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特許7600245ヒト又はキメラＭＨＣタンパク質複合体を有する遺伝子組換え非ヒト動物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-06
(45)【発行日】2024-12-16
(54)【発明の名称】ヒト又はキメラＭＨＣタンパク質複合体を有する遺伝子組換え非ヒト動物
(51)【国際特許分類】
A01K 67/0278 20240101AFI20241209BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241209BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241209BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20241209BHJP
A01K 67/0271 20240101ALI20241209BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20241209BHJP
C07K 14/74 20060101ALN20241209BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20241209BHJP
【ＦＩ】
A01K67/0278 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/12
G01N33/15 Z
A01K67/0271
C07K19/00
C07K14/74
C07K14/705
【請求項の数】
35
(21)【出願番号】P 2022542077
(86)(22)【出願日】2021-01-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-06
(86)【国際出願番号】 CN2021070967
(87)【国際公開番号】W WO2021139799
(87)【国際公開日】2021-07-15
【審査請求日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】202010028231.9
(32)【優先日】2020-01-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】521213200
【氏名又は名称】バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094112
【弁理士】
【氏名又は名称】岡部 讓
(74)【代理人】
【識別番号】100136799
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 亜希
(72)【発明者】
【氏名】シェン，ユエレイ
(72)【発明者】
【氏名】グオ，チャオシェ
(72)【発明者】
【氏名】チャン，メイリン
(72)【発明者】
【氏名】フアン，ルイ
(72)【発明者】
【氏名】グオ，ヤナン
(72)【発明者】
【氏名】バイ，ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ヤオ，ジアウェイ
(72)【発明者】
【氏名】シャン，チェンチャン
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／０５６７７４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／１９０９２２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５１０９９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５３２４１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０２０／００４６２２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５０４８９５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ａ０１Ｋ ６７／０２７－６７／０２７８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及びヒト又はヒト化主要組織適合複合体（ＭＨＣ）α鎖を含む融合タンパク質を発現する遺伝子組換え非ヒト動物であって、前記融合タンパク質は、ヒトＢ２Ｍタンパク質と、ヒトＨＬＡ－Ａα１及びα２ドメイン及びマウスＨ２－Ｄ１α３ドメインを含むキメラＭＨＣα鎖とを含むか、あるいは前記融合タンパク質は、ヒトＢ２Ｍタンパク質及びヒトＨＬＡ－Ａタンパク質を含み、
前記ヒトＨＬＡ－Ａは、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１であり、
内因性Ｂ２Ｍを発現しなく、
内因性Ｂ２Ｍの領域をコードする配列は、前記融合タンパク質をコードする配列と置換され、内因性Ｂ２Ｍの前記領域をコードする前記配列は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１、エクソン２及びエクソン３を含み、
前記融合タンパク質は、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチドをさらに含み、
マウスであり、
Ｂ２Ｍ及び前記ＭＨＣα鎖は、互いに会合し、機能的ＭＨＣタンパク質複合体を形成することができ、前記タンパク質複合体は、非自己抗原を１つ以上の細胞の表面に提示することができる、遺伝子組換え非ヒト動物。
【請求項2】
前記動物のゲノムは、前記融合タンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つの染色体を含む、請求項１に記載の動物。
【請求項3】
前記融合タンパク質をコードする前記配列は、前記少なくとも１つの染色体における内因性β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座で内因性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される、請求項２に記載の動物。
【請求項4】
前記ヒトＢ２Ｍ及び前記ヒトＨＬＡ－Ａは、リンカーペプチド配列を介して連結される、請求項１に記載の動物。
【請求項5】
前記ヒトＢ２Ｍは、配列番号４又は配列番号４のアミノ酸２１～１１９の配列を有するＢ２Ｍのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４に記載の動物。
【請求項6】
前記ヒトＨＬＡ－Ａは、配列番号５９又は配列番号５９のアミノ酸２２～３６２のアミノ酸配列を有するヒトＨＬＡ－Ａのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４又は５に記載の動物。
【請求項7】
前記融合タンパク質は、配列番号６２のアミノ酸配列を有する前記融合タンパク質のアミノ酸配列に対して１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４～６のいずれか一項に記載の動物。
【請求項8】
前記ヒトＢ２Ｍ及び前記キメラＭＨＣα鎖は、リンカーペプチド配列を介して連結される、請求項１に記載の動物。
【請求項9】
前記キメラＭＨＣα鎖は、内因性ＭＨＣα３ドメイン及び内因性ＭＨＣ細胞質領域をさらに含む、請求項１に記載の動物。
【請求項10】
前記キメラＭＨＣα鎖は、内因性ＭＨＣのα３ドメイン、Ｃペプチド、膜貫通領域及び細胞質領域を含む、請求項１に記載の動物。
【請求項11】
マウスであり、及び前記キメラＭＨＣα鎖は、マウスＨ２－Ｄ１のα３ドメイン、Ｃペプチド、膜貫通領域及び細胞質領域を含む、請求項１に記載の動物。
【請求項12】
前記キメラＭＨＣα鎖は、配列番号６のアミノ酸配列を有するマウスＨ２－Ｄ１のアミノ酸２０７～３６２に対して少なくとも９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の動物。
【請求項13】
前記融合タンパク質は、配列番号６１又は配列番号６３のアミノ酸配列を有する前記融合タンパク質のアミノ酸配列に対して１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の動物。
【請求項14】
前記ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチドは、前記融合タンパク質のＮ末端にある、請求項１～１３のいずれか一項に記載の動物。
【請求項15】
前記シグナルペプチドは、配列番号５９のアミノ酸配列を有するヒトＨＬＡ－Ａ２．１のアミノ酸１～２１に対して少なくとも９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の動物。
【請求項16】
前記融合タンパク質をコードする前記配列に対してヘテロ接合性である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の動物。
【請求項17】
前記融合タンパク質をコードする前記配列に対してホモ接合性である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の動物。
【請求項18】
内因性ＭＨＣα鎖を発現しない、請求項１～１７のいずれか一項に記載の動物。
【請求項19】
ヒトＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）は、前記提示された非自己抗原を認識し、且つ免疫応答を開始することができる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の動物。
【請求項20】
内因性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）は、前記提示された非自己抗原を認識し、且つ免疫応答を開始することができる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の動物。
【請求項21】
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドを有するマウスである、請求項１に記載の動物。
【請求項22】
免疫不全マウスである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の動物。
【請求項23】
前記動物の前記ゲノムは、前記動物の内因性ＣＤ１３２遺伝子における破壊を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の動物。
【請求項24】
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ／ｓｃｉｄヌードマウス又はＢ－ＮＤＧマウスである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の動物。
【請求項25】
追加的なヒト又はキメラタンパク質をコードする配列をさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の動物。
【請求項26】
前記追加的なヒト又はキメラタンパク質は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、リンパ球活性化３（ＬＡＧ－３）、Ｂ及びＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＳＩＲＰα、ＣＤ４７、ＴＨＰＯ、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）又はＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）である、請求項２５に記載の動物。
【請求項27】
癌の治療のための薬剤又は薬剤の組み合わせの有効性を判定する方法であって、腫瘍細胞を、請求項１～２６のいずれか一項に記載の動物に移植し、それにより前記動物において１つ以上の腫瘍を形成することと；
前記薬剤又は前記薬剤の組み合わせを前記動物に投与することと；
前記腫瘍に対する阻害効果を判定することと
を含む方法。
【請求項28】
前記腫瘍細胞を前記動物に移植する前に、ヒト末梢血細胞（ｈＰＢＭＣ）又はヒト造血幹細胞は、前記動物に注射される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記腫瘍細胞は、癌細胞株に由来する、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記腫瘍細胞は、ヒト患者から得られた腫瘍サンプルに由来する、請求項２７に記載の方法。
【請求項31】
前記阻害効果は、前記動物における腫瘍体積を測定することによって判定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項32】
前記腫瘍細胞は、メラノーマ細胞、肺癌細胞、原発性肺癌細胞、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞、原発性胃癌細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞及び／又は前立腺癌細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項33】
ヒト血液リンパ系を含む動物を作製する方法であって、ヒト造血細胞又はヒト末梢血細胞を含む細胞の集団を、請求項１～２６のいずれか一項に記載の動物に移植することを含む方法。
【請求項34】
前記ヒト血液リンパ系は、造血幹細胞、骨髄前駆体細胞、骨髄系細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、好中球、肥満細胞、リンパ球及び血小板からなる群から選択されるヒト細胞を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記移植前に前記動物を照射することをさらに含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質複合体を発現する遺伝子組換え動物及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩタンパク質は、免疫系の適応ブランチにおける中心的役割を果たす。両方のタンパク質クラスは、Ｔ細胞による認識のため、細胞表面上にペプチドを提示するタスクを共有する。免疫原性ペプチド－ＭＨＣクラスＩ（ｐＭＨＣＩ）複合体は、有核細胞上に提示され、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。それに対して、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ又はＢ細胞）によるｐＭＨＣＩＩの提示は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、エフェクター細胞の協調及び調節をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
ヒトＭＨＣタンパク質複合体は、高度に多型であり、動物のＭＨＣと異なる。この差異は、薬剤開発におけるより高い失敗率をもたらすことがある。特に、インビボ薬理学的試験における通常の実験動物の使用から得られた試験結果は、ヒトにおける実際の病態及び細胞相互作用を反映しないことがあり、そのため、多くの臨床試験における結果は、動物実験結果と有意に異なり得る。ヒト免疫系により類似する免疫系をもたらし得る遺伝子改変動物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本開示は、ヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質複合体を発現する遺伝子組換え動物に関する。いくつかの実施形態では、動物は、（例えば、ＣＤ１３２遺伝子ノックアウトを有する）免疫不全動物モデルとして使用される。ＭＨＣがＴ細胞発現に関与することから、ヒト又はヒト化ＭＨＣは、再構築されたヒト免疫系を有する動物モデルにおけるＴ細胞発現にとってより良好な環境を提供し得る。
【0005】
一態様では、本開示は、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及びヒト又はヒト化主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、ＭＨＣα鎖）を含む融合タンパク質を発現する遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
【0006】
いくつかの実施形態では、動物のゲノムは、融合タンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つの染色体を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ヒト又はヒト化Ｂ２Ｍタンパク質を含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩα鎖である。
【0009】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣα鎖は、ヒトＨＬＡ－Ａタンパク質である。
【0010】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣα鎖は、キメラＭＨＣα鎖である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣα鎖は、ヒトＨＬＡ－Ａ／マウスＨ２－Ｄ１キメラ分子である。
【0011】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＢ２Ｍタンパク質と、ヒトＨＬＡ－Ａα１及び／又はα２ドメインを含むキメラＭＨＣα鎖とを含む。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、マウスＨ２－Ｄ１ドメイン（例えば、α１、α２及び／又はα３ドメイン）をさらに含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＢ２Ｍタンパク質及びヒトＨＬＡ－Ａタンパク質を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、少なくとも１つの染色体における内因性β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座で内因性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。
【0014】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、少なくとも１つの染色体における内因性ＭＨＣ遺伝子座で内因性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。
【0015】
いくつかの実施形態では、動物は、マウスであり、及びＭＨＣ分子をコードする配列は、少なくとも１つの染色体におけるマウスＨ２－Ｄ１遺伝子座で内因性調節エレメントに作動可能に連結される。
【0016】
いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１である。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、ヒトＨＬＡ－Ａ１＊０１０１である。
【0017】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、（ａ）ヒトＢ２Ｍ；及び（ｂ）ヒトＨＬＡ－Ａを含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍ及びヒトＨＬＡ－Ａは、リンカーペプチド配列を介して連結される。
【0019】
いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍは、配列番号４又は配列番号４のアミノ酸２１～１１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【0020】
いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、ＨＬＡ－Ａ２．１又はＨＬＡ－Ａ１＊０１０１である。
【0021】
いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、配列番号８、配列番号８のアミノ酸２５～３６５、配列番号５９又は配列番号５９のアミノ酸２２～３６２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【0022】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【0023】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、（ａ）ヒトＢ２Ｍ；及び（ｂ）キメラＭＨＣα鎖を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍ及びキメラＭＨＣα鎖は、リンカーペプチド配列を介して連結される。
【0025】
いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍは、配列番号４又は配列番号４のアミノ酸２１～１１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【0026】
いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、ヒトＨＬＡ－Ａα１及びα２ドメインを含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、ヒトＨＬＡ－Ａα３ドメインをさらに含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、内因性ＭＨＣα３ドメイン及び／又は内因性ＭＨＣ細胞質領域をさらに含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、配列番号８、配列番号８のアミノ酸２５～２０６、配列番号５９又は配列番号５９のアミノ酸２２～２０３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、内因性ＭＨＣのα３ドメイン、Ｃペプチド、膜貫通領域及び細胞質領域を含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、動物は、マウスであり、及びキメラＭＨＣは、マウスＨ２－Ｄ１のα３ドメイン、Ｃペプチド、膜貫通領域及び細胞質領域を含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣは、配列番号６のアミノ酸２０７～３６２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣは、配列番号６１又は配列番号６３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、（例えば、融合タンパク質のＮ末端において）ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチドをさらに含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号５９のアミノ酸１～２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、動物は、ヒト若しくはヒト化ＭＨＣα鎖又は融合タンパク質をコードする配列に対してヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、動物は、ヒト若しくはヒト化ＭＨＣα鎖又は融合タンパク質をコードする配列に対してホモ接合性である。
【0037】
一態様では、本開示は、遺伝子組換え非ヒト動物であって、そのゲノムは、ヒトＨＬＡ－Ａα１ドメイン、ヒトＨＬＡ－Ａα２ドメイン及び内因性ＭＨＣα３ドメインを含むキメラＭＨＣα鎖をコードする配列を含む少なくとも１つの染色体を含む、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
【0038】
いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖をコードする配列は、少なくとも１つの染色体における内因性ＭＨＣ遺伝子座で内因性調節エレメントに作動可能に連結される。
【0039】
いくつかの実施形態では、動物のゲノムは、ヒトＢ２Ｍをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍ及びキメラＭＨＣα鎖は、互いに会合し、動物内で機能的ＭＨＣタンパク質複合体を形成することができる。
【0040】
いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍをコードする配列は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座で内因性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。
【0041】
いくつかの実施形態では、動物は、マウスであり、及びキメラＭＨＣα鎖をコードする配列は、マウスＨ２－Ｄ１遺伝子座で内因性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。
【0042】
いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１である。
【0043】
一態様では、本開示は、遺伝子組換え非ヒト動物であって、そのゲノムは、ヒトＨＬＡ－Ａをコードする配列を含む少なくとも１つの染色体を含む、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
【0044】
いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａをコードする配列は、少なくとも１つの染色体における内因性ＭＨＣ遺伝子座で内因性調節エレメントに作動可能に連結される。
【0045】
いくつかの実施形態では、動物のゲノムは、ヒトＢ２Ｍをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍ及びヒトＨＬＡ－Ａは、互いに会合し、動物内で機能的ＭＨＣタンパク質複合体を形成することができる。
【0046】
いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍをコードする配列は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座で内因性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。
【0047】
いくつかの実施形態では、動物は、マウスであり、及びヒトＨＬＡ－Ａをコードする配列は、マウスＨ２－Ｄ１遺伝子座で内因性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。
【0048】
いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１である。
【0049】
いくつかの実施形態では、動物は、内因性Ｂ２Ｍを発現しない。
【0050】
いくつかの実施形態では、動物は、内因性ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣα鎖）を発現しない。
【0051】
いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ及びＭＨＣα鎖は、互いに会合し、機能的ＭＨＣタンパク質複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、非自己抗原を１つ以上の細胞の表面に提示することができる。
【0052】
いくつかの実施形態では、ヒトＴ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）は、提示された非自己抗原を認識し、且つ免疫応答を開始することができる。いくつかの実施形態では、内因性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）は、提示された非自己抗原を認識し、且つ免疫応答を開始することができる。
【0053】
いくつかの実施形態では、動物は、哺乳動物、例えばサル、齧歯類又はマウスである。いくつかの実施形態では、動物は、（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドを有する）マウスである。
【0054】
いくつかの実施形態では、動物のゲノムは、動物の内因性ＣＤ１３２遺伝子における破壊を含む。いくつかの実施形態では、動物は、Ｂ－ＮＤＧマウス、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ／ｓｃｉｄヌードマウス又はＢ－ＮＤＧマウスである。いくつかの実施形態では、動物は、免疫不全マウスである。
【0055】
いくつかの実施形態では、動物は、追加的なヒト又はキメラタンパク質をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加的なヒト又はキメラタンパク質は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、リンパ球活性化３（ＬＡＧ－３）、Ｂ及びＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＳＩＲＰα、ＣＤ４７、ＴＨＰＯ、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）又はＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）である。
【0056】
一態様では、本開示は、遺伝子組換え非ヒト動物を作製するための方法であって、動物の少なくとも１つの細胞において、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座で、内因性Ｂ２Ｍの領域をコードする配列を、ヒトＢ２Ｍをコードする配列又は本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列と置換することを含む方法に関する。
【0057】
いくつかの実施形態では、内因性Ｂ２Ｍの領域をコードする配列は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１、エクソン２及びエクソン３の全て又は一部を含む。
【0058】
一態様では、本開示は、遺伝子組換え非ヒト動物を作製するための方法であって、動物の少なくとも１つの細胞において、内因性ＭＨＣ遺伝子座で、内因性ＭＨＣ遺伝子の領域をコードする配列を、ヒトＭＨＣ遺伝子をコードする配列又は融合タンパク質をコードする配列と置換することを含む方法に関する。
【0059】
いくつかの実施形態では、内因性ＭＨＣの領域をコードする配列は、内因性ＭＨＣ遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及びエクソン８の全て又は一部を含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、動物は、マウスであり、及び内因性ＭＨＣの領域をコードする配列は、マウスＨ２－Ｄ１遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３の全て又は一部を含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、以下のエレメント：（ａ）ヒトＢ２Ｍのエクソン１、エクソン２及び／又はエクソン３；（ｂ）リンカーペプチド配列をコードする任意選択的な配列；及び（ｃ）ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のエクソン２及び／又はエクソン３を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、エレメント（ｃ）の下流にある内因性ＭＨＣのエクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及び／又はエクソン８をさらに含む。
【0062】
いくつかの実施形態では、動物は、マウスであり、及び融合タンパク質をコードする配列は、マウスＨ２－Ｄ１遺伝子の３’ＵＴＲをさらに含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３又は配列番号６４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0064】
一態様では、本開示は、癌の治療のための薬剤又は薬剤の組み合わせの有効性を判定する方法であって、腫瘍細胞を、本明細書に記載の動物に移植し、それにより動物において１つ以上の腫瘍を形成することと；薬剤又は薬剤の組み合わせを動物に投与することと；腫瘍に対する阻害効果を判定することとを含む方法に関する。
【0065】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞を動物に移植する前に、ヒト末梢血細胞（ｈＰＢＭＣ）又はヒト造血幹細胞は、動物に注射される。
【0066】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、癌細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ヒト患者から得られた腫瘍サンプルに由来する。
【0067】
いくつかの実施形態では、阻害効果は、動物における腫瘍体積を測定することによって判定される。
【0068】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、メラノーマ細胞、肺癌細胞、原発性肺癌細胞、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞、原発性胃癌細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞及び／又は前立腺癌細胞である。
【0069】
一態様では、本開示は、ヒト血液リンパ系を含む動物を作製する方法であって、ヒト造血細胞又はヒト末梢血細胞を含む細胞の集団を、本明細書に記載の動物に移植することを含む方法に関する。
【0070】
いくつかの実施形態では、ヒト血液リンパ系は、造血幹細胞、骨髄前駆体細胞、骨髄系細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、好中球、肥満細胞、リンパ球及び血小板からなる群から選択されるヒト細胞を含む。
【0071】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、移植前に動物を照射することをさらに含む。
【0072】
一態様では、本開示は、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及びヒト又はヒト化主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子を含む融合タンパク質に関する。
【0073】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸に関する。
【0074】
一態様では、本開示は、アミノ酸配列を含むタンパク質に関する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、以下：
（ａ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示されるアミノ酸配列と１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１アミノ酸以下だけ異なるアミノ酸配列；及び
（ｅ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示されるアミノ酸配列に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超えるアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含むアミノ酸配列
の１つである。
（ａ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示されるアミノ酸配列と１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１アミノ酸以下だけ異なるアミノ酸配列；及び
（ｅ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示されるアミノ酸配列に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超えるアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含むアミノ酸配列
の１つである。
【0075】
一態様では、本開示は、ヌクレオチド配列を含む核酸に関する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、以下：
（ａ）本明細書に記載のタンパク質をコードする配列；
（ｂ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４又は６５；
（ｃ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４又は６５に対して少なくとも９０％同一である配列；及び
（ｄ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４又は６５に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列
の１つである。
（ａ）本明細書に記載のタンパク質をコードする配列；
（ｂ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４又は６５；
（ｃ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４又は６５に対して少なくとも９０％同一である配列；及び
（ｄ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４又は６５に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列
の１つである。
【0076】
一態様では、本開示は、本明細書に記載のタンパク質及び／又は核酸を含む細胞に関する。一態様では、本開示は、本明細書に記載のタンパク質及び／又は核酸を含む動物に関する。
【0077】
一態様では、遺伝子組換え非ヒト動物であって、そのゲノムは、融合タンパク質（例えば、キメラポリペプチド）を発現する配列を含む少なくとも１つの染色体を含む、遺伝子組換え非ヒト動物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＢ２Ｍタンパク質の全て若しくは一部及び／又はヒトＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣα鎖）の全て若しくは一部を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、本開示に記載される融合タンパク質のいずれか１つである。
【0078】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、野生型ヒトＭＨＣ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ）のタンパク質活性（例えば、抗原提示）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％を含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、少なくとも１つの染色体における内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座で内因性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、少なくとも１つの染色体における内因性ＭＨＣ遺伝子座で内因性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、動物は、マウスであり、及び融合タンパク質をコードする配列は、少なくとも１つの染色体におけるマウスＨ２－Ｄ１遺伝子座で内因性調節エレメントに作動可能に連結される。
【0080】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の破壊、欠失又は遺伝子修飾を含む非ヒト哺乳動物細胞に関する。
【0081】
いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ又はそのインビトロ転写物を含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、受精卵細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、胚細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、胚盤胞である。
【0083】
別の態様では、本開示は、非ヒト哺乳動物モデルが本明細書に記載の方法を通して得られることを特徴とする、腫瘍を有する非ヒト哺乳動物モデルに関する。
【0084】
本開示は、非ヒト哺乳動物又はその子孫或いは腫瘍を有する非ヒト哺乳動物に由来する細胞若しくは細胞株又はその初代細胞培養物にも関する。
【0085】
本開示は、非ヒト哺乳動物若しくはその子孫又は腫瘍を有する非ヒト哺乳動物に由来する組織、臓器若しくはその培養物にさらに関する。
【0086】
別の態様では、本開示は、腫瘍を有するときの非ヒト哺乳動物若しくはその子孫又は腫瘍を有する非ヒト哺乳動物に由来する腫瘍組織に関する。
【0087】
本開示は、非ヒト哺乳動物若しくはその子孫又は腫瘍を有する非ヒト哺乳動物の使用にさらに関し、動物モデルは、ヒト細胞の免疫プロセスに関する産物の発現、ヒト抗体の作製又は薬理学、免疫学、微生物学及び医学における研究のためのモデル系において、本明細書に記載の方法を通して作製される。
【0088】
本開示は、非ヒト哺乳動物若しくはその子孫又は腫瘍を有する非ヒト哺乳動物の使用にも関し、動物モデルは、ヒト細胞を含む免疫プロセスの動物実験疾患モデルの作製及び利用、病原体に関する試験又は新しい診断方法及び／若しくは治療方法の開発において、本明細書に記載の方法を通して作製される。
【0089】
別途定義されない限り、本明細書で用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。方法及び材料が本発明における使用のために本明細書に説明され；当技術分野で公知の他の好適な方法及び材料も使用可能である。材料、方法及び例は、あくまで例示目的であり、限定することを意図されていない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー及び他の参考文献は、その全体が参照により援用される。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先することになる。
【0090】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【0091】
免疫不全動物は、疾患の機序及びかかる疾患を治療する方法を試験するための不可欠な研究ツールである。免疫不全動物は、それらの免疫不全により異種細胞又は組織を容易に受け入れることができ、研究で広く使用されている。一般に使用される免疫不全動物として、例えば、ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ
マウス、ＮＯＤ－Ｒａｇ１－／－－ＩＬ２ｒｇ－／－（ＮＲＧ）、Ｒａｇ２－／－－ＩＬ２ｒｇ－／－（ＲＧ）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）及びＮＯＤ／ＳＣＩＤヌードマウスが挙げられる。それらの中で、ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ
マウスは、移植にとって最適なレシピエントマウスであり得る。これらマウスの一部は、例えば、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．”Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９．３（２０１２）：２０８；及び米国特許出願公開第２０１９０３２０６３１Ａ１号明細書（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）に詳述されている。
【0092】
Ｔ細胞は、自己ＭＨＣタンパク質に関連するが、外来ＭＨＣタンパク質に関連しない抗原を認識する。即ち、Ｔ細胞がＭＨＣ制限を示すことは、十分に確立されている。この制限は、胸腺におけるＴ細胞発生中のポジティブ選択のプロセスに起因する。このプロセスでは、自己ＭＨＣタンパク質によって提示された外来ペプチドを認識する能力がある未成熟Ｔ細胞が選択されて生存する一方、動物にとって有効とならない残りのものは、アポトーシスを受ける。したがって、ＭＨＣ制限は、Ｔ細胞が胸腺において発生するときに顕在化する免疫系の後天的特性である。しかし、これらの免疫不全動物（例えば、ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ
）では、免疫不全動物のＭＨＣは、依然として内因性ＭＨＣである。ヒト細胞又は組織の移植後、ヒト由来免疫細胞は、免疫療法後又は病原体の感染後に動物の胸腺におけるヒトＨＬＡによって媒介される制限プロセスを通過することができず、ヒトＭＨＣの制限を反映することができない。したがって、場合により、移植されたヒトＴ及びＢ細胞は、これらの免疫不全動物における機能的成熟が十分ではない。
【0093】
本開示は、ヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質複合体を発現する遺伝子組換え動物及びその使用方法に関する。いくつかの実施形態では、動物は、（例えば、ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ
、ＮＯＤ－Ｒａｇ１－／－－ＩＬ２ｒｇ－／－（ＮＲＧ）、Ｒａｇ２－／－－ＩＬ２ｒｇ－／－（ＲＧ）又はＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）バックグラウンドを有する）免疫不全動物である。ヒト又はヒト化ＭＨＣは、移植されたヒト免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞）が成熟するためのより適した環境をもたらし、特に、これらの動物は、ヒトに対する様々な治療法の有効性を判定するためのより駆動型のモデルを提供する。
【0094】
主要組織適合複合体
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、癌又はウイルス由来の抗原ペプチドを提示することによるＴ細胞免疫応答によって誘導される身体の防御機構において主要な役割を果たす。ＭＨＣは、クラスＩ又はクラスＩＩとして分類される。クラスＩは、胚細胞及び赤血球を除く全ての体細胞内で発現される。ＭＨＣクラスＩタンパク質複合体は、α鎖（アルファ鎖又は重鎖）及びβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）として知られるより小さい鎖からなる。α鎖は、抗原ペプチドを保持する溝の形成に関連するα１及びα２ドメイン並びに細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）表面上に発現される共受容体ＣＤ８分子への結合に関連するα３ドメインからなる。ＭＨＣクラスＩ分子と同様に、クラスＩＩ分子もヘテロ二量体であり、２つのペプチドα及びβ鎖を有する。
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、癌又はウイルス由来の抗原ペプチドを提示することによるＴ細胞免疫応答によって誘導される身体の防御機構において主要な役割を果たす。ＭＨＣは、クラスＩ又はクラスＩＩとして分類される。クラスＩは、胚細胞及び赤血球を除く全ての体細胞内で発現される。ＭＨＣクラスＩタンパク質複合体は、α鎖（アルファ鎖又は重鎖）及びβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）として知られるより小さい鎖からなる。α鎖は、抗原ペプチドを保持する溝の形成に関連するα１及びα２ドメイン並びに細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）表面上に発現される共受容体ＣＤ８分子への結合に関連するα３ドメインからなる。ＭＨＣクラスＩ分子と同様に、クラスＩＩ分子もヘテロ二量体であり、２つのペプチドα及びβ鎖を有する。
【0095】
ヒト及びマウスの両方は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ遺伝子を有する。ヒトでは、古典的クラスＩ遺伝子がＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃと称される一方、マウスでは、それらは、Ｈ－２Ｋ、Ｈ－２Ｄ及びＨ－２Ｌである。クラスＩ分子では、α鎖（重鎖としても公知である）は、多型であり、より小さい鎖Ｂ２Ｍ（軽鎖としても公知である）は、一般に、多型でない。α鎖は、３つのドメイン（α１、α２及びα３）を有する。通常、α鎖遺伝子のエクソン１は、リーダー配列をコードし、エクソン２及び３は、α１及びα２ドメインをコードし、エクソン４は、α３ドメインをコードし、エクソン５は、膜貫通ドメインをコードし、エクソン６及び７は、細胞質側末端をコードする。α鎖は、（Ｉｇ様ドメインに類似する）α１及びα２ドメイン、続いてβ２ミクログロブリンに類似するα３ドメインを含むペプチド結合間隙を形成する。
【0096】
クラスＩ ＭＨＣは、腫瘍細胞を含む全ての有核細胞上で発現される。それらは、詳細には、細胞の中でも特に、Ｔ及びＢリンパ球、マクロファージ、樹状細胞及び好中球で発現され、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対する表面上にペプチド断片（典型的には８～１０アミノ酸長）を提示するように機能する。ＣＴＬは、それ自体の膜結合ＴＣＲによって認識されるＭＨＣＩ結合ペプチドを有する任意の細胞を殺傷するように専門化される。細胞が、（例えば、ウイルス、腫瘍又は他の非自己起源の）通常提示されない細胞タンパク質由来のペプチドを提示するとき、かかるペプチドがＣＴＬによって認識されることで活性化されるようになり、ペプチドを提示する細胞を殺傷する。
【0097】
本開示は、ヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）ＭＨＣタンパク質複合体、ＭＨＣクラスＩポリペプチド又はＢ２Ｍを発現する遺伝子組換え動物に関する。本明細書で用いられるとき、用語「ＭＨＣＩ複合体」又は「ＭＨＣクラスＩ複合体」は、ＭＨＣＩα鎖ポリペプチド及びＢ２Ｍポリペプチドによって形成された複合体を指す。いくつかの実施形態では、ＭＨＣＩα鎖ポリペプチド及びＢ２Ｍポリペプチドは、一緒に融合される。用語「ＭＨＣＩポリペプチド」又は「ＭＨＣクラスＩポリペプチド」は、本明細書で用いられるとき、ＭＨＣＩα鎖ポリペプチド単独を指す。
【0098】
β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）
上記で考察したように、野生型ＭＨＣクラスＩ分子は、２つのポリペプチド鎖、α及びβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）からなるヘテロ二量体である（図１）。２つの鎖は、Ｂ２Ｍ及びα３ドメインの相互作用を介して非共有結合的に連結される。α鎖のみが多型であり、ＨＬＡ遺伝子によってコードされる。Ｂ２Ｍサブユニットは、多型でなく、Ｂ２Ｍ遺伝子によってコードされる。α３ドメインは、原形質膜に及び、且つＴ細胞のＣＤ８共受容体と相互作用する。α３－ＣＤ８相互作用がＭＨＣＩ分子をその場所に保持する一方、細胞傷害性Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、そのα１－α２ヘテロ二量体リガンドに結合し、共役ペプチドの抗原性についてチェックする。α１及びα２ドメインは、折り畳み、ペプチドが結合するための溝を形成する。ＭＨＣクラスＩ分子は、主に８～１０アミノ酸長であるペプチドに結合する。
上記で考察したように、野生型ＭＨＣクラスＩ分子は、２つのポリペプチド鎖、α及びβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）からなるヘテロ二量体である（図１）。２つの鎖は、Ｂ２Ｍ及びα３ドメインの相互作用を介して非共有結合的に連結される。α鎖のみが多型であり、ＨＬＡ遺伝子によってコードされる。Ｂ２Ｍサブユニットは、多型でなく、Ｂ２Ｍ遺伝子によってコードされる。α３ドメインは、原形質膜に及び、且つＴ細胞のＣＤ８共受容体と相互作用する。α３－ＣＤ８相互作用がＭＨＣＩ分子をその場所に保持する一方、細胞傷害性Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、そのα１－α２ヘテロ二量体リガンドに結合し、共役ペプチドの抗原性についてチェックする。α１及びα２ドメインは、折り畳み、ペプチドが結合するための溝を形成する。ＭＨＣクラスＩ分子は、主に８～１０アミノ酸長であるペプチドに結合する。
【0099】
Ｂ２Ｍ（β２Ｍ、β２ミクログロブリン又はベータ２ミクログロブリンとして公知である）は、ほぼ全ての有核細胞並びに血清、尿及び滑液を含む大部分の生体液に存在する低分子タンパク質（約１１，８００ダルトン）である。ヒトβ２Ｍは、マウスタンパク質に対する７０％のアミノ酸配列類似性を示し、それらは、いずれもシンテニー染色体上に位置する。Ｂ２Ｍの二次構造は、単一のジスルフィド架橋によって連結された２つのβシートに組織化され、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインに典型的な古典的βサンドイッチを提示する７つのβ鎖からなる。Ｂ２Ｍは、膜貫通領域を有さず、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩを含む他の適応免疫分子と共有する、定常な１つのＩｇスーパーファミリードメインと称される特徴的な分子構造を有する。２つの進化的保存されたトリプトファン（Ｔｒｐ）残基は、Ｂ２Ｍの正確な構造的フォールド及び機能にとって重要である。Ｔｒｐ６０は、タンパク質ループの頂端で溶媒に曝露され、ＭＨＣＩにおけるＢ２Ｍの会合を促進するのに決定的である。
【0100】
通常、Ｂ２Ｍは、他のポリペプチド鎖（α鎖）と非共有結合的に連結され、ＭＨＣＩ、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、表面抗原分類１（ＣＤ１）、ヒトヘモクロマトーシスタンパク質（ＨＦＥ）、Ｑａなどを含むＭＨＣＩ又はそのような構造を形成する。Ｂ２Ｍは、α鎖の３つ全てのドメインと広範に接触する。したがって、α鎖の立体構造は、Ｂ２Ｍの存在に高度に依存する。α１及びα２ドメインは、分子中で異なるが、α３ドメイン及びＢ２Ｍは、分子間相互作用が生じる場合、比較的保存される。Ｂ２Ｍとの接触ポイントのいくつかの残基は、ＭＨＣＩ又はそのような分子の中で共有される。さらに、α１及びα２ドメインとの相互作用は、天然抗原の存在下でのα３ドメイン及びＢ２Ｍの対会合にとって重要である。Ｂ２Ｍは、かかる分子から解離し、血清中に流出することができ、Ｂ２Ｍは、腎臓に輸送され、分解及び排泄される。８８ｋＤのタンパク質（カルネキシン）は、小胞体内部で新規に合成されたマウスＭＨＣＩ分子と急速且つ量的に会合する。Ｂ２Ｍ及びペプチドの両方は、効率的なカルネキシンの解離及びそれに続くＭＨＣＩの輸送に必要とされる。
【0101】
Ｂ２Ｍは、ＭＨＣＩ又はそのような分子の三次構造を安定化し得る。それは、癌細胞における生存、増殖、アポトーシス、さらに転移といった機能的調節にも広範に関与する。
【0102】
Ｂ２Ｍ及びその機能の詳細な説明は、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｂｅｔａ ２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ：Ａ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ．”Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ １２９．４（２０１６）：４４８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ β２－Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｍｉｎｉｍｉｚｅｓ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，”Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４．１０（２０１５）：１２３４－１２４５（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【0103】
ヒトゲノムにおいて、Ｂ２Ｍ遺伝子（遺伝子ＩＤ：５６７）の遺伝子座は、エクソン１、エクソン２、エクソン３及びエクソン４といった４つのエクソンを有する（図２）。Ｂ２Ｍタンパク質は、シグナルペプチドも有する。ヒトＢ２Ｍ ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド配列は、ＮＭ＿００４０４８．４（配列番号３）であり、ヒトＢ２Ｍにおけるアミノ酸配列は、ＮＰ＿００４０３９．１（配列番号４）である。ヒトＢ２Ｍのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列における各エクソン及び各領域の位置が以下に列記される。
【0104】
【表1】
【0105】
ヒトＢ２Ｍ遺伝子（遺伝子ＩＤ：５６７）は、ヒトゲノムの染色体１５に位置し、ＮＣ＿００００１５．１０（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３（ＧＣＦ＿０００００１４０５．３９））の４４，７１１，４８７～４４，７１８，８７７に位置する。転写物ＮＭ＿００４０４８．３に基づき、５’ＵＴＲは、４４，７１１，５１７～４４，７１１，５４６であり、エクソン１は、４４，７１１，６１４～４４，７１１，６１３であり、第１のイントロンは、４４，７１１，６１４～４４，７１５，４２２であり、エクソン２は、４４，７１５，４２３～４４，７１５，７０１であり、第２のイントロンは、４４，７１５，７０２～４４，７１６，３２８であり、エクソン３は、４４，７１６，３２９～４４，７１６，３５６であり、第３のイントロンは、４４，７１６，３５７～４４，７１７，６０６であり、エクソン４は、４４，７１７，６０７～４４，７１８，１４５であり、３’ＵＴＲは、４４，７１６，３４３～４４，７１６，３５６及び４４，７１７，６０７～４４，７１８，１４５である。ヒトＢ２Ｍ遺伝子座についての全ての関連情報は、遺伝子ＩＤ：５６７を有するＮＣＢＩウェブサイトにおいて見出すことができる（その全体が参照により本明細書に援用される）。
【0106】
マウスでは、Ｂ２Ｍ遺伝子座は、エクソン１、エクソン２、エクソン３及びエクソン４の４つのエクソンを有する（図２）。マウスＢ２Ｍタンパク質は、シグナルペプチドも有する。マウスＢ２Ｍ ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド配列は、ＮＭ＿００９７３５．３（配列番号１）であり、マウスＢ２Ｍにおけるアミノ酸配列は、ＮＰ＿０３３８６５．２（配列番号２）である。マウスＢ２Ｍのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列における各エクソン及び各領域の位置が以下に列記される。
【0107】
【表2】
【0108】
マウスＢ２ｍ遺伝子（遺伝子ＩＤ：１２０１０）は、マウスゲノムの染色体２に位置し、ＮＣ＿００００６８．７（ＧＲＣｍ３８．ｐ６（ＧＣＦ＿０００００１６３５．２６））の１２２，１４７，６８６～１２２，１５３，０８３に位置する。転写物ＮＭ＿００９７３５．３に基づき、５’ＵＴＲは、１２２，１４７，６８６～１２２，１４７，７３６であり、エクソン１は、１２２，１４７，６８６～１２２，１４７，８０４であり、第１のイントロンは、１２２，１４７，８０５～１２２，１５０，８７２であり、エクソン２は、１２２，１５０，８７３～１２２，１５１，１５１であり、第２のイントロンは、１２２，１５１，１５２～１２２，１５１，６４６であり、エクソン３は、１２２，１５１，６４７～１２２，１５１，６７５であり、第３のイントロンは、１２２，１５１，６７６～１２２，１５２，６５０であり、エクソン４は、１２２，１５２，６５１～１２２，１５３，０８３であり、３’ＵＴＲは、１２２，１５１，６６１～１２２，１５３，０８３である。マウスＢ２ｍ遺伝子座についての全ての関連情報は、遺伝子ＩＤ：１２０１０を有するＮＣＢＩウェブサイトにおいて見出すことができる（その全体が参照により本明細書に援用される）。
【0109】
図２３は、マウスＢ２Ｍアミノ酸配列（ＮＰ＿０３３８６５．２；配列番号２）と、ヒトＢ２Ｍアミノ酸配列（ＮＰ＿００４０３９．１；配列番号４）との間の整列化を示す。したがって、ヒト及びマウスＢ２Ｍ間の対応するアミノ酸残基又は領域は、図２３に見出すことができる。
【0110】
他種のＢ２Ｍ遺伝子、タンパク質及び遺伝子座も当技術分野で公知である。例えば、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ラット）におけるＢ２Ｍの遺伝子ＩＤは、２４２２３であり、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）（アカゲザル）におけるＢ２Ｍの遺伝子ＩＤは、７１２４２８であり、ウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）（ウマ）におけるＢ２Ｍの遺伝子ＩＤは、１０００３４２０３であり、及びイノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）（ブタ）におけるＢ２Ｍの遺伝子ＩＤは、３９７０３３である。これらの遺伝子についての関連情報（例えば、イントロン配列、エクソン配列、これらのタンパク質のアミノ酸残基）は、例えば、ＮＣＢＩデータベース内に見出すことができる（その全体が参照により本明細書に援用される）。図２４は、齧歯類Ｂ２Ｍアミノ酸配列（ＮＰ＿０３６６４４．１；配列番号６６）と、ヒトＢ２Ｍアミノ酸配列（ＮＰ＿００４０３９．１；配列番号４）との間の整列化を示す。したがって、ヒト及び齧歯類Ｂ２Ｍ間の対応するアミノ酸残基又は領域は、図２４に見出すことができる。
【0111】
本開示は、ヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）Ｂ２Ｍヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、マウスエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４及び／又はシグナルペプチドの全配列は、対応するヒト配列と置換される。いくつかの実施形態では、マウスエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４及び／又はシグナルペプチドの「領域」又は「部分」は、対応するヒト配列と置換される。用語「領域」又は「部分」は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００若しくは６００ヌクレオチド又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００若しくは１１０アミノ酸残基を指し得る。いくつかの実施形態では、「領域」又は「部分」は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４又はシグナルペプチドに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一であり得る。いくつかの実施形態では、マウスエクソン１、エクソン２、エクソン３及び／又はエクソン４の領域、一部又は全配列（例えば、エクソン１の一部、エクソン２及びエクソン３の一部）は、ヒトエクソン１、エクソン２、エクソン３及び／又はエクソン４の領域、一部又は全配列（例えば、エクソン１の一部、エクソン２及びエクソン３の一部）の配列と置換される。
【0112】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子組換え非ヒト動物であって、そのゲノムは、キメラ（例えば、ヒト化）Ｂ２Ｍヌクレオチド配列を含む、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態では、キメラ（例えば、ヒト化）Ｂ２Ｍヌクレオチド配列は、シグナルペプチドを含むＢ２Ｍタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸１～２２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシグナルペプチドは、配列番号４のアミノ酸１～２２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、ヒト化タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１～１１９又は２３～１１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を有する。いくつかの実施形態では、ヒト化タンパク質は、配列番号４のアミノ酸１～１１９、２３～１１９又は２１～１１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を有する。
【0113】
いくつかの実施形態では、本開示は、キメラ（例えば、ヒト化）Ｂ２Ｍヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列も提供し、いくつかの実施形態では、配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、マウスＢ２Ｍ ｍＲＮＡ配列（例えば、配列番号１）、マウスＢ２Ｍアミノ酸配列（例えば、配列番号２）又はその一部（エクソン１の一部、エクソン２及びエクソン３の一部）に同一であるか又はそれに由来し；またいくつかの実施形態では、配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、ヒトＢ２Ｍ ｍＲＮＡ配列（例えば、配列番号３）、ヒトＢ２Ｍアミノ酸配列（例えば、配列番号４）又はその一部（例えば、エクソン１の一部、エクソン２及びエクソン３の一部）に同一であるか又はそれに由来する。
【0114】
いくつかの実施形態では、マウスＢ２Ｍの領域（例えば、配列番号２のアミノ酸１～１１９）をコードする配列が置換される。いくつかの実施形態では、配列は、ヒトＢ２Ｍの対応する領域（例えば、ヒトＢ２Ｍ（配列番号４）のアミノ酸１～１１９）をコードする配列と置換される。
【0115】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、プロモーター又は調節エレメント、例えば内因性マウスＢ２Ｍプロモーター、誘導性プロモーター、エンハンサー及び／又はマウス若しくはヒト調節エレメントに作動可能に連結される。
【0116】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、全マウスＢ２Ｍヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４又はＮＭ＿００９７３５．３（配列番号１））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0117】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、全マウスＢ２Ｍヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４又はＮＭ＿００９７３５．３（配列番号１））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0118】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、全ヒトＢ２Ｍヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４又はＮＭ＿００４０４８．４（配列番号３））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0119】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、全ヒトＢ２Ｍヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４又はＮＭ＿００４０４８．４（配列番号３））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0120】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、全マウスＢ２Ｍアミノ酸配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿００９７３５．３（配列番号１）のエクソン１、エクソン２、エクソン３及び／若しくはエクソン４によってコードされるアミノ酸；又はＮＰ＿０３３８６５．２（配列番号２））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸残基、例えば隣接又は非隣接アミノ酸残基）を有する。
【0121】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、全マウスＢ２Ｍアミノ酸配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿００９７３５．３（配列番号１）のエクソン１、エクソン２、エクソン３及び／若しくはエクソン４によってコードされるアミノ酸；又はＮＰ＿０３３８６５．２（配列番号２））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸残基、例えば隣接又は非隣接アミノ酸残基）を有する。
【0122】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、全ヒトＢ２Ｍアミノ酸配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿００４０４８．４（配列番号３）のエクソン１、エクソン２、エクソン３及び／若しくはエクソン４によってコードされるアミノ酸；又はＮＰ＿００４０３９．１（配列番号４））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸残基、例えば隣接又は非隣接アミノ酸残基）を有する。
【0123】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、全ヒトＢ２Ｍアミノ酸配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿００４０４８．４（配列番号３）のエクソン１、エクソン２、エクソン３及び／若しくはエクソン４によってコードされるアミノ酸；又はＮＰ＿００４０３９．１（配列番号４））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸残基、例えば隣接又は非隣接アミノ酸残基）を有する。
【0124】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）
ＭＨＣクラスＩ分子に対応するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃを含む。ＭＨＣクラスＩＩ分子に対応するヒトＨＬＡは、例えば、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲを含む。
ＭＨＣクラスＩ分子に対応するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃを含む。ＭＨＣクラスＩＩ分子に対応するヒトＨＬＡは、例えば、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲを含む。
【0125】
ヒトＨＬＡ－Ａは、多くの血清型グループ、例えばＨＬＡ－Ａ１及びＨＬＡ－Ａ＊０２を有し得る。ＨＬＡ－Ａ１（Ａ１）の場合、血清型は、ＨＬＡ－Ａα鎖のα１サブセットの抗体認識により決定される。Ａ１の場合、α鎖は、ＨＬＡ－Ａ＊０１対立遺伝子グループによってコードされ、β鎖は、Ｂ２Ｍ遺伝子座によってコードされる。このグループは、現在、Ａ＊０１０１（Ａ＊０１：０１：０１：０１）が主流となっている。ＨＬＡ－Ａ＊０２（ＨＬＡ－Ａ２）の場合、血清型は、ＨＬＡ－Ａα鎖のα２ドメインの抗体認識により決定される。Ａ＊０２の場合、α鎖は、ＨＬＡ－Ａ＊０２遺伝子によってコードされ、β鎖は、Ｂ２Ｍ遺伝子座によってコードされる。ＨＬＡ－Ａ２のサブタイプは、ＨＬＡ－Ａ２．１である。ＨＬＡ命名法の詳細は、例えば、Ｍａｒｓｈ，Ｓ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ ｓｙｓｔｅｍ，２０１０．”Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ７５．４（２０１０）：２９１（その全体が参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【0126】
ヒトゲノムにおいて、典型的なＨＬＡ－Ａ遺伝子座は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及びエクソン８の８つのエクソンを有する（図３）。ＨＬＡ－Ａタンパク質は、シグナルペプチド、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞質領域も有する。さらに、細胞外領域は、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及びＣペプチドを含む。ヒトＨＬＡ－Ａ＊０１０１ ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド配列は、ＮＭ＿００１２４２７５８．１（配列番号７）であり、ヒトＨＬＡ－Ａ＊０１０１におけるアミノ酸配列は、ＮＰ＿００１２２９６８７．１（配列番号８）である。さらに、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１におけるヌクレオチド配列は、ＡＦ０５５０６６．１の核酸９５４９３～９９４３６（配列番号５４）であり、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１におけるアミノ酸配列は、ＡＡＣ２４８２５．１（配列番号５９）である。ヒトＨＬＡ－Ａヌクレオチド配列及びアミノ酸配列における各エクソン及び各領域の位置が以下に列記される。
【0127】
【表3】
【0128】
ヒトＭＨＣクラスＩ領域（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＡＦ０５５０６６．１）は、ヒトゲノムの染色体６に位置する。ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子は、ＡＦ０５５０６６．１の９５４９３～９９４３６に位置する。ＡＦ０５５０６６．１に基づき、エクソン１は、９９５６６～９９６２９であり、第１のイントロンは、９９４３６～９９５６５であり、エクソン２は、９９１６６～９９４３５であり、第２のイントロンは、９８９２５～９９１６５であり、エクソン３は、９８６４９～９８９２４であり、第３のイントロンは、９８０４９～９８６４８であり、エクソン４は、９７７７３～９８０４８であり、第４のイントロンは、９７６７４～９７７７２であり、エクソン５は、９７５５７～９７６７３であり、第５のイントロンは、９７１１９～９７５５６であり、エクソン６は、９７０８６～９７１１８であり、第６のイントロンは、９７０８５～９６９４４であり、エクソン７は、９６８９６～９６９４３であり、第７のイントロンは、９６７２７～９６８９５であり、エクソン８は、９６７２６～９６３２２であり、３’ＵＴＲは、９６７２１～９６３２２である。ヒトＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子座についての全ての関連情報は、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＡＦ０５５０６６．１を有するＮＣＢＩウェブサイトにおいて見出すことができる（その全体が参照により本明細書に援用される）。
【0129】
マウスでは、Ｈ－２Ｋ、Ｈ－２Ｄ及びＨ－２Ｌは、ＭＨＣクラスＩ遺伝子である。特に、Ｈ２－Ｄ１遺伝子座は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及びエクソン８の８つのエクソンを有する（図３）。（ＭＨＣクラスＩα鎖をコードする）マウスＨ２－Ｄ１タンパク質は、シグナルペプチド、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞質領域も有する。詳細には、細胞外領域は、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及びＣペプチドを含む。マウスＨ２－Ｄ１ ｍＲＮＡにおけるヌクレオチド配列は、ＮＭ＿０１０３８０．３（配列番号５）であり、マウスＨ２－Ｄ１におけるアミノ酸配列は、ＮＰ＿０３４５１０．３（配列番号６）である。マウスＨ２－Ｄ１ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列における各エクソン及び各領域の位置が以下に列記される。
【0130】
【表4】
【0131】
マウスＨ２－Ｄ１遺伝子（遺伝子ＩＤ：１４９６４；ＭＧＩ：９５８９６）は、マウスゲノムの染色体１７に位置し、ＮＣ＿００００８３．７（ＧＲＣｍ３９（ＧＣＦ＿０００００１６３５．２７））の３５４８２０７０～３５４８６４７３に位置する。転写物ＮＭ＿０１０３８０．３に基づき、５’ＵＴＲは、３５，２６２，７３０～３５，２６３，１１３であり、エクソン１は、３５，２６２，７３０～３５，２６３，１８６であり、第１のイントロンは、３５，２６３，１８７～３５，２６３，３７８であり、エクソン２は、３５，２６３，３７９～３５，２６３，６４８であり、第２のイントロンは、３５，２６３，６４９～３５，２６３，８３８であり、エクソン３は、３５，２６３，８３９～３５，２６４，１１４であり、第３のイントロンは、３５，２６４，１１５～３５，２６５，７８３であり、エクソン４は、３５，２６５，７８４～３５，２６６，０５９であり、第４のイントロンは、３５，２６６，０６０～３５，２６６，１８６であり、エクソン５は、３５，２６６，１８７～３５，２６６，３０３であり、第５のイントロンは、３５，２６６，３０４～３５，２６６，４８１であり、エクソン６は、３５，２６６，４８２～３５，２６６，５１４であり、第６のイントロンは、３５，２６６，５１５～３５，２６６，６８７であり、エクソン７は、３５，２６６，６８８～３５，２６６，７２６であり、第７のイントロンは、３５，２６６，７２７～３５，２６６，８６５であり、エクソン８は、３５，２６６，８６６～３５，２６７，４９９であり、３’ＵＴＲは、３５，２６６，８７１～３５，２６７，４９９である。マウスＨ２－Ｄ１遺伝子座についての全ての関連情報は、遺伝子ＩＤ：１４９６４を有するＮＣＢＩウェブサイトにおいて見出すことができる（その全体が参照により本明細書に援用される）。
【0132】
図２５は、マウスＨ２－Ｄ１アミノ酸配列（ＮＰ＿０３４５１０．３；配列番号６）と、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１アミノ酸配列（ＡＡＣ２４８２５．１；配列番号５９）との間の整列化を示す。したがって、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１とマウスＨ２－Ｄ１との間の対応するアミノ酸残基又は領域は、図２５に見出すことができる。
【0133】
図２６は、マウスＨ２－Ｄ１アミノ酸配列（ＮＰ＿０３４５１０．３；配列番号６）と、ヒトＨＬＡ－Ａ＊０１０１アミノ酸配列（ＮＰ＿００１２２９６８７．１；配列番号８）との間の整列化を示す。したがって、ヒトＨＬＡ－Ａ＊０１０１とマウスＨ２－Ｄ１との間の対応するアミノ酸残基又は領域は、図２６に見出すことができる。
【0134】
他種のＭＨＣ分子の遺伝子、タンパク質及び遺伝子座についても当技術分野で公知である。例えば、これらの遺伝子についての遺伝子ＩＤ及び関連情報（例えば、イントロン配列、エクソン配列、これらのタンパク質のアミノ酸残基）は、例えば、ＮＣＢＩデータベース（その全体が参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【0135】
本開示は、ヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖）ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列を提供する。本開示は、ヒト若しくはキメラ（例えば、ヒト化）ＨＬＡ－Ａタンパク質複合体及び／又はＨＬＡ－Ａポリペプチドを発現する遺伝子組換え動物にも関する。本明細書で用いられるとき、用語「ＨＬＡ－Ａ複合体」又は「ＨＬＡ－Ａタンパク質複合体」は、ＨＬＡ－Ａα鎖ポリペプチド及びＢ２Ｍポリペプチドによって形成される複合体を指す。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａα鎖ポリペプチド及びＢ２Ｍポリペプチドは、一緒に融合される。用語「ＨＬＡ－Ａ」又は「ＨＬＡ－Ａポリペプチド」は、本明細書で用いられるとき、ＨＬＡ－Ａα鎖ポリペプチドを指す。
【0136】
いくつかの実施形態では、マウスＨ２－Ｄ１のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、シグナルペプチド、細胞外領域（例えば、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及び／又はＣペプチド）、膜貫通領域及び／又は細胞質領域の全配列は、対応するヒト配列と置換される。いくつかの実施形態では、マウスＨ２－Ｄ１のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、シグナルペプチド、細胞外領域（例えば、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及び／又はＣペプチド）、膜貫通領域及び／又は細胞質領域の「領域」又は「部分」は、対応するヒト配列と置換される。用語「領域」又は「部分」は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００若しくは６００ヌクレオチド又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０若しくは３６０アミノ酸残基を指し得る。いくつかの実施形態では、「領域」又は「部分」は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、シグナルペプチド、細胞外領域（例えば、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及び／又はＣペプチド）、膜貫通領域及び／又は細胞質領域に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一であり得る。いくつかの実施形態では、マウスＨ２－Ｄ１のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及び／又はエクソン８（例えば、エクソン１、エクソン２及びエクソン３）の領域、一部又は全配列は、ヒトＨＬＡ－Ａのエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及び／又はエクソン８（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３）配列の領域、一部又は全配列と置換される。
【0137】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子組換え非ヒト動物であって、そのゲノムは、キメラ（例えば、ヒト化）ＭＨＣ分子（例えば、ヒトＨＬＡ／マウスＨ２－Ｄ１）ヌクレオチド配列を含む、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態では、キメラ（例えば、ヒト化）ＭＨＣ分子のヌクレオチド配列は、細胞外領域、膜貫通領域、細胞質領域及びシグナルペプチドを含むＭＨＣ分子のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、細胞外領域は、ヒトＨＬＡ－Ａ（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０１０１又はＨＬＡ－Ａ２．１）細胞外領域の全て又は一部を含む。例えば、本明細書に記載の細胞外領域は、ヒトＨＬＡ－Ａ細胞外領域（例えば、配列番号８のアミノ酸２５～３０８又は配列番号５９のアミノ酸２２～３０５）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ヒトＨＬＡ－Ａ（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０１０１又はＨＬＡ－Ａ２．１）膜貫通領域の全て又は一部を含む。例えば、膜貫通領域は、ヒトＨＬＡ膜貫通領域（例えば、配列番号８のアミノ酸３０９～３３２又は配列番号５９のアミノ酸３０６～３２９）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、細胞質領域は、ヒトＨＬＡ－Ａ（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０１０１又はＨＬＡ－Ａ２．１）細胞質領域の全て又は一部を含む。例えば、細胞質領域は、ヒトＨＬＡ細胞外領域（例えば、配列番号８のアミノ酸３３３～３６５又は配列番号５９のアミノ酸３３０～３６２）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。
【0138】
いくつかの実施形態では、キメラ（例えば、ヒト化）ＭＨＣ分子のヌクレオチド配列は、シグナルペプチドを含むＭＨＣ分子のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸１～２４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシグナルペプチドは、配列番号８のアミノ酸１～２４又は配列番号５９のアミノ酸１～２１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。
【0139】
いくつかの実施形態では、本開示は、キメラ（例えば、ヒト化）ＭＨＣ分子のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列も提供し、いくつかの実施形態では、配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、マウスＨ２－Ｄ１ ｍＲＮＡ配列（例えば、配列番号５）、マウスＨ２－Ｄ１アミノ酸配列（例えば、配列番号６）又はその一部（例えば、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及びエクソン８の一部）に対して同一であるか又はそれに由来し；またいくつかの実施形態では、配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、ヒトＨＬＡ－Ａ分子のｍＲＮＡ配列（例えば、配列番号７）、ヒトＨＬＡ－Ａアミノ酸配列（例えば、配列番号８又は配列番号５９）又はその一部（例えば、エクソン１の一部、エクソン２及びエクソン３）に対して同一であるか又はそれに由来する。
【0140】
いくつかの実施形態では、マウスＨ２－Ｄ１の領域（例えば、配列番号６のアミノ酸１～２０６又は２５～２０６）をコードする配列が置換される。いくつかの実施形態では、配列は、ヒトＨＬＡ－Ａの対応する領域（例えば、ヒトＨＬＡ－Ａ＊０１０１（配列番号８）のアミノ酸１～２０６若しくは２５～２０６；又はヒトＨＬＡ－Ａ２．１（配列番号５９）のアミノ酸１～２０３若しくは２２～２０３）をコードする配列と置換される。
【0141】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、プロモーター又は調節エレメント、例えば内因性マウスＨ２－Ｄ１プロモーター、誘導性プロモーター、エンハンサー及び／又はマウス若しくはヒト調節エレメントに作動可能に連結される。
【0142】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、全マウスＨ２－Ｄ１ヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８又はＮＭ＿０１０３８０．３（配列番号５））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0143】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、全マウスＨ２－Ｄ１ヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８又はＮＭ＿０１０３８０．３（配列番号５））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0144】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、全ヒトＨＬＡ－Ａヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８又はＮＭ＿００１２４２７５８．１（配列番号７））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0145】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、全ヒトＨＬＡ－Ａヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８又はＮＭ＿００１２４２７５８．１（配列番号７））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0146】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、全マウスＨ２－Ｄ１アミノ酸配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿０１０３８０．３（配列番号５）のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及び／若しくはエクソン８によってコードされるアミノ酸；又はＮＰ＿０３４５１０．３（配列番号６））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸残基、例えば隣接又は非隣接アミノ酸残基）を有する。
【0147】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、全マウスＨ２－Ｄ１アミノ酸配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿０１０３８０．３（配列番号５）のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及び／若しくはエクソン８によってコードされるアミノ酸；又はＮＰ＿０３４５１０．３（配列番号６））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸残基、例えば隣接又は非隣接アミノ酸残基）を有する。
【0148】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、全ヒトＨＬＡ－Ａアミノ酸配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿００１２４２７５８．１（配列番号７）のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及び／若しくはエクソン８によってコードされるアミノ酸；ＮＰ＿００１２２９６８７．１（配列番号８）；又はＡＡＣ２４８２５．１（配列番号５９））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸残基、例えば隣接又は非隣接アミノ酸残基）を有する。
【0149】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、全ヒトＨＬＡ－Ａアミノ酸配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿００１２４２７５８．１（配列番号７）のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及び／若しくはエクソン８によってコードされるアミノ酸；ＮＰ＿００１２２９６８７．１（配列番号８）；又はＡＡＣ２４８２５．１（配列番号５９））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸残基、例えば隣接又は非隣接アミノ酸残基）を有する。
【0150】
本開示は、ヒト化マウスのＢ２Ｍ又はＭＨＣ分子のゲノムＤＮＡ配列にさらに関する。ＤＮＡ配列は、その転写によって得られたｍＲＮＡの逆転写によって得られ、配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４又は６５で示される配列に対して相同なＤＮＡ配列に一致するか又は相補的である。
【0151】
本開示は、配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示される配列と少なくとも９０％の相同性を有するか又は少なくとも９０％同一であり、且つタンパク質活性を有するアミノ酸配列も提供する。いくつかの実施形態では、配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示される配列との相同性は、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、前述の相同性は、少なくとも約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約８０％又は約８５％である。
【0152】
いくつかの実施形態では、配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示される配列との百分率同一性は、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、前述の百分率同一性は、少なくとも約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約８０％又は約８５％である。
【0153】
本開示は、配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４又は６５で示される配列に対して少なくとも９０％の相同性を有するか又は少なくとも９０％同一であり、且つタンパク質活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も提供する。いくつかの実施形態では、配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４又は６５で示される配列との相同性は、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、前述の相同性は、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約８０％又は約８５％である。
【0154】
いくつかの実施形態では、配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４又は６５で示される配列との百分率同一性は、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、前述の百分率同一性は、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約８０％又は約８５％である。
【0155】
本開示は、本明細書に記載の任意のヌクレオチド配列に対して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である核酸配列及び本明細書に記載の任意のアミノ酸配列に対して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列も提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される任意のペプチドをコードするヌクレオチド配列又は本明細書に記載の任意のヌクレオチド配列によってコードされる任意のアミノ酸配列に関する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００又は６００ヌクレオチドより少ない。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００アミノ酸残基より少ない。
【0156】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、（ｉ）アミノ酸配列を含むか；又は（ｉｉ）アミノ酸配列からなり、アミノ酸配列は、本明細書に記載の配列のいずれか１つである。
【0157】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、（ｉ）核酸配列を含むか；又は（ｉｉ）核酸配列からなり、核酸配列は、本明細書に記載の配列のいずれか１つである。
【0158】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列は、最適な比較を目的として整列される（例えば、最適な整列化のため、第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップが導入され得、非相同性配列は、比較を目的として無視され得る）。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列内のある位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占有されるとき、分子は、その位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列化のために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である。例えば、配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ延長ペナルティ及び５のフレームシフトギャップペナルティでのＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスを用いて達成され得る。
【0159】
類似する物理化学的特性が保存された残基、例えばロイシン及びイソロイシンの百分率（パーセント相同性）も、配列類似性を評価するために使用可能である。類似する物理化学的特性を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。相同性百分率は、多くの場合、同一性百分率より高い。
【0160】
本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む細胞、組織及び動物（例えば、マウス）並びに内因性非ヒトＢ２Ｍ又はＭＨＣ遺伝子座からヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）ＭＨＣを発現する細胞、組織及び動物（例えば、マウス）も提供される。
【0161】
遺伝子組換え動物
本明細書で用いられるとき、用語「遺伝子組換え非ヒト動物」は、修飾配列（例えば、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列若しくは本明細書に記載のヒト化Ｂ２Ｍをコードする配列による置換及び／又は動物のゲノムの少なくとも１つの染色体における内因性ＭＨＣ遺伝子の置換（例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖）の本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列若しくは本明細書に記載のヒト化ＭＨＣ遺伝子をコードする配列によるもの）を有する非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態では、少なくとも１つ以上の細胞、例えば遺伝子組換え非ヒト動物の細胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％は、そのゲノム中に修飾配列を有する。修飾配列を有する細胞は、種々の細胞、例えば内因性細胞、体細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、胚細胞、胚盤胞又は内因性腫瘍細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト若しくはヒト化Ｂ２Ｍ及び／又はヒト若しくはヒト化ＭＨＣ分子遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖）を内因性Ｂ２Ｍ又はＭＨＣ遺伝子座に含む遺伝子組換え非ヒト動物が提供される。動物は、一般に、その修飾を子孫に、即ち生殖系列伝達を通して渡すことができる。
本明細書で用いられるとき、用語「遺伝子組換え非ヒト動物」は、修飾配列（例えば、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列若しくは本明細書に記載のヒト化Ｂ２Ｍをコードする配列による置換及び／又は動物のゲノムの少なくとも１つの染色体における内因性ＭＨＣ遺伝子の置換（例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖）の本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列若しくは本明細書に記載のヒト化ＭＨＣ遺伝子をコードする配列によるもの）を有する非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態では、少なくとも１つ以上の細胞、例えば遺伝子組換え非ヒト動物の細胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％は、そのゲノム中に修飾配列を有する。修飾配列を有する細胞は、種々の細胞、例えば内因性細胞、体細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、胚細胞、胚盤胞又は内因性腫瘍細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト若しくはヒト化Ｂ２Ｍ及び／又はヒト若しくはヒト化ＭＨＣ分子遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖）を内因性Ｂ２Ｍ又はＭＨＣ遺伝子座に含む遺伝子組換え非ヒト動物が提供される。動物は、一般に、その修飾を子孫に、即ち生殖系列伝達を通して渡すことができる。
【0162】
本明細書で用いられるとき、用語「ヒト化される」などは、起源が非ヒトであり、一部が、対応するヒト分子の対応する部分で、修飾（例えば、ヒト化）分子が、その生物学的機能を保持し、且つ／又は保持された生物学的機能を果たす構造を維持するように置換されている場合の分子（例えば、核酸、タンパク質など）を指す。ヒト化分子は、ヒト分子をコードする核酸配列を含むヌクレオチド（又はその一部）によってコードされる場合、ヒト分子に由来すると考えられ得る。
【0163】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え非ヒト動物は、内因性Ｂ２Ｍ（例えば、マウスＢ２Ｍ）を発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え非ヒト動物は、機能的内因性Ｂ２Ｍ（例えば、マウスＢ２Ｍ）を発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え非ヒト動物は、内因性ＭＨＣ分子（例えば、マウスＨ２－Ｄ１）を発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え非ヒト動物は、機能的内因性ＭＨＣ分子（例えば、マウスＨ２－Ｄ１）又は機能的内因性ＭＨＣタンパク質複合体を発現しない。
【0164】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子組換え非ヒト動物は、免疫不全である。いくつかの実施形態では、動物は、ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ
、ＮＯＤ－Ｒａｇ１－／－－ＩＬ２ｒｇ－／－（ＮＲＧ）、Ｒａｇ２－／－－ＩＬ２ｒｇ－／－（ＲＧ）又はＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）バックグラウンドを有する。
【0165】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子組換え非ヒト動物（例えば、マウス）は、破壊された内因性Ｂ２Ｍ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子組換え非ヒト動物（例えば、マウス）は、機能不全内因性Ｂ２Ｍタンパク質（例えば、マウスＢ２Ｍ）を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子組換え非ヒト動物（例えば、マウス）は、破壊された内因性ＭＨＣ遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子組換え非ヒト動物（例えば、マウス）は、機能不全内因性ＭＨＣ分子（例えば、マウスＨ２－Ｄ１）又は機能不全内因性ＭＨＣタンパク質複合体を発現する。
【0166】
本明細書で用いられるとき、用語「白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）」又は「白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）」は、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、骨髄系細胞（ＣＤ３３＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ５６＋）、顆粒球（ＣＤ６６ｂ＋）及び単球（ＣＤ１４＋）を含む。全ての白血球は、それらを無核赤血球（ＲＢＣ）及び血小板から識別する核を有する。白血球共通抗原（ＬＣＡ）としても公知のＣＤ４５は、白血球における細胞表面マーカーである。リンパ球は、白血球のサブタイプである。リンパ球は、（細胞媒介性の細胞傷害性自然免疫において機能する）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞を含む。骨髄系細胞は、白血球のサブタイプである。骨髄系細胞は、単球及び顆粒球を含む。
【0167】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え非ヒト動物は、マウスである。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え非ヒト動物は、Ｂ－ＮＤＧマウスである。Ｂ－ＮＤＧマウスの詳細は、例えば、ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０１８／０７９３６５号明細書；米国特許第１０８２０５８０Ｂ２号明細書（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物は、ＮＳＧマウス又はＮＯＧマウスである。ＮＳＧマウス及びＮＯＤマウスの詳細な説明は、例えば、Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ ｃｈａｉｎｎｕｌｌ ｍｉｃｅ．”Ｂｌｏｏｄ １０６．５（２００５）：１５６５－１５７３；Ｋａｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．“ＮＯＤ－Ｒａｇ２ｎｕｌｌ ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ ｍｉｃｅ：ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ＮＯＧ ｍｉｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ．”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｉｍａｌｓ ６３．３（２０１４）：３２１－３３０（これらの両方は、全体が参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【0168】
一態様では、遺伝子組換え非ヒト動物（例えば、マウス）は、ヒト免疫系を発生するためにヒト造血幹細胞を移植される。
【0169】
一態様では、遺伝子組換え動物は、ヒト免疫系を発生するためにヒト造血幹細胞を移植される。いくつかの実施形態では、動物におけるヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の平均百分率は、動物における（例えば赤血球の溶解後の血液からの）全生細胞の少なくとも又はおよそ１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％である。いくつかの実施形態では、動物におけるヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の平均百分率は、Ｂ－ＮＤＧバックグラウンドを有する動物（例えば、Ｂ－ＮＤＧマウス）の場合より少なくとも又はおよそ５０％、８０％、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍又は２０倍高く、Ｂ－ＮＤＧバックグラウンドを有する動物は、ヒト免疫系を発生するため、照射され、次にヒト造血幹細胞を移植される。いくつかの実施形態では、ヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の平均百分率は、移植されてから少なくとも若しくはおよそ１２週後、少なくとも若しくはおよそ１６週後、少なくとも若しくはおよそ２０週後、少なくとも若しくはおよそ２４週後、少なくとも若しくはおよそ２６週後、少なくとも若しくはおよそ２８週後又は少なくとも若しくはおよそ３０週後に決定される。
【0170】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物（例えば、マウス）における再構築の成功率は、少なくとも又はおよそ２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物（例えば、マウス）における再構築の成功率は、Ｂ－ＮＤＧバックグラウンドを有する動物（例えば、Ｂ－ＮＤＧマウス）の場合よりも少なくとも又はおよそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍又は１００倍高い。成功率は、再構築が成功した免疫系（ｈＣＤ４５＋細胞百分率≧赤血球の溶解後の血液からの全生細胞の２５％）を有するマウスの数を生存マウスの総数で除することにより計算される。いくつかの実施形態では、成功率は、ヒト免疫系を発生するために動物（例えば、マウス）にヒト細胞（例えば造血幹細胞）を移植されてから少なくとも又はおよそ１６週後、少なくとも又はおよそ２０週後、少なくとも又はおよそ２４週後、少なくとも又はおよそ２６週後、少なくとも又はおよそ２８週後又は少なくとも又はおよそ３０週後に決定される。いくつかの実施形態では、移植から少なくとも又はおよそ１６週後、動物における再構築の成功率は、少なくとも又はおよそ５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％（例えば８０％）である。いくつかの実施形態では、移植から少なくとも又はおよそ２０週後、動物における再構築の成功率は、少なくとも又はおよそ５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％（例えば８０％）である。
【0171】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物（例えば、マウス）の生存率は、移植の約１００日後、約１２０日後、約１４０日後、約１６０日後又は約１８０日後、少なくとも又はおよそ２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物（例えば、マウス）の生存率は、移植の約１００日後、約１２０日後、約１４０日後、約１６０日後又は約１８０日後、Ｂ－ＮＤＧバックグラウンドを有する動物（例えば、Ｂ－ＮＤＧマウス）の場合よりも少なくとも又はおよそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、５倍又は１０倍高い。
【0172】
遺伝子組換え非ヒト動物は、様々な他の動物、例えばラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、水牛）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）でもあり得る。好適な遺伝子組換え可能なＥＳ細胞が容易に入手できない場合の非ヒト動物では、遺伝子修飾を含む非ヒト動物を作製するための他の方法が使用される。かかる方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞又は人工多能性細胞）を修飾することと、核移植を用いて、修飾ゲノムを好適な細胞、例えば卵母細胞に導入することと、修飾細胞（例えば修飾卵母細胞）を非ヒト動物中において好適な条件下で妊娠させ、胚を形成することとを含む。これらの方法は、当技術分野で公知であり、例えばＡ．Ｎａｇｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００３（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【0173】
一態様では、動物は、例えば、トビネズミ（Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ）上科又はネズミ（Ｍｕｒｏｉｄｅａ）上科の哺乳動物である。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物は、齧歯類である。齧歯類は、マウス、ラット及びハムスターから選択され得る。いくつかの実施形態では、齧歯類は、ネズミ（Ｍｕｒｏｉｄｅａ）上科から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物は、ヨルマウス科（Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ）（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ）（例えば、ハムスター、ＮｅｗＷｏｒｌｄラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）（真性マウス及びラット、スナネズミ、トゲマウス、クレステッドラット）、アシナガマウス科（Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ）（キノボリマウス、イワマウス、ウィズテイルドラット、マダガスカルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ）（例えば、トゲヤマネ（ｓｐｉｎｙ ｄｏｒｍｉｃｅ））及びメクラネズミ科（Ｓｐａｌａｃｉｄａｅ）（例えば、デバネズミ、タケネズミ及びモグラネズミ（ｚｏｋｏｒｓ））から選択される科から得られる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え齧歯類は、真性マウス又はラット（ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ））、スナネズミ、トゲマウス及びクレステッドラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。
【0174】
いくつかの実施形態では、動物は、ＢＡＬＢ／ｃ，Ａ、Ａ／Ｈｅ、Ａ／Ｊ、Ａ／ＷｙＳＮ、ＡＫＲ、ＡＫＲ／Ａ、ＡＫＲ／Ｊ、ＡＫＲ／Ｎ、ＴＡ１、ＴＡ２、ＲＦ、ＳＷＲ、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＲ、ＳＪＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ／２、ＫＭ、ＮＩＨ、ＩＣＲ、ＣＦＷ、ＦＡＣＡ、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、Ｃ５７ＢＬ／Ｏｌａ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５８、ＣＢＡ／Ｂｒ、ＣＢＡ／Ｃａ、ＣＢＡ／Ｊ、ＣＢＡ／ｓｔ及びＣＢＡ／Ｈから選択される株のマウスである。いくつかの実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である株からなる群から選択される１２９株である。これらのマウスは、例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ １２９ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ１０：８３６（１９９９）；Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １２９／ＳｖＥｖ－ ａｎｄ Ｃ５７ＢＬ／６－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ（２０００）（これらの両方は、全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えマウスは、１２９株とＣ５７ＢＬ／６株との混合である。いくつかの実施形態では、マウスは、１２９株の混合又はＢＬ／６株の混合である。いくつかの実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ株、例えばＢＡＬＢ／ｃ株である。いくつかの実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ株と別の株との混合である。いくつかの実施形態では、マウスは、ハイブリッド株（例えば、５０％ＢＡＬＢ／ｃ－５０％１２９５４／Ｓｖ；又は５０％Ｃ５７ＢＬ／６－５０％１２９）から得られる。
【0175】
いくつかの実施形態では、動物は、ラットである。ラットは、ウィスターラット、ＬＥＡ株、スプラーグドーリー株、フィッシャー株、Ｆ３４４、Ｆ６及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択され得る。いくつかの実施形態では、ラット株は、ウィスター、ＬＥＡ、スプラーグドーリー、フィッシャー、Ｆ３４４、Ｆ６及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２種以上の株の混合である。
【0176】
動物は、ヒト又はヒト化Ｂ２Ｍ及び／又はＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖）を発現する動物が作製されるという特定の目的に適した１つ以上の他の遺伝子修飾及び／又は他の修飾を有し得る。例えば、異種移植片（例えば、ヒト癌又は腫瘍）を維持するのに適したマウスは、非ヒト動物の免疫系を全体的又は部分的に損なうか、不活化するか又は破壊するといった１つ以上の修飾を有し得る。非ヒト動物の免疫系の損傷、不活化又は破壊は、例えば、造血細胞及び／又は免疫細胞の化学的手段（例えば、毒素の投与）、物理的手段（例えば、動物の照射）及び／又は遺伝子修飾（例えば、１つ以上の遺伝子のノックアウト）による破壊を含み得る。
【0177】
かかるマウスの非限定例として、例えば、ＮＯＤマウス、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ヌードマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤヌードマウス、ＮＯＤ－Ｒａｇ１－／－－ＩＬ２ｒｇ－／－（ＮＲＧ）マウス、Ｒａｇ２－／－－ＩＬ２ｒｇ－／－（ＲＧ）マウス、Ｂ－ＮＤＧ（ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ）マウス並びにＲａｇ１及び／又はＲａｇ２ノックアウトマウスが挙げられる。いくつかの実施形態では、これらのマウスは、１つ以上の免疫細胞型を破壊するため、任意選択的に照射され得るか又は他に治療され得る。したがって、様々な実施形態では、遺伝子組換えマウスは、内因性非ヒトＢ２Ｍ又はＭＨＣ遺伝子座で１つ以上の突然変異を含み得るように提供され、非ヒト動物の免疫系（又は免疫系の１つ以上の細胞型）を全体的又は部分的に損なうか、不活化するか又は破壊するといった修飾をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾は、例えば、ＮＯＤマウス、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、Ｂ－ＮＤＧ（ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ）マウス、ヌードマウス、Ｒａｇ１及び／又はＲａｇ２ノックアウトマウス並びにこれらの組み合わせをもたらす修飾からなる群から選択される。これらの遺伝子組換え動物は、例えば、米国特許出願公開第２０１５０１０６９６１号明細書及びＰＣＴ／中国特許出願公開第２０１８／０７９３６５号明細書（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【0178】
本明細書に記載の修飾（例えば、破壊、突然変異）を含み得る遺伝子組換え細胞（例えば、ＥＳ細胞、体細胞）も提供されるが、多くの実施形態では、遺伝子組換え非ヒト動物は、動物の生殖系列における内因性Ｂ２Ｍ及び／又はＭＨＣ遺伝子座の修飾を含む。
【0179】
さらに、遺伝子組換え動物は、内因性Ｂ２Ｍ及び／又はＭＨＣ遺伝子の修飾（例えば、置換）に対してホモ接合性であり得る。いくつかの実施形態では、動物は、内因性Ｂ２Ｍ及び／又はＭＨＣ遺伝子の修飾（例えば、置換）に対してヘテロ接合性であり得る。
【0180】
一態様では、本開示は、遺伝子組換え非ヒト動物であって、そのゲノムは、動物の内因性ＣＤ１３２遺伝子における破壊を含む、遺伝子組換え非ヒト動物に関し、内因性ＣＤ１３２遺伝子の破壊は、内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン２の欠失を含む。
【0181】
いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ１３２遺伝子の破壊は、内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン１の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ１３２遺伝子の破壊は、内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン１の部分的欠失を含む。
【0182】
いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ１３２遺伝子の破壊は、内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及びエクソン８からなる群から選択される１つ以上のエクソン又はエクソンの一部の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ１３２遺伝子の破壊は、内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン１～８の欠失を含む。
【0183】
いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ１３２遺伝子の破壊は、内因性ＣＤ１３２遺伝子のイントロン１、イントロン２、イントロン３、イントロン４、イントロン５、イントロン６及びイントロン７からなる群から選択される１つ以上のイントロン又はイントロンの一部の欠失をさらに含む。
【0184】
いくつかの実施形態では、破壊は、エクソン１における１５０を超えるヌクレオチドの欠失；イントロン１、エクソン２、イントロン２、エクソン３、イントロン３、エクソン４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７、イントロン７の全体の欠失；及びエクソン８における２５０を超えるヌクレオチドの欠失からなる。
【0185】
いくつかの実施形態では、動物は、内因性ＣＤ１３２遺伝子の破壊に対してホモ接合性である。いくつかの実施形態では、動物は、内因性ＣＤ１３２遺伝子の破壊に対してヘテロ接合性である。
【0186】
いくつかの実施形態では、破壊は、機能的ＣＤ１３２タンパク質の発現を妨げる。
【0187】
いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ１３２遺伝子座での残りのエクソン配列の長さは、内因性ＣＤ１３２遺伝子の全てのエクソン配列の全長の３０％未満である。いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ１３２遺伝子座での残りの配列の長さは、内因性ＣＤ１３２遺伝子の全配列の全長の１５％未満である。
【0188】
別の態様では、本開示は、遺伝子組換え非ヒト動物に関し、動物のゲノムは、動物の内因性ＣＤ１３２遺伝子座でＣＤ１３２遺伝子のエクソン２を有しない。
【0189】
いくつかの実施形態では、動物のゲノムは、エクソン１、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及びエクソン８からなる群から選択される１つ以上のエクソン又はエクソンの一部を有しない。いくつかの実施形態では、動物のゲノムは、イントロン１、イントロン２、イントロン３、イントロン４、イントロン５、イントロン６及びイントロン７からなる群から選択される１つ以上のイントロン又はイントロンの一部を有しない。
【0190】
一態様では、本開示は、ＣＤ１３２ノックアウト非ヒト動物も提供し、動物のゲノムは、内因性ＣＤ１３２遺伝子座で５’から３’に、（ａ）第１のＤＮＡ配列；任意選択的に、（ｂ）外因性配列を含む第２のＤＮＡ配列；（ｃ）第３のＤＮＡ配列を含み、第１のＤＮＡ配列、任意選択的な第２のＤＮＡ配列及び第３のＤＮＡ配列は、連結され、第１のＤＮＡ配列は、イントロン１の上流に位置する内因性ＣＤ１３２遺伝子配列を含み、第２のＤＮＡ配列は、０ヌクレオチド～３００ヌクレオチドの長さを有し得、及び第３のＤＮＡ配列は、イントロン７の下流に位置する内因性ＣＤ１３２遺伝子配列を含む。
【0191】
いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ配列は、（５’から３’に）１０～１００ヌクレオチド（例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００ヌクレオチド）の長さを有する配列を含み、配列の長さは、ＣＤ１３２遺伝子のエクソン１における最初のヌクレオチドから第１のＤＮＡ配列の最終のヌクレオチドにかけての長さを指す。
【0192】
いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ配列は、内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン１から少なくとも１０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ配列は、内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン１から最大で１００ヌクレオチドを有する。
【0193】
いくつかの実施形態では、第３のＤＮＡ配列は、（５’から３’に）２００～６００ヌクレオチド（例えば、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００ヌクレオチド）の長さを有する配列を含み、配列の長さは、第３のＤＮＡ配列における最初のヌクレオチドから内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン８における最終のヌクレオチドにかけての長さを指す。
【0194】
いくつかの実施形態では、第３のＤＮＡ配列は、内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン８から少なくとも３００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第３のＤＮＡ配列は、内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン８から最大で４００ヌクレオチドを有する。
【0195】
一態様では、本開示は、（１）内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン１又は内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン１の上流における標的配列に結合する、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクタードメイン又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合ドメインを含む第１のヌクレアーゼ、及び（２）内因性ＣＤ１３２遺伝子のエクソン８における配列に結合する、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクタードメイン又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合ドメインを含む第２のヌクレアーゼを使用することにより内因性ＣＤ１３２遺伝子の１つ以上のエクソンをノックアウトすることを含む方法によって作製される遺伝子組換え非ヒト動物にも関する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である。いくつかの実施形態では、動物は、機能的ＣＤ１３２タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、動物は、機能的インターロイキン２受容体を発現しない。
【0196】
一態様では、本開示は、遺伝子組換えマウス又はその子孫であって、そのゲノムは、マウスの内因性ＣＤ１３２遺伝子の破壊を含む、遺伝子組換えマウス又はその子孫に関し、内因性ＣＤ１３２遺伝子の破壊は、エクソン１における１５０を超えるヌクレオチドの欠失；イントロン１、エクソン２、イントロン２、エクソン３、イントロン３、エクソン４、イントロン４、エクソン５、イントロン５、エクソン６、イントロン６、エクソン７、イントロン７の全体の欠失；及びエクソン８における２５０を超えるヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、動物は、ＮＳＧマウス、ＮＯＧマウス又はＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスと比較して、外因性細胞の増強された移植能力を有する。
【0197】
本開示は、本明細書に記載の方法を通して作製される非ヒト哺乳動物にさらに関する。いくつかの実施形態では、そのゲノムは、ヒト遺伝子を有する。
【0198】
さらに、本開示は、非ヒト哺乳動物モデルが本明細書に記載の方法を通して得られることを特徴とする、腫瘍を有する非ヒト哺乳動物モデルにも関する。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物は、齧歯類（例えば、マウス）である。
【0199】
本開示は、非ヒト哺乳動物又はその子孫或いは腫瘍を有する非ヒト哺乳動物に由来する細胞若しくは細胞株又はその一次細胞培養；非ヒト哺乳動物若しくはその子孫又は腫瘍を有する非ヒト哺乳動物に由来する組織、臓器若しくはその培養物；及び腫瘍を有するときの非ヒト哺乳動物若しくはその子孫又は腫瘍を有する非ヒト哺乳動物に由来する腫瘍組織にさらに関する。
【0200】
本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかにより作製される非ヒト哺乳類も提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物が提供され；遺伝子組換え動物は、動物のゲノムにおけるＢ２Ｍ及び／又はＭＨＣ遺伝子の修飾（例えば、置換）を有する。
【0201】
上記の非ヒト哺乳類における遺伝子、分子及び挙動分析が実施され得る。本開示は、同じ又は他の遺伝子型と交配された本開示によって提供される非ヒト哺乳動物により作製される子孫にも関する。
【0202】
本開示は、非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来する細胞株又は一次細胞培養物も提供する。細胞培養に基づくモデルは、例えば、以下の方法により調製可能である。細胞培養物は、非ヒト哺乳動物からの単離を通して得ることができ、代わりに、細胞は、同じ構築物を用いて確立された細胞培養及び細胞トランスフェクション技術から得ることができる。Ｂ２Ｍ及び／又はＭＨＣ遺伝子の修飾は、種々の方法により検出可能である。
【0203】
さらに、（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）又はサザンブロッティング及び原位置ハイブリダイゼーションを用いるｍＲＮＡ定量化手法を含む）ＲＮＡレベルでの方法及び（組織化学、イムノブロット分析及びインビトロ結合試験を含む）タンパク質レベルでの方法を含む、ＤＮＡの発現を検出するために使用可能である分析法が多く存在する。分析方法を用いて、定量的測定を完遂することができる。例えば、野生型遺伝子及び修飾配列の転写レベルは、ＲＴ－ＰＣＲ及びハイブリダイゼーション法、例えばリボヌクレアーゼ保護、サザンブロット解析、ＲＮＡドット分析（ＲＮＡドット）の分析を用いて測定可能である。ヒトタンパク質の存在を評価するため、免疫組織化学的染色、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット解析も使用可能である。
【0204】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物におけるヒト若しくはヒト化ＭＨＣタンパク質複合体、ヒト若しくはヒト化Ｂ２Ｍ、ヒト若しくはヒト化ＭＨＣ遺伝子（例えば、ＭＨＣクラスＩα鎖）及び／又は融合タンパク質の発現は、例えば、特定の誘導物質又は抑制物質の添加により制御可能である。いくつかの実施形態では、特定の誘導物質は、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ系／Ｔｅｔ－Ｏｎ系又はタモキシフェン系から選択される。
【0205】
融合タンパク質
一態様では、本開示は、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端に、
（ａ）ヒトＢ２Ｍ（シグナルペプチドの存在下又は不在下）；
（ｂ）任意選択的なリンカーペプチド配列；及び
（ｃ）ヒトＭＨＣα鎖（シグナルペプチドの存在下又は不在下）
を含む融合タンパク質を発現する遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
一態様では、本開示は、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端に、
（ａ）ヒトＢ２Ｍ（シグナルペプチドの存在下又は不在下）；
（ｂ）任意選択的なリンカーペプチド配列；及び
（ｃ）ヒトＭＨＣα鎖（シグナルペプチドの存在下又は不在下）
を含む融合タンパク質を発現する遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
【0206】
いくつかの実施形態では、ヒトＭＨＣα鎖は、ヒトＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃα鎖である。いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍは、シグナルペプチド（例えば、配列番号４のアミノ酸１～２２）を有しない。いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍは、配列番号４のアミノ酸１～１１９、２３～１１９又は２１～１１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、シグナルペプチド（例えば、配列番号８のアミノ酸１～２４又は配列番号５９のアミノ酸１～２１）を有しない。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、シグナルペプチドを有する。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、ＨＬＡ－Ａ＊０１０１である。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、配列番号８のアミノ酸１～３６５又は２５～３６５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、ＨＬＡ－Ａ２．１である。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａは、配列番号５９のアミノ酸１～３６２又は２２～３６２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【0207】
一態様では、本開示は、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端に、
（ａ）ヒトＢ２Ｍ（シグナルペプチドの存在下又は不在下）；
（ｂ）リンカーペプチド配列（任意選択）；及び
（ｃ）キメラＭＨＣα鎖（シグナルペプチドの存在下又は不在下）
を含む融合タンパク質を発現する遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
（ａ）ヒトＢ２Ｍ（シグナルペプチドの存在下又は不在下）；
（ｂ）リンカーペプチド配列（任意選択）；及び
（ｃ）キメラＭＨＣα鎖（シグナルペプチドの存在下又は不在下）
を含む融合タンパク質を発現する遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
【0208】
いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、キメラＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃα鎖である。いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍは、シグナルペプチド（例えば、配列番号４のアミノ酸１～２２）を有しない。いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍは、配列番号４のアミノ酸１～１１９、２３～１１９又は２１～１１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【0209】
いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、キメラ細胞外領域、内因性膜貫通領域及び内因性細胞質領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ細胞外領域は、ヒトＨＬＡ－Ａα１ドメイン（例えば、ヒトＨＬＡ－Ａ＊０１０１α１ドメイン又はヒトＨＬＡ－Ａ２．１α１ドメイン）、ヒトＨＬＡ－Ａα２ドメイン（例えば、ヒトＨＬＡ－Ａ＊０１０１α２ドメイン又はヒトＨＬＡ－Ａ２．１α２ドメイン）及び内因性ＭＨＣα鎖α３ドメイン（例えば、マウスＨ２－Ｄ１α３ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、シグナルペプチド（例えば、配列番号８のアミノ酸１～２４又は配列番号５９のアミノ酸１～２１）を含まない。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、配列番号８のアミノ酸２５～１１４又は配列番号５９のアミノ酸２２～１１１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるヒトＨＬＡ－Ａα１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、配列番号８のアミノ酸１１５～２０６又は配列番号５９のアミノ酸１１２～２０３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるヒトＨＬＡ－Ａα２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、配列番号８のアミノ酸２５～２０６若しくは１～２０６；又は配列番号５９のアミノ酸２２～２０３若しくは１～２０３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるヒトＨＬＡ－Ａα１及びα２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、配列番号６のアミノ酸２０７～２９８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一である内因性ＭＨＣα鎖α３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、配列番号６のアミノ酸２９９～３０９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一である内因性ＭＨＣα鎖のＣペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、配列番号６のアミノ酸３１０～３３１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一である内因性ＭＨＣα鎖の膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、配列番号６のアミノ酸３３２～３６２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一である内因性ＭＨＣα鎖の細胞質領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣα鎖は、配列番号６のアミノ酸２０７～３６２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一である、内因性ＭＨＣα鎖α３ドメイン、内因性Ｃペプチド、内因性膜貫通領域及び内因性細胞質領域を含む。
【0210】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、ヒトＢ２Ｍ ｍＲＮＡ配列（例えば、ＮＭ＿００４０４８．３（配列番号３））又はその一部（例えば、エクソン１の一部、エクソン２及びエクソン３の一部）に同一であるか又は由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、アミノ酸配列を含む．いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、ヒトＢ２Ｍアミノ酸配列（例えば、ＮＰ＿０００５６３．１（配列番号４））又はその一部（例えば、配列番号４のアミノ酸１～１１９、２３～１１９又は２１～１１９）に同一であるか又は由来する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である。
【0211】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、ヒトＨＬＡ－ＡのＤＮＡ又はｍＲＮＡ配列（例えば、ＡＦ０５５０６６．１の核酸９５４９３～９９４３６（配列番号５４）；又はＮＭ＿００１２４２７５８．１（配列番号７））又はその一部（例えば、配列番号７のエクソン２及びエクソン３）に同一であるか又は由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、ヒトＨＬＡ－Ａアミノ酸配列（例えば、ＡＡＣ２４８２５．１（配列番号５９）又はＮＰ＿００１２２９６８７．１（配列番号８））又はその一部（例えば、配列番号８のアミノ酸１～２０６若しくは２５～２０６；又は配列番号５９のアミノ酸１～２０３若しくは２２～２０３）に同一であるか又は由来する。
【0212】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、内因性ＭＨＣα鎖ｍＲＮＡ配列（例えば、マウスＨ２－Ｄ１ ｍＲＮＡ配列ＮＭ＿０１０３８０．３（配列番号５））又はその一部（例えば、配列番号５のエクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及びエクソン８）に同一であるか又は由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、内因性ＭＨＣα鎖アミノ酸配列（例えば、マウスＨ２－Ｄ１アミノ酸配列ＮＰ＿０３４５１０．３（配列番号６））又はその一部（例えば、配列番号６のアミノ酸２０７～３６２）に同一であるか又は由来する。
【0213】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、ヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、好ましくは、ヌクレオチド配列の３’末端に、内因性ＭＨＣα鎖ｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲ（例えば、マウスＨ２－Ｄ１ ｍＲＮＡ配列ＮＭ＿０１０３８０．３（配列番号５）の３’ＵＴＲ）をさらに含む。
【0214】
いくつかの実施形態では、動物のゲノムは、融合タンパク質をコードする配列を含む少なくとも１つの染色体を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、プロモーター又は調節エレメント、例えば内因性Ｂ２Ｍ（例えば、マウスＢ２Ｍ）プロモーター、誘導性プロモーター、エンハンサー及び／又はマウス若しくはヒト調節エレメントに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、プロモーター又は調節エレメント、例えば内因性マウスＨ２－Ｄ１プロモーター、誘導性プロモーター、エンハンサー及び／又はマウス若しくはヒト調節エレメントに作動可能に連結される。
【0215】
いくつかの実施形態では、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座の全て又は一部（例えば、マウスＢ２Ｍ遺伝子座のエクソン１の一部、エクソン２及びエクソン３の一部）は、融合タンパク質をコードする配列と置換される。いくつかの実施形態では、置換された配列は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の全コード領域である。いくつかの実施形態では、置換された配列は、マウスＢ２Ｍの領域（例えば、配列番号２のアミノ酸１～１１９又は２３～１１９）をコードする。いくつかの実施形態では、内因性ＭＨＣα鎖遺伝子座の全て又は一部（例えば、マウスＨ２－Ｄ１遺伝子座のエクソン１の一部、エクソン２及びエクソン３の一部）は、融合タンパク質をコードする配列と置換される。いくつかの実施形態では、置換された領域は、内因性ＭＨＣα鎖遺伝子（例えば、マウスＨ２－Ｄ１遺伝子）の全コード領域である。いくつかの実施形態では、置換された配列は、マウスＨ２－Ｄ１の領域（例えば、配列番号６のアミノ酸１～２０６又は２５～２０６）をコードする。
【0216】
いくつかの実施形態では、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の全て又は一部がノックアウトされる。いくつかの実施形態では、内因性ＭＨＣα鎖遺伝子（例えば、マウスＨ２－Ｄ１遺伝子）の全て又は一部がノックアウトされる。
【0217】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする組換え配列は、内因性Ｂ２Ｍ又はＭＨＣα鎖遺伝子座内に挿入される。いくつかの実施形態では、内因性Ｂ２Ｍ又はＭＨＣα鎖遺伝子のコード領域は、挿入された組換え配列に後続する停止コドン及びポリＡシグナルの存在に起因して転写又は翻訳されない。
【0218】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、全ヒトＢ２Ｍヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４又はＮＭ＿００４０４８．４（配列番号３））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0219】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、全ヒトＢ２Ｍヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４又はＮＭ＿００４０４８．４（配列番号３））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0220】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、全ヒトＨＬＡ－Ａヌクレオチド配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿００１２４２７５８．１（配列番号７）のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８又はＡＦ０５５０６６．１の核酸９５４９３～９９４３６（配列番号５４））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0221】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、全ヒトＨＬＡ－Ａヌクレオチド配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿００１２４２７５８．１（配列番号７）のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８又はＡＦ０５５０６６．１の核酸９５４９３～９９４３６（配列番号５４））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0222】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、全マウスＨ２－Ｄ１ヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８又はＮＭ＿０１０３８０．３（配列番号５））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0223】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、全マウスＨ２－Ｄ１ヌクレオチド配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８又はＮＭ＿０１０３８０．３（配列番号５））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチド、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0224】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列は、全ヒトＢ２Ｍアミノ酸配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４若しくはＮＭ＿００４０４８．４（配列番号３）によってコードされるアミノ酸；又はＮＰ＿００４０３９．１（配列番号４））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0225】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列は、全ヒトＢ２Ｍアミノ酸配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４若しくはＮＭ＿００４０４８．４（配列番号３）によってコードされるアミノ酸；又はＮＰ＿００４０３９．１（配列番号４））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0226】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列は、全ヒトＨＬＡ－Ａアミノ酸配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿００１２４２７５８．１（配列番号７）のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８若しくはＡＦ０５５０６６．１の核酸９５４９３～９９４３６（配列番号５４）によってコードされるアミノ酸；ＮＰ＿００１２２９６８７．１（配列番号８）；又はＡＡＣ２４８２５．１（配列番号５９））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0227】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列は、全ヒトＨＬＡ－Ａアミノ酸配列又はその一部（例えば、ＮＭ＿００１２４２７５８．１（配列番号７）のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８若しくはＡＦ０５５０６６．１の核酸９５４９３～９９４３６（配列番号５４）によってコードされるアミノ酸；ＮＰ＿００１２２９６８７．１（配列番号８）；又はＡＡＣ２４８２５．１（配列番号５９））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0228】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列は、全マウスＨ２－Ｄ１アミノ酸配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８若しくはＮＭ＿０１０３８０．３（配列番号５）によってコードされるアミノ酸；又はＮＰ＿０３４５１０．３（配列番号６））と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0229】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列は、全マウスＨ２－Ｄ１アミノ酸配列又はその一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８若しくはＮＭ＿０１０３８０．３（配列番号５）によってコードされるアミノ酸；又はＮＰ＿０３４５１０．３（配列番号６））と同じである少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００アミノ酸、例えば隣接又は非隣接ヌクレオチド）を有する。
【0230】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、
ａ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するか又はそれに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に低ストリンジェンシー条件下又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の相同性を有するか、又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列；
ｅ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２アミノ酸以下若しくは１アミノ酸以下だけ異なるアミノ酸配列；又は
ｆ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列に対する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
ａ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するか又はそれに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に低ストリンジェンシー条件下又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の相同性を有するか、又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列；
ｅ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２アミノ酸以下若しくは１アミノ酸以下だけ異なるアミノ酸配列；又は
ｆ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列に対する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【0231】
本開示は、
ａ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４若しくは６５で示されるとおりの核酸配列又はヒト化マウスＢ２Ｍ若しくはＭＨＣα鎖の相同性Ｂ２Ｍ若しくはＭＨＣα鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｂ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４若しくは６５で示されるとおりのヌクレオチド配列に低ストリンジェンシー条件下又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能である核酸配列；
ｃ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４若しくは６５で示されるとおりのヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の相同性を有するか、又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である核酸配列；
ｄ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するか又は少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｅ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の相同性を有するか、又はそれに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｆ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２アミノ酸以下若しくは１アミノ酸以下だけ異なるアミノ酸配列をコードする核酸配列；及び／又は
ｇ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列に対する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択され得る核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）配列にも関する。
ａ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４若しくは６５で示されるとおりの核酸配列又はヒト化マウスＢ２Ｍ若しくはＭＨＣα鎖の相同性Ｂ２Ｍ若しくはＭＨＣα鎖アミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｂ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４若しくは６５で示されるとおりのヌクレオチド配列に低ストリンジェンシー条件下又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能である核酸配列；
ｃ）配列番号９、１０、１３、１４、１５、１６、５２、５４若しくは６５で示されるとおりのヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の相同性を有するか、又は少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である核酸配列；
ｄ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３又は６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するか又は少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｅ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の相同性を有するか、又はそれに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｆ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２アミノ酸以下若しくは１アミノ酸以下だけ異なるアミノ酸配列をコードする核酸配列；及び／又は
ｇ）配列番号４、８、５９、６１、６２、６３若しくは６４で示されるアミノ酸配列に対する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択され得る核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）配列にも関する。
【0232】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端にヒトＭＨＣα鎖のシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＭＨＣα鎖のシグナルペプチドは、ヒトＨＬＡ－Ａ（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０１０１又はＨＬＡ－Ａ２．１）のシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａのシグナルペプチドは、配列番号８のアミノ酸１～２４又は配列番号５９のアミノ酸１～２１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａのシグナルペプチドは、配列番号１３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一である配列によってコードされる。
【0233】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端に内因性ＭＨＣ分子（例えば、マウスＨ２－Ｄ１遺伝子）のシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸１～２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【0234】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端にヒト又は内因性Ｂ２Ｍシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ヒト又は内因性Ｂ２Ｍシグナルペプチドは、配列番号４のアミノ酸１～２０又は配列番号２のアミノ酸１～２０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【0235】
いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍは、リンカーペプチド配列の存在下又は不在下でヒトＭＨＣα鎖に融合される。いくつかの実施形態では、リンカーペプチド配列は、任意選択的であり、即ち、一緒に連結された２つの領域は、ペプチド結合により直接的に連結され得る。いくつかの実施形態では、リンカーペプチド配列は、少なくとも又はおよそ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０又は５０アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーペプチド配列は、少なくとも又はおよそ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２５、３０又は４０グリシン残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーペプチド配列は、少なくとも又はおよそ１、２、３、４、５、６、７又は８セリン残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーペプチド配列は、グリシン及びセリン残基の両方を含むか又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、リンカーペプチド配列は、任意の配列番号６７に対して少なくとも又はおよそ７０％、少なくとも又はおよそ７５％、少なくとも又はおよそ８０％、少なくとも又はおよそ８５％、少なくとも又はおよそ９０％、少なくとも又はおよそ９５％、少なくとも又はおよそ９９％又は１００％同一である配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、リンカーペプチド配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号６８）の少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８リピートを含む。いくつかの実施形態では、リンカーペプチド配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０又は５０アミノ酸残基以下を有する。いくつかの実施形態では、リンカーペプチド配列は、配列番号５１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一である配列によってコードされる。
【0236】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化ＭＨＣタンパク質複合体を発現する遺伝子組換え非ヒト動物は、内因性Ｂ２Ｍ（例えば、マウスＢ２Ｍ）を正常レベルで発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化ＭＨＣタンパク質複合体を発現する遺伝子組換え非ヒト動物は、内因性Ｂ２Ｍ（例えば、マウスＢ２Ｍ）を、減少レベル（例えば、遺伝子修飾を有しない動物の場合と比較して、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満又は５０％未満）で発現した。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化ＭＨＣタンパク質複合体を発現する遺伝子組換え非ヒト動物は、内因性Ｂ２Ｍ（例えば、マウスＢ２Ｍ）を発現しない。
【0237】
ベクター
本開示は、ヒト化ＭＨＣタンパク質複合体の動物モデルを構築するためのベクターも提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｓｇＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、（例えば、本明細書に記載の非ヒト動物の）Ｂ２Ｍ遺伝子を標的にし、ｓｇＲＮＡは、改変されるべきＢ２Ｍ遺伝子の標的配列に対して特有であり、５’－ＮＮＮ（２０）－ＮＧＧ３’又は５’－ＣＣＮ－Ｎ（２０）－３’の配列配置規則を満たす。いくつかの実施形態では、マウスＢ２Ｍ遺伝子におけるｓｇＲＮＡの標的化部位は、マウスＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、イントロン１、イントロン２、イントロン３、エクソン１の上流又はエクソン４の下流に位置する。いくつかの実施形態では、マウスＢ２Ｍ遺伝子におけるｓｇＲＮＡの標的化部位は、エクソン１又はイントロン１に位置する。いくつかの実施形態では、マウスＢ２Ｍ遺伝子におけるｓｇＲＮＡの標的化部位は、エクソン３又はイントロン３に位置する。
本開示は、ヒト化ＭＨＣタンパク質複合体の動物モデルを構築するためのベクターも提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｓｇＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、（例えば、本明細書に記載の非ヒト動物の）Ｂ２Ｍ遺伝子を標的にし、ｓｇＲＮＡは、改変されるべきＢ２Ｍ遺伝子の標的配列に対して特有であり、５’－ＮＮＮ（２０）－ＮＧＧ３’又は５’－ＣＣＮ－Ｎ（２０）－３’の配列配置規則を満たす。いくつかの実施形態では、マウスＢ２Ｍ遺伝子におけるｓｇＲＮＡの標的化部位は、マウスＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、イントロン１、イントロン２、イントロン３、エクソン１の上流又はエクソン４の下流に位置する。いくつかの実施形態では、マウスＢ２Ｍ遺伝子におけるｓｇＲＮＡの標的化部位は、エクソン１又はイントロン１に位置する。いくつかの実施形態では、マウスＢ２Ｍ遺伝子におけるｓｇＲＮＡの標的化部位は、エクソン３又はイントロン３に位置する。
【0238】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、マウスＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１又はイントロン１内の標的化部位を認識する。いくつかの実施形態では、エクソン１又はイントロン１内の標的化部位は、配列番号１７～２３で示される。いくつかの実施形態では、エクソン１又はイントロン１内の標的化部位は、配列番号１９で示される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、マウスＢ２Ｍ遺伝子のエクソン３又はイントロン３内の標的化部位を認識する。いくつかの実施形態では、エクソン３又はイントロン３内の標的化部位は、配列番号２４～３１で示される。いくつかの実施形態では、エクソン３又はイントロン３内の標的化部位は、配列番号３０で示される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、配列番号３２及び配列番号３４；配列番号３３及び配列番号３５；配列番号３６及び配列番号３８；又は配列番号３７及び配列番号３９で示される配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子によってコードされる。
【0239】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｓｇＲＮＡ配列を含むプラスミド構築物（例えば、ｐＴ７－ｓｇＲＮＡ）及び／又は構築物を含む細胞に関する。
【0240】
いくつかの実施形態では、本開示は、５’相同性アーム及び３’相同性アームを含む標的化ベクターに関する。いくつかの実施形態では、５’相同性アームは、エクソン１の上流及びエクソン１の全て又は一部に及ぶ配列を含む。いくつかの実施形態では、３’相同性アームは、イントロン３、エクソン４及びエクソン４の下流の全て又は一部に及ぶ配列を含む。
【0241】
いくつかの実施形態では、５’相同性アームは、配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、３’相同性アームは、配列番号１２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、５’相同性アームは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００６８．７の１２２１４６３２９～１２２１４７７３７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、３’相同性アームは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００６８．７の１２２１５２１７１～１２２１５３５１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％又は１００％同一である配列を含む。
【0242】
いくつかの実施形態では、標的化ベクターは、５’及び３’相同性アーム間のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書に記載の融合タンパク質の全て又は一部をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ配列）を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、好ましくは、５’末端から３’末端に、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１シグナルペプチドをコードする配列、ヒトＢ２Ｍをコードする配列、本明細書に記載のリンカーペプチド配列をコードする配列、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１の一部をコードする配列及びマウスＨ２－Ｄ１の一部をコードする配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１シグナルペプチドをコードする配列は、配列番号１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍをコードする配列は、配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、リンカーペプチド配列をコードする配列は、配列番号５１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１の一部をコードする配列は、配列番号１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、マウスＨ２－Ｄ１の一部をコードする配列は、配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％又は１００％同一である。
【0243】
いくつかの実施形態では、５’相同性アームは、配列番号６０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、３’相同性アームは、配列番号５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、５’相同性アームは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００６８．７の１２２１４６３２９～１２２１４７７３７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、５’相同性アームは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００６８．７の、１２２１４７０１５位でのＧからＴへの突然変異、１２２１４７１０８位及び１２２１４７５９１位でのＣからＴへの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、３’相同性アームは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００６８．７の１２２１５２１７１～１２２１５３５１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、３’相同性アームは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００６８．７内において、１２２１５２２５８位での突然変異（ＧからＡ）、１２２１５２３９１位での突然変異（ＧからＡ）、１２２１５２７７１位での突然変異（ＡからＧ）、１２２１５３１０４位での突然変異（ＴからＣ）及び１２２１５３１４８位での突然変異（ＡからＣ）；並びに１２２１５２７８８位での欠失（Ａの欠失）を含む。
【0244】
いくつかの実施形態では、標的化ベクターは、５’及び３’相同性アーム間のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書に記載の融合タンパク質の全て又は一部をコードする配列（例えば、ｃＤＮＡ配列）を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、好ましくは、５’末端から３’末端に、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１シグナルペプチドをコードする配列、ヒトＢ２Ｍをコードする配列、本明細書に記載のリンカーペプチド配列をコードする配列及びヒトＨＬＡ－Ａ２．１をコードする配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１シグナルペプチドをコードする配列は、配列番号１３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、ヒトＢ２Ｍをコードする配列は、配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、リンカーペプチド配列をコードする配列は、配列番号５１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１をコードする配列は、配列番号５４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、５’及び３’相同性アーム間のヌクレオチド配列は、配列番号６５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％又は１００％同一である。
【0245】
加えて、本開示は、前述の標的化ベクターのいずれか１つ及び本明細書に記載のｓｇＲＮＡ構築物の１つ以上のインビトロ転写物を有する非ヒト哺乳動物細胞にさらに関する。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ又はそのインビトロ転写物を含む。
【0246】
いくつかの実施形態では、細胞内の遺伝子は、ヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞内の遺伝子は、ホモ接合性である。
【0247】
いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、受精卵細胞である。
【0248】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列を含むベクターを調製するための方法であって、（ａ）フォワードオリゴヌクレオチド配列及びリバースオリゴヌクレオチド配列を使用して得られるｓｇＲＮＡ配列であって、本明細書に記載の非ヒト動物Ｂ２Ｍ遺伝子を標的にし、ｓｇＲＮＡは、改変されるべき標的Ｂ２Ｍ遺伝子に対して特有であり、且つ５’－ＮＮＮ（２０）－ＮＧＧ３’又は５’－ＣＣＮ－Ｎ（２０）－３’の配列配置規則を満たす、ｓｇＲＮＡ配列を提供するステップと；（ｂ）Ｔ７プロモーター及びｓｇＲＮＡスキャフォールド（例えば、配列番号４０に対して少なくとも８０％同一である）を有するＤＮＡ断片を合成し、次いでＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化後に骨格ベクターにライゲートし、及び配列決定による検証後、ｐＴ７－ｓｇＲＮＡベクターを得るステップと；（ｃ）ステップ（ａ）で得られたフォワードオリゴヌクレオチド及びリバースオリゴヌクレオチドを変性及びアニーリングし、ステップ（ｂ）に記載のｐＴ７－ｓｇＲＮＡベクターにライゲート可能である二本鎖を形成するステップと；（ｄ）ステップ（ｃ）でアニールされた二本鎖ｓｇＲＮＡオリゴヌクレオチドをｐＴ７－ｓｇＲＮＡベクターとライゲートし、スクリーニングすることでｓｇＲＮＡベクターを得るステップとを含む方法が本明細書で提供される。
【0249】
遺伝子組換え動物を作製する方法
遺伝子組換え動物は、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え（ＨＲ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムを含む、当技術分野で公知であるいくつかの技術により作製可能である。いくつかの実施形態では、相同組換えが使用される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物を作製するため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集が使用される。これらのゲノム編集技術の多くは、当技術分野で公知であり、例えばＹｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １６．６（２０１７）：３８７－３９９（その全体が参照により援用される）に記載されている。さらに、他の多くの方法が提供され、ゲノム編集、例えば遺伝子組換え核の除核卵母細胞へのマイクロインジェクション及び除核卵母細胞と別の遺伝子組換え細胞との融合において使用可能である。
遺伝子組換え動物は、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え（ＨＲ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムを含む、当技術分野で公知であるいくつかの技術により作製可能である。いくつかの実施形態では、相同組換えが使用される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物を作製するため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集が使用される。これらのゲノム編集技術の多くは、当技術分野で公知であり、例えばＹｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １６．６（２０１７）：３８７－３９９（その全体が参照により援用される）に記載されている。さらに、他の多くの方法が提供され、ゲノム編集、例えば遺伝子組換え核の除核卵母細胞へのマイクロインジェクション及び除核卵母細胞と別の遺伝子組換え細胞との融合において使用可能である。
【0250】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、動物の少なくとも１つの細胞において、内因性Ｂ２Ｍ又はＭＨＣ遺伝子座で、内因性Ｂ２Ｍ又はＭＨＣα鎖の領域をコードする配列を、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列と置換することを提供する。いくつかの実施形態では、置換は、胚細胞、体細胞、胚盤胞又は線維芽細胞などで生じる。体細胞又は線維芽細胞の核は、除核卵母細胞内に挿入され得る。
【0251】
図９及び図１８は、マウスＢ２Ｍ遺伝子座でのＭＨＣタンパク質複合体のヒト化方法を示す。図９及び図１８では、標的化方法は、５’相同性アーム、融合タンパク質をコードする配列及び３’相同性アームを含むベクターを含む。方法は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子配列を、融合タンパク質をコードする配列と相同組換えにより置換することを含み得る。いくつかの実施形態では、（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲによる）標的部位の上流及び下流での切断は、ＤＮＡ二本鎖切断をもたらし得、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子配列を、融合タンパク質をコードする配列と置換するために相同組換えが使用される。
【0252】
いくつかの実施形態では、５’末端標的化部位及び３’末端標的化部位間の配列がノックアウトされる。いくつかの実施形態では、５’末端標的化部位及び３’末端標的化部位間の配列が置換される。いくつかの実施形態では、置換された配列は、マウスＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１又はイントロン１内から開始する。いくつかの実施形態では、置換された配列は、マウスＢ２Ｍ遺伝子のエクソン３又はイントロン３内で終結する。
【0253】
したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子組換えヒト化動物を作製するための方法は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座（又は部位）において、内因性Ｂ２Ｍの領域をコードする配列をコードする核酸を、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列と置換するステップを含み得る。配列は、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４の領域（例えば、一部又は全部の領域）を含み得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする配列は、ヒトＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４の領域（例えば、一部又は全部の領域）並びに内因性又はヒトＭＨＣα鎖遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７及びエクソン８の領域（例えば、一部又は全部の領域）を含む。いくつかの実施形態では、内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座は、マウスＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１の一部、エクソン２及びエクソン３の一部（例えば、配列番号２のアミノ酸１～１１９をコードする配列）である。
【0254】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質を発現するためにマウスのＢ２Ｍ遺伝子座を修飾する方法は、内因性マウスＢ２Ｍ遺伝子座でマウスＢ２Ｍをコードするヌクレオチド配列を、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と置換し、それによりヒトＢ２Ｍ及びヒト又はキメラＭＨＣα鎖を含む融合タンパク質をコードする配列を作製するステップを含み得る。
【0255】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、互いに重複しない（例えば、５’相同性アーム、Ａ断片（又はＢＮＤＧ－Ａ断片）及び／又は３’相同性アームは、重複しない）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸配列は、互いに重複しない。
【0256】
ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクタードメイン又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合ドメインは、内因性（例えば、マウス）Ｂ２Ｍ遺伝子座のエクソン１内、エクソン２内、エクソン３内、エクソン４内、イントロン１内、イントロン２内及び／又はイントロン３内の領域を標的にするように設計され得る。例えば、配列番号１７～２３の標的化配列は、内因性（例えば、マウス）Ｂ２Ｍ遺伝子座のエクソン１又はイントロン１に位置し；配列番号２４～３１の標的化配列は、内因性（例えば、マウス）Ｂ２Ｍ遺伝子座のエクソン３又はイントロン３に位置する。ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクタードメイン又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合ドメインが標的配列に結合した後、ヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡを切断する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である。
【0257】
したがって、ヒト若しくはヒト化ＭＨＣタンパク質複合体、ヒト若しくはヒト化Ｂ２Ｍ及び／又はヒト若しくはヒト化ＭＨＣ分子を発現するマウスを作製する方法は、マウス胚性幹細胞を、内因性Ｂ２Ｍ又はＭＨＣ遺伝子を標的にする遺伝子編集システムにより形質転換し、それにより形質転換された胚性幹細胞を作製するステップと；形質転換された胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入するステップと；マウス胚盤胞を偽妊娠雌マウスに移植するステップと；胚盤胞が胎児発生から満期出産までを経ることを可能にするステップとの１つ以上を含み得る。
【0258】
いくつかの実施形態では、形質転換された胚細胞は、代わりに、偽妊娠雌マウスに直接的に移植され、胚細胞は、胎児発生を経る。
【0259】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクタードメイン又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合ドメインを含み得る。
【0260】
本開示は、ヒト若しくはヒト化ＭＨＣタンパク質複合体、ヒト若しくはヒト化Ｂ２Ｍ及び／又はヒト若しくはヒト化ＭＨＣ分子を発現する動物モデルを確立するための方法であって、
（ａ）細胞（例えば、受精卵細胞）に、本明細書に記載の方法に基づく遺伝子修飾を提供するステップと；
（ｂ）液体培地中で細胞を培養するステップと；
（ｃ）培養された細胞をレシピエント雌非ヒト哺乳動物の卵管又は子宮に移植し、雌非ヒト哺乳動物の子宮内で細胞が発現することを可能にするステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）における妊娠雌の遺伝子組換えヒト化非ヒト哺乳動物の子孫における生殖系列伝達を同定するステップと
を含む方法をさらに提供する。
（ａ）細胞（例えば、受精卵細胞）に、本明細書に記載の方法に基づく遺伝子修飾を提供するステップと；
（ｂ）液体培地中で細胞を培養するステップと；
（ｃ）培養された細胞をレシピエント雌非ヒト哺乳動物の卵管又は子宮に移植し、雌非ヒト哺乳動物の子宮内で細胞が発現することを可能にするステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）における妊娠雌の遺伝子組換えヒト化非ヒト哺乳動物の子孫における生殖系列伝達を同定するステップと
を含む方法をさらに提供する。
【0261】
いくつかの実施形態では、前述の方法における非ヒト哺乳動物は、マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤ／ｓｃｉｄヌードマウス又はＢ－ＮＤＧマウス）である。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物は、Ｂ－ＮＤＧ（ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ－２ｒγｎｕｌｌ）マウスである。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスである。
【0262】
Ｂ－ＮＤＧマウスにおいて、（一般に「ＳＣＩＤ」又は「重症複合免疫不全」として知られる）Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄの突然変異が非肥満糖尿病（ＮＯＤ）バックグラウンドに対して導入されている。ＳＣＩＤ突然変異に対してホモ接合性の動物は、Ｔ及びＢ細胞リンパ球の発現を損なっている。ＮＯＤバックグラウンドは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞機能の欠損をさらにもたらす。ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌは、マウスＣＤ１３２遺伝子における特定のノックアウト改変を指す。詳細は、例えば、ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０１８／０７９３６５号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【0263】
いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物は、Ｂ－ＮＤＧマウスである。Ｂ－ＮＤＧマウスは、マウスにおける染色体１１上のＦＯＸＮ１遺伝子の破壊をさらに有する。
【0264】
いくつかの実施形態では、上記の方法における受精卵は、ＮＯＤ／ｓｃｉｄ受精卵、ＮＯＤ／ｓｃｉｄヌード受精卵又はＢ－ＮＤＧ受精卵である。本明細書に記載の方法においても使用可能である他の受精卵として、限定はされないが、Ｃ５７ＢＬ／６受精卵、ＦＶＢ／Ｎ受精卵、ＢＡＬＢ／ｃ受精卵、ＤＢＡ／１受精卵及びＤＢＡ／２受精卵が挙げられる。
【0265】
受精卵は、任意の非ヒト動物、例えば本明細書に記載の任意の非ヒト動物に由来し得る。いくつかの実施形態では、受精卵細胞は、齧歯類に由来する。遺伝子構築物は、ＤＮＡのマイクロインジェクションにより、受精卵に導入され得る。例えば、マイクロインジェクション後に受精卵を培養することを通して、培養された受精卵は、偽妊娠非ヒト動物に移植可能であり、及び非ヒト哺乳動物の出生により、上記方法において言及された非ヒト哺乳動物が作製される。
【0266】
本明細書に記載の遺伝子組換え動物（例えば、マウス）は、いくつかの利点を有し得る。例えば、遺伝子組換えマウスは、戻し交配を必要とせず、そのため、当技術分野で公知の他のいくつかの免疫不全マウスと比較して、比較的より純粋なバックグラウンド（例えば、Ｂ－ＮＤＧ）を有する。純粋なバックグラウンドは、一貫した実験結果を得るために有利である。
【0267】
遺伝子組換え動物を使用する方法
ヒト又はヒト化ＭＨＣタンパク質複合体を発現する遺伝子組換え動物は、限定はされないが、ヒト血液リンパ系動物モデルを確立することと、ヒト疾患及び障害に対する治療薬を開発することと、動物モデルにおけるこれらの治療薬の有効性を評価することとを含む種々の使用を提供し得る。
ヒト又はヒト化ＭＨＣタンパク質複合体を発現する遺伝子組換え動物は、限定はされないが、ヒト血液リンパ系動物モデルを確立することと、ヒト疾患及び障害に対する治療薬を開発することと、動物モデルにおけるこれらの治療薬の有効性を評価することとを含む種々の使用を提供し得る。
【0268】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物は、ヒト血液リンパ系を確立するために使用可能である。方法は、ヒト造血細胞（ＣＤ３４＋細胞）又はヒト末梢血細胞を含む細胞の集団を本明細書に記載の遺伝子組換え動物に移植することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、移植前に動物を照射するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、照射するステップは、移植前に必要とされない。遺伝子組換え動物におけるヒト血液リンパ系は、様々なヒト細胞、例えば造血幹細胞、骨髄前駆体細胞、骨髄系細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、好中球、肥満細胞、リンパ球及び血小板を含み得る。
【0269】
（例えば、ヒト又はヒト化ＭＨＣタンパク質複合体を発現する）本明細書に記載の遺伝子組換え動物は、ヒト血液リンパ系を確立するための優れた動物モデルでもある。いくつかの実施形態では、ヒト免疫系を発生するため、ヒト造血幹細胞又はヒト末梢血細胞を移植された後の動物は、以下の特徴：
（ａ）ヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の百分率が、動物における（赤血球の溶解後の）血液からの全生細胞の少なくとも又はおよそ１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％であること；
（ｂ）ヒトＴ細胞（又はＣＤ３＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の少なくとも又はおよそ１％、２％、３％、４％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％又は５０％であること；
（ｃ）ヒトＢ細胞（又はＣＤ１９＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の少なくとも又はおよそ３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又は８０％であること；
（ｄ）ヒトＮＫ細胞（又はＣＤ５６＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の少なくとも又はおよそ１％、２％、３％、４％、５％、８％又は１０％であること、
（ｅ）ヒト骨髄系細胞（又はＣＤ３３＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の少なくとも又はおよそ２％、５％、８％、１０％、１５％又は２０％であること；
（ｆ）ヒト単球（又はＣＤ１４＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト骨髄系細胞（又はＣＤ３３＋細胞）の少なくとも又はおよそ５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％であること；及び
（ｇ）ヒト顆粒球（又はＣＤ６６ｂ＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト骨髄系細胞（又はＣＤ３３＋細胞）の少なくとも又はおよそ１％、２％、３％、４％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％又は３０％であること
の１つ以上を有する。
（ａ）ヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の百分率が、動物における（赤血球の溶解後の）血液からの全生細胞の少なくとも又はおよそ１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％であること；
（ｂ）ヒトＴ細胞（又はＣＤ３＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の少なくとも又はおよそ１％、２％、３％、４％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％又は５０％であること；
（ｃ）ヒトＢ細胞（又はＣＤ１９＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の少なくとも又はおよそ３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又は８０％であること；
（ｄ）ヒトＮＫ細胞（又はＣＤ５６＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の少なくとも又はおよそ１％、２％、３％、４％、５％、８％又は１０％であること、
（ｅ）ヒト骨髄系細胞（又はＣＤ３３＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト白血球（又はＣＤ４５＋細胞）の少なくとも又はおよそ２％、５％、８％、１０％、１５％又は２０％であること；
（ｆ）ヒト単球（又はＣＤ１４＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト骨髄系細胞（又はＣＤ３３＋細胞）の少なくとも又はおよそ５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％であること；及び
（ｇ）ヒト顆粒球（又はＣＤ６６ｂ＋細胞）の百分率が、動物におけるヒト骨髄系細胞（又はＣＤ３３＋細胞）の少なくとも又はおよそ１％、２％、３％、４％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％又は３０％であること
の１つ以上を有する。
【0270】
いくつかの実施形態では、ヒト免疫系を発生するため、動物（マウス）にヒト造血幹細胞を移植されてから少なくとも又はおよそ４週、少なくとも又はおよそ８週、少なくとも又はおよそ１２週、少なくとも又はおよそ１６週、少なくとも又はおよそ２０週、少なくとも又はおよそ２４週、少なくとも又はおよそ２６週、少なくとも又はおよそ２８週、少なくとも又はおよそ３０週の経過後、１つ以上の特徴が決定される。
【0271】
いくつかの実施形態では、動物は、ＮＳＧマウス、ＮＯＧマウス、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス又はＢ－ＮＤＧマウスと比較して、外因性細胞の増強された移植能力を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の動物モデルは、ヒト血液リンパ系を確立するためのより優れた（例えば、より高い生存率を有するか；全生細胞中の白血球のより高い百分率を有するか；又は再構築のより高い成功率を有する）動物モデルである。ＮＳＧマウス、ＮＯＤマウス及びＢ－ＮＤＧの詳細な説明は、例えば、Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ ｃｈａｉｎｎｕｌｌ ｍｉｃｅ．”Ｂｌｏｏｄ １０６．５（２００５）：１５６５－１５７３；Ｋａｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．“ＮＯＤ－Ｒａｇ２ｎｕｌｌ ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ ｍｉｃｅ：ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ＮＯＧ ｍｉｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ．”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｉｍａｌｓ ６３．３（２０１４）：３２１－３３０；米国特許出願公開第２０１９０３２０６３１Ａ１号明細書（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。
【0272】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物は、癌の治療のための薬剤又は薬剤の組み合わせの有効性を判定するために使用され得る。方法は、腫瘍細胞を、本明細書に記載の動物に移植することと、薬剤又は薬剤の組み合わせを動物に投与することと、腫瘍に対する阻害効果を判定することとを含む。
【0273】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ヒト患者から得られた腫瘍サンプルに由来する。これらの動物モデルは、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルとしても知られる。ＰＤＸモデルは、癌の進行及び治療の試験のために、癌の自然増殖に類似する環境を創出するために使用されることが多い。ＰＤＸモデル内の患者腫瘍サンプルは、患者の原発性腫瘍部位に見出される酸素、栄養素及びホルモンレベルを再現する生理学的に関連する腫瘍微小環境下で増殖する。さらに、移植された腫瘍組織は、患者に見出される遺伝的及びエピジェネティック異常を維持し、異種移植片組織は、周囲のヒト間質を含むように患者から切除され得る。結果として、ＰＤＸモデルは、多くの場合、腫瘍サンプルを提供する実患者において認められるとおり、抗癌剤に対する類似の応答を示し得る。
【0274】
遺伝子組換え免疫不全動物（例えば、Ｂ－ＮＤＧバックグラウンドを有するマウス）は、機能的Ｔ細胞又はＢ細胞を有しない一方、動物は、機能的な食細胞、例えば好中球、好酸球（乳酸菌）、好塩基球又は単球を依然として有する。マクロファージは、単球由来であり得、細胞片、外来物質、微生物、癌細胞を貪食及び消化し得る。したがって、本明細書に記載の遺伝子組換え動物は、薬剤（例えば、抗ＣＤ４７抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ１５抗体又は抗ＳＩＲＰα抗体）の食作用に対する効果及び薬剤の腫瘍細胞の増殖を阻害する効果を判定するために使用可能である。
【0275】
いくつかの実施形態では、ヒト造血系の発生のため、ヒト末梢血細胞（ｈＰＢＭＣ）又はヒト造血幹細胞が動物に注射される。本明細書に記載の遺伝子組換え動物は、ヒト造血系における薬剤の効果及び薬剤の腫瘍細胞増殖又は腫瘍増殖を阻害する効果を判定するために使用可能である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、薬剤のヒト免疫細胞（例えば、ヒトＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞）に対する効果、例えば薬剤がＴ細胞を刺激し得るか又はＴ細胞を阻害し得るか、薬剤が免疫応答を上方制御し得るか又は免疫応答を下方制御し得るかも判定するように設計される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物は、対象における疾患、例えば癌又は自己免疫疾患を治療するための治療薬の有効用量を決定するために使用可能である。
【0276】
いくつかの実施形態では、様々な癌を治療するため、被験薬又は被験薬の組み合わせが設計される。本明細書で用いられるとき、用語「癌（ｃａｎｃｅｒ）」は、自律的増殖能力、即ち急速に増殖する細胞増殖を特徴とする異常な状態又は病態を有する細胞を指す。この用語は、癌性増殖又は発癌性プロセス、転移性組織又は悪性に形質転換された細胞、組織若しくは臓器といった全てのタイプを、侵襲性の病理組織学的タイプ又は状態と無関係に含むことを意味する。用語「腫瘍」は、本明細書で用いられるとき、癌性細胞、例えば癌性細胞の集団を指す。本明細書に記載の方法を用いて治療又は診断可能な癌は、例えば、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸管及び泌尿生殖器を冒す様々な臓器系の悪性腫瘍並びに大部分の結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌及び食道の癌などの悪性腫瘍を含む腺癌を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬剤は、対象における癌を治療又は診断するように設計される。用語「癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」は、当技術分野で認められており、呼吸器系癌、胃腸系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌及びメラノーマを含む、上皮又は内分泌組織の悪性腫瘍を指す。いくつかの実施形態では、癌は、腎癌又はメラノーマである。例示的な癌は、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸及び卵巣の組織から形成するものを含む。この用語は、癌肉腫も含み、例えば癌性及び肉腫性組織からなる悪性腫瘍を含む。「腺癌」は、腺組織に由来するか、又は腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する場合の癌を指す。用語「肉腫」は、当技術分野で認められており、間葉誘導系の悪性腫瘍を指す。
【0277】
いくつかの実施形態では、被験薬は、メラノーマ、原発性肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、原発性胃癌、膀胱癌、乳癌及び／又は前立腺癌を治療するように設計される。
【0278】
いくつかの実施形態では、注射される腫瘍細胞は、ヒト腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、注射される腫瘍細胞は、メラノーマ細胞、原発性肺癌細胞、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞、原発性胃癌細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞及び／又は前立腺癌細胞である。
【0279】
腫瘍に対する阻害効果は、当技術分野で公知の任意の方法によっても判定され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子により標識され得る。したがって、動物における腫瘍細胞の数又は腫瘍のサイズは、インビボでの画像処理システム（例えば、蛍光の強度）により判定され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍に対する阻害効果は、動物における腫瘍体積を測定し、且つ／又は腫瘍（体積）阻害率（ＴＧＩＴＶ）を決定することによっても判定され得る。腫瘍増殖阻害率は、式ＴＧＩＴＶ（％）＝（１－ＴＶｔ／ＴＶｃ）×１００（式中、ＴＶｔ及びＴＶｃは、治療群及び対照群の平均腫瘍体積（又は重量）である）を用いて計算可能である。
【0280】
いくつかの実施形態では、被験薬は、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、ペメトレキセド、５－ＦＵ、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ドセタキセル及びカペシタビンからなる群から選択される１種以上の薬剤であり得る。
【0281】
いくつかの実施形態では、被験薬は、抗体、例えばＣＳＦ２、ＩＬ３、ＣＳＦ１、ＩＬ１５、ＣＤ４７、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＰＤ－Ｌ１、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４７、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ又はＯＸ４０に結合する抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。
【0282】
本開示は、ヒト細胞の免疫プロセス、ヒト抗体の作製又は薬理学、免疫学、微生物学及び医学における研究のためのモデル系に関する産物の発現における、本明細書に記載の方法を通して作製された動物モデルの使用にも関する。
【0283】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト細胞を含む免疫プロセスの動物実験疾患モデルの作製及び利用、病原体に関する試験又は新しい診断方法及び／若しくは治療方法の開発における、本明細書に記載の方法を通して作製された動物モデルの使用を提供する。
【0284】
大部分の免疫不全マウス（例えば、Ｂ－ＮＤＧマウス）では、ＭＨＣタンパク質複合体は、（例えば、マウスＨ２分子を含む）マウス内因性ＭＨＣタンパク質複合体である。ヒト細胞又は組織の移植後、ヒト由来細胞（例えば、ヒト造血細胞又はヒト末梢血細胞）は、ヒトＭＨＣ制限抗原認識を得ることができない。さらに、ヒトＭＨＣ制限免疫応答は、免疫不全マウスにおける免疫療法又は特定病原体による感染後に評価され得ない。さらに、移植されたヒトＴ及びＢリンパ球は、免疫不全マウスにおいて十分機能的に成熟し得ない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化ＭＨＣタンパク質複合体を発現する遺伝子組換え非ヒト動物は、ヒト細胞（例えば、ヒト造血細胞又はヒト末梢血細胞）又は組織を移植された後、ＭＨＣ制限効果を、ヒト化ＭＨＣタンパク質複合体を発現しない（同じバックグラウンドを有する）対照マウスの場合と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％改善し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化ＭＨＣタンパク質複合体を発現する遺伝子組換え非ヒト動物は、ヒト細胞（例えば、ヒト造血細胞又はヒト末梢血細胞）又は組織を移植された後、ヒトＴ細胞及び／又はＢ細胞の成熟を、ヒト化ＭＨＣタンパク質複合体を発現しない（同じバックグラウンドを有する）対照マウスの場合と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％改善し得る。
【0285】
したがって、一態様では、本明細書に記載の遺伝子組換え動物は、細胞療法（例えば、Ｔ細胞に基づく細胞療法）の有効性を評価するのに特に適する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＣＲ－Ｔ、ＣＡＲ－Ｔ及び／又は他の免疫療法（例えば、Ｔ細胞養子移入療法）のインビボ有効性を検証するための方法を提供する。例えば、方法は、ヒト腫瘍細胞を、本明細書に記載の動物に移植することと、免疫療法（例えば、ヒトＣＡＲ－Ｔ療法）を、ヒト腫瘍細胞を有する動物に適用することとを含む。ＣＡＲ－Ｔ療法の有効性は、判定及び評価可能である。いくつかの実施形態では、動物は、本明細書に記載の方法によって調製された非ヒト動物、本明細書に記載の非ヒト動物、本明細書に記載の方法によって作製された二重若しくは多重ヒト化非ヒト動物（又はその子孫）、ヒト化ＭＨＣタンパク質複合体を発現する非ヒト動物又は本明細書に記載の腫瘍保有若しくは炎症性動物モデルから選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ－Ｔ、ＣＡＲ－Ｔ及び／又は他の免疫療法により、本明細書に記載の疾患を治療することができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ－Ｔ、ＣＡＲ－Ｔ及び／又は他の免疫療法は、本明細書に記載の疾患（例えば癌）を治療するための評価方法を提供する。
【0286】
さらなる遺伝子修飾を有する動物モデル
本開示は、いくつかの追加的な修飾（例えば、ヒト若しくはキメラ遺伝子又は追加的な遺伝子のノックアウト）を伴う本明細書に記載の遺伝子組換え動物モデルを作製するための方法にさらに関する。
本開示は、いくつかの追加的な修飾（例えば、ヒト若しくはキメラ遺伝子又は追加的な遺伝子のノックアウト）を伴う本明細書に記載の遺伝子組換え動物モデルを作製するための方法にさらに関する。
【0287】
いくつかの実施形態では、動物は、ヒト又はヒト化ＭＨＣタンパク質複合体をコードする配列及び追加的なヒト又はキメラタンパク質をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態では、追加的なヒト又はキメラタンパク質は、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、ＩＬ３、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）、ＩＬ１５、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（４－１ＢＢ又はＣＤ１３７）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、ＬＡＧ－３、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、Ｂ及びＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）、ＣＤ４７、トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）又はＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４；又はＯＸ４０）であり得る。
【0288】
いくつかの実施形態では、動物は、ヒト又はヒト化ＭＨＣタンパク質複合体をコードする配列及び他のいくつかの内因性遺伝子での破壊（例えば、ＣＤ１３２、β２ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）又はフォークヘッドボックスＮ１（Ｆｏｘｎ１））を含み得る。いくつかの実施形態では、動物は、ＫＩＴに突然変異を有する。ＫＩＴに突然変異を有する遺伝子組換え非ヒト動物は、例えば、ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０２０／１１３６０８号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【0289】
２つ以上のヒト又はキメラ遺伝子（例えば、ヒト化遺伝子）を有する遺伝子組換え動物モデルを作製する方法は、
（ａ）本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列を導入する方法を使用し、遺伝子組換え非ヒト動物を得るステップと；
（ｂ）遺伝子組換え非ヒト動物を別の遺伝子組換え非ヒト動物と交配させ、次に子孫をスクリーニングし、２つ以上のヒト又はキメラ遺伝子を有する遺伝子組換え非ヒト動物を得るステップと
を含み得る。
（ａ）本明細書に記載の融合タンパク質をコードする配列を導入する方法を使用し、遺伝子組換え非ヒト動物を得るステップと；
（ｂ）遺伝子組換え非ヒト動物を別の遺伝子組換え非ヒト動物と交配させ、次に子孫をスクリーニングし、２つ以上のヒト又はキメラ遺伝子を有する遺伝子組換え非ヒト動物を得るステップと
を含み得る。
【0290】
いくつかの実施形態では、方法のステップ（ｂ）において、遺伝子組換え動物は、ヒト又はキメラＣＳＦ２、ＩＬ３、ＣＳＦ１、ＩＬ１５、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＰＤ－Ｌ１、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＳＩＲＰα、ＣＤ４７、ＴＨＰＯ、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ又はＯＸ４０を有する遺伝子組換え非ヒト動物と交配され得る。これらの遺伝子組換え非ヒト動物の一部は、例えば、ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０１７／０９０３２０号明細書、ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０１７／０９９５７７号明細書、ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０１７／０９９５７５号明細書、ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０１７／０９９５７６号明細書、ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０１７／０９９５７４号明細書、ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０１７／１０６０２４号明細書、ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０２０／１２５４８９号明細書、ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０２０／１４２５４６号明細書、中国特許出願公開第１１１１７２１９０Ａ号明細書、中国特許出願公開第１１１１１８０１９Ａ号明細書及び中国特許出願公開第１１１０７３９０７Ａ号明細書（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【0291】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾は、ヒト又はキメラＣＳＦ２、ＩＬ３、ＣＳＦ１、ＩＬ１５、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＰＤ－Ｌ１、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＳＩＲＰα、ＣＤ４７、ＴＨＰＯ、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ又はＯＸ４０遺伝子を有する遺伝子組換え動物に対して直接的に実施され得る。
【0292】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾は、Ｂ２ｍノックアウトマウス又はＦｏｘｎ１ノックアウトマウスに対して直接的に実施され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾は、Ｂ－ＮＤＧマウスに対して直接的に実施され得る。
【0293】
これらのタンパク質が異なる機構を含み得ることから、そのこれらタンパク質の２つ以上を標的にする併用療法は、より有効な治療であり得る。事実、多くの関連する臨床試験が進行中であり、良好な効果を示している。
【0294】
併用療法の有効性を判定するため、ＭＨＣタンパク質複合体ヒト化動物モデル及び／又は追加的な遺伝子修飾を有するＭＨＣタンパク質複合体ヒト化動物モデルが使用可能である。
【0295】
いくつかの実施形態では、薬剤の組み合わせは、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、ペメトレキセド、５－ＦＵ、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ドセタキセル及びカペシタビンからなる群から選択される１種以上の薬剤を含み得る。
【0296】
いくつかの実施形態では、薬剤の組み合わせは、カンポテシン、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロスレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（プリコマイシン）、マイトマイシン、エトポシド、ベラムピル、ポドフィロトキシン、タモキシフェン、タキソール、トランス白金、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びメトトレキサートからなる群から選択される１種以上の薬剤を含み得る。
【0297】
いくつかの実施形態では、薬剤の組み合わせは、ＣＳＦ２、ＩＬ３、ＣＳＦ１、ＩＬ１５、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＰＤ－Ｌ１、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＳＩＲＰα、ＣＤ４７、ＴＨＰＯ、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ及び／又はＯＸ４０に結合する１種以上の抗体を含み得る。
【0298】
代替的に又は追加的に、方法は、対象に対して手術を実施し、癌の少なくとも一部を除去し、例えば対象からの腫瘍の一部又は全部を除去することも含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0299】
【図1】ＨＬＡ－Ａの三次元図式的構造である。
【図2】マウスＢ２Ｍ遺伝子座及びヒトＢ２Ｍ遺伝子座を示す概略図である。
【図3】マウスＨ２－Ｄ１遺伝子座及びヒトＨＬＡ－Ａ遺伝子座を示す概略図である。
【図4】ヒト化マウスＢ２Ｍ遺伝子座を示す概略図である。マウスＢ２Ｍ遺伝子コード領域は、ヒトＢ２Ｍタンパク質、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の一部及びマウスＨ２－Ｄ１タンパク質の一部をコードする核酸配列と置換される。
【図5】ヒト化マウスＢ２Ｍ遺伝子座を示す概略図である。マウスＢ２Ｍ遺伝子コード領域は、ヒトＢ２Ｍ遺伝子のコード領域と置換される。
【図6】ヒト化マウスＨ２－Ｄ１遺伝子座を示す概略図である。マウスＨ２－Ｄ１遺伝子の一部は、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の一部をコードする核酸配列と置換される。
【図7】ヒト化マウスＨ２－Ｄ１遺伝子座を示す概略図である。マウスＨ２－Ｄ１遺伝子の一部は、ヒトＢ２Ｍタンパク質及びヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の一部をコードする核酸配列と置換される。
【図8】ヒト化マウスＢ２Ｍ遺伝子座を示す概略図である。マウスＢ２Ｍ遺伝子コード領域は、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチド、ヒトＢ２Ｍタンパク質、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の一部及びマウスＨ２－Ｄ１タンパク質の一部をコードする核酸配列と置換された。
【図9】マウスＢ２Ｍ遺伝子座での標的化方法の概略図を示す。
【図10A-10B】図１０ＡはｓｇＲＮＡ１～ｓｇＲＮＡ７（ｓｇ１～ｓｇ７）における活性試験結果を示す。ＰＣは、陽性対照である。Ｃｏｎ．は、陰性対照である。Ｂｌａｎｋは、ブランク対照である。図１０ＢはｓｇＲＮＡ９～ｓｇＲＮＡ１５（ｓｇ９～ｓｇ１５）における活性試験結果を示す。ＰＣは、陽性対照である。Ｃｏｎ．は、陰性対照である。Ｂｌａｎｋは、ブランク対照である。
【図11A-11B】図１１ＡはプライマーＬ－ＧＴ－Ｆ及びＬ－ＧＴ－ＲによるＦ０世代マウスの５’末端のＰＣＲ検出結果を示す。Ｍは、マーカーである。Ｈ２Ｏは、水対照である。ＷＴは、野生型対照である。ＰＣは、陽性対照である。Ｆ０－０１、Ｆ０－０２、Ｆ０－０３、Ｆ０－０４、Ｆ０－０５、Ｆ０－０６、Ｆ０－０７、Ｆ０－０８、Ｆ０－０９及びＦ０－１０は、マウス番号である。図１１ＢはプライマーＲ－ＧＴ－Ｆ及びＲ－ＧＴ－ＲによるＦ０世代マウスの３’末端のＰＣＲ検出結果を示す。Ｍは、マーカーである。Ｈ２Ｏは、水対照である。ＷＴは、野生型対照である。ＰＣは、陽性対照である。Ｆ０－０１、Ｆ０－０２、Ｆ０－０３、Ｆ０－０４、Ｆ０－０５、Ｆ０－０６、Ｆ０－０７、Ｆ０－０８、Ｆ０－０９及びＦ０－１０は、マウス番号である。
【図12A-12B】図１２ＡはプライマーＬ－ＧＴ－Ｆ及びＬ－ＧＴ－ＲによるＦ１世代マウスの５’末端のＰＣＲ検出結果を示す。Ｍは、マーカーである。Ｈ２Ｏは、水対照である。ＷＴは、野生型対照である。ＰＣは、陽性対照である。Ｆ１－０１、Ｆ１－０２、Ｆ１－０３、Ｆ１－０４、Ｆ１－０５、Ｆ１－０６及びＦ１－０７は、陽性マウス番号である。図１２ＢはプライマーＲ－ＧＴ－Ｆ及びＲ－ＧＴ－ＲによるＦ１世代マウスの３’末端のＰＣＲ検出結果を示す。Ｍは、マーカーである。Ｈ２Ｏは、水対照である。ＷＴは、野生型対照である。ＰＣは、陽性対照である。Ｆ１－０１、Ｆ１－０２、Ｆ１－０３、Ｆ１－０４、Ｆ１－０５、Ｆ１－０６及びＦ１－０７は、陽性マウス番号である。
【図13】Ｐ１又はＰ２プローブによるＦ１世代マウスのサザンブロット解析結果を示す。Ｍは、マーカーである。ＷＴは、野生型対照である。Ｆ１－０１、Ｆ１－０２、Ｆ１－０３、Ｆ１－０４、Ｆ１－０５、Ｆ１－０６及びＦ１－０７は、マウス番号である。
【図14A-14H】図１４Ａは非刺激野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＢ２Ｍ抗体ｍβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｂは非刺激ＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＢ２Ｍ抗体ｍβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｃは抗マウスＣＤ３抗体によって刺激された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＢ２Ｍ抗体ｍβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｄは抗マウスＣＤ３抗体によって刺激されたＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＢ２Ｍ抗体ｍβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｅは非刺激野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＢ２Ｍ抗体ｈβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｆは非刺激ＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＢ２Ｍ抗体ｈβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｇは抗マウスＣＤ３抗体によって刺激された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＢ２Ｍ抗体ｈβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｈは抗マウスＣＤ３抗体によって刺激されたＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＢ２Ｍ抗体ｈβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。
【図14I-14P】図１４Ｉは非刺激野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ抗体及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｊは非刺激ＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ抗体及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｋは抗マウスＣＤ３抗体によって刺激された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ抗体及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｌは抗マウスＣＤ３抗体によって刺激されたＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ抗体及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｍは非刺激野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体ｈＨＬＡ－Ａ２ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｎは非刺激ＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体ｈＨＬＡ－Ａ２ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｏは抗マウスＣＤ３抗体によって刺激された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体ｈＨＬＡ－Ａ２ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図１４Ｐは抗マウスＣＤ３抗体によって刺激されたＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体ｈＨＬＡ－Ａ２ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。
【図15A-15F】図１５Ａは野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞における白血球のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。白血球の比は、８８．６％であった。図１５ＢはＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）脾臓細胞における白血球のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。白血球の比は、９６．５％であった。図１５Ｃは野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス白血球におけるＴ細胞及びＢ細胞のフローサイトメトリー結果を示す。Ｔ細胞及びＢ細胞は、マウスＴ細胞表面抗体ｍＴＣＲＢ－ＡＰＣ－Ｃｙ７及び抗マウスＣＤ１９抗体ｍＣＤ１９－ＰＥの各々で染色された。図１５ＤはＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）白血球におけるＴ細胞及びＢ細胞のフローサイトメトリー結果を示す。Ｔ細胞及びＢ細胞は、マウスＴ細胞表面抗体ｍＴＣＲＢ－ＡＰＣ－Ｃｙ７及び抗マウスＣＤ１９抗体ｍＣＤ１９－ＰＥの各々で染色された。図１５Ｅは野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスＴ細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗マウスＣＤ４抗体ｍＣＤ４－ＢＶ４２１及び抗マウスｍＣＤ８ａ抗体ｍＣＤ８ａ－ＢＶ７１１の各々で染色された。図１５ＦはＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）Ｔ細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー結果を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗マウスＣＤ４抗体ｍＣＤ４－ＢＶ４２１及び抗マウスｍＣＤ８ａ抗体ｍＣＤ８ａ－ＢＶ７１１の各々で染色された。
【図16】ＳＩＲＰαノックアウトマウスからのＰＣＲ結果を示す。Ｍは、マーカーである。ＷＴは、野生型対照である。Ｈ２Ｏは、水対照である。数字１～１０は、陽性マウス番号である。
【図17】ヒト化マウスＢ２Ｍ遺伝子座を示す概略図である。マウスＢ２Ｍ遺伝子コード領域は、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチド、ヒトＢ２Ｍタンパク質及びヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質をコードする核酸配列と置換された。
【図18】マウスＢ２Ｍ遺伝子座での標的化方法の概略図を示す。
【図19A-19B】図１９ＡはプライマーＬ－ＧＴ－Ｆ及びＢＮＤＧ－Ｌ－ＧＴ－ＲによるＦ０世代マウスの５’末端のＰＣＲ検出結果を示す。Ｍは、マーカーである。Ｈ２Ｏは、水対照である。ＷＴは、野生型対照である。ＰＣは、陽性対照である。ＢＮＤＧ－Ｆ０－０１、ＢＮＤＧ－Ｆ０－０２、ＢＮＤＧ－Ｆ０－０３、ＢＮＤＧ－Ｆ０－０４、ＢＮＤＧ－Ｆ０－０５及びＢＮＤＧ－Ｆ０－０６は、マウス番号である。図１９ＢはプライマーＢＮＤＧ－Ｒ－ＧＴ－Ｆ及びＲ－ＧＴ－ＲによるＦ０世代マウスの３’末端のＰＣＲ検出結果を示す。Ｍは、マーカーである。Ｈ２Ｏは、水対照である。ＷＴは、野生型対照である。ＰＣは、陽性対照である。ＢＮＤＧ－Ｆ０－０１、ＢＮＤＧ－Ｆ０－０２、ＢＮＤＧ－Ｆ０－０３、ＢＮＤＧ－Ｆ０－０４、ＢＮＤＧ－Ｆ０－０５及びＢＮＤＧ－Ｆ０－０６は、マウス番号である。
【図20A-20B】図２０ＡはプライマーＬ－ＧＴ－Ｆ及びＢＮＤＧ－Ｌ－ＧＴ－ＲによるＦ１世代マウスの５’末端のＰＣＲ検出結果を示す。Ｍは、マーカーである。Ｈ２Ｏは水対照である。ＷＴは、野生型対照である。ＰＣは、陽性対照である。ＢＮＤＧ－Ｆ０－０１及びＢＮＤＧ－Ｆ０－０２は、マウス番号である。図２０ＢはプライマーＢＮＤＧ－Ｒ－ＧＴ－Ｆ及びＲ－ＧＴ－ＲによるＦ１世代マウスの３’末端のＰＣＲ検出結果を示す。Ｍは、マーカーである。Ｈ２Ｏは水対照である。ＷＴは、野生型対照である。ＰＣは、陽性対照である。ＢＮＤＧ－Ｆ０－０１及びＢＮＤＧ－Ｆ０－０２は、マウス番号である。
【図21】ＢＮＤＧ－Ｐ１又はＢＮＤＧ－Ｐ２プローブによるＦ１世代マウスのサザンブロット解析結果を示す。Ｍは、マーカーである。ＷＴは、野生型対照である。ＢＮＤＧ－Ｆ０－０１及びＢＮＤＧ－Ｆ０－０２は、マウス番号である。
【図22A-22D】図２２ＡはＢ－ＮＤＧマウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＢ２Ｍ抗体ｍβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図２２ＢはＢ－ＮＤＧバックグラウンドのＭＨＣヒト化ヘテロ接合性マウス（Ｈ／＋）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＢ２Ｍ抗体ｍβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図２２ＣはＢ－ＮＤＧマウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＢ２Ｍ抗体ｈβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図２２ＤはＢ－ＮＤＧバックグラウンドのＭＨＣヒト化ヘテロ接合性マウス（Ｈ／＋）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＢ２Ｍ抗体ｈβ２Ｍ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。
【図22E-22H】図２２ＥはＢ－ＮＤＧマウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ抗体及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図２２ＦはＢ－ＮＤＧバックグラウンドのＭＨＣヒト化ヘテロ接合性マウス（Ｈ／＋）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗マウスＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ抗体及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図２２ＧはＢ－ＮＤＧマウスからの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体ｈＨＬＡ－Ａ２ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。図２２ＨはＢ－ＮＤＧバックグラウンドのＭＨＣヒト化ヘテロ接合性マウス（Ｈ／＋）からの脾臓細胞のフローサイトメトリー結果を示す。脾臓細胞は、抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体ｈＨＬＡ－Ａ２ ＰＥ及び抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣで染色された。
【図23】マウスＢ２Ｍアミノ酸配列（ＮＰ＿０３３８６５．２；配列番号２）とヒトＢ２Ｍアミノ酸配列（ＮＰ＿００４０３９．１；配列番号４）との間の整列化を示す。
【図24】ラットＢ２Ｍアミノ酸配列（ＮＰ＿０３６６４４．１；配列番号６６）とヒトＢ２Ｍアミノ酸配列（ＮＰ＿００４０３９．１；配列番号４）との間の整列化を示す。
【図25】マウスＨ２－Ｄ１アミノ酸配列（ＮＰ＿０３４５１０．３；配列番号６）とヒトＨＬＡ－Ａ２．１アミノ酸配列（ＡＡＣ２４８２５．１；配列番号５９）との間の整列化を示す。
【図26】マウスＨ２－Ｄ１アミノ酸配列（ＮＰ＿０３４５１０．３；配列番号６）とヒトＨＬＡ－Ａ＊０１０１アミノ酸配列（ＮＰ＿００１２２９６８７．１；配列番号８）との間の整列化を示す。
【発明を実施するための形態】
【0300】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明され、それは、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【0301】
材料及び方法
以下の実施例では、以下の材料を使用した。
以下の実施例では、以下の材料を使用した。
【0302】
ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ－２ｒｇｎｕｌｌ（Ｂ－ＮＤＧ）マウスは、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手した。カタログ番号は、Ｂ－ＣＭ－００１又はＢ－ＣＭ－００２である。
【0303】
ＵＣＡキットは、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手した。カタログ番号は、ＢＣＧ－ＤＸ－００１である。
【0304】
Ａｍｂｉｏｎ（商標）インビトロ転写キットは、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．から購入した。カタログ番号は、ＡＭ１３５４である。
【0305】
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ＳＩＧＭＡから入手した。カタログ番号は、ＣＡＳ９ＭＲＮＡ－１ＥＡである。
【0306】
ＰＥ抗ヒトβ２ミクログロブリン抗体（ｈβ２Ｍ ＰＥ）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、３１６３０５である。
【0307】
ＰＥ抗マウスβ２ミクログロブリン抗体（ｍβ２Ｍ ＰＥ）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、１５４５０３である。
【0308】
ＰＥ抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（ｈＨＬＡ－Ａ２ ＰＥ）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、３４３３０５である。
【0309】
ＰＥ抗マウスＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ抗体（Ｈ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ ＰＥ）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、１１４６０７である。
【0310】
ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１９抗体（ｍＣＤ１９ＦＩＴＣ）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、１１５５０６である。
【0311】
精製抗マウスＣＤ１６／３２抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、１０１３０２である。
【0312】
ＡＰＣ抗ｍＣＤ４５（ｍＣＤ４５ＡＰＣ）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、５５９８６４である。
【0313】
ＡＰＣ／Ｃｙ７抗マウスＴＣＲβ鎖抗体（ｍＴＣＲβ ＡＰＣ／Ｃｙ７）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、１０９２２０である。
【0314】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗マウスＣＤ３抗体（ｍＣＤ３ Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、１００２１０である。
【0315】
ＰＥ抗マウスＣＤ１９抗体（ｍＣＤ１９ ＰＥ）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、１１５５０８である。
【0316】
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（商標）抗マウスＣＤ４抗体（ｍＣＤ４ ＢＶ４２１）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、１００４３８である。
【0317】
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１（商標）抗マウスＣＤ８ａ抗体（ｍＣＤ８ａ ＢＶ７１１）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。カタログ番号は、１００７４７である。
【0318】
ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＮＩ及びＳｓｐＩ制限酵素は、ＮＥＢから購入した。カタログ番号は、それぞれＲ３１３６、Ｒ０１４４、Ｒ０５２１及びＲ３１３２である。
【0319】
実施例１：ＭＨＣヒト化マウスの作製
非ヒト動物（例えば、マウス）のゲノムは、ヒトＢ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の全て又は一部をコードする核酸配列を含むように修飾され得、遺伝子組換え非ヒト動物がヒト又はヒト化Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質を発現し得る。マウスＢ２Ｍ遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１２０１０、一次供給源：ＭＧＩ：８８１２７、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０１８８７）は、マウスゲノムの染色体２（ＮＣ＿００００６８．７の１２２，１４７，６８６～１２２，１５３，０８３）に位置する。転写物配列ＮＭ＿００９７３５．３を配列番号１で示し、対応するタンパク質配列ＮＰ＿０３３８６５．２を配列番号２で示す。ヒトＢ２Ｍ遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５６７、一次供給源：ＨＧＮＣ：９１４、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ６１７６９）は、ヒトゲノムの染色体１５（ＮＣ＿００００１５．１０の４４，７１１，４８７～４４，７１８，８７７）に位置する。転写物配列ＮＭ＿００４０４８．３を配列番号３で示し、対応するタンパク質配列ＮＰ＿００４０３９．１を配列番号４で示す。マウス及びヒトＢ２Ｍ遺伝子座を図２に示す。
非ヒト動物（例えば、マウス）のゲノムは、ヒトＢ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の全て又は一部をコードする核酸配列を含むように修飾され得、遺伝子組換え非ヒト動物がヒト又はヒト化Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質を発現し得る。マウスＢ２Ｍ遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１２０１０、一次供給源：ＭＧＩ：８８１２７、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０１８８７）は、マウスゲノムの染色体２（ＮＣ＿００００６８．７の１２２，１４７，６８６～１２２，１５３，０８３）に位置する。転写物配列ＮＭ＿００９７３５．３を配列番号１で示し、対応するタンパク質配列ＮＰ＿０３３８６５．２を配列番号２で示す。ヒトＢ２Ｍ遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５６７、一次供給源：ＨＧＮＣ：９１４、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ６１７６９）は、ヒトゲノムの染色体１５（ＮＣ＿００００１５．１０の４４，７１１，４８７～４４，７１８，８７７）に位置する。転写物配列ＮＭ＿００４０４８．３を配列番号３で示し、対応するタンパク質配列ＮＰ＿００４０３９．１を配列番号４で示す。マウス及びヒトＢ２Ｍ遺伝子座を図２に示す。
【0320】
マウスＨ２－Ｄ１遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１４９６４、一次供給源：ＭＧＩ：９５８９６、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０１８９９）は、マウスゲノムの染色体１７に位置する。転写物配列ＮＭ＿０１０３８０．３を配列番号５で示し、対応するタンパク質配列ＮＰ＿０３４５１０．３を配列番号６で示す。ヒトＨＬＡ－Ａ遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３１０５、一次供給源：ＨＧＮＣ：４９３１、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０４４３９）は、ヒトゲノムの染色体６に位置する。転写物配列ＮＭ＿００１２４２７５８．１を配列番号７で示し、対応するタンパク質配列ＮＰ＿００１２２９６８７．１を配列番号８で示す。マウスＨ２－Ｄ１遺伝子座及びヒトＨＬＡ－Ａ遺伝子座を図３に示す。
【0321】
ヒト又はヒト化ＭＨＣ分子を発現するトランスジェニックマウスを得るため、様々な方法を用いることができる。例えば、マウス内因性Ｂ２Ｍ遺伝子及び内因性Ｈ２－Ｄ１遺伝子は、不活化可能であり、ヒトＢ２Ｍ；ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチド及び細胞外領域の一部（例えば、配列番号５９のアミノ酸１～２０３）；マウスＨ２－Ｄ１の細胞外領域の一部（アルファ３領域及びＣペプチド）、膜貫通領域及び細胞質領域（例えば、配列番号６のアミノ酸２０７～３６２）を含むポリペプチド配列をコードする核酸配列をマウスゲノムにノックインすることができる。
【0322】
さらに、マウスＢ２Ｍ及び／又はマウスＨ２－Ｄ１遺伝子座に対して、異なる修飾及び組み合わせを用いることができる。
【0323】
例えば、マウス内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座は、以下のようにヒト化することができる。図４に示すとおり、マウス内因性Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１内のヒトＢ２Ｍ；ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチド、アルファ１及びアルファ２領域（例えば、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１エクソン１～３によってコードされるＡＡＣ２４８２５．１（配列番号５９）のアミノ酸１～２０３）；マウスＨ２－Ｄ１のアルファ３領域、Ｃペプチド、膜貫通領域及び細胞質領域（例えば、マウスＨ２－Ｄ１のエクソン４～８によってコードされるＮＰ＿０３４５１０．３（配列番号６）のアミノ酸２０７～３６２）を含むポリペプチドをコードする核酸配列は、マウス内因性Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１～３に及ぶ配列を置換するために使用することができる。
【0324】
異なる方法として、マウス内因性Ｂ２Ｍ遺伝子は、直接的にヒト化することができる。図５に示すとおり、マウスＢ２Ｍ遺伝子のコード領域は、ヒトＢ２Ｍ遺伝子のコード領域と置換することができる。一方で、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチド、アルファ１及びアルファ２領域；マウスＨ２－Ｄ１のアルファ３領域、Ｃペプチド、膜貫通領域及び細胞質領域を含むポリペプチド（配列番号６４）をコードする配列は、トランスジェニック技術によりマウスゲノムにノックインすることができる。代わりに、図６に示すとおり、マウス内因性Ｈ２－Ｄ１遺伝子座で、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチド、アルファ１及びアルファ領域を含むポリペプチドをコードする配列を使用し、シグナルペプチド、アルファ１及びアルファ２領域をコードするマウスＨ２－Ｄ１遺伝子の対応する配列を置換することができる。マウスＢ２Ｍ遺伝子及びＨ２－Ｄ１遺伝子の各々をヒト化するとき、二重遺伝子ヒト化マウスは、１ステップ又は多ステップの標的化方法により調製することができる。単一遺伝子ヒト化マウスを別々に調製し、繁殖などの方法を通して二重遺伝子ヒト化マウスを得ることも可能である。得られた二重遺伝子ヒト化マウスは、ヒトＢ２Ｍタンパク質及びヒト化ＭＨＣα鎖タンパク質をインビボで同時に発現することができる。
【0325】
異なる方法として、マウス内因性Ｂ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトすることができる。一方で、図７に示すとおり、マウス内因性Ｈ２－Ｄ１遺伝子座で、ヒトＢ２Ｍ；ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチド、アルファ１及びアルファ２領域を含むポリペプチド（配列番号６３）をコードする配列を使用し、マウスＨ２－Ｄ１のシグナルペプチド、アルファ１及びアルファ２領域をコードする配列を置換することができる。
【0326】
以下の実験では、図４に示すヒト化方法を使用し、ヒト化ＭＨＣ分子を有するトランスジェニックマウスを作製した。マウス細胞を修飾するため、遺伝子編集技術を用いることができる。内因性マウスＢ２Ｍ遺伝子座は、ヒトＢ２Ｍタンパク質、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の一部及びマウスＨ２－Ｄ１タンパク質の一部をコードする配列にノックインすることができ、それによりマウスＢ２Ｍ遺伝子コード領域を破壊することもできる。作製したヒト化マウスは、ヒトＢ２Ｍタンパク質；ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列：ＡＡＣ２４８２５．１、配列番号５９）のアルファ１及びアルファ２領域；マウスＨ２－Ｄ１タンパク質のアルファ３領域、Ｃペプチド、膜貫通領域及び細胞質領域を有するヒト化ＭＨＣ分子をインビボで発現することができる。ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質部分は、マウスＨ２－Ｄ１タンパク質部分に直接的に接続され、ヒト化マウスは、内因性Ｂ２Ｍタンパク質を発現しない。さらに、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の正確な発現を保証するため、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列をヒトＢ２Ｍコード領域の前に挿入することができる。ヒト化マウスＢ２Ｍ遺伝子座の概略図を図８に示す。ヒト化Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ２．１及びＨ２－Ｄ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡ配列を配列番号９で示し、（修飾部分のみの）ヒト化Ｂ２Ｍ遺伝子座のＤＮＡ配列を配列番号１０で示す。
【0327】
ヒトＢ２Ｍが複数のアイソフォーム又は転写物を有すると仮定すると、本明細書に記載の方法は、他のアイソフォーム又は転写物に適用することができる。
【0328】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを遺伝子編集に適用し、標的化方法を図９に示す。標的化ベクターは、マウスＢ２Ｍ遺伝子の上流及び下流の相同性アーム配列並びにヒトＢ２Ｍタンパク質、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の一部及びマウスＨ２－Ｄ１タンパク質の一部をコードする「Ａ断片」を有するように設計した。上流の相同性アーム配列（５’相同性アーム、配列番号１１）は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００６８．７の核酸１２２１４６３２９～１２２１４７７３７に同一である。下流の相同性アーム配列（３’相同性アーム、配列番号１２）は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００６８．７の核酸１２２１５２１７１～１２２１５３５１３に同一である。「Ａ断片」は、以下のポリペプチド：ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチド；ヒトＢ２Ｍ；フレキシブルリンカーポリペプチド配列；ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の一部；及びマウスＨ２－Ｄ１タンパク質の一部をコードする５’末端から３’末端にかけての配列を有する。具体的には、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１のシグナルペプチドをコードする配列（配列番号１３）は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列ＡＦ０５５０６６．１の核酸９９５６７～９９６３８に同一である。ヒトＢ２Ｍをコードする配列（配列番号１４）は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００４０４８．３の核酸９１～３８７に同一である。フレキシブルリンカーポリペプチド配列は、４５ｂｐの配列５’－ＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴ－３’（配列番号５１）によってコードされる（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６７）リンカーである。ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の一部は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列ＡＦ０５５０６６．１の核酸９８６０６～９９４３５に同一である配列（配列番号１５）によってコードされる。マウスＨ２－Ｄ１タンパク質の一部は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００８３．６の核酸３５２６６８７１～３５２６７７６５に同一である配列（配列番号１６）によってコードされる。トランスジェニックマウスにおいて発現されるタンパク質を配列番号６１で示す。しかし、フレキシブルリンカーポリペプチド配列の存在に起因して、タンパク質は、ヒトＢ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の機能ドメインを有し得る。
【0329】
標的化ベクターは、例えば制限酵素消化／ライゲーション又は遺伝子合成により構築した。構築した標的化ベクター配列は、制限酵素消化により予備的に検証し、次に配列決定により検証した。検証した標的化ベクターを後続の実験に使用した。
【0330】
標的配列は、ｓｇＲＮＡの標的化特異性及びＣａｓ９誘導切断の効率にとって重要である。５’末端の標的化部位（ｓｇＲＮＡ１～ｓｇＲＮＡ７）及び３’末端の標的化部位（ｓｇＲＮＡ８～ｓｇＲＮＡ１５）を認識する特定のｓｇＲＮＡ配列を設計し、合成した。５’末端の標的化部位は、マウスＢ２Ｍ遺伝子の第１のエクソン内又は第１のイントロン内に位置する。３’末端の標的化部位は、マウスＢ２Ｍ遺伝子の第３のエクソン又は第３のイントロン上に位置する。Ｂ２Ｍ遺伝子座上の各ｓｇＲＮＡの標的化部位配列は、以下のとおりである：
ｓｇＲＮＡ１標的化部位（配列番号１７）：５’－ＣＣＴＧＧＣＣＡＡＴＣＣＣＧＴＣＧＧＧＡＡＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ２標的化部位（配列番号１８）：５’－ＣＣＧＴＣＡＧＣＡＣＡＣＴＣＧＣＡＡＡＣＡＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ３標的化部位（配列番号１９）：５’－ＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＧＡＣＧＧＧＡＴＴＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ４標的化部位（配列番号２０）：５’－ＡＣＴＣＴＧＧＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＧＧＣＣＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ５標的化部位（配列番号２１）：５’－ＣＴＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ６標的化部位（配列番号２２）：５’－ＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＣＡＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ７標的化部位（配列番号２３）：５’－ＧＡＣＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ８標的化部位（配列番号２４）：５’－ＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＡＣＡＣＴＣＡＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ９標的化部位（配列番号２５）：５’－ＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＴＡＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１０標的化部位（配列番号２６）：５’－ＡＧＧＡＧＣＧＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＣＧＴＧＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１１標的化部位（配列番号２７）：５’－ＧＡＧＧＡＡＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１２標的化部位（配列番号２８）：５’－ＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＴＡＡＡＧＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１３標的化部位（配列番号２９）：５’－ＣＡＴＧＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１４標的化部位（配列番号３０）：５’－ＡＣＣＣＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１５標的化部位（配列番号３１）：５’－ＣＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧ－３’。
ｓｇＲＮＡ１標的化部位（配列番号１７）：５’－ＣＣＴＧＧＣＣＡＡＴＣＣＣＧＴＣＧＧＧＡＡＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ２標的化部位（配列番号１８）：５’－ＣＣＧＴＣＡＧＣＡＣＡＣＴＣＧＣＡＡＡＣＡＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ３標的化部位（配列番号１９）：５’－ＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＧＡＣＧＧＧＡＴＴＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ４標的化部位（配列番号２０）：５’－ＡＣＴＣＴＧＧＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＧＧＣＣＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ５標的化部位（配列番号２１）：５’－ＣＴＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ６標的化部位（配列番号２２）：５’－ＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＣＡＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ７標的化部位（配列番号２３）：５’－ＧＡＣＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ８標的化部位（配列番号２４）：５’－ＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＡＣＡＣＴＣＡＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ９標的化部位（配列番号２５）：５’－ＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＴＡＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１０標的化部位（配列番号２６）：５’－ＡＧＧＡＧＣＧＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＣＧＴＧＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１１標的化部位（配列番号２７）：５’－ＧＡＧＧＡＡＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１２標的化部位（配列番号２８）：５’－ＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＴＡＡＡＧＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１３標的化部位（配列番号２９）：５’－ＣＡＴＧＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１４標的化部位（配列番号３０）：５’－ＡＣＣＣＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣＧＧ－３’
ｓｇＲＮＡ１５標的化部位（配列番号３１）：５’－ＣＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧ－３’。
【0331】
ＵＣＡキットを使用し、ｓｇＲＮＡの活性を検出した。結果は、ｓｇＲＮＡが異なる活性を有することを示した。結果を表５及び図１０Ａ～１０Ｂに示す。後続の実験のためにｓｇＲＮＡ３及びｓｇＲＮＡ１４を選択した。フォワードオリゴヌクレオチド及びリバースオリゴヌクレオチドを得るため、オリゴヌクレオチドを５’末端及び相補鎖に付加した（配列については、表６を参照されたい）。アニーリング後、産物をそれぞれｐＴ７－ｓｇＲＮＡプラスミドにライゲートし（プラスミドは最初にＢｂｓＩで線状化した）、発現ベクターＰＴ７－Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ａ２．１－３及びｐＴ７－Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ａ２．１－１４を得た。
【0332】
【表5】
【0333】
【表6】
【0334】
Ｔ７プロモーター及びｓｇＲＮＡスキャフォールド（配列番号４０）を有するＤＮＡ断片を含むｐＴ７－ｓｇＲＮＡベクターを合成し、制限酵素消化（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ）後、骨格ベクター（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号：３２９９）にライゲートした。得られたプラスミドを配列決定により確認した。
【0335】
ｐＴ７－Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ａ２．１－３及びｐＴ７－Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ａ２．１－１４プラスミドの予備混合したＣａｓ９ ｍＲＮＡ、標的化ベクター、インビトロ転写産物を、（製品使用説明書に提供される方法に従い、転写を実施するためのＡｍｂｉｏｎインビトロ転写キットを使用して）Ｃ５７ＢＬ／６マウス受精卵の細胞質又は核にマイクロインジェクション装置により注射した。胚マイクロインジェクションは、例えば、Ａ．Ｎａｇｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００３に記載の方法に従って実施した。次に、注射した受精卵を短時間培養するための培地に移し、次にレシピエントマウスの輸卵管に移植し、遺伝子組換えマウス（Ｆ０世代）を作製した。マウス集団を交雑及び自己繁殖によりさらに拡大し、ヒト又はヒト化Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子を有する安定なマウス系統を確立した。
【0336】
実験を実施し、Ｆ０世代マウスの体細胞遺伝子型を同定した。例えば、Ｆ０世代マウスのマウステールゲノムＤＮＡを使用し、ＰＣＲ分析を実施した。Ｆ０マウスの一部についてのＰＣＲ分析結果を図１１Ａ～１１Ｂに示す。５’末端プライマー検出結果及び３’末端プライマー検出結果を踏まえて、Ｆ０－０１からＦ０－１０にかけて付番したマウス１０匹の全てが陽性マウスであった。
【0337】
以下のプライマーをＰＣＲに使用した：
５’末端プライマー：
Ｌ－ＧＴ－Ｆ（配列番号４１）：５’－ＧＡＡＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣ－３’
Ｌ－ＧＴ－Ｒ（配列番号４２）：５’－ＴＣＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＴＣＴＧＣ－３’
３’末端プライマー：
Ｒ－ＧＴ－Ｆ（配列番号４３）：５’－ＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧ－３’
Ｒ－ＧＴ－Ｒ（配列番号４４）：５’－ＴＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＣＣＣＴＡＧＣＴ－３’。
５’末端プライマー：
Ｌ－ＧＴ－Ｆ（配列番号４１）：５’－ＧＡＡＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣ－３’
Ｌ－ＧＴ－Ｒ（配列番号４２）：５’－ＴＣＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＴＣＴＧＣ－３’
３’末端プライマー：
Ｒ－ＧＴ－Ｆ（配列番号４３）：５’－ＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧ－３’
Ｒ－ＧＴ－Ｒ（配列番号４４）：５’－ＴＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＣＣＣＴＡＧＣＴ－３’。
【0338】
プライマーＬ－ＧＴ－Ｆは、５’相同性アームの左側に位置する。Ｒ－ＧＴ－Ｒは、３’相同性アームの右側に位置する。Ｌ－ＧＴ－Ｒ及びＲ－ＧＴ－Ｆの両方は、ヒト配列上に位置する。
【0339】
陽性Ｆ０世代のＭＨＣヒト化マウスを野生型マウスとともに繁殖させ、Ｆ１世代マウスを作製した。Ｆ１世代マウスの遺伝子型同定のため、同じ方法（例えば、ＰＣＲ）を使用した。図１２Ａ～１２Ｂに示すとおり、Ｆ１－０１、Ｆ１－０２、Ｆ１－０３、Ｆ１－０４、Ｆ１－０５、Ｆ１－０６及びＦ１－０７に付番したマウス７匹が陽性マウスとして同定された。陽性Ｆ１世代マウス７匹をサザンブロットによりさらに分析し、ランダム挿入が導入されるか否かを確認した。具体的には、マウステールゲノムＤＮＡを抽出し、ＢａｍＨＩ又はＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、膜に移し、次にプローブとハイブリダイズした。プローブＰ１及びＰ２の各々は、５’相同性アームの上流領域及び３’相同性アーム上に位置する。サザンブロットアッセイで使用したプローブを下表に列記する。
【0340】
【表7】
【0341】
プローブは、以下のプライマー：
Ｐ１－Ｆ（配列番号４５）：５’－ＡＴＧＡＧＧＴＣＴＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＡ－３’
Ｐ１－Ｒ（配列番号４６）：５’－ＣＴＣＣＣＴＡＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＡＣ－３’
Ｐ２－Ｆ（配列番号４７）：５’－ＴＡＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＡＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＣ－３’
Ｐ２－Ｒ（配列番号４８）：５’－ＴＣＣＡＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＧ－３’
を使用して合成した。
Ｐ１－Ｆ（配列番号４５）：５’－ＡＴＧＡＧＧＴＣＴＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＡ－３’
Ｐ１－Ｒ（配列番号４６）：５’－ＣＴＣＣＣＴＡＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＡＣ－３’
Ｐ２－Ｆ（配列番号４７）：５’－ＴＡＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＡＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＣ－３’
Ｐ２－Ｒ（配列番号４８）：５’－ＴＣＣＡＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＧ－３’
を使用して合成した。
【0342】
サザンブロットの検出結果を図１３に示す。Ｐ１及びＰ２プローブによるハイブリダイゼーション結果を踏まえて、Ｆ１世代マウス７匹が陽性ヘテロ接合体であることが確認され、ランダム挿入は、検出されなかった。これは、上記の方法を使用することで、ランダム挿入がなく安定に継代可能である遺伝子組換えＭＨＣ遺伝子ヒト化マウスを作製できることを示す。
【0343】
Ｆ１世代における陽性として同定されたヘテロ接合性マウスを互いに繁殖させることで、Ｆ２世代のＭＨＣヒト化ホモ接合性マウス（Ｈ／Ｈ）を得ることができる。
【0344】
陽性マウスにおけるヒトＢ２Ｍタンパク質及びＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の発現をＥＬＩＳＡにより確認した。具体的には、本明細書に記載の方法により調製した野生型Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（６週齢）１匹及びＭＨＣヒト化ホモ接合性雌マウス（６週齢）１匹を選択し、各マウスに７．５μｇ（体積：２００μｌ）の抗マウスＣＤ３抗体を腹腔内注射した。２４時間後、マウスを屠殺し、次に脾臓細胞を収集した。抗マウスＢ２Ｍ抗体ｍβ２Ｍ ＰＥ、抗マウスＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ抗体、抗ヒトＢ２Ｍ抗体ｈβ２Ｍ ＰＥ又は抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体ｈＨＬＡ－Ａ２ ＰＥを抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣと一緒に脾臓細胞染色に使用した。染色した細胞をフローサイトメトリー分析にかけた結果を図１４Ａ～１４Ｐに示す。細胞を抗マウスＣＤ３抗体により刺激したか否かと無関係に、マウスＢ２Ｍ発現細胞のみがＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて検出され（図１４Ａ及び１４Ｃ）、ヒト又はヒト化Ｂ２Ｍ発現細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて検出されなかった（図１４Ｅ及び１４Ｇ）。ヒトＢ２Ｍを発現する細胞（図１４Ｆ及び１４Ｈ）及びＨＬＡ－Ａ２．１を発現する細胞（図１４Ｎ及び１４Ｐ）は、ＭＨＣヒト化ホモ接合性マウスに限り検出された。しかし、マウスＢ２Ｍを発現する細胞は、ＭＨＣヒト化ホモ接合性マウスにおいて検出されなかった（図１４Ｂ及び１４Ｄ）。さらに、マウスＨ２－Ｄ１コード配列がノックアウトされなかったことから、マウスＨ２－Ｄ１を発現する少数の細胞がＭＨＣヒト化ホモ接合性マウスにおいて検出された（図１４Ｇ及び１４Ｌ）。
【0345】
Ｆ２世代のＭＨＣヒト化ホモ接合性マウスにおけるＢ細胞及びＴ細胞の分化が野生型マウスの場合に一致したか否かを確認するため、マウスリンパ球サブセットをフローサイトメトリーにより分析した。具体的には、野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（１６週齢）１匹及びＭＨＣヒト化ホモ接合性雄マウス（１３週齢）１匹をそれぞれ選択した。脾臓細胞を収集し、抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣを細胞染色及びフローサイトメトリー検出に使用した。図１５Ａ～１５Ｂに示すとおり、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＭＨＣヒト化ホモ接合性マウスにおける白血球の比は、それぞれ８８．６％及び９６．５％であった。その後、マウスＴ細胞表面抗体ｍＴＣＲＢ－ＡＰＣ－Ｃｙ７及び抗マウスＣＤ１９抗体ｍＣＤ１９－ＰＥを使用し、Ｔ細胞及びＢ細胞を各々染色し、フローサイトメトリー分析にかけた。結果は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＴ細胞及びＢ細胞がそれぞれ２３．８％及び６１．４％である（図１５Ｃ）一方、ヒト化ＭＨＣホモ接合性マウスにおけるＴ細胞及びＢ細胞がそれぞれ２７．７％及び６１．８％である（図１５Ｄ）ことを示した。さらに、抗マウスＣＤ４抗体ｍＣＤ４－ＢＶ４２１及び抗マウスｍＣＤ８ａ抗体ｍＣＤ８ａ－ＢＶ７１１を細胞染色に使用し、染色した細胞をフローサイトメトリー分析にかけた。図１５Ｅ～１５Ｆに示すとおり、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＭＨＣヒト化ホモ接合性マウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の比は、同等であった。
【0346】
要するに、上記の結果は、ＭＨＣヒト化マウスにおけるリンパ球サブセットの発現が野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの場合に類似することを示した。さらに、結果は、ＭＨＣヒト化マウスにおけるＴ細胞及びＢ細胞の分化がＢ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子のヒト化による影響を受けないことを示した。
【0347】
Ｃａｓ９の切断がＤＮＡ二本鎖破壊をもたらし、且つ相同組換え修復が挿入／欠失突然変異をもたらす場合があることから、本明細書に記載の方法を用いてＢ２Ｍ遺伝子ノックアウトマウスを得ることが可能である。プライマー対は、遺伝子ノックアウトマウスを検出するように設計した。野生型マウスは、ＰＣＲバンドを有しない必要があり、ノックアウトマウスは、約６８２ｂｐで１つのＰＣＲバンドを有する必要がある。図１６に示すとおり、１～１０に付番したマウスは、Ｂ２Ｍ遺伝子ノックアウトマウスとして同定された。一方のＰＣＲプライマーが５’標的化部位の左側に位置し、他方のＰＣＲプライマーが３’標的化部位の右側に位置した。プライマーを以下に示す：
配列番号４９：５’－ＧＡＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧＴＣＣＣＡＧＧＣＴ－３’
配列番号５０：５’－ＡＧＧＴＧＡＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＴＴＧ－３’。
配列番号４９：５’－ＧＡＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧＴＣＣＣＡＧＧＣＴ－３’
配列番号５０：５’－ＡＧＧＴＧＡＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＴＴＧ－３’。
【0348】
実施例２．重症免疫不全を有するＭＨＣヒト化マウス
実施例１に記載のヒト化方法に加えて、ＭＨＣ分子のより高度なヒト化を伴うマウスも設計することができる。さらに、ヒト化ＭＨＣ分子を有する免疫不全マウスは、免疫系疾患、例えば糖尿病及び移植拒絶の病態形成機序並びに医薬品開発の研究にとって有効な実験動物モデルを提供するように設計することができる。本実施例では、Ｂ－ＮＤＧバックグラウンドマウスを使用し、ＭＨＣ分子のより高度なヒト化を実施した。具体的には、遺伝子編集技術を使用し、Ｂ－ＮＤＧマウスを修飾した。内因性マウスＢ２Ｍ遺伝子座をヒトＢ２Ｍタンパク質及びＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質をコードする配列にノックインし、さらにマウスＢ２Ｍ遺伝子コード領域を破壊した。作製されたヒト化マウスは、ヒトＢ２Ｍタンパク質及びヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質を有するヒト化ＭＨＣ分子をインビボで発現し得る。ヒト化マウスは、内因性Ｂ２Ｍタンパク質を発現しなかった。さらに、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の正確な発現を保証するため、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列をヒトＢ２Ｍコード領域の前に挿入した。ヒト化マウスＢ２Ｍ遺伝子座の概略図を図１７に示す。ヒト化Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子から転写されたｍＲＮＡ配列を配列番号５２で示す。トランスジェニックマウスによって発現されたタンパク質を配列番号６２で示す。しかし、フレキシブルリンカーポリペプチド配列の存在に起因して、タンパク質は、ヒトＢ２Ｍタンパク質及びヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の機能ドメインを有し得る。
実施例１に記載のヒト化方法に加えて、ＭＨＣ分子のより高度なヒト化を伴うマウスも設計することができる。さらに、ヒト化ＭＨＣ分子を有する免疫不全マウスは、免疫系疾患、例えば糖尿病及び移植拒絶の病態形成機序並びに医薬品開発の研究にとって有効な実験動物モデルを提供するように設計することができる。本実施例では、Ｂ－ＮＤＧバックグラウンドマウスを使用し、ＭＨＣ分子のより高度なヒト化を実施した。具体的には、遺伝子編集技術を使用し、Ｂ－ＮＤＧマウスを修飾した。内因性マウスＢ２Ｍ遺伝子座をヒトＢ２Ｍタンパク質及びＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質をコードする配列にノックインし、さらにマウスＢ２Ｍ遺伝子コード領域を破壊した。作製されたヒト化マウスは、ヒトＢ２Ｍタンパク質及びヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質を有するヒト化ＭＨＣ分子をインビボで発現し得る。ヒト化マウスは、内因性Ｂ２Ｍタンパク質を発現しなかった。さらに、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の正確な発現を保証するため、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列をヒトＢ２Ｍコード領域の前に挿入した。ヒト化マウスＢ２Ｍ遺伝子座の概略図を図１７に示す。ヒト化Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子から転写されたｍＲＮＡ配列を配列番号５２で示す。トランスジェニックマウスによって発現されたタンパク質を配列番号６２で示す。しかし、フレキシブルリンカーポリペプチド配列の存在に起因して、タンパク質は、ヒトＢ２Ｍタンパク質及びヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の機能ドメインを有し得る。
【0349】
ヒトＢ２Ｍ遺伝子が複数のアイソフォーム又は転写物を有すると仮定すると、本明細書に記載の方法は、他のアイソフォーム又は転写物に適用可能である。
【0350】
さらに、標的化方法の概略図を図１８に示す。標的化ベクターは、５’相同性アーム（配列番号６０）がＮＣＢＩ参照番号ＮＣ＿００００６８．７の核酸１２２１４６３２９～１２２１４７７３７と９９％の相同性を有し、１２２１４７０１５位（ＧからＴ）、１２２１４７１０８位（ＣからＴ）及び１２２１４７５９１位（ＣからＴ）で突然変異を有し；３’相同性アーム（配列番号５３）がＮＣＢＩ参照番号ＮＣ＿００００６８．７の核酸１２２１５２１７１～１２２１５３５１３と９９％の相同性を有し、１２２１５２２５８位（ＧからＡ）、１２２１５２３９１位（ＧからＡ）、１２２１５２７７１位（ＡからＧ）、１２２１５３１０４位（ＴからＣ）及び１２２１５３１４８位（ＡからＣ）で突然変異；及び１２２１５２７８８位で欠失（Ａの欠失）を有することを除き、実施例１で使用した標的化ベクターと類似し；且つＢＮＤＧ－Ａ断片（配列番号６５）は、実施例１における「Ａ断片」と類似するが、全長ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質をコードする配列を有する。全長ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質をコードする配列（配列番号５４）は、ＧｅｎＢａｎｋ参照配列ＡＦ０５５０６６．１の核酸９５４９３～９９４３６に同一である。ＢＮＤＧ－Ａ断片は、マウスＨ２－Ｄ１タンパク質をコードする配列を全く有しない。
【0351】
標的化ベクターは、例えば、制限酵素消化／ライゲーション又は遺伝子合成により構築した。構築された標的化ベクター配列は、制限酵素消化により予備的に検証し、次に配列決定により検証した。検証された標的化ベクターを後続の実験（例えば、マイクロインジェクション）に使用した。使用したｓｇＲＮＡは、実施例１で使用したｓｇＲＮＡと同じであった。
【0352】
具体的には、ｐＴ７－Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ａ２．１－３及びｐＴ７－Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ａ２．１－１４プラスミドの予備混合したＣａｓ９ ｍＲＮＡ、標的化ベクター、インビトロ転写産物を、（製品使用説明書に提供される方法に従い、転写を実施するためのＡｍｂｉｏｎインビトロ転写キットを使用して）Ｂ－ＮＤＧマウス受精卵の細胞質又は核にマイクロインジェクション装置により注射した。胚マイクロインジェクションは、例えば、Ａ．Ｎａｇｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００３に記載の方法に従って実施した。次に、注射した受精卵を短時間培養するための培地に移し、次にレシピエントマウスの輸卵管に移植し、遺伝子組換えマウス（Ｆ０世代）を作製した。マウス集団を交雑及び自己繁殖によりさらに拡大し、ヒトＢ２Ｍ及びＨＬＡ－Ａ２．１遺伝子を有する安定なＢ－ＮＤＧバックグラウンドマウス系統を確立した。
【0353】
実験を実施し、Ｂ－ＮＤＧバックグラウンドを有するＦ０世代マウスの体細胞遺伝子型を同定した。例えば、Ｆ０世代マウスのマウステールゲノムＤＮＡを使用し、ＰＣＲ分析を実施した。Ｆ０マウスの一部についてのＰＣＲ分析結果を図１９Ａ～１９Ｂに示す。５’末端プライマー検出結果及び３’末端プライマー検出結果を踏まえて、ＢＮＤＧ－Ｆ０－０１からＢＮＤＧ－Ｆ０－０６にかけて付番したマウス６匹の全てが陽性マウスであった。
【0354】
以下のプライマーをＰＣＲに使用した：
５’末端プライマー：
Ｌ－ＧＴ－Ｆ（配列番号４１）：５’－ＧＡＡＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣ－３’
ＢＮＤＧ－Ｌ－ＧＴ－Ｒ（配列番号５５）：５’－ＣＡＧＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧ－３’
３’末端プライマー：
ＢＮＤＧ－Ｒ－ＧＴ－Ｆ（配列番号５６）：５’－ＴＡＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣ－３’
Ｒ－ＧＴ－Ｒ（配列番号４４）：５’－ＴＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＣＣＣＴＡＧＣＴ－３’。
５’末端プライマー：
Ｌ－ＧＴ－Ｆ（配列番号４１）：５’－ＧＡＡＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣ－３’
ＢＮＤＧ－Ｌ－ＧＴ－Ｒ（配列番号５５）：５’－ＣＡＧＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧ－３’
３’末端プライマー：
ＢＮＤＧ－Ｒ－ＧＴ－Ｆ（配列番号５６）：５’－ＴＡＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣ－３’
Ｒ－ＧＴ－Ｒ（配列番号４４）：５’－ＴＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＣＣＣＴＡＧＣＴ－３’。
【0355】
陽性Ｆ０世代のＭＨＣヒト化マウスを野生型マウスとともに繁殖させ、Ｆ１世代マウスを作製した。Ｆ１世代マウスの遺伝子型同定のため、同じ方法（例えば、ＰＣＲ）を使用した。図２０Ａ～２０Ｂに示すとおり、ＢＮＤＧ－Ｆ１－０１及びＢＮＤＧ－Ｆ１－０２に付番したマウス２匹が陽性マウスと同定された。陽性Ｆ１世代マウス２匹をサザンブロットによりさらに分析し、ランダム挿入が導入されるか否か確認した。具体的には、マウステールゲノムＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＮＩ又はＳｓｐＩ制限酵素で消化し、膜に移し、次にプローブとハイブリダイズした。プローブＢＮＤＧ－Ｐ１及びＢＮＤＧ－Ｐ２は、５’相同性アームの上流領域及び３’相同性アームにそれぞれ位置する。サザンブロットアッセイで使用したプローブを下表に列記する。
【0356】
【表8】
【0357】
プローブは、以下のプライマー：
ＢＮＤＧ－Ｐ１－Ｆ（配列番号５７）：５’－ＴＴＣＴＧＡＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＧＴＧＣ－３’
ＢＮＤＧ－Ｐ１－Ｒ（配列番号５８）：５’－ＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＣＴＧＣ－３’
ＢＮＤＧ－Ｐ２－Ｆ（配列番号４７）：５’－ＴＡＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＡＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＣ－３’
ＢＮＤＧ－Ｐ２－Ｒ（配列番号４８）：５’－ＴＣＣＡＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＧ－３’
を使用して合成した。
ＢＮＤＧ－Ｐ１－Ｆ（配列番号５７）：５’－ＴＴＣＴＧＡＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＧＴＧＣ－３’
ＢＮＤＧ－Ｐ１－Ｒ（配列番号５８）：５’－ＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＣＴＧＣ－３’
ＢＮＤＧ－Ｐ２－Ｆ（配列番号４７）：５’－ＴＡＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＡＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＣ－３’
ＢＮＤＧ－Ｐ２－Ｒ（配列番号４８）：５’－ＴＣＣＡＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＧ－３’
を使用して合成した。
【0358】
サザンブロットの検出結果を図２１に示す。ＢＮＤＧ－Ｐ１及びＢＮＤＧ－Ｐ２プローブによるハイブリダイゼーション結果を踏まえて、ＢＮＤＧ－Ｆ１－０１及びＢＮＤＧ－Ｆ１－０２に付番したＦ１世代マウス２匹が陽性ヘテロ接合体であることを確認し、ランダム挿入は検出されなかった。これは、上記の方法を使用し、ランダム挿入がなく安定に継代され得る、Ｂ－ＮＤＧバックグラウンドを有する遺伝子組換えＭＨＣ遺伝子ヒト化マウスを作製できることを示す。
【0359】
（Ｂ－ＮＤＧバックグラウンドを有する）陽性マウスにおけるヒトＢ２Ｍタンパク質及びＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の発現をフローサイトメトリーにより確認した。具体的には、本明細書に記載の方法により調製したＢ－ＮＤＧ雌マウス（６週齢）１匹及びＭＨＣヒト化ヘテロ接合性雌マウス（６週齢）１匹を屠殺し、次に脾臓細胞を収集した。抗マウスＢ２Ｍ抗体ｍβ２Ｍ ＰＥ、抗マウスＨ－２Ｋｂ／Ｈ－２Ｄｂ抗体、抗ヒトＢ２Ｍ抗体ｈβ２Ｍ ＰＥ又は抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体ｈＨＬＡ－Ａ２ ＰＥを、抗マウスＣＤ４５抗体ｍＣＤ４５ ＡＰＣと一緒に、脾臓細胞染色に使用した。染色した細胞をフローサイトメトリー分析にかけた結果を図２２Ａ～２２Ｈに示す。結果は、Ｂ－ＮＤＧマウス及びＢ－ＮＤＧバックグラウンドＭＨＣヒト化ヘテロ接合性マウスにおいて、マウスＢ２Ｍを発現する細胞（図２２Ａ及び２２Ｂ）及びマウスＨ２－Ｄ１を発現する細胞（図２２Ｅ及び２２Ｆ）が検出されることを示した。しかし、ヒトＢ２Ｍタンパク質を発現する細胞（図２２Ｄ）及びヒトＨＬＡ－Ａ２タンパク質を発現する細胞（図２２Ｈ）は、Ｂ－ＮＤＧバックグラウンドを有するヒト化ＭＨＣマウスに限って検出された。ヒトＢ２Ｍタンパク質を発現する細胞（図２２Ｃ）及びヒトＨＬＡ－Ａ２タンパク質を発現する細胞（図２２Ｇ）は、Ｂ－ＮＤＧマウスにおいて検出されなかった。
【0360】
実施例３．胚性幹細胞に基づく方法
非ヒト哺乳類は、限定はされないが、胚性幹細胞（ＥＳ）に基づく遺伝子相同組換え技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）技術、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ｍｅｇａｋａｂｌｅ塩基リボザイム）又は他の分子生物学技術を含む、他の遺伝子編集システム及び手法を通しても調製することができる。本実施例において、通常のＥＳ細胞の遺伝子相同組換え技術は、他の方法によりＭＨＣヒト化マウスをどのように得るかを説明するための例として使用する。
非ヒト哺乳類は、限定はされないが、胚性幹細胞（ＥＳ）に基づく遺伝子相同組換え技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）技術、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ｍｅｇａｋａｂｌｅ塩基リボザイム）又は他の分子生物学技術を含む、他の遺伝子編集システム及び手法を通しても調製することができる。本実施例において、通常のＥＳ細胞の遺伝子相同組換え技術は、他の方法によりＭＨＣヒト化マウスをどのように得るかを説明するための例として使用する。
【0361】
本明細書に記載の方法の遺伝子編集方法及びＭＨＣヒト化マウスにおける修飾されたＢ２Ｍ遺伝子座（図８～９）によると、標的化方法は、異なる標的化ベクターを用いて設計することができる。目的の１つが、マウスＢ２Ｍ遺伝子コード領域のコード領域を破壊することと、ヒトＢ２Ｍタンパク質、ヒトＨＬＡ－Ａ２．１タンパク質の一部及びマウスＨ２－Ｄ１タンパク質の一部をコードする核酸配列をマウスＢ２Ｍ遺伝子座にノックインすることという事実を踏まえて、５’相同性アーム、３’相同性アーム及びヒト化遺伝子断片を有する標的化ベクターを設計する。ベクターは、陽性クローンのスクリーニングのための耐性遺伝子、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列Ｎｅｏも有し得る。耐性遺伝子の両側に、同じ方向性の２つの部位特異的組換え系、例えばＦｒｔ又はＬｏｘＰを付加することができる。さらに、陰性スクリーニングマーカーを有するコード遺伝子、例えばジフテリア毒素Ａサブユニットコード遺伝子（ＤＴＡ）を組換えベクター３’相同性アームの下流に構築することができる。ベクター構築は、当技術分野で公知の方法、例えば制限酵素消化及びライゲーションを用いて実施することができる。次に、正確な配列を有する組換えベクターをマウス胚性幹細胞にトランスフェクトし、次に組換えベクターを陽性クローンのスクリーニング遺伝子によりスクリーニングすることができる。次に、組換えベクターをトランスフェクトした細胞を陽性クローンのマーカー遺伝子の使用によりスクリーニングし、ＤＮＡ組換えの同定にサザンブロットを使用することができる。選択された正確な陽性クローンの場合、陽性クローン細胞（黒色マウス）を単離した胚盤胞（白色マウス）に、書籍Ａ．Ｎａｇｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００３に記載の方法に従い、マイクロインジェクションにより注射する。注射後に形成され、得られたキメラ胚盤胞を短時間培養のための培地に移し、次にレシピエントマウス（白色マウス）の卵管に移植し、Ｆ０世代キメラマウス（黒色及び白色）を作製する。次に、正確な遺伝子組換えを有するＦ０世代キメラマウスを、マウステールゲノムＤＮＡを抽出することにより選択し、その後の繁殖及び同定のため、ＰＣＲ分析する。Ｆ０世代キメラマウスを野生型マウスと交配することにより、Ｆ１世代マウスを得る。テールゲノムＤＮＡの抽出及びＰＣＲ分析により、安定に継代され得る陽性Ｆ１世代ヘテロ接合性マウスを選択する。次に、Ｆ１ヘテロ接合性マウスを互いに繁殖させ、遺伝子組換え陽性Ｆ２世代ホモ接合性マウスを得る。さらに、Ｆ１ヘテロ接合性マウスをＦｌｐ又はＣｒｅマウスと繁殖させ、陽性クローンのスクリーニングマーカー遺伝子（Ｎｅｏなど）を除去することもでき、次にこれらのマウスを互いに繁殖させることにより、ヒト化ホモ接合性マウスを得ることができる。得られたＦ１ヘテロ接合性マウス又はＦ２ホモ接合性マウスの遺伝子型を同定し、表現型を検出する方法は、上記の実施例で使用された方法に類似する。
【0362】
他の実施形態
本発明がその詳細な説明と併せて説明されている一方、前述の説明は、貼付の請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を例示し、限定しないことが意図されることが理解されるべきである。他の態様、利点及び修飾は、以下の請求項の範囲内に含まれる。
本発明がその詳細な説明と併せて説明されている一方、前述の説明は、貼付の請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を例示し、限定しないことが意図されることが理解されるべきである。他の態様、利点及び修飾は、以下の請求項の範囲内に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A-10B】
【図11A-11B】
【図12A-12B】
【図13】
【図14A-14H】
【図14I-14P】
【図15A-15F】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19A-19B】
【図20A-20B】
【図21】
【図22A-22D】
【図22E-22H】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】