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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-09
(45)【発行日】2024-12-17
(54)【発明の名称】ＧＬＰ－１類似体の精製
(51)【国際特許分類】
C07K 1/20 20060101AFI20241210BHJP
C07K 14/575 20060101ALN20241210BHJP
【ＦＩ】
C07K1/20 ZNA
C07K14/575
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2021569597
(86)(22)【出願日】2020-02-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-12
(86)【国際出願番号】 IB2020050915
(87)【国際公開番号】W WO2020161636
(87)【国際公開日】2020-08-13
【審査請求日】2022-11-14
(31)【優先権主張番号】201941004693
(32)【優先日】2019-02-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】506292941
【氏名又は名称】バイオコン・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＣＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】２０ｔｈ ＫＭ，Ｈｏｓｕｒ Ｒｏａｄ，Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｉｔｙ，Ｋａｒｎａｔａｋａ Ｂａｎｇａｌｏｒｅ ５６０ １００，Ｉｎｄｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パティル，ニティン ソパンラオ
(72)【発明者】
【氏名】ガネシュ，ラマチャンドラン
(72)【発明者】
【氏名】サンタン，オンカー プラカシュ
(72)【発明者】
【氏名】ランべ，アビジート アルン
(72)【発明者】
【氏名】バスティコッパ，クルティ サティシュ
(72)【発明者】
【氏名】シンデュアムタン，カティラヴァン
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１０４９２２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１３－５０１７７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】高松亨 ほか，"イオン対クロマトグラフィーの基礎的検討"，東洋曹達研究報告，1980年，Vol. 24，pp. 23-32
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
粗リラグルチドを精製するための方法であって、以下：ａ．水性酸性溶液およびアセトニトリルを含む混合物中に粗リラグルチドを溶解することによって粗リラグルチドの溶液を得ること；
ｂ．移動相Ａとして水性酸性溶液およびイオンペアリング剤、移動相Ｂとしてアルコールを含有するアセトニトリルを使用して、粗リラグルチドの溶液を第１のＨＰＬＣ精製に付すこと；
ｃ．第１のＨＰＬＣ精製からのリラグルチドを第２のＨＰＬＣ精製に付すこと；および
ｄ．精製されたリラグルチドを単離すること
を含み、イオンペアリング剤が、アルカンスルホン酸の塩である、前記方法。
【請求項2】
アルカンスルホン酸の塩が、１－オクタンスルホン酸ナトリウム塩および１－ヘプタンスルホン酸ナトリウム塩からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
アルカンスルホン酸の塩が、１－ヘキサンスルホン酸ナトリウム塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
水性酸性溶液が、選択されたクエン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、またはギ酸である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願：
本出願は、本明細書に参照によって組み込まれる、２０１９年２月６日に出願された、我々のインド特許出願第２０１９４１００４６９３号の優先権の利益を主張する。
本出願は、本明細書に参照によって組み込まれる、２０１９年２月６日に出願された、我々のインド特許出願第２０１９４１００４６９３号の優先権の利益を主張する。
【0002】
本発明は、とりわけ式－Ｉによって表される、粗ＧＬＰ－１類似体、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）を精製するための方法に関する。
式－Ｉ
式－Ｉ
【化1】
【背景技術】
【0003】
本開示の背景および先行技術
リラグルチド（ＶＩＣＴＯＺＡ（登録商標））は、２型糖尿病を伴う成人の血糖制御を改善するための食事および運動の補助剤として用いられるグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニストである。
リラグルチド（ＶＩＣＴＯＺＡ（登録商標））は、２型糖尿病を伴う成人の血糖制御を改善するための食事および運動の補助剤として用いられるグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニストである。
【0004】
リラグルチドは、位置３４のリシンがアルギニンによって置き換えられ、そして、パルミトイル基がグルタモイルスペーサーを介してリシンに位置２６で付着している、天然に存在するヒトグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１（７－３７））の長時間作用型類似体である。
Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋによって開発されたリラグルチド（ＶＩＣＴＯＺＡ（登録商標））は、皮下注射として２０１０年に米国において最初の承認を得た。
リラグルチドは、パルミトイル基に起因するその長いペプチド鎖および高い疎水性に起因して、精製することが高度に困難である。
リラグルチドを含むＧＬＰ－１類似体の精製のための複数の試みが過去に報告されている。
Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋによって開発されたリラグルチド（ＶＩＣＴＯＺＡ（登録商標））は、皮下注射として２０１０年に米国において最初の承認を得た。
リラグルチドは、パルミトイル基に起因するその長いペプチド鎖および高い疎水性に起因して、精製することが高度に困難である。
リラグルチドを含むＧＬＰ－１類似体の精製のための複数の試みが過去に報告されている。
【0005】
Journal of Medicinal Chemistry 43, 1664-1669, 2000は、シアノプロピルカラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－ＣＮ）および標準アセトニトリル／ＴＦＡシステムを使用する逆相－高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ ＨＰＬＣ）によるリラグルチドの精製プロセスを開示する。
上に開示された方法は、３５％の減少した精製収率を結果としてもたらす。ＷＯ２０１３１１７１３５は、イソプロピルアルコール／ＴＦＡシステムを使用するＲＰ ＨＰＬＣによるリラグルチドの精製プロセスを開示する。
開示された方法には、面倒なプロセスである３ＲＰ ＨＰＬＣ操作を関与させた複数の精製ステップが関与する。
上に開示された方法は、３５％の減少した精製収率を結果としてもたらす。ＷＯ２０１３１１７１３５は、イソプロピルアルコール／ＴＦＡシステムを使用するＲＰ ＨＰＬＣによるリラグルチドの精製プロセスを開示する。
開示された方法には、面倒なプロセスである３ＲＰ ＨＰＬＣ操作を関与させた複数の精製ステップが関与する。
【0006】
ＧＬＰ－１ペプチドは、合成によってまたは組み換えアプローチによってのいずれかで生成され、しばしば、ＲＰ－ＨＰＬＣ上で分離するのが困難である密接に関連した不純物（closely related impurities）を有する。これらの不純物は、親分子と類似の特徴を有する、異性体または欠失／添加ベースの不純物である。これらの密接に関連した不純物は、精製の課題を提起する。
【0007】
ＲＰ－ＨＰＬＣの使用は、ｐＫａ値における大きいバリエーションを伴う構成要素を有する複合体混合物の分離および同定については限定されることが周知である。よって、不純物を厳密に溶出させる分解能は、クロマトグラフィーの精製において常に難題であった。従来のＨＰＬＣ方法を伴う有機イオンの分解能において、イオン対試薬の使用は、溶離液比率を変更するかまたは固定相を変えることなどの一般的な改善策が失敗するときに、ピーク形状および保持時間を増強することができる。この技法は、しばしば、イオン対クロマトグラフィー（ＩＰＣ）と称される。
【0008】
ＩＰＣは、帯電アナライトを伴うイオン対の形成を推進するためにイオン対試薬が移動相に加えられるＲＰ－ＨＰＬＣのタイプであり、それはイオン性分子の分離のために好適な逆相カラムを形成する。保持／分離は、逆相およびイオン対－イオン交換機構の動的な組み合わせに続く。
【0009】
イオン対試薬は、長い直鎖アルキル鎖（Ｃ３からＣ１６まで）、および、ＲＰ相のアルキル鎖（Ｃ８またはＣ１８）に可逆的に吸着して動的なイオン交換体を形成することができるイオン性基を含んでなり、イオン性化合物は、そこで分離されることができる。イオン対試薬には２つの主なタイプ、塩基性化合物のためのアニオン性アルキルスルホナートおよび酸性化合物のためのカチオン性第四級アミンがある。ＩＰＣにおいて一般的に用いられるアルキルスルホナートは、１－ヘキサンスルホン酸ナトリウム塩、１－へプタスルホン酸ナトリウム塩、１－オクタンスルホン酸ナトリウム塩などである。システムの選択性は、移動相における前者のイオン対の選択および量に強く依存する。長い鎖長を伴う試薬は、ＲＰ相上へ大幅によりよく吸着され、保持に肯定的な影響を及ぼす。
【0010】
これらの密接に関連した不純物からのリラグルチドの分離は、ＲＰ－ＨＰＬＣ上で、イオンペアリング剤、すなわち１－オクタンスルホン酸、ヘキサンスルホン酸のナトリウム塩の不在下および存在下で研究された。密接に関連した不純物の分解能が、イオンペアリング剤が使用されない精製実行と比較して、全体的により良好な純度に、結果としてなるイオンペアリング剤の存在下においてより有効であったことが観察された。
【0011】
本発明は、イオンペアリング剤、すなわちプロパンスルホン酸、ブタンスルホン酸、ペンタンスルホン酸、ヘキサンスルホン酸、ヘプタンスルホン酸、オクタンスルホン酸、ノナンスルホン酸、デカンスルホン酸、ウンデカンスルホン酸、ドデカンスルホン酸、トリデカンスルホン酸のナトリウム塩の不在下および存在下で、ＲＰ－ＨＰＬＣ上で研究された、これらの密接に関連した不純物からのリラグルチドの精製のための方法を、提供する。
【0012】
密接に関連した不純物の分解能が、イオンペアリング剤が使用されないＲＰＨＰＬＣ精製と比較して、全体的により良好な純度に、結果としてなるイオンペアリング剤の存在下においてより有効であったことが観察された。
【発明の概要】
【0013】
本出願の側面は、リラグルチドの精製のためのプロセスを提供する。
本発明の一側面は、粗リラグルチドを精製するための方法を開示し、該方法は、以下を含む：
ａ．水性酸性溶液およびアセトニトリルを含む混合物中に粗リラグルチドを溶解することによってリラグルチドの溶液を得ること；
ｂ．移動相Ａとして水性酸性溶液およびイオンペアリング剤、移動相Ｂとしてアルコールを含有するアセトニトリルを使用して、粗リラグルチドの溶液を第１のＨＰＬＣ精製に付すこと；
ｃ．第１のＨＰＬＣ精製からのリラグルチドを第２のＨＰＬＣ精製に付すこと；
および
ｄ．精製されたリラグルチドを単離すること。
本発明の別の側面は、粗リラグルチドを精製するための方法を開示し、ここで、イオンペアリング剤は、アルカンスルホン酸の塩から選択される。
本発明の一側面は、粗リラグルチドを精製するための方法を開示し、該方法は、以下を含む：
ａ．水性酸性溶液およびアセトニトリルを含む混合物中に粗リラグルチドを溶解することによってリラグルチドの溶液を得ること；
ｂ．移動相Ａとして水性酸性溶液およびイオンペアリング剤、移動相Ｂとしてアルコールを含有するアセトニトリルを使用して、粗リラグルチドの溶液を第１のＨＰＬＣ精製に付すこと；
ｃ．第１のＨＰＬＣ精製からのリラグルチドを第２のＨＰＬＣ精製に付すこと；
および
ｄ．精製されたリラグルチドを単離すること。
本発明の別の側面は、粗リラグルチドを精製するための方法を開示し、ここで、イオンペアリング剤は、アルカンスルホン酸の塩から選択される。
【0014】
本発明の別の側面は、粗リラグルチドを精製するための方法を開示し、ここで、アルカンスルホン酸の塩は、１－オクタンスルホン酸ナトリウム塩または１－ヘプタンスルホン酸ナトリウム塩からなる群から、選択される。
本発明の別の側面は、粗リラグルチドを精製するための方法を開示し、ここで、アルカンスルホン酸の塩は、１－ヘキサンスルホン酸ナトリウム塩である。
本発明の別の側面は、粗リラグルチドを精製するための方法を開示し、ここで、水性酸性溶液は、選択されたクエン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、またはギ酸である。
本発明の別の側面は、イオンペアリング剤を使用したＨＰＬＣによって粗リラグルチドを精製するための方法を開示する。
機器のパラメーター：
ＨＰＬＣ機器パラメーター：
カラム ：Ｃ８、１５０×４．６ｍｍ、２．７μｍ
カラム温度 ：６０℃
検出 ：ＵＶ
波長 ：２１５ｎｍ
本発明の別の側面は、粗リラグルチドを精製するための方法を開示し、ここで、アルカンスルホン酸の塩は、１－ヘキサンスルホン酸ナトリウム塩である。
本発明の別の側面は、粗リラグルチドを精製するための方法を開示し、ここで、水性酸性溶液は、選択されたクエン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、またはギ酸である。
本発明の別の側面は、イオンペアリング剤を使用したＨＰＬＣによって粗リラグルチドを精製するための方法を開示する。
機器のパラメーター：
ＨＰＬＣ機器パラメーター：
カラム ：Ｃ８、１５０×４．６ｍｍ、２．７μｍ
カラム温度 ：６０℃
検出 ：ＵＶ
波長 ：２１５ｎｍ
【0015】
本発明の利点：
粗リラグルチド粉末（アッセイ２０～２５％；純度３０～５０％）が、それぞれ異なる条件の下の２つの連続したＲＰ－ＨＰＬＣ精製ステップに付され、続いて、凍結乾燥によって純粋なリラグルチドが産生される。本発明には、密接に関連した不純物から粗リラグルチドを精製するために、ＲＰ－ＨＰＬＣステップの１つにおいて、選択的イオンペアリング剤を使用することが関与する。プロセスにおけるイオンペアリング剤の不在は、関連した不純物の分解能が全くないかまたは劣るという結果をもたらし、最終的なＡＰＩ中の不純物につながる。
粗リラグルチド粉末（アッセイ２０～２５％；純度３０～５０％）が、それぞれ異なる条件の下の２つの連続したＲＰ－ＨＰＬＣ精製ステップに付され、続いて、凍結乾燥によって純粋なリラグルチドが産生される。本発明には、密接に関連した不純物から粗リラグルチドを精製するために、ＲＰ－ＨＰＬＣステップの１つにおいて、選択的イオンペアリング剤を使用することが関与する。プロセスにおけるイオンペアリング剤の不在は、関連した不純物の分解能が全くないかまたは劣るという結果をもたらし、最終的なＡＰＩ中の不純物につながる。
【0016】
イオンペアリング剤としてのオクタン－１－スルホン酸を伴わないおよび伴うリラグルチド純度プロファイルの比較：
下表は、イオンペアリング剤としてのオクタン－１－スルホン酸の使用を伴わないおよび伴う、ＲＲＴの０．９３、０．９８、および１．０６で存在する、密接に関連する不純物に関して、リラグルチド純度プロファイルの比較を提供する。
下表は、イオンペアリング剤としてのオクタン－１－スルホン酸の使用を伴わないおよび伴う、ＲＲＴの０．９３、０．９８、および１．０６で存在する、密接に関連する不純物に関して、リラグルチド純度プロファイルの比較を提供する。
【0017】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【0018】
開示が容易に理解されることができ、実質的に実行に移されることができるために、参照は、添付の図に図示されるように、ここで、例示的実施形態とされる。以下の詳細な説明を伴う図は、中に組み込まれて、明細書の部分を形成し、更に実施形態を図示し、種々の原理および利点を説明するのに役立ち、ここで本開示に従って：
【発明を実施するための形態】
【0019】
発明の詳細な説明
本発明の態様は、以後具体的な例を使用して、本願明細書において更に記載される。該例は、発明の一定の実施形態のより良い理解のために提供され、そして、いかなる方法においても、それらの範囲を限定しない。本願の記載の教示および本発明の技術分野の一般的な技術を用いる当業者にとって明らかな、可能な変更および等価物も、この明細書の部分を形成し、その範囲内に含まれることが意図される。
本発明の態様は、以後具体的な例を使用して、本願明細書において更に記載される。該例は、発明の一定の実施形態のより良い理解のために提供され、そして、いかなる方法においても、それらの範囲を限定しない。本願の記載の教示および本発明の技術分野の一般的な技術を用いる当業者にとって明らかな、可能な変更および等価物も、この明細書の部分を形成し、その範囲内に含まれることが意図される。
【0020】
例：
例１：
固相合成から得た粗リラグルチドの２７５．５ｍｇを、１０％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）を含有する２５０ｍＭのクエン酸一水和物中に溶解し、ろ過して、ツーステップＲＰ－ＨＰＬＣ精製に付した。
例１：
固相合成から得た粗リラグルチドの２７５．５ｍｇを、１０％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）を含有する２５０ｍＭのクエン酸一水和物中に溶解し、ろ過して、ツーステップＲＰ－ＨＰＬＣ精製に付した。
【0021】
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１：
粗リラグルチド溶液を、０．０５％ｗ／ｖオクタン－１－スルホン酸ナトリウム塩（移動相Ａ）、２５％アセトニトリル：イソプロパノール（７：３）（移動相Ｂ）ｐＨ２．０を含有する１００ｍＭクエン酸の約６０ｍｌと平衡化したＣ８－置換シリカカラム（粒子サイズ１０～１３μｍ）の２０ｍｌ上へ装填した。装填後、カラムを、８：２の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂによって洗浄した。
粗リラグルチド溶液を、０．０５％ｗ／ｖオクタン－１－スルホン酸ナトリウム塩（移動相Ａ）、２５％アセトニトリル：イソプロパノール（７：３）（移動相Ｂ）ｐＨ２．０を含有する１００ｍＭクエン酸の約６０ｍｌと平衡化したＣ８－置換シリカカラム（粒子サイズ１０～１３μｍ）の２０ｍｌ上へ装填した。装填後、カラムを、８：２の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂによって洗浄した。
【0022】
生成物を、最大６０％Ｂまでのグラディエントを適用することによって、溶出させた。検出波長を、２１５ｎｍに保った。クロマトグラフィーの温度は、２５℃に保った。＞９１％の純度を伴う画分をプールし、そして、ＲＰ－１での平均プール純度は、０．５０％未満の密接に関連した不純物を伴い、＞９５％であった。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１からのリラグルチド生成物は、さらにＲＰ－ＨＬＣ－２に用いられた。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１からのリラグルチド生成物は、さらにＲＰ－ＨＬＣ－２に用いられた。
【0023】
例２：
固相合成から得た粗リラグルチドの２７５．５ｍｇを、１０％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）を含有する２５０ｍＭのクエン酸一水和物中に溶解し、ろ過して、ツーステップＲＰ－ＨＰＬＣ精製に付した。
固相合成から得た粗リラグルチドの２７５．５ｍｇを、１０％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）を含有する２５０ｍＭのクエン酸一水和物中に溶解し、ろ過して、ツーステップＲＰ－ＨＰＬＣ精製に付した。
【0024】
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１：
粗リラグルチド溶液を、０．０５％１－ヘキサンスルホン酸ナトリウム塩（移動相Ａ）、２５％アセトニトリル：イソプロパノール（７：３）（移動相Ｂ）ｐＨ２．０を含有する１００ｍＭクエン酸の約６０ｍｌと平衡化したＣ８－置換シリカカラム（粒子サイズ１０～１３μｍ）の２０ｍｌ上へ装填した。
粗リラグルチド溶液を、０．０５％１－ヘキサンスルホン酸ナトリウム塩（移動相Ａ）、２５％アセトニトリル：イソプロパノール（７：３）（移動相Ｂ）ｐＨ２．０を含有する１００ｍＭクエン酸の約６０ｍｌと平衡化したＣ８－置換シリカカラム（粒子サイズ１０～１３μｍ）の２０ｍｌ上へ装填した。
【0025】
装填後、カラムを、８：２の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂによって洗浄した。生成物を、最大６０％までのグラディエントを適用することによって、溶出させた。検出波長を、２１５ｎｍに保った。クロマトグラフィーの温度は、２５℃に保った。
画分を収集し、純度に関して分析した。＞９１％の純度を伴う画分を、プールした。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドＨＰＬＣクロマトグラムの純度は、図４に示すとおりである。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドのＨＰＬＣ純度は、２．０％未満の密接に関連した不純物を伴い、＞９５％であった。
画分を収集し、純度に関して分析した。＞９１％の純度を伴う画分を、プールした。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドＨＰＬＣクロマトグラムの純度は、図４に示すとおりである。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドのＨＰＬＣ純度は、２．０％未満の密接に関連した不純物を伴い、＞９５％であった。
【0026】
これらのプールのｐＨを、７．８まで調整し、３５℃で蒸留して、有機溶媒を取り除いた。沈殿をｐＨ－４．９でさせ、そして、ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドを単離した。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１からのリラグルチド生成物は、さらにＲＰ－ＨＬＣ－２に用いられた。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１からのリラグルチド生成物は、さらにＲＰ－ＨＬＣ－２に用いられた。
【0027】
例３：
固相合成から得た粗リラグルチドの２７５．５ｍｇを、１０％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）を含有する２５０ｍＭのクエン酸一水和物中に溶解し、ろ過して、ツーステップＲＰ－ＨＰＬＣ精製に付した。
固相合成から得た粗リラグルチドの２７５．５ｍｇを、１０％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）を含有する２５０ｍＭのクエン酸一水和物中に溶解し、ろ過して、ツーステップＲＰ－ＨＰＬＣ精製に付した。
【0028】
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１：
粗リラグルチド溶液を、１００ｍＭクエン酸（移動相Ａ）、２５％アセトニトリル：イソプロパノール（７：３）（移動相Ｂ）ｐＨ２．０の約６０ｍｌと平衡化したＣ８－置換シリカカラム（粒子サイズ１０～１３μｍ）の２０ｍｌ上へ装填した。装填後、カラムを、８：２の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂによって洗浄した。生成物を、最大６０％Ｂまでのグラディエントを適用することによって、溶出させた。検出波長を、２１５ｎｍに保った。クロマトグラフィーの温度は、２５℃に保った。画分を収集し、純度に関して分析した。＞９１％の純度を伴う画分を、プールした。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドのＨＰＬＣ純度は、２．０％未満の密接に関連した不純物を伴い、＞９５％であった。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドＨＰＬＣクロマトグラムの純度は、図２に示すとおりである。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１からのリラグルチド生成物は、さらにＲＰ－ＨＬＣ－２に用いられた。
粗リラグルチド溶液を、１００ｍＭクエン酸（移動相Ａ）、２５％アセトニトリル：イソプロパノール（７：３）（移動相Ｂ）ｐＨ２．０の約６０ｍｌと平衡化したＣ８－置換シリカカラム（粒子サイズ１０～１３μｍ）の２０ｍｌ上へ装填した。装填後、カラムを、８：２の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂによって洗浄した。生成物を、最大６０％Ｂまでのグラディエントを適用することによって、溶出させた。検出波長を、２１５ｎｍに保った。クロマトグラフィーの温度は、２５℃に保った。画分を収集し、純度に関して分析した。＞９１％の純度を伴う画分を、プールした。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドのＨＰＬＣ純度は、２．０％未満の密接に関連した不純物を伴い、＞９５％であった。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドＨＰＬＣクロマトグラムの純度は、図２に示すとおりである。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１からのリラグルチド生成物は、さらにＲＰ－ＨＬＣ－２に用いられた。
【0029】
例４：
固相合成から得た粗リラグルチドの３２．６ｇを、１０％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）を含有する２５０ｍＭのクエン酸一水和物中に溶解し、ろ過して、ツーステップＲＰ－ＨＰＬＣ精製に付した。
固相合成から得た粗リラグルチドの３２．６ｇを、１０％のアセトニトリル（ｖ／ｖ）を含有する２５０ｍＭのクエン酸一水和物中に溶解し、ろ過して、ツーステップＲＰ－ＨＰＬＣ精製に付した。
【0030】
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１：
粗リラグルチド溶液を、０．０５％オクタン－１－スルホン酸ナトリウム塩（移動相Ａ）、２５％アセトニトリル：イソプロパノール（７：３）（移動相Ｂ）ｐＨ２．０を含有する１００ｍＭクエン酸の約７．２Ｌと平衡化したＣ８－置換シリカカラム（粒子サイズ１０～１３μｍ）の２．４Ｌ上へ装填した。装填後、カラムを、８：２の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂによって洗浄した。生成物を、最大６０％Ｂまでのグラディエントを適用することによって、溶出させた。検出波長を、２１５ｎｍに保った。クロマトグラフィーの温度は、２５℃に保った。画分を収集し、純度に関して分析した。＞９１％の純度を伴う画分を、プールした。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドＨＰＬＣクロマトグラムの純度は、図３に示すとおりである。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドのＨＰＬＣ純度は、０．５０％未満の密接に関連した不純物を伴い、＞９４％であった。
粗リラグルチド溶液を、０．０５％オクタン－１－スルホン酸ナトリウム塩（移動相Ａ）、２５％アセトニトリル：イソプロパノール（７：３）（移動相Ｂ）ｐＨ２．０を含有する１００ｍＭクエン酸の約７．２Ｌと平衡化したＣ８－置換シリカカラム（粒子サイズ１０～１３μｍ）の２．４Ｌ上へ装填した。装填後、カラムを、８：２の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂによって洗浄した。生成物を、最大６０％Ｂまでのグラディエントを適用することによって、溶出させた。検出波長を、２１５ｎｍに保った。クロマトグラフィーの温度は、２５℃に保った。画分を収集し、純度に関して分析した。＞９１％の純度を伴う画分を、プールした。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドＨＰＬＣクロマトグラムの純度は、図３に示すとおりである。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドのＨＰＬＣ純度は、０．５０％未満の密接に関連した不純物を伴い、＞９４％であった。
【0031】
これらのプールのｐＨを、７．８まで調整し、３５℃で蒸留して、有機溶媒を取り除いた。沈殿をｐＨ－４．９でさせ、そして、ＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製されたリラグルチドを単離した。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１からのリラグルチド生成物は、さらにＲＰ－ＨＬＣ－２に用いられた。
ＲＰ－ＨＰＬＣ－１からのリラグルチド生成物は、さらにＲＰ－ＨＬＣ－２に用いられた。
【0032】
ＲＰ－ＨＰＬＣ－２：
３ｍｇ／ｍｌで２５％メタノールを含有する５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム中に溶解したＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製リラグルチドの３．１Ｌを、５％アセトニトリルを含有する５０ｍＭナトリウムホスファート緩衝液ｐＨ７．５の約７．２Ｌによって平衡化したＣ８－置換シリカカラム（粒子サイズ１０～１３μｍ）の２．４Ｌ上に装填した。生成物を、最大４１％Ｂまでのグラディエントを適用することによって、溶出させた。検出波長を、２１５ｎｍに保った。
３ｍｇ／ｍｌで２５％メタノールを含有する５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム中に溶解したＲＰ－ＨＰＬＣ－１精製リラグルチドの３．１Ｌを、５％アセトニトリルを含有する５０ｍＭナトリウムホスファート緩衝液ｐＨ７．５の約７．２Ｌによって平衡化したＣ８－置換シリカカラム（粒子サイズ１０～１３μｍ）の２．４Ｌ上に装填した。生成物を、最大４１％Ｂまでのグラディエントを適用することによって、溶出させた。検出波長を、２１５ｎｍに保った。
【0033】
クロマトグラフィーの温度は、２５℃に保った。個々の画分を、収集して、純度に関して分析した。＞９８．０％の純度を伴う画分をプールして、３５℃で蒸留し、有機溶媒を取り除いた。沈殿を、ｐＨ４．９で行った。精製したリラグルチドを、凍結乾燥に付した。凍結乾燥粉末のＨＰＬＣ純度は、０．２０％を超える不純物を伴わず、＞９９％であった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
