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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-09
(45)【発行日】2024-12-17
(54)【発明の名称】軟骨を作製するための剤及び軟骨の作製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20241210BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021558437
(86)(22)【出願日】2020-11-19
(86)【国際出願番号】 JP2020043150
(87)【国際公開番号】W WO2021100796
(87)【国際公開日】2021-05-27
【審査請求日】2023-03-01
(31)【優先権主張番号】P 2019209620
(32)【優先日】2019-11-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 発効日：令和１年９月８日、刊行物名：第１１回プロテオグリカン国際会議（１１ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｒｃａｎｓ）プログラムおよびポスター発表情報Ｂ－１８
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 開催日：令和１年１０月２日、集会名：第１１回プロテオグリカン国際会議（１１ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ）、開催場所：石川県立音楽堂
(73)【特許権者】
【識別番号】000119472
【氏名又は名称】一丸ファルコス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110003557
【氏名又は名称】弁理士法人レクシード・テック
(72)【発明者】
【氏名】桝谷 晃明
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－１８３１４１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１４２８２９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１９－０１４６６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５１８２８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－０００１４３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／０７７
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
インビトロで実施される軟骨の作製方法であって、
軟骨前駆細胞とプロテオグリカンとを接触させて、前記軟骨前駆細胞上に前記プロテオグリカンを含む足場を形成する工程と、
前記軟骨前駆細胞を軟骨細胞へ分化誘導する工程と、を含み、前記分化誘導された軟骨細胞は、軟骨細胞の状態を維持しており、
前記プロテオグリカンは、サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンであり、
前記足場を形成する工程において用いる前記プロテオグリカンの濃度が３．９μｇ／ｍｌ以上であり、
前記分化誘導する工程において、成長因子を添加しない、軟骨の作製方法。
【請求項2】
前記足場を形成する工程は、前記軟骨前駆細胞と前記プロテオグリカン（ただし、前記プロテオグリカンは、プロテオグリカンとコラーゲンとの組成物の形態の場合を除く。）とを接触させて、前記軟骨前駆細胞上に前記プロテオグリカンを含む足場を形成する工程である、請求項１に記載の軟骨の作製方法。
【請求項3】
前記分化誘導では、前記プロテオグリカンの足場が、前記軟骨前駆細胞の細胞膜に接着し、前記細胞膜に存在する上皮成長因子受容体及びインスリン様成長因子１受容体を活性化して、前記軟骨前駆細胞の増殖を促進する、請求項１または２に記載の軟骨の作製方法。
【請求項4】
前記分化誘導では、前記プロテオグリカンの足場が、前記軟骨前駆細胞におけるＧＤＦ５の発現を促進することにより、前記軟骨前駆細胞を前記軟骨細胞へ分化誘導する、請求項１から３のいずれか一項に記載の軟骨の作製方法。
【請求項5】
前記軟骨前駆細胞と前記プロテオグリカンを含む足場との接触により、分化誘導された軟骨細胞のＲｕｎｘ２発現を阻害する工程を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の軟骨の作製方法。
【請求項6】
前記軟骨前駆細胞と前記プロテオグリカンを含む足場との接触により、分化誘導された軟骨細胞の肥大化、および／または軟骨細胞の石灰化を抑制する、請求項１から５のいずれか一項に記載の軟骨の作製方法。
【請求項7】
前記プロテオグリカンが、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである請求項１から６のいずれか一項に記載の軟骨の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【クロスリファレンス】
【0001】
本出願は、日本国において、２０１９年１１月２０日に出願された特願２０１９－２０９６２０号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。また、本願において引用した全ての特許、特許出願及び文献に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。
【技術分野】
【0002】
本発明は、プロテオグリカンを有効成分とする、軟骨を作製するための剤に関する。また、本発明は、この剤を用いて軟骨を作製する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
例えば、変形性関節症は、運動機能に大きな影響を与えるため、ＱＯＬの著しい低下につながり、ヒトの健康寿命にとって大きな問題となっている。変形性関節症は、関節にかかる過度の力学的ストレスや加齢変化によって関節の変形が生じる慢性疾患であるが、詳細な分子メカニズムが解明されていないため、有効な対処法がないのが現状である。運動療法やヒアルロン酸などの関節注射に加え、軟骨欠損に対する自己細胞移植による軟骨再生治療も試みられているが、より有効な治療方法の開発が強く望まれている。
【0004】
例えば、特許文献１には、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、それらの細胞の軟骨分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こすＲＡＮＫＬ結合分子を有効量投与することにより軟骨細胞の増殖、分化を誘導し、あるいは軟骨基質産生を増加させる方法が開示されている。ここで、ＲＡＮＫＬ結合分子とは、９アミノ酸から構成され、二つのシステイン残基がジスルフィド結合により結合した環状ペプチドである。
【0005】
また、特許文献２には、多能性幹細胞又は分化多能性幹細胞の集団から軟骨細胞の集団を生成する方法であって、軟骨前駆細胞をＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する成長因子の存在下で三次元培養する方法が記載されている。
【0006】
しかしながら、ＴＧＦ－βスーパーファミリーのような軟骨細胞の増殖を誘導する因子には、軟骨細胞増殖作用以外にも、未分化間葉系幹細胞の凝集、軟骨細胞の肥大及び／又は石灰化の促進作用などの機能を有しており、これらの因子を用いて培養した軟骨は、移植後に骨化し、軟骨としての機能を失ってしまう可能性がある。
【0007】
変形性関節症の初期症状としては、軟骨前駆細胞が存在する最表層から変性・破壊が生じること、及び最表層でのＥＧＦＲの活性が恒常性に重要であると報告されている。症状の進行に伴って細胞外マトリックスが顕著に減少し、中でも軟骨に豊富に存在しているプロテオグリカンの減少は粘弾性に大きく関係している。軟骨ではコンドロイチン硫酸を主要なグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）として構成しているアグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ、アグレカンともいう）というプロテオグリカンが主である。一方、アグリカンの粘弾性以外の詳細な機能は不明な点が多い。近年、サケ鼻軟骨から高精度にアグリカンタイプのプロテオグリカン（ＳＰＧ）を精製することが可能となり、その多様な機能の開発が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特許第５７３００１８号公報
【文献】特許第６３９９５５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、軟骨前駆細胞の増加及び／又は分化誘導を促進するとともに、軟骨細胞の増殖も促進すること、軟骨細胞の肥大及び／又は石灰化を抑制すること、などにより、変形性関節症等の治療に使用しうる軟骨の維持及び／又は改善のための材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであって、プロテオグリカン（ＰＧ）が、軟骨前駆細胞の増加、分化誘導及び石灰化抑制作用などを有するという発見に基づく。
【0011】
すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
（１）プロテオグリカンを有効成分とする、軟骨を作製するための剤。
（２）軟骨前駆細胞を増殖させ、かつ軟骨前駆細胞を軟骨細胞に分化誘導するための足場形成剤である（１）に記載の剤。
（３）軟骨前駆細胞が、哺乳動物の間葉系幹細胞である（１）又は（２）に記載の剤。
（４）成長因子（上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＧＦ－１、インスリン、ＢＭＰなどのＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する成長因子など）を実質的に含まない（１）～（３）の何れかに記載の剤。
（５）プロテオグリカンが、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである（１）～（４）の何れかに記載の剤。
（６）軟骨前駆細胞とプロテオグリカンとを接触させて、軟骨前駆細胞上にプロテオグリカンを含む足場を形成する工程と、軟骨前駆細胞を軟骨細胞へ分化誘導する工程と、を含み、分化誘導された軟骨細胞の肥大及び／又は石灰化が抑制されて軟骨細胞の状態を維持している、軟骨の作製方法。
（７）軟骨前駆細胞とプロテオグリカンとを接触させる工程がインビトロで行われる、（６）に記載の軟骨の作製方法。
（８）プロテオグリカンが、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである（６）又は（７）に記載の軟骨の作製方法。
（１）プロテオグリカンを有効成分とする、軟骨を作製するための剤。
（２）軟骨前駆細胞を増殖させ、かつ軟骨前駆細胞を軟骨細胞に分化誘導するための足場形成剤である（１）に記載の剤。
（３）軟骨前駆細胞が、哺乳動物の間葉系幹細胞である（１）又は（２）に記載の剤。
（４）成長因子（上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＧＦ－１、インスリン、ＢＭＰなどのＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する成長因子など）を実質的に含まない（１）～（３）の何れかに記載の剤。
（５）プロテオグリカンが、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである（１）～（４）の何れかに記載の剤。
（６）軟骨前駆細胞とプロテオグリカンとを接触させて、軟骨前駆細胞上にプロテオグリカンを含む足場を形成する工程と、軟骨前駆細胞を軟骨細胞へ分化誘導する工程と、を含み、分化誘導された軟骨細胞の肥大及び／又は石灰化が抑制されて軟骨細胞の状態を維持している、軟骨の作製方法。
（７）軟骨前駆細胞とプロテオグリカンとを接触させる工程がインビトロで行われる、（６）に記載の軟骨の作製方法。
（８）プロテオグリカンが、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである（６）又は（７）に記載の軟骨の作製方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明の剤は、軟骨前駆細胞の増加及び／又は分化誘導を促進するとともに、軟骨細胞の増殖を促進すること、軟骨細胞の肥大及び／又は石灰化を抑制すること、などにより、変形性関節症等の治療に使用しうる軟骨の維持及び／又は改善のための材料を作製するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図2】図２は、プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の増殖に及ぼす影響を調べた結果である。図２では細胞増殖効果（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を定量化したデータを示す。プロテオグリカンを添加しない群（０μｇ／ｍＬ）のときの細胞増殖効果を１００％としたとき、プロテオグリカンを３．９μｇ／ｍＬ添加した群が１１４．４％、プロテオグリカンを７．８μｇ／ｍＬ添加した群が１２１．５％、プロテオグリカンを１５．６μｇ／ｍＬ添加した群が１２２．０％、プロテオグリカンを３１．３μｇ／ｍＬ添加した群が１１８．１％、プロテオグリカンを６２．５μｇ／ｍＬ添加した群が１２２．０％、プロテオグリカンを１２５μｇ／ｍＬ添加した群が１２７．２％、プロテオグリカンを２５０μｇ／ｍＬ添加した群が１３１．２％、プロテオグリカンを５００μｇ／ｍＬ添加した群が１３０．８％であった。
【図5】図５は、プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の軟骨分化に及ぼす影響を調べた結果である。図５Ｂではアリシアンブルーの陽性のエリア（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｒｅａ）を定量化したデータを示す。アリシアンブルー染色の陽性のエリアが、プロテオグリカンを添加しない群（０μｇ／ｍＬ）が０．１２％、プロテオグリカンを１２．５μｇ／ｍＬ添加した群が６．３７％、プロテオグリカンを２５μｇ／ｍＬ添加した群が７．８０％、プロテオグリカンを５０μｇ／ｍＬ添加した群が１３．５４％、であった。また、陽性対象のインスリンの添加群においては、アリシアンブルー染色の陽性のエリアが、インスリンを添加しない群（０μｇ／ｍＬ）が０．４３％、インスリンを０．１μｇ／ｍＬ添加した群が３．７９％、インスリンを１μｇ／ｍＬ添加した群が７．０３％、インスリンを１０μｇ／ｍＬ添加した群が２４．７８％であった。
【図6】図６は、プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の軟骨分化組織の三次元構造の観察結果である。図６Ａは、光学顕微鏡で、４００倍の倍率で観察した結果（２１日間培養した細胞を観察した結果）である。図６Ｂでは、プロテオグリカンの添加により分化した軟骨細胞が増殖すること（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ）を定量化したデータを示す。プロテオグリカンを添加しない群（０μｇ／ｍＬ）が１００％として、プロテオグリカンを６．２５μｇ／ｍＬ添加した群が１１８．０％、プロテオグリカンを１２．５μｇ／ｍＬ添加した群が１２１．８％、プロテオグリカンを２５μｇ／ｍＬ添加した群が１２６．０％、プロテオグリカンを５０μｇ／ｍＬ添加した群が１３５．８％、であった。なお、陽性対象のインスリンの添加した群においては、インスリンを添加しない群（０μｇ／ｍＬ）が１００％として、プロテオグリカンを１０μｇ／ｍＬ添加した群が１６３．８％であった。
【図7】図７は、プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の軟骨の分化を調節する因子の発現を調べた結果である。図７において、「Ｃ」はコントロール（プロテオグリカンの未添加の群）、「Ｐ」はプロテオグリカンを添加した群、「Ｉ」は陽性対象のインスリンの添加した群、を示す。図７Ｂではプロテオグリカンの添加によるＩＧＦ－１受容体のリン酸化を定量化したデータ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏ ＩＧＦ－１Ｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｆｏｌｄｓ））を示す。６時間（６ｈ）において、Ｃを１としたとき、Ｐは２．９５、Ｉは１９．１８であった。２４時間（２４ｈ）において、Ｃを１としたとき、Ｐは１．９４、Ｉは１．７７であった。４８時間（４８ｈ）において、Ｃを１としたとき、Ｐは１．５３、Ｉは１．２２であった。図７Ｄではプロテオグリカンの添加によるＧｄｆ５の発現を定量化したデータ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ Ｇｄｆ５ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｆｏｌｄｓ））を示す。７日（Ｄａｙ７）において、Ｃを１としたとき、Ｐは１．６０、Ｉは２．２４であった。１４日（Ｄａｙ１４）において、Ｃを１としたとき、Ｐは２．１７、Ｉは２．７３であった。
【図8】図８は、プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の石灰化に及ぼす影響を調べた結果である。図８Ｃでは、アリザリンレッド染色の陽性エリア（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｒｅａ）を定量化したデータを示す。このエリアが、プロテオグリカンを添加しない群（０μｇ／ｍＬ）が４２．１６％、プロテオグリカンを１０μｇ／ｍＬ添加した群が２７．０３％、プロテオグリカンを５０μｇ／ｍＬ添加した群が１．０８％、プロテオグリカンを２５０μｇ／ｍＬ添加した群が０．５８％、であった。
【図9】図９は、プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞での軟骨の石灰化を調節する因子（ｍＲＮＡ）の発現を調べた結果である。図９において、「Ｃ」はコントロール（プロテオグリカンの未添加の群）、「Ｐ」はプロテオグリカンを添加した群、を示す。図９ＡはＲｕｎｘ２のｍＲＮＡの発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ Ｒｕｎｘ２ ｍＲＮＡ（ｆｏｌｄｓ））を示す。２８日（Ｄａｙ２８）におけるＣを１．００としたとき、４２日（Ｄａｙ４２）においてＣが０．８６で、Ｐが０．３２であり、５２日（Ｄａｙ５２）においてＣが１．２１で、Ｐが０．４４であった。図９ＢはＣｏｌ１０のｍＲＮＡの発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌ１０ ｍＲＮＡ（ｆｏｌｄｓ））を示す。２８日（Ｄａｙ２８）におけるＣを１．００としたとき、４２日（Ｄａｙ４２）においてＣが３．８７で、Ｐが０．１１であり、５２日（Ｄａｙ５２）においてＣが４．０５で、Ｐが０．３４であった。図９ＣはＭｇｐのｍＲＮＡの発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ Ｍｇｐ ｍＲＮＡ（ｆｏｌｄｓ））を示す。２８日（Ｄａｙ２８）におけるＣを１．００としたとき、４２日（Ｄａｙ４２）においてＣが１．２０で、Ｐが１．８６であり、５２日（Ｄａｙ５２）においてＣが０．９７で、Ｐが１．９１であった。
【発明を実施するための形態】
【0014】
次に、本発明の好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせのすべてが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。また、本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【0015】
（軟骨を作製するための剤）
本発明の一実施形態に係る軟骨を作製するための剤は、有効成分としてプロテオグリカンを含む。ここで、軟骨とは、脊椎動物の鼻、肋骨、関節、気管の周囲、耳殻、椎間板などに存在する結合組織の１つであり、細胞外基質と、軟骨細胞との複合体をいう。軟骨における細胞外基質を、軟骨基質という場合もある。軟骨基質の主成分は、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びプロテオグリカンなどを含む。コンドロイチン硫酸に代表される軟骨基質は、大量の陰電荷を持っており、静電的にナトリウムイオンや水和水を引きつけることにより、軟骨は豊富な水分を含んでいる。したがって、本実施形態における「軟骨」とは、少なくとも１つの軟骨基質と軟骨細胞とを含む複合体であればよく、生体内に存在する軟骨組織のみならず、これと類似する様々な複合体材料を意味する。例えば、軟骨細胞と、プロテオグリカンとからなる複合体であってもよい。
本発明の一実施形態に係る軟骨を作製するための剤は、有効成分としてプロテオグリカンを含む。ここで、軟骨とは、脊椎動物の鼻、肋骨、関節、気管の周囲、耳殻、椎間板などに存在する結合組織の１つであり、細胞外基質と、軟骨細胞との複合体をいう。軟骨における細胞外基質を、軟骨基質という場合もある。軟骨基質の主成分は、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びプロテオグリカンなどを含む。コンドロイチン硫酸に代表される軟骨基質は、大量の陰電荷を持っており、静電的にナトリウムイオンや水和水を引きつけることにより、軟骨は豊富な水分を含んでいる。したがって、本実施形態における「軟骨」とは、少なくとも１つの軟骨基質と軟骨細胞とを含む複合体であればよく、生体内に存在する軟骨組織のみならず、これと類似する様々な複合体材料を意味する。例えば、軟骨細胞と、プロテオグリカンとからなる複合体であってもよい。
【0016】
本実施形態の剤は、軟骨前駆細胞を増殖させ、かつ軟骨前駆細胞を軟骨細胞に分化誘導するための足場形成剤であることが好ましい。軟骨前駆細胞とは、適切な培養条件で軟骨細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。好ましくは、軟骨前駆細胞は、間葉系幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などを含み、上記間葉系幹細胞は、脂肪由来、骨髄由来、臍帯由来、臍帯血由来、胎盤由来、滑膜由来、骨膜由来又は軟骨膜由来細胞を含む。足場形成剤とは、軟骨前駆細胞と接着し、足場を提供することにより何らかのシグナルを伝達して、接着した軟骨前駆細胞を増殖させると共に、軟骨細胞への分化を促す作用を有する剤を意味する。
【0017】
本実施形態の足場形成剤が、軟骨前駆細胞を増殖させ、かつ軟骨前駆細胞を軟骨細胞へ分化誘導する作用については、必ずしも明らかではなく、また、いかなる理論にも拘束されるわけではないが、図１で示すような作用機構に基づくと推定される。すなわち、本実施形態の足場形成剤は、軟骨前駆細胞の細胞膜に局在し、細胞周囲基質（ＰＣＭ）として細胞の環境を制御する。後述する実施例で示すように、プロテオグリカンは、細胞膜の上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体及びインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）受容体のリン酸化を促進して、細胞に増殖シグナルを伝達する。軟骨前駆細胞は、関節の形成に重要な役割を果たすことが知られている成長因子であるＧＤＦ５（ＢＭＰ１４）により軟骨細胞に分化誘導されるが、プロテオグリカンは、その発現を促進する。
【0018】
一方、プロテオグリカンは、軟骨の石灰化を誘導することが知られているＲｕｎｘ２の発現を阻害して、軟骨の肥大化を抑止する。このとき、軟骨石灰化のマーカーであるコラーゲンタイプＸの発現も抑止される。また、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）の発現を増強することにより、軟骨の骨化を抑制する。このように、プロテオグリカンを含む細胞外マトリックスの減少は、軟骨組織の粘弾性を低下させるだけでなく、軟骨細胞の代謝にも大きな影響を与えると考えられる。したがって、プロテオグリカンを有効成分として含む足場形成剤は、変形性関節症の治療に使用しうる軟骨の維持及び／又は改善のための材料としての軟骨の製造に有用である。
【0019】
（プロテオグリカン）
本発明の有効成分として用いるプロテオグリカンは、コアタンパク質にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等のグリコサミノグリカン（以下ＧＡＧと表す。）と呼ばれる糖鎖が共有結合した糖タンパク質である。プロテオグリカンは、細胞外マトリックス（以下ＥＣＭと表す。）の主要構成成分の一つとして皮膚や軟骨など体内に広く分布している。ＧＡＧ鎖は分岐を持たない長い直鎖構造を持つ。多数の硫酸基とカルボキシル基を持つため負に荷電しており、ＧＡＧ鎖はその電気的反発力のために延びた形状をとる。また、プロテオグリカンは、糖の持つ水親和性により、多量の水を保持することができる。プロテオグリカンに含まれる多数のＧＡＧ鎖群はスポンジのように水を柔軟に保持しながら、弾性や衝撃への耐性といった軟骨特有の機能を担っている。
本発明の有効成分として用いるプロテオグリカンは、コアタンパク質にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等のグリコサミノグリカン（以下ＧＡＧと表す。）と呼ばれる糖鎖が共有結合した糖タンパク質である。プロテオグリカンは、細胞外マトリックス（以下ＥＣＭと表す。）の主要構成成分の一つとして皮膚や軟骨など体内に広く分布している。ＧＡＧ鎖は分岐を持たない長い直鎖構造を持つ。多数の硫酸基とカルボキシル基を持つため負に荷電しており、ＧＡＧ鎖はその電気的反発力のために延びた形状をとる。また、プロテオグリカンは、糖の持つ水親和性により、多量の水を保持することができる。プロテオグリカンに含まれる多数のＧＡＧ鎖群はスポンジのように水を柔軟に保持しながら、弾性や衝撃への耐性といった軟骨特有の機能を担っている。
【0020】
プロテオグリカンのコアタンパク質はマトリックス中の様々な分子と結合する性質をもつ。軟骨プロテオグリカンの場合、Ｎ末端側にヒアルロン酸やリンクタンパク質との結合領域を持ち、これらの物質と結合すること、同一分子間で会合することもある。Ｃ末端にはレクチン様領域、ＥＧＦ様領域などを持ち様々な他の分子と結合する。この性質により、プロテオグリカンはそれぞれの組織にあった構造を築く。
【0021】
プロテオグリカンのうち、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは、コンドロイチン硫酸がコアタンパク質に共有結合されているプロテオグリカンである。また、サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンは、サケの鼻軟骨から抽出して得られたプロテオグリカンである。ここで、サケは、例えばサケ属（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）に属する魚（通称シロザケ、学名：Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｅｔａ）であるが、シロザケ以外にも、タイセイヨウサケ（アトランティックサーモン）、ベニザケ、ギンザケ、キングサーモン等でもよい。好ましくは軟骨前駆細胞の増殖促進の観点で学名が「Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｋｅｔａ」のサケが選択される。この他、ニワトリ（胸軟骨由来）、ブタ（気管支軟骨由来）、カレイ（ヒレ由来）等であってもよい。
【0022】
プロテオグリカンの製造方法についても特に制限はなく、サケ等の魚類の軟骨からグアニジン塩酸塩溶液で抽出する方法、抽出溶液として、酢酸を用いる方法等、適宜選択することができる。
【0023】
以下、実施例で示す実験において、プロテオグリカンとしてサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン（富士フイルム和光純薬株式会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））を用いた。
【0024】
（剤型及び／又は製剤形態）
プロテオグリカンを有効成分として含む軟骨を作製するための剤又は足場形成剤の剤型については、特に限定されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、軟骨を作製する部位、用途、投与方法などに応じて適宜設定することができる。
本発明に係る剤では、ＩＧＦ－１、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、軟骨細胞への分化を誘導することが報告されているＢＭＰなどのＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する成長因子などの成長因子を実質的に含まないことが好ましい。ここで、実質的に含まないとは、軟骨を作製するための剤をヒト等の動物の生体に適用（投与など）した場合に悪影響を及ぼさない程度であることをいい、好ましくは、下記で記載の分化誘導工程で用いる培養液に成長因子を積極的に添加しないことなどを意味する。
プロテオグリカンを有効成分として含む軟骨を作製するための剤又は足場形成剤の剤型については、特に限定されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、軟骨を作製する部位、用途、投与方法などに応じて適宜設定することができる。
本発明に係る剤では、ＩＧＦ－１、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、軟骨細胞への分化を誘導することが報告されているＢＭＰなどのＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する成長因子などの成長因子を実質的に含まないことが好ましい。ここで、実質的に含まないとは、軟骨を作製するための剤をヒト等の動物の生体に適用（投与など）した場合に悪影響を及ぼさない程度であることをいい、好ましくは、下記で記載の分化誘導工程で用いる培養液に成長因子を積極的に添加しないことなどを意味する。
【0025】
（軟骨の作製方法）
本発明の他の実施形態では、プロテオグリカンを用いて軟骨を作製する方法に関する。この方法は、軟骨前駆細胞とプロテオグリカンとを接触させて、軟骨前駆細胞上にプロテオグリカンを含む足場を形成する工程（足場形成工程）と、軟骨前駆細胞を軟骨細胞へ分化誘導する工程（分化誘導工程）と、を含む。そして、このようにして分化誘導された軟骨細胞は、その石灰化などが抑制されて、軟骨細胞の状態を維持していることを特徴とする。
本発明の他の実施形態では、プロテオグリカンを用いて軟骨を作製する方法に関する。この方法は、軟骨前駆細胞とプロテオグリカンとを接触させて、軟骨前駆細胞上にプロテオグリカンを含む足場を形成する工程（足場形成工程）と、軟骨前駆細胞を軟骨細胞へ分化誘導する工程（分化誘導工程）と、を含む。そして、このようにして分化誘導された軟骨細胞は、その石灰化などが抑制されて、軟骨細胞の状態を維持していることを特徴とする。
【0026】
足場形成工程で用いる軟骨前駆細胞及びプロテオグリカンについては上述した通りである。軟骨前駆細胞と、プロテオグリカンとを接触させる環境は、試験管内（インビトロ）又は生体内（インビボ）のいずれであってもよい。インビトロの環境としては、特に限定しないで従来公知の各種の培養容器を用いることができる。培養面は、平面又は曲面であってもよく、これらの面にコラーゲン等のＥＣＭをあらかじめコーティングしておいてもよい。このような培養容器としては、各種の平面培養用容器を挙げることができ、具体的には、Ｔ型フラスコ、角型フラスコ、ＴＤ型フラスコ、シャーレ等を挙げることができる。培養表面の材質も限定しないで用いることができる。
【0027】
軟骨前駆細胞と、プロテオグリカンとの接触は、プロテオグリカンをコーティングしておいた培養容器を用いて軟骨前駆細胞を培養する方法、あるいは培養液中に所定量のプロテオグリカンを添加して培養する方法及びこれらの両方であってもよい。培養液中に添加する場合のプロテオグリカンの濃度は、例えば、好ましくは０．５μｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以上であり、更に好ましくは３．０μｇ／ｍＬ以上である。
【0028】
培養液については、特に制限はなく、通常の細胞培養に使用される培養液を用いることができる。好ましい培養液の例には、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最少必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、Ｃｌｉｃｋ培地、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ－１５培地、ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地、グラスゴー最少必須培地（ＧＭＥＭ）、ＮＣＴＣ１０９培地、ウィリアムＥ培地、ＲＰＭＩ－１６４０、１９９培地、ハムＦ１２培地及びＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）が含まれる。また、本発明では、これらの培地の２以上を混合した培養液を用いることもある。培養液には血清、好ましくは牛胎児血清を含むが、特定のサイトカインを含む無血清培地を用いてもよい。
【0029】
足場を形成するための、軟骨前駆細胞とプロテオグリカンとの接触時間は、プロテオグリカンが軟骨前駆細胞に接着すれば特に制限はない。
【0030】
足場を形成するプロテオグリカンは、軟骨前駆細胞の細胞膜に接着し、細胞膜に存在するＥＧＦ受容体やＩＧＦ－１受容体を活性化して軟骨前駆細胞の増殖を促進すると考えられる。軟骨前駆細胞の増殖の程度は、培養液の組成、培養時間などによって異なるが、後述する実施例で示すように、例えば４日間の培養で少なくとも２０％程度の細胞増殖が認められる。
【0031】
分化誘導工程は、プロテオグリカンの足場を形成した上記の軟骨前駆細胞を、インビトロ又はインビボで培養、維持する工程である。この工程では、軟骨前駆細胞とプロテオグリカンとが接着して複合体を形成しているため、細胞周囲に存在する培養液を交換しても複合体が解離することはない。したがって、インビトロで培養する場合、交換する培養液中にプロテオグリカンを添加することは必ずしも必要ではないが、所定の濃度で添加することが好ましい。分化誘導工程において、培養液中に添加する場合のプロテオグリカンの濃度は、好ましくは０．５μｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以上であり、更に好ましくは３．０μｇ／ｍＬ以上である。
【0032】
培養液は、上述した足場形成工程で用いた培養液と実質的に同様であるが、特に、ＩＧＦ－１、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、軟骨細胞への分化を誘導することが報告されているＢＭＰなどのＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する成長因子などの成長因子を実質的に含まないことが好ましい。ここで、実質的に含まないとは、培養液中の成長因子の含量が、軟骨を作製するための剤をヒト等の動物の生体に適用（投与など）した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液に成長因子を積極的に添加しないことを意味する。
【0033】
ＴＧＦ－β（トランスフォーミング増殖因子－β）スーパーファミリーには、ＴＧＦ－β、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）など３０種類近くの増殖因子と分化因子が含まれる。
【0034】
一方、培養液には、ウシ血清アルブミンなどの、細胞を支持するためのタンパク質を添加してもよい。所望の場合は、培養液には、培地に加えてバッファー（例えば、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＳＥ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ－トリス（ヒドロキシメチル）メタン（ＢＩＳ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－３－プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ又はＨＥＰＰＳ）、グリシン、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ－モルフォリノ）－プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタン－スルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、重炭酸ナトリウム、３－（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－メチル－アミノ）－２－ヒドロキシ－プロパンスルホン酸）ＴＡＰＳＯ、（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－グリシン（トリシン）、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン（トリス）など）などを、培養物のアシドーシスを制限する試薬をさらに補充してもよい。さらに、必要に応じて、抗生物質やビタミン類などを加えることができる。
【0035】
軟骨前駆細胞の培養は、細胞を加湿状態にて、例えば、３７℃で、２～１０％のＣＯ２、好ましくは５％のＣＯ２を加えて培養させるなど、適切な培養条件下で培養させることができる。プレーティングの初期濃度、増殖培地の品質、細胞に固有の遺伝的要因、温度などを含む種々の要因に応じて、特定の細胞群に対する倍加時間は変化することがある。培養時間は特に制限はなく、コンフルエントの状態になってから２０～３０日間培養してもよい。培養液は、最初の播種後、例えば、３日から４日ごとに完全に又は部分的に交換される。
【0036】
このようにして分化誘導された軟骨細胞は、肥大及び／又は石灰化などが抑制されて軟骨細胞の状態を維持している。本実施形態の方法によれば、分化した軟骨細胞の細胞膜上に足場を形成したプロテオグリカンが、Ｒｕｎｘ２の発現を阻害し、さらにマトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）の発現を増強することで軟骨の肥大及び／又は石灰化を抑制すると考えられる。
【0037】
（軟骨維持及び／又は改善材料）
一実施形態において、本実施形態で開示される方法により作製される軟骨は、軟骨の維持及び／又は改善のための材料として軟骨組織を再生成する方法に使用される。例えば、それ自体、軟骨の欠損領域に直接用いることができる。あるいは、支持生体材料と共に、軟骨の欠損領域に入れられる。これらによって生成される新たな軟骨組織は、軟骨又は骨の表面を修復する。一実施形態において、本実施形態の軟骨の維持及び／又は改善のための材料は、軟骨関連の障害を処置するために用いることができ、該方法は、本実施形態の軟骨の維持及び／又は改善のための材料を、必要とする被験体の軟骨損傷又は欠損部位に投与する工程を含む。幾つかの実施形態において、軟骨関連の障害は、関節軟骨外傷、半月板損傷、軟骨形成障害、関節炎、軟骨疾患、軟骨肉腫、軟骨軟化症、多発性軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、大腿骨頭すべり症、離断性骨軟骨炎、軟骨異形成症、肋軟骨炎、骨軟骨腫、脊椎症、骨軟骨症、ティーツェ症候群、骨端異形成症、手根関連性骨軟骨腫症、軟骨無形成症、軟骨石灰化症、遺伝性軟骨種症、軟骨腫、軟骨無発生症、内軟骨種、軟骨低形成症、及びＫｅｕｔｅｌ症候群である。一実施形態において、軟骨関連の障害は関節炎である。他の実施形態において、関節炎は骨関節炎である。幾つかの実施形態において、骨関節炎は、被験体の膝、指、手首、殿部、脊椎、肩、肘、つま先、足首、又は頚部に生じる。
一実施形態において、本実施形態で開示される方法により作製される軟骨は、軟骨の維持及び／又は改善のための材料として軟骨組織を再生成する方法に使用される。例えば、それ自体、軟骨の欠損領域に直接用いることができる。あるいは、支持生体材料と共に、軟骨の欠損領域に入れられる。これらによって生成される新たな軟骨組織は、軟骨又は骨の表面を修復する。一実施形態において、本実施形態の軟骨の維持及び／又は改善のための材料は、軟骨関連の障害を処置するために用いることができ、該方法は、本実施形態の軟骨の維持及び／又は改善のための材料を、必要とする被験体の軟骨損傷又は欠損部位に投与する工程を含む。幾つかの実施形態において、軟骨関連の障害は、関節軟骨外傷、半月板損傷、軟骨形成障害、関節炎、軟骨疾患、軟骨肉腫、軟骨軟化症、多発性軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、大腿骨頭すべり症、離断性骨軟骨炎、軟骨異形成症、肋軟骨炎、骨軟骨腫、脊椎症、骨軟骨症、ティーツェ症候群、骨端異形成症、手根関連性骨軟骨腫症、軟骨無形成症、軟骨石灰化症、遺伝性軟骨種症、軟骨腫、軟骨無発生症、内軟骨種、軟骨低形成症、及びＫｅｕｔｅｌ症候群である。一実施形態において、軟骨関連の障害は関節炎である。他の実施形態において、関節炎は骨関節炎である。幾つかの実施形態において、骨関節炎は、被験体の膝、指、手首、殿部、脊椎、肩、肘、つま先、足首、又は頚部に生じる。
【実施例】
【0038】
以下に示す実施例は、単なる例示であって、上述した実施形態と共に本発明を詳細に説明することのみを意図しており、本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、係る変更も本発明の範囲に含まれる。
【0039】
１．実験材料及び実験方法
（細胞培養）
ＡＴＤＣ５細胞（軟骨前駆細胞）は、軟骨分化及び石灰化までの複雑な内軟骨性骨化のプロセスをインビトロにて多段階で評価可能である。ＡＴＤＣ５は、理研バイオリソース研究センターから購入した。ＡＴＤＣ５は、通常ＤＭＥＭ／Ｆ１２に５％ＦＢＳ、トランスフェリン、亜セレン酸、抗生物質を添加して３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
（細胞培養）
ＡＴＤＣ５細胞（軟骨前駆細胞）は、軟骨分化及び石灰化までの複雑な内軟骨性骨化のプロセスをインビトロにて多段階で評価可能である。ＡＴＤＣ５は、理研バイオリソース研究センターから購入した。ＡＴＤＣ５は、通常ＤＭＥＭ／Ｆ１２に５％ＦＢＳ、トランスフェリン、亜セレン酸、抗生物質を添加して３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【0040】
（ＡＴＤＣ５細胞の増殖の確認試験）
図２で示すように、プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の増殖の変化について、ＣＣＫ－８アッセイキット（株式会社同仁化学研究所）を用いて評価した。軟骨前駆細胞状態のＡＴＤＣ５細胞は、インスリンなしで０．５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に、３．９～５００μｇ／ｍＬ濃度のプロテオグリカンを添加して９６時間培養後の細胞数を、ＣＣＫ－８キットにより測定した。また、軟骨分化状態の細胞は、５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に、プロテオグリカン又はインスリンを添加して数日間培養後に評価した。図２で示すように、対照として、プロテオグリカンを添加しない群（図２の０μｇ／ｍｌの群）を含まない実験を行った。
図２で示すように、プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の増殖の変化について、ＣＣＫ－８アッセイキット（株式会社同仁化学研究所）を用いて評価した。軟骨前駆細胞状態のＡＴＤＣ５細胞は、インスリンなしで０．５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に、３．９～５００μｇ／ｍＬ濃度のプロテオグリカンを添加して９６時間培養後の細胞数を、ＣＣＫ－８キットにより測定した。また、軟骨分化状態の細胞は、５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に、プロテオグリカン又はインスリンを添加して数日間培養後に評価した。図２で示すように、対照として、プロテオグリカンを添加しない群（図２の０μｇ／ｍｌの群）を含まない実験を行った。
【0041】
（軟骨細胞への分化の誘導）
軟骨への分化を確認するため、プロテオグリカンの添加又は未添加の培養条件において、ＡＴＤＣ５細胞がコンフルエントになった後、２１日間培養した。軟骨分化の陽性対照としてインスリンを用いた。
軟骨への分化を確認するため、プロテオグリカンの添加又は未添加の培養条件において、ＡＴＤＣ５細胞がコンフルエントになった後、２１日間培養した。軟骨分化の陽性対照としてインスリンを用いた。
【0042】
（分化した軟骨細胞の石灰化の誘導）
所定の培地にて２８日間培養して軟骨に分化したＡＴＤＣ５細胞を、プロテオグリカンの添加又は未添加の培養条件において、５％ＦＢＳとインスリンとを含むＭＥＭ培地で３７℃、３％ＣＯ２の条件にて、２４日間培養し、軟骨細胞の石灰化の有無を確認した。
所定の培地にて２８日間培養して軟骨に分化したＡＴＤＣ５細胞を、プロテオグリカンの添加又は未添加の培養条件において、５％ＦＢＳとインスリンとを含むＭＥＭ培地で３７℃、３％ＣＯ２の条件にて、２４日間培養し、軟骨細胞の石灰化の有無を確認した。
【0043】
（ＲＮＡの単離とＲＴ－ＰＣＲ）
培養されたＡＴＤＣ５細胞は、培養液をすすぎ落した後、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて定量した。５０ｎｇの全ＲＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲのためのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写試薬キット（タカラバイオ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。ＲＴ－ＰＣＴは、３７℃、１５分間の逆転写反応と、８５℃、５秒間の酵素失活条件で行った。
培養されたＡＴＤＣ５細胞は、培養液をすすぎ落した後、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて定量した。５０ｎｇの全ＲＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲのためのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写試薬キット（タカラバイオ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。ＲＴ－ＰＣＴは、３７℃、１５分間の逆転写反応と、８５℃、５秒間の酵素失活条件で行った。
【0044】
（リアルタイム定量ＰＣＲ）
各遺伝子に対する特異的プライマーとＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ ＩＩ（タカラバイオ株式会社製）を使用してリアルタイム定量ＰＣＲを行った。ターゲットとしてのＲｕｎｘ２、Ｃｏｌ１０、Ｍｇｐ及び内部コントロールとしてのＲｐｓ１８に対して使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーは、北海道システム・サイエンス株式会社から購入した。サーマルサイクラーダイスリアルタイムシステムシングル（タカラバイオ株式会社製）を使用して、リアルタイム蛍光検出を行った。ＰＣＲは、９４℃で１５分間処理した後、９４℃で３０秒間及び５４～６０℃で３０秒間の４０サイクルの条件で行った。
各遺伝子に対する特異的プライマーとＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ ＩＩ（タカラバイオ株式会社製）を使用してリアルタイム定量ＰＣＲを行った。ターゲットとしてのＲｕｎｘ２、Ｃｏｌ１０、Ｍｇｐ及び内部コントロールとしてのＲｐｓ１８に対して使用したフォワードプライマー及びリバースプライマーは、北海道システム・サイエンス株式会社から購入した。サーマルサイクラーダイスリアルタイムシステムシングル（タカラバイオ株式会社製）を使用して、リアルタイム蛍光検出を行った。ＰＣＲは、９４℃で１５分間処理した後、９４℃で３０秒間及び５４～６０℃で３０秒間の４０サイクルの条件で行った。
【0045】
（イムノブロット）
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファーを用いて溶解し、総タンパク質を抽出した。抽出液を凍結融解後、５分間の遠心分離により、抽出されたタンパク質から細胞片を除去した。ＢＣＡ法（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して、タンパク質濃度を測定した。得られたタンパク質を、２－メルカプトエタノールを含む２×ＳＤＳサンプルバッファーで５分間煮沸することにより溶出させた。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した後、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ＰＶＤＦ膜にタンパク質をブロッティングした。タンパク質ブロットされた膜は、室温で１時間、ＰＶＤＦブロッキング試薬（東洋紡）でブロックした。その後、ＣａｎＧｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（東洋紡）の中で、４℃で一晩、１０００倍希釈の抗リン酸化ＩＧＦ－１Ｒ Ｔｙｒ１１３５／１１３６抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１０００倍希釈の抗リン酸化ＥＧＦＲ Ｔｙｒ１１７３抗体（メルク社、Ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＧＦＲ （Ｔｙｒ１１７３） Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、又は１００００倍希釈の抗β－アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートした。ＴＢＳ－Ｔ溶液で５分間３回洗浄した後、膜をさらに１時間、１００００倍希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）に結合したヤギ－ウサギＩｇＧ又はヤギ－マウスＩｇＧ抗体とともに室温で１時間インキュベートした。 Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（東洋紡）で、検出前にＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。タンパク質の発現は、Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用したＥＣＬ検出システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって検出した。
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファーを用いて溶解し、総タンパク質を抽出した。抽出液を凍結融解後、５分間の遠心分離により、抽出されたタンパク質から細胞片を除去した。ＢＣＡ法（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して、タンパク質濃度を測定した。得られたタンパク質を、２－メルカプトエタノールを含む２×ＳＤＳサンプルバッファーで５分間煮沸することにより溶出させた。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した後、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ＰＶＤＦ膜にタンパク質をブロッティングした。タンパク質ブロットされた膜は、室温で１時間、ＰＶＤＦブロッキング試薬（東洋紡）でブロックした。その後、ＣａｎＧｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（東洋紡）の中で、４℃で一晩、１０００倍希釈の抗リン酸化ＩＧＦ－１Ｒ Ｔｙｒ１１３５／１１３６抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１０００倍希釈の抗リン酸化ＥＧＦＲ Ｔｙｒ１１７３抗体（メルク社、Ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＧＦＲ （Ｔｙｒ１１７３） Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、又は１００００倍希釈の抗β－アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートした。ＴＢＳ－Ｔ溶液で５分間３回洗浄した後、膜をさらに１時間、１００００倍希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）に結合したヤギ－ウサギＩｇＧ又はヤギ－マウスＩｇＧ抗体とともに室温で１時間インキュベートした。 Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（東洋紡）で、検出前にＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した。タンパク質の発現は、Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用したＥＣＬ検出システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって検出した。
【0046】
（アルシアンブルー染色）
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、－２０℃で１０分間メタノールにより固定した後、細胞を０．１ ＭのＨＣｌ中の０．１％Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ ８ＧＸで一晩染色した。 染色後、細胞を３％酢酸で３回洗浄し、位相差顕微鏡（オリンパス）とデジタルカメラを使用して画像を取得した。定量分析では、同じピクセル数で取得した画像から閾値処理によりアルシアンブルーの染色領域を選択することにより、比率を計算した。相対アルシアンブルー染色領域は、プロテオグリカン未添加群をコントロールとした。
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、－２０℃で１０分間メタノールにより固定した後、細胞を０．１ ＭのＨＣｌ中の０．１％Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ ８ＧＸで一晩染色した。 染色後、細胞を３％酢酸で３回洗浄し、位相差顕微鏡（オリンパス）とデジタルカメラを使用して画像を取得した。定量分析では、同じピクセル数で取得した画像から閾値処理によりアルシアンブルーの染色領域を選択することにより、比率を計算した。相対アルシアンブルー染色領域は、プロテオグリカン未添加群をコントロールとした。
【0047】
（アリザリンレッド染色）
所定の条件にて培養したＡＴＤＣ５細胞をＰＢＳで３回すすぎ、メタノールにより－２０℃で１０分間固定した。それらは、ｐＨ６．４の１％アリザリンレッドＳ（富士フイルム和光純薬株式会社）で５分間染色し、蒸留水で洗浄した。画像は、位相差顕微鏡（オリンパス）とデジタルカメラを使用して取得した。定量分析では、同じピクセル数で取得した画像から閾値処理によりアリザリンレッドで染色された領域を選択することにより、比率を計算した。プロテオグリカン未添加群をコントロールとして用いた。
所定の条件にて培養したＡＴＤＣ５細胞をＰＢＳで３回すすぎ、メタノールにより－２０℃で１０分間固定した。それらは、ｐＨ６．４の１％アリザリンレッドＳ（富士フイルム和光純薬株式会社）で５分間染色し、蒸留水で洗浄した。画像は、位相差顕微鏡（オリンパス）とデジタルカメラを使用して取得した。定量分析では、同じピクセル数で取得した画像から閾値処理によりアリザリンレッドで染色された領域を選択することにより、比率を計算した。プロテオグリカン未添加群をコントロールとして用いた。
【0048】
（三次元軟骨分化した組織の評価）
三次元軟骨分化した組織の評価のため、ＡＴＤＣ５細胞を、インスリンなしのコンフルエンス後から２１日間、プロテオグリカンの存在又は非存在下で、細胞培養インサート上にてインキュベートした。サンプルを４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水し、パラフィンに包埋し、切片を作製した。次に、４～５μｍの切片をヘマトキシリンとエオシンで染色（ＨＥ染色）し、光学顕微鏡を用いて評価した。
三次元軟骨分化した組織の評価のため、ＡＴＤＣ５細胞を、インスリンなしのコンフルエンス後から２１日間、プロテオグリカンの存在又は非存在下で、細胞培養インサート上にてインキュベートした。サンプルを４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水し、パラフィンに包埋し、切片を作製した。次に、４～５μｍの切片をヘマトキシリンとエオシンで染色（ＨＥ染色）し、光学顕微鏡を用いて評価した。
【0049】
（統計解析）
図２～図９に示す定量データ（棒グラフで示すデータ）は、ＪＭＰ８（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して、統計解析も行ったデータである。統計解析を行ったデータは、３回以上の実験データから、その実験データの平均値±ＳＤを表しているデータである。当該定量データは、ガウス分布のデータを想定して、データは分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析したデータである。多重比較を実行するために、ＡＮＯＶＡの後、Ｄｕｎｎｅｔｔ又はＴｕｋｅｙのテストを行ったデータである。図２～図９において、統計学的な有意のレベルを次のように示した。＊又は†（ダガー）：ｐ＜０．０５、＊＊又は††：ｐ＜０．０１。
図２～図９に示す定量データ（棒グラフで示すデータ）は、ＪＭＰ８（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して、統計解析も行ったデータである。統計解析を行ったデータは、３回以上の実験データから、その実験データの平均値±ＳＤを表しているデータである。当該定量データは、ガウス分布のデータを想定して、データは分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析したデータである。多重比較を実行するために、ＡＮＯＶＡの後、Ｄｕｎｎｅｔｔ又はＴｕｋｅｙのテストを行ったデータである。図２～図９において、統計学的な有意のレベルを次のように示した。＊又は†（ダガー）：ｐ＜０．０５、＊＊又は††：ｐ＜０．０１。
【0050】
２．結果
（プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の増殖に及ぼす影響）
ＡＴＤＣ５細胞を用いて、未分化間葉系の軟骨前駆細胞に対する細胞増殖効果を評価した。増殖試験は、血清濃度を０．５％まで下げた状態にプロテオグリカンを添加して４日間培養を行った後、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）を発色試薬として評価した。図２に示すように、プロテオグリカンは添加によって有意な細胞増殖効果が認められた。
（プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の増殖に及ぼす影響）
ＡＴＤＣ５細胞を用いて、未分化間葉系の軟骨前駆細胞に対する細胞増殖効果を評価した。増殖試験は、血清濃度を０．５％まで下げた状態にプロテオグリカンを添加して４日間培養を行った後、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）を発色試薬として評価した。図２に示すように、プロテオグリカンは添加によって有意な細胞増殖効果が認められた。
【0051】
（プロテオグリカンの添加による細胞増殖に関連する受容体のリン酸化の確認）
図２で見られたプロテオグリカンの添加による細胞増殖のメカニズムを検討するために、軟骨細胞を含む間葉系細胞の増殖への関与が知られているＩＧＦ－１のシグナルに着目し、その受容体の活性化（プロテオグリカン自体のＩＧＦ－１受容体リン酸化への関与の有無の検討など）を評価した。ＡＴＤＣ５細胞におけるプロテオグリカン自体のＩＧＦ－１受容体（ＩＧＦ－１Ｒとも標記する）のリン酸化への関与を検討するために、血清を完全に抜いた状態でのプロテオグリカンの添加により、ＩＧＦ－１受容体のリン酸化が上昇するかを評価した。また、血清によるＩＧＦ－１受容体のリン酸化をプロテオグリカンがさらに上昇させるかについても同時に評価した。その結果、無血清培地でのＡＴＤＣ５細胞の培養において、ＩＧＦ－１受容体のリン酸化がほとんど見られない状態において、プロテオグリカンの添加により、ＩＧＦ－１受容体のリン酸化を誘導した（図３Ａ）。また、血清によるＩＧＦ－１受容体のリン酸化状態においても、プロテオグリカンの添加によりリン酸化をさらに上昇された。次に、ＩＧＦ－１受容体以外のチロシンキナーゼ型受容体としてＥＧＦＲに関するプロテオグリカンの効果を、ＡＴＤＣ５細胞を用いて、同様に評価した。その結果、無血清培地でのＡＴＤＣ５細胞の培養において、ＥＧＦＲのリン酸化がほとんど見られない状態において、プロテオグリカンの添加により、ＥＧＦＲのリン酸化が誘導された（図３Ｂ）。また、血清培地でのＡＴＤＣ５細胞の培養（ＥＧＦＲのリン酸化の状態）において、プロテオグリカンの添加により、ＥＧＦＲのリン酸化がさらに上昇された。
図２で見られたプロテオグリカンの添加による細胞増殖のメカニズムを検討するために、軟骨細胞を含む間葉系細胞の増殖への関与が知られているＩＧＦ－１のシグナルに着目し、その受容体の活性化（プロテオグリカン自体のＩＧＦ－１受容体リン酸化への関与の有無の検討など）を評価した。ＡＴＤＣ５細胞におけるプロテオグリカン自体のＩＧＦ－１受容体（ＩＧＦ－１Ｒとも標記する）のリン酸化への関与を検討するために、血清を完全に抜いた状態でのプロテオグリカンの添加により、ＩＧＦ－１受容体のリン酸化が上昇するかを評価した。また、血清によるＩＧＦ－１受容体のリン酸化をプロテオグリカンがさらに上昇させるかについても同時に評価した。その結果、無血清培地でのＡＴＤＣ５細胞の培養において、ＩＧＦ－１受容体のリン酸化がほとんど見られない状態において、プロテオグリカンの添加により、ＩＧＦ－１受容体のリン酸化を誘導した（図３Ａ）。また、血清によるＩＧＦ－１受容体のリン酸化状態においても、プロテオグリカンの添加によりリン酸化をさらに上昇された。次に、ＩＧＦ－１受容体以外のチロシンキナーゼ型受容体としてＥＧＦＲに関するプロテオグリカンの効果を、ＡＴＤＣ５細胞を用いて、同様に評価した。その結果、無血清培地でのＡＴＤＣ５細胞の培養において、ＥＧＦＲのリン酸化がほとんど見られない状態において、プロテオグリカンの添加により、ＥＧＦＲのリン酸化が誘導された（図３Ｂ）。また、血清培地でのＡＴＤＣ５細胞の培養（ＥＧＦＲのリン酸化の状態）において、プロテオグリカンの添加により、ＥＧＦＲのリン酸化がさらに上昇された。
【0052】
（軟骨前駆細胞に接触させたプロテオグリカンの局在の空間解析）
蛍光ラベルをしたプロテオグリカンを用いて、軟骨前駆細胞に接触させたプロテオグリカンの局在化を、共焦点顕微鏡を用いて、空間解析を行った。
蛍光ラベルをしたプロテオグリカンを用いて、軟骨前駆細胞に接触させたプロテオグリカンの局在化を、共焦点顕微鏡を用いて、空間解析を行った。
【0053】
まず、この確認で用いた蛍光ラベルをしたプロテオグリカンを作製した。ＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とプロテオグリカンとを、メーカー推奨の方法（製品：ＡＴＴＯ ４８８ ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に示す方法）にて、室温で２時間反応させた。この反応の後、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製を行い、蛍光ラベル化プロテオグリカンを回収した。
【0054】
次に、無血清条件下のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にあるＡＴＤＣ５細胞に、蛍光ラベル化プロテオグリカンを添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件にて３０分間培養を行った。この培養の後、常法にてＡＴＤＣ５細胞をＰＢＳで洗浄を行った。この洗浄の後、ＡＴＤＣ５細胞を無血清条件下のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地におき、ＡＴＤＣ５細胞の細胞膜を染色する為にＣｅｌｌＭａｓｋ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件にて３０分間培養を行った。この培養の後、常法にてＡＴＤＣ５細胞をＰＢＳで洗浄を行った。この洗浄後のＡＴＤＣ５細胞を、ＣＯ２供給装置を搭載したＬＳＭ ７１０ ＣＬＳＭ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて、ライブセルイメージングを行い、光学断層による三次元画像を取得した。
【0055】
この画像（確認した結果）を図４に示す。図４において、プロテオグリカン（＋）は上述の蛍光ラベルをしたプロテオグリカンを添加して培養した群の三次元画像であり、プロテオグリカン（－）はプロテオグリカンと反応させていないＡＴＴＯ ４８８のみを添加した群（上述の蛍光ラベルをしたプロテオグリカンを添加せずに培養した群）の三次元画像である。
【0056】
図４の左図は、上述の蛍光ラベルをしたプロテオグリカンを添加せずに培養した群の軟骨前駆細胞１０を示し、右図は上述の蛍光ラベルをしたプロテオグリカンを添加して培養した群の軟骨前駆細胞１０を示す。図４に示したように、ＡＴＴＯ ４８８で蛍光標識したプロテオグリカン２０は、軟骨前駆細胞１０の細胞膜上に局在化した。プロテオグリカンは、細胞膜の表面に局在化したが、細胞にダメージを与えなかった。細胞膜表面への局在化は、１時間から２４時間及び４８時間経過後も維持された。
【0057】
（プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の軟骨分化に及ぼす影響）
プロテオグリカンの添加による軟骨分化能の評価を行った。ＡＴＤＣ５細胞をコンフルエントまで培養した後、インスリンの未添加状態で、プロテオグリカンを添加した群において形態の変化が認められるかを、顕微鏡を用いて、画像観察を行った。陽性対照としてインスリンの添加群を用いた。その結果を図５Ａに示す。プロテオグリカン未添加群（図５Ａのａ）に関しては、接触阻止の状態で変化は認められなかったが、プロテオグリカン添加群では、プロテオグリカン添加７日以降で顕著な細胞凝集が見られた（図５Ａのｃ）。また、陽性対照のインスリンの添加群に関しては、インスリンの添加後５日以降で顕著な細胞凝集が見られた（図５Ａのｂ）。その後さらに２１日目まで培養を行い、三次元の軟骨様結節の形成及び、アルシアンブルーによる染色にて軟骨分化能を評価した。未添加の細胞に関しては、三次元の軟骨様結節の形成は認められず、アルシアンブルーの陽性も認められなかった（図５Ａのｄ）。一方、陽性対照であるインスリンの添加群では、インスリンの添加によって顕著な三次元の軟骨様結節が形成され、アルシアンブルーも顕著な陽性であった（図５Ａのｅ）。プロテオグリカンの添加群では、顕著な軟骨様結節が認められ、アルシアンブルーも顕著な陽性であった（図５Ａのｆ）。画像解析ソフト（ｗｉｎｒｏｏｆ）を用いて、陽性エリア（アルシアンブルーが染色されたエリア）を抽出し、定量解析を行った。その結果、プロテオグリカンに関しては、アルシアンブルーの陽性エリア（アルシアンブルーが染色されたエリア）が有意に増加し、濃度依存性も認められた（図５Ｂ）。また、陽性対照のインスリンの添加群に関しては、濃度依存的に、アルシアンブルーの陽性エリアの有意な増加が認められた（図５Ｂ）。
プロテオグリカンの添加による軟骨分化能の評価を行った。ＡＴＤＣ５細胞をコンフルエントまで培養した後、インスリンの未添加状態で、プロテオグリカンを添加した群において形態の変化が認められるかを、顕微鏡を用いて、画像観察を行った。陽性対照としてインスリンの添加群を用いた。その結果を図５Ａに示す。プロテオグリカン未添加群（図５Ａのａ）に関しては、接触阻止の状態で変化は認められなかったが、プロテオグリカン添加群では、プロテオグリカン添加７日以降で顕著な細胞凝集が見られた（図５Ａのｃ）。また、陽性対照のインスリンの添加群に関しては、インスリンの添加後５日以降で顕著な細胞凝集が見られた（図５Ａのｂ）。その後さらに２１日目まで培養を行い、三次元の軟骨様結節の形成及び、アルシアンブルーによる染色にて軟骨分化能を評価した。未添加の細胞に関しては、三次元の軟骨様結節の形成は認められず、アルシアンブルーの陽性も認められなかった（図５Ａのｄ）。一方、陽性対照であるインスリンの添加群では、インスリンの添加によって顕著な三次元の軟骨様結節が形成され、アルシアンブルーも顕著な陽性であった（図５Ａのｅ）。プロテオグリカンの添加群では、顕著な軟骨様結節が認められ、アルシアンブルーも顕著な陽性であった（図５Ａのｆ）。画像解析ソフト（ｗｉｎｒｏｏｆ）を用いて、陽性エリア（アルシアンブルーが染色されたエリア）を抽出し、定量解析を行った。その結果、プロテオグリカンに関しては、アルシアンブルーの陽性エリア（アルシアンブルーが染色されたエリア）が有意に増加し、濃度依存性も認められた（図５Ｂ）。また、陽性対照のインスリンの添加群に関しては、濃度依存的に、アルシアンブルーの陽性エリアの有意な増加が認められた（図５Ｂ）。
【0058】
（プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の軟骨分化組織の観察）
図５で見られたプロテオグリカンの添加による軟骨様結節に関して、三次元構造を確認する為に、ＨＥ染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ染色）を行った。ＡＴＤＣ５細胞をインサート上に播種し、ＡＴＤＣ５細胞をコンフルエントまで培養した後、プロテオグリカンの添加及び未添加で２１日間培養を行い、パラフィン切片の作製、ＨＥ染色を行い、顕微鏡にて画像を取得した。陽性対照にはインスリンの添加群を用いた。プロテオグリカン未添加群に関しては単層の軟骨前駆細胞の単一層のみが認められた（図６Ａのａ）。インスリンを添加した群（インスリンの添加群）に関しては、三次元に分化した重層構造が認められ、核及び細胞の肥大化が認められた（図６Ａのｂ）。プロテオグリカンを添加した群では、細胞を含んだ三次元の重層構造が認められたが、インスリンを添加した群と比較すると、核の肥大化は抑えられていた（図６Ａのｃ）。また、形態として単層細胞のような扁平化した構造では無く、核が丸い形態をした重層構造であった（図６Ａのｃ）。顕微鏡下で、顕著な軟骨様結節の形成と組織切片による三次元方向への分化が認められたが、生理的な活性が生じているかを検討する為に、コンフルエントからの三次元的な軟骨細胞への分化に伴う、細胞数の増加が認められるかについて、ＷＳＴ法を用いて評価した。その結果、プロテオグリカン未添加群と比較して有意な細胞増殖が認められたことから、三次元的な軟骨細胞の増殖が示唆された（図６Ｂ）。また、インスリンに関しても有意な軟骨細胞の増殖が確認できた（図６Ｂ）。よって、図６Ａと図６Ｂに示す観察結果から、プロテオグリカンの添加により、分化した軟骨細胞が増えていることが示された。
図５で見られたプロテオグリカンの添加による軟骨様結節に関して、三次元構造を確認する為に、ＨＥ染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ染色）を行った。ＡＴＤＣ５細胞をインサート上に播種し、ＡＴＤＣ５細胞をコンフルエントまで培養した後、プロテオグリカンの添加及び未添加で２１日間培養を行い、パラフィン切片の作製、ＨＥ染色を行い、顕微鏡にて画像を取得した。陽性対照にはインスリンの添加群を用いた。プロテオグリカン未添加群に関しては単層の軟骨前駆細胞の単一層のみが認められた（図６Ａのａ）。インスリンを添加した群（インスリンの添加群）に関しては、三次元に分化した重層構造が認められ、核及び細胞の肥大化が認められた（図６Ａのｂ）。プロテオグリカンを添加した群では、細胞を含んだ三次元の重層構造が認められたが、インスリンを添加した群と比較すると、核の肥大化は抑えられていた（図６Ａのｃ）。また、形態として単層細胞のような扁平化した構造では無く、核が丸い形態をした重層構造であった（図６Ａのｃ）。顕微鏡下で、顕著な軟骨様結節の形成と組織切片による三次元方向への分化が認められたが、生理的な活性が生じているかを検討する為に、コンフルエントからの三次元的な軟骨細胞への分化に伴う、細胞数の増加が認められるかについて、ＷＳＴ法を用いて評価した。その結果、プロテオグリカン未添加群と比較して有意な細胞増殖が認められたことから、三次元的な軟骨細胞の増殖が示唆された（図６Ｂ）。また、インスリンに関しても有意な軟骨細胞の増殖が確認できた（図６Ｂ）。よって、図６Ａと図６Ｂに示す観察結果から、プロテオグリカンの添加により、分化した軟骨細胞が増えていることが示された。
【0059】
（プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の軟骨への分化を調節する因子に及ぼす影響）
プロテオグリカンの添加により、軟骨分化の初期に見られる細胞凝集を介してアルシアンブルー陽性の軟骨様結節が形成されたことから、ＩＧＦ－１活性の関与を検討するために、ＩＧＦ－１受容体のリン酸化の有無を評価した。その結果、プロテオグリカンの添加により、ＩＧＦ－１受容体はプロテオグリカンの未添加群と比較してＴｙｒ１１３５／１１３６における顕著なリン酸化の上昇が認められた（図７ＡとＢ）。また、インスリンの添加においても非常に顕著なリン酸化の上昇が認められた（図７ＡとＢ）。ただし、プロテオグリカンの添加において６時間から４８時間まで、プロテオグリカン未添加群と比較してリン酸化の上昇が見られた（図７ＡとＢ）。インスリンの添加においては、６時間でのリン酸化と比較するとそれ以降は全て減少の傾向を示した（図７ＡとＢ）。次に、プロテオグリカンの添加により、軟骨分化に関わる遺伝子として顕著な増加が認められたＧＤＦ５について、そのタンパク質の発現を特異的抗体で評価した。その結果、プロテオグリカンの添加によるＧＤＦ５の発現は、コントロール（プロテオグリカンの未添加群）と比較して７日目で発現上昇の傾向が見られ、１４日目では有意な発現上昇が認められた（図７ＣとＤ）。また、インスリンの添加群においても、ＧＤＦ５のタンパク質は有意な上昇を示した（図７ＣとＤ）。
プロテオグリカンの添加により、軟骨分化の初期に見られる細胞凝集を介してアルシアンブルー陽性の軟骨様結節が形成されたことから、ＩＧＦ－１活性の関与を検討するために、ＩＧＦ－１受容体のリン酸化の有無を評価した。その結果、プロテオグリカンの添加により、ＩＧＦ－１受容体はプロテオグリカンの未添加群と比較してＴｙｒ１１３５／１１３６における顕著なリン酸化の上昇が認められた（図７ＡとＢ）。また、インスリンの添加においても非常に顕著なリン酸化の上昇が認められた（図７ＡとＢ）。ただし、プロテオグリカンの添加において６時間から４８時間まで、プロテオグリカン未添加群と比較してリン酸化の上昇が見られた（図７ＡとＢ）。インスリンの添加においては、６時間でのリン酸化と比較するとそれ以降は全て減少の傾向を示した（図７ＡとＢ）。次に、プロテオグリカンの添加により、軟骨分化に関わる遺伝子として顕著な増加が認められたＧＤＦ５について、そのタンパク質の発現を特異的抗体で評価した。その結果、プロテオグリカンの添加によるＧＤＦ５の発現は、コントロール（プロテオグリカンの未添加群）と比較して７日目で発現上昇の傾向が見られ、１４日目では有意な発現上昇が認められた（図７ＣとＤ）。また、インスリンの添加群においても、ＧＤＦ５のタンパク質は有意な上昇を示した（図７ＣとＤ）。
【0060】
（プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞の石灰化に及ぼす影響）
ＡＴＤＣ５細胞を用いて、軟骨石灰化誘導条件下において、プロテオグリカンの添加による石灰化抑制能の評価を行った。ＡＴＤＣ５細胞をコンフルエントまで培養した後、インスリン添加状態で２８日間培養して軟骨様結節を形成させ、さらに石灰化誘導条件下でプロテオグリカンを添加して２４日間（２８日間も含めると５２日目）まで培養を行い、形態変化については細胞観察像により評価し、石灰化に関してはアリザリンレッドによる染色により評価した。石灰化はプロテオグリカンの未添加群を基準として評価した。プロテオグリカンの未添加のサンプルに関しては、アリザリンレッドの染色により顕著な陽性を示した（図８Ａ、Ｎｏｎの群）。一方、プロテオグリカンの添加群では、アリザリンレッド染色により染色されたエリアも僅かであった（図８Ａ、Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎの群）。また、この際に、軟骨様結節の消失を懸念して、同一条件のサンプルをアルシアンブルーで染色した結果、顕著な陽性を示した（図８Ｂ）。画像解析ソフト（ｗｉｎｒｏｏｆ）にて陽性エリア（アリザリンレッド染色により染色されたエリア）を抽出し、定量解析を行った。その結果、プロテオグリカンの添加により、プロテオグリカンの１０μｇ／ｍＬの添加群から、濃度依存的にアリザリンレッドの陽性は抑制された（図８Ａ、Ｃ）。
ＡＴＤＣ５細胞を用いて、軟骨石灰化誘導条件下において、プロテオグリカンの添加による石灰化抑制能の評価を行った。ＡＴＤＣ５細胞をコンフルエントまで培養した後、インスリン添加状態で２８日間培養して軟骨様結節を形成させ、さらに石灰化誘導条件下でプロテオグリカンを添加して２４日間（２８日間も含めると５２日目）まで培養を行い、形態変化については細胞観察像により評価し、石灰化に関してはアリザリンレッドによる染色により評価した。石灰化はプロテオグリカンの未添加群を基準として評価した。プロテオグリカンの未添加のサンプルに関しては、アリザリンレッドの染色により顕著な陽性を示した（図８Ａ、Ｎｏｎの群）。一方、プロテオグリカンの添加群では、アリザリンレッド染色により染色されたエリアも僅かであった（図８Ａ、Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎの群）。また、この際に、軟骨様結節の消失を懸念して、同一条件のサンプルをアルシアンブルーで染色した結果、顕著な陽性を示した（図８Ｂ）。画像解析ソフト（ｗｉｎｒｏｏｆ）にて陽性エリア（アリザリンレッド染色により染色されたエリア）を抽出し、定量解析を行った。その結果、プロテオグリカンの添加により、プロテオグリカンの１０μｇ／ｍＬの添加群から、濃度依存的にアリザリンレッドの陽性は抑制された（図８Ａ、Ｃ）。
【0061】
（プロテオグリカンの添加によるＡＴＤＣ５細胞での軟骨の石灰化に調節する因子（ｍＲＮＡ）の発現の変化）
ＡＴＤＣ５細胞において、プロテオグリカンの添加により、軟骨石灰化抑制に関して、どのような因子の変動が認められたかについて、ｑＲＴ－ＰＣＲ法を用いて、軟骨の石灰化に関連する因子（Ｒｕｎｘ２、Ｃｏｌ１０、Ｍｇｐ）の遺伝子発現解析を行った。プロテオグリカンの添加により、軟骨石灰化を誘導する中心的因子であるＲｕｎｘ２の発現が有意に抑制された（図９Ａ）。また、プロテオグリカンの添加により、軟骨石灰化の指標であるＣｏｌ１０の発現も有意に抑制された（図９Ｂ）。一方、プロテオグリカンの添加により、軟骨石灰化の抑制因子であるＭｇｐの発現は有意に増加された（図９Ｃ）。
ＡＴＤＣ５細胞において、プロテオグリカンの添加により、軟骨石灰化抑制に関して、どのような因子の変動が認められたかについて、ｑＲＴ－ＰＣＲ法を用いて、軟骨の石灰化に関連する因子（Ｒｕｎｘ２、Ｃｏｌ１０、Ｍｇｐ）の遺伝子発現解析を行った。プロテオグリカンの添加により、軟骨石灰化を誘導する中心的因子であるＲｕｎｘ２の発現が有意に抑制された（図９Ａ）。また、プロテオグリカンの添加により、軟骨石灰化の指標であるＣｏｌ１０の発現も有意に抑制された（図９Ｂ）。一方、プロテオグリカンの添加により、軟骨石灰化の抑制因子であるＭｇｐの発現は有意に増加された（図９Ｃ）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
