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特許7599830周囲温度における血液サンプル中の変性されていないポリペプチド、核酸、およびエキソソームの安定化
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-06
(45)【発行日】2024-12-16
(54)【発明の名称】周囲温度における血液サンプル中の変性されていないポリペプチド、核酸、およびエキソソームの安定化
(51)【国際特許分類】
A61K 35/14 20150101AFI20241209BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241209BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20241209BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241209BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20241209BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20241209BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20241209BHJP
A61K 47/30 20060101ALI20241209BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20241209BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20241209BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20241209BHJP
【ＦＩ】
A61K35/14
A61K9/08
A61K47/10
A61K47/18
A61K47/22
A61K47/24
A61K47/26
A61K47/30
A61K47/32
A61K47/36
A61P7/00
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2020032331
(22)【出願日】2020-02-27
(62)【分割の表示】P 2016571742の分割
【原出願日】2015-06-09
(65)【公開番号】P2020100652
(43)【公開日】2020-07-02
【審査請求日】2020-03-27
【審判番号】
【審判請求日】2022-11-28
(31)【優先権主張番号】62/010,164
(32)【優先日】2014-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】515345724
【氏名又は名称】バイオマトリカ，インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ミュラー，ロルフ
(72)【発明者】
【氏名】ホイットニー，スコット
(72)【発明者】
【氏名】ディアズ，ポール
【合議体】
【審判長】冨永 みどり
【審判官】齋藤 恵
【審判官】伊藤 幸司
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K 35/00-35/768
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＣＡＰｌｕｓ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
周囲温度における、血液サンプル中の天然の、未変性のコンフォメーションでの１つ以上のポリペプチドの少なくとも３日間の安定化のための製剤であって、該製剤は：（ｉ）ｐＨ緩衝液；
（ｉｉ）スクロース；
（ｉｉｉ）メレチトース；
（ｉｖ）グリコール、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、アドニトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトール、イノシトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリオール；および
（ｖ）ポリビニルアルコールまたはホスファターゼ阻害剤を含む、製剤。
【請求項2】
１つ以上のポリペプチドの少なくとも８０％は、少なくとも３日間の周囲温度での保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで安定化される、請求項１に記載の製剤。
【請求項3】
ホスファターゼ阻害剤は、２－グリセロールリン酸である、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項4】
１つ以上のポリペプチドは、抗体、酵素、血漿タンパク質、血清タンパク質、およびそれらのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項5】
非イオン性デンプン、アミノ酸またはそれらのいずれかの組み合わせの１つ以上をさらに含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項6】
アミノ酸は、グリシンまたはサルコシンである、請求項５に記載の製剤。
【請求項7】
請求項１乃至６のいずれか１項の製剤と混合された、天然の、未変性のコンフォメーションでの１つ以上のポリペプチドを含む組成物。
【請求項8】
周囲温度において、血液サンプル中の天然の、未変性のコンフォメーションで１つ以上のポリペプチドを安定化する方法であって、該方法は：被験体から採取した血液のサンプルを、請求項１乃至６のいずれか１項の製剤と混合する工程を含み、ここで１つ以上のポリペプチドは、少なくとも３日間の室温での保存後に、天然の、未変性の状態で残存する、方法。
【請求項9】
ポリペプチドは、抗体、酵素、血漿タンパク質、血清タンパク質、およびそれらのいずれかの組み合わせから成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ポリペプチドの少なくとも８０％は、少なくとも３日間の周囲温度での保存後に、天然の、未変性の状態で残存する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項11】
被験体は、動物である、請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
被験体は、哺乳動物である、請求項８乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
被験体は、ヒトである、請求項８乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１４年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／０１０，１６４号の利益を主張し、当該文献は参照によってその全体が本明細書中に組み込まれる。
１．技術分野
本発明は一般的に、周囲温度における血液サンプル中の、１つ以上の未変性の核酸分子および／またはポリペプチド、またはエキソソームの安定化に関する。本発明は特に、周囲温度における血液サンプル中の、１つ以上の未変性の核酸分子および／またはポリペプチド、またはエキソソームの実質的に安定した保存のための製剤、組成物、製品、キット、および方法に関する。
本出願は、２０１４年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／０１０，１６４号の利益を主張し、当該文献は参照によってその全体が本明細書中に組み込まれる。
１．技術分野
本発明は一般的に、周囲温度における血液サンプル中の、１つ以上の未変性の核酸分子および／またはポリペプチド、またはエキソソームの安定化に関する。本発明は特に、周囲温度における血液サンプル中の、１つ以上の未変性の核酸分子および／またはポリペプチド、またはエキソソームの実質的に安定した保存のための製剤、組成物、製品、キット、および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
２．背景
全血は、細胞、核酸、タンパク質、および様々な他の分析物の複合の混合物である。血液成分は特に、限定されないが以下を含む：白血球（単球、リンパ球、および顆粒球）、赤血球、血小板、および、循環腫瘍細胞などの細胞；循環する遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）などの核酸分子；リポタンパク質、アルブミンおよび血清タンパク質、および他の様々な分析物などのポリペプチド。
全血は、細胞、核酸、タンパク質、および様々な他の分析物の複合の混合物である。血液成分は特に、限定されないが以下を含む：白血球（単球、リンパ球、および顆粒球）、赤血球、血小板、および、循環腫瘍細胞などの細胞；循環する遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）などの核酸分子；リポタンパク質、アルブミンおよび血清タンパク質、および他の様々な分析物などのポリペプチド。
【0003】
全血に対する比較的短い半減期および保存要件が部分的に原因で、全血のための献血者の持続的な必要性が存在する。例えば、輸血のために収集された全血は、無傷の生細胞を維持し、および化学的または酵素的な分解から細胞性または無細胞のポリペプチド、核酸分子、および他の分析物を保護するために、冷蔵状態で輸送され持続的な振動（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｏｃｋｉｎｇ）を有する冷凍状態下で保存されなければならない。この冷蔵状態の要件は、例えば適切な冷蔵温度を維持するための十分な設備または必要な持続的な電力の不足が原因で、必要な冷蔵施設を欠く地域の、全血の供給の利用を制限しかねない。
【0004】
周囲温度における全血および血液成分の安定化、輸送および保存する組成物および方法が調査されてきた。現在使用される組成物がポリペプチドおよび核酸分子の分解を防ぐことができる一方で、主に限定されていることは、安定化されたポリペプチドおよび核酸分子が、保存の製剤および組成物に使用される反応成分が原因で、変性されたコンフォメーション（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、例えば、適切な二次および／または三次構造を欠く一本鎖ＤＮＡ、およびアンフォールドされたタンパク質で維持されるということである。さらに制限されることは、これらの製剤が、結果として血液細胞の溶解に繋がり、それによって全血サンプル内に細胞の内容物が放出され、それにより、汚染するゲノムＤＮＡおよび細胞内タンパク質が原因で、その後の自由に循環するポリペプチドおよび核酸分子の定量化および診断分析を複雑にしかねないことである。
【0005】
母体血（例えばＭＡＴＥＲＮＩＴ２１（登録商標）ＰＬＵＳ非侵襲性の胎児の異常試験、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ）で循環する無細胞のＤＮＡを使用して胎児の異常を判断するめに、非侵襲性の診断テストが近年開発されている。このツールの影響によって、疾病状態および特定の疾病の相対的な進行を予測する無細胞のＤＮＡおよび無細胞のアミノ酸プロフィールの使用に関するさらなる研究が拒絶された。あらかじめ記載された短い時間以内に採取された血液サンプルの使用は、最も重要であり、なぜなら、プロフィールへの変化が周囲温度において比較的短時間に生じ、また、４℃への露出が、細胞表面上の診断マーカーの偽性の変化（ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｃｈａｎｇｅ）を引き起こし、血漿または血清の部分へ放出される量を増大させ得るからである。室温で最大７日の間無細胞の核酸を安定させるための収集チューブが存在する（Ｓｔｒｅｃｋ Ｌａｂｓ）が、チューブで提供される製剤の主成分は、細胞を固定し、かつ細胞を出入りする薬剤に対する浸透性を低くするように反応するホルムアルデヒド放出剤（イミダゾリニル尿素またはジアゾリジニル尿素など）である。
【0006】
したがって、核酸分子とポリペプチドの安定化のための新規の製剤、組成物、および方法を個別に、または一緒に開発する必要性が存在し、ここで、周囲温度における血液サンプル中の天然の未変性のコンフォメーションで実質的に安定した核酸分子およびポリペプチドが維持される。本発明の製剤、組成物および方法は、周囲温度において機能的に活性なポリペプチドおよび核酸分子を天然のコンフォメーションで保護しながら、溶解された細胞の成分による循環する核酸分子およびポリペプチドの汚染を防ぐために血球の完全性を維持することによって、前述の制限を好適に克服する。これらの安定した核酸分子およびポリペプチドは、冷蔵または冷凍の必要性なしで輸送および保存されてもよく、長期間、例えば数日、数週間、数か月、または数年にわたって周囲温度で安定しており診断的な、および潜在的に治療上の応用のための様々な核酸分子およびポリペプチドの、定量化、分析、および／または使用を促進する。
【発明の概要】
【0007】
本発明の１つの態様では、周囲温度における、血液サンプル中の天然の、未変性のコンフォメーションでの１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤が提供され、１つ以上のポリペプチドは、少なくとも３日間の周囲温度での保存後に、汚染する細胞内のポリペプチドが実質的にない、天然の、未変性のコンフォメーションで安定化される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの少なくとも８０％は、少なくとも３日間の周囲温度での保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで安定化される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリペプチドは、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日の間の、周囲温度で保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。いくつかの実施形態では、製剤は以下を含む：ｐＨ緩衝液；非還元糖；三糖；および水溶性ポリマー；陽イオン化合物；双性イオン化合物；ホスファターゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせの１つ以上。いくつかの実施形態では、非還元糖はスクロースである。いくつかの実施形態では、三糖は、マルトトリオース、イソマルトトリオース、ラフィノース、メレジトース、ニゲロトリオース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、三糖は、メレジトースである。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリビニルアルコールである。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は、２－グリセロールリン酸である。いくつかの実施形態では、双性イオン化合物は式（Ｉ）の化合物であり：
【0008】
【化1】
【0009】
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；および、ＺはＣＯ２－、ＳＯ３－、またはＯＰＯ３－である。いくつかの実施形態では、陽イオン化合物は、以下の式の化合物からなる群から選択され：
（ａ）式（ＩＩ）の化合物
（ａ）式（ＩＩ）の化合物
【0010】
【化2】
【0011】
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；ＺはＣＯ２Ａであり；および、Ｘは薬学的に許容可能な陰イオンであり：
（ｂ）式（ＩＩＩ）の化合物
（ｂ）式（ＩＩＩ）の化合物
【0012】
【化3】
【0013】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；およびＸは薬学的に許容可能な陰イオンであり；および（ｃ）式（ＩＶ）の化合物
【0014】
【化4】
【0015】
式中、Ｒ１とＲ２は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択され；および、Ｘは薬学的に許容可能な陰イオンである。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物のＲ１およびＲ２は、モルフォリノ環、ピロリジニウム環、ピペリジニウム環またはオキサジニウム環を形成する。いくつかの実施形態では、双性イオン化合物は、表１で明記される双性イオン化合物から選択される。いくつかの実施形態では、陽イオン化合物は、表１で明記される陽イオン化合物から選択される。いくつかの実施形態では、双性イオン化合物は、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－３－アンモニウム－プロピオン酸塩、またはＮ－エチル－ピペリジニウム－４－ブチルスルホン酸塩である。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリペプチドは、抗体、酵素、血漿タンパク質、血清タンパク質、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は以下を含む：ｐＨ緩衝液；非イオン性デンプン；およびポリオール、ホスファターゼ阻害剤、アミノ酸、またはそれらの組み合わせの１つ以上。いくつかの実施形態では、ポリオールは、グリコール、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、アドニトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトール、イノシトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリオールはグリセロールである。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はグリシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸はサルコシンである。いくつかの実施形態では、非還元糖はスクロースであり、三糖はマルトトリオース、イソマルトトリオース、ラフィノース、メレジトース、およびニゲロトリオースからなる群から選択され、より好ましくはメレジトースである。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリビニルアルコールであり、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、および、双性イオン化合物は四級の分子内塩である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリビニルアルコールであり、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、および、双性イオン化合物は、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－３－アンモニウム－プロピオン酸塩、またはＮ－エチル－ピペリジニウム－４－ブチルスルホン酸塩である。特定の実施形態では、ポリオールは、グリコール、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、アドニトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトールおよびイノシトールからなる群から選択され、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、アミノ酸はグリシンまたはサルコシンである。特定の実施形態では、ポリオールはグリセロールであり、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、アミノ酸はグリシンまたはサルコシンである。いくつかの実施形態では、製剤は表２に明記されるものから選択される。いくつかの実施形態では、前述の製剤のいずれかと混合された１つ以上の精製された、未変性のポリペプチドを含む、実質的に安定して保存された１つ以上の精製された、未変性のポリペプチドの組成物が提供される。
【0016】
いくつかの実施形態では、周囲温度において、血液サンプル中の天然の、未変性のコンフォメーションで１つ以上のポリペプチドを実質的に安定して保存する方法が本明細書において記載され、該方法は：被験体から採取した血液のサンプルを、本明細書に記載の血液サンプル中の天然の、未変性のコンフォメーションでの１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤と混合する工程を含み、ここで１つ以上のポリペプチドは、少なくとも３日間の室温での保存後に、天然の、未変性の状態で残存する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体、酵素、血漿タンパク質、血清タンパク質、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの少なくとも８０％は、少なくとも３日間の周囲温度での保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。いくつかの実施形態では、被験体は動物である。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
【0017】
本発明の別の態様では、周囲温度における、血液サンプル中の、天然の、未変性の状態での１つ以上の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤が提供され、ここで、１つ以上の核酸分子は、少なくとも３日間の周囲温度で保存後に、汚染する細胞内の核酸分子が実質的にない、天然の、未変性の状態で安定化される。いくつかの実施形態では、核酸分子の少なくとも８０％は、少なくとも３日間の周囲温度での保存後に、汚染する細胞内の核酸分子が実質的にない、天然の、未変性の状態で安定化される。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸分子は、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日の間の室温での保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。いくつかの実施形態では、該製剤は以下を含む：ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物；陽イオン化合物；またはそれらの組み合わせ；およびアポトーシス阻害剤またはカスパーゼ阻害剤。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸である。いくつかの実施形態では、双性イオン化合物は四級の分子内塩である。いくつかの実施形態では、四級の分子内塩は２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩である。いくつかの実施形態では、双性イオン化合物は式（Ｉ）の化合物であり：
【0018】
【化5】
【0019】
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；および、ＺはＣＯ２－、ＳＯ３－、またはＯＰＯ３－である。いくつかの実施形態では、陽イオン化合物は、以下の式の化合物からなる群から選択され：
（ａ）式（ＩＩ）の化合物：
（ａ）式（ＩＩ）の化合物：
【0020】
【化6】
【0021】
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；ＺはＣＯ２Ａであり；およびＸは薬学的に許容可能な陰イオンであり；
（ｂ）式（ＩＩＩ）の化合物：
（ｂ）式（ＩＩＩ）の化合物：
【0022】
【化7】
【0023】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；およびＸは薬学的に許容可能な陰イオンであり；および（ｃ）式（ＩＶ）の化合物：
【0024】
【化8】
【0025】
式中、Ｒ１とＲ２は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択され；および、Ｘは薬学的に許容可能な陰イオンである。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物のＲ１およびＲ２は、モルフォリノ環、ピロリジニウム環、ピペリジニウム環またはオキサジニウム環を形成する。いくつかの実施形態では、双性イオン化合物は、表１で明記される双性イオン化合物から選択される。いくつかの実施形態では、陽イオン化合物は、表１で明記される陽イオン化合物から選択される。いくつかの実施形態では、製剤はさらに、ヌクレアーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、プリンは、アデニンである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ阻害剤は、アウリントリカルボン酸である。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、抗生物質、プリン誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤を含む。いくつかの実施形態では、抗生物質は、リファンピシン、アクチノマイシンＤ、５－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プリン誘導体は５－メルカプトプリンである。いくつかの実施形態では、カスパーゼ阻害剤はＱ－ＶＤ－ＯＰＨである。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸分子は循環フリーＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ）分子である。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は、２－グリセロールリン酸であり、双性イオン化合物は四級の分子内塩であり、より好ましくは、２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩であり、アポトーシス阻害剤は、Ａｐｏｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ ＃１７８４８８）であり、カスパーゼ阻害剤はＱ－ＶＤ－ＯＰＨであり、また、ｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、双性イオン化合物は２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩であり、アポトーシス阻害剤はアポトーシス阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ＃１７８４８８）であり、カスパーゼ阻害剤はＱ－ＶＤ－ＯＰＨであり、また、ｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。いくつかの実施形態では、製剤は以下を含む：ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；陽イオン化合物または双性イオン化合物；およびヌクレアーゼ阻害剤。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、プリンはアデニンであり、双性イオン化合物は四級の分子内塩であり、ヌクレアーゼ阻害剤はアウリントリカルボン酸であり、また、ｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、プリンはアデニンであり、双性イオン化合物は２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩であり、ヌクレアーゼ阻害剤はアウリントリカルボン酸であり、また、ｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。いくつかの実施形態では、製剤はさらに、極性溶媒およびキレート化剤を含む。いくつかの実施形態では、製剤はさらに、ジメチルアセトアミドおよび三カリウムＥＤＴＡを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、表３で明記される製剤から選択される。いくつかの実施形態では、前述の製剤のいずれかと混合された精製された、未変性の１つ以上の核酸分子を含む、実質的に安定して保存された精製された、未変性の１つ以上の核酸分子の組成物が提供される。
【0026】
いくつかの実施形態では、周囲温度において、血液サンプル中の天然の、未変性の状態で１つ以上の核酸分子を実質的に安定して保存する方法が本明細書において記載され、該方法は：被験体から採取した血液のサンプルを、本明細書に記載の周囲温度における、血液サンプル中の、天然の、未変性の状態での１つ以上の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤と混合する工程を含み、ここで１つ以上の核酸分子は少なくとも３日間の室温での保存後に、汚染する細胞内の核酸分子が実質的にない、天然の、未変性の状態で残存する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗体、酵素、血漿タンパク質、および血清タンパク質から成る群から選択されるポリペプチドをコード化する。いくつかの実施形態では、核酸分子の少なくとも８０％は、少なくとも３日間の周囲温度での保存後に、汚染する細胞内の核酸分子が実質的にない、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。いくつかの実施形態では、核酸分子は循環フリーＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、被験体は動物である。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
【0027】
いくつかの実施形態では、周囲温度における、血液サンプル中の、天然状態での１つ以上のエキソソームの実質的に安定した保存のための製剤が本明細書において記載され、該製剤は：ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物；陽イオン化合物；またはそれらの組み合わせ；および、アポトーシス阻害剤またはカスパーゼ阻害剤を含み、少なくとも３日間の室温での保存後に、１つ以上のエキソソームが安定化される。いくつかの実施形態では、エキソソームの少なくとも８０％は、少なくとも３日間の室温での保存後に安定化される。いくつかの実施形態では、１つ以上のエキソソームは、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日の間の、室温での保存後に安定化される。いくつかの実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸である。いくつかの実施形態では、双性イオン化合物は四級の分子内塩である。いくつかの実施形態では、四級の分子内塩は２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩である。いくつかの実施形態では、双性イオン化合物は式（Ｉ）の化合物であり：
【0028】
【化9】
【0029】
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；および、ＺはＣＯ２－、ＳＯ３－、またはＯＰＯ３－である。いくつかの実施形態では、陽イオン化合物は、以下の式の化合物からなる群から選択され：
（ａ）式（ＩＩ）の化合物：
（ａ）式（ＩＩ）の化合物：
【0030】
【化10】
【0031】
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；ＺはＣＯ２Ａであり；およびＸは薬学的に許容可能な陰イオンであり；
（ｂ）式（ＩＩＩ）の化合物：
（ｂ）式（ＩＩＩ）の化合物：
【0032】
【化11】
【0033】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；およびＸは薬学的に許容可能な陰イオンであり；および（ｃ）式（ＩＶ）の化合物：
【0034】
【化12】
【0035】
式中、Ｒ１とＲ２は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択され；および、Ｘは薬学的に許容可能な陰イオンである。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物のＲ１およびＲ２は、モルフォリノ環、ピロリジニウム環、ピペリジニウム環またはオキサジニウム環を形成する。いくつかの実施形態では、双性イオン化合物は、表１で明記される双性イオン化合物から選択される。いくつかの実施形態では、陽イオン化合物は、表１で明記される陽イオン化合物から選択される。いくつかの実施形態では、製剤はさらに、ヌクレアーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、プリンは、アデニンである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ阻害剤は、アウリントリカルボン酸である。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、抗生物質、プリン誘導体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤を含む。いくつかの実施形態では、抗生物質は、リファンピシン、アクチノマイシンＤ、５－ヒドロキシ－１、４－ナフトキノン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プリン誘導体は５－メルカプトプリンである。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は、２－グリセロールリン酸であり、双性イオン化合物は四級の分子内塩であり、より好ましくは、２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩であり、アポトーシス阻害剤は、Ａｐｏｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ ＃１７８４８８）であり、カスパーゼ阻害剤はＱ－ＶＤ－ＯＰＨであり、また、ｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、双性イオン化合物は２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩であり、アポトーシス阻害剤はＡｐｏｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ＃１７８４８８）であり、カスパーゼ阻害剤はＱ－ＶＤ－ＯＰＨであり、また、ｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。特定の実施形態では、製剤は、ｐＨ緩衝液、ホスファターゼ阻害剤、プリン、陽イオン化合物、または双性イオン化合物；およびヌクレアーゼ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、プリンはアデニンであり、双性イオン化合物は四級の分子内塩であり、ヌクレアーゼ阻害剤はアウリントリカルボン酸であり、また、ｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、プリンはアデニンであり、双性イオン化合物は２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩であり、ヌクレアーゼ阻害剤はアウリントリカルボン酸であり、また、ｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。いくつかの実施形態では、製剤はさらに、極性溶媒およびキレート化剤を含む。いくつかの実施形態では、製剤はさらに、ジメチルアセトアミドおよび三カリウムＥＤＴＡを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、表３で明記される製剤から選択される。いくつかの実施形態では、前述の製剤のうち任意のものと混合された、１つ以上の精製されたエキソソームを含む、実質的に安定して保存された１つ以上の精製されたエキソソームの組成物が提供される。
【0036】
いくつかの実施形態では、周囲温度において、血液サンプル中の、天然状態で１つ以上のエキソソームを実質的に安定して保存する方法が本明細書において開示され、該方法は：被験体から採取した血液のサンプルを、本明細書に記載の血液サンプル中の、天然状態での１つ以上のエキソソームの実質的に安定した保存のための製剤と混合する工程を含み、ここで１つ以上のエキソソームは少なくとも３日間の室温での保存後に、天然状態で残存する。いくつかの実施形態では、被験体は動物である。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
【0037】
いくつかの実施形態では、採血管内に収容された、表２および３で明記されるものを含む、本明細書に記載されたいずれか１つの製剤を含む製品が本明細書において記載される。いくつかの実施形態では、採血管は、真空採血管である。
【0038】
いくつかの実施形態では、製品のいずれか１つ、および添付文書を含むキットが本明細書において記載される。
【発明を実施するための形態】
【0039】
本発明は、周囲温度における血液サンプル中の、天然の、未変性の１つ以上のポリペプチドまたは核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤、組成物、製品、キット、および方法に関する。本発明はまた、周囲温度における血液サンプル中の、１つ以上のエキソソームの実質的に安定した保存のための製剤、組成物、製品、キット、および方法に関する。いくつかの実施形態では、製剤は、ポリペプチドおよび／または核酸分子の実質的に安定した保存を提供し、ここでポリペプチドおよび／または核酸分子の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらに９９％が、室温での保存の後に、汚染する細胞内の成分が実質的にない、天然の、未変性の状態で残存する。いくつかの実施形態では、製剤は、エキソソームの実質的に安定した保存を提供し、ここでエキソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらに９９％は、室温での保存の後に安定している。
【0040】
いくつかの実施形態では、製剤は、天然のコンフォメーションを保持する、および機能的に活性であるポリペプチドの実質的に安定した保存を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された組成物はまた、改善された定量化または診断分析のために、汚染する細胞内のＤＮＡがない、循環フリーＤＮＡなどの未変性の完全長の核酸分子のための実質的に安定した保存状態を提供する。
定義
別段定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において引用された特許、特許出願、および公報は全て、参照によってそれらの全体が組み込まれる。
定義
別段定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において引用された特許、特許出願、および公報は全て、参照によってそれらの全体が組み込まれる。
【0041】
本明細書および添付の請求項で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に指示されない限り、複数の言及も含む。したがって、例えば「方法」への言及は、本開示等を読んだ当業者に明らかになるであろう本明細書において記載されたタイプの１つ以上の方法および／または工程などを含む。
【0042】
量、一時的な継続期間などのような測定可能な値について指すときの、本明細書において使用される「約」は、指定された値から±２０％、または±１０％、または±５％、または±１％の変動を包含するように意味し、そのような変動は開示された組成物に適しているか、または開示された方法を実行するために適している。
【0043】
本明細書に記載されるように、核酸分子は、別々のフラグメントの形態またはより大きな構造の成分のいずれかである、２つ以上の修飾された、および／または非修飾のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。核酸分子、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ（一本鎖または二本鎖のいずれか、コード化、相補性またはアンチセンス）、または、一本鎖または二本鎖の形態である１つを超えるヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列、ＰＮＡ（ペプチド核酸）などのＤＮＡアナログおよびそれらの任意の化学的修飾を含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または任意の増幅技術で増幅されたＤＮＡまたは任意のＤＮＡポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は循環フリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。本明細書で使用されるように、ｃｆＤＮＡは被験体の血液中で循環し、細胞内に含まれていないＤＮＡを指す。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、トータルＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ、細胞または組織から分離されたＲＮＡ、リボザイム、または任意のＲＮＡポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、自然源から分離することができるものなどの、天然の核酸分子が包含されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は自然源に由来した形態、フラグメント、および誘導体に加えて、天然の分子の少なくとも１つの特性が存在する限り、組み換えの形態および人工分子である。いくつかの実施形態では、核酸分子は生体サンプル中にあり、限定されないが、核酸およびそれらの誘導体（例えば、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ生成物、ゲノムＤＮＡ、プラスミド、染色体、人工染色体、遺伝子導入ベクター、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、リボザイム、ゲノムＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびバクテリア人工染色体（ＢＡＣ））などの、分析、診断、および／または製薬の目的に適用することができるものである。いくつかの実施形態では、生体サンプルは血液である。
【0044】
「精製されたポリペプチド」、または「精製された核酸分子」、または「精製されたエキソソーム」において使用されるように、用語「精製された」は、それぞれ、ポリペプチド、核酸分子、またはエキソソームの回収を指し、これは、不純物、例えばタンパク質、脂質または塩など細胞成分の除去に関して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が、精製される。用語「実質的に精製された」は、一般に血液サンプルからの細胞タンパク質または反応不純物の大部分の分離を指し、その結果、分離された生体分子（核酸分子など）のその後の使用を妨げることが可能な化合物が除去される。
【0045】
本明細書に記載されているように、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。用語「ペプチド」、および「タンパク質」は、用語ポリペプチドと互換的に使用され、またアミノ酸のポリマー鎖を指す。用語「ポリペプチド」は、天然または人工のタンパク質タンパク質フラグメントおよび、タンパク質配列のポリペプチドアナログを包含する。ポリペプチドは単量体または重合体であり得る。もし文脈で別段矛盾しないならば、用語「ポリペプチド」は、フラグメントおよびその変異体（変異体のフラグメントを含む）を包含する。
【0046】
用語「分離されたタンパク質」または「分離されたポリペプチド」は、その起源（例えば細胞または生体サンプル）または派生の源によって、天然の状態で付随する、自然に関連した成分に関連しない、タンパク質またはポリペプチドである。したがって、化学的に合成されるポリペプチドは、その自然に関連した成分から「分離される」ことになる。タンパク質はまた、当該技術分野において周知なタンパク質精製技術を使用して、不純物、例えば核酸、脂質または塩など細胞成分の除去に関して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を精製した分離によって、自然に関連した成分を実質的になくすことで、精製され得る、または実質的に精製され得る。
＜周囲温度における血液サンプル中の天然の、未変性の状態であるポリペプチド、核酸、またはエキソソームの安定化のための製剤および組成物＞
本発明の１つの態様では、周囲温度における、血液サンプル中の未変性のコンフォメーションでの１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤および組成物が提供され、１つ以上のポリペプチドは、少なくとも３日間の周囲温度での保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで安定化される。幾つかの実施形態では、周囲温度において、血液サンプル中の天然の、未変性のコンフォメーションでのポリペプチドの実質的な安定のための製剤および組成物が提供され、ここでポリペプチドの少なくとも８０％は、少なくとも３日間の室温での保存後に、汚染する細胞内のポリペプチドが実質的にない、天然の、未変性のコンフォメーションで安定化される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリペプチドは、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日の間の、室温での保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。
＜周囲温度における血液サンプル中の天然の、未変性の状態であるポリペプチド、核酸、またはエキソソームの安定化のための製剤および組成物＞
本発明の１つの態様では、周囲温度における、血液サンプル中の未変性のコンフォメーションでの１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤および組成物が提供され、１つ以上のポリペプチドは、少なくとも３日間の周囲温度での保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで安定化される。幾つかの実施形態では、周囲温度において、血液サンプル中の天然の、未変性のコンフォメーションでのポリペプチドの実質的な安定のための製剤および組成物が提供され、ここでポリペプチドの少なくとも８０％は、少なくとも３日間の室温での保存後に、汚染する細胞内のポリペプチドが実質的にない、天然の、未変性のコンフォメーションで安定化される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリペプチドは、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日の間の、室温での保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。
【0047】
本明細書において使用されるような用語「周囲温度」は、一般的な室内温度を指す。いくつかの実施形態では、周囲温度は１５℃から３２℃である。いくつかの実施形態では、周囲温度は２０℃から２７℃である。
【0048】
特定の実施形態では、周囲温度における、血液サンプル中の１つ以上の天然の、未変性の状態の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤が本明細書において記載され、該製剤は以下を含む：ｐＨ緩衝液；非還元糖；三糖；および水溶性ポリマー、陽イオン化合物、双性イオン化合物、およびホスファターゼ阻害剤の少なくとも１つ。特定の実施形態では、周囲温度における、血液サンプル中の天然の、未変性の状態での１つ以上のポリペプチドおよび／または核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤が提供され、該製剤は、ｐＨ緩衝液；非イオン性デンプン；およびポリオール、ホスファターゼ阻害剤、およびアミノ酸の１つ以上を含み、ここで１つ以上のポリペプチドおよび／または核酸分子は、少なくとも３日間の室温での保存後に、天然の、未変性の状態で安定化される。特定の実施形態では、ポリオールは、グリコール、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、アドニトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトールおよびイノシトールからなる群から選択され、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、アミノ酸はグリシンまたはサルコシンである。特定の実施形態では、ポリオールはグリセロールであり、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、アミノ酸はグリシンまたはサルコシンである。
【0049】
いくつかの実施形態では、周囲温度において、血液サンプル中の、天然の、未変性の状態で１つ以上の核酸分子を実質的に安定して保存するための製剤が提供され、ここで、１つ以上の核酸分子は、少なくとも３日間の室温での保存後に、汚染する細胞内の核酸分子が実質的にない、天然の、未変性の状態で残存する。いくつかの実施形態では、核酸分子の少なくとも８０％は、少なくとも３日間の室温での保存後に、汚染する細胞内の核酸分子が実質的にない、天然の、未変性の状態で安定化される、周囲温度において、血液サンプル中の、天然の、未変性の状態で１つ以上の核酸分子を実質的に安定して保存するための製剤が提供される。他の実施形態では、１つ以上の核酸分子は、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日の、室温での保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。
【0050】
特定の実施形態において、製剤は以下を含む；ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物、陽イオン化合物またはそれらの組み合わせ；およびアポトーシス阻害剤またはカスパーゼ阻害剤。特定の好ましい実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は、２－グリセロールリン酸であり、双性イオン化合物は四級の分子内塩、より好ましくは、２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩であり、アポトーシス阻害剤は、Ａｐｏｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ ＃１７８４８８）であり、カスパーゼ阻害剤はＱ－ＶＤ－ＯＰＨであり、また、ｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。
【0051】
特定の他の実施形態では、周囲温度における、血液サンプル中の天然の、未変性の状態での１つ以上の核酸の実質的に安定した保存のための製剤は、：ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物、陽イオン化合物、またはそれらの組み合わせ；およびヌクレアーゼ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、プリンはアデニンであり、双性イオン化合物は四級の分子内塩、より好ましくは２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩であり、ヌクレアーゼ阻害剤はアウリントリカルボン酸であり、また、ｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。幾つかの実施形態では、製剤はさらに、以下のうち１つを含む：抗生物質、プリン誘導体、アポトーシス阻害剤、カスパーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、製剤は、極性溶媒およびキレート化剤を含む。いくつかの実施形態では、製剤はさらに、ジメチルアセトアミドおよび三カリウムＥＤＴＡを含む。
【0052】
いくつかの実施形態では、血液サンプルが、核酸、ポリペプチド、またはエキソソーム、および安定化製剤と混合されて、全血の調製中において、実質的に安定した未変性の１つ以上の核酸、ポリペプチド、またはエキソソームがそれぞれ生成される、組成物が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、対応する安定化製剤と混合された、精製または実質的に精製された１つ以上の核酸分子、ポリペプチド、またはエキソソームを含む組成物が提供される。
製剤試薬
Ａ．ｐＨ緩衝液
特定の実施形態によれば、本明細書において記載された、周囲温度における血液サンプル中の、核酸分子、ポリペプチド、またはエキソソームの実質的に安定した保存のための製剤および組成物は、１つ以上のｐＨ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、ｐＨ緩衝液は、ｐＨ緩衝液が存在する水溶液のような溶液のｐＨの変化に抵抗する能力について当該技術分野で知られている、多くの化合物のいずれかである。安定した保存用の組成物に含めるための１つ以上の特定のｐＨ緩衝液の選択は、本開示に基づいて、および当該技術分野における慣行によって行なわれ得、また、維持することが望ましいｐＨ、安定化されるサンプルの性質、利用される溶剤の状態、使用される製剤の他の成分、および他の基準を含む様々な因子によって影響され得る。例えば、典型的に、ｐＨ緩衝液は、緩衝液の特徴であるプロトン解離定数（ｐＫａ）約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０のｐＨ単位の範囲内のｐＨで利用される。
製剤試薬
Ａ．ｐＨ緩衝液
特定の実施形態によれば、本明細書において記載された、周囲温度における血液サンプル中の、核酸分子、ポリペプチド、またはエキソソームの実質的に安定した保存のための製剤および組成物は、１つ以上のｐＨ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、ｐＨ緩衝液は、ｐＨ緩衝液が存在する水溶液のような溶液のｐＨの変化に抵抗する能力について当該技術分野で知られている、多くの化合物のいずれかである。安定した保存用の組成物に含めるための１つ以上の特定のｐＨ緩衝液の選択は、本開示に基づいて、および当該技術分野における慣行によって行なわれ得、また、維持することが望ましいｐＨ、安定化されるサンプルの性質、利用される溶剤の状態、使用される製剤の他の成分、および他の基準を含む様々な因子によって影響され得る。例えば、典型的に、ｐＨ緩衝液は、緩衝液の特徴であるプロトン解離定数（ｐＫａ）約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０のｐＨ単位の範囲内のｐＨで利用される。
【0053】
ｐＨ緩衝液の非限定的な例は、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、スルホサリチル酸、スルホイソフタル酸、シュウ酸、ホウ酸塩、ＣＡＰＳ（３－（シクロヘキシルアミノ）－１－プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（３－（シクロヘキシルアミノ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸）、ＥＰＰＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（３－モルフォリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（２－ヒドロキシ－３－［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－１－プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－２－アミノエタンスルホン酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、トリシン（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、およびビス－トリス（２－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール）を含む。表２、または表３で明記される多くの製剤を含む、本明細書で熟考される特定の実施形態は、約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０のｐＨを有する製剤を特徴とし得る。
Ｂ．陽イオン化合物および双性イオン化合物
本明細書に記載される特定の実施形態では、双性イオン化合物は四級の分子内塩である。いくつかの実施形態では、核酸の実質的に安定した保存のための四級の分子内塩は、ＷＯ ２０１２／０１８６３８に開示されたものである。
Ｂ．陽イオン化合物および双性イオン化合物
本明細書に記載される特定の実施形態では、双性イオン化合物は四級の分子内塩である。いくつかの実施形態では、核酸の実質的に安定した保存のための四級の分子内塩は、ＷＯ ２０１２／０１８６３８に開示されたものである。
【0054】
いくつかの実施形態では、双性イオン化合物は式（Ｉ）の化合物であり：
【0055】
【化13】
【0056】
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；および、ＺはＣＯ２－、ＳＯ３－、またはＯＰＯ３－である。いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２はモルフォリノ環、ピロリジニウム環、ピペリジニウム環、またはオキサジニウム環を形成する。
【0057】
いくつかの実施形態では、陽イオン化合物は、以下の式の化合物からなる群から選択され：
（ａ）式（ＩＩ）の化合物：
（ａ）式（ＩＩ）の化合物：
【0058】
【化14】
【0059】
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；ＺはＣＯ２Ａであり；およびＸは薬学的に許容可能な陰イオンであり；
（ｂ）式（ＩＩＩ）の化合物：
（ｂ）式（ＩＩＩ）の化合物：
【0060】
【化15】
【0061】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択される、またはＲ１およびＲ２は随意に環を形成し、ＹはＣＨ２、ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）、ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）－ＣＨ（Ａ）であり、ここで、Ａは非置換または置換のアルキル、アリール、アリールアルキル、または２０の自然発生のアミノ酸の１つにおいて典型的に発見される任意の側鎖であり；およびＸは薬学的に許容可能な陰イオンであり；および（ｃ）式（ＩＶ）の化合物：
【0062】
【化16】
【0063】
式中、Ｒ１とＲ２は、非置換または置換のアルキル、非置換または置換のアリール、非置換または置換のアリールアルキルから独立して選択され；および、Ｘは薬学的に許容可能な陰イオンである。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物のＲ１およびＲ２は、モルフォリノ環、ピロリジニウム環、ピペリジニウム環またはオキサジニウム環を形成する。
【0064】
「アルキル」基は、脂肪族炭化水素基を指す。アルキル部分は、「飽和したアルキル」基を含み、これは、それがアルケンまたはアルキンの部分を含まないことを意味する。アルキル部分はまた、「不飽和のアルキル」部分を含み、これは、それが少なくとも１つのアルケンまたはアルキン部分を含むことを意味する。「アルケン」部分は、少なくとも１つの炭素炭素二重結合を有する基を指し、「アルキン」部分は、少なくとも１つの炭素炭素三重結合を有する基を指す。アルキル部分は、飽和または不飽和であっても、分枝鎖、直鎖、または環式の部分を含む。構造によって、アルキル基は、モノラジカルまたはジラジカル（つまり、アルキレン基）を含み、１乃至６の炭素原子を有している「低級アルキル」である。本明細書で使用されるように、Ｃ１－Ｃｘは、Ｃ１－Ｃ２、Ｃ１－Ｃ３．．．Ｃ１－Ｃｘを含む。「アルキル」部分は、随意に、１乃至１０の炭素原子を有する（それが本明細書で出現するときは常に、「１乃至１０」などの数の範囲は、与えられた範囲内の各整数を指し；例えば、「１乃至１０の炭素原子」は、アルキル基が、１つの炭素原子、２つの炭素原子、３つの炭素原子などから、最大１０の炭素原子までを有する部分から選択されることを意味するが、本定義はまた、数の範囲が指定されていない用語「アルキル」の出現も包含する）。本明細書で記載される化合物のアルキル基は、「Ｃ１－Ｃ４アルキル」または類似した名称として指定されてもよい。ほんの一例として、「Ｃ１－Ｃ４アルキル」は、アルキル鎖に１乃至４の炭素原子があることを示し、即ち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、およびｔ－ブチルから選択される。したがって、Ｃ１－Ｃ４アルキルは、Ｃ１－Ｃ２アルキルおよびＣ１－Ｃ３アルキルを含む。アルキル基は、随意に、置換されるか又は非置換である。典型的なアルキル基は、全く限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ヘキシル、エテニル、プロペニル、ブテニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、などを含む。
【0065】
本明細書に使用されるように、用語「環」は、共有結合的に閉じた構造を指す。環は、例えば、炭素環（例えば、アリールおよびシクロアルキル）、複素環（例えば、ヘテロアリールおよび非芳香族複素環）、芳香族（例えば、アリールおよびヘテロアリール）、および非芳香族（例えば、シクロアルキルおよび非芳香族複素環）を含む。環は、随意に置換され得る。環は、単環式または多環式であり得る。
【0066】
単独で又は「アリールアルキル」、「アリールアルコキシ」、または「アリールオキシアルキル」でのようにより大きな部分の一部として使用される用語「アリール」は、少なくとも１つの環が芳香族である縮合環を含む、単環式、二環式、または三環式の炭素環系を指す。用語「アリール」は、用語「アリール環」と交換可能に使用されてもよい。一実施形態では、アリールは、６－１２の炭素原子を有している基を含む。別の実施形態では、アリールは、６－１０の炭素原子を有している基を含む。アリール基の例として、フェニル、ナフチル、アントラシル、フェナントレニル、ナフタセニル（ｎａｐｈｔｈａｃｅｎｙｌ）、１，２，３，４－テトラヒドロナフタレニル、１Ｈ－インデニル、２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インデニルなどが挙げられる。特定のアリールはフェニルである。別の実施形態では、アリールは、インダニル、ナフチル、およびテトラヒドロナフチルを含み、ここで、ラジカルまたは結合点は、芳香族環上にある。
【0067】
用語「随意に置換された」または「置換された」は、参照の基が、一置換及び二置換のアミノ基を含む、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルスルホン、アリールスルホン、シアノ、ハロ、アシル、ニトロ、ハロアルキル、フルオロアルキル、アミノ、およびそれらの保護誘導体から個々に及び独立して選択される、１以上の追加の基と置換され得ることを意味する。
一例として、随意の置換基は、ＬｓＲｓであってもよく、ここで、各Ｌｓは、単結合、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ－、－ＮＨＳ（＝Ｏ）２、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－、－（置換または非置換のＣ１－Ｃ６アルキル）、または－（置換または非置換のＣ２－Ｃ６アルケニル）から独立して選択され；各Ｒｓは、Ｈ、置換または非置換のＣ１－Ｃ４アルキル、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロアルキルから独立して選択される。
一例として、随意の置換基は、ＬｓＲｓであってもよく、ここで、各Ｌｓは、単結合、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ－、－ＮＨＳ（＝Ｏ）２、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－、－（置換または非置換のＣ１－Ｃ６アルキル）、または－（置換または非置換のＣ２－Ｃ６アルケニル）から独立して選択され；各Ｒｓは、Ｈ、置換または非置換のＣ１－Ｃ４アルキル、置換または非置換のＣ３－Ｃ６シクロアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロアルキルから独立して選択される。
【0068】
表２または表３で明記される製造を含む、本明細書で記載される製剤の特定の他の実施形態において、陽イオン化合物または双性イオン化合物は、表１の典型的な化合物の１つから選択される。
【0069】
【表1-1】
【0070】
【表1-2】
【0071】
表２に明記される製剤を含む、１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための特定の実施形態において、双性イオン化合物は、四級の分子内塩である。特定の実施形態では、四級の分子内塩は、約１．０ －１００ｍｇ／ｍＬ、１．０－５０ｍｇ／ｍＬ、または１０．０－５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－３－アンモニウム－プロピオン酸塩またはＮ－エチル－ピペリジニウム－４－ブチルスルホン酸塩である。表３に明記される製剤を含む、１つ以上の核酸分子の実質的に安定した保存のための特定の実施形態において、四級の分子内塩は、２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩である。
Ｃ．非還元糖
また、本明細書で記載されるように、幾つかの実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の天然コンフォメーションにおける１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための、組成物中に少なくとも１つの非還元糖を含む製剤がある。非還元糖は、官能性のアルデヒド基を欠く炭水化物分子である。典型的な非還元糖は、スクロースおよびトレハロースを含む。幾つかの実施形態では、非還元糖は、トレハロースであり、約１．０－５０ｍＭ、または約１０．０－３０ｍＭ、または約２５ｍＭの濃度で存在している。天然コンフォメーションでの１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための幾つかの実施形態において、非還元糖は、約１．０－５０ｍＭ、約１．０－３０ｍＭ、または約１０ｍＭの濃度で存在するスクロースである。
Ｄ．三糖
本明細書で記載されるように、特定の実施形態では、製剤は、周囲温度での全血サンプル中の天然コンフォメーションにおける１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤または組成物に少なくとも１つの三糖を含む。三糖は、それらと結合するグリコシド結合を有する３つの単糖モノマーから成るオリゴ糖である。グリコシド結合は、構成単糖上のヒドロキシル基間で形成され得、異なる結合の組み合わせ（位置化学）および立体化学（アルファ－またはベータ－）は、結果として、異なる化学的および物理的な特性を備えたジアステレオ異性体である三糖をもたらす。安定した保存のための組成物に含めるための１つ以上の特定の三糖の選択は、本開示に基づいて及び当該技術分野の慣例に従って行われてよく、他の製剤成分を含む様々な因の影響を受け得る。典型的な三糖は、限定されないが、マルトトリオース、イソマルトトリオース、ラフィノース、メレチトース、およびニゲロトリオースを含む。表２に明記される製剤を含む、ポリペプチドを安定させるための特定の実施形態では、三糖は、メレチトースである。幾つかの実施形態では、メレチトースは、約１％－２０％、または約５．０－１５％の濃度で存在する。
Ｅ．ポリオール
また、本明細書で記載されるように、特定の実施形態は、周囲温度での全血サンプル中の天然コンフォメーションにおける１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための組成物中に少なくとも１つのポリオールを含む。ポリオールは、２つ以上のヒドロキシル基を含んでいる多価アルコールでさり、一般式Ｈ（ＣＨＯＨ）ｎＨを有し、式中、ｎは、２から７までで選択される整数である。ポリオールは、鎖長が異なり、５または６の炭素鎖を有しているほとんどのポリオールは、ペントース（５の炭素糖）およびヘキソース（６の炭素糖）に由来しているが、より短い炭素鎖ポリオールおよびより長い炭素鎖ポリオールも存在する。典型的なポリオールは、限定されないが、グリコール、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、アドニトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトールおよびイノシトールを含む。実質的に安定した保存のための組成物に含めるための１つ以上の特定のポリオールの選択は、本開示に基づいて及び当該技術分野の慣例に従って行われてよく、他の製剤成分を含む様々な因の影響を受け得る。特定の実施形態では、表２の製剤を含む、製剤中に存在するポリオールは、ペントースポリオールであり、２０－１００ｍＭ、または約２５－７５ｍＭの間の濃度で存在する。特定の実施形態では、表２の製剤を含む、製剤中に存在するポリオールは、アドニトールであり、２０－１００ｍＭ、または約２５－７５ｍＭの間の濃度で存在する。
Ｆ．水溶性ポリマー
本明細書で記載されるように、特定の実施形態は、周囲温度での全血サンプル中の天然コンフォメーションにおける１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤および組成物中に少なくとも１つの水溶性ポリマーを含む。そのような水溶性ポリマーは、ポリビニルアルコールを含む。本開示から、当業者が、安定した保存のための製剤および組成物において使用するための他の水溶性ポリマーを選択してもよく、これは、利用される組成物の他の成分、保存されている特定の生体サンプル、核酸分子またはポリペプチド分子、あるいはその両方が回収されることが望まれるかどうか、および他の因子に基づいて様々であり得ることが理解される。限定されないが、表２に示される製剤を含む、特定の実施形態は、約０．１乃至１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、約０．１乃至５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、または１．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度（容積測定基準、つまり、ｖｏｌ／ｖｏｌで）の水溶性ポリマーの包含を熟考する。特定の実施形態では、水溶性ポリマーは、約３０－７０，０００ダルトンの分子量範囲を有する及び約８７－９０％が加水分解した、ポリビニルアルコールである。
Ｇ．ホスファターゼ阻害剤
周囲温度での血液サンプル中の未変性状態の１つ以上の核酸分子またはポリペプチドの実質的に安定した保存のための本明細書で記載される製剤は、特定の実施形態において、ホスファターゼ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は、ホスファターゼのセリン－トレオニンクラスの阻害剤である。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は、２－グリセロールリン酸である。ポリペプチドを安定化させるために、濃度は、約１．０－１００ｍＭ、約２５－７５ｍＭ、または約５０ｍＭであり；核酸分子については、濃度は、約１．０－２００ｍＭ、約２５－１５０ｍＭ、または約１２５ｍＭであり；およびエキソソームについては、濃度は、約１．０－２００ｍＭ、約２５－１５０ｍＭ、または約１２５ｍＭである。
Ｈ．非イオン性デンプン
特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の未変性のコンフォメーションにおける１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤は、特定の実施形態において、非イオン性デンプンを含む。特定の実施形態では、非イオン性デンプンは、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。ヒドロキシエチルデンプンは、Ｂ． Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．による商品名ＨＥＳＰＡＮの下で最も頻繁に使用される容積増量剤の１つである。特定の実施形態では、ＨＥＳは、約１．０－１０％、約１．０－５．０％、または約１．０－２．０％の濃度で存在する。
Ｉ．キレート化剤
キレート化剤またはキレート剤は、特定の実施形態によると、血液サンプル中の未変性状態の１つ以上のポリペプチドまたは核酸分子の実質的に安定した保存のための本明細書に記載される製剤および組成物に含まれており、金属陽イオンの反応性と複合する及びそれを妨げるそれらの能力のための当該技術分野に精通した当業者に知られている。典型的なキレート化剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＣＤＴＡ）、１，２－ビス（２－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－三酢酸、グルコン酸ナトリウム、およびニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を含む。幾つかの実施形態では、キレート化剤は、ジナトリウムまたは三カリウムＥＤＴＡであり、約１．０－１００ｍＭ、約１０－９０ｍＭ、または約７０ｍＭの濃度で存在する。
Ｊ．ヌクレアーゼ阻害剤
特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上の未変性の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤は、ヌクレアーゼ阻害剤を含む。ヌクレアーゼ阻害剤は当業者に周知である。幾つかの実施形態では、そのようなヌクレアーゼ阻害剤は、本発明の、表３の製剤を含む製剤、組成物および方法に使用される。幾つかの実施形態では、ヌクレアーゼ阻害剤は、アウリントリカルボン酸である。
Ｋ．プリンおよびプリン誘導体
プリンまたはプリン誘導体は、特定の実施形態によると、血液サンプル中の核酸分子の実質的に安定した保存のための本明細書に記載される組成物に含まれている。幾つかの実施形態では、プリンは、アデニン、グアニン、またはその組み合わせである。幾つかの実施形態では、プリンは、プリン誘導体である。幾つかの実施形態では、プリン誘導体は、２－メルカプトプリンである。
Ｌ．抗生物質
特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上の未変性の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤は、抗生物質を含む。抗生物質は当業者に周知である。幾つかの実施形態では、そのような抗生物質は、本発明の製剤、組成物および方法に使用される。幾つかの実施形態では、抗生物質は、リファンピシン、アクチノマイシンＤ、５－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン、またはそれらの組み合わせである。
Ｍ．極性溶媒
特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上の未変性の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤は、極性溶媒を含む。幾つかの実施形態では、極性溶媒は、ジメチルアセトアミドである。幾つかの実施形態では、極性溶媒は、２５％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、極性溶媒は、ジメチルアセトアミドである且つ、２５％の濃度で存在する。
＜周囲温度で血液サンプル中の未変性の、天然ポリペプチド、核酸分子、またはエキソソームを安定化させる製剤＞
本明細書には、幾つかの実施形態にいて、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上の未変性のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤が記載され、該製剤は、ｐＨ緩衝液；非還元糖；三糖；および水溶性ポリマー、双性イオン化合物、陽イオン化合物またはホスファターゼ阻害剤の少なくとも１つを含み、ここで、１つ以上のポリペプチド及び／又は核酸分子は、少なくとも３日の期間の間の室温での保存後に、天然の、未変性状態で残存する。他の実施形態では、１つ以上のポリペプチドまたは核酸分子は、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日の期間の間の室温での保存後に、汚染する細胞内ポリペプチドが実質的にない、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。
Ｃ．非還元糖
また、本明細書で記載されるように、幾つかの実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の天然コンフォメーションにおける１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための、組成物中に少なくとも１つの非還元糖を含む製剤がある。非還元糖は、官能性のアルデヒド基を欠く炭水化物分子である。典型的な非還元糖は、スクロースおよびトレハロースを含む。幾つかの実施形態では、非還元糖は、トレハロースであり、約１．０－５０ｍＭ、または約１０．０－３０ｍＭ、または約２５ｍＭの濃度で存在している。天然コンフォメーションでの１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための幾つかの実施形態において、非還元糖は、約１．０－５０ｍＭ、約１．０－３０ｍＭ、または約１０ｍＭの濃度で存在するスクロースである。
Ｄ．三糖
本明細書で記載されるように、特定の実施形態では、製剤は、周囲温度での全血サンプル中の天然コンフォメーションにおける１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤または組成物に少なくとも１つの三糖を含む。三糖は、それらと結合するグリコシド結合を有する３つの単糖モノマーから成るオリゴ糖である。グリコシド結合は、構成単糖上のヒドロキシル基間で形成され得、異なる結合の組み合わせ（位置化学）および立体化学（アルファ－またはベータ－）は、結果として、異なる化学的および物理的な特性を備えたジアステレオ異性体である三糖をもたらす。安定した保存のための組成物に含めるための１つ以上の特定の三糖の選択は、本開示に基づいて及び当該技術分野の慣例に従って行われてよく、他の製剤成分を含む様々な因の影響を受け得る。典型的な三糖は、限定されないが、マルトトリオース、イソマルトトリオース、ラフィノース、メレチトース、およびニゲロトリオースを含む。表２に明記される製剤を含む、ポリペプチドを安定させるための特定の実施形態では、三糖は、メレチトースである。幾つかの実施形態では、メレチトースは、約１％－２０％、または約５．０－１５％の濃度で存在する。
Ｅ．ポリオール
また、本明細書で記載されるように、特定の実施形態は、周囲温度での全血サンプル中の天然コンフォメーションにおける１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための組成物中に少なくとも１つのポリオールを含む。ポリオールは、２つ以上のヒドロキシル基を含んでいる多価アルコールでさり、一般式Ｈ（ＣＨＯＨ）ｎＨを有し、式中、ｎは、２から７までで選択される整数である。ポリオールは、鎖長が異なり、５または６の炭素鎖を有しているほとんどのポリオールは、ペントース（５の炭素糖）およびヘキソース（６の炭素糖）に由来しているが、より短い炭素鎖ポリオールおよびより長い炭素鎖ポリオールも存在する。典型的なポリオールは、限定されないが、グリコール、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、アドニトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトールおよびイノシトールを含む。実質的に安定した保存のための組成物に含めるための１つ以上の特定のポリオールの選択は、本開示に基づいて及び当該技術分野の慣例に従って行われてよく、他の製剤成分を含む様々な因の影響を受け得る。特定の実施形態では、表２の製剤を含む、製剤中に存在するポリオールは、ペントースポリオールであり、２０－１００ｍＭ、または約２５－７５ｍＭの間の濃度で存在する。特定の実施形態では、表２の製剤を含む、製剤中に存在するポリオールは、アドニトールであり、２０－１００ｍＭ、または約２５－７５ｍＭの間の濃度で存在する。
Ｆ．水溶性ポリマー
本明細書で記載されるように、特定の実施形態は、周囲温度での全血サンプル中の天然コンフォメーションにおける１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤および組成物中に少なくとも１つの水溶性ポリマーを含む。そのような水溶性ポリマーは、ポリビニルアルコールを含む。本開示から、当業者が、安定した保存のための製剤および組成物において使用するための他の水溶性ポリマーを選択してもよく、これは、利用される組成物の他の成分、保存されている特定の生体サンプル、核酸分子またはポリペプチド分子、あるいはその両方が回収されることが望まれるかどうか、および他の因子に基づいて様々であり得ることが理解される。限定されないが、表２に示される製剤を含む、特定の実施形態は、約０．１乃至１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、約０．１乃至５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、または１．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度（容積測定基準、つまり、ｖｏｌ／ｖｏｌで）の水溶性ポリマーの包含を熟考する。特定の実施形態では、水溶性ポリマーは、約３０－７０，０００ダルトンの分子量範囲を有する及び約８７－９０％が加水分解した、ポリビニルアルコールである。
Ｇ．ホスファターゼ阻害剤
周囲温度での血液サンプル中の未変性状態の１つ以上の核酸分子またはポリペプチドの実質的に安定した保存のための本明細書で記載される製剤は、特定の実施形態において、ホスファターゼ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は、ホスファターゼのセリン－トレオニンクラスの阻害剤である。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は、２－グリセロールリン酸である。ポリペプチドを安定化させるために、濃度は、約１．０－１００ｍＭ、約２５－７５ｍＭ、または約５０ｍＭであり；核酸分子については、濃度は、約１．０－２００ｍＭ、約２５－１５０ｍＭ、または約１２５ｍＭであり；およびエキソソームについては、濃度は、約１．０－２００ｍＭ、約２５－１５０ｍＭ、または約１２５ｍＭである。
Ｈ．非イオン性デンプン
特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の未変性のコンフォメーションにおける１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤は、特定の実施形態において、非イオン性デンプンを含む。特定の実施形態では、非イオン性デンプンは、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。ヒドロキシエチルデンプンは、Ｂ． Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．による商品名ＨＥＳＰＡＮの下で最も頻繁に使用される容積増量剤の１つである。特定の実施形態では、ＨＥＳは、約１．０－１０％、約１．０－５．０％、または約１．０－２．０％の濃度で存在する。
Ｉ．キレート化剤
キレート化剤またはキレート剤は、特定の実施形態によると、血液サンプル中の未変性状態の１つ以上のポリペプチドまたは核酸分子の実質的に安定した保存のための本明細書に記載される製剤および組成物に含まれており、金属陽イオンの反応性と複合する及びそれを妨げるそれらの能力のための当該技術分野に精通した当業者に知られている。典型的なキレート化剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＣＤＴＡ）、１，２－ビス（２－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－三酢酸、グルコン酸ナトリウム、およびニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を含む。幾つかの実施形態では、キレート化剤は、ジナトリウムまたは三カリウムＥＤＴＡであり、約１．０－１００ｍＭ、約１０－９０ｍＭ、または約７０ｍＭの濃度で存在する。
Ｊ．ヌクレアーゼ阻害剤
特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上の未変性の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤は、ヌクレアーゼ阻害剤を含む。ヌクレアーゼ阻害剤は当業者に周知である。幾つかの実施形態では、そのようなヌクレアーゼ阻害剤は、本発明の、表３の製剤を含む製剤、組成物および方法に使用される。幾つかの実施形態では、ヌクレアーゼ阻害剤は、アウリントリカルボン酸である。
Ｋ．プリンおよびプリン誘導体
プリンまたはプリン誘導体は、特定の実施形態によると、血液サンプル中の核酸分子の実質的に安定した保存のための本明細書に記載される組成物に含まれている。幾つかの実施形態では、プリンは、アデニン、グアニン、またはその組み合わせである。幾つかの実施形態では、プリンは、プリン誘導体である。幾つかの実施形態では、プリン誘導体は、２－メルカプトプリンである。
Ｌ．抗生物質
特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上の未変性の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤は、抗生物質を含む。抗生物質は当業者に周知である。幾つかの実施形態では、そのような抗生物質は、本発明の製剤、組成物および方法に使用される。幾つかの実施形態では、抗生物質は、リファンピシン、アクチノマイシンＤ、５－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン、またはそれらの組み合わせである。
Ｍ．極性溶媒
特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上の未変性の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤は、極性溶媒を含む。幾つかの実施形態では、極性溶媒は、ジメチルアセトアミドである。幾つかの実施形態では、極性溶媒は、２５％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、極性溶媒は、ジメチルアセトアミドである且つ、２５％の濃度で存在する。
＜周囲温度で血液サンプル中の未変性の、天然ポリペプチド、核酸分子、またはエキソソームを安定化させる製剤＞
本明細書には、幾つかの実施形態にいて、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上の未変性のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤が記載され、該製剤は、ｐＨ緩衝液；非還元糖；三糖；および水溶性ポリマー、双性イオン化合物、陽イオン化合物またはホスファターゼ阻害剤の少なくとも１つを含み、ここで、１つ以上のポリペプチド及び／又は核酸分子は、少なくとも３日の期間の間の室温での保存後に、天然の、未変性状態で残存する。他の実施形態では、１つ以上のポリペプチドまたは核酸分子は、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日の期間の間の室温での保存後に、汚染する細胞内ポリペプチドが実質的にない、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。
【0072】
特定の実施形態では、二糖はスクロースであり、三糖は、マルトトリオース、イソマルトトリオース、ラフィノース、メレチトース、およびニゲロトリオースから成る群から選択され、より好ましくはメレチトースである。さらに別の好ましい実施形態では、水溶性ポリマーはポリビニルアルコールであり、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、双性イオン化合物は、第四級アミン、好ましくは、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－３－アンモニウム－プロピオン酸塩またはＮ－エチル－ピペリジニウム－４－ブチルスルホン酸塩である。
【0073】
特定の好ましい実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の未変性のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤は、表２から選択される。
【0074】
【表2】
【0075】
他の態様では、周囲温度での血液サンプル中の天然の未変性状態の１つ以上の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤が提供され、ここで、１つ以上の核酸分子は、少なくとも３日の期間の間の室温での保存後に、細胞内の核酸が実質的にない天然の未変性状態で安定化される。特定の実施形態では、製剤は、ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物、陽イオン化合物、またはその組み合わせ；およびアポトーシス阻害剤またはカスパーゼ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、双性イオン化合物は四級の分子内塩であり、アポトーシス阻害剤はＡｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ ＃１７８４８８）であり、カスパーゼ阻害剤はＱ－ＶＤ－ＯＰＨであり、およびｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、双性イオン化合物は２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ酢酸塩であり、アポトーシス阻害剤はＡｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ ＃１７８４８８）であり、カスパーゼ阻害剤はＱ－ＶＤ－ＯＰＨであり、およびｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。他の実施形態では、１つ以上の核酸分子は、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日の期間の間の室温での保存後に、細胞内核酸が実質的にない、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。
【0076】
特定の他の実施形態では、製剤は、ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物、陽イオン化合物、またはその組み合わせ；およびヌクレアーゼ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、プリンはアデニンであり、双性イオン化合物は四級の分子内塩、より好ましくは、２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩であり、ヌクレアーゼ阻害剤はアウリントリカルボン酸であり、およびｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。他の実施形態では、製剤は、以下の１つをさらに含んでよい：抗生物質、プリン誘導体、アポトーシス阻害剤、またはカスパーゼ阻害剤。幾つかの実施形態では、製剤は、極性溶媒およびキレート化剤をさらに含む。幾つかの実施形態では、製剤は、ジメチルアセトアミドおよび三カリウムＥＤＴＡを含む。
【0077】
特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の未変性の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤は、表３から選択される。
【0078】
【表3】
【0079】
他の態様では、少なくとも３日の期間の間の周囲温度での血液サンプル中の天然状態の１以上エキソソームの実質的に安定した保存のための製剤が提供される。特定の実施形態では、製剤は、ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物、陽イオン化合物、またはその組み合わせ；およびアポトーシス阻害剤またはカスパーゼ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、双性イオン化合物は四級の分子内塩であり、アポトーシス阻害剤はＡｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ ＃１７８４８８）であり、カスパーゼ阻害剤はＱ－ＶＤ－ＯＰＨであり、およびｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、双性イオン化合物は２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ酢酸塩であり、アポトーシス阻害剤はＡｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔ ＃１７８４８８）であり、カスパーゼ阻害剤はＱ－ＶＤ－ＯＰＨであり、およびｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。他の実施形態では、エキソソームは、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日の期間の間の室温での保存後に、天然状態で残存する。特定の実施形態では、製剤は、ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物または陽イオン化合物；およびヌクレアーゼ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ホスファターゼ阻害剤は２－グリセロールリン酸であり、プリンはアデニンであり、双性イオン化合物は四級の分子内塩、より好ましくは、２－（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）（メチル）アンモニオ）酢酸塩であり、ヌクレアーゼ阻害剤はアウリントリカルボン酸であり、およびｐＨ緩衝液はＭＯＰＳである。他の実施形態では、製剤は、以下の１つをさらに含んでよい：抗生物質およびプリン誘導体。幾つかの実施形態では、製剤は、極性溶媒およびキレート化剤をさらに含む。幾つかの実施形態では、製剤は、ジメチルアセトアミドおよび三カリウムＥＤＴＡを含む。
【0080】
特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中のエキソソームの実質的に安定した保存のための製剤は、表３から選択される。
＜周囲温度で未変性の核酸分子およびポリペプチドを安定化させるための製剤を調製する方法＞
本発明の製剤は、市販の試薬および当業者に周知の方法を使用して調製され得る。幾つかの実施形態では、製剤は、製剤試薬の濃縮した保存溶液（例えば、２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、２０Ｘなど）として調製され、適切な濃度で血液サンプルと混合される。幾つかの実施形態では、血液サンプルは、等しい量（１：１）で製剤ストック（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｔｏｃｋ）と混合される。
＜精製された核酸分子およびポリペプチド＞
幾つかの実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の実質的に安定した１つ以上のポリペプチド及び／又は核酸分子は、当業者によって慣例的に利用される周知の従来の方法を使用してさらに精製される。血液から核酸分子およびポリペプチドを精製するための装置、キットおよび方法は周知である。例えば、実質的に安定したポリペプチドおよび核酸は、幾つかの実施形態において、親和性クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などによって精製される。幾つかの実施形態では、精製された１つ以上のポリペプチドまたは核酸分子は、続いて、分析前に長期間の間、本明細書に記載される製剤に保存される。
＜製品＞
特定の実施形態では、製品が提供され、その中で、表２または３に明記される製剤を含む、本明細書に記載される製剤の１つが、適切な採血管、容器または器内に含まれている。幾つかの実施形態では、これらの製品は、採血時に１つ以上の血液成分を安定化させることによって、１つ以上の血液成分の実質的に安定した保存のために使用される。特定の実施形態では、採血管は、予め決められた量の全血を取り出すために大気圧未満を有する真空血液チューブである。幾つかの実施形態では、これらの製品は、本明細書に記載されるキットおよび方法に使用される。
＜キット＞
本発明の特定の態様では、本発明の製剤を含む製品のいずれか１つおよび添付文書を含むキットが提供される。幾つかの実施形態では、キットの構成要素は、区画されたプラスチックエンクロージャなどの、容器中に供給される。幾つかの実施形態では、容器は、密封カバーを有し、それによって、キットの中身を、使用前に保存のために殺菌且つ密封することができる。
＜血液成分の実質的に安定した保存のための方法＞
本発明の別の態様では、天然の、未変性のコンフォメーションまたは状態の血液サンプル中の１つ以上のポリペプチド、核酸分子、またはエキソソームの実質的に安定した保存のための方法が提供される。
＜周囲温度で未変性の核酸分子およびポリペプチドを安定化させるための製剤を調製する方法＞
本発明の製剤は、市販の試薬および当業者に周知の方法を使用して調製され得る。幾つかの実施形態では、製剤は、製剤試薬の濃縮した保存溶液（例えば、２Ｘ、５Ｘ、１０Ｘ、２０Ｘなど）として調製され、適切な濃度で血液サンプルと混合される。幾つかの実施形態では、血液サンプルは、等しい量（１：１）で製剤ストック（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｔｏｃｋ）と混合される。
＜精製された核酸分子およびポリペプチド＞
幾つかの実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の実質的に安定した１つ以上のポリペプチド及び／又は核酸分子は、当業者によって慣例的に利用される周知の従来の方法を使用してさらに精製される。血液から核酸分子およびポリペプチドを精製するための装置、キットおよび方法は周知である。例えば、実質的に安定したポリペプチドおよび核酸は、幾つかの実施形態において、親和性クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などによって精製される。幾つかの実施形態では、精製された１つ以上のポリペプチドまたは核酸分子は、続いて、分析前に長期間の間、本明細書に記載される製剤に保存される。
＜製品＞
特定の実施形態では、製品が提供され、その中で、表２または３に明記される製剤を含む、本明細書に記載される製剤の１つが、適切な採血管、容器または器内に含まれている。幾つかの実施形態では、これらの製品は、採血時に１つ以上の血液成分を安定化させることによって、１つ以上の血液成分の実質的に安定した保存のために使用される。特定の実施形態では、採血管は、予め決められた量の全血を取り出すために大気圧未満を有する真空血液チューブである。幾つかの実施形態では、これらの製品は、本明細書に記載されるキットおよび方法に使用される。
＜キット＞
本発明の特定の態様では、本発明の製剤を含む製品のいずれか１つおよび添付文書を含むキットが提供される。幾つかの実施形態では、キットの構成要素は、区画されたプラスチックエンクロージャなどの、容器中に供給される。幾つかの実施形態では、容器は、密封カバーを有し、それによって、キットの中身を、使用前に保存のために殺菌且つ密封することができる。
＜血液成分の実質的に安定した保存のための方法＞
本発明の別の態様では、天然の、未変性のコンフォメーションまたは状態の血液サンプル中の１つ以上のポリペプチド、核酸分子、またはエキソソームの実質的に安定した保存のための方法が提供される。
【0081】
特定の実施形態では、該方法は、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤と血液サンプルを混合する工程を含み、ここで、１つ以上のポリペプチドは、少なくとも３日の期間の間の室温での保存後に、天然の、未変性状態で安定化される。幾つかの実施形態では、ポリペプチドの少なくとも８０％は、少なくとも３日の期間の間、天然の未変性状態で残存する。特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上の未変性のポリペプチドの実質的に安定した保存のための製剤は、ｐＨ緩衝液；非還元糖；三糖；および水溶性ポリマー、双性イオン化合物、陽イオン化合物、またはホスファターゼ阻害剤の少なくとも１つ以上を含む。特定の実施形態では、製剤は、表２に明記される製剤の１つである。該方法の幾つかの実施形態では、１つ以上のポリペプチドは、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日の期間の間、室温での保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。
【0082】
幾つかの実施形態では、該方法は、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤と血液サンプルを混合する工程を含み、ここで、１つ以上の核酸分子は、少なくとも３日の期間の間の室温での保存の後に、汚染する細胞内核酸が実質的にない、天然の、未変性の状態で安定化される。幾つかの実施形態では、核酸の少なくとも８０％は、少なくとも３日の期間の間、天然の未変性状態で残存する。特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の１つ以上の未変性の核酸分子の実質的に安定した保存のための製剤は、ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物、陽イオン化合物、またはその組み合わせ；およびアポトーシス阻害剤またはカスパーゼ阻害剤を含む。特定の実施形態では、製剤は、ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物または陽イオン化合物；およびヌクレアーゼ阻害剤を含む。幾つかの実施形態では、製剤はさらに、極性溶媒およびキレート化剤を含む。幾つかの実施形態では、製剤は、ジメチルアセトアミドおよび三カリウムＥＤＴＡをさらに含む。特定の実施形態では、製剤は、表３に明記される製剤の１つである。該方法の幾つかの実施形態では、１つ以上の核酸分子は、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日の期間の間の室温での保存後に、天然の、未変性のコンフォメーションで残存する。
【0083】
幾つかの実施形態では、該方法は、周囲温度での血液サンプル中の１以上のエキソソームの実質的に安定した保存のための製剤と血液サンプルを混合する工程を含み、ここで、１以上のエキソソームは、周囲温度で少なくとも３日の期間の間、安定化される。幾つかの実施形態では、エキソソームの少なくとも８０％は、少なくとも３日の期間の間、安定化される。特定の実施形態では、周囲温度での血液サンプル中の１以上のエキソソームの実質的に安定した保存のための製剤は、ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物、陽イオン化合物、またはその組み合わせ；およびアポトーシス阻害剤またはカスパーゼ阻害剤を含む。特定の実施形態では、製剤は、ｐＨ緩衝液；ホスファターゼ阻害剤；プリン；双性イオン化合物または陽イオン化合物；およびヌクレアーゼ阻害剤を含む。幾つかの実施形態において、製剤はさらに、極性溶媒およびキレート化剤を含む。幾つかの実施形態では、製剤は、ジメチルアセトアミドおよび三カリウムＥＤＴＡをさらに含む。特定の実施形態では、製剤は、表３に明記される製剤の１つである。該方法の幾つかの実施形態では、１以上のエキソソームは、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、または少なくとも１８日の期間の間の室温での保存後に安定化される。
【0084】
採血管、バッグ、容器および器は、当該芸術分野で周知であり、数十年間医師によって利用されてきた。血液は、静脈穿刺または指先穿刺などの、当業者によって一般に利用される方法または装置を使用して採取されてよい。血液が静脈穿刺によって採取される場合、本発明の製剤は、血液サンプルが被験体から得られた時に採血管、例えば、真空管（ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲの採血管、Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｅｎｓｏｎまたはＶＡＣＵＥＴＴＥ、Ｇｒｅｉｎｅｒ）の内部で位置付けされ得るか、または既に得られた全血サンプルに、それが取り出された直後またはすぐ後に加えられ得る。
【0085】
本明細書で記載されるような方法は、本明細書で開示される製品およびキットを使用し得る。
【0086】
以下の実施例は、例示によって示され、限定するものではない。
【実施例】
【0087】
＜実施例１．周囲温度での少なくとも９日の期間の間のヒト血液サンプル中の機能的に活性なポリペプチドの安定化＞
本実施例は、周囲温度での少なくとも９日の期間の間の血液サンプル中の天然の、未変性のコンフォメーションでの天然の、機能的に活性なポリペプチドの実質的に安定した保存を調製するために明記される製剤を含む、本発明の製剤を実証した。
本実施例は、周囲温度での少なくとも９日の期間の間の血液サンプル中の天然の、未変性のコンフォメーションでの天然の、機能的に活性なポリペプチドの実質的に安定した保存を調製するために明記される製剤を含む、本発明の製剤を実証した。
【0088】
周囲温度で複数のポリペプチドを安定化させる、表２に明記される典型的な製剤Ａ－Ｇの能力（例えば、２９のサイトカインおよびケモカインの調査）を、製造業者の指示に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＣｏｒｐからのＭｉｌｌｉｐｅｘ ＭＡＰ Ｈｕｍａｎのサイトカイン／ケモカインのパネルＨＣＹＴＯＭＡＧ－６０Ｋ－ＰＸ２９のキットを使用して検査した。
【0089】
簡潔には、ヒト全血サンプルをドナーから採取し、血液を分画し（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）、血漿層を分析した。血漿の７５または１３５（表２中の９：１のサンプル）マイクロリットルの分割量を、１．７ｍＬのマイクロチューブに加え、そこに、２９の異なるサイトカインの溶液を加えて、４００ｐｇ／ｍＬの内部標準でサンプルをスパイクし（ｓｐｉｋｅ）、容積を１５０マイクロリットルに調節した。血漿（アッセイの日に新鮮）がない状態（－８０℃で保存された）またはある状態で内部標準を含んでいる対照サンプルを、試験サンプルと同時に調製且つ処理した。さらに、１６、８０、４００、２，０００、および１０，０００ ｐｇ／ｍＬを使用して、標準曲線を準備し、アッセイの直線性を確かなものとし、結合したサイトカインおよびケモカインの濃度の適切な定量化を助けた。
【0090】
対照サンプルおよび試験サンプルを室温で置き、２５マイクロリットルの分割量を、０日目、３日目および６日目に除去した。０日目および３日目に、サンプルを－８０℃で保存し、６日目に処理した。各２５ｍＬの分割量に、２５マイクロリットルの各々のアッセイ緩衝液を加え、その後、サイトカイン／ケモカインのパネルの各メンバーに向けられた２９の抗体のうちの１つでコーティングされた、２５マイクロリットルの量のヒトのサイトカイン／ケモカインの抗体が固定化された磁気ビーズを加えた。抗体は、未変性のサイトカインおよびケモカインのポリペプチドのみを認識し、変性したポリペプチドは、ビーズに結合しない。混合物を、振盪させながら４℃で一晩インキュベートした。９６ウェルのプレートを、結合した磁気ビーズを隔離するために磁石に対して置き、上清を除去し、ビーズを、洗浄緩衝液で２回洗浄した。
【0091】
洗浄したビーズに、検出抗体（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）溶液の２５マイクロリットルの分割量を、各サンプルに加え、室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン－フィコエリトリン溶液の２５マイクロリットルの分割量を加え、サンプルを３０分間室温で保存した。ビーズを隔離するために、磁石を９６ウェルのプレートの隣りに置き、上清を除去し、サンプルを、２回洗浄し、１５０マイクロリットルの洗浄緩衝液中で再懸濁した。
【0092】
各血漿サンプルからの結合したサイトカイン／ケモカインの量を、製造業者の指示に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｂｉｏ－Ｔｅｋ ＥＬｘ４０５の機器を使用して判定し、各サンプルに対する未変性のサイトカインおよびケモカインの２９のメンバーの各々の量を計算した。サイトカインのサブセットに対する結果を表４に示す。
【0093】
【表4】
【0094】
＜実施例２．周囲温度での少なくとも８日の期間の間のヒト血液サンプル中の遊離核酸を循環させる安定化＞
本実施例は、周囲温度で少なくとも８日の期間の間、溶解された血液細胞から細胞内核酸からの相当程度の汚染を防ぎながら、血液サンプル中の天然の、未変性状態の核酸分子の実質的に安定した保存を調製するための、表３に明記される製剤を含む、本発明の製剤を実証した。
本実施例は、周囲温度で少なくとも８日の期間の間、溶解された血液細胞から細胞内核酸からの相当程度の汚染を防ぎながら、血液サンプル中の天然の、未変性状態の核酸分子の実質的に安定した保存を調製するための、表３に明記される製剤を含む、本発明の製剤を実証した。
【0095】
血液サンプル中の汚染する細胞内核酸が実質的にない複数の循環する遊離核酸を安定化させる、表３に明記される典型的な製剤１－１０の能力を、２つの別々の試験で検査した。簡潔には、１．０ｍＬの製剤を、各製剤に対して３本の５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆのチューブに入れた。室温および４℃での保護されていないチューブは、製剤を受けなかった。新鮮なヒトの全血を、健全なドナーから採取した。血液を、プールし、混合し、その後、各チューブへと４．０ｍＬの分割量にした。１０本のチューブに血液を充填した後、チューブを閉め、より多くのチューブに血液を加える前に、１０回反転によって混合した。血液を、チューブの次のセットに加える前に再び混合した。すべてのチューブが充填され、混合されると、 時刻ゼロの（ｔｉｍｅ ｚｅｒｏ）チューブを、１０分間３０００ｒｐｍで回させた。血漿の２回の１．２５ｍＬの分割量を、白血球および赤血球を妨害することなく除去し、個々の１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆのマイクロチューブに移し、４℃で１０分間１６，０００ｇで回転させた。ＮＰの室温での時刻ゼロの血液を、１ｍＬの１Ｘ ＰＢＳ ｐＨ７．４を加えることによって調製した。上に記載されるように、チューブを、１０回反転によって混合し、その後、血漿を調製した。試験される各製剤に対する２回の１ｍＬの無細胞血漿の分割量を、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳｙｓｔｅｍｓからのＲｏｃｈｅ ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ上のＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ
１， Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃ ０３ ７３０ ９７２ ００１）を使用して、抽出した。核酸を、１００μＬの溶出緩衝液中で溶出した。上に記載されるように、４日目のサンプルを調製するまで、時刻ゼロのサンプルを、４℃で保持した。各サンプルから抽出されたＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃａｔ＃ ＰＰＨ０５６６６Ｅ－２００）およびＢｉｏ－Ｒａｄ ｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｃａｔ＃ １７０－８８８２）からの１セットの１８ｓ ｒＲＮＡのプライマーを使用して、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）上のｑＰＣＲによって分析した。５μＬの各サンプルを使用し、以下のプロットを作成した。さらに、１：１０希釈の単離ＤＮＡを調製し、また、５μＬの希釈液をｑＰＣＲによって増幅した。
１， Ｌａｒｇｅ Ｖｏｌｕｍｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃ ０３ ７３０ ９７２ ００１）を使用して、抽出した。核酸を、１００μＬの溶出緩衝液中で溶出した。上に記載されるように、４日目のサンプルを調製するまで、時刻ゼロのサンプルを、４℃で保持した。各サンプルから抽出されたＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃａｔ＃ ＰＰＨ０５６６６Ｅ－２００）およびＢｉｏ－Ｒａｄ ｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｃａｔ＃ １７０－８８８２）からの１セットの１８ｓ ｒＲＮＡのプライマーを使用して、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）上のｑＰＣＲによって分析した。５μＬの各サンプルを使用し、以下のプロットを作成した。さらに、１：１０希釈の単離ＤＮＡを調製し、また、５μＬの希釈液をｑＰＣＲによって増幅した。
【0096】
【表5】
【0097】
【表6】
【0098】
表５および６に示されるように、ヒト血液に表３の典型的な製剤を加えることによって、結果として、汚染する細胞内ＤＮＡが実質的にないままである、循環する遊離核酸の回収がもたらされた。０日目に、試験サンプル中に存在する循環する遊離核酸の量は、制御および他の試験サンプルと本質的に同一であったが、８日目に、４℃または室温で保存された血液は、溶解された血液細胞から汚染する細胞内核酸からのこれらのサンプル中で増加した収率によって示される、循環する遊離核酸のレベルの著しい増加を示した。対照的に、製剤１－１０は、８日目にわずかな増加を示しただけで細胞内核酸が実質的にない循環する遊離核酸を維持し、これらの製剤はすべて、４℃で８日間保存された保護されていないサンプルと同じように又はそれより好適に実行された。
【0099】
文脈が特段必要としない限り、本発明の明細書および請求項の全体にわたって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」に加えて、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」と交換可能に使用される、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、包括的なものであるか、オープン・エンド言語であり、追加の、列挙されていない要素または方法の工程を除外しない。句「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、請求項に明示されていないあらゆる要素、工程、または成分を除外する。句「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、請求項の範囲を、明示された物質または工程、および請求された本発明の基礎となる且つ新規な特徴に実質的に影響しないものに制限する。本開示は、これらの句の各々の範囲に対応する本発明の組成物および方法の実施形態を熟考する。したがって、列挙された要素または工程を含む組成物または方法は、該組成物または方法がこれらの要素または工程から本質的に成る特定の実施形態を熟考する。
【0100】
本明細書全体にわたる「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「一実施形態（ａ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、または「一態様」への参照は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な箇所での句「一実施形態では（ｉｎ ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「一実施形態では（ｉｎ ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わされてもよい。
【0101】
上に記載される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。これら及び他の変化が、上述の記載に照らして実施形態に対して行われ得る。一般に、以下の請求項において、使用される用語は、請求項を、明細書および請求項に開示される具体的な実施形態に制限するように解釈されるべきでないが、そのような請求項が与えられる同等物の全範囲とともに考えられ得る実施形態をすべて含むように解釈されるべきである。したがって、請求項は、本開示によって限定されない。
【0102】
前述から、本発明の具体的な実施形態が、例示目的のために本明細書に記載されているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な修正がなされ得ることが認識される。したがって、本発明は、請求項によるものを除いて限定されない。