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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-06
(45)【発行日】2024-12-16
(54)【発明の名称】バイオプリンティングされた腎臓組織
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20241209BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20241209BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
A61L27/38 100
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022512822
(86)(22)【出願日】2020-08-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-27
(86)【国際出願番号】 AU2020050882
(87)【国際公開番号】W WO2021035291
(87)【国際公開日】2021-03-04
【審査請求日】2023-04-03
(31)【優先権主張番号】2019903094
(32)【優先日】2019-08-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(73)【特許権者】
【識別番号】505183417
【氏名又は名称】マードック チルドレンズ リサーチ インスティテュート
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】メリッサ・エイチ・リトル
(72)【発明者】
【氏名】キナン・ロウラー
(72)【発明者】
【氏名】ジェシカ・ヴァンスラムブローク
(72)【発明者】
【氏名】ショーン・ウィルソン
【審査官】藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０６４３２３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５３２４１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５２９８７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Higgins JW et al.，Bioprinted pluripotent stem cell-derived kidney organoids provide opportunities for high content screening，bioRxiv，2018年，pp.1-34，doi: https://doi.org/10.1101/505396
【文献】Nature，2015年，Vol.526，pp.564-568, METHODS, Ext. Data Fig.1-9
【文献】Korean J. Intern. Med.，2018年，Vol.33，pp.649-659
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラインの形状である腎臓組織の層、および１０，０００個の細胞当たり０．２ｍｍ２超の表面積を有するネフロン組織
を含む、バイオプリンティングされた腎臓組織であって、前記ネフロン組織が、腎臓組織の層全体に分布しているネフロンを含む、バイオプリンティングされた腎臓組織。
【請求項2】
前記腎臓組織の層が、１ｍｍ２当たり約３０，０００個以下の細胞を含む、請求項１に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
【請求項3】
前記腎臓組織の層が、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＳＬＣ３０Ａ１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＦＡＢＰ３、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢのうちの１つ以上を、手作業で凝集された腎臓オルガノイド、あるいは細胞のドットまたはブロブとして生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドと比較して高いレベルで発現する、請求項１に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
【請求項4】
前記腎臓組織が、ネフロンを含み、その近位尿細管および遠位尿細管セグメントが、ＨＮＦ４ＡおよびＳＬＣ１２Ａ１を含む成熟マーカーを発現する、請求項３に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
【請求項5】
前記腎臓組織が、マーカーＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢのうちの１つ以上を発現する、請求項４に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
【請求項6】
前記腎臓組織の層が、約５０μｍ以下の高さである、請求項１に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
【請求項7】
前記腎臓組織の層が、約１ｍｍ～約３０ｍｍの長さおよび約０．５ｍｍ～約２０ｍｍの幅を有する、請求項１に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
【請求項8】
前記腎臓組織の層が、約５～約１００ネフロン／１ｍｍ２を含む、請求項７に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
【請求項9】
前記腎臓組織の層が、前記層全体に均一に分布したＭＡＦＢを発現する糸球体構造を含む、請求項１に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
【請求項10】
バイオプリンティングされた腎臓組織を製造するための方法であって、所定量のバイオインクを表面にバイオプリンティングすることであって、前記バイオインクが、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から選択されるヒト幹細胞（ＨＳＣ）から分化した複数の細胞を含み、前記バイオインクが、約５０μｍ以下の高さの層に、ラインの形状でバイオプリンティングされることと、前記所定量の前記バイオインクを誘導して、バイオプリンティングされた腎臓組織を形成することと、を含む、方法。
【請求項11】
前記所定量のバイオインクが、約１０，０００個の細胞／μｌ～約４００，０００個の細胞／μｌを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記バイオプリンティングされた腎臓組織が、約５～約１００ネフロン／１０，０００個の細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
前記表面が、生体適合性の足場である、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記所定量のバイオインクを誘導することが、バイオプリンティングされた腎臓組織をＦＧＦ－９と接触させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記複数の細胞が、バイオプリンティングされる前に、ＣＨＩＲ９９０２１と接触する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、バイオプリンティングされた腎臓組織およびその製造方法に関する。バイオプリンティングされた組織および方法は、疾患モデリング、薬物スクリーニング、薬物試験、腎置換、組織工学、再生医療などの様々な用途に使用できる。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月２３日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２０１９／９０３０９４号の優先権の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年８月２３日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２０１９／９０３０９４号の優先権の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
腎臓は、老廃物の除去および体液量の維持に大きな役割を果たす。腎臓の機能単位は、ネフロンとして知られている。ヒトの腎臓には、血液の濾過に関与する最大２００万個の上皮ネフロンが備わり、これらはすべて、出生前のネフロン前駆細胞から生じる。出生後のヒトの腎臓には、ネフロン前駆細胞は存在しない。このネフロン前駆細胞集団の欠如であっても、新しいネフロン形成（新腎形成）の能力は担保されないため、その後の傷害、老化、および疾患は、ネフロン数の減少および結果として生じる慢性腎臓病（ＣＫＤ）につながる可能性がある。これは最終的に、透析（腹膜透析または血液透析）または臓器移植などの、何らかの形での腎代替療法で処置されない限り、生命を危機にさらす末期腎疾患（ＥＳＫＤ）をもたらす。これらは、ＥＳＫＤにおいて利用可能な唯一の治療オプションである。透析および腎臓移植はいずれも費用がかかり、重大な欠点があり、患者の生活の質に影響を及ぼす。現在、ＣＫＤは世界中で毎年６％で増加しており、ドナー臓器にアクセスできる患者は４人に１人しかいないため、置換する腎臓組織の給源が主要な治療的標的となっている。
【0004】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）およびヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）の両方を含むヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を異なる細胞エンドポイントに誘導分化させることで、腎臓などの様々なヒト組織のオルガノイドモデルを生成させることが可能となった。Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２６：５６４－５６８で論じられるような従来のオルガノイドモデルは、ヒト腎臓の多細胞モデルである、複雑な三次元構造を有する腎臓オルガノイドを製造できる。これらの複雑な多細胞構造には、腎間質および内皮細胞に囲まれた集合管ネットワークに連結された、完全にセグメント化されたネフロンが含まれる。それらは、発生のトリメスター１のヒト胎児腎臓と同等の遺伝子発現を示す。
【0005】
この重要な研究成果もかかわらず、前述の方法に従って製造した腎臓オルガノイドは、持続的なネフロン前駆細胞集団を有さないため、自己制限的である。正常なヒトの腎臓の発達の、ネフロン形成の進行は、ネフロン前駆細胞集団から持続的に行われる。この集団は、腎臓オルガノイドに存在することが示されているが、この前駆細胞の集団はネフロンを生成した後は失われるため、このアプローチを使用して生成できるネフロンの数の上限が制限されることも示されている（Ｈｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１９）。幹細胞から機能的な腎臓組織を最大限生成させるための重要な要素は、ネフロンで構成される組織の相対的な割合である。第ニに重要な要素は、不要な非腎臓集団の低減である。したがって、かかる組織を生成させるために使用される細胞数当たりのネフロン数が多く、かつネフロンの分布がより均一な、操作された腎臓組織が必要である。第三に重要な要因は、構成要素であるネフロンのパターンが良好であり、またネフロンセグメントが成熟している証拠を示す、腎臓組織の存在である。移植可能な腎代替組織を生成させるための第四に重要な要素は、自動化に適する信頼性および再現性を有する態様で、かかる組織を作製する能力である。
【発明の概要】
【0006】
本発明者らは、驚くべきことに、幹細胞由来の腎前駆細胞を含む組成物に由来する、インビトロで操作された、またはバイオプリンティングされた腎臓組織が、組織のバイオプリンティングに適用される空間パラメーターに応じて、組織を生成させるために使用される細胞数当たりに生じるネフロンの数を増減させつつ生成され得ることを見出した。驚くべきことに、ネフロンの分布がより均一なバイオプリンティング組織を生成させることが可能であることを見出した。本発明者らは、驚くべきことに、バイオプリンティングされた組織の空間パラメーターを変化させることにより、同じ量の出発物質（細胞）からより多くのネフロンを生成できること、および得られた組織が改善された特性を有することを見出した。したがって、本明細書で記載するのは、成熟ネフロンが富化されたバイオプリンティングされた腎臓組織、およびその製造方法である。
【0007】
第１の態様によれば、本発明は、バイオプリンティングされた腎臓組織であって、組織全体に分布しているネフロンが富化されている、バイオプリンティングされた腎臓組織を提供する。好ましい実施形態では、ネフロンは、プリンティングされた組織全体に均等または均一に分布している。
【0008】
第２の態様によれば、本発明は、所定量のバイオインクを含むバイオプリンティングされた腎臓組織を提供し、ここで、バイオインクは、複数の細胞を含み、バイオインクは、約５０μｍ未満の高さであり、バイオプリンティングされたバイオインクは、誘導されて腎臓組織を形成する。別の実施形態では、バイオプリンティングされたバイオインクが誘導されて腎臓組織を形成した後の、バイオプリンティングされた腎臓組織の高さは、約１５０μｍ以下である。言い換えれば、最終的なバイオプリンティングされた腎臓組織の高さは、約１５０μｍ以下である。
【0009】
第３の態様によれば、本発明は、所定量のバイオインクを含むバイオプリンティングされた腎臓組織を提供し、ここで、バイオインクは、複数の細胞を含み、バイオインクは、１ｍｍ２当たり３０，０００個以下の細胞を含む層にバイオプリンティングされる。
【0010】
第４の態様によれば、本発明は、所定量のバイオインクを表面にバイオプリンティングするステップであって、バイオインクが、複数の細胞を含み、バイオインクが、約５０μｍ以下の高さの層にバイオプリンティングされる、ステップと、バイオプリンティングされた、所定量のバイオインクを誘導して、バイオプリンティングされた腎臓組織を形成するステップと、を含む、バイオプリンティングされた腎臓組織を製造するための方法を提供する。
【0011】
第５の態様によれば、本発明は、所定量のバイオインクを表面にバイオプリンティングするステップであって、バイオインクが、１ｍｍ２当たり約３０，０００個以下の細胞を含む層にバイオプリンティングされる複数の細胞を含む、ステップと、バイオプリンティングされた、所定量のバイオインクを誘導して、バイオプリンティングされた腎臓組織を形成するステップと、を含む、バイオプリンティングされた腎臓組織を製造するための方法を提供する。
【0012】
第６の態様によれば、本発明は、第４または第５の態様の方法に従って製造されたバイオプリンティングされた腎臓組織を提供する。
【0013】
第７の態様によれば、本発明は、腎疾患または腎不全の治療を必要とする対象においてその治療に使用するための、第１、第２、第３または第６の態様のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織を提供する。
【0014】
第８の態様によれば、本発明は、腎疾患の治療を必要とする対象においてその治療のための薬剤の製造における、第１、第２、第３または第６の態様のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織の使用を提供する。
【0015】
第９の態様によれば、本発明は、腎疾患または腎不全の治療を必要とする対象においてその治療のための方法であって、第１、第２、第３または第６の態様のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0016】
本発明の付番されたステートメントは、以下のとおりである：
１．バイオプリンティングされた腎臓組織であって、組織全体に分布しているネフロンが富化されている、バイオプリンティングされた腎臓組織。
２．バイオプリンティングされた腎臓組織が、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり０．２ｍｍ２超のネフロン組織の表面積を含むバイオプリンティングされた組織の層である、ステートメント１のバイオプリンティングされた腎臓組織。
３．バイオプリンティングされた腎臓組織が、プリンティング時に１ｍｍ２当たり約３０，０００個以下の細胞を含むバイオプリンティングされた腎臓組織の層である、ステートメント１または２に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
４．バイオプリンティングされた腎臓組織が、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＳＬＣ３０Ａ１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＦＡＢＰ３、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢのいずれか１つ以上を高レベルで発現する、先行ステートメントのいずれか１つに記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
５．バイオプリンティングされた腎臓組織が、ネフロンを含み、その近位尿細管および遠位尿細管セグメントが、ＨＮＦ４ＡおよびＳＬＣ１２Ａ１を含む成熟マーカーを発現する、ステートメント４のバイオプリンティングされた腎臓組織。
６．バイオプリンティングされた腎臓組織が、マーカーＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢをそれぞれ発現する、ステートメント４または５のバイオプリンティングされた腎臓組織。
７．バイオプリンティングされた腎臓組織の高さが、プリンティング時に約５０μｍ以下である、先行ステートメントのいずれか１つに記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
８．バイオプリンティングされた腎臓組織が、約１ｍｍ～約３０ｍｍの長さおよび約０．５ｍｍ～約２０ｍｍの幅を有する、先行ステートメントのいずれか１つに記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
９．バイオプリンティングされた腎臓組織が、約５～約１００ネフロン／バイオプリンティングされた腎臓組織１ｍｍ２を含む、ステートメント７または８のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１０．所定量のバイオインクを含むバイオプリンティングされた腎臓組織であって、バイオインクが複数の細胞を含み、バイオインクが約５０μｍ以下の高さの層にバイオプリンティングされ、バイオプリンティングされたバイオインクが、腎臓組織を形成するように誘導されている、バイオプリンティングされた腎臓組織。
１１．バイオインクが、約２０μｍの高さ～約４０μｍの高さから選択される層にバイオプリンティングされている、ステートメント１０のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１２．バイオインクが約３０μｍの高さの層にバイオプリンティングされている、ステートメント１０のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１３．バイオインクが約２５μｍの高さの層にバイオプリンティングされている、ステートメント１０のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１４．所定量のバイオインクが、約１０，０００個の細胞／μｌ～約４００，０００個の細胞／μｌを含む、ステートメント１０～１４のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
１５．上記複数の細胞が、部分的に分化した細胞を含む、ステートメント１０～１４のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
１６．上記複数の細胞が、腎前駆細胞を含む、ステートメント１０～１５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
１７．腎前駆細胞が、ネフロン前駆細胞を含む、ステートメント１６のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１８．腎前駆細胞が、尿管上皮前駆細胞を含む、ステートメント１６または１７のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１９．上記複数の細胞が、中間中胚葉細胞を含む、ステートメント１０～１５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２０．上記複数の細胞が、後腎間葉細胞を含む、ステートメント１０～１５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２１．上記複数の細胞が、腎管細胞を含む、ステートメント１０～１５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２２．上記複数の細胞が、完全に分化した細胞を含む、ステートメント１０～１５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２３．上記複数の細胞が、患者由来の細胞を含む、ステートメント１０～２２のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２４．上記複数の細胞が、レポーター細胞株からの細胞を含む、ステートメント１０～２３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２５．上記複数の細胞が、遺伝子編集された細胞を含む、ステートメント１０～２４のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２６．上記複数の細胞が、罹患細胞、健常細胞、または罹患細胞と健常細胞の組み合わせを含む、ステートメント１０～２５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２７．バイオプリンティングされた腎臓組織が、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり０．２ｍｍ２超のネフロン組織の表面積を含む、ステートメント１０～２６のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２８．バイオプリンティングされた腎臓組織が、プリンティング時に１ｍｍ２当たり約３０，０００個以下の細胞を含む、ステートメント１０～２７のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２９．バイオプリンティングされた腎臓組織が、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭ、およびＭＡＦＢのいずれか１つ以上を高レベルで発現する、ステートメント１０～２８のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３０．バイオプリンティングされた腎臓組織が、ネフロンを含み、その近位尿細管および遠位尿細管セグメントが、ＨＮＦ４Ａを含む成熟マーカーを発現する、ステートメント２９のバイオプリンティングされた腎臓組織。
３１．バイオプリンティングされた腎臓組織が、マーカーＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢをそれぞれ発現する、ステートメント２９または３０のバイオプリンティングされた腎臓組織。
３２．組織が、約５～約１００ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む、ステートメント１～３１のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３３．組織が、バイオプリンティングされた層全体にネフロンの均一な分布を有する、ステートメント１０～３２のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３４．組織が、バイオプリンティングされた層全体にＭＡＦＢを発現する糸球体構造の均一な分布を有する、ステートメント１０～３３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３５．生体適合性の足場をさらに含む、ステートメント１～３４のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３６．バイオインクが、生体適合性の足場にバイオプリンティングされている、ステートメント３５のバイオプリンティングされた腎臓組織。
３７．生体適合性の足場が、ヒドロゲルである、ステートメント３５または３６のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３８．生体適合性の足場が、生分解性または生体吸収性である、ステートメント３５～３７のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３９．バイオインクが、１つ以上の生物学的活性剤をさらに含む、ステートメント１０～３８のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
４０．上記１つ以上の生物学的活性剤が、上記複数の細胞からの腎臓組織の誘導を促進する、ステートメント３９のバイオプリンティングされた腎臓組織。
４１．バイオプリンティングされた腎臓組織を製造するための方法であって、所定量のバイオインクを表面にバイオプリンティングするステップであって、バイオインクが、複数の細胞を含み、バイオインクが、約５０μｍ以下の高さの層にバイオプリンティングされる、ステップと、バイオプリンティングされた、所定量のバイオインクを誘導して、バイオプリンティングされた腎臓組織を形成するステップと、を含む、方法。
４２．バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクが、約２０μｍの高さ～約４０μｍの高さから選択される層にバイオプリンティングされる、ステートメント４１の方法。
４３．バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクが、約３０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる、ステートメント４１の方法。
４４．バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクが、約２５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる、ステートメント４１の方法。
４５．所定量のバイオインクが、約１０，０００個の細胞／μｌ～約４００，０００個の細胞／μｌを含む、ステートメント４１～４４のいずれか１つの方法。
４６．バイオインクが、約２００，０００個の細胞／μｌを含む、ステートメント４５の方法。
４７．上記複数の細胞が、部分的に分化した細胞を含む、ステートメント４１～４６のいずれか１つの方法。
４８．上記複数の細胞が、腎前駆細胞を含む、ステートメント４１～４６のいずれか１つの方法。
４９．腎前駆細胞が、ネフロン前駆細胞を含む、ステートメント４８のバイオプリンティングされた腎臓組織。
５０．腎前駆細胞が、尿管上皮前駆細胞を含む、ステートメント４８または４９の方法。
５１．上記複数の細胞が、中間中胚葉細胞、好ましくは、幹細胞由来の中間中胚葉細胞の培養増殖集団を含む、ステートメント４１～４７のいずれか１つの方法。
５２．上記複数の細胞が、後腎間葉細胞を含む、ステートメント４１～４７のいずれか１つの方法。
５３．上記複数の細胞が、腎管細胞を含む、ステートメント４１～４７のいずれか１つの方法。
５４．上記複数の細胞が、完全に分化した細胞を含む、ステートメント４１～４７のいずれか１つの方法。
５５．上記複数の細胞が、患者由来の細胞を含む、ステートメント４１～５４のいずれか１つの方法。
５６．上記複数の細胞が、レポーター細胞株からの細胞を含む、ステートメント４１～５５のいずれか１つの方法。
５７．上記複数の細胞が、遺伝子編集された細胞を含む、ステートメント４１～５６のいずれか１つの方法。
５８．上記複数の細胞が、罹患細胞、健常細胞、または罹患細胞と健常細胞との組み合わせを含む、ステートメント４１～５７のいずれか１つの方法。
５９．バイオプリンティングされた腎臓組織が、約５～約１００ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む、ステートメント４１～５８のいずれか１つの方法。
６０．バイオプリンティングされた腎臓組織が、バイオプリンティングされた層全体にネフロンの均一な分布を有する、ステートメント４１～５９のいずれか１つの方法。
６１．バイオプリンティングされた腎臓組織が、バイオプリンティングされた層全体にＭＡＦＢを発現する糸球体構造の均一な分布を有する、ステートメント４１～６０のいずれか１つの方法。
６２．バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクが生体適合性の足場にバイオプリンティングされる、ステートメント４１～６１のいずれか１つの方法。
６３．生体適合性の足場が、ヒドロゲルである、ステートメント６２の方法。
６４．生体適合性の足場が、生分解性または生体吸収性である、ステートメント６２または６３のいずれか１つの方法。
６５．バイオインクが、１つ以上の生物学的活性剤をさらに含む、ステートメント４１～６４のいずれか１つの方法。
６６．上記１つ以上の生物学的活性剤が、上記複数の細胞からの腎臓組織の誘導を促進する、ステートメント６５の方法。
６７．誘導のステップが、バイオプリンティングされた所定量のバイオインクをＦＧＦ－９と接触させることを含む、ステートメント４１～６６のいずれか１つの方法。
６８．誘導のステップが、バイオプリンティングされた所定量のバイオインクをＦＧＦ－９と５日間接触させることを含む、ステートメント６７の方法。
６９．複数の細胞が、バイオプリンティングされる前に、ＣＨＩＲを含む細胞培養培地と接触する、ステートメント４１～６８のいずれか１つの方法。
７０．バイオプリンティングのステップが、押し出しベースのバイオプリンターを使用するものである、ステートメント４１～６９のいずれか１つの方法。
７１．バイオプリンティングのステップにおいて、バイオプリンターの分配装置が、上記層を１つ以上のラインで分配するように構成されている、ステートメント４１～７０のいずれか１つの方法。
７２．バイオプリンティングのステップにおいて、バイオプリンターの分配装置が、連続的なシートまたはパッチを形成するように、上記層を１つ以上のラインで分配するように構成されている、ステートメント４１～７１のいずれか１つの方法。
７３．ステートメント４１～７２のいずれか１つに従って製造された、バイオプリンティングされた腎臓組織。
７４．腎臓病または腎不全の治療を必要とする対象においてその治療に使用するための、ステートメント１～４０、または７３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
７５．腎臓病の治療を必要とする対象においてその治療のための薬剤の製造における、ステートメント１～４０、または７３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織の使用。
７６．腎疾患または腎不全の治療を必要とする対象においてその治療のための方法であって、ステートメント１～４０、または７３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織を対象に投与することを含む、方法。
７７．上記治療において、バイオプリンティングされた腎臓組織が、上記対象の腎被膜下に移植される、ステートメント７４に従って使用するためのステートメント１～４０もしくは７３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織、ステートメント７５の使用、またはステートメント７６の方法。
１．バイオプリンティングされた腎臓組織であって、組織全体に分布しているネフロンが富化されている、バイオプリンティングされた腎臓組織。
２．バイオプリンティングされた腎臓組織が、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり０．２ｍｍ２超のネフロン組織の表面積を含むバイオプリンティングされた組織の層である、ステートメント１のバイオプリンティングされた腎臓組織。
３．バイオプリンティングされた腎臓組織が、プリンティング時に１ｍｍ２当たり約３０，０００個以下の細胞を含むバイオプリンティングされた腎臓組織の層である、ステートメント１または２に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
４．バイオプリンティングされた腎臓組織が、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＳＬＣ３０Ａ１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＦＡＢＰ３、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢのいずれか１つ以上を高レベルで発現する、先行ステートメントのいずれか１つに記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
５．バイオプリンティングされた腎臓組織が、ネフロンを含み、その近位尿細管および遠位尿細管セグメントが、ＨＮＦ４ＡおよびＳＬＣ１２Ａ１を含む成熟マーカーを発現する、ステートメント４のバイオプリンティングされた腎臓組織。
６．バイオプリンティングされた腎臓組織が、マーカーＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢをそれぞれ発現する、ステートメント４または５のバイオプリンティングされた腎臓組織。
７．バイオプリンティングされた腎臓組織の高さが、プリンティング時に約５０μｍ以下である、先行ステートメントのいずれか１つに記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
８．バイオプリンティングされた腎臓組織が、約１ｍｍ～約３０ｍｍの長さおよび約０．５ｍｍ～約２０ｍｍの幅を有する、先行ステートメントのいずれか１つに記載のバイオプリンティングされた腎臓組織。
９．バイオプリンティングされた腎臓組織が、約５～約１００ネフロン／バイオプリンティングされた腎臓組織１ｍｍ２を含む、ステートメント７または８のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１０．所定量のバイオインクを含むバイオプリンティングされた腎臓組織であって、バイオインクが複数の細胞を含み、バイオインクが約５０μｍ以下の高さの層にバイオプリンティングされ、バイオプリンティングされたバイオインクが、腎臓組織を形成するように誘導されている、バイオプリンティングされた腎臓組織。
１１．バイオインクが、約２０μｍの高さ～約４０μｍの高さから選択される層にバイオプリンティングされている、ステートメント１０のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１２．バイオインクが約３０μｍの高さの層にバイオプリンティングされている、ステートメント１０のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１３．バイオインクが約２５μｍの高さの層にバイオプリンティングされている、ステートメント１０のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１４．所定量のバイオインクが、約１０，０００個の細胞／μｌ～約４００，０００個の細胞／μｌを含む、ステートメント１０～１４のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
１５．上記複数の細胞が、部分的に分化した細胞を含む、ステートメント１０～１４のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
１６．上記複数の細胞が、腎前駆細胞を含む、ステートメント１０～１５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
１７．腎前駆細胞が、ネフロン前駆細胞を含む、ステートメント１６のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１８．腎前駆細胞が、尿管上皮前駆細胞を含む、ステートメント１６または１７のバイオプリンティングされた腎臓組織。
１９．上記複数の細胞が、中間中胚葉細胞を含む、ステートメント１０～１５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２０．上記複数の細胞が、後腎間葉細胞を含む、ステートメント１０～１５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２１．上記複数の細胞が、腎管細胞を含む、ステートメント１０～１５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２２．上記複数の細胞が、完全に分化した細胞を含む、ステートメント１０～１５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２３．上記複数の細胞が、患者由来の細胞を含む、ステートメント１０～２２のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２４．上記複数の細胞が、レポーター細胞株からの細胞を含む、ステートメント１０～２３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２５．上記複数の細胞が、遺伝子編集された細胞を含む、ステートメント１０～２４のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２６．上記複数の細胞が、罹患細胞、健常細胞、または罹患細胞と健常細胞の組み合わせを含む、ステートメント１０～２５のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２７．バイオプリンティングされた腎臓組織が、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり０．２ｍｍ２超のネフロン組織の表面積を含む、ステートメント１０～２６のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２８．バイオプリンティングされた腎臓組織が、プリンティング時に１ｍｍ２当たり約３０，０００個以下の細胞を含む、ステートメント１０～２７のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
２９．バイオプリンティングされた腎臓組織が、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭ、およびＭＡＦＢのいずれか１つ以上を高レベルで発現する、ステートメント１０～２８のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３０．バイオプリンティングされた腎臓組織が、ネフロンを含み、その近位尿細管および遠位尿細管セグメントが、ＨＮＦ４Ａを含む成熟マーカーを発現する、ステートメント２９のバイオプリンティングされた腎臓組織。
３１．バイオプリンティングされた腎臓組織が、マーカーＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢをそれぞれ発現する、ステートメント２９または３０のバイオプリンティングされた腎臓組織。
３２．組織が、約５～約１００ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む、ステートメント１～３１のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３３．組織が、バイオプリンティングされた層全体にネフロンの均一な分布を有する、ステートメント１０～３２のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３４．組織が、バイオプリンティングされた層全体にＭＡＦＢを発現する糸球体構造の均一な分布を有する、ステートメント１０～３３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３５．生体適合性の足場をさらに含む、ステートメント１～３４のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３６．バイオインクが、生体適合性の足場にバイオプリンティングされている、ステートメント３５のバイオプリンティングされた腎臓組織。
３７．生体適合性の足場が、ヒドロゲルである、ステートメント３５または３６のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３８．生体適合性の足場が、生分解性または生体吸収性である、ステートメント３５～３７のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
３９．バイオインクが、１つ以上の生物学的活性剤をさらに含む、ステートメント１０～３８のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
４０．上記１つ以上の生物学的活性剤が、上記複数の細胞からの腎臓組織の誘導を促進する、ステートメント３９のバイオプリンティングされた腎臓組織。
４１．バイオプリンティングされた腎臓組織を製造するための方法であって、所定量のバイオインクを表面にバイオプリンティングするステップであって、バイオインクが、複数の細胞を含み、バイオインクが、約５０μｍ以下の高さの層にバイオプリンティングされる、ステップと、バイオプリンティングされた、所定量のバイオインクを誘導して、バイオプリンティングされた腎臓組織を形成するステップと、を含む、方法。
４２．バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクが、約２０μｍの高さ～約４０μｍの高さから選択される層にバイオプリンティングされる、ステートメント４１の方法。
４３．バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクが、約３０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる、ステートメント４１の方法。
４４．バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクが、約２５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる、ステートメント４１の方法。
４５．所定量のバイオインクが、約１０，０００個の細胞／μｌ～約４００，０００個の細胞／μｌを含む、ステートメント４１～４４のいずれか１つの方法。
４６．バイオインクが、約２００，０００個の細胞／μｌを含む、ステートメント４５の方法。
４７．上記複数の細胞が、部分的に分化した細胞を含む、ステートメント４１～４６のいずれか１つの方法。
４８．上記複数の細胞が、腎前駆細胞を含む、ステートメント４１～４６のいずれか１つの方法。
４９．腎前駆細胞が、ネフロン前駆細胞を含む、ステートメント４８のバイオプリンティングされた腎臓組織。
５０．腎前駆細胞が、尿管上皮前駆細胞を含む、ステートメント４８または４９の方法。
５１．上記複数の細胞が、中間中胚葉細胞、好ましくは、幹細胞由来の中間中胚葉細胞の培養増殖集団を含む、ステートメント４１～４７のいずれか１つの方法。
５２．上記複数の細胞が、後腎間葉細胞を含む、ステートメント４１～４７のいずれか１つの方法。
５３．上記複数の細胞が、腎管細胞を含む、ステートメント４１～４７のいずれか１つの方法。
５４．上記複数の細胞が、完全に分化した細胞を含む、ステートメント４１～４７のいずれか１つの方法。
５５．上記複数の細胞が、患者由来の細胞を含む、ステートメント４１～５４のいずれか１つの方法。
５６．上記複数の細胞が、レポーター細胞株からの細胞を含む、ステートメント４１～５５のいずれか１つの方法。
５７．上記複数の細胞が、遺伝子編集された細胞を含む、ステートメント４１～５６のいずれか１つの方法。
５８．上記複数の細胞が、罹患細胞、健常細胞、または罹患細胞と健常細胞との組み合わせを含む、ステートメント４１～５７のいずれか１つの方法。
５９．バイオプリンティングされた腎臓組織が、約５～約１００ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む、ステートメント４１～５８のいずれか１つの方法。
６０．バイオプリンティングされた腎臓組織が、バイオプリンティングされた層全体にネフロンの均一な分布を有する、ステートメント４１～５９のいずれか１つの方法。
６１．バイオプリンティングされた腎臓組織が、バイオプリンティングされた層全体にＭＡＦＢを発現する糸球体構造の均一な分布を有する、ステートメント４１～６０のいずれか１つの方法。
６２．バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクが生体適合性の足場にバイオプリンティングされる、ステートメント４１～６１のいずれか１つの方法。
６３．生体適合性の足場が、ヒドロゲルである、ステートメント６２の方法。
６４．生体適合性の足場が、生分解性または生体吸収性である、ステートメント６２または６３のいずれか１つの方法。
６５．バイオインクが、１つ以上の生物学的活性剤をさらに含む、ステートメント４１～６４のいずれか１つの方法。
６６．上記１つ以上の生物学的活性剤が、上記複数の細胞からの腎臓組織の誘導を促進する、ステートメント６５の方法。
６７．誘導のステップが、バイオプリンティングされた所定量のバイオインクをＦＧＦ－９と接触させることを含む、ステートメント４１～６６のいずれか１つの方法。
６８．誘導のステップが、バイオプリンティングされた所定量のバイオインクをＦＧＦ－９と５日間接触させることを含む、ステートメント６７の方法。
６９．複数の細胞が、バイオプリンティングされる前に、ＣＨＩＲを含む細胞培養培地と接触する、ステートメント４１～６８のいずれか１つの方法。
７０．バイオプリンティングのステップが、押し出しベースのバイオプリンターを使用するものである、ステートメント４１～６９のいずれか１つの方法。
７１．バイオプリンティングのステップにおいて、バイオプリンターの分配装置が、上記層を１つ以上のラインで分配するように構成されている、ステートメント４１～７０のいずれか１つの方法。
７２．バイオプリンティングのステップにおいて、バイオプリンターの分配装置が、連続的なシートまたはパッチを形成するように、上記層を１つ以上のラインで分配するように構成されている、ステートメント４１～７１のいずれか１つの方法。
７３．ステートメント４１～７２のいずれか１つに従って製造された、バイオプリンティングされた腎臓組織。
７４．腎臓病または腎不全の治療を必要とする対象においてその治療に使用するための、ステートメント１～４０、または７３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織。
７５．腎臓病の治療を必要とする対象においてその治療のための薬剤の製造における、ステートメント１～４０、または７３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織の使用。
７６．腎疾患または腎不全の治療を必要とする対象においてその治療のための方法であって、ステートメント１～４０、または７３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織を対象に投与することを含む、方法。
７７．上記治療において、バイオプリンティングされた腎臓組織が、上記対象の腎被膜下に移植される、ステートメント７４に従って使用するためのステートメント１～４０もしくは７３のいずれか１つのバイオプリンティングされた腎臓組織、ステートメント７５の使用、またはステートメント７６の方法。
【0017】
本明細書の任意の実施例または実施形態は、特に明記しない限り、必要な変更を加えて他の任意の実施例または実施形態においても適用されるものとする。
【0018】
本開示は、例示のみを目的とし、本明細書に記載の特定の実施例によってその範囲が限定されるものではない。機能的に均等の製品、組成物および方法は、本明細書に記載されるように、明らかに本開示の範囲内にある。
【0019】
本明細書全体を通して、特に別段の記載がない限り、または文脈において別段の必要がある場合を除き、単一のステップ、物質の組成、一群のステップ、または一群の物質の組成への言及は、それらのステップ、物質の組成、一群のステップ、または一群の物質の組成の１つおよび複数（すなわち１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。
【0020】
以下の非限定的な実施例および添付の図面を参照しつつ、本開示を以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】７日目の中間中胚葉細胞ペーストの押し出しベースの細胞バイオプリンティングによる、再現性の高い、ヒト多能性幹細胞由来の腎臓オルガノイドの生成。Ａ．多能性幹細胞を分化させ、腎臓オルガノイドを生成するための、バイオプリンティングのプロトコル。本図は、バイオプリンティングを使用して手作業処理を置き換えるポイントを示し、手作業処理（Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）と３Ｄ細胞ペースト押し出しバイオプリンティングとで、相対的な細胞数およびオルガノイド生成速度を比較する。Ｂ．プリンティング日（７日目＋０日目）から培養２０日目（７日目＋２０日目）までのマイクロマス細胞ペースト培養物の明視野画像であり、経時的なネフロンの自発的形成を示す。Ｃ．７日目＋１８日目のオルガノイドのホールマウント免疫蛍光染色であり、遠位尿細管（Ｅ－ＣＡＤＨＥＲＩＮ、緑）、近位尿細管（ＬＴＬ、青）、有足細胞（ＮＥＰＨＲＩＮ、白）、および潜血セグメント／集合管（ＧＡＴＡ３、赤）を含むパターン化およびセグメント化されたネフロンの証拠を示す。チャネルの融合は、個々のネフロンセグメントの関係を示す。Ｄ．７日目＋１８日目のバイオプリンティングされたオルガノイドの、マーカーを使用したホールマウント免疫蛍光染であり、近位尿細管セグメント（ＣＤ１３、ＣＵＢＮ、ＬＴＬ）、管状基底膜（ＬＡＭＩＮＩＮ）、周囲の間質（ＭＥＩＳ１／２）、ヘンレＴＡＬ（ＳＬＣ１２Ａ１）および内皮（ＣＤ３１）の遠位尿細管／ループの存在を示す。Ｅ．同じｉＰＳＣ由来の中間中胚葉のバッチから同時に生成させた、明視野（７日目＋７日目）の、およびホールマウントの免疫蛍光染色された、手作業およびバイオプリンティングされた腎臓オルガノイド。染色により、手作業およびバイオプリンティングされたオルガノイドの両方で、パターン化およびセグメント化されたネフロンの証拠を示す（ＥＰＣＡＭ、緑：上皮；ＬＴＬ、青：近位尿細管；ＮＰＨＳ１、白：糸球体；ＧＡＴＡ３、赤：連結セグメント／集合管）。Ｆ．トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）（登録商標）インサートに、３つの腎臓オルガノイドがバイオプリンティングされている。開始時の細胞数を表示する。上の列は、細胞数を減少させたときのオルガノイドを生成する能力を示す。下の行は、複数のウェルにわたって特定の細胞数をバイオプリンティングした場合のサイズの再現性を示す。Ｇ．９つのバイオプリンティングされたオルガノイドを含む、６ウェルのトランスウェル（登録商標）インサートであり、それぞれ約９６，０００個の細胞を含む。Ｈ．バイオプリンティングされたオルガノイド内の腎臓オルガノイドの分化は、開始細胞数の減少にかかわらず同等である。画像は、２×１０５または４×１０５細胞オルガノイドとしてプリンティングされた成熟オルガノイドのＨ＆Ｅ染色切片を示す。
【図2】Ａ．７＋１８日目のバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドの完全な組織断面図であり、相互に連結する上皮（矢印）からネフロンが発生する明確な証拠を示す。Ｂ．複数のＥＣＡＤ＋ＧＡＴＡ３－ネフロンが結合したＧＡＴＡ３＋ＥＣＡＤ＋連結セグメント／集合管を示す、バイオプリンティングされた腎臓オルガノイド切片の免疫染色。Ｃ．ＭＡＦＢ＋糸球体に結合したＥＣＡＤ＋ネフロンを示す、バイオプリンティングされた腎臓オルガノイド切片の免疫染色。Ｄ．オルガノイドの直径を制御した乾燥細胞ペースト、対、細胞数を制御した乾燥細胞ペースト、対、湿細胞ペーストを使用して手作業で生成させた腎臓オルガノイド（オルガノイド当たり５×１０５細胞）の明視野での、組織学的および免疫蛍光の比較。
【図3】Ａ．手作業によるオルガノイド（５×１０５細胞）の生成に使用される単一の開始分化からのオルガノイド、対、わずか４，０００細胞から生成されたバイオプリンティングオルガノイド、の免疫蛍光観察。Ｂ．ＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２レポーターｉＰＳＣ株を使用して生成されたバイオプリンティングオルガノイドの、時間経過による分化を示す。Ｃ．同じトランスウェルフィルター上にＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２を、オルガノイド当たり４Ｋ、５０Ｋ、または１００Ｋの細胞でバイオプリンティングしたオルガノイドであり、蛍光レポーターイメージング（青）および分化の染色（ＥＣＡＤ、緑；ＬＴＬ、青；ＧＡＴＡ３、赤；ＮＰＨＳ１、紫）を示す。Ｄ．同じトランスウェルフィルター上にＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２を、オルガノイド当たり１００Ｋの細胞を使用してバイオプリンティングしたオルガノイドであり、ライブ蛍光イメージング（青）および分化の染色（ＥＣＡＤ、緑；ＬＴＬ、青；ＧＡＴＡ３、赤；ＮＰＨＳ１、紫）を示す。
【図4】９６ウェルフォーマットでの化合物スクリーニングのための、バイオプリンティングされたオルガノイドの応用。Ａ．９６ウェルトランスウェルフォーマット内のすべてのバイオプリンティングオルガノイドの画像。バイオプリンティングされたオルガノイドは、オルガノイド当たり１×１０５細胞の堆積を用いて生成させ、さらに１８日間培養した。Ｂ．堆積直前にプレートホルダー内のプリントステージに固定された９６ウェルプレート。Ｃ．オルガノイド当たりのバイオプリンティングされた細胞数および９６ウェルプレート全体の細胞生存率の品質管理評価。Ｄ．対照に対する、１０．０ｕＭのドキソルビシンに対する応答の、免疫蛍光解析。バイオプリンティングされたオルガノイドの切片を用い、ＭＡＦＢ（有足細胞マーカー）、切断型カスパーゼ３（ＣＣ３、アポトーシスマーカー）、サイトケラチン８／１８（ＣＣＫ８／１８、尿細管マーカー）、ロータステトラノグロブリンレクチン（ＬＴＬ、近位尿細管）に対する抗体で染色し、また核を標識するためＤＡＰＩ染色した。ドキソルビシンの存在下で、有足細胞特異的な、ＭＡＦＢの発現の喪失およびアポトーシスの誘導が見られた。Ｅ．ドキソルビシン処理に応答した、腎障害分子－１（ＨＡＶＣＲ）およびアポトーシス遺伝子（ＣＡＳＰ３、ＢＡＸ）の遺伝子発現。Ｆ．ドキソルビシン処理に応答した、主要な有足細胞（ＮＰＨＳ１、ＰＯＤＸＬ）および近位尿細管（ＣＵＢＮ）遺伝子の遺伝子発現。Ｇ．６ウェル（緑）および９６ウェル（青）のトランスウェルフォーマットで堆積されたバイオプリンティングオルガノイドからのデータを比較した、ドキソルビシン処理に応答した細胞生存率の評価。ドキソルビシンの添加後７２時間で生存率を評価した。Ｈ．一連のアミノグリコシド系抗生物質に応答した生存率をスクリーニングするための、９６ウェルのバイオプリンティングオルガノイドの適用。
【図5】オルガノイドのコンフォメーションを変化させるための押し出しバイオプリンティングの使用。Ａ．同一の開始細胞数（１．１×１０５細胞）からの、長さが増加する一連のオルガノイドの生成。本図は、バイオプリンティングにおける、オルガノイドプロファイル／高さを、比率０（押し出し時にニードルが動かない）～比率４０（トランスウェル表面を横切るようニードルが動く押し出し）に変化させたときの相対的な影響を示すのに有用である。比率は、先端の動きと押し出しとの比率を指す。Ｂ．オルガノイドを製造するときのトランスウェル表面全体に広がる細胞ペーストを測定するため、蛍光ビーズを含有させた。広がりが大きいほど、表面積当たりのビーズが少なくなる。比率０および４０の細胞ペーストの堆積からの代表的な領域を示す。白い点線は細胞ペーストのエッジを示す。Ｃ．トランスウェル単位表面積当たりのビーズ密度の定量。比率が高いほど、広がりが大きくなり、ビーズ密度が低くなる（ｎ＝合計２１オルガノイド、ｎ＝９の比率０を除き、１条件当たりｎ＝３）。Ｄ．バイオプリンティング直後のＤ７＋０で測定された組織の高さ（ｎ＝２７オルガノイド、２つの独立した実験から）。Ｅ．様々なコンフォメーションでプリンティングされたオルガノイドの、７＋１２日目に測定されたオルガノイドの高さ（ｎ＝２１オルガノイド）。ＤおよびＥの赤い点は、平均値を表す。Ｙ軸のスケールはＤとＥで異なることに注意されたい。詳細については図６を参照。Ｆ．様々なコンフォメーションでプリンティングされたオルガノイドの糸球体領域を示す、青色蛍光タンパク質を含むＭＡＦＢｍＴＧＡＢＦＰ２レポーター株を使用して生成された、生きたオルガノイドの代表的な蛍光イメージング。Ｇ．異なるコンフォメーションの、バイオプリンティングオルガノイド複製物における、測定されたｍＴａｇＢＦＰ２面積およびオルガノイド長の定量。各点は単一のオルガノイドを表す（ｎ＝計９０個のオルガノイド、図６を参照）。Ｈ．ＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２（糸球体、青色の内因性蛍光）、上皮（ＥＰＣＡＭ、灰色）、近位尿細管（ＬＴＬ、緑色）、および連結セグメント／集合管（ＧＡＴＡ３、赤色）を示す、各コンフォメーションからの代表的なバイオプリンティングされたオルガノイドの免疫蛍光。
【図6-1】様々なコンフォメーションにおける、オルガノイド中のビーズ密度およびＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２レポーターシグナルの定量。Ａ．プリントパターン全体にわたる、Ｄ７＋０での蛍光ビーズシグナル（グレースケール）の代表的な画像であり、左から右に、比率０（３回の繰り返し）、比率４０、比率３０、比率２０、比率１０の５つのコンフォメーションすべてを示す。Ｂ．ｍＴａｇＢＦＰ２レポーター発現（青）およびビーズシグナル（赤）を示す、Ｄ７＋１２での各コンフォメーションの合成画像。画像は黒い背景に配置されていることに注意されたい。スケールバーは、ＡおよびＢでは１ｍｍである。Ｃ．オルガノイド複製物の総オルガノイド面積（方法を参照）およびｍＴａｇＢＦＰ２面積の定量（図７Ｇと比較）。Ｄ．Ｃおよび図７Ｇの定量に使用されたプレート複製物によるオルガノイド数および比率の表。Ｅ．比率２０を使用して製造された９つのオルガノイド複製物の例。オルガノイドは、各プレートの別々のウェルからの３つのオルガノイド間、およびプレート間で均一である。Ｆ．Ｄ７＋０でのオルガノイドの高さを定量するための、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ色素によるスパースラベリングの代表的な画像。ＸＹ方向および直交方向から見た図を示す。Ｇ．定量に使用したスコアリング方法の概略図。
【図7】オルガノイドのコンフォメーションを変化させると、パターン化されていない組織が減少し、ネフロンの数および成熟度が増加する（図９も参照）。Ａ．比率０（Ｒ０）、比率２０（Ｒ２０）、および比率４０（Ｒ４０）のオルガノイドの、バルクＲＮＡｓｅｑ転写プロファイルにおける、１００万回の発現値当たりのスケーリングされたログカウントを比較するヒートマップ。Ｂ．比率４０対比率０における、オルガノイドで最も有意に富化されたＧＯタームを表す、遺伝子１００万回発現値当たりのスケーリングされたログカウントのヒートマップ。Ｃ．転写の変化を検証するための蛍光抗体法であり、比率が増加するにつれて、内皮マーカーＳＯＸ１７が減少し、ヘンレ係蹄（ＴＡＬ）マーカーＳＬＣ１２Ａ１のループが増加することを示す。Ｄ．バイオプリンティングされたオルガノイドの３Ｄレンダリングであり、比率０～比率４０のオルガノイドにおける明確な形態を示す。画像は、ＸＹ平面が４５度で傾斜していることを示すようレンダリングされている。
【図8-1】手作業でのオルガノイド、バイオプリンティングされたＲ０「ドット」、およびバイオプリンティングされたＲ４０「ライン」の、単一細胞ＲＮＡｓｅｑの比較。Ａ．実験デザイン。コンフォメーションごとに複数のオルガノイドセットを生成させ、各セットにバーコードを付し、組み合わせ、条件ごとに１つのｓｃＲＮＡｓｅｑライブラリーを形成させる。両方のバイオプリンティングタイプを、１．１×１０５細胞から生成させる一方で、手作業でのオルガノイドは２．３×１０５細胞から生成させる。Ｂ．画像の定量化により、ＭＡＦＢレポーター領域に基づくＲ４０のラインのオルガノイドのネフロンの増加が確認される。黒いバーは平均値を表す。Ｒ４０－Ｍａｎ、ｐ＝２．１×１０－５、Ｒ４０－Ｒ０、ｐ＝２×１０－１６、ホルム多重比較補正を使用したペアワイズｔ検定に基づく。条件ごとのｎ値の詳細、セットレベルの比較、および代表的な画像を図９に示す。Ｃ．ｓｃＲＮＡの間質系統細胞における転写変動を視覚化するＵＭＡＰ。クラスターのＩＤの詳細については、図１０を参照されたい。Ｄ．複製および条件による、各間質細胞クラスターの割合。Ｐ値はｐ＜０．２で示し、３つの条件すべてを比較した一元配置分散分析を表す。各点は単一の複製物を表し、赤いダイヤモンド形はｎ＝４の平均値を表す。Ｅ．ｓｃＲＮＡｓｅｑデータにおける、ネフロン系細胞における転写変動を視覚化するＵＭＡＰ。クラスターは、ネフロン前駆細胞様（３）、前有足細胞（４）、有足細胞（１）、前尿細管（２）、遠位尿細管（０）、近位尿細管（８）である。クラスター５および７は、サイクリング細胞を表し、クラスター６は、ダブレットセルを表すために削除した。詳細については、図１０を参照されたい。Ｆ．条件全体での複製ごとの各ネフロン細胞型の割合。Ｐ値はｐ＜０．２で示し、３つの条件すべてを比較した一元配置分散分析を表す。クラスター４の場合、ＡＮＯＶＡの後に平均のＴｕｋｅｙ多重比較を行い、Ｒ４０対Ｍａｎにおけるｐ＝０．０２１を得た。Ｇ．ネフロン系統のクラスターのコンフォメーション間の各クラスター内のフィルタリングされた差次的発現（ＤＥ）遺伝子数を示すヒートマップ。ＤＥ試験は、複製物および条件ごとに、特定の細胞型の疑似バルクカウントの合計に対して実施し、その際、複製物間の変動（ｎ＝４）を考慮して、統計的に有意な（調整されたｐ値＜０．０５）変化を同定する。遺伝子リストをフィルタリングして、３つ以上の細胞型に現れる遺伝子を削除し、特定の変化に焦点を当て、バッチ効果の可能性を最小限に抑えた。Ｈ．近位尿細管細胞（ネフロンクラスター８）の疑似バルク分析において、Ｒ４０と手作業オルガノイドとの間で統計的に有意なＤＥを有すると同定された、選択された遺伝子の正規化された単一細胞発現値のバイオリンプロット。バイオリンプロットは、単一細胞の発現値の分布を色付きの形状として示し、個々の点は黒い点としてオーバーレイされる。Ｒ４０オルガノイドは、手作業オルガノイドと比較し、近位尿細管の成熟に関連する遺伝子（ＳＬＣ３０Ａ１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＦＡＢＰ３、ＳＵＬＴ１Ｅ１）の発現増加、および初期の未成熟尿細管（ＳＰＰ１、ＪＡＧ１）に関連する遺伝子の発現の減少を示す。Ｉ．間質系統クラスターのコンフォメーション間の各クラスター内で差次的に発現するフィルタリングされた遺伝子数を示すヒートマップ。Ｊ．Ｒ４０と手作業オルガノイドとの間の間質クラスター２細胞の疑似バルク分析において、発現が有意に増加していると同定された、選択された遺伝子の正規化された単一細胞発現値のバイオリンプロット。Ｋ、Ｌ．Ｒ４０オルガノイドの間質クラスター３細胞の疑似バルク分析で発現が大幅に増加した、選択された遺伝子の正規化された発現値のバイオリンプロット。ネフロン前駆細胞の同一性に関連する遺伝子は、Ｋ）Ｒ４０対手作業オルガノイド（ＨＯＸＡ１１、ＦＯＸＣ２）、およびＬ）Ｒ４０対Ｒ０オルガノイド（ＥＹＡ１、ＳＩＸ１）で有意に増加した。
【図9】単細胞ＲＮＡｓｅｑに使用されるオルガノイドに関連する大きな画像データセットの定量。ラインオルガノイドは約１２ｍｍの長さである。Ａ．複製および条件にわたる、３つの別々のウェルからの代表的な画像。Ｂ．セットおよび条件ごとの、ＭＡＦＢ－ｍＴａｇＢＦＰ２レポーター領域の定量。データは図８Ｂのとおりであるが、ここではセットで区切られている。Ｃ．ＧＡＴＡ３－ｍＣｈｅｒｒｙレポーター面積の定量。ほとんどの場合、ＧＡＴＡ３領域はオルガノイドのかなり小さな割合を表すため、Ｙ軸のスケールはＢとＣで異なることに留意されたい。Ｄ．測定されたレポーターの総面積（ＭＡＦＢ＋ＧＡＴＡ３）における割合としてのＧＡＴＡ３の面積であり、Ｒ０がより遠位の運命に向かってシフトしていることを示す。Ｅ．セットおよび条件ごとの、定量に使用された個々のオルガノイドの総数。
【図10-1】単細胞ＲＮＡデータセットの解析。Ａ．ＵＭＡＰプロットとして表されるデータセット内の変動性であり、転写クラスター、予測される細胞周期フェーズ、主な細胞型、およびオルガノイドのコンフォメーション（左上から時計回り）で色分けしている。Ｂ．主要な細胞型、ＷＴ１およびＰＡＸ２（ネフロン）、ＰＤＧＦＲＡ（間質）およびＳＯＸ１７（内皮）のマーカー遺伝子。Ｃ．複製条件における各細胞型の割合。ｐ＜０．２の場合に示されるＰ値（一元配置分散分析）。Ｄ．再形質転換およびクラスタリング後のネフロン細胞のＵＭＡＰを高い解像度で表す。プロットを、転写クラスター、予測される細胞周期の段階、およびオルガノイドのコンフォメーションによって色分けする。クラスターのＩＤを示す。Ｅ．各クラスターを識別するマーカー遺伝子：ＧＡＴＡ３（遠位）、ＨＮＦ１Ｂ（尿細管前）、ＣＵＢＮ（近位）、ＨＮＦ４Ａ（近位）、ＦＯＸＣ２（前足細胞）、ＭＡＦＢ（前足細胞／有足細胞）、ＰＯＤＸＬ（有足細胞）、ＳＩＸ２（前駆細胞）、ＥＹＡ１（前駆細胞）。Ｆ．転写クラスター、予測される細胞周期相、およびオルガノイドコンフォメーションで色分けされた間質ＵＭＡＰ（上から下）。Ｇ．特異的な間質クラスターのマーカー；ＳＩＸ２、ＬＹＰＤ１、ＦＯＸＣ２、ＨＯＸＡ１１（クラスター３、ネフロン前駆細胞様）、ＷＮＴ５Ａ、ＬＨＸ９（クラスター７）、ＺＩＣ１およびＺＩＣ４（クラスター１０）。Ｈ．バルクＲＮＡｓｅｑ分析で同定された上位１００の最も顕著に発現された遺伝子の、ｓｃＲＮＡｓｅｑセットからの疑似バルクカウント１００万当たりのスケーリングされたログカウントのヒートマップ（図７）。各列は、単一の複製物（例えば、Ｒ４０、Ｎｅｐｈｒｏｎ、Ｓｅｔ１）からの単一のクラスターを表す。限られた遺伝子セットの階層的クラスタリングは、バルクＲＮＡｓｅｑの変化が主にネフロンおよび内皮細胞の変化によって引き起こされることを示す。
【図11】３Ｄ押し出し細胞バイオプリンティングを使用した腎臓組織パッチの生成。Ａ．細胞ペースト押し出し用のニードルの先端の動作の図であり、約４．８ｍｍ×６ｍｍの領域に、約４×１０５個の細胞を含むパッチオルガノイドを生成させる。線は連続的な動きを示す。Ｂ．バイオプリンティングされた腎臓組織パッチの明視野イメージングであり、パッチの端部および中央部を含む、ネフロン構造の均一な形成を示す。Ｃ．培養Ｄ７＋１２でのパッチオルガノイド全体のＭＡＦＢｍＴＡＧＢＦＰ２レポーターシグナルのライブ共焦点イメージング。スケールバーは１ｍｍを表す。Ｄ．Ｄ７＋１４のパッチオルガノイドの共焦点免疫蛍光であり、糸球体の有足細胞（ｍＴａｇＢＦＰ２［左パネル；青］）、近位尿細管（ＬＴＬ［左パネル；緑］およびＨＮＦ４Ａ［右パネル；赤］）、ネフロン上皮（ＥＰＣＡＭ［左パネル；赤］）、ヘンレＴＡＬの遠位尿細管／ループ（ＳＬＣ１２Ａ１［右パネル；緑］）および内皮細胞（ＳＯＸ１７［右パネル；灰色］）のマーカーを発現するネフロンの均一な分布を示す。スケールバーは１００μｍを表す。Ｅ．ＴＲＩＴＣ－アルブミン基質中でのインキュベーション後のＨＮＦ４ＡＹＦＰレポーターｉＰＳＣ株に由来するＤ７＋１４パッチオルガノイドのライブ共焦点イメージング。画像は、ＹＦＰ陽性近位尿細管（黄色）へのＴＲＩＴＣ－アルブミン（赤）の取り込みを示す。上図の輪郭が描かれた領域（オルガノイド画像全体）は、位相差オーバーレイがある場合とない場合について、下図に高倍率で表示する。スケールバーは１００μｍを表す。
【図12】オルガノイドにおけるＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２レポーター発現は、総ネフロン数と相関している。Ａ、Ｂ）オルガノイドのネフロン体積の代用としてＭＡＦＢ＋領域を定量するために使用される、低解像度、ハイスループットイメージングの例。明視野およびＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２シグナルを、回転ディスクシステムとともに低ＮＡ ４×対物レンズを使用して各オルガノイドに対してキャプチャし、多くのサンプルの高速キャプチャを可能にした。軸方向の被写界深度が大きいため、これらの画像は、単一平面内の各オルガノイド内のシグナルの大部分をキャプチャする。類似する厚さ（Ｅ、Ｆ、図５）を考慮すると、この平面領域は、ＭＡＦＢ＋糸球体の総体積にほぼ比例するため、ネフロン数と相関する。Ｄ７＋１２でのＲ０（Ａ）およびＲ４０（Ｂ）オルガノイドの定量に使用される画像の例の一部を示す。Ｒ４０オルガノイドははるかに長く、複数の視野の画像をステッチすることによってキャプチャした。オルガノイドのごく一部のみを示す。Ｃ、Ｄ）サンプルを固定し、Ｄ７＋１２において、ＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２レポーター（青）、成熟した有足細胞マーカーＮＰＨＳ１（赤）、および頂端細胞膜のマーカーである非定型プロテインキナーゼＣ（ａＰＫＣ、緑）で染色した。各ネフロンは、ａＰＫＣで標識されるがＮＰＨＳ１を欠く他の管状セグメントに連結された有足細胞（例えば白い矢印で強調表示するもの）を含む丸い糸球体構造で構成されている。ネフロンは視野全体に見られ、個々のネフロンが簡単に視覚的に識別できない程、詰め込まれている。ＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２レポーターは、ＮＰＨＳ１を発現する有足細胞で特異的に発現するが、他のネフロンセグメント（ａＰＫＣ＋、ＮＰＨＳ１－領域）または他の細胞型には存在しない。画像は最大投影（５０μｍスパン）である。Ｅ、Ｆ）両方の条件において、直交スライス（つまり、イメージングＺ軸に沿った）方向から観察した場合、ネフロン含有領域に同様の軸方向形態を有している。３Ｄスタックからレンダリングされた単一の直交スライスを表示する。Ｇ、Ｈ）各条件の単一の糸球体を示すトリミングされた高解像度フィールドは、有足細胞におけるＭＡＦＢｍｔａｇＢＦＰ２レポーターおよびＮＰＨＳ１の共発現を確認する。単一の共焦点スライスを表示する。すべての画像は、少なくともｎ＝３の染色サンプルを表す。
【図13】ホールマウント蛍光抗体法による間質マーカーの空間分布。Ａ～Ｃ）ｓｃＲＮＡプロファイリングに基づくオルガノイド間質集団のマーカーの免疫蛍光染色。Ｒ０オルガノイドは、ネフロンを含む領域（Ｎｅｐｈｒｏｎｓ）、ネフロンがほとんど存在しない中央部（Ｃｏｒｅ）、および明視野イメージングでは通常観察されない単層細胞の薄いエッジ（Ｔｈｉｎ ｅｄｇｅ）で構成される。Ｒ４０のラインのオルガノイドは、主に高密度のネフロン含有領域と薄い単分子層のエッジで構成され、中央のコアは存在しない。間質集団マーカー（Ａ）ＭＥＩＳ１／２／３、（Ｂ）ＳＩＸ１、および（Ｃ）ＳＯＸ９は、ネフロンの周囲の領域、および各オルガノイドのエッジにある薄い単層シート内に存在するが、Ｒ０オルガノイドの中央コアにはほとんど存在しない。条件ごとに染色されたｎ＝３個のオルガノイドの代表的な画像を示す。画像は、オルガノイドの全体積にわたる最大の投影である。Ｄ）ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２、ＳＩＸ１、およびＳＯＸ９の発現を示すために色分けされた、ｓｃＲＮＡデータセット内の間質細胞を表すＵＭＡＰプロット。これらの組み合わされたマーカーは、データセット内のほとんどの細胞に含まれており、（Ｅ）で観察された中央コアに染色がないことは、その領域が全体的に細胞としての性質が低いことを示す可能性がある。
【図14-1】腎臓オルガノイドとヒト胎児腎臓を直接比較すると、Ｒ４０バイオプリンティングされたライン内の近位尿細管の成熟が改善されていることが確認される。Ａ）Ｓｅｕｒａｔでのバイアスのないクラスタリングに基づく転写同一性を比較するＵＭＡＰプロット（左）、およびｓｃＰｒｅｄメソッドを使用した予測による、ヒト胎児腎臓（ＨＦＫ）データセットとの類似性に従う細胞の分類（右）。ＩＤは、ヒトの胎児の腎臓データで最も類似した細胞型に基づいて割り当てる。Ｂ）複製物全体で各細胞型のＩＤに割り当てられた細胞の割合。点は、複製物バーコード（ＨＴＯ－１がセット１）によって色分けされた個々の複製物の値を示す。バーはＳＥＭを示す。一元配置分散分析に基づくＰ値は、Ｐｒｅ－Ｐｏｄ細胞であると予測される細胞数に有意差があり、Ｒ４０データセットで最も豊富であることを示す。バイオプリンティングの条件（Ｒ４０およびＲ０）では、有足細胞であると予測される細胞が多く、遠位および尿細管前の細胞が少ない。ただし、これらの変動は有意ではない。これらの結果は、図５に示されている分析で観察された傾向を裏付ける。Ｃ）予測された細胞型によってプロットされた、コンフォメーション全体での各細胞の分類の最大類似度スコアの分布。ほとんどの細胞は、予測される胎児の腎臓の細胞型と高い類似性を示す。Ｄ）手作業オルガノイド（ＳＬＣ５１Ｂ、ＦＡＢＰ３、ＳＵＬＴ１Ｅ１）と比較してＲ４０で有意に増加していると同定された遺伝子は、ヒト胎児腎臓の成熟近位尿細管細胞で発現し、これらの遺伝子が、成熟した細胞型と関連することが確認される。手作業オルガノイドに対してＲ４０で有意に低い遺伝子（ＳＰＰ１）は、成熟度の低い細胞型で選択的に発現するものであり、Ｒ４０の近位細胞における成熟度の増加がさらに確認される。ＵＭＡＰは、ヒト胎児腎臓データでの転写の同一性を示す。左上のプロットは、分化中のヒト胎児腎臓細胞型（腎小胞およびコンマ型体［ＲＶ＿ＣＳＢ］、青；近位初期ネフロン［ＰＥＮ］、赤）および成熟近位尿細管（ＰＴ、緑）によって色分けする。左下のプロットは、選択された遺伝子の「ドットプロット」スタイルを示し、そのサイズは遺伝子を発現するＨＦＫ細胞のパーセンテージを示し、色は正規化された発現レベルを示す。細胞ごとの各遺伝子の正規化された発現を、発現が色分けされている個々のＵＭＡＰプロットに示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または均等な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または均等な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
【0023】
本明細書で使用される場合、文脈上別段の必要がある場合を除いて、「含む」という用語および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの用語の活用形は、さらなる添加物、成分、整数またはステップを除外することを意図するものではない。
【0024】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、単数の不定冠詞として、または、不定冠詞が参照する複数または複数の主題を除外するものとして、解釈されるべきではないことが理解されよう。例えば、「１つの（ａ）」細胞は、１つの細胞、１つ以上の細胞、および複数の細胞を包含する。
【0025】
本明細書で使用される場合、「バイオインク」は、バイオプリンティングで使用するための液体、半固体、または固体の組成物を意味する。いくつかの実施形態では、バイオインクは、細胞溶液、細胞凝集体、細胞含有ゲル、または多細胞体を包含する。いくつかの実施形態では、バイオインクは、支持材料をさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、バイオプリンティングを可能にする特定の生体力学的特性を提供する非細胞材料をさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、押し出し化合物を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、バイオインクの粘度を増加させ、バイオプリンティングの前に細胞の沈降を減少させるための添加剤をさらに含む。適切な添加剤の例としては、ヒドロゲルおよびヒアルロン酸が挙げられる。
【0026】
本明細書で使用される場合、「バイオプリンティング（ｂｉｏ－ｐｒｉｎｔｉｎｇ）」、「バイオプリンティングされた（ｂｉｏ－ｐｒｉｎｔｅｄ）」、「バイオプリンティングの（ｂｉｏ－ｐｒｉｎｔｉｎｇ）」、または「バイオプリンティングによる（ｂｉｏ－ｐｒｉｎｔｅｄ）」は、自動化または半自動化された、コンピューター制御による三次元プロトタイピング装置（例えばバイオプリンター）と互換性のある方法論によって、細胞（例えば、細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁液、細胞濃縮液、多細胞凝集体、多細胞体など）の三次元の正確な堆積を利用することを意味する。この場合、これはロボットによる液体の操作ではなく、押し出しまたは付加製造によるバイオプリンティングを指す。細胞を含むバイオインクの正確な堆積のための押し出しバイオプリンティングが可能な任意の適切なバイオプリンターを、本発明のバイオプリンティングに利用することができる。バイオプリンターは、例えば、細胞のみとして、または、細胞の生存に適合性を有するヒドロゲル、生物学的マトリックスまたは他の化合物を含み得る材料内に懸濁された細胞として、細胞が押し出される押し出しバイオプリンターであり得る。適切なバイオプリンターの例としては、Ｏｒｇａｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のＮｏｖｏｇｅｎ Ｂｉｏ－ｐｒｉｎｔｅｒ（登録商標）が挙げられる。本明細書で使用される場合、バイオプリンティングされた腎臓組織は、バイオプリンティングのプロセスを通じて調製された腎臓オルガノイドを指し、「バイオプリンティングされた腎臓組織」および「バイオプリンティングされた腎臓オルガノイド」という用語は交換可能に使用され得る。
【0027】
「分化する」、「分化している（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ）」および「分化した（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）」という用語は、発達経路の早期または初期の段階から、発達経路の後期またはより成熟した段階への細胞の移行のことを指す。この文脈において、「分化した」とは、細胞が完全に分化し、発達経路または他の発達経路に沿ってさらに移行するための、多能性または能力を失ったことを意味または示唆しないことが理解されよう。分化は細胞分裂を伴い得る。
【0028】
本明細書で使用される場合、「押し出しバイオプリンティング」という用語は、自動化または半自動化された、コンピューター支援による三次元プロトタイピング装置（例えばバイオプリンター）によって、細胞（例えば、細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁液、細胞濃度、多細胞凝集体、多細胞体など）の三次元の正確な押し出しを利用することを指す。押し出しバイオプリンティングでは、細胞が押し出されるときに細い先端（チップ）の動きを導入することにより、細胞凝集体の形状、細胞数、細胞密度、および最終的な組織の高さ（厚さ）を制御する。押し出しプロセス中の押し出しポートの動作をスクリプト化することにより、手作業では制御したり少なくとも正確に再現したりすることができない態様で、バイオインクを一定の距離で、特定の構成で、広げることができる。所定の細胞押し出し速度（比率）で先端の動作の量を増やすことにより、ユーザーは、細胞がより大きな表面領域に広がり、続いて凝集するときに、様々な細胞密度、形状、および厚さを有するバイオプリンティングされた組織を作製できる。
【0029】
本明細書で使用される場合、１つの細胞または複数の細胞、またはバイオインク（プリンティングされたバイオインクを含む）に関して、「誘導する」、「誘導すること（ｉｎｄｕｃｉｎｇ）」、「誘導される（ｉｎｄｕｃｅｄ）」および「誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語は、１つの細胞または複数の細胞またはバイオインク（プリンティングされたバイオインクを含む）の、分化、発達または成熟を促進することを指す。例えば、誘導は、１つの細胞または複数の細胞またはバイオインク（プリンティングされたバイオインクを含む）を、デフォルトの遺伝子型および／または表現型から、異なるまたは非デフォルトの遺伝子型および／または表現型に変化させる時間および条件において処理することを含むことができる。細胞または複数の細胞またはバイオインク（プリンティングされたバイオインクを含む）の分化、発達または成熟を促進してバイオプリンティングされた腎臓組織を形成するという文脈において、これは、１つの細胞または複数の細胞において、腎臓組織に関連する１つ以上のマーカーを発現させること、あるいは、元の細胞の同一性とは異なる、腎臓組織に関連する１つ以上のマーカーを発現する、例えば、遺伝子型が異なる（ＰＣＲまたはマイクロアレイなどの遺伝子分析によって測定される遺伝子発現の変化を有する）および／または表現型が異なる（タンパク質の形態、機能および／または発現の変化を有する）、子孫細胞に分裂させること、を含む。一例では、「誘導」は、１つ以上のネフロン前駆細胞の、１つ以上の連結セグメント、遠位尿細管（ＤＣＴ）細胞、遠位尿細管（ＤＳＴ）細胞、近位尿細管（ＰＣＴ）および近位尿細管（ＰＳＴ）セグメント１、２および３、ＰＣＴおよびＰＳＴ細胞、有足細胞、糸球体内皮細胞、上昇ヘンレループおよび／もしくは下降ヘンレループなどのネフロン上皮への、分化、発達または成熟を促進することを包含する。一例では、「誘導」は、ＳＬＣ１２Ａ１、ＣＤＨ１、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢのうちの１つ以上の発現の増加を引き起こすことが包含される。誘導のステップは、腎臓組織を形成するのに十分な時間、バイオプリンティングされたバイオインクを特定の成長因子（例えば、ＦＧＦ－９）と接触させることを含み得る。いくつかの例において、誘導のステップはまた、バイオインクがバイオプリンティングされ、さらに培養される前に、十分な時間、バイオインクを特定の成長因子（例えば、ＣＨＩＲ）と接触させることを含み得る。
【0030】
本明細書で使用される場合、文脈上別段の必要がある場合を除いて、「高さ」という用語は、組織の高さまたはマイクロマスの高さを意味する。一例では、「バイオプリンティングされた腎臓組織の高さ」に関して使用される「高さ」という用語は、組織が堆積する表面からの組織の高さを意味し、最終的な組織の高さを指す。別の例では、「高さ」という用語は、「バイオプリンティングされたバイオインクの層の高さ」に関して使用され、層内の細胞塊またはマイクロマスの高さを意味する。さらに別の例では、「の高さ」という用語は、「バイオインクが約Ｘμｍの高さの層にバイオプリンティングされる」ことを指定するために使用され、層内の細胞塊またはマイクロマスがＸμｍの高さであることを意味する。バイオインクが添加剤、追加の化合物または材料（支持材料、非細胞材料、押し出し化合物または添加剤など）をさらに含む場合、バイオプリンティングされたバイオインクの層の高さは、細胞塊またはマイクロマスの高さであり、バイオインク自体の高さではない。測定される高さは、組織が堆積する表面からの沈降した細胞塊またはマイクロマスの層の高さである。
【0031】
「前駆細胞」は、自己複製の有無に関係なく、１つ以上の発達経路に沿って分化することができる細胞である。典型的には、前駆細胞は単能性または複能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）であり、少なくとも限定された自己再生が可能である。
【0032】
当技術分野で周知のように、細胞分化の段階または状態は、複数のマーカーのうちの１つの発現および／または非発現によって特徴付けられ得る。この文脈において、「マーカー」とは、細胞、細胞集団、細胞系、区画またはサブセットのゲノムによってコードされ、その発現または発現のパターンが発生を通して変化する、核酸またはタンパク質を意味する。核酸マーカーの発現は、核酸配列の増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）および核酸ハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイ、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション）などの、当技術分野で知られている任意の技術によって検出または測定され得るが、これらに限定されない。タンパク質マーカーの発現は、限定されないがフローサイトメトリー、免疫組織化学、イムノブロッティング、タンパク質アレイ、タンパク質プロファイリング（例えば、二次元ゲル電気泳動）などの、当技術分野で公知の任意の技術によって検出または測定し得る。
【0033】
本明細書で使用される場合、「ネフロン前駆細胞」は、後腎間葉に由来する前駆細胞であり、初期間葉から上皮への移行を介して、限定されないが、連結セグメント、遠位尿細管（ＤＣＴ）細胞、遠位尿細管（ＤＳＴ）細胞、近位尿細管および近位尿細管セグメント１、２、３（ＰＣＴ／ＰＳＴ）、ＰＣＴおよびＰＳＴ細胞、有足細胞、糸球体内皮細胞などのネフロン上皮、上昇ヘンレ係蹄および／または下降ヘンレ係蹄などの、すべてのネフロンセグメント（集合管を除く）に分化できる前駆細胞である。ネフロン前駆細胞は自己複製も可能である。
【0034】
後腎間葉（ＭＭ）の特徴的または代表的なマーカーの非限定的な例としては、ＷＴ１、ＳＡＬＬ１、ＧＤＮＦおよび／またはＨＯＸＤ１１が挙げられるが、これらに限定されない。ネフロン前駆細胞の特徴的または代表的なマーカーの非限定的な例としては、ＷＴ１、ＳＩＸ１、ＳＩＸ２、ＣＩＴＥＤ１、ＰＡＸ２、ＧＤＮＦ、ＳＡＬＬ１、ＯＳＲ１およびＨＯＸＤ１１が挙げられるが、これらに限定されない。
【0035】
「尿管上皮前駆細胞」とは、中腎管またはその派生する尿管芽に由来する、それから得られる、またはそれらを始原とする、腎臓組織および／または集合管などの構造に発達することができる上皮前駆細胞を意味する。
【0036】
尿管上皮前駆細胞の特徴的または代表的なマーカーの非限定的な例としては、ＷＮＴ９Ｂ、ＲＥＴ、ＧＡＴＡ３、ＣＡＬＢ１、Ｅ－カドヘリンおよびＰＡＸ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【0037】
前述のように、ネフロン前駆細胞および尿管上皮前駆細胞は、ＦＧＦ９の単独の存在下で、または、レチノイン酸（ＲＡ）のアゴニストまたはアナログであるＢＭＰ７、ＡＧＮ１９３１０９および／またはＦＧＦ２０、好ましくはヘパリンなどのＲＡアンタゴニストなどの１つ以上の薬剤との組み合わせで、中間中胚葉（ＩＭ）細胞から分化する。
【0038】
「中間中胚葉（ＩＭ）」とは、最終的な中胚葉から生じる胚性中胚葉細胞を意味し、それは後部原始線条に由来し、最終的には尿管や腎臓、性腺などの他の組織を含む泌尿生殖器系に発達する。中間中胚葉の特徴的または代表的なマーカーの非限定的な例としては、ＰＡＸ２、ＯＳＲ１および／またはＬＨＸ１が挙げられる。
【0039】
ＩＭ細胞の製造は、該ＩＭ細胞が、他の細胞型（最終的な中胚葉など）が存在しない、純粋なまたは均質なＩＭ細胞の集団であることを意味するものではないことも理解されよう。したがって、「ＩＭ細胞」または「ＩＭ細胞の集団」というときは、細胞または細胞集団がＩＭ細胞を含むことを意味する。適切には、本発明によれば、ＩＭ細胞は、以下でより詳細に説明されるように、後部原始線条細胞をＩＭ細胞への分化を促進する１つ以上の薬剤と接触させることによって製造される。
【0040】
好ましくは、ＩＭ細胞は、後部原始線条細胞を、後部原始線条細胞のＩＭ細胞への分化を促進する１つ以上の薬剤と接触させることによって製造される。
【0041】
「原始線条（ＰＰＳ）」とは、哺乳動物の胚発生の初期段階で胞胚に形成される原始線条構造の後端の細胞、または機能的および／または表現型的に対応する細胞から得られる細胞を意味する。後部原始線条は、左右対称を確立し、原腸陥入の部位を決定し、胚葉形成を開始する。通常、後部原始線条は中胚葉の前駆細胞（すなわち推定中胚葉）であり、前部原始線条は内胚葉の前駆細胞（すなわち推定内胚葉）である。後部原始線条の特徴的または代表的なマーカーの非限定的な例としては、ブラキュリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）（Ｔ）が挙げられる。前部原始線条の特徴的または代表的なマーカーの非限定的な例は、ＳＯＸ１７である。ＭＩＸＬ１は、後部および前部原始線条の両方で発現し得る。
【0042】
後部原始線条細胞の製造は、該後部原始線条細胞が、他の細胞型が存在しない後部原始線条細胞の純粋なまたは均質な集団であることを意味するものではないことも理解されよう。したがって、「後部原始線条細胞」または「後部原始線条細胞の集団」というときは、細胞または細胞集団が後部原始線条細胞を含むことを意味する。
【0043】
「ヒト多能性幹細胞」および「ｈＰＳＣ」という用語は、ヒト組織に由来する、それから入手できる、またはそれを始原とする、多能性を示す細胞を指す。ｈＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞であり得る。
【0044】
ヒト多能性幹細胞は、内部細胞塊に由来するものであり得、または、多くの胎児または成体体細胞型から、Ｙａｍａｎａｋａ因子を使用して再プログラムしたものでもあり得る。ｈＰＳＣの生成は、体細胞の核移植を使用しても実現し得る。
【0045】
「ヒト胚性幹細胞」、「ｈＥＳ細胞」および「ｈＥＳＣ」という用語は、自己複製し、多能性または全能性であり、成熟動物に存在する細胞型のすべてを製造する能力を有する、ヒト胚または胚盤胞に由来するか、それから得られるか、またはそれを始原とする細胞を指す。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、例えば、ヒトのインビボ移植前胚、インビトロ受精胚、または胚盤胞期に増殖した一細胞ヒト胚から得られたヒト胚盤胞から単離することができる。
【0046】
「人工多能性幹細胞」および「ｉＰＳＣ」という用語は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣの好ましい組み合わせを含む、転写因子などの外因性遺伝子の発現を通じて多能性状態に再プログラムされた任意のタイプの、ヒト成体細胞から誘導されうる、取得され得る、または由来する細胞を指す。ｈｉＰＳＣは、ｈＥＳＣと同等の多能性のレベルを示すが、分化および細胞送達の前に遺伝子修正を同時に行うか否かにかかわらず、自家療法の患者から導き出すことができる。
【0047】
より広義には、本明細書に開示される方法は、任意の患者に由来する任意の多能性幹細胞、または遺伝子編集を使用して変異モデルを生成するように後で改変されたｈＰＳＣ、または遺伝子編集を使用して修正された変異ｈＰＳＣに適用することができる。遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、またはＺＦヌクレアーゼ技術を介して行うことができる。
【0048】
本明細書で使用される場合、「組織」は細胞の集合体を意味する。いくつかの実施形態では、組織内の細胞は、凝集または融合している。
【0049】
本明細書で使用される場合、「足場」は、ポリマー足場および多孔性ヒドロゲルなどの合成足場、予め形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および脱細胞化組織などの非合成足場、ならびに、人工組織の物理的構造に不可欠であり、組織の損傷／破壊なしに組織から除去することができない、任意の他のタイプの予め形成された足場を指す。さらなる実施形態では、脱細胞化組織足場としては、任意の方法で培養細胞によって生成された脱細胞化天然組織または脱細胞化細胞材料が挙げられ、例えば、細胞を死なせるかまたは脱細胞化させ、生存期間中に生成された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を残した細胞層である。
【0050】
本明細書で使用される場合、「個体」は、ヒト、霊長類、類人猿、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウマなどを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物種の生物である。対象は、生死を問わない、あらゆる哺乳動物種とすることができる。
【0051】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」は、記載された値の±１０％を意味する。例えば、約１０は９～１１を包含する。
【0052】
「および／または」という用語、例えば「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解され、両方の意味またはいずれかの意味を明示的にサポートすると解釈するものとする。
【0053】
バイオプリンティングされた腎臓組織
本明細書に開示されるのは、バイオインクを含むバイオプリンティングされた腎臓組織であり、バイオインクは複数の細胞を含み、バイオインクは約１５０μｍ以下の高さの層にバイオプリンティングされ、バイオプリンティングされたバイオインクは誘導されて腎臓組織を形成する。一実施形態では、バイオインクは、約１５μｍ～約１５０μｍから選択される層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２５μｍの高さ～約１００μｍの高さから選択される層にバイオプリンティングされる。好ましい実施形態では、バイオインクは、約５０μｍ以下の高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約１５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約３０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約３５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約４０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約５０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約６０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約７０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約８０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約９０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約１００μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。
本明細書に開示されるのは、バイオインクを含むバイオプリンティングされた腎臓組織であり、バイオインクは複数の細胞を含み、バイオインクは約１５０μｍ以下の高さの層にバイオプリンティングされ、バイオプリンティングされたバイオインクは誘導されて腎臓組織を形成する。一実施形態では、バイオインクは、約１５μｍ～約１５０μｍから選択される層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２５μｍの高さ～約１００μｍの高さから選択される層にバイオプリンティングされる。好ましい実施形態では、バイオインクは、約５０μｍ以下の高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約１５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約３０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約３５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約４０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約５０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約６０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約７０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約８０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約９０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約１００μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。
【0054】
一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織の高さは、約１５０μｍ以下である。言い換えれば、バイオプリンティングされたバイオインクが誘導されて腎臓組織が形成された後の最終的なバイオプリンティングされた腎臓組織の高さは、約１５０μｍ以下である。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織の高さは、約５０μｍ～約１５０μｍである。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織の高さは、約１００μｍ～約１５０μｍである。
【0055】
一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約５，０００～約１００，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約１０，０００～約５０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約５，０００～約２０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約１０，０００～約１５，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約５，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約１０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約１５，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約２０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約３０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約４０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約５０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約６０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約７０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約８０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約９０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約１００，０００個の細胞を含む。
【0056】
好ましい実施形態によれば、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約１０，０００個の細胞～約２０，０００個の細胞／ｍｍ２を含み、プリンティング時に約５０μｍ以下の高さを有するバイオインクのバイオプリンティング層を含む。さらに好ましい実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、１ｍｍ２当たり約２０，０００個の細胞を含み、プリンティングされたときに約４０μｍ以下の高さを有する、バイオインクのバイオプリンティングされた層を含む。さらに好ましい実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約１４，０００個の細胞／ｍｍ２を含み、プリンティング時に約３０μｍ以下の高さを有する、バイオインクのバイオプリンティングされた層を含む。さらに好ましい実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約１１，０００個の細胞／ｍｍ２を含み、プリンティング時に約２５μｍ以下の高さを有する、バイオインクのバイオプリンティングされた層を含む。さらに好ましい実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、１ｍｍ２当たり約１０，０００個の細胞を含み、プリンティングされたときに約２０μｍ以下の高さを有する、バイオインクのバイオプリンティングされた層を含む。
【0057】
一実施形態では、バイオインクは、約１０，０００個の細胞／μｌ～約４００，０００個の細胞／μｌを含む。一実施形態では、バイオインクは、約１０，０００個の細胞／μｌ～約１００，０００個の細胞／μｌを含む。一実施形態では、バイオインクは、約１００，０００個の細胞／μｌ～約４００，０００個の細胞／μｌを含む。一実施形態では、バイオインクは、約５０，０００個の細胞／μｌ～約２００，０００個の細胞／μｌを含む。一実施形態では、バイオインクは、約１０，０００個の細胞／μｌ、約３０，０００個の細胞／μｌ、約４０，０００個の細胞／μｌ、約５０，０００個の細胞／μｌ、約６０，０００個の細胞／μｌ、約７０，０００個の細胞／μｌ、約８０，０００個の細胞／μｌ、約９０，０００個の細胞／μｌ、約１００，０００個の細胞／μｌ、約１５０，０００個の細胞／μｌ、約２００，０００個の細胞／μｌ、約２５０，０００個の細胞／μｌ、約３００，０００個の細胞／μｌ、または約４００，０００個の細胞／μｌを含む。好ましい実施形態では、バイオインクは約２００，０００個の細胞／μｌを含む。
【0058】
いくつかの実施形態では、バイオインクは、部分的に分化した細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、完全に分化した細胞を含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、バイオインクは、限定されないが、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などのヒト幹細胞（ＨＳＣ）から分化した細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、限定されないが、後部原始線条細胞などの原始線条細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、中間中胚葉（ＩＭ）細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、後腎間葉（ＭＭ）細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、腎管細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、限定されないが、ネフロン前駆細胞、尿管上皮前駆細胞、またはそれらの組み合わせなどの腎前駆細胞を含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、患者由来の細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、遺伝子編集された細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、遺伝子編集された細胞でもある患者由来の細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、レポーター株からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、遺伝子編集されたレポーター株細胞を含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、正常な健常細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、腎臓病患者の細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、患者の細胞と健常細胞との組み合わせを含む。
【0062】
一例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ネフロン前駆細胞などの腎前駆細胞の培養増殖集団に由来する。
【0063】
別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、培養物の増殖および／または製造に使用される方法によって特徴付けられる、ＭＭ細胞またはＩＭ細胞の培養増殖集団に由来する。
【0064】
一例では、腎前駆細胞は、後部原始線条細胞を、ＩＭ細胞またはＭＭ細胞などの腎前駆細胞への後部原始線条細胞の分化を促進する１つ以上の薬剤と接触させることによって製造される。一例では、腎前駆細胞を製造する方法は、幹細胞の集団を、Ｗｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む細胞培養培地中で約２～５日間培養し、続いて細胞を、ＦＧＦ９などのＦＧＦを含む細胞培養培地中で約２～５日間培養することを含む。一例では、腎前駆細胞を製造する方法は、幹細胞の集団を、Ｗｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む細胞培養培地中で約２～５日間培養し、続いて細胞を、ＦＧＦ９などのＦＧＦを含む細胞培養培地中で約３～４日間培養することを含む。この例では、細胞を７日以上培養し、その後、腎前駆細胞を解離させ得る。この例では、腎前駆細胞は、１０日目～１３日目頃にプリンティングされる。別の例では、腎前駆細胞を製造する方法は、幹細胞の集団を、Ｗｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む細胞培養培地中で約２～５日間培養し、続いて細胞を、ＦＧＦ９などのＦＧＦを含む細胞培養培地中で約３～４日間培養することを含む。別の例では、腎前駆細胞は、腎前駆細胞がプリンティングされる約１０日～１４日前まで、ネフロン前駆細胞維持培地で培養され得る。
【0065】
別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、培養増殖および／または製造に使用される方法によって特徴付けられる、本明細書に記載の方法に従うバイオプリンティングされたＩＭ細胞の培養増殖集団に由来する。
【0066】
したがって、一例では、ＩＭ細胞を製造する方法は、幹細胞の集団を、Ｗｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む細胞培養培地中で約３～５日間培養し、続いて細胞を、ＦＧＦ９などのＦＧＦを含む細胞培養培地中で約２～５日間培養することを含む。一例では、ＩＭ細胞を製造する方法は、幹細胞の集団を、Ｗｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む細胞培養培地中で約３～５日間培養し、続いて細胞を、ＦＧＦ９などのＦＧＦを含む培地中で約３～５日間細胞を培養することを含む。これらの例では、細胞は合計７日間培養でき、その後ＩＭ細胞を解離させる。本開示の文脈における「Ｗｎｔ／β－カテニンアゴニスト」という用語は、標準的なＷｎｔシグナル伝達経路の文脈においては、ＧＳＫ３（例えばＧＳＫ３－β）を阻害する分子を指すものとして使用されるが、非標準的なＷｎｔシグナル伝達経路の他の文脈においては好ましくない。Ｗｎｔβ－カテニンアゴニストの例としては、組換えＷＮＴ３Ａ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）、ＬｉＣｌ ＳＢ－２１６７６３、ＣＡＳ ８５３２２０－５２－７、およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙやＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓなどの業者から市販されている他のＷｎｔ／β－カテニンアゴニストが挙げられる
【0067】
一例では、ＩＭ細胞は、幹細胞を７日間培養することによって製造され、ここで、３～５日目は、上記の高濃度のＣＨＩＲを含む細胞培養培地で幹細胞を培養することを含み、残りの日は、上記の濃度のＦＧＦを含む細胞培養培地で細胞を培養することを含む。例えば、ＩＭ細胞は、幹細胞を７日間培養することによって製造することができ、ここで、３～５日は、少なくとも３μＭのＣＨＩＲを含む細胞培養培地で幹細胞を培養することを含み、残りの日は、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む細胞培養培地で細胞を培養することを含む。
【0068】
別の例では、幹細胞を最大１３日間培養することによってＩＭ細胞を製造することができ、その後、ＩＭ細胞を解離させる。別の例では、幹細胞を８日間培養することによってＩＭ細胞を製造することができる。別の例では、幹細胞を９日間培養することによってＩＭ細胞を製造することができる。別の例では、幹細胞を１０日間培養することによってＩＭ細胞を製造することができる。別の例では、幹細胞を１１日間培養することによってＩＭ細胞を製造することができる。別の例では、幹細胞を１２日間培養することによってＩＭ細胞を製造することができる。別の例では、幹細胞を１３日間培養することによってＩＭ細胞を製造することができる。別の例では、幹細胞を１４日間培養することによってＩＭ細胞を製造することができる。別の例では、幹細胞を１５日間培養することによってＩＭ細胞を製造することができる。別の例では、幹細胞を１０日以上培養することによってＩＭ細胞を製造することができる。これらの例のそれぞれにおいて、３～５日目は、少なくとも３μＭのＣＨＩＲを含む細胞培養培地で幹細胞を培養することを含み、残りの日は、ＦＧＦ９を含む細胞培養培地で細胞を培養することを含み得る。例えば、３日目～５日目は、３μＭ～８μＭのＣＨＩＲを含む細胞培養培地で幹細胞を培養することを含み、残りの日は、ＦＧＦ９を含む細胞培養培地で細胞を培養することを含み得る。
【0069】
一例では、細胞は、ＦＧＦを含む細胞培養培地で培養される前に、３～８μＭのＷｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む細胞培養培地で培養される。別の例では、細胞は、ＦＧＦを含む細胞培養培地で培養される前に、４μＭのＷｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む細胞培養培地で培養される。別の例では、細胞は、ＦＧＦを含む細胞培養培地で培養される前に、５μＭのＷｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む細胞培養培地で培養される。別の例では、細胞は、ＦＧＦを含む細胞培養培地で培養される前に、６μＭのＷｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む細胞培養培地で培養される。別の例では、細胞は、ＦＧＦを含む細胞培養培地で培養される前に、７μＭのＷｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む細胞培養培地で培養される。別の例では、細胞は、ＦＧＦを含む細胞培養培地で培養される前に、８μＭのＷｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む細胞培養培地で培養される。これらの例では、Ｗｎｔ／β－カテニンアゴニストはＣＨＩＲとすることができる。例えば、細胞は、ＦＧＦを含む細胞培養培地で培養される前に、３～８μＭのＣＨＩＲを含む細胞培養培地で培養され得る。
【0070】
一例では、ＩＭ細胞培養培地は、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。別の例では、細胞培養培地は、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。別の例では、細胞培養培地は、少なくとも１５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。別の例では、細胞培養培地は、少なくとも２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。別の例では、細胞培養培地は、少なくとも３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。別の例では、細胞培養培地は、少なくとも３５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。別の例では、細胞培養培地は、少なくとも４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。別の例では、細胞培養培地は、少なくとも５００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。別の例では、細胞培養培地は、５０ｎｇ～４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。別の例では、細胞培養培地は、５０ｎｇ～３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。別の例では、細胞培養培地は、５０ｎｇ～２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。別の例では、細胞培養培地は、１００ｎｇ～２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む。
【0071】
別の例では、上記のレベルのＦＧＦ９が、ＦＧＦ２で代用される。例えば、ＩＭ細胞培養培地は、５０ｎｇ～４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含むことができる。別の例では、細胞培養培地は、５０ｎｇ～３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む。別の例では、細胞培養培地は、５０ｎｇ～２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む。別の例では、細胞培養培地は、１００ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む。
【0072】
別の例では、上記のレベルのＦＧＦ９が、ＦＧＦ２０で代用される。例えば、ＩＭ細胞培養培地は、５０ｎｇ～４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含むことができる。別の例では、細胞培養培地は、５０ｎｇ～３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含む。別の例では、細胞培養培地は、５０ｎｇ～２５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含む。別の例では、細胞培養培地は、１００ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２０を含む。
【0073】
一例では、ＦＧＦを含むＩＭ細胞培養培地はまた、ヘパリンも含む。一例では、細胞培養培地は、０．５μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。別の例では、細胞培養培地は、１μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。別の例では、細胞培養培地は、１．５μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。別の例では、細胞培養培地は２μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。別の例では、細胞培養培地は、０．５μｇ／ｍｌ～２μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。別の例では、細胞培養培地は、０．５μｇ～１．５μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。別の例では、細胞培養培地は、０．８μｇ／ｍｌ～１．２μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。
【0074】
一例では、バイオインクをＦＧＦ－９と接触させることにより、バイオインクを誘導し、腎臓組織を形成させる。別の例では、バイオインクをＦＧＦ－９と５日間接触させることにより、バイオインクを誘導し、腎臓組織を形成させる。いくつかの例において、複数の細胞を、ＣＨＩＲを含む細胞培養培地と短時間接触させ、その後、バイオプリンティングし、さらに培養し得る。例えば、複数の細胞を、３～８μＭのＣＨＩＲを含む細胞培養培地と１～２時間接触させ、その後、バイオプリンティングし、さらに培養することができる。別の例では、複数の細胞を、５μＭのＣＨＩＲを含む細胞培養培地と１時間接触させ、その後、バイオプリンティングし、さらに培養することができる。
【0075】
他の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織を生成するために使用されるＩＭまたはＭＭ細胞は、異なるまたはさらなる成分を含む培地で培養することができる。細胞培養における例示的な成分およびそれらの使用のためのタイミングを以下で論じる。
【0076】
一例では、細胞培養培地は、Ｙ－２７６３２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫｉ）を含むことができる。この例では、幹細胞は、ＲＯＣＫｉを含む細胞培養培地で２４時間培養された後、少なくとも４μＭのＣＨＩＲを含む細胞培養培地で約３～４日間培養される。この例では、細胞はその後、ＦＧＦを含む細胞培養培地でさらに３～４日間培養することができる。一例では、細胞培養培地は、８μＭのＲＯＣＫｉを含むことができる。別の例では、細胞培養培地は、１０μＭのＲＯＣＫｉを含むことができる。別の例では、細胞培養培地は、１２μＭのＲＯＣＫｉを含むことができる。別の例では、細胞培養培地は、８μＭ～１２μＭのＲＯＣＫｉを含むことができる。
【0077】
上記の例では、ＲＯＣＫｉで２４時間、および少なくとも４μＭのＣＨＩＲで約３～４日間培養した後、ＦＧＦ９、ならびに低濃度（例えば３μＭ未満）のＣＨＩＲ、上記の濃度のヘパリン、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）およびメチルセルロース（ＭＣ）などの１つ以上またはすべてのＷｎｔ／β－カテニンアゴニストを含む培地で細胞を培養することができる。この例では、ＩＭ細胞培養培地は、少なくとも０．０５％のＰＶＡを含むことができる。別の例では、細胞培養培地は、０．１％のＰＶＡを含む。別の例では、細胞培養培地は、０．１５％のＰＶＡを含む。別の例では、細胞培養培地は、０．１％～０．１５％のＰＶＡを含む。一例では、細胞培養培地は、少なくとも０．０５％のＭＣを含むことができる。別の例では、細胞培養培地は、０．１％のＭＣを含む。別の例では、細胞培養培地は、０．１５％のＭＣを含む。別の例では、細胞培養培地は、０．１％～０．１５％のＭＣを含む。
【0078】
一例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、上記の方法を使用してＩＭ細胞を製造し、ＩＭ細胞を分離し、バイオインクを調製し、バイオインクをバイオプリンティングし、次いでバイオインクを、すなわち以下に論じるバイオプリンティングされた腎臓組織を生成する方法におけるバイオプリンティングされた細胞を、さらに培養することによって得られる。例えば、ＩＭ細胞は、上記の例示された方法を使用して製造され、解離され、次にバイオプリンティングされ、腎臓組織を形成することができる。例では、バイオプリンティングは、担持されているフィルター上の培養物において実施することができる。例えば、ＩＭ細胞は、上記の例示された方法を使用して製造され、解離され、次にバイオプリンティング後の次の期間（例えば、１２日間）、トランスウェルＴＭフィルター上で培養されることができる。
【0079】
一例では、複数の細胞は、標的腎細胞前駆細胞を製造するのに十分な条件下および期間で培養した後、ＥＤＴＡを使用して解離させることができる。一例では、ＩＭ細胞は、ＥＤＴＡを使用して解離させることができる。別の例では、細胞は、トリプシンまたはＴｒｙｐＬＥまたはアキュターゼまたはコラゲナーゼを使用して解離させることができる。一例では、細胞は、バイオプリンティング後少なくとも１２日間培養される。別の例では、細胞は、バイオプリンティング後少なくとも１３日間培養される。別の例では、細胞は、バイオプリンティング後少なくとも１４日間培養される。別の例では、細胞は、バイオプリンティング後少なくとも１５日間培養される。別の例では、細胞は、バイオプリンティング後少なくとも２０日間培養される。別の例では、細胞は、バイオプリンティング後少なくとも２５日間培養される。別の例では、細胞は、バイオプリンティング後少なくとも３５日間培養される。
【0080】
一例では、複数の細胞は、標的腎細胞前駆細胞を製造するのに十分な培養期間の後に解離される。この例では、解離した細胞をバイオプリンティングして、バイオプリンティングされた腎臓組織を製造する。一例では、ＩＭ細胞は、培養（ｄ７）で７日後に解離され、次いでバイオプリンティングされ、バイオプリンティングされた腎臓組織を製造する。一例では、細胞は、ＦＧＦを含む細胞培養培地で培養される。例えば、細胞は、解離および／またはバイオプリンティングの後に、上記で参照した濃度のＦＧＦ９、ＦＧＦ２またはＦＧＦ２０を含む細胞培養培地で培養される。一例では、細胞は、解離および／またはバイオプリンティングの後に、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む細胞培養培地で培養される。別の例では、細胞は、解離および／またはバイオプリンティングの後に、２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を含む細胞培養培地で培養される。これらの例では、細胞培養培地はヘパリンを含むこともできる。例えば、細胞培養培地は、解離および／またはバイオプリンティングの後に、ＦＧＦ９および１μｇ／ｍｌのヘパリンを含むことができる。これらの例では、細胞は、解離および／またはバイオプリンティングの後に、ＦＧＦおよびヘパリンを含む細胞培養培地中で４～６日間培養することができる。一例では、細胞は、解離および／またはバイオプリンティングの後に、ＦＧＦおよびヘパリンを含む細胞培養培地中で５日間培養することができる。
【0081】
一例では、ＦＧＦは、解離および／またはバイオプリンティングの４～６日後に、細胞培養培地から除去される。別の例では、ＦＧＦは、解離および／またはバイオプリンティングの５日後に、細胞培養培地から除去される。一例では、解離および／またはバイオプリンティングの５日後、培養培地に成長因子は提供されない。
【0082】
一例では、解離および／またはバイオプリンティングの後に使用される細胞培養培地はまた、レチノイン酸を含むこともできる。一例では、全トランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）が、解離および／またはバイオプリンティングの後に、細胞培養培地に添加される。一例では、少なくとも０．０７μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。一例では、少なくとも０．１μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。一例では、少なくとも０．２μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。一例では、少なくとも０．５μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。
【0083】
別の例では、少なくとも１．５μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。一例では、少なくとも１．８μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。一例では、少なくとも２．０μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。別の例では、少なくとも２．５μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。別の例では、１．５μＭ～１０μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。別の例では、１．５μＭ～５μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。別の例では、２．０μＭ～８μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。別の例では、２．０μＭ～３μＭのレチノイン酸が、細胞培養培地に添加される。
【0084】
一例では、レチノイン酸は、解離および／またはバイオプリンティングの４日後に細胞培養培地に添加される。別の例では、レチノイン酸は、解離および／またはバイオプリンティングの５日後に細胞培養培地に添加される。別の例では、レチノイン酸は、解離および／またはバイオプリンティングの４～６日後に細胞培養培地に添加される。
【0085】
本開示に含まれ、本明細書に開示される方法に従って製造されたバイオプリンティングされた腎臓組織は、培養日数に基づいて記載することができる。培養日数は、幹細胞からＩＭ細胞への製造のための日数（Ｘ）と、（バイオプリンティングされた）ＩＭ細胞から腎臓組織への形成のための日数（Ｙ）と、を含む２つの要素に分けることができる。一例では、幹細胞からのＩＭ細胞の製造と、ＩＭ細胞からのバイオプリンティングされた腎臓組織の製造とを区別するステップは、ＩＭ細胞の解離である。幹細胞からＩＭ細胞を製造するための培養日数と、ＩＭ細胞からバイオプリンティングされた腎臓組織を形成するための日数と、を表す１つの方法は、日（ｄ）Ｘ＋Ｙである（例えば、ｄ７＋１２は、７日間の幹細胞からのＩＭ細胞の製造、それに続くＩＭ細胞の解離およびバイオプリンティングと、１２日間のＩＭ細胞からの腎臓組織形成の「誘導」（すなわち、Ｙ＝培養におけるバイオプリンティングされた腎臓組織としての日数）を表す）。
【0086】
一例では、培養日数は、幹細胞からのＩＭ細胞の製造については７日とし、（バイオプリンティングされた）ＩＭ細胞からの腎臓組織の形成については４日～３０日以上（ｄ７＋４～ｄ７＋３０、プリンティング日はｄ７＋０）とすることができる。一例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋８～ｄ７＋２０の腎臓組織である。一例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋１０～ｄ７＋１５の腎臓組織である。一例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋１２の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋１４の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋１５の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋１６の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋１７の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋１８の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋１９の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋２０の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋２１の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋２２の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋２３の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋２４の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋２５の腎臓組織である。
【0087】
別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋３０の腎臓組織である。別の例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ｄ７＋１２～ｄ７＋３０である。上記の参照例では、幹細胞は、約８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間～約２８日間まで（すなわち、ｄ８＋Ｙ、ｄ９＋Ｙ、ｄ１０＋Ｙ、ｄ１１＋Ｙ、ｄ１２＋Ｙ、ｄ１３＋Ｙまたはｄ１４＋Ｙ～約ｄ２８＋Ｙ）培養することができる。
【0088】
別の実施形態によれば、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約２～約１００個のネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約２～約５０ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約２～約４５ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約３０ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約２０ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約１０ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、％ネフロン、％間質、および／または％血管系に関して特徴付けられる。「ネフロン」は、老廃物の除去および体液量の維持に主要な役割を果たす、腎臓の機能的な作業単位である。それらは、様々な方法を使用して、本明細書に開示されるバイオプリンティングされた腎臓組織において当業者によって識別およびカウントすることができる。例えば、ネフロンは、共焦点顕微鏡および免疫蛍光標識を使用して視覚化およびカウントできる（例えば、ＷＴ１＋糸球体、ＭＡＦＢ＋ＮＰＨＳ１＋有足細胞、ＨＮＦ４Ａ＋ＬＴＬ＋ＥＣＡＤ－近位尿細管、ＳＬＣ１２Ａ１＋ＥＣＡＤ＋遠位尿細管、およびＥＣＡＤ＋ＧＡＴＡ３＋集合管）。この実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、単一細胞ＲＮＡ配列決定、ＰＣＲベースの遺伝子発現分析、または免疫組織化学的方法を使用して、追加的にまたは代替的に特徴付けることができる。
【0089】
一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり０．２ｍｍ２超のネフロン組織の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり０．２ｍｍ２～１．５ｍｍ２のネフロン組織の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２５ｍｍ２、０．３ｍｍ２、０．４ｍｍ２、０．５ｍｍ２、０．６ｍｍ２、０．７ｍｍ２、０．８ｍｍ２、０．９ｍｍ２、１ｍｍ２、１．１ｍｍ２、１．２ｍｍ２、１．３ｍｍ２、１．４ｍｍ２、または１．５ｍｍ２のネフロン組織の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２ｍｍ２超の、ＭＡＦＢを発現する細胞の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２ｍｍ２～１．５ｍｍ２の、ＭＡＦＢを発現する細胞の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２５ｍｍ２、０．３ｍｍ２、０．４ｍｍ２、０．５ｍｍ２、０．６ｍｍ２、０．７ｍｍ２、０．８ｍｍ２、０．９ｍｍ２、１ｍｍ２、１．１ｍｍ２、１．２ｍｍ２、１．３ｍｍ２、１．４ｍｍ２、または１．５ｍｍ２の、ＭＡＦＢを発現する細胞の表面積を含む。
【0090】
一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、バイオプリンティングされた層全体にネフロンが均一に分布している。すなわち、先行技術で説明されているような、細胞のドットまたはブロブとして生成され、トランスウェルから１５０ｕＭを超える高さのドーム型構造を形成し、ネフロンを欠くパターン化されていない中央領域またはコアを有する、最適ではないコンフォメーションの、手作業で凝集されたオルガノイドまたはバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドとは対照的である。この実施形態は、非ネフロン組織のコアを有さない、多数の均一なネフロンの分布を含む、バイオプリンティングされた腎臓組織を説明する。例えば、バイオプリンティングされた腎臓は、バイオプリンティングされた層全体に、例えばＭＡＦＢを発現する細胞によって標識されるように、糸球体が均一に分布している。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、構造全体にわたってＳＬＣ１２Ａ１、ＣＤＨ１、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢのうちの１つ以上を発現する。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、過去に公表された方法（Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２６：５６４－５６８）すなわち、手作業で凝集した、または細胞のドットまたはブロブとして生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドと比較し、ＳＬＣ１２Ａ１、ＣＤＨ１、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢのうちの１つ以上の発現レベルの増加または上昇を示す。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、過去に公表された方法（Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２６：５６４－５６８）すなわち、手作業で凝集した、または細胞のドットまたはブロブとして生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドと比較し、ＳＬＣ３０Ａ１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＦＡＢＰ３、およびＳＵＬＴ１Ｅ１（近位尿細管成熟に関連する遺伝子）の１つ以上の発現の増加または高レベル、および／またはＳＰＰ１、ＪＡＧ１（初期未成熟尿細管に関連する遺伝子）のいずれかまたは両方の発現の減少を示す。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、過去に公表された方法（Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２６：５６４－５６８）すなわち、手作業で凝集した、または細胞のドットまたはブロブとして生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドと比較し、ＴＨＹ１、ＤＣＮ、ＳＯＸ１７、ＦＬＴ１およびＰＥＣＡＭのうちの１つ以上の発現が低いか全くないか、またはＴＨＹ１、ＤＣＮ、ＳＯＸ１７、ＦＬＴ１およびＰＥＣＡＭのうちの１つ以上の発現が減少していることを示す。つまり、上記の例では、高レベルおよび低レベルでの発現は、Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２６：５６４－５６８、Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１１：１６８１－１６９２、またはＴａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１６：１１８－１２７に記載される方法により培養された腎臓オルガノイドと比較したものである。この例では、高発現は少なくとも１．５倍高い。別の例では、高発現は少なくとも２倍高い。別の例では、高発現は少なくとも３倍高い。一例では、低発現は少なくとも１．５倍低い。別の例では、低発現は少なくとも２分の１である。別の例では、低発現は少なくとも３分の１である。
【0091】
発現レベルは、目的のマーカーに対する適切なプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応などの技術を使用して測定できる。例えば、細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写し、ＰＣＲおよび分析を行うことができる。
【0092】
本発明者らはまた、驚くべきことに、バイオプリンティングされた腎臓組織の「非ネフロン」組織においては、過去に公表された方法（Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２６：５６４－５６８）すなわち、手作業で凝集した、または細胞のドットまたはブロブとして生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドと比較し、ネフロン前駆体の同一性に関連する発現または遺伝子の増加を示すことを発見した。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、過去に公表された方法（Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２６：５６４－５６８）すなわち、手作業で凝集した、または細胞のドットまたはブロブとして生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドと比較し、ＨＯＸＡ１１、ＦＯＸＣ２、ＥＹＡ１、およびＳＩＸ２のうちの１つ以上の発現レベルの増加または上昇を示す。
【0093】
別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、生体適合性の足場をさらに含む。例えば、別の実施形態では、バイオインクは、生体適合性の足場にバイオプリンティングされる。つまり、バイオインクがプリンティングされる表面は生体適合性の足場である。一実施形態では、生体適合性の足場は、生分解性または生体吸収性である。別の実施形態では、生体適合性の足場はヒドロゲルである。別の実施形態では、足場は、１つ以上の薬剤（例えば生物学的活性剤）により機能付与され得る。例えば、生物学的活性剤（サイトカイン、ケモカイン、分化因子、シグナル伝達経路阻害剤など）は、例えば、その上にプリンティングされたバイオインク中の細胞のさらなる発達または分化を促進し得る。
【0094】
別の実施形態では、バイオインクは、１つ以上の生物学的活性剤をさらに含む。一例では、１つ以上の生物学的活性剤は、複数の細胞からの腎臓組織の誘導を促進する。別の実施形態では、バイオインクは、分化培地、バイオプリンティング培地、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオプリンティング培地は、修飾ヒドロゲルまたは官能化ヒドロゲルなどのヒドロゲル、またはマトリックス成分もしくは細胞外マトリックス成分の混合物を含む。別の実施形態では、バイオインクはヒアルロン酸を含む。一実施形態では、１つ以上の活性剤は、抗増殖剤、免疫抑制剤、血管新生促進化合物、抗体またはその断片もしくは部分、抗生物質または抗菌化合物、抗原またはエピトープ、アプタマー、バイオポリマー、炭水化物、細胞付着メディエーター（ＲＧＤなど）、サイトカイン、細胞毒性薬、薬物、酵素、成長因子または組換え成長因子ならびにその断片および変異体、ホルモン拮抗薬、ホルモン、免疫剤、脂質、金属、ナノ粒子、核酸類似体、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびマイクロＲＮＡ剤）、ヌクレオチド、栄養補助食品剤、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド、プロドラッグ、予防剤、タンパク質、小分子、治療剤、あるいはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0095】
他の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織はさらに、他のバイオプリンティングされたバイオインクに隣接して、またはそれに近接して配置された、本願明細書において上記したバイオインクを含み、それは、上記の１つ以上の薬剤または１つ以上の他の細胞型を任意選択的に含み得る。例えば、複数の細胞（および任意選択で１つ以上の薬剤）を含むバイオインクは、別のバイオプリンティングされたバイオインクに隣接するか、または近接するようにバイオプリンティングされ得る。例えば、複数の細胞（および任意選択で１つ以上の薬剤）を含むバイオインクは、（任意選択的に、１つ以上の薬剤および／または１つ以上の他の細胞型を含む）バイオプリンティングされたバイオインクのラインまたは層の上またはその隣（直接上または隣を含む）に、バイオプリンティングされ得る。例えば、バイオプリンティングされた腎臓組織を製造するための方法は、所定量の第１のバイオインクをバイオプリンティングすることと、所定量の第２のバイオインクを表面にプリンティングすることと、を含み、ここで、第１のバイオインクと第２のバイオインクとは異なる。一例では、第１のバイオインクは、第２のバイオインク内の複数の細胞とは異なる複数の細胞を含む。別の例では、第１のバイオインクは複数の細胞を含み、第２のバイオインクは、細胞を含まないが、例えば生物学的活性剤などの他の成分を含み得る。
【0096】
バイオプリンティングされた腎臓組織の製造方法
別の態様では、本発明は、バイオプリンティングされた腎臓組織の製造方法に関する。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織を製造するための方法は、所定量のバイオインクを表面にバイオプリンティングするステップであって、バイオインクが、複数の細胞を含み、バイオインクが、約１５０μｍ未満の高さの層にバイオプリンティングされる、ステップと、バイオプリンティングされた、所定量のバイオインクを誘導して、バイオプリンティングされた腎臓組織を形成するステップと、を含む。好ましくは、バイオインクは、約５０μｍ以下の高さの層にバイオプリンティングされる。
別の態様では、本発明は、バイオプリンティングされた腎臓組織の製造方法に関する。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織を製造するための方法は、所定量のバイオインクを表面にバイオプリンティングするステップであって、バイオインクが、複数の細胞を含み、バイオインクが、約１５０μｍ未満の高さの層にバイオプリンティングされる、ステップと、バイオプリンティングされた、所定量のバイオインクを誘導して、バイオプリンティングされた腎臓組織を形成するステップと、を含む。好ましくは、バイオインクは、約５０μｍ以下の高さの層にバイオプリンティングされる。
【0097】
一実施形態では、バイオプリンティングするステップにおいて、複数の細胞を含むバイオインクは、約１５０μｍ未満の高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約１５μｍ～約１５０μｍから選択される層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２５μｍの高さ～約１００μｍの高さから選択される層にバイオプリンティングされる。好ましい実施形態では、バイオインクは、高さ約５０μｍ以下の層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約１５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約３０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約３５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約４０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約５０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約６０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約７０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約８０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約９０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約１００μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。
【0098】
一実施形態では、バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約５，０００～約１００，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約１０，０００～約５０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約５，０００～約５０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約１０，０００～約４０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約１０，０００～約３０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約１０，０００～約２０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約３０，０００個以下の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約５，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約１０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティング層は、１ｍｍ２当たり約１５，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約２０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約３０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約４０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約５０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約６０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約７０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約８０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約９０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約１００，０００個の細胞を含む。
【0099】
好ましい実施形態によれば、バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約１０，０００個の細胞～約２０，０００個の細胞を含み、約５０μｍ以下の高さを有する。さらに好ましい実施形態では、バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約２０，０００個の細胞を含み、約４０μｍ以下の高さを有するバイオインクのバイオプリンティングされた層を含む。さらに好ましい実施形態では、バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約１４，０００個の細胞を含み、約３０μｍ以下の高さを有する。さらに好ましい実施形態では、バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約１１，０００個の細胞を含み、約２５μｍ以下の高さを有する。さらに好ましい実施形態では、バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクのバイオプリンティングされた層は、１ｍｍ２当たり約１０，０００個の細胞を含み、約２０μｍ以下の高さを有する。
【0100】
好ましい実施形態では、バイオインクは湿細胞ペーストである。別の実施形態では、バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクは、約１０，０００個の細胞／μｌ～約４００，０００個の細胞／μｌを含む。一実施形態では、バイオインクは、約１０，０００個の細胞／μｌ～約１００，０００個の細胞／μｌを含む。一実施形態では、バイオインクは、約１００，０００個の細胞／μｌ～約４００，０００個の細胞／μｌを含む。一実施形態では、バイオインクは、約５０，０００個の細胞／μｌ～約２００，０００個の細胞／μｌを含む。一実施形態では、バイオインクは、約１０，０００個の細胞／μｌ、約３０，０００個の細胞／μｌ、約４０，０００個の細胞／μｌ、約５０，０００個の細胞／μｌ、約６０，０００個の細胞／μｌ、約７０，０００個の細胞／μｌ、約８０，０００個の細胞／μｌ、約９０，０００個の細胞／μｌ、約１００，０００個の細胞／μｌ、約１５０，０００個の細胞／μｌ、約２００，０００個の細胞／μｌ、約２５０，０００個の細胞／μｌ、約３００，０００個の細胞／μｌ、または約４００，０００個の細胞／μｌを含む。好ましい実施形態では、バイオインクは約２００，０００個の細胞／μｌを含む。
【0101】
いくつかの実施形態では、バイオインクは、部分的に分化した細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、完全に分化した細胞を含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、バイオインクは、限定されないが、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）などのヒト幹細胞（ＨＳＣ）から分化した細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、限定されないが、後部原始線条細胞などの原始線条細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、中間中胚葉（ＩＭ）細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、後腎間葉（ＭＭ）細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、腎管細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクは、限定されないが、ネフロン前駆細胞、尿管上皮前駆細胞、またはそれらの組み合わせなどの腎前駆細胞を含む。
【0103】
いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、患者由来の細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、遺伝子編集された細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、遺伝子編集された細胞でもある患者由来の細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、レポーター株からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、バイオインクの細胞は、遺伝子編集されたレポーター株細胞を含む。
【0104】
本明細書に開示されるバイオプリンティングされた腎臓組織を製造するための方法を使用することにより、ネフロンが濃縮されたバイオプリンティングされた操作された腎臓組織を製造することができる。別の実施形態によれば、本明細書に記載および例示される方法に従って調製されたバイオプリンティングされた腎臓組織は、約２～約１００ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。別の実施形態によれば、本明細書に記載および例示される方法に従って調製されたバイオプリンティングされた腎臓組織は、約２～約５０ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。別の実施形態によれば、本明細書に記載および例示される方法に従って調製されたバイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約４０ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。別の実施形態によれば、本明細書に記載および例示される方法に従って調製されたバイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約７５ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。別の実施形態によれば、本明細書に記載および例示される方法に従って調製されたバイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約６０ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。別の実施形態によれば、本明細書に記載および例示される方法に従って調製されたバイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約５０ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。別の実施形態によれば、本明細書に記載および例示される方法に従って調製されたバイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約４０ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約２０ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約１０ネフロン／プリンティングされた１０，０００個の細胞を含む。本明細書に詳述するように、ネフロンは、当業者によって、共焦点顕微鏡法および免疫蛍光標識を使用する視覚化およびカウントなどの様々な方法を使用して、本明細書に開示されるバイオプリンティングされた腎臓組織において（例えばＷＴ１＋糸球体、ＭＡＦＢ＋ＮＰＨＳ１＋有足細胞、ＨＮＦ４Ａ＋ＬＴＬ＋ＥＣＡＤ－近位尿細管、ＳＬＣ１２Ａ１＋ＥＣＡＤ＋遠位尿細管、およびＥＣＡＤ＋ＧＡＴＡ３＋連結セグメントまたは集合管について）識別およびカウントすることができる。この実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、単一細胞ＲＮＡ配列決定、ＰＣＲベースの遺伝子発現分析、免疫蛍光標識または免疫組織化学的方法を使用して、追加的または代替的に特徴付けられ得る。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり０．２ｍｍ２超のネフロン組織の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり０．２ｍｍ２～１．５ｍｍ２のネフロン組織の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２５ｍｍ２、０．３ｍｍ２、０．４ｍｍ２、０．５ｍｍ２、０．６ｍｍ２、０．７ｍｍ２、０．８ｍｍ２、０．９ｍｍ２、１ｍｍ２、１．１ｍｍ２、１．２ｍｍ２、１．３ｍｍ２、１．４ｍｍ２、または１．５ｍｍ２のネフロン組織の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２ｍｍ２超の、ＭＡＦＢを発現する細胞の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２ｍｍ２～１．５ｍｍ２の、ＭＡＦＢを発現する細胞の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２５ｍｍ２、０．３ｍｍ２、０．４ｍｍ２、０．５ｍｍ２、０．６ｍｍ２、０．７ｍｍ２、０．８ｍｍ２、０．９ｍｍ２、１ｍｍ２、１．１ｍｍ２、１．２ｍｍ２、１．３ｍｍ２、１．４ｍｍ２、または１．５ｍｍ２の、ＭＡＦＢを発現する細胞の表面積を含む。
【0105】
別の実施形態によれば、本明細書に開示される方法に従って製造されたバイオプリンティングされた腎臓組織は、バイオプリンティングされた層全体にネフロンが均一に分布している。すなわち、先行技術に記載されるような、細胞のドットまたはブロブとして生成することができ、ネフロンを欠く間質中心を有するドーム型構造を形成する、手作業で凝集またはバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドとは対照的に、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ネフロンの数が多く、より均一に分布している。例えば、バイオプリンティングされた腎臓は、バイオプリンティングされた層全体に、例えばＭＡＦＢを発現する細胞によって標識されるように、糸球体が均一に分布している。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ＳＬＣ１２Ａ１、ＣＤＨ１、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢのうちの１つ以上を発現する。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、過去に公表された方法（Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２６：５６４－５６８）すなわち、手作業で凝集した、または細胞のドットまたはブロブとして生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドと比較し、ＳＬＣ１２Ａ１、ＣＤＨ１、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢのうちの１つ以上の発現レベルの増加を示す。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、過去に公表された方法（Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２６：５６４－５６８）すなわち、手作業で凝集した、または細胞のドットまたはブロブとして生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドと比較し、ＴＨＹ１、ＤＣＮ、ＳＯＸ１７、ＦＬＴ１およびＰＥＣＡＭのうちの１つ以上の発現が低いか全くないか、またはＴＨＹ１、ＤＣＮ、ＳＯＸ１７、ＦＬＴ１およびＰＥＣＡＭのうちの１つ以上の発現が減少していることを示す。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ネフロンを有し、その近位尿細管および遠位尿細管セグメントは、ＨＮＦ４ＡおよびＳＬＣ１２Ａ１を含む成熟マーカーを示す。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、間質、線維芽細胞、および内皮細胞の存在の減少を示す。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ネフロン細胞型に関して標的外集団の減少を示す。
【0106】
別の実施形態では、バイオプリンティングするステップにおいて、バイオインクは、生体適合性の足場にバイオプリンティングされる。つまり、バイオインクがプリンティングされる表面は生体適合性の足場である。一実施形態では、生体適合性の足場は、生分解性または生体吸収性である。別の実施形態では、生体適合性の足場はヒドロゲルである。別の実施形態では、足場は、１つ以上の生物学的活性剤で機能付与され得る。例えば、生物学的活性剤（例えば、小分子、サイトカインおよびケモカインを含むポリペプチド、分化因子、シグナル伝達経路阻害剤など）は、例えば、バイオインク内の細胞の生存能力およびバイオインク内の細胞のさらなる発達または分化を促進し得る。
【0107】
別の実施形態では、バイオインクは、１つ以上の薬剤（例えば、生物学的活性剤）をさらに含む。一例では、１つ以上の生物学的活性剤は、複数の細胞からの腎臓組織の誘導を促進する。別の実施形態では、バイオインクは、分化培地、バイオプリンティング培地、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオプリンティング培地は、ヒドロゲルおよび／または１つ以上のＥＣＭ成分を含む。一実施形態では、バイオインクはヒアルロン酸を含む。一実施形態では、１つ以上の活性剤は、抗増殖剤、免疫抑制剤、血管新生促進化合物、抗体またはその断片もしくは部分、抗生物質または抗菌化合物、抗原またはエピトープ、アプタマー、バイオポリマー、炭水化物、細胞付着メディエーター（ＲＧＤなど）、サイトカイン、細胞毒性薬、薬物、酵素、成長因子または組換え成長因子ならびにその断片および変異体、ホルモン拮抗薬、ホルモン、免疫剤、脂質、金属、ナノ粒子、核酸類似体、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびマイクロＲＮＡ剤）、ヌクレオチド、栄養補助食品剤、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド、プロドラッグ、予防剤、タンパク質、小分子、治療剤、あるいはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0108】
他の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織はさらに、他のバイオプリンティングされたバイオインクに隣接して、またはそれに近接して配置された、本願明細書において上記したバイオインクを含み、それは、上記の１つ以上の薬剤または１つ以上の他の細胞型を任意選択的に含み得る。例えば、複数の細胞（および任意選択で１つ以上の薬剤）を含むバイオインクは、別のバイオプリンティングされたバイオインクに隣接するか、または近接するようにバイオプリンティングされ得る。例えば、複数の細胞（および任意選択で１つ以上の薬剤）を含むバイオインクは、（任意選択的に、１つ以上の薬剤および／または１つ以上の他の細胞型を含む）バイオプリンティングされたバイオインクのラインまたは層の上またはその隣（直接上または隣を含む）に、バイオプリンティングされ得る。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織を製造するための方法は、所定量の第１のバイオインクをバイオプリンティングすることと、所定量の第２のバイオインクを表面にプリンティングすることと、を含み、ここで、第１のバイオインクと第２のバイオインクとは異なる。一例では、第１のバイオインクは、第２のバイオインク内の複数の細胞とは異なる複数の細胞を含む。別の例では、第１のバイオインクは複数の細胞を含み、第２のバイオインクは、細胞を含まないが、例えば生物学的活性剤などの他の成分を含み得る。
【0109】
一例では、バイオプリンティングされたバイオインクを誘導して腎臓組織を形成するステップは、バイオインクをＦＧＦ－９と接触させることを含む。別の例では、バイオインクをＦＧＦ－９と５日間接触させることにより、バイオインクを誘導し、腎臓組織を形成させる。いくつかの例において、複数の細胞を、ＣＨＩＲを含む細胞培養培地と短時間接触させ、その後、バイオプリンティングし、さらに培養し得る。例えば、複数の細胞を、３～８μＭのＣＨＩＲを含む細胞培養培地と１～２時間接触させ、その後、バイオプリンティングし、さらに培養することができる。別の例では、複数の細胞を、５μＭのＣＨＩＲを含む細胞培養培地と１時間接触させ、その後、バイオプリンティングし、さらに培養することができる。別の実施形態では、バイオプリンティングされたバイオインクを誘導して腎臓組織を形成するステップは、バイオプリンティングされ、さらに培養された後で、バイオインクをＣＨＩＲを含む細胞培養培地と短時間接触させることを含む。一実施形態では、この方法は、バイオプリンティングされたバイオインクを５～１０μＭのＣＨＩＲの存在下で１時間培養することを含む。
【0110】
一実施形態では、複数の細胞は、幹細胞由来の中間中胚葉（ＩＭ）細胞の培養増殖集団を含む。ＩＭ細胞は、上記のタイトル「バイオプリンティングされた腎臓組織」のセクションに記載されている方法に従って調製および培養することができる。一実施形態では、誘導するステップは、バイオプリンティングされた所定量のバイオインクをＦＧＦ－９と接触させることを含む。別の実施形態では、誘導するステップは、バイオプリンティングされた所定量のバイオインクをＦＧＦ－９と５日間接触させることを含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた所定量のバイオインクを誘導してバイオプリンティングされた腎臓組織を形成するステップは、上記のタイトル「バイオプリンティングされた腎臓組織」のセクションに記載されるように実施される。
【0111】
押し出しバイオプリンティングでは、細胞を押し出すときに先端を細かく動かすことで、細胞凝集体の形状、細胞数、細胞密度、最終的な組織の高さ（または厚さ）を制御できる。押し出しプロセス中の押し出しポートの動きをスクリプト化することにより、手作業ではバイオインクを制御したり少なくとも正確に再現したりすることができない態様で、定義された距離に広げることができる。所定の細胞押し出し速度（比率）で先端の動作の量を増やすことにより、ユーザーは、細胞がより大きな表面領域に広がり、続いて凝集するときに、様々な細胞密度、形状、および高さ（厚さ）を有するバイオプリンティングされた組織を作製できる。一実施形態によれば、バイオプリンティングするステップは、押し出しベースのバイオプリンターを使用する。別の実施形態では、バイオプリンティングするステップは、１００～５００μｌのシリンジおよび約１００～約５５０μｍの内径を有するニードルを備える、押し出しベースのバイオプリンターを使用する。
【0112】
一実施形態では、バイオプリンティングするステップにおいて、バイオプリンターの分配装置は、上記の層を１つ以上のラインで分配するように構成されている。別の実施形態では、バイオプリンティングするステップにおいて、バイオプリンターの分配装置は、連続的なシートまたはパッチを形成するように上記の層を１つ以上のラインで分配するように構成されている。
【0113】
本明細書に開示される方法で使用される押し出しバイオプリンターは、分配装置の動きに伴うバイオインクの押し出し速度を調節するようにスクリプト化することができる。これは「比率」と呼ばれる。例えば、この用語は、バイオインクが押し出されるチップの所定の動きにわたって分配される材料の速度を指す。比率が高いということは、同じ押し出し量でより多くのチップが動くことを意味する。分配の比率を増減することで、一定量のバイオインクボリュームが押し出される領域が増減する。したがって、比率は細胞／ｍｍチップの動きとして定義できる。一実施形態では、４０、３０、２０または１０の比率は、約９，０００細胞／ｍｍ、約１２，０００細胞／ｍｍ、約１８，０００細胞／ｍｍ、および約３６，０００細胞／ｍｍに相当し、ここで、ｍｍは、先端の動きのｍｍであり、好ましくは、先端は２５Ｇのニードルである。
【0114】
プリンティング時の所定量のバイオインクのバイオプリンティングされた層の高さは、分配比率が増加するにつれて減少する。すなわち、プリンティング時の所定量のバイオインクのバイオプリンティングされた層の高さは、線の長さの増加とともに低下する。好ましい実施形態では、バイオインクのバイオプリンティングされた層の高さは、約５０μｍ以下である。分化後（例えば、本明細書に記載の方法における「誘導」ステップ後）の同じバイオプリンティングされた構造の高さは、培養日数に応じて変化し得る。本明細書で提供される例は、さらに１２日間培養された組織構造を示し、その間にバイオインクのプリンティングされた層は、構成する細胞の自己組織化および分化した細胞型への分化を経る。好ましい実施形態では、バイオプリンティングされた組織の高さは、培養期間後、約１５０μｍ以下である。
【0115】
好ましい実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織を作製する方法の方法は、ｉ）複数の細胞を含む所定量のバイオインクを表面にバイオプリンティングして、上記バイオインクの層を製造するステップであって、バイオインクの層の高さが約５０μｍ以下であり、１ｍｍ２当たり約１０，０００個の細胞～約２０，０００個の細胞を含み、細胞が幹細胞由来のＩＭ細胞である、ステップと、ｉｉ）プリンティングされたバイオインクを誘導して腎臓組織を形成するステップと、を含む。
【0116】
別の態様によれば、本発明は、本明細書に記載の方法に従って製造されたバイオプリンティングされた腎臓組織を提供する。
【0117】
移植のための腎臓組織の組織工学
腎臓病および腎不全患者への移植の目的でヒト腎臓組織を操作するためには、操作された構造当たり、および開始細胞型当たりで形成されるネフロンの数を増加させ、腎被膜下での移植に修正可能な生体適合性構造を作製する必要がある。手作業で生成されたオルガノイドまたはバイオプリンティングされたドットは、腎被膜下に移植されたときに、レシピエント動物によって血管新生されることができる。しかしながら、かかる操作された組織の移植に関連する問題は、「標的外」の組織分化および間質の異常増殖である。したがって、移植のためのより良好な組織が必要である。
腎臓病および腎不全患者への移植の目的でヒト腎臓組織を操作するためには、操作された構造当たり、および開始細胞型当たりで形成されるネフロンの数を増加させ、腎被膜下での移植に修正可能な生体適合性構造を作製する必要がある。手作業で生成されたオルガノイドまたはバイオプリンティングされたドットは、腎被膜下に移植されたときに、レシピエント動物によって血管新生されることができる。しかしながら、かかる操作された組織の移植に関連する問題は、「標的外」の組織分化および間質の異常増殖である。したがって、移植のためのより良好な組織が必要である。
【0118】
本明細書に記載されるように、本発明者らはまた、驚くべきことに、本明細書に開示されるバイオプリンティングされた腎臓組織が高いネフロン含有量を有することを確認した。特定の理論に拘束されることを望まないが、構造当たりおよび開始細胞型当たりに形成されるネフロンの数の増加は、腎被膜下での移植に修正可能な生体適合性構造の作製を可能にし得る。これらの特徴は、バイオプリンティングされた腎臓組織が移植などの治療用途により適していることを示し得る。例えば、バイオプリンティングされた腎臓組織は、標的外の組織分化および間質の異常増殖の問題を回避し得る。本明細書で定義されるバイオプリンティングされた腎臓組織は、移植のためのより良好な組織を表し得る。
【0119】
一態様によれば、本発明は、本明細書に開示されるか、または本明細書に開示される方法に従って製造されるバイオプリンティングされた腎臓組織であって、腎疾患または腎不全の治療を必要とする対象においてそれに使用するための、腎臓組織に関する。したがって、本発明はまた、本明細書に開示されるか、または本明細書に開示される方法に従って製造されるバイオプリンティングされた腎臓組織の、腎疾患または腎不全患者への移植に使用するための使用に関する。
【0120】
本発明はまた、患者における腎疾患または腎不全の治療方法であって、それを必要とする患者に対し、本明細書に開示されるか、または本明細書に開示される方法に従って製造されるバイオプリンティングされた腎臓組織を投与することを含む、方法に関する。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、組織全体にわたりネフロンが富化されている。これは、生成されるネフロンが少なく、オルガノイドの周辺にのみ分布している、バイオプリンティングされた腎臓オルガノイドとは対照的である。
【0121】
一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、バイオインクを含み、バイオインクは、複数の細胞を含み、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり０．２ｍｍ２超のネフロン組織の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり０．２ｍｍ２～１．５ｍｍ２のネフロン組織の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２５ｍｍ２、０．３ｍｍ２、０．４ｍｍ２、０．５ｍｍ２、０．６ｍｍ２、０．７ｍｍ２、０．８ｍｍ２、０．９ｍｍ２、１ｍｍ２、１．１ｍｍ２、１．２ｍｍ２、１．３ｍｍ２、１．４ｍｍ２、または１．５ｍｍ２のネフロン組織の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２ｍｍ２超の、ＭＡＦＢを発現する細胞の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２ｍｍ２～１．５ｍｍ２の、ＭＡＦＢを発現する細胞の表面積を含む。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、プリンティングされた１０，０００個の細胞当たり、０．２５ｍｍ２、０．３ｍｍ２、０．４ｍｍ２、０．５ｍｍ２、０．６ｍｍ２、０．７ｍｍ２、０．８ｍｍ２、０．９ｍｍ２、１ｍｍ２、１．１ｍｍ２、１．２ｍｍ２、１．３ｍｍ２、１．４ｍｍ２、または１．５ｍｍ２の、ＭＡＦＢを発現する細胞の表面積を含む。
【0122】
一例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約１００ネフロン／バイオプリンティングされた腎臓組織１ｍｍ２を含む。一例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約７５ネフロン／バイオプリンティングされた腎臓組織１ｍｍ２を含む。一例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約５０ネフロン／バイオプリンティングされた腎臓組織１ｍｍ２を含む。一例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約５～約２０ネフロン／バイオプリンティングされた腎臓組織１ｍｍ２を含む。一例では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約２０～約５０ネフロン／バイオプリンティングされた腎臓組織１ｍｍ２を含む。
【0123】
一例では、バイオプリンティングされた腎臓組織はバイオプリンティングされた層全体に、例えばＭＡＦＢを発現する細胞によって標識されるように、糸球体が均一に分布している。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ＳＬＣ１２Ａ１、ＣＤＨ１、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢのうちの１つ以上を発現する。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、過去に公表された方法（Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２６：５６４－５６８）すなわち、手作業で凝集した、または細胞のドットまたはブロブとして生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドと比較し、ＳＬＣ１２Ａ１、ＣＤＨ１、ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＥＰＣＡＭおよびＭＡＦＢのうちの１つ以上の発現レベルの増加を示す。一実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、過去に公表された方法（Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５２６：５６４－５６８）すなわち、手作業で凝集した、または細胞のドットまたはブロブとして生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドと比較し、ＴＨＹ１、ＤＣＮ、ＳＯＸ１７、ＦＬＴ１およびＰＥＣＡＭのうちの１つ以上の発現が低いか全くないか、またはＴＨＹ１、ＤＣＮ、ＳＯＸ１７、ＦＬＴ１およびＰＥＣＡＭのうちの１つ以上の発現が減少していることを示す。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、ネフロンを有し、その近位尿細管および遠位尿細管セグメントは、ＨＮＦ４ＡおよびＳＬＣ１２Ａ１を含む成熟マーカーを示す。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、間質、線維芽細胞、および内皮細胞の存在の減少を示す。
【0124】
バイオプリンティングされた腎臓組織は、移植に適する様々なサイズで製造することができる。いくつかの実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、約１５μｍ～約１５０μｍの高さでプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２５μｍの高さ～約１００μｍの高さから選択される層にバイオプリンティングされる。好ましい実施形態では、バイオインクは、約５０μｍ以下の層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約１５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約２５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約３０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約３５μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約４０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約５０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約６０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約７０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約８０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約９０μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。一実施形態では、バイオインクは、約１００μｍの高さの層にバイオプリンティングされる。上記のように、バイオプリンティングされた組織の高さは、その後の培養中（例えば、腎臓組織を形成するためのバイオプリンティングされたバイオインクの誘導中）、および／または維持中など、バイオプリンティングの後で若干増加し得る。一実施形態では、培養期間後、バイオプリンティングされた組織は、１５０μｍを超えない高さを得る。一実施形態では、培養期間後、バイオプリンティングされた組織は、約１００μｍ～１５０μｍの高さを得る。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、１ｍｍ～３０ｍｍの長さ、および０．５ｍｍ～２０ｍｍの幅を有する。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、５ｍｍ～３０ｍｍの長さ、および０．５ｍｍ～２ｍｍの幅を有する。別の実施形態では、バイオプリンティングされた腎臓組織は、最大約１００μｍ～２５０μｍの高さを有する。この実施形態では、高さ（または厚さ）は、組織がプリンティングされる高さではなく、バイオプリンティングされたバイオインクが誘導された後（例えば培養期間後）の腎臓組織の高さ（または厚さ）である。
【0125】
別の実施形態では、治療／移植で使用するためのバイオプリンティングされた腎臓組織は、生体適合性の足場をさらに含む。例えば、別の実施形態では、バイオインクは、生体適合性の足場にバイオプリンティングされる。つまり、バイオインクがプリンティングされる表面は、生体適合性の足場である。一実施形態では、生体適合性の足場は、生分解性または生体吸収性である。別の実施形態では、生体適合性の足場はヒドロゲルである。別の実施形態では、足場は、１つ以上の薬剤（例えば生物学的活性剤）により機能付与され得る。例えば、生物学的活性剤（サイトカイン、ケモカイン、分化因子、シグナル伝達経路阻害剤など）は、例えば、その上にプリンティングされたバイオインク内の細胞のさらなる発達もしくは分化を促進するか、または移植されたバイオプリンティング組織の生着および／もしくは生存を促進し得る。
【0126】
別の実施形態では、バイオインクまたは足場は、複数の細胞からの腎臓組織の誘導を促進する１つ以上の生物学的活性剤をさらに含む。別の実施形態では、バイオインクまたは足場は、修飾ヒドロゲルもしくは官能化ヒドロゲルなどのヒドロゲル、またはマトリックス成分または細胞外マトリックス成分の混合物をさらに含む。一実施形態では、１つ以上の活性剤は、抗増殖剤、免疫抑制剤、血管新生促進化合物、抗体またはその断片もしくは部分、抗生物質または抗菌化合物、抗原またはエピトープ、アプタマー、バイオポリマー、炭水化物、細胞付着メディエーター（ＲＧＤなど）、サイトカイン、細胞毒性薬、薬物、酵素、成長因子または組換え成長因子ならびにその断片および変異体、ホルモン拮抗薬、ホルモン、免疫剤、脂質、金属、ナノ粒子、核酸類似体、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびマイクロＲＮＡ剤）、ヌクレオチド、栄養補助食品剤、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド、プロドラッグ、予防剤、タンパク質、小分子、治療剤、あるいはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0127】
上記の実施形態によれば、バイオプリンティングされた腎臓組織は、患者への移植に使用し得る。この患者には、慢性腎臓病、遺伝性腎疾患、またはがんの腎減少手術後に腎機能が低下した患者が含まれ得る。一実施形態では、バイオプリンティングされた組織は、レシピエントの腎被膜下に移植される。一実施形態では、バイオプリンティングされた組織は、シートまたはパッチであり得る。
【0128】
薬物スクリーニング
別の態様によれば、本発明は、腎毒性または治療効果について候補化合物をスクリーニングする方法を提供し、その方法は、本明細書に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織を候補化合物と接触させ、候補化合物が、腎毒性であるかまたは治療的に有効であるか否かを決定することを含む。
別の態様によれば、本発明は、腎毒性または治療効果について候補化合物をスクリーニングする方法を提供し、その方法は、本明細書に記載のバイオプリンティングされた腎臓組織を候補化合物と接触させ、候補化合物が、腎毒性であるかまたは治療的に有効であるか否かを決定することを含む。
【0129】
一実施形態では、その方法は、上記バイオプリンティングされた腎臓組織を候補化合物および腎毒性物質と接触させ、候補化合物が治療的に有効であるか否かを決定することを含む。一実施形態では、候補化合物が腎毒性であるかまたは治療上有効であるか否かを決定することは、細胞死に関連する１つ以上の遺伝子の発現、細胞生存率に関連する１つ以上の遺伝子の発現、１つ以上のネフロン関連遺伝子の発現、糸球体細胞外マトリックスに関連する１つ以上の遺伝子の発現、有足細胞、内皮細胞またはメサンギウム細胞型に関連する１つ以上の遺伝子の発現、少なくとも１つの目的遺伝子に関連するレポーター遺伝子の発現強度、のうちの１つ以上を測定することを含む。
【0130】
別の実施形態では、ｉ）測定による、細胞生存率に関連する１つ以上の遺伝子の発現、１つ以上のネフロン関連遺伝子の発現、糸球体細胞外マトリックスに関連する１つ以上の遺伝子の発現、有足細胞、内皮細胞もしくはメサンギウム細胞型に関連する１つ以上の遺伝子の発現、および上記レポーター遺伝子の強度、のうちの１つ以上の減少、ならびに／またはｉｉ）測定による、細胞死に関連する１つ以上の遺伝子の発現の増加、は、候補化合物の腎毒性を示す。
【0131】
別の実施形態では、ｉ）測定による、細胞生存率に関連する１つ以上の遺伝子の発現、１つ以上のネフロン関連遺伝子の発現、糸球体細胞外マトリックスに関連する１つ以上の遺伝子の発現、有足細胞、内皮細胞もしくはメサンギウム細胞型に関連する１つ以上の遺伝子の発現、および上記レポーター遺伝子の強度、のうちの１つ以上の増加、ならびに／またはｉｉ）測定による、細胞死に関連する１つ以上の遺伝子の発現の減少、は、候補化合物の治療効果を示す。一実施形態では、候補化合物は、小分子、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、血清、ウイルス、細菌、幹細胞、またはそれらの組み合わせである。別の実施形態では、候補化合物は、腎臓病を有する対象から単離された血清などの血清である。
【0132】
別の実施形態では、その方法は、腎毒性ではない、および／または治療的に有効である、候補化合物を選抜することをさらに含み得る。
【実施例】
【0133】
実施例１．ヒト多能性幹細胞は、分化、および手作業によるオルガノイドの製造を誘導した。
ヒト多能性幹細胞を解凍し、１×ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ２６４４５０１）の存在下で一晩播種し、ＧｅｌＴｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ１４１３３０１）またはＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、標準的なフィーダーフリーの所定条件下で培養し、その際、培地を毎日交換した。分化開始の前日に、細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃１２５６３０１１）で分離し、Ｎｅｘｃｅｌｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でトリパン排出を用いてカウントし、ＧｅｌＴｒｅｘ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、またはＬａｍｉｎｉｎ－５２１コーティングされたＴ－２５フラスコまたは６ウェルプレートの、１×ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ＃Ａ２６４４５０１）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地中に播種した。中間中胚葉誘導は、ｉＰＳＣを、６～８μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４４２３／１０）を含むＳＴＥＭｄｉｆｆ ＡＰＥＬ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号５２１０）またはＴｅＳＲ－Ｅ６培地で４日間培養することによって実施した。４日目に、２００ ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２７３－Ｆ９－０２５）および１μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｈ４７８４－２５０ＭＧ）を添加したＳＴＥＭｄｉｆｆ ＡＰＥＬ培地またはＴｅＳＲ－Ｅ６培地で細胞を分化させた。
ヒト多能性幹細胞を解凍し、１×ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ２６４４５０１）の存在下で一晩播種し、ＧｅｌＴｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ１４１３３０１）またはＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、標準的なフィーダーフリーの所定条件下で培養し、その際、培地を毎日交換した。分化開始の前日に、細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃１２５６３０１１）で分離し、Ｎｅｘｃｅｌｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でトリパン排出を用いてカウントし、ＧｅｌＴｒｅｘ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、またはＬａｍｉｎｉｎ－５２１コーティングされたＴ－２５フラスコまたは６ウェルプレートの、１×ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ＃Ａ２６４４５０１）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地中に播種した。中間中胚葉誘導は、ｉＰＳＣを、６～８μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４４２３／１０）を含むＳＴＥＭｄｉｆｆ ＡＰＥＬ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号５２１０）またはＴｅＳＲ－Ｅ６培地で４日間培養することによって実施した。４日目に、２００ ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２７３－Ｆ９－０２５）および１μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｈ４７８４－２５０ＭＧ）を添加したＳＴＥＭｄｉｆｆ ＡＰＥＬ培地またはＴｅＳＲ－Ｅ６培地で細胞を分化させた。
【0134】
Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １１，１６８１－１６９２．（２０１６））に従って、分化の７日後に手作業でオルガノイド生成を実施し、オルガノイドをさらに１４～１８日間培養した後、回収した。
【0135】
実施例２．腎臓オルガノイドのバイオプリンティング
材料および方法
幹細胞を、実施例１に記載されているように調製した。７日目に、細胞をトリプシンＥＤＴＡ（０．２５％、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号２５２００－０７２）またはＴｒｙＰＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号１２５６３０１１）で分離した。得られた懸濁液をＮｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒでカウントし、トリパン排出によって生細胞を測定した。分化した細胞の単一細胞懸濁液を最初にＮｅｕｂａｕｅｒ血球計数板（ＢＬＡＵＢＲＡＮＤカタログ番号ＢＲ７－１８６０５）を使用してカウントし、細胞数を得た後、２００～３００×ｇで３～５分間遠心分離し、５０ｍＬまたは１５ｍＬのポリプロピレン製コニカルチューブ中で細胞をペレット化した。上澄みを吸引した後、この細胞材料を、バイオプリンティング用に２１～２５ゲージの取り外し可能なニードル（Ｈａｍｉｌｔｏｎカタログ番号７８０４－１２）を備えた１００ｕＬの気密シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎカタログ番号７６５６－０１）に直接移すか、またはＳＴＥＭｄｉｆｆ ＡＰＥＬまたはＴＥＳＲ－Ｅ６培地中に操作用の細胞密度となるよう再懸濁してから、バイオプリンティングに供した。細胞バイオインクを含むすべてのシリンジを、ＮｏｖｏＧｅｎ ＭＭＸバイオプリンターにロードし、細胞材料が流れるようプライミングし、ユーザー用に調製されたバイオインクのアリコートを６ウェルトランスウェル透過性サポート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒカタログ＃３４５０）の０．４μｍポリエステルメンブレンに堆積させた。
材料および方法
幹細胞を、実施例１に記載されているように調製した。７日目に、細胞をトリプシンＥＤＴＡ（０．２５％、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号２５２００－０７２）またはＴｒｙＰＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号１２５６３０１１）で分離した。得られた懸濁液をＮｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒでカウントし、トリパン排出によって生細胞を測定した。分化した細胞の単一細胞懸濁液を最初にＮｅｕｂａｕｅｒ血球計数板（ＢＬＡＵＢＲＡＮＤカタログ番号ＢＲ７－１８６０５）を使用してカウントし、細胞数を得た後、２００～３００×ｇで３～５分間遠心分離し、５０ｍＬまたは１５ｍＬのポリプロピレン製コニカルチューブ中で細胞をペレット化した。上澄みを吸引した後、この細胞材料を、バイオプリンティング用に２１～２５ゲージの取り外し可能なニードル（Ｈａｍｉｌｔｏｎカタログ番号７８０４－１２）を備えた１００ｕＬの気密シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎカタログ番号７６５６－０１）に直接移すか、またはＳＴＥＭｄｉｆｆ ＡＰＥＬまたはＴＥＳＲ－Ｅ６培地中に操作用の細胞密度となるよう再懸濁してから、バイオプリンティングに供した。細胞バイオインクを含むすべてのシリンジを、ＮｏｖｏＧｅｎ ＭＭＸバイオプリンターにロードし、細胞材料が流れるようプライミングし、ユーザー用に調製されたバイオインクのアリコートを６ウェルトランスウェル透過性サポート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒカタログ＃３４５０）の０．４μｍポリエステルメンブレンに堆積させた。
【0136】
組織学的染色
腎臓組織を２％または４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）で４℃で一晩固定し、ＨｉｓｔｏＧｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に事前に包埋した後、ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ ＶＩＰ組織処理システム（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を使用して脱水し、パラフィンを浸透させた。平面または横方向の５μｍの切片を、Ｌｅｉｃａ ＲＭ ２１３５ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して取得した。切片を焼き、脱パラフィンし、水和させ、その後標準的な退行性染色プロトコルに従い、ＳｅｌｅｃＴｅｃｈ染色液（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＩＬ、ヘマトキシリン＃３８０１５７０、Ｄｅｆｉｎｅ ＃３８０３５９０、Ｂｌｕｅ Ｂｕｆｆｅｒ ＃３８０２９１５、およびエオシンＹ ５１５ ＃３８０１６１５）を用い染色した。染色されたスライドを、連続的に脱水し、透明にし、Ｐｅｒｍａｓｌｉｐ（Ａｌｂａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ＃６５３０Ｂ）に装着した。画像は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）を備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ａ２で取得した。
腎臓組織を２％または４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）で４℃で一晩固定し、ＨｉｓｔｏＧｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に事前に包埋した後、ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ ＶＩＰ組織処理システム（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を使用して脱水し、パラフィンを浸透させた。平面または横方向の５μｍの切片を、Ｌｅｉｃａ ＲＭ ２１３５ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して取得した。切片を焼き、脱パラフィンし、水和させ、その後標準的な退行性染色プロトコルに従い、ＳｅｌｅｃＴｅｃｈ染色液（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＩＬ、ヘマトキシリン＃３８０１５７０、Ｄｅｆｉｎｅ ＃３８０３５９０、Ｂｌｕｅ Ｂｕｆｆｅｒ ＃３８０２９１５、およびエオシンＹ ５１５ ＃３８０１６１５）を用い染色した。染色されたスライドを、連続的に脱水し、透明にし、Ｐｅｒｍａｓｌｉｐ（Ａｌｂａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ＃６５３０Ｂ）に装着した。画像は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）を備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ａ２で取得した。
【0137】
切片およびホールマウントの免疫蛍光
パラフィン包埋オルガノイドの場合、脱パラフィンした切片からクエン酸緩衝液、ｐＨ ６．０（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓｏｎｔｏｎ、ＣＡ＃ＫＯ３５）で抗原を回収し、免疫蛍光抗体法の前にＴＢＳ－Ｔ（ｖ／ｖ）で希釈した５％ニワトリ血清でブロックした。ホールマウントのオルガノイドの場合、オルガノイドの採取、固定およびブロッキング、ならびに調製された切片および全オルガノイドの免疫蛍光法を、文献（Ｖａｎｓｌａｍｂｒｏｕｃｋ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ３０、１８１１－１８２３（２０１９））に記載のとおり実施した。Ｖａｎｓｌａｍｂｒｏｕｃｋ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．に記載されているように、またはＮｉｋｏｎ ２５ｘ１．０５ＮＡシリコーン浸漬対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して、画像を取得した。
パラフィン包埋オルガノイドの場合、脱パラフィンした切片からクエン酸緩衝液、ｐＨ ６．０（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓｏｎｔｏｎ、ＣＡ＃ＫＯ３５）で抗原を回収し、免疫蛍光抗体法の前にＴＢＳ－Ｔ（ｖ／ｖ）で希釈した５％ニワトリ血清でブロックした。ホールマウントのオルガノイドの場合、オルガノイドの採取、固定およびブロッキング、ならびに調製された切片および全オルガノイドの免疫蛍光法を、文献（Ｖａｎｓｌａｍｂｒｏｕｃｋ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ３０、１８１１－１８２３（２０１９））に記載のとおり実施した。Ｖａｎｓｌａｍｂｒｏｕｃｋ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．に記載されているように、またはＮｉｋｏｎ ２５ｘ１．０５ＮＡシリコーン浸漬対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して、画像を取得した。
【0138】
直径の測定
オルガノイドの断面直径は、ＩｍａｇｅＪ（バージョン１．５１）を使用した画像ベースの分析によって経時的に評価した。総画像は、プレート表面から、２倍の対物レンズを使用して、一定の距離で７日目のプリンティング後に収集した。各サンプルは、楕円形の選択ツールを使用して手作業で輪郭を描き、各画像のピクセル単位の面積を計算するために使用した。円形の面積の値を、次の式を使用して直径（ｍｍ）に変換した。
オルガノイドの断面直径は、ＩｍａｇｅＪ（バージョン１．５１）を使用した画像ベースの分析によって経時的に評価した。総画像は、プレート表面から、２倍の対物レンズを使用して、一定の距離で７日目のプリンティング後に収集した。各サンプルは、楕円形の選択ツールを使用して手作業で輪郭を描き、各画像のピクセル単位の面積を計算するために使用した。円形の面積の値を、次の式を使用して直径（ｍｍ）に変換した。
【数1】
【0139】
ドライペーストを使用した押出バイオプリンティング
押出バイオプリンティングの最適化の際、手作業でオルガノイドを調製するときに使用する、添加した細胞密度を再現するために生成させた、沈降したウェットペーストとドライペーストとを比較した。押出シリンジ内でこの密度のドライペーストを実現するために、調製したシリンジを独自のアダプターにロードして、５０ｍＬのポリプロピレン製コニカルチューブ内で４００×ｇで遠心分離できるようにした。シリンジ／アダプターアセンブリを合計９分間遠心分離し、手作業プロトコルを再現した。
押出バイオプリンティングの最適化の際、手作業でオルガノイドを調製するときに使用する、添加した細胞密度を再現するために生成させた、沈降したウェットペーストとドライペーストとを比較した。押出シリンジ内でこの密度のドライペーストを実現するために、調製したシリンジを独自のアダプターにロードして、５０ｍＬのポリプロピレン製コニカルチューブ内で４００×ｇで遠心分離できるようにした。シリンジ／アダプターアセンブリを合計９分間遠心分離し、手作業プロトコルを再現した。
【0140】
結果
細胞ペーストを含むバイオインクを、一点堆積（比率０）でバイオプリンティングした。この一点堆積（またはドット）を使用して、開始濃度およびプリンティング時のコンフォメーションが最終的な形態に影響を与えるか否かを評価した。バイオプリンティングの後、一点堆積（比率０）組織は、手作業で生成された腎臓オルガノイドと同様の特性を持つドーム型構造を形成し、したがって、一点堆積（比率０）は、バイオプリンティングされたオルガノイドとも呼ばれ得る。
細胞ペーストを含むバイオインクを、一点堆積（比率０）でバイオプリンティングした。この一点堆積（またはドット）を使用して、開始濃度およびプリンティング時のコンフォメーションが最終的な形態に影響を与えるか否かを評価した。バイオプリンティングの後、一点堆積（比率０）組織は、手作業で生成された腎臓オルガノイドと同様の特性を持つドーム型構造を形成し、したがって、一点堆積（比率０）は、バイオプリンティングされたオルガノイドとも呼ばれ得る。
【0141】
カスタムソフトウェアインターフェース内で堆積比を変化させることによって、様々なオルガノイドのコンフォメーションを生成させ、一方でオルガノイドの長さをスケーリングし、各オルガノイドが約０．５５μｌの体積で堆積される一定の１．１×１０５細胞から形成されるようにした。設定された細胞密度のウェット細胞ペーストを含むバイオインクから開始し、同数の細胞をバイオプリンティングし、約３ｍｍ（比率１０）のライン～約１２ｍｍ（比率４０）の細胞のラインの長さまで、様々に堆積を変化させた。これにより、以下に詳述するように、開始密度が最終形態に影響を与えるか否かの評価が可能になった。各場合において、本発明者らは、各オルガノイドの開始細胞の絶対数がほぼ等しくなるようラインの長さを変えた。ラインのオルガノイドは、均一な流体の流れを確保するために、パターンの開始時に一点堆積（合計で約１０％）を行った。「ドット」のオルガノイドは、細胞数の一致が維持されるよう、同じ総細胞体積を添加した。堆積中、ニードルをトランスウェル表面から３００ミクロンの位置に配置した。すべての場合において、堆積率は２５ゲージのニードルおよび１００μｌのシリンジに基づくものとした。
【0142】
バイオプリンティングの後、バイオプリンティングされたオルガノイドは、トランスウェル培養プレートの基底外側コンパートメントでＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬまたはＴｅＳＲ－Ｅ６培地のいずれかにおいて５～１０μＭのＣＨＩＲ９９０２１の存在下で１時間培養し、その後、２００ ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ９および１μｇ／ｍＬのヘパリンを添加したＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬまたはＴＥＳＲ－Ｅ６培地（基底外側コンパートメントのみの培地）中で７日目＋５日目まで培養する。７日目＋５日目～７日目＋１８日目まで、オルガノイドを、補充なしで、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬ培地またはＴｅＳＲ－Ｅ６培地で成長させる。腎臓のオルガノイドは、回収するまで、７日目＋１２日目～７日目＋２０日目まで培養できる。組織を上記と同じ条件下で維持した。
【0143】
得られたバイオプリンティングされたオルガノイドは、その後の２０日間の培養で、ネフロンの自発的な形成を示した（図１Ａ、Ｂ、Ｅ）。免疫蛍光法を使用して、古典的にパターン化されたネフロンの存在を確認したため、有足細胞（ＮＥＰＨＲＩＮ）、近位尿細管（ＬＴＬ、ＣＵＢＮ）、ヘンレ係蹄の遠位尿細管／ループ（ＴＡＬ；ＥＣＡＤ、ＳＬＣ１２Ａ１）および連結／尿管上皮（ＧＡＴＡ３、ＥＣＡＤ）の存在が明らかとなった（図１Ｃ、Ｄ）。内皮細胞（ＣＤ３１）および腎間質（ＭＥＩＳ１／２）を含む追加の細胞成分の存在も明らかとなった（図１Ｄ）。バイオプリンティングされたオルガノイドの組織切片は、個々のネフロンが放射状に広がる組織の幅全体にわたる、隣接する連結上皮（ＥＣＡＤ、ＧＡＴＡ３）の存在を明らかにした（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）。なお、細胞ペーストは細胞のみを表し、関連するＥＣＭまたはヒドロゲルマトリックスは組み込まれていないことに留意すべきである。達成されたパターン化を、細胞ペーストを遠心分離して残りのすべての培地を除去し、パックした「乾燥」細胞ペーストを作成したときの結果と比較した。その後の乾燥ペースト由来のオルガノイドの培養では、ネフロン形成の証拠は示されなかった（図２Ｄ）。
【0144】
バイオプリンティングによる細胞の複雑さを、手作業でペレット化したオルガノイドと直接比較するために、同じ単層の分化を両方のアプローチに供した。得られた腎臓オルガノイドを、明視野イメージングおよび免疫蛍光法を使用して解析し、その結果、バイオプリンティングされた腎臓オルガノイドが手作業の腎臓オルガノイドと形態学的同等性を示すことが示しされた（図１Ｅ）。
【0145】
実施例３．高いスループットで、オルガノイドのサイズが小さい、バイオプリンティングされた腎臓オルガノイド。
ここで適用されたオルガノイドのバイオプリンティングの自動化プロセスは、非常に高いオルガノイドの直径の再現性で、３秒ごとに約１マイクロマスの堆積を可能にした（表１）。わずか２×１０５個の細胞からなるマイクロマスを２４ウェルトランスウェルプレートに手作業で配置することは可能であるが、バイオプリンティングにより、複数のマイクロマスを同じフィルターに正確に配置できた（６ウェルプレートのフィルター当たり３～９個のオルガノイド）（図１Ｆ、Ｇ）。オルガノイド内の組織学的複雑さを失うことなく、最初のマイクロマスを生成するために使用される細胞数を減らすことも可能であった（図１Ｆ、Ｈ）。したがって、腎臓オルガノイド生成プロセスの収量およびスループットを大幅に向上させることができ、わずか４×１０３個の細胞からバイオプリンティングされたオルガノイドで腎臓構造のパターンが明らかになった（図３Ａ、Ｃ）。実際、プリンティングされた体積と結果として得られる平均直径によって評価される細胞ペースト堆積の再現性は、１％～４％の変動係数を示した（表１）。
ここで適用されたオルガノイドのバイオプリンティングの自動化プロセスは、非常に高いオルガノイドの直径の再現性で、３秒ごとに約１マイクロマスの堆積を可能にした（表１）。わずか２×１０５個の細胞からなるマイクロマスを２４ウェルトランスウェルプレートに手作業で配置することは可能であるが、バイオプリンティングにより、複数のマイクロマスを同じフィルターに正確に配置できた（６ウェルプレートのフィルター当たり３～９個のオルガノイド）（図１Ｆ、Ｇ）。オルガノイド内の組織学的複雑さを失うことなく、最初のマイクロマスを生成するために使用される細胞数を減らすことも可能であった（図１Ｆ、Ｈ）。したがって、腎臓オルガノイド生成プロセスの収量およびスループットを大幅に向上させることができ、わずか４×１０３個の細胞からバイオプリンティングされたオルガノイドで腎臓構造のパターンが明らかになった（図３Ａ、Ｃ）。実際、プリンティングされた体積と結果として得られる平均直径によって評価される細胞ペースト堆積の再現性は、１％～４％の変動係数を示した（表１）。
【表1】
【0146】
腎臓オルガノイド生成のためのバイオプリンティング細胞株の使用可能性を、様々なヒト人工多能性幹細胞株を使用して広く評価した。対照、レポーター、および患者由来のｉＰＳＣ株は、この方法でバイオプリンティングしたとき、腎臓組織の生成に成功した。例えば、ＭＡＦＢ遺伝子プロモーター（ＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２）の制御下で青色蛍光タンパク質が挿入された特定のレポーター株を使用することで、生存組織の蛍光イメージングによる、各腎臓ネフロンの一端に形成される糸球体における有足細胞の分化の視覚化などの評価が可能になった（図３Ｂ）。
【0147】
実施例４．９６ウェルフォーマットでの化合物の試験のための、バイオプリンティングされた腎臓オルガノイド。
材料および方法
バイオプリンティングされたオルガノイドを、実施例２に概説されている方法を使用して調製した。
材料および方法
バイオプリンティングされたオルガノイドを、実施例２に概説されている方法を使用して調製した。
【0148】
バイオインクの生存率および濃度のアッセイ
分配されたバイオインクを、９６ウェルプレートの２つの列（２４オルガノイド）へのプリンティングの前後にサンプリングした。プリンティングされたバイオインクを、ＡＰＥＬ培地を満たした１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに直接分配して希釈し、トリパンブルー排出によるＮｅｘｅｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｅｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してカウントした。Ｎｅｘｃｅｌｏｍの結果を、視覚化および統計的分析のためにＪＭＰに入力した。２つの条件のみを比較する分析ではｔ検定を実行し、２つ以上の条件を比較する分析では一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ比較を実行し、近似平均、線形近似線を使用して２変量近似を実行し、９５％信頼区間で有意なトレンドを決定した。
分配されたバイオインクを、９６ウェルプレートの２つの列（２４オルガノイド）へのプリンティングの前後にサンプリングした。プリンティングされたバイオインクを、ＡＰＥＬ培地を満たした１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに直接分配して希釈し、トリパンブルー排出によるＮｅｘｅｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｅｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してカウントした。Ｎｅｘｃｅｌｏｍの結果を、視覚化および統計的分析のためにＪＭＰに入力した。２つの条件のみを比較する分析ではｔ検定を実行し、２つ以上の条件を比較する分析では一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ比較を実行し、近似平均、線形近似線を使用して２変量近似を実行し、９５％信頼区間で有意なトレンドを決定した。
【0149】
薬物誘発性の腎毒性試験
ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ１５１５）ストック溶液をＤＭＳＯ中に調製した。アミカシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、およびストレプトマイシンはすべて、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手し、ＡＰＥＬ培地で２５ｍｇ／ｍｌの溶液として調製した。６ウェルでの腎毒性試験のための投薬は、最初にＡＰＥＬ培地でドキソルビシンのＤＭＳＯストックを希釈し、その後、追加の培地でさらに希釈して０．３～１０μＭの範囲の濃度とすることによって実施した。９６ウェルでの腎毒性評価のための投薬は、段階希釈によって実施した。ドキソルビシンの場合、ＤＭＳＯストックの段階希釈物をＡＰＥＬ培地に添加して、２４ｎＭ～２５μＭの範囲の濃度とした。アミノグリコシドのストック溶液をＡＰＥＬ培地で段階希釈して、１．５μｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬの範囲の投薬濃度とした。薬物の投薬は、分化プロトコルの２１日目または２２日後に開始した。投薬は、ＡＰＥＬ培地±試験物質の総ウェル体積を、トランスウェルの透過性担体のアピカルバスケットにアプライすることによって実施した（６ウェルプレートの場合は４ｍＬ、９６ウェルプレートの場合は３００μＬ）。試験物質を含む培地がトランスウェル透過性担体に添加されたとき、オルガノイドは完全に沈降し、頂端部および基底外側区画が平衡化されたとき、添加された化合物に曝露された。指定された回収時点まで、薬剤添加培地を隔日で交換した。
ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ１５１５）ストック溶液をＤＭＳＯ中に調製した。アミカシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、およびストレプトマイシンはすべて、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手し、ＡＰＥＬ培地で２５ｍｇ／ｍｌの溶液として調製した。６ウェルでの腎毒性試験のための投薬は、最初にＡＰＥＬ培地でドキソルビシンのＤＭＳＯストックを希釈し、その後、追加の培地でさらに希釈して０．３～１０μＭの範囲の濃度とすることによって実施した。９６ウェルでの腎毒性評価のための投薬は、段階希釈によって実施した。ドキソルビシンの場合、ＤＭＳＯストックの段階希釈物をＡＰＥＬ培地に添加して、２４ｎＭ～２５μＭの範囲の濃度とした。アミノグリコシドのストック溶液をＡＰＥＬ培地で段階希釈して、１．５μｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬの範囲の投薬濃度とした。薬物の投薬は、分化プロトコルの２１日目または２２日後に開始した。投薬は、ＡＰＥＬ培地±試験物質の総ウェル体積を、トランスウェルの透過性担体のアピカルバスケットにアプライすることによって実施した（６ウェルプレートの場合は４ｍＬ、９６ウェルプレートの場合は３００μＬ）。試験物質を含む培地がトランスウェル透過性担体に添加されたとき、オルガノイドは完全に沈降し、頂端部および基底外側区画が平衡化されたとき、添加された化合物に曝露された。指定された回収時点まで、薬剤添加培地を隔日で交換した。
【0150】
オルガノイドの生存率の評価
薬物処理後の腎臓オルガノイドの生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏまたはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ３Ｄ生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）でＡＴＰ含有量を測定することによって評価した。簡単に説明すると、６ウェルプレート中のバイオプリンティングされたオルガノイドを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ緩衝液を使用してＰｒｅｃｅｌｌｙｓチューブ（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）に個別にロードし、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ ２４組織ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して分離した。ホモジナイズしたオルガノイドを室温で１０分間インキュベートした後、１０００ｇで２分間遠心分離し、ホモジナイズビーズから緩衝液を分離した。上清を白色の不透明な９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で発光を測定した。示された６ウェルの生存率の結果は、３つの独立した実験を組み合わせたものであり、それぞれの試験において、それぞれの対照ＡＴＰレベルに対して正規化されている。９６ウェルプレートにバイオプリンティングされたオルガノイドのＡＴＰ含有量を解析するため、すべての培地を吸引し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ３Ｄ試薬をトランスウェル透過性担体の頂端チャンバーに添加した。プレートを４００ｒｐｍで５分間室温で振とうした後、２５分間静置し、その後、マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、白色の不透明な９６ウェルプレートで発光を測定した。生存率の解析は、処理されたオルガノイドのＡＴＰ含有量を対照オルガノイドと比較して正規化することにより、対照に対するパーセントとして示した。生存率の結果のフィッティングは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３ソフトウェア（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で、４パラメーターの用量反応曲線（式１）を使用して実行した。
Ｙ＝下部＋（上部－下部）／（１＋（（ＸＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）／（ＩＣ５０ ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）））（式１）
薬物処理後の腎臓オルガノイドの生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏまたはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ３Ｄ生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）でＡＴＰ含有量を測定することによって評価した。簡単に説明すると、６ウェルプレート中のバイオプリンティングされたオルガノイドを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ緩衝液を使用してＰｒｅｃｅｌｌｙｓチューブ（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）に個別にロードし、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ ２４組織ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して分離した。ホモジナイズしたオルガノイドを室温で１０分間インキュベートした後、１０００ｇで２分間遠心分離し、ホモジナイズビーズから緩衝液を分離した。上清を白色の不透明な９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で発光を測定した。示された６ウェルの生存率の結果は、３つの独立した実験を組み合わせたものであり、それぞれの試験において、それぞれの対照ＡＴＰレベルに対して正規化されている。９６ウェルプレートにバイオプリンティングされたオルガノイドのＡＴＰ含有量を解析するため、すべての培地を吸引し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ３Ｄ試薬をトランスウェル透過性担体の頂端チャンバーに添加した。プレートを４００ｒｐｍで５分間室温で振とうした後、２５分間静置し、その後、マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、白色の不透明な９６ウェルプレートで発光を測定した。生存率の解析は、処理されたオルガノイドのＡＴＰ含有量を対照オルガノイドと比較して正規化することにより、対照に対するパーセントとして示した。生存率の結果のフィッティングは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３ソフトウェア（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で、４パラメーターの用量反応曲線（式１）を使用して実行した。
Ｙ＝下部＋（上部－下部）／（１＋（（ＸＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）／（ＩＣ５０ ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）））（式１）
【0151】
薬物曝露後の定量的ＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現分析
薬物曝露後の腎臓オルガノイドからの全ＲＮＡ抽出は、製造元の指示に従ってＲｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用した分光光度法で定量した。遺伝子発現を解析するため、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、目的遺伝子のＴａｑＭａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、およびハウスキーピング遺伝子プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、割り当てられたウェル中でＲＮＡと混合した。すべてのｑＰＣＲ反応は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ ｑＲＴ－ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において実施および分析した。対照サンプルに対して正規化する前に、すべてのデータをハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化した。
薬物曝露後の腎臓オルガノイドからの全ＲＮＡ抽出は、製造元の指示に従ってＲｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用した分光光度法で定量した。遺伝子発現を解析するため、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、目的遺伝子のＴａｑＭａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、およびハウスキーピング遺伝子プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、割り当てられたウェル中でＲＮＡと混合した。すべてのｑＰＣＲ反応は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ ｑＲＴ－ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において実施および分析した。対照サンプルに対して正規化する前に、すべてのデータをハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化した。
【0152】
結果
腎臓は生体異物の除去に重要な役割を果たすが、管状の特定の溶質チャネルを介した様々な化合物の取り込みにより、腎臓は腎毒性損傷のリスクにさらされる。初代腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）を使用した腎毒性の前臨床スクリーニングでは、２Ｄ培養でのそのような細胞の急速な脱分化により、臓器特異的な毒性を正確に予測できず、主要なトランスポーターと代謝酵素の発現が失われることがしばしばある。ヒトの腎臓オルガノイドは、薬物反応をモデル化するためのより正確で予測可能なツールを提供するものとあり得、これは、変動係数（ｃｖ）が低く、実行可能で再現性のあるパターン化されたオルガノイドを多数生成する能力に部分的に依存する。この目的のために、自動バイオプリンティングはさらにスケールダウンされ（オルガノイド当たり１．０×１０５の開始細胞）、９６ウェルのトランスウェルフィルター上での個々のオルガノイドの製造に適するものであった（図４Ａ、Ｂ）。細胞数および細胞生存率の精度は、９６ウェルすべてで再現可能であり、全体的な細胞生存率は９３～９９％の範囲であった（図４Ｃ）。このアプローチを腎毒性試験に適用するための実証試験として、既知の有足細胞毒素である化学療法剤ドキソルビシンの投与の効果を、２μＭまたは１０μＭのドキソルビシンで７２時間処理した後、バイオプリンティングしたオルガノイドを使用して最初に評価した（図４Ｄ～Ｆ）。得られたオルガノイドの免疫蛍光染色は、１０μＭドキソルビシンに応答したオルガノイド糸球体の有足細胞内でのカスパーゼ３の特異的な活性化およびＭＡＦＢ染色の喪失の証拠を示した（図４Ｄ）。定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、腎臓の損傷分子ＫＩＭ１（ＨＡＶＣＲ）およびアポトーシスの指標であるＢｃｌ２関連Ｘタンパク質（ＢＡＸ）の、１０μＭでの上方制御を示した（図４Ｅ）。ドキソルビシンはまた、２μＭで主要な有足細胞マーカーであるＮＰＨＳ１およびＰＯＤＸＬを下方制御したが、近位尿細管遺伝子ＣＵＢＮは１０μＭドキソルビシンに応答してのみ下方制御され（図４Ｆ）、濃度による細胞型特異的感度の違いを示唆する。用量反応をさらに評価するために、オルガノイドを６ウェルまたは９６ウェルの形式でバイオプリンティングし、ＡＴＰ含有量を生存率の読み取り値として使用し、２４ｎＭ～２５μＭのドキソルビシンで処理した。生存率は、ドキソルビシン曝露によって用量依存的に影響を受け、６ウェルおよび９６ウェルの両方のフォーマットで、処理に応じた同等のＩＣ５０値が得られた（６ウェルのＩＣ５０：３．９±１．８μＭ、９６ウェルのＩＣ５０：３．１±１．０μＭ）（図４Ｇ）。アミノグリコシドは、グラム陰性病原菌によって引き起こされる感染症を治療するために一般的に使用される広宿主域抗生物質のクラスである。急性尿細管壊死による腎臓損傷は、アミノグリコシド療法の、近位尿細管細胞内への細胞内蓄積の高さに由来する一般的な合併症である。
腎臓は生体異物の除去に重要な役割を果たすが、管状の特定の溶質チャネルを介した様々な化合物の取り込みにより、腎臓は腎毒性損傷のリスクにさらされる。初代腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）を使用した腎毒性の前臨床スクリーニングでは、２Ｄ培養でのそのような細胞の急速な脱分化により、臓器特異的な毒性を正確に予測できず、主要なトランスポーターと代謝酵素の発現が失われることがしばしばある。ヒトの腎臓オルガノイドは、薬物反応をモデル化するためのより正確で予測可能なツールを提供するものとあり得、これは、変動係数（ｃｖ）が低く、実行可能で再現性のあるパターン化されたオルガノイドを多数生成する能力に部分的に依存する。この目的のために、自動バイオプリンティングはさらにスケールダウンされ（オルガノイド当たり１．０×１０５の開始細胞）、９６ウェルのトランスウェルフィルター上での個々のオルガノイドの製造に適するものであった（図４Ａ、Ｂ）。細胞数および細胞生存率の精度は、９６ウェルすべてで再現可能であり、全体的な細胞生存率は９３～９９％の範囲であった（図４Ｃ）。このアプローチを腎毒性試験に適用するための実証試験として、既知の有足細胞毒素である化学療法剤ドキソルビシンの投与の効果を、２μＭまたは１０μＭのドキソルビシンで７２時間処理した後、バイオプリンティングしたオルガノイドを使用して最初に評価した（図４Ｄ～Ｆ）。得られたオルガノイドの免疫蛍光染色は、１０μＭドキソルビシンに応答したオルガノイド糸球体の有足細胞内でのカスパーゼ３の特異的な活性化およびＭＡＦＢ染色の喪失の証拠を示した（図４Ｄ）。定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、腎臓の損傷分子ＫＩＭ１（ＨＡＶＣＲ）およびアポトーシスの指標であるＢｃｌ２関連Ｘタンパク質（ＢＡＸ）の、１０μＭでの上方制御を示した（図４Ｅ）。ドキソルビシンはまた、２μＭで主要な有足細胞マーカーであるＮＰＨＳ１およびＰＯＤＸＬを下方制御したが、近位尿細管遺伝子ＣＵＢＮは１０μＭドキソルビシンに応答してのみ下方制御され（図４Ｆ）、濃度による細胞型特異的感度の違いを示唆する。用量反応をさらに評価するために、オルガノイドを６ウェルまたは９６ウェルの形式でバイオプリンティングし、ＡＴＰ含有量を生存率の読み取り値として使用し、２４ｎＭ～２５μＭのドキソルビシンで処理した。生存率は、ドキソルビシン曝露によって用量依存的に影響を受け、６ウェルおよび９６ウェルの両方のフォーマットで、処理に応じた同等のＩＣ５０値が得られた（６ウェルのＩＣ５０：３．９±１．８μＭ、９６ウェルのＩＣ５０：３．１±１．０μＭ）（図４Ｇ）。アミノグリコシドは、グラム陰性病原菌によって引き起こされる感染症を治療するために一般的に使用される広宿主域抗生物質のクラスである。急性尿細管壊死による腎臓損傷は、アミノグリコシド療法の、近位尿細管細胞内への細胞内蓄積の高さに由来する一般的な合併症である。
【0153】
このクラスの化合物に対する腎臓オルガノイドの応答を評価するために、オルガノイドを９６ウェル形式でバイオプリンティングし、アミカシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシンなどの既知の腎毒性アミノグリコシドのパネルで広い濃度範囲で処理した。細胞のＡＴＰ含有量により測定した細胞生存率は、評価したすべてのアミノグリコシドで７２時間処理した後、濃度依存的に低下した（図４Ｈ）。
【0154】
したがって、本明細書に例示されるバイオプリンティングされた腎臓組織は、前臨床安全性評価をサポートするために必要な再現性を有する新規な薬剤または薬物足場の腎毒性の評価に適用可能な、薬物検査に対する実際的なアプローチを表すものである。
実施例５．バイオプリンティングされた腎臓組織のコンフォメーションは、ネフロンのパターンおよび数を変化させる。
実施例５．バイオプリンティングされた腎臓組織のコンフォメーションは、ネフロンのパターンおよび数を変化させる。
【0155】
本明細書に開示される方法を使用してバイオプリンティングされたオルガノイドを生成することにより、より優れた品質管およびスループットの向上が提供されるだけでなく、組織形態に対するオルガノイドのコンフォメーションの変化の影響の解析も可能になった。押し出しバイオプリンティングの際、細胞が押し出されるときにニードル先を三次元で正確に配置および移動することにより、形成される細胞マイクロマスのスケールおよびコンフォメーションを制御できる。
【0156】
材料および方法
バイオプリンティングされたオルガノイドを、実施例２に概説されている方法を使用して調製した。
バイオプリンティングされたオルガノイドを、実施例２に概説されている方法を使用して調製した。
【0157】
プリンティング時の細胞密度および高さに関する、ビーズベースの解析
細胞ペーストに４ｕｍのＴｅｔｒａｓｐｅｃビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ）を、５０ｕｌのペースト当たり１ｕｌのビーズ懸濁液でスパイクした。オルガノイドは、バイオプリンティングから２～３時間以内にイメージ化し、明視野および蛍光ビーズのシグナルをキャプチャし、オルガノイド培養中の様々な時点で再びイメージ化した。イメージングは、４×０．２ＮＡ Ｎｉｋｏｎ対物レンズを備えたＡｎｄｏｒドラゴンフライピニングディスク共焦点を使用して実行し、トランスウェル表面から開始し、ビーズシグナルが検出されなくなるまでｚスタックをキャプチャした。Ｆｉｊｉ（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，６７６－６８２．（２０１２））を使用し、タイル化されたデータセットをステッチし、ビーズ画像の最大投影を生成させた。カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、各データセットの個々のビーズをカウントし、最終的なカウントデータをＲで分析した。ビーズの分布から得られた表面積を使用して、プリンティング時のオルガノイドの高さを、側面が垂直の形状の場合の高さとして、また堆積したオルガノイドと同じ表面積および体積を有するものとして概算した。
細胞ペーストに４ｕｍのＴｅｔｒａｓｐｅｃビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ）を、５０ｕｌのペースト当たり１ｕｌのビーズ懸濁液でスパイクした。オルガノイドは、バイオプリンティングから２～３時間以内にイメージ化し、明視野および蛍光ビーズのシグナルをキャプチャし、オルガノイド培養中の様々な時点で再びイメージ化した。イメージングは、４×０．２ＮＡ Ｎｉｋｏｎ対物レンズを備えたＡｎｄｏｒドラゴンフライピニングディスク共焦点を使用して実行し、トランスウェル表面から開始し、ビーズシグナルが検出されなくなるまでｚスタックをキャプチャした。Ｆｉｊｉ（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，６７６－６８２．（２０１２））を使用し、タイル化されたデータセットをステッチし、ビーズ画像の最大投影を生成させた。カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、各データセットの個々のビーズをカウントし、最終的なカウントデータをＲで分析した。ビーズの分布から得られた表面積を使用して、プリンティング時のオルガノイドの高さを、側面が垂直の形状の場合の高さとして、また堆積したオルガノイドと同じ表面積および体積を有するものとして概算した。
【0158】
Ｄ７＋０でのオルガノイドの高さの測定
オルガノイドの高さは、Ｆｉｊｉ（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．）を使用した事前標識した細胞の画像ベースの定量によって評価した。バイオプリンティングの前に、細胞の１０％を取り出し、メーカーの指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃ３４５６４）で標識した。標識された細胞を残りの細胞と混合して戻し、バイオプリンティングしてマイクロマス中にまばらな標識を付した。オルガノイドを含むトランスウェルを取り除き、少量の培地を入れた皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に平らに置くことにより、Ｄ７＋０で２つの独立したオルガノイドのセットを特徴付けた。これにより、はるかに短い作動距離でのイメージングが可能になった一方で、オルガノイドの乾燥が防止された。画像は、Ｎｉｋｏｎ １．１５ ＮＡ ４０ｘ水浸対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ Ｄｒａｇｏｎｆｌｙ回転ディスクを使用してキャプチャし、その際、０．３２５×０．３２５×０．５ミクロンのボクセルサイズで画像をキャプチャした。画像スタックの最高点および最低点を、Ｆｉｊｉの直交ビュー下で手作業で測定した。各サンプルについて、Ｙ軸に沿って、ＸＹ平面で３つのセクション（上、中、下）に均等に画像を分割した（図６Ｇ）。次に、各セクションで、画像の中央領域の３００ミクロンの範囲（中心から－Ｘ方向および＋Ｘ方向の両方に１５０ミクロン）にわたる２つの最高点および２つの最低点を記録した。すなわち、各条件について、６つの最高点および６つの最低点を収集した。オルガノイドの高さは以下のように算出した。
Ｈ（ｍｍ）＝［平均（最高６点スライド数）－平均（最低６点スライド数）］×ボクセル深さ（ｍｍ）
データは、分析およびプロットのためにＲでコンパイルした。
オルガノイドの高さは、Ｆｉｊｉ（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．）を使用した事前標識した細胞の画像ベースの定量によって評価した。バイオプリンティングの前に、細胞の１０％を取り出し、メーカーの指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃ３４５６４）で標識した。標識された細胞を残りの細胞と混合して戻し、バイオプリンティングしてマイクロマス中にまばらな標識を付した。オルガノイドを含むトランスウェルを取り除き、少量の培地を入れた皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に平らに置くことにより、Ｄ７＋０で２つの独立したオルガノイドのセットを特徴付けた。これにより、はるかに短い作動距離でのイメージングが可能になった一方で、オルガノイドの乾燥が防止された。画像は、Ｎｉｋｏｎ １．１５ ＮＡ ４０ｘ水浸対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ Ｄｒａｇｏｎｆｌｙ回転ディスクを使用してキャプチャし、その際、０．３２５×０．３２５×０．５ミクロンのボクセルサイズで画像をキャプチャした。画像スタックの最高点および最低点を、Ｆｉｊｉの直交ビュー下で手作業で測定した。各サンプルについて、Ｙ軸に沿って、ＸＹ平面で３つのセクション（上、中、下）に均等に画像を分割した（図６Ｇ）。次に、各セクションで、画像の中央領域の３００ミクロンの範囲（中心から－Ｘ方向および＋Ｘ方向の両方に１５０ミクロン）にわたる２つの最高点および２つの最低点を記録した。すなわち、各条件について、６つの最高点および６つの最低点を収集した。オルガノイドの高さは以下のように算出した。
Ｈ（ｍｍ）＝［平均（最高６点スライド数）－平均（最低６点スライド数）］×ボクセル深さ（ｍｍ）
データは、分析およびプロットのためにＲでコンパイルした。
【0159】
レポーター細胞株の定量的イメージング
バイオプリンティングされたＤ７＋１２オルガノイドを、明視野を介して、Ａｐｏｔｏｍｅ．２蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、ｍＴａｇＢＦＰ２強度についてライブイメージングした。自動イメージングの場合、トランスウェルをガラス底の６ウェルディッシュ（ＣｅｌｌＶｉｓ）に移し、４ｘ ０．２ＮＡ Ｎｉｋｏｎ対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ Ｄｒａｇｏｎｆｌｙ回転ディスク共焦点を使用してイメージングした。Ｆｉｊｉを使用し、タイル化されたデータセットをステッチした（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，６７６－６８２．（２０１２））。ｓｃｉｋｉｔ－ｉｍａｇｅライブラリーを使用したＰｙｔｈｏｎスクリプト（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ，ｓ．ｅｔ ａｌ．ＰｅｅｒＪ，１９，２ｅ４５３．（２０１４））を使用し、ｍＴａｇＢＦＰ２シグナルの領域をセグメント化および測定した。各オルガノイドの合計サイズを、各ｍＴａｇＢＦＰ２領域の周りの凸包を算出することによって概算した。オルガノイドの長さは、各オブジェクトの主軸の長さにより概算した。手作業で検証されたセグメンテーションのエラーを示す、ｍＴａｇＢＦＰ２陽性ピクセル：合計ピクセル＞０．８の比率に基づいて、少数のオルガノイドを最終分析から除外した。
バイオプリンティングされたＤ７＋１２オルガノイドを、明視野を介して、Ａｐｏｔｏｍｅ．２蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、ｍＴａｇＢＦＰ２強度についてライブイメージングした。自動イメージングの場合、トランスウェルをガラス底の６ウェルディッシュ（ＣｅｌｌＶｉｓ）に移し、４ｘ ０．２ＮＡ Ｎｉｋｏｎ対物レンズを備えたＡｎｄｏｒ Ｄｒａｇｏｎｆｌｙ回転ディスク共焦点を使用してイメージングした。Ｆｉｊｉを使用し、タイル化されたデータセットをステッチした（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，６７６－６８２．（２０１２））。ｓｃｉｋｉｔ－ｉｍａｇｅライブラリーを使用したＰｙｔｈｏｎスクリプト（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ，ｓ．ｅｔ ａｌ．ＰｅｅｒＪ，１９，２ｅ４５３．（２０１４））を使用し、ｍＴａｇＢＦＰ２シグナルの領域をセグメント化および測定した。各オルガノイドの合計サイズを、各ｍＴａｇＢＦＰ２領域の周りの凸包を算出することによって概算した。オルガノイドの長さは、各オブジェクトの主軸の長さにより概算した。手作業で検証されたセグメンテーションのエラーを示す、ｍＴａｇＢＦＰ２陽性ピクセル：合計ピクセル＞０．８の比率に基づいて、少数のオルガノイドを最終分析から除外した。
【0160】
バルクＲＮＡｓｅｑ転写プロファイリング
Ｂｉｏｌｉｎｅ Ｉｓｏｌａｔｅ ＩＩ Ｍｉｎｉ／Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔｓ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、製造元の指示に従い使用して、ＲＮＡをＤ７＋１２オルガノイドから抽出した。ＲＮＡを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖｏｓｅｑ ６０００シーケンサーを使用するシーケンス用のライブラリーを生成させた。Ｆａｓｔｑファイルを、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（０．３５）を使用してトリミングした。ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）へのマッピングを読み取り、ＳＴＡＲアライナー（２．５．３ａ）を使用してカウントを実行した（Ｄｏｂｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２９，１５－２１．（２０１３））。ＥｄｇｅＲ（３．２６．５）（Ｒｉｔｃｈｉｅ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４３，ｅ４７（２０１５））を使用し、ライブラリーの正規化、および準尤度の負の二項一般化対数線形モデルを使用した差次的遺伝子発現試験を行った。
Ｂｉｏｌｉｎｅ Ｉｓｏｌａｔｅ ＩＩ Ｍｉｎｉ／Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔｓ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、製造元の指示に従い使用して、ＲＮＡをＤ７＋１２オルガノイドから抽出した。ＲＮＡを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖｏｓｅｑ ６０００シーケンサーを使用するシーケンス用のライブラリーを生成させた。Ｆａｓｔｑファイルを、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（０．３５）を使用してトリミングした。ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）へのマッピングを読み取り、ＳＴＡＲアライナー（２．５．３ａ）を使用してカウントを実行した（Ｄｏｂｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２９，１５－２１．（２０１３））。ＥｄｇｅＲ（３．２６．５）（Ｒｉｔｃｈｉｅ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４３，ｅ４７（２０１５））を使用し、ライブラリーの正規化、および準尤度の負の二項一般化対数線形モデルを使用した差次的遺伝子発現試験を行った。
【0161】
結果
細胞の押し出し速度を一定に保つために先端の移動速度を変更することにより、細胞がより大きな表面積に広がり、続いて凝集するときに組織の高さ（厚さ）を細かく制御できる（図５Ａ）。組織のコンフォメーションは、堆積した細胞懸濁液の体積に対するトランスウェル表面に沿った先端の動きの比率によって与えられる堆積率の観点から定義した。バイオプリンターは、同じ総細胞数（１．１×１０５細胞）を含むが、単一点の堆積（比率０、押し出し時の先端の動きなし）から長さ約１２ｍｍの細胞のライン（比率４０、押し出し時に１２ｍｍの動きあり）まで変化するオルガノイドを作成するようにプログラムした（図５Ａ、Ｆ）。最終的に、マイクロマスが「ドット」として堆積した古典的なオルガノイド構造の形成から、押し出された細胞ペーストの「ライン」として形成されたオルガノイドが得られた。堆積率の増加に伴い、本発明者らは、各オルガノイドの開始細胞の同じ絶対数をほぼ等しく（１．１×１０５細胞）維持するために、ラインの長さを増加させ、より大きな表面積に広がるより薄い細胞塊を生じさせた。これを経験的に確認するために、細胞ペーストに蛍光ビーズをスパイクし、それにより、蛍光ビーズが同程度の広がりを示す一方で、簡単に画像化され、プリンティング時に自動的に定量化されるようになった（図５Ｂ、図６）。これにより、占有されるトランスウェル表面積の１ｍｍ２当たりのビーズ数の算出が可能になった（図５Ｃ）。予想通り、細胞が長い距離に広がるにつれてビーズ密度は低下し、最も密度の高い条件と最も密度の低い条件の間で約３倍の違いが生じた（図５Ｃ）。本発明者らはまた、３Ｄ共焦点顕微鏡を使用して、バイオプリンティング後の最初の２４時間における組織の高さを測定した。細胞がまばらに標識された組織を測定することで、各オルガノイドの細胞の上限および下限の位置を注意深く特定することができ、高い堆積率が高い組織量をもたらすことを確認した（図５Ｄ、図６Ｆ～Ｇ）。
細胞の押し出し速度を一定に保つために先端の移動速度を変更することにより、細胞がより大きな表面積に広がり、続いて凝集するときに組織の高さ（厚さ）を細かく制御できる（図５Ａ）。組織のコンフォメーションは、堆積した細胞懸濁液の体積に対するトランスウェル表面に沿った先端の動きの比率によって与えられる堆積率の観点から定義した。バイオプリンターは、同じ総細胞数（１．１×１０５細胞）を含むが、単一点の堆積（比率０、押し出し時の先端の動きなし）から長さ約１２ｍｍの細胞のライン（比率４０、押し出し時に１２ｍｍの動きあり）まで変化するオルガノイドを作成するようにプログラムした（図５Ａ、Ｆ）。最終的に、マイクロマスが「ドット」として堆積した古典的なオルガノイド構造の形成から、押し出された細胞ペーストの「ライン」として形成されたオルガノイドが得られた。堆積率の増加に伴い、本発明者らは、各オルガノイドの開始細胞の同じ絶対数をほぼ等しく（１．１×１０５細胞）維持するために、ラインの長さを増加させ、より大きな表面積に広がるより薄い細胞塊を生じさせた。これを経験的に確認するために、細胞ペーストに蛍光ビーズをスパイクし、それにより、蛍光ビーズが同程度の広がりを示す一方で、簡単に画像化され、プリンティング時に自動的に定量化されるようになった（図５Ｂ、図６）。これにより、占有されるトランスウェル表面積の１ｍｍ２当たりのビーズ数の算出が可能になった（図５Ｃ）。予想通り、細胞が長い距離に広がるにつれてビーズ密度は低下し、最も密度の高い条件と最も密度の低い条件の間で約３倍の違いが生じた（図５Ｃ）。本発明者らはまた、３Ｄ共焦点顕微鏡を使用して、バイオプリンティング後の最初の２４時間における組織の高さを測定した。細胞がまばらに標識された組織を測定することで、各オルガノイドの細胞の上限および下限の位置を注意深く特定することができ、高い堆積率が高い組織量をもたらすことを確認した（図５Ｄ、図６Ｆ～Ｇ）。
【0162】
測定されたコンフォメーションでオルガノイドの複製セットを生成させ、バイオプリンティング後１２日間における分化およびパターン化が可能になった。１２日間の培養後の各オルガノイドの絶対組織高さを測定し、細胞押し出し時のおおよその開始高さと比較した（図５Ｄ、Ｅ）。両方のコンフォメーションにおいて、成長するにつれて高さが増加したが、厚い開始オルガノイドでは培養後も厚いままであった（図５Ｅ）。これらの実験では、上記のようにＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２レポーター株を使用して細胞ペーストを生成させ、複製された生サンプル全体の糸球体組織の領域にわたる効率的なイメージングを可能にした（図５Ｆ、図６）。ＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２の発現は、ＮＰＨＳ１（ネフリン）タンパク質の染色と一致し、形成中の糸球体内の有足細胞に対する、ＭＡＦＢ誘導による青色蛍光の特異性を示す（図１２）。したがって、生存するオルガノイドの蛍光イメージングは、ネフロン数の代わりとしての、ＭＡＦＢ陽性領域の定量を可能にした。画像処理スクリプトを適用して、ネフロン数の尺度として、ｍＴａｇＢＦＰ２陽性構造（糸球体のＭＡＦＢ発現有足細胞）を含む各オルガノイドの面積を算出した。長く薄い開始コンフォメーションを有するオルガノイドは、同数の開始細胞に由来するにもかかわらず、小さな厚いオルガノイドよりも総ｍＴａｇＢＦＰ２陽性糸球体面積が大きかった（図５Ｇ）。この傾向は密度の勾配全体で一貫しており、すべての条件で糸球体構造が含まれていたため、ネフロン組織全体の体積が大きいことが原因であるとも考えられた。各コンフォメーションで確認された糸球体構造の個々の糸球体の高解像度イメージングの結果、オルガノイドのコンフォメーションに関係なく同等のサイズであった（図１２）。したがって、高い堆積率でバイオプリンティングされた薄いオルガノイドは、ネフロン数の増加を示す。
【0163】
糸球体の数と同様に、オルガノイドのコンフォメーションの変化は、オルガノイドの形態に影響を与えると考えられ、その際、パターン化されていない間質組織が比率０のオルガノイドの中心で最も顕著である（図５Ｈ）。このパターン形成の変化をさらに解析するため、バルクＲＮＡｓｅｑ転写プロファイリングを実施して、比率０の「ドット」オルガノイドを２つの異なる長さ（比率２０および比率４０）の「ライン」オルガノイドと比較した。上皮形成に関連する遺伝子（ＣＤＨ１、ＥＰＣＡＭ）、ならびに尿細管のパターン形成および機能に関連する遺伝子（ＨＮＦ４Ａ、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＳＬＣ１２Ａ１）は、比率４０（Ｒ４０）で上方制御され、血管（ＦＬＴ１、ＳＯＸ１７、ＰＥＣＡＭ）および間質／線維芽細胞（ＴＨＹ１、ＤＣＮ）の発生は、比率０（Ｒ０）で上方制御された（図７Ａ）。経路変化のＧＯ分析の結果、バイオプリンティングされたＲ０ドットと比較して、Ｒ４０ラインにおいて、膜輸送、細胞外の２２８の組織化、および細胞間接着の改善も示唆された（図７Ｂ）。かかる変化は、細胞型の相対比またはかかる細胞型内の遺伝子発現の個々のレベルの変化を反映している可能性がある。糸球体（内因性ｍＴａｇＢＦＰ２）、近位尿細管（ＨＮＦ４Ａ）、および内皮細胞（ＳＯＸ１７）の位置を示す、比率０および比率４０の染色オルガノイドの高解像度イメージングの結果、ドットでは、血管網を含む組織の広い縁の存在が明らかになり、それはラインでは減少していることが解った（図７Ｄ）。これらの従来のマイクロマスドットは、非特異的な二次抗体染色によって証明されるように、ネフロンが形成されていない明確な中心コアも示した（図７Ｄ）。逆に、オルガノイドがラインとしてバイオプリンティングされた場合、ネフロンは組織の幅全体に均一に存在していた（図７Ｄ）。
【0164】
実施例６．オルガノイドのコンフォメーション間の細胞組成および成熟に関する、単一細胞のＲＮＡｓｅｑによる比較
オルガノイドのコンフォメーションが変化するとネフロンの均一性に明らかな変化がある一方で、同じ細胞株で実施した場合でも、個々のオルガノイド分化実験間のパターンの変化があることについての重要な証拠が、過去に確認されている。形態に関するこの変化の再現性を検証し、細胞型の相対的な組成または個々の構成細胞の成熟が、オルガノイドの製造モード（手作業対バイオプリンティング）またはコンフォメーション（点対ライン）によって変化するか否かを判断するため、本発明者らは、３つのオルガノイドコンフォメーション（手作業オルガノイド、バイオプリンティング比０の堆積「ドット」［Ｒ０］、およびバイオプリンティング比４０の堆積「ライン」［Ｒ４０］）の広範な転写プロファイリング（単一細胞ＲＮＡシーケンス；ｓｃＲＮＡｓｅｑ）を実施した。
オルガノイドのコンフォメーションが変化するとネフロンの均一性に明らかな変化がある一方で、同じ細胞株で実施した場合でも、個々のオルガノイド分化実験間のパターンの変化があることについての重要な証拠が、過去に確認されている。形態に関するこの変化の再現性を検証し、細胞型の相対的な組成または個々の構成細胞の成熟が、オルガノイドの製造モード（手作業対バイオプリンティング）またはコンフォメーション（点対ライン）によって変化するか否かを判断するため、本発明者らは、３つのオルガノイドコンフォメーション（手作業オルガノイド、バイオプリンティング比０の堆積「ドット」［Ｒ０］、およびバイオプリンティング比４０の堆積「ライン」［Ｒ４０］）の広範な転写プロファイリング（単一細胞ＲＮＡシーケンス；ｓｃＲＮＡｓｅｑ）を実施した。
【0165】
材料および方法
単一細胞ＲＮＡシーケンシングライブラリーの生成および解析
４つの複製オルガノイドセットを生成させ、ここで、各複製は、３つの単層培養ウェルに由来するＤ７分化ｉＰＳＣの独立したプールに由来するものとした。各プールについて、細胞をバイオプリンターにロードし、ウェル当たり３つのＲ０「ドット」および３つのＲ４「ライン」からなるパターンを、１０～１２ウェル（２プレート）にわたってプリンティングした。同時に、細胞プールの残りの部分を、手作業オルガノイドを生成するために使用した。バイオプリンティングされたオルガノイドは、それぞれ１．１×１０５細胞から生成させた一方で、手作業オルガノイドは、２．３×１０５細胞から生成させたが、これは、小さな塊を手作業で操作することが技術的に不可能だったためである。細胞が常に短時間でロードおよびプリンティングされるよう、複製セットを同じ日に順次処理した。細胞をロード後約１０分でプリンティングし、ロード～約２０分以内にランを完了させた。
単一細胞ＲＮＡシーケンシングライブラリーの生成および解析
４つの複製オルガノイドセットを生成させ、ここで、各複製は、３つの単層培養ウェルに由来するＤ７分化ｉＰＳＣの独立したプールに由来するものとした。各プールについて、細胞をバイオプリンターにロードし、ウェル当たり３つのＲ０「ドット」および３つのＲ４「ライン」からなるパターンを、１０～１２ウェル（２プレート）にわたってプリンティングした。同時に、細胞プールの残りの部分を、手作業オルガノイドを生成するために使用した。バイオプリンティングされたオルガノイドは、それぞれ１．１×１０５細胞から生成させた一方で、手作業オルガノイドは、２．３×１０５細胞から生成させたが、これは、小さな塊を手作業で操作することが技術的に不可能だったためである。細胞が常に短時間でロードおよびプリンティングされるよう、複製セットを同じ日に順次処理した。細胞をロード後約１０分でプリンティングし、ロード～約２０分以内にランを完了させた。
【0166】
オルガノイドは、過去に公表された方法（Ｖａｎｓｌａｍｂｒｏｕｃｋ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ３０，１８１１－１８２３（２０１９））に従い、Ｄ７＋１２で分離させた。Ｒ０およびＲ４０のそれぞれについて、３つのウェル（条件ごとに３つ、ウェルごとに３つ）に由来する９つのオルガノイドを分離させた。手作業では、複製物ごとに３つのオルガノイドを分離させた。Ｓｏｅｃｋｉｕｓら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１９，２２４．（２０１８））の方法に従って、複製物を多重化した。細胞を氷上で２０分間、１μｇのＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＴｏｔａｌＳｅｑ－Ａ抗ヒトハッシュタグオリゴ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＴｏｔａｌＳｅｑ－Ａ０２５１、０２５２、０２５３、０２５４）で染色した。細胞を３回洗浄した後、シーケンシングのために等しい比率でプールした。各サスペンション／条件（手作業、Ｒ０、Ｒ４０）ごとに、同じサイズの各複製物のプールで構成される単一のライブラリーを生成させた（セット１～４）。ライブラリーは、標準的な１０ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ ｖ３．１プロトコルに従って製造したが、１０ｘデバイスの「スーパーローディング」は約３０ｋ細胞で実施した（Ｌｕｎ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５，２１２２．（２０１６））。ハッシュタグオリゴ（ＨＴＯ）ライブラリーは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社のプロトコルに従って作製した。シーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖｏｓｅｑを使用して実施した。
【0167】
ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（３．１．０）を使用して１０ｘ ｍＲＮＡライブラリーを逆多重化し、細胞当たりのＵＭＩカウントのマトリックスを生成させた。ＨＴＯライブラリーは、Ｃｉｔｅ－ｓｅｑ－ｃｏｕｎｔ（１．４．３）を使用して逆多重化し、細胞バーコードごとのＨＴＯカウントのマトリックスを生成させた。すべてのデータをＳｅｕｒａｔ（３．１．４）にロードし、ＨＴＯライブラリーをｍＲＮＡライブラリーと照合した。Ｓｅｕｒａｔを使用してＨＴＯカウントを正規化し、カットオフを決定して、細胞ごとにＨＴＯ ＩＤを割り当てた（カットオフは通常、細胞当たり１００～２００カウントとした）。ミトコンドリア含有量が１５％を超える細胞、または遺伝子数が１０００未満の細胞と同様に、ダブレットおよび割り当てられていない細胞を除外し、最終サイズが手作業では９９６３細胞、Ｒ０では８９１２細胞、Ｒ４０では１３５２５細胞と、選別処理されたデータセットを取得した。２０細胞未満のカウントであった遺伝子を除外した。組み合わせたデータセットには、細胞当たり２０３４個の遺伝子の中央値が含まれ、また細胞当たり５４９９個のＵＭＩカウントの中央値が含まれていた。
【0168】
ＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ法（Ｌｕｎ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５，２１２２．（２０１６））を使用してデータを正規化し、Ｓｅｕｒａｔを使用して統合し、単一のデータセットを取得した。クラスタリングを最初に実施し、間質、ネフロン、または内皮コンパートメントに属するクラスタリングを識別した。Ｃｌｕｓｔｒｅｅパッケージ（Ｗｏｌｏｃｋ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ，８：２８１－２９１（２０１９））を使用して、クラスタリングを視覚化し、安定したクラスタリング解像度を決定した。ネフロンおよび間質の集団をＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍで再び正規化し、クラスター化し、細胞の不均一性のより詳細な解像度のビューを得た。このレベルの解像度で、本発明者らは、Ｓｃｒｕｂｌｅｔ（０．２．１）（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｎ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２９，８０６－８２４．（２０１８））を使用して、高い算出ダブレットスコア、および２つの既知の細胞タイプを組み合わせたように見えるアイデンティティを有するクラスターを識別することができた。これらは、単一のＨＴＯのＩＤで構成される識別できないダブレットであると推定され、以降の解析からは除外した。Ｓｅｕｒａｔ ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓ関数を使用してマーカー解析を実行し、０．２５ｌｏｇ倍の変化を超える陽性マーカー（つまり、クラスター内での発現の増加）に限定した。マーカーリストをエクスポートし、クラスターのアイデンティティを、公開されているヒト単一細胞データとの比較（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７，Ｗ３０５－３１１．（２００９））またはＴｏｐｐＦｕｎを使用した遺伝子オントロジー分析（Ｂｅｒｇ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６，１２２６－１２３２．（２００９））によって決定した。
【0169】
Ｓｃａｔｅｒ（１．１２．２）のｓｕｍＣｏｕｎｔｓＡｃｒｏｓｓＣｅｌｌｓ関数を使用して、差次的発現試験を実施し、クラスターごと、複製物ごとに「疑似バルク」カウントを生成するためにカウントを合計し、１２の条件（オルガノイドのコンフォメーションごとに４つの複製物）にわたる遺伝子カウントのマトリックスを生成させた。このカウントのマトリックスを、ｇｌｍＱＬＦＦｉｔ関数に設けられた準尤度の負の二項一般化対数線形モデルを使用してＥｄｇｅＲ（３．２６．５）で差次的発現試験を行うためのインプットとして使用した。クラスター内の差次的発現試験では、３つ以上のクラスターで差次的に発現しているように見える遺伝子をさらなる解析から除外し、潜在的なバッチ効果を取り除き、より生物学的に関連する可能性のある特定の細胞型に特異的な遺伝子に焦点を当てた。頻繁に変化する遺伝子は、ミトコンドリアおよびリボソームの遺伝子である傾向が見られた。調整されたｐ値が０．０５未満の場合、遺伝子は差次的に発現しているとみなした。
【0170】
細胞同一性の予測を使用した、オルガノイドとヒト胎児腎臓とのデータ比較
Ｈｏｃｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１８で公表された１１、１３、１６、１８週目の単一細胞データセットの生のｆａｓｔｑファイルを、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓからダウンロードし、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒを使用してリファレンスゲノムＧＲＣｈ３８－３．０．０にマッピングした。Ｓｅｕｒａｔパッケージ（３．１．５）５２は、品質管理および解析を実行するために使用した。７５０未満の特徴を有する細胞を除外し、ＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ法を使用してｒａｗのカウントを正規化およびスケーリングし、ディメンジョン削減（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を実施した。ＳｅｕｒａｔＷｒａｐｐｅｒｓパッケージ（０．１．０）内に設けられるｆａｓｔＭＮＮ法を使用してデータセットを統合した。最初のクラスタリングの後、ネフロンとして識別されたサブセットを単離し、再度解析し、前駆細胞、前鞘細胞、有足細胞、前尿細管、遠位尿細管、および近位尿細管の細胞集団を識別した。有足細胞および近位細胞集団をさらに解析し、これらの細胞系内に存在する成熟の段階を特定した。細胞型を識別するために使用するモデルは、参照としての統合されたヒト胎児腎臓データのネフロンサブセットに基づくｓｃＰｒｅｄパッケージ（０．０．０．９）を使用して生成させた。これにより、細胞をネフロンのサブカテゴリ（前駆細胞、前鞘、有足細胞、前尿細管、遠位尿細管、近位尿細管）の１つに分類するモデルを作成した。次に、このモデルをオルガノイド単一細胞データセットに適用して、構成細胞の型（ｔｙｐｅ）を定義した。
Ｈｏｃｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１８で公表された１１、１３、１６、１８週目の単一細胞データセットの生のｆａｓｔｑファイルを、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓからダウンロードし、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒを使用してリファレンスゲノムＧＲＣｈ３８－３．０．０にマッピングした。Ｓｅｕｒａｔパッケージ（３．１．５）５２は、品質管理および解析を実行するために使用した。７５０未満の特徴を有する細胞を除外し、ＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ法を使用してｒａｗのカウントを正規化およびスケーリングし、ディメンジョン削減（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を実施した。ＳｅｕｒａｔＷｒａｐｐｅｒｓパッケージ（０．１．０）内に設けられるｆａｓｔＭＮＮ法を使用してデータセットを統合した。最初のクラスタリングの後、ネフロンとして識別されたサブセットを単離し、再度解析し、前駆細胞、前鞘細胞、有足細胞、前尿細管、遠位尿細管、および近位尿細管の細胞集団を識別した。有足細胞および近位細胞集団をさらに解析し、これらの細胞系内に存在する成熟の段階を特定した。細胞型を識別するために使用するモデルは、参照としての統合されたヒト胎児腎臓データのネフロンサブセットに基づくｓｃＰｒｅｄパッケージ（０．０．０．９）を使用して生成させた。これにより、細胞をネフロンのサブカテゴリ（前駆細胞、前鞘、有足細胞、前尿細管、遠位尿細管、近位尿細管）の１つに分類するモデルを作成した。次に、このモデルをオルガノイド単一細胞データセットに適用して、構成細胞の型（ｔｙｐｅ）を定義した。
【0171】
結果
実験結果のばらつきに対処するため、各条件の反復実験を表す４つの個別にバーコード化された細胞プールからライブラリーを生成させ、それにより、条件間での集団および遺伝子発現の両方の変化を確実に評価できるようになった。各複製オルガノイドセットを、分化したｉＰＳＣ（ＭＡＦＢｍＴＡＧＢＦＰ２ＧＡＴＡ３ｍＣｈｅｒｒｙ）細胞の別個の開始プールから生成させ、Ｒ０ドットおよびＲ４０ラインを生成させるためにバイオプリンティングし、一方で、手作業オルガノイドを同じ細胞から並行して作製した（図８Ａ）。選別されたｓｃＲＮＡｓｅｑライブラリーは、オルガノイドコンフォメーション当たり８０００超の個々の細胞トランスクリプトームを表す。生成されたすべてのオルガノイド（ｎ＝２２９オルガノイド、１０プレートにわたる４つの複製セットから）の糸球体（ＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２）および遠位ネフロン（ＧＡＴＡ３ｍＣｈｅｒｒｙ）蛍光の定量により、すべてのコンフォメーションにおいて、以前に観察されたオルガノイド形態の存在が確認され、そこでは、同じ開始細胞数にもかかわらず、バイオプリンティングされた細胞ラインにおいてはネフロンの存在量が明確かつ定量可能に増加していた（図８Ｂ、図９）。バイオプリンティングされたラインには、上記の技術的制限により多くの開始細胞数から作製された手作業で作製されたオルガノイドと比較し、より多くのネフロンが含まれていた（手作業：２．３×１０５、Ｒ４０：１．１×１０５、図８Ｂ、図９）。
実験結果のばらつきに対処するため、各条件の反復実験を表す４つの個別にバーコード化された細胞プールからライブラリーを生成させ、それにより、条件間での集団および遺伝子発現の両方の変化を確実に評価できるようになった。各複製オルガノイドセットを、分化したｉＰＳＣ（ＭＡＦＢｍＴＡＧＢＦＰ２ＧＡＴＡ３ｍＣｈｅｒｒｙ）細胞の別個の開始プールから生成させ、Ｒ０ドットおよびＲ４０ラインを生成させるためにバイオプリンティングし、一方で、手作業オルガノイドを同じ細胞から並行して作製した（図８Ａ）。選別されたｓｃＲＮＡｓｅｑライブラリーは、オルガノイドコンフォメーション当たり８０００超の個々の細胞トランスクリプトームを表す。生成されたすべてのオルガノイド（ｎ＝２２９オルガノイド、１０プレートにわたる４つの複製セットから）の糸球体（ＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２）および遠位ネフロン（ＧＡＴＡ３ｍＣｈｅｒｒｙ）蛍光の定量により、すべてのコンフォメーションにおいて、以前に観察されたオルガノイド形態の存在が確認され、そこでは、同じ開始細胞数にもかかわらず、バイオプリンティングされた細胞ラインにおいてはネフロンの存在量が明確かつ定量可能に増加していた（図８Ｂ、図９）。バイオプリンティングされたラインには、上記の技術的制限により多くの開始細胞数から作製された手作業で作製されたオルガノイドと比較し、より多くのネフロンが含まれていた（手作業：２．３×１０５、Ｒ４０：１．１×１０５、図８Ｂ、図９）。
【0172】
すべての単一細胞データセットは、Ｓｅｕｒａｔ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３６，４１１－４２０．（２０１８））を使用して統合し、それにより、すべてのオルガノイドのコンフォメーションにおける内皮、間質、ネフロンクラスターの幅広い特定を可能にした（図１０Ａ～Ｃ）。
【0173】
バルクプロファイリングで見られる差次的遺伝子発現に寄与する細胞型を決定するため（図７）、各主要な細胞型を組み合わせた転写プロファイルを使用し、「疑似バルク」発現プロファイルを再作成した。これにより、Ｒ０ドットのバルクＲＮＡｓｅｑで上方制御された遺伝子が内皮細胞のマーカーであり、Ｒ４０系統で上方制御された遺伝子がネフロンマーカーであることが確認された（図１０Ｈ）。
【0174】
すべてのオルガノイドコンフォメーション内に存在する間質細胞の再クラスター化により、１０個の異なるクラスターが明らかになった（図８Ｃ）。バイオプリンティングされたオルガノイドでは、クラスター７（ＷＮＴ５Ａ、ＬＨＸ９を発現）が増加し、クラスター１０（ＺＩＣ１、ＺＩＣ４を発現）が減少する傾向があったが、これらの差は統計的に有意ではなかった（図８Ｄ、図１０）。全体として、すべての間質クラスターはすべてのオルガノイドコンフォメーションに存在し、各細胞型の割合に統計的な有意差はなかった。Ｒ０および手作業のオルガノイドでは中央部がパターン化されていないことを考慮すると、これは驚くべきことであった。しかしながら、データセットの大部分（ＭＥＩＳ１／２／３、ＳＩＸ１およびＳＯＸ９）を識別する間質マーカーの蛍光抗体法を使用したこれらのオルガノイドの再度の解析から、この中央領域の細胞性が低下した領域の存在が示唆された（図１３）。したがって、中央部のコアは、細胞クラスターに対しあまり貢献しないと考えられた。
【0175】
ｓｃＲＮＡｓｅｑデータセット内のネフロン系統細胞の高解像度の再クラスタリングにより、すべてのオルガノイドのコンフォメーションにすべての主要なネフロン細胞型が存在することが明らかになり（図８Ｅ～Ｆ、図１０Ｄ～Ｅ）、有足細胞ではＭＡＦＢ、近位尿細管ではＨＮＦ４Ａ、遠位尿細管クラスターではＧＡＴＡ３が明確に発現していた（図１０Ｄ～Ｅ）。バイオプリンティングされたオルガノイドでは、手作業のオルガノイドと比較し、初期の有足細胞（「Ｐｒｅ－Ｐｏｄ」）の分布の有意な増加（平均値は約５％対約１０～１５％）（図８Ｆ）、および有足細胞（「Ｐｏｄ」）の増加傾向があり、また手作業およびＲ０オルガノイドでは遠位尿細管の分布の増加傾向があり、後者は、Ｒ０オルガノイドにおける遠位尿細管を発現するＧＡＴＡ３ｍＣｈｅｒｒｙの割合の増加によって裏付けられる（図９Ｄ）。しかしながら、識別されたすべての細胞クラスターは、すべてのオルガノイドのコンフォメーションで存在していた（図８Ｆ、図１０Ｄ）。本発明者らは、パターン化はすべてのオルガノイドのコンフォメーション間で非常に類似しているが、形成されたネフロンの総数はバイオプリンティングされたラインの方が多いと結論付けている。
【0176】
バイオプリンティングされたラインとして生成された腎臓オルガノイドは、近位尿細管の成熟の改善およびネフロン数の増加を示す。
成熟における潜在的な違いを評価するために、本発明者らは、コンフォメーション間で発現に有意な差が見られる各細胞クラスター内の遺伝子を同定した。これにより、特に遠位ネフロンの同一性において、手作業のオルガノイドとＲ４０のバイオプリンティングされたラインとの最も大きい差異が明らかになった（図８Ｇ）。Ｒ０とＲ４０のバイオプリンティングされたオルガノイド間での個々のネフロン細胞型の差異は少なく、ネフロン前駆細胞内で最も多くの差次的に発現する遺伝子が生じた（図８Ｇ）。重要なことに、手作業オルガノイドと比較し、バイオプリンティングされたＲ４０ラインでは、近位尿細管上皮の成熟が改善されたことを示す証拠が存在したが、バイオプリンティングされたＲ０ドットではそうではなかった。重要な溶質チャネル（ＳＬＣ３０Ａ１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＳＵＬＴ１Ｅ１）ならびに脂肪酸代謝関連遺伝子ＦＡＢＰ３などの、成熟した尿細管の機能および代謝に関連することが公知であった遺伝子は、手作業オルガノイドの近位尿細管細胞と比較し、Ｒ４０で有意に増加した（図８Ｈ）。逆に、手作業オルガノイド細胞におけるＪＡＧ１およびＳＰＰ１などのマーカーの有意に高い発現は、成熟度が低いことを示唆していた（図８Ｈ）。
成熟における潜在的な違いを評価するために、本発明者らは、コンフォメーション間で発現に有意な差が見られる各細胞クラスター内の遺伝子を同定した。これにより、特に遠位ネフロンの同一性において、手作業のオルガノイドとＲ４０のバイオプリンティングされたラインとの最も大きい差異が明らかになった（図８Ｇ）。Ｒ０とＲ４０のバイオプリンティングされたオルガノイド間での個々のネフロン細胞型の差異は少なく、ネフロン前駆細胞内で最も多くの差次的に発現する遺伝子が生じた（図８Ｇ）。重要なことに、手作業オルガノイドと比較し、バイオプリンティングされたＲ４０ラインでは、近位尿細管上皮の成熟が改善されたことを示す証拠が存在したが、バイオプリンティングされたＲ０ドットではそうではなかった。重要な溶質チャネル（ＳＬＣ３０Ａ１、ＳＬＣ５１Ｂ、ＳＵＬＴ１Ｅ１）ならびに脂肪酸代謝関連遺伝子ＦＡＢＰ３などの、成熟した尿細管の機能および代謝に関連することが公知であった遺伝子は、手作業オルガノイドの近位尿細管細胞と比較し、Ｒ４０で有意に増加した（図８Ｈ）。逆に、手作業オルガノイド細胞におけるＪＡＧ１およびＳＰＰ１などのマーカーの有意に高い発現は、成熟度が低いことを示唆していた（図８Ｈ）。
【0177】
間質クラスター内の差次的発現分析により、間質クラスター０、１、２および３内のコンフォメーション間の最大の差異が特定された（図８Ｉ）。初期の腎臓形成間葉に最も類似しているクラスター２および３は、ＨＯＸＡ１１、ＦＯＸＣ２、ＥＹＡ１、およびＳＩＸ１などの、バイオプリンティングＲ４０ラインにおける腎臓の発生関連遺伝子、ならびに発生シグナル伝達関連遺伝子であるＷＮＴ５ＡおよびＲＳＰＯ３の有意な上方制御を示した（図８Ｊ～Ｌ）。すなわち、この間質細胞型はすべてのコンフォメーションに存在していたが、バイオプリンティングされたラインでは、これらの細胞は初期のネフロン前駆細胞により近い同一性を有していると考えられる。これは、バイオプリンティングされたラインにおけるネフロンの増加に寄与し得る。
【0178】
別個のオルガノイドのコンフォメーションの成熟をより明確に比較するために、本発明者らは、ヒト胎児腎臓との直接比較に基づいて、オルガノイド内の各細胞の細胞同一性を予測する独立した解析アプローチを使用した。ｓｃＰｒｅｄ法を使用して、本発明者らは、公表されたヒト胎児腎臓（妊娠１１～１８週）のｓｃＲＮＡトレーニングデータセットとの転写類似性に基づいて、細胞の同一性を予測するモデルを作製した（図１４Ａ）。このモデルは、すべてのオルガノイドデータを再度解析して、オルガノイド内の細胞型の偏りのない予測を提供するために使用した。このアプローチにより、Ｒ４０オルガノイド内の前有足細胞の有意な増加が再び確認された（図１４Ｂ）。Ｒ４０近位尿細管細胞クラスターで差次的に発現することが示された遺伝子は、ヒト胎児腎臓の最も成熟した近位尿細管細胞内で選択的に発現した（図１４Ｄ）。したがって、実験的変動にもかかわらず、バイオプリンティングされたラインは、他のコンフォメーションと比較し、ネフロン成熟の改善および糸球体数の増加を示したと結論付けることができる。
【0179】
実施例７．ネフロン数が増加した、バイオプリンティングされた腎臓組織パッチ
幹細胞由来の腎臓組織の臨床的使用では、移植される組織に存在するネフロン構造の数を大幅に増やす能力が必要となる。本明細書において、本発明者らは、驚くべきことに、押し出しバイオプリンティングを使用して腎臓オルガノイドのコンフォメーションを変化させることにより、所定の開始細胞数から最終的なネフロン数を最大化することが可能となることを見出した。これは、コンフォメーションの変化が腎臓組織の広がりを増大させ得ることを示唆している。
幹細胞由来の腎臓組織の臨床的使用では、移植される組織に存在するネフロン構造の数を大幅に増やす能力が必要となる。本明細書において、本発明者らは、驚くべきことに、押し出しバイオプリンティングを使用して腎臓オルガノイドのコンフォメーションを変化させることにより、所定の開始細胞数から最終的なネフロン数を最大化することが可能となることを見出した。これは、コンフォメーションの変化が腎臓組織の広がりを増大させ得ることを示唆している。
【0180】
材料および方法
近位尿細管の機能アッセイ
機能的取り込みアッセイを、６ウェルのトランスウェルプレート上で培養されたＤ７＋１４のＨＮＦ４ＡＹＦＰ由来のパッチオルガノイドで実施し、上記のように分化および生成させた。オルガノイドを、ＴｅＳＲ－Ｅ６（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１：５００で溶解させたテトラメチルローダミンイソチオシネート－ウシアルブミン（ＴＲＩＴＣ－アルブミン；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）基質とともに一晩インキュベートし（標準的な３７℃のＣＯ２インキュベーター条件）、トランスウェルのインサートの下の基底外側コンパートメントに添加した。インキュベーション後、オルガノイドをハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３回洗浄し、ガラス底の６ウェルプレートに移し、ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でライブでイメージングした。
近位尿細管の機能アッセイ
機能的取り込みアッセイを、６ウェルのトランスウェルプレート上で培養されたＤ７＋１４のＨＮＦ４ＡＹＦＰ由来のパッチオルガノイドで実施し、上記のように分化および生成させた。オルガノイドを、ＴｅＳＲ－Ｅ６（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１：５００で溶解させたテトラメチルローダミンイソチオシネート－ウシアルブミン（ＴＲＩＴＣ－アルブミン；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）基質とともに一晩インキュベートし（標準的な３７℃のＣＯ２インキュベーター条件）、トランスウェルのインサートの下の基底外側コンパートメントに添加した。インキュベーション後、オルガノイドをハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３回洗浄し、ガラス底の６ウェルプレートに移し、ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でライブでイメージングした。
【0181】
結果
実施例２および５で説明した方法、ならびに一連の平行なラインを生成するスクリプト（図１１Ａ）を使用して、比率３０のラインと同じ押し出しパラメーターを使用して、バイオプリンティングされた腎臓組織パッチを押し出した。バイオプリンティングされた腎臓組織パッチには、約４．８×６ｍｍの全範囲にわたって合計約４×１０５個の細胞が含まれていた（図１１Ｂ、Ｃ）。得られた腎臓組織パッチを、培養の１２日後および１４日後に、明視野での照明および内因性ＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰレポーターシグナルおよび追加の腎臓マーカーの共焦点イメージングによって解析した。これらの解析により、パッチ全体に上皮構造およびＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２を発現する糸球体が均一に分布していること、ならびに比率０のドットオルガノイドで観察されたようなネフロンを欠く中央領域がないことが明らかになった（図１１Ｂ、Ｃ）。パッチオルガノイドはまた、ＳＯＸ１７を発現する間質性内皮細胞に囲まれた、近位尿細管（ＬＴＬおよびＨＮＦ４Ａ）およびヘンレＴＡＬの遠位尿細管／ループ（ＳＬＣ１２Ａ１）のマーカーを発現する、正しくパターン化されたネフロンを示した（図１１Ｄ）。
実施例２および５で説明した方法、ならびに一連の平行なラインを生成するスクリプト（図１１Ａ）を使用して、比率３０のラインと同じ押し出しパラメーターを使用して、バイオプリンティングされた腎臓組織パッチを押し出した。バイオプリンティングされた腎臓組織パッチには、約４．８×６ｍｍの全範囲にわたって合計約４×１０５個の細胞が含まれていた（図１１Ｂ、Ｃ）。得られた腎臓組織パッチを、培養の１２日後および１４日後に、明視野での照明および内因性ＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰレポーターシグナルおよび追加の腎臓マーカーの共焦点イメージングによって解析した。これらの解析により、パッチ全体に上皮構造およびＭＡＦＢｍＴａｇＢＦＰ２を発現する糸球体が均一に分布していること、ならびに比率０のドットオルガノイドで観察されたようなネフロンを欠く中央領域がないことが明らかになった（図１１Ｂ、Ｃ）。パッチオルガノイドはまた、ＳＯＸ１７を発現する間質性内皮細胞に囲まれた、近位尿細管（ＬＴＬおよびＨＮＦ４Ａ）およびヘンレＴＡＬの遠位尿細管／ループ（ＳＬＣ１２Ａ１）のマーカーを発現する、正しくパターン化されたネフロンを示した（図１１Ｄ）。
【0182】
代替腎組織は、糸球体濾過、ならびに水および選択された溶質の尿細管再吸収／分泌など、それらのインビボ対応物と同様の機能的能力を有するネフロンを含まなければならない。溶質の再吸収における近位尿細管の重要性を考慮し、ＨＮＦ４Ａプロモーターの制御下で黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）が挿入された近位尿細管特異的ｉＰＳＣレポーター株（ＨＮＦ４ＡＹＦＰｉＰＳ細胞）から、パッチオルガノイドを生成させた。ＨＮＦ４ＡＹＦＰ由来のバイオプリンティングパッチを、糸球体および近位尿細管の有足細胞で発現されるメガリンおよびキュビリン受容体に対する親和性を有する蛍光標識タンパク質基質（ＴＲＩＴＣ－アルブミン）中で一晩インキュベートした。ライブ共焦点イメージングにより、ＹＦＰ陽性近位尿細管へのＴＲＩＴＣアルブミンの特異的な取り込みが明らかになり、これらのネフロンセグメントの機能が確認された（図１１Ｅ）。
【0183】
押し出された単位細胞当たりの相対糸球体数は、比の設定を０から４０に変化させることにより約２．５～５倍に増加することが示されたため、５×１０５細胞の押し出しによって生成される４．８×６ｍｍのパッチには最大２５０～５００個のネフロンが含まれ得ると予想される。したがって、１０×１２ｍｍのパッチは１０００個のネフロンを生成し得る。
【0184】
まとめると、これらのデータは、幅広いバイオエンジニアリングまたはスクリーニングの用途に適する機能的な腎臓組織を生成させるための、パッチオルガノイドの潜在的な用途を印象付けるものである。
【0185】
実施例８．バイオプリンティングされたオルガノイドの移植の比較例
実施例２で生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイド（または一点堆積（比０）腎臓組織）をマウスに移植した。８週齢のレシピエントマウス（ｎ＝８、非肥満糖尿病／重症複合免疫不全症（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をイソフルランで麻酔し、手術前に痛みを和らげるためにテムゲシック（ブプレノルフィン）を注射した。体幹温度を３７℃に維持した。側部を切開して腎臓を露出させ、腎被膜に小さな切開を行った。７＋１８日間培養されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドを二分し、左右の腎臓の腎被膜下に移植した。７日後および２８日後にマウスを麻酔して安楽死させ、腎臓を採取した。
実施例２で生成されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイド（または一点堆積（比０）腎臓組織）をマウスに移植した。８週齢のレシピエントマウス（ｎ＝８、非肥満糖尿病／重症複合免疫不全症（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をイソフルランで麻酔し、手術前に痛みを和らげるためにテムゲシック（ブプレノルフィン）を注射した。体幹温度を３７℃に維持した。側部を切開して腎臓を露出させ、腎被膜に小さな切開を行った。７＋１８日間培養されたバイオプリンティングされた腎臓オルガノイドを二分し、左右の腎臓の腎被膜下に移植した。７日後および２８日後にマウスを麻酔して安楽死させ、腎臓を採取した。
【0186】
バイオプリンティングされたオルガノイド（７日目＋１８日目）を、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で４℃で２０分間固定した。オルガノイドを透過処理し、ＰＢＳ中の０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ中の１０％ロバ血清で２時間ブロッキングした。一次抗体で一晩インキュベートし、二次抗体で室温で２時間または４℃で一晩、インキュベートし、検出した。マウス腎被膜下のオルガノイドをＴｉｓｓｕｅＴｅｋで急速凍結するか、２％ＰＦＡで２０分間固定し、ホールマウント分析のためにＰＢＳ中に保存した。凍結した腎臓切片（厚さ５～１０μｍ）を２％ＰＦＡで室温で１０分間固定し、ＰＢＳ中の０．３％ＴｒｉｔｏｎＸで１５分間透過処理した。Ｍｏｕｓｅ ｏｎ Ｍｏｕｓｅ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔを使用して、バイオプリンティングされた腎臓オルガノイドおよびマウス腎臓の構造を検出した。
【0187】
移植および非移植オルガノイドの免疫蛍光特性の評価は、ＮＰＨＳ１（ＡＦ４２６９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＷＴ１（ＳＣ－１９２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＵＢＩＬＩＮ（ＳＣ２０６０７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＤ３１（５５５４４４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＥＣＡＤ（６１０１８１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＴＬ－ビオチン結合（Ｂ－１３２５、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などの抗体を使用して実施でき、またはその他の例では、ＭＥＣＡ－３２（５５３８４９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのオルガノイド由来の組織または抗体を強調表示して、マウス由来の細胞型、本例ではマウス内皮を標識する。ライブ蛍光イメージングは、レポーター株を使用して生成されたバイオプリンティングされたオルガノイドにも使用できる。
【0188】
移植されたオルガノイドは、パラフィン包埋組織を使用して試験し、ヘマトキシリンおよびエオシンなどの様々な免疫化学的染色、または過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を使用して染色した後、組織学的試験のために切片化することもできる。移植されたオルガノイドは、透過型または走査型電子顕微鏡を使用して試験することもできる。
【0189】
本明細書に記載の結果は、バイオプリンティングされたオルガノイドが移植され、移植後も生存し続け、血管系を誘引し、成熟の改善を示すことができることを示唆する。本発明の結果は、移植アッセイを使用して、レポーターｉＰＳＣ株または患者由来のｉＰＳＣ株などの様々な開始細胞株から生成されたバイオプリンティングオルガノイド間の、相対的な尿細管の成熟および結果の成功如何を比較することができることも示唆する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
