物１μｌを増幅した。

【0092】

【表4】

【0093】

第２回ＰＣＲに続いて、ランしたすべてのサンプルの産物を、等モル比で８つのチューブ状のサブプールにプールし、ゲル抽出により精製した（アンプリコン長について表５を参照）。最後に、サブプールを等モルで１つの最終プールにプールした。アンプリコンライブラリーの最終濃度７ｐＭで、２×２５０ｂｐ ｖ２ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを使用し、低複雑度ライブラリーの問題を避けるために１０％のＰｈｉＸコントロールを加えて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシークエンサーでシークエンスを行った。

【0094】

【表5】

【0095】

バイオインフォーマティクスのプロトコール
ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅは、本研究で使用した主要なバイオインフォーマティクスのプラットフォームであり、Ｖｉｄｊｉｌ（非特許文献４７）およびＩＭＧＴ（非特許文献４８）リソースと共に、本研究の特定の局面で使用された。ミスマッチがないことを確認し、デマルチプレクシングを行った。リードは、ユーロクローナリティ－ＮＧＳプライマー配列（非アンプリコン配列を切り取るため、およびｃＰＴ－ＱＣベースの品質管理のため）、ペアエンド結合、デリプリケート、免疫遺伝学的アノテーション（非特許文献４８）、および再構成型で分類（完全および不完全、ならびに、イントロン－Ｋｄｅ再構成等の他の特定の型）、または「ジャンクションの種類」でアノテーションされる。再構成がないリードは、相対的存在量のために使用する総リード数から除外した。

【0096】

上述のｃＩＴ－ＱＣ配列は、その免疫遺伝学的アノテーションを通じて、データで同定された。それらのカウントは、「チューブ内」コントロールとしてと、プライマーセットあたりの正規化のための両方で機能し、総ｃＩＴ－ＱＣ細胞数をｃＩＴ－ＱＣの総リード数で割り、得られた係数を、再構成リードを細胞に変換するために使用し、それらの細胞数を総入力細胞数（本実施例では１５，０００）で割った。ＩＧ／ＴＲ配列の同定は、ｃＩＴ－ＱＣ正規化後の存在量が５％を超える場合、インデックス配列として定義された。

【0097】

ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅは、ジャンクションのＤＮＪ３’ステムを追跡することができ、この配列は、Ｖ再構成、または進行中のＶからＤＪへの再構成である場合、ＩＧＨまたはＴＲＢクローン性進化の間、安定したままである。ステムは、Ｄ（または、Ｄがないことが同定されている場合はＮＤＮ）の末尾の３ｎｔ以下、いくつかの、またはすべてのＮ２ヌクレオチド、およびジャンクションのＪヌクレオチドからなる。このステムは、すべてのサンプルにおいて別の免疫遺伝学的特徴として利用でき、したがって、他の特徴、たとえばクロノタイプとリンクさせることができる。

【0098】

ＡＬＬにおけるＭＲＤマーカーの同定のためのアッセイの多施設検証
次に、多施設検証研究のために、５０のＡＬＬ診断サンプル（２９のＢＣＰ－ＡＬＬおよび２１のＴ－ＡＬＬ）を解析した。５つの各参画研究室は、標的ごとに異なる多重ＮＧＳプライマーの組み合わせを含む、予め設定された９６穴プレートを受け取った（図４）。

【0099】

要約すると、９６のライブラリーはラボごとに作られ（計４８０ライブラリー）、４７Ｍリードの総アウトプット（φ９．２Ｍ／ラボ）でシークエンスされた。集中型の解析は、ＩＭＧＴ生殖細胞系列の配列（非特許文献４８）を用いてＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ（非特許文献４３）で行い、さらなる解析および検証は、Ｖｉｄｊｉｌ（非特許文献４７）およびＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ（非特許文献４８）で行った。

【0100】

全体としては、３１１のクローンＩＧ／ＴＲ再構成（クロノタイプ）が同定され、ＮＧＳで平均５．９（０～１４）／サンプル（ｃＩＴ－ＱＣベースの正規化後のＮＧＳに５％閾値を適用）対サンガーで５．０（０～１４）／サンプルであり、一方、２１７（４５％）のライブラリーは、いずれかの方法により閾値を超えるクロノタイプを示さなかった。計１９６／３１１（６３％）のクロノタイプは、ＮＧＳとサンガーの間で完全に一致した（図６）。ＮＧＳは６３のインデックス配列を独占的に同定し、５２のＩＧ／ＴＲサンガー配列は、ＡＲＲｅｓＴ／ＩｎｔｅｒｒｏｇａｔｅによりＮＧのインデックス配列として割り当てられなかった。２６のＮＧＳ検出／サンガー非検出のケースは、それぞれ低スループットアプローチでもクローン性のＰＣＲ産物を示したが、その後のサンガーシークエンシングが、ポリクローナルバックグラウンド、混合配列、または少ないＰＣＲ産物のために失敗した。さらなる６のサンガー非検出／ＮＧＳ検出のケースでは、低スループットアプローチでそれぞれのプライマーが欠落していた。残りの３１の矛盾について、サンガーの失敗についての技術的な説明はみつからなかった（１６／１９のｑ／ｄｄＰＣＲ評価では、再構成はＡＳＯ－ＰＣＲにより確認され、３／１６はサブクローナルレベルであった）。

【0101】

逆に、５％ＮＧＳ閾値を適用した場合に、５２のクローンＩＧ／ＴＲ再構成がサンガーでのみ検出され、５つの配列（ＴＲＧ１つ、ＴＲＢ－ＶＪ２つ、およびＩＧＨ－ＤＪ２つ）については適切なプライマーがＮＧＳプライマーセットに存在せず、１２のケースでは、不一致について説明がみつからなかった。しかし、サンガーが配列を同定した主要な不一致のケース（３５／５２）では（ＴＲＤ７つ、ＴＲＢ－ＶＪ８つ、ＴＲＧ６つ、ＴＲＢ－ＤＪ４つ、ＩＧＫ－ＶＪ－Ｋｄｅ２つ、ＩＧＨ－ＶＪ５つ、ＩＧＨ－ＤＪ３つ）、ＮＧＳによっても検出することができたが、存在量が５％未満であった。３６／３９のｑ／ｄｄＰＣＲ評価では、全ての低ＮＧＳ検出配列を含み、再構成はＡＳＯ－ＰＣＲにより確認され、１４／３６のケースはサブクローナルレベルであった。非検出のライブラリーを含み、サンガーとＮＧＳの間の全体的な一致率は７８％であった。

【0102】

１２／２９のＢ系統ＡＬＬのサンプルにおいて、優勢なクローン性ＩＧＨ配列の進化が、ＡＲＲｅｓＴ／Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅを用いて同定された。進化したクロノタイプは、ＤＮＪステムは優勢なものと同じであるが、ＶＮＤ部分の再構成は異なっていた。

【0103】

ＱＣサンプル（ｃＩＴ－ＱＣおよびｃＰＴ－ＱＣ）の標準的な評価によりアッセイ性能も解析した。これは、５つのラボ間で統計的有意差がなく、著しく高いラボ内およびラボ間での一貫性を示した。

【0104】

ＭＲＤマーカーの同定のための主要なＳＯＰの適切な修正
多施設検証の過程で、特定の研究室において、ＳＯＰの適切な修正が並行して試験された。

【0105】

１ステップＰＣＲ対２ステップＰＣＲ：ユーロクローナリティ－ＮＧＳワーキンググループは、シークエンスアダプターの切り替えを可能にするため、および多数のバーコードが必要な場合であっても必要なプライマーバッチの総数を限定するために、２ステップＰＣＲを使用することを決定した。第１回ＰＣＲ産物はバーコード化されていないため、この方法での異物混入現象の同定が困難である。したがって、単一施設（パリ）において、より多くの異なるプライマーバッチを維持することができる研究室のための代替手段として、１ステップＰＣＲが試験された。１ステップアプローチは、異物混入のリスクを低減し、したがって、マーカー同定のためだけでなく、ＭＲＤ評価のためのＮＧＳの使用に好都合である。標準作業手順は補足情報に示す。

【0106】

ビーズ抽出：我々の単一標的の評価および検証の段階において、特定のＴＲＢアンプリコンのゲル抽出が、ビーズ抽出と比較して、より特異的なライブラリーをもたらすことがわかった。しかし、ゲル抽出はすべての研究室で使用されているわけではないため、本研究の後半の段階では、すべてのライブラリーのビーズ精製も試験した。精製プロセスの最適化により、ライブラリー精製のタイプに関わらず、特異的なリードの比率が同程度になった。

【0107】

反応ミックスへのポリクローナルＤＮＡの添加の取りやめ：特異的な再構成がないサンプルにおける過度のプライマーダイマー形成を防ぐために、各反応にポリクローナルＤＮＡを添加した。しかし、ポリクローナルＤＮＡの添加は、サンプルのポリクローナルバックグラウンドの組成を変更し、免疫レパートリーの解析を妨害する。したがって、Ｂ細胞形成不全の４サンプルおよびＴ細胞形成不全の４サンプルで試験し、ｃＩＴ－ＱＣの添加により非特異的なＰＣＲ産物の過剰形成を十分に防ぐことを示した。

【0108】

（付記）
（付記１）
９種の培養細胞株のセットから単離されたゲノムＤＮＡの混合物を含む組成物であって、前記セットは、Ｂ細胞株であるＡＬＬ／ＭＩＫ（Ｂ前駆細胞型ＡＬＬ）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、ＲＥＨ（Ｂ前駆細胞型ＡＬＬ）、ＴＭＭ（ＣＭＬ－ＢＣ／ＥＢＶ＋Ｂ－ＬＣＬ）、ＴＯＭ－１（Ｂ前駆細胞型ＡＬＬ）、ＷＳＵ－ＮＨＬ（Ｂ細胞リンパ腫）、ならびにＴ細胞株であるＪＢ６（ＡＬＣＬ）、Ｋａｒｐａｓ２９９（ＡＬＣＬ）、およびＭＯＬＴ－１３（Ｔ－ＡＬＬ）を含むか、または前記セットの１以上の細胞株が、同一の免疫グロブリン（ＩＧ）／Ｔ細胞受容体（ＴＲ）遺伝子再構成を含む１種以上の他の細胞株に置き換えられる、組成物。

【0109】

（付記２）
Ｂ細胞株であるＡＬＬ／ＭＩＫ、Ｒａｊｉ、ＲＥＨ、ＴＭＭ、ＴＯＭ－１、ＷＳＵ－ＮＨＬ、ならびにＴ細胞株であるＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ２９９およびＭＯＬＴ－１３から単離されたゲノムＤＮＡの混合物を含む、付記１に記載の組成物。

【0110】

（付記３）
実質的に等量の前記細胞株の各々のゲノムＤＮＡを含む、付記１または２に記載の組成物。

【0111】

（付記４）
健康なヒト胸腺、健康なヒト扁桃腺、および健康なヒト末梢血単核球から単離された、実質的に等モル量のゲノムＤＮＡからなる組成物。

【0112】

（付記５）
各組織について、前記ゲノムＤＮＡは、多数の、好ましくは３～１０の異なるヒト個体から得られたものである、付記４に記載の組成物。

【0113】

（付記６）
付記１～３のいずれか１つに記載の組成物を含む容器、および／または付記４もしくは５に記載の組成物を含む容器を含む、診断キット。

【0114】

（付記７）
付記１～３のいずれか１つに記載の組成物を含む第１容器、および付記４または５に記載の組成物を含む第２容器を含む、付記６に記載のキット。

【0115】

（付記８）
免疫グロブリン（ＩＧ）／Ｔ細胞受容体（ＴＲ）遺伝子再構成を検出するための１種以上の薬剤をさらに含む、付記６または７に記載のキット。

【0116】

（付記９）
ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成のアンプリコンベースの次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のためのプライマーのセットを含む、付記８に記載のキット。

【0117】

（付記１０）
ＩＧＨ－ＶＪ、ＩＧＨ－ＤＪ、ＩＧＫ－ＶＪ－Ｋｄｅ、ＴＲＢ－ＶＪ、ＴＲＢ－ＤＪ、ＴＲＧ、およびＴＲＤからなる群から選択される前記ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成の１以上を検出するためのプライマーセットを含む、付記８または９に記載のキット。

【0118】

（付記１１）
図５に示すプライマーから選択される１以上のプライマー、好ましくは表３に示すプライマーから選択される１以上のプライマーを含む、付記９または１０に記載のキット。

【0119】

（付記１２）
図５に示すプライマーから選択される２以上のプライマーを含む、ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成のアンプリコンベースの次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のためのプライマーセット。

【0120】

（付記１３）
表３に示すプライマーから選択される２以上のプライマーを含む、付記１２に記載のプライマーセット。

【0121】

（付記１４）
ＩＧ／ＴＲ遺伝子再構成を検出するためのアッセイにおける、付記１～５のいずれか１つに記載の組成物、付記６～１１の何れか１つに記載のキット、および／または付記１２もしくは１３に記載のプライマーセットの使用。

【0122】

（付記１５）
前記アッセイは臨床診断アッセイ、好ましくは、クローン性の検出のため、微小残存病変（ＭＲＤ）マーカーの同定および／もしくはＭＲＤのモニタリングのため、ならびに／またはリンパ系腫瘍における（クローン）免疫レパートリーの解析のためのアッセイである、付記１４に記載の使用。

【0123】

（付記１６）
サンプル調製、ＰＣＲおよび／またはライブラリー構築、シークエンシングおよびバイオインフォーマティクス解析のステップを含む、ＮＧＳを用いた、少なくとも１つの生体サンプルにおけるＩＧ／ＴＲを検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、前記少なくとも１つの生体サンプルに付記１～３のいずれか１つに記載の組成物が添加され、かつ／または前記少なくとも１つの生体サンプルと並行して付記４または５に記載の組成物がサンプルとしてランされる、方法。

【0124】

（付記１７）
前記少なくとも１つの生体サンプルは、臨床的に適切なサンプル、好ましくは、悪性リンパ増殖の診断を支持もしくは除外するためのクローン性の検出のためのサンプル、または、ＭＲＤマーカー同定もしくはＭＲＤモニタリング解析、または（クローン）免疫レパートリー解析のために採取されたサンプルである、付記１６に記載の方法。

【0125】

（付記１８）
当該方法の少なくとも一部がマイクロ流体デバイスを用いて行われる、付記１７または１８に記載の方法。

【0126】

（付記１９）
前記マイクロ流体デバイスは遠心マイクロ流体ディスクシステムを含み、好ましくは、前記ディスクは、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ、および／またはライブラリー作成を自動化および統合するために予め入れられた薬剤を含む、付記１８に記載の方法。

【0127】

（付記２０）
前記バイオインフォーマティクス解析のステップは、生データの前処理、プライマー配列解析、免疫遺伝学的アノテーション、結果の後処理、ｃＩＴ－ＱＣの解析と使用（マーカーの定量を含む）、ｃＰＴ－ＱＣの解析と使用（予め解析され蓄積されている参照データセットとの比較を含む）、結果の報告／結果へのアクセス／結果の可視化のためのウェブベースのインタラクティブアプリケーションの使用を含む、付記１７～１９のいずれか１つに記載の方法。

【図1(1-2)】

【図1(2-2)】

【図2(1-2)】

【図2(2-2)】

【図3】

【図4(1-4)】

【図4(2-4)】

【図4(3-4)】

【図4(4-4)】

【図5A-1】

【図5A-2】

【図5A-3】

【図5B-1】

【図5B-2】

【図5B-3】

【図5C-1】

【図5C-2】

【図5C-3】

【図5D-1】

【図5D-2】

【図5E-1】

【図5E-2】

【図6】

【配列表】

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