ホーム > 特許ランキング > 学校法人関西医科大学
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-09
(45)【発行日】2024-12-17
(54)【発明の名称】ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤
(51)【国際特許分類】
A61K 35/15 20150101AFI20241210BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241210BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241210BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241210BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20241210BHJP
【ＦＩ】
A61K35/15
A61P35/02
A61P37/04
A61P43/00 105
C12N5/0783
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021524895
(86)(22)【出願日】2020-06-04
(86)【国際出願番号】 JP2020022065
(87)【国際公開番号】W WO2020246535
(87)【国際公開日】2020-12-10
【審査請求日】2023-06-02
(31)【優先権主張番号】P 2019105453
(32)【優先日】2019-06-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、次世代がん医療創生研究事業「成人Ｔ細胞白血病細胞のアジュバント特性に基づく新規免疫療法の開発」委託研究開発および平成２９年度国立研究開発法人日本医療研究開発機構、次世代がん医療創生研究事業「成人Ｔ細胞白血病細胞のアジュバント特性に基づく新規免疫療法の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】500409219
【氏名又は名称】学校法人関西医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】神奈木 真理
(72)【発明者】
【氏名】長谷川 温彦
【審査官】伊藤 基章
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００６／０３５６８１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００４／０９２３７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－０７７１８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１２－０９０５７４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞を含有する、前記対象に投与するための、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性化剤。【請求項2】
末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を、１日以上培養して得られる末梢血単核細胞である、請求項１に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤。【請求項3】
動物細胞培養用培地が、ＩＬ－２、ＩＬ－１５又はその両方を含有する、請求項１又は２に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤。【請求項4】
動物細胞培養用培地が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含有する、請求項１～３のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤。【請求項5】
ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血単核細胞である、請求項１～４のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤。【請求項6】
ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した後、ＣＤ３抗体、又は、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の両抗体で活性化された末梢血単核細胞である、請求項１～５のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤。【請求項7】
ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後に、ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合し得る抗体を接触させた末梢血単核細胞である、請求項１～６のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤。【請求項8】
（ａ）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程；（ｂ）前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程；及び、
（ｃ）前記工程（ｂ）で採取された末梢血単核細胞を薬学的に許容される担体と混合して製剤化する工程；
を有する、前記対象に投与するための、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法。
【請求項9】
動物細胞培養用培地が、ＩＬ－２、ＩＬ－１５又はその両方を含有する、請求項８に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法。【請求項10】
動物細胞培養用培地が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含有する、請求項８又は９に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法。【請求項11】
工程（ａ）が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程である、請求項８～１０のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法。【請求項12】
工程（ａ）が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した後、ＣＤ３抗体、又は、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の両抗体で活性化した末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程である、請求項８～１１のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤、及びその製造方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
成人Ｔ細胞白血病（Adult T cell leukemia；ＡＴＬ）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（human T cell leukemia virus type-1；ＨＴＬＶ－１）を原因とする悪性リンパ性腫瘍であり、ＨＴＬＶ－１感染者の約５％に発症する。ＡＴＬのうち、急性型やリンパ腫型（両型併せて「アグレッシブＡＴＬ（aggressive ATL）」とも呼ばれる）は、急激な発症と高頻度の再発のため、予後不良である。アグレッシブＡＴＬの３年生存率は、化学療法では２４％、造血幹細胞移植では３３％であり、日本で最近臨床適用が可能となったモガムリズマブ（Mogamulizumab）、レナリドミド（Lenalidomide）等の新薬による全生存期間（overall survival）の中央値も２年以内に留まっている。したがって、アグレッシブＡＴＬに対する安全かつ有効な治療方法の確立が求められている。
【0003】
一方、ＡＴＬのうち、くすぶり型や慢性型（両型併せてインドレントＡＴＬ（indolent ATL）とも呼ばれる）は、アグレッシブＡＴＬと比較して病状の進行は遅いものの、数年以内に増悪するケースが多く、長期の予後はやはり不良である。ただし、インドレントＡＴＬに対しては、化学療法はかえって病状の進行を早めることが指摘されているため、アグレッシブＡＴＬへの急性転化の兆候（血液中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）濃度の増加等）が現れて、実際に急性転化するまで、無治療で経過観察することが臨床上、原則となっている。ＡＴＬは早期診断が可能であるにもかかわらず、インドレントＡＴＬは病期が進行するまで為す術が無く、インドレントＡＴＬに対して安全かつ有効で、しかも早期に適用できる治療方法の確立が求められている。
【0004】
また、ＨＴＬＶ－１は、ＡＴＬ以外にも、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（HTLV-I-associated myelopathy：ＨＡＭ）又は熱帯性痙性対麻痺（Tropical spastic paraparesis：ＴＳＰ）、ＨＴＬＶ－１ぶどう膜炎（HTLV-1 uveitis：ＨＵ）の原因ウイルスとしても知られている。
【0005】
さらに、２０１０年から妊婦検診におけるＨＴＬＶ－１抗体検査の推奨レベルが上がり、抗体陽性者には感染告知を行うことが開始されている。これは、抗体陽性者には乳児への授乳を制限することによって、母乳を介した乳児へのＨＴＬＶ－１の垂直感染の頻度を減少させるためである。しかし、人工乳で乳児を保育しても、数％の乳児にはＨＴＬＶ－１の感染が成立してしまう。また、ＨＴＬＶ－１感染者の発症リスクを減少させる方法や発症予防方法は確立していないため、感染妊婦自身に対してはカウンセリングのみで対応しているのが実情であり、感染告知による心理的、社会的問題は計り知れない。この問題は献血時にＨＴＬＶ－１感染が判明した者への感染告知においても同様である。従って、ＨＴＬＶ－１感染者に対する発症予防方法の確立は急務である。
【0006】
これまでに、本発明者らは、抗腫瘍効果を担うＨＴＬＶ－１ Ｔａｘ特異的ＣＴＬ活性がＡＴＬ患者では低下していることを確認し、ＨＴＬＶ－１ Ｔａｘ特異的ＣＴＬを活性化させる方法について研究を行ってきた。例えば、特許文献１には、ＨＴＬＶ－１ Ｔａｘ特異的ＣＴＬを活性化させることができる、Ｔａｘ特異的ＣＴＬのエピトープ部位のペプチドや、かかるペプチドを含む免疫応答誘導用ワクチンが開示されている。本発明者らは、かかるペプチドを抗原とするＴａｘペプチドパルス樹状細胞ワクチンの開発を実際に行った。かかる樹状細胞ワクチン療法の予備的な臨床研究では、３例中２例で４年以上生存の好成績が得られ、免疫療法の有効性が示唆された（非特許文献１）。このような免疫療法は、化学療法等に比べて副作用が少なく、今後、より早期のＡＴＬ患者への適応拡大が期待される。しかし、現時点では、使用可能なエピトープの種類が限られているため、適応となる患者は、ＨＬＡ－Ａ０２０１、ＨＬＡ－Ａ２４０２又はＨＬＡ－Ａ１１０１というヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen：ＨＬＡ）のタイプを有する患者に限定されている。日本では、かかるＨＬＡ型を有するＡＴＬ患者は、ＡＴＬ患者全体の約６５％であり、残りの約３５％のＡＴＬ患者に対してはかかるペプチドワクチンを使用することができない。そのため、より多くのＡＴＬ患者に適用することができる、より普遍的な治療方法の確立が望まれている。
【0007】
Ｔ細胞には、主に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞が存在し、ＣＤ４陽性のＴ細胞としては、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞が挙げられ、ＣＤ８陽性のＴ細胞としては、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＣＴＬ）が挙げられる。一般に、ＣＤ８＋ＣＴＬの応答を活性化させるためには、抗原を貪食した抗原提示細胞（antigen presenting cell；ＡＰＣ）が活性化し、副刺激分子（ＣＤ８６等）の発現やＩＬ－１２等のサイトカイン産生を行うと共に、抗原ペプチドをＭＨＣクラスII分子だけでなくＭＨＣクラスＩ分子にも提示すること（すなわち、「抗原のクロスプレゼンテーション」）が必要である。しかし、抗原として、タンパク抗原を免疫した場合、かかるタンパク抗原は主にＭＨＣクラスII分子に提示され、ＭＨＣクラスＩ分子にはほとんど提示されない。そのため、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答を活性化する場合には、ＭＨＣクラスＩに結合可能な合成オリゴペプチドが抗原として使われることが多いが、この場合には抗原提示細胞を活性化するためのアジュバントが別途必要となる。現在、ヒトに使用可能なアジュバントは限られており、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答の誘導効率も不確実である。
【0008】
ところで、本発明者らは、これまでに、ＨＴＬＶ－１の経口感染モデルラットが、ＨＴＬＶ－１特異的Ｔ細胞の免疫寛容を示すこと、前述のモデルラットにおけるＨＴＬＶ－１のプロウイルス量がＨＴＬＶ－１特異的Ｔ細胞応答と逆相関すること、及び、前述のモデルラットへの同系のＨＴＬＶ－１感染細胞の接種により、ＨＴＬＶ－１特異的Ｔ細胞応答が回復したこと等を見いだしている（非特許文献２及び３）。しかし、これら非特許文献２及び３では、かかるＴ細胞応答が、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の応答か、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の応答かを区別しておらず、ＨＴＬＶ－１感染細胞の接種がＣＤ８陽性Ｔ細胞の応答を活性化することは開示されていない。また、本発明者らは、ＡＴＬ患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養し、かかる末梢血リンパ球におけるＴａｘ発現を確認したところ、約半数のＡＴＬ患者においてＴａｘ発現が誘導されると共に、ＣＤ８０等の副刺激分子が誘導されることを見いだしている（非特許文献４）。また、非特許文献４には、ＡＴＬ患者由来の末梢血リンパ球を培養後にホルマリン固定したものを健常ラットに投与したところ、ＨＴＬＶ－１特異的Ｔ細胞応答がＣＤ４優位で惹起されることが記載されている。
【0009】
しかし、ＡＴＬ患者等のＨＴＬＶ－１感染者から採取されたＰＢＭＣを培養して得られるＰＢＭＣを抗がん剤で処理して得られるＰＢＭＣを対象に投与すると、その対象において、ＨＴＬＶ－１特異的なＣＤ８陽性ＣＴＬを効率的に活性化することができることは、これまでに知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【文献】国際公開第２００６／０３５６８１号パンフレット
【非特許文献】
【0011】
【文献】Br J Haematol, 169: 356-367, 2015
【文献】J Virol 77: 2956-2963. 2003
【文献】J Virol 80:7375-7381. 2006
【文献】Int J Cancer 114:257-267. 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の課題は、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤、及びその製造方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、以下のような研究を鋭意行った。
まず、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬと、かかるＣＴＬとＭＨＣ－Ｉの一致する抗原提示細胞を用意した。次に、これら両細胞（ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ及び抗原提示細胞）とはＭＨＣ－Ｉが一致しないＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞を培養した後、抗がん剤で処理した。前述の培養後抗がん剤で処理したＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞（以下、「抗がん剤処理した培養感染Ｔ細胞」とも言う。）を、前述の抗原提示細胞と共培養し、さらにこれをホルマリン固定した後、前述のＣＴＬと共培養したところ、ＩＦＮ－γの産生が認められた。このことから、その共培養中に抗原提示細胞が「抗がん剤処理した培養感染Ｔ細胞」を取り込み、ＭＨＣ－Ｉ上にＨＴＬＶ－１由来のＴａｘ抗原を提示し、ＣＴＬがそのＴａｘ抗原を認識してＩＦＮ－γを産生したことが示された。また、「抗がん剤処理した培養感染Ｔ細胞」と、健常者の単球由来の未熟樹状細胞とを共培養したところ、その未熟樹状細胞からのＣＤ８６（ＣＤ８陽性ＣＴＬの応答を活性化するために必要であることが知られる副刺激分子の１種）の発現が大幅に増加した。これらのことから、「抗がん剤処理した培養感染Ｔ細胞」は、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤として用い得ることが示された。
まず、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬと、かかるＣＴＬとＭＨＣ－Ｉの一致する抗原提示細胞を用意した。次に、これら両細胞（ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ及び抗原提示細胞）とはＭＨＣ－Ｉが一致しないＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞を培養した後、抗がん剤で処理した。前述の培養後抗がん剤で処理したＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞（以下、「抗がん剤処理した培養感染Ｔ細胞」とも言う。）を、前述の抗原提示細胞と共培養し、さらにこれをホルマリン固定した後、前述のＣＴＬと共培養したところ、ＩＦＮ－γの産生が認められた。このことから、その共培養中に抗原提示細胞が「抗がん剤処理した培養感染Ｔ細胞」を取り込み、ＭＨＣ－Ｉ上にＨＴＬＶ－１由来のＴａｘ抗原を提示し、ＣＴＬがそのＴａｘ抗原を認識してＩＦＮ－γを産生したことが示された。また、「抗がん剤処理した培養感染Ｔ細胞」と、健常者の単球由来の未熟樹状細胞とを共培養したところ、その未熟樹状細胞からのＣＤ８６（ＣＤ８陽性ＣＴＬの応答を活性化するために必要であることが知られる副刺激分子の１種）の発現が大幅に増加した。これらのことから、「抗がん剤処理した培養感染Ｔ細胞」は、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤として用い得ることが示された。
【0014】
また、ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞を培養する際の培地にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を添加すると、抗原提示細胞（好ましくは樹状細胞）からのＩＬ－１２産生が増加し、また、クロスプレゼンテーション効率も向上することが示された。
【0015】
また、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血単核細胞を培養して得られる末梢血単核細胞を、抗がん剤で処理して得られた末梢血単核細胞では、ＨＴＬＶ－１由来の抗原であるＴａｘタンパク質を発現する細胞の割合が高くなることが示された。
【0016】
本発明者らは、これらのことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【0017】
すなわち、本発明は、
（１）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞を含有する、前記対象に投与するための、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤；や、
（２）末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を、１日以上培養して得られる末梢血単核細胞である、上記（１）に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤や；
（３）動物細胞培養用培地が、ＩＬ－２、ＩＬ－１５又はその両方を含有する、上記（１）又は（２）に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤や；
（４）動物細胞培養用培地が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含有する、上記（１）～（３）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤や；
（５）ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血単核細胞である、上記（１）～（４）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤や；
（６）ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した後、ＣＤ３抗体、又は、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の両抗体で活性化された末梢血単核細胞である、上記（１）～（５）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤や；
（７）ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後に、ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合し得る抗体を接触させた末梢血単核細胞である、上記（１）～（６）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤；や、
（８）（ａ）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程；及び、
（ｃ）前記工程（ｂ）で採取された末梢血単核細胞を薬学的に許容される担体と混合して製剤化する工程；
を有する、前記対象に投与するための、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法；や、
（９）動物細胞培養用培地が、ＩＬ－２、ＩＬ－１５又はその両方を含有する、上記（８）に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法；や、
（１０）動物細胞培養用培地が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含有する、上記（８）又は（９）に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法；や、
（１１）工程（ａ）が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程である、上記（８）～（１０）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法；や、
（１２）工程（ａ）が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した後、ＣＤ３抗体、又は、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の両抗体で活性化した末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程である、上記（８）～（１１）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法；
に関する。
（１）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞を含有する、前記対象に投与するための、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤；や、
（２）末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を、１日以上培養して得られる末梢血単核細胞である、上記（１）に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤や；
（３）動物細胞培養用培地が、ＩＬ－２、ＩＬ－１５又はその両方を含有する、上記（１）又は（２）に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤や；
（４）動物細胞培養用培地が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含有する、上記（１）～（３）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤や；
（５）ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血単核細胞である、上記（１）～（４）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤や；
（６）ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した後、ＣＤ３抗体、又は、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の両抗体で活性化された末梢血単核細胞である、上記（１）～（５）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤や；
（７）ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後に、ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合し得る抗体を接触させた末梢血単核細胞である、上記（１）～（６）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤；や、
（８）（ａ）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程；及び、
（ｃ）前記工程（ｂ）で採取された末梢血単核細胞を薬学的に許容される担体と混合して製剤化する工程；
を有する、前記対象に投与するための、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法；や、
（９）動物細胞培養用培地が、ＩＬ－２、ＩＬ－１５又はその両方を含有する、上記（８）に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法；や、
（１０）動物細胞培養用培地が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含有する、上記（８）又は（９）に記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法；や、
（１１）工程（ａ）が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程である、上記（８）～（１０）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法；や、
（１２）工程（ａ）が、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した後、ＣＤ３抗体、又は、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の両抗体で活性化した末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程である、上記（８）～（１１）のいずれかに記載のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法；
に関する。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤、及びその製造方法等を提供することができる。また、本発明によれば、ＨＴＬＶ－１の感染に起因する疾患の患者のＨＬＡ型に制限されずに、多くの患者に比較的安価で効果的な免疫療法を提供できることが期待される。また、本発明によれば、現在、安全で有効な治療法が存在しないため無治療観察が原則となっているくすぶり型や慢性型のＡＴＬ（インドレントＡＴＬ）に対して早期段階で適用が可能な治療法を提供できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１は、急性型ＡＴＬ患者（ａＡＴＬ）のＰＢＭＣを培養前（Ｄａｙ０）又は３日間（Ｄａｙ３）培養後に固定／透過処理し、細胞内Ｔａｘタンパクを一次抗体（抗Ｔａｘ抗体、又は、対照抗体であるマウス抗ＩｇＧ抗体）で染色後、二次抗体（Ａ４８８標識抗マウスＩｇＧ）で染色した細胞内のＨＴＬＶ－１ Ｔａｘタンパク質を検出した結果を示す図である。図１左パネルはＤａｙ０の結果を表し、図１右パネルはＤａｙ３の結果を表す。
【図2】図２は、急性型ＡＴＬ患者（ａＡＴＬ）のＰＢＭＣをそのまま（Ｗｈｏｌｅ）又はＣＤ８陽性細胞を除去した後（ＣＤ８（－））、１日間（ｄａｙ１）培養した後、ＰＢＭＣの細胞内のＴａｘタンパク質を検出した結果を示す図である。図２左パネル（Whole day1）；ａＡＴＬのＰＢＭＣをそのまま１日間培養した場合の結果を表す。図２右パネル（CD8(-) day1）；ａＡＴＬのＰＢＭＣからＣＤ８陽性細胞を除去した後、そのＰＢＭＣを１日間培養した場合の結果を表す。
【図3】図３は、慢性型ＡＴＬ患者（ｃＡＴＬ）のＰＢＭＣからＣＤ８陽性細胞を除去した後、ＣＤ３及びＣＤ２８抗体で刺激し、そのＰＢＭＣを２４日間培養した後、ＰＢＭＣの細胞内のＴａｘタンパク質を検出した結果を示す図である。
【図4】図４は、ａＡＴＬのＰＢＭＣ由来の細胞株（ＩＬＴ－Ａ株）またはｃＡＴＬのＰＢＭＣ由来の細胞株（ＩＬＴ－Ｂ株）を、ＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）又はＤＭＳＯ（コントロール）を含有する培地で２日間培養した後、ＰＢＭＣの細胞内のＴａｘタンパク質を検出した結果を示す図である。図４左下パネル；ＩＬＴ－Ａ株を、ＩＬ－１５及びＳＡＨＡ含有培地で培養した場合の結果を表す。図４左上パネル；ＩＬＴ－Ａ株を、ＩＬ－１５及びＤＭＳＯ含有培地で培養した場合の結果を表す。図４右下パネル；ＩＬＴ－Ｂ株を、ＩＬ－２及びＳＡＨＡ含有培地で培養した場合の結果を表す。図４右上パネル；ＩＬＴ－Ｂ株を、ＩＬ－２及びＤＭＳＯ含有培地で培養した場合の結果を表す。
【図6】図６は、本発明者らが構築した評価系により、培養液の上清中のＩＦＮ－γ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した結果を示す。図６の「ILT-MMC alone」；始めの培養として、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞（ＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞株）のみを培養した場合のＣＴＬとの共培養液上清中のＩＦＮ－γ濃度を表す。図６の「ILT-Formalin alone」；始めの培養として、ホルマリン処理したＩＬＴ－Ａ細胞（ＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞株）のみを培養した場合のＣＴＬとの共培養液上清中のＩＦＮ－γ濃度を表す。図６の「THP1 alone」；始めの培養として、抗原提示細胞であるＴＨＰ１細胞のみを培養した場合のＣＴＬとの共培養液上清中のＩＦＮ－γ濃度を表す。図６の「ILT-MMC+THP1」；始めの培養として、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞と、ＴＨＰ１細胞（抗原提示細胞）を培養した場合のＣＴＬとの共培養液上清中のＩＦＮ－γ濃度を表す。図６の「ILT-Formalin+THP1」；始めの培養として、ホルマリン処理したＩＬＴ－Ａ細胞と、ＴＨＰ１細胞（抗原提示細胞）を培養した場合のＣＴＬとの共培養液上清中のＩＦＮ－γ濃度を表す。図６の「None (CTL alone)」；始めの培養の際にＩＬＴ－Ａ細胞もＴＨＰ１細胞（抗原提示細胞）も培養しなかった場合（すなわち、ＣＴＬであるＴｃ－Ｍ１のみを培養した場合）のＩＦＮ－γ濃度を表す。
【図7】図７は、ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞に、ＡＴＬ患者、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者、又は非感染者の血漿を接触させた後、ＴＨＰ１細胞（抗原提示細胞）と共培養を行い、ホルマリンで固定した後、ＣＴＬとの共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した結果を表す。図７の「ILT alone」；ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞を用いたが、ＴＨＰ１細胞を用いなかった場合の結果を表す。図７の「ILT+APC」；ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞を用い、血漿や抗体は用いなかった場合の結果を表す。図７の「SN-1」及び「SN-2」；ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞に加えて、非感染者の血漿を用いた場合の結果を表す。図７の「ATL-1」、「ATL-2」及び「ATL-3」；ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞に加えて、ＡＴＬ患者の血漿を用いた場合の結果を表す。図７の「HAM-1」、「HAM-2」及び「HAM-3」；ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞に加えて、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者の血漿を用いた場合の結果を表す。図７の「Poteligeo」；ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞に加えて、抗ＣＣＲ４抗体であるモガムリズマブを用いた場合の結果を表す。図７の「APC alone」；ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞を用いずに、ＴＨＰ１細胞を用いた場合の結果を表す。
【図8】図８は、ＭＭＣ処理後、ＨＴＬＶ－１感染者の血漿で処理したＩＬＴ－Ａ細胞と、ＴＨＰ１細胞とを共培養した後、ホルマリンで固定し、ＣＴＬとの共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した結果を表す。図８の「10(5)」；上記のＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞とを、１：１の比率（細胞の個数の比率）で共培養した場合の結果を表す。図８の「5×10(4)」；上記のＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞とを、０．５：１の比率（細胞の個数の比率）で共培養した場合の結果を表す。図８の「2.5×10(4)」；上記のＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞とを、０．２５：１の比率（細胞の個数の比率）で共培養した場合の結果を表す。また、図８において、黒塗りの棒グラフ（「MMC-ILT/(+)plasma」）は、「ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞」とＨＴＬＶ－１感染者の血漿を接触させた場合の結果を表し、グレーの棒グラフ（「MMC-ILT/(-)plasma」）は、「ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞」に非感染者の血漿を接触させた場合の結果を表し、白抜きの棒グラフ（「MMC-ILT」）は、「ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞」にＨＴＬＶ－１感染者の血漿を接触させなかった場合の結果を表す。
【図9】図９は、逆転写酵素阻害剤（ジドブジン：ＡＺＴ）で処理した抗原提示細胞（ＴＨＰ１細胞）と、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞とを１６時間共培養した後、得られた全細胞をホルマリン水溶液で固定し、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）と１６時間共培養を行い、その培養上清中のＩＦＮ－γ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した結果を表す。図９の「ILT 1×10(5)」；上記のＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞とを、１：１の比率（細胞の個数の比率）で共培養した場合の結果を表す。図９の「ILT 3×10(4)」；上記のＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞とを、０．３：１の比率（細胞の個数の比率）で共培養した場合の結果を表す。図９の横軸の「Medium」；ＩＬＴ－Ａ細胞を用いなかった場合の結果を表す。また、図９において、黒塗りの棒グラフ（「THP1-AZT」）は、培地にＡＺＴを添加してＴＨＰ１細胞等を培養した場合の結果を表し、グレーの棒グラフ（「THP1」）は、培地にＡＺＴを添加しなかった場合の結果を表し、白抜きの棒グラフ（「Medium」）はＴＨＰ１細胞を用いなかった場合の結果を表す。
【図10】図１０は、ＨＬＡ－Ａ２陰性の健常人未熟樹状細胞とＭＭＣ処理したＨＬＡ－Ａ２陽性のＩＬＴ－Ｃ株とを２４時間共培養した後、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体と、抗ヒトＣＤ８３抗体又は抗ヒトＣＤ８６抗体とで染色し、フローサイトメーターでＨＬＡ－Ａ２陰性樹状細胞分画のＣＤ８３及びＣＤ８６の発現強度を測定した結果を示す。なおグレーの結果は、対照抗体（マウスＩｇＧ１）染色の結果を表す。図１０左下パネル；健常人未熟樹状細胞とＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株とを共培養して得られた細胞におけるＣＤ８３の発現を測定した結果を表す。図１０左上パネル；ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株を用いずに健常人未熟樹状細胞を培養して得られた細胞におけるＣＤ８３の発現を測定した結果を表す。図１０右下パネル；健常人未熟樹状細胞とＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株とを共培養して得られた細胞におけるＣＤ８６の発現を測定した結果を表す。図１０右上パネル；ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株を用いずに健常人未熟樹状細胞を培養して得られた細胞におけるＣＤ８６の発現を測定した結果を表す。
【図11】図１１は、ＩＬＴ－Ａ細胞又はＩＬＴ－Ｂ細胞を、ＳＡＨＡ（ＨＤＡＣ阻害剤の１種）含有培地又はＤＭＳＯ含有培地（コントロール培地）で２４時間培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した後、樹状細胞と共培養を行い、その培養上清中のＩＬ－１２濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した結果を表す。図１１の「ILT-A SAHA」；ＩＬＴ－Ａ細胞をＳＡＨＡ含有培地で培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した細胞を用いた場合の結果を表す。図１１の「ILT-A DMSO」；ＩＬＴ－Ａ細胞をＤＭＳＯ含有培地で培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した細胞を用いた場合の結果を表す。図１１の「ILT-B SAHA」；ＩＬＴ－Ｂ細胞をＳＡＨＡ含有培地で培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した細胞を用いた場合の結果を表す。図１１の「ILT-B DMSO」；ＩＬＴ－Ｂ細胞をＤＭＳＯ含有培地で培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した細胞を用いた場合の結果を表す。なお、各項目における右側には、樹状細胞と共培養した場合の結果（黒塗りの棒グラフ（「DC」））を表し、各項目における左側には、樹状細胞を用いなかった場合の結果（「Medium」）を表す。ただし、「Medium」の実際の結果はいずれも検出限界以下（n.d.）であった。
【図12】図１２は、ＩＬＴ－Ｂ細胞を、ＶＰＡ（ＨＤＡＣ阻害剤の１種）含有培地又はＤＭＳＯ含有培地（コントロール培地）で２４時間培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した後、樹状細胞と共培養を行い、その培養上清中のＩＬ－１２濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した結果を表す。図１２の「ＶＰＡ」；ＩＬＴ－Ｂ細胞をＶＰＡ含有培地で培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した細胞を用いた場合の結果を表す。図１２の「ＤＭＳＯ」；ＩＬＴ－Ｂ細胞をＤＭＳＯ含有培地で培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した細胞を用いた場合の結果を表す。なお、各項目における右側には、樹状細胞と共培養した場合の結果（黒塗りの棒グラフ（「DC」）を表し、各項目における左側には、樹状細胞を用いなかった場合の結果（「Medium」）を表す。ただし、「Medium」の実際の結果はいずれも検出限界以下（n.d.）であった。
【図13】図１３は、ＩＬＴ－Ａ細胞又はＩＬＴ－Ｂ細胞を、ＳＡＨＡ（ＨＤＡＣ阻害剤の１種）含有培地又はＤＭＳＯ含有培地（コントロール培地）で２４時間培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した後、樹状細胞と共培養を行い、ホルマリンで固定した後、ＣＴＬとの共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した結果を表す。図１３の「ILT-A SAHA」；ＩＬＴ－Ａ細胞をＳＡＨＡ含有培地で培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した細胞を用いた場合の結果を表す。図１３の「ILT-A DMSO」；ＩＬＴ－Ａ細胞をＤＭＳＯ含有培地で培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した細胞を用いた場合の結果を表す。図１３の「ILT-B SAHA」；ＩＬＴ－Ｂ細胞をＳＡＨＡ含有培地で培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した細胞を用いた場合の結果を表す。図１３の「ILT-B DMSO」；ＩＬＴ－Ｂ細胞をＤＭＳＯ含有培地で培養して得られた細胞をＭＭＣ処理した細胞を用いた場合の結果を表す。図１３の横軸の「Medium」；ＩＬＴ細胞を用いず、培地または樹状細胞（ＤＣ）のみをＣＴＬと共培養した場合の結果を表す。なお、各項目における右側には、樹状細胞と共培養した場合の結果（黒塗りの棒グラフ（「DC」））を表し、各項目における左側には、樹状細胞を用いなかった場合の結果（白抜きの棒グラフ（「Medium」）を表す。ただし、「n.d.」は検出限界以下を表す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明は、
［１］ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞を含有する、前記対象に投与するための、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤（又は、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化用組成物）；や、
［２］（ａ）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程；及び、
（ｃ）前記工程（ｂ）で採取された末梢血単核細胞を薬学的に許容される担体と混合して製剤化する工程；
を有する、前記対象に投与するための、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤（又は、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤又は活性化用組成物）の製造方法；
などの態様を含んでいる。なお、本明細書において、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤は、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化用組成物として用いることができる。
［１］ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞を含有する、前記対象に投与するための、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤（又は、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化用組成物）；や、
［２］（ａ）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程；及び、
（ｃ）前記工程（ｂ）で採取された末梢血単核細胞を薬学的に許容される担体と混合して製剤化する工程；
を有する、前記対象に投与するための、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤（又は、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤又は活性化用組成物）の製造方法；
などの態様を含んでいる。なお、本明細書において、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤は、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化用組成物として用いることができる。
【0021】
また、本発明はその他の態様として、
［３］（ａ）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程；及び、
（ｃ）前記工程（ｂ）で採取した末梢血単核細胞（又は、かかる末梢血単核細胞を含むＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤又は活性化用組成物）を前記対象に投与する工程；
を有する、前記対象におけるＨＴＬＶ－１感染に起因する疾患の予防又は治療方法；や、
［４］（ａ）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程；及び、
（ｃ）前記工程（ｂ）で採取した末梢血単核細胞（又は、かかる末梢血単核細胞を含むＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤又は活性化用組成物）を前記対象に投与する工程；
を有する、前記対象における抗ＨＴＬＶ－１特異的ＣＴＬの活性化方法；や、
［５］ＨＴＬＶ－１感染に起因する疾患の予防又は治療における使用のための、「ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞」；や、
［６］ＨＴＬＶ－１感染に起因する疾患の予防又は治療剤（又は、予防又は治療用医薬組成物）の製造のための、「ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞」の使用；
などの態様も含んでいる。
［３］（ａ）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程；及び、
（ｃ）前記工程（ｂ）で採取した末梢血単核細胞（又は、かかる末梢血単核細胞を含むＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤又は活性化用組成物）を前記対象に投与する工程；
を有する、前記対象におけるＨＴＬＶ－１感染に起因する疾患の予防又は治療方法；や、
［４］（ａ）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程；及び、
（ｃ）前記工程（ｂ）で採取した末梢血単核細胞（又は、かかる末梢血単核細胞を含むＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤又は活性化用組成物）を前記対象に投与する工程；
を有する、前記対象における抗ＨＴＬＶ－１特異的ＣＴＬの活性化方法；や、
［５］ＨＴＬＶ－１感染に起因する疾患の予防又は治療における使用のための、「ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞」；や、
［６］ＨＴＬＶ－１感染に起因する疾患の予防又は治療剤（又は、予防又は治療用医薬組成物）の製造のための、「ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞」の使用；
などの態様も含んでいる。
【0022】
（末梢血単核細胞）
本発明における「末梢血単核細胞」としては、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞（以下、「感染対象由来ＰＢＭＣ」とも表示する。）を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞（以下、「培養感染ＰＢＭＣ（cultured infected PBMC）」とも表示する。）を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞（以下、「抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣ」とも表示する。）である限り特に制限されない。
本発明における「末梢血単核細胞」としては、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞（以下、「感染対象由来ＰＢＭＣ」とも表示する。）を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞（以下、「培養感染ＰＢＭＣ（cultured infected PBMC）」とも表示する。）を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞（以下、「抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣ」とも表示する。）である限り特に制限されない。
【0023】
本発明における末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の種類としては、末梢血由来のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球が挙げられ、中でも、末梢血由来のＴ細胞が特に好ましく挙げられる。
【0024】
上記の「ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象」として具体的には、ＨＴＬＶ－１に起因する疾患（以下、「ＨＴＬＶ－１疾患」とも表示する。）に罹患している対象や、ＨＴＬＶ－１疾患に罹患していない（すなわち、ＨＴＬＶ－１疾患を未発症である）がＨＴＬＶ－１に感染している対象を挙げることができる。なかでも、本発明の効果をより多く享受する観点から、Ｔａｘ特異的ＣＴＬ活性の低い対象を好ましく挙げる事ができる。上記のＨＴＬＶ－１疾患としては、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、ＨＡＭ、ＴＳＰ、ＨＵを挙げることができ、ＡＴＬを好ましく挙げることができる。
【0025】
ある対象がＨＴＬＶ－１に感染しているかどうかは、公知の方法を用いることができる。かかる公知の方法としては、その対象の血液中に抗ＨＴＬＶ－１抗体が含まれているかを調べるウエスタンブロット法又はラインブロット法、あるいは、その対象のＰＢＭＣのゲノム中のＨＴＬＶ－１ウイルスＤＮＡ（プロウイルスＤＮＡ）を特異的に検出する核酸検出法（ＰＣＲ法）を挙げることができる。
【0026】
ＨＴＬＶ－１に感染した対象からＰＢＭＣを採取する方法としては、特に制限されず、対象から採取した末梢血について公知の密度勾配遠心法などを適用することにより、ＰＢＭＣを採取する方法を好ましく挙げることができる。上記の密度勾配遠心法には、市販のヒトリンパ球分離液を好適に用いることができる。
【0027】
ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞（「感染対象由来ＰＢＭＣ」）としては、ＨＴＬＶ－１に感染したＰＢＭＣを好ましく挙げることができる。ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取されたＰＢＭＣの細胞集団は、ＨＴＬＶ－１に感染したＰＢＭＣを含んでいればよく、その細胞集団の個々のすべての細胞がＨＴＬＶ－１に感染していなくてもよいが、感染細胞の割合は高いほど良く、かかる細胞集団のＰＢＭＣのうち、５％以上、１５％以上、４０％以上の割合の個数の細胞がＨＴＬＶ－１に感染していることが挙げられる。
【0028】
また、感染対象由来ＰＢＭＣとしては、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取されたＰＢＭＣ（ＰＢＭＣの細胞集団）からＣＤ８陽性細胞を除去したＰＢＭＣ（ＰＢＭＣの細胞集団）を好ましく挙げることができる。ＣＤ８陽性細胞を除去したＰＢＭＣ（ＰＢＭＣの細胞集団）を感染対象由来ＰＢＭＣとして用いると、該ＰＢＭＣを培養したときに、ＨＴＬＶ－１由来の抗原であるＴａｘタンパク質を発現する細胞の割合が高くなるため好ましい。かかる割合としては、２０％以上、３５％以上、５０％以上などが好ましく挙げられる。
【0029】
また、感染対象由来ＰＢＭＣとしては、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取されたＰＢＭＣ（ＰＢＭＣの細胞集団）からＣＤ８陽性細胞を除去したＰＢＭＣ（ＰＢＭＣの細胞集団）をＣＤ３抗体、又は、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の両抗体で刺激したＰＢＭＣ（ＰＢＭＣの細胞集団）を好ましく挙げることができる。かかる刺激したＰＢＭＣ（ＰＢＭＣの細胞集団）を感染対象由来ＰＢＭＣとして用いると、該ＰＢＭＣを培養したときに、ＨＴＬＶ－１由来の抗原であるＴａｘタンパク質を発現する細胞の割合が高くなるため好ましい。
【0030】
（動物細胞培養用培地）
本発明に用いる「動物細胞培養用培地」としては、末梢血単核細胞（好ましくは末梢血Ｔ細胞）の増殖に適している液体培地である限り特に制限されず、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地などの動物細胞培養用基本培地を使用することができる。また、これらの動物細胞培養用基本培地の混合培地を用いることもできる。これらの動物細胞培養用基本培地は市販されているものを用いることができる。
本発明に用いる「動物細胞培養用培地」としては、末梢血単核細胞（好ましくは末梢血Ｔ細胞）の増殖に適している液体培地である限り特に制限されず、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地などの動物細胞培養用基本培地を使用することができる。また、これらの動物細胞培養用基本培地の混合培地を用いることもできる。これらの動物細胞培養用基本培地は市販されているものを用いることができる。
【0031】
本発明における動物細胞培養用培地は、無血清培地であってもよいが、血清含有培地であってもよく、かかる血清含有培地としては、前述の動物細胞培養用基本培地にさらに５～２０重量％の血清（例えばＦＣＳ）を添加した培地を好ましく挙げることができる。
【0032】
また、本発明における動物細胞培養用培地は、ＩＬ－２（インターロイキン－２）及びＩＬ－１５（インターロイキン－１５）のいずれも含有していなくてもよいが、ＩＬ－２（インターロイキン－２）及びＩＬ－１５（インターロイキン－１５）からなる群から選択される１種又は２種の物質をさらに含有していることが好ましい。ＩＬ－２やＩＬ－１５は、末梢血単核細胞の培養を長期間継続させるために好適であるため、感染者対象由来ＰＢＭＣを例えば２日間以上培養する場合に特に好適に用いることができる。本発明における動物細胞培養用培地中のＩＬ－２の濃度としては、例えば３～３００ｕ／ｍＬ、好ましくは６～１５０ｕ／ｍＬ、より好ましくは１５～６０ｕ／ｍＬを挙げることができ、また、ＩＬ－１５の濃度としては、例えば１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５～２０ｎｇ／ｍＬを挙げることができる。なお、ＩＬ－２やＩＬ－１５は市販されているものを用いることができる。
【0033】
また、本発明における動物細胞培養用培地は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤を含有していなくてもよいが、さらにＨＤＡＣ阻害剤を含有していることが好ましい。感染対象由来ＰＢＭＣを培養する培地にＨＤＡＣ阻害剤が含まれていると、かかるＰＢＭＣを抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養した際の、ＡＰＣからのＩＬ－１２産生が増加し、また、ＡＰＣのクロスプレゼンテーション効率も向上するため好ましい。
【0034】
ＨＤＡＣ阻害剤としては、ＨＤＡＣへの阻害作用を有する物質である限り特に制限されず、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、バルプロ酸(Valproic acid, ＶＰＡ)、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スクリプタイド（Scriptaid）、オキサムフラチン（Oxamflatin）、トラポキシン（trapoxin）、フェニル酪酸（phenylbutyrate）、ＭＳ－２７５（Entinostat）、ピロキシアミド（pyroxamide）等を挙げることができ、中でも、ＳＡＨＡやＶＰＡを好ましく挙げることができる。また、ＨＤＡＣ阻害剤は２種類以上を併用してもよい。なお、これらのＨＤＡＣ阻害剤は市販されているものを用いることができる。
【0035】
本発明における動物細胞培養用培地中のＨＤＡＣ阻害剤の濃度としては、用いるＨＤＡＣ阻害剤の種類に応じて適宜設定することができるが、例えばＳＡＨＡの場合、例えば０.１～２０μＭ、好ましくは０.２５～１０μＭ、より好ましくは０．５～２μＭを挙げることができ、ＶＰＡの場合は、例えば０.１～２０mＭ、好ましくは０.２５～１０mＭ、より好ましくは０．５～２mＭを挙げることができる。
【0036】
本発明におけるＰＢＭＣを、ＣＤ３抗体、又は、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体で刺激する場合、本発明における動物細胞培養用培地中に添加するＣＤ３抗体やＣＤ２８抗体の量は特に制限されないが、本発明における動物細胞培養用培地中に、ＣＤ３抗体を付着したイムノビーズをＰＢＭＣの細胞数に対して０．３～２倍（好ましくは０．５～１．５倍、より好ましくは０．８～１．２倍）の個数となるように添加すること、あるいは、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体を付着したイムノビーズをＰＢＭＣの細胞数に対して０．３～２倍（好ましくは０．５～１．５倍、より好ましくは０．８～１．２倍）の個数となるように添加することができる。
【0037】
（感染対象由来ＰＢＭＣの培養方法）
感染対象由来ＰＢＭＣの培養方法としては、該細胞を動物細胞培養用培地で培養する方法である限り特に制限されない。上記の動物細胞培養用培地を用いること以外は、ＰＢＭＣの通常の培養条件（例えば温度条件、二酸化炭素濃度条件、培養期間等）を用いることができる。
感染対象由来ＰＢＭＣの培養方法としては、該細胞を動物細胞培養用培地で培養する方法である限り特に制限されない。上記の動物細胞培養用培地を用いること以外は、ＰＢＭＣの通常の培養条件（例えば温度条件、二酸化炭素濃度条件、培養期間等）を用いることができる。
【0038】
前述の温度条件としては、例えば３０～３９℃、好ましくは３５～３９℃を挙げることができる。
【0039】
前述の二酸化炭素濃度条件としては、例えば３～７％、４～６％などを挙げることができる。
【0040】
前述の培養期間の下限としては、例えば１日間以上を挙げることができ、ＨＴＬＶ－１由来のＴａｘタンパク質を発現する細胞の割合がより高くなる観点から、好ましくは３日間以上、より好ましくは５日間以上を挙げることができる。培養期間の上限としては、特に制限されないが、６か月間以下、３か月間以下、１か月間以下を挙げることができる。前述の培養期間としてより具体的には、１日間～６か月間、１日間～３か月間、１日間～１か月間、２日間～６か月間、２日間～３か月間、２日間～１か月間、３日間～６か月間、３日間～３か月間、３日間～１か月間、５日間～６か月間、５日間～３か月間、５日～１か月間などを挙げることができる。
【0041】
感染対象由来ＰＢＭＣを動物細胞培養用培地で培養する際に、培養開始時に用いる、培地１ｍＬあたりの感染対象由来ＰＢＭＣの個数としては、例えば、１０５～１０７個／ｍＬ、５×１０５～５×１０６個／ｍＬなどを挙げることができる。
【0042】
（抗がん剤）
培養感染ＰＢＭＣでは、感染対象由来ＰＢＭＣと比較して、ＨＴＬＶ－１抗原の発現が増加している。かかる培養感染ＰＢＭＣをＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤としてＨＴＬＶ－１感染者に投与した場合、その感染者が体液中に既に有しているＨＴＬＶ－１中和抗体が働き、培養感染ＰＢＭＣに基づく新たなＨＴＬＶ－Ｉ感染は基本的に生じないと考えられる。さらに、本発明では培養感染ＰＢＭＣを抗がん剤で処理することにより、培養感染ＰＢＭＣ自体をほとんど死滅させるため、新たなＨＴＬＶ－Ｉ感染が生じる可能性はほとんどなく、あったとしても極めて限定的且つ一過性と考えられる。
培養感染ＰＢＭＣでは、感染対象由来ＰＢＭＣと比較して、ＨＴＬＶ－１抗原の発現が増加している。かかる培養感染ＰＢＭＣをＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤としてＨＴＬＶ－１感染者に投与した場合、その感染者が体液中に既に有しているＨＴＬＶ－１中和抗体が働き、培養感染ＰＢＭＣに基づく新たなＨＴＬＶ－Ｉ感染は基本的に生じないと考えられる。さらに、本発明では培養感染ＰＢＭＣを抗がん剤で処理することにより、培養感染ＰＢＭＣ自体をほとんど死滅させるため、新たなＨＴＬＶ－Ｉ感染が生じる可能性はほとんどなく、あったとしても極めて限定的且つ一過性と考えられる。
【0043】
本明細書における「抗がん剤」とは、培養感染ＰＢＭＣの生存及び／又は増殖を阻害する活性を有する物質である限り特に制限されず、例えば通常、抗がん剤として用いられない物質についても便宜上含まれるが、抗がん剤を好ましく挙げることができる。
【0044】
かかる抗がん剤としては、抗腫瘍性抗生物質、アルキル化薬、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害薬などのＤＮＡ複製阻害薬；葉酸代謝拮抗薬、ピリミジン代謝阻害薬、プリン代謝阻害薬などの代謝拮抗薬；微小管重合阻害薬、微小管脱重合阻害薬などの微小管阻害薬；分子標的治療薬；などを挙げることができる。
【0045】
上記の抗腫瘍性抗生物質としては、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、ザルコマイシンなどを挙げることができ、中でも、マイトマイシンＣを好ましく挙げることができる。
【0046】
上記のアルキル化薬としては、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、チオテパなどのナイトロジェンマスタード類；ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバジン、プロカルバシン、テモゾロマイド、カルムスチン、ストレプトゾトシン、ベンダムスチンなどのニトロソウレア類を挙げることができる。
【0047】
上記の白金製剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチンなどを挙げることができる。
【0048】
上記のトポイソメラーゼ阻害薬としては、イリノテカン、エトポシド、ドキソルビシン、エピルビシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシンなどを挙げることができる。
【0049】
上記の葉酸代謝拮抗薬としては、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、ジアフェニルスルホンなどのジヒドロプテロイン酸シンターゼ阻害薬；メソトレキセート、トリメトプリム、ピリメタミンなどのジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬；などを挙げることができる。
【0050】
上記のピリミジン代謝阻害薬としては、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フルシトシン（ＦＣ）などのチミジル酸シンターゼ阻害薬を挙げることができる。
【0051】
上記のプリン代謝阻害薬としては、６－メルカプトプリン、アザチオプリンなどのIMPDH阻害薬；ペントスタチンなどのアデノシンデアミナーゼ阻害薬；ヒドロキシウレアなどのリボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬；チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビンなどのプリンアナログや、シタラビン、ゲムシタビンなどのピリミジンアナログなどのヌクレオチドアナログ；などを挙げることができる。
【0052】
上記の微小管重合阻害薬としては、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、フォルデシンを挙げることができる。
【0053】
上記の微小管脱重合阻害薬としては、パクリタキセル、ドセタキセルなどを挙げることができる。
【0054】
上記の分子標的治療薬としては、モガムリズマブなどを挙げることができる。
【0055】
なお、これらの抗がん剤は２種類以上を併用してもよい。また、これらの抗がん剤は市販されているものを用いることができる。
【0056】
（培養感染ＰＢＭＣを抗がん剤で処理する方法）
本発明において、培養感染ＰＢＭＣを抗がん剤で処理する方法としては、培養感染ＰＢＭＣと抗がん剤を接触させる方法である限り特に制限されず、例えば、培養感染ＰＢＭＣを含む溶液（例えば培地）中に抗がん剤を添加したのち、一定時間静置する方法を好ましく挙げることができる。
本発明において、培養感染ＰＢＭＣを抗がん剤で処理する方法としては、培養感染ＰＢＭＣと抗がん剤を接触させる方法である限り特に制限されず、例えば、培養感染ＰＢＭＣを含む溶液（例えば培地）中に抗がん剤を添加したのち、一定時間静置する方法を好ましく挙げることができる。
【0057】
培地等の溶液中の抗がん剤濃度としては、培養感染ＰＢＭＣの生存及び／又は増殖を阻害することができる限り特に制限されず、当業者は用いる抗がん剤の種類に応じて適宜設定することができる。例えばマイトマイシンＣを用いる場合のマイトマイシンＣの培地中の濃度としては、例えば５～５００μｇ／ｍＬ、好ましくは１０～２５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは２５～１００μｇ／ｍＬを挙げることができる。
【0058】
培養感染ＰＢＭＣを抗がん剤に接触させる時間としては、培養感染ＰＢＭＣの生存及び／又は増殖を阻害することができる限り特に制限されず、例えば、３０分間～２４時間、３０分間～８時間、３０分間～２時間などを挙げることができる。
【0059】
培養感染ＰＢＭＣを抗がん剤で処理した後は、培養感染ＰＢＭＣから抗がん剤を除去するために、培養感染ＰＢＭＣを培地等で洗浄することが好ましい。かかる洗浄の後、遠心分離するなどして、培養感染ＰＢＭＣを採取することができる。
【0060】
（ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合し得る抗体を接触させること）
抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣは、さらに、ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合し得る抗体を接触させなくてもよいが、抗原提示細胞による貪食作用が高まる場合があるため、さらに、ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合し得る抗体を接触させることが好ましい。
抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣは、さらに、ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合し得る抗体を接触させなくてもよいが、抗原提示細胞による貪食作用が高まる場合があるため、さらに、ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合し得る抗体を接触させることが好ましい。
【0061】
本発明において「ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合し得る抗体」としては、モガムリズマブや、ＨＴＬＶ－Ｉ感染対象の血液中に含まれる抗体を挙げることができる。
【0062】
抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣを、ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合し得る抗体に接触させる方法としては、該抗体を含む溶液中に、抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣを入れる方法が挙げられる。なお、ＨＴＬＶ－Ｉ感染対象の血液中に含まれる抗体を用いる場合、かかる感染対象の血漿を用いることができる。
【0063】
（ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤）
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤は、抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣ（すなわち、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞）のみを含んでいてもよいし、他の成分（すなわち任意成分）をさらに含んでいてもよい。
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤は、抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣ（すなわち、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養して得られる末梢血単核細胞を抗がん剤で処理して得られる末梢血単核細胞）のみを含んでいてもよいし、他の成分（すなわち任意成分）をさらに含んでいてもよい。
【0064】
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤は、抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣを、薬学的に許容される担体と混合する等の常法にしたがって製剤化したものであってもよい。かかる製剤としては、固体製剤であってもよいし、液体製剤であってもよいが、液体製剤を好ましく挙げることができる。
【0065】
かかる液体製剤としては、液剤、懸濁剤、シロップ剤、スラリー、乳剤などを挙げることができる。かかる液体製剤に用い得る液体担体としては、任意の適当な有機又は無機溶媒、例えば食塩水、緩衝生理食塩水（例えばリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水）、生理食塩水溶液などを挙げることができる。これらの溶媒は無菌化処理されたものが好ましい。
【0066】
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤中の「抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣ」の含有量としては、活性剤全体の約０．１～１００重量％、好ましくは約１～９９重量％、より好ましくは１０～９０重量％を挙げることができる。また、本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤中の「抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣ」の含有量を、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤１ｍＬ当たりの「抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣ」の個数で述べると、例えば１０５～１０７個／ｍＬ、５×１０５～５×１０６個／ｍＬなどを挙げることができる。
【0067】
（投与量）
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調節されるが、対象への１回の投与における薬剤中の「抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣ」の個数として、例えば１０５～１０７個、好ましくは５×１０５～５×１０６個を挙げることができる。このような投与を数日間、数週間又は数か月に１回ずつ、合計２回以上（例えば２～１０回）、反復投与することが好ましい。
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調節されるが、対象への１回の投与における薬剤中の「抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣ」の個数として、例えば１０５～１０７個、好ましくは５×１０５～５×１０６個を挙げることができる。このような投与を数日間、数週間又は数か月に１回ずつ、合計２回以上（例えば２～１０回）、反復投与することが好ましい。
【0068】
（投与方法）
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の投与方法としては、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化効果が得られる限り特に制限されないが、例えば皮下投与、皮内投与、筋肉内投与などを挙げることができ、中でも、皮下投与を好ましく挙げることができる。
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の投与方法としては、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化効果が得られる限り特に制限されないが、例えば皮下投与、皮内投与、筋肉内投与などを挙げることができ、中でも、皮下投与を好ましく挙げることができる。
【0069】
（投与対象）
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の投与対象は、感染対象由来ＰＢＭＣを採取した対象と同じであることが望ましい。この場合、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤は、拒絶反応を起こさずに、投与対象のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬを活性化することができる。
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の投与対象は、感染対象由来ＰＢＭＣを採取した対象と同じであることが望ましい。この場合、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤は、拒絶反応を起こさずに、投与対象のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬを活性化することができる。
【0070】
（本発明の用途）
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤は、ＨＴＬＶ－１疾患の患者において、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬを活性化することができ、その結果、ＨＴＬＶ－１疾患に対して治療効果を有すると考えられる。かかる治療効果には、ＨＴＬＶ－１疾患の症状を改善する効果や、ＨＴＬＶ－１疾患（特にＡＴＬ）が急性転化することを抑制する効果、化学療法後の再発を防止する効果などが含まれる。また、本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤は、ＨＴＬＶ－１疾患を発症していないものの、ＨＴＬＶ－Ｉに感染している対象において、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬを活性化することにより、ＨＴＬＶ－１疾患の発症抑制効果を有すると考えられる。
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤は、ＨＴＬＶ－１疾患の患者において、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬを活性化することができ、その結果、ＨＴＬＶ－１疾患に対して治療効果を有すると考えられる。かかる治療効果には、ＨＴＬＶ－１疾患の症状を改善する効果や、ＨＴＬＶ－１疾患（特にＡＴＬ）が急性転化することを抑制する効果、化学療法後の再発を防止する効果などが含まれる。また、本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤は、ＨＴＬＶ－１疾患を発症していないものの、ＨＴＬＶ－Ｉに感染している対象において、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬを活性化することにより、ＨＴＬＶ－１疾患の発症抑制効果を有すると考えられる。
【0071】
したがって、本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤（ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化用組成物）又は抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣは、ＨＴＬＶ－１感染に起因する疾患の改善剤（又は改善用医薬組成物）、ＨＴＬＶ－１感染に起因する疾患の急性転化抑制剤（又は急性転化抑制用医薬組成物）、ＨＴＬＶ－１感染に起因する疾患の発症抑制剤（又は発症抑制用医薬組成物）、ＨＴＬＶ－１感染に起因する疾患の予防又は治療剤（又は予防又は治療用医薬組成物）などとしても用いることができる。
【0072】
（ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化）
本発明において、「ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化」（ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬを活性化すること）とは、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬのＨＴＬＶ－１に対する細胞傷害活性を向上させることを意味し、例えば、本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤又は「抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣ」を投与した対象の体内において、抗原提示細胞（好ましくは樹状細胞）のクロスプレゼンテーションが誘導され、次いで、細胞傷害活性を持たないナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞からＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬが誘導されるなどして、前記対象の体内におけるＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬのＨＴＬＶ－１に対する細胞傷害活性を向上させることが含まれる。
本発明において、「ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化」（ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬを活性化すること）とは、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬのＨＴＬＶ－１に対する細胞傷害活性を向上させることを意味し、例えば、本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤又は「抗がん剤処理した培養感染ＰＢＭＣ」を投与した対象の体内において、抗原提示細胞（好ましくは樹状細胞）のクロスプレゼンテーションが誘導され、次いで、細胞傷害活性を持たないナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞からＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬが誘導されるなどして、前記対象の体内におけるＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬのＨＴＬＶ－１に対する細胞傷害活性を向上させることが含まれる。
【0073】
ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬのＨＴＬＶ－１に対する細胞傷害活性が向上しているとは、本来あるべきＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性が減弱している感染対象に対して、抗がん剤で処理した末梢血単核細胞を投与した場合、投与前と比較して、対象におけるＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬのＨＴＬＶ－１に対する細胞傷害活性が向上していることを意味する。
【0074】
（ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法）
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法としては、
（ａ）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程；及び、
（ｃ）前記工程（ｂ）で採取された末梢血単核細胞を薬学的に許容される担体と混合して製剤化する工程；
を有している限り特に制限されない。
本発明のＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤の製造方法としては、
（ａ）ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程；及び、
（ｃ）前記工程（ｂ）で採取された末梢血単核細胞を薬学的に許容される担体と混合して製剤化する工程；
を有している限り特に制限されない。
【0075】
上記の（ａ）の工程としては、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）に感染した対象から採取された末梢血単核細胞を動物細胞培養用培地で培養する工程である限り特に制限されない。かかる培養の方法は前述したとおりである。なお、かかる工程（ａ）の中でも、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血単核細胞をＣＤ３抗体、又は、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の両抗体で刺激した後、動物細胞培養用培地で培養する工程を好ましく挙げることができる。また、ＨＴＬＶ－１に感染した対象から採取された末梢血単核細胞からＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血単核細胞をＣＤ３抗体、又は、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の両抗体で刺激する方法としては、ＣＤ３抗体を付着したイムノビーズ又はＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体を付着したイムノビーズをＰＢＭＣ（ＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血単核細胞）の細胞数に対して０．３～２倍（好ましくは０．５～１．５倍、より好ましくは０．８～１．２倍）の個数となるように添加した本発明における動物細胞培養用培地中にて、ＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血単核細胞を培養する方法が挙げられる。
【0076】
上記の（ｂ）の工程としては、前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後、末梢血単核細胞を採取する工程である限り特に制限されない。かかる抗がん剤での処理方法、採取方法は前述したとおりである。
【0077】
上記の（ｂ）の工程としては、前記工程（ａ）の培養で得られた末梢血単核細胞を抗がん剤で処理した後に、ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合し得る抗体を接触させ、次いで、かかる末梢血単核細胞を採取する工程を好ましく挙げることができる。
【0078】
上記の（ｃ）の工程としては、前記工程（ｂ）で採取された末梢血単核細胞を薬学的に許容される担体と混合して製剤化する工程である限り特に制限されない。かかる方法は前述したとおりである。
【0079】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【0080】
試験１．［ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞の培養によるＴａｘ抗原発現誘導試験］
ＨＴＬＶ－１感染者（ＡＴＬ患者を含む）の末梢血中にはＨＴＬＶ－１に感染した単核細胞が存在する。しかし、末梢血から分離した直後の感染単核細胞では、ＨＴＬＶ－１抗原は全く検出されない。ＨＴＬＶ－１感染末梢血単核細胞をワクチン抗原として使うためには、ＨＴＬＶ－１のＴａｘ抗原の発現が必要である。そこで、ＨＴＬＶ－１感染末梢血単核細胞を培養することにより、Ｔａｘ抗原の発現がどのようになるかを調べるために以下の試験を行った。
ＨＴＬＶ－１感染者（ＡＴＬ患者を含む）の末梢血中にはＨＴＬＶ－１に感染した単核細胞が存在する。しかし、末梢血から分離した直後の感染単核細胞では、ＨＴＬＶ－１抗原は全く検出されない。ＨＴＬＶ－１感染末梢血単核細胞をワクチン抗原として使うためには、ＨＴＬＶ－１のＴａｘ抗原の発現が必要である。そこで、ＨＴＬＶ－１感染末梢血単核細胞を培養することにより、Ｔａｘ抗原の発現がどのようになるかを調べるために以下の試験を行った。
【0081】
（１）ＰＢＭＣの培養方法
２人の急性型ＡＴＬ（ａＡＴＬ）患者からそれぞれ末梢血を採取した。ヒトリンパ球比重分離液であるFicoll-Paque（登録商標）を用いた密度勾配法により、前述の末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をそれぞれ分離した。１０ｕ／ｍＬとなるようにｒｈＩＬ－２（「イムネース（Immunace）」（登録商標）、シオノギ製薬社製）を添加した１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）添加 ＲＰＭＩ １６４０培地（以下、「ＩＬ－２添加培地」と言う。）に、前述のＰＢＭＣをそのまま５×１０５個／ｍＬ添加し、数日間～数週間、ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて培養を行った。
２人の急性型ＡＴＬ（ａＡＴＬ）患者からそれぞれ末梢血を採取した。ヒトリンパ球比重分離液であるFicoll-Paque（登録商標）を用いた密度勾配法により、前述の末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をそれぞれ分離した。１０ｕ／ｍＬとなるようにｒｈＩＬ－２（「イムネース（Immunace）」（登録商標）、シオノギ製薬社製）を添加した１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）添加 ＲＰＭＩ １６４０培地（以下、「ＩＬ－２添加培地」と言う。）に、前述のＰＢＭＣをそのまま５×１０５個／ｍＬ添加し、数日間～数週間、ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて培養を行った。
【0082】
（２）ＣＤ８陽性細胞を除去したＰＢＭＣの培養方法
また、前述のＰＢＭＣをそのままＩＬ－２添加培地に添加することに代えて、前述のＰＢＭＣからＣＤ８陽性細胞を除去したＰＢＭＣをＩＬ－２添加培地に添加して、数日間～数週間、ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて培養を行った。なお、ＰＢＭＣからのＣＤ８陽性細胞の除去には、ＣＤ８抗体を付着させたイムノビーズ（「Dynabeads」（登録商標）、ThermoFisher社製）を用いた。
また、前述のＰＢＭＣをそのままＩＬ－２添加培地に添加することに代えて、前述のＰＢＭＣからＣＤ８陽性細胞を除去したＰＢＭＣをＩＬ－２添加培地に添加して、数日間～数週間、ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて培養を行った。なお、ＰＢＭＣからのＣＤ８陽性細胞の除去には、ＣＤ８抗体を付着させたイムノビーズ（「Dynabeads」（登録商標）、ThermoFisher社製）を用いた。
【0083】
（３）培養後のＰＢＭＣにおけるＴａｘ抗原の発現の確認
上記（１）の方法でａＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣを３日間培養した後、そのＰＢＭＣについてフローサイトメトリーを行い、ＰＢＭＣの細胞内のＴａｘタンパク質を検出した。フローサイトメトリーによるＴａｘタンパク質の検出方法は以下のとおりである。
上記（１）の方法でａＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣを３日間培養した後、そのＰＢＭＣについてフローサイトメトリーを行い、ＰＢＭＣの細胞内のＴａｘタンパク質を検出した。フローサイトメトリーによるＴａｘタンパク質の検出方法は以下のとおりである。
【0084】
３日間培養後のＰＢＭＣをPermeabilization/Fixation Buffer（eBioscience社製）で３０分間固定した後、Permeabilizing buffer（eBioscience社製）で洗浄した。これらのＰＢＭＣに一次抗体としてマウス抗ＨＴＬＶ－１ Ｔａｘ抗体ＬＴ－４（Lee B, Tanaka Y, Tozawa H. 1989. Monoclonal antibody defining tax protein of human T-cell leukemia virus type-I. Tohoku J Exp Med 157:1-11.）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。これらのＰＢＭＣを洗浄した後、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８－抗マウスＩｇＧ抗体を添加して、ＰＢＭＣを３０分間染色した。これらのＰＢＭＣを洗浄した後、細胞解析装置MACSQuant(Miltenyi Biotec社製)を用いてＰＢＭＣ内のＨＴＬＶ－１ Ｔａｘタンパク質を検出した（図１の右パネル（Ｄａｙ３））。
【0085】
一方、コントロールとして、上記（１）の方法におけるａＡＴＬ患者由来の、培養前のＰＢＭＣについて、同様のフローサイトメトリーを行って、ＰＢＭＣ内のＨＴＬＶ－１ Ｔａｘタンパク質を検出した（図１の左パネル（Ｄａｙ０））。
【0086】
図１の結果から分かるように、培養前のＰＢＭＣからはＴａｘタンパク質を全く検出することができなかったが、３日間培養後には約半数以上のＰＢＭＣからＴａｘタンパク質を検出することができた。これらの結果から、ａＡＴＬ患者のＰＢＭＣを培養すると、細胞内でのＴａｘ抗原の発現が誘導されることが示された。
【0087】
（４）ＰＢＭＣからのＣＤ８陽性細胞を除去することの影響
上記（１）の方法でａＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣを１日間培養した後、そのＰＢＭＣについて、上記（３）に記載の方法でフローサイトメトリーを行い、ＰＢＭＣの細胞内のＴａｘタンパク質を検出した。その結果を図２の左パネルに示す。
上記（１）の方法でａＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣを１日間培養した後、そのＰＢＭＣについて、上記（３）に記載の方法でフローサイトメトリーを行い、ＰＢＭＣの細胞内のＴａｘタンパク質を検出した。その結果を図２の左パネルに示す。
【0088】
また、上記（２）の方法でａＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣからＣＤ８陽性細胞を除去した後、かかるＰＢＭＣを上記（１）の方法で１日間培養した。かかるＰＢＭＣについて、上記（３）に記載の方法でフローサイトメトリーを行い、ＰＢＭＣの細胞内のＴａｘタンパク質を検出した。その結果を図２の右パネルに示す。
【0089】
図２の結果から分かるように、ＰＢＭＣからＣＤ８陽性細胞を除去してから１日間培養を行った場合の、Ｔａｘタンパク質が検出される細胞の割合（７．１５％）は、ＰＢＭＣをそのまま１日間培養を行った場合のその割合（５．３３％）よりも高かった。この結果から、感染対象ＰＢＭＣからＣＤ８陽性細胞を除去してから培養すると、ＨＴＬＶ－１由来の抗原であるＴａｘタンパク質を発現する細胞の割合が高くなる点で好ましいことが示された。
【0090】
（５）ＣＤ８陽性細胞を除去したＰＢＭＣのより長期間の培養
上記（２）と同様の方法で慢性ＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣからＣＤ８陽性細胞を除去した後、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体を付着させたイムノビーズ（Dynabeads, ThermoFisher社製）を培地にＰＢＭＣと同数加えてＰＢＭＣを刺激した後、かかるＰＢＭＣを上記（１）の方法で２４日間培養した。かかるＰＢＭＣについて、上記（３）に記載の方法でフローサイトメトリーを行い、ＰＢＭＣの細胞内のＴａｘタンパク質を検出した。その結果を図３に示す。
上記（２）と同様の方法で慢性ＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣからＣＤ８陽性細胞を除去した後、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体を付着させたイムノビーズ（Dynabeads, ThermoFisher社製）を培地にＰＢＭＣと同数加えてＰＢＭＣを刺激した後、かかるＰＢＭＣを上記（１）の方法で２４日間培養した。かかるＰＢＭＣについて、上記（３）に記載の方法でフローサイトメトリーを行い、ＰＢＭＣの細胞内のＴａｘタンパク質を検出した。その結果を図３に示す。
【0091】
図３の結果から分かるように、ＰＢＭＣからＣＤ８陽性細胞を除去してから２４日間培養を行うと、約６０％以上のＰＢＭＣからＴａｘタンパク質を検出することができた。
【0092】
（６）ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤の影響
これまでに、本発明者らは、ＡＴＬ患者のＰＢＭＣを、３０ｕ／ｍＬのＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２；Peprotec社製）又は１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（ｒｈＩＬ－１５；Peprotec社製）存在下で長期培養することにより、Ｔａｘタンパク質を発現したＴ細胞株を樹立した（J Virol 79:10088-10092や、PLoS Pathog. 2017 Sep 14;13(9):e1006597.）。本発明者らが樹立したそのような細胞株のうち、ＩＬＴ－Ａ株とＩＬＴ－Ｂ株を用意した。ＩＬＴ－Ａ株は急性ＡＴＬ患者のＰＢＭＣ由来のＩＬ－１５依存性細胞株であり、ＩＬＴ－Ｂ株は慢性ＡＴＬ患者のＰＢＭＣ由来のＩＬ－２依存性細胞株である。抗がん作用が知られているヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤が、ＩＬＴ－Ａ細胞やＩＬＴ－Ｂ細胞を培養した際のＴａｘタンパク質の発現にどのような影響を与えるか確認を試みた。
これまでに、本発明者らは、ＡＴＬ患者のＰＢＭＣを、３０ｕ／ｍＬのＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２；Peprotec社製）又は１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（ｒｈＩＬ－１５；Peprotec社製）存在下で長期培養することにより、Ｔａｘタンパク質を発現したＴ細胞株を樹立した（J Virol 79:10088-10092や、PLoS Pathog. 2017 Sep 14;13(9):e1006597.）。本発明者らが樹立したそのような細胞株のうち、ＩＬＴ－Ａ株とＩＬＴ－Ｂ株を用意した。ＩＬＴ－Ａ株は急性ＡＴＬ患者のＰＢＭＣ由来のＩＬ－１５依存性細胞株であり、ＩＬＴ－Ｂ株は慢性ＡＴＬ患者のＰＢＭＣ由来のＩＬ－２依存性細胞株である。抗がん作用が知られているヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤が、ＩＬＴ－Ａ細胞やＩＬＴ－Ｂ細胞を培養した際のＴａｘタンパク質の発現にどのような影響を与えるか確認を試みた。
【0093】
上記（１）又は（６）に記載のＩＬ－２またはＩＬ－１５添加培地に、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）を添加して、０．５μＭのＳＡＨＡを含むＳＡＨＡ含有培地を調製した。また、上記（１）又は（６）に記載のＩＬ－２またはＩＬ－１５添加培地に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して、０．００１重量％のＤＭＳＯを含むＤＭＳＯ含有培地（コントロール培地）を調製した。
【0094】
ＩＬＴ－Ａ細胞を、ＳＡＨＡ含有培地とコントロール培地にてそれぞれ２日間、ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて培養を行った。かかるＩＬＴ－Ａ細胞について上記（３）に記載の方法でフローサイトメトリーを行い、ＩＬＴ－Ａ細胞内のＴａｘタンパク質を検出した。ＩＬＴ－Ａ細胞に代えて、ＩＬＴ－Ｂ細胞を用いて同様の実験を行い、ＩＬＴ－Ｂ細胞内のＴａｘタンパク質を検出した。これらの結果を図４に示す。図４の結果から、ＰＢＭＣ細胞株をＨＤＡＣ阻害剤の存在下で培養すると、ＨＤＡＣ阻害剤非存在下で培養した場合と比較して、Ｔａｘタンパク質発現の誘導効率が向上することが示された。
【0095】
試験２．［ＨＴＬＶ－１感染細胞による抗原のクロスプレゼンテーションの誘導］
一般に、ＣＤ８＋ＣＴＬの応答を活性化させるためには、抗原を貪食した抗原提示細胞が活性化し、副刺激分子（ＣＤ８６等）の発現やＩＬ－１２等のサイトカイン産生を行うと共に、抗原ペプチドをＭＨＣクラスII分子だけでなくＭＨＣクラスＩ分子にも提示すること（すなわち、「抗原のクロスプレゼンテーション」）が必要である。そこで、本発明者らは、クロスプレゼンテーションが生じているかのin vitroでの評価系について検討し、かかる評価系を構築した（図５）。この評価系では、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）とＭＨＣ－Ｉの一致する抗原提示細胞（ＴＨＰ１）を用いる。そして、そのＣＴＬやその抗原提示細胞とは、ＭＨＣの一致しないＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞（ＩＬＴ－Ａ又はＩＬＴ－Ｂ）を、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）（抗がん剤の１種）で処理したものを、前述のＣＴＬ及び抗原提示細胞と共培養する。かかる共培養中に、抗原提示細胞がＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞を取り込み、ＨＴＬＶ－１由来のＴａｘ抗原をＭＨＣ－Ｉ上に提示（クロスプレゼンテーション）した場合には、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬが提示されたＴａｘ抗原を認識し、培養液中にＩＦＮ－γを産生する。培養液の上清中のＩＦＮ－γ濃度の高さで、プレゼンテーションによりＣＴＬが活性化した程度を評価することができる。この評価系によるクロスプレゼンテーションの評価は、具体的に以下の方法で行った。
一般に、ＣＤ８＋ＣＴＬの応答を活性化させるためには、抗原を貪食した抗原提示細胞が活性化し、副刺激分子（ＣＤ８６等）の発現やＩＬ－１２等のサイトカイン産生を行うと共に、抗原ペプチドをＭＨＣクラスII分子だけでなくＭＨＣクラスＩ分子にも提示すること（すなわち、「抗原のクロスプレゼンテーション」）が必要である。そこで、本発明者らは、クロスプレゼンテーションが生じているかのin vitroでの評価系について検討し、かかる評価系を構築した（図５）。この評価系では、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）とＭＨＣ－Ｉの一致する抗原提示細胞（ＴＨＰ１）を用いる。そして、そのＣＴＬやその抗原提示細胞とは、ＭＨＣの一致しないＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞（ＩＬＴ－Ａ又はＩＬＴ－Ｂ）を、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）（抗がん剤の１種）で処理したものを、前述のＣＴＬ及び抗原提示細胞と共培養する。かかる共培養中に、抗原提示細胞がＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞を取り込み、ＨＴＬＶ－１由来のＴａｘ抗原をＭＨＣ－Ｉ上に提示（クロスプレゼンテーション）した場合には、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬが提示されたＴａｘ抗原を認識し、培養液中にＩＦＮ－γを産生する。培養液の上清中のＩＦＮ－γ濃度の高さで、プレゼンテーションによりＣＴＬが活性化した程度を評価することができる。この評価系によるクロスプレゼンテーションの評価は、具体的に以下の方法で行った。
【0096】
ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬとしては、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬであるＴｃ－Ｍ１株を用いた。Ｔｃ－Ｍ１株は、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者のＰＢＭＣを１００ｕ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２存在下で培養し、自家ＨＴＬＶ－１感染細胞で２週間隔にて繰り返し刺激することにより誘導して得られた細胞株である（International immunology 3:761-767）。ＨＬＡ－Ａ２陽性の抗原提示細胞としては、ヒト単球由来ＴＨＰ１細胞株（Virology 318:17-23）を用いた。抗原細胞としては、「ＨＬＡ－Ａ２を持たないＩＬＴ－Ａ細胞（ＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞株）をＩＬ－１５添加培地で２日間培養後、５０μｇ／ｍＬのＭＭＣ（協和発酵キリン社製）（抗がん剤の１種）で３７℃、３０分間処理した後、洗浄した細胞」（以下、単に「ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞」とも表示する。）、あるいは、「ＨＬＡ－Ａ２を持たないＩＬＴ－Ａ細胞（ＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞株）をＩＬ－１５添加培地で２日間培養後、１重量％ホルマリンで１５分間処理した後、洗浄した細胞」を用いた。
【0097】
ＨＬＡ－Ａ２を持たない前述の抗原細胞を、ＨＬＡ－Ａ２陽性のＴＨＰ１細胞株と１６～２０時間共培養した。かかる共培養で得られた全細胞を１重量％ホルマリン水溶液で室温にて１５分間固定した後、洗浄した細胞を、２５ｕ／ｍＬのＩＬ－２と１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、前述のＨＬＡ－Ａ２拘束性ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）と１６時間共培養した。共培養して得られた培養液の上清を回収し、かかる上清中のＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡ（BD OptiEIA（登録商標））で測定した。そしてそのＩＦＮ－γ濃度を、ＣＴＬ活性の指標とした。
【0098】
なお、コントロール実験の１つとして、抗原細胞と抗原提示細胞との共培養を行わずに、抗原細胞を前述のＨＬＡ－Ａ２拘束性ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）と１６時間共培養し、得られた培養液の上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定した。
【0099】
これらのＩＦＮ－γ濃度の測定結果を図６に示す。図６において、「ILT-MMC alone」は、始めの培養として、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞（ＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞株）のみをＣＴＬと共培養した場合の培養液上清中のＩＦＮ－γ濃度を表し、「ILT-Formalin alone」は、始めの培養として、ホルマリン処理したＩＬＴ－Ａ細胞（ＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞株）のみをＣＴＬと共培養した場合のＩＦＮ－γ濃度を表し、「THP1 alone」は、始めの培養として、抗原提示細胞であるＴＨＰ１細胞のみをＣＴＬと共培養した場合のＩＦＮ－γ濃度を表し、「ILT-MMC+THP1」は、始めの培養として、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞と、ＴＨＰ１細胞（抗原提示細胞）を培養した場合のＣＴＬが産生するＩＦＮ－γ濃度を表し、「ILT-Formalin+THP1」は、始めの培養として、ホルマリン処理したＩＬＴ－Ａ細胞と、ＴＨＰ１細胞（抗原提示細胞）を培養した場合のＣＴＬが産生するＩＦＮ－γ濃度を表し、「None (CLT alone)」は、始めの培養の際にＩＬＴ－Ａ細胞もＴＨＰ１細胞（抗原提示細胞）も培養しなかった場合（すなわち、ＣＴＬであるＴｃ－Ｍ１のみを培養した場合）のＩＦＮ－γ濃度を表す。
【0100】
図６の結果から以下のことが示された。
ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）は、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞とのみ共培養しても、ほとんど活性化しない。また、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）は、ＴＨＰ１細胞（抗原提示細胞）とのみ共培養しても、ほとんど活性化しない。しかし、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）は、「ＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞を共培養した細胞」と共培養すると活性化する（ＩＦＮ－γを産生する）。これらのことから、ＭＭＣ処理したＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞（例えばＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞）を、抗原提示細胞（例えばＴＨＰ１細胞）と共培養すると、抗原提示細胞はＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞を取り込み、ＨＴＬＶ－１由来のＴａｘ抗原をＭＨＣ－Ｉ上に提示していると考えられた。すなわち、抗原提示細胞は、Ｔａｘ抗原をクロスプレゼンテーションしていると考えられた。
なお、図６の「ILT-Formalin+THP1」の結果から分かるように、「ホルマリン固定したＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞と抗原提示細胞を共培養した細胞」と、ＣＴＬとを共培養しても、ＣＴＬはほとんど活性化しなかった。
ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）は、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞とのみ共培養しても、ほとんど活性化しない。また、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）は、ＴＨＰ１細胞（抗原提示細胞）とのみ共培養しても、ほとんど活性化しない。しかし、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）は、「ＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞を共培養した細胞」と共培養すると活性化する（ＩＦＮ－γを産生する）。これらのことから、ＭＭＣ処理したＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞（例えばＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞）を、抗原提示細胞（例えばＴＨＰ１細胞）と共培養すると、抗原提示細胞はＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞を取り込み、ＨＴＬＶ－１由来のＴａｘ抗原をＭＨＣ－Ｉ上に提示していると考えられた。すなわち、抗原提示細胞は、Ｔａｘ抗原をクロスプレゼンテーションしていると考えられた。
なお、図６の「ILT-Formalin+THP1」の結果から分かるように、「ホルマリン固定したＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞と抗原提示細胞を共培養した細胞」と、ＣＴＬとを共培養しても、ＣＴＬはほとんど活性化しなかった。
【0101】
試験３．［ＨＴＬＶ－１中和抗体及び逆転写酵素阻害剤の影響］
前述の試験２において、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）は、「ＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞を共培養した細胞」と共培養すると活性化する（ＩＦＮ－γを産生する）ことが示された。試験２におけるこの現象が、ＨＴＬＶ－１感染細胞であるＩＬＴ－Ａ細胞から抗原提示細胞へＨＴＬＶ－１が新たに感染し、その新たな感染細胞から生じるＨＴＬＶ－１抗原の結果ではないことを確認するために、ＨＴＬＶ－１の新たな感染をＨＴＬＶ－１中和抗体又は逆転写酵素阻害剤で阻害した上で、試験２のクロスプレゼンテーションの評価試験を行った。具体的には以下のような実験を行い、ＨＴＬＶ－１感染細胞によるＴａｘ抗原のクロスプレゼンテーション惹起効率に対して、ＨＴＬＶ－１中和抗体や逆転写酵素阻害剤がどのような影響を与えるかを調べた。
前述の試験２において、ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）は、「ＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞を共培養した細胞」と共培養すると活性化する（ＩＦＮ－γを産生する）ことが示された。試験２におけるこの現象が、ＨＴＬＶ－１感染細胞であるＩＬＴ－Ａ細胞から抗原提示細胞へＨＴＬＶ－１が新たに感染し、その新たな感染細胞から生じるＨＴＬＶ－１抗原の結果ではないことを確認するために、ＨＴＬＶ－１の新たな感染をＨＴＬＶ－１中和抗体又は逆転写酵素阻害剤で阻害した上で、試験２のクロスプレゼンテーションの評価試験を行った。具体的には以下のような実験を行い、ＨＴＬＶ－１感染細胞によるＴａｘ抗原のクロスプレゼンテーション惹起効率に対して、ＨＴＬＶ－１中和抗体や逆転写酵素阻害剤がどのような影響を与えるかを調べた。
【0102】
（１）ＨＴＬＶ－１中和抗体による影響
ＨＴＬＶ－１感染者の血中には高濃度のＨＴＬＶ－１中和抗体が含まれており、ＨＴＬＶ－１抗原を発現した細胞に結合することが予想される。抗ＣＣＲ４抗体であるモガムリズマブ（商品名ポテリジオ（登録商標）；協和発酵キリン社製）も同様にＨＴＬＶ－１感染細胞に結合する。ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合するこれらの抗体による影響を調べるために以下の実験を行った。
ＨＴＬＶ－１感染者の血中には高濃度のＨＴＬＶ－１中和抗体が含まれており、ＨＴＬＶ－１抗原を発現した細胞に結合することが予想される。抗ＣＣＲ４抗体であるモガムリズマブ（商品名ポテリジオ（登録商標）；協和発酵キリン社製）も同様にＨＴＬＶ－１感染細胞に結合する。ＨＴＬＶ－１感染細胞に結合するこれらの抗体による影響を調べるために以下の実験を行った。
【0103】
ＩＬＴ－Ａ細胞をＩＬ－１５添加培地で２日間培養後、５０μｇ／ｍＬのＭＭＣ（協和発酵キリン社製）（抗がん剤の１種）で３７℃、３０分間処理した後、洗浄することによって、「ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞（ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞）」を得た。一方、ＡＴＬ患者３例、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者３例及び非感染者２例の血漿（plasma）をそれぞれ０．５重量％含む水溶液を調製し、血漿水溶液とした。かかる血漿水溶液中に前述の「ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞」をそれぞれ約１０５cellずつ添加して、血漿中の抗体とＩＬＴ－Ａ細胞を接触させた。ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞を洗浄した後、約１０５cellずつのＴＨＰ１細胞と共培養した。かかる共培養で得られた全細胞を１重量％ホルマリン水溶液で室温にて１５分間固定した後、洗浄した細胞を、前述のＨＬＡ－Ａ２拘束性ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）と１６時間共培養した。共培養して得られた培養液の上清を回収し、かかる上清中のＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡ（BD OptiEIA（登録商標））で測定した。そしてそのＩＦＮ－γ濃度を、ＣＴＬ活性の指標とした。
【0104】
また、患者等の血漿を０．５重量％含む水溶液に代えて、抗ＣＣＲ４抗体であるモガムリズマブ（商品名ポテリジオ（登録商標）；協和発酵キリン社製）を１０μｇ／ｍＬ含む水溶液を用いて同様の実験を行い、上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定した。
【0105】
これらの実験でＩＦＮ－γ濃度を測定した結果を図７に示す。図７の結果から分かるように、ＨＴＬＶ－１感染者の血漿で処理した場合（図７の「ATL-1」、「ATL-2」、「ATL-3」、「HAM-1」、「HAM-2」、「HAM-3」）や、抗ＣＣＲ４抗体で処理した場合（図７の「Poteligeo」）に、ＩＦＮ－γ濃度が有意に低下するということはなかった。これらの結果から、ＨＴＬＶ－１感染細胞によるＴａｘ抗原のクロスプレゼンテーションの誘導は、ＨＴＬＶ－１の新たな感染によるものではないことが示された。また、ＨＴＬＶ－１感染者の血漿で処理した場合（図７の「ATL-1」、「ATL-2」、「ATL-3」、「HAM-1」、「HAM-2」、「HAM-3」）と、非感染者の血漿で処理した場合（図７の「SN-1」、「SN-2」）と、抗ＣＣＲ４抗体で処理した場合（図７の「Poteligeo」）とで、有意な差までは認められなかった。
【0106】
（２）「ＭＭＣ処理ILT-A細胞」とＴＨＰ１細胞の細胞数の比率の影響
ILT-A細胞をＩＬ－１５添加培地で２日間培養後（前述）、５０μｇ／ｍＬのＭＭＣ（協和発酵キリン社製）（抗がん剤の１種）で３７℃、３０分間処理した後、洗浄することによって、「ＭＭＣ処理したILT-A細胞（ＭＭＣ処理ILT-A細胞）」を得た。
「ＭＭＣ処理ILT-A細胞」とＴＨＰ１細胞を共培養する際の、そのＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞の細胞数の比率を、１：１又は０．５：１又は０．２５：１として、上記の「（１）ＨＴＬＶ－１中和抗体による影響」と同様の方法でＩＦＮ－γ濃度を測定した。その際、ＡＬＴ患者の血漿として、ＡＴＬ－１の血漿を用いた。
ILT-A細胞をＩＬ－１５添加培地で２日間培養後（前述）、５０μｇ／ｍＬのＭＭＣ（協和発酵キリン社製）（抗がん剤の１種）で３７℃、３０分間処理した後、洗浄することによって、「ＭＭＣ処理したILT-A細胞（ＭＭＣ処理ILT-A細胞）」を得た。
「ＭＭＣ処理ILT-A細胞」とＴＨＰ１細胞を共培養する際の、そのＩＬＴ－Ａ細胞とＴＨＰ１細胞の細胞数の比率を、１：１又は０．５：１又は０．２５：１として、上記の「（１）ＨＴＬＶ－１中和抗体による影響」と同様の方法でＩＦＮ－γ濃度を測定した。その際、ＡＬＴ患者の血漿として、ＡＴＬ－１の血漿を用いた。
【0107】
これらの実験の結果を図８に示す。横軸は、ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞数を表し、左から１～３番目の棒グラフはＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞が１０５個（cell）（すなわち、前述の比率が１：１）の場合の結果を表し、左から４～６番目の棒グラフはＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞５×１０４個（cell）（すなわち、前述の比率が０．５：１）の場合の結果を表し、右から１～３番目の棒グラフが２.５×１０４個（cell）（すなわち、前述の比率が０．２５：１）の場合の結果を表す。また、図８において、黒塗りの棒グラフ（「MMC-ILT/(+)plasma」）は、「ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞」とＨＴＬＶ－１感染者の血漿を接触させた場合の結果を表し、グレーの棒グラフ（「MMC-ILT/(-)plasma」）は、「ＭＭＣ処理ILT-A細胞」に非感染者の血漿を接触させた場合の結果を表し、白抜きの棒グラフ（「MMC-ILT」）は、「ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞」にＨＴＬＶ－１感染者の血漿を接触させなかった場合の結果を表す。
【0108】
図８の結果から、ILT-A細胞をＨＴＬＶ－１感染者の血漿により処理すると、ＣＴＬ活性化効果がある程度増加する傾向が認められた。また、この傾向は、標的細胞である「ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞」の数が、抗原提示細胞の数に対して比較的少ない場合（図８の「５～２．５×１０４」）により強く認められた。なお、ＩＬＴ－Ａ細胞をＨＴＬＶ－１感染者の血漿により処理するとＣＴＬ活性化効果が増加することは、ＩＬＴ－Ａ細胞に感染者の血漿中の抗ＨＴＬＶ－１抗体が結合することによるオプソニン効果の結果であると考えられた。
【0109】
（３）逆転写酵素阻害剤による影響
逆転写酵素阻害剤として、ジドブジン（Zidovudine:ＡＺＴ）（商品名レトロビル（登録商標）、グラクソスミスクライン社製）を用いた。２０μＭのＡＺＴを含む培地中で、抗原提示細胞であるＴＨＰ１細胞を３７℃で１時間、前培養した。一方、ＩＬＴ－Ａ細胞をＩＬ－１５添加培地で２日間培養後、５０μｇ／ｍＬのＭＭＣ（協和発酵キリン社製）（抗がん剤の１種）で３７℃、３０分間処理した後、洗浄することによって、「ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞（ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞）」を得た。前述の前培養を行ったＴＨＰ１細胞の培地中に、ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞を添加して３７℃で１６時間共培養した。なお、共培養の際の培地中のＡＺＴ濃度は１０μＭであった。かかる共培養で得られた全細胞を１重量％ホルマリン水溶液で室温にて１５分間固定した後、洗浄した細胞を、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）と１６時間共培養した。共培養して得られた培養液の上清を回収し、かかる上清中のＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡ（BD OptiEIA（登録商標））で測定した。そしてそのＩＦＮ－γ濃度を、ＣＴＬ活性の指標とした。
逆転写酵素阻害剤として、ジドブジン（Zidovudine:ＡＺＴ）（商品名レトロビル（登録商標）、グラクソスミスクライン社製）を用いた。２０μＭのＡＺＴを含む培地中で、抗原提示細胞であるＴＨＰ１細胞を３７℃で１時間、前培養した。一方、ＩＬＴ－Ａ細胞をＩＬ－１５添加培地で２日間培養後、５０μｇ／ｍＬのＭＭＣ（協和発酵キリン社製）（抗がん剤の１種）で３７℃、３０分間処理した後、洗浄することによって、「ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞（ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞）」を得た。前述の前培養を行ったＴＨＰ１細胞の培地中に、ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ａ細胞を添加して３７℃で１６時間共培養した。なお、共培養の際の培地中のＡＺＴ濃度は１０μＭであった。かかる共培養で得られた全細胞を１重量％ホルマリン水溶液で室温にて１５分間固定した後、洗浄した細胞を、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）と１６時間共培養した。共培養して得られた培養液の上清を回収し、かかる上清中のＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡ（BD OptiEIA（登録商標））で測定した。そしてそのＩＦＮ－γ濃度を、ＣＴＬ活性の指標とした。
【0110】
これらのＩＦＮ－γ濃度の測定結果を図９に示す。右から１～３番目の棒グラフはＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞（ＩＬＴ－Ａ細胞）が１０５個（cell）（すなわち、前述の比率が１：１）の場合の結果を表し、右から４～６番目の棒グラフはＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞（ＩＬＴ－Ａ細胞）が３×１０４個（cell）（すなわち、前述の比率が０．３：１）の場合の結果を表し、左から１～３番目の棒グラフはＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞（ＩＬＴ－Ａ細胞）を用いなかった場合の結果を表す。また、図９において、黒塗りの棒グラフ（「THP1-AZT」）は、培地にＡＺＴを添加してＴＨＰ１細胞等を培養した場合の結果を表し、グレーの棒グラフ（「THP1」）は、培地にＡＺＴを添加しなかった場合の結果を表し、白抜きの棒グラフ（「Medium」）はＴＨＰ１細胞を用いなかった場合の結果を表す。
【0111】
図９の結果から分かるように、ＡＺＴ処理の有無により、ＣＴＬ活性には大きな影響は認められなかった。これらの結果から、ＨＴＬＶ－１感染細胞によるＴａｘ抗原のクロスプレゼンテーションの誘導は、ＨＴＬＶ－１の新たな感染によるものではないことが示された。
【0112】
試験４．［抗原提示細胞における副刺激分子の発現の、ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞による増強］
樹状細胞等の抗原提示細胞がＴ細胞を活性化させるためには、ＣＤ８３、ＣＤ８６等の副刺激シグナルを表出することが必要とされている（例えば、Leukemia & lymphoma 38:247-263）。そこで、ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ細胞（ＡＴＬ患者ＰＢＭＣを長期培養したＨＴＬＶ－１感染細胞株）が、抗原提示細胞上の副刺激分子の発現を増強するかを調べるために、以下の実験を行った。
樹状細胞等の抗原提示細胞がＴ細胞を活性化させるためには、ＣＤ８３、ＣＤ８６等の副刺激シグナルを表出することが必要とされている（例えば、Leukemia & lymphoma 38:247-263）。そこで、ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ細胞（ＡＴＬ患者ＰＢＭＣを長期培養したＨＴＬＶ－１感染細胞株）が、抗原提示細胞上の副刺激分子の発現を増強するかを調べるために、以下の実験を行った。
【0113】
（１）健常人のＰＢＭＣ由来の未熟樹状細胞
抗原提示細胞としては、抗原を取り込む能力を未だ保持している未熟樹状細胞を用いた。この未熟樹状細胞は、１０％ＦＣＳ添加 ＲＰＭＩ１６４０培地をプラスチックプレートに入れ、その培地中で健常人のＰＢＭＣを２時間培養した後、プラスチックプレートに接着した単球細胞にｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Miltenyi Biotec社製）（培地中の最終濃度１０００ｕ／ｍＬ）及びｒｈＩＬ－４（Miltenyi Biotec社製）（培地中の最終濃度５００ｕ／ｍＬ）を添加し、５日間培養して得られた未熟樹状細胞（以下、「健常人未熟樹状細胞」とも表示する。）である。
抗原提示細胞としては、抗原を取り込む能力を未だ保持している未熟樹状細胞を用いた。この未熟樹状細胞は、１０％ＦＣＳ添加 ＲＰＭＩ１６４０培地をプラスチックプレートに入れ、その培地中で健常人のＰＢＭＣを２時間培養した後、プラスチックプレートに接着した単球細胞にｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Miltenyi Biotec社製）（培地中の最終濃度１０００ｕ／ｍＬ）及びｒｈＩＬ－４（Miltenyi Biotec社製）（培地中の最終濃度５００ｕ／ｍＬ）を添加し、５日間培養して得られた未熟樹状細胞（以下、「健常人未熟樹状細胞」とも表示する。）である。
【0114】
（２）副刺激分子の発現の評価
ＩＬＴ－Ｃ２２細胞（ＨＬＡ－Ａ２陽性）をＩＬ－２添加培地で２日間培養後、５０μｇ／ｍＬのＭＭＣ（協和発酵キリン社製）（抗がん剤の１種）で３７℃、３０分間処理した後、洗浄することによって、「ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ｃ細胞（ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ細胞）」を得た。次に、前述の健常人未熟樹状細胞（ＨＬＡ－Ａ２陰性）とＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株とを、１０％ＦＣＳ添加 ＲＰＭＩ１６４０培地で２４時間共培養した後、ＦＩＴＣ標識ＨＬＡ－Ａ２抗体（「BD 551285」；ベクトン・ディッキンソン社製）と、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識抗ヒトＣＤ８３抗体（「305320」；Biolegend社製）又はＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識抗ヒトＣＤ８６抗体（「BD 561129」；ベクトン・ディッキンソン社製）とを用いて氷上で３０分間染色し、洗浄後、フローサイトメーターMACSQuant（登録商標）（Miltenyi Biotec社製）を用いたフローサイトメトリーでＨＬＡ－Ａ２陰性樹状細胞分画のＣＤ８３及びＣＤ８６の発現強度を測定した。また、ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株を用いないこと以外は同じ方法（すなわち、ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株と共培養しない健常人未熟樹状細胞を用いた方法）で、ＣＤ８３及びＣＤ８６の発現強度を測定した。なお、ＨＬＡ－Ａ２発現の有無により、樹状細胞とＩＬＴ－Ｃ細胞を区別した。
ＩＬＴ－Ｃ２２細胞（ＨＬＡ－Ａ２陽性）をＩＬ－２添加培地で２日間培養後、５０μｇ／ｍＬのＭＭＣ（協和発酵キリン社製）（抗がん剤の１種）で３７℃、３０分間処理した後、洗浄することによって、「ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ｃ細胞（ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ細胞）」を得た。次に、前述の健常人未熟樹状細胞（ＨＬＡ－Ａ２陰性）とＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株とを、１０％ＦＣＳ添加 ＲＰＭＩ１６４０培地で２４時間共培養した後、ＦＩＴＣ標識ＨＬＡ－Ａ２抗体（「BD 551285」；ベクトン・ディッキンソン社製）と、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識抗ヒトＣＤ８３抗体（「305320」；Biolegend社製）又はＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識抗ヒトＣＤ８６抗体（「BD 561129」；ベクトン・ディッキンソン社製）とを用いて氷上で３０分間染色し、洗浄後、フローサイトメーターMACSQuant（登録商標）（Miltenyi Biotec社製）を用いたフローサイトメトリーでＨＬＡ－Ａ２陰性樹状細胞分画のＣＤ８３及びＣＤ８６の発現強度を測定した。また、ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株を用いないこと以外は同じ方法（すなわち、ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株と共培養しない健常人未熟樹状細胞を用いた方法）で、ＣＤ８３及びＣＤ８６の発現強度を測定した。なお、ＨＬＡ－Ａ２発現の有無により、樹状細胞とＩＬＴ－Ｃ細胞を区別した。
【0115】
これらの測定結果を図１０に示す。ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株を用いなかった場合の健常人未熟樹状細胞と比較して、ＭＭＣ処理ＩＬＴ－Ｃ株と共培養した健常人未熟樹状細胞では、ＣＤ８３の発現が軽度に増加し（図１０の左上パネル及び左下パネル）、ＣＤ８６の発現は大幅に増加した（図１０の右上パネル及び右下パネル）。これらの結果から、ＭＭＣ処理ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞と未熟樹状細胞を共培養すると、ＭＭＣ処理ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞が未熟樹状細胞を刺激して、ＣＤ８３やＣＤ８６等の副刺激分子の発現を増強させることが示された。
【0116】
試験５．［抗原提示細胞におけるＩＬ－１２の発現の、ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞による増強］
抗原提示細胞からＩＬ－１２が産生されることは、抗原提示の際に免疫環境をＴｈ１型に傾け、ＣＴＬを誘導する上で重要であるとされている（Therapeutic immunology 1:187-196.）。そこで、抗原提示細胞を、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞又はＩＬＴ－Ｂ細胞と共培養することにより、抗原提示細胞におけるＩＬ－１２産生にどのような影響が生じるかを調べるために、以下の実験を行った。
抗原提示細胞からＩＬ－１２が産生されることは、抗原提示の際に免疫環境をＴｈ１型に傾け、ＣＴＬを誘導する上で重要であるとされている（Therapeutic immunology 1:187-196.）。そこで、抗原提示細胞を、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞又はＩＬＴ－Ｂ細胞と共培養することにより、抗原提示細胞におけるＩＬ－１２産生にどのような影響が生じるかを調べるために、以下の実験を行った。
【0117】
（１）抗原提示細胞におけるＩＬ－１２の発現の、ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞の薬剤処理による影響
ＩＬ－１５またはＩＬ－２を含む１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）添加 ＲＰＭＩ １６４０培地に、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）を添加して、０．５μＭのＳＡＨＡを含むＳＡＨＡ含有培地を調製した。また、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）添加 ＲＰＭＩ １６４０培地に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して、０．００１重量％のＤＭＳＯを含むＤＭＳＯ含有培地（コントロール培地）を調製した。
ＩＬ－１５またはＩＬ－２を含む１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）添加 ＲＰＭＩ １６４０培地に、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）を添加して、０．５μＭのＳＡＨＡを含むＳＡＨＡ含有培地を調製した。また、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）添加 ＲＰＭＩ １６４０培地に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して、０．００１重量％のＤＭＳＯを含むＤＭＳＯ含有培地（コントロール培地）を調製した。
【0118】
ＩＬＴ－Ａ細胞又はＩＬＴ－Ｂ細胞を、ＳＡＨＡ含有培地又はＤＭＳＯ含有培地（コントロール培地）で２４時間、ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて培養を行った。培養して得られた細胞を、５０μｇ／ｍＬのＭＭＣ（協和発酵キリン社製）で３７℃３０分間処理した後、洗浄した。このＭＭＣ処理ＩＬＴ細胞（すなわち、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞又はＩＬＴ－Ｂ細胞）をＨＬＡ－Ａ２陽性健常人未熟樹状細胞（ＤＣ）と３７℃で２０時間共培養した。かかる共培養後の培地の上清を分取し、上清中のＩＬ－１２濃度をＥＬＩＳＡ（BD OptiEIA（登録商標））で測定した。これらの結果を図１１の「ＤＣ」にそれぞれ示す。
また、コントロールとして、前述のＭＭＣ処理ＩＬＴ細胞（すなわち、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞又はＩＬＴ－Ｂ細胞）を、健常人未熟樹状細胞（ＤＣ）と共にではなく、３７℃で２０時間培養した。かかる培養後の培地の上清を分取し、上清中のＩＬ－１２濃度（ｐｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡ（BD OptiEIA（登録商標））で測定した。これらの結果を図１１の「Medium」にそれぞれ示す。
また、コントロールとして、前述のＭＭＣ処理ＩＬＴ細胞（すなわち、ＭＭＣ処理したＩＬＴ－Ａ細胞又はＩＬＴ－Ｂ細胞）を、健常人未熟樹状細胞（ＤＣ）と共にではなく、３７℃で２０時間培養した。かかる培養後の培地の上清を分取し、上清中のＩＬ－１２濃度（ｐｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡ（BD OptiEIA（登録商標））で測定した。これらの結果を図１１の「Medium」にそれぞれ示す。
【0119】
ＤＭＳＯ含有培地で培養したＩＬＴ－Ｂ細胞をＭＭＣ処理した後、洗浄し、樹状細胞と共培養した場合は、培地の上清に約１２０ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１２産生が検出されたが（図１１の「ILT-B」の「DMSO」の黒塗りの棒グラフ（「DC」））、ＤＭＳＯ含有培地で培養したＩＬＴ－Ａ細胞をＭＭＣ処理した後、洗浄し、樹状細胞と共培養した場合は、培地の上清中のＩＬ－１２濃度は感度以下であった（図１１の「ILT-A」の「DMSO」のうちの右側）。一方、０．５μＭのＳＡＨＡ（ＨＤＡＣ阻害剤の一種）を含むＳＡＨＡ含有培地で培養したＩＬＴ細胞（ＩＬＴ－Ａ細胞又はＩＬＴ－Ｂ細胞）を用いると、ＤＭＳＯ含有培地で培養したＩＬＴ細胞（ＩＬＴ－Ａ細胞又はＩＬＴ－Ｂ細胞）を用いた場合と比較して、培地へのＩＬ－１２産生が有意に増加した（図１１の「ILT-A」の「SAHA」の黒塗りの棒グラフ（「DC」）及び「ILT-B」の「SAHA」の黒塗りの棒グラフ（「DC」）。
【0120】
ＳＡＨＡの替わりに別のＨＤＡＣ阻害剤であるバルプロ酸（ＶＰＡ）を用いた場合の結果を図１２に示す。ＩＬＴ－Ｂ細胞をＶＰＡ含有培地又はＤＭＳＯ含有培地（コントロール培地）で２４時間培養した。この細胞をＭＭＣ処理した後、洗浄し、樹状細胞と共培養し、上清中のＩＬ－１２濃度を測定した。図１２の「ＤＣ」にそれぞれ示すように、１ｍＭのＶＰＡを含む培地で培養したＩＬＴ－Ｂ細胞を用いると、ＤＭＳＯ含有培地で培養したＩＬＴ－Ｂ細胞を用いた場合と比較して、培地へのＩＬ－１２産生が有意に増加した（図１２の黒塗りの棒グラフ（「DC」））。
【0121】
（２）抗原提示細胞による抗原クロスプレゼンテーションへの、ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞の薬剤処理による影響
図１１における共培養後の各細胞を１重量％ホルマリンで１５分間処理した後、洗浄した細胞を、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）と１６時間共培養した。共培養して得られた培養液の上清を回収し、かかる上清中のＩＦＮ－γ濃度（ｐｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡ（BD OptiEIA（登録商標））で測定した。これらの結果を図１３に示す。
図１１における共培養後の各細胞を１重量％ホルマリンで１５分間処理した後、洗浄した細胞を、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＣＤ８陽性Ｔａｘ特異的ＣＴＬ（Ｔｃ－Ｍ１）と１６時間共培養した。共培養して得られた培養液の上清を回収し、かかる上清中のＩＦＮ－γ濃度（ｐｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡ（BD OptiEIA（登録商標））で測定した。これらの結果を図１３に示す。
【0122】
図１３から分かるように、ＳＡＨＡ処理されたＩＬＴ細胞を用いた場合は、ＳＡＨＡ処理されていないＩＬＴ細胞を用いた場合よりも、ＣＴＬからのＩＦＮ－γ産生量が高かった。これらの結果から、ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞を、ＳＡＨＡ等のＨＤＡＣ阻害剤で処理すると、抗原提示細胞がＴａｘ特異的ＣＴＬへ抗原をクロスプレゼンテーションする効率も向上することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【0123】
本発明によれば、ＨＴＬＶ－Ｉ特異的ＣＴＬ活性化剤、及びその製造方法等を提供することができる。また、本発明によれば、ＨＴＬＶ－１の感染に起因する疾患の患者のＨＬＡ型に制限されずに、多くの患者に比較的安価で効果的な免疫療法を提供できることが期待される。また、本発明によれば、現在、安全で有効な治療法が存在しないため無治療観察が原則となっているくすぶり型や慢性型のＡＴＬ（インドレントＡＴＬ）に対して早期段階で適用が可能な治療法を提供できることが期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
