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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-09
(45)【発行日】2024-12-17
(54)【発明の名称】新規なエステラーゼ及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/18 20060101AFI20241210BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241210BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241210BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241210BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241210BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241210BHJP
C12Q 1/44 20060101ALI20241210BHJP
C11D 3/386 20060101ALI20241210BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20241210BHJP
【ＦＩ】
C12N9/18
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12Q1/44
C11D3/386
C12N15/55 ZNA
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021504395
(86)(22)【出願日】2019-07-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-11-18
(86)【国際出願番号】 EP2019070289
(87)【国際公開番号】W WO2020021118
(87)【国際公開日】2020-01-30
【審査請求日】2022-07-25
(31)【優先権主張番号】18306020.1
(32)【優先日】2018-07-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】18306447.6
(32)【優先日】2018-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】514245373
【氏名又は名称】キャルビオス
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＢＩＯＳ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ドゥケーヌ，ソフィー
(72)【発明者】
【氏名】トゥルニエ，ヴァンサン
(72)【発明者】
【氏名】マルティ，アラン
【審査官】野村 英雄
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第１８／０１１２８１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第１８／０１１２８４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第１２／０９９０１８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第１５／０８５９２０（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）配列番号：１に示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、（ｉｉ）配列番号：１のアミノ酸配列と比較して、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ又はＦ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃから選択される少なくとも１つの置換の組み合わせ及びＶ１７０Ｉ、Ｖ１７７Ｉ、Ｔ１７６Ｎ、Ｔ６１Ｍ、Ｓ６５Ｔ、Ｙ９２Ｇ及びＮ２１１Ｍから選択される１つの置換を有し、（ｉｉｉ）配列番号：１のエステラーゼと比較して、向上したポリエステル分解活性及び向上した熱安定性を示す、エステラーゼ。
【請求項2】
（ｉ）配列番号：１に示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１記載のエステラーゼ。
【請求項3】
前記エステラーゼが、さらに、親エステラーゼにおけるのと同様に、Ｓ１３０、Ｄ１７５又はＨ２０７から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、請求項１又は２記載のエステラーゼ。
【請求項4】
前記エステラーゼが、さらに、Ａ１２１Ｓ、Ｎ２１３Ｐ、Ｓ２１２Ｆ／Ｔ／Ｉ／Ｌ、Ａ１２５Ｇ、Ｎ２０４Ｄ／Ｉ／Ｌ／Ｙ／Ｈ／Ｆ、Ｇ１３５Ａ、Ｗ６９Ｒ、Ｎ２１４Ｄ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｙ／Ｈ、Ｎ２４１Ｐ、Ｎ２４３Ｐ、Ｒ１２Ｆ／Ｙ／Ｈ、Ｐ１７９Ｅ、Ｖ２４２Ｙ、Ｖ１６７Ｑ又はＮ２１１Ｄ／Ｍから選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項１～３のいずれか一項記載のエステラーゼ。
【請求項5】
前記エステラーゼが、以下の表に列記された置換の組み合わせから選択される置換の組み合わせを含む、請求項１～４のいずれか一項記載のエステラーゼ。【表1】
【請求項6】
前記エステラーゼが、配列番号：２に示されるアミノ酸配列及びＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ又はＦ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃから選択される少なくとも１つの置換の組み合わせ及びＶ１７０Ｉ、Ｖ１７７Ｉ、Ｔ６１Ｍ、Ｔ１７６Ｎ、Ｓ６５Ｔ、Ｎ２１１Ｍ又はＦ９２Ｇから選択される１つの置換を有し、ここで、該位置は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を参照してナンバリングされ、配列番号：１のエステラーゼと比較して、向上したポリエステル分解活性及び向上した熱安定性を示す、請求項１～５のいずれか一項記載のエステラーゼ。
【請求項7】
前記エステラーゼが、さらに、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６又は配列番号：７に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をＮ末端に含む、請求項１～６のいずれか一項記載のエステラーゼ。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項記載のエステラーゼをコードする、核酸。
【請求項9】
請求項８記載の核酸を含む、発現カセット又はベクター。
【請求項10】
請求項８記載の核酸又は請求項９記載の発現カセットもしくはベクターを含む、ホスト細胞。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか一項記載のエステラーゼ又は請求項１０記載のホスト細胞、及び賦形剤を含む、組成物。
【請求項12】
ポリエステル含有材料の少なくとも１種のポリエステルを分解する方法であって、(ａ)ポリエステル含有材料を請求項１～７のいずれか一項記載のエステラーゼ又は請求項１０記載のホスト細胞又は請求項１１記載の組成物と接触させることを含む、
方法。
【請求項13】
前記ポリエステルが、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタラート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタラート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）、ポリブチレンスクシナート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシナートアジパート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジパートテレフタラート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノアート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジパート)(ＰＥＡ)、ポリエチレンナフタラート（ＰＥＮ）及びこれらの材料のブレンド／混合物から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項14】
請求項１～７のいずれか一項記載のエステラーゼ又は請求項１０記載のホスト細胞又は請求項１１記載の組成物を含有する、ポリエステル含有材料。
【請求項15】
請求項１～７のいずれか一項記載のエステラーゼ又は請求項１０記載のホスト細胞又は請求項１１記載の組成物を含む、洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規なエステラーゼ、とりわけ、親エステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された熱安定性を有するエステラーゼに関する。また、本発明は、ポリエステル含有材料、例えば、プラスチック製品を分解するための前記新規なエステラーゼの使用に関する。本発明のエステラーゼは、ポリエチレンテレフタラート及びポリエチレンテレフタラート含有材料を分解するのに特に適している。
【0002】
背景
エステラーゼは、ポリエステルを含む各種のポリマーの加水分解を触媒可能である。この文脈において、エステラーゼは、食器洗浄及び洗濯用途のための洗剤として、バイオマス及び食品を加工するための分解酵素として、環境汚染物質の無毒化における生体触媒として又は織物産業におけるポリエステル布地の処理のためを含む、多くの産業用途において有望な効果を示している。ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）を加水分解するための分解酵素としてのエステラーゼの使用は特に興味深い。実際に、ＰＥＴは、衣類、カーペットの製造又は包装もしくは自動車用プラスチック等の製造のための熱硬化性樹脂の形態等の多数の技術分野で使用されている。その結果、埋め立てごみ処理地におけるＰＥＴの蓄積は、ますます生態学的問題となっている。
エステラーゼは、ポリエステルを含む各種のポリマーの加水分解を触媒可能である。この文脈において、エステラーゼは、食器洗浄及び洗濯用途のための洗剤として、バイオマス及び食品を加工するための分解酵素として、環境汚染物質の無毒化における生体触媒として又は織物産業におけるポリエステル布地の処理のためを含む、多くの産業用途において有望な効果を示している。ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）を加水分解するための分解酵素としてのエステラーゼの使用は特に興味深い。実際に、ＰＥＴは、衣類、カーペットの製造又は包装もしくは自動車用プラスチック等の製造のための熱硬化性樹脂の形態等の多数の技術分野で使用されている。その結果、埋め立てごみ処理地におけるＰＥＴの蓄積は、ますます生態学的問題となっている。
【0003】
ポリエステル、特に、ＰＥＴの酵素分解は、プラスチック廃棄物の蓄積を減少させるための興味深い解決策と考えられる。実際に、酵素は、ポリエステル含有材料、とりわけ、プラスチック製品の加水分解を、モノマーレベルにまでも加速させることができる。さらに、加水分解物（すなわち、モノマー及びオリゴマー）は、新しいポリマーを合成するための材料として再利用することができる。
【0004】
この文脈において、幾つかのエステラーゼが、ポリエステルのための分解酵素の候補として特定されており、このようなエステラーゼの一部の変異体が開発されている。エステラーゼの中で、クチナーゼ（クチンヒドロラーゼとしても公知）（ＥＣ ３．１．１．７４）が特に興味深い。クチナーゼは、種々の真菌（P.E. Kolattukudy in 「Lipases」, Ed. B. Borg- strom and H.L. Brockman, Elsevier 1984, 471-504）、細菌及び植物花粉から特定されている。近年、メタゲノミクスのアプローチにより、更なるエステラーゼが特定されている。
【0005】
しかしながら、ポリエステル分解プロセスをより効率的に、それにより、より競争力のあるものにするために、既知のエステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された熱安定性を有するエステラーゼが依然として必要とされている。
【0006】
発明の概要
本発明は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する親エステラーゼ又は野生型エステラーゼと比較して、向上した活性及び／又は向上した熱安定性を示す、新規なエステラーゼを提供する。この野生型エステラーゼは、Sulaiman et al., Appl Environ Microbiol. 2012 Marに記載されているメタゲノム由来クチナーゼのアミノ酸配列のアミノ酸３６～２９３に対応し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔのＧ９ＢＹ５７に言及されている。本発明のエステラーゼは、プラスチック製品、とりわけ、ＰＥＴを含有するプラスチック製品を分解するための方法に特に有用である。
本発明は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する親エステラーゼ又は野生型エステラーゼと比較して、向上した活性及び／又は向上した熱安定性を示す、新規なエステラーゼを提供する。この野生型エステラーゼは、Sulaiman et al., Appl Environ Microbiol. 2012 Marに記載されているメタゲノム由来クチナーゼのアミノ酸配列のアミノ酸３６～２９３に対応し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔのＧ９ＢＹ５７に言及されている。本発明のエステラーゼは、プラスチック製品、とりわけ、ＰＥＴを含有するプラスチック製品を分解するための方法に特に有用である。
【0007】
これについて、本発明の目的は、（ｉ）配列番号：１に示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し、（ｉｉ）配列番号：１のアミノ酸配列と比較して、Ｆ２０８、Ｄ２０３、Ｓ２４８、Ｖ１７０、Ｖ１７７、Ｔ１７６、Ｔ６１、Ｓ６５又はＹ９２から選択される位置に少なくとも４つの置換を含有し、（ｉｉｉ）配列番号：１のエステラーゼと比較して、向上したポリエステル分解活性及び／又は向上した熱安定性を示す、エステラーゼを提供することである。
【0008】
本発明の別の目的は、（ｉ）配列番号：１に示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し、（ｉｉ）配列番号：１のアミノ酸配列と比較して、Ｆ２０８、Ｄ２０３、Ｓ２４８、Ｖ１７０、Ｖ１７７、Ｔ１７６、Ｔ６１、Ｓ６５、Ｎ２１１又はＹ９２から選択される位置に少なくとも４つの置換を含有し、（ｉｉｉ）配列番号：１のエステラーゼと比較して、向上したポリエステル分解活性及び／又は向上した熱安定性を示す、エステラーゼを提供することである。
【0009】
好ましくは、該エステラーゼは、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８の位置における置換の組み合わせ及びＶ１７０、Ｖ１７７、Ｔ１７６、Ｔ６１、Ｓ６５、Ｎ２１１又はＹ９２から選択される位置に１つ又は２つの置換を少なくとも含む。
【0010】
本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼをコードする核酸を提供することである。また、本発明は、前記核酸を含む発現カセット又は発現ベクター及び前記核酸、発現カセット又はベクターを含むホスト細胞に関する。
【0011】
また、本発明は、本発明のエステラーゼ、本発明のホスト細胞又はその抽出物を含む、組成物を提供する。
【0012】
本発明の更なる目的は、（ａ）本発明のホスト細胞を、エステラーゼをコードする核酸を発現するのに適した条件下で培養することと、場合により、（ｂ）前記エステラーゼを細胞培養物から回収することとを含む、本発明のエステラーゼを製造する方法を提供することである。
【0013】
本発明の更なる目的は、ポリエステルを分解する方法であって、(ａ)ポリエステルを本発明のエステラーゼ又は本発明のホスト細胞又は本発明の組成物と接触させることと、場合により、(ｂ)モノマー及び／又はオリゴマーを回収することとを含む、方法を提供することである。
【0014】
特に、本発明は、ＰＥＴを分解する方法であって、ＰＥＴを少なくとも１種の本発明のエステラーゼと接触させることと、場合により、ＰＥＴのモノマー及び／又はオリゴマーを回収することとを含む、方法を提供することである。
【0015】
また、本発明は、ポリエステル含有材料の少なくとも１種のポリエステルを分解する方法であって、下記工程：(ａ)ポリエステル含有材料を本発明のエステラーゼ又はホスト細胞と接触させることにより、ポリエステル含有材料の少なくとも１種のポリエステルを分解する工程と、場合により、(ｂ)前記少なくとも１種のポリエステルのモノマー及び／又はオリゴマーを回収する工程とを含む、方法に関する。
【0016】
また、本発明は、ＰＥＴ又はＰＥＴを含有するプラスチック製品を分解するための、本発明のエステラーゼの使用に関する。
【0017】
また、本発明は、本発明のエステラーゼ又はホスト細胞又は組成物が含まれている、ポリエステル含有材料に関する。
【0018】
また、本発明は、本発明のエステラーゼもしくはホスト細胞又は本発明のエステラーゼを含む組成物を含む、洗剤組成物に関する。
【0019】
発明の詳細な説明
定義
本開示は、下記定義を参照することにより最も良く理解されるであろう。
定義
本開示は、下記定義を参照することにより最も良く理解されるであろう。
【0020】
本明細書において、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」という用語は、鎖を形成するアミノ酸の数にかかわらず、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の鎖を指す。本明細書において、アミノ酸は、下記命名法に従った１文字又は３文字のコードにより表される：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リシン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：トレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）及びＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。
【0021】
「エステラーゼ」という用語は、酵素命名法に従ってＥＣ ３．１．１に分類されるヒドロラーゼのクラスに属し、エステルの酸とアルコールとへの加水分解を触媒する酵素を指す。「クチナーゼ」又は「クチンヒドロラーゼ」という用語は、酵素命名法に従ってＥＣ ３．１．１．７４に分類され、クチン及び水からのクチンモノマーの生成の化学反応を触媒可能なエステラーゼを指す。
【0022】
「野生型タンパク質」又は「親タンパク質」という用語は、天然に存在するポリペプチドの非突然変異版を指す。本件では、親エステラーゼは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するエステラーゼを指す。
【0023】
「突然変異体」及び「変異体」という用語は、配列番号：１に由来し、１つ以上の（例えば、複数の）位置に少なくとも１つの修飾又は改変、すなわち、置換、挿入及び／又は欠失を含み、ポリエステル分解活性を有するポリペプチドを指す。変異体は、当技術分野において周知の種々の技術により得ることができる。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変するための技術の例は、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発及び合成オリゴヌクレオチド構築を含むが、これらに限定されない。このため、本明細書で使用する場合、特定の位置に関する「修飾」及び「改変」という用語は、この特定の位置のアミノ酸が野生型タンパク質におけるこの特定の位置のアミノ酸と比較して修飾されていることを意味する。
【0024】
「置換」は、アミノ酸残基が別のアミノ酸残基により置き換えられていることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、天然の標準的な２０種のアミノ酸残基、天然に稀に存在するアミノ酸残基（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、６－Ｎ－メチルリシン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロイソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）及び多くの場合合成される非天然アミノ酸残基（例えば、シクロヘキシルアラニン）から選択される別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置き換えを指す。好ましくは、「置換」という用語は、天然の標準的な２０種アミノ酸残基（Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ及びＴ）から選択される別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置き換えを指す。「＋」という符号は、置換の組み合わせを示す。本明細書において、下記専門用語は、置換を指定するのに使用される：Ｌ８２Ａは、親配列の８２位のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）により置換されていることを指す。Ａ１２１Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１２１位のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が下記アミノ酸：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）又はメチオニン（Ｍ）のうちの１つにより置換されていることを指す。置換は、保存的置換又は非保存的置換であることができる。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン及びトレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）及び小型アミノ酸（グリシン、アラニン及びセリン）のグループ内である。
【0025】
特に断りない限り、本願で開示された位置は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を参照してナンバリングされる。
【0026】
本明細書で使用する場合、「配列同一性」又は「同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列間の一致（同一のアミノ酸残基）の数（又は割合％として表現される分率）を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小限にしながら、重複及び同一性を最大限にするようにアライメントされた場合の配列を比較することにより決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、多数の数学的グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムのいずれかを使用して決定することができる。類似の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたって最適にアライメントさせるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム；Needleman and Wunsch, 1970）を使用してアライメントされ、一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981）又はＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Altschul et al., 1997；Altschul et al., 2005））を使用してアライメントされる。アミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、例えば、インターネットウェブサイト、例えば、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/又はhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/上で利用可能な公衆に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である種々の方法で達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するのに適したパラメーターを決定することができる。本明細書の目的で、％ アミノ酸配列同一性値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して２つの配列の最適なグローバルアラインメントを生成するペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して生成される値を指し、ここで、全ての検索パラメーターは、デフォルト値、すなわち、スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップエクステンド＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープン＝１０及びエンドギャップエクステンド＝０．５に設定される。
【0027】
「ポリマー」は、その構造が共有化学結合により連結された複数のモノマー（繰り返し単位）から構成される化合物又は化合物の混合物を指す。本発明の文脈において、ポリマーという用語は、単一種の繰り返し単位（すなわち、ホモポリマー）又は異なる繰り返し単位の混合物（すなわち、コポリマー又はヘテロポリマー）から構成される天然又は合成ポリマーを含む。本発明によれば、「オリゴマー」は、２～約２０個のモノマーを含有する分子を指す。
【0028】
本発明の文脈において、「ポリエステル含有材料」又は「ポリエステル含有製品」は、少なくとも１種のポリエステルを結晶、半結晶又は完全に非晶質の形態で含む製品、例えば、プラスチック製品を指す。特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、少なくとも１種のプラスチック材料から製造される任意の品目、例えば、プラスチックシート、チューブ、ロッド、プロファイル、シェイプ、フィルム、塊状ブロック等を指す。これらは、少なくとも１種のポリエステルと、場合により、他の物質又は添加剤、例えば、可塑剤、鉱物又は有機充填剤を含有する。別の特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、プラスチック製品を製造するのに適した、溶融状又は固体状のプラスチックコンパウンド又はプラスチック配合物を指す。別の特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、少なくとも１種のポリエステルを含む織物、布地又は繊維を指す。別の特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、少なくとも１種のポリエステルを含むプラスチック廃棄物又は繊維廃棄物を指す。
【0029】
本説明において、「ポリエステル」という用語は、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタラート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタラート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）、ポリブチレンスクシナート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシナートアジパート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジパートテレフタラート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノアート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジパート)(ＰＥＡ)、ポリエチレンナフタラート（ＰＥＮ）及びこれらのポリマーのブレンド／混合物を包含するが、これらに限定されない。
【0030】
新規なエステラーゼ
本発明は、親エステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された熱安定性を有する新規なエステラーゼを提供する。とりわけ、本発明者らは、工業プロセスでの使用に特に適した新規な酵素を設計した。本発明のエステラーゼは、ポリエステル、とりわけ、ＰＥＴ（ＰＥＴ含有材料及び特に、ＰＥＴを含有するプラスチック製品を含む）を分解するのに特に適している。特定の実施態様では、エステラーゼは、向上した活性及び向上した熱安定性の両方を示す。
本発明は、親エステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された熱安定性を有する新規なエステラーゼを提供する。とりわけ、本発明者らは、工業プロセスでの使用に特に適した新規な酵素を設計した。本発明のエステラーゼは、ポリエステル、とりわけ、ＰＥＴ（ＰＥＴ含有材料及び特に、ＰＥＴを含有するプラスチック製品を含む）を分解するのに特に適している。特定の実施態様では、エステラーゼは、向上した活性及び向上した熱安定性の両方を示す。
【0031】
したがって、本発明の目的は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するエステラーゼと比較して、向上した活性を示すエステラーゼを提供することである。
【0032】
特に、本発明者らは、基質とエステラーゼとの接触を促進し、ポリマーの吸着を増加させかつ／又はそれによりこのポリマーに対するエステラーゼの活性を向上させるように有利に修飾されていることができる、エステラーゼのＸ線結晶構造（すなわち、折り畳まれた３Ｄ構造）においてポリマー基質と接触することが意図される、配列番号：１の特定のアミノ酸残基を特定した。
【0033】
本発明の文脈において、「向上した活性」又は「向上した分解活性」という用語は、配列番号：１のエステラーゼが同じ温度で同じポリエステルを分解する能力と比較して、所定の温度でポリエステルを分解するエステラーゼの向上した能力及び／又はポリエステルに吸着する向上した能力を示す。特に、本発明のエステラーゼは、向上したＰＥＴ分解活性を有する。このような向上は、配列番号：１のエステラーゼのＰＥＴ分解活性より少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％以上高いことができる。特に、分解活性は、ポリエステルのモノマー及び／又はオリゴマーをもたらす脱重合活性であり、モノマー及び／又はオリゴマーをさらに回収し、場合により再利用することができる。
【0034】
エステラーゼの「分解活性」は、当業者に公知の方法に従って、当業者が評価することができる。例えば、分解活性は、特定のポリマーの脱重合活性速度の測定、アガープレート中に分散された固体ポリマーコンパウンドを分解する速度の測定又は反応器中でのポリマーの脱重合活性速度の測定により評価することができる。特に、分解活性は、エステラーゼの「比分解活性」を測定することにより評価することができる。ＰＥＴについてのエステラーゼの「比分解活性」は、反応の最初の期間（すなわち、最初の２４時間）におけるエステラーゼ１mgあたりに加水分解されたＰＥＴ μmol/分又はmg 生成された当量のＴＡ/時間に相当し、反応の加水分解曲線の直線部分から決定され、このような曲線は、最初の２４時間の間に異なる時間に行われる複数回のサンプリングにより設定される。別の例として、「分解活性」は、ポリマー又はポリマー含有プラスチック製品を分解酵素と接触させる場合、温度、ｐＨ及びバッファーの適切な条件下で放出されるオリゴマー及び／又はモノマーの割合を、定義された期間後に測定することにより評価することができる。
【0035】
酵素が基質に吸着する能力は、当業者により、当技術分野においてそれ自体公知の方法に従って評価することができる。例えば、酵素が基質に吸着する能力は、酵素を含有する溶液から測定することができ、ここで、酵素は、適切な条件下で基質と予めインキュベーションされる。
【0036】
また、本発明者らは、高温、有利には、５０℃超、好ましくは、７０℃超の温度で、対応するエステラーゼの安定性を改善する（すなわち、改善された熱安定性）のに有利に改変することができる、配列番号：１におけるターゲットアミノ酸残基を特定した。
【0037】
したがって、本発明の目的は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するエステラーゼの熱安定性と比較して向上した熱安定性を示す、新規エステラーゼを提供することである。
【0038】
本発明の文脈において、「向上した熱安定性」という用語は、配列番号：１のエステラーゼと比較して、エステラーゼが、高温、特に、５０℃～９０℃の温度で、その化学的及び／又は物理的構造の変化に抵抗する向上した能力を示す。
【0039】
特に、熱安定性は、エステラーゼの融解温度（Ｔｍ）の評価により評価することができる。本発明の文脈において、「融解温度」は、考慮される酵素集団の半分がアンフォールドされるか又はミスフォールドされる温度を指す。典型的には、本発明のエステラーゼは、配列番号：１のエステラーゼのＴｍと比較して、約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１２℃以上のＴｍの上昇を示す。特に、本発明のエステラーゼは、配列番号：１のエステラーゼと比較して、５０℃～９０℃の温度で延長した半減期を有することができる。
【0040】
エステラーゼの融解温度（Ｔｍ）は、当業者により、当技術分野においてそれ自体公知の方法に従って測定することができる。例えば、ＤＳＦを使用して、エステラーゼの熱変性温度の変化を定量化し、それにより、そのＴｍを決定することができる。代替的には、Ｔｍは、円二色性を使用したタンパク質フォールディングの分析により評価することができる。好ましくは、Ｔｍは、実験部で触れられたＤＳＦ又は円二色性を使用して測定される。本発明の文脈において、Ｔｍの比較は、同じ条件（例えば、ｐＨ、ポリエステルの性質及び量等）下で測定されるＴｍにより行われる。
【0041】
代替的には、熱安定性は、異なる温度でインキュベーションした後のエステラーゼのエステラーゼ活性及び／又はポリエステル脱重合活性を測定し、親エステラーゼのエステラーゼ活性及び／又はポリエステル脱重合活性と比較することにより評価することができる。異なる温度でポリエステルの脱重合アッセイを複数回行う能力も評価することができる。迅速かつ価値のある試験は、種々の温度でのインキュベーション後にアガープレート中に分散された固体ポリエステル化合物を分解するエステラーゼの能力のハロー直径測定による評価からなることができる。
【0042】
このため、本発明の目的は、（ｉ）配列番号：１に示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し、（ｉｉ）配列番号：１のアミノ酸配列と比較して、Ｆ２０８、Ｄ２０３、Ｓ２４８、Ｖ１７０、Ｖ１７７、Ｔ１７６、Ｔ６１、Ｓ６５、Ｎ２１１又はＹ９２から選択される位置に少なくとも４つの置換を含有し、（ｉｉｉ）配列番号：１のエステラーゼと比較して、向上したポリエステル分解活性及び／又は向上した熱安定性を示す、エステラーゼを提供することである。
【0043】
本発明によれば、ターゲットアミノ酸は、１９種の他のアミノ酸のいずれか１つにより置き換えることができる。
【0044】
特定の実施態様では、該エステラーゼ変異体は、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ、Ｄ２０３Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｖ１７０Ｉ、Ｖ１７７Ｉ、Ｔ１７６Ｎ、Ｔ６１Ｍ、Ｓ６５Ｔ又はＹ９２Ｇ／Ｐから選択される少なくとも４つの置換を含有する。
【0045】
別の特定の実施態様では、該エステラーゼ変異体は、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ、Ｄ２０３Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｖ１７０Ｉ、Ｖ１７７Ｉ、Ｔ１７６Ｎ、Ｔ６１Ｍ、Ｓ６５Ｔ、Ｎ２１１Ｄ／Ｍ又はＹ９２Ｇ／ＰもしくはＹ９２Ｆから選択される少なくとも４つの置換を含有する。
【0046】
好ましい実施態様では、本発明のエステラーゼは、親エステラーゼにおけるのと同様に、Ｓ１３０、Ｄ１７５又はＨ２０７から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、すなわち、本発明のエステラーゼは、これらの位置のうちの１つ、２つ又は全てで修飾されていない。好ましくは、該エステラーゼは、親エステラーゼにおけるのと同様に、Ｓ１３０＋Ｄ１７５＋Ｈ２０７の組み合わせを含む。
【0047】
特定の実施態様では、該エステラーゼは、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８の位置における置換の組み合わせ及びＶ１７０、Ｖ１７７、Ｔ１７６、Ｔ６１、Ｓ６５、Ｎ２１１又はＹ９２から選択される位置における１つの置換を少なくとも含む。特定の実施態様では、該エステラーゼは、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｖ１７０、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｖ１７７、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｔ６１、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｙ９２、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｔ１７６、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｓ６５、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｎ２１１又はＦ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｖ１７０＋Ｙ９２から選択される位置の少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。特に、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ又はＦ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃから選択される置換の組み合わせ及びＴ６１Ｍ、Ｖ１７０Ｉ、Ｖ１７７Ｉ、Ｔ１７６Ｎ、Ｓ６５Ｔ、Ｎ２１１Ｄ／Ｍ又はＹ９２Ｇ／Ｐ／Ｆから選択される１つの置換を少なくとも含む。
【0048】
特定の実施態様によれば、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７７Ｉ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７７Ｉ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｆ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｆ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｔ６１Ｍ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｔ６１Ｍ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｔ１７６Ｎ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｔ１７６Ｎ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｓ６５Ｔ及びＦ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｓ６５Ｔからなる組み合わせから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0049】
特定の実施態様によれば、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｄ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｄ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｍ及びＦ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｍからなる組み合わせから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0050】
実施態様において、該エステラーゼは、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８の位置における置換の組み合わせ及びＶ１７０又はＹ９２の位置における１つ又は２つの置換を少なくとも含む。好ましくは、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ又はＦ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃから選択される置換の組み合わせ及びＶ１７０Ｉ又はＹ９２Ｇから選択される１つ又は２つの置換を少なくとも含む。特に、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇから選択される置換の組み合わせを含む。代替的には、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ又はＦ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇから選択される置換の組み合わせを含む。
【0051】
特定の実施態様では、本発明の変異体は、さらに、Ｔ１１、Ｒ１２、Ａ１４、Ｗ６９、Ｒ７３、Ａ２０５、Ｎ２１４、Ａ２１５、Ａ２１６、Ｉ２１７、Ｆ２３８、Ｖ２４２、Ｄ２４４、Ｐ２４５、Ａ２４６、Ｌ２４７、Ｄ９４、Ｒ１３８、Ｄ１５８、Ｑ１８２、Ｆ１８７、Ｐ１０、Ｌ１５、Ｄ１８、Ｎ８７、Ｓ８８、Ｓ９５、Ｑ９９、Ｋ１５９、Ａ１７４、Ａ１２５、Ｓ２１８、Ｓ１３、Ｔ１６、Ｌ２０２、Ｎ２０４、Ｓ２１２、Ｖ２１９、Ｙ２２０、Ｑ２３７、Ｌ２３９、Ｎ２４１、Ｎ２４３、Ａ６２、Ｌ６７、Ｄ９１、Ｐ９３、Ｍ１３１、Ｐ２１０、Ａ２０９、Ｐ１７９、Ｒ３０、Ｇ３７、Ｒ７２、Ｓ９８、Ａ６８、Ｒ９６、Ｈ１５６、Ｈ１８３、Ａ１７、Ｔ２７、Ｓ４８、Ｆ９０、Ｌ８２、Ｇ１３５、Ａ１４０、Ｎ１４３、Ｓ１４５、Ａ１４９、Ｓ１６４、Ｖ１６７、Ｓ２０６、Ｎ２１３、Ｔ２５２、Ｅ１７３、Ｇ５３、Ａ１２１、Ｔ１５７、Ｎ２１１、Ｙ６０、Ｄ６３又はＳ６６から選択される位置に少なくとも１つの置換を含む。
【0052】
特定の実施態様では、本発明の変異体は、さらに、Ｎ２１３、Ｎ２１１、Ａ１２１、Ｎ２０４、Ｓ２１２、Ａ１２５、Ｇ１３５、Ｗ６９、Ｎ２１４、Ｎ２４１、Ｎ２４３、Ｒ１２、Ｐ１７９、Ｖ２４２又はＶ１６７から選択される位置に少なくとも１つの置換を含む。
【0053】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、さらに、置換Ｎ２１３Ｐ／Ｄ、好ましくは、Ｎ２１３Ｐを含む。特に、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｎ２１３Ｐ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。好ましくは、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐからなる置換の組み合わせを含む。
【0054】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、さらに、置換Ｎ２１１Ｄ／Ｍを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１１Ｄ／Ｍ、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｎ２１１Ｄ／Ｍ又はＦ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１１Ｄ／Ｍから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。好ましくは、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１１Ｍ、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｎ２１１Ｍ又はＦ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１１Ｍから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0055】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、さらに、置換Ａ１２１Ｓを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ａ１２１Ｓ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ａ１２１Ｓ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ＋Ａ１２１Ｓから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0056】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、さらに、置換Ｎ２０４Ｄ／Ｉ／Ｌ／Ｙ／Ｈ／Ｆを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２０４Ｄ／Ｉ／Ｌ／Ｙ／Ｈ／Ｆ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｎ２０４Ｄ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２０４Ｄから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0057】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、さらに、置換Ｓ２１２Ｆ／Ｔ／Ｉ／Ｌを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｓ２１２Ｆ／Ｔ／Ｉ／Ｌ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｓ２１２Ｆ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｓ２１２Ｆから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0058】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、置換Ａ１２５Ｇを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ａ１２５Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ａ１２５Ｇ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ＋Ａ１２５Ｇから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0059】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、置換Ｇ１３５Ａを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｇ１３５Ａの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0060】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、置換Ｗ６９Ｒを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｗ６９Ｒ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｗ６９Ｒ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｗ６９Ｒの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0061】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、置換Ｎ２１４Ｄ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｙ／Ｈを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１４Ｄ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｙ／Ｈの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0062】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、置換Ｎ２４１Ｐを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２４１Ｐの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0063】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、置換Ｎ２４３Ｐを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２４３Ｐの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0064】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、置換Ｒ１２Ｆ／Ｙ／Ｈを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｒ１２Ｆ／Ｙ／Ｈの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0065】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、置換Ｐ１７９Ｅを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｐ１７９Ｅの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0066】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、置換Ｖ２４２Ｙを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｖ２４２Ｙの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0067】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、置換Ｖ１６７Ｑを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｖ１６７Ｑの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0068】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、置換Ａ１４０Ｓを含む。
【0069】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、さらに、Ｔ１１、Ｒ１２、Ａ１４、Ｗ６９、Ｒ７３、Ａ２０５、Ｎ２１４、Ａ２１５、Ａ２１６、Ｆ２３８、Ｖ２４２、Ｄ２４４、Ｐ２４５、Ａ２４６、Ｌ２４７、Ｑ１８２、Ｆ１８７又はＳ２１８から選択される位置に少なくとも１つの置換を含む。該置換は、より好ましくは、Ｔ１１Ｍ／Ｅ／Ｉ／Ｓ／Ｎ／Ｄ／Ｑ、Ｒ１２Ｑ／Ｄ／Ｎ／Ｇ／Ｐ／Ｆ／Ｖ／Ｅ／Ｌ／Ｙ、Ｒ１２Ｈ、Ａ１４Ｅ／Ｄ、Ｗ６９Ｄ／Ｍ／Ｅ／Ｒ、Ｒ７３Ｉ／Ｇ／Ｍ／Ｄ／Ｅ／Ｓ／Ｃ／Ｑ／Ｆ／Ｎ／Ｖ、Ａ２０５Ｄ、Ｎ２１４Ｄ／Ｅ／Ｃ、Ｎ２１４Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｙ／Ｈ、Ａ２１５Ｎ、Ａ２１６Ｑ、Ｆ２３８Ｅ、Ｖ２４２Ｐ／Ｙ、Ｄ２４４Ｅ／Ｃ、Ｐ２４５Ｄ／Ｙ／Ｅ、Ａ２４６Ｓ／Ｄ／Ｈ／Ｅ、Ｌ２４７Ｔ、Ｑ１８２Ｄ／Ｅ、Ｆ１８７Ｙ／Ｉ又はＳ２１８Ａから選択される。実施態様において、該エステラーゼは、Ｔ１１Ｍ／Ｉ／Ｓ／Ｎ／Ｄ、Ｒ１２Ｎ／Ｇ／Ｐ／Ｖ／Ｌ、Ａ１４Ｅ、Ｗ６９Ｍ、Ｒ７３Ｉ／Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｃ／Ｑ／Ｆ／Ｎ／Ｖ、Ａ２０５Ｄ、Ｎ２１４Ｅ／Ｃ、Ａ２１５Ｎ、Ｐ２４５Ｙ又はＡ２４６Ｄ／Ｈから選択される少なくとも１つの置換を含む。別の特定の実施態様では、本発明の変異体は、さらに、Ｔ１１、Ｒ１２、Ａ１４、Ｗ６９、Ｒ７３、Ａ２０５、Ｎ２１４、Ａ２１５、Ａ２１６、Ｉ２１７、Ｆ２３８、Ｖ２４２、Ｄ２４４、Ｐ２４５、Ａ２４６、Ｌ２４７、Ｄ９４、Ｒ１３８、Ｄ１５８、Ｑ１８２、Ｆ１８７、Ｐ１０、Ｌ１５、Ｄ１８、Ｎ８７、Ｓ８８、Ｓ９５、Ｑ９９、Ｋ１５９、Ａ１７４、Ａ１２５、Ｓ２１８、Ｓ１３、Ｔ１６、Ｌ２０２、Ｎ２０４、Ｓ２１２、Ｖ２１９、Ｙ２２０、Ｑ２３７、Ｌ２３９、Ｎ２４１、Ｎ２４３、Ａ６２、Ｌ６７、Ｄ９１、Ｐ９３、Ｍ１３１、Ｐ２１０、Ａ２０９、Ｐ１７９、Ｒ３０、Ｇ３７、Ｒ７２、Ｓ９８、Ａ６８、Ｒ９６、Ｈ１５６、Ｈ１８３、Ａ１７、Ｔ２７、Ｓ４８、Ｆ９０、Ｌ８２、Ｇ１３５、Ａ１４０、Ｎ１４３、Ｓ１４５、Ａ１４９、Ｓ１６４、Ｖ１６７、Ｓ２０６、Ｎ２１３、Ｔ２５２、Ｅ１７３、Ｇ５３、Ａ１２１、Ｔ１５７、Ｎ２１１、Ｙ６０、Ｄ６３又はＳ６６から選択される位置に少なくとも２つの置換を含む。
【0070】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、さらに、Ｓ２１２Ｆ＋Ｎ２１３Ｐの置換の組み合わせを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｓ２１２Ｆ＋Ｎ２１３Ｐ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｓ２１２Ｆ＋Ｎ２１３Ｐ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｓ２１２Ｆ＋Ｎ２１３Ｐから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0071】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、Ｎ２１３Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ａ１４０Ｓ、Ｖ１６７Ｑ、Ｎ２４１Ｐ又はＲ１２Ｈから選択される少なくとも２つの置換を含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｇ１３５Ａ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｒ１２Ｈ＋Ｎ２４１Ｐ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｒ１２Ｈ＋Ｖ１６７Ｑ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ａ１４０Ｓ＋Ｖ１６７Ｑ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２４１Ｐ＋Ｖ１６７Ｑから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0072】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、Ｎ２１３Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｖ１６７Ｑ、Ｎ２４１Ｐ又はＲ１２Ｈから選択される少なくとも３つの置換を含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｖ１６７Ｑ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｎ２４１Ｐ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｒ１２Ｈ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２４１Ｐ＋Ｖ１６７Ｑ＋Ｒ１２Ｈから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0073】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、Ａ１７Ｔ、Ｔ２７Ｓ、Ｓ４８Ｔ、Ｆ９０Ｌ、Ｌ８２Ｉ、Ｇ１３５Ａ、Ａ１４０Ｓ、Ｎ１４３Ｉ、Ｓ１４５Ｔ、Ａ１４９Ｇ、Ｓ１６４Ｐ、Ｖ１６７Ｑ、Ｓ２０６Ｔ、Ｎ２１３Ｐ又はＴ２５２Ｓから選択される少なくとも１つの置換、好ましくは、少なくとも２つの置換を含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｆ＋Ａ１７Ｔ＋Ｔ２７Ｓ＋Ｓ４８Ｔ＋Ｌ８２Ｉ＋Ｇ１３５Ａ＋Ａ１４０Ｓ＋Ｎ１４３Ｉ＋Ｓ１４５Ｔ＋Ａ１４９Ｇ＋Ｓ１６４Ｐ＋Ｖ１６７Ｑ＋Ｓ２０６Ｔ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｔ２５２Ｓ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ＋Ａ１７Ｔ＋Ｔ２７Ｓ＋Ｓ４８Ｔ＋Ｌ８２Ｉ＋Ｆ９０Ｌ＋Ｇ１３５Ａ＋Ａ１４０Ｓ＋Ｎ１４３Ｉ＋Ｓ１４５Ｔ＋Ａ１４９Ｇ＋Ｓ１６４Ｐ＋Ｖ１６７Ｑ＋Ｓ２０６Ｔ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｔ２５２Ｓ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｆ＋Ｔ２７Ｓ＋Ｓ４８Ｔ＋Ｌ８２Ｉ＋Ｆ９０Ｌ＋Ｇ１３５Ａ＋Ａ１４０Ｓ＋Ｎ１４３Ｉ＋Ｓ１４５Ｔ＋Ａ１４９Ｇ＋Ｓ１６４Ｐ＋Ｖ１６７Ｑ＋Ｓ２０６Ｔ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｔ２５２Ｓから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0074】
別の特定の実施態様では、該エステラーゼは、さらに、ＷＯ第２０１８／０１１２８４号及び／又はＷＯ第２０１８／０１１２８１号で言及された、１つもしくは複数の置換又は置換の組み合わせを含む。更なる実施態様では、本発明のエステラーゼは、さらに、親エステラーゼにおけるのと同様に、Ｃ２４０＋Ｃ２５７又はＳ１３０＋Ｄ１７５＋Ｈ２０７＋Ｃ２４０＋Ｃ２５７から選択されるアミノ酸の組み合わせを少なくとも含む、すなわち、本発明のエステラーゼは、配列番号：１と比較して、これらの位置で修飾されていない。
【0075】
別の実施態様では、本発明のエステラーゼは、さらに、親エステラーゼにおけるのと同様に、Ｇ５９、Ｙ６０、Ｔ６１、Ｄ６３、Ｓ６５、Ｓ６６、Ｎ８５、Ｔ８６、Ｒ８９、Ｆ９０、Ｈ１２９、Ｗ１５５、Ｔ１５７、Ｔ１７６、Ｖ１７７、Ａ１７８及びＮ２１１から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、すなわち、本発明のエステラーゼは、配列番号：１と比較して、これらの位置のうちの１つで修飾されていない。好ましくは、該エステラーゼは、親エステラーゼにおけるのと同様に、アミノ酸残基Ｆ９０を含む。
【0076】
本発明の更なる目的は、（ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有し、（ｉｉ）Ｆ２０８、Ｄ２０３、Ｓ２４８、Ｖ１７０、Ｖ１７７、Ｔ１７６、Ｓ６５、Ｔ６１又はＦ９２から選択される位置に少なくとも４つの置換を有し、ここで、該位置は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を参照してナンバリングされ、（ｉｉｉ）配列番号：１のエステラーゼと比較して、向上したポリエステル分解活性及び／又は向上した熱安定性を示す、エステラーゼを提供することである。
【0077】
本発明の更なる目的は、（ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有し、（ｉｉ）Ｆ２０８、Ｄ２０３、Ｓ２４８、Ｖ１７０、Ｖ１７７、Ｔ１７６、Ｓ６５、Ｔ６１、Ｎ２１１又はＦ９２から選択される位置に少なくとも４つの置換を有し、ここで、該位置は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を参照してナンバリングされ、（ｉｉｉ）配列番号：１のエステラーゼと比較して、向上したポリエステル分解活性及び／又は向上した熱安定性を示す、エステラーゼを提供することである。
【0078】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列は、配列番号：１と比較して、Ａ１７Ｔ＋Ｔ２７Ｓ＋Ｓ４８Ｔ＋Ｌ８２Ｉ＋Ｆ９０Ｌ＋Ｙ９２Ｆ＋Ｇ１３５Ａ＋Ａ１４０Ｓ＋Ｎ１４３Ｉ＋Ｓ１４５Ｔ＋Ａ１４９Ｇ＋Ｓ１６４Ｐ＋Ｖ１６７Ｑ＋Ｓ２０６Ｔ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｔ２５２Ｓの置換の組み合わせを有する、配列番号：１のアミノ酸配列の変異体に相当する。
【0079】
特定の実施態様では、該エステラーゼ変異体は、配列番号：２のエステラーゼと比較して、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ、Ｄ２０３Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｖ１７０Ｉ、Ｖ１７７Ｉ、Ｔ１７６Ｎ、Ｔ６１Ｍ、Ｓ６５Ｔ又はＦ９２Ｇ／Ｐから選択される少なくとも４つの置換を含有する。
【0080】
特定の実施態様では、該エステラーゼ変異体は、配列番号：２のエステラーゼと比較して、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ、Ｄ２０３Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｖ１７０Ｉ、Ｖ１７７Ｉ、Ｔ１７６Ｎ、Ｔ６１Ｍ、Ｓ６５Ｔ、Ｎ２１１Ｄ／Ｍ又はＦ９２Ｇ／Ｐから選択される少なくとも４つの置換を含有する。
【0081】
好ましい実施態様では、本発明のエステラーゼは、配列番号：２におけるのと同様に、Ｓ１３０、Ｄ１７５又はＨ２０７から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、すなわち、本発明のエステラーゼは、これらの位置の１つ、２つ又は全てで修飾されていない。好ましくは、該エステラーゼは、配列番号：２におけるのと同様に、Ｓ１３０＋Ｄ１７５＋Ｈ２０７の組み合わせを含む。
【0082】
特定の実施態様では、該エステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８の位置における置換の組み合わせ及びＶ１７０、Ｖ１７７、Ｔ１７６、Ｔ６１又はＦ９２から選択される位置における１つの置換を少なくとも含む。特定の実施態様では、該エステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８の位置における置換の組み合わせ及びＶ１７０、Ｖ１７７、Ｔ１７６、Ｔ６１、Ｓ６５、Ｎ２１１又はＦ９２から選択される位置における１つの置換を少なくとも含む。特定の実施態様では、該エステラーゼは、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｖ１７０、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｖ１７７、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｔ６１、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｆ９２、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｔ１７６、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｓ６５、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｎ２１１又はＦ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８＋Ｖ１７０＋Ｆ９２から選択される位置に１つの置換の組み合わせを含む。特に、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ又はＦ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃから選択される置換の組み合わせ及びＴ６１Ｍ、Ｖ１７０Ｉ、Ｖ１７７Ｉ、Ｔ１７６Ｎ、Ｓ６５Ｔ、Ｎ２１１Ｄ／Ｍ又はＦ９２Ｇ／Ｐから選択される１つの置換を少なくとも含む。
【0083】
特定の実施態様によれば、該エステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７７Ｉ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７７Ｉ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｔ６１Ｍ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｔ６１Ｍ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｔ１７６Ｎ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｔ１７６Ｎ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｓ６５Ｔ及びＦ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｓ６５Ｔからなる組み合わせから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0084】
特定の実施態様によれば、該エステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｄ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｄ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｍ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｍからなる組み合わせから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0085】
特定の実施態様では、該エステラーゼは、Ｆ２０８＋Ｄ２０３＋Ｓ２４８の位置における置換の組み合わせ及びＶ１７０又はＦ９２から選択される位置における１つ又は２つの置換を少なくとも含む。好ましくは、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ又はＦ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃから選択される位置における置換の組み合わせ及びＶ１７０Ｉ又はＦ９２Ｇから選択される１つ又は２つの置換を少なくとも含む。特に、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇから選択される少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。代替的には、該エステラーゼは、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇ又はＦ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇから選択される置換の組み合わせを含む。
【0086】
特定の実施態様では、本発明の変異体は、さらに、Ｔ１１、Ｒ１２、Ａ１４、Ｗ６９、Ｒ７３、Ａ２０５、Ｎ２１４、Ａ２１５、Ａ２１６、Ｉ２１７、Ｆ２３８、Ｖ２４２、Ｄ２４４、Ｐ２４５、Ａ２４６、Ｌ２４７、Ｄ９４、Ｒ１３８、Ｄ１５８、Ｑ１８２、Ｆ１８７、Ｐ１０、Ｌ１５、Ｄ１８、Ｎ８７、Ｓ８８、Ｓ９５、Ｑ９９、Ｋ１５９、Ａ１７４、Ａ１２５、Ｓ２１８、Ｓ１３、Ｔ１６、Ｌ２０２、Ｎ２０４、Ｓ２１２、Ｖ２１９、Ｙ２２０、Ｑ２３７、Ｌ２３９、Ｎ２４１、Ｎ２４３、Ａ６２、Ｌ６７、Ｄ９１、Ｐ９３、Ｍ１３１、Ｐ２１０、Ａ２０９、Ｐ１７９、Ｒ３０、Ｇ３７、Ｒ７２、Ｓ９８、Ａ６８、Ｒ９６、Ｈ１５６、Ｈ１８３、Ｅ１７３、Ｇ５３、Ａ１２１、Ｔ１５７、Ｎ２１１、Ｙ６０、Ｄ６３又はＳ６６から選択される位置に少なくとも１つの置換を含む。ここで、該位置は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を参照してナンバリングされる。
【0087】
特定の実施態様では、本発明の変異体は、さらに、Ｎ２１１、Ａ１２１、Ｎ２０４、Ｓ２１２、Ａ１２５、Ｗ６９、Ｎ２１４、Ｎ２４１、Ｎ２４３、Ｒ１２、Ｐ１７９又はＶ２４２から選択される位置に少なくとも１つの置換を含む。
【0088】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ｎ２１１Ｄ／Ｍを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｎ２１１Ｄ／Ｍ、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｎ２１１Ｄ／Ｍ又はＦ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｎ２１１Ｄ／Ｍから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。好ましくは、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｎ２１１Ｍ、Ｆ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｎ２１１Ｍ又はＦ２０８Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｎ２１１Ｍから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0089】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ａ１２１Ｓを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ａ１２１Ｓ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ａ１２１Ｓ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇ＋Ａ１２１Ｓから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0090】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ｎ２０４Ｄ／Ｉ／Ｌ／Ｙ／Ｈ／Ｆを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｎ２０４Ｄ／Ｉ／Ｌ／Ｙ／Ｈ／Ｆ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｎ２０４Ｄ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｎ２０４Ｄから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0091】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ｓ２１２Ｆ／Ｔ／Ｉ／Ｌを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｓ２１２Ｆ／Ｔ／Ｉ／Ｌ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｓ２１２Ｆ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｓ２１２Ｆから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0092】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ａ１２５Ｇを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ａ１２５Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ａ１２５Ｇ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇ＋Ａ１２５Ｇから選択される置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0093】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ｗ６９Ｒを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｗ６９Ｒ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｗ６９Ｒ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｗ６９Ｒの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0094】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ｎ２１４Ｄ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｙ／Ｈを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｎ２１４Ｄ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｙ／Ｈの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0095】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ｎ２４１Ｐを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｎ２４１Ｐの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0096】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ｎ２４３Ｐを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｎ２４３Ｐの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0097】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ｒ１２Ｆ／Ｙ／Ｈを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｒ１２Ｆ／Ｙ／Ｈの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0098】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ｐ１７９Ｅを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｐ１７９Ｅの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0099】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、置換Ｖ２４２Ｙを含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｖ２４２Ｙの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0100】
実施態様において、本発明の変異体は、さらに、Ｔ１１、Ｒ１２、Ａ１４、Ｗ６９、Ｒ７３、Ａ２０５、Ｎ２１４、Ａ２１５、Ａ２１６、Ｆ２３８、Ｖ２４２、Ｄ２４４、Ｐ２４５、Ａ２４６、Ｌ２４７、Ｑ１８２、Ｆ１８７又はＳ２１８から選択される位置に少なくとも１つの置換を含む。該置換は、より好ましくは、Ｔ１１Ｍ／Ｅ／Ｉ／Ｓ／Ｎ／Ｄ／Ｑ、Ｒ１２Ｑ／Ｄ／Ｎ／Ｇ／Ｐ／Ｆ／Ｖ／Ｅ／Ｌ／Ｙ、Ｒ１２Ｈ、Ａ１４Ｅ／Ｄ、Ｗ６９Ｄ／Ｍ／Ｅ／Ｒ、Ｒ７３Ｉ／Ｇ／Ｍ／Ｄ／Ｅ／Ｓ／Ｃ／Ｑ／Ｆ／Ｎ／Ｖ、Ａ２０５Ｄ、Ｎ２１４Ｄ／Ｅ／Ｃ、Ｎ２１４Ｉ／Ｌ／Ｆ／Ｙ／Ｈ、Ａ２１５Ｎ、Ａ２１６Ｑ、Ｆ２３８Ｅ、Ｖ２４２Ｐ／Ｙ、Ｄ２４４Ｅ／Ｃ、Ｐ２４５Ｄ／Ｙ／Ｅ、Ａ２４６Ｓ／Ｄ／Ｈ／Ｅ、Ｌ２４７Ｔ、Ｑ１８２Ｄ／Ｅ、Ｆ１８７Ｙ／Ｉ又はＳ２１８Ａから選択される。実施態様において、該エステラーゼは、Ｔ１１Ｍ／Ｉ／Ｓ／Ｎ／Ｄ、Ｒ１２Ｎ／Ｇ／Ｐ／Ｖ／Ｌ、Ａ１４Ｅ、Ｗ６９Ｍ、Ｒ７３Ｉ／Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｃ／Ｑ／Ｆ／Ｎ／Ｖ、Ａ２０５Ｄ、Ｎ２１４Ｅ／Ｃ、Ａ２１５Ｎ、Ｐ２４５Ｙ又はＡ２４６Ｄ／Ｈから選択される少なくとも１つの置換を含む。
【0101】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、さらに、Ｔ１１、Ｒ１２、Ａ１４、Ｗ６９、Ｒ７３、Ａ２０５、Ｎ２１４、Ａ２１５、Ａ２１６、Ｉ２１７、Ｆ２３８、Ｖ２４２、Ｄ２４４、Ｐ２４５、Ａ２４６、Ｌ２４７、Ｄ９４、Ｒ１３８、Ｄ１５８、Ｑ１８２、Ｆ１８７、Ｐ１０、Ｌ１５、Ｄ１８、Ｎ８７、Ｓ８８、Ｓ９５、Ｑ９９、Ｋ１５９、Ａ１７４、Ａ１２５、Ｓ２１８、Ｓ１３、Ｔ１６、Ｌ２０２、Ｎ２０４、Ｓ２１２、Ｖ２１９、Ｙ２２０、Ｑ２３７、Ｌ２３９、Ｎ２４１、Ｎ２４３、Ａ６２、Ｌ６７、Ｄ９１、Ｐ９３、Ｍ１３１、Ｐ２１０、Ａ２０９、Ｐ１７９、Ｒ３０、Ｇ３７、Ｒ７２、Ｓ９８、Ａ６８、Ｒ９６、Ｈ１５６、Ｈ１８３、Ｅ１７３、Ｇ５３、Ａ１２１、Ｔ１５７、Ｎ２１１、Ｙ６０、Ｄ６３又はＳ６６から選択される位置に少なくとも２つの置換を含む。ここで、該位置は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を参照してナンバリングされる。
【0102】
実施態様において、本発明のエステラーゼは、配列番号：２のエステラーゼと比較して、Ｎ２４１Ｐ＋Ｒ１２Ｈの置換の組み合わせを少なくとも含む。特に、該変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ＋Ｎ２４１Ｐ＋Ｒ１２Ｈの置換の組み合わせを少なくとも含む。
【0103】
特定の実施態様では、該エステラーゼは、さらに、ＷＯ第２０１８／０１１２８４号及び／又はＷＯ第２０１８／０１１２８１号で言及された、１つもしくは複数の置換又は置換の組み合わせを含む。
【0104】
更なる実施態様では、本発明のエステラーゼは、さらに、配列番号：２におけるのと同様に、Ｃ２４０＋Ｃ２５７又はＳ１３０＋Ｄ１７５＋Ｈ２０７＋Ｃ２４０＋Ｃ２５７から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つの組み合わせを含む、すなわち、本発明のエステラーゼは、配列番号：２と比較して、これらの位置で修飾されていない。
【0105】
別の実施態様では、本発明のエステラーゼは、さらに、配列番号：２におけるのと同様に、Ｇ５９、Ｙ６０、Ｔ６１、Ｄ６３、Ｓ６５、Ｓ６６、Ｎ８５、Ｔ８６、Ｒ８９、Ｈ１２９、Ｗ１５５、Ｔ１５７、Ｔ１７６、Ｖ１７７、Ａ１７８及びＮ２１１から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、すなわち、本発明のエステラーゼは、配列番号：２と比較して、これらの位置のうちの１つで修飾されていない。
【0106】
特定の実施態様では、配列番号：１又は配列番号：２から得られた本発明のエステラーゼは、さらに、配列番号：３に示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも５５％、６５％、７５％、８５％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をＮ末端に含む。特に、該エステラーゼは、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６又は配列番号：７に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をＮ末端に含むことができる。特に、配列番号：１から得られた本発明のエステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇから選択される置換の組み合わせ及び配列番号：５（ＳＰＳＶＥＡＱ）をＮ末端に少なくとも含む。特に、配列番号：２から得られた本発明のエステラーゼは、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｆ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｆ９２Ｇから選択される置換の組み合わせ及び配列番号：５（ＳＰＳＶＥＡＱ）をＮ末端に少なくとも含む。
【0107】
特定の実施態様では、該エステラーゼ変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７７Ｉ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７７Ｉ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｍ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｍから選択される置換の組み合わせを含む。このようなエステラーゼは、配列番号：１又は配列番号：２のエステラーゼと比較して、向上したポリエステル分解活性及び向上した熱安定性の両方を示す。
【0108】
特定の実施態様では、該エステラーゼ変異体は、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７７Ｉ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７７Ｉ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｍ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｎ２１１Ｍ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｔ１７６Ｎ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｔ１７６Ｎ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ａ１２１Ｓ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ＋Ａ１２１Ｓ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｓ６５Ｔ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｓ６５Ｔ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２０４Ｈ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２４１Ｐ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２４３Ｐ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｒ１２Ｆ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｒ１２Ｙ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｐ１７９Ｅ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｖ２４２Ｙ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉから選択される置換の組み合わせ＋配列番号：５をＮ末端に、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇから選択される置換の組み合わせ＋配列番号：５をＮ末端に、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｖ１６７Ｑ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｖ１６７Ｑ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｎ２４１Ｐ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｒ１２Ｈ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｒ１２Ｈ＋Ｎ２４１Ｐ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｒ１２Ｈ＋Ｖ１６７Ｑ又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ａ１４０Ｓ＋Ｖ１６７Ｑから選択される置換の組み合わせを含む。このようなエステラーゼは、配列番号：１又は配列番号：２のエステラーゼと比較して、向上したポリエステル分解活性及び向上した熱安定性の両方を示す。
【0109】
好ましくは、該エステラーゼ変異体は、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７７Ｉ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｔ１７６Ｎ、Ｆ２０８Ｗ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｓ６５Ｔ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｎ２４１Ｐ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｒ１２Ｈ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ、Ｆ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｙ９２Ｇから選択される置換の組み合わせ＋配列番号：５をＮ末端に又はＦ２０８Ｉ＋Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃ＋Ｖ１７０Ｉ＋Ｙ９２Ｇ＋Ｎ２１３Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｖ１６７Ｑから選択される置換の組み合わせを含む。
【0110】
変異体のポリエステル分解活性
本発明の目的は、エステラーゼ活性を有する新規な酵素を提供することである。特定の実施態様では、本発明の酵素は、クチナーゼ活性を示す。
本発明の目的は、エステラーゼ活性を有する新規な酵素を提供することである。特定の実施態様では、本発明の酵素は、クチナーゼ活性を示す。
【0111】
特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、ポリエステル分解活性、好ましくは、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）分解活性及び／又はポリブチレンアジパートテレフタラート（ＰＢＡＴ）分解活性及び／又はポリブチレンスクシナート（ＰＢＳ）分解活性及び／又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）分解活性、より好ましくは、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）分解活性及び／又はポリブチレンアジパートテレフタラート（ＰＢＡＴ）分解活性及び／又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）分解活性を有する。さらにより好ましくは、本発明のエステラーゼは、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）分解活性を有する。
【0112】
有利には、本発明のエステラーゼは、少なくとも２０℃～９０℃、好ましくは、４０℃～８０℃、より好ましくは、５０℃～７０℃、さらにより好ましくは、６０℃～７０℃の温度範囲でポリエステル分解活性を示す。特定の実施態様では、該エステラーゼは、６５℃でポリエステル分解活性を示す。特定の実施態様では、該エステラーゼは、７０℃でポリエステル分解活性を示す。特定の実施態様では、ポリエステル分解活性は、６０℃～９０℃の温度でも依然として測定可能である。
【0113】
特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、配列番号：１のエステラーゼと比較して、所定の温度、とりわけ、４０℃～８０℃、より好ましくは、５０℃～７０℃、さらにより好ましくは、６０℃～７０℃、さらにより好ましくは、６５℃の温度で、向上したポリエステル分解活性を有する。
【0114】
特定の実施態様では、該エステラーゼは、配列番号：１のエステラーゼのポリエステル分解活性より、少なくとも５％、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、１３０％以上高い６５℃でのポリエステル分解活性を有する。
【0115】
特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、少なくともｐＨ５～１１の範囲、好ましくは、ｐＨ６～９の範囲、より好ましくは、ｐＨ６．５～９の範囲、さらにより好ましくは、ｐＨ６．５～８の範囲で測定可能なエステラーゼ活性を示す。
【0116】
核酸、発現カセット、ベクター、ホスト細胞
本発明の更なる目的は、上記定義されたエステラーゼをコードする核酸を提供することである。
本発明の更なる目的は、上記定義されたエステラーゼをコードする核酸を提供することである。
【0117】
本明細書で使用する場合、「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドの配列を指す。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ又はｇＤＮＡ）、ＲＮＡ又はそれらの混合物であることができる。核酸は、一本鎖の形態もしくは二本鎖の形態又はそれらの混合物であることができる。核酸は、リコンビナント、人工及び／又は合成起源であることができ、例えば、修飾結合、修飾プリンもしくはピリミジン塩基又は修飾糖を含む修飾ヌクレオチドを含むことができる。本発明の核酸は、単離又は精製された形態であることができ、当技術分野においてそれ自体公知の技術、例えば、ｃＤＮＡライブラリのクローニング及び発現、増幅、酵素合成又はリコンビナント技術により生成し、単離しかつ／又は操作することができる。また、核酸は、例えば、Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444に記載されているように、周知の化学合成技術によりｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することもできる。
【0118】
また、本発明は、ストリンジェントな条件下で、上記定義されたエステラーゼをコードする核酸にハイブリダイズする、核酸を包含する。好ましくは、このようなストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションフィルターを２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中において約４２℃で約２．５時間インキュベーションし、続けて、このフィルターを１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中において６５℃で１５分間４回洗浄することを含む。使用されるプロトコールは、Sambrook et al.（Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)）及びAusubel（Current Protocols in Molecular Biology (1989)）等の参考文献に記載されている。
【0119】
また、本発明は、本発明のエステラーゼをコードする核酸を包含し、ここで、前記核酸の配列又は少なくとも前記配列の一部は、最適化されたコドン利用を使用して操作されている。
【0120】
代替的には、本発明の核酸は、本発明のエステラーゼの配列から推定することができ、コドン利用は、核酸が転写されるであろうホスト細胞に応じて適合させることができる。これらの工程は、当業者に周知の方法に従って行うことができる。同方法の一部は、参考文献マニュアルSambrook et al.（Sambrook et al., 2001）に記載されている。
【0121】
本発明の核酸は、選択されたホスト細胞又は系におけるポリペプチドの表現を引き起こし又はレギュレーションするのに使用することができる、更なる核酸配列、すなわち、レギュラトリー配列、すなわち、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、シグナルペプチド等をさらに含むことができる。
【0122】
さらに、本発明は、適切なホスト細胞において前記核酸の発現に向けさせる１つ以上の制御配列に操作可能に連結された本発明の核酸を含む、発現カセットに関する。
【0123】
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程を指し、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含むがこれらに限定されない。
【0124】
「発現カセット」という用語は、コード領域、すなわち、本発明の核酸及びレギュラトリー領域、すなわち、操作可能に連結された１つ以上の制御配列を含む領域を含む核酸構築物を指す。
【0125】
典型的には、発現カセットは、制御配列、例えば、転写プロモーター及び／又は転写ターミネーターに操作可能に連結された本発明の核酸を含むか又はそれからなる。制御配列は、本発明のエステラーゼをコードする核酸の発現のためにホスト細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系に認識されるプロモーターを含むことができる。プロモーターは、酵素の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異プロモーター、切断プロモーター及びハイブリッドプロモーターを含むホスト細胞中で転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであることができ、ホスト細胞と同種又は異種のいずれかの細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。また、制御配列は、転写ターミネーターであることができる。転写ターミネーターは、ホスト細胞に認識されて、転写を終結させる。ターミネーターは、エステラーゼをコードする核酸の３’末端に操作可能に連結される。ホスト細胞において機能的である任意のターミネーターを本発明に使用することができる。典型的には、発現カセットは、転写プロモーター及び転写ターミネーターに操作可能に連結された本発明の核酸を含むか又はそれからなる。
【0126】
また、本発明は、上記定義された核酸又は発現カセットを含む、ベクターに関する。
【0127】
本明細書で使用する場合、「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、リコンビナント遺伝物質をホスト細胞に移入するための媒体として使用される、本発明の発現カセットを含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。主要な種類のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド及び人工染色体である。ベクター自体は、一般的には、インサート（異種核酸配列、導入遺伝子）及びベクターの「骨格」として機能するより大きな配列からなるＤＮＡ配列である。遺伝情報をホストに伝達するベクターの目的は、典型的には、ターゲット細胞中でインサートを単離し、増幅させ又は発現させることである。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、ターゲット細胞中で異種配列の発現に特異的に適合され、一般的には、ポリペプチドをコードする異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。一般的には、発現ベクターに存在するレギュラトリーエレメントは、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター及び場合により存在するオペレーターを含む。また、好ましくは、発現ベクターは、ホスト細胞における自律複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位及び高いコピー数の可能性も含有する。発現ベクターの例は、クローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特異的に設計されたプラスミド及びウイルスである。異なる宿主において適切なレベルのポリペプチド発現を提供する発現ベクターは、当技術分野において周知である。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入されるホスト細胞とのベクターの適合性により決まるであろう。好ましくは、発現ベクターは、線状又は環状二本鎖ＤＮＡ分子である。
【0128】
本発明の別の目的は、上記された核酸、発現カセット又はベクターを含む、ホスト細胞を提供することである。このため、本発明は、ホスト細胞を形質転換し、トランスフェクションし又は形質導入するための、本発明の核酸、発現カセット又はベクターの使用に関する。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される必要があるホスト細胞とのベクターの適合性により決まるであろう。
【0129】
本発明によれば、ホスト細胞は、一過性又は安定な様式で形質転換され、トランスフェクションされ又は形質導入されることができる。本発明の発現カセット又はベクターは、そのカセット又はベクターが染色体組み込み体として又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、ホスト細胞に導入される。また、「ホスト細胞」という用語は、複製の間に起こる突然変異のために親ホスト細胞と同一でなくなった親ホスト細胞の任意の子孫も包含する。ホスト細胞は、本発明の変異体の産生に有用な任意の細胞、例えば、原核生物又は真核生物であることができる。原核生物ホスト細胞は、グラム陽性又はグラム陰性細菌のいずれかであることができる。また、ホスト細胞は、真核生物細胞、例えば、酵母、真菌、ほ乳類、昆虫又は植物細胞であることもできる。特定の実施態様では、ホスト細胞は、Escherichia coli、Bacillus、Streptomyces、Trichoderma、Aspergillus、Saccharomyces、Pichia、Vibrio又はYarrowiaの群から選択される。
【0130】
本発明の核酸、発現カセット又は発現ベクターは、当業者に公知の任意の方法、例えば、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、形質導入、コンピテント細胞形質転換、プロトプラスト形質転換、プロトプラスト融合、バイオリスティック「遺伝子銃」形質転換、ＰＥＧ媒介形質転換、脂質補助形質転換又はトランスフェクション、化学媒介形質転換、酢酸リチウム媒介形質転換、リポソーム媒介形質転換により、ホスト細胞に導入することができる。
【0131】
場合により、本発明の核酸、カセット又はベクターの２つ以上のコピーをホスト細胞に挿入して、変異体の産生を増加させることができる。
【0132】
特定の実施態様では、ホスト細胞は、リコンビナント微生物である。実際に、本発明により、ポリエステル含有材料を分解する能力が改善された微生物の操作が可能とする。例えば、本発明の配列は、系統の能力を改善しかつ／又は向上させるために、ポリエステルを分解可能であることが既知の真菌又は細菌の野生型系統を補完するのに使用することができる。
【0133】
エステラーゼの製造
本発明の別の目的は、エステラーゼをコードする核酸を発現させ、場合により、エステラーゼを回収することを含む、本発明のエステラーゼの製造方法を提供することである。
本発明の別の目的は、エステラーゼをコードする核酸を発現させ、場合により、エステラーゼを回収することを含む、本発明のエステラーゼの製造方法を提供することである。
【0134】
特に、本発明は、（ａ）本発明の核酸、カセット又はベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系と接触させることと、（ｂ）産生されたエステラーゼを回収することとを含む、本発明のエステラーゼを製造するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系は、当業者に周知であり、市販されている。
【0135】
好ましくは、この製造方法は、
（ａ）本発明のエステラーゼをコードする核酸を含むホスト細胞を、該核酸を発現させるのに適した条件下で培養することと、場合により
（ｂ）細胞培養物から前記エステラーゼを回収することとを含む。
（ａ）本発明のエステラーゼをコードする核酸を含むホスト細胞を、該核酸を発現させるのに適した条件下で培養することと、場合により
（ｂ）細胞培養物から前記エステラーゼを回収することとを含む。
【0136】
有利には、ホスト細胞は、リコンビナントBacillus、リコンビナントE. coli、リコンビナントAspergillus、リコンビナントTrichoderma、リコンビナントStreptomyces、リコンビナントSaccharomyces、リコンビナントPichia、リコンビナントVibrio又はリコンビナントYarrowiaである。
【0137】
ホスト細胞は、当技術分野において公知の方法を使用して、ポリペプチドの産生に適した栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、振とうフラスコ培養又は適切な培地中で、酵素が発現されかつ／又は単離されるのが可能な条件下で行われる実験室又は工業発酵槽中での小規模もしくは大規模発酵（連続、バッチ、フェドバッチ、又は固体相発酵を含む）により培養することができる。培養は、商業的供給元から又は公開された組成物（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ）に従って調製された適切な栄養培地中で行われる。
【0138】
該エステラーゼが、栄養培地中に分泌される場合、該エステラーゼは、培養上清から直接回収することができる。逆に、該エステラーゼは、細胞ライゼートから又は透過後に回収することができる。該エステラーゼは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して回収することができる。例えば、該エステラーゼは、従来の手法により栄養培地から回収することができる。同手法は、回収、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含むが、これらに限定されない。場合により、該エステラーゼは、当技術分野において公知の各種の手法により部分的又は完全に精製することができる。同手法は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば、調製用等電点電気泳動）、示差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ又は実質的に純粋なポリペプチドを得るための抽出を含むが、これらに限定されない。
【0139】
該エステラーゼは、ポリエステル及び／又はポリエステル含有材料、例えば、ポリエステルを含有するプラスチック製品の分解及び／又は再利用に関与する酵素反応を触媒するために、単独で又は更なる酵素と組み合わせて、精製された形態でそのまま使用することができる。該エステラーゼは、可溶性の形態であることができ又は固体相上にあることができる。特に、該エステラーゼは、細胞膜又は脂質小胞又は合成支持体、例えば、ビーズ、カラム、プレート等の形態にある、ガラス、プラスチック、ポリマー、フィルター、膜等に結合することができる。
【0140】
組成物
本発明の更なる目的は、本発明のエステラーゼ又はホスト細胞又はその抽出物を含む、組成物を提供することである。本発明の文脈において、「組成物」という用語は、本発明のエステラーゼ又はホスト細胞を含む、任意の種類の組成物を包含する。
本発明の更なる目的は、本発明のエステラーゼ又はホスト細胞又はその抽出物を含む、組成物を提供することである。本発明の文脈において、「組成物」という用語は、本発明のエステラーゼ又はホスト細胞を含む、任意の種類の組成物を包含する。
【0141】
本発明の組成物は、組成物の総重量に基づいて、０．１重量％～９９．９重量％、好ましくは、０．１重量％～５０重量％、より好ましくは、０．１重量％～３０重量％、さらにより好ましくは、０．１重量％～５重量％のエステラーゼ含むことができる。代替的には、該組成物は、５～１０重量％の本発明のエステラーゼを含むことができる。
【0142】
該組成物は、液体であることができ又は乾燥していることができ、例えば、粉末の形態にあることができる。一部の実施態様では、該組成物は、凍結乾燥物である。
【0143】
該組成物は、賦形剤及び／又は試薬等をさらに含むことができる。適切な賦形剤は、生化学において一般に使用されるバッファー、ｐＨを調節するための作用剤、防腐剤、例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム又はアスコルビン酸ナトリウム、保存剤、保護剤又は安定化剤、例えば、デンプン、デキストリン、アラビアゴム、塩、糖、例えば、ソルビトール、トレハロース又はラクトース、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール、金属イオン封鎖剤、例えば、ＥＤＴＡ、還元剤、アミノ酸、担体、例えば、溶媒又は水溶液等を包含する。本発明の組成物は、エステラーゼを１種又は複数種の賦形剤と混合することにより得ることができる。
【0144】
特定の実施態様では、該組成物は、組成物の総重量に基づいて、０．１重量％～９９．９重量％、好ましくは、５０重量％～９９．９重量％、より好ましくは、７０重量％～９９．９重量％、さらにより好ましくは、９５重量％～９９．９重量％の賦形剤を含む。代替的には、該組成物は、９０重量％～９５重量％の賦形剤を含むことができる。
【0145】
特定の実施態様では、該組成物は、酵素活性を示す更なるポリペプチドをさらに含むことができる。本発明のエステラーゼの量は、例えば、分解するポリエステル及び／又は組成物中に含まれる更なる酵素／ポリペプチドの性質に応じて、当業者により容易に適合されるであろう。
【0146】
特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、１種又は複数種の賦形剤、特に、ポリペプチドを安定化し又は分解から保護可能な賦形剤と共に水性媒体中で可溶化される。例えば、本発明のエステラーゼを、最終的に、更なる成分、例えば、グリセロール、ソルビトール、デキストリン、デンプン、グリコール、例えば、プロパンジオール、塩等と共に、水に可溶化させることができる。ついで、得られた混合物を乾燥させて、粉末を得ることができる。このような混合物を乾燥させる方法は、当業者に周知であり、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）、噴霧乾燥、超臨界乾燥、ダウンドラフト蒸発、薄層蒸発、遠心分離蒸発、コンベヤー乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥又はこれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0147】
特定の実施態様では、該組成物は、粉末形態にあり、エステラーゼと、安定化／可溶化量のグリセロール、ソルビトール又はデキストリン、例えば、マルトデキストリン及び／もしくはシクロデキストリン、デンプン、グリコール、例えば、プロパンジオール並びに／又は塩とを含む。
【0148】
特定の実施態様では、本発明の組成物は、本発明のエステラーゼを発現する少なくとも１種のリコンビナント細胞又はその抽出物を含む。「細胞の抽出物」は、細胞から得られる任意の画分、例えば、細胞上清、細胞破片、細胞壁、ＤＮＡ抽出物、酵素もしくは酵素調製物又は化学的、物理的及び／もしくは酵素的処理により細胞から得られる任意の調製物を指し、生きている細胞を本質的に含まない。好ましい抽出物は、酵素活性抽出物である。本発明の組成物は、本発明の１種又は複数種のリコンビナント細胞又はその抽出物及び場合により、１種又は複数種の更なる細胞を含むことができる。
【0149】
実施態様において、該組成物は、本発明のエステラーゼを発現し、分泌するリコンビナント微生物の培養培地からなるか又はそれを含む。特定の実施態様では、該組成物は、凍結乾燥されたこのような培養培地を含む。
【0150】
エステラーゼの使用
本発明の更なる目的は、好気性又は嫌気性条件において、ポリエステル又はポリエステル含有材料を分解しかつ／又は再利用するための、本発明のエステラーゼを使用する方法を提供することである。本発明のエステラーゼは、ＰＥＴ及びＰＥＴ含有材料を分解するのに特に有用である。
本発明の更なる目的は、好気性又は嫌気性条件において、ポリエステル又はポリエステル含有材料を分解しかつ／又は再利用するための、本発明のエステラーゼを使用する方法を提供することである。本発明のエステラーゼは、ＰＥＴ及びＰＥＴ含有材料を分解するのに特に有用である。
【0151】
したがって、本発明の目的は、ポリエステルの酵素分解のために、本発明のエステラーゼ又は対応するリコンビナント細胞もしくはその抽出物又は組成物を使用することである。
【0152】
特定の実施態様では、該エステラーゼのターゲットとなるポリエステルは、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタラート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタラート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）、ポリブチレンスクシナート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシナートアジパート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジパートテレフタラート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノアート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジパート)(ＰＥＡ)、ポリエチレンナフタラート（ＰＥＮ）及びこれらの材料のブレンド／混合物、好ましくは、ポリエチレンテレフタラートから選択される。
【0153】
好ましい実施態様では、ポリエステルは、ＰＥＴであり、少なくともモノマー（例えば、モノエチレングリコール又はテレフタル酸）及び／又はオリゴマー（例えば、メチル－２－ヒドロキシエチルテレフタラート（ＭＨＥＴ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタラート（ＢＨＥＴ）、１－（２－ヒドロキシエチル） ４－メチルテレフタラート（ＨＥＭＴ）及びジメチルテレフタラート（ＤＭＴ）が回収される。
【0154】
また、本発明の目的は、ポリエステル含有材料の少なくとも１種のポリエステルの酵素分解のために、本発明のエステラーゼ又は対応するリコンビナント細胞もしくはその抽出物又は組成物を使用することである。
【0155】
本発明の別の目的は、ポリエステル含有材料の少なくとも１種のポリエステルを分解するための方法であって、ポリエステル含有材料を本発明のエステラーゼ又はホスト細胞又は組成物と接触させ、それにより、ポリエステル含有材料の少なくとも１種のポリエステルを分解する、方法を提供することである。
【0156】
有利には、ポリエステルは、モノマー及び／又はオリゴマーまで脱重合される。
【0157】
特に、本発明は、ＰＥＴ含有材料のＰＥＴを分解するための方法であって、ＰＥＴ含有材料を本発明のエステラーゼ又はホスト細胞又は組成物と接触させ、それにより、ＰＥＴを分解する、方法を提供する。
【0158】
実施態様において、少なくとも１種のポリエステルは、再重合可能なモノマー及び／又はオリゴマーに分解され、これらは、再使用するために有利に回収することができる。回収されたモノマー／オリゴマーは、再利用（例えば、ポリエステルの再重合）又はメタン化に使用することができる。特定の実施態様では、少なくとも１種のポリエステルは、ＰＥＴであり、モノエチレングリコール、テレフタル酸、メチル－２－ヒドロキシエチルテレフタラート（ＭＨＥＴ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタラート（ＢＨＥＴ）、１－（２－ヒドロキシエチル）４－メチルテレフタラート（ＨＥＭＴ）及び／又はジメチルテレフタラート（ＤＭＴ）が回収される。
【0159】
実施態様において、ポリエステル含有材料のポリエステルは完全に分解される。
【0160】
ポリエステル含有材料を分解するのに必要な時間は、ポリエステル含有材料自体（すなわち、ポリエステル含有材料の性質及び起源、その組成、形状等）、使用されるエステラーゼの種類及び量並びに種々のプロセスパラメータ（すなわち、温度、ｐＨ、更なる作用剤等）に応じて変化させることができる。当業者であれば、プロセスパラメータをポリエステル含有材料及び想定される分解時間に容易に適合させることができる。
【0161】
有利には、該分解方法は、２０℃～９０℃、好ましくは、４０℃～８０℃、より好ましくは、５０℃～７０℃、より好ましくは、６０℃～７０℃に含まれる温度で行われる。特定の実施態様では、分解プロセスは、６５℃で行われる。別の特定の実施態様では、該分解方法は、７０℃で行われる。より一般的には、温度は、エステラーゼが不活性化される（すなわち、その最適温度でのその活性と比較して、８０％超の活性が失われる）かつ／又はリコンビナント微生物がもはやエステラーゼを合成しない温度に対応する不活性化温度未満に維持される。特に、温度は、ターゲットとなるポリエステルのガラス転移点（Ｔｇ）未満に維持される。
【0162】
有利には、該方法は、エステラーゼを数回使用しかつ／又は再利用することができる温度での連続流動法で行われる。
【0163】
有利には、分解方法は、５～１１の間に含まれるｐＨ、好ましくは、６～９の間のｐＨ、より好ましくは、６．５～９の間のｐＨ、さらにより好ましくは、６．５～８の間のｐＨで行われる。
【0164】
特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、ポリエステルとエステラーゼとの間の接触表面を増加させるようにその構造を物理的に変化させるために、エステラーゼと接触させる前に前処理することができる。
【0165】
本発明の別の目的は、ポリエステル含有材料からモノマー及び／又はオリゴマーを製造する方法であって、ポリエステル含有材料を本発明のエステラーゼ又は対応するリコンビナント細胞もしくはその抽出物又は組成物に暴露することと、場合により、モノマー及び／又はオリゴマーを回収することとを含む、方法を提供することである。
【0166】
脱重合により生じるモノマー及び／又はオリゴマーは、順次又は連続的に回収することができる。出発ポリエステル含有材料に応じて、１つの種類のモノマー及び／もしくはオリゴマー又は複数の異なる種類のモノマー及び／もしくはオリゴマーを回収することができる。
【0167】
本発明の方法は、モノエチレングリコール及びテレフタル酸から選択されるモノマー並びに／又はメチル－２－ヒドロキシエチルテレフタラート（ＭＨＥＴ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタラート（ＢＨＥＴ）、１－（２－ヒドロキシエチル）４－メチルテレフタラート（ＨＥＭＴ）及びジメチルテレフタラート（ＤＭＴ）から選択されるオリゴマーを、ＰＥＴ及び／又はＰＥＴを含むプラスチック製品から製造するのに特に有用である。
【0168】
回収されたモノマー及び／又はオリゴマーは、全ての適切な精製方法を使用してさらに精製することができ、再重合可能な形態に調整することができる。精製方法の例は、ストリッピングプロセス、水溶液による分離、水蒸気選択的凝縮、バイオプロセス後のろ過及び媒体の濃縮、分離、蒸留、真空蒸発、抽出、電気透析、吸着、イオン交換、沈殿、結晶化、濃縮及び酸添加脱水及び沈殿、ナノろ過、酸触媒処理、半連続モード蒸留又は連続モード蒸留、溶媒抽出、蒸発濃縮、蒸発結晶化、液体／液体抽出、水素化、共沸蒸留プロセス、吸着、カラムクロマトグラフィー、単純真空蒸留並びに精密ろ過の組み合わせ又は単独を含む。
【0169】
回収された再重合可能なモノマー及び／又はオリゴマーは、例えば、ポリエステルを合成するのに再利用することができる。有利には、同じ性質のポリエステルが再重合される。ただし、例えば、新たなコポリマーを合成するために、回収されたモノマー及び／又はオリゴマーを他のモノマー及び／又はオリゴマーと混合することが可能である。代替的には、回収されたモノマーは、目的の新たな化合物を生成するために、化学中間体として使用することができる。
【0170】
また、本発明は、ポリエステル含有材料の表面加水分解又は表面官能化の方法であって、ポリエステル含有材料を本発明のエステラーゼ又は対応するリコンビナント細胞もしくはその抽出物又は組成物に暴露することを含む、方法に関する。本発明の方法は、ポリエステル材料の親水性又は吸水性を向上させるのに特に有用である。このように向上した親水性は、織物製造、エレクトロニクス及び生物医学的用途において特に興味深い場合がある。
【0171】
本発明の更なる目的は、本発明のエステラーゼ及び／又は前記エステラーゼを発現し、分泌するリコンビナント微生物が含まれる、ポリエステル含有材料を提供することである。一例として、本発明のエステラーゼを含むこのようなポリエステル含有材料を製造するための方法は、ＷＯ第２０１３／０９３３５５号、同第２０１６／１９８６５０号、同第２０１６／１９８６５２号、同第２０１９／０４３１４５号及び同第２０１９／０４３１３４号の特許出願に開示されている。
【0172】
このため、本発明の目的は、本発明のエステラーゼ及び／又はリコンビナント細胞及び／又は組成物もしくはその抽出物と、少なくともＰＥＴを含有する、ポリエステル含有材料を提供することである。実施態様によれば、本発明は、ＰＥＴと、ＰＥＴ分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含む、プラスチック製品を提供する。
【0173】
このため、本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼ及び／又はリコンビナント細胞及び／又は組成物もしくはその抽出物と、少なくともＰＢＡＴとを含有するポリエステル含有材料を提供することである。実施態様によれば、本発明は、ＰＢＡＴと、ＰＢＡＴ分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含む、プラスチック製品を提供する。
【0174】
このため、本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼ及び／又はリコンビナント細胞及び／又は組成物もしくはその抽出物と、少なくともＰＢＳとを含有するポリエステル含有材料を提供することである。実施態様によれば、本発明は、ＰＢＳと、ＰＢＳ分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含む、プラスチック製品を提供する。
【0175】
このため、本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼ及び／又はリコンビナント細胞及び／又は組成物もしくはその抽出物と、少なくともＰＣＬとを含有するポリエステル含有材料を提供することである。実施態様によれば、本発明は、ＰＣＬと、ＰＣＬ分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含む、プラスチック製品を提供する。
【0176】
古典的には、本発明のエステラーゼは、洗剤、食品、動物飼料及び医薬用途に使用することができる。とりわけ、本発明のエステラーゼは、洗剤組成物の成分として使用することができる。洗剤組成物は、手洗い又は機械洗濯洗剤組成物、例えば、しみの付いた布地の前処理に適した洗濯添加剤組成物及びすすぎ添加布地柔軟剤組成物、一般的な家庭用硬質表面洗浄作業に使用するための洗剤組成物、手洗い又は機械食器洗い作業のための洗剤組成物を含むが、これらに限定されない。特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、洗剤添加剤として使用することができる。このため、本発明は、本発明のエステラーゼを含む洗剤組成物を提供する。特に、本発明のエステラーゼは、織物洗浄中のピリング作用及びグレーイング作用を低減するために、洗剤添加剤として使用することができる。
【0177】
また、本発明は、動物飼料に本発明のエステラーゼを使用するための方法並びに本発明のエステラーゼを含む飼料組成物及び飼料添加剤も対象にする。「飼料」及び「飼料組成物」という用語は、動物による摂取に適した又は動物による摂取を意図した任意のコンパウンド、調製物、混合物又は組成物を指す。別の特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、タンパク質を加水分解し、ペプチドを含む加水分解物を製造するのに使用される。このような加水分解物は、飼料組成物又は飼料添加剤として使用することができる。
【0178】
実施例
実施例１－エステラーゼの構築、発現及び精製
構築
本発明のエステラーゼを、プラスミド構築物ｐＥＴ２６ｂ－ＬＣＣ－Ｈｉｓを使用して生成した。このプラスミドは、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位間のEscherichia coli発現に最適化された、配列番号：１のエステラーゼをコードする遺伝子のクローニングからなる。エステラーゼ変異体を生成するために、供給元の推奨に従って、Agilent（Santa Clara, California, USA）製の２つの部位特異的突然変異誘発キット：QuikChange II Site-Directed Mutagenesisキット及びQuikChange Lightning Multi Site-Directedを使用した。
実施例１－エステラーゼの構築、発現及び精製
構築
本発明のエステラーゼを、プラスミド構築物ｐＥＴ２６ｂ－ＬＣＣ－Ｈｉｓを使用して生成した。このプラスミドは、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位間のEscherichia coli発現に最適化された、配列番号：１のエステラーゼをコードする遺伝子のクローニングからなる。エステラーゼ変異体を生成するために、供給元の推奨に従って、Agilent（Santa Clara, California, USA）製の２つの部位特異的突然変異誘発キット：QuikChange II Site-Directed Mutagenesisキット及びQuikChange Lightning Multi Site-Directedを使用した。
【0179】
エステラーゼの発現及び精製
Stellar（商標）（Clontech, California, USA）系統及びE. coli One Shot（登録商標） BL21 DE3（Life technologies, Carlsbad, California, USA）系統を連続的に利用して、LB-Miller培地又はＺＹＭ自己誘引培地（Studier et al., 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234） ５０mL中でクローニング及びリコンビナント発現を行った。LB-Miller培地中での誘引を０．５mM イソプロピル β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Euromedex, Souffelweyersheim, France）により１６℃で行った。培養をAvanti J－26 XP遠心分離機（Beckman Coulter, Brea, USA）における遠心分離（８０００rpm、２０分、１０℃）により停止させた。細胞をTalonバッファー（２０mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００mM ＮａＣｌ、ｐＨ８） ２０mLに懸濁させた。ついで、細胞懸濁液をFB 705超音波処理装置（Fisherbrand, Illkirch, France）により、振幅の３０％（２秒ＯＮ及び１秒ＯＦＦのサイクル）で２分間超音波処理した。ついで、遠心分離の工程をEppendorf遠心分離機中において１１０００rpm、１０℃、３０分間で実現した。可溶性画分を収集し、親和性クロマトグラフィーに供した。この精製工程をTalon（登録商標）Metal Affinity Resin（Clontech, CA, USA）で完了した。タンパク質溶出を、イミダゾールを補充したTalonバッファーの工程で行った。精製タンパク質を、Talonバッファーで透析し、次いで、Bio-Radタンパク質アッセイを使用し、製造メーカーの説明書（Lifescience Bio-Rad, France）に従って定量し、＋４℃で保存した。
Stellar（商標）（Clontech, California, USA）系統及びE. coli One Shot（登録商標） BL21 DE3（Life technologies, Carlsbad, California, USA）系統を連続的に利用して、LB-Miller培地又はＺＹＭ自己誘引培地（Studier et al., 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234） ５０mL中でクローニング及びリコンビナント発現を行った。LB-Miller培地中での誘引を０．５mM イソプロピル β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Euromedex, Souffelweyersheim, France）により１６℃で行った。培養をAvanti J－26 XP遠心分離機（Beckman Coulter, Brea, USA）における遠心分離（８０００rpm、２０分、１０℃）により停止させた。細胞をTalonバッファー（２０mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００mM ＮａＣｌ、ｐＨ８） ２０mLに懸濁させた。ついで、細胞懸濁液をFB 705超音波処理装置（Fisherbrand, Illkirch, France）により、振幅の３０％（２秒ＯＮ及び１秒ＯＦＦのサイクル）で２分間超音波処理した。ついで、遠心分離の工程をEppendorf遠心分離機中において１１０００rpm、１０℃、３０分間で実現した。可溶性画分を収集し、親和性クロマトグラフィーに供した。この精製工程をTalon（登録商標）Metal Affinity Resin（Clontech, CA, USA）で完了した。タンパク質溶出を、イミダゾールを補充したTalonバッファーの工程で行った。精製タンパク質を、Talonバッファーで透析し、次いで、Bio-Radタンパク質アッセイを使用し、製造メーカーの説明書（Lifescience Bio-Rad, France）に従って定量し、＋４℃で保存した。
【0180】
実施例２－エステラーゼの分解活性の評価
エステラーゼの分解活性を決定し、配列番号：１のエステラーゼの分解活性と比較した。
エステラーゼの分解活性を決定し、配列番号：１のエステラーゼの分解活性と比較した。
【0181】
比活性を評価するための複数の方法を使用した。
（１）ＰＥＴ加水分解に基づく比活性
（２）固体状のポリエステルの分解に基づく活性
（３）１００mLを超える反応器中でのＰＥＴ加水分解に基づく活性
（１）ＰＥＴ加水分解に基づく比活性
（２）固体状のポリエステルの分解に基づく活性
（３）１００mLを超える反応器中でのＰＥＴ加水分解に基づく活性
【0182】
２．１ ＰＥＴ加水分解に基づく比活性
１００mg 非晶質ＰＥＴ（粉末状、ＷＯ第２０１７／１９８７８６号に従って調製し、２０％未満の結晶化度に達した）を秤量し、１００mLのガラス瓶に導入した。Talonバッファー（２０mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．３M ＮａＣｌ、ｐＨ８）中において、０．０２又は０．０３mg／mLに調製された配列番号：１のエステラーゼ（参照対照として）又は本発明のエステラーゼを含むエステラーゼ調製物 １mLをガラス瓶に導入した。最後に、０．１M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８） ４９mLを加えた。
１００mg 非晶質ＰＥＴ（粉末状、ＷＯ第２０１７／１９８７８６号に従って調製し、２０％未満の結晶化度に達した）を秤量し、１００mLのガラス瓶に導入した。Talonバッファー（２０mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．３M ＮａＣｌ、ｐＨ８）中において、０．０２又は０．０３mg／mLに調製された配列番号：１のエステラーゼ（参照対照として）又は本発明のエステラーゼを含むエステラーゼ調製物 １mLをガラス瓶に導入した。最後に、０．１M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８） ４９mLを加えた。
【0183】
脱重合を、各ガラス瓶を６０℃、６５℃又は７０℃及び１５０rpmで、Max Q 4450インキュベーター（Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA）中でインキュベーションすることにより開始した。
【0184】
脱重合反応の初速度（mg 生成された当量のＴＡ/時間）を最初の２４時間の間に異なる時点で行ったサンプリングにより決定し、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）により分析した。必要であれば、サンプルを０．１M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）で希釈した。ついで、メタノール １５０μL及び６N ＨＣｌ ６．５μLをサンプル又は希釈液 １５０μLに加えた。混合し、０．４５μmのシリンジフィルターでろ過した後、サンプルをＵＨＰＬＣにロードして、テレフタル酸（ＴＡ）、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴの遊離をモニターした。使用したクロマトグラフィーシステムは、ポンプモジュール、オートサンプラー、２５℃に温度調節されたカラムオーブン及び２４０nmでのＵＶ検出器を含むUltimate 3000 ＵＨＰＬＣシステム（Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA）とした。使用したカラムは、Discovery（登録商標）HS Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６mm、５μm、プレカラムを備える、Supelco, Bellefonte, USA）とした。ＴＡ、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴを１mM Ｈ２ＳＯ４中のＭｅＯＨの勾配（３０％～９０％）を使用して１mL/分で分離した。インジェクションは、サンプル ２０μLとした。ＴＡ、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴを市販のＴＡ及びＢＨＥＴ並びに自社合成したＭＨＥＴからサンプルと同じ条件で作成した検量線に従って測定した。ＰＥＴ加水分解の比活性（mg 当量のＴＡ/時間／mg 酵素）を反応の加水分解曲線の直線部分において決定し、このような曲線を最初の２４時間の間に異なる時点で行ったサンプリングにより設定した。当量のＴＡは、測定されたＴＡと、測定されたＭＨＥＴ及びＢＨＥＴに含まれるＴＡとの合計に相当する。
２．２ 固体状のポリエステルの分解に基づく活性
誘引細胞、半精製タンパク質抽出物又は精製タンパク質を、このようなエステラーゼの活性を評価するための本発明のエステラーゼを含む組成物として使用することができる。
２．２ 固体状のポリエステルの分解に基づく活性
誘引細胞、半精製タンパク質抽出物又は精製タンパク質を、このようなエステラーゼの活性を評価するための本発明のエステラーゼを含む組成物として使用することができる。
【0185】
誘引細胞は、ＺＹＭ自己誘引培地での培養後又はLB-Miller培地（実施例１に記載）中でのＩＰＴＧによる誘引後のいずれかで得られた細胞培養物のサンプルに対応する。
【0186】
半精製タンパク質抽出物をＺＹＭ自己誘引培地での培養後又はLB-Miller培地（実施例１に記載）中でのＩＰＴＧによる誘引後のいずれかから、下記プロトコールに従って得た。培養をAvanti J－26 XP遠心分離機（Beckman Coulter, Brea, USA）における遠心分離（８０００rpm、２０分、１０℃）により停止させた。細胞ペレットを溶解バッファー（２０mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００mM ＮａＣｌ、ｐＨ８）に懸濁させた。細胞を、－８０℃で２時間の凍結／解凍サイクル、続けて、リソナーゼバイオプロセシング試薬（Merck Millipore, Darmstadt, Germany） １μLの添加及び１５分毎のボルテックスホモジナイゼーションを含む２８℃での１時間のインキュベーションにより破壊した。ライゼートを遠心分離（２２５０×ｇ、１５分、４℃）により清澄化した。半精製画分を生成するために、ライゼートを７０℃で１時間処理し、遠心分離（２２５０×ｇ、１５分、４℃）により清澄化した。画分のタンパク質濃度を、製造メーカーの説明書（Lifescience Bio-Rad, France）に従って、Bio-Radタンパク質アッセイを使用して定量した。
【0187】
精製タンパク質を実施例１に記載されたようにして得た。
【0188】
組成物のサンプルを、ＰＥＴ又は以下のように調製された別の固体ポリエステル化合物（例えば、ＰＢＡＴ又は類似体）を含有するアガーオムニトレイの表面上又は同トレイに形成されたウェル内のいずれかに置いた。ＰＥＴを含有するアガープレートの作製を、５００mg ＰＥＴをヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）に可溶化し、この媒体を水溶液 ２５０mLに注ぐことにより実現した。１４０mbar下、５２℃でのＨＦＩＰの蒸発後、溶液を、３％ アガーを含有する０．２M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）とｖ／ｖ混合した。混合物 約３０mLを使用して、各オムニトレイを作製し、４℃で保存した。
【0189】
野生型エステラーゼ及び本発明の変異体によるポリエステル分解により形成されたハローの表面積又は直径を測定し、６０℃、６５℃又は７０℃で２～２４時間後に比較した。
【0190】
２．３ 反応器中でのＰＥＴ加水分解に基づく活性
１００mM リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８） ８０mL中で調製された、０．６９μmol～２．０７μmol 精製エステラーゼを、５００mLのMinibio反応器（Applikon Biotechnology, Delft, The Netherlands）中で２０ｇ 非晶質ＰＥＴ（ＷＯ第２０１７／１９８７８６号に従って調製、２０％未満の結晶化度に達する）と混合した。６０℃での温度レギュレーションを水浴浸漬により行い、１つのマリンインペラ（ｍａｒｉｎｅ ｉｍｐｅｌｌｅｒ）を使用して、２５０rpmで一定の撹拌を維持した。ＰＥＴ脱重合アッセイのｐＨを６N ＮａＯＨによりｐＨ８にレギュレーションし、my-Control bio controllerシステム（Applikon Biotechnology, Delft, The Netherlands）により保証した。塩基消費をアッセイ中に記録し、ＰＥＴ脱重合アッセイの特徴決定に使用することができる。
１００mM リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８） ８０mL中で調製された、０．６９μmol～２．０７μmol 精製エステラーゼを、５００mLのMinibio反応器（Applikon Biotechnology, Delft, The Netherlands）中で２０ｇ 非晶質ＰＥＴ（ＷＯ第２０１７／１９８７８６号に従って調製、２０％未満の結晶化度に達する）と混合した。６０℃での温度レギュレーションを水浴浸漬により行い、１つのマリンインペラ（ｍａｒｉｎｅ ｉｍｐｅｌｌｅｒ）を使用して、２５０rpmで一定の撹拌を維持した。ＰＥＴ脱重合アッセイのｐＨを６N ＮａＯＨによりｐＨ８にレギュレーションし、my-Control bio controllerシステム（Applikon Biotechnology, Delft, The Netherlands）により保証した。塩基消費をアッセイ中に記録し、ＰＥＴ脱重合アッセイの特徴決定に使用することができる。
【0191】
ＰＥＴ脱重合アッセイの最終収率を残留ＰＥＴ重量の測定又は生成された当量のＴＡ及びＥＧの測定又は塩基消費のいずれかにより決定した。残留ＰＥＴの重量測定は、反応の終わりに、１２～１５μmグレードの１１無灰ろ紙（Dutscher SAS, Brumath, France）を通して反応体積をろ過し、このような残留物を乾燥させ、その後に秤量することにより評価した。生成された当量のＴＡ及びＥＧの測定を、２．１に記載されたＵＨＰＬＣ法を使用して実現し、％ 加水分解を、初期サンプル中に含まれるＴＡの総量に対する所定時間におけるモル濃度（ＴＡ＋ＭＨＥＴ＋ＢＨＥＴ）の比に基づいて計算した。ＰＥＴ脱重合により、塩基で中和されて反応器内のｐＨを維持可能であろう酸性モノマーが生成された。生成された当量のＴＡの測定は、対応するモル塩基消費量を使用して計算し、％ 加水分解を初期サンプルに含まれるＴＡの総量に対する当量のＴＡの所与の時間におけるモル濃度の比に基づいて計算した。
【0192】
本発明のエステラーゼ（変異体）の比分解活性を以下の表１に示す。配列番号：１のエステラーゼの比分解活性を参照として使用し、１００％の比分解活性とみなす。比分解活性を実施例２．１に示したように測定する。
【0193】
【表1】
【0194】
変異体Ｖ１～Ｖ８３は、表１にそれぞれ列挙された置換の組み合わせを除いて、配列番号：１に示された正確なアミノ酸配列を有する。
【0195】
本発明のエステラーゼ（変異体）の分解活性を反応器中で実施例２．３に従って測定し、比較した。該変異体のＰＥＴ脱重合の２４時間後でのＰＥＴ脱重合割合及び９０％の割合に達する時間を評価し、配列番号：１と比較した。配列番号：１のエステラーゼは、このような条件において、２４時間後に６６％のＰＥＴ脱重合に達し、９０％の割合のＰＥＴ脱重合に達するのに４３．５時間必要である。結果を以下の表２に示す。
【0196】
【表2】
【0197】
実施例３－本発明のエステラーゼの熱安定性の評価
本発明のエステラーゼの熱安定性を決定し、配列番号：１のエステラーゼの熱安定性と比較した。
本発明のエステラーゼの熱安定性を決定し、配列番号：１のエステラーゼの熱安定性と比較した。
【0198】
種々の方法を使用して、熱安定性を推定した。
（１）溶液中のタンパク質の円二色性
（２）所定の温度、時間及びバッファー条件下でタンパク質をインキュベーションした後の残留エステラーゼ活性
（３）所定の温度、時間及びバッファー条件下でタンパク質をインキュベーションした後の残留ポリエステル脱重合活性
（４）所定の温度、時間及びバッファー条件下でタンパク質をインキュベートションした後のアガープレート中に分散した固体ポリエステル化合物（例えば、ＰＥＴ又はＰＢＡＴもしくは類似体）を分解する能力
（５）所定の温度、バッファー、タンパク質濃度及びポリエステル濃度の条件下でポリエステル脱重合アッセイを複数回行う能力
（６）示差走査フルオロメトリー（ＤＳＦ）
（１）溶液中のタンパク質の円二色性
（２）所定の温度、時間及びバッファー条件下でタンパク質をインキュベーションした後の残留エステラーゼ活性
（３）所定の温度、時間及びバッファー条件下でタンパク質をインキュベーションした後の残留ポリエステル脱重合活性
（４）所定の温度、時間及びバッファー条件下でタンパク質をインキュベートションした後のアガープレート中に分散した固体ポリエステル化合物（例えば、ＰＥＴ又はＰＢＡＴもしくは類似体）を分解する能力
（５）所定の温度、バッファー、タンパク質濃度及びポリエステル濃度の条件下でポリエステル脱重合アッセイを複数回行う能力
（６）示差走査フルオロメトリー（ＤＳＦ）
【0199】
このような方法のプロトコールの詳細を以下に示す。
【0200】
３．１ 円二色性
円二色性（ＣＤ）を、配列番号：１のエステラーゼの融解温度（Ｔｍ）（Ｔｍ＝８４．７℃）を本発明のエステラーゼのＴｍと比較するために、Jasco 815装置（Easton, USA）により行った。技術的に、タンパク質サンプル ４００μLをTalonバッファー中に０．５mg/mLで調製し、ＣＤに使用した。タンパク質の正しいフォールディングに対応するＣＤの２つの最大強度を決定するために、２８０～１９０ｎｍの１回目のスキャンを実現した。ついで、２回目のスキャンをこのような最大強度に対応する長さの波で２５℃～１１０℃で行い、Sigmaplotバージョン１１．０ソフトウェアにより分析された特定の曲線（シグモイド３パラメーター ｙ＝ａ／（１＋ｅ＾（（ｘ－ｘ０）／ｂ）））を提供し、ｘ＝ｘ０の場合に、Ｔｍを決定した。得られたＴｍは、所定のタンパク質の熱安定性を反映している。Ｔｍが高いほど、変異体は、高温でより安定である。
円二色性（ＣＤ）を、配列番号：１のエステラーゼの融解温度（Ｔｍ）（Ｔｍ＝８４．７℃）を本発明のエステラーゼのＴｍと比較するために、Jasco 815装置（Easton, USA）により行った。技術的に、タンパク質サンプル ４００μLをTalonバッファー中に０．５mg/mLで調製し、ＣＤに使用した。タンパク質の正しいフォールディングに対応するＣＤの２つの最大強度を決定するために、２８０～１９０ｎｍの１回目のスキャンを実現した。ついで、２回目のスキャンをこのような最大強度に対応する長さの波で２５℃～１１０℃で行い、Sigmaplotバージョン１１．０ソフトウェアにより分析された特定の曲線（シグモイド３パラメーター ｙ＝ａ／（１＋ｅ＾（（ｘ－ｘ０）／ｂ）））を提供し、ｘ＝ｘ０の場合に、Ｔｍを決定した。得られたＴｍは、所定のタンパク質の熱安定性を反映している。Ｔｍが高いほど、変異体は、高温でより安定である。
【0201】
３．２ 残留エステラーゼ活性
４０mg/L（Talonバッファー中） 配列番号：１のエステラーゼ又は本発明のエステラーゼの溶液 １mLを、種々の温度（６５、７０、７５、８０及び９０℃）で１０日間インキュベーションした。サンプルを定期的に採取し、０．１M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で１～５００倍に希釈し、パラニトロフェノール－ブチラート（ｐＮＰ－Ｂ）アッセイを実現した。サンプル ２０μLを１M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０） １７５μL及び２－メチル－２ブタノール中のｐＮＰ－Ｂ溶液（４０mM） ５μLと混合する。酵素反応を撹拌下、３０℃で１５分間行い、４０５nmでの吸光度をマイクロプレート分光光度計（Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）により取得した。ｐＮＰ－Ｂ加水分解の活性（μmol ｐＮＰＢ/分で表現される初速度）を、加水分解曲線の直線部分における遊離したパラニトロフェノールについての検量線を使用して決定した。
４０mg/L（Talonバッファー中） 配列番号：１のエステラーゼ又は本発明のエステラーゼの溶液 １mLを、種々の温度（６５、７０、７５、８０及び９０℃）で１０日間インキュベーションした。サンプルを定期的に採取し、０．１M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で１～５００倍に希釈し、パラニトロフェノール－ブチラート（ｐＮＰ－Ｂ）アッセイを実現した。サンプル ２０μLを１M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０） １７５μL及び２－メチル－２ブタノール中のｐＮＰ－Ｂ溶液（４０mM） ５μLと混合する。酵素反応を撹拌下、３０℃で１５分間行い、４０５nmでの吸光度をマイクロプレート分光光度計（Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）により取得した。ｐＮＰ－Ｂ加水分解の活性（μmol ｐＮＰＢ/分で表現される初速度）を、加水分解曲線の直線部分における遊離したパラニトロフェノールについての検量線を使用して決定した。
【0202】
３．３ 残留ポリエステル脱重合活性
４０mg/L（Talonバッファー中） 配列番号：１のエステラーゼ及び本発明のエステラーゼそれぞれの溶液 １０mLを、種々の温度（６５、７０、７５、８０及び９０℃）で１～３０日間インキュベーションした。サンプル １mLを定期的に採取し、２５０～５００μmに微粉化した１００mg 非晶質ＰＥＴ（ＷＯ第２０１７／１９８７８６号に従って調製、２０％未満の結晶化度に達する）及び０．１M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０） ４９mLを含有するボトルに移し、６５℃でインキュベーションした。バッファー １５０μLを定期的にサンプリングした。必要に応じて、サンプルを０．１M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）で希釈した。ついで、メタノール １５０μL及び６N ＨＣｌ ６．５μLをサンプル又は希釈液 １５０μLに加えた。混合し、０．４５μmのシリンジフィルターでろ過した後、サンプルをＵＨＰＬＣにロードして、テレフタル酸（ＴＡ）、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴの遊離をモニターした。使用したクロマトグラフィーシステムは、ポンプモジュール、オートサンプラー、２５℃に温度調節されたカラムオーブン及び２４０nmでのＵＶ検出器を含むUltimate 3000 ＵＨＰＬＣシステム（Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA）とした。使用したカラムは、Discovery（登録商標）HS Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６mm、５μm、プレカラムを備える、Supelco, Bellefonte, USA）とした。ＴＡ、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴを１mM Ｈ２ＳＯ４中のＭｅＯＨの勾配（３０％～９０％）を使用して１mL/分で分離した。インジェクションは、サンプル ２０μLとした。ＴＡ、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴを市販のＴＡ及びＢＨＥＴ並びに自社合成したＭＨＥＴからサンプルと同じ条件で作成した検量線に従って測定した。ＰＥＴ加水分解の活性（μmol 加水分解されたＰＥＴ/分又はmg 生成された当量のＴＡ/時間）を加水分解曲線の直線部分において決定し、このような曲線を最初の２４時間の間に異なる時点で行ったサンプリングにより設定した。当量のＴＡは、測定されたＴＡと、測定されたＭＨＥＴ及びＢＨＥＴに含まれるＴＡとの合計に相当する。
４０mg/L（Talonバッファー中） 配列番号：１のエステラーゼ及び本発明のエステラーゼそれぞれの溶液 １０mLを、種々の温度（６５、７０、７５、８０及び９０℃）で１～３０日間インキュベーションした。サンプル １mLを定期的に採取し、２５０～５００μmに微粉化した１００mg 非晶質ＰＥＴ（ＷＯ第２０１７／１９８７８６号に従って調製、２０％未満の結晶化度に達する）及び０．１M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０） ４９mLを含有するボトルに移し、６５℃でインキュベーションした。バッファー １５０μLを定期的にサンプリングした。必要に応じて、サンプルを０．１M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）で希釈した。ついで、メタノール １５０μL及び６N ＨＣｌ ６．５μLをサンプル又は希釈液 １５０μLに加えた。混合し、０．４５μmのシリンジフィルターでろ過した後、サンプルをＵＨＰＬＣにロードして、テレフタル酸（ＴＡ）、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴの遊離をモニターした。使用したクロマトグラフィーシステムは、ポンプモジュール、オートサンプラー、２５℃に温度調節されたカラムオーブン及び２４０nmでのＵＶ検出器を含むUltimate 3000 ＵＨＰＬＣシステム（Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA）とした。使用したカラムは、Discovery（登録商標）HS Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６mm、５μm、プレカラムを備える、Supelco, Bellefonte, USA）とした。ＴＡ、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴを１mM Ｈ２ＳＯ４中のＭｅＯＨの勾配（３０％～９０％）を使用して１mL/分で分離した。インジェクションは、サンプル ２０μLとした。ＴＡ、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴを市販のＴＡ及びＢＨＥＴ並びに自社合成したＭＨＥＴからサンプルと同じ条件で作成した検量線に従って測定した。ＰＥＴ加水分解の活性（μmol 加水分解されたＰＥＴ/分又はmg 生成された当量のＴＡ/時間）を加水分解曲線の直線部分において決定し、このような曲線を最初の２４時間の間に異なる時点で行ったサンプリングにより設定した。当量のＴＡは、測定されたＴＡと、測定されたＭＨＥＴ及びＢＨＥＴに含まれるＴＡとの合計に相当する。
【0203】
３．４ 固体状のポリエステルの分解
４０mg/L（Talonバッファー中） 配列番号：１のエステラーゼ及び本発明のエステラーゼそれぞれの溶液 １mLを、種々の温度（６５、７０、７５、８０及び９０℃）で１～３０日間インキュベーションした。酵素調製物 ２０μLを、ＰＥＴを含有するアガープレート中に作製されたウェルに規則正しく入れた。ＰＥＴを含有するアガープレートの作製を、５００mg ＰＥＴをヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）に可溶化し、この媒体を水溶液 ２５０mLに注ぐことにより実現した。１４０mbar下、５２℃でのＨＦＩＰの蒸発後、溶液を、３％ アガーを含有する０．２M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）とｖ／ｖ混合した。混合物 約３０mLを使用して、各オムニトレイを作製し、４℃で保存した。
４０mg/L（Talonバッファー中） 配列番号：１のエステラーゼ及び本発明のエステラーゼそれぞれの溶液 １mLを、種々の温度（６５、７０、７５、８０及び９０℃）で１～３０日間インキュベーションした。酵素調製物 ２０μLを、ＰＥＴを含有するアガープレート中に作製されたウェルに規則正しく入れた。ＰＥＴを含有するアガープレートの作製を、５００mg ＰＥＴをヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）に可溶化し、この媒体を水溶液 ２５０mLに注ぐことにより実現した。１４０mbar下、５２℃でのＨＦＩＰの蒸発後、溶液を、３％ アガーを含有する０．２M リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）とｖ／ｖ混合した。混合物 約３０mLを使用して、各オムニトレイを作製し、４℃で保存した。
【0204】
野生型エステラーゼ及び本発明の変異体によるポリエステル分解により形成されたハローの直径又は表面積を測定し、６０℃、６５℃又は７０℃で２～２４時間後に比較した。所定の温度での酵素の半減期は、ハローの直径又は表面積が１／２になるのに必要な時間に相当する。
【0205】
３．５ 複数回のポリエステルの脱重合
エステラーゼが連続回のポリエステル脱重合アッセイを行う能力を酵素反応器で評価した。Minibio 500反応器（Applikon Biotechnology B.V., Delft, The Netherlands）を、３ｇ 非晶質ＰＥＴ（ＷＯ第２０１７／１９８７８６号に従って調製、２０％未満の結晶化度に達する）及び３mg ＬＣ－エステラーゼを含有する１０mM リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８） １００mLで開始した。攪拌は、マリンインペラを使用して２５０rpmに設定した。バイオリアクターを外付け水浴に浸漬させることにより、６０℃、６５℃又は７０℃で温度調節した。ｐＨを３M ＫＯＨの添加により８にレギュレーションした。種々のパラメーター（ｐＨ、温度、撹拌、塩基の添加）を、BioXpertソフトウェアＶ２．９５によりモニターした。１．８ｇ 非晶質ＰＥＴを２０時間毎に加えた。反応媒体 ５００μLを定期的にサンプリングした。
エステラーゼが連続回のポリエステル脱重合アッセイを行う能力を酵素反応器で評価した。Minibio 500反応器（Applikon Biotechnology B.V., Delft, The Netherlands）を、３ｇ 非晶質ＰＥＴ（ＷＯ第２０１７／１９８７８６号に従って調製、２０％未満の結晶化度に達する）及び３mg ＬＣ－エステラーゼを含有する１０mM リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８） １００mLで開始した。攪拌は、マリンインペラを使用して２５０rpmに設定した。バイオリアクターを外付け水浴に浸漬させることにより、６０℃、６５℃又は７０℃で温度調節した。ｐＨを３M ＫＯＨの添加により８にレギュレーションした。種々のパラメーター（ｐＨ、温度、撹拌、塩基の添加）を、BioXpertソフトウェアＶ２．９５によりモニターした。１．８ｇ 非晶質ＰＥＴを２０時間毎に加えた。反応媒体 ５００μLを定期的にサンプリングした。
【0206】
ＴＡ、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴの量を、実施例２．３に記載されたようにＨＰＬＣにより決定した。ＥＧの量を、６５℃に温度調節されたAminex HPX-87Kカラム（Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, California, United States）を使用して決定した。溶出液は、０．６mL.分－１での５mM Ｋ２ＨＰＯ４とした。インジェクションは、２０μLとした。エチレングリコールを、屈折計を使用してモニターした。
【0207】
％ 加水分解を、初期サンプル中に含まれるＴＡの総量に対する所定時間におけるモル濃度（ＴＡ＋ＭＨＥＴ＋ＢＨＥＴ）の比に基づいて又は初期サンプル中に含まれるＥＧの総量に対する所定時間におけるモル濃度（ＥＧ＋ＭＨＥＴ＋２×ＢＨＥＴ）の比に基づいて計算した。分解速度を１時間あたりのmg 総遊離ＴＡ又は１時間あたりのmg 総ＥＧで計算する。
【0208】
酵素の半減期を、分解速度の５０％の損失を得るのに必要なインキュベーション時間として評価した。
【0209】
３．６ 示差走査フルオロメトリー（ＤＳＦ）
ＤＳＦを使用して、タンパク質集団の半分がアンフォールドされる温度である融解温度（Ｔｍ）を決定することにより、野生型タンパク質（配列番号：１）及びその変異体の熱安定性を評価した。タンパク質サンプルを１４μM（０．４mg／mL）の濃度で調製し、２０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００mM ＮａＣｌからなるバッファーＡ中に保存した。ＤＭＳＯ中のSYPROオレンジ色素５０００×ストック溶液を、最初に水で２５０×に希釈した。タンパク質サンプルを白色透明９６ウェルＰＣＲプレート（Bio-Rad ｃａｔ＃ ＨＳＰ９６０１）上にロードした。ここで、各ウェルは２５μlの最終容量を含有した。各ウェル中のタンパク質及びSYPROオレンジ色素の最終濃度はそれぞれ、５μM（０．１４mg／ml）及び１０×であった。ウェル当たりにロードされた容量を以下のとおりとした：バッファーＡ １５μL、０．４mg／mL タンパク質溶液 ９μL及び２５０×Syproオレンジ希釈溶液 １μL。ついで、ＰＣＲプレートを光学品質シールテープでシールし、２０００rpm、室温で１分間回転させた。ついで、ＤＳＦ実験を、４５０／４９０励起及び５６０／５８０発光フィルターを使用するように設定されたCFX96リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行った。サンプルを０．３℃/秒の速度で２５～１００℃に加熱した。１回の蛍光測定を０．０３秒毎に行った。融解温度をBio-Rad CFX Managerソフトウェアを使用して、融解曲線の一次導関数のピークから決定した。
ＤＳＦを使用して、タンパク質集団の半分がアンフォールドされる温度である融解温度（Ｔｍ）を決定することにより、野生型タンパク質（配列番号：１）及びその変異体の熱安定性を評価した。タンパク質サンプルを１４μM（０．４mg／mL）の濃度で調製し、２０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００mM ＮａＣｌからなるバッファーＡ中に保存した。ＤＭＳＯ中のSYPROオレンジ色素５０００×ストック溶液を、最初に水で２５０×に希釈した。タンパク質サンプルを白色透明９６ウェルＰＣＲプレート（Bio-Rad ｃａｔ＃ ＨＳＰ９６０１）上にロードした。ここで、各ウェルは２５μlの最終容量を含有した。各ウェル中のタンパク質及びSYPROオレンジ色素の最終濃度はそれぞれ、５μM（０．１４mg／ml）及び１０×であった。ウェル当たりにロードされた容量を以下のとおりとした：バッファーＡ １５μL、０．４mg／mL タンパク質溶液 ９μL及び２５０×Syproオレンジ希釈溶液 １μL。ついで、ＰＣＲプレートを光学品質シールテープでシールし、２０００rpm、室温で１分間回転させた。ついで、ＤＳＦ実験を、４５０／４９０励起及び５６０／５８０発光フィルターを使用するように設定されたCFX96リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行った。サンプルを０．３℃/秒の速度で２５～１００℃に加熱した。１回の蛍光測定を０．０３秒毎に行った。融解温度をBio-Rad CFX Managerソフトウェアを使用して、融解曲線の一次導関数のピークから決定した。
【0210】
ついで、配列番号：１のエステラーゼ及び本発明のエステラーゼをそれらのＴｍ値に基づいて比較した。異なる調製由来の同じタンパク質についての実験間の高い再現性のために、０．８℃のΔＴｍは、変異体を比較するのに有意であるとみなした。Ｔｍ値は、少なくとも３回の測定の平均に対応する。配列番号：１のエステラーゼのＴｍを８４．７℃で評価した。
【0211】
本発明のエステラーゼ変異体の熱安定性を以下の表３に示し、Ｔｍ値で表現し、実施例２．６に従って評価した。配列番号：１のエステラーゼと比較したＴｍの上昇を括弧内に示す。
【0212】
【表3】
【0213】
変異体Ｖ１～Ｖ８３は、表３にそれぞれ列挙された置換の組み合わせを除いて、配列番号：１に示される正確なアミノ酸配列を有する。
【配列表】