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▶ オスロ ウニヴェルスィテーツスィーケフース ホーエフの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-06
(45)【発行日】2024-12-16
(54)【発明の名称】組換えＣＣＮドメインタンパク質および融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20241209BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20241209BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20241209BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20241209BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241209BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241209BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241209BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241209BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241209BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241209BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241209BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241209BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241209BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20241209BHJP
C07K 14/765 20060101ALN20241209BHJP
C07K 14/79 20060101ALN20241209BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20241209BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241209BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
A61K38/17
A61K47/64
A61K47/65
A61K47/68
A61P35/00
A61P43/00 105
A61P43/00 111
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C07K14/47
C07K14/765
C07K14/79
C07K16/00
C12N15/12
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021556442
(86)(22)【出願日】2020-03-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-18
(86)【国際出願番号】 EP2020057773
(87)【国際公開番号】W WO2020188081
(87)【国際公開日】2020-09-24
【審査請求日】2023-03-17
(31)【優先権主張番号】19163970.7
(32)【優先日】2019-03-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】517258833
【氏名又は名称】オスロ ウニヴェルスィテーツスィーケフース ホーエフ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】アットラマダル，ホーバード
(72)【発明者】
【氏名】カースボール，オーレ・ユルゲン
【審査官】西澤 龍彦
(56)【参考文献】
【文献】特表２００７－５０１２０３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５３６６５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１７７０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１３１２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５２８８１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００５／０４０１９１（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号８４、８５、８８、８９、９７、９８、１０２、１０３、１０６、１０７、１１０、および１１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単量体性融合タンパク質。
【請求項2】
請求項１に定義するような単量体性融合タンパク質をコードする、ＤＮＡ分子。
【請求項3】
シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２のＤＮＡ分子。
【請求項4】
配列番号８６、８７、９０、９１、９９、１００、１０４、１０５、１０８、１０９、１１２または１１３に示すようなヌクレオチド配列を含む、請求項２または３のＤＮＡ分子。
【請求項5】
請求項２～４のいずれか一項に定義するようなＤＮＡ分子を含む、発現ベクター。
【請求項6】
請求項５に定義するようなベクターを含む、宿主細胞。
【請求項7】
療法において使用するための、請求項１に記載の融合タンパク質を含む薬学的組成物。
【請求項8】
４ドメインＣＣＮファミリータンパク質に起因する細胞シグナル伝達および細胞生理学的機能を阻害するかまたは相殺することによって、障害を治療するかまたは防止する際に使用するための、請求項１に記載の融合タンパク質を含む薬学的組成物。
【請求項9】
線維症、または線維化状態または疾患の治療または防止において使用するための、請求項７または８に記載の薬学的組成物。
【請求項10】
癌の治療において使用するための、請求項７～９のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＣＮファミリータンパク質のメンバーのトロンボスポンジン１型リピート相同ドメイン（ドメインＩＩＩ）に対応するかまたは関連するアミノ酸配列を有する組換えタンパク質、およびその使用に関し、特に、一部切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、そして／または特定のアミノ酸修飾を含む、こうしたタンパク質が含まれる。さらに、本発明は、随意にリンカーペプチドを通じて、融合パートナーと組み合わされた、ＣＣＮファミリータンパク質のメンバーのトロンボスポンジン１型リピート相同ドメインに対応するかまたは関連するアミノ酸配列を含む融合タンパク質に関する。特に、融合パートナーは単量体性（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）タンパク質であり、そして融合タンパク質は単量体性である。
【0002】
また、新規プロテアーゼ耐性Ｆｃ断片を本明細書に開示する。
【背景技術】
【0003】
ＣＣＮタンパク質は、分泌糖タンパク質のファミリーである。ＣＣＮは、元来、該遺伝子ファミリーの最初に同定された３つのメンバー；Ｃｙｒ６１、ＣＴＧＦおよびＮＯＶに由来する頭字語として作られた呼称である。しかし、この頭字語は、近年、細胞コミュニケーションネットワーク（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ Ｎｅｔｗｏｒｋ）因子の短縮として当てはめられてきており、そしてＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されている（Ｐｅｒｂａｌ Ｂ，Ｔｗｅｅｄｉｅ ＳおよびＢｒｕｆｏｒｄ Ｅ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ．２０１９ Ｓｅｐ；１３（３）：４３５）。該タンパク質は、しばしば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と関連するマトリックス細胞タンパク質として分類される。ＣＣＮタンパク質は、細胞を組織に編成する足場機能の一部ではなく、むしろシグナル伝達タンパク質であり、そして独立のオートクリンまたはパラクリンシグナル伝達因子として、あるいは他の細胞外シグナル伝達タンパク質の修飾因子として機能しうる。３つのＷｎｔ誘導性シグナル伝達経路タンパク質（ＷＩＳＰ１／ＣＣＮ４、ＷＩＳＰ２／ＣＣＮ５、およびＷＩＳＰ３／ＣＣＮ６）のセットとともに、これらは、哺乳動物において、６つの相同システインリッチタンパク質のファミリーを含み、ＣＣＮ１～６と改名されている。
【0004】
ＣＣＮファミリーの最初のメンバーは、モジュラー構造を共有し、分泌のためのＮ末端ペプチドシグナルに、４つの保存ドメインが続く。第一のドメインは、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に配列相同性を示し、そしてしたがってＩＧＦ結合タンパク質相同ドメインとして知られるが、ＩＧＦには無視できる程度のアフィニティしか持たない。第二のドメインは、フォン・ヴィルブランド因子Ｃ型リピート（ＶＷＣ）相同ドメインとして知られ、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質にしばしば見られる。第三のドメインは、トロンボスポンジンＩ型リピート相同ドメイン（ＴＳＰ－１）として知られ、インテグリンへのＣＣＮタンパク質の付着に関与する可能性もある。第四のドメインは、システイン・リッチＣ末端リピートまたはシスチン・ノット相同ドメインであり、ヘパリンに結合すると報告されているドメインである。ＣＣＮタンパク質ファミリーの５番目のメンバーであるＷＩＳＰ２（Ｗｎｔ１誘導性シグナル伝達経路タンパク質２）は、ＣＣＮ５としてもまた知られ、カルボキシル末端シスチン・ノット・ドメイン（ドメイン４）を欠く点で非典型的である。ＣＣＮタンパク質ファミリーのＴＳＰ－１相同ドメインは、３４％のアミノ酸配列同一性および２５％の配列類似性を共有する（ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａによって分析した際。参考のため以下を参照されたい）。４ドメインのＣＣＮタンパク質は、ＣＣＮ６を除いて、一次配列全体で３８の保存されたシステインを含有し、ＣＣＮ６においては、ＶＷＣ相同ドメインの４つのシステインが他のファミリーメンバーとの間で保存されていない。また、カルボキシル末端シスチン・ノット相同ドメインを欠くＣＣＮ５に関しては、他のＣＣＮファミリーメンバーと比較して、ＩＧＦＢＰ、ＶＷＣおよびＴＳＰ－１相同ドメインのすべてのシステインが保存されている。
【0005】
しばしばヒンジ領域と称される、保存されていないプロテアーゼ感受性の中央領域は、タンパク質を２つに分ける。ＣＣＮタンパク質の発現は、環境刺激における変化に反応して、転写、転写後および翻訳レベルで制御される。
【0006】
ＣＣＮタンパク質ファミリーのドメイン編成に関する情報は、例えばＬｉｕら，２０１７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，９，ｐｐ．４６２－４７４に見られる。
細胞レベルでは、ＣＣＮタンパク質は、細胞外マトリックスおよび細胞表面の界面で、多様な制御性の役割を有しうる。ＣＣＮタンパク質は、細胞接着、遊走、増殖、分化、アポトーシス、生存、老化および遺伝子発現を制御しうる。これらの細胞機能の１つまたはそれより多くの側面を調節することによって、細胞タイプ特異的方式で、ＣＣＮは、胚発生中の心臓血管および骨格発生、ならびに成体における炎症、創傷治癒、および組織傷害および修復を含む、複雑な生物学的プロセスを協調させる。一般的に言って、４ドメインのＣＣＮ１～４およびＣＣＮ６（特にＣＣＮ１、ＣＣＮ２およびＣＣＮ４）は、線維化促進活性を発揮しうる一方、３つのドメインＩ～ＩＩＩしか含まないＣＣＮ５は、抗線維化活性を有する。
細胞レベルでは、ＣＣＮタンパク質は、細胞外マトリックスおよび細胞表面の界面で、多様な制御性の役割を有しうる。ＣＣＮタンパク質は、細胞接着、遊走、増殖、分化、アポトーシス、生存、老化および遺伝子発現を制御しうる。これらの細胞機能の１つまたはそれより多くの側面を調節することによって、細胞タイプ特異的方式で、ＣＣＮは、胚発生中の心臓血管および骨格発生、ならびに成体における炎症、創傷治癒、および組織傷害および修復を含む、複雑な生物学的プロセスを協調させる。一般的に言って、４ドメインのＣＣＮ１～４およびＣＣＮ６（特にＣＣＮ１、ＣＣＮ２およびＣＣＮ４）は、線維化促進活性を発揮しうる一方、３つのドメインＩ～ＩＩＩしか含まないＣＣＮ５は、抗線維化活性を有する。
【0007】
ＣＣＮタンパク質はまた、進行性線維症、例えば肝線維症および特発性肺線維症による臓器不全などの、非常に多様な病的状態、ならびに癌浸潤および転移にも関与する。これに関して、ＪｕｎおよびＬａｕ，２０１１，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１０（１２），ｐｐ．９４５－９６３を参照されたい。再び、一般的に言って、４ドメインのＣＣＮタンパク質、特にＣＣＮ２は、多様な線維性疾患の機構に関与することが示されてきている一方、こうした疾患の前臨床疾患モデルにおいて、逆に、ＣＣＮ５レベルの増加が有益でありうることが示されてきている。
【0008】
Ｋａａｓｂｏｅｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２９３：４６，ｐｐ．１７９５３－１７９７０において、ＣＣＮ２としてもまた知られる結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）が合成され、そして生物学的に活性であるＣＣＮ２を放出するためにはタンパク質分解的切断を必要とする不活性プレプロタンパク質として分泌され、そしてドメインＩＩＩ～ＩＶで構成されるＣ末端断片のホモ二量体は、ＣＣＮ２の生物学的に完全に活性である型に相当し、そして最後にＣＣＮ２の主要な報告される活性は、Ｃ末端ドメインＩＩＩ～ＩＶ断片のホモ二量体によって再現可能であることが報告されている。Ｋａａｓｂｏｅｌｌらによって報告される活性アッセイによって、プロセシングされていない全長ＣＣＮ２またはドメインＩ～ＩＩで構成されるＮ末端断片のいずれも生物学的に活性でないことが明らかになった。さらに、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）活性による全長ＣＣＮ２のタンパク質分解的プロセシングは、その不顕性活性を解放することが見出された。まとめると、Ｋａａｓｂｏｅｌｌらによって報告される知見は、プレプロ－ＣＣＮ２が、Ｎ末端ドメインＩおよびＩＩによって自己阻害されることを示す。ＣＣＮ１およびＣＣＮ３のＣ末端ドメインＩＩＩおよびＩＶ断片が、迅速な細胞シグナル伝達の活性化および細胞生理学的反応の誘発に十分であることもまた見出された。しかし、ＣＣＮ１および／またはＣＣＮ３、あるいは任意の他のＣＣＮタンパク質ファミリーメンバーのヒンジ領域のどの程度の度合いのエンドペプチダーゼ切断が、生物学的活性の放出に必要であるのかは未知である。
【0009】
ＣＣＮ２は、発生中に、増進された線維化および組織線維症を伴う多様な病的状態において、そしていくつかの癌において、高発現されることが知られる（ＪｕｎおよびＬａｕ、２０１１、上記）。ＣＣＮタンパク質が非常に多様な病的状態に関与し、線維症の発展に機構的に関与する細胞外タンパク質であり、そして健康な生物においては限定された発現しか示さないという事実により、これらは療法的ターゲットとして魅力的である。
【0010】
Ｊｅｏｎｇら，２０１６，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，６７：１３，ｐｐ．１５５７－１５６８は、実験的に誘導された心臓の圧過負荷後、ネズミ心臓へのＣＣＮ５のアデノ随伴ウイルス仲介性遺伝子トランスファーの役割を調べた研究に関して報告する。該研究は、ＣＣＮ５が心筋における筋線維芽細胞の生成を阻害しそして該細胞のアポトーシスを増進させることによって、確立された心臓線維症を逆転させる可能性があると結論付け、ＣＣＮ５が抗心臓線維症療法を開発するプラットフォームを提供しうると示唆する。
【0011】
ＵＳ２００８／０２０７４８９において、平滑筋増殖に基づく障害を治療するための方法であって、ＣＣＮ５の発現または平滑筋細胞へのＣＣＮ５タンパク質の投与を伴う前記方法を開示する。
【0012】
ＥＰ２５５６８３９において、全長ＣＣＮ５またはＣＣＮ２ΔＣＴをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子キャリアーを含む組成物が提供され、そして心不全の治療におけるその役割が示唆される。ＥＰ２５５６８３９におけるＣＣＮ２ΔＣＴは、Ｋ２５１（ｕｎｉｐｒｏｔ番号付け）の後ろで一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されたＣＣＮ２のアミノ酸配列と定義される。
【0013】
ＣＣＮ５の過剰発現は、いくつかの実験系で報告されており、ＣＣＮ２過剰発現のものとは反対の表現型を生じている（Ｊｅｏｎｇら、上記、Ｙｏｏｎら，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ，４９（２），２９４－３０３ Ａｕｇ ２０１０）が、ＣＣＮ５による４ドメインＣＣＮタンパク質の拮抗は、著者らの知る限り報告されてきていない。特に、他のＣＣＮファミリーメンバーのＣＣＮ５／ＷＩＳＰ２仲介性拮抗の構造的基礎は、本発明に提示する研究以前には未知であった。
【0014】
本発明者らは、より早い段階で、全長ＣＣＮ２（ＦＬ－ＣＣＮ２）がプレプロタンパク質、不活性前駆体であり、そしてドメインＩＩＩおよびＩＶを含む断片がＣＣＮ２のすべての生物学的に適切な活性を伝達するようであることを示している。タンパク質分解的活性化が必要な不活性プレプロタンパク質として、一般に、どの程度のＣＣＮタンパク質が分泌されるのかは未知のままである。しかし、本発明者ら（Ｋａａｓｂоｅｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１８） ２９３（４６）１７９５３－１７９７０）および他の研究者ら（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．ら Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ ５９，２３－３８（２０１７）およびＧｕｉｌｌｏｎ－Ｍｕｎｏｓ，Ａ．ら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６，２５５０５－２５５１８（２０１１））によって立証されるように、多数のプロテアーゼに対する全長ＣＣＮタンパク質の感受性は、未修飾の全長ＣＣＮタンパク質が、組換えタンパク質製造中およびｉｎ ｖｉｖｏ投与後の両方で、安定性の理由から、薬剤としては非常に不適切であろうことを示す。療法タンパク質として非修飾全長ＣＣＮタンパク質を用いるのがこのように不適切であることはまた、例えば全長ＣＣＮ１（Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ｎ．ら（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ４２，２１９－２２５）および全長ＣＣＮ６（Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ｎら（２００７）ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８，４５）に関して記載されるように、全長ＣＣＮタンパク質の融合タンパク質にも当てはまる。ＣＣＮタンパク質の分野において、これらのタンパク質のタンパク質分解に対する感受性は、組換えＣＣＮタンパク質を産生することが非常に困難である理由の１つであることが周知である。さらに、Ｋａａｓｂｏｅｌｌら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１８；２９３（４６）：１７９５３－１７９７０）の新規知見に基づいて、組換え全長ＣＣＮタンパク質は、その活性があらかじめタンパク質分解的プロセシングされていることに依存する可能性があり、このことが薬物動態学および薬力学を予測不能にしているために、理想的な生物学的薬剤からは程遠い可能性がある。さらに、Ｆｃ－融合タンパク質の場合、構成要素、例えばペプチドリンカー、ＣＣＮ断片およびＦｃ断片のタンパク質分解感受性に加えて、構成要素の配置が、組換え融合タンパク質の有効性および強度に重要であることもまた示されてきている。この一例は、本発明者らによって公表された論文（Ｋａａｓｂｏｅｌｌら（２０１８））中にあり、この中で、ＣＣＮ２のドメインＩＩＩ～ＩＶを含有するＦｃ－融合タンパク質の変異体が、あらかじめ容易に予測可能ではない方式で、非常に多様な活性を有することが見出されている。
【0015】
ＣＣＮタンパク質の作用は、高濃度のＣＣＮタンパク質一次配列由来の合成ペプチドによる拮抗効果に感受性であることが報告されてきている。一例は、ＩＧＦＢＰ相同ドメインであるドメインＩ由来のペプチドによる、そしてより低い度合いで、ＣＣＮ２のＴＳＰ－１リピート相同ドメインであるドメインＩＩＩ由来のペプチドによる、Ｒａｔ２線維芽細胞における組換えＣＣＮ２によって刺激されたＡＫＴリン酸化の阻害である（Ｍｏｅら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｓｉｇｎａｌ．（２０１３）７：３１－４７）。別の例は、ＣＣＮ２のシスチン・ノット相同ドメインであるドメインＩＶ由来のペプチドによる、肝臓星状細胞のＣＣＮ２（ドメインＩＶ）刺激接着の阻害である（Ｇａｏ ＲおよびＢｒｉｇｓｔｏｃｋ ＤＲ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４ Ｍａｒ ５；２７９（１０）：８８４８－５５）。さらに、ＣＣＮ１のドメインＩＩＩ（Ｌｅｕら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００３，Ｖｏｌ．２７８，Ｎｏ．３６，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ５，ｐｐ．３３８０１－３３８０８，２００３）、ならびにＣＣＮ１、ＣＣＮ２、ＣＣＮ３、ＣＣＮ５およびＣＣＮ６のドメインＩＩＩ（Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ＥＧおよびＰｏｐｅｌ Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３９（２００７）２３１４－２３２３）由来のペプチドは、ＨＵＶＥＣ細胞でのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてある程度の抗血管形成効果を（Ｌｅｕら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００３、ならびにＫａｒａｇｉａｎｎｉｓ ＥＧおよびＰｏｐｅｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３９（２００７））、そして１０６４ＳＫヒト包皮線維芽細胞に対して抗接着効果を（Ｌｅｕら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００３）有することが報告されてきているが、これらのペプチドは、本文書で記載する本発明の中心的な保存されたシステインの１つ（Ｌｅｕら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００３）または２つ（Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ＥＧおよびＰｏｐｅｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３９，２００７）しか含有しない。ＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩにおけるシステインは、ＨＵＶＥＣ細胞から内因性に発現されたＣＣＮ２において（Ｌｕ，Ｓら（２０１５）Ｎａｔ ｍｅｔｈｏｄｓ １２，３２９－３３１）そして精製組換えＣＣＮ２（Ｋａａｓｂｏｅｌｌら,Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１８）から立証されるように、ジスルフィド架橋を生成することが知られる。ＣＣＮ２において示された、Ｃ１９９～Ｃ２２８（ｕｎｉｐｒｏｔ番号付け）に渡るジスルフィド架橋は、アミノ酸鎖が折り重ねられる複雑な３Ｄ構造を与える。これは、ＣＣＮタンパク質の完全ドメインＩＩＩが、真核系において産生されたＣＣＮタンパク質の完全ドメインＩＩＩにおけるように、システイン間のジスルフィド架橋によって構造的に制約されない小分子ペプチドによっては複製されると予期することは不可能であることを示す。さらに、ドメインＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの一次配列由来のペプチドによるＣＣＮ２活性の阻害は、ＣＣＮ２の特定のドメイン由来のペプチドが、４ドメインＣＣＮタンパク質の阻害を与えうるかどうかに関して、技術分野には知識が欠如していることを例示する。
【0016】
本発明者らはここで、ＣＣＮファミリータンパク質の構造－活性分析、および生物学的に活性になるために、ＣＣＮ２がタンパク質分解的プロセシングを経る必要があるという観察に基づいて、ＣＣＮ５タンパク質の生物学的活性部分が、トロンボスポンジンＩ型リピート相同ドメインであるドメインＩＩＩであることを見出している。この新規知見は、ＣＣＮ５のドメインＩＩＩならびにＣＣＮタンパク質ファミリーの他のメンバーのドメインＩＩＩに基づく、生物活性構造の提供を生じている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0017】
【文献】ＵＳ２００８／０２０７４８９
【文献】ＥＰ２５５６８３９
【非特許文献】
【0018】
【文献】Ｐｅｒｂａｌ Ｂ，Ｔｗｅｅｄｉｅ ＳおよびＢｒｕｆｏｒｄ Ｅ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ．２０１９ Ｓｅｐ；１３（３）：４３５
【文献】Ｌｉｕら，２０１７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，９，ｐｐ．４６２－４７４
【文献】ＪｕｎおよびＬａｕ，２０１１，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１０（１２），ｐｐ．９４５－９６３
【文献】Ｋａａｓｂｏｅｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２９３：４６，ｐｐ．１７９５３－１７９７０
【文献】Ｊｅｏｎｇら，２０１６，Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，６７：１３，ｐｐ．１５５７－１５６８
【文献】Ｙｏｏｎら，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ，４９（２），２９４－３０３ Ａｕｇ ２０１０
【文献】Ｂｕｔｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．ら Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ ５９，２３－３８（２０１７）
【文献】Ｇｕｉｌｌｏｎ－Ｍｕｎｏｓ， Ａ．ら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６，２５５０５－２５５１８（２０１１）
【文献】Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ｎ．ら（２００５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ４２，２１９－２２５
【文献】Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ｎら（２００７） ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８，４５
【文献】Ｍｏｅら， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｓｉｇｎａｌ．（２０１３）７：３１－４７
【文献】Ｇａｏ ＲおよびＢｒｉｇｓｔｏｃｋ ＤＲ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４ Ｍａｒ ５；２７９（１０）：８８４８－５５
【文献】Ｌｅｕら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００３，Ｖｏｌ．２７８，Ｎｏ．３６，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ５，ｐｐ．３３８０１－３３８０８，２００３
【文献】Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ＥＧおよびＰｏｐｅｌ Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３９（２００７）２３１４－２３２３
【文献】Ｌｕ，Ｓら（２０１５） Ｎａｔ ｍｅｔｈｏｄｓ １２，３２９－３３１
【発明の概要】
【0019】
本発明者らは、ＣＣＮ５および他のＣＣＮタンパク質の構造－活性関係への洞察の結果、ＣＣＮ５シグナル伝達に起因する細胞シグナル伝達および細胞生理学的機能を再現し、そしてまた他の４ドメインＣＣＮタンパク質（Ｃｙｒ６１（ＣＣＮ１としてもまた知られる）、ＣＴＧＦ（ＣＣＮ２としてもまた知られる）、ＮＯＶ（ＣＣＮ３としてもまた知られる）、ＷＩＳＰ１（ＣＣＮ４としてもまた知られる）およびＷＩＳＰ３（ＣＣＮ６としてもまた知られる））を相殺可能である、新規生物学的活性組換えタンパク質を提供している。言い換えると、ＣＣＮ５の生物学的活性を再現するかまたは該活性を有し、そして４ドメインＣＣＮタンパク質、ＣＣＮ１～４またはＣＣＮ６の効果に拮抗するかまたは該効果を阻害することが可能である、ＣＣＮタンパク質のＴＳＰ１相同ドメインであるドメインＩＩＩに基づく、融合タンパク質型を含むタンパク質を提供する。特に、本明細書のタンパク質は、抗線維化活性を有し、そしてまた、直接の抗癌活性を有する可能性もある。
【0020】
上述のように、他のＣＣＮタンパク質、すなわち４ドメインＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩ（ＴＳＰ－１相同ドメイン）は、他のＣＣＮドメインの非存在下で別個のドメインとして提供された際には、驚くべきことに、ＣＣＮ５の報告される活性を再現するために十分であることが見出されてきている。したがって、言い換えると、４ドメインＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩは、他のＣＣＮドメインの非存在下で別個のドメインとして（すなわち単離ドメインとして）提供された際には、ＣＣＮ５と、あるいは別の表現ではＣＣＮ５のドメインＩＩＩ／ＴＳＰ－１相同ドメインと、同じ活性（すなわち、全長４ドメインＣＣＮタンパク質のものとは反対の活性）を有する。したがって、本文書で開示する実験から、任意のＣＣＮタンパク質の単離ＴＳＰ－１相同ドメインが、ＣＣＮ５のＴＳＰ－１相同ドメインのものと同じ活性を発揮しうることは明らかである。ＣＣＮ５の場合以外では、これは全長ＣＣＮタンパク質によって発揮される活性とは同じでない可能性もある。
【0021】
ＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩが単量体性融合パートナーに融合している単量体性融合タンパク質は、本発明および本明細書の開示にしたがって、特に有益であり、そして有用であることが見出されてきている。
【0022】
第一の側面にしたがって、本発明は、単量体性融合タンパク質であって：
（ｉ）ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメインの少なくとも部分に対応するポリペプチド；
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列にＮ末端またはＣ末端で融合した単量体性融合パートナー；および
（ｉｉｉ）随意に、（ｉ）のポリペプチドおよび（ｉｉ）の単量体性融合パートナーの間のペプチドリンカー
を含み、
（ｉ）のポリペプチドが長さ４０～６０アミノ酸であり、そして配列番号３７または２～６より選択されるアミノ酸配列、あるいは配列番号３７または２～６より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、配列番号３７または２～６より選択される前記配列中のシステイン残基のすべてが保存されており、
そして（ｉｉ）の単量体性融合パートナーおよび（ｉｉｉ）のペプチドリンカーが、ＣＣＮファミリータンパク質のＩＧＦ結合タンパク質相同ドメイン、フォン・ヴィルブランド因子Ｃ型リピート相同ドメイン、またはシステイン・ノット・ドメインではないか、またはこうしたドメインを含まない
前記単量体性融合タンパク質を提供する。
（ｉ）ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメインの少なくとも部分に対応するポリペプチド；
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列にＮ末端またはＣ末端で融合した単量体性融合パートナー；および
（ｉｉｉ）随意に、（ｉ）のポリペプチドおよび（ｉｉ）の単量体性融合パートナーの間のペプチドリンカー
を含み、
（ｉ）のポリペプチドが長さ４０～６０アミノ酸であり、そして配列番号３７または２～６より選択されるアミノ酸配列、あるいは配列番号３７または２～６より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、配列番号３７または２～６より選択される前記配列中のシステイン残基のすべてが保存されており、
そして（ｉｉ）の単量体性融合パートナーおよび（ｉｉｉ）のペプチドリンカーが、ＣＣＮファミリータンパク質のＩＧＦ結合タンパク質相同ドメイン、フォン・ヴィルブランド因子Ｃ型リピート相同ドメイン、またはシステイン・ノット・ドメインではないか、またはこうしたドメインを含まない
前記単量体性融合タンパク質を提供する。
【0023】
以下により詳細に記載するであろうように、配列番号３７および２～６は、それぞれ、ＣＣＮ５、ＣＣＮ３、ＣＣＮ２、ＣＣＮ１、ＣＣＮ４およびＣＣＮ６のドメインＩＩＩの４４アミノ酸一部切除断片に相当し、これらはこのドメインの６つの保存されたシステイン残基を含む。特に、該断片には、ドメインの第一のおよび最後のシステイン残基が隣接する。こうした断片は、特に有効であり、そしてタンパク質分解的分解に耐性であることが見出されてきている。
【0024】
１つの態様において、（ｉ）のポリペプチドは：
（ａ）配列番号１または８～１２より選択されるアミノ酸配列；あるいは
（ｂ）配列番号１または８～１２より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列の部分であって、それぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５の、またはそれぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の、少なくとも４４アミノ酸配列を含む、前記部分
を含むか、あるいはこれらからなる。
（ａ）配列番号１または８～１２より選択されるアミノ酸配列；あるいは
（ｂ）配列番号１または８～１２より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列の部分であって、それぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５の、またはそれぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の、少なくとも４４アミノ酸配列を含む、前記部分
を含むか、あるいはこれらからなる。
【0025】
配列番号１、および８～１２は、それぞれ、ＣＣＮ５、ＣＣＮ６、ＣＣＮ３、ＣＣＮ２、ＣＣＮ１、およびＣＣＮ４のドメインＩＩＩのわずかにより長いＮ末端一部切除断片に相当する。これらの断片は、それぞれのドメインＩＩＩ由来のいくつかのさらなるＣ末端配列を伴う、それぞれ、配列番号３７、６、２、３、４、および５の対応する配列を含む。
【0026】
さらなる態様において、（ｉ）のポリペプチドは、配列番号３７または２～６、あるいは配列番号１または８～１２より選択される前記配列の２位に対応する位で、アラニン残基を含む。いくつかの態様において、（ｉ）のアミノ酸配列は、配列番号３８または４２～４６、あるいはこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含む。別の態様において、（ｉ）のアミノ酸配列は、配列番号７、または４７～５１、あるいはこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含む。これに関して、２位のこの残基の置換は、タンパク質の安定性を促進する際に有益であることが見出されてきている。
【0027】
本発明のさらなる側面にしたがって、単量体性融合タンパク質は、配列番号８４、８５、８８、８９、９７、９８、１０２、１０３、１０６、１０７、１１０、１１１、またはこれらに８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【0028】
これらの側面の態様において、単量体性融合パートナーは、血清アルブミン、トランスフェリンおよび単量体性Ｆｃ断片、特にＩｇＧ、より具体的にはヒトＩｇＧの単量体性Ｆｃ断片より選択される。
【0029】
上述のように、本明細書のドメインＩＩＩ断片の２位の置換は、断片の安定性、特にプロテアーゼ分解に対する耐性を改善させる。本明細書において、ドメインＩＩＩ断片のこうした配列修飾された変異体は、融合パートナーに連結されることなく、それ自体で有用なタンパク質に相当する。
【0030】
したがって、本発明の別の側面はまた、配列番号７、３８、４２～４６、または４７～５１に示すようなアミノ酸配列、あるいはこれらに少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含む長さ４０～６０アミノ酸のタンパク質、あるいはこうした配列からなるタンパク質であって、配列番号７、３８、４２～４６、４７～５１の前記配列の２位に対応する位でアラニン残基を含み、そして前記配列中のシステイン残基のすべてが保存されている、前記タンパク質も提供する。
【0031】
本発明のさらなる側面として、以下に詳述するような、他のタンパク質および融合タンパク質もまた提供する。
本発明のさらなる側面にしたがって、式（Ｉ）を含む組換えタンパク質であって
Ｃｙｓ－Ａ－Ｃｙｓ－Ｂ－Ｃｙｓ－Ｃ－Ｃｙｓ－Ｄ－Ｃｙｓ－Ｅ－Ｃｙｓ－Ｆ（式（Ｉ））
式中、
Ａは式ＩＩ
Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９
のペプチドであり、式中、Ａ１はＰ、Ａ、Ｖ、Ｉ、およびＬからなる群より選択され；Ａ２はＥ、Ｄ、Ａ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群より選択され；Ａ３はＧ、Ｑ、Ｙ、Ｓ、Ｎ、Ｗ、Ｆからなる群より選択され；Ａ４はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｔからなる群より選択され；Ａ５はＴ、Ｙ、Ｎ、Ｇ、ＱおよびＳからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ａ６はＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、およびＨからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ａ７はＷであり；Ａ８はＧ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｙ、Ｎ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｉ、およびＬからなる群より選択され；Ａ９はＡ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｑからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂは式ＩＩＩ
Ｂ１－Ｂ２－Ｂ３
のペプチドであり、式中、Ｂ１はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｂ２はＴ、Ｓ、Ｎ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、ＲおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｂ３はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、Ｔからなる群より選択されるアミノ酸であり；ここでＢ１～Ｂ３の１つは存在せず；そして
Ｃは式ＩＶ
Ｃ１－Ｃ２－Ｃ３－Ｃ４－Ｃ５－Ｃ６－Ｃ７－Ｃ８－Ｃ９－Ｃ１０－Ｃ１１－Ｃ１２－Ｃ１３－Ｃ１４
のペプチドであり、式中、Ｃ１はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ２はＫ、Ｒ、Ｈ、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｉ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ３はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ４はＭ、Ｆ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、およびＷからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ５はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ６はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ７はＨ、Ｒ、およびＬからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ８はＡ、Ｌ、Ｉ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ９はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、ＴおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１０はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙからなる群より選択されるアミノ酸（好ましくはＮ）であり；Ｃ１１はＶ、Ｐ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、およびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１２はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１３はＨ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１４はＦ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、Ｔ、Ｅ、およびＤからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｄは式Ｖ
Ｄ１－Ｄ２－Ｄ３－Ｄ４－Ｄ５－Ｄ６－Ｄ７－Ｄ８
のペプチドであり、式中、Ｄ１はＲ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｗ、Ｐからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ２はＰ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｄ、およびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ３はＤ、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｋ、およびＨからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ４はＧ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｌ、Ｋ、およびＨからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ５はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、Ｔ、Ｄ、およびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ６はＨ、Ｒ；Ｋ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ７はＬ、Ｈ、およびＲからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ８はＡ、Ｌ、Ｉ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｅは式ＶＩ
Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４
のペプチドであり、式中、Ｅ１はＰ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、およびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ２は；Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ３はＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、ＴおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ４はＰ、Ａ、Ｌ、ＩおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｆは存在しないかまたは最大約１３アミノ酸のアミノ酸配列であり
４０～６０アミノ酸を含む
前記組換えタンパク質を提供する。
本発明のさらなる側面にしたがって、式（Ｉ）を含む組換えタンパク質であって
Ｃｙｓ－Ａ－Ｃｙｓ－Ｂ－Ｃｙｓ－Ｃ－Ｃｙｓ－Ｄ－Ｃｙｓ－Ｅ－Ｃｙｓ－Ｆ（式（Ｉ））
式中、
Ａは式ＩＩ
Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９
のペプチドであり、式中、Ａ１はＰ、Ａ、Ｖ、Ｉ、およびＬからなる群より選択され；Ａ２はＥ、Ｄ、Ａ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群より選択され；Ａ３はＧ、Ｑ、Ｙ、Ｓ、Ｎ、Ｗ、Ｆからなる群より選択され；Ａ４はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｔからなる群より選択され；Ａ５はＴ、Ｙ、Ｎ、Ｇ、ＱおよびＳからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ａ６はＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、およびＨからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ａ７はＷであり；Ａ８はＧ、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｙ、Ｎ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｉ、およびＬからなる群より選択され；Ａ９はＡ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｑからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂは式ＩＩＩ
Ｂ１－Ｂ２－Ｂ３
のペプチドであり、式中、Ｂ１はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｂ２はＴ、Ｓ、Ｎ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、ＲおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｂ３はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、Ｔからなる群より選択されるアミノ酸であり；ここでＢ１～Ｂ３の１つは存在せず；そして
Ｃは式ＩＶ
Ｃ１－Ｃ２－Ｃ３－Ｃ４－Ｃ５－Ｃ６－Ｃ７－Ｃ８－Ｃ９－Ｃ１０－Ｃ１１－Ｃ１２－Ｃ１３－Ｃ１４
のペプチドであり、式中、Ｃ１はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ２はＫ、Ｒ、Ｈ、Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｉ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ３はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ４はＭ、Ｆ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、およびＷからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ５はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ６はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ７はＨ、Ｒ、およびＬからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ８はＡ、Ｌ、Ｉ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ９はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、ＴおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１０はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙからなる群より選択されるアミノ酸（好ましくはＮ）であり；Ｃ１１はＶ、Ｐ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、およびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１２はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１３はＨ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１４はＦ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、Ｔ、Ｅ、およびＤからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｄは式Ｖ
Ｄ１－Ｄ２－Ｄ３－Ｄ４－Ｄ５－Ｄ６－Ｄ７－Ｄ８
のペプチドであり、式中、Ｄ１はＲ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｗ、Ｐからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ２はＰ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｄ、およびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ３はＤ、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｒ、Ｋ、およびＨからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ４はＧ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｌ、Ｋ、およびＨからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ５はＧ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、Ｔ、Ｄ、およびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ６はＨ、Ｒ；Ｋ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｙ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ７はＬ、Ｈ、およびＲからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ８はＡ、Ｌ、Ｉ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｅは式ＶＩ
Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４
のペプチドであり、式中、Ｅ１はＰ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、およびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ２は；Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ３はＲ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、ＴおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ４はＰ、Ａ、Ｌ、ＩおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｆは存在しないかまたは最大約１３アミノ酸のアミノ酸配列であり
４０～６０アミノ酸を含む
前記組換えタンパク質を提供する。
【0032】
上記側面の１つの態様にしたがって、
Ａ１はＰ、Ｉ、およびＬからなる群より選択され；Ａ２はＥ、Ｖ、およびＡからなる群より選択され；Ａ３はＷ、Ｑ、およびＹからなる群より選択され；Ａ４はＳ、Ｔ、およびＡからなる群より選択され；Ａ５はＴおよびＳからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ａ６はＡ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ａ７はＷであり；Ａ８はＧ、ＳおよびＴからなる群より選択され；Ａ９はＰ、ＱおよびＡからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ１はセリン（Ｓ）であり；Ｂ２はＴ、ＫおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｂ３はＴおよびＳからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｃ１はアミノ酸Ｇであり；Ｃ２はＴ、ＬおよびＭからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ３はＧであり；Ｃ４はＭ、Ｆ、Ｉ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ５はＳおよびＡからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ６はＴおよびＮからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ７はＲであり；Ｃ８はＶ、およびＩからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ９はＳ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１０はアスパラギンＮであり；Ｃ１１はＱ、Ｒ、Ｄ、Ｖ、およびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１２はアスパラギンＮであり；Ｃ１３はＲ、Ａ、Ｐ、およびＳからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１４はＦ、Ｑ、Ｓ、Ｅ、およびＮからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｄ１はＲ、Ｅ、およびＷからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ２はＬ、Ｍ、およびＰからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ３はＥ、Ｌ、ＶおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ４はＴ、Ｋ、およびＱからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ５はＱおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ６はＲ、Ｔ、Ｓ、およびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ７はアルギニン（Ｒ）であり；Ｄ８はＬ、およびＩからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｅ１はＬ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ２は；Ｓ、Ｖ、ＬおよびＩからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ３はＱおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ４はＰであり；Ｆは存在しないかまたは最大１３アミノ酸のペプチドであり、そしてＰＰＳＲＧＲＳＰＱＮＳＡＦ、ＧＱＰＶＹＳＳＬ、ＥＡＤＬＥＥＮ、ＥＱＥＰＥＱＰＴＤ、ＤＶＤＩＨＴＬＩ、およびＤＳＮＩＬＫＴＩＫＩＰからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
総数４４～５７のアミノ酸を含む
式（Ｉ）の組換えタンパク質を提供する。
Ａ１はＰ、Ｉ、およびＬからなる群より選択され；Ａ２はＥ、Ｖ、およびＡからなる群より選択され；Ａ３はＷ、Ｑ、およびＹからなる群より選択され；Ａ４はＳ、Ｔ、およびＡからなる群より選択され；Ａ５はＴおよびＳからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ａ６はＡ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ａ７はＷであり；Ａ８はＧ、ＳおよびＴからなる群より選択され；Ａ９はＰ、ＱおよびＡからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｂ１はセリン（Ｓ）であり；Ｂ２はＴ、ＫおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｂ３はＴおよびＳからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｃ１はアミノ酸Ｇであり；Ｃ２はＴ、ＬおよびＭからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ３はＧであり；Ｃ４はＭ、Ｆ、Ｉ、およびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ５はＳおよびＡからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ６はＴおよびＮからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ７はＲであり；Ｃ８はＶ、およびＩからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ９はＳ、およびＴからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１０はアスパラギンＮであり；Ｃ１１はＱ、Ｒ、Ｄ、Ｖ、およびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１２はアスパラギンＮであり；Ｃ１３はＲ、Ａ、Ｐ、およびＳからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｃ１４はＦ、Ｑ、Ｓ、Ｅ、およびＮからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｄ１はＲ、Ｅ、およびＷからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ２はＬ、Ｍ、およびＰからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ３はＥ、Ｌ、ＶおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ４はＴ、Ｋ、およびＱからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ５はＱおよびＥからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ６はＲ、Ｔ、Ｓ、およびＫからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｄ７はアルギニン（Ｒ）であり；Ｄ８はＬ、およびＩからなる群より選択されるアミノ酸であり；そして
Ｅ１はＬ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、およびＹからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ２は；Ｓ、Ｖ、ＬおよびＩからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ３はＱおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸であり；Ｅ４はＰであり；Ｆは存在しないかまたは最大１３アミノ酸のペプチドであり、そしてＰＰＳＲＧＲＳＰＱＮＳＡＦ、ＧＱＰＶＹＳＳＬ、ＥＡＤＬＥＥＮ、ＥＱＥＰＥＱＰＴＤ、ＤＶＤＩＨＴＬＩ、およびＤＳＮＩＬＫＴＩＫＩＰからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
総数４４～５７のアミノ酸を含む
式（Ｉ）の組換えタンパク質を提供する。
【0033】
上記側面のさらなる態様にしたがって、Ｆが完全に存在しないか、部分的に存在しないか、またはＰＰＳＲＧＲＳＰＱＮＳＡＦのアミノ酸配列を含む約１３アミノ酸のペプチドである、式Ｉの組換えタンパク質を提供する。
【0034】
より具体的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７、配列番号３８；ならびにアミノ酸配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７、配列番号３８と５０％を超える配列同一性を有するその断片または変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0035】
本発明の別の側面にしたがって、ＰＥＧ化されている、上に定義するような組換えタンパク質を提供する。
別の側面にしたがって、本発明は
（ｉ）ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメイン；
（ｉｉ）（ｉ）のＴＳＰ－１リピート相同ドメインにＮ末端またはＣ末端で融合し、そして血清アルブミン、トランスフェリンおよびヒトＩｇＧのＦｃ断片からなる群より選択される、融合パートナー；
（ｉｉｉ）随意に、ＴＳＰ－１リピート相同ドメインおよびＦｃ断片（（ｉ）のＴＳＰ－１リピート相同ドメインにＮ末端またはＣ末端で融合したもの）の間のペプチドリンカー
を含む融合タンパク質を提供する。
別の側面にしたがって、本発明は
（ｉ）ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメイン；
（ｉｉ）（ｉ）のＴＳＰ－１リピート相同ドメインにＮ末端またはＣ末端で融合し、そして血清アルブミン、トランスフェリンおよびヒトＩｇＧのＦｃ断片からなる群より選択される、融合パートナー；
（ｉｉｉ）随意に、ＴＳＰ－１リピート相同ドメインおよびＦｃ断片（（ｉ）のＴＳＰ－１リピート相同ドメインにＮ末端またはＣ末端で融合したもの）の間のペプチドリンカー
を含む融合タンパク質を提供する。
【0036】
上記側面の態様にしたがって、本発明のさらなる側面として上述するような、本発明にしたがった組換えタンパク質を含む、融合タンパク質を提供する。
本発明にしたがった融合タンパク質の融合パートナーは、１つの態様にしたがって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ断片、血清アルブミンおよびトランスフェリンからなる群より選択される。
本発明にしたがった融合タンパク質の融合パートナーは、１つの態様にしたがって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ断片、血清アルブミンおよびトランスフェリンからなる群より選択される。
【0037】
さらなる態様にしたがって、融合パートナー（ｉｉ）が、安定化ジスルフィド架橋を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ断片である、融合タンパク質を提供する。こうした突然変異はタンパク質の熱安定性を増加させうる。安定化突然変異は当該技術分野に知られ、そして報告されてきている。
【0038】
さらにさらなる態様にしたがって、融合パートナー（ｉｉ）が、Ｓ２２８Ｐ（ＩｇＧ４に関する）、Ｅ２３３Ｐ（ＩｇＧ１およびＩｇＧ４に関する）、Ｆ２３４Ａ（ＩｇＧ４に関する）、Ｌ２３４Ａ（ＩｇＧ１に関する）、Ｌ２３４Ｖ（ＩｇＧ１に関する）、Ｆ２３４Ｖ（ＩｇＧ４に関する）、Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１およびＩｇＧ４に関する）、ΔＧ２３６（ＩｇＧ１およびＩｇＧ４に関する）およびΔＫ４４７（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４に関する）からなる群より選択される１つまたはそれより多い突然変異を含む、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ断片である、融合タンパク質を提供する。
【0039】
別の態様にしたがって、融合タンパク質は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群より選択されるＦｃ断片を含んでもよい。
【0040】
別の態様にしたがって、融合タンパク質は、配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、および配列番号３９からなる群より選択されるリンカーを含む。
【0041】
１つの態様にしたがって、リンカーは、アミノ酸配列（ＥＡＡＡＫ）ｎを含み、式中、ｎは少なくとも４であり、好ましくはｎは８である。
別の態様にしたがって、融合タンパク質は、配列番号２６、配列番号２７；配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号４０および配列番号４１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
別の態様にしたがって、融合タンパク質は、配列番号２６、配列番号２７；配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号４０および配列番号４１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【0042】
別の態様にしたがって、（ｉｉ）の融合パートナーは血清アルブミンである。
本発明の第二の側面の別の態様にしたがって、（ｉｉ）の融合パートナーはトランスフェリンである。
本発明の第二の側面の別の態様にしたがって、（ｉｉ）の融合パートナーはトランスフェリンである。
【0043】
本発明は、さらにさらなる側面にしたがって、本発明にしたがった組換えタンパク質、タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸分子（例えばＤＮＡ）をさらに提供する。
【0044】
この側面の１つの態様にしたがって、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号８６、８７、９０、９１、９９、１００、１０４、１０５、１０８、１０９、１１２または１１３に示すような核酸配列、および配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号８６、８７、９０、９１、９９、１００、１０４、１０５、１０８、１０９、１１２または１１３と約８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、ＤＮＡ配列を提供する。
【0045】
さらに、本発明の別の側面にしたがって、本発明にしたがったＤＮＡ配列を含む、発現ベクターを提供する。また、本発明にしたがった発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0046】
最後に、４ドメインＣＣＮファミリータンパク質に起因する細胞シグナル伝達および細胞生理学的機能を阻害するかまたは相殺することによって、障害を治療するかまたは防止するため、医薬として使用するための、上に定義するような、ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメイン、タンパク質および融合タンパク質を提供する。
【0047】
１つの側面において、療法において使用するための、本明細書に定義するような融合タンパク質またはタンパク質を提供する。
融合タンパク質またはタンパク質は、４ドメインＣＣＮタンパク質の活性、特に４ドメインＣＣＮタンパク質の望ましくないまたは異常な活性と関連する状態の治療において使用するためであってもよい。活性は、線維化効果と関連してもよい。活性は線維化促進活性であってもよい。
融合タンパク質またはタンパク質は、４ドメインＣＣＮタンパク質の活性、特に４ドメインＣＣＮタンパク質の望ましくないまたは異常な活性と関連する状態の治療において使用するためであってもよい。活性は、線維化効果と関連してもよい。活性は線維化促進活性であってもよい。
【0048】
別の側面において、線維症、または線維症を示す任意の状態（すなわち線維化状態または疾患）の治療または防止において使用するための、本明細書に定義するような融合タンパク質またはタンパク質を提供する。さらなる側面において、癌の治療において使用するための、本明細書に定義するような融合タンパク質またはタンパク質を提供する。炎症性または自己免疫疾患、あるいは代謝性疾患の治療において使用するための、本明細書に定義するような融合タンパク質またはタンパク質もまた提供する。
【0049】
本発明のこうした側面にしたがって、本明細書に定義するかまたは記載するような、状態または疾患を治療するかまたは防止するための薬剤製造のための、本明細書に定義するようなタンパク質または融合タンパク質の使用もまた提供する。
【0050】
こうした側面にはまた、本明細書に定義するかまたは記載するような状態または疾患を治療するかまたは防止する際に使用するための、本明細書に定義するようなタンパク質または融合タンパク質を含む組成物（例えば薬学的組成物）も含まれる。
【0051】
こうした側面にはまた、本明細書に定義するかまたは記載するような状態または疾患を治療するかまたは防止する方法であって、本明細書に定義するようなタンパク質または融合タンパク質、特に前記タンパク質または融合タンパク質の有効量を、その必要がある被験体に投与する工程を含む、前記方法も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1-1】図１は、ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２（配列番号２８の配列に定義するような、本発明の一態様）の細胞生理および細胞シグナル伝達を示す。Ａ）は配列番号２８のＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２融合タンパク質が、Ａ５４９肺癌細胞においてＡｋｔのリン酸化（セリン－４７３）の濃度依存性阻害を引き起こすことを示す。すべてのエラーバーはＳＤを示す。統計的有意性は、ダネットの事後検定を伴う１方向ＡＮＯＶＡによって計算した（ｐ＜０．０５を＊によって示す）。
【図1-2】図１は、ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２（配列番号２８の配列に定義するような、本発明の一態様）の細胞生理および細胞シグナル伝達を示す。Ｂ）は配列番号２８のＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２融合タンパク質が、ヒト肺線維芽細胞株、ＩＭＲ９０において増殖を阻害することを示す。すべてのエラーバーはＳＤを示す。統計的有意性は、ダネットの事後検定を伴う１方向ＡＮＯＶＡによって計算した（ｐ＜０．０５を＊によって示す）。
【図1-3】図１は、ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２（配列番号２８の配列に定義するような、本発明の一態様）の細胞生理および細胞シグナル伝達を示す。Ｃ）は配列番号２８のＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２融合タンパク質が、エストロゲン受容体陽性乳癌細胞株ＭＣＦ－７の、およびトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の球体形成能（係留独立増殖）を阻害することを示す。すべてのエラーバーはＳＤを示す。統計的有意性は、ダネットの事後検定を伴う１方向ＡＮＯＶＡによって計算した（ｐ＜０．０５を＊によって示す）。
【図1-4】図１は、ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２（配列番号２８の配列に定義するような、本発明の一態様）の細胞生理および細胞シグナル伝達を示す。Ｄ）は配列番号２８のＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２融合タンパク質が、ＴＧＦ－β誘導性ＳＭＡＤレポーター活性（ＳＭＡＤタンパク質はカノニカルなＴＧＦ－β制御性転写因子である）を、用量依存性に阻害することを示す。すべてのエラーバーはＳＤを示す。統計的有意性は、ダネットの事後検定を伴う１方向ＡＮＯＶＡによって計算した（ｐ＜０．０５を＊によって示す）。
【図2】図２は、ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）がＩｇＧのＦｃ断片に融合している本発明の態様の、プロテアーゼ感受性に対するＦｃ断片のヒンジ領域の異なる変異体の効果を示し、ここで、試験される融合タンパク質は、それぞれ、配列番号２８；配列番号２９、および配列番号３０に示すような配列を含む。以下の実施例６を参照されたい。
【図3】図３は、ＩｇＧのＦｃ断片とＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）を連結するペプチドリンカーの構造に応じた、本発明の態様の凝集の傾向を示し、ここで、試験される融合タンパク質は、配列番号３０および配列番号３１に示すような配列を含む。
【図5】図５は、本発明の態様が、ＣＣＮ５ ＴＳＰ－１リピート相同ドメインの野生型Ｐ１９５変異体（Ｆｃ－ＨＬｎ８－ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）、配列番号４０）に比較して、配列番号７に示すような、ＣＣＮ５ ＴＳＰ－１リピート相同ドメインのプロリン１９５の突然変異を取り込んだ場合（Ｆｃ－ＨＬｎ８－ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｐ１９５Ａ、配列番号４１）の、エンドペプチダーゼ切断に対する感受性の減少を示す。
【図6】図６は、プロテインＡ捕捉クロマトグラフィによって精製された、配列番号５８に対応するタンパク質の産生を示す。還元剤、ベータ－メルカプトエタノールの非存在下（－レーン）では二量体が存在することがわかる。しかし、ベータ－メルカプトエタノールの存在下（＋レーン）では、主な産物は、配列番号５８によってコードされる部分すべてを含む、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）融合タンパク質（ＴＳＰ－１相同ドメイン断片、ペプチドリンカーおよびＦｃ断片）ではなく、Ｆｃ断片のみで構成される切断断片であることがわかる。
【図7】図７は、プロテインＡ捕捉クロマトグラフィによって精製された、一部切除Ｃ末端テールを有する、配列番号２７に対応するタンパク質の産生を示す。該タンパク質が、Ｃ末端テールが含まれている配列番号５８に対応するタンパク質よりも、プロテアーゼ分解に対して有意により耐性であることがわかる。
【図8】図８は、プロテインＡ捕捉クロマトグラフィによって精製された、配列番号２７に対応するタンパク質に類似の、配列番号７３に対応するタンパク質の産生を示す。再び、ベータ－メルカプトエタノールの存在下（＋レーン）で、該タンパク質が、配列番号５８に対応するタンパク質よりも、プロテアーゼ分解により耐性であることがわかる。
【図9】図９は、安定トランスフェクション細胞において産生された、配列番号４１に対応するタンパク質の多様な濃度の投与後の、Ａ５４９肺癌細胞におけるホスホ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ－４７３）レベルを測定するアッセイの結果を示す。該タンパク質が、ＡＫＴのリン酸化の阻害をまったく示さないことがわかる。
【図10】図１０は、安定トランスフェクション細胞において産生された、配列番号８０に対応するタンパク質の多様な濃度の投与後の、Ａ５４９肺癌細胞におけるホスホ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ－４７３）レベルを測定するアッセイの結果を示す。該タンパク質が、ＡＫＴのリン酸化の有意な阻害をまったく示さず、そして実際、より高い濃度では、ホスホ－ＡＫＴの増加すら生じうることがわかる。
【図11】図１１は、一過性トランスフェクション細胞において産生された、配列番号８０に対応するタンパク質の多様な濃度の投与後の、Ａ５４９肺癌細胞におけるホスホ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ－４７３）レベルを測定するアッセイの結果を示す。一過性トランスフェクション細胞において産生された際、該タンパク質が、ＡＫＴのリン酸化に対して、濃度依存性の阻害活性を有することがわかる。
【図12】図１２は、配列番号８４、９４および１０６に対応するタンパク質の多様な濃度の投与後、Ａ５４９肺癌細胞におけるホスホ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ－４７３）レベルを測定するアッセイの結果を示す。これらのタンパク質各々が、ＡＫＴのリン酸化に対して、濃度依存性の阻害活性を有することがわかる。
【図13】図１３は、配列番号８８に対応するタンパク質の多様な濃度の投与後、Ａ５４９肺癌細胞におけるホスホ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ－４７３）レベルを測定するアッセイの結果を示す。該タンパク質が、１０μｇ／ｍｌを超える濃度で、ＡＫＴのリン酸化を阻害可能であることがわかる。
【図14】図１４は、配列番号１０２および９７に対応するタンパク質の多様な濃度の投与後、Ａ５４９肺癌細胞におけるホスホ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ－４７３）レベルを測定するアッセイの結果を示す。どちらのタンパク質も、ＡＫＴのリン酸化に対する、濃度依存性阻害活性を有することがわかる。
【図15】図１５は、配列番号１１０に対応するタンパク質の多様な濃度の投与後、Ａ５４９肺癌細胞におけるホスホ－ＡＫＴレベルを測定するアッセイの結果を示す。該タンパク質が、ＡＫＴのリン酸化に対する、濃度依存性阻害活性を有することがわかる。
【図16-1】図１６は、配列番号１０６に対応するタンパク質を伴ういくつかの実験の結果を示す。Ａ）ＴＧＦ－ベータおよびＣＣＮ２の両方によって誘導されるヒト肺線維芽細胞の遊走を、該タンパク質が阻害することを示す。Ｂ）ＴＧＦ－ベータおよびＣＣＮ２の両方によって誘導されるスクラッチ創傷の閉鎖を、該タンパク質が阻害することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0053】
本発明は、言及するように、ＣＣＮ５のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメインが、ＣＣＮ５／ＷＩＳＰ２の細胞シグナル伝達機能を与える、完全に活性な構造であるという驚くべき知見に基づく。ＣＣＮ５のＴＳＰ－１リピート相同ドメインの活性に対するこの新規洞察に基づいて、本発明者らは、４ドメインＣＣＮタンパク質、すなわちＣＣＮ１、ＣＣＮ２、ＣＣＮ３、ＣＣＮ４およびＣＣＮ６に起因する細胞シグナル伝達および細胞生理学的機能を阻害するかまたは相殺するために使用可能な、本発明にしたがったタンパク質、組換えタンパク質および融合タンパク質を提供する。ＣＣＮ５の活性を再現するために全長ＣＣＮ５のどの部分が必要であるか、以前は明らかでなかったため、そして全長ＣＣＮ分子はタンパク質分解に非常に感受性であり、そして活性がある均質な型で生じることが困難であるため、この新規洞察は、ＣＣＮ５に基づく、安定で均質な薬剤様分子の形成を可能にするために非常に重要であると見なされる。さらに、ＣＣＮ５の特定の部分が、例えば全長タンパク質の一過性過剰発現に際して観察される活性を再現するために十分でありうるというこの含意はまた、ＣＣＮタンパク質がマトリックス細胞タンパク質として働くという、技術分野における一般的な意見とは対照的である。ＣＣＮタンパク質、およびマトリックス細胞タンパク質一般の作用機構に関する一般的な意見は、細胞シグナル伝達の直接調節因子として働くというよりも、ＣＣＮタンパク質の異なるセグメントが多様な他のＥＣＭタンパク質および細胞表面受容体と相互作用して、それによってその活性を調節するというものである。ＣＣＮ５のＴＳＰ－１リピート相同ドメインの活性の新規知見、およびＣＣＮタンパク質ファミリーの他のメンバーとの構造的に緊密な関係の知見によって、他のＣＣＮファミリータンパク質のＴＳＰ－１リピート相同ドメインもまた、４ドメインＣＣＮファミリータンパク質の細胞シグナル伝達機能を阻害するために利用可能であることが示唆される。１つの側面にしたがって、本発明の組換えタンパク質および融合タンパク質は、Ａ５４９細胞においてＡＫＴのリン酸化（Ｓｅｒ４７３）を阻害する。
【0054】
前記細胞シグナル伝達の阻害は、多様な障害の治療に適切である。例えば、ＣＣＮ２は、いくつかの疾患、特に、増進された線維形成および組織線維症が特徴的な病態生理特性である疾患に関与する。
【0055】
例えば、ＣＣＮ２のみの過剰発現は、肺において線維症を誘導するために十分であることが示されてきている（Ｓｏｎｎｙｌａｌら， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ６２，１５２３－１５３２（２０１０））。ＣＣＮ２はまた、ブレオマイシン誘導性肺線維症（Ｂｏｎｎｉａｕｄ Ｐ．ら Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１，５１０－５１６（２００４））、放射線誘導性肺線維症（Ｂｉｃｋｅｌｈａｕｐｔ，Ｓ．ら Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０９（２０１７））、およびＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシン相同体（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ａｎｄ Ｔｅｎｓｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇ））発現の喪失による肺線維症（Ｐａｒａｐｕｒａｍ，Ｓ．Ｋ．ら Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ ４３， ３５－４１（２０１５））に必要であることもまた見出されてきている。さらに、他の誘発剤の非存在下で、ＣＣＮ２は、肺クララ細胞（Ｗｕ，Ｓ．ら Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２，５５２－５６３（２０１０））、肺胞ＩＩ型上皮細胞で発現され、そしてそこから分泌された際（Ｃｈｅｎ，Ｓ．ら Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３００，Ｌ３３０－３４０）、線維芽細胞特異的プロモーターから発現された際（Ｓｏｎｎｙｌａｌら（２０１０）、上記、Ｓｏｎｎｙｌａｌ，Ｓ．ら， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２６，２１６４－２１７５（２０１３））、またはアデノウイルスによって送達された際（Ｂｏｎｎｉａｕｄ，Ｐ．ら， Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １６８，７７０－７７８（２００３））、肺線維症を誘導することが見出されてきている。したがって、多数の報告はすべて、ＣＣＮ２が皮膚または肺において線維症を誘発するために十分であるだけでなく、いくつかの疾患モデルにおいて、完全な線維症表現型にも必要であるという結論を支持する。肺線維症は、ヒト疾患、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の特徴であるが、肺線維症はまた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（Ｊａｎｇ，Ｊ．Ｈ．ら， ＣＯＰＤ １４，２２８－２３７（２０１７））、および全身性硬化症の状況でも起こる。実際、肺線維症は、全身性硬化症患者の最大４０％で、主な死因として報告されてきている（Ｔｙｎｄａｌｌ ＡＪら， Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ．２０１０ Ｏｃｔ；６９（１０）：１８０９－１５）。ＣＣＮ２、および他のＣＣＮタンパク質、例えばＷＩＳＰ１もまた、ヒト患者において、ＩＰＦ（Ｋｏｎｉｇｓｈｏｆｆ，Ｍ．ら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１９，７７２－７８７（２００９））およびＣＯＰＤ（Ｊａｎｇら、上記）の両方の病態生理に関連付けられてきている。
【0056】
別の例は新生物障害である。例えば、乳癌の状況において、ＣＣＮ２は、トリプルネガティブ乳癌モデル（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）において、骨転移に寄与することが示されてきている（Ｋａｎｇ，Ｙ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３， ５３７－５４９（２００３））。さらに、高レベルのＣＣＮ２を発現する細胞株であるトリプルネガティブ乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）（Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｓ．ら， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２０，２０５３－２０６５（２００７））において、ＣＣＮ２をノックダウンすると、これらの細胞の遊走能が減少する一方、ＣＣＮ２の内因性発現が低いホルモン受容体陽性ＭＣＦ－７乳癌細胞株（Ｃｈｅｎら、上記）において、ＣＣＮ２を過剰発現すると、後者の細胞の遊走能が増加した（Ｃｈｅｎら、上記、Ｃｈｉｅｎ，Ｗ．ら， Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ３８，１７４１－１７４７（２０１１））。さらに後の報告はまた、ＭＣＦ－７細胞においてＣＣＮ２を過剰発現させると、化学耐性が増加する一方、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞においてＣＣＮ２をノックダウンすると、化学耐性が減少することも見出した（Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｙ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９，３４８２－３４９１（２００９））。ＣＣＮ２によって与えられる化学耐性の増加はまた、他の乳癌細胞に関しても報告されてきている（Ｌａｉ，Ｄら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７１，２７２８－２７３８（２０１１））。さらに、過剰発現またはノックダウン研究を通じて、ＣＣＮ２が、上皮から間葉系への遷移（ＥＭＴ）、および乳癌細胞の係留独立増殖（マンモスフェア形成）能の増加に寄与することもまた示されてきている（Ｃｈｅｎら、上記、Ｚｈｕ， Ｘ．ら， Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ６，２５３２０－２５３３８（２０１５））。化学耐性増加およびＣＣＮ２によって誘導されるＥＭＴの増進の知見はどちらも、他の癌タイプにおいてもまた、ＥＭＴおよび化学耐性の間にある関連と一致する（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｋ．Ｒ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ５２７，４７２－４７６（２０１５）、Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ５２７，５２５－５３０（２０１５））。
【0057】
特定の側面において、本発明は、ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメインの少なくとも部分に対応するポリペプチドを含み、ＴＳＰ－１相同ドメイン配列が一部切除され、そして／または修飾されていてもよいが、該ドメインのシステイン残基が保存されているポリペプチドを含む、上に定義するような単量体性融合タンパク質を提供する。このポリペプチドは、便宜上、「ＴＳＰ－１ポリペプチド」と称されてもよく、そしてこの用語は、したがって、特定の天然ＴＳＰ－１相同ドメイン配列のみへのいかなる限定も持たずまたは示さないと理解されるものとする。用語「ＴＳＰ－１ポリペプチド」は、「ＴＳＰ－１ドメインタンパク質」または「ＴＳＰ－１ドメイン配列」と同義にまたは交換可能に使用可能である。
【0058】
以下の実施例に立証するように、驚くべきことに、単量体性融合パートナーは、二量体性融合タンパク質を生じるＩｇＧタンパク質由来のＦｃ断片などの、二量体性融合パートナーに比較して、活性であり、そして安定であるタンパク質を産生する際に好適であることが見出されてきている。単量体性融合は、これらが含むＴＳＰ－１ドメインポリペプチドの活性を保持する。さらに、タンパク質は、タンパク質分解的分解に関するものを含めて安定である。さらに以下に記載するように、タンパク質分解的分解に対する耐性は、特に、上述のＡｌａ置換を含めて、ＴＳＰ－１ポリペプチドのアミノ酸配列に対する修飾を作製することによって、改善されうる。
【0059】
したがって、融合タンパク質の構成要素（ｉ）のポリペプチドは、配列番号３７または２～６より選択される前記配列と、あるいは配列番号１または８～１２より選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を保持し、そして前記配列中のシステイン残基のすべてが保存される限り、前記配列に対して、挿入、欠失、置換、突然変異またはその任意の組み合わせを含んでもよい。
【0060】
別の側面において、本発明は、ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメインの少なくとも部分に対応するポリペプチドからなるかまたはこうしたポリペプチドを含むが、融合タンパク質の背景にはないタンパク質（例えば組換えタンパク質）を提供し、ここで、ＴＳＰ－１ドメイン配列は一部切除され、そして／または修飾されていてもよく、そして配列番号３７または２～６、あるいは配列番号１または８～１２の２位に対応する位でＡｌａ置換を含むが、該ドメインのシステイン残基は保存されている。言い換えると、ＴＳＰ－１ドメインタンパク質は、融合パートナーなどの別の構成要素は含まずに、またはこうした構成要素とは独立に、提供されてもよい。したがって、ＴＳＰ－１ドメインタンパク質は、別のタンパク質ドメインまたは構成要素、あるいは他の機能的または構造的タンパク質配列に融合もまたは連結もされていない。便宜上、こうしたタンパク質は、「Ａｌａ置換タンパク質」と称されてもよい。
【0061】
本明細書において、用語「保存された」は、所定の配列における残基が、欠失または置換されていないことを意味する。言い換えると、用語「保存された」は、用語「保持された」と同義に（そして交換可能に）用いられる。これは単純に、システイン残基が配列から除去されないことを意味する。したがって、上記背景において、これは、配列番号３７または２～６あるいは１または８～１２より選択される配列中のシステイン残基が欠失もまたは置換もされないことを意味する。保存された残基間（例えば保存されたシステイン間）でのさらなる残基の挿入、または保存されない（例えば非システイン）残基の欠失は、元来の参照配列（例えば配列番号３７または２～６より選択される配列）中のその位に対して、ポリペプチド配列中の保存された残基の位置を改変させる可能性もあることが注目される。しかし、本明細書に定義した際、こうした残基はなお、「保存された」と見なされる。したがって、用語「保存された」は、システイン残基の位（またはより具体的には、位の番号）に対するいかなる制限または限定も課さない。
【0062】
いくつかの態様において、（ｉ）のポリペプチドは：
（ａ）配列番号１または８～１２より選択されるアミノ酸配列；あるいは
（ｂ）配列番号１または８～１２より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列の部分であって、それぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５の、またはそれぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の、少なくとも４４アミノ酸配列を含む、前記部分
を含むか、あるいはこれらからなる。
（ａ）配列番号１または８～１２より選択されるアミノ酸配列；あるいは
（ｂ）配列番号１または８～１２より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列の部分であって、それぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５の、またはそれぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の、少なくとも４４アミノ酸配列を含む、前記部分
を含むか、あるいはこれらからなる。
【0063】
上述のように、（ｉｉ）の単量体性融合パートナーおよび（ｉｉｉ）のペプチドリンカーは、ＣＣＮファミリータンパク質のＩＧＦ結合タンパク質相同ドメイン、フォン・ヴィルブランド因子Ｃ型リピート相同ドメイン、またはシステイン・ノット・ドメインではないかまたはこれらのドメインを含まない。言い換えると、本発明の融合タンパク質中に存在してもよいＣＣＮファミリータンパク質の唯一のドメインは、ＴＳＰ－１相同ドメインである。
【0064】
同様におよび類似に、融合タンパク質ではないＡｌａ置換タンパク質の背景において、該タンパク質は、いかなる他のＣＣＮドメインも（ＴＳＰ－１ドメインタンパク質以外には）含まない。
【0065】
いくつかの態様において、（ｉ）のポリペプチドまたはＡｌａ置換タンパク質は、上に定義するように、ＴＳＰ－１相同ドメインの部分しか含まなくてもよい。本発明者らは、必要とされるＴＳＰ－１ドメインの最小限の断片は、配列番号３７、６、２、３、４または５の４４アミノ酸配列であることを見出している。したがって、いくつかの態様において、（ｉ）のポリペプチドは、長さ少なくとも４４アミノ酸である。いくつかの態様において、（ｉ）のポリペプチドは、長さ４４～５７アミノ酸である。しかし、上述のように、システイン残基の間に位置する４４アミノ酸最小断片において、１つまたはそれより多いアミノ酸の欠失があってもよい。したがって、いくつかの態様において、ＴＳＰ－１ポリペプチドの長さは、４４残基未満、すなわち４０～４３残基であってもよい。
【0066】
いくつかの態様において、（ｉ）のポリペプチドは、配列番号３７または２～６より選択されるアミノ酸配列、あるいは配列番号３７または２～６より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなる。
【0067】
上述のように、本発明のタンパク質は、融合タンパク質を含めて、ＣＣＮ５の活性、より具体的には生物学的活性を提示する（または言い換えると、示すまたは有する）。１つの態様において、タンパク質は、ＣＣＮ５のＴＳＰ－１相同ドメインの活性を保持するかまたは示すかまたは有してもよい。あるいは、タンパク質は、ＣＣＮタンパク質の単離ＴＳＰ－１相同ドメインの活性、特に生物学的活性を提示する（または示すまたは有する）と定義されてもよい。前述は、ドメインの任意の活性、そして特にＴＳＰ－１相同ドメインの抗線維化効果を反映する活性に当てはまりうる。ドメインの任意の特定の生物学的効果に基づいて、任意の好適なアッセイまたは方法を用いて、こうした活性に関してアッセイ（または試験または検出）してもよい。
【0068】
ＡＫＴのリン酸化に対するタンパク質の効果を分析することによって、所定のタンパク質の活性を好適に評価してもよいことが注目される。特に、実施例２に記載するように、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、ＡＫＴのリン酸化（Ｓｅｒ－４７３）を阻害する能力に関して、所定のタンパク質をアッセイしてもよい。当業者は、他の類似のアッセイを考案して、同じ活性を評価してもよいし、または他の関連する抗線維化活性を評価してもよいことを認識するであろう。
【0069】
上述のように、本発明の他の側面において、４ドメインＣＣＮタンパク質に起因する細胞シグナル伝達および細胞生理学的機能を阻害するかまたは相殺する組換えタンパク質であって、上記式Ｉ記載のアミノ酸配列を含む、前記組換えタンパク質を提供する。
【0070】
Ｃｙｓ－Ａ－Ｃｙｓ－Ｂ－Ｃｙｓ－Ｃ－Ｃｙｓ－Ｄ－Ｃｙｓ－Ｅ－Ｃｙｓ－Ｆ
式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上に定義する通りであり、そして付随する請求項における通りである。式Ｉは、構造的に関連するＣＣＮファミリータンパク質（ＣＣＮ１～ＣＣＮ６）のＴＳＰ－１リピート相同ドメインの整列の結果であり、これらはすべて６つの保存されたシステインを含み、そしてタンパク質の活性に影響を及ぼすことなくアミノ酸が置換されてもよい（以下にさらに論じるような保存的置換）ことを考慮に入れている。異なるＣＣＮタンパク質のＴＳＰ１リピート相同ドメインの最初の保存されるシステインの位置は、式Ｉの組換えタンパク質の１位と定義される。
式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは上に定義する通りであり、そして付随する請求項における通りである。式Ｉは、構造的に関連するＣＣＮファミリータンパク質（ＣＣＮ１～ＣＣＮ６）のＴＳＰ－１リピート相同ドメインの整列の結果であり、これらはすべて６つの保存されたシステインを含み、そしてタンパク質の活性に影響を及ぼすことなくアミノ酸が置換されてもよい（以下にさらに論じるような保存的置換）ことを考慮に入れている。異なるＣＣＮタンパク質のＴＳＰ１リピート相同ドメインの最初の保存されるシステインの位置は、式Ｉの組換えタンパク質の１位と定義される。
【0071】
保存されたシステインの間の５つのセグメントは、それぞれ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥである。
第一のセグメントＡは、式Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９によって定義され、式中、Ａ１～Ａ９は上に定義する通りである。セグメントＡの７番目の位置（Ａ７）中のアミノ酸は、ＣＮＮファミリータンパク質のすべてのメンバーにおいてトリプトファン（Ｗ）であり、そして保存されていると考えられる。
第一のセグメントＡは、式Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ａ５－Ａ６－Ａ７－Ａ８－Ａ９によって定義され、式中、Ａ１～Ａ９は上に定義する通りである。セグメントＡの７番目の位置（Ａ７）中のアミノ酸は、ＣＮＮファミリータンパク質のすべてのメンバーにおいてトリプトファン（Ｗ）であり、そして保存されていると考えられる。
【0072】
第二のセグメントＢは、式Ｂ１－Ｂ２－Ｂ３によって定義され、式中、Ｂ１～Ｂ３は上に定義する通りである。１つの態様にしたがって、Ｂ１およびＢ３はセリンまたはスレオニンのいずれかである。
【0073】
第三のセグメントＣは、式Ｃ１－Ｃ２－Ｃ３－Ｃ４－Ｃ５－Ｃ６－Ｃ７－Ｃ８－Ｃ９－Ｃ１０－Ｃ１１－Ｃ１２－Ｃ１３－Ｃ１４であり、式中、アミノ酸Ｃ１～Ｃ１４は上に定義する通りである。１つの態様にしたがって、アミノ酸Ｃ１およびＣ３はグリシン（Ｇ）である。別の態様にしたがって、Ｃ７はアルギニン（Ｒ）であり、Ｃ１０およびＣ１２はどちらもアスパラギン（Ｎ）である。
【0074】
第四のセグメントＤは、式Ｄ１－Ｄ２－Ｄ３－Ｄ４－Ｄ５－Ｄ６－Ｄ７－Ｄ８によって定義され、式中、アミノ酸Ｄ１～Ｄ８は上に定義する通りである。１つの態様にしたがって、Ｄ７はアルギニン（Ｒ）である。
【0075】
第五のセグメントＥは、式Ｅ１－Ｅ２－Ｅ３－Ｅ４によって定義され、式中、アミノ酸Ｅ１～Ｅ４は上に定義する通りである。本発明の１つの態様にしたがって、Ｅ４はプロリンである。
【0076】
最後のシステインに続いて、０～１３アミノ酸を含む、可変長のカルボキシル末端ペプチドセグメント（Ｆ）がある。
Ｆは、ＣＣＮファミリータンパク質のＴＳＰ－１リピート相同ドメインのアミノ酸配列と比較して、欠失されてもまたは短縮されてもよい。１つの態様にしたがって、Ｆは存在しない。別の態様にしたがって、Ｆは、ＰＰＳＲＧＲＳＰＱＮＳＡＦ、ＧＱＰＶＹＳＳＬ、ＥＡＤＬＥＥＮ、ＥＱＥＰＥＱＰＴＤ、ＤＶＤＩＨＴＬＩ、およびＤＳＮＩＬＫＴＩＫＩＰからなる群より選択されるペプチドからなる。本態様の１つの側面にしたがって、組換えタンパク質は、配列番号８～１２に示すようなアミノ酸配列の型を取ってもよい。
Ｆは、ＣＣＮファミリータンパク質のＴＳＰ－１リピート相同ドメインのアミノ酸配列と比較して、欠失されてもまたは短縮されてもよい。１つの態様にしたがって、Ｆは存在しない。別の態様にしたがって、Ｆは、ＰＰＳＲＧＲＳＰＱＮＳＡＦ、ＧＱＰＶＹＳＳＬ、ＥＡＤＬＥＥＮ、ＥＱＥＰＥＱＰＴＤ、ＤＶＤＩＨＴＬＩ、およびＤＳＮＩＬＫＴＩＫＩＰからなる群より選択されるペプチドからなる。本態様の１つの側面にしたがって、組換えタンパク質は、配列番号８～１２に示すようなアミノ酸配列の型を取ってもよい。
【0077】
別の側面にしたがって、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７、配列番号３８；ならびにアミノ酸配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７、配列番号３８と少なくとも５０％の配列同一性を有するその断片または変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0078】
１つの側面にしたがって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７、配列番号３８；ならびにアミノ酸配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７、配列番号３８と５０％を超える配列同一性を有するその断片または変異体からなる群より選択されるアミノ酸からなる、組換えタンパク質を提供する。
【0079】
「組換えタンパク質」は、本明細書において、組換え核酸によってコードされるタンパク質である。これらは、以下にさらに開示するように、宿主細胞において、組換え核酸から発現される。
【0080】
「組換え核酸」は、本明細書において、以下にさらに開示するように、その起源または操作によって、天然に会合しているポリヌクレオチドのすべてまたは部分と会合しておらず、そして／または天然に連結しているもの以外のポリヌクレオチドに連結している、核酸分子を記載する。
【0081】
当業者は、本発明記載の組換えタンパク質および融合タンパク質のアミノ酸配列の修飾を、前記タンパク質の活性を改変することなく導入しうることを知っている。アミノ酸は通常、疎水性または親水性として、そして／あるいは極性または非極性側鎖を有するとして分類される。１つのアミノ酸の、同じ生化学的特性を有する別のものでの置換は、一般的に保存的置換として知られる。
【0082】
アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：
・ＭＩＬＶ
・ＦＹＷ
・ＫＲＨ
・ＡＧ
・ＳＴ
・ＱＮ
・ＥＤ
一般的に、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対電荷またはサイズ特性を改変しないアミノ酸置換を指し、そしてしたがって、タンパク質の構造をほとんど改変せず、これが生物学的活性もまた有意には改変されない理由である。
・ＭＩＬＶ
・ＦＹＷ
・ＫＲＨ
・ＡＧ
・ＳＴ
・ＱＮ
・ＥＤ
一般的に、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対電荷またはサイズ特性を改変しないアミノ酸置換を指し、そしてしたがって、タンパク質の構造をほとんど改変せず、これが生物学的活性もまた有意には改変されない理由である。
【0083】
当業者は、構造的および化学物理的特性が保存される限り、１つまたはいくつかのアミノ酸が欠失されるか、挿入されるか、またはアミノ酸配列に付加されても、タンパク質の生物学的活性もまた保持されうることを知っている。
【0084】
記号「Δ」は、アミノ酸の直前で用いられた際、示すアミノ酸の欠失を指し、例えばΔＫ４４７は、Ｋ４４７が存在しないタンパク質と理解されるものとする。特定のアミノ酸の欠失はまた、本明細書において、代わりに「－」で示され、例えばＫ４４７－もまた、Ｋ４４７が存在しないタンパク質と理解されるものとする。
【0085】
したがって、本発明は、付随する請求項において開示されるように、組換えタンパク質および融合タンパク質を含み、上述のようなこうした修飾（アミノ酸の置換、欠失、挿入および付加）は、その生物学的活性、すなわち４ドメインＣＣＮファミリータンパク質；ＣＣＮ１、ＣＣＮ２、ＣＣＮ３、ＣＣＮ４およびＣＣＮ６に起因する細胞シグナル伝達および細胞生理学的機能を阻害するかまたは相殺する能力を本質的に改変することなく導入されうることが理解されるものとする。
【0086】
本明細書を通して、アミノ酸配列に言及する。本明細書でアミノ酸配列に言及する際、ときに、本明細書において、「ｕｎｉｐｒｏｔ番号付け」またはＥｕ番号付けを参照することにより、問題のアミノ酸配列またはタンパク質の修飾に言及する。ｕｎｉｐｒｏｔ番号付けはｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１９ Ｊａｎ ８；４７（Ｄ１）：Ｄ５０６－Ｄ５１５）で利用される番号付けを指す。ＣＣＮタンパク質のアミノ酸番号に言及する際、ｕｎｉｐｒｏｔ番号付けを用いる。Ｅｕ番号付けは、Ｅｕ抗体の番号付け（Ｅｄｅｌｍａｎら，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５）を指し、そして野生型とは異なる突然変異またはキメラを含むまたは含まないヒトＩｇＧサブクラスのＦｃ断片におけるアミノ酸を指す際に用いられる。Ｅｕ番号付け系は、例えば、ＩＭＧＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃチャート中の国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報系（ＩＭＧＴ）からアクセス可能である。ＩＭＧＴは、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ， Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１４ Ｄｅｃ；４（４）：１１０２－１１３９に記載される。
【0087】
本明細書において、「配列同一性」に言及する際、第二の配列に少なくともｘ％の同一性を有する配列は、第二のアミノ酸配列の全長に対して、全体整列を通じて両方の配列を最適に整列させた際、第二の配列のマッチするアミノ酸に同一である、第一の配列中のアミノ酸の数を示す。ｘが最大である場合、両方の配列は最適に整列されている。整列および同一性パーセントの決定を、手動でまたは自動的に行ってもよい。
【0088】
アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列を、当該技術分野の技術範囲内の多様な方式で達成してもよく、例えば公的に入手可能なソフトウェア、例えばＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ Ｆ， Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ（２０１８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２７：１３５－１４５）、タンパク質ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、米国より）、または商業的に入手可能なソフトウェア、例えばＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いてもよい。当業者は、比較する配列の全長に渡って最大整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、整列を測定するために適切なパラメータを決定してもよい。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴは、アミノ酸配列同一性を決定するために用いられるソフトウェアの別の例である（ＭａｃＷｉｌｌｉａｍら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ｊｕｌ；４１（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５９７－Ｗ６００）。
【0089】
本発明の１つの側面にしたがって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７、および配列番号３８；ならびにアミノ酸配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７および配列番号３８と少なくとも５０％の配列同一性を有するその断片または変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0090】
別の側面にしたがって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７、および配列番号３８からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0091】
生物学的に活性であるタンパク質およびペプチドは、ヒト疾患の臨床管理において、重要な位置を有する。しかし、多くのタンパク質およびペプチドは、これらが小さいサイズであるために腎濾過によって除去されるため、そして／またはタンパク質分解的代謝のためのいずれかで、理想的な薬物動態学的特性ではないため、困難を提示する。こうした要因は、タンパク質またはペプチドの循環濃度を有効な療法レベルに維持するために、一定の注入または頻繁な皮下投与を投与する必要があるなど、治療の必要がある被験体に薬剤を投与する際に、限界または困難を課す可能性もある。薬剤の一定のまたは非常に頻繁な投与の必要性は、患者および医師の両方に明らかな困難および不都合を与えるため、臨床的に望ましくない。
【0092】
生物学的活性ペプチドまたはタンパク質の半減期を延長させるための１つの戦略は、ＰＥＧ化と呼ばれるプロセスによって、関心対象のペプチドまたはタンパク質にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を連結させることである（例えばＤｏｚｉｅら（２０１５）， Ｉｎｔ．Ｊ．ＭｏｌＳｃｉ， １６（１０） ２５８３１－２５８６４を参照されたい）。タンパク質ＰＥＧ化のための一般的な戦略は、タンパク質－ＰＥＧコンジュゲートを形成するため、タンパク質上の官能基と、ＰＥＧ分子上の相補基を反応させることである。ＰＥＧ部分は、柔軟性、親水性、多様なサイズおよび低毒性のため、タンパク質の安定性および循環半減期を増加させるためのいくつかの利点を提供する。
【0093】
１つの態様において、本発明は、したがって、前記タンパク質がＰＥＧ化されている、上述のような組換えタンパク質を提供する。本発明にしたがった融合タンパク質もまた、ＰＥＧ化されていてもよい。
【0094】
融合タンパク質
ペプチドおよびタンパク質の医学的使用に関する困難を除去する別の方法は、融合タンパク質を作製することによって、生物活性タンパク質またはペプチドの半減期の延長を得ることである（例えば、Ｖａｌｅｒｉａら（２０１７），“Ａ Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｆｃ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｐｒｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，７：２５５，ｄｏｉ：１０．４１７２／２１６７－１０７９．１０００２５５）。遺伝子組み換えを通じて、タンパク質またはペプチドをキャリアータンパク質に共有的に融合させることによって、関心対象のタンパク質の分子量を、腎濾過の閾値であるおよそ６０～７０ｋＤａに増加させることが可能である。
ペプチドおよびタンパク質の医学的使用に関する困難を除去する別の方法は、融合タンパク質を作製することによって、生物活性タンパク質またはペプチドの半減期の延長を得ることである（例えば、Ｖａｌｅｒｉａら（２０１７），“Ａ Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｆｃ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｐｒｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，７：２５５，ｄｏｉ：１０．４１７２／２１６７－１０７９．１０００２５５）。遺伝子組み換えを通じて、タンパク質またはペプチドをキャリアータンパク質に共有的に融合させることによって、関心対象のタンパク質の分子量を、腎濾過の閾値であるおよそ６０～７０ｋＤａに増加させることが可能である。
【0095】
本発明は、
（ｉ）ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメイン；
（ｉｉ）（ｉ）のＴＳＰ－１リピート相同ドメインにＮまたはＣ末端で融合し、そして血清アルブミン、トランスフェリンおよび免疫グロブリンＦｃ断片からなる群より選択される、融合パートナー；
（ｉｉｉ）随意に、（ｉ）のＴＳＰ－１リピート相同ドメインおよびＦｃ断片（ＴＳＰ－１リピート相同ドメインにＮまたはＣ末端で融合している）の間のペプチドリンカー
を含む、融合タンパク質を提供する。
（ｉ）ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメイン；
（ｉｉ）（ｉ）のＴＳＰ－１リピート相同ドメインにＮまたはＣ末端で融合し、そして血清アルブミン、トランスフェリンおよび免疫グロブリンＦｃ断片からなる群より選択される、融合パートナー；
（ｉｉｉ）随意に、（ｉ）のＴＳＰ－１リピート相同ドメインおよびＦｃ断片（ＴＳＰ－１リピート相同ドメインにＮまたはＣ末端で融合している）の間のペプチドリンカー
を含む、融合タンパク質を提供する。
【0096】
本明細書を通して、ＴＳＰ－１リピート相同ドメインはまた、ＣＣＮファミリータンパク質の第三のドメインを指す、ドメインＩＩＩと称されてもよく、そして該ドメインを指してもよい。
【0097】
１つの好ましい側面において、融合パートナーは単量体性融合パートナーであり、そして単量体性である融合タンパク質を生じる。こうした融合タンパク質、そして特にそのＴＳＰ－１ドメインは、上記のように定義され、そしてさらに以下に記載される。
【0098】
しかし、本開示にはまた、ＴＳＰ－１ドメインタンパク質構成要素および融合パートナー構成要素両方に関して、他の態様も含まれる。
こうした態様にしたがって、ＴＳＰ－１リピート相同ドメインは、上に定義するような式Ｉの組換えタンパク質である。
こうした態様にしたがって、ＴＳＰ－１リピート相同ドメインは、上に定義するような式Ｉの組換えタンパク質である。
【0099】
ＴＳＰ－１リピート相同ドメインは、別の態様にしたがって、配列番号１～１２、３７、および３８に示す配列のいずれか１つに定義するようなアミノ酸配列を有する組換えタンパク質、または上に定義するような式Ｉの組換えタンパク質である。
【0100】
１つの態様にしたがって、ＴＳＰ－１リピート相同ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７、および配列番号３８からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えタンパク質である。
【0101】
タンパク質は、本質的にプロテアーゼ分解に感受性である。本発明にしたがった組換えタンパク質および融合タンパク質のプロテアーゼ分解を防止するため、プロテアーゼ耐性組換えタンパク質および融合タンパク質を提供するために、例えば部位特異的突然変異誘発によって、アミノ酸配列に対する修飾を導入してもよい。例えば、融合タンパク質の、または組換えタンパク質中の、配列番号１～１２、３７または３８に定義するようなＣＣＮファミリータンパク質、あるいはより具体的には配列番号１～６、８～１２または３７のいずれか１つに定義するようなタンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメイン中に、点突然変異を導入してもよい。１つの態様にしたがって、タンパク質分解的分解の感受性を減少させる点突然変異を導入する。本発明の組換えタンパク質および融合タンパク質のより少ないタンパク質分解を生じる点突然変異の限定されない例は、ＣＣＮ５、例えば配列番号７に示すもののドメインＩＩＩの１９５位のプロリンのアラニンでの置換（Ｐ１９５Ａ）に対応する点突然変異を導入することによる。また、他のＣＣＮファミリーメンバーのドメインＩＩＩから生じるアミノ酸配列において、類似の突然変異を導入してもよい。配列番号３８は、Ａｌａ置換を含む、ＣＣＮ５のＴＳＰ－１ドメインの一部切除４４アミノ酸配列に相当する。配列番号４２～４６は、それぞれ、Ａｌａ置換を含むＣＣＮ１、２、３、４および６のＴＳＰ－１相同ドメインの一部切除４４アミノ酸配列に相当する。配列番号４７～５１は、それぞれ、Ａｌａ置換を含む、ＣＣＮ１、２、３、４および６のより長いＴＳＰ－１相同配列に相当する。任意のこうした配列、またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を、本発明にしたがって用いてもよい。
【0102】
上述のように、好ましい態様において、本発明にしたがった融合タンパク質の融合パートナー（ｉｉ）は単量体性である。いかなる単量体性融合パートナーを用いてもよい。したがって、融合パートナーは、ＴＳＰ－１相同ドメインタンパク質構成要素と融合した際、単量体型で存在し、そして単量体型のままである、いかなるタンパク質、またはその部分（例えばタンパク質ドメイン）であってもよい。したがって、単量体性融合パートナーおよびＴＳＰ－１相同ドメインタンパク質を含む融合タンパク質は、単量体として存続する。すなわち、二量体化するか、またはそれ自身とより高次の多量体を形成することはない。
【0103】
多様なタンパク質が、ありうる融合パートナーとして知られ、そしてこれには、天然タンパク質、あるいはその断片またはアミノ酸配列修飾変異体、ならびに合成タンパク質またはアミノ酸ホモポリマーが含まれてもよい。こうしたタンパク質には、特に、ＩｇＧのＦｃ断片、血清アルブミンまたはトランスフェリンが含まれる。
【0104】
融合パートナーは、第一のＣＣＮ ＴＳＰ－１相同ポリペプチドと天然には組み合わされて（例えば隣接して、あるいは直接または間接的に、連結されて）存在せず、そして合成または人工的な組み合わせで、第一のＣＣＮ ＴＳＰ－１相同ポリペプチドに連結される、第二のポリペプチド（または第二のアミノ酸配列）と、本明細書において、広く定義される。したがって、融合タンパク質は、ともに連結されるかまたは融合される、少なくとも２つのアミノ酸配列またはポリペプチドの非天然組み合わせを含む。
【0105】
融合パートナーは、長さ少なくとも６、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０あるいはそれより多いアミノ酸のアミノ酸配列であってもよい。典型的には、融合パートナーは、機能性ポリペプチドであるか、あるいは言い換えると、融合タンパク質に機能または特性、例えば融合タンパク質を安定化させる（第一のポリペプチドをより安定にする）か、または血清半減期を増加させる機能または特性を与えるポリペプチドである。したがって、融合パートナーは、構造タンパク質であるかまたは構造的機能を有してもよく、あるいは融合パートナーは、融合タンパク質に活性または特性、例えば結合活性を与えてもよい（例えば、融合パートナーは結合対のメンバーであってもよいし、またはアフィニティ結合パートナーであってもよいなど）。代表的な例において、融合パートナーは、アルブミン（特に血清アルブミン）、フィブリノーゲン、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、トランスフェリン、ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン様タンパク質、または免疫グロブリン、またはその部分、特に免疫グロブリンのＦｃ部分（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）あるいはその部分または修飾であってもよい。適切な血清アルブミンには、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）および特にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が含まれる。他のありうる融合パートナーには、融合タンパク質の薬物動態学的特性を改善するよう作用しうるポリペプチド、例えば合成ポリペプチド、例えばホモアミノ酸ポリマー、プロリン－アラニン－セリンポリマー、またはエラスチン様ペプチド、例えばＳｔｒｏｈｌ，２０１５，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２９， ２１５－２３９に記載されるようなものが含まれる。療法タンパク質との使用が当該技術分野に知られる任意の融合パートナーを用いてもよい。
【0106】
１つの態様において、本発明にしたがった融合タンパク質の融合パートナー（ｉｉ）は、ＩｇＧ（任意のサブクラスまたは任意のサブクラスのキメラ）のＦｃ断片、血清アルブミンまたはトランスフェリンのいずれかであってもよい。
【0107】
融合パートナーを、融合タンパク質のＴＳＰ－１相同ドメインタンパク質構成要素に、例えば本明細書に定義するような、ＣＣＮ５または他のＣＣＮタンパク質のいずれかのＴＳＰ－１リピート相同ドメインに、ＮまたはＣ末端でカップリングさせてもよい。以下にさらに記載するように、直接またはリンカーを通じて間接的に、連結してもよい。
【0108】
Ｆｃ断片は、二量体を形成する傾向があり、そして融合タンパク質において用いた場合、融合タンパク質構築物は、２コピーの融合タンパク質を含む傾向がある。しかし、当該技術分野には単量体性Ｆｃ断片およびこれらを含む単量体性融合タンパク質を調製可能であることが知られる。
【0109】
したがって、融合パートナーがＦｃ断片である場合、これは、好ましくは、単量体性Ｆｃ断片、例えば任意のクラスのヒトＩｇＧの単量体性Ｆｃ断片である。異なるクラス由来のＦｃ領域の部分を含むキメラＦｃ断片が含まれ、修飾配列を含むＦｃ断片も含まれる。
【0110】
Ｆｃ融合タンパク質は、ＩｇＧアイソタイプのＦｃ断片にカップリングしたエフェクタードメインからなるキメラタンパク質に基づくタンパク質療法剤の成長しつつある分野である。生物製剤製品の典型的な例は、関節リウマチの治療に用いられるエタネルセプト（Ｆｃ断片にカップリングしたＴＮＦ－α受容体）である。Ｆｃ融合生物製剤タンパク質の別の例はアフリベルセプトである。アフリベルセプトは、滲出性黄斑変性症および転移性結腸直腸癌の治療に用いられるＶＥＧＦ受容体－Ｆｃ融合タンパク質である。Ｆｃ断片融合タンパク質を作製するための主な論理的根拠は、腎排出を排除するために十分な分子量の増加のために半減期の延長を得て、そして新生Ｆｃ受容体を通じて腎近位尿細管再吸収を増進させることである。また、内皮細胞上の新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのＦｃ融合タンパク質のｐＨ依存性結合によって、そうでなければエンドサイトーシス、およびそれに続くリソソーム分解を運命づけられているＦｃに基づく融合タンパク質が、リサイクルされ、そして循環内に再び放出されることを可能にする。
【0111】
１つの態様にしたがって、融合パートナー（ｉｉ）が、ヒトＩｇＧのすべてのサブクラスを含む、ヒトＩｇＧ（免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンγとしてもまた知られる）由来のＦｃ断片である、融合タンパク質を提供する。本発明のさらに別の態様にしたがって、融合パートナーが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ断片である融合タンパク質を提供する。好ましくは、ヒトＩｇＧのＦｃ断片は、サブクラスＩｇＧ４（配列番号１３）またはＩｇＧ２（配列番号１４）のものである。
【0112】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、しばしば、およそ３週間のより長い半減期を有するため、ＩｇＧ３より好ましい。当業者は、Ｆｃ融合パートナーとしての特定のサブクラスのＩｇＧアイソタイプの選択は、最終化合物の望ましい半減期延長および活性の細胞毒性レベルに応じることを知っているであろう。癌または自己免疫疾患の治療のために示される療法抗体は、大部分の場合、ＩｇＧ１サブクラスに属し、これは、Ｆｃ受容体へのアフィニティが高く、そして免疫エフェクター機能を発揮する強力な能力を有するためである。一方、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、免疫エフェクター機能が不都合な影響を引き起こしうるため、免疫エフェクター機能の欠如が望ましい場合、療法候補の主鎖としての使用のために好ましいＩｇＧサブクラスである。免疫エフェクター機能を活性化するＦｃ断片の傾向は、Ｉｇアイソタイプおよびサブクラスに依存し、そして異なる免疫エフェクターに関して多様である。適切なＩｇＧサブクラスのＦｃ断片を選択することに加えて、Ｆｃ断片が免疫エフェクター機能を活性化する能力を減少させるため、ＩｇＧサブクラスのアミノ酸配列を、例えば部位特異的突然変異誘発によって修飾してもよい。
【0113】
単量体を形成する、またはより正確には単量体型を保持するかまたは有するＦｃ断片を選択してもよいし、あるいはＦｃ断片を修飾して、単量体構造を可能にするかまたは促進する突然変異を導入してもよい。こうした突然変異は、本明細書において、「単量体生成突然変異」と称される。単量体生成突然変異を含むＦｃ断片の例は、配列番号５４および配列番号５５である。当業者は、こうした突然変異をどのように導入して、そして単量体性Ｆｃ突然変異体を選択するかを知っている。
【0114】
Ｆｃ断片の免疫エフェクター活性化機能の回避
例えば、２型糖尿病の週１回の治療に用いるＧＬＰ－１アゴニスト－Ｆｃ断片融合タンパク質である、生物製剤融合タンパク質デュラグルチド（ＴｒｕｌｉｃｉｔｙＴＭ）において、活性化免疫エフェクター機能の能力を減少させるため、よく特徴づけられた突然変異Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５ＡがＩｇＧ４ Ｆｃ断片のヒンジ領域中に導入されている。
例えば、２型糖尿病の週１回の治療に用いるＧＬＰ－１アゴニスト－Ｆｃ断片融合タンパク質である、生物製剤融合タンパク質デュラグルチド（ＴｒｕｌｉｃｉｔｙＴＭ）において、活性化免疫エフェクター機能の能力を減少させるため、よく特徴づけられた突然変異Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５ＡがＩｇＧ４ Ｆｃ断片のヒンジ領域中に導入されている。
【0115】
本発明の１つの態様にしたがって、Ｆｃ融合パートナーは、ＩｇＧ４のＦｃ断片であり、ここでＩｇＧ４ Ｆｃ断片は、免疫エフェクター機能を回避するために、例えば上記Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含むよう、修飾されている。
【0116】
プロテアーゼ耐性Ｆｃ断片
製造の際の収量および生物学的半減期の両方を減少させうる別の要因は、融合タンパク質のエンドペプチダーゼ切断である。タンパク質分解的分解のリスクを減少させるかまたは排除するため、特にタンパク質分解的切断に感受性である部位に突然変異を導入することによって、Ｆｃ断片のアミノ酸配列中に修飾を導入してもよい。ＥＰ特許出願ＥＰ２６５４７８０Ｂ１において、Ｅ２３３－Ｌ２３４－Ｌ２３５－Ｇ２３６をＰ２３３－Ｖ２３４－Ａ２３５（Ｇ２３６を欠失させる）（ＥＵ番号付け）で置換することによって、ＩｇＧ１定常領域のＦｃドメインを修飾して、生じた修飾Ｆｃ含有タンパク質をタンパク質分解的分解に対して耐性にした。
製造の際の収量および生物学的半減期の両方を減少させうる別の要因は、融合タンパク質のエンドペプチダーゼ切断である。タンパク質分解的分解のリスクを減少させるかまたは排除するため、特にタンパク質分解的切断に感受性である部位に突然変異を導入することによって、Ｆｃ断片のアミノ酸配列中に修飾を導入してもよい。ＥＰ特許出願ＥＰ２６５４７８０Ｂ１において、Ｅ２３３－Ｌ２３４－Ｌ２３５－Ｇ２３６をＰ２３３－Ｖ２３４－Ａ２３５（Ｇ２３６を欠失させる）（ＥＵ番号付け）で置換することによって、ＩｇＧ１定常領域のＦｃドメインを修飾して、生じた修飾Ｆｃ含有タンパク質をタンパク質分解的分解に対して耐性にした。
【0117】
ＣＣＮ５のドメインＩＩＩにカップリングしたＩｇＧ４のＦｃ断片において、ＥＰ２６５４７８０Ｂ１に開示するアミノ酸修飾の取り込みは、エンドペプチダーゼに対する十分な耐性を提供しないと考慮された。しかし、本発明にしたがった融合パートナーとして用いられたＩｇＧサブタイプのさらなる修飾によって、プロテアーゼ耐性の改善が達成された。
【0118】
より具体的には、ＩｇＧ２の全ヒンジ領域、ならびにＩｇＧ４の定常重鎖２および３を含む融合タンパク質は、優れたタンパク質分解耐性を示すことが見出されてきている。
Ｍｕｅｌｌｅｒ ＪＰら， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），３４（６），ｐｐ．４４１－４５２において、ＩｇＧ抗体中のＩｇＧ２／ＩＧ４キメラの使用を開示する。発作性夜間ヘモグロビン尿症および非典型溶血性尿毒症症候群の治療に用いられる、エクリズマブと称される別の生物製剤モノクローナル抗体は、例えば、ＩｇＧ４がＦｃγＲ依存性免疫エフェクターを活性化する能力を回避する際に、有用であることが示されてきている。さらに、こうしたキメラＦｃ断片のＩｇＧ４定常ドメイン２および３が、ＩｇＧ２が補体依存性免疫エフェクター機能を活性化する能力を回避することもまた示されている。これに関して、Ｒｏｔｈｅｒら（２００７），ｃｆ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５（１１），ｐｐ．１２５６－１２６４の報告およびＭｕｅｌｌｅｒ ＪＰら、上記を参照されたい。
Ｍｕｅｌｌｅｒ ＪＰら， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），３４（６），ｐｐ．４４１－４５２において、ＩｇＧ抗体中のＩｇＧ２／ＩＧ４キメラの使用を開示する。発作性夜間ヘモグロビン尿症および非典型溶血性尿毒症症候群の治療に用いられる、エクリズマブと称される別の生物製剤モノクローナル抗体は、例えば、ＩｇＧ４がＦｃγＲ依存性免疫エフェクターを活性化する能力を回避する際に、有用であることが示されてきている。さらに、こうしたキメラＦｃ断片のＩｇＧ４定常ドメイン２および３が、ＩｇＧ２が補体依存性免疫エフェクター機能を活性化する能力を回避することもまた示されている。これに関して、Ｒｏｔｈｅｒら（２００７），ｃｆ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５（１１），ｐｐ．１２５６－１２６４の報告およびＭｕｅｌｌｅｒ ＪＰら、上記を参照されたい。
【0119】
また、Ｂｏｒｒｏｋら（２０１７）， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．１０６；１００８－１０１７は、抗体の免疫エフェクター機能に対するその影響を研究するため、Ｆｃ断片中の修飾の導入を開示する（ＦＱＱ－ＹＴＥ突然変異）。ＷＯ２０１７１５８４２６Ａ１において、抗体の半減期を改善するため、Ｆｃ断片中に突然変異を導入することによる抗体の修飾を開示する。特に、免疫グロブリンのＦｃ領域中の３１１、４３４、４２８、４３８、および４３５位の１つまたはそれより多くの修飾を開示する。
【0120】
さらに、Ｋｉｎｄｅｒら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１３ Ｏｃｔ ２５；２８８（４３）：３０８４３－５４は、ＩｇＧ１の下部ヒンジにおける突然変異（すなわち、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６－、Ｅｕ番号付け）が、プロテアーゼ耐性ＩｇＧ１抗体を生じたことを報告する。
【0121】
１つの態様にしたがって、本発明にしたがった融合タンパク質のＦｃ断片は、以下の突然変異；Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付けを取り込むＩｇＧ４サブクラスのＦｃ断片からなる配列番号１５を参照されたい。
【0122】
Ｊａｃｏｂｓｅｎら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１７ Ｆｅｂ ３；２９２（５）：１８６５－１８７５は、Ｆｃ断片のアグリコシル化を生じ、さらにＩｇＧエフェクター機能の欠如を生じるＡｓｎ２９７の突然変異を報告した。Ｊａｃｏｂｓｅｎはまた、いくつかの変異体（Ｎ２９７Ｇ）が、他の変異体（Ｎ２９７ＱまたはＮ２９７Ａ）と比較して、より優れた安定性および発展可能性を有する抗体を生じることも見出した。親ＩｇＧ１よりも、より優れた安定性を生じるさらなる修飾もまた導入された（ジスルフィド架橋）。
【0123】
本発明にしたがって、融合パートナーがＦｃ断片である場合、これは、配列番号１６におけるように、安定化ジスルフィド架橋を含まず、または含み、アグリコシル化されてもよい。
【0124】
本発明者らの知る限り、ＩｇＧ２の全ヒンジ領域ならびにＩｇＧ４の定常重鎖２および３で構成されるＦｃ断片は、前記Ｆｃ断片をエフェクタータンパク質に連結することによって、融合タンパク質を調製するためには用いられてこなかった。
【0125】
１つの態様にしたがって、本融合タンパク質の融合パートナーは、アグリコシル化され、そしてジスルフィド架橋によって安定化され、そして以下の突然変異：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６－（Ｅｕ番号付け）を含む下部ヒンジが導入されている、ＩｇＧ１のＦｃ断片である（配列番号１７）。
【0126】
１つの態様にしたがって、ＣＣＮファミリータンパク質のＴＳＰ－１リピート相同ドメインを含む融合タンパク質の融合パートナーは、ＩｇＧ４のＦｃ断片であり、そしてＳ２２８ＰおよびＫ４７７－突然変異に加えて、下部ヒンジに以下の突然変異：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６－（Ｅｕ番号付け）が導入されている（配列番号１８）。
【0127】
１つの好ましい態様において、Ｆｃ断片は、ＩｇＧ２のヒンジ領域（２１６ ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ－ＧＰ ２３８、Ｅｕ番号付け）および任意の他のＩｇＧサブクラスのキメラである。最も好ましくは、Ｆｃ断片は、配列番号１９に示すような、ＩｇＧ２のヒンジ領域ならびにカルボキシル末端Ｋ４７７（Ｅｕ番号付け）の欠失を伴うＩｇＧ４の定常重鎖ドメイン２および３のキメラである。本発明のこの態様は、改善されたプロテアーゼ耐性特性を有することが示されてきている（実施例６を参照されたい）。
【0128】
１つの態様において、本発明の単量体性融合タンパク質の融合パートナーは、配列番号５４に提供するような、ジスルフィド架橋安定化され（Ｒ２９２Ｃ、Ｖ３０２Ｃ）、アグリコシル化され（Ｎ２９７Ｇ）、そして単量体生成突然変異（Ｃ２２０Ｑ、Ｃ２２６Ｑ、Ｃ２２９Ｑ、Ｔ３６６Ｒ、Ｌ３６８Ｈ、Ｐ３９５Ｋ、Ｋ４０９Ｔ、Ｍ４２８Ｌ、Ｅｕ番号付け）を伴う、ＩｇＧ１のＦｃ断片である。
【0129】
さらなる態様において、本発明の単量体性融合タンパク質の融合パートナーは、配列番号５５に提供するような、ＩｇＧ２のヒンジ領域、ならびにカルボキシル末端Ｋ４７７－の欠失および単量体生成突然変異（Ｃ２１９Ｑ、Ｃ２２０Ｑ、Ｃ２２６Ｑ、Ｃ２２９Ｑ、Ｌ３５１Ｆ、Ｔ３６６Ｒ、Ｐ３９５Ｋ、Ｆ４０５Ｒ、Ｙ４０７Ｅ）および半減期延長突然変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）（Ｅｕ番号付け）を含む、ＩｇＧ４の定常重鎖ドメイン２および３のキメラであるＦｃ断片である。
【0130】
本発明にしたがった融合タンパク質は、ＩｇＧ２の全ヒンジ領域、ＩｇＧ４の定常重鎖２および３、ならびにＣＣＮタンパク質ファミリーメンバーのドメインＩＩＩからなるＦｃ断片を用いることによって例示されるが、こうしたＦｃ断片キメラを他のエフェクター分子、例えばＶＥＧＦＲ、ＦＧＦ－２１またはＧＬＰ１にカップリングしてもまた、好適なプロテアーゼ耐性が達成されると考えられる。エフェクター分子は、望ましい薬物動態学的特性を与えるＦｃ融合タンパク質の部分である一方、Ｆｃ断片は薬力学的特性に寄与する。
【0131】
融合パートナーとしての血清アルブミン
ペプチドおよびタンパク質の半減期を延長させるための別の戦略は、融合パートナーとして血清アルブミン（ＳＡ）を用いることである。ＩｇＧおよびＳＡは、他の大部分の循環タンパク質に関する数日間またはそれ未満と比較して、約１９日間の延長された半減期を共有する。ＳＡはまた、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対するアフィニティも有し、そして細胞内分解からレスキューされる（Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２０１４）， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８９（１９）；ｐｐ１３４９２－１３５０２を参照されたい）。
ペプチドおよびタンパク質の半減期を延長させるための別の戦略は、融合パートナーとして血清アルブミン（ＳＡ）を用いることである。ＩｇＧおよびＳＡは、他の大部分の循環タンパク質に関する数日間またはそれ未満と比較して、約１９日間の延長された半減期を共有する。ＳＡはまた、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対するアフィニティも有し、そして細胞内分解からレスキューされる（Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２０１４）， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８９（１９）；ｐｐ１３４９２－１３５０２を参照されたい）。
【0132】
本発明の１つの態様において、融合パートナーが血清アルブミン、好ましくはヒト血清アルブミンである、上述のような融合タンパク質を提供する。
１つの態様において、融合タンパク質が、配列番号１０１に提供するような、ヒト血清アルブミンのアミノ酸２５～６０６を含む、上述のような単量体性融合タンパク質を提供する。
１つの態様において、融合タンパク質が、配列番号１０１に提供するような、ヒト血清アルブミンのアミノ酸２５～６０６を含む、上述のような単量体性融合タンパク質を提供する。
【0133】
本発明のさらなる態様において、アルブミン、例えばヒト血清アルブミンは、例えばｐＨ依存性を伴いまたは伴わずに、そのＦｃＲｎアフィニティを改変して増加したまたは減少した半減期を生じることによって、半減期を増加させるかまたは減少させるために修飾されている。
【0134】
融合パートナーとしてのトランスフェリン
ペプチドおよびタンパク質の半減期を延長するためのさらに別の戦略は、融合パートナーとしてトランスフェリンを用いて、トランスフェリンの天然の長い半減期を利用することである（Ｓｔｒｏｈｌ Ｗ． ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１５；２９（４）：２１５－２３９）。グリコシル化または非グリコシル化型のトランスフェリンを用いてもよい。
ペプチドおよびタンパク質の半減期を延長するためのさらに別の戦略は、融合パートナーとしてトランスフェリンを用いて、トランスフェリンの天然の長い半減期を利用することである（Ｓｔｒｏｈｌ Ｗ． ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１５；２９（４）：２１５－２３９）。グリコシル化または非グリコシル化型のトランスフェリンを用いてもよい。
【0135】
本発明の１つの態様において、融合パートナーがトランスフェリン、好ましくはヒトトランスフェリンである、上述のような融合タンパク質を提供する。
１つの態様において、融合タンパク質が、配列番号５３に提供するような、ヒトトランスフェリンのアミノ酸２０～６９８を含む、上述のような単量体性融合タンパク質を提供する。
１つの態様において、融合タンパク質が、配列番号５３に提供するような、ヒトトランスフェリンのアミノ酸２０～６９８を含む、上述のような単量体性融合タンパク質を提供する。
【0136】
リンカー
別の態様にしたがって、本発明にしたがった融合タンパク質は、随意に、融合パートナーおよびエフェクター分子の間にペプチドリンカーを含み、すなわち、リンカーは、ＣＣＮタンパク質のＴＳＰ－１リピート相同ドメイン（ＴＳＰ－１ドメインタンパク質／ポリペプチド）にＮまたはＣ末端で融合している。
別の態様にしたがって、本発明にしたがった融合タンパク質は、随意に、融合パートナーおよびエフェクター分子の間にペプチドリンカーを含み、すなわち、リンカーは、ＣＣＮタンパク質のＴＳＰ－１リピート相同ドメイン（ＴＳＰ－１ドメインタンパク質／ポリペプチド）にＮまたはＣ末端で融合している。
【0137】
（ＣＣＮタンパク質配列でない限り）任意のペプチドリンカーを用いてもよく、これらの多くが当該技術分野に知られそして記載されている。リンカーは、（柔軟リンカー配列モチーフのリピートを含んでもよい）柔軟リンカー配列であってもよい。当該技術分野に知られる典型的なリンカーは、小さい非極性（例えばグリシン）または極性（例えばセリンまたはスレオニン）残基がリッチであり、そして一般的に、グリシンおよびセリン残基（ＧＳ）のストレッチ、あるいはアラニン、リジンおよび／またはグルタミン酸（Ａ、Ｋ、および／またはＥ）などの他のアミノ酸残基、あるいはまったく任意のアミノ酸からなる。一般的に用いられるリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）リンカー（配列番号１２１）であり、これは、リンカー中の反復ユニットとして提供されてもよい（（ＧＧＧＧＳ）ｎとして、ここで、ｎのコピー数は調節可能であり、例えば１～１０、１～６、１～４等である）。リンカーは、長さ１～５０、１～４５、１～４０、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１２、１～１０、例えば１～８、１～６、１～５、または１～４アミノ酸であってもよい。以下の実施例に多様な異なるリンカーを記載し、そして用い、そしてこれらのいずれも、本発明の融合タンパク質のいずれで用いてもよい。
【0138】
いくつかの態様において、リンカーは５０を超えないアミノ酸を含む。
ペプチドリンカーの特性は、エフェクター機能の維持をさらに改善してもよい。しかし、ペプチドリンカーは、融合タンパク質のエンドペプチダーゼ切断および除去に感受性であってもよい。散在するセリン残基を含むまたは含まない、グリシンを含むペプチドリンカーが一般的に利用されるが、この設計は、望ましい活性およびエンドペプチダーゼに対する耐性を持つ融合タンパク質を常に生じるわけではない。ニューロトロフィン結合タンパク質－Ｆｃ融合タンパク質を開示するＵＳ２０１８０２７３６０３において、配列Ａ（ＥＡＡＡＫ）Ａ（該文書において配列番号１４）の反復を含むα－らせんリンカーの使用が示唆される。さらに、ＵＳ２０１８／０１２７４７８は、配列ＥＡＡＡＫの１～３の反復からなるアミノ酸リンカーの使用が、Ｆｃ融合タンパク質において示唆されることを開示する。
ペプチドリンカーの特性は、エフェクター機能の維持をさらに改善してもよい。しかし、ペプチドリンカーは、融合タンパク質のエンドペプチダーゼ切断および除去に感受性であってもよい。散在するセリン残基を含むまたは含まない、グリシンを含むペプチドリンカーが一般的に利用されるが、この設計は、望ましい活性およびエンドペプチダーゼに対する耐性を持つ融合タンパク質を常に生じるわけではない。ニューロトロフィン結合タンパク質－Ｆｃ融合タンパク質を開示するＵＳ２０１８０２７３６０３において、配列Ａ（ＥＡＡＡＫ）Ａ（該文書において配列番号１４）の反復を含むα－らせんリンカーの使用が示唆される。さらに、ＵＳ２０１８／０１２７４７８は、配列ＥＡＡＡＫの１～３の反復からなるアミノ酸リンカーの使用が、Ｆｃ融合タンパク質において示唆されることを開示する。
【0139】
本発明にしたがって、ペプチド配列ＥＡＡＡＫ（本明細書において配列番号２１）からなるリンカーもまた、ＴＳＰ－１相同ドメインおよび融合パートナー（Ｆｃ断片）の間に取り込まれてもよい。より好ましくは、リンカーは、アミノ酸配列ＥＡＡＡＫの反復で構成される。
【0140】
リンカーが本発明の融合タンパク質中に含まれる場合、リンカーは、融合パートナーおよびエフェクター分子、すなわちＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩの間に配置される。リンカーは、ＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩのＣ末端またはＮ末端のどちらに導入されてもよい。
【0141】
さらに、らせんリンカーは、懸濁ＣＨＯ細胞において、組換えタンパク質の発現後、エンドペプチダーゼ切断に耐性であった。これは、製造目的のため、およびｉｎ ｖｉｖｏ有効性のためのどちらに関しても重要である。さらに、Ｆｃ融合タンパク質において、Ｆｃ断片およびエフェクタードメインの間のα－らせんリンカーの取り込みは、Ｆｃ融合タンパク質の凝集傾向を減少させることが示されている。
【0142】
これらの知見は、エフェクタータンパク質としてのＣＣＮファミリータンパク質のドメインＩＩＩを含む融合タンパク質で示されたが、本発明にしたがったＦｃ断片およびα－らせんリンカーに他のエフェクター分子を組み合わせてもまた、好適な凝集傾向減少およびプロテアーゼ耐性効果は得られると考えられる。
【0143】
したがって、本発明は、式ａａ１－ａａ２－（ＥＡＡＡＫ）ｎ－ａａ３－ａａ４－ａａ５、式中、ｎ≧４のペプチドリンカー配列を、Ｆｃ断片およびエフェクター分子の間に有し、そしてａａ１、ａａ２、ａａ３、ａａ４、ａａ５は、独立に、存在しないかまたは１つのアミノ酸である、Ｆｃ断片を含むＦｃ融合タンパク質を提供する。リンカーをＦｃ断片のＮ末端またはＣ末端に配置してもよい。１つの態様にしたがって、ｎは８である。別の態様にしたがって、ａａ１はスレオニン（Ｔ）であり、ａａ１、ａａ２、ａａ３、ａａ４およびａａ５はＡｌａ（Ａ）である。１つの態様にしたがって、上記Ｆｃ融合タンパク質のリンカーは、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群より選択される。特に、（ＥＡＡＡＫ）リピート、すなわち例えば（ＥＡＡＡＫ）ｎ、式中、ｎは８である、からなるリンカーを含む、本発明記載の融合タンパク質の使用は、好適に、より少ない凝集を生じる。
【0144】
本発明にしたがって用いてもよい別のリンカーは、配列番号２０に示すようなアミノ酸配列を持つリンカー（ＴＥＧＲＭＤ）である。
１つの態様において、したがって、本発明には、融合パートナー、およびＣＣＮ５のドメインＩＩＩ（例えば配列番号１～配列番号１２、３７または３８）の間のリンカーペプチドの取り込みが含まれてもよい。配列番号２０のリンカーを取り込む融合タンパク質の限定されない例を、それぞれ、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に示す。
１つの態様において、したがって、本発明には、融合パートナー、およびＣＣＮ５のドメインＩＩＩ（例えば配列番号１～配列番号１２、３７または３８）の間のリンカーペプチドの取り込みが含まれてもよい。配列番号２０のリンカーを取り込む融合タンパク質の限定されない例を、それぞれ、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に示す。
【0145】
本発明が、ペプチドリンカー（配列番号２０におけるようなもの）および以下の突然変異（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）を取り込むＩｇＧサブタイプＩｇＧ４のＦｃ断片（配列番号１５におけるようなもの）のＮ末端に遺伝子融合したＣＣＮ５のドメインＩＩＩの態様を取る場合、完全配列は、ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２ともまた称される、配列番号２８におけるようなものであろう。
【0146】
本発明が、ペプチドリンカー（配列番号２０におけるようなもの）および以下の突然変異（Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６－、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）を取り込む配列番号１８に示すようなＩｇＧサブタイプＩｇＧ４のＦｃ断片のＮ末端に遺伝子融合したＣＣＮ５のドメインＩＩＩの態様を取る場合、生じる配列は、ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．１ともまた称される、配列番号２９に示すようなものであろう。
【0147】
本発明が、ペプチドリンカー（配列番号２０におけるようなもの）および配列番号１９に示すようなＩｇＧサブタイプＩｇＧ２／４サブタイプのキメラＦｃ断片のＮ末端に遺伝子融合したＣＣＮ５のドメインＩＩＩの態様を取る場合、生じる配列は、ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３ともまた称される、配列番号３０に示すようなものであろう。
【0148】
本発明が、ペプチドリンカー（配列番号２５におけるようなもの）および配列番号１９に示すようなＩｇＧサブタイプＩｇＧ２／４サブタイプのキメラＦｃ断片のＮ末端に遺伝子融合したＣＣＮ５のドメインＩＩＩ（配列番号１におけるようなもの）の態様を取る場合、生じる配列は、ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－ＨＬｎ８－Ｆｃｖ２．３ともまた称される、配列番号３１に示すようなものであろう。
【0149】
本発明の好ましい態様にしたがって：
１）ドメインＩＩＩのタンパク質分解感受性の減少を生じる、ＣＣＮファミリータンパク質、特にＣＣＮ５のドメインＩＩＩ内の点突然変異（配列番号７を参照されたい）；
２）Ｆｃ融合タンパク質中で利用される、以前記載されたＦｃ断片主鎖に比較して、タンパク質分解感受性を減少させる、ヒトＩｇＧ４およびヒトＩｇＧ２のＦｃ断片の操作キメラ（配列番号１９）；および
３）タンパク質分解感受性が減少し、融合タンパク質の生物学的活性が増進し、そして融合タンパク質の凝集傾向が減少している、ペプチドリンカーの最適化組成（配列番号２１～２５を参照されたい）
を含む、本発明にしたがった融合タンパク質を提供する。
１）ドメインＩＩＩのタンパク質分解感受性の減少を生じる、ＣＣＮファミリータンパク質、特にＣＣＮ５のドメインＩＩＩ内の点突然変異（配列番号７を参照されたい）；
２）Ｆｃ融合タンパク質中で利用される、以前記載されたＦｃ断片主鎖に比較して、タンパク質分解感受性を減少させる、ヒトＩｇＧ４およびヒトＩｇＧ２のＦｃ断片の操作キメラ（配列番号１９）；および
３）タンパク質分解感受性が減少し、融合タンパク質の生物学的活性が増進し、そして融合タンパク質の凝集傾向が減少している、ペプチドリンカーの最適化組成（配列番号２１～２５を参照されたい）
を含む、本発明にしたがった融合タンパク質を提供する。
【0150】
いくつかの態様において、（ｉ）のアミノ酸配列および単量体性融合パートナーの間のペプチドリンカーは、配列番号２０～２５または３９からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいは該配列に８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【0151】
本発明にしたがって用いてもよい別のリンカー配列を、配列番号５７、６３、６５、６７および１２１に提供する。
組換え体発現
本発明にしたがった組換えタンパク質および融合タンパク質を、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする宿主細胞を培養することによって、製造してもよい。当業者は、一般的に利用可能な遺伝子操作技術および組換えＤＮＡ発現系を用いて、多様な宿主細胞系における異種発現によって、組換えタンパク質の調製のため、単離された核酸配列の発現を提供する、多様な利用可能なバイオテクノロジー技術をよく知っている。例えば、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，Ｒｏｃｋｙ Ｓ Ｔｕａｎ監修，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＳＮ １０６４－３７４５）中、またはＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版），２００１，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，（ＩＳＢＮ ９７８－０８７９６９５７７－４）を参照されたい。例えば、本発明にしたがった組換えタンパク質をコードする核酸配列を、適切な宿主細胞において、所望のタンパク質コード核酸配列の発現を指示するために特に適応している、すべての必要な転写および翻訳制御配列を含む適切な発現ベクター中に挿入してもよい。適切な発現ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ウイルスまたは人工的酵母染色体（ＹＡＣ）である。
組換え体発現
本発明にしたがった組換えタンパク質および融合タンパク質を、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする宿主細胞を培養することによって、製造してもよい。当業者は、一般的に利用可能な遺伝子操作技術および組換えＤＮＡ発現系を用いて、多様な宿主細胞系における異種発現によって、組換えタンパク質の調製のため、単離された核酸配列の発現を提供する、多様な利用可能なバイオテクノロジー技術をよく知っている。例えば、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，Ｒｏｃｋｙ Ｓ Ｔｕａｎ監修，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＳＮ １０６４－３７４５）中、またはＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版），２００１，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，（ＩＳＢＮ ９７８－０８７９６９５７７－４）を参照されたい。例えば、本発明にしたがった組換えタンパク質をコードする核酸配列を、適切な宿主細胞において、所望のタンパク質コード核酸配列の発現を指示するために特に適応している、すべての必要な転写および翻訳制御配列を含む適切な発現ベクター中に挿入してもよい。適切な発現ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ウイルスまたは人工的酵母染色体（ＹＡＣ）である。
【0152】
本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、当業者に周知の方法によって、または当業者に周知の商業的供給業者、例えばＧｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ等によって、合成してもよい。
【0153】
この側面の１つの態様にしたがって、配列番号８６、８７、９０、９１、９９、１００、１０４、１０５、１０８、１０９、１１２、または１１３に示すような核酸配列、あるいは任意の前述の配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子を提供する。こうしたＤＮＡ分子を含む発現ベクターもまた提供する。この側面の別の態様にしたがって、こうしたベクターを含む宿主細胞もまた提供する。
【0154】
組換えタンパク質を調製するために発現され、そして用いられるＤＮＡ配列を、Ｇａｔｅｗａｙクローニング系（Ｅｓｐｏｓｉｔｏら，２００９，“Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ中，４９８，ｐｐ．３１－５４）を用いて、エントリーベクターとして一般的に知られるベクター中に挿入してもよい。エントリーベクター内にクローニングされた遺伝子は、組換えによって、多様な発現ベクター内に容易に導入されうる。例として、本発明にしたがった組換えタンパク質または融合タンパク質をコードする合成配列を、ＢＰ Ｇａｔｅｗａｙレコンビナーゼクローニングによって組み換えて、適切な宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞においてプラスミドを増殖させるために用いてもよいエントリーベクターを生成してもよい。好ましい態様において、プラスミドの効率的な増殖を可能にするために突然変異された大腸菌細胞、例えばＯｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０ＴＭ細胞を用いる。
【0155】
本発明の１つの態様にしたがって、機能可能であるようにプロモーターに連結された、本発明にしたがった組換えタンパク質または融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを調製する。当業者は、本明細書において、「プロモーター」が特定の遺伝子の転写を調節し、そして開始する、ＤＮＡコード配列のＤＮＡ上流（５’端）のＤＮＡ領域を指すことを知っている。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合を調節して、転写を開始する。「機能可能であるように連結された」は、プロモーターおよび第二の配列の間の機能的連結を指し、ここでプロモーター配列は、第二の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始し、そして仲介する。一般的に、「機能可能であるように連結された」は、連結されている核酸配列が連続性であることを意味する。
【0156】
エントリーベクターならびに発現ベクター、例えば以下に言及するデスティネーションベクターから生成されるものを、当業者に周知の標準的なプラスミド単離技術を用いて、例えばＱｉａｇｅｎＴＭのＱＩＡｐｒｅｐＴＭスピンミニプレップキットまたはＱＩＡＧＥＮＴＭプラスミドプラスマキシキットを用いて、単離してもよい。
【0157】
本発明にしたがった組換えタンパク質または融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するエントリーベクターを用いる場合、前記エントリーベクターは、さらにＬＲゲートウェイレコンビナーゼを用いて、デスティネーションベクターと組み換えられて、発現ベクターを生成してもよい。次いで、発現ベクターを用いて、適切な宿主細胞において、タンパク質コードＤＮＡ配列を発現させてもよい。適用可能なデスティネーションベクターの限定されない例は、例えば、Ｋａａｓｂｏｅｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２９３：４６，ｐｐ．１７９５３－１７９７０に記載されるような、ｐＵＣＯＥ－ＤＨＦＲ－ＤＥＳＴである。
【0158】
また、生じた発現ベクターを、標準的制限酵素消化およびＤＮＡゲル電気泳動によって検証してもよい。
本発明の１つの側面にしたがって、式（Ｉ）の組換えタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。本発明のさらに別の側面にしたがって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８～１２、３７、３８、８４、８５、８８、８９、９７、９８、１０２、１０３、１０６、１０７、１１０および１１１；ならびにアミノ酸配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７および配列番号３８、ならびに配列番号８４、８５、８８、８９、９７、９８、１０２、１０３、１０６、１０７、１１０および１１１と少なくとも５０％の配列同一性を有するその断片または変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含む、発現ベクターを提供する。
本発明の１つの側面にしたがって、式（Ｉ）の組換えタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。本発明のさらに別の側面にしたがって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８～１２、３７、３８、８４、８５、８８、８９、９７、９８、１０２、１０３、１０６、１０７、１１０および１１１；ならびにアミノ酸配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７および配列番号３８、ならびに配列番号８４、８５、８８、８９、９７、９８、１０２、１０３、１０６、１０７、１１０および１１１と少なくとも５０％の配列同一性を有するその断片または変異体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列を含む、発現ベクターを提供する。
【0159】
別の側面にしたがって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号３７、および配列番号３８、ならびに配列番号８４、８５、８８、８９、９７、９８、１０２、１０３、１０６、１０７、１１０および１１１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えタンパク質をコードする、発現ベクターを提供する。
【0160】
本発明のさらなる態様にしたがって、本発明にしたがった融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供する。
当業者は、遺伝暗号の縮重、および多様な生物における特定のコドンの優先性をよく知っている。したがって、宿主細胞の選択に応じて、本発明の組換えタンパク質および融合タンパク質をコードする核酸配列を宿主細胞の好ましいコドンに適応させてもよい。したがって、本発明のタンパク質のアミノ酸は、以下の表に示すようなコドンの任意の組み合わせによってコードされてもよい。
当業者は、遺伝暗号の縮重、および多様な生物における特定のコドンの優先性をよく知っている。したがって、宿主細胞の選択に応じて、本発明の組換えタンパク質および融合タンパク質をコードする核酸配列を宿主細胞の好ましいコドンに適応させてもよい。したがって、本発明のタンパク質のアミノ酸は、以下の表に示すようなコドンの任意の組み合わせによってコードされてもよい。
【0161】
【表1】
【0162】
好ましくは、コドンは、選択した宿主細胞にしたがって、高発現のためにさらに最適化される。
組換えＤＮＡ技術によるタンパク質の発現のため、本発明の特定の態様に加えて、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が、好ましくは、タンパク質配列のＮ末端に付け加えられる。シグナルペプチドは、宿主細胞における合成中および／または合成後に、融合タンパク質の局在を指示するように働いてもよい。したがって、これは、融合タンパク質の分泌を指示する配列であってもよい。こうしたシグナルペプチド配列の使用は、当該技術分野に周知である。シグナルペプチドはいかなる型を取ってもよく、例えばＩｇＧｋ鎖シグナルペプチドを構成してもよく、またはヒト血清アルブミン由来のシグナルペプチド（配列番号３２）を構成してもよい。
組換えＤＮＡ技術によるタンパク質の発現のため、本発明の特定の態様に加えて、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が、好ましくは、タンパク質配列のＮ末端に付け加えられる。シグナルペプチドは、宿主細胞における合成中および／または合成後に、融合タンパク質の局在を指示するように働いてもよい。したがって、これは、融合タンパク質の分泌を指示する配列であってもよい。こうしたシグナルペプチド配列の使用は、当該技術分野に周知である。シグナルペプチドはいかなる型を取ってもよく、例えばＩｇＧｋ鎖シグナルペプチドを構成してもよく、またはヒト血清アルブミン由来のシグナルペプチド（配列番号３２）を構成してもよい。
【0163】
ヒト血清アルブミン由来のシグナルペプチド（配列番号３２）を配列番号２８のＮ末端に付け加える場合、発現されるタンパク質配列は、配列番号３３、あるいは配列番号８５、８９、９８、１０３、１０７、または１１１に示される通りであってもよい。
【0164】
さらに、組換えＤＮＡ技術によるタンパク質の発現のため、本発明の１つの特定の態様にしたがって、配列番号３３に示すようなアミノ酸配列、配列番号３４または配列番号８６、９０、９９、１０４、１０８、または１１２に示すようなヌクレオチド配列を有するタンパク質を用いてもよく、ここで、コード配列の３’端には翻訳停止コドンが付け加えられる。
【0165】
本発明が配列番号３４におけるヌクレオチド配列によって体現される場合、配列番号３５あるいは配列番号８６、９０、９９、１０４、１０８、または１１２におけるように、ヌクレオチド配列には、好ましくは、コード配列の５’端にすぐ隣接してＫｏｚａｋ配列、例えばＧＣＣＡＡＣが付け加えられる。ＤＮＡ配列にはさらに、サブクローニングを可能にするＤＮＡ要素、例えばゲートウェイレコンビナーゼａｔｔＢ部位が隣接してもよい。しかし、ＤＮＡ配列を生成し、そして発現ベクター内へのサブクローニングを促進するために、いかなるクローニングまたは合成戦略を用いてもよい。ＤＮＡ配列をゲートウェイレコンビナーゼ部位に取り込んでサブクローニングを可能にする場合、ヌクレオチド配列は、配列番号３６または配列番号８７、９１、１００、１０５、１０９、または１１３に示す通りであってもよい。
【0166】
本発明の組換えタンパク質または融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、得られた発現ベクターを、所望のタンパク質の産生のため、適切な宿主細胞中に導入してもよい。多様な商業的に入手可能なまたは私有の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）宿主細胞を用いてもよい。例えば、発現ベクターを、真核宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ ＤＧ４４ ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ－／－）懸濁培養適応ＣＨＯ細胞内にトランスフェクトしてもよい。発現ベクターでの宿主細胞のトランスフェクションを、当業者に周知の方法によって、例えばエレクトロポレーションを用いて、実行してもよい。
【0167】
適切な培地中で宿主細胞を培養する際、宿主細胞中の発現ベクターによってコードされる、本発明にしたがった組換えタンパク質または融合タンパク質を産生し、そして生じたタンパク質を、当業者に周知の方法によって、収集し、そして精製してもよい。
【0168】
発現ベクターには、培地内への発現されたタンパク質または融合タンパク質の分泌のための、一般的に「シグナルペプチド」として知られるシグナル配列が含まれてもよい。
細胞培地から分泌された組換えタンパク質の単離および精製のため、大きな粒子およびバイオマスを除去するため、一般的に、まず、１つまたはそれより多くの前処理または清澄化工程が用いられる。適用可能な前処理工程の限定されない例は、例えば、逆浸透法、遠心分離、濾過法およびディアフィルトレーション、またはその組み合わせである。次いで、得られたタンパク質は、一般的に、当業者に周知の１つまたはそれより多い多様なクロマトグラフィ法によって、例えばアフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、混合様式クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィまたは他のクロマトグラフィ技術、あるいはその組み合わせによって、精製される。
細胞培地から分泌された組換えタンパク質の単離および精製のため、大きな粒子およびバイオマスを除去するため、一般的に、まず、１つまたはそれより多くの前処理または清澄化工程が用いられる。適用可能な前処理工程の限定されない例は、例えば、逆浸透法、遠心分離、濾過法およびディアフィルトレーション、またはその組み合わせである。次いで、得られたタンパク質は、一般的に、当業者に周知の１つまたはそれより多い多様なクロマトグラフィ法によって、例えばアフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、混合様式クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィまたは他のクロマトグラフィ技術、あるいはその組み合わせによって、精製される。
【0169】
例えば、アフィニティクロマトグラフィ法を用いて、例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭＳｕＲｅＴＭ媒体、例えばＦＰＬＣクロマトグラフィ系、例えば５ｍｍ ＵＶフローセルを取り付けたＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ ＤｉｓｃｏｖｅｒＴＭ１０ Ｐｒｏシステム上に搭載された５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭＳｕＲｅＴＭカラムを用いて、適切な宿主細胞によって発現される組換えタンパク質または融合タンパク質を精製してもよい。精製しようとするタンパク質を含む試料を装填した後、一般的に、カラムを１つまたはそれより多い適用可能な洗浄緩衝液で、１回またはそれより多く洗浄し、その後、適切な溶出緩衝液を用いて、タンパク質を溶出させる。上に列挙するクロマトグラフィ法の１つまたはそれより多くを用いて、得られたタンパク質をさらに精製してもよい。
【0170】
当業者に周知の技術、例えば発現を促進する技術を利用して、本発明の組換えタンパク質をコードする核酸配列中に、多様な修飾を導入してもよいことが理解されるべきである。部位特異的突然変異誘発の使用によって、用いる所望の宿主にコード配列を適応させるように修飾を導入して、配列を発現させ、そしてしたがって組換えタンパク質を産生してもよい。当業者は、宿主特異的コドンの存在の事実をよく知っており、そして上述のように、異種核酸配列を宿主特異的コドンに適応させると発現効率が増加することをよく知っている。例えば単離および精製を促進するため、すなわちこうした目的のために有用なペプチドまたはタンパク質をコードする配列を付加することによって、他の修飾もまた導入してもよい。また、宿主細胞からの所望の組換えタンパク質の分泌を提供するシグナルペプチドをコードする核酸配列もまた、本発明の核酸配列に連結してもよい。
【0171】
本発明はさらに、本発明にしたがった組換えタンパク質または融合タンパク質の産生に適した宿主細胞を提供する。組換えタンパク質の産生に特に適応した、原核宿主細胞および真核宿主細胞両方の多様な商業的に入手可能な宿主細胞を用いてもよい。適切な宿主細胞の限定されない例は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞、ＮＳ０細胞または大腸菌細胞である。
【0172】
最後に、本発明はまた、ＣＣＮファミリータンパク質に起因する細胞シグナル伝達および細胞生理学的機能を阻害するかまたは相殺することによって、障害を治療するかまたは防止するための薬剤として使用するための、ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメインおよび前記ＴＳＰ－１リピート相同ドメインを含む融合タンパク質にも関する。
【0173】
１つの側面において、本発明は、療法において使用するための、本明細書に定義するようなタンパク質、例えば融合タンパク質を提供する。
いくつかの側面において、タンパク質、例えば融合タンパク質は、線維症、または線維症を示す任意の状態（すなわち任意の線維化状態または障害）の治療または防止に使用するためであってもよい。線維症は、例えば肺、目、心臓、骨格筋、腹膜、腎臓、肝臓、膵臓、胆管、皮膚、血管、またはより全身性の系を含む、いかなる組織または臓器に影響を及ぼしてもよい。特に、線維症を示す状態を、特発性肺線維症を含む、任意の病因であってもよい肺線維症、気管支肺異形成症、網膜線維症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症、網膜剥離、酸素誘導性網膜症、緑内障、心線維症、移植後移植片線維症、心筋関連線維症、筋線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、腹膜線維症、糖尿病性腎症、慢性腎疾患（腎線維症）、急性腎傷害、尿細管間質性線維症、慢性同種移植片腎症、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎、脂肪肝疾患、慢性膵炎、胆管線維症、ケロイド、瘢痕、全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、硬膜外線維症より選択してもよい。
いくつかの側面において、タンパク質、例えば融合タンパク質は、線維症、または線維症を示す任意の状態（すなわち任意の線維化状態または障害）の治療または防止に使用するためであってもよい。線維症は、例えば肺、目、心臓、骨格筋、腹膜、腎臓、肝臓、膵臓、胆管、皮膚、血管、またはより全身性の系を含む、いかなる組織または臓器に影響を及ぼしてもよい。特に、線維症を示す状態を、特発性肺線維症を含む、任意の病因であってもよい肺線維症、気管支肺異形成症、網膜線維症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症、網膜剥離、酸素誘導性網膜症、緑内障、心線維症、移植後移植片線維症、心筋関連線維症、筋線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、腹膜線維症、糖尿病性腎症、慢性腎疾患（腎線維症）、急性腎傷害、尿細管間質性線維症、慢性同種移植片腎症、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎、脂肪肝疾患、慢性膵炎、胆管線維症、ケロイド、瘢痕、全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、硬膜外線維症より選択してもよい。
【0174】
心線維症の背景において、治療または防止すべき状態には、駆出率の保持を伴うまたは伴わない心肥大および心不全が含まれてもよい。
さらなる側面において、本発明は、炎症性または自己免疫疾患の治療において使用するための、本明細書に定義するようなタンパク質、例えば融合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、炎症性疾患は、関節リウマチ、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病より選択される。
さらなる側面において、本発明は、炎症性または自己免疫疾患の治療において使用するための、本明細書に定義するようなタンパク質、例えば融合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、炎症性疾患は、関節リウマチ、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病より選択される。
【0175】
さらなる側面において、本発明は、癌の治療において使用するための、本明細書に定義するようなタンパク質、例えば融合タンパク質を提供する。これに関連して、４ドメインＣＣＮタンパク質は、癌細胞に直接または腫瘍間質に作用することによって、単離癌細胞における発癌性反応を誘発し、かつ転移、化学耐性および免疫療法耐性にも寄与しうることが知られる。本明細書のタンパク質が４ドメインＣＣＮタンパク質の効果または活性を阻害する活性は、したがって、癌を治療するための論理的根拠を提供する。癌は悪性または前悪性新生物状態のいずれであってもよい。癌はいかなる組織または臓器のものであってもよい。１つの態様において、癌は、固形腫瘍として現れてもよい。別の態様において、癌は造血系のものであるかまたは造血系中にあってもよい。癌は、原発性癌または続発性癌、あるいは転移であってもよい。したがって、癌は、膵臓、乳房、前立腺、子宮頸、卵巣、肝臓、膀胱、脳、血液、骨、皮膚、肺または胃の癌であってもよい。いくつかの態様において、癌は、膵臓癌、膵管腺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、肝細胞癌、尿路上皮性膀胱癌、脳癌、神経膠芽腫、急性リンパ芽球性白血病、骨肉腫、黒色腫、中皮腫、胃癌、口腔扁平上皮癌、食道癌、結腸直腸癌、肺癌より選択される。
【0176】
さらなる側面において、本発明は、代謝性疾患の治療において使用するための、本明細書に定義するようなタンパク質、例えば融合タンパク質を提供する。代謝性疾患は、インスリン耐性またはグルコース不耐性であってもよいし、またはこれらに関連してもよい。いくつかの態様において、代謝性疾患は、２型糖尿病および代謝性症候群より選択される。
【0177】
また、本発明の融合タンパク質を、上述の状態の治療法において用いてもよい。同様に、本発明の融合タンパク質を、上述の状態の治療において使用するための薬剤の製造法において、用いてもよい。
非限定的に本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
単量体性融合タンパク質であって：
（ｉ）ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメインの少なくとも部分に対応するポリペプチド；
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列にＮ末端またはＣ末端で融合した単量体性融合パートナー；および
（ｉｉｉ）随意に、（ｉ）のポリペプチドおよび（ｉｉ）の単量体性融合パートナーの間のペプチドリンカー
を含み、
（ｉ）のポリペプチドが長さ４０～６０アミノ酸であり、そして配列番号３７または２～６より選択されるアミノ酸配列、あるいは配列番号３７または２～６より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、配列番号３７または２～６より選択される前記配列中のシステイン残基のすべてが保存されており、
そして（ｉｉ）の単量体性融合パートナーおよび（ｉｉｉ）のペプチドリンカーが、ＣＣＮファミリータンパク質のＩＧＦ結合タンパク質相同ドメイン、フォン・ヴィルブランド因子Ｃ型リピート相同ドメイン、またはシステイン・ノット・ドメインではないか、またはこうしたドメインを含まない
前記単量体性融合タンパク質。
［態様２］
（ｉ）のポリペプチドが長さ４４～５７アミノ酸である、態様１の融合タンパク質。
［態様３］
（ｉ）のポリペプチドが：
（ａ）配列番号１または８～１２より選択されるアミノ酸配列；あるいは
（ｂ）配列番号１または８～１２より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列の部分であって、それぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５の、またはそれぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の、少なくとも４４アミノ酸配列を含む、前記部分
を含むか、あるいはこれらからなる、態様１または態様２の融合タンパク質。
［態様４］
前記ポリペプチドが、配列番号３７または２～６より選択されるアミノ酸配列、あるいは配列番号３７または２～６より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなる、態様１～３のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様５］
（ｉｉｉ）のペプチドリンカーが５０を超えないアミノ酸を含む、態様１～４のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様６］
（ｉ）のポリペプチドが、配列番号３７または２～６、あるいは配列番号１または８～１２より選択される前記配列の２位に対応する位でアラニン残基を含む、態様１～５のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様７］
態様１～６のいずれか一項の融合タンパク質であって、（ｉ）のアミノ酸配列が、配列番号７、３８、４２～４６または４７～５１より選択されるアミノ酸配列、あるいはこれらの配列に少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含み、該タンパク質が、配列番号７、３８、４２～４６または４７～５１の前記配列の２位に対応する位でアラニン残基を含む、前記融合タンパク質。
［態様８］
前記単量体性融合パートナーが、血清アルブミン、トランスフェリン、およびヒトＩｇＧの単量体性Ｆｃ断片からなる群より選択される、態様１～７のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様９］
ヒトＩｇＧの前記単量体性Ｆｃ断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の単量体性Ｆｃ断片である、態様８の融合タンパク質。
［態様１０］
単量体性Ｆｃ断片がアグリコシル化されている、態様８または態様９の融合タンパク質。
［態様１１］
単量体性Ｆｃ断片が、安定化ジスルフィド架橋および／またはプロテアーゼ安定化突然変異を含む、態様８～１０のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様１２］
単量体性Ｆｃ断片が免疫エフェクター機能を持たない、態様８～１１のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様１３］
（ｉ）のアミノ酸配列および単量体性融合パートナーの間のペプチドリンカーが、配列番号２０～２５、３９、５７、６３、６５または６７、あるいはこれらに８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、態様１～１２のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様１４］
融合タンパク質が、配列番号８４、８５、８８、８９、９７、９８、１０２、１０３、１０６、１０７、１１０、および１１１、あるいはこれらに８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、態様１～８のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様１５］
態様１～１４のいずれか一項に定義するような単量体性融合タンパク質をコードする、ＤＮＡ分子。
［態様１６］
シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、態様１５のＤＮＡ分子。
［態様１７］
配列番号３４、３５、３６、８６、８７、９０、９１、９９、１００、１０４、１０５、１０８、１０９、１１２または１１３に示すようなヌクレオチド配列、あるいは前記配列いずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、態様１５または１６のＤＮＡ分子。
［態様１８］
態様１５～１７のいずれか一項に定義するようなＤＮＡ分子を含む、発現ベクター。
［態様１９］
態様１８に定義するようなベクターを含む、宿主細胞。
［態様２０］
療法において使用するための、態様１～１４のいずれか一項記載の融合タンパク質。
［態様２１］
４ドメインＣＣＮファミリータンパク質に起因する細胞シグナル伝達および細胞生理学的機能を阻害するかまたは相殺することによって、障害を治療するかまたは防止する際に使用するための、態様１～１４のいずれか一項記載の融合タンパク質。
［態様２２］
線維症、または線維症を示す任意の状態の治療または防止において使用するための、態様１～１４、２０または２１のいずれか一項記載の融合タンパク質。
［態様２３］
癌の治療において使用するための、態様１～１４、または２０～２２のいずれか一項記載の融合タンパク質。
［態様２４］
配列番号７、３８、４２～４６、４７～５１に示すようなアミノ酸配列、あるいはこれらに少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むかあるいはこうした配列からなる、長さ４０～６０アミノ酸のタンパク質であって、配列番号７、３８、４２～４６、４７～５１の前記配列の２位に対応する位でアラニン残基を含み、そして前記配列中のシステイン残基のすべてが保存されている、前記タンパク質。
非限定的に本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
単量体性融合タンパク質であって：
（ｉ）ＣＣＮファミリータンパク質のトロンボスポンジン１型リピート（ＴＳＰ－１）相同ドメインの少なくとも部分に対応するポリペプチド；
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列にＮ末端またはＣ末端で融合した単量体性融合パートナー；および
（ｉｉｉ）随意に、（ｉ）のポリペプチドおよび（ｉｉ）の単量体性融合パートナーの間のペプチドリンカー
を含み、
（ｉ）のポリペプチドが長さ４０～６０アミノ酸であり、そして配列番号３７または２～６より選択されるアミノ酸配列、あるいは配列番号３７または２～６より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、配列番号３７または２～６より選択される前記配列中のシステイン残基のすべてが保存されており、
そして（ｉｉ）の単量体性融合パートナーおよび（ｉｉｉ）のペプチドリンカーが、ＣＣＮファミリータンパク質のＩＧＦ結合タンパク質相同ドメイン、フォン・ヴィルブランド因子Ｃ型リピート相同ドメイン、またはシステイン・ノット・ドメインではないか、またはこうしたドメインを含まない
前記単量体性融合タンパク質。
［態様２］
（ｉ）のポリペプチドが長さ４４～５７アミノ酸である、態様１の融合タンパク質。
［態様３］
（ｉ）のポリペプチドが：
（ａ）配列番号１または８～１２より選択されるアミノ酸配列；あるいは
（ｂ）配列番号１または８～１２より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列の部分であって、それぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５の、またはそれぞれ、配列番号３７、６、２、３、４もしくは５より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の、少なくとも４４アミノ酸配列を含む、前記部分
を含むか、あるいはこれらからなる、態様１または態様２の融合タンパク質。
［態様４］
前記ポリペプチドが、配列番号３７または２～６より選択されるアミノ酸配列、あるいは配列番号３７または２～６より選択される配列に少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなる、態様１～３のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様５］
（ｉｉｉ）のペプチドリンカーが５０を超えないアミノ酸を含む、態様１～４のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様６］
（ｉ）のポリペプチドが、配列番号３７または２～６、あるいは配列番号１または８～１２より選択される前記配列の２位に対応する位でアラニン残基を含む、態様１～５のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様７］
態様１～６のいずれか一項の融合タンパク質であって、（ｉ）のアミノ酸配列が、配列番号７、３８、４２～４６または４７～５１より選択されるアミノ酸配列、あるいはこれらの配列に少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含み、該タンパク質が、配列番号７、３８、４２～４６または４７～５１の前記配列の２位に対応する位でアラニン残基を含む、前記融合タンパク質。
［態様８］
前記単量体性融合パートナーが、血清アルブミン、トランスフェリン、およびヒトＩｇＧの単量体性Ｆｃ断片からなる群より選択される、態様１～７のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様９］
ヒトＩｇＧの前記単量体性Ｆｃ断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の単量体性Ｆｃ断片である、態様８の融合タンパク質。
［態様１０］
単量体性Ｆｃ断片がアグリコシル化されている、態様８または態様９の融合タンパク質。
［態様１１］
単量体性Ｆｃ断片が、安定化ジスルフィド架橋および／またはプロテアーゼ安定化突然変異を含む、態様８～１０のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様１２］
単量体性Ｆｃ断片が免疫エフェクター機能を持たない、態様８～１１のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様１３］
（ｉ）のアミノ酸配列および単量体性融合パートナーの間のペプチドリンカーが、配列番号２０～２５、３９、５７、６３、６５または６７、あるいはこれらに８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、態様１～１２のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様１４］
融合タンパク質が、配列番号８４、８５、８８、８９、９７、９８、１０２、１０３、１０６、１０７、１１０、および１１１、あるいはこれらに８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、態様１～８のいずれか一項の融合タンパク質。
［態様１５］
態様１～１４のいずれか一項に定義するような単量体性融合タンパク質をコードする、ＤＮＡ分子。
［態様１６］
シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、態様１５のＤＮＡ分子。
［態様１７］
配列番号３４、３５、３６、８６、８７、９０、９１、９９、１００、１０４、１０５、１０８、１０９、１１２または１１３に示すようなヌクレオチド配列、あるいは前記配列いずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、態様１５または１６のＤＮＡ分子。
［態様１８］
態様１５～１７のいずれか一項に定義するようなＤＮＡ分子を含む、発現ベクター。
［態様１９］
態様１８に定義するようなベクターを含む、宿主細胞。
［態様２０］
療法において使用するための、態様１～１４のいずれか一項記載の融合タンパク質。
［態様２１］
４ドメインＣＣＮファミリータンパク質に起因する細胞シグナル伝達および細胞生理学的機能を阻害するかまたは相殺することによって、障害を治療するかまたは防止する際に使用するための、態様１～１４のいずれか一項記載の融合タンパク質。
［態様２２］
線維症、または線維症を示す任意の状態の治療または防止において使用するための、態様１～１４、２０または２１のいずれか一項記載の融合タンパク質。
［態様２３］
癌の治療において使用するための、態様１～１４、または２０～２２のいずれか一項記載の融合タンパク質。
［態様２４］
配列番号７、３８、４２～４６、４７～５１に示すようなアミノ酸配列、あるいはこれらに少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を含むかあるいはこうした配列からなる、長さ４０～６０アミノ酸のタンパク質であって、配列番号７、３８、４２～４６、４７～５１の前記配列の２位に対応する位でアラニン残基を含み、そして前記配列中のシステイン残基のすべてが保存されている、前記タンパク質。
【実施例】
【0178】
実施例１
本発明にしたがった融合タンパク質の発現
本実施例において、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧ、ＩｇＧ４サブクラスのＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）（すなわち配列番号２８にしたがった融合タンパク質）の提供を記載する。配列番号３２のアルブミンから生じるＮ末端シグナル配列を融合タンパク質にさらに付け加え、そしてこれを以下に開示するように、哺乳動物細胞において発現した。
本発明にしたがった融合タンパク質の発現
本実施例において、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧ、ＩｇＧ４サブクラスのＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）（すなわち配列番号２８にしたがった融合タンパク質）の提供を記載する。配列番号３２のアルブミンから生じるＮ末端シグナル配列を融合タンパク質にさらに付け加え、そしてこれを以下に開示するように、哺乳動物細胞において発現した。
【0179】
商業的供給業者によって、配列番号３６に示すＤＮＡ配列を合成し、そして配列を検証した。合成した配列を、ＢＰゲートウェイレコンビナーゼクローニングによって、ｐＤｏｎｒＺｅｏと組み換えて、エントリーベクターを生成した。プラスミドの効率的な増殖を可能にするように突然変異されたコンピテント大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０ＴＭ細胞）のトランスフェクション後、ＱｉａｇｅｎＴＭのＱＩＡｐｒｅｐＴＭスピンミニプレップキットの使用を通じた標準的プラスミド単離技術で、エントリーベクターを単離した。プラスミド単離後、当業者に周知の標準的技術にしたがって、制限酵素消化、その後、ＤＮＡゲル電気泳動によって、エントリーベクターを検証した。
【0180】
ＬＲゲートウェイレコンビナーゼを用いて、デスティネーションベクターと、配列番号３５を含有するエントリーベクターをさらに組み換えた。用いたデスティネーションベクターは、Ｋａａｓｂｏｅｌｌら、２０１８、上記に記載されるような、ｐＵＣＯＥ－ＤＨＦＲ－ＤＥＳＴであった。
【0181】
プラスミドの効率的な増殖を可能にするように突然変異されたコンピテント大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０ＴＭ細胞）のトランスフェクション後、ＱＩＡＧＥＮＴＭプラスミドプラスマキシキットを用いた標準的プラスミド単離技術で、発現ベクターを単離した。当業者に周知の標準的技術にしたがった標準的制限酵素消化およびＤＮＡゲル電気泳動によって、生じた発現ベクターを検証した。次いで、生じた発現ベクターを、ＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ２９１２９）の製造者によって供給される「Ｍａｘ Ｔｉｔｅｒ」プロトコルにしたがって、そしてＫａａｓｂｏｅｌｌら、２０１８、上記に簡潔に記載されるように、ＥｘｐｉＣＨＯ懸濁培養に適応したＣＨＯ細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクション６日後、４７５０ｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって、細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを１ｍＭの濃度まで添加し、そして０．５Ｍ ＥＤＴＡを２ｍＭの濃度まで添加した。次いで、９６％エタノールを約３％の最終濃度まで添加した。クロマトグラフィ精製の前に、１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．４を２５ｍＭの最終濃度まで添加した。
【0182】
プロテインＡクロマトグラフィ媒体でのアフィニティクロマトグラフィによって、精製の捕捉工程を行った。この実験で用いた媒体はｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。上述のように採取し、そして補充した細胞培地６０ｍＬから、発現された組換えタンパク質の精製のために、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。５ｍｍ ＵＶフローセルを取り付けたＦＰＬＣクロマトグラフィ系（ＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ ＤｉｓｃｏｖｅｒＴＭ １０ Ｐｒｏ系）上にＨｉＴｒａｐＴＭ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦカラムを搭載し、そして２５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＮａＣｌおよび３％エタノールを含有する緩衝液で平衡化した。組換えタンパク質を含有する、採取した細胞培地を、２．５ｍｌ／分の速度で、試料ポンプを用いて装填した後、６カラム体積の洗浄緩衝液（２５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＮａＣｌおよび３％エタノール）で洗浄し、その後、３％エタノール中の０．１Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ３．０で溶出した。１００ｍＡＵを超えるＵＶ２８０ｎｍ吸光度の溶出物を、１ｍＬ １Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ９．０をあらかじめ充填した低タンパク質結合チューブ中、３ｍＬの分画で収集した。ＵＶ吸光度ピークを含有する分画を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）２０ｍＬ、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ濃縮デバイスを用いて、５００μＬに濃縮した。濃縮後、ＦＰＬＣクロマトグラフィ系（ＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ ＤｉｓｃｏｖｅｒＴＭ １０ Ｐｒｏ系）上の試料装填ループ内に試料を装填した。ＦＰＬＣクロマトグラフィ系に、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を取り付けた。試料を注入し、そして０．２５ｍＬ／分の流速で、前平衡化緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０）でカラムを灌流した。主なＵＶ ２８０ｎｍ吸光度ピークは、精製組換えタンパク質（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２、配列番号２８）を含有することが見出された。収集した分画の１０μＬの試料を、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭプレキャストゲルを利用したＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して、そしてＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ画像化系（ＢｉｏＲａｄ）を利用して、単離された組換えタンパク質を視覚化した。
【0183】
当業者には、多様な発現系において組換えタンパク質を産生し、そして多様なクロマトグラフィ法によってこれらを精製して、類似の結果が得られうることが広く知られている。
【0184】
実施例２
配列番号２８にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧ、サブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
配列番号２８にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧ、サブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
【0185】
Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、生存促進シグナル伝達を阻害する能力に関して（ＡＫＴのセリン－４７３リン酸化）、得られたタンパク質を試験した（図１Ａ）。組織培養処理Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェル無菌ポリスチレンプレートを、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｌｏｎｚａカタログ番号１７－５１２Ｆ、以後、ＰＢＳと称する）中、１０μｇ／ｍＬに希釈したフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｆ１１４１）でコーティングした。フィブロネクチンを含有するコーティング溶液を、１００μＬ／ウェルの体積でウェルに分配し、室温で１時間インキュベーションした後、コーティング溶液をデカントし、１００μＬのＰＢＳもまた、フィブロネクチンコーティングウェルに分配し、これもまたデカントした。最大８０％集密度の密度を維持するように継代培養されたＡ５４９細胞を酵素処理（Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）、ｂｉｏｗｅｓｔ（登録商標）のカタログ番号Ｌ０９５０－１００）によって剥離し、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（室温に平衡化したＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏのカタログ番号１６０００－０４４）を含む５００ｍＬフラスコを振盪しながら６０℃の温度で３０分間水槽中でインキュベーションした）および５０μｇ／ｍｌゲンスマイシン（ｇｅｎｓｕｍｙｃｉｎ）（Ｓａｎｏｆｉ）を補充した高グルコースを含むダルベッコの修飾イーグル培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号４１９６５－０３９）中で、１１００００細胞／ｍＬの濃度まで希釈し、そして１００μＬの細胞溶液をフィブロネクチンコーティングウェルに分配した。３７℃の温度、室内空気加湿大気および５％ＣＯ２に維持した細胞培養インキュベーター中ですべての細胞インキュベーションを行った。一晩インキュベーション後、Ａ５９４細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そしてＦＢＳを含まず、高グルコースを含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏカタログ番号４１９６５－０３９）９０μＬおよび５０μｇ／ｍｌゲンスマイシン（Ｓａｎｏｆｉ）をウェルに分配した。ＦＢＳを含まない培地中で１８時間インキュベーションした後、細胞を問題の組換えタンパク質１０μＬ溶液で刺激した。６０分間刺激した後、培地をデカントし、そしてＣｉｓｂｉｏホスホ－ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）キット（Ｃｉｓｂｉｏ Ｉｎｃ、カタログ番号６４ＫＳＰＥＧ）によって供給される通りのブロッキング試薬を含む５０μＬ溶解緩衝液を添加することによって細胞を採取した。ブロッキング試薬を含む溶解緩衝液を添加した後、９６ウェルプレートをＰＳＴ－６０ＨＬ ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）プレート振盪装置上、５００ｒｐｍ上で６０分間インキュベーションする。振盪後、溶解試料を粉砕した（ｔｒｉｔｒｕｒａｔｅ）後、白色壁ＨＴＲＦ９６ウェル低体積プレート（Ｃｉｓｂｉｏ Ｉｎｃ．、カタログ番号６６ＰＬ９６０２５）に、各ウェルから１６μＬトランスファーした。リン酸化されたＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）の量をアッセイするため、４μＬの標識抗体混合物（Ｃｉｓｂｉｏ Ｉｎｃ、カタログ番号６４ＡＫＳＰＥＧのホスホ－ＡＫＴ ｄ２およびホスホ－ＡＫＴクリプテートの５０／５０体積／体積混合物）を各ウェルに添加し（陰性対照ウェルには、クリプテート抗体のみを用いた）、プレートを接着性プラスチックフィルムで密封し、そして４℃で一晩インキュベーションした後、ＴＲ－ＦＲＥＴ記録ヘッドならびに３３７ｎｍ放出および６１５ｎｍおよび６６５ｎｍ励起フィルターを取り付けたＰｏｌａｒＳｔａｒ Ｏｍｅｇａプレート読み取り装置（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）で読み取った。６６５ｎｍおよび６１５ｎｍ励起記録の間の比をブランク補正し、そして組換えタンパク質で刺激したウェルの値を、ビヒクルで刺激したウェルの割合として表した。
【0186】
実施例３
配列番号２８にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧサブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
配列番号２８にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧサブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
【0187】
得られたタンパク質を、ＩＭＲ９０ヒト肺線維芽細胞において、ＴＧＦ－βが刺激する線維化促進性転写（ＳＭＡＤ２／３結合シス要素からの転写）を阻害する能力に関して試験した（図１Ｄ）。Ｒａｔ２細胞の代わりに、２５００のＩＭＲ９０肺線維芽細胞／ウェルを利用することを除いて、技術的にＫａａｓｂｏｅｌｌら（２０１８）上記に記載するように、アッセイを行った。刺激のために用いるタンパク質は図１Ｄに示す通りであった。使用前に、ＩＭＲ９０細胞を、Ａ５４９細胞に関して上記に記載するように継代培養した。継代２０回より前、すなわち複製老化に到達する前のＩＭＲ９０細胞を用いた。
【0188】
実施例４
配列番号２８にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧ、サブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
配列番号２８にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧ、サブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
【0189】
得られたタンパク質を、ヒト肺線維芽細胞株ＩＭＲ９０の増殖を阻害する能力に関して試験した（図１Ｂ）。使用前に、ＩＭＲ９０細胞を、Ａ５４９細胞に関して上記に記載するように継代培養した。継代２０回より前、すなわち複製老化に到達する前のＩＭＲ９０細胞を用いた。実験のため、ＩＭＲ９０細胞を、Ａ５４９細胞に関して上記に記載するように採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、実施例２に関して上記に記載するようにゲンスマイシンを含む１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で希釈し、そして１２０００／ウェルの密度でｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅインピーダンスプレート中に植え付けた。２時間後、問題の組換えタンパク質またはＦＢＳの１０μＬ溶液で細胞を刺激し、そしてさらに７２時間インキュベーションした後、Ｋａａｓｂｏｅｌｌら（２０１８）、上記に記載されるように、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）で採取した。
【0190】
実施例５
配列番号２８にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧ、サブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
配列番号２８にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧ、サブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
【0191】
得られたタンパク質を、Ｋａａｓｂｏｅｌｌら、上記に記載されるように、エストロゲン受容体陽性乳癌細胞株ＭＣＦ－７およびトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の球体形成能（係留独立増殖）を阻害する能力に関して試験した（図１Ｃ）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、Ｋａａｓｂｏｅｌｌら、上記においてＭＣＦ－７細胞株に関して記載するものと同じように処理した。ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を、Ａ５４９細胞株に関して上記に記載するように継代培養した。
【0192】
実施例６
配列番号２８（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）、配列番号２９（ＣＣＮ４（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．１）および配列番号３０（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３）にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧ、サブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）、配列番号１８のＩｇＧ、サブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６－、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．１）またはＩｇＧ２／４サブクラスのキメラＦｃ断片（配列番号１９）（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
配列番号２８（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）、配列番号２９（ＣＣＮ４（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．１）および配列番号３０（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３）にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号２０）および配列番号１５のＩｇＧ、サブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）、配列番号１８のＩｇＧ、サブクラスＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６－、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．１）またはＩｇＧ２／４サブクラスのキメラＦｃ断片（配列番号１９）（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３）のＮ末端に融合したＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
【0193】
特に、配列番号２８（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２）、配列番号２９（ＣＣＮ４（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．１）および配列番号３０（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３）の発現のためコードする発現ベクターを、ＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ２９１２９）の製造者によって供給される「Ｍａｘ Ｔｉｔｅｒ」プロトコルにしたがって、そしてＫａａｓｂｏｅｌｌら、上記に簡潔に記載されるように、ＥｘｐｉＣＨＯ懸濁培養適応ＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクション６日後、Ｈｅｒａｅｕｓ ｂｉｏｆｕｇｅ ｐｉｃｏベンチトップ遠心分離装置中、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。採取した細胞培養上清の試料を、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭプレキャストゲルを利用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、そしてＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ画像化系（ＢｉｏＲａｄ）を利用して組換えタンパク質を視覚化した。分離したタンパク質を、次いで、ウェスタンブロット分析のため、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ、セミドライブロッティング系（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。視覚化のため、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＴＭ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ感受性基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ画像化系（ＢｉｏＲａｄ）と組み合わせて用いる、セイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１０６５４）にコンジュゲート化された抗ヒトＩｇＧ４抗体でブロットを探査した。
【0194】
図２において、ＩｇＧ２／４キメラ（配列番号１９に示す）で構成されるＦｃ断片主鎖の改善されたプロテアーゼ耐性を示すデータを示す。
免疫エフェクターがサイレンシングされたＩｇＧ４ヒンジ（配列番号２８に定義されるようなもの）を含むＩｇＧ４ Ｆｃ断片に融合されたＣＣＮ５／ＷＩＳＰ２（ドメインＩＩＩ）；ＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ）－Ｆｃｖ２、ＩｇＧ２に基づく突然変異を取り込む同じＩｇＧ４主鎖（配列番号２９に定義されるようなもの）；ＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．１、またはＩｇＧ２由来の完全ヒンジ領域を持つ同じＩｇＧ４主鎖（配列番号３０に定義されるようなもの）；ＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３のいずれかを、ＥｘｐｉＣＨＯ系で発現し、そして馴化培地（ＣＭ）を６日後に採取した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロッティングおよび総タンパク質染色によって、ＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３変異体が、培養中に存在するプロテアーゼに最も感受性でないことが明らかになる。Ｆｃ断片に対する抗ＩｇＧ４抗体の免疫反応性が、ＩｇＧ２由来の配列の置換で部分的に失われ、そしてしたがって、一般的なタンパク質染色に比較して、タンパク質レベルを過小評価していることに注目されたい。
免疫エフェクターがサイレンシングされたＩｇＧ４ヒンジ（配列番号２８に定義されるようなもの）を含むＩｇＧ４ Ｆｃ断片に融合されたＣＣＮ５／ＷＩＳＰ２（ドメインＩＩＩ）；ＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ）－Ｆｃｖ２、ＩｇＧ２に基づく突然変異を取り込む同じＩｇＧ４主鎖（配列番号２９に定義されるようなもの）；ＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．１、またはＩｇＧ２由来の完全ヒンジ領域を持つ同じＩｇＧ４主鎖（配列番号３０に定義されるようなもの）；ＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３のいずれかを、ＥｘｐｉＣＨＯ系で発現し、そして馴化培地（ＣＭ）を６日後に採取した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロッティングおよび総タンパク質染色によって、ＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３変異体が、培養中に存在するプロテアーゼに最も感受性でないことが明らかになる。Ｆｃ断片に対する抗ＩｇＧ４抗体の免疫反応性が、ＩｇＧ２由来の配列の置換で部分的に失われ、そしてしたがって、一般的なタンパク質染色に比較して、タンパク質レベルを過小評価していることに注目されたい。
【0195】
実施例７
配列番号３０（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３）および配列番号３１（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－ＨＬｎ８－Ｆｃｖ２．３）にしたがった組換えタンパク質を産生するため、配列番号２０に記載するペプチドリンカーおよびＩｇＧ２／４サブクラスのキメラＦｃ断片（配列番号１９）（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３）または配列番号２５に記載するペプチドリンカーおよびＩｇＧ２／４サブクラスのキメラＦｃ断片（配列番号１９）（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－ＨＬｎ８－Ｆｃｖ２．３）のいずれかのＮ末端に融合した、ＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
配列番号３０（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３）および配列番号３１（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－ＨＬｎ８－Ｆｃｖ２．３）にしたがった組換えタンパク質を産生するため、配列番号２０に記載するペプチドリンカーおよびＩｇＧ２／４サブクラスのキメラＦｃ断片（配列番号１９）（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３）または配列番号２５に記載するペプチドリンカーおよびＩｇＧ２／４サブクラスのキメラＦｃ断片（配列番号１９）（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－ＨＬｎ８－Ｆｃｖ２．３）のいずれかのＮ末端に融合した、ＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
【0196】
特に、配列番号３０（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３）および配列番号３１（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－ＨＬｎ８－Ｆｃｖ２．３）の発現のためコードする発現ベクターを、ＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ２９１２９）の製造者によって供給される「Ｍａｘ Ｔｉｔｅｒ」プロトコルにしたがって、そしてＫａａｓｂｏｅｌｌら、上記に簡潔に記載されるように、ＥｘｐｉＣＨＯ懸濁培養適応ＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクション４日後、Ｈｅｒａｅｕｓ ｂｉｏｆｕｇｅ ｐｉｃｏベンチトップ遠心分離装置中、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。採取した細胞培養上清の試料を、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭプレキャストゲルを利用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。分離したタンパク質を、ウェスタンブロット分析のため、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ、セミドライブロッティング系（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。視覚化のため、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＴＭ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ感受性基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ画像化系（ＢｉｏＲａｄ）と組み合わせて用いる、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１０６５４）にコンジュゲート化された抗ヒトＩｇＧ４抗体でブロットを探査した。
【0197】
図３において、本発明の態様が配列番号２５に示すペプチドリンカーを取り込んだ場合の凝集の減少傾向を示すデータを提供する。
多様なペプチドリンカーを通じて、キメラＩｇＧ２／４ Ｆｃ断片のアミノ末端に融合したＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ）を発現する、一過性トランスフェクションＣＨＯ懸濁細胞由来のＣＭの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。ウェスタンブロットによって、配列番号３１に示すようなアミノ酸配列を含む融合タンパク質；（ｄＩＩＩ）－ＨＬｎ８－Ｆｃｖ２．３が、配列番号３０に示すようなアミノ酸配列を有する本発明の融合タンパク質；ＣＣＮ（ドメインＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３よりも、より低い凝集傾向を有することが明らかになる。この知見は、配列番号２５の配列中に定義するペプチドリンカーが、配列番号２０の配列に定義するペプチドリンカーを含有する融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の凝集のより低い傾向を提供することを示す。
多様なペプチドリンカーを通じて、キメラＩｇＧ２／４ Ｆｃ断片のアミノ末端に融合したＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ）を発現する、一過性トランスフェクションＣＨＯ懸濁細胞由来のＣＭの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。ウェスタンブロットによって、配列番号３１に示すようなアミノ酸配列を含む融合タンパク質；（ｄＩＩＩ）－ＨＬｎ８－Ｆｃｖ２．３が、配列番号３０に示すようなアミノ酸配列を有する本発明の融合タンパク質；ＣＣＮ（ドメインＩＩＩ）－Ｆｃｖ２．３よりも、より低い凝集傾向を有することが明らかになる。この知見は、配列番号２５の配列中に定義するペプチドリンカーが、配列番号２０の配列に定義するペプチドリンカーを含有する融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の凝集のより低い傾向を提供することを示す。
【0198】
実施例８
配列番号４０（Ｆｃ－ＨＬｎ８－ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ））または配列番号４１（Ｆｃ－ＨＬｎ８－ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｐ１９５Ａ）にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号３９）および配列番号１５のＩｇＧサブタイプＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＣ末端に融合している、ＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）、または１９５位のアミノ酸（プロリン）がアラニンで置換されているＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号７）のいずれかを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
配列番号４０（Ｆｃ－ＨＬｎ８－ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ））または配列番号４１（Ｆｃ－ＨＬｎ８－ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｐ１９５Ａ）にしたがった組換えタンパク質を産生するため、ペプチドリンカー（配列番号３９）および配列番号１５のＩｇＧサブタイプＩｇＧ４のＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＣ末端に融合している、ＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号１）、または１９５位のアミノ酸（プロリン）がアラニンで置換されているＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号７）のいずれかを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させた。
【0199】
特に、配列番号４０（Ｆｃ－ＨＬｎ８－ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ））および配列番号４１（Ｆｃ－ＨＬｎ８－ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｐ１９５Ａ）の発現のためコードする発現ベクターを、ＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ２９１２９）の製造者によって供給される「Ｍａｘ Ｔｉｔｅｒ」プロトコルにしたがって、そしてＫａａｓｂｏｅｌｌら、上記に簡潔に記載されるように、ＥｘｐｉＣＨＯ懸濁培養適応ＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクション３日後、Ｈｅｒａｅｕｓ ｂｉｏｆｕｇｅ ｐｉｃｏベンチトップ遠心分離装置中、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。採取した細胞培養上清の試料を、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭプレキャストゲルを利用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。分離したタンパク質を、ウェスタンブロット分析のため、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ、セミドライブロッティング系（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。視覚化のため、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＴＭ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ感受性基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ画像化系（ＢｉｏＲａｄ）と組み合わせて用いる、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１０６５４）にコンジュゲート化された抗ヒトＩｇＧ４抗体でブロットを探査した。
【0200】
図５において、本発明の態様が、配列番号７に示すような、ＣＣＮ５ ＴＳＰ－１リピート相同ドメインのプロリン１９５の突然変異を取り込む場合の、エンドペプチダーゼ切断に対する感受性の減少を示すデータを提示する。
【0201】
Ｐ１９５Ａ突然変異を取り込むか（Ｆｃ－ＨＬｎ８－ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－Ｐ１９５Ａ）またはＣＣＮ５ ＴＳＰ－１リピート相同ドメインの野生型Ｐ１９５変異体を発現するか（Ｆｃ－ＨＬｎ８－ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ））いずれかの、配列番号１５に記載するようなＩｇＧ４ Ｆｃ断片のカルボキシル末端に融合しているＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ）を発現する、一過性トランスフェクションＣＨＯ懸濁細胞由来のＣＭの還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。このブロットは、Ｐ１９５Ａ突然変異が、ＣＣＮ５のＴＳＰ－１リピート相同ドメインにタンパク質分解的耐性を提供することを立証する。
【0202】
実施例９
ペプチドリンカー（配列番号５７）および配列番号１５のヒトＩｇＧ、ＩｇＧ４サブクラスのＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合している、ヒトＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２５０（配列番号５６）を含み、配列番号５８に対応するタンパク質配列（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－ＳＬ－Ｆｃｖ０）を生じる融合タンパク質を開示する。該融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列をさらに付け加えて、配列番号５９に対応する融合タンパク質を生じ、そして以下に開示するように、哺乳動物細胞中で発現させた。
ペプチドリンカー（配列番号５７）および配列番号１５のヒトＩｇＧ、ＩｇＧ４サブクラスのＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＮ末端に融合している、ヒトＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２５０（配列番号５６）を含み、配列番号５８に対応するタンパク質配列（ＣＣＮ５（ｄＩＩＩ）－ＳＬ－Ｆｃｖ０）を生じる融合タンパク質を開示する。該融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列をさらに付け加えて、配列番号５９に対応する融合タンパク質を生じ、そして以下に開示するように、哺乳動物細胞中で発現させた。
【0203】
配列番号５９の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号６０のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号６１のＤＮＡ配列を生じた。商業的供給業者によって、配列番号６１の配列を合成し、そして検証した。合成した配列を、ＢＰ Ｇａｔｅｗａｙレコンビナーゼクローニングによって、ｐＤｏｎｒＺｅｏと組み換えて、エントリーベクターを生成した。プラスミドの効率的な増殖を可能にするように突然変異させたコンピテント大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０ＴＭ細胞）のトランスフェクション後、ＱｉａｇｅｎＴＭのＱＩＡｐｒｅｐＴＭスピンミニプレップキットの使用を通じた標準的プラスミド単離技術でエントリーベクターを単離した。プラスミド単離後、当業者に周知の標準的技術にしたがって、制限酵素消化、その後、ＤＮＡゲル電気泳動によって、エントリーベクターを検証した。
【0204】
配列番号６０の配列を含有するエントリーベクターを、ＬＲゲートウェイレコンビナーゼを用いて、デスティネーションベクターとさらに組み換えた。用いたデスティネーションベクターは、Ｋａａｓｂｏｅｌｌら，２０１８， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２９３：４６，ｐｐ．１７９５３－１７９７０に記載されるような、ｐＵＣＯＥ－ＤＨＦＲ－ＤＥＳＴであった。
【0205】
プラスミドの効率的な増殖を可能にするように突然変異されたコンピテント大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０ＴＭ細胞）のトランスフェクション後、ＱＩＡＧＥＮＴＭプラスミドプラスマキシキットを用いた標準的プラスミド単離技術で、発現ベクターを単離した。当業者に周知の標準的技術にしたがった標準的制限酵素消化およびＤＮＡゲル電気泳動によって、生じた発現ベクターを検証した。次いで、生じた発現ベクターを、ＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯトランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ２９１２９）の製造者によって供給される「Ｍａｘ Ｔｉｔｅｒ」プロトコルにしたがって、そしてＫａａｓｂｏｅｌｌら、２０１８、上記に簡潔に記載されるように、懸濁培養に適応したＥｘｐｉＣＨＯ細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクション４日後、４７５０ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって、細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを１ｍＭの濃度に添加し、そして０．５Ｍ ＥＤＴＡを２ｍＭの濃度に添加した。次いで、９６％エタノールを約３％の最終濃度まで添加した。クロマトグラフィ精製の前に、１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．４を２５ｍＭの最終濃度まで添加した。
【0206】
プロテインＡクロマトグラフィ媒体を利用したアフィニティクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。この実験で用いたクロマトグラフィ媒体はｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。上述のように採取し、そして補充した細胞培地１２０ｍＬから、発現された組換えタンパク質の精製のために、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。５ｍｍ ＵＶフローセルを取り付けたＦＰＬＣクロマトグラフィ系（ＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ ＤｉｓｃｏｖｅｒＴＭ １０ Ｐｒｏ系）上にＨｉＴｒａｐＴＭ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦカラムを搭載し、そして２５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＮａＣｌおよび３％エタノールを含有する緩衝液で平衡化した。組換えタンパク質を含有する、採取した細胞培地を、２．５ｍｌ／分の速度で、試料ポンプを用いて装填した後、１０カラム体積の洗浄緩衝液（２５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＮａＣｌおよび３％エタノール）で洗浄し、その後、３％エタノール中の０．１Ｍクエン酸Ｎａ、ｐＨ３．０で溶出した。１ｍＬ １Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ９．０をあらかじめ充填した低タンパク質結合チューブ中、３ｍＬの溶出分画を収集した。タンパク質溶出を２８０ｎｍ ＵＶ吸光度で監視し、そしてＵＶ ２８０ｎｍ吸光度ピークを含有するプールした分画の１０μＬ試料を、還元剤β－メルカプトエタノールの存在下または非存在下で、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭプレキャストゲルを利用したＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して、そしてＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ画像化系（ＢｉｏＲａｄ）を利用して、単離された組換えタンパク質を視覚化した。
【0207】
当業者には、多様な発現系において組換えタンパク質を産生し、そして多様なクロマトグラフィ法によってこれらを精製してもよく、類似の結果が得られることが広く知られている。
【0208】
図６において、配列番号５８に対応するタンパク質の発現および精製は、還元剤β－メルカプトエタノールの非存在下で、予期されるよりも高い位置に移動するタンパク質を生じ、したがって二量体形成が示される。しかし、還元剤β－メルカプトエタノールの存在下で、精製タンパク質を含有するレーンからわかるように、配列番号５８に対応するタンパク質の発現および精製は、主に、切断断片を生じ、そして損なわれていないタンパク質を生じない。
【0209】
実施例１０
配列番号５８に対応するタンパク質のタンパク質分解耐性を増加させる試みにおいて、配列番号５８の配列の多数の変異体を生成した。商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようなプラスミドおよび実施例９に記載するように発現させたタンパク質を生成した。変異体には、以下に列挙するような修飾を含むタンパク質が含まれた：
１）配列番号３２のアルブミンから生じるＮ末端シグナル配列を、配列番号６３に対応するペプチドリンカーの一部切除および配列番号１５のＦｃ断片と組み合わせた、配列番号６２に対応する突然変異（Ｐ２４５Ｌ）を取り込んだアミノ酸１９４～２４９で構成されるＣＣＮ５の断片のアミノ末端につなぎ、配列番号６４に対応する配列を生じる、
２）配列番号３２のアルブミンから生じるＮ末端シグナル配列を、配列番号６５に対応するペプチドリンカーの変形および配列番号１５のＦｃ断片と組み合わせた、配列番号１に対応するアミノ酸１９４～２４６で構成されるＣＣＮ５の断片のアミノ末端につなぎ、配列番号６６に対応する配列を生じる、
３）配列番号３２のアルブミンから生じるＮ末端シグナル配列を、配列番号６７に対応するペプチドリンカーの変形および配列番号１５のＦｃ断片と組み合わせた、配列番号１に対応するアミノ酸１９４～２４６で構成されるＣＣＮ５の断片のアミノ末端につなぎ、配列番号６８に対応する配列を生じる、
４）配列番号３２のアルブミンから生じるＮ末端シグナル配列を、配列番号６５に対応するペプチドリンカーの変形および配列番号１９のＦｃ断片と組み合わせた、配列番号１に対応するアミノ酸１９４～２４６で構成されるＣＣＮ５の断片のアミノ末端につなぎ、配列番号６９に対応する配列を生じる。
配列番号５８に対応するタンパク質のタンパク質分解耐性を増加させる試みにおいて、配列番号５８の配列の多数の変異体を生成した。商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようなプラスミドおよび実施例９に記載するように発現させたタンパク質を生成した。変異体には、以下に列挙するような修飾を含むタンパク質が含まれた：
１）配列番号３２のアルブミンから生じるＮ末端シグナル配列を、配列番号６３に対応するペプチドリンカーの一部切除および配列番号１５のＦｃ断片と組み合わせた、配列番号６２に対応する突然変異（Ｐ２４５Ｌ）を取り込んだアミノ酸１９４～２４９で構成されるＣＣＮ５の断片のアミノ末端につなぎ、配列番号６４に対応する配列を生じる、
２）配列番号３２のアルブミンから生じるＮ末端シグナル配列を、配列番号６５に対応するペプチドリンカーの変形および配列番号１５のＦｃ断片と組み合わせた、配列番号１に対応するアミノ酸１９４～２４６で構成されるＣＣＮ５の断片のアミノ末端につなぎ、配列番号６６に対応する配列を生じる、
３）配列番号３２のアルブミンから生じるＮ末端シグナル配列を、配列番号６７に対応するペプチドリンカーの変形および配列番号１５のＦｃ断片と組み合わせた、配列番号１に対応するアミノ酸１９４～２４６で構成されるＣＣＮ５の断片のアミノ末端につなぎ、配列番号６８に対応する配列を生じる、
４）配列番号３２のアルブミンから生じるＮ末端シグナル配列を、配列番号６５に対応するペプチドリンカーの変形および配列番号１９のＦｃ断片と組み合わせた、配列番号１に対応するアミノ酸１９４～２４６で構成されるＣＣＮ５の断片のアミノ末端につなぎ、配列番号６９に対応する配列を生じる。
【0210】
実施例１２に開示するタンパク質のこれらの反復（上記１～４）は、実施例９に記載するように行ったＥｘｐｉＣＨＯ系における発現中、タンパク質分解的切断に対する耐性のある程度の改善を示した。しかし、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８および配列番号６９に対応するタンパク質の発現によって、タンパク質分解耐性の度合いは、損なわれていない精製タンパク質の産生を可能にするためにはなお不十分であることが明らかになった。
【0211】
実施例１１
ペプチドリンカー（配列番号２１）およびカルボキシル末端Ｋ４７７－（ＥＵ番号付け）の欠失を含むＩｇＧサブタイプＩｇＧ２／４のキメラＦｃ断片（配列番号１９）のＮ末端に融合している、１９５位のアミノ酸（プロリン）がアラニンで置換されているＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２３７（配列番号３８）を含み、配列番号２７を生じる、融合タンパク質を生成した。該融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列をさらに付け加えて、配列番号７０に対応する融合タンパク質を生成した。配列番号７０の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号７１のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号７２のＤＮＡ配列を生じた。
ペプチドリンカー（配列番号２１）およびカルボキシル末端Ｋ４７７－（ＥＵ番号付け）の欠失を含むＩｇＧサブタイプＩｇＧ２／４のキメラＦｃ断片（配列番号１９）のＮ末端に融合している、１９５位のアミノ酸（プロリン）がアラニンで置換されているＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２３７（配列番号３８）を含み、配列番号２７を生じる、融合タンパク質を生成した。該融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列をさらに付け加えて、配列番号７０に対応する融合タンパク質を生成した。配列番号７０の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号７１のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号７２のＤＮＡ配列を生じた。
【0212】
商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようにプラスミドを生成し、そして実施例９に記載するようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによって配列番号７０に対応するタンパク質を発現させた。
【0213】
トランスフェクション６日後、４７５０ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって、細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを０．１ｍＭの濃度まで添加した。クロマトグラフィ精製の前に、１Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５を３０ｍＭの最終濃度まで添加した。
【0214】
１ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＴＭカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後のＢｉｏＳｃａｌｅＴＭ Ｍｉｎｉ Ｂｉｏ－Ｇｅｌ（登録商標）Ｐ－６ １０ｍＬカラム（ＢｉｏＲａｄ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。５ｍｍ ＵＶフローセルを取り付けたＦＰＬＣクロマトグラフィ系（ＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ ＤｉｓｃｏｖｅｒＴＭ １０ Ｐｒｏ系）上にカラムを搭載した。第一のカラムスイッチングバルブ上にＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＴＭカラムを搭載し、そして３０ｍＭクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５で構成される緩衝液で平衡化する一方、Ｂｉｏ－Ｇｅｌ（登録商標）カラムを第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載して、そして緩衝液Ａ２（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ６．５）で平衡化した。Ｂｉｏ－Ｇｅｌ（登録商標）カラムを含有する第二のカラムスイッチングバルブをバイパスするようにセットして、組換えタンパク質を含有する採取した細胞培地１４０ｍＬを、２．０ｍｌ／分の速度で、試料ポンプを用いて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＴＭカラム上に装填した後、５カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１（３０ｍＭクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５）、その後、５カラム体積の洗浄緩衝液Ａ３（３０ｍＭクエン酸Ｎａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）、その後、３カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１で洗浄した。溶出緩衝液（３０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．４）での溶出前に、第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載されたＢｉｏ－Ｇｅｌ（登録商標）カラムをスイッチングして流路に進入させた。２ｍＬ溶出緩衝液で溶出した後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＴＭカラムをスイッチングして流路から外して、そして精製タンパク質を、緩衝液Ａ２でＢｉｏ－Ｇｅｌ（登録商標）カラムから溶出させた。タンパク質溶出を２８０ｎｍ ＵＶ吸光度で監視し、そして吸光度が１００ｍＡＵを超えたら収集を誘発した。収集した分画をプールし、そして１０μＬ試料を、還元剤β－メルカプトエタノールの存在下で、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭプレキャストゲルを利用したＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、そしてＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ画像化系（ＢｉｏＲａｄ）を利用して、単離された組換えタンパク質を視覚化した。
【0215】
図７において、実施例９に比較して継代培養のさらに２日後に細胞培地を採取してもなお、ＣＣＮ５のカルボキシル末端テールが一部切除された配列番号２７に対応するタンパク質の発現および精製が、ＣＣＮ５のカルボキシル末端アミノ酸がすべて含まれている変異体（配列番号５８、６４、６６、６８および６９におけるようなもの）よりも、タンパク質分解的に実質的により耐性であることが示される。
【0216】
実施例１２
ペプチドリンカー（配列番号２１）、およびカルボキシル末端Ｋ４７７－（Ｅｕ番号付け）の欠失を含むＩｇＧサブタイプＩｇＧ２／４のキメラＦｃ断片（配列番号１９）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンに置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号７３の融合タンパク質を生じる、融合タンパク質を生成した。該融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列をさらに付け加えて、配列番号７４に対応する融合タンパク質を生成した。配列番号７４の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号７５のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号７６のＤＮＡ配列を生じた。
ペプチドリンカー（配列番号２１）、およびカルボキシル末端Ｋ４７７－（Ｅｕ番号付け）の欠失を含むＩｇＧサブタイプＩｇＧ２／４のキメラＦｃ断片（配列番号１９）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンに置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号７３の融合タンパク質を生じる、融合タンパク質を生成した。該融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列をさらに付け加えて、配列番号７４に対応する融合タンパク質を生成した。配列番号７４の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号７５のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号７６のＤＮＡ配列を生じた。
【0217】
商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようにプラスミドを生成し、そして実施例９に記載するようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによって配列番号７４に対応するタンパク質を発現させた。
【0218】
トランスフェクション５日後、４７５０ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって、細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを０．１ｍＭの濃度まで添加した。クロマトグラフィ精製の前に、１Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５を３０ｍＭの最終濃度まで添加した。
【0219】
５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＴＭカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。５ｍｍ ＵＶフローセルを取り付けたＦＰＬＣクロマトグラフィ系（ＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ ＤｉｓｃｏｖｅｒＴＭ １０ Ｐｒｏ系）上にカラムを搭載した。第一のカラムスイッチングバルブ上にＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＴＭカラムを搭載し、そして３０ｍＭクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５で構成される緩衝液で平衡化する一方、ＨｉＰｒｅｐＴＭカラムを第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載して、そして緩衝液Ａ２（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ６．５）で平衡化した。ＨｉＰｒｅｐＴＭカラムを含有する第二のカラムスイッチングバルブをバイパスするようにセットして、組換えタンパク質を含有する採取した細胞培地２６０ｍＬを、３．５ｍｌ／分の速度で、試料ポンプを用いて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＴＭカラム上に装填した後、５カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１（３０ｍＭクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５）、その後、５カラム体積の洗浄緩衝液Ａ３（３０ｍＭクエン酸Ｎａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）、その後、２カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１で洗浄した。溶出緩衝液（３０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．４）での溶出前に、第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載されたＨｉＰｒｅｐＴＭカラムをセットして流路に進入させた。１０ｍＬ溶出緩衝液で溶出した後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＴＭカラムをスイッチングして流路から外して、そして精製タンパク質を、緩衝液Ａ２でＨｉＰｒｅｐＴＭカラムから溶出させた。タンパク質溶出を２８０ｎｍのＵＶ吸光度で監視し、そして吸光度が１００ｍＡＵを超えたら収集を誘発した。収集した分画をプールし、そして１０μＬ試料を、還元剤β－メルカプトエタノールの存在下または非存在下で、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭプレキャストゲルを利用したＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、そしてＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ画像化系（ＢｉｏＲａｄ）を利用して、単離された組換えタンパク質を視覚化した。
【0220】
図８において、配列番号２７に開示するような相同ＣＣＮ５（ドメインＩＩＩ／ＴＳＰ－１相同ドメイン）由来のアミノ酸を含有する融合タンパク質同様、配列番号７３に開示するようなＣＣＮ３／Ｎоｖ（ドメインＩＩＩ／ＴＳＰ－１相同ドメイン）由来のアミノ酸を含有する融合タンパク質は、実施例１１に記載し、そして図７に示すような、ＣＣＮ５由来のアミノ酸を含有する融合タンパク質と類似かまたはそれより優れたタンパク質分解耐性を有することが示される。
【0221】
実施例１３
ペプチドリンカー（配列番号３９）および配列番号１５のＩｇＧ、ＩｇＧ４サブクラスのＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＣ末端に融合している、１９５位のアミノ酸（プロリン）がアラニンで置換されているＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号７）を含み、配列番号４１に対応するタンパク質配列を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号７７に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号７７の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号７８のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号７９のＤＮＡ配列を生じた。
ペプチドリンカー（配列番号３９）および配列番号１５のＩｇＧ、ＩｇＧ４サブクラスのＦｃ断片（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７－、Ｅｕ番号付け）のＣ末端に融合している、１９５位のアミノ酸（プロリン）がアラニンで置換されているＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号７）を含み、配列番号４１に対応するタンパク質配列を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号７７に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号７７の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号７８のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号７９のＤＮＡ配列を生じた。
【0222】
商業的供給業者によって、配列番号７９の配列を合成し、そして配列を検証した。合成した配列を、ＢＰ Ｇａｔｅｗａｙレコンビナーゼクローニングによって、ｐＤｏｎｒＺｅｏと組み換えて、エントリーベクターを生成した。プラスミドの効率的な増殖を可能にするように突然変異させたコンピテント大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０ＴＭ細胞）のトランスフェクション後、ＱｉａｇｅｎＴＭのＱＩＡｐｒｅｐＴＭスピンミニプレップキットの使用を通じた標準的プラスミド単離技術でエントリーベクターを単離した。プラスミド単離後、当業者に周知の標準的技術にしたがって、制限酵素消化、その後、ＤＮＡゲル電気泳動によって検証した。
【0223】
配列番号７８の配列を含有するエントリーベクターを、ＬＲゲートウェイレコンビナーゼを用いて、デスティネーションベクターとさらに組み換えた。用いたデスティネーションベクターは、Ｋａａｓｂｏｅｌｌら，２０１８， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２９３：４６，ｐｐ．１７９５３－１７９７０に記載されるような、ｐＵＣＯＥ－ＤＨＦＲ－ＤＥＳＴであった。
【0224】
プラスミドの効率的な増殖を可能にするように突然変異されたコンピテント大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０ＴＭ細胞）のトランスフェクション後、ＱＩＡＧＥＮＴＭプラスミドプラスマキシキットを用いた標準的プラスミド単離技術で、発現ベクターを単離した。当業者に周知の標準的技術にしたがった標準的制限酵素消化およびＤＮＡゲル電気泳動によって、生じた発現ベクターを検証した。次いで、生じた発現ベクターを、Ｎｅｏｎトランスフェクション系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用したエレクトロポレーションによって、懸濁培養に適応したＤＧ４４ ＣＨＯ細胞内にトランスフェクトした。振盪プラットフォーム上、８％ＣＯ２を含み３７℃で維持した細胞培養インキュベーター中、通気型三角フラスコ中で細胞を維持した（Ｋａａｓｂｏｅｌｌら、上記に記載される通り）。トランスフェクション細胞をＣＤ ＤＧ４４細胞培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６１０－０１０）中で一晩維持した後、ＨｙＣｌｏｎｅＴＭ ＡｃｔｉＰｒｏＴＭ培地（ヒポキサンチンおよびチミジンを含まない、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にトランスファーし、そして生存度が８０％に近づくまで継代培養し、その時点で培地に０．１μＭメトトレキセートを補充した。０．１μＭメトトレキセートを添加した後、再び、生存度が８０％に近づくまで細胞を継代培養し、その時点で培地に１μＭメトトレキセートを補充した。生存度が９８％を超え、そして倍加時間が２６時間未満まで減少するまで細胞を再び継代培養し、その時点で細胞プールが安定トランスフェクションされたと見なした。安定細胞プールが確立されたら、細胞培養体積を拡大して、１＊１０＾６細胞／ｍＬの密度で、産生のため、安定トランスフェクション細胞の植え付けを可能にした。継代培養３日後から毎日、４／０．４％ｖ／ｖ ＨｙＣｌｏｎｅＴＭ Ｃｅｌｌ ＢｏｏｓｔＴＭ７ａ／７ｂを細胞培養に補充した。１０日後、４７５０ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって、細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを０．１ｍＭの濃度まで添加した。クロマトグラフィ精製の前に、１Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５を最終濃度３０ｍＭの最終濃度まで添加した。
【0225】
実施例１５に記載するように、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅＴＭカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。精製タンパク質調製物（タンパク質分解プロセシングの徴候をまったく示さない）を続いて、実施例２に記載するようにＡ５４９ヒト肺癌細胞における生存促進シグナル伝達（ＡＫＴのセリン－４７３リン酸化）を阻害する能力に関して試験した。図９からわかるように、ＣＨＯ懸濁細胞の安定トランスフェクションプールから産生される配列番号４１に対応する精製タンパク質は、驚くべきことに、ＡＫＴのリン酸化（セリン４７３）を阻害する能力の徴候をまったく示さなかった。
【0226】
実施例１４
ペプチドリンカー（配列番号２２）およびＩｇＧサブタイプＩｇＧ２／４のキメラＦｃ断片（配列番号１９）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号８０に対応するタンパク質配列を生じる融合タンパク質を生成し、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号８１に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号８１の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号８２のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号８３のＤＮＡ配列を生じた。
ペプチドリンカー（配列番号２２）およびＩｇＧサブタイプＩｇＧ２／４のキメラＦｃ断片（配列番号１９）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号８０に対応するタンパク質配列を生じる融合タンパク質を生成し、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号８１に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号８１の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号８２のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号８３のＤＮＡ配列を生じた。
【0227】
商業的供給業者によって、配列番号８３の配列を合成し、そして配列を検証した。合成した配列を、ＢＰ Ｇａｔｅｗａｙレコンビナーゼクローニングによって、ｐＤｏｎｒＺｅｏと組み換えて、エントリーベクターを生成した。プラスミドの効率的な増殖を可能にするように突然変異させたコンピテント大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０ＴＭ細胞）のトランスフェクション後、ＱｉａｇｅｎＴＭのＱＩＡｐｒｅｐＴＭスピンミニプレップキットの使用を通じた標準的プラスミド単離技術でエントリーベクターを単離した。プラスミド単離後、当業者に周知の標準的技術にしたがって、制限酵素消化、その後、ＤＮＡゲル電気泳動によってエントリーベクターを検証した。
【0228】
配列番号８２の配列を含有するエントリーベクターを、ＬＲゲートウェイレコンビナーゼを用いて、デスティネーションベクターとさらに組み換えた。用いたデスティネーションベクターは、Ｋａａｓｂｏｅｌｌら，２０１８， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２９３：４６，ｐｐ．１７９５３－１７９７０に記載されるような、ｐＵＣＯＥ－ＤＨＦＲ－ＤＥＳＴであった。
【0229】
プラスミドの効率的な増殖を可能にするように突然変異されたコンピテント大腸菌（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０ＴＭ細胞）のトランスフェクション後、ＱＩＡＧＥＮＴＭプラスミドプラスマキシキットを用いた標準的プラスミド単離技術で、発現ベクターを単離した。当業者に周知の標準的技術にしたがった標準的制限酵素消化およびＤＮＡゲル電気泳動によって、生じた発現ベクターを検証した。次いで、生じた発現ベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ安定産生培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ３７１１００１）の製造者によって供給される「ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ産物を用いた安定細胞株の生成およびスケールアップ」プロトコルにしたがって、ＥｘｐｉＣＨＯ懸濁培養に適応したＣＨＯ細胞内にトランスフェクトした。振盪装置プラットフォーム上、８％ＣＯ２を含み３７℃で維持した細胞培養インキュベーター中、通気型三角フラスコ中で細胞を維持した（Ｋａａｓｂｏｅｌｌら、上記に記載される通り）。トランスフェクション細胞をＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地中で一晩維持した後、０．１μＭメトトレキセートを補充したＥｘｐｉＣＨＯＴＭ発現培地にトランスファーした。次いで、生存度が８０％に近づくまで細胞を継代培養し、その時点で培地に１μＭメトトレキセートを補充した。生存度が９５％を超え、そして倍加時間が２０時間未満まで減少するまで細胞を再び継代培養し、その時点で細胞プールが安定トランスフェクションされたと見なした。安定細胞プールが確立されたら、細胞培養体積を拡大して、１＊１０＾６細胞／ｍＬの密度で、産生のため、安定トランスフェクション細胞の植え付けを可能にした。５日後、４７５０ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって、細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを０．１ｍＭの濃度まで添加した。クロマトグラフィ精製前に、１Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５を３０ｍＭの最終濃度まで添加し、そして２Ｍ Ｌ－アルギニンｐＨ４．０を１００ｍＭの最終濃度まで添加した。
【0230】
緩衝液Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＢ１に１００ｍＭ Ｌ－アルギニンを添加することを除いて、実施例１２に記載したものと同じプロトコルを利用して、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡＴＭカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。精製タンパク質調製物（タンパク質分解プロセシングの徴候をまったく示さない）を続いて、実施例２に記載するようなＡ５４９ヒト肺癌細胞における生存促進シグナル伝達（ＡＫＴのセリン－４７３リン酸化）を阻害する能力に関して試験した。図１０からわかるように、ＣＨＯ懸濁細胞の安定トランスフェクションプールから産生される配列番号８０に対応する精製タンパク質は、驚くべきことに、ＡＫＴのリン酸化（セリン４７３）を阻害する能力の徴候をまったく示さず、ＣＣＮ５由来のアミノ酸を含有する損なわれていない二量体性Ｆｃ融合タンパク質調製物（配列番号４１、実施例１３、図９）も、またＣＣＮ３由来のアミノ酸を含有する損なわれていない二量体性Ｆｃ融合タンパク質調製物（配列番号８０）のいずれも、生物学的に活性でないことが示された。
【0231】
実施例１５
配列番号８２を含有する、実施例１４に記載する発現プラスミドであって、ペプチドリンカー（配列番号２２）およびＩｇＧサブタイプＩｇＧ２／４のキメラＦｃ断片（配列番号１９）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号８０に対応するタンパク質配列を生じ、これに配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列をさらに付け加え、そして配列番号８１に対応する融合タンパク質をコードする前記プラスミドを、実施例９に記載するようなＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクション６日後、実施例１４に記載するように細胞を沈降させ、そして実施例１４に記載するように培地を補充した。実施例１４に記載するように、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡＴＭカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。
配列番号８２を含有する、実施例１４に記載する発現プラスミドであって、ペプチドリンカー（配列番号２２）およびＩｇＧサブタイプＩｇＧ２／４のキメラＦｃ断片（配列番号１９）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号８０に対応するタンパク質配列を生じ、これに配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列をさらに付け加え、そして配列番号８１に対応する融合タンパク質をコードする前記プラスミドを、実施例９に記載するようなＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクション６日後、実施例１４に記載するように細胞を沈降させ、そして実施例１４に記載するように培地を補充した。実施例１４に記載するように、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡＴＭカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。
【0232】
精製したタンパク質調製物（部分的にタンパク質分解的にプロセシングした）を続いて、実施例２に記載するようなＡ５４９ヒト肺癌細胞における生存促進シグナル伝達（ＡＫＴのセリン－４７３リン酸化）を阻害する能力に関して試験した。図１１からわかるように、一過性トランスフェクションＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞から産生された配列番号８０に対応する精製タンパク質は、ＡＫＴのリン酸化（セリン４７３）を阻害する濃度依存性の能力を示し、配列番号８０に対応する融合タンパク質を産生するために用いた発現系、およびその結果、観察されるタンパク質分解的プロセシングの度合いが、生じるタンパク質調製物の活性またはその欠如に非常に影響を及ぼすことを示した。
【0233】
実施例１６
ペプチドリンカー（配列番号２１）、ならびに単量体誘導性および半減期延長突然変異を含むＦｃ断片（配列番号５５）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号８４に対応するタンパク質配列を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号８５に対応する融合タンパク質を生じる。配列番号８５の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号８６のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号８６のＤＮＡ配列を生じた。商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようにプラスミドを生成し、そして実施例９に記載するようにＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクション５日後、実施例１４に記載するように、細胞を沈降させ、そして実施例１４に記載するように、培地を補充した。実施例１４に記載するように、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡＴＭカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。
ペプチドリンカー（配列番号２１）、ならびに単量体誘導性および半減期延長突然変異を含むＦｃ断片（配列番号５５）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号８４に対応するタンパク質配列を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号８５に対応する融合タンパク質を生じる。配列番号８５の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号８６のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号８６のＤＮＡ配列を生じた。商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようにプラスミドを生成し、そして実施例９に記載するようにＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクション５日後、実施例１４に記載するように、細胞を沈降させ、そして実施例１４に記載するように、培地を補充した。実施例１４に記載するように、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡＴＭカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。
【0234】
予期される単量体型を示す精製タンパク質調製物を、続いて、実施例２に記載するように、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、生存促進性シグナル伝達（ＡＫＴのセリン－４７３リン酸化）を阻害する能力に関して試験した。図１２からわかるように、配列番号８４に対応する精製タンパク質は、ＡＫＴのリン酸化（セリン４７３）を阻害する濃度依存性能力を示し、ＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩ／ＴＳＰ－１相同ドメイン由来のアミノ酸を含む別の単量体性融合タンパク質が、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、ＡＫＴ（セリンー４７３）のリン酸化を阻害する能力を有することを示した。
【0235】
実施例１７
ペプチドリンカー（配列番号２１）、ならびに単量体誘導性および安定性誘導性突然変異を含むＦｃ断片（配列番号５４）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号８８に対応するタンパク質配列を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号８９に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号８９の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号９０のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号９１のＤＮＡ配列を生じた。商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようにプラスミドを生成し、そして実施例９に記載するようにＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクション６日後、実施例１４に記載するように、細胞を沈降させ、そして実施例１４に記載するように、培地を補充した。実施例１４に記載するように、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡＴＭカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。
ペプチドリンカー（配列番号２１）、ならびに単量体誘導性および安定性誘導性突然変異を含むＦｃ断片（配列番号５４）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号８８に対応するタンパク質配列を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号８９に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号８９の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号９０のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号９１のＤＮＡ配列を生じた。商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようにプラスミドを生成し、そして実施例９に記載するようにＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクション６日後、実施例１４に記載するように、細胞を沈降させ、そして実施例１４に記載するように、培地を補充した。実施例１４に記載するように、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡＴＭカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。
【0236】
予期される単量体型を主に示す精製タンパク質調製物を、続いて、実施例２に記載するように、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、生存促進性シグナル伝達（ＡＫＴのセリン－４７３リン酸化）を阻害する能力に関して試験した。図１３からわかるように、配列番号８８に対応する精製タンパク質は、ＡＫＴのリン酸化（セリン４７３）を阻害する濃度依存性能力を示し、ＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩ／ＴＳＰ－１相同ドメイン由来のアミノ酸を含む別の単量体性融合タンパク質が、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、ＡＫＴ（セリンー４７３）のリン酸化を阻害する能力を有することを示した。
【0237】
実施例１８
ペプチドリンカー（配列番号９３）ならびに６ｘＨｉｓタグ、ＨａｌｏタグおよびＳｕｍｏ＊要素を含む多機能タグ（配列番号９２）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号９４に対応するタンパク質配列を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号１１４に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号１１４の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号９５のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号９６のＤＮＡ配列を生じた。商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようにプラスミドを生成し、そして実施例１５に記載するようにＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクション５日後、実施例１４に記載するように、細胞を沈降させた。クロマトグラフィ精製前に、１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを０．１ｍＭの濃度まで添加し、１Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５を３０ｍＭの最終濃度まで添加し、２Ｍ Ｌ－アルギニンｐＨ４．０を０．１Ｍの最終濃度まで添加し、そしてイミダゾールを５ｍＭの最終濃度まで添加した。
ペプチドリンカー（配列番号９３）ならびに６ｘＨｉｓタグ、ＨａｌｏタグおよびＳｕｍｏ＊要素を含む多機能タグ（配列番号９２）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号９４に対応するタンパク質配列を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号１１４に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号１１４の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号９５のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号９６のＤＮＡ配列を生じた。商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようにプラスミドを生成し、そして実施例１５に記載するようにＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。トランスフェクション５日後、実施例１４に記載するように、細胞を沈降させた。クロマトグラフィ精製前に、１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを０．１ｍＭの濃度まで添加し、１Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５を３０ｍＭの最終濃度まで添加し、２Ｍ Ｌ－アルギニンｐＨ４．０を０．１Ｍの最終濃度まで添加し、そしてイミダゾールを５ｍＭの最終濃度まで添加した。
【0238】
５ｍＬ ＨｉＴｒａｐＴＭＨｉｓＴｒａｐＴＭエクセルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。５ｍｍ ＵＶフローセルを取り付けたＦＰＬＣクロマトグラフィ系（ＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ ＤｉｓｃｏｖｅｒＴＭ １０ Ｐｒｏ系）上にカラムを搭載した。第一のカラムスイッチングバルブ上にＨｉｓＴｒａｐＴＭカラムを搭載し、そして５ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｌ－アルギニンで構成されるＡ１緩衝液で平衡化する一方、ＨｉＰｒｅｐＴＭカラムを第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載して、そして緩衝液Ａ２（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニン ｐＨ６．５）で平衡化した。ＨｉＰｒｅｐＴＭカラムを含有する第二のカラムスイッチングバルブをバイパスするようにセットして、組換えタンパク質を含有する採取した細胞培地２５０ｍＬを、３．５ｍｌ／分の速度で、試料ポンプを用いて、ＨｉｓＴｒａｐＴＭカラム上に装填した後、５カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１、その後、５カラム体積の洗浄緩衝液Ａ３（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｌ－アルギニン）、その後、２カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１で洗浄した。溶出緩衝液（２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｌ－アルギニン）での溶出前に、第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載したＨｉＰｒｅｐＴＭカラムをスイッチングして流路に進入させた。１０ｍＬ溶出緩衝液で溶出した後、ＨｉｓＴｒａｐＴＭカラムをスイッチングして流路から外して、そして精製タンパク質を、緩衝液Ａ２でＨｉＰｒｅｐＴＭカラムから溶出させた。タンパク質溶出を２８０ｎｍのＵＶ吸光度で監視し、そして吸光度が６０ｍＡＵを超えたら収集を誘発した。
【0239】
予期される単量体型を示す精製タンパク質調製物を、続いて、実施例２に記載するように、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、生存促進性シグナル伝達（ＡＫＴのセリン－４７３リン酸化）を阻害する能力に関して試験した。図１２からわかるように、配列番号９４に対応する精製タンパク質は、ＡＫＴのリン酸化（セリン４７３）を阻害する濃度依存性能力を示し、ＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩ／ＴＳＰ－１相同ドメイン由来のアミノ酸を含む別の単量体性融合タンパク質が、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、ＡＫＴ（セリンー４７３）のリン酸化を阻害する能力を有することを示した。
【0240】
実施例１９
ペプチドリンカー（配列番号２１）およびヒト血清アルブミンのアミノ酸２５～６０９（配列番号５２）のＮ末端に融合している、１９５位のアミノ酸（プロリン）がアラニンで置換されているＣＣＮ５のアミノ酸１９４から２３７（配列番号３８）を含み、配列番号９７を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のヒト血清アルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号９８に対応するタンパク質配列を生じた。配列番号９８の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号９９のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号１００のＤＮＡ配列を生じた。
ペプチドリンカー（配列番号２１）およびヒト血清アルブミンのアミノ酸２５～６０９（配列番号５２）のＮ末端に融合している、１９５位のアミノ酸（プロリン）がアラニンで置換されているＣＣＮ５のアミノ酸１９４から２３７（配列番号３８）を含み、配列番号９７を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のヒト血清アルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号９８に対応するタンパク質配列を生じた。配列番号９８の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号９９のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号１００のＤＮＡ配列を生じた。
【0241】
商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようにプラスミドを生成し、そしてＡＫＴの恒常的活性型を発現するように操作されたＤＧ４４ ＣＨＯ懸濁細胞を用いて、実施例１３に記載するように配列番号９８のタンパク質を発現するＣＨＯ懸濁細胞の安定プールを生成した。安定細胞プールが確立されたら、細胞培養体積を拡大して、１＊１０＾６細胞／ｍＬの密度で、産生のため、安定トランスフェクション細胞の植え付けを可能にした。６日後、４７５０ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって、細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。クロマトグラフィ精製前に、１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを０．１ｍＭの濃度まで添加し、０．５Ｍ ＥＤＴＡを２ｍＭの最終濃度まで添加し、１Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５を３０ｍＭの最終濃度まで添加し、そして２Ｍ Ｌ－アルギニンｐＨ４．０を０．１Ｍの最終濃度まで添加した。
【0242】
３ｍＬのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭヒトアルブミンアフィニティマトリックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を充填したＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。５ｍｍ ＵＶフローセルを取り付けたＦＰＬＣクロマトグラフィ系（ＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ ＤｉｓｃｏｖｅｒＴＭ １０ Ｐｒｏ系）上にカラムを搭載した。第一のカラムスイッチングバルブ上にＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラムを搭載し、そして１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニンｐＨ６．５で構成されるＡ１緩衝液で平衡化する一方、ＨｉＰｒｅｐＴＭカラムを第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載して、そして緩衝液Ａ１（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニン ｐＨ６．５）で平衡化した。ＨｉＰｒｅｐＴＭカラムを含有する第二のカラムスイッチングバルブをバイパスするようにセットして、組換えタンパク質を含有する採取した細胞培地５００ｍＬを、２．０ｍｌ／分の速度で、試料ポンプを用いて、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラム上に装填した後、５カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１、その後、５カラム体積の洗浄溶液Ａ２（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニン、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）、その後、５カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１で洗浄した。溶出緩衝液（３０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５＋０．５Ｍ Ｌ－アルギニン）での溶出前に、第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載したＨｉＰｒｅｐＴＭカラムをスイッチングして流路に進入させた。１０ｍＬ溶出緩衝液で溶出した後、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラムをスイッチングして流路から外して、そして精製タンパク質を、緩衝液Ａ１でＨｉＰｒｅｐＴＭカラムから溶出させた。タンパク質溶出を２８０ｎｍのＵＶ吸光度で監視し、そして吸光度が１００ｍＡＵを超えたら収集を誘発した。
【0243】
予期される単量体型を示す精製タンパク質調製物を、続いて、実施例２に記載するように、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、生存促進性シグナル伝達（ＡＫＴのセリン－４７３リン酸化）を阻害する能力に関して試験した。図１４からわかるように、配列番号９７に対応する精製タンパク質は、ＡＫＴのリン酸化（セリン４７３）を阻害する濃度依存性能力を示し、ＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩ／ＴＳＰ－１相同ドメイン由来のアミノ酸を含む別の単量体性融合タンパク質が、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、ＡＫＴ（セリンー４７３）のリン酸化を阻害する能力を有することを示した。
【0244】
実施例２０
ヒト血清アルブミン（アミノ酸２５～６０６、配列番号１０１）の融合タンパク質を、１９５位のアミノ酸（プロリン）がアラニンで置換されているヒトＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号７）に連結するペプチドリンカー（配列番号２２）にＣ末端で融合させて、配列番号１０３を生じた。配列番号１０２に対応する融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号１０３に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号１０３の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号１０４のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号１０５のＤＮＡ配列を生じた。
ヒト血清アルブミン（アミノ酸２５～６０６、配列番号１０１）の融合タンパク質を、１９５位のアミノ酸（プロリン）がアラニンで置換されているヒトＣＣＮ５のアミノ酸１９４～２４６（配列番号７）に連結するペプチドリンカー（配列番号２２）にＣ末端で融合させて、配列番号１０３を生じた。配列番号１０２に対応する融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号１０３に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号１０３の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号１０４のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号１０５のＤＮＡ配列を生じた。
【0245】
商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようにプラスミドを生成し、そしてＡＫＴの恒常的活性型を発現するように操作されたＤＧ４４ ＣＨＯ懸濁細胞を用いて、実施例１３に記載するように配列番号１０４のタンパク質を発現するＣＨＯ懸濁細胞の安定プールを生成した。安定細胞プールが確立されたら、細胞培養体積を拡大して、１＊１０＾６細胞／ｍＬの密度で、産生のため、安定トランスフェクション細胞の植え付けを可能にした。６日後、４７５０ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって、細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。クロマトグラフィ精製前に、１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを０．１ｍＭの濃度まで添加し、０．５Ｍ ＥＤＴＡを２ｍＭの最終濃度まで添加し、１Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５を３０ｍＭの最終濃度まで添加し、そして２Ｍ Ｌ－アルギニンｐＨ４．０を０．１Ｍの最終濃度まで添加した。
【0246】
試料装填流が、２．０ｍＬ／分ではなく０．３７ｍＬ／分であることを除いて、実施例１９に記載するように、３ｍＬのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭヒトアルブミンアフィニティマトリックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を充填したＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。
【0247】
予期される単量体型を示す精製タンパク質調製物を、続いて、実施例２に記載するように、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、生存促進性シグナル伝達（ＡＫＴのセリン－４７３リン酸化）を阻害する能力に関して試験した。図１４からわかるように、配列番号１０２に対応する精製タンパク質は、ＡＫＴのリン酸化（セリン４７３）を阻害する濃度依存性能力を示し、ＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩ／ＴＳＰ－１相同ドメイン由来のアミノ酸を含む別の単量体性融合タンパク質が、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、ＡＫＴ（セリンー４７３）のリン酸化を阻害する能力を有することを示した。
【0248】
実施例２１
ペプチドリンカー（配列番号２１）およびヒト血清アルブミンのアミノ酸２５～６０９（配列番号５２）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号１０６を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号１０７に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号１０７の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号１０８のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号１０９のＤＮＡ配列を生じた。
ペプチドリンカー（配列番号２１）およびヒト血清アルブミンのアミノ酸２５～６０９（配列番号５２）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号１０６を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号１０７に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号１０７の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号１０８のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号１０９のＤＮＡ配列を生じた。
【0249】
商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようなプラスミドを生成し、そして実施例９に記載するようなＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞の一過性トランスフェクションによって発現した。トランスフェクション６日後、実施例１４に記載するように細胞を沈降させ、そして実施例１９に記載するように培地を補充した。１０ｍＬのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭヒトアルブミンアフィニティマトリックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を充填したＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。５ｍｍ ＵＶフローセルを取り付けたＦＰＬＣクロマトグラフィ系（ＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ ＤｉｓｃｏｖｅｒＴＭ １０ Ｐｒｏ系）上にカラムを搭載した。第一のカラムスイッチングバルブ上にＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラムを搭載し、そして１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニンｐＨ６．５で構成されるＡ１緩衝液で平衡化する一方、ＨｉＰｒｅｐＴＭカラムを第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載して、そして緩衝液Ａ１（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニンｐＨ６．５）で平衡化した。ＨｉＰｒｅｐＴＭカラムを含有する第二のカラムスイッチングバルブをバイパスするようにセットして、組換えタンパク質を含有する採取した細胞培地５００ｍＬを、１．０ｍｌ／分の速度で、試料ポンプを用いて、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラム上に装填した後、３カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１、その後、２カラム体積の洗浄緩衝液Ａ２（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニン、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）、その後、３カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１で洗浄した。溶出緩衝液（３０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５＋０．１Ｍ Ｌ－アルギニン）での溶出前に、第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載されたＨｉｓＰｒｅｐＴＭカラムをセットして流路に進入させた。１５ｍＬ溶出緩衝液で溶出した後、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラムをスイッチングして流路から外して、そして精製タンパク質を、緩衝液Ａ１でＨｉＰｒｅｐＴＭカラムから溶出させた。タンパク質溶出を２８０ｎｍのＵＶ吸光度で監視し、そして吸光度が１００ｍＡＵを超えたら収集を誘発した。
【0250】
予期される単量体型を含有する精製タンパク質調製物を、続いて、実施例２に記載するように、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、生存促進性シグナル伝達（ＡＫＴのセリン－４７３リン酸化）を阻害する能力に関して試験した。図１２からわかるように、配列番号１０６に対応する精製タンパク質は、ＡＫＴのリン酸化（セリン４７３）を阻害する濃度依存性能力を示し、ＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩ／ＴＳＰ－１相同ドメイン由来のアミノ酸を含む別の単量体性融合タンパク質が、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、ＡＫＴ（セリンー４７３）のリン酸化を阻害する能力を有することを示した。
【0251】
実施例２２
ペプチドリンカー（配列番号２２）およびヒト血清アルブミンのアミノ酸２５～６０９（配列番号５２）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号１１０を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号１１１に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号１１１の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号１１２のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号１１３のＤＮＡ配列を生じた。
ペプチドリンカー（配列番号２２）およびヒト血清アルブミンのアミノ酸２５～６０９（配列番号５２）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、配列番号１１０を生じる融合タンパク質に、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、配列番号１１１に対応する融合タンパク質を生じた。配列番号１１１の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ハムスター細胞におけるタンパク質発現のためにコドン最適化し（商業的供給業者のアルゴリズムによる）、そして翻訳のためのＫＯＺＡＫ配列を５’端に付け加え、そして停止コドンを３’端に導入して、配列番号１１２のＤＮＡ配列を生じた。ＤＮＡ配列の両端にＧａｔｅｗａｙ ａｔｔＢ部位をさらに付け加えて、配列番号１１３のＤＮＡ配列を生じた。
【0252】
商業的供給業者によって、ＤＮＡ配列を合成し、そして検証した後、サブクローニングして、実施例９に記載するようにプラスミドを生成し、そして実施例９に記載するようにＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞の一過性トランスフェクションによって発現した。トランスフェクション６日後、実施例１４に記載するように細胞を沈降させ、そして実施例１９に記載するように培地を補充した。１０ｍＬのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭヒトアルブミンアフィニティマトリックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を充填したＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の５３ｍＬ ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での脱塩で構成されるタンデムクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。５ｍｍ ＵＶフローセルを取り付けたＦＰＬＣクロマトグラフィ系（ＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ ＤｉｓｃｏｖｅｒＴＭ １０ Ｐｒｏ系）上にカラムを搭載した。第一のカラムスイッチングバルブ上にＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラムを搭載し、そして１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニンｐＨ６．５で構成されるＡ１緩衝液で平衡化する一方、ＨｉＰｒｅｐＴＭカラムを第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載して、そして緩衝液Ａ１（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニン ｐＨ６．５）で平衡化した。ＨｉＰｒｅｐＴＭカラムを含有する第二のカラムスイッチングバルブをバイパスするようにセットして、組換えタンパク質を含有する採取した細胞培地３００ｍＬを、１．０ｍｌ／分の速度で、試料ポンプを用いて、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラム上に装填した後、３カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１、その後、２カラム体積の洗浄緩衝液Ａ２（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニン、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）、その後、３カラム体積の洗浄緩衝液Ａ１で洗浄した。溶出緩衝液（３０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５＋０．５Ｍ Ｌ－アルギニン）での溶出前に、第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載されたＨｉＰｒｅｐＴＭカラムをセットして流路に進入させた。１５ｍＬ溶出緩衝液で溶出した後、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラムをスイッチングして流路から外して、そして精製タンパク質を、緩衝液Ａ１でＨｉＰｒｅｐＴＭカラムから溶出させた。タンパク質溶出を２８０ｎｍのＵＶ吸光度で監視し、そして吸光度が１００ｍＡＵを超えたら収集を誘発した。
【0253】
予期される単量体型を含有する精製タンパク質調製物を、続いて、実施例２に記載するように、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、生存促進性シグナル伝達（ＡＫＴのセリン－４７３リン酸化）を阻害する能力に関して試験した。図１５からわかるように、配列番号１１０に対応する精製タンパク質は、ＡＫＴのリン酸化（セリン４７３）を阻害する濃度依存性能力を示し、ＣＣＮタンパク質のドメインＩＩＩ／ＴＳＰ－１相同ドメイン由来のアミノ酸を含む別の単量体性融合タンパク質が、Ａ５４９ヒト肺癌細胞において、ＡＫＴ（セリンー４７３）のリン酸化を阻害する能力を有することを示した。
【0254】
実施例２３
配列番号１０８を含有する実施例２１に記載する発現プラスミドであって、ペプチドリンカー（配列番号２１）およびヒト血清アルブミンのアミノ酸２５～６０９（配列番号５２）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、さらに、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、そして配列番号１０７に対応する融合タンパク質をコードする、前記プラスミドを用いて、実施例１４に記載するような安定トランスフェクションＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞のプールを生成した。配列番号１０６に対応する分泌タンパク質を含有する馴化培地のバッチを産生するため、安定トランスフェクション細胞のプールを拡大して、１＊１０＾６細胞／ｍＬの密度で安定トランスフェクション細胞の２５０ｍＬの体積での植え付けを可能にした。細胞培養に５％ｖ／ｖ ２ＸＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄＴＭＣ＋（ＧｉｂｃｏＴＭ）を継代培養２日後から始めて１日おきに補充し、そして継代培養２日後、３％グルコース（１０％ｗ／ｖ）を、そして継代培養６日後、５％グルコース（１０％ｗ／ｖ）を補充した。９日後、４７５０ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを０．１ｍＭの濃度まで添加した。クロマトグラフィ精製の前に、１Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５を３０ｍＭの最終濃度まで添加し、そして２Ｍ Ｌ－アルギニン ｐＨ４．０を１００ｍＭの最終濃度まで添加した。
配列番号１０８を含有する実施例２１に記載する発現プラスミドであって、ペプチドリンカー（配列番号２１）およびヒト血清アルブミンのアミノ酸２５～６０９（配列番号５２）のＮ末端に融合している、２０７位のアミノ酸（イソロイシン）がアラニンで置換されているＣＣＮ３のアミノ酸２０６～２４９（配列番号４４）を含み、さらに、配列番号３２のアルブミンから生じる分泌のためのＮ末端シグナル配列を付け加えて、そして配列番号１０７に対応する融合タンパク質をコードする、前記プラスミドを用いて、実施例１４に記載するような安定トランスフェクションＥｘｐｉＣＨＯＴＭ細胞のプールを生成した。配列番号１０６に対応する分泌タンパク質を含有する馴化培地のバッチを産生するため、安定トランスフェクション細胞のプールを拡大して、１＊１０＾６細胞／ｍＬの密度で安定トランスフェクション細胞の２５０ｍＬの体積での植え付けを可能にした。細胞培養に５％ｖ／ｖ ２ＸＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄＴＭＣ＋（ＧｉｂｃｏＴＭ）を継代培養２日後から始めて１日おきに補充し、そして継代培養２日後、３％グルコース（１０％ｗ／ｖ）を、そして継代培養６日後、５％グルコース（１０％ｗ／ｖ）を補充した。９日後、４７５０ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離することによって細胞を沈降させ、そして上清細胞培地を採取した。１００％イソプロパノール中の０．１Ｍ ＰＭＳＦを０．１ｍＭの濃度まで添加した。クロマトグラフィ精製の前に、１Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ５．５を３０ｍＭの最終濃度まで添加し、そして２Ｍ Ｌ－アルギニン ｐＨ４．０を１００ｍＭの最終濃度まで添加した。
【0255】
１０ｍＬのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭヒトアルブミンアフィニティマトリックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を充填したＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での捕捉工程、その直後の２つの連続連結Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムでのサイズ排除クロマトグラフィで構成される２Ｄクロマトグラフィによって、タンパク質を精製した。５ｍｍ ＵＶフローセルを取り付けたＦＰＬＣクロマトグラフィ系（ＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ ＤｉｓｃｏｖｅｒＴＭ １０ Ｐｒｏ系）上にカラムを搭載し、そして出口バルブを５ｍＬ試料ループに連結した。第一のカラムスイッチングバルブ上にＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラムを搭載し、そして１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニンｐＨ６．５で構成されるＡ１緩衝液で平衡化する一方、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムを第二のカラムスイッチングバルブ上に搭載して、そして緩衝液Ａ１（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニン ｐＨ６．５）で平衡化した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラムを含有する第二のカラムスイッチングバルブをバイパスするようにセットして、組換えタンパク質を含有する採取した細胞培地１２０ｍＬを、３．９ｍｌ／分の速度で、試料ポンプを用いて、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラム上に装填した。組換えタンパク質を含有する採取した細胞培地をＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラム上に装填した後、３カラム体積の緩衝液Ａ１、その後、２カラム体積の緩衝液Ａ２（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ Ｌ－アルギニン、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）、その後、３カラム体積の緩衝液Ａ１で洗浄した。１２００ｍＡＵを超える吸光度で溶出物を試料ループ内に収集するようにセットされた系で、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラムを１５ｍＬ緩衝液Ｂ１（３０ｍＭクエン酸、０．５Ｍ Ｌ－アルギニン、ｐＨ３．５）で溶出させた。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラムの溶出後、第一のカラムスイッチングバルブに連結されたＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラムをスイッチングして流路から外して、そして第二のカラムスイッチングバルブをスイッチングするようセットして、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ含有カラムを流路に入れた。次いで、溶出タンパク質を含有するＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ含有カラムからの溶出物を、０．５ｍＬ／分の速度で、緩衝液Ａ１で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ含有カラム上に装填した。タンパク質溶出を２８０ｎｍのＵＶ吸光度で監視し、そして吸光度が２００ｍＡＵを超えたら収集を誘発した。
【0256】
予期される単量体型を含有する精製タンパク質調製物を、続いて、正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＣＣ－２５１２）のＴＧＦβ誘導性および活性ＣＣＮ２誘導性活性を阻害する能力に関して試験した。ＮＨＬＦを、完全増殖培地（すべての添加剤（２％ウシ胎児血清、インスリン、ｈＦＧＦ－Ｂ、ゲンタマイシン／アンホテリシンＢ）を含むＬｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅブレットキット（カタログ番号ＣＣ－３１３２））中で継代培養して、商業的供給業者（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の指示にしたがって、最大８０％の集密度の密度を維持した。活性ＣＣＮ２は、ＣＣＮ２のドメイン３～４で構成され、そしてＫａａｓｂｏｅｌｌら、２０１８、上記に記載されるように産生され、そして精製された。
【0257】
ＮＨＬＦの活性ＣＣＮ２およびＴＧＦβ誘導性細胞遊走に対する、配列番号１０６に対応するタンパク質の効果を試験するため（トランスウェルアッセイ／修飾ボイデンチャンバーアッセイ）、細胞をまずトリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、トリプシン中和試薬（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＣＣ－５０３４）で中和し、そして基本増殖培地（線維芽細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号ＣＣ－３１３１、ゲンスマイシン（５０μｇ／ｍＬ）以外の添加剤を含まない））に再懸濁した後、５μｍ孔サイズ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）の２４ウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）、カタログ番号ＣＬＳ３４０２－４８ＥＡ）を有するトランスウェル・インサートの上側に、ウェルあたり１００μＬの体積で、３０，０００細胞を植え付けた。ウェルの下部チャンバーは、ゲンスマイシン以外の他の添加物を含まない基本増殖培地５００μＬ中に溶解した試験物質またはビヒクル対照を含有した。２０時間のインキュベーション後、インサートをウェルから取り除き、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１７－５１２Ｆ）中に浸すことによって２回洗浄した後、４％ホルムアルデヒド（Ｓｏｌｖｅｃｏ、スウェーデン、カタログ番号６２１０９２）中、３７℃で１５分間固定した。ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０分間処理することによって細胞を透過処理した後、ＰＢＳで２回洗浄した。インサートの上側の非遊走細胞を、コットンスワップ（ｓｗａｐ）で掻き取った後、膜を乾燥させた。インサート上側の遊走細胞の核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ２０ｍＭ（ＰＢＳ中、１：５０００希釈、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６２２４９）で、暗所中、１５分間染色した後、ＰＢＳに浸すことによって２回洗浄した。トランスウェル・インサートから膜を切り出し、そしてガラスに向かって遊走した細胞とともにガラススライド上にマウントし、１滴のＰｒｏＬｏｎｇＴＭ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｐ３６９３４）で覆い、カバーガラスをマウントし、そして各ウェル５～１０画像をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ．１画像化系上で保持した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアｖ１．５１ｋ、Ｒａｓｂａｎｄ， Ｗ．Ｓ．、Ｉｍａｇｅ Ｊ、米国国立衛生研究所、米国メリーランド州ベセスダ、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／、１９９７～２０１８を利用して、画像を半自動的に分析した。図１６Ａからわかるように、配列番号１０６に対応するタンパク質は、ＴＧＦβおよび活性ＣＣＮ２の両方によって誘導される遊走を阻害する。
【0258】
活性ＣＣＮ２およびＴＧＦβ誘導性スクラッチ創傷アッセイに対する配列番号１０６に対応するタンパク質の効果を試験するため、ＮＨＬＦをトリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、トリプシン中和試薬（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＣＣ－５０３４）で中和した後、組織培養処理１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、カタログ番号３５１３）中、１ｍＬ体積中で１００，０００細胞を植え付けた。植え付け翌日、０．９％ＮａＣｌで細胞を２回洗浄し、そして完全増殖培地を基本増殖培地に交換した。基本増殖培地中で１６～２０時間インキュベーションした後、無菌１２．５μＬピペットチップ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９４４２００５３）で細胞単層にスクラッチを作製し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を、試験物質またはビヒクルをともに含む１ｍＬの基本増殖培地中でインキュベーションした。細胞をさらに２４時間インキュベーションした後、ＰＢＳ中で３回洗浄し、その後、４％ホルムアルデヒド中、３７℃で１５分間固定した。固定後、穏やかに振盪しながらＰＢＳ中で３ｘ３分間、再び細胞を洗浄し、穏やかに振盪しながら、ＰＢＳ中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０分間透過処理した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ ２０ｍＭ（ＰＢＳ中、１：５０００希釈、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６２２４９）で、暗所中で１５分間処理した後、穏やかに振盪しながらＰＢＳ中で３ｘ５分間洗浄することによって、細胞核を染色した。１滴のＰｒｏＬｏｎｇＴＭ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｐ３６９３４）をマウント前に適用し、そしてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ．１画像化系で、残ったギャップを中心として５画像を各ウェルから捕捉した。スクラッチ創傷の長さに沿って、３つの固定間隔で、スクラッチ後の残ったギャップの距離を測定することによって、画像を分析した。各ウェル由来の画像すべてからの測定すべての平均を計算し、そして１つの生物学的複製物としてカウントした。図１６Ｂからわかるように、配列番号１０６に対応するタンパク質は、ＴＧＦβおよび活性ＣＣＮ２の両方によって誘導されたスクラッチ創傷の閉鎖を阻害する。
【0259】
ＴＧＦβ誘導性遺伝子制御に対する、配列番号１０６に対応するタンパク質の効果を試験するため、ＮＨＬＦをトリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、トリプシン中和試薬（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＣＣ－５０３４）で中和した後、組織培養処理１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、カタログ番号３５１３）中、１ｍＬの体積中で１００，０００細胞を植え付けた。植え付け翌日、細胞を０．９％ＮａＣｌで２回洗浄し、そして完全増殖培地を、０．１％熱不活化ウシ胎児血清（ＧｉｂｃｏＴＭのカタログ番号１６０００－０４４、実施例２に記載するように実行した熱不活化）を補充した基本増殖培地に交換した。０．１％ウシ胎児血清を含む基本増殖培地中で６時間インキュベーションした後、試験物質またはビヒクル対照をウェルに添加した。９６時間後、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、そして製造者のプロトコルにしたがって、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ抽出キット（カタログ番号７４１０６）を利用してＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ－１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）でＲＮＡ濃度を定量化し、ヌクレアーゼ不含水で５０ｎｇ／μＬの最終ＲＮＡ濃度まで希釈した後、各複製物から２００ｎｇ ＲＮＡを利用して、製造者のプロトコルにしたがって、ＴａｑＭａｎＴＭ逆転写キット（カタログ番号Ｎ８０８０２３４）を利用することによって、ｃＤＮＡを生成した。それぞれのＴａｑＭａｎＴＭアッセイおよびＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４４４４５５７）によって、生じたｃＤＮＡ試料から示差遺伝子発現を分析した。製造者のプロトコルにしたがって、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ系を用いて、各試料に関して技術的３つ組で、ＴａｑＭａｎＴＭリアルタイムＰＣＲ反応を行った。標準曲線から、異なる転写物の相対量を計算した後、技術的３つ組を平均して、各試料から単一の値を得た。すべての遺伝子発現結果を、ＧＡＰＤＨ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇｌ）ｍＲＮＡレベルに比較し、そして標準化して、ビヒクル対照刺激ウェルの平均の倍数として表した。図１９Ｃ～Ｆよりわかるように、配列番号１０７に対応するタンパク質は、一般的に、線維化促進遺伝子と見なされる、ＴＧＦβに誘導される遺伝子：ＣＯＬ１Ａ１（「コラーゲン１型α－１」、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｈｓ００１６４００４＿ｍ１）、ＦＮ１（「フィブロネクチン１」、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｈｓ０１５４９９７６＿ｍ１）、ＡＣＴＡ２（「平滑筋アクチンα－２」、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｈｓ００４２６８３５＿ｇ１）およびＣＣＮ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｈｓ００１７００１４＿ｍ１）の部分的阻害を提供する。
【0260】
明細書および配列表に言及される配列番号の概観
【0261】
【表2-1】
【0262】
【表2-2】
【0263】
【表2-3】
【0264】
【表2-4】
【0265】
【表2-5】
【0266】
【表2-6】
【0267】
【表2-7】
【0268】
【表2-8】
【0269】
【表2-9】
【0270】
【表2-10】
【0271】
【表2-11】
【0272】
【表2-12】
【0273】
ＣＣＮタンパク質の番号付けは、「本発明の詳細な説明」、上記に記載するようにｕｎｉｐｒｏｔデータベースにしたがった。Ｆｃ断片の番号付けは、「本発明の詳細な説明」、上記に記載するようにＥｕ番号付け系にしたがった。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【配列表】