特許 7602454 核酸分子及び非ウイルス遺伝子治療のためのそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-10

(45)【発行日】2024-12-18

(54)【発明の名称】核酸分子及び非ウイルス遺伝子治療のためのそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/85 20060101AFI20241211BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241211BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241211BHJP

   C12N 15/16 20060101ALI20241211BHJP

   C12N 15/19 20060101ALI20241211BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241211BHJP

   C12N 15/866 20060101ALI20241211BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20241211BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20241211BHJP

   C07K 14/475 20060101ALI20241211BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20241211BHJP

   C07K 14/575 20060101ALI20241211BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20241211BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20241211BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241211BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241211BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241211BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241211BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241211BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241211BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241211BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241211BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20241211BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241211BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241211BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241211BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20241211BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20241211BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20241211BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20241211BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20241211BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20241211BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20241211BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20241211BHJP

   A61K 38/37 20060101ALN20241211BHJP

   A61K 38/36 20060101ALN20241211BHJP

   A61K 38/22 20060101ALN20241211BHJP

   A61K 38/19 20060101ALN20241211BHJP

   A61K 38/18 20060101ALN20241211BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20241211BHJP

【ＦＩ】

C12N15/85 Z

C12N15/12 ZNA

C12N15/13

C12N15/16

C12N15/19

C12N15/63 Z

C12N15/866 Z

C12N15/88 Z

C12N15/113 Z

C07K14/475

C07K14/52

C07K14/575

C07K16/00

C07K16/46

C07K19/00

C12P21/02 C

C12P21/08

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P43/00 111

A61P7/04

A61K35/76

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K48/00

A61K31/7105

A61K31/713

A61K47/44

A61K9/127

A61K9/51

A61K47/46

A61K47/24

A61P1/16

A61K38/37

A61K38/36

A61K38/22

A61K38/19

A61K38/18

A61K39/395 D

A61K39/395 N

【請求項の数】 45

(21)【出願番号】P 2021506753

(86)(22)【出願日】2019-08-09

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-12-09

(86)【国際出願番号】 US2019045957

(87)【国際公開番号】W WO2020033863

(87)【国際公開日】2020-02-13

【審査請求日】2022-08-03

(31)【優先権主張番号】62/716,826

(32)【優先日】2018-08-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】512147244

【氏名又は名称】バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ダグラス・ドレイガー

(72)【発明者】

【氏名】ジァイン・リウ

(72)【発明者】

【氏名】トンヤオ・リウ

(72)【発明者】

【氏名】スザンナ・パタロヨ－ホワイト

(72)【発明者】

【氏名】ロバート・ティ・ピーターズ

(72)【発明者】

【氏名】アレクシー・セレジン

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ・ザカス

【審査官】西村 亜希子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５０９１４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００８／０１６３９１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００８－５１０４８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５１３０２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－０６７２１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５１１６９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１３０２４５（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子であって、該第一のＩＴＲは、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列からなり、及び該第二のＩＴＲは、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列からなる；又は該第一のＩＴＲは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列からなり、及び該第二のＩＴＲは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列からなる、上記核酸分子。

【請求項2】

遺伝子カセットはプロモーターをさらに含み、
該プロモーターは、該異種ポリヌクレオチド配列に対して５'側に位置する；
該プロモーターは、組織特異的プロモーターである；
該プロモーターは、筋肉、中枢神経系（ＣＮＳ）、眼球、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、肺、皮膚、膀胱、尿路、もしくは任意のその組合せから選択される臓器における該異種ポリヌクレオチド配列の発現を推進する；
該プロモーターは、肝細胞、内皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、類洞細胞、求心性神経、遠心性神経、介在ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、小膠細胞、上衣細胞、肺上皮細胞、シュワン細胞、サテライト細胞、光受容細胞、網膜神経節細胞、もしくは任意のその組合せにおける該異種ポリヌクレオチド配列の発現を推進する；並びに／又は、
該プロモーターは、マウスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミンミニマルプロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）、ミオグロビン（ＭＢ）、デスミン（ＤＥＳ）、ＳＰｃ５－１２、２Ｒ５Ｓｃ５－１２、ｄＭＣＫ、ｔＭＣＫ、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターからなる群より選択される、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

該異種ポリヌクレオチド配列は、イントロン配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項4】

該イントロン配列は、該異種ポリヌクレオチド配列に対して５'側に位置する；
該イントロン配列は、該プロモーターに対して３'側に位置する；及び／もしくは、
該イントロン配列は、合成イントロン配列を含む；
該異種ポリヌクレオチド配列は、凝固因子、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、そのフラグメント、もしくは任意のその組合せをコードする、
請求項３に記載の核酸分子。

【請求項5】

該異種ポリヌクレオチド配列は、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバー、コロニー刺激因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エフリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ウシ胎児ソマトトロピン（ＦＢＳ）、ＧＤＮＦファミリーメンバー、増殖分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝癌細胞由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子、インターロイキン（ＩＬ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン、ニューロトロフィン、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換増殖因子、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、並びに任意のその組合せからなる群より選択される、増殖因子をコードする；
該異種ポリヌクレオチド配列は、ホルモンをコードする；
該異種ポリヌクレオチド配列は、サイトカインをコードする；もしくは、
該異種ポリヌクレオチド配列は、抗体もしくはそのフラグメントをコードする；又は
該異種ポリヌクレオチド配列は、ジストロフィンＸ連鎖、ＭＴＭ１（ミオチューブラリン）、チロシン水酸化酵素、ＡＡＤＣ、シクロヒドロラーゼ、ＳＭＮ１、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＳ１、ＣＦＨ、ＨＴＲＡ、ＡＲＭＳ、ＣＦＢ／ＣＣ２、ＣＮＧＡ／ＣＮＧＢ、Ｐｒｆ６５、ＡＲＳＡ、ＰＳＡＰ、ＩＤＵＡ（ＭＰＳＩ）、ＩＤＳ（ＭＰＳＩＩ）、ＰＡＨ、ＧＡＡ（酸性アルファグルコシダーゼ）、及び任意のその組合せから選択される遺伝子をコードする、
請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項6】

該異種ポリヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする；並びに／又は、
該異種ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている、
請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項7】

該ｍｉＲＮＡは、ＳＯＤ１、ＨＴＴ、ＲＨＯ、及び任意のその組合せから選択される標的遺伝子の発現を下方調節する、請求項６に記載の核酸分子。

【請求項8】

該異種ポリヌクレオチド配列は、ヒトにおける発現にコドン最適化されている、請求項６又は７に記載の核酸分子。

【請求項9】

該遺伝子カセットは、転写後調節エレメントをさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項10】

該転写後調節エレメントは、該異種ポリヌクレオチド配列の３'側に位置する；及び／もしくは、
該転写後調節エレメントは、変異ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（
ＷＰＲＥ）、マイクロＲＮＡ結合部位、ＤＮＡ核標的化配列、もしくは任意のその組合せを含み、又は、該マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１４２－３ｐに対する結合部位を含む；
該遺伝子カセットは、３'ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列をさらに含む；
該遺伝子カセットは、エンハンサー配列をさらに含み、該エンハンサー配列は、該第一のＩＴＲと該第二のＩＴＲとの間に位置する；
該遺伝子カセットは、一本鎖核酸を含む；並びに／又は、
該遺伝子カセットは、二本鎖核酸を含む、
請求項９に記載の核酸分子。

【請求項11】

該３'ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列は、ｂＧＨポリ（Ａ）、アクチンポリ（Ａ）、ヘモグロビンポリ（Ａ）、及び任意のその組合せからなる群より選択され、又は、該３'ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列は、ｂＧＨポリ（Ａ）を含む、請求項１０に記載の核酸分子。

【請求項12】

該核酸分子は、５'から３'へ：該第一のＩＴＲ、該遺伝子カセット、及び該第二のＩＴＲを含み；該遺伝子カセットは、組織特異的プロモーター配列、イントロン配列、該異種ポリヌクレオチド配列、転写後調節エレメント、及び３'ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項13】

該遺伝子カセットは、５'から３'へ：組織特異的プロモーター配列、イントロン配列、該異種ポリヌクレオチド配列、転写後調節エレメント、及び３'ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列を含む、請求項１２に記載の核酸分子。

【請求項14】

（ａ）該組織特異的プロモーター配列は、ＴＴＰプロモーターを含み；
（ｂ）該イントロンは、合成イントロンであり；
（ｃ）該転写後調節エレメントは、ＷＰＲＥを含み；及び
（ｄ）該３'ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列は、ｂＧＨｐＡを含む、
請求項１３に記載の核酸分子。

【請求項15】

該異種ポリヌクレオチド配列は、第Ｉ因子（ＦＩ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第ＩＩＩ因子（ＦＩＩＩ）、第ＩＶ因子（ＦＶＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第ＶＩ因子（ＦＶＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、フォン・ビルブランド因子（ＶＷＦ）、プレカリクレイン、高分子キニノーゲン、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２－抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子－１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子－２（ＰＡＩ２）、及び任意のその組合せからなる群より選択される凝固因子をコードする、
請求項１に記載の核酸分子。

【請求項16】

該凝固因子は、ＦＶＩＩＩである、請求項１５に記載の核酸分子。

【請求項17】

該異種ポリヌクレオチド配列は、全長成熟ＦＶＩＩＩをコードする、請求項１５又は１６に記載の核酸分子。

【請求項18】

該全長成熟ＦＶＩＩＩは、配列番号１０６のアミノ酸配列を含み、該ＦＶＩＩＩは、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、及び部分Ｂドメインを含むか、もしくはＢドメインは含まず、又は、該ＦＶＩＩＩは、配列番号１０９
のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の核酸分子。

【請求項19】

該凝固因子は、異種部分を含み、該異種部分は、アルブミンもしくはそのフラグメント、免疫グロブリンＦｃ領域、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはそのフラグメント、アルブミン結合部分、その誘導体、もしくは任意のその組合せからなる群より選択される；
該ＦＶＩＩＩは、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、任意のＢドメイン、及び異種部分をさらに含み、該異種部分は、成熟ＦＶＩＩＩ（配列番号１０６）に対応するアミノ酸７４５のすぐ下流側に挿入される；
該ＦＶＩＩＩは、ＦｃＲｎ結合パートナーをさらに含み、該ＦｃＲｎ結合パートナーは、免疫グロブリン定常ドメインのＦｃ領域を含む；
該ＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、コドン最適化されている；並びに／又は、
該ＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、ヒトにおける発現にコドン最適化されている、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項20】

該異種部分は、ＦＶＩＩＩのＮ末端もしくはＣ末端に連結されるか、もしくはＦＶＩＩＩ中の２つのアミノ酸の間に挿入される、請求項１９に記載の核酸分子。

【請求項21】

該ＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、配列番号１０７のヌクレオチド配列を含む；もしくは、該ＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、配列番号７１のヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の核酸分子。

【請求項22】

該核酸分子は、送達剤とともに製剤化され；
該核酸分子は、静脈内送達、経皮送達、皮内送達、皮下送達、経肺送達、もしくは経口送達用、又は任意のその組合せのために製剤化される、
請求項１に記載の核酸分子。

【請求項23】

該送達剤は、脂質ナノ粒子を含む、又は該送達剤は、リポソーム、非脂質ポリマー分子、及びエンドソーム、並びに任意のその組合せからなる群より選択される、請求項２２に記載の核酸分子。

【請求項24】

該核酸分子は、静脈内送達用に製剤化される、請求項２２または２３に記載の核酸分子。

【請求項25】

請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。

【請求項26】

請求項１に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。

【請求項27】

請求項１に記載の核酸分子、及び薬学的に許容しうる賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項28】

請求項２６に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容しうる賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項29】

請求項１に記載の核酸分子、及び該核酸分子をそれを必要とする対象に投与するための使用説明書を含む、キット。

【請求項30】

請求項１に記載の核酸分子であって、該核酸分子は、昆虫細胞において産生される、上記核酸分子。

【請求項31】

請求項１に記載の核酸分子を含む、ナノ粒子送達系。

【請求項32】

請求項２６に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養すること、及びポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチドを製造する方法であって、該ポリペプチドは、凝固活性を有するポリペプチドであり、該方法は、該凝固活性を有するポリペプチドを回収することを含む、上記方法。

【請求項33】

異種ポリヌクレオチド配列を、それを必要とする対象において発現させる方法に使用するための医薬組成物であって、請求項１に記載の核酸分子を含む、上記医薬組成物。

【請求項34】

凝固因子を、それを必要とする対象において発現させる方法に使用するための医薬組成物であって、請求項１５に記載の核酸分子を含む、上記医薬組成物。

【請求項35】

それを必要とする対象において疾患又は障害を処置する方法に使用するための医薬組成物であって、請求項１に記載の核酸分子を含む、上記医薬組成物。

【請求項36】

それを必要とする対象において凝固因子欠乏症を処置する方法に使用するための医薬組成物であって、請求項１５に記載の核酸分子を含む、上記医薬組成物。

【請求項37】

該核酸分子は、静脈内投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経肺投与、もしくは任意のその組合せで投与される；
該対象に第二の薬剤を投与することをさらに含む；
該対象は哺乳動物である；
該対象はヒトである；
該対象への該核酸分子の投与は、投与前の対象におけるＦＶＩＩＩ活性と比較して増加したＦＶＩＩＩ活性を生じ、該ＦＶＩＩＩ活性は、少なくとも２倍増加する；及び／又は、
該対象は出血障害を有する、
請求項３６に記載の医薬組成物。

【請求項38】

該核酸分子は静脈内投与される、請求項３７に記載の医薬組成物。

【請求項39】

該出血障害は血友病である、請求項３７に記載の医薬組成物。

【請求項40】

該出血障害は血友病Ａである、請求項３９に記載の医薬組成物。

【請求項41】

それを必要とする対象において血友病Ａを処置する方法に使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、凝固因子をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を含み、該第一のＩＴＲは、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列からなり、及び該第二のＩＴＲは、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列からなる；又は該第一のＩＴＲは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列からなり、及び該第二のＩＴＲは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列からなる、上記医薬組成物。

【請求項42】

それを必要とする対象において肝臓の代謝障害を処置する方法に使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、該対象において欠乏している肝臓関連代謝酵素をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を含み、該第一のＩＴＲは、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列からなり、及び該第二のＩＴＲは、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列からなる；又は該第一のＩＴＲは、配列番号１８３に示されるヌク
レオチド配列からなり、及び該第二のＩＴＲは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列からなる、上記医薬組成物。

【請求項43】

該遺伝子カセットは一本鎖核酸を含む；
該遺伝子カセットは二本鎖核酸を含む；
該肝臓の代謝障害は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、尿素サイクル異常症、リソソーム蓄積症、及び糖原病からなる群より選択される；
該核酸分子は、静脈内投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経肺投与、もしくは任意のその組合せで投与される；
第二の薬剤を該対象に投与することをさらに含む；
該対象は哺乳動物である；並びに／又は、
該対象はヒトである、
請求項４２に記載の医薬組成物。

【請求項44】

該肝臓の代謝障害は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である、請求項４３に記載の医薬組成物。

【請求項45】

該核酸分子は静脈内投与される、請求項４３又は４４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６２／７１６，８２６号（２０１８年８月９日出願）に対して優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に加入される。

【0002】

電子的に提出された配列表の参照
ＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出された配列表（名称： ＳＡ９－４６５ＰＣ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：４６０，６４８バイト；及び作成日：２０１９年８月８日）の内容は、その全体として参照により本明細書に加入される。

【背景技術】

【0003】

開示の背景
遺伝子治療は、様々な疾患を処置する持続的な手段の可能性を提供する。過去において、多くの遺伝子治療処置は、典型的にはウイルスの使用に頼ってきた。この目的のために選択され得る多くのウイルス性薬剤があり、それぞれ程度の差はあるが遺伝子治療に適した個別の特性を有する。非特許文献１。しかし、それらの免疫原性プロフィール又はそれらの癌を引き起こす傾向を含むいくつかのウイルスベクターの望ましくない特性は、臨床上の安全性の懸念を生じ、そして最近まで、それらの臨床上の使用は特定の適用、例えばワクチン及び腫瘍溶解ストラテジーに限られてきた。非特許文献２。

【0004】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、最も広く研究されている遺伝子治療ベクターのうちの１つである。ＡＡＶは、およそ４．８キロベース（ｋｂ）の小さな一本鎖ＤＮＡゲノムを取り囲んで保護するタンパク質シェルである。非特許文献３。ＡＡＶはパルボウイルスファミリーに属し、そして複製するために他のウイルス、主にアデノウイルスとの同時感染に依存している。同上。その一本鎖ゲノムは３つの遺伝子を含有する、Ｒｅｐ（複製）、Ｃａｐ（カプシド）、及びａａｐ（会合）。同上。これらのコード配列は、ゲノム複製及びパッケージングに必要な末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接している。同上。２つのシス作用性ＡＡＶ ＩＴＲは、およそ１４５ヌクレオチド長であり、ＤＮＡ複製の開始の間プライマーとして機能するＴ字形ヘアピン構造へと折りたたむことができる回分構造配列で中断されている。

【0005】

しかし、従来のＡＡＶの遺伝子送達ベクターとしての使用は特定の欠点を有する。主な欠点のうちの１つは、異種ＤＮＡ約４．５ｋｂというＡＡＶの限られたウイルスパッケージング能力に付随するものである。（非特許文献４）。さらに、ＡＡＶベクターの投与はヒトにおいて免疫応答を誘発し得る。ＡＡＶはいくつかの他のウイルス（すなわち、アデノウイルス）より低い免疫原性であることが示されてきたが、カプシドタンパク質は、ヒト免疫系の様々な構成要素を惹起し得る。Ｎａｓｏら、２０１７年を参照のこと。ＡＡＶはヒト集団において一般的なウイルスであり、そして大部分の人々はＡＡＶに曝露されたことがあり、したがって大部分の人々は、彼らが以前に曝露したことがある特定のバリアントに対してすでに免疫応答を発生したことがある。既存の適応応答は、中和抗体（ＮＡｂ）及びＴ細胞を含み得、これらはＡＡＶのその後の再感染の臨床有効性及び／又は形質導入された細胞の除去を減少させ得、このことは、ＡＶＶベースの遺伝子治療処置に対して既存の抗ＡＡＶ免疫を有する患者を不適格にし得る。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲのＴ字形ヘアピンループが、ＡＡＶ ＩＴＲのＴ字形ヘアピン構造に結合する宿主細胞タンパク質／タンパク質複合体による阻害を受けやすいということが証拠により示唆される。例えば、非特許文献５。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．１０６（Ｐｔ Ａ）：３－２６、２０１６

【文献】Ｃｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ． １０：１０９８－１０５ （２００５）

【文献】Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、３１（４）： ３１７－３３４、２０１７

【文献】Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７（１７）： ２１０１－１２、１９９６

【文献】Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：５４３２ （２０１７年７月１４日）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、既存のＡＡＶベクター技術の意図しない結果及び制限のうちのいくつかを回避しながら、インビトロ及びインビボの状況で、標的配列、例えば治療用タンパク質及び／又はｍｉＲＮＡを効率的かつ持続的に発現させるという必要性が当該分野に存在する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

開示の要旨
特定の態様において、異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子が提供され、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７もしくは１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【0009】

特定の例となる実施形態において、第一のＩＴＲは配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列を含み、そして第二のＩＴＲは配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列を含む。特定の例となる実施形態において、第一のＩＴＲは配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列を含み、そして第二のＩＴＲは配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列を含む。特定の例となる実施形態において、第一のＩＴＲは配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列を含み、そして第二のＩＴＲは配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含む。特定の例となる実施形態において、第一のＩＴＲは配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含み、そして第二のＩＴＲは配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0010】

特定の例となる実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７又は１８８に示されるヌクレオチド配列からなる。特定の例となる実施形態において、第一のＩＴＲ及び第二のＩＴＲは互いの逆相補鎖である。

【0011】

特定の例となる実施形態において、核酸分子はプロモーターをさらに含む。特定の例となる実施形態において、プロモーターは組織特異的プロモーターである。特定の例となる実施形態において、プロモーターは、筋肉、中枢神経系（ＣＮＳ）、眼球、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、肺、皮膚、膀胱、尿路、又は任意のその組合せから選択される臓器における異種ポリヌクレオチド配列の発現を推進する。特定の例となる実施形態において、プロモーターは、肝細胞、内皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、類洞細胞、求心性神経、遠心性神経、介在ニューロン、グリア細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、小膠細胞、上衣細胞、肺上皮細胞、シュワン細胞、サテライト細胞、光受容細胞、網膜神経節細胞、又は任意のその組合せにおける異種ポリヌクレオチド配列の発現を推進する。特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列の５’側に位置する。特定の例となる実施形態において、プロモーターは、マウスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミンミニマルプロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）、ミオグロビン（ＭＢ）、デスミン（ＤＥＳ）、ＳＰｃ５－１２、２Ｒ５Ｓｃ５－１２、ｄＭＣＫ、ｔＭＣＫ、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターからなる群より選択される。

【0012】

特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列はイントロン配列をさらに含む。特定の例となる実施形態において、イントロン配列は異種ポリヌクレオチド配列に対して５’側に位置する。特定の例となる実施形態において、イントロン配列はプロモーターに対して３’側に位置する。特定の例となる実施形態において、イントロン配列は合成イントロン配列を含む。特定の例となる実施形態において、イントロン配列は配列番号１１５又は１９２を含む。

【0013】

特定の例となる実施形態において、遺伝子カセットは転写後調節エレメントをさらに含む。特定の例となる実施形態において、転写後調節エレメントは異種ポリヌクレオチド配列に対して３’側に位置する。特定の例となる実施形態において、転写後調節エレメントは、変異ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、マイクロＲＮＡ結合部位、ＤＮＡ核標的化配列、又は任意のその組合せを含む。特定の例となる実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位はｍｉＲ１４２－３ｐに対する結合部位を含む。

【0014】

特定の例となる実施形態において、遺伝子カセットは３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列をさらに含む。特定の例となる実施形態において、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列は、ｂＧＨポリ（Ａ）、アクチンポリ（Ａ）、ヘモグロビンポリ（Ａ）、及び任意のその組合せからなる群より選択される。特定の例となる実施形態において、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列はｂＧＨポリ（Ａ）を含む。

【0015】

特定の例となる実施形態において、遺伝子カセットはエンハンサー配列をさらに含む。特定の例となる実施形態において、エンハンサー配列は第一のＩＴＲと第二のＩＴＲとの間に位置する。

【0016】

特定の例となる実施形態において、核酸分子は、５’から３’へ：第一のＩＴＲ、遺伝子カセット、及び第二のＩＴＲを含み；ここで遺伝子カセットは、組織特異的プロモーター配列、イントロン配列、異種ポリヌクレオチド配列、転写後調節エレメント、及び３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列を含む。特定の例となる実施形態において、遺伝子カセットは、５’から３’へ：組織特異的プロモーター配列、イントロン配列、異種ポリヌクレオチド配列、転写後調節エレメント、及び３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列を含む。特定の例となる実施形態において、組織特異的プロモーター配列はＴＴＴプロモーターを含み；イントロンは合成イントロンであり；転写後調節エレメントはＷＰＲＥを含み、そして３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列はｂＧＨｐＡを含む。

【0017】

特定の例となる実施形態において、遺伝子カセットは一本鎖核酸を含む。 特定の例となる実施形態において、遺伝子カセットは二本鎖核酸を含む。

【0018】

特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列は、凝固因子、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、そのフラグメント、又はそれらの組み合わせを含む。

【0019】

特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列は、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７）、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバー（例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６））、コロニー刺激因子（例えば、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エフリン（例えば、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３）、ウシ胎児ソマトトロピン（ＦＢＳ）、ＧＤＮＦファミリーメンバー（例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン）、増殖分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝癌細胞由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（例えば、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）又はＩＧＦ－２、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ又は肝細胞増殖因子様タンパク質（ＨＧＦＬＰ））、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン（例えば、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧ４）、ニューロトロフィン（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ＮＴ－４、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換増殖因子（例えば、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ－α）、ＴＧＦ－β、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、並びに任意のその組合せからなる群より選択される増殖因子をコードする。

【0020】

特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列はホルモンをコードする。

【0021】

特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列はサイトカインをコードする。

【0022】

特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列は抗体又はそのフラグメントをコードする。

【0023】

特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列は、Ｘ連鎖ジストロフィン、ＭＴＭ１（ミオチューブラリン）、チロシン水酸化酵素、ＡＡＤＣ、シクロヒドロラーゼ、ＳＭＮ１、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＳ１、ＣＦＨ、ＨＴＲＡ、ＡＲＭＳ、ＣＦＢ／ＣＣ２、ＣＮＧＡ／ＣＮＧＢ、Ｐｒｆ６５、ＡＲＳＡ、ＰＳＡＰ、ＩＤＵＡ（ＭＰＳ Ｉ）、ＩＤＳ（ＭＰＳ ＩＩ）、ＰＡＨ、ＧＡＡ（酸性アルファグルコシダーゼ）、及び任意のその組合せから選択される遺伝子をコードする。

【0024】

特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする。特定の例となる実施形態において、ｍｉＲＮＡはＳＯＤ１、ＨＴＴ、ＲＨＯ、及び任意のその組合せから選択される標的遺伝子の発現を下方調節する。

【0025】

特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列は、第Ｉ因子（ＦＩ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第ＩＩＩ因子（ＦＩＩＩ）、第ＩＶ因子（ＦＶＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第ＶＩ因子（ＦＶＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、フォン・ビルブランド因子（ＶＷＦ）、プレカリクレイン、高分子キニノーゲン、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２－抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子－１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子－２（ＰＡＩ２）、及び任意のその組合せからなる群より選択される凝固因子をコードする。

【0026】

特定の例となる実施形態において、凝固因子はＦＶＩＩＩである。特定の例となる実施形態において、ＦＶＩＩＩは全長成熟ＦＶＩＩＩである。特定の例となる実施形態において、ＦＶＩＩＩは、配列番号１０６を有するアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0027】

特定の例となる実施形態において、ＦＶＩＩＩは、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、及び部分Ｂドメインを含むか、又はＢドメインは含まない。特定の例となる実施形態において、ＦＶＩＩＩは、配列番号１０９のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0028】

特定の例となる実施形態において、凝固因子は異種部分を含む。特定の例となる実施形態において、異種部分は、アルブミンもしくはそのフラグメント、免疫グロブリンＦｃ領域、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはそのフラグメント、アルブミン結合部分、その誘導体、又は任意のその組合せからなる群より選択される。特定の例となる実施形態において、異種部分は、ＦＶＩＩＩのＮ末端もしくはＣ末端に連結されるか、又はＦＶＩＩＩ中の２つのアミノ酸の間に挿入される。特定の例となる実施形態において、異種部分は、表４に列挙される挿入部位から選択される１つ又はそれ以上の挿入部位において２つのアミノ酸の間に挿入される。

【0029】

特定の例となる実施形態において、ＦＶＩＩＩは、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、任意のＢドメイン、及び異種部分をさらに含み、ここで異種部分は成熟ＦＶＩＩＩ（配列番号１０６）に対応するアミノ酸７４５のすぐ下流側に挿入される。

【0030】

特定の例となる実施形態において、ＦＶＩＩＩはＦｃＲｎ結合パートナーを更に含む。特定の例となる実施形態において、ＦｃＲｎ結合パートナーは免疫グロブリン定常ドメインのＦｃ領域を含む。

【0031】

特定の例となる実施形態において、ＦＶＩＩＩをコードする核酸配列はコドン最適化されている。特定の例となる実施形態において、ＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、ヒトにおける発現にコドン最適化されている。

【0032】

特定の例となる実施形態において、ＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、配列番号１０７のヌクレオチド配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0033】

特定の例となる実施形態において、ＦＶＩＩＩをコードする核酸配列は、配列番号７１のヌクレオチド配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0034】

特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列はコドン最適化されている。特定の例となる実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列はヒトにおける発現にコドン最適化されている。

【0035】

特定の例となる実施形態において、核酸分子は送達剤とともに製剤化される。特定の例となる実施形態において、送達剤は脂質ナノ粒子を含む。特定の例となる実施形態において、送達剤は、リポソーム、非脂質ポリマー分子、及びエンドソーム、並びに任意のその組合せからなる群より選択される。

【0036】

特定の例となる実施形態において、核酸分子は、静脈内送達、経皮送達、皮内送達、皮下送達、経肺送達、もしくは経口送達用、又は任意のその組合せのために製剤化される。特定の例となる実施形態において、核酸分子は静脈内送達用に製剤化される。

【0037】

特定の態様において、本明細書に記載されるような核酸分子を含むベクターが提供される。

【0038】

特定の態様において、本明細書に記載されるような核酸分子を含む宿主細胞が提供される。

【0039】

特定の態様において、本明細書に記載されるような核酸分子又はベクター、及び薬学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物が提供される。

【0040】

特定の態様において、本明細書に記載されるような宿主細胞、及び薬学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物が提供される。

【0041】

特定の態様において、本明細書に記載されるような核酸分子及び該核酸分子をそれを必要とする対象に投与するための指示書を含むキットが提供される。

【0042】

特定の態様において、本明細書に記載されるような核酸分子の製造のためのバキュロウイルス系が提供される。

【0043】

特定の例となる実施形態において、本明細書に記載されるような核酸分子は昆虫細胞において産生される。

【0044】

特定の態様において、本明細書に記載されるような核酸分子を含むナノ粒子送達系が提供される。

【0045】

特定の態様において、本明細書に記載されるような宿主細胞を適切な条件下で培養すること、及びポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチドを製造する方法が提供される。

【0046】

特定の態様において、本明細書に記載されるような宿主細胞を適切な条件下で培養すること、及び凝固活性を有するポリペプチドを回収することを含む、凝固活性を有するポリペプチドを製造する方法が提供される。

【0047】

特定の態様において、異種ポリヌクレオチド配列をそれを必要とする対象において発現させる方法が提供され、該方法は本明細書に記載されるような核酸分子、本明細書に記載されるベクター、又は本明細書に記載される医薬組成物を該対象に投与することを含む。

【0048】

特定の態様において、それを必要とする対象において凝固因子を発現させる方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されるような核酸分子、本明細書に記載されるベクター、本明細書に記載されるポリペプチド、又は本明細書に記載される医薬組成物を該対象に投与することを含む。

【0049】

特定の態様において、それを必要とする対象において疾患又は障害を処置する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されるような核酸分子、本明細書に記載されるベクター、又は本明細書に記載される医薬組成物を該対象に投与することを含む。

【0050】

特定の態様において、凝固因子欠乏症を有する対象を処置する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されるような核酸分子、本明細書に記載されるベクター、本明細書に記載されるポリペプチド、又は本明細書に記載される医薬組成物を該対象に投与することを含む。

【0051】

特定の態様において、それを必要とする対象において凝固因子欠乏症を処置する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されるような核酸分子、本明細書に記載されるベクター、本明細書に記載されるポリペプチド、又は本明細書に記載される医薬組成物を該対象に投与することを含む。

【0052】

特定の例となる実施形態において、核酸分子は、静脈内投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経肺投与、又は任意のその組合せで投与される。特定の例となる実施形態において、核酸分子は静脈内投与される。

【0053】

特定の例となる実施形態において、上記方法は第二の薬剤を対象に投与することをさらに含む。

【0054】

特定の例となる実施形態において、対象は哺乳動物である。特定の例となる実施形態において、対象はヒトである。

【0055】

特定の例となる実施形態において、対象への核酸分子の投与は、投与前の対象におけるＦＶＩＩＩ活性と比較して増加したＦＶＩＩＩ活性を生じ、ここでＦＶＩＩＩ活性は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、又は少なくとも約１００倍増加する。

【0056】

特定の例となる実施形態において、対象は出血障害を有する。特定の例となる実施形態において、出血障害は血友病である。特定の例となる実施形態において、出血障害は血友病Ａである。

【0057】

特定の態様において、それを必要とする対象において出血障害を処置する方法が提供され、該方法は、凝固因子をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を該対象に投与することを含み、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７もしくは１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はそれらの機能性誘導体を含む。

【0058】

特定の態様において、それを必要とする対象において血友病Ａを処置する方法が提供され、該方法は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を該対象に投与することを含み、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７もしくは１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【0059】

特定の態様において、それを必要とする対象において肝臓の代謝障害を処置する方法が提供され、該方法は、該対象において欠乏している肝臓関連代謝酵素をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を該対象に投与することを含み、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは非アデノ随伴ウイルス（非ＡＡＶ）のＩＴＲである。

【0060】

特定の例となる実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７もしくは１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【0061】

特定の態様において、それを必要とする対象において肝臓の代謝障害を処置する方法が提供され、該方法は、該対象において欠乏している肝臓関連代謝酵素をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を該対象に投与することを含み、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７もしくは１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【0062】

特定の例となる実施形態において、遺伝子カセットは一本鎖核酸を含む。特定の例となる実施形態において、遺伝子カセットは二本鎖核酸を含む。

【0063】

特定の例となる実施形態において、肝臓の代謝障害は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、尿素サイクル異常症、リソソーム蓄積症、及び糖原病からなる群より選択される。特定の例となる実施形態において、肝臓の代謝障害はフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である。

【0064】

特定の例となる実施形態において、核酸分子は、静脈内投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経肺投与、又は任意のその組合せで投与される。特定の例となる実施形態において、核酸分子は静脈内投与される。

【0065】

特定の例となる実施形態において、上記方法は第二の薬剤を対象に投与することをさらに含む。

【0066】

特定の例となる実施形態において、対象は哺乳動物である。特定の例となる実施形態において、対象はヒトである。

【0067】

特定の態様において、それを必要とする対象においてフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置する方法が提供され、該方法は、フェニルアラニン水酸化酵素をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を該対象に投与することを含み、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７もしくは１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【0068】

特定の例となる実施形態において、遺伝子カセットは一本鎖核酸を含む。特定の例となる実施形態において、遺伝子カセットは二本鎖核酸を含む。

【0069】

特定の例となる実施形態において、核酸分子は送達剤とともに製剤化される。特定の例となる実施形態において、送達剤は脂質ナノ粒子を含む。

【0070】

特定の態様において、複雑な二次構造をとることができる核酸分子を適切なベクターに挿入すること、及び得られたベクターを、ＳｂｃＣＤ複合体における破壊を含む細菌宿主株に導入することを含む、核酸分子をクローン化する方法が提供される。

【0071】

特定の例となる実施形態において、ＳｂｃＣＤ複合体における破壊は、ＳｂｃＣ遺伝子及び／又はＳｂｃＤ遺伝子における遺伝子破壊を含む。特定の例となる実施形態において、ＳｂｃＣＤ複合体における破壊は、ＳｂｃＣ遺伝子における遺伝子破壊を含む。特定の例となる実施形態において、ＳｂｃＣＤ複合体における破壊はＳｂｃＤ遺伝子における遺伝子破壊を含む。

【0072】

特定の例となる実施形態において、核酸分子は第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含み、ここで第一及び／又は第二のＩＴＲは非アデノ随伴ウイルス（非ＡＡＶ）ＩＴＲである。

【0073】

特定の例となる実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７もしくは１８８と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【0074】

特定の例となる実施形態において、核酸分子は遺伝子カセットをさらに含み、該遺伝子カセットは第一のＩＴＲを及び第二のＩＴＲに隣接している。

【0075】

特定の例となる実施形態において、遺伝子カセットは異種ポリヌクレオチド配列を含む。

【0076】

特定の例となる実施形態において、適切なベクターは低コピーベクターである。特定の例となる実施形態において、適切なベクターはｐＢＲ３２２である。

【0077】

特定の例となる実施形態において、細菌宿主株は十字型ＤＮＡ構造を分解することができない。

【0078】

特定の例となる実施形態において、細菌宿主株は、遺伝子型ｓｂｃＣ、ｒｅｃＤ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦを含むＰＭＣ１０３である。特定の例となる実施形態において、細菌宿主株は、遺伝子型ｒｅｃＢＣ、ｒｅｃＪ、ｓｂｃＢＣ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦを含むＰＭＣ１０７である。特定の例となる実施形態において、細菌宿主株は、遺伝子型ｒｅｃＢ、ｒｅｃＪ、ｓｂｃＣ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦ、ｕｍｕＣ、ｕｖｒＣを含むＳＵＲＥである。

【0079】

特定の態様において、核酸分子をクローン化する方法が提供され、該方法は、複雑な二次構造をとることができる核酸分子を適切なベクターに挿入すること、及びＳｂｃＣＤ複合体において破壊を含む細菌宿主株に得られたベクターを導入することを含み、ここで核酸分子は第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含み、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７もしくは１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【図面の簡単な説明】

【0080】

【図1-1】図１Ａ～１Ｂは、一本鎖凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）発現カセットの略図である。非ＡＡＶ由来の５’ＩＴＲ（ｓｓＤＮＡ構造の末端にヘアピンループを有する）、非ＡＡＶ由来の３’ＩＴＲ（ヘアピンループを有する）、プロモーター配列（例えば、ＴＴＰｐ又はＣＡＧｐ）、及び導入遺伝子配列、例えば、Ｂドメイン内にＸＴＥＮ１４４を挿入されたＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ配列の位置が示される。例となる発現カセットはまた、さらなる可能なエレメント、例えば、イントロン配列、ＷＰＲＥｍｕｔ配列、及びｂＧＨｐＡ配列も示す。

【図1-2】図１Ｃ～１Ｆは、図１Ａ～１Ｂに示されるカセットのような一本鎖凝固因子発現カセットを製造するために使用されるプラスミドの略図であり、ここでカセットのＩＴＲは、ＡＡＶ２（図１Ｃ）、Ｂ１９（図１Ｄ）、ＧＰＶ（図１Ｅ）から誘導されるか、又は野生型Ｂ１９ ＩＴＲ配列（図１Ｆ）である。ここで示されるようなｓｓＦＶＩＩＩ発現カセットを含むプラスミド構築物を、ＰｖｕＩＩ（ＰｖｕＩＩ部位において）（図１Ｃ）又はＬｇｕＩ（ＬｇｕＩ部位において）（図１Ｄ～１Ｆ）を用いて消化し、ＩＴＲ及び発現カセットを含む配列を正確に放出させた。二本鎖ＤＮＡを９５℃で熱変性してｓｓＤＮＡを生じ、次いで４℃でインキュベートしてＩＴＲ構造形成させた。

【図1-3】図１－２の続き。

【図1-4】図１－３の続き。

【図2A】図２Ａは、様々なパルボウイルスファミリーメンバー間の関係を説明する系統樹である。Ｂ１９、ＡＡＶ－２、及びＧＰＶに四角の枠を付けて示す。

【図2B】図２Ｂは、ヘアピン構造を含む様々なカセットの概要図である。

【図3A】図３Ａ及び３Ｂは、Ｂ１９、ＧＰＶ、及びＡＡＶ２（図３Ａ）並びにＢ１９及びＧＰＶ（図３Ｂ）のＩＴＲのアライメントである。灰色のシェーディングは相同性を示す。

【図3B】図３Ａ及び３Ｂは、Ｂ１９、ＧＰＶ、及びＡＡＶ２（図３Ａ）並びにＢ１９及びＧＰＶ（図３Ｂ）のＩＴＲのアライメントである。灰色のシェーディングは相同性を示す。

【図4】図４Ａ～４Ｃは、Ｈｅｍ Ａマウスにおけるハイドロダイナミック注入（ＨＤＩ）による一本鎖ＦＶＩＩＩ－ＡＡＶネイキッドＤＮＡ（ｓｓＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ；図１Ｃ）、ｓｓＤＮＡ－Ｂ１９ ＦＶＩＩＩ（図１Ｄ）、又はｓｓＤＮＡ－ＧＰＶ ＦＶＩＩＩ（図１Ｅ）投与後のＦＶＩＩＩ血漿活性を示す。５０μｇ／マウス（図４Ｃ）、２０μｇ／マウス（図４Ａ及び４Ｂ）、１０μｇ／マウス（図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃ）、又は５μｇ／マウス（図４Ａ）でのｓｓＤＮＡの単回ＨＤＩを用いて処置されたマウスにおけるＦＶＩＩＩ活性を、血漿サンプルにおいて２４時間、３日、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、及び６か月目に（ヒトにおける正常生理的レベルのパーセンテージとして）測定した。プラスミドＤＮＡ ５μｇ／マウスのＨＤＩを対照として投与した（図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃ）。

【図5】図５は、等モル量の一本鎖ネイキッドＤＮＡ（ｓｓＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ、図１Ａ）、ＩＴＲ配列を含有する二本鎖ＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、ＩＴＲを含まない二本鎖ＦＶＩＩＩ ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ Ｎｏ ＩＴＲ）、又はＩＴＲも細菌配列も含まない環状二本鎖ＦＶＩＩＩ ＤＮＡ（ミニサークル）の単回ハイドロダイナミック注入後の血友病Ａマウス血漿におけるＦＶＩＩＩ活性を示す。ＡＡＶ－ＦＶＩＩＩプラスミド（図２Ｃ）のＰｖｕＩＩを用いた酵素的切断によりｄｓＤＮＡを生成したが熱変性は行わなかった。ｄｓＤＮＡ Ｎｏ ＩＴＲを、ＡＡＶ－ＦＶＩＩＩプラスミド（図２Ｃ）のＡｆｌＩＩを用いた酵素的切断により生成し、続いて精製した。ミニサークルＤＮＡを、ｄｓＤＮＡ Ｎｏ ＩＴＲ ＤＮＡのＡｆｌＩＩ部位のライゲーションにより生成した。マウス血漿を３か月又は４か月にわたって集め、そしてＦＶＩＩＩを発色活性アッセイにより決定した。

【図6】図６は、一本鎖ネイキッドＦＶＩＩＩ－ＤＮＡ（図１Ａ、図１Ｄ～１Ｆ）３０μｇのハイドロダイナミック注入後の血友病Ａマウス血漿におけるＦＶＩＩＩ活性を示す。血漿を７週間毎週集め、そしてＦＶＩＩＩ活性を発色アッセイにより決定した。３５日後に（黒矢印として示される）、ＦＶＩＩＩ－Ｂ１９ｄ１３５及びＦＶＩＩＩ－ＧＰＶｄ１６２ ｓｓＤＮＡを投与されたマウスに、３０μｇをハイドロダイナミック注入により再投与した。

【図7-1】図７Ａは、一本鎖マウスフェニルアラニン水酸化酵素（例えば、ＰＡＨ）発現カセットの略図である。非ＡＡＶ由来５’ＩＴＲ（ｓｓＤＮＡ構造の末端にヘアピンループを有する）、非ＡＡＶ由来３’ＩＴＲ（ヘアピンループを有する）、プロモーター配列（例えば、ＣＡＧｐ）、及び導入遺伝子配列、例えば、３ｘＦＬＡＧ＿ｍＰＡＨ配列の位置を示す。例となる発現カセットはまた、さらなる可能なエレメント、例えば、ＷＰＲＥｍｕｔ配列、及びｂＧＨｐＡ配列も示す。図７Ｂ～７Ｄは、マウスＰＡＨ ｃＤＮＡ及び非ＡＡＶ ＩＴＲ Ｂ１９ｄ１３５又はＧＰＶｄ１６２を含有する一本鎖ＤＮＡのハイドロダイナミック注入による単回投与の前（０日）及び投与後の、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）マウスにおけるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の血漿濃度を示す。血漿を、ｓｓＤＮＡ投与の３、７、１４、２８、４２、及び５６日後に集めた。残留フェニルアラニンレベルを、μｇ／ｍｌ（図７Ｂ～７Ｃ）で濃度として又は投与前のパーセントとして示す（図７Ｄ）。水平の線は投与前のベースラインＰｈｅレベルを示す。図７Ｅは、マウスＰＡＨ導入遺伝子及びＢ１９ｄ１３５又はＧＰＶｄ１６５ ＩＴＲのいずれかを含有するｓｓＤＮＡを用いて処置したＰＫＵマウスからの肝臓溶解物のウェスタン免疫ブロットを示す。処置後８１日めに肝臓を集め、そしてタンパク質溶解物を抽出した。各ウェルは単一の動物を表す。ＦＬＡＧ－タグ化マウスＰＡＨタンパク質を、Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出し、そしてＧＡＰＤＨローディングコントロールを比較のために含めた。

【図7-2】図７－１の続き。

【図8】図８Ａ～Ｂは、ＦＶＩＩＩ－ＡＡＶ ＤＮＡ（図１Ａ～１Ｃ）を被包した脂質ナノ粒子を用いて形質導入した後のＨｕｈ７細胞上清におけるＦＶＩＩＩ活性レベルを示す。ＣＡＧｐプロモーター（図１Ｂ）下のプラスミドＦＶＩＩＩ－ＡＡＶを、３つのアミン対ホスフェート（ＮＰ）比で被包し、そしてｐｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイにより決定した様々な濃度で（図８Ａ）Ｈｕｈ７細胞に適用した。ＴＴＰｐプロモーター下のプラスミド、二本鎖線状（ｄｓ）、及び一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ（図１Ａ）もまた、２つのＮＰ比で脂質ナノ粒子に被包し、そしてＨｕｈ７細胞に形質導入するために様々なＤＮＡ濃度で使用した（図８Ｂ）。ＦＶＩＩＩを、ヒトＦＡＣＴ血漿標準と比較して発色活性アッセイにより測定した。

【発明を実施するための形態】

【0081】

開示の詳細な説明
本開示は、第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）、第二のＩＴＲ、及び例えば、標的配列（本明細書で異種ポリヌクレオチド配列とも呼ばれる）、例えば、治療用タンパク質又はｍｉＲＮＡをコードする遺伝子カセットを含むプラスミド様核酸分子を記載し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、非アデノ随伴ウイルスのＩＴＲである（例えば、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは非ＡＡＶ由来である）。一部の実施形態において、遺伝子カセットは治療用タンパク質をコードし、例えば、標的配列は治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態において、治療用タンパク質は、凝固因子、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、そのフラグメント、又はそれらの組み合わせから選択されるタンパク質を含む。一部の実施形態において、遺伝子カセットは、Ｘ連鎖ジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ）、ＭＴＭ１（ミオチューブラリン）、チロシン水酸化酵素、ＡＡＤＣ、シクロヒドロラーゼ、ＳＭＮ１、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＳ１、ＣＦＨ、ＨＴＲＡ、ＡＲＭＳ、ＣＦＢ／ＣＣ２、ＣＮＧＡ／ＣＮＧＢ、Ｐｒｆ６５、ＡＲＳＡ、ＰＳＡＰ、ＩＤＵＡ （ＭＰＳ Ｉ）、ＩＤＳ （ＭＰＳ ＩＩ）、ＰＡＨ、ＧＡＡ（酸性アルファグルコシダーゼ）、又は任意のその組合せをコードする。

【0082】

一部の実施形態において、治療用タンパク質は凝固因子を含む。１つのある特定の実施形態において、治療用タンパク質はＦＶＩＩＩ又はＦＩＸタンパク質を含む。

【0083】

一部の実施形態において、遺伝子カセットはｍｉＲＮＡをコードする。ある特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ＳＯＤ１、ＨＴＴ、ＲＨＯ、又は任意のその組合せから選択される標的遺伝子の発現を下方調節する。

【0084】

ある特定の実施形態において、非ＡＡＶは、ウイルスファミリーパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバー及び任意のその組合せからなる群より選択される。本開示はさらに、それを必要とする対象において治療用タンパク質、例えば、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩを発現させる方法に関し、該方法は、第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）、第二のＩＴＲ、及び例えば、治療用タンパク質又はｍｉＲＮＡをコードする遺伝子カセットを含む核酸分子を該対象に投与することを含み、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは非アデノ随伴ウイルス（非ＡＡＶ）のＩＴＲでる。ある特定の実施形態において、本開示は、配列番号１１３及び１２０から選択されるヌクレオチド配列に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を記載する。

【0085】

ある特定の実施形態において、本開示は、異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を提供し、ここで第一及び／又は第二のＩＴＲはパルボウイルスＢ１９又はガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）に由来する。

【0086】

本開示の例となる構築物を、添付の図面及び配列表において説明する。明細書及び特許請求の明確な理解を提供するために、以下の定義を以下に示す。

【0087】

Ｉ． 定義
用語「ａ」又は「ａｎ」実体は、その実体の１つ又はそれ以上を指すということに留意すべきであり：例えば、「ヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つ又はそれ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。同様に、「治療用タンパク質（ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）」及び「ａ ｍｉＲＮＡ」は、１つ又はそれ以上の治療用タンパク質及び１つ又はそれ以上のｍｉＲＮＡをそれぞれ表すと理解されるべきである。このように、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ又はそれ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において交換可能に使用され得る。

【0088】

用語「約」は、本明細書において、近似的に、大体、およそ、又はほぼを意味するため使用される。用語「約」が数値範囲に併せて使用される場合、これは、示される数値範囲の上下に境界を拡大することによりその範囲を修飾する。一般に、用語「約」は、１０パーセントの分散だけ記述された値を上及び下に、上下に（より高く又はより低く）数値を修飾するために本明細書において使用される。

【0089】

また本明細書において使用される「及び／又は」は、関連付けられた列挙された項目の１つ又はそれ以上のいずれか及びすべての可能な組み合わせ、さらには選択的に解釈される場合（「又は」）は組み合わせがないことも指し、かつこれらを包含する。

【0090】

「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」は交換可能に使用され、そして一本鎖形態、又は二本鎖らせんのいずれかの、リボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）又はデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」、そのいずれかのリン酸エステルアナログ、例えばホスホリチオアート及びチオエステルのホスフェートエステルポリマー形態を指す。一本鎖核酸配列は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ及びＲＮＡ－ＲＮＡらせんが可能である。用語核酸分子、及び特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子は分子の一次構造及び二次構造のみを指し、そしていずれの特定の三次形態にも限定しない。したがって、この用語は、とりわけ、線状又は環状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミド、スーパーコイルＤＮＡ及び染色体において見いだされる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する際に、配列は本明細書においてＤＮＡの非転写鎖に沿って５’から３’の方向の配列（すなわち、ｍＲＮＡに対して相同な配列を有する鎖）のみを与える通常の慣例に従って本明細書において記載され得る。「組み換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡとしては、限定されないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び半合成ＤＮＡが挙げられる。本開示の「核酸組成物」は、本明細書に記載される１つ又はそれ以上の核酸を含む。

【0091】

本明細書で使用されるように、「末端逆位配列」（又は「ＩＴＲ」）は、下流側にその逆相補鎖が続く一組のヌクレオチド（初期配列）、すなわち回分配列を含む、一本鎖核酸配列の５’又は３’末端のいずれかに位置する核酸配列を指す。初期配列と逆相補鎖との間のヌクレオチドの介在配列は、０を含めていずれの長さでもよい。一実施形態において、本開示に有用なＩＴＲは、１つ又はそれ以上の「回分配列」を含む。ＩＴＲは任意の数の機能を有し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＴＲはヘアピン構造を形成する。一部の実施形態において、ＩＴＲはＴ字形ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態において、ＩＴＲは非Ｔ字形ヘアピン構造、例えば、Ｕ字形ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態において、ＩＴＲは細胞の核において核酸分子の長期存続を増進する。一部の実施形態において、ＩＴＲは細胞の核において核酸分子の永続的な存続を増進する（例えば、細胞の寿命全体の間）。一部の実施形態において、ＩＴＲは細胞の核における核酸分子の安全性を増進する。一部の実施形態において、ＩＴＲは細胞の核における核酸分子の保持を増進する。一部の実施形態において、ＩＴＲは細胞の核における核酸分子の持続性を増進する。一部の実施形態において、ＩＴＲは細胞の核における核酸分子の分解を阻害するか又は防止する。

【0092】

一実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２－６００ヌクレオチド、約２～５５０ヌクレオチド、約２～５００ヌクレオチド、約２～４５０ヌクレオチド、約２～４００ヌクレオチド、約２～３５０ヌクレオチド、約２～３００ヌクレオチド、又は約２～２５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約５～６００ヌクレオチド、約１０～６００ヌクレオチド、約１５～６００ヌクレオチド、約２０～６００ヌクレオチド、約２５～６００ヌクレオチド、約３０～６００ヌクレオチド、約３５～６００ヌクレオチド、約４０～６００ヌクレオチド、約４５～６００ヌクレオチド、約５０～６００ヌクレオチド、約６０～６００ヌクレオチド、約７０～６００ヌクレオチド、約８０～６００ヌクレオチド、約９０～６００ヌクレオチド、約１００～６００ヌクレオチド、約１５０～６００ヌクレオチド、約２００～６００ヌクレオチド、約３００～６００ヌクレオチド、約３５０～６００ヌクレオチド、約４００～６００ヌクレオチド、約４５０～６００ヌクレオチド、約５００～６００ヌクレオチド、又は約５５０～６００ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約５～５５０ヌクレオチド、約５～５００ヌクレオチド、約５～４５０ヌクレオチド、約５～４００ヌクレオチド、約５～３５０ヌクレオチド、約５～３００ヌクレオチド、又は約５～２５０ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約１０～５５０ヌクレオチド、約１５～５００ヌクレオチド、約２０～４５０ヌクレオチド、約２５～４００ヌクレオチド、約３０～３５０ヌクレオチド、約３５～３００ヌクレオチド、又は約４０～２５０ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２２５ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約２７５ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３２５ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約３７５ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約４２５ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約４７５ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約５２５ヌクレオチド、約５５０ヌクレオチド、約５７５ヌクレオチド、又は約６００ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は約４００ヌクレオチドを含む。

【0093】

他の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２～２００ヌクレオチド、約５～２００ヌクレオチド、約１０～２００ヌクレオチド、約２０～２００ヌクレオチド、約３０～２００ヌクレオチド、約４０～２００ヌクレオチド、約５０～２００ヌクレオチド、約６０～２００ヌクレオチド、約７０～２００ヌクレオチド、約８０～２００ヌクレオチド、約９０～２００ヌクレオチド、約１００～２００ヌクレオチド、約１２５～２００ヌクレオチド、約１５０～２００ヌクレオチド、又は約１７５～２００ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２～１５０ヌクレオチド、約５～１５０ヌクレオチド、約１０～１５０ヌクレオチド、約２０～１５０ヌクレオチド、約３０～１５０ヌクレオチド、約４０～１５０ヌクレオチド、約５０～１５０ヌクレオチド、約７５～１５０ヌクレオチド、約１００～１５０ヌクレオチド、又は約１２５～１５０ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２～１００ヌクレオチド、約５～１００ヌクレオチド、約１０～１００ヌクレオチド、約２０～１００ヌクレオチド、約３０～１００ヌクレオチド、約４０～１００ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、又は約７５～１００ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、約２～５０ヌクレオチド、約１０～５０ヌクレオチド、約２０～５０ヌクレオチド、約３０～５０ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約３～３０ヌクレオチド、約４～２０ヌクレオチド、又は約５～１０ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、初期配列及び／又は逆相補鎖は、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、又は２０ヌクレオチドからなる。他の実施形態において、初期配列と逆相補鎖との間の介在ヌクレオチドは、０ヌクレオチド、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、又は２０ヌクレオチドである（例えばそれらからなる）。

【0094】

したがって、本明細書で使用されるように、「ＩＴＲ」は、それ自体で折り返して二本鎖セグメントを形成することができる。例えば、配列ＧＡＴＣＸＸＸＸＧＡＴＣは、折り返して二重らせんを形成する場合、ＧＡＴＣの初期配列及びその相補鎖（３’ＣＴＡＧ５’）を含む。一部の実施形態において、ＩＴＲは連続した回分配列（例えば、ＧＡＴＣＧＡＴＣ）を初期配列と逆相補鎖との間に含む。一部の実施形態において、ＩＴＲは、介在回分配列（例えば、ＧＡＴＣＸＸＸＸＧＡＴＣ）を初期配列と逆相補鎖とを含む。一部の実施形態において、連続した又は中断された回分配列の相補セクションは、互いに相互作用して「ヘアピンループ」構造を形成する。本明細書で使用されるように、「ヘアピンループ」構造は、一本鎖ヌクレオチド分子上の少なくも２つの相補配列が塩基対合して二本鎖セクションを形成する場合に生じる。一部の実施形態において、ＩＴＲの一部のみがヘアピンループを形成する。他の実施形態において、ＩＴＲ全体がヘアピンループを形成する。

【0095】

本開示において、少なくとも１つのＩＴＲは非アデノウイルス随伴ウイルス（非ＡＡＶ）のＩＴＲである。ある特定の実施形態において、ＩＴＲは、ウイルスファミリーパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の非ＡＡＶメンバーのＩＴＲである。一部の実施形態において、ＩＴＲは、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）又はエリスロウイルス属（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）の非ＡＡＶメンバーのＩＴＲである。ある特定の実施形態において、ＩＴＲは、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、ノバリケン（Ｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ）パルボウイルス（ＭＤＰＶ）、又はエリスロウイルスパルボウイルスＢ１９（パルボウイルスＢ１９、霊長類エリスロウイルスパルボウイルス１、Ｂ１９ウイルス、及びエリスロウイルスとしても知られる）のＩＴＲである。ある特定の実施形態において、２つのＩＴＲのうちの１つのＩＴＲはＡＡＶのＩＴＲである。他の実施形態において、構築物中の２つのＩＴＲのうちの１つは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び任意のその組合せから選択されるＡＡＶ血清型のＩＴＲである。１つのある特定の実施形態において、ＩＴＲはＡＡＶ血清型２に由来し、例えば、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲである。

【0096】

本開示の特定の態様において、核酸分子は２つのＩＴＲ、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含み、ここで５’ＩＴＲは核酸分子の５’末端に位置し、そして３’ＩＴＲは核酸分子の３’末端に位置する。５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、同じウイルスに由来しても異なるウイルスに由来してもよい。ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲはＡＡＶ由来であり、そして３’ＩＴＲはＡＡＶウイルスに由来しない（例えば、非ＡＡＶ）。一部の実施形態において、３’ＩＴＲはＡＡＶ由来であり、そして５’ＩＴＲはＡＡＶウイルスに由来しない（例えば、非ＡＡＶ）。他の実施形態において、５’ＩＴＲはＡＡＶウイルスに由来せず（例えば、非ＡＡＶ）、そして３’ＩＴＲは同じか又は異なる非ＡＡＶウイルス由来である。

【0097】

本明細書で使用されるように、用語「パルボウイルス」はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）を包含し、これらとしては、限定されないが、自己複製パルボウイルス及びディペンドウイルスが挙げられる。自律パルボウイルスとしては、例えば、ボカウイルス属（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス属（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、アムドウイルス属（Ａｍｄｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス属（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、デンソウイルス属（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス属（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）、コントラウイルス属（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス属（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス属（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス属（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アンビデンソウイルス属（Ａｍｂｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ、ブレビデンソウイルス属（Ｂｒｅｖｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ヘパンデンソウイルス属（Ｈｅｐａｎｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、及びペンスチルデンソウイルス属（Ｐｅｎｓｔｙｌｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）のメンバーが挙げられる。

【0098】

例となる自律パルボウイルスとしては、限定されないが、ブタパルボウイルス、マウス微小ウイルス、イヌパルボウイルス、ミンク腸炎ウイルス、ウシパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、ノバリケンパルボウイルス、ヘビパルボウイルス、及びＢ１９ウイルスが挙げられる。他の自律パルボウイルスは当業者に公知である。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ． ＶＩＲＯＬＯＧＹ、ｖｏｌｕｍｅ ２、ｃｈａｐｔｅｒ ６９ （４ｔｈ ｅｄ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。

【0099】

本明細書で使用されるように、用語「非ＡＡＶ」は、パルボウイルス科のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を除くパルボウイルス科の由来の核酸、タンパク質及びウイルスを包含する。「非ＡＡＶ」としては、限定されないが、ボカウイルス（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス属（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、アムドウイルス（Ａｍｄｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス属（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、デンソウイルス属（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス属（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）、コントラウイルス属（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス属（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス属（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス属（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アンビデンソウイルス属（Ａｍｂｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ブレビデンソウイルス属（Ｂｒｅｖｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ヘパンデンソウイルス属（Ｈｅｐａｎｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、及びペンスチルデンソウイルス属（Ｐｅｎｓｔｙｌｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）の自己複製性メンバーが挙げられる。

【0100】

本明細書で使用されるように、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）としては、限定されないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、Ｇａｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１（２００４））及びＭｏｒｉｓら（Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５（２００４））により開示されるＡＡＶ血清型及び系統群のＡＡＶ、並びに現在公知であるか又は後に発見された他のＡＡＶが挙げられる。例えば、ＦＩＥＬＤＳら ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、６９章（第４編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。

【0101】

本明細書で使用されるように、用語「に由来する」は、特定の分子もしくは生物、又は特定の分子もしくは生物からの情報（例えば、アミノ酸又は核酸配列）から単離されたか又はそれらを使用して製造された成分を指す。例えば、第二の核酸配列（例えば、ＩＴＲ）に由来する核酸配列（例えば、ＩＴＲ）は、第二の核酸配列のヌクレオチド配列と同一であるか又は実質的に類似したヌクレオチド配列を含み得る。ヌクレオチド又はポリペプチドの場合、由来種は、例えば、天然に存在する変異誘発、人工的に指向された変異誘発又は人工的なランダム変異誘発により得ることができる。ヌクレオチド又はポリペプチドを派生させるために使用される変異誘発は、意図的に指向されても意図的に無作為にされても、又はそれぞれの混合でもよい。最初のものに由来する異なるヌクレオチド又はポリペプチドを作製するためのヌクレオチド又はポリペプチドの変異誘発は、無作為な事象（例えば、ポリメラーゼの非忠実度（ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ）により引き起こされる）であり得、そして由来ヌクレオチド又はポリペプチドの同定は、例えば本明細書において考察されるような適切なスクリーニング方法により行われ得る。ポリペプチドの変異誘発は、典型的にはそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を必然的に伴う。一部の実施形態において、第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列に由来するヌクレオチド又はアミノ酸配列は、第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列と、それぞれ少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、ここで第一のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列の生物学的活性を保持する。他の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（又はそれぞれＡＡＶ ＩＴＲ）と少なくとも９０％同一であり、ここで非ＡＡＶ（又はＡＡＶ） ＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（又はそれぞれＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を保持する。一部の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）と少なくとも８０％同一であり、ここで非ＡＡＶ（又はＡＡＶ） ＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を保持する。一部の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）と少なくとも７０％同一であり、ここで非ＡＡＶ（又はＡＡＶ） ＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を保持する。一部の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）と少なくとも６０％同一であり、ここで非ＡＡＶ（又はＡＡＶ） ＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を保持する。一部の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）と少なくとも５０％同一であり、ここで非ＡＡＶ（又はＡＡＶ） ＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を保持する。

【0102】

ある特定の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲのフラグメントを含むか又はそのフラグメントからなる。一部の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲのフラグメントを含むか又は該フラグメントからなり、ここで該フラグメントは、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１２５ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１７５ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２２５ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約２７５ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３２５ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、少なくとも約３７５ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約４２５ヌクレオチド、少なくとも約４５０ヌクレオチド、少なくとも約４７５ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約５２５ヌクレオチド、少なくとも約５５０ヌクレオチド、少なくとも約５７５ヌクレオチド、又は少なくとも約６００ヌクレオチドを含み；ここで、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を保持する。ある特定の実施形態において、非ＡＡＶ（又は ＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲのフラグメントを含むか又は該フラグメントからなり、ここで該フラグメントは少なくとも約１２９ヌクレオチドを含み、そしてここで非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を保持する。ある特定の実施形態において、非ＡＡＶ（又は ＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲのフラグメントを含むか又は該フラグメントからなり、ここで該フラグメントは少なくとも約１０２ヌクレオチドを含み、そしてここで非ＡＡＶ（又は ＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を保持する。

【0103】

一部の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲのフラグメントを含むか又は該フラグメントからなり、ここで該フラグメントは、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲの長さの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を含む。

【0104】

ある特定の実施形態において、第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列に由来するヌクレオチド又はアミノ酸配列は、適切に整列された場合、それぞれ第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列の相同部分に対して、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、ここで第一のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列の生物学的活性を保持する。他の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、適切に整列された場合、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の相同部分と少なくとも９０％同一であり、ここで第一のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列の生物学的活性を保持する。一部の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、適切に整列された場合、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の相同部分と少なくとも８０％同一であり、ここで第一のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列の生物学的活性を保持する。一部の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、適切に整列された場合、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の相同部分と少なくとも７０％同一であり、ここで第一のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列の生物学的活性を保持する。一部の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、適切に整列された場合、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の相同部分と少なくとも６０％同一であり、第一のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列の生物学的活性を保持する。一部の実施形態において、非ＡＡＶ（又はＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、適切に整列された場合、非ＡＡＶ ＩＴＲ（それぞれ又はＡＡＶ ＩＴＲ）の相同部分と少なくとも５０％同一であり、第一のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列の生物学的活性を保持する。

【0105】

「無カプシド（ｃａｐｓｉｄ－ｆｒｅｅ）」又は「カプシドレス（ｃａｐｓｉｄ－ｌｅｓｓ）」ベクター又は核酸分子は、カプシドを含まないベクター構築物を指す。一部の実施形態において、カプシドレスベクター又は核酸分子は、例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする配列を含有しない。

【0106】

本明細書で使用されるように、「コード領域」又は「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）は典型的にはアミノ酸に翻訳されないが、これはコード領域の一部とみなすことができるが、いずれかの隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、イントロンなどはコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、典型的には、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端における開始コドン、及び得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端における翻訳終止コドンにより決定される。２つ又はそれ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド中に、例えば、単一のベクター上に、又は別個のポリヌクレオチド構築物中に、例えば、別個の（異なる）ベクター上に存在し得る。次いで、単一のベクターが単一のコード領域だけを含有し得るか、又は２つもしくはそれ以上のコード領域を含むということになる。

【0107】

哺乳動物細胞により分泌される特定のタンパク質は分泌シグナルペプチドと関連しており、これは粗面小胞体を横切って伸長するタンパク質鎖の排出が開始されると、成熟タンパク質から切断される。シグナルペプチドは、一般的にはポリペプチドのＮ末端に融合されており、そして完全又は「全長」ポリペプチドから切断されてポリペプチドの分泌又は「成熟」形態を生成するということを当業者は理解する。ある特定の実施形態において、天然シグナルペプチド又はその配列の機能性誘導体は、それに作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を方向づける能力を保持する。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼシグナルペプチド、又はその機能性誘導体が使用され得る。

【0108】

用語「下流」は、参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態において、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。

【0109】

用語「上流」は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態において、上流ヌクレオチド配列は、コード領域又は転写開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、大部分のプロモーターは転写開始部位の上流に位置する。

【0110】

本明細書で使用されるように、用語「遺伝子調節領域」又は「調節領域」は、コード領域の上流（５’非コード配列）、コード領域内、又はコード領域の下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、そしてこれは関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節領域は、ロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、又はステムループ構造を含み得る。コード領域が真核細胞における発現を意図される場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は通常はコード配列に対して３’側に位置する。

【0111】

産物、例えば、ｍｉＲＮＡ又は遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質のようなポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、１つ又はそれ以上のコード領域に作動可能に結合されたプロモーター及び／又は他の発現（例えば、転写又は翻訳）制御エレメントを含み得る。作動可能な結合において、遺伝子産物、例えばポリペプチドのためのコード領域は、１つ又はそれ以上の調節領域と、遺伝子産物の発現を調節領域の影響下又は制御下に置くような方法で結合される。例えば、コード領域及びプロモーターは、プロモーター機能の誘導が、コード領域によりコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じる場合、及びプロモーターとコード領域との間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を方向づけるプロモーターの能力と干渉せず、転写しようとするＤＮＡテンプレートの能力とも干渉しない場合に、「作動可能に結合されている」。プロモーターに加えて、他の発現制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルもまた、遺伝子産物発現を方向づけるようにコード領域と作動可能に結合され得る。

【0112】

「転写制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現をもたらすプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのようなＤＮＡ調節配列を指す。様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらとしては、限定することなく、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス（最初期プロモーター、イントロン－Ａと関連する）、サルウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーター及びエンハンサーセグメントが挙げられる。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビンのような脊椎動物遺伝子由来のもの、さらには真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、さらにはリンホカイン誘導プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）が挙げられる。

【0113】

同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにピコルナウイルス由来のエレメント（特に配列内リボソーム進入部位又はＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。

【0114】

本明細書で使用されるように、用語「発現」は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばＲＮＡ又はポリペプチドを生じるプロセスを指す。これとしては、限定することなく、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又はいずれかの他のＲＮＡ産物への転写、及びｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が挙げられる。発現は「遺伝子産物」を生じる。本明細書で使用される遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により生じるメッセンジャーＲＮＡ、又は転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれでもよい。本明細書において記載されるような遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸、又は翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、又はタンパク質分解切断を有するポリペプチドをさらに含む。本明細書で使用されるように用語「収量」は、遺伝子の発現により生じるポリペプチドの量を指す。

【0115】

「ベクター」は、核酸の宿主細胞へのクローン化及び／又は輸送のための媒介物を指す。ベクターは別の核酸セグメントが付着して付着したセグメントの複製を起こすためのレプリコンであり得る。「レプリコン」は、インビボでの複製の自律単位として機能する、すなわちそれ自体の制御下での複製が可能ないずれかの遺伝要素（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。用語「ベクター」は、核酸をインビトロで、エクスビボで、又はインビボで細胞中に導入するための媒介物を含む。多数のベクターが公知であり、そして当該分野で使用され、これらとしては、例えば、プラスミド、改変真核生物ウイルス、又は改変細菌ウイルスが挙げられる。ポリヌクレオチドの適切なベクターへの挿入は、適切なポリヌクレオチドフラグメントを、相補的付着末端を有する選択されたベクター中に連結することにより達成され得る。

【0116】

ベクターが組み込まれた細胞の選択又は同定を提供する選択可能なマーカー又はレポーターをコードするようにベクターは操作され得る。選択可能なマーカー又はレポーターの発現は、ベクターに含まれる他のコード領域を組み込んで発現する宿主細胞の同定及び／又は選択を可能にする。当該分野において公知であり使用される選択可能なマーカー遺伝子の例としては：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する抵抗性を与える遺伝子；及び表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。当該分野で公知であり使用されるレポーターの例としては：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが挙げられる。選択可能なマーカーはレポーターであるとも考えられ得る。

【0117】

本明細書で使用されるように、用語「宿主細胞」は、例えば、ｓｓＤＮＡもしくはベクターとして使用され得るか、又はｓｓＤＮＡもしくはベクターのレシピエントとして使用されたことがある微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を指す。この用語は、形質導入された元の細胞の後代を含む。したがって、本明細書で使用されるように、「宿主細胞」は、一般に、外来ＤＮＡ配列で形質導入された細胞を指す。単一の親細胞の後代は、天然の、偶発的な、又は計画的な変異に起因して、必ずしも元の親と形態学的に完全に同一でなくてもよく、又はゲノム的にもしくは総ＤＮＡにおいて相補的でないかもしれないということが理解される。一部の実施形態において、宿主細胞はインビトロ宿主細胞であり得る。

【0118】

用語「選択可能なマーカー」は、識別因子、通常は、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する抵抗性、除草剤に対する抵抗性に基づいて選択されることが可能な抗生物質又は化学物質抵抗性遺伝子、比色分析マーカー、酵素、蛍光マーカーなどを指し、ここでこの効果は、目的の核酸の遺伝を追跡するため、かつ／又は目的の核酸を受け継いだ細胞もしくは生物を同定するために使用される。当該分野で公知であり使用される選択可能なマーカー遺伝子の例としては：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する抵抗性を与える遺伝子；及び表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。

【0119】

用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の効果に基づいて識別することができる識別因子をコードする核酸を指し、ここでこの効果は、目的の核酸の遺伝を追跡するため、目的の核酸を受け継いだ細胞もしくは生物を同定するため、かつ／又は遺伝子発現誘導もしくは転写を測定するために使用される。当該分野において公知で使用されるレポーター遺伝子の例としては：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが挙げられる。選択可能なマーカーはレポーター遺伝子であるとも考えられ得る。

【0120】

「プロモーター」および「プロモーター配列」は互換的に使用され、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは天然の遺伝子から完全に誘導することができるか、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されるか、合成ＤＮＡセグメントを含むこともできる。当業者は、異なるプロモーターが異なる組織もしくは細胞型において、または発達の異なる段階で、または異なる環境もしくは生理的条件に応答して遺伝子の発現を方向付けることができるということを理解する。ほとんどの細胞型においてほとんどのときに遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成プロモーター」と呼ばれる。特異的細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。発達または細胞分化の特異的段階で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「発達特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する薬剤、生体分子、化学物質、リガンド、光などによる細胞の曝露または処理の後に誘導されて、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「誘導可能なプロモーター」または「調節可能なプロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に規定されているとは限らないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。

【0121】

プロモーター配列は転写開始部位によりその３’末端に境界され、そして上流（５’方向）に伸長してバックグラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列の中には、転写開始部位（例えばヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって都合良く規定される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合の役割を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。

【0122】

一部の実施形態において、核酸分子は、組織特異的プロモーターを含む。ある特定の実施形態では、組織特異的プロモーターは、肝臓において、例えば肝細胞および／または内皮細胞において、治療用タンパク質、例えば凝固因子の発現を促進する。ある特定の実施形態では、プロモーターは、マウスサイレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトアルファ－１－抗トリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよび任意のその組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーター（例えば、α１－抗トリプシン（ＡＡＴ））、筋肉特異的プロモーター（例えば、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）、ミオグロビン（ＭＢ）およびデスミン（ＤＥＳ））、合成プロモーター（例えば、ＳＰｃ５－１２、２Ｒ５Ｓｃ５－１２、ｄＭＣＫおよびｔＭＣＫ）および任意のその組合せから選択される。特定の一実施形態では、プロモーターはＴＴＰプロモーターを含む。

【0123】

用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ内の特異的ヌクレオチド配列内で結合して切断する酵素を指す。

【0124】

用語「プラスミド」は、細胞の中心的代謝の一部でなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子をしばしば有する染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、線状、環状またはスーパーコイル状の、自己複製配列、ゲノム組入れ配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってよく、そこでは、適当な３’非翻訳配列とともに選択される遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である特異な構築物に、いくつかのヌクレオチド配列が連結されているか組み換えられている。

【0125】

使用することができる真核生物のウイルスベクターには、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターが含まれる。非ウイルス性のベクターには、プラスミド、リポソーム、帯電した脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ－タンパク質複合体およびバイオポリマーが含まれる。

【0126】

「クローニングベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドなどの、逐次的に複製し、そして複製起点を含む単位長の核酸である「レプリコン」を指し、付着したセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントをそれに対して付着させることができる。ある特定のクローニングベクターは、１つの細胞型、例えば細菌における複製、および別の細胞型、例えば真核細胞における発現が可能である。クローニングベクターは、典型的にはベクターを含む細胞の選択のために使用することができる１つ若しくはそれ以上の配列、および／または目的の核酸配列の挿入のための１つ若しくはそれ以上の多重クローニング部位を含む。

【0127】

用語「発現ベクター」は、宿主細胞への挿入の後に、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計された媒介物を指す。挿入された核酸配列は、上記の調節領域との作動可能な関係に置かれる。

【0128】

ベクターは、当技術分野で周知である方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体によって宿主細胞に導入される。本明細書で使用されるように、「培養」、「培養すること」および「培養すること」は、細胞の増殖もしくは分裂を可能にするインビトロ条件下で細胞をインキュベートすること、または細胞を生存状態に維持することを意味する。本明細書で使用されるように、「培養された細胞」は、インビトロで増殖した細胞を意味する。

【0129】

本明細書で使用されるように、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」だけでなく複数の「ポリペプチド」も包含するものであり、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結される単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ又は以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を指し、具体的長さの生成物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つ若しくはそれ以上のアミノ酸の鎖または複数の鎖を指すために使用される他の任意の用語が「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、そして用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりにまたは互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後の改変の生成物も指すものであり、これらの改変としては、限定することなく、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性切断または天然に存在しないアミノ酸による改変が挙げられる。ポリペプチドは天然の生物供給源から誘導することができるか、または組換え技術で生成することができるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。それは、化学的合成を含む任意の方法で生成することができる。

【0130】

用語「アミノ酸」には、アラニン（ＡｌａまたはＡ）；アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）；アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）；アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）；システイン（ＣｙｓまたはＣ）；グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；グリシン（ＧｌｙまたはＧ）；ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）：ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）；リシン（ＬｙｓまたはＫ）；メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）；フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）；プロリン（ＰｒｏまたはＰ）；セリン（ＳｅｒまたはＳ）；トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）；チロシン（ＴｙｒまたはＹ）；およびバリン（ＶａｌまたはＶ）が含まれる。非伝統的なアミノ酸も本開示の範囲内であり、これにはノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１～３３６（１９９１）に記載されるものなどの他のアミノ酸残基類似体が含まれる。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２（１９８９）および上記のＥｌｌｍａｎらの手法を使用することができる。簡潔には、これらの手法は、天然に存在しないアミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することと、続くＲＮＡのインビトロ転写および翻訳を含む。非伝統的アミノ酸の導入は、当技術分野で公知のペプチド化学を使用して達成することもできる。本明細書で使用されるように、用語「極性アミノ酸」は、ゼロ総電荷を有するが、それらの側鎖の異なる部分にノンゼロ部分電荷を有するアミノ酸を含む（例えば、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｃ）。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電的相互作用に関与することができる。本明細書で使用されるように、用語「荷電アミノ酸」は、それらの側鎖にノンゼロ総電荷を有することができるアミノ酸を含む（例えば、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ）。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電的相互作用に関与することができる。

【0131】

ポリペプチドのフラグメントまたはバリアントおよび任意のその組合せも本開示に含まれる。本開示のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子を指す場合の用語「フラグメント」または「バリアント」は、参照ポリペプチドの特性（例えば、ＦｃＲｎ結合ドメインまたはＦｃバリアントへのＦｃＲｎ結合親和性、ＦＶＩＩＩバリアントの凝固活性またはＶＷＦフラグメントへのＦＶＩＩＩ結合活性）の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドのフラグメントには、本明細書の他の場所で考察される特異的抗体フラグメントに加えてタンパク分解性フラグメント、さらには欠失フラグメントが含まれるが、天然に存在する全長ポリペプチド（または、成熟ポリペプチド）は含まれない。本開示のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子のバリアントには、上記のフラグメント、およびアミノ酸の置換、欠失または挿入のために変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。バリアントは、天然に存在するもの、または天然に存在しないものであってもよい。天然に存在しないバリアントは、当技術分野で公知の変異誘発技術を使用して生成することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。

【0132】

「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で規定されている。したがって、ポリペプチド中のアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置き換えられる場合、その置換は保存的であると考えられる。別の実施形態では、アミノ酸の文字列は、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似している文字列で保存的に置き換えることができる。

【0133】

当技術分野で公知であるように、用語「同一性パーセント」は、配列の比較で判定される、２つ若しくはそれ以上のポリペプチド配列または２つ若しくはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当技術分野で、「同一性」は、そのような配列の文字列の間の一致によって判定される、場合によってポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、以下に記載されるものを非限定的に含む、公知の方法によって容易に計算することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｌｅｓｋ、Ａ． Ｍ．編） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ （Ｓｍｉｔｈ、Ｄ． Ｗ．編） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ （Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ． Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ． Ｇ．編） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ （１９９４）； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．編） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編） Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）。同一性を判定する好ましい方法は、試験する配列の間で最高の一致を与えるように設計される。同一性を判定する方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１５ ＵＳＡ）などの、配列分析ソフトウェアを使用して実行することができる。本出願の文脈の範囲内で、配列分析ソフトウェアが分析のために使用される場合、特に明記しない限り、分析の結果は参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。本明細書で使用されるように、「デフォルト値」は、最初に初期化されるときにソフトウェアと一緒に当初ロードする値またはパラメーターのセットを意味する。治療用タンパク質、例えば、凝固因子、本開示の配列および参照配列の間の同一性パーセントを判定する目的のために、同一性パーセントを計算するために治療用タンパク質、例えば凝固因子、本開示の配列の中のヌクレオチドに対応する参照配列のヌクレオチドだけを使用する。例えば、Ｂドメインを含有する全長ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列を本開示の最適化されたＢドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列と比較する場合、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含むアラインメントの部分は、同一性パーセントを計算するために使用される。全長ＦＶＩＩＩ配列のＢドメイン（これは、アラインメントに大きな「ギャップ」をもたらす）をコードする部分のヌクレオチドは、ミスマッチとして数えられない。さらに、本開示の最適化されたＢＤＤ ＦＶＩＩＩ配列またはその指定部分（例えば、配列番号３のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４）と参照配列の間の同一性パーセントの判定では、同一性パーセントは、一致したヌクレオチドの数を最適化されたＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ配列の完全配列または、本明細書に列挙されるその指定部分のヌクレオチドの総数で割ることによって計算される。

【0134】

本明細書で使用されるように、本開示の特定の配列のヌクレオチドに対応するヌクレオチドは、参照配列との同一性を最大にするような本開示の配列のアラインメントによって同定される。参照配列中の同等のアミノ酸を同定するために使用される数は、本開示の配列中の対応するアミノ酸を同定するために使用される数に基づく。

【0135】

「融合」または「キメラ」タンパク質は、それが本来は天然に連結していない第二のアミノ酸配列に連結している第一のアミノ酸配列を含む。別個のタンパク質に通常は存在するアミノ酸配列を融合ポリペプチド中で一緒にすることができるか、または、同じタンパク質に通常は存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチド、例えば、本開示の第ＶＩＩＩ因子ドメインとＩｇ Ｆｃドメインとの融合における新しい配置に置くことができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作製し、翻訳することによって作製される。キメラタンパク質は、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合によって第一のアミノ酸配列に関連付けられた第二のアミノ酸配列をさらに含むことができる。

【0136】

本明細書で使用されるように、用語「挿入部位」は、異種部分を挿入することができる位置のすぐ上流にある、ポリペプチドまたはそのフラグメント、バリアントもしくは誘導体の中の位置を指す。「挿入部位」は番号で規定され、この番号は参照配列の中のアミノ酸の番号である。例えば、ＦＶＩＩＩにおける「挿入部位」は、挿入位置のすぐＮ末端側にある、挿入部位が対応する成熟天然ＦＶＩＩＩ（配列番号１５）におけるアミノ酸配列の番号を指す。例えば、「ａ３は配列番号１５のアミノ酸１６５６に対応する挿入部位に異種部分を含む」という語句は、異種部分が配列番号１５のアミノ酸１６５６およびアミノ酸１６５７に対応する２つのアミノ酸の間に位置することを示す。

【0137】

本明細書で使用される「アミノ酸のすぐ下流」という語句は、アミノ酸の末端カルボキシル基のすぐ隣の位置を指す。同様に、「アミノ酸のすぐ上流」という語句は、アミノ酸の末端アミン基のすぐ隣の位置を指す。

【0138】

本明細書で使用されるように、用語「挿入された」、「挿入される」、「に挿入される」または文法的に関連した用語は、親のポリペプチドの中の類似した位置に対する、ポリペプチド、例えば凝固因子の中の異種部分の位置を指す。例えば、ある特定の実施形態では、「挿入された」などは、天然成熟ヒトＦＶＩＩＩの類似した位置に対する、組換えＦＶＩＩＩポリペプチドの中の異種部分の位置を指す。本明細書で使用されるように、これらの用語はポリペプチドの特徴を指し、ポリペプチドが作製されたいかなる方法またはプロセスをも示しも、暗示も、意味もしない。

【0139】

本明細書で使用されるように、用語「半減期」は、インビボにおける特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与された量の半分がその動物における循環および／または他の組織から除去されるのに必要とされる時間で表すことができる。所与のポリペプチドのクリアランス曲線が時間の関数として構築される場合、曲線は、通常迅速なα相およびより長いβ相による二相性である。α相は、一般的に脈管内と脈管外の空間の間の投与されたＦｃポリペプチドの平衡化を表し、一部、ポリペプチドのサイズによって決定される。β相は、脈管内空間におけるポリペプチドの異化作用を一般的に表す。一部の実施形態では、治療用タンパク質、例えば凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ、およびそれを含むキメラタンパク質は一相性であり、したがってアルファ相を有さず、単一のベータ相だけである。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で使用される用語半減期は、β相におけるポリペプチドの半減期を指す。

【0140】

本明細書で使用される用語「連結される」は、共有結合または非共有結合で第二のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列にそれぞれ連結される第一のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。第一のアミノ酸またはヌクレオチド配列は、第二のアミノ酸若しくはヌクレオチド配列に直接的に接合若しくは並置させることができるか、またあるいは、介在配列で第一の配列を第二の配列に共有結合で接合させることができる。用語「連結される」は、Ｃ末端またはＮ末端での第一のアミノ酸配列の第二のアミノ酸配列への融合を意味するだけでなく、第一のアミノ酸配列（または、第二のアミノ酸配列）全体の第二のアミノ酸配列（それぞれまたは第一のアミノ酸配列）中の任意の２つのアミノ酸の中への挿入も含む。一実施形態では、第一のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーによって第二のアミノ酸配列に連結することができる。第一のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって第二のヌクレオチド配列に連結することができる。リンカーは、ペプチドもしくはポリペプチド（ポリペプチド鎖の場合）またはヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖の場合）または任意の化学部分（ポリペプチドおよびポリヌクレオチド鎖の場合の両方）であってよい。用語「連結される」は、ハイフン（－）によっても示される。

【0141】

本明細書で使用されるように、止血は、出血もしくは大出血の停止もしくは鈍化；または、血管もしくは身体部分を通しての血流の停止もしくは鈍化を意味する。

【0142】

止血障害は、本明細書で使用されるように、フィブリン凝塊を形成する能力の障害または欠損による、自然発生的なまたは外傷の結果としての出血傾向によって特徴付けられる、遺伝的に継承したかまたは後天性の状態を意味する。そのような障害の例には、血友病が含まれる。３つの主な形態は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損または「クリスマス病」）および血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠損、軽度の出血傾向）である。他の止血障害には、例えば、フォン・ウィルブラント病、第ＸＩ因子欠損（ＰＴＡ欠乏症）、第ＸＩＩ因子欠損、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造異常、ＧＰＩｂの欠陥または欠損
であるベルナール－スリエ症候群が含まれる。ｖＷＦの受容体ＧＰＩｂが欠損し、一次凝塊形成（一次止血）の喪失および出血傾向の増加、ならびにＧｌａｎｚｍａｎおよびＮａｅｇｅｌｉの血小板無力症（Ｇｌａｎｚｍａｎｎ血小板無力症）につながることがある。肝不全（急性および慢性の形態）では、肝臓による凝固因子の生成が不十分であり、これは、出血リスクを増加させることがある。

【0143】

本開示の単離された核酸分子、単離されたポリペプチド、または単離された核酸分子を含むベクターは、予防的に使用することができる。本明細書で使用されるように、用語「予防的治療」は、出血エピソードの前の分子の投与を指す。一実施形態では、全身止血剤を必要とする対象は、手術を受けているか、受けようとしている。本開示のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはベクターは、予防薬として手術の前又は後に投与することができる。本開示のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはベクターは、急性出血エピソードを制御するために、手術中に、または手術後に投与することができる。手術には、これらに限定されないが、肝移植、肝臓切除、歯科処置または幹細胞移植が含まれ得る。

【0144】

本開示の単離された核酸分子、単離されたポリペプチド、またはベクターは、注文対応の処置のためにも使用される。用語「注文対応の処置」は、出血エピソードの症状に応じた、または出血を引き起こす可能性のある活動の前の、単離された核酸分子、単離されたポリペプチドまたはベクターの投与を指す。一態様では、注文対応の治療は、損傷の後のような出血が開始するとき、または手術前のような出血が予想されるときに場合に与えることができる。別の態様では、注文対応の治療は、接触競技などの出血のリスクを増加させる活動の前に与えることができる。

【0145】

本明細書で使用されるように、用語「急性出血」は、根底にある原因に関わらず、出血エピソードを指す。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝性出血障害（例えば、第ＶＩＩ因子欠損）、血小板障害または凝固因子に対する抗体の発達による耐性を有してもよい。

【0146】

本明細書で使用されるように、処置する、処置、処置することは、例えば疾患または状態の重症度の低減；疾患経過期間の低減；疾患または状態に関連した１つまたはそれ以上の症状の改善；疾患または状態を必ずしも治癒せず、疾患または状態に関連した１つまたはそれ以上の症状の予防もなしに、疾患または状態を有する対象に有益な作用を提供することを指す。一実施形態では、用語「処置すること」または「処置」は、本開示の単離された核酸分子、単離されたポリペプチドまたはベクターを投与することによって、対象において、例えば、少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬ、２０ＩＵ／ｄＬ、２５ＩＵ／ｄＬ、３０ＩＵ／ｄＬ、３５ＩＵ／ｄＬ、４０ＩＵ／ｄＬ、４５ＩＵ／ｄＬ、５０ＩＵ／ｄＬ、５５ＩＵ／ｄＬ、６０ＩＵ／ｄＬ、６５ＩＵ／ｄＬ、７０ＩＵ／ｄＬ、７５ＩＵ／ｄＬ、８０ＩＵ／ｄＬ、８５ＩＵ／ｄＬ、９０ＩＵ／ｄＬ、９５ＩＵ／ｄＬ、１００ＩＵ／ｄＬ、１０５ＩＵ／ｄＬ、１１０ＩＵ／ｄＬ、１１５ＩＵ／ｄＬ、１２０ＩＵ／ｄＬ、１２５ＩＵ／ｄＬ、１３０ＩＵ／ｄＬ、１３５ＩＵ／ｄＬ、１４０ＩＵ／ｄＬ、１４５ＩＵ／ｄＬ、又は１５０ＩＵ／ｄＬのＦＶＩＩＩトラフレベルを維持することを意味する。別の実施形態では、治療することまたは治療は、ＦＶＩＩＩトラフレベルを約１と約１５０ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約１２５ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約１００ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約９０ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約８５ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約８０ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約７５ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約７０ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約６５ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約６０ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約５５ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約５０ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約４５ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約４０ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約３５ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約３０ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約２５ＩＵ／ｄＬとの間、約２５と約１２５ＩＵ／ｄＬとの間、約５０と約１００ＩＵ／ｄＬとの間、約５０と約７５ＩＵ／ｄＬとの間、約７５と約１００ＩＵ／ｄＬとの間、約１と約２０ＩＵ／ｄＬとの間、約２と約２０ＩＵ／ｄＬとの間、約３と約２０ＩＵ／ｄＬとの間、約４と約２０ＩＵ／ｄＬとの間、約５と約２０ＩＵ／ｄＬとの間、約６と約２０ＩＵ／ｄＬとの間、約７と約２０ＩＵ／ｄＬとの間、約８と約２０ＩＵ／ｄＬとの間、約９と約２０ＩＵ／ｄＬとの間、又は約１０と約２０ＩＵ／ｄＬとの間で維持することを意味する。疾患または状態の処置または処置することは、対象におけるＦＶＩＩＩ活性を、非血友病対象におけるＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、又は１５０％と同等のレベルに維持することを含むこともできる。治療のために必要とされる最小限のトラフレベルは、１つまたはそれ以上の公知の方法によって測定することができ、そして各個人のために調整する（増加または低下させる）ことができる。

【0147】

本明細書で使用されるように、「投与すること」は、薬学的に許容される核酸分子、それから発現されるポリペプチド、または本開示の核酸分子を含むベクターを、薬学的に許容される経路を通して対象に与えることを意味する。投与経路は静脈内、例えば、静脈内注射および静脈内注入であってよい。さらなる投与経路には、例えば、皮下、筋内、経口、経鼻および経肺投与が含まれる。核酸分子、ポリペプチドおよびベクターは、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の一部として投与することができる。

【0148】

本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」は、ヒトに投与された場合に、生理的に許容され、かつ毒性も、胃の不調、めまいなどのアレルギー性もしくは類似の厄介な反応も一般的に生じない、分子実体および組成物を指す。場合により、本明細書で使用されるように、用語「薬学的に許容される」は、連邦もしくは州政府の規制機関に承認されたこと、または、動物、より詳細にはヒトでの使用のために米国薬局方もしくは他の公認の薬局方に掲載されていることを意味する。

【0149】

本明細書で使用されるように、「それを必要とする対象」という語句は、例えば止血を向上させるために、本開示の核酸分子、ポリペプチドまたはベクターの投与から利益を受けるであろう哺乳動物対象などの対象を含む。一実施形態では、対象には、これらに限定されないが、血友病の個体が含まれる。別の実施形態では、対象には、これらに限定されないが、治療用タンパク質、例えば凝固因子、例えばＦＶＩＩＩに対する阻害物質を発生し、したがってバイパス療法を必要とする個体が含まれる。対象は、成人または未成年（例えば、１２才未満）であってよい。

【0150】

本明細書で使用されるように、用語「治療用タンパク質」は、対象に投与することができる当技術分野で公知の任意のポリペプチドを指す。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、凝固因子、増殖因子、抗体、その機能的フラグメント、またはその組合せから選択されるタンパク質を含む。本明細書で使用されるように、用語「凝固因子」は、対象において出血エピソードを予防するかその期間を短くする、天然に存在するかまたは組換えで生成される分子またはその類似体を指す。言い換えると、それは、凝固促進活性を有する、すなわち、血液の凝集または凝固を引き起こす不溶性フィブリンのメッシュへのフィブリノーゲンの変換の役割を担う分子を意味する。本明細書で使用される「凝固因子」は、活性化凝固因子、その酵素前駆体または活性化可能な凝固因子を含む。「活性化可能な凝固因子」は、活性型に変換することが可能である不活性型（例えば、その酵素前駆体の形態）にある凝固因子である。用語「凝固因子」には、これらに限定されないが、第Ｉ因子（ＦＩ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２－抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子－１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子－２（ＰＡＩ２）、その酵素前駆体、その活性化型または任意のその組合せが含まれる。

【0151】

本明細書で使用されるように、凝固活性は、フィブリン凝塊の形成を完了させる、および／または大出血もしくは出血エピソードの重症度、期間もしくは頻度を低減する生化学反応のカスケードに参加する能力を意味する。

【0152】

本明細書で使用されるように、「増殖因子」は、サイトカインおよびホルモンを含む、当技術分野で公知の任意の増殖因子を含む。一部の実施形態では、増殖因子は、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、オートクリン運動性因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７）、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバー（例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６））、コロニー刺激因子（例えば、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エフリン（例えば、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３）、胎児ウシソマトトロピン（ＦＢＳ）、ＧＤＮＦファミリーメンバー（例えば、グリア細胞由来神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン）、増殖分化因子－９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝癌由来の増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（例えば、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）またはＩＧＦ－２、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰまたは肝細胞増殖因子様タンパク質（ＨＧＦＬＰ））、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン（例えば、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧ４）、ニューロトロフィン（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ＮＴ－４、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子（例えば、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ－α）、ＴＧＦ－β、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）から選択される。

【0153】

一部の実施形態において、治療用タンパク質は、Ｘ連鎖ジストロフィン、ＭＴＭ１（ミオチューブラリン）、チロシン水酸化酵素、ＡＡＤＣ、シクロヒドロラーゼ、ＳＭＮ１、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＳ１、ＣＦＨ、ＨＴＲＡ、ＡＲＭＳ、ＣＦＢ／ＣＣ２、ＣＮＧＡ／ＣＮＧＢ、Ｐｒｆ６５、ＡＲＳＡ、ＰＳＡＰ、ＩＤＵＡ（ＭＰＳ Ｉ）、ＩＤＳ（ＭＰＳ ＩＩ）、ＰＡＨ、ＧＡＡ（酸性アルファ－グルコシダーゼ）または任意のその組合せから選択される遺伝子によってコードされる。

【0154】

本明細書で使用されるように、用語「異種」または「外因性」は、所与の場面、例えば細胞またはポリペプチドにおいて通常は見出されない分子を指す。外因性または異種分子を細胞に導入することができ、例えばトランスフェクション若しくは遺伝子操作の他の形態による細胞の操作の後にだけ存在するか、または異種アミノ酸配列が、それが天然に見出されないタンパク質に存在することができる。

【0155】

本明細書で使用されるように、用語「異種ヌクレオチド配列」は、所与のポリヌクレオチド配列と一緒に天然に存在しないヌクレオチド配列を指す。一実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、治療用タンパク質、例えば凝固因子、例えばＦＶＩＩＩの半減期を延長することが可能なポリペプチドをコードする。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、治療用タンパク質、例えば凝固因子、例えばＦＶＩＩＩの流体力学半径を増加させるポリペプチドをコードする。他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、その生物活性にも機能（例えば、凝血促進活性）にも有意に影響を与えることなく、治療用タンパク質の１つまたはそれ以上の薬物動態学的特性を向上させるポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドにリンカーによって連結または接続される。異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド部分の非限定的な例には、免疫グロブリン定常領域またはその一部、アルブミンまたはそのフラグメント、アルブミン結合部分、トランスフェリン、米国特許出願第２０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰ配列、トランスフェリンまたはそのフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、アルブミン結合小分子、ＸＴＥＮ配列、ＦｃＲｎ結合部分（例えば、ＦｃＲｎに結合する完全Ｆｃ領域またはその部分）、単鎖Ｆｃ領域（ＳｃＦｃ領域、例えば、ＵＳ２００８／０２６０７３８、ＷＯ２００８／０１２５４３またはＷＯ２００８／１４３９５４５に記載のもの）、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、ペプチドおよびとりわけ５０％未満から５０％超の様々な程度の二次構造を有する、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される２つのタイプのアミノ酸の６～４０アミノ酸の短いポリペプチド、またはその２つ若しくは以上の組合せが含まれる。一部の実施形態では、異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、非ポリペプチド部分に連結される。非ポリペプチド部分の非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン結合小分子、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、その誘導体または任意のその組合せが含まれる。

【0156】

本明細書で使用されるように、用語「Ｆｃ領域」は、天然のＩｇのＦｃ領域に対応するポリペプチドの部分、すなわち、その２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメインの二量体会合によって形成されるものと規定される。天然のＦｃ領域は、別のＦｃ領域とホモダイマーを形成する。対照的に、本明細書で使用されるように、用語「遺伝子融合Ｆｃ領域」または「単鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）は、単一のポリペプチド鎖内で遺伝子的に連結される（すなわち、単一の連続した遺伝子配列にコードされる）Ｆｃドメインで構成される合成二量体Ｆｃ領域を指す。

【0157】

一実施形態では、「Ｆｃ領域」は、パパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４としたときの、ＩｇＧの残基２１６）のすぐ上流のヒンジ領域から始まり抗体のＣ末端で終わる、単一のＩｇ重鎖の部分を指す。したがって、完全なＦｃドメインは、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを少なくとも含む。

【0158】

Ｉｇ定常領域のＦｃ領域は、Ｉｇアイソタイプにより、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン、さらにはヒンジ領域を含むことができる。ＩｇのＦｃ領域を含むキメラタンパク質は、安定性の増加、血清半減期の増加（Ｃａｐｏｎら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５を参照のこと）、さらには新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのＦｃ受容体への結合性を含むいくつかの望ましい特性をキメラタンパク質に与える（米国特許第６，０８６，８７５号、第６，４８５，７２６号、第６，０３０，６１３号；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３－０２３５５３６Ａ１）（これらは参照により本明細書に完全に組み入れる）。

【0159】

本開示のヌクレオチド配列との比較として本明細書で使用される場合、「参照ヌクレオチド配列」は、配列が最適化されていないこと以外は、本開示のヌクレオチド配列と事実上同一であるポリヌクレオチド配列である。例えば、配列番号１のコドン最適化ＢＤＤ ＦＶＩＩＩおよび、その３’末端で配列番号１に連結される単鎖Ｆｃ領域をコードする異種ヌクレオチド配列からなる核酸分子のための参照ヌクレオチド配列は、配列番号１６の元の（または、「親」の）ＢＤＤ ＦＶＩＩＩおよび、その３’末端で配列番号１６に連結される単鎖Ｆｃ領域をコードする同一の異種ヌクレオチド配列からなる核酸分子である。

【0160】

本明細書で使用されるように、ヌクレオチド配列に関する用語「最適化される」は、そのポリヌクレオチド配列の特性を強化するように変異されている、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、最適化は、転写レベルを増加させるために、翻訳レベルを増加させるために、定常状態のｍＲＮＡレベルを増加させるために、基本転写因子などの調節タンパク質の結合性を増減するために、スプライシングを増減するために、または、ポリヌクレオチド配列によって生成されるポリペプチドの収量を増加させるために実行される。それを最適化するためにポリヌクレオチド配列に加えることができる変更の例には、コドン最適化、Ｇ／Ｃ含有量最適化、反復配列の除去、ＡＴリッチエレメントの除去、潜在性スプライス部位の除去、転写または翻訳を抑圧するシス作用性エレメントの除去、ポリＴまたはポリＡ配列を加えるか除去すること、転写開始部位の周囲にコザックコンセンサス配列などの転写を強化する配列を加えること、ステムループ構造を形成するかもしれない配列の除去、不安定化配列の除去、および２つ以上のその組合せが含まれる。

【0161】

ＩＩ． 核酸分子
本開示は、治療用タンパク質または標的タンパク質の発現をモジュレートすることができる遺伝子、例えばｍｉＲＮＡをコードする、プラスミド様無カプシド核酸分子に関する。ウイルスのタンパク質の殻であるカプシドは、ウイルスの遺伝物質を封入する。カプシドは、ウイルスゲノムを保護し、ゲノムを宿主に送達し、そして宿主と相互作用することによって、ビリオンの機能を助けることが知られている。それにもかかわらず、ウイルスカプシドは、ベクターのパッケージング能力の制限および／または、特に遺伝子療法で使用する場合の免疫応答の誘導における因子であり得る。

【0162】

ＡＡＶベクターは、より一般的なタイプの遺伝子療法ベクターの１つとして現れた。しかし、カプシドの存在は、遺伝子療法におけるＡＡＶベクターの有用性を制限する。詳細には、カプシド自体は、ベクターに含まれる導入遺伝子のサイズを４．５ｋｂ未満という低さにそれ自体制限することができる。遺伝子療法において有用であり得る様々な治療用タンパク質は、調節エレメントが加えられる前でさえ、このサイズを容易に超え得る。

【0163】

さらに、カプシドを構成するタンパク質は、対象の免疫系が標的にすることができる抗原の役割をすることができる。一般集団においてＡＡＶは非常に一般的であり、ほとんどの人は生涯の間にＡＡＶに曝露されたことがある。その結果、ほとんどの潜在的遺伝子療法レシピエントは、ＡＡＶに対する免疫応答をすでに起こしている可能性があり、したがって、療法を拒絶する可能性がより高い。

【0164】

本開示のある特定の態様は、ＡＡＶベクターのこれらの欠陥を克服することを目標とする。特に、本開示のある特定の態様は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、並びに例えば、治療用タンパク質及び／又はｍｉＲＮＡをコードする遺伝子カセットを含む核酸分子に関する。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び第二のＩＴＲは、異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接する。一部の実施形態において、核酸分子は、カプシドタンパク質、複製タンパク質、及び／又は集合タンパク質をコードする遺伝子を含まない。一部の実施形態において、遺伝子カセットは治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態において、治療用タンパク質は凝固因子を含む。一部の実施形態において、遺伝子カセットはｍｉＲＮＡをコードする。ある特定の実施形態において、遺伝子カセットは第一のＩＴＲと第二のＩＴＲとの間に位置づけられる。一部の実施形態において、核酸分子は１つ又はそれ以上の非コード領域をさらに含む。ある特定の実施形態において、１つ又はそれ以上の非コード領域はプロモーター配列、イントロン、転写後調節エレメント、３’ＵＴＲポリ（Ａ）配列、又は任意のその組合せを含む。

【0165】

一実施形態において、遺伝子カセットは一本鎖核酸である。別の実施形態において、遺伝子カセットは二本鎖核酸である。

【0166】

一実施形態において、核酸分子は：
（ａ） パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の非ＡＡＶファミリーメンバーのＩＴＲ（例えば、Ｂ１９又はＧＰＶ ＩＴＲ）である第一のＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ｍｉＲＮＡ又は治療用タンパク質、例えば、凝固因子をコードするヌクレオチド；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；
（ｇ） パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の非ＡＡＶファミリーメンバーのＩＴＲ（例えば、Ｂ１９又はＧＰＶ ＩＴＲ）である第二のＩＴＲ
を含む。

【0167】

一実施形態において、核酸分子は：
（ａ） パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の非ＡＡＶファミリーメンバーのＩＴＲである第一のＩＴＲ
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド、［ここでｍｉＲＮＡは、ＳＯＤ１、ＨＴＴ、ＲＨＯ、及び任意のその組合せから選択される標的遺伝子の発現を下方調節する］；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；
（ｇ） パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の非ＡＡＶファミリーメンバーのＩＴＲである第二のＩＴＲ
を含む。

【0168】

一実施形態において、核酸分子は：
（ａ） パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の非ＡＡＶファミリーメンバーのＩＴＲである第一のＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） Ｘ連鎖ジストロフィン、ＭＴＭ１（ミオチューブラリン）、チロシン水酸化酵素、ＡＡＤＣ、シクロヒドロラーゼ、ＳＭＮ１、ＦＸＮ （フラタキシン）、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＳ１、ＣＦＨ、ＨＴＲＡ、ＡＲＭＳ、ＣＦＢ／ＣＣ２、ＣＮＧＡ／ＣＮＧＢ、Ｐｒｆ６５、ＡＲＳＡ、ＰＳＡＰ、ＩＤＵＡ（ＭＰＳ Ｉ）、ＩＤＳ（ＭＰＳ ＩＩ）、ＰＡＨ、ＧＡＡ（酸性アルファグルコシダーゼ）、又は任意のその組合せをコードするヌクレオチド；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；
（ｇ） パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の非ＡＡＶファミリーメンバーのＩＴＲである第二のＩＴＲ
を含む。

【0169】

一実施形態において、核酸分子は：
（ａ） ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ血清型２ゲノムのＩＴＲである第一のＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド；［ここで、ヌクレオチドは、配列番号１～１４又は配列番号７１から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、ここで該ヌクレオチドによりコードされるＦＶＩＩＩはＦＶＩＩＩ活性を保持する］；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び
（ｇ） ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ血清型２ゲノムのＩＴＲである第二のＩＴＲ
を含む。

【0170】

一実施形態において、核酸分子は：
（ａ） ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ血清型２ゲノムのＩＴＲである第一のＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド、［ここでｍｉＲＮＡは、標的遺伝子、例えば、ＳＯＤ１、ＨＴＴ、ＲＨＯ、及び任意のその組合せの発現を下方調節する］；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び
（ｇ） ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ血清型２ゲノムのＩＴＲである第二のＩＴＲ
を含む。

【0171】

一実施形態において、核酸分子は：
（ａ） ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ血清型２ゲノムのＩＴＲである第一のＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） Ｘ連鎖ジストロフィン、ＭＴＭ１（ミオチューブラリン）、チロシン水酸化酵素、ＡＡＤＣ、シクロヒドロラーゼ、ＳＭＮ１、ＦＸＮ （フラタキシン）、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＳ１、ＣＦＨ、ＨＴＲＡ、ＡＲＭＳ、ＣＦＢ／ＣＣ２、ＣＮＧＡ／ＣＮＧＢ、Ｐｒｆ６５、ＡＲＳＡ、ＰＳＡＰ、ＩＤＵＡ（ＭＰＳ Ｉ）、ＩＤＳ（ＭＰＳ ＩＩ）、ＰＡＨ、ＧＡＡ（酸性アルファグルコシダーゼ）、又は任意のその組合せをコードするヌクレオチド；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び
（ｇ） ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ血清型２ゲノムのＩＴＲである第二のＩＴＲ
を含む。

【0172】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 第一のＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ｍｉＲＮＡ又は治療用タンパク質、例えば、凝固因子をコードするヌクレオチド；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び
（ｇ） 第二のＩＴＲ、
を含み、ここで第一のＩＴＲ又は第二のＩＴＲのうちの一方はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の非ＡＡＶファミリーメンバーのＩＴＲであり、そして他方のＩＴＲはＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ血清型２ゲノムのＩＴＲである。

【0173】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 配列番号１１１に示されるＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ配列を有する５’ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ＦＶＩＩＩ、例えば、ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 配列番号１２４に示されるＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ配列を有する３’ＩＴＲ
を含む。

【0174】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 配列番号１１１に示されるＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ配列を有する５’ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＣＡＧプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ＦＶＩＩＩ、例えば、ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 配列番号１９３に示されるＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ配列を有する３’ＩＴＲ
を含む。

【0175】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 第一のＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ｍｉＲＮＡ又は治療用タンパク質、例えば、凝固因子をコードするヌクレオチド；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び
（ｇ） 第二のＩＴＲ、
を含み、ここで第一のＩＴＲは合成ＩＴＲであり、第二のＩＴＲは合成ＩＴＲであり、又は第一のＩＴＲ及び第二のＩＴＲの両方が合成ＩＴＲである。

【0176】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 第一のＢ１９ ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） 凝固因子、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、そのフラグメント、及びその組合せからなる群より選択される治療用タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；並びに／又は
（ｇ） 第二のＢ１９ ＩＴＲ
を含む。

【0177】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 第一のＧＰＶ ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） 凝固因子、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、そのフラグメント、及びその組合せからなる群より選択される治療用タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；並びに／又は
（ｇ） 第二のＧＰＶ ＩＴＲ
を含む。

【0178】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 第一のＢ１９ ＩＴＲ；
（ｂ） ユビキタスプロモーター配列、例えば、ＣＡＧプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） 凝固因子、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、そのフラグメント、及びその組合せからなる群より選択される治療用タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；並びに／又は
（ｇ） 第二のＢ１９ ＩＴＲ
を含む。

【0179】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 第一のＧＰＶ ＩＴＲ；
（ｂ） ユビキタスプロモーター配列、例えば、ＣＡＧプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） 凝固因子、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、抗体、そのフラグメント、及びその組合せからなる群より選択される治療用タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 第二のＧＰＶ ＩＴＲ
を含む。

【0180】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 第一のＢ１９ ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）をコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 第二のＢ１９ ＩＴＲ
を含む。

【0181】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 第一のＧＰＶ ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）をコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 第二のＧＰＶ ＩＴＲ
を含む。

【0182】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 配列番号１８０に示されるＢ１９ｄ１３５ ５’ＩＴＲ配列を有する５’ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ＦＶＩＩＩ、例えば、ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 配列番号１８１に示されるＢ１９ｄ１３５ ３’ＩＴＲ配列を有する３’ＩＴＲ
を含む。

【0183】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 配列番号１８３に示されるＧＰＶｄ１６２ ５’ＩＴＲ配列を有する５’ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ＦＶＩＩＩ、例えば、ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 配列番号１８４に示されるＧＰＶｄ１６２ ３’ＩＴＲ配列を有する３’ＩＴＲ
を含む。

【0184】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 配列番号１８５に示される全長Ｂ１９ ５’ＩＴＲ配列を有する５’ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ＦＶＩＩＩ、例えば、ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 配列番号１８６に示される全長Ｂ１９ ３’ＩＴＲ配列を有する３’ＩＴＲ
を含む。

【0185】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 配列番号１８７に示される全長ＧＰＶ ５’ＩＴＲ配列を有する５’ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＴＴＰプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ＦＶＩＩＩ、例えば、ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 配列番号１８８に示される全長ＧＰＶ ３’ＩＴＲ配列を有する３’ＩＴＲ
を含む。

【0186】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 配列番号１８０に示されるＢ１９ｄ１３５ ５’ ＩＴＲ配列を有する５’ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＣＡＧプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ＰＡＨをコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 配列番号１８１に示されるＢ１９ｄ１３５ ３’ＩＴＲ配列を有する３’ＩＴＲ
を含む。

【0187】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 配列番号１８３に示されるＧＰＶｄ１６２ ５’ＩＴＲ配列を有する５’ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＣＡＧプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ＰＡＨをコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 配列番号１８４に示されるＧＰＶｄ１６２ ３’ＩＴＲ配列を有する３’ＩＴＲ
を含む。

【0188】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 配列番号１８５に示される全長Ｂ１９ ５’ＩＴＲ配列を有する５’ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＣＡＧプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ＰＡＨをコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 配列番号１８６に示される全長Ｂ１９ ３’ＩＴＲ配列を有する３’ＩＴＲ
を含む。

【0189】

別の実施形態において、核酸分子は：
（ａ） 配列番号１８７に示される全長ＧＰＶ ５’ＩＴＲ配列を有する５’ＩＴＲ；
（ｂ） 組織特異的プロモーター配列、例えば、ＣＡＧプロモーター；
（ｃ） イントロン、例えば、合成イントロン；
（ｄ） ＰＡＨをコードする異種ポリヌクレオチド配列；
（ｅ） 転写後調節エレメント、例えば、ＷＰＲＥ；
（ｆ） ３’ＵＴＲポリ（Ａ）テイル配列、例えば、ｂＧＨｐＡ；及び／又は
（ｇ） 配列番号１８８に示される全長ＧＰＶ ３’ＩＴＲ配列を有する３’ＩＴＲ
を含む。

【0190】

Ａ． 末端逆位配列
本開示のある特定の態様は、第一のＩＴＲ、例えば５’ＩＴＲ、および第二のＩＴＲ、例えば３’ＩＴＲを含む核酸分子に関する。一般的に、ＩＴＲは、原核生物のプラスミドからのパルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ＤＮＡの複製および解放、または切除に関与する（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８３年、１９８７年；Ｓｅｎａｐａｔｈｙら、１９８４年；ＧｏｔｔｌｉｅｂおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８８年）。さらに、ＩＴＲは、ＡＡＶプロウイルス組入れのために、およびビリオンへのＡＡＶ ＤＮＡのパッケージングのために必要とされる最小限の配列のようである（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８年；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９年）。これらのエレメントは、パルボウイルスゲノムの効率的な増殖のために必須である。ＩＴＲ機能にとって不可欠な最小限の規定エレメントは、Ｒｅｐ結合部位（例えば、ＲＢＳ；ＡＡＶ２の場合ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ（配列番号１０４））および末端分解部位（例えば、ＴＲＳ；ＡＡＶ２の場合ＡＧＴＴＧＧ（配列番号１０５））、さらにヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列であると仮定される。パリンドロームヌクレオチド領域は、ＤＮＡ複製の起点として、およびウイルスのためのパッケージングシグナルとして、通常シスで一緒に機能する。ＩＴＲの中の相補的配列は、ＤＮＡ複製の間、ヘアピン構造に折りたたまれる。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピンＴ字形構造に折りたたまれる。他の実施形態では、ＩＴＲは、非Ｔ字形ヘアピン構造、例えば、Ｕ字形ヘアピン構造に折りたたまれる。ＡＡＶ ＩＴＲのＴ字形ヘアピン構造は、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子の発現を抑制し得ることをデータは示唆する。例えば、Ｚｈｏｕら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：５４３２（２０１７年７月１４日）を参照のこと。Ｔ字形ヘアピン構造を形成しないＩＴＲを利用することによって、この形態の抑制を回避することができる。したがって、ある特定の態様では、非ＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドは、Ｔ字形ヘアピンを形成するＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドと比較して向上した導入遺伝子発現を有する。

【0191】

一部の実施形態において、ＩＴＲは天然に存在するＩＴＲを含む、例えば、ＩＴＲはパルボウイルスＩＴＲの全部または一部を含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、合成配列を含む。一実施形態では、第一のＩＴＲまたは第二のＩＴＲは、合成配列を含む。別の実施形態では、第一のＩＴＲおよび第二のＩＴＲの各々は、合成配列を含む。一部の実施形態では、第一のＩＴＲまたは第二のＩＴＲは、天然に存在する配列を含む。別の実施形態では、第一のＩＴＲおよび第二のＩＴＲの各々は、天然に存在する配列を含む。

【0192】

一部の実施形態において、ＩＴＲは、天然に存在するＩＴＲの一部、例えばトランケートされたＩＴＲを含むかそれからなる。一部の実施形態では、ＩＴＲは、天然に存在するＩＴＲのフラグメントを含むかそれからなり、ここで、フラグメントは、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１２５ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１７５ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２２５ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約２７５ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３２５ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、少なくとも約３７５ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約４２５ヌクレオチド、少なくとも約４５０ヌクレオチド、少なくとも約４７５ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約５２５ヌクレオチド、少なくとも約５５０ヌクレオチド、少なくとも約５７５ヌクレオチド、又は少なくとも約６００個のヌクレオチドを含み；ここで、ＩＴＲは天然に存在するＩＴＲの機能特性を保持する。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、天然に存在するＩＴＲのフラグメントを含むかそれからなり、ここで、フラグメントは少なくとも約１２９個のヌクレオチドを含み、ここで、ＩＴＲは天然に存在するＩＴＲの機能特性を保持する。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、天然に存在するＩＴＲのフラグメントを含むかそれからなり、ここで、フラグメントは少なくとも約１０２個のヌクレオチドを含み、ここで、ＩＴＲは天然に存在するＩＴＲの機能的特性を保持する。

【0193】

一部の実施形態において、ＩＴＲは、天然に存在するＩＴＲの一部を含むか又はそれからなり、ここで、フラグメントは、天然に存在するＩＴＲの長さの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を含み；ここで、フラグメントは天然に存在するＩＴＲの機能特性を保持する。

【0194】

ある特定の実施形態において、ＩＴＲは、適切に整列させた場合、天然に存在するＩＴＲの相同部分に対して、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むかそれからなり；ここで、ＩＴＲは天然に存在するＩＴＲの機能特性を保持する。他の実施形態では、ＩＴＲは、適切に整列させた場合、天然に存在するＩＴＲの相同部分と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むかそれからなり；ここで、ＩＴＲは天然に存在するＩＴＲの機能特性を保持する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、適切に整列させた場合、天然に存在するＩＴＲの相同部分と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むかそれからなり；ここで、ＩＴＲは天然に存在するＩＴＲの機能特性を保持する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、適切に整列させた場合、天然に存在するＩＴＲの相同部分と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含むかそれからなり；ここで、ＩＴＲは天然に存在するＩＴＲの機能特性を保持する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、適切に整列させた場合、天然に存在するＩＴＲの相同部分と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むかそれからなり；ここで、ＩＴＲは天然に存在するＩＴＲの機能特性を保持する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、適切に整列させた場合、天然に存在するＩＴＲの相同部分と少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含むかそれからなり；ここで、ＩＴＲは天然に存在するＩＴＲの機能特性を保持する。

【0195】

一部の実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムからのＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１および任意のその組合せから選択されるＡＡＶゲノムのＩＴＲである。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ゲノムのＩＴＲである。別の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの１つまたはそれ以上に由来するＩＴＲをその５’および３’末端に含むように遺伝子操作された合成配列である。

【0196】

一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来しない。一部の実施形態では、ＩＴＲは、非ＡＡＶのＩＴＲである。一部の実施形態では、ＩＴＲは、これらに限定されないが、ボカウイルス（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、アムドウイルス（Ａｍｄｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、デンソウイルス（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アムビデンソウイルス（Ａｍｂｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ブレビデンソウイルス（Ｂｒｅｖｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ヘパンデンソウイルス（Ｈｅｐａｎｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ペンスチルデンソウイルス（Ｐｅｎｓｔｙｌｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）および任意のその組合せからなる群から選択される、ウイルスのパルボウイルス科からの非ＡＡＶゲノムのＩＴＲである。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、エリスロウイルスパルボウイルスＢ１９（ヒトウイルス）に由来する。別の実施形態では、ＩＴＲは、ノバリケンパルボウイルス（ＭＤＰＶ）株に由来する。ある特定の実施形態では、ＭＤＰＶ株は弱毒化される、例えば、ＭＤＰＶ株ＦＺ９１－３０。他の実施形態では、ＭＤＰＶ株は病原性である、例えば、ＭＤＰＶ株ＹＹ。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ブタパルボウイルス、例えば、ブタパルボウイルスＵ４４９７８に由来する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、マウス微小ウイルス、例えば、マウス微小ウイルスＵ３４２５６に由来する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、イヌパルボウイルス、例えば、イヌパルボウイルスＭ１９２９６に由来する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ミンク腸炎ウイルス、例えば、ミンク腸炎ウイルスＤ００７６５に由来する。一部の実施形態では、ＩＴＲは、デペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に由来する。一実施形態では、デペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）は、ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）株である。具体的な実施形態では、ＧＰＶ株は弱毒化される、例えば、ＧＰＶ株８２－０３２１Ｖ。別の具体的な実施形態では、ＧＰＶ株は病原性である、例えば、ＧＰＶ株Ｂ。

【0197】

核酸分子の第一のＩＴＲおよび第二のＩＴＲは、同じゲノム、例えば同じウイルスのゲノム、または異なるゲノム、例えば２つ若しくはそれ以上の異なるウイルスゲノムのゲノムに由来し得る。ある特定の実施形態では、第一のＩＴＲおよび第二のＩＴＲは同じＡＡＶゲノムに由来する。具体的な実施形態では、本発明の核酸分子に存在する２つのＩＴＲは同じであり、特にＡＡＶ２ ＩＴＲであってよい。他の実施形態では、第一のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、第二のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来しない（例えば、非ＡＡＶゲノム）。他の実施形態では、第一のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来せず（例えば、非ＡＡＶゲノム）、そして第二のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来する。さらに他の実施形態では、第一のＩＴＲと第二のＩＴＲは、両方ともＡＡＶゲノムに由来しない（例えば、非ＡＡＶゲノム）。特定の一実施形態では、第一のＩＴＲおよび第二のＩＴＲは同一である。

【0198】

一部の実施形態では、第一のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして第二のＩＴＲは、ボカウイルス（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、アムドウイルス（Ａｍｄｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、デンソウイルス（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アムビデンソウイルス（Ａｍｂｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ブレビデンソウイルス（Ｂｒｅｖｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ヘパンデンソウイルス（Ｈｅｐａｎｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ペンスチルデンソウイルス（Ｐｅｎｓｔｙｌｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）および任意のその組合せからなる群から選択されるゲノムに由来する。他の実施形態では、第二のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、第一のＩＴＲは、ボカウイルス（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、アムドウイルス（Ａｍｄｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、デンソウイルス（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アムビデンソウイルス（Ａｍｂｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ブレビデンソウイルス（Ｂｒｅｖｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ヘパンデンソウイルス（Ｈｅｐａｎｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ペンスチルデンソウイルス（Ｐｅｎｓｔｙｌｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）および任意のその組合せからなる群から選択されるゲノムに由来する。他の実施形態では、第一のＩＴＲおよび第二のＩＴＲは、ボカウイルス（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、アムドウイルス（Ａｍｄｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、デンソウイルス（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アムビデンソウイルス（Ａｍｂｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ブレビデンソウイルス（Ｂｒｅｖｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ヘパンデンソウイルス（Ｈｅｐａｎｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ペンスチルデンソウイルス（Ｐｅｎｓｔｙｌｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）および任意のその組合せからなる群から選択されるゲノムに由来し、ここで、第一のＩＴＲおよび第二のＩＴＲは同じゲノムに由来する。他の実施形態では、第一のＩＴＲおよび第二のＩＴＲは、ボカウイルス（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、アムドウイルス（Ａｍｄｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、デンソウイルス（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アムビデンソウイルス（Ａｍｂｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ブレビデンソウイルス（Ｂｒｅｖｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ヘパンデンソウイルス（Ｈｅｐａｎｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ペンスチルデンソウイルス（Ｐｅｎｓｔｙｌｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）および任意のその組合せからなる群から選択されるゲノムに由来し、ここで、第一のＩＴＲおよび第二のＩＴＲは異なるゲノムに由来する。

【0199】

一部の実施形態では、第一のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして第二のＩＴＲはエリスロウイルスパルボウイルスＢ１９（ヒトウイルス）に由来する。他の実施形態では、第二のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、第一のＩＴＲはエリスロウイルスパルボウイルスＢ１９（ヒトウイルス）に由来する。

【0200】

ある特定の実施形態では、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、Ｂ１９に由来するＩＴＲの全体または一部を含むかそれからなる。一部の実施形態では、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、配列番号１６７、１６８、１６９、１７０および１７１から選択されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むかそれからなり、ここで、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、それが由来するＢ１９ ＩＴＲの機能特性を保持する。一部の実施形態では、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、配列番号１６７、１６８、１６９、１７０および１７１から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むかそれからなり、ここで、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲはヘアピン構造を形成することができる。ある特定の実施形態では、ヘアピン構造は、Ｔ字形ヘアピンを含まない。

【0201】

一部の実施形態では、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、配列番号１６７、１６８、１６９、１７０および１７１から選択されるヌクレオチド配列を含むかそれからなる。一部の実施形態では、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、配列番号１６７に示すヌクレオチド配列を含むかそれからなる。一部の実施形態では、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、配列番号１６８に示すヌクレオチド配列を含むかそれからなる。一部の実施形態では、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、配列番号１６９に示すヌクレオチド配列を含むかそれからなる。一部の実施形態では、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、配列番号１７０に示すヌクレオチド配列を含むかそれからなる。一部の実施形態では、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、配列番号１７１に示すヌクレオチド配列を含むかそれからなる。

【0202】

【表1】

【表2】

【表3】

【0203】

ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１６７に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１６７からなる。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１６８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１６８からなる。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１６９に示される最小ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含み、そしてここで該ヌクレオチド配列は、配列番号１６７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であり、それが由来するＢ１９ ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１６９に示される最小ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含み、そしてここで該ヌクレオチド配列は、配列番号１６７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であり、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成することができる。ある特定の実施形態において、ヘアピン構造はＴ字形ヘアピンを含まない。

【0204】

ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、Ｂ１９に由来するＩＴＲの全て又は一部を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第二のＩＴＲは第一のＩＴＲの逆相補鎖である。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは第二のＩＴＲの逆相補鎖である。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８５、及び１８６から選択されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、機能性誘導体は、それが由来するＢ１９ ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１８０、１８１、１８５、及び１８６から選択されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、機能性誘導体はヘアピン構造を形成する事が可能である。ある特定の実施形態において、ヘアピン構造はＴ字形ヘアピンを含まない。

【0205】

ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１８０からなる。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１８１からなる。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１８５からなる。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１８６からなる。

【0206】

一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８５、及び１８６から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第二のＩＴＲは、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第二のＩＴＲは、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第二のＩＴＲは、配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第二のＩＴＲは、配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。

【0207】

一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、そして第二のＩＴＲは、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、そして第二のＩＴＲは、配列番号１８０に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、そして第二のＩＴＲは、配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、そして第二のＩＴＲは、配列番号１８５に示されるヌクレオチドを含むか又はそれからなる。

【0208】

一部の実施形態において、第一のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして第二のＩＴＲはＧＰＶに由来する。他の実施形態において、第二のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして第一のＩＴＲはＧＰＶに由来する。

【0209】

ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１７２からなる。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７３に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１７３からなる。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、ＧＰＶに由来するＩＴＲの全て又は一部を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７２、１７３、１７４、１７５、及び１７６から選択されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、それが由来するＧＰＶ ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、ＧＰＶに由来するＩＴＲの全て又は一部を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７２、１７３、１７４、１７５、及び１７６から選択されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含むかか又はそれからなり、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲはヘアピン構造を形成することができる。ある特定の実施形態において、ヘアピン構造はＴ字形ヘアピンを含まない。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７２、１７３、１７４、１７５、及び１７６から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７３に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７４に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７５に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７６に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。

【0210】

ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７４に示される最小ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含み、そしてここで該ヌクレオチド配列は、配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であり、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、それが由来するＧＰＶ ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７４に示される最小ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含み、そしてここで該ヌクレオチド配列は、配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であり、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲはヘアピン構造を形成することができる。ある特定の実施形態において、ヘアピン構造はＴ字形ヘアピンを含まない。

【0211】

ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７６に示される最小ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含み、そしてここで該ヌクレオチド配列は、配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であり、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、それが由来するＧＰＶ ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７６に示される最小ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含み、そしてここでヌクレオチド配列は、配列番号１７２に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であり、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲはヘアピン構造を形成することができる。ある特定の実施形態において、ヘアピン構造はＴ字形ヘアピンを含まない。

【0212】

ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、ＧＰＶに由来するＩＴＲの全て又は一部を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第二のＩＴＲは第一のＩＴＲの逆相補鎖である。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは第二のＩＴＲの逆相補鎖である。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８３、１８４、１８７及び１８８から選択されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、機能性誘導体は、それが由来するＧＰＶ ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８３、１８４、１８７及び１８８から選択されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、機能性誘導体はヘアピン構造を形成することができる。ある特定の実施形態において、ヘアピン構造はＴ字形ヘアピンを含まない。

【0213】

ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１８３からなる。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１８４からなる。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１８７からなる。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは配列番号１８８からなる。

【0214】

一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８３、１８４、１８７及び１８８から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第二のＩＴＲは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第二のＩＴＲは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第二のＩＴＲは、配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第二のＩＴＲは、配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。

【0215】

一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、そして第二のＩＴＲは配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、そして第二のＩＴＲは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、そして第二のＩＴＲは、配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲは、配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、そして第二のＩＴＲは、配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。

【0216】

ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲ又は第二のＩＴＲの一方は、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲの全て又は一部を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ又は第二のＩＴＲは、配列番号１７７又は１７８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、それが由来するＡＡＶ２ ＩＴＲの機能的特性を保持する。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ又は第二のＩＴＲは、配列番号１７７又は１７８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲはヘアピン構造を形成することができる。ある特定の実施形態において、ヘアピン構造はＴ字形ヘアピンを含まない。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７７又は１７８に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７７に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１７８に示されるヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。

【0217】

一部の実施形態において、第一のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして第二のＩＴＲはノバリケンパルボウイルス（ＭＤＰＶ）株に由来する。他の実施形態において、第二のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして第一のＩＴＲはノバリケンパルボウイルス（ＭＤＰＶ）株に由来する。ある特定の実施形態において、ＭＤＰＶ株は弱毒化されている、例えば、ＭＤＰＶ株ＦＺ９１－３０。他の実施形態において、ＭＤＰＶ株は病原性である、例えば、ＭＤＰＶ株ＹＹ。

【0218】

一部の実施形態において、第一のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして第二のＩＴＲはデペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に由来する。一部の実施形態において、第二のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして第一のＩＴＲはデペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に由来する。他の実施形態において、第一のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして第二のＩＴＲは、ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）株に由来する。他の実施形態において、第二のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして第一のＩＴＲはディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）ＧＰＶ株に由来する。ある特定の実施形態において、ＧＰＶ株は弱毒化されている、例えば、ＧＰＶ株８２－０３２１Ｖ。他の実施形態において、ＧＰＶ株は病原性である、例えば、ＧＰＶ株Ｂ。

【0219】

ある特定の実施形態において、第一のＩＴＲはＡＡＶゲノム由来であり、そして第二のＩＴＲは、ブタパルボウイルス、例えば、ブタパルボウイルス株Ｕ４４９７８；マウス微小ウイルス、例えば、マウス微小ウイルス株Ｕ３４２５６；イヌパルボウイルス、例えば、イヌパルボウイルス株Ｍ１９２９６；ミンク腸炎ウイルス、例えば、ミンク腸炎ウイルス株Ｄ００７６５；及び任意のその組合せからなる群より選択されるゲノムに由来する。他の実施形態において、第二のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして第一のＩＴＲは、ブタパルボウイルス、例えば、ブタパルボウイルス株Ｕ４４９７８；マウス微小ウイルス、例えば、マウス微小ウイルス株Ｕ３４２５６；イヌパルボウイルス、例えば、イヌパルボウイルス株Ｍ１９２９６；ミンク腸炎ウイルス、例えば、ミンク腸炎ウイルス株Ｄ００７６５；及び任意のその組合せからなる群より選択されるゲノムに由来する。

【0220】

別の特定の実施形態において、ＩＴＲは、その５’及び３’末端にＡＡＶゲノムに由来しないＩＴＲを含むように遺伝子操作された合成配列である。別の特定の実施態様において、ＩＴＲは、非ＡＡＶゲノムの１つ又はそれ以上に由来するＩＴＲをその５’及び３’末端に含むように遺伝子操作された合成配列である。本発明の核酸分子中に存在する２つのＩＴＲは同じ非ＡＡＶであっても異なる非ＡＡＶでもよい。特に、ＩＴＲは同じ非ＡＡＶゲノムに由来し得る。特定の実施形態において、本発明の核酸分子中に存在する２つのＩＴＲは同じであり、そして特にＡＡＶ２ ＩＴＲであり得る。

【0221】

一部の実施形態では、ＩＴＲ配列は、１つまたはそれ以上のパリンドローム配列を含む。本明細書に開示されるＩＴＲのパリンドローム配列には、これらに限定されないが、天然のパリンドローム配列（すなわち、天然に見出される配列）、合成配列（すなわち、天然に見出されない配列）、例えば偽パリンドローム配列、およびその組合せまたは改変形態が含まれる。「偽パリンドローム配列」は、二次構造を形成する天然のＡＡＶまたは非ＡＡＶパリンドローム配列中の配列と、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満または５％未満、または同一性なしを含む８０％未満の核酸配列同一性を共有する、不完全パリンドローム配列を含むパリンドロームＤＮＡ配列である。天然のパリンドローム配列は、本明細書に開示される任意のゲノムから入手され得るかまたはそれに由来し得る。合成パリンドローム配列は、本明細書に開示される任意のゲノムに基づくことができる。

【0222】

パリンドローム配列は、連続的であっても中断されていてもよい。一部の実施形態では、パリンドローム配列は中断され、ここで、パリンドローム配列は第二の配列の挿入を含む。一部の実施形態では、第二の配列は、プロモーター、エンハンサー、インテグラーゼのための組入れ部位（例えば、ＣｒｅまたはＦｌｐリコンビナーゼのための部位）、遺伝子産物のためのオープンリーディングフレーム、またはその組合せを含む。

【0223】

一部の実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピンループ構造を形成する。一実施形態では、第一のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。別の実施形態では、第二のＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。さらに別の実施形態では、第一のＩＴＲおよび第二のＩＴＲの両方は、ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、Ｔ字形ヘアピン構造を形成しない。ある特定の実施形態では、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、非Ｔ字形ヘアピン構造を形成する。一部の実施形態では、非Ｔ字形ヘアピン構造は、Ｕ字形ヘアピン構造を含む。

【0224】

一部の実施形態では、本明細書に記載されるような核酸分子中のＩＴＲは、転写活性化ＩＴＲであってよい。転写活性化ＩＴＲは、少なくとも１つの転写活性エレメントの包含によって転写活性化された野生型ＩＴＲの全部または一部を含むことができる。各種の転写活性エレメントがこの場面での使用に適する。一部の実施形態では、転写活性エレメントは、構成的転写活性エレメントである。構成的転写活性エレメントは継続したレベルの遺伝子転写を提供し、そして導入遺伝子が継続的に発現されることが望まれるときに好ましい。他の実施形態では、転写活性エレメントは、誘導可能な転写活性エレメントである。誘導可能な転写活性エレメントは、インデューサー（また、誘導条件）の不在下で低い活性を一般的に示し、そしてインデューサーの存在（または、誘導条件への切り替え）下で上方制御される。ある特定の時だけもしくはある特定の場所だけで発現が望ましい場合、または誘導剤を使用して発現レベルを滴定することが望ましい場合、誘導可能な転写活性エレメントが好ましいかもしれない。転写活性エレメントは、組織特異的であってもよい；すなわち、それらは、ある特定の組織または細胞型においてだけ活性を示す。

【0225】

転写活性エレメントを、様々な方法でＩＴＲに組み込むことができる。一部の実施形態では、転写活性エレメントは、ＩＴＲの任意の部分の５’側に、またはＩＴＲの任意の部分の３’側に組み込まれる。他の実施形態では、転写活性化ＩＴＲの転写活性エレメントは、２つのＩＴＲ配列の間にある。転写活性エレメントが間隔をあけなければならない２つ以上のエレメントを含む場合、それらのエレメントはＩＴＲの部分を交互になり得る。一部の実施形態では、ＩＴＲのヘアピン構造は欠失し、転写エレメントの逆方向反復で置き換えられる。この後者の配置は、構造の欠失部分を模倣するヘアピンを形成するであろう。転写活性化ＩＴＲに複数の直列型の転写活性エレメントが存在することができ、これらは隣接していても離れていてもよい。さらに、転写活性化ＩＴＲの転写活性エレメントに、タンパク質結合部位（例えば、Ｒｅｐ結合部位）を導入することができる。転写活性エレメントは、ＲＮＡを形成するＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの制御された転写を可能にする任意の配列を含むことができ、例えば、下で規定される転写活性エレメントを含むことができる。

【0226】

転写活性化ＩＴＲは、比較的制限されたヌクレオチド配列長の核酸分子に転写活性化およびＩＴＲ機能の両方を提供し、それは、核酸分子から運び、発現させることができる導入遺伝子の長さを効果的に最大にする。転写活性エレメントのＩＴＲへの組み込みは、様々な方法で達成することができる。転写活性エレメントのＩＴＲ配列および配列必要条件の比較は、ＩＴＲ内のエレメントをコードする方法に関する識見を提供することができる。例えば、転写活性エレメントの機能的エレメントを複製するＩＴＲ配列における特異的変更の導入を通して、転写活性をＩＴＲに加えることができる。特異的部位で特定のヌクレオチド配列を効率的に加え、削除し、および／または変更するためのいくつかの技術が当技術分野に存在する（例えば、ＤｅｎｇおよびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：８１～８８を参照のこと）。転写活性化ＩＴＲを作製する別の方法は、ＩＴＲの所望の位置での制限部位の導入を含む。さらに、当技術分野で公知の方法を使用して、複数の転写活性エレメントを転写活性化ＩＴＲに組み込むことができる。

【0227】

実例として、転写活性化ＩＴＲは、ＴＡＴＡボックス、ＧＣボックス、ＣＣＡＡＴボックス、Ｓｐ１部位、Ｉｎｒ領域、ＣＲＥ（ｃＡＭＰ調節エレメント）部位、ＡＴＦ－１／ＣＲＥ部位、ＡＰＢβボックス、ＡＰＢαボックス、ＣＡｒＧボックス、ＣＣＡＣボックス、または当技術分野で公知であるような転写に関与する任意の他のエレメントなどの、１つまたはそれ以上の転写活性エレメントの包含によって生成することができる。

【0228】

本開示の態様は、本明細書に記載されるような核酸分子をクローン化する方法を提供し、該方法は、複雑な（ｃｏｍｐｌｅｘ）二次構造をとることができる核酸分子を適切なベクター中に挿入すること、及び得られたベクターを適切な細菌宿主株中に導入することを含む。当該分野で公知のように、核酸の複雑な二次構造（例えば、長い回文領域）は不安定であり、細菌宿主株にクローン化することは困難であるかもしれない。例えば、本開示の第一のＩＴＲ及び第二のＩＴＲ（例えば、非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲ、例えば、Ｂ１９又はＧＰＶ ＩＴＲ）を含む核酸分子は、従来の方法論を使用してクローン化することが困難であるかもしれない。長いＤＮＡパリンドロームはＤＮＡ複製を抑制し、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、出芽酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、マウス、及びヒトのゲノム中で不安定である。これらの効果は、ストランド内塩基対合によるヘアピン又は十字型構造の形成から生じる。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）において、ＤＮＡ複製の抑制は、ＳｂｃＣ又はＳｂｃＤ変異体においてななり克服され得る。ＳｂｃＤはヌクレアーゼサブユニットであり、そしてＳｂｃＣはＳｂｃＣＤ複合体のＡＴＰａｓｅサブユニットである。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＳｂｃＣＤ複合体は、長いパリンドロームの複製を防止する原因となるエキソヌクレアーゼ複合体である。ＳｂｃＣＤ複合体は、ＡＴＰ依存性二本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性及びＡＴＰ依存性一本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性の核である。ＳｂｃＣＤはＤＮＡパリンドロームを認識し得、そして生じるヘアピン構造を攻撃することにより複製フォークを崩壊させる。

【0229】

ある特定の実施形態において、適切な細菌宿主株は、十字型ＤＮＡ構造を分解することができない。ある特定の実施形態において、適切な細菌宿主株はＳｂｃＣＤ複合体において破壊を含む。一部の実施形態において、ＳｂｃＣＤ複合体における破壊はＳｂｃＣ遺伝子及び／又はＳｂｃＤ遺伝子における遺伝子破壊を含む。ある特定の実施形態において、ＳｂｃＣＤ複合体における破壊はＳｂｃＣ遺伝子における遺伝子破壊を含む。ＳｂｃＣ遺伝子において遺伝子破壊を含む様々な細菌宿主株は当該分野で公知である。例えば、限定することなく、細菌宿主株ＰＭＣ１０３は、遺伝子型ｓｂｃＣ、ｒｅｃＤ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦを含み；細菌宿主株ＰＭＣ１０７は遺伝子型ｒｅｃＢＣ、ｒｅｃＪ、ｓｂｃＢＣ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦを含み；そして細菌宿主株ＳＵＲＥは遺伝子型ｒｅｃＢ、ｒｅｃＪ、ｓｂｃＣ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦ、ｕｍｕＣ、ｕｖｒＣを含む。したがって、一部の実施形態において、本明細書に記載されるような核酸分子をクローン化する方法は、複雑な二次構造をとることができる核酸分子を適切なベクターに挿入すること、及び得られたベクターを宿主株ＰＭＣ１０３、ＰＭＣ１０７、又はＳＵＲＥに導入することを含む。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるような核酸分子をクローン化する方法は、複雑な二次構造をとることができる核酸分子を適切なベクターに挿入すること、及び得られたベクターを宿主株ＰＭＣ１０３に導入することを含む。

【0230】

適切なベクターは当該分野で公知であり、そして本明細書の他所に記載される。ある特定の実施形態において、本開示のクローン化方法における使用のための適切なベクターは、低コピーベクターである。ある特定の実施形態において、本開示のクローン化方法における使用に適切なベクターはｐＢＲ３２２である。

【0231】

したがって、本開示は核酸分子をクローン化する方法を提供し、該方法は、複雑な二次構造をとることができる核酸分子を適切なベクターに挿入すること、及び得られたベクターを、ＳｂｃＣＤ複合体における破壊を含む細菌宿主株に導入することを含み、ここで該核酸分子は第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含み、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７又は１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【0232】

Ｂ． 治療用タンパク質
本開示のある特定の態様は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、及び標的配列をコードする遺伝子カセットを含む核酸分子に関し、ここで標的配列は治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態において、遺伝子カセットは１つの治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態において、遺伝子カセットは１つより多くの治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態において、遺伝子カセットは、同じ治療用タンパク質の２つ又はそれ以上のコピーをコードする。一部の実施形態において、遺伝子カセットは同じ治療用タンパク質の２つ又はそれ以上のバリアントをコードする。一部の実施形態において、遺伝子カセットは２つ又はそれ以上の異なる治療用タンパク質をコードする。

【0233】

本開示のある特定の実施形態は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、及び治療用タンパク質をコードする遺伝子カセットを含む核酸分子に関し、ここで、治療用タンパク質は凝固因子を含む。一部の実施形態において、凝固因子は、ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＩＩＩ、ＦＩＶ、ＦＶ、ＦＶＩ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ）、ＶＷＦ、プレカリクレイン、高分子キニノーゲン、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、アルファ２－抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子－１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子－２（ＰＡＩ２）、任意のその酵素原、任意のその活性形態、及び任意のその組合せからなる群より選択される。一実施形態において、凝固因子はＦＶＩＩＩ又はそのバリアント若しくはフラグメントを含む。別の実施形態において、凝固因子はＦＩＸ又はそのバリアント若しくはフラグメントを含む。別の実施形態において、凝固因子はＦＶＩＩ又はそのバリアント若しくはフラグメントを含む。別の実施形態において、凝固因子はＶＷＦ又はそのバリアント若しくはフラグメントを含む。

【0234】

１． 凝固因子
一部の実施形態では、核酸分子は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含み、ここで標的配列は治療用タンパク質をコードし、ここで治療用タンパク質は第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含む。本出願全体を通して「ＦＶＩＩＩ」と略される「第ＶＩＩＩ因子」は、本明細書で使用されるように、別段に特定されていなければ、凝固におけるその通常の役割において、機能的なＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。よって、ＦＶＩＩＩという用語は、機能的であるバリアントポリペプチドを含む。「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、ＦＶＩＩＩポリペプチド（またはタンパク質）またはＦＶＩＩＩと互換的に使用される。ＦＶＩＩＩ機能の例として、これらに限定されないが、凝固を活性化する能力、第ＩＸ因子に関する補因子として作用する能力、またはＣａ^２＋とリン脂質の存在下で、第ＩＸ因子とテナーゼ複合体を形成し、次いで、第Ｘ因子を活性化形態Ｘａに変換する能力が挙げられる。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスのＦＶＩＩＩタンパク質であり得る。さらに、ヒト由来のＦＶＩＩＩと他の種由来のＦＶＩＩＩの間の比較によって、機能に必要とされる可能性の高い保存残基が特定された（Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ７９：３１７～２２（１９９８）；ＵＳ６，２５１，６３２）。全長ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、多くの機能的フラグメント、変異体および改変バージョンがそうであるように、公知である。様々なＦＶＩＩＩアミノ酸およびヌクレオチド配列が、例えば、米国出願公開第２０１５／０１５８９２９号、同第２０１４／０３０８２８０号、および同第２０１４／０３７００３５号ならびに国際公開ＷＯ２０１５／１０６０５２に開示されている。ＦＶＩＩＩポリペプチドとして、例えば、全長ＦＶＩＩＩ、全長ＦＶＩＩＩからＮ末端のＭｅｔを除いたもの、成熟ＦＶＩＩＩ（シグナル配列を除いたもの）、Ｎ末端に追加のＭｅｔを有する成熟ＦＶＩＩＩ、および／またはＢドメインの全体的または部分的欠失を有するＦＶＩＩＩが挙げられる。ＦＶＩＩＩバリアントは、部分的欠失であるか全体的欠失であるかにかかわらず、Ｂドメインの欠失を含む。

【0235】

ａ．ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列
一部の実施形態では、核酸分子は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含み、ここで標的配列は治療用タンパク質をコードし、ここで治療用タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含む。本出願全体を通して「ＦＶＩＩＩ」と略される「第ＶＩＩＩ因子」は、本明細書で使用されるように、別段に特定されていなければ、凝固におけるその通常の役割において、機能的なＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。よって、ＦＶＩＩＩという用語は、機能的であるバリアントポリペプチドを含む。「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、ＦＶＩＩＩポリペプチド（またはタンパク質）またはＦＶＩＩＩと互換的に使用される。ＦＶＩＩＩ機能の例として、これらに限定されないが、凝固を活性化する能力、第ＩＸ因子に関する補因子として作用する能力、またはＣａ^２＋とリン脂質の存在下で、第ＩＸ因子とテナーゼ複合体を形成し、次いで、第Ｘ因子を活性化形態Ｘａに変換する能力が挙げられる。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスのＦＶＩＩＩタンパク質であり得る。さらに、ヒト由来のＦＶＩＩＩと他の種由来のＦＶＩＩＩの間の比較によって、機能に必要とされる可能性の高い保存残基が特定された（Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ７９：３１７～２２（１９９８）；ＵＳ６，２５１，６３２）。全長ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、多くの機能的フラグメント、変異体および改変バージョンがそうであるように、公知である。様々なＦＶＩＩＩアミノ酸およびヌクレオチド配列が、例えば、米国出願公開第２０１５／０１５８９２９号、同第２０１４／０３０８２８０号、および同第２０１４／０３７００３５号ならびに国際公開ＷＯ２０１５／１０６０５２に開示されている。ＦＶＩＩＩポリペプチドとして、例えば、全長ＦＶＩＩＩ、全長ＦＶＩＩＩからＮ末端のＭｅｔを除いたもの、成熟ＦＶＩＩＩ（シグナル配列を除いたもの）、Ｎ末端に追加のＭｅｔを有する成熟ＦＶＩＩＩ、および／またはＢドメインの全体的または部分的欠失を有するＦＶＩＩＩが挙げられる。ＦＶＩＩＩバリアントは、部分的欠失であるか全体的欠失であるかにかかわらず、Ｂドメインの欠失を含む。

【0236】

本明細書で使用されるキメラタンパク質におけるＦＶＩＩＩ部分は、ＦＶＩＩＩ活性を有する。ＦＶＩＩＩ活性は、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。凝固系の機能を評価するための多数の検査が利用可能である：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）検査、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭアッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）検査（ＩＮＲを決定するためにも使用される）、フィブリノーゲン検査（Ｃｌａｕｓｓ方法による場合も多い）、血小板数、血小板機能検査（ＰＦＡ－１００による場合も多い）、ＴＣＴ、出血時間、混合検査（患者の血漿が正常な血漿と混合される場合に、異常が訂正されるかどうか）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ－二量体、遺伝子検査（例えば、第Ｖ因子ライデン、プロトロンビン変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセル蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）、種々の血小板機能検査、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標）、例えば、ＲＯＴＥＭ（登録商標））、または真性グロブリン溶解時間（ＥＬＴ）。

【0237】

ａＰＴＴ検査は、「内因系」凝固経路（接触活性化経路とも称される）と通常の凝固経路の両方の有効性を測定する性能指標である。この検査は、市販の組換え凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの凝固活性を測定するために、通常使用される。この検査は、外因系経路を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）と合わせて使用される。

【0238】

ＲＯＴＥＭ分析は、止血の動態全体に関する情報を提供する：凝固時間、血餅形成、血餅の安定性および溶解。トロンボエラストメトリーの様々なパラメーターは、血漿凝固系の活性、血小板機能、線維素溶解、またはこれらの相互作用に影響を及ぼす多くの因子に依存する。このアッセイは、二次止血の全景を提供することができる。

【0239】

発色アッセイのメカニズムは、活性化したＦＶＩＩＩが、活性化した第ＩＸ因子、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下で、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換を加速する血液凝固カスケードの原理に基づく。第Ｘａ因子の活性は、第Ｘａ因子に特異的なｐ－ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質の加水分解によって評価される。４０５ｎＭで測定されるｐ－ニトロアニリン放出の初期速度は、試料中の第Ｘａ因子活性、よってＦＶＩＩＩ活性に直接比例する。

【0240】

国際血栓止血学会（ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｔｓｉｓ （ＩＳＴＨ））の学術標準化委員会（ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＳＳＣ））のＦＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子の分科委員会により、発色アッセイが推奨される。１９９４年以来、発色アッセイは、ＦＶＩＩＩ濃縮物の効力の帰属に関する欧州薬局方の基準方法でもある。よって、一実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、成熟ＦＶＩＩＩまたはＢＤＤ ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、またはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））に匹敵するＦＶＩＩＩ活性を有する。

【0241】

別の実施形態では、この開示のＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、成熟ＦＶＩＩＩまたはＢＤＤ ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、またはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））に匹敵する第Ｘａ因子の生成速度を有する。

【0242】

第Ｘ因子を活性化して第Ｘａ因子とするために、活性化した第ＩＸ因子（第ＩＸａ因子）は、Ｃａ２＋、膜リン脂質、およびＦＶＩＩＩ補因子の存在下で、第Ｘ因子の１つのアルギニン－イソロイシン結合を加水分解して、第Ｘａ因子を形成する。したがって、ＦＶＩＩＩと第ＩＸ因子との相互作用は、凝集経路において決定的である。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、成熟ＦＶＩＩＩの配列またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、またはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））に匹敵する速度で第ＩＸａ因子と相互作用することができる。

【0243】

さらに、ＦＶＩＩＩは、フォンビルブランド因子に結合するが、循環血液中で不活性である。ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦに結合しない場合、急速に分解し、トロンビンの作用によってＶＷＦから放出される。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、成熟ＦＶＩＩＩの配列またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、またはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））に匹敵するレベルでフォンビルブランド因子に結合する。

【0244】

ＦＶＩＩＩは、カルシウムおよびリン脂質の存在下で、活性化したプロテインＣによって不活性化され得る。活性化したプロテインＣは、Ａ１ドメインのアルギニン３３６の後のＦＶＩＩＩ重鎖を切断して、第Ｘ因子の基質相互作用部位を破壊し、そしてＡ２ドメインのアルギニン５６２の後を切断して、Ａ２ドメインの解離を促進し、さらには第ＩＸａ因子との相互作用部位を破壊する。この切断はまた、Ａ２ドメイン（４３ｋＤａ）を二等分し、そしてＡ２－Ｎドメイン（１８ｋＤａ）とＡ２－Ｃドメイン（２５ｋＤａ）を生じる。よって、活性化したプロテインＣは、重鎖における複数の切断部位を触媒することができる。一実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、成熟ＦＶＩＩＩの配列またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、またはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））に匹敵するレベルで活性化したプロテインＣによって不活性化される。

【0245】

他の実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、成熟ＦＶＩＩＩの配列またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、またはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））に匹敵するインビボでのＦＶＩＩＩ活性を有する。特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチドは、ＨｅｍＡマウスの尾静脈切断モデルにおいて成熟ＦＶＩＩＩの配列またはＢＤＤ ＦＶＩＩＩを含むキメラポリペプチド（例えば、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）、またはＥＬＯＣＴＡＴＥ（登録商標））に匹敵するレベルでＨｅｍＡマウスを保護することが可能である。

【0246】

ＦＶＩＩＩの「Ｂドメイン」は、本明細書で使用されるように、内部アミノ酸配列の同一性およびトロンビンによるタンパク質切断の部位により定義される、当技術分野で公知のＢドメインと同一であり、例えば、成熟ヒトＦＶＩＩＩの残基Ｓｅｒ７４１～Ａｒｇ１６４８である。他のヒトＦＶＩＩＩドメインは、成熟ヒトＦＶＩＩＩに対して、以下のアミノ酸残基により定義される：Ａ１，成熟ＦＶＩＩＩの残基Ａｌａ１～Ａｒｇ３７２；Ａ２，成熟ＦＶＩＩＩの残基Ｓｅｒ３７３～Ａｒｇ７４０；Ａ３，成熟ＦＶＩＩＩの残基Ｓｅｒ１６９０～Ｉｌｅ２０３２；Ｃ１，成熟ＦＶＩＩＩの残基Ａｒｇ２０３３～Ａｓｎ２１７２；Ｃ２，成熟ＦＶＩＩＩの残基Ｓｅｒ２１７３～Ｔｙｒ２３３２。別段指定されていなければ、いずれの配列番号にも言及しない本明細書で使用される配列残基番号は、シグナルペプチドの配列（１９アミノ酸）を含まないＦＶＩＩＩ配列に対応する。ＦＶＩＩＩ重鎖としても知られるＡ３－Ｃ１－Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０～Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列、残基Ｇｌｕ１６４９～Ａｒｇ１６８９は、通常、ＦＶＩＩＩ軽鎖活性化ペプチドと称される。また、ブタ、マウスおよびイヌのＦＶＩＩＩに関するＢドメインを含む、ドメインの全てに関する境界の位置も、当技術分野で公知である。一実施形態では、ＦＶＩＩＩのＢドメインは欠失している（「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」または「ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ」）。ＢＤＤ ＦＶＩＩＩの一例は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）（組換えＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）である。特定の一実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩバリアントは、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸残基７４６から１６４８の欠失を含む。

【0247】

「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」は、米国特許第６，３１６，２２６号、同第６，３４６，５１３号、同第７，０４１，６３５号、同第５，７８９，２０３号、同第６，０６０，４４７号、同第５，５９５，８８６号、同第６，２２８，６２０号、同第５，９７２，８８５号、同第６，０４８，７２０号、同第５，５４３，５０２号、同第５，６１０，２７８号、同第５，１７１，８４４号、同第５，１１２，９５０号、同第４，８６８，１１２号、および同第６，４５８，５６３号ならびに国際公開ＷＯ２０１５１０６０５２Ａ１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１０７３８）に開示される、全部または部分的な欠失を有し得る。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列は、米国特許第６，３１６，２２６号（また、ＵＳ６，３４６，５１３）の第４欄４行目から第５欄２８行目および実施例１～５に開示される欠失のうちのいずれか１つを含む。別の実施形態では、Ｂドメイン欠失第ＦＶＩＩＩ因子は、Ｓ７４３／Ｑ１６３８ Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（ＳＱ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）（例えば、アミノ酸７４４からアミノ酸１６３７の欠失を有する第ＶＩＩＩ因子、例えば、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸１～７４３およびアミノ酸１６３８～２３３２を有する第ＶＩＩＩ因子）である。一部の実施形態では、本開示の方法において使用されるＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，７８９，２０３号（また、ＵＳ６，０６０，４４７、ＵＳ５，５９５，８８６、およびＵＳ６，２２８，６２０）の第２欄、２６～５１行目および実施例５～８に開示される欠失を有する。一部の実施形態では、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，９７２，８８５号の第１欄２５行目～第２欄４０行目；米国特許第６，０４８，７２０号の第６欄１～２２行目および実施例１；米国特許第５，５４３，５０２号の第２欄１７～４６行目；米国特許第５，１７１，８４４号の第４欄２２行目～第５欄３６行目；米国特許第５，１１２，９５０号の第２欄５５～６８行目、図２、および実施例１；米国特許第４，８６８，１１２号の第２欄２行目から第１９欄２１行目および表２；米国特許第７，０４１，６３５号の第２欄１行目から第３欄１９行目、第３欄４０行目から第４欄６７行目、第７欄４３行目から第８欄２６行目、および第１１欄５行目から第１３欄３９行目；または米国特許第６，４５８，５６３号の第４欄２５～５３行目に記載の欠失を有する。一部の実施形態では、ＷＯ９１／０９１２２に開示されるように、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、ほとんどのＢドメインの欠失を有するが、２つのポリペプチド鎖への一次翻訳産物のインビボタンパク質プロセシングに不可欠であるＢドメインのアミノ末端配列を依然として含有する。一部の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、アミノ酸７４７～１６３８の欠失、すなわち、Ｂドメインの実質的に完全な欠失により構築される。Ｈｏｅｂｅｎ Ｒ．Ｃ．ら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１３）：７３１８～７３２３頁（１９９０）。Ｂドメイン欠失ＶＩＩＩ因子は、ＦＶＩＩＩのアミノ酸７７１～１６６６またはアミノ酸８６８～１５６２の欠失を含有する場合もある。Ｍｅｕｌｉｅｎ Ｐ．らＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２（４）：３０１～６（１９８８）。本開示の一部であるさらなるＢドメイン欠失として、アミノ酸９８２から１５６２または７６０から１６３９（Ｔｏｏｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：５９３９～５９４２（１９８６））、７９７から１５６２（Ｅａｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：８３４３～８３４７頁（１９８６））、７４１から１６４６（Ｋａｕｆｍａｎ（ＰＣＴ出願公開第８７／０４１８７号））、７４７～１５６０（Ｓａｒｖｅｒら、ＤＮＡ ６：５５３～５６４頁（１９８７））、７４１から１６４８（Ｐａｓｅｋ（ＰＣＴ出願第８８／００８３１号））、または８１６から１５９８もしくは７４１から１６４８（Ｌａｇｎｅｒ（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１９８８）Ｎｏ ８２：１６～２５頁、ＥＰ ２９５５９７））の欠失が挙げられる。特定の一実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸残基７４６から１６４８の欠失を含む。別の実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸残基７４５から１６４８の欠失を含む。一部の実施形態では、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、成熟全長ＦＶＩＩＩ（ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎおよびＡＦＳＴＹＬＡ（登録商標）としても知られる）に対応するアミノ酸７６５から１６５２の欠失を含有する単鎖ＦＶＩＩＩを含む。米国特許第７，０４１，６３５号を参照のこと。

【0248】

他の実施形態では、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、全長ＦＶＩＩＩ配列のアミノ酸配列に対応する、１つまたはそれ以上のＮ連結グリコシル化部位、例えば、残基７５７、７８４、８２８、９００、９６３、または場合により９４３を保持するＢドメインのフラグメントを含有するＦＶＩＩＩポリペプチドを含む。Ｂドメインフラグメントの例は、Ｍｉａｏ， Ｈ．Ｚ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０３（ａ）：３４１２～３４１９（２００４）、Ｋａｓｕｄａ，Ａら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６：１３５２～１３５９（２００８）およびＰｉｐｅ，Ｓ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９：２２３５～２２４２頁（２０１１）に開示されるＢドメインの２２６アミノ酸または１６３アミノ酸を含む（すなわち、Ｂドメインの最初の２２６アミノ酸または１６３アミノ酸が保持される）。さらに他の実施形態では、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、点変異を残基３０９（ＰｈｅからＳｅｒ）にさらに含み、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩタンパク質の発現を向上させる。Ｍｉａｏ，Ｈ．Ｚ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０３（ａ）：３４１２～３４１９（２００４）を参照されたい。さらに他の実施形態では、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、Ｂドメインの一部分を含有するが、１つまたはそれ以上のフーリン切断部位（例えば、Ａｒｇ１３１３およびＡｒｇ１６４８）を含有しないＦＶＩＩＩポリペプチドを含む。Ｐｉｐｅ，Ｓ．Ｗら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９：２２３５～２２４２（２０１１）を参照されたい。一部の実施形態では、ＢＤＤ ＦＶＩＩＩは、成熟全長ＦＶＩＩＩ（ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎおよびＡＦＳＴＹＬＡ（登録商標）としても知られる）に対応するアミノ酸７６５から１６５２に欠失を含有する単鎖ＦＶＩＩＩを含む。米国特許第７，０４１，６３５号を参照のこと。前記欠失のそれぞれは、任意のＦＶＩＩＩ配列においてなされ得る。

【0249】

非常に多くの機能的ＦＶＩＩＩバリアントが、上記および下記で考察されるように公知である。さらに、ＦＶＩＩＩにおける数百もの非機能的変異が血友病患者において特定されており、ＦＶＩＩＩ機能に対するこれらの変異の効果は、それらが、置換の性質に関するよりもＦＶＩＩＩの３次元構造内にある場所により起因することが決定されている（Ｃｕｔｌｅｒら、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９：２７４～８（２００２））（参照によってその全体として本明細書に組み入れる）。さらに、ヒト由来のＦＶＩＩＩと他の種由来のＦＶＩＩＩの比較から、機能に必要とされる可能性のある保存残基が特定されている（Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７～２２（１９９８）；ＵＳ６，２５１，６３２）（参照によってその全体として本明細書に組み入れる）。

【0250】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩＩバリアントまたはそのフラグメントを含み、ＦＶＩＩＩバリアントまたはそのフラグメントはＦＶＩＩＩ活性を有する。一部の実施形態では、遺伝子カセットは全長ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。他の実施形態では、遺伝子カセットは、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードし、ＦＶＩＩＩのＢドメインの全てまたは一部が欠失している。特定の一実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１０６、１０７、１０９、１１０、１１１、または１１２と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１０６のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１０７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１０９のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１６と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１０９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0251】

一部の実施形態では、本開示の遺伝子カセットは、シグナルペプチドまたはそのフラグメントを含むＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。他の実施形態では、遺伝子カセットは、シグナルペプチドを欠くＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１７のアミノ酸１～１９を含む。

【0252】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列はコドン最適化されている。ある特定の実施形態では、遺伝子カセットは、参照によってその全体として組み入れられる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１５８７９号に開示されているヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列はコドン最適化されている。ある特定の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１～１４から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号７１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、配列番号１９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0253】

ｉ．ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列
一部の実施形態では、本開示の核酸分子は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含み、ここで標的配列は治療用タンパク質をコードし、ここで第一のＩＴＲおよび第二のＩＴＲはＡＡＶゲノムに由来し、そして遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、全長ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。他の実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードし、ＦＶＩＩＩのＢドメインの全てまたは一部は、欠失している。特定の一実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１７と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする。一実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする。

【0254】

一部の実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、シグナルペプチドまたはそのフラグメントを含むＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。他の実施形態では、コドン最適化された配列は、シグナルペプチドを欠くＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１７のアミノ酸１～１９を含む。

【0255】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１または（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し；そしてここでＮ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。特定の一実施形態では、第一の核酸配列は、配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。別の実施形態では、第一の核酸配列は、配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、第一のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１または配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１を含む。

【0256】

他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド１～１７９１または（ｉｉ）配列番号４のヌクレオチド１～１７９１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し；そしてここで、Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。一実施形態では、第一のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド１～１７９１または配列番号４のヌクレオチド１～１７９１を含む。別の実施形態では、第二のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド１７９２～４３７４または配列番号４の１７９２～４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。特定の一実施形態では、第二のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド１７９２～４３７４または配列番号４の１７９２～４３７４を含む。さらに別の実施形態では、第二のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４または配列番号４の１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインのフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号３のヌクレオチド１７９２～４３７４または配列番号４の１７９２～４３７４）に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。特定の一実施形態では、第二のヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４または配列番号４の１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインのフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号３のヌクレオチド１７９２～４３７４または配列番号４の１７９２～４３７４）を含む。

【0257】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４または（ｉｉ）配列番号６の１７９２～４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し；そしてここで、Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。ある特定の実施形態では、第二の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、第二の核酸配列は、配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。特定の一実施形態では、第二の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４または配列番号６の１７９２～４３７４を含む。一部の実施形態では、上記に列挙した第二の核酸配列に連結した第一の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド５８～１７９１または配列番号６のヌクレオチド５８～１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、上記に列挙した第二の核酸配列に連結した第一の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１～１７９１または配列番号６のヌクレオチド１～１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0258】

他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインのフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４）または（ｉｉ）配列番号６の１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインのフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し；そしてここで、Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。ある特定の実施形態では、第二の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインのフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、第二の核酸配列は、配列番号６のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインのフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４）に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。特定の一実施形態では、第二の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４または配列番号６の１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインのフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４および配列番号６の１７９２～４３７４）を含む。一部の実施形態では、上記に列挙した第二の核酸配列に連結した第一の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド５８～１７９１または配列番号６のヌクレオチド５８～１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、上記に列挙した第二の核酸配列に連結した第一の核酸配列は、配列番号５のヌクレオチド１～１７９１または配列番号６のヌクレオチド１～１７９１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0259】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５８～１７９１、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド５８～１７９１、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド５８～１７９１、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド５８～１７９１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し；そしてここで、Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。他の実施形態では、第一のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド５８～１７９１、配列番号２のヌクレオチド５８～１７９１、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド５８～１７９１、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド５８～１７９１を含む。

【0260】

他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１～１７９１、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１～１７９１、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１～１７９１、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１～１７９１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し；そしてここでＮ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。一実施形態では、第一のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド１～１７９１、配列番号２のヌクレオチド１～１７９１、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１～１７９１、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１～１７９１を含む。別の実施形態では、第一のヌクレオチド配列に連結した第二のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド１７９２～４３７４、配列番号２の１７９２～４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２～４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２～４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。特定の一実施形態では、第一のヌクレオチド配列に連結した第二のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２～４３７４、（ｉｉ）配列番号２の１７９２～４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２～４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２～４３７４を含む。他の実施形態では、第一のヌクレオチド配列に連結した第二のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、第二のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４を含む。

【0261】

別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２～４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２～４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２～４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２～４３７４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し；そしてここで、Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。特定の一実施形態では、第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２～４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２～４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２～４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２～４３７４を含む。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化された配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインのフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１のヌクレオチド１７９２～４３７４、配列番号２のヌクレオチド１７９２～４３７４、配列番号７０のヌクレオチド１７９２～４３７４、または配列番号７１のヌクレオチド１７９２～４３７４）に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し；そしてここで、Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する。一実施形態では、第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、（ｉｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４、または（ｉｖ）配列番号７１のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインのフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１のヌクレオチド１７９２～４３７４、配列番号２のヌクレオチド１７９２～４３７４、配列番号７０のヌクレオチド１７９２～４３７４、または配列番号７１のヌクレオチド１７９２～４３７４）を含む。

【0262】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド５８から４３７４に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１のヌクレオチド５８～４３７４）または配列番号１のヌクレオチド５８から４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド１～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１のヌクレオチド１～４３７４）または配列番号１のヌクレオチド１から４３７４を含む。

【0263】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド５８～４３７４に対して少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４とに対して少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号２のヌクレオチド５８～４３７４）または配列番号２のヌクレオチド５８から４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド１～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号２のヌクレオチド１～４３７４）または配列番号２のヌクレオチド１から４３７４を含む。

【0264】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、配列番号７０のヌクレオチド５８～４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７０のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号７０のヌクレオチド５８～４３７４）に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、核酸配列は、配列番号７０に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７０のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号７０のヌクレオチド５８～４３７４）または配列番号７０のヌクレオチド５８から４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７０のヌクレオチド１～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号７０のヌクレオチド１～４３７４）または配列番号７０のヌクレオチド１から４３７４を含む。

【0265】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、配列番号７１のヌクレオチド５８～４３７４に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７１のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号７１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、核酸配列は、配列番号７１に対して少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７１のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号７１のヌクレオチド５８～４３７４）または配列番号７１のヌクレオチド５８から４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号７１のヌクレオチド１～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号７１のヌクレオチド１～４３７４）または配列番号７１のヌクレオチド１から４３７４を含む。

【0266】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド５８～４３７４に対して少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号３のヌクレオチド５８～４３７４）に対して少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号３に対して少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号３のヌクレオチド５８～４３７４）または配列番号３のヌクレオチド５８から４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号３のヌクレオチド１～４３７４）または配列番号３のヌクレオチド１から４３７４を含む。

【0267】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド５８～４３７４に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号４のヌクレオチド５８～４３７４）に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号４のヌクレオチド５８～４３７４）または配列番号４のヌクレオチド５８から４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド１～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号４のヌクレオチド１～４３７４）または配列番号４のヌクレオチド１から４３７４を含む。

【0268】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド５８～４３７４と少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド５８～４３７４）に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号５に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド５８～４３７４）または配列番号５のヌクレオチド５８から４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド１～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド１～４３７４）または配列番号５のヌクレオチド１から４３７４を含む。

【0269】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド５８～４３７４に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド５８～４３７４）に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号６に対して少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド５８～４３７４）または配列番号６のヌクレオチド５８から４３７４を含む。さらに他の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド１～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド１～４３７４）または配列番号６のヌクレオチド１から４３７４を含む。

【0270】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＦＶＩＩＩシグナルペプチドである。一部の実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、コドン最適化されている。特定の一実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１から５７；（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド１から５７；（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１から５７；（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１から５７；（ｖ）配列番号５のヌクレオチド１から５７；（ｖｉ）配列番号６のヌクレオチド１から５７；（ｖｉｉ）配列番号７０のヌクレオチド１から５７；（ｖｉｉｉ）配列番号７１のヌクレオチド１から５７；または（ｉｘ）配列番号６８のヌクレオチド１から５７に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。

【0271】

配列番号１～６、７０、および７１は、開始または「親」または「野生型」ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列である、配列番号１６の最適化されたバージョンである。配列番号１６は、Ｂドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩをコードする。配列番号１～６、７０、および７１は、ＦＶＩＩＩの特異的なＢドメイン欠失形態（配列番号１６）に由来するが、本開示は、ＦＶＩＩＩの他のバージョンをコードする核酸の最適化されたバージョンも含むと理解されるべきである。例えば、ＦＶＩＩＩの他のバージョンとして、全長ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩの他のＢドメイン欠失（本明細書に記載する）、またはＦＶＩＩＩ活性を保持するＦＶＩＩＩの他のフラグメントを挙げることができる。

【0272】

一実施形態において、遺伝子カセットは、表２Ａ～２Ｆに列挙されるポリヌクレオチド配列を含むＦＶＩＩＩ構築物を含む。一実施形態において、遺伝子カセットは、表２Ａに示されるポリヌクレオチド配列を含むＦＶＩＩＩ構築物を含む。一実施形態において、遺伝子カセットは、表２Ｂに列挙されるポリヌクレオチド配列を含むＦＶＩＩＩ構築物を含む。一実施形態において、遺伝子カセットは、表２Ｃに列挙されるポリヌクレオチド配列を含むＦＶＩＩＩ構築物を含む。一実施形態において、遺伝子カセットは、表２Ｄに列挙されるポリヌクレオチド配列を含むＦＶＩＩＩ構築物を含む。一実施形態において、遺伝子カセットは、表２Ｅに列挙されるポリヌクレオチド配列を含むＦＶＩＩＩ構築物を含む。一実施形態において、遺伝子カセットは、表２Ｆに列挙されるポリヌクレオチド配列を含むＦＶＩＩＩ構築物を含む。

【0273】

ある特定の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１７９、１８２、１８９、又は１９４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１７９のヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１８２のヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１８９のヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１９４のヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、単離された核酸分子は機能的ＦＶＩＩＩタンパク質を発現する能力を保持する。

【0274】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【0275】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【0276】

【表13】

【表14】

【表15】

【表16】

【表17】

【0277】

【表18】

【表19】

【表20】

【表21】

【表22】

【0278】

【表23】

【表24】

【表25】

【表26】

【表27】

【0279】

【表28】

【表29】

【表30】

【表31】

【表32】

【0280】

一実施形態において、遺伝子カセットは、表１０Ａ及び１０Ｂに列挙されるポリヌクレオチド配列を含むフェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）構築物を含む。一実施形態において、遺伝子カセットは、表１０Ａに示されるポリヌクレオチド配列を含むＰＡＨ構築物を含む。一実施形態において、遺伝子カセットは、表１０Ｂに示されるポリヌクレオチド配列を含むＰＡＨ構築物を含む。

【0281】

ある特定の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１９７又は１９８のヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１９７のヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１９８のヌクレオチド配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、単離された核酸分子は、機能的フェニルアラニン水酸化酵素を発現する能力を保持する。

【0282】

Ａ．コドン適応指数（Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）
一実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、コドン最適化されたヌクレオチド配列のヒトコドン適応指数は、配列番号１６に対して増加する。例えば、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）、少なくとも約０．８８（８８％）、少なくとも約０．８９（８９％）、少なくとも約０．９０（９０％）、少なくとも約０．９１（９１％）、少なくとも約０．９２（９２％）、少なくとも約０．９３（９３％）、少なくとも約０．９４（９４％）、少なくとも約０．９５（９５％）、少なくとも約０．９６（９６％）、少なくとも約０．９７（９７％）、少なくとも約０．９８（９８％）、または少なくとも約０．９９（９９％）であるヒトコドン適応指数を有し得る。一部の実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約．８８（８８％）であるヒトコドン適応指数を有する。他の実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約．９１（９１％）であるヒトコドン適応指数を有する。他の実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約．９７（９７％）であるヒトコドン適応指数を有する。

【0283】

特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１～１７９１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；ヌクレオチド配列のヒトコドン適応指数は、配列番号１６と比較して増加する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）、少なくとも約０．８８（８８％）、少なくとも約０．８９（８９％）、少なくとも約０．９０（９０％）、または少なくとも約．９１（９１％）であるヒトコドン適応指数を有する。特定の一実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．８８（８８％）であるヒトコドン適応指数を有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．９１（９１％）であるヒトコドン適応指数を有する。

【0284】

別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含むヌクレオチド配列を含み；ここで第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４または（ｉｉ）配列番号６の１７９２～２２７７および２３２０～４３７４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；ここでＮ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてヌクレオチド配列のヒトコドン適応指数は、配列番号１６と比較して増加する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）、または少なくとも約０．８８（８８％）であるヒトコドン適応指数を有する。特定の一実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．８３（８３％）であるヒトコドン適応指数を有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．８８（８８％）であるヒトコドン適応指数を有する。

【0285】

他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；そしてヌクレオチド配列のヒトコドン適応指数は、配列番号１６と比較して増加する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）、または少なくとも約０．８８（８８％）であるヒトコドン適応指数を有する。特定の一実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．７５（７５％）であるヒトコドン適応指数を有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．８３（８３％）であるヒトコドン適応指数を有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．８８（８８％）であるヒトコドン適応指数を有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．９１（９１％）であるヒトコドン適応指数を有する。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも約．９７（９７％）であるヒトコドン適応指数を有する。

【0286】

一部の実施形態では、本開示のＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較して増加した最適コドン頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｄｏｎ）（ＦＯＰ）を有する。ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列のＦＯＰは、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６４、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約７９、少なくとも約８０、少なくとも約８５、または少なくとも約９０である。

【0287】

他の実施形態では、本開示のＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較して増加した相対同義コドン使用頻度（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）（ＲＣＳＵ）を有する。一部の実施形態では、単離された核酸分子のＲＣＳＵは、１．５を超える。他の実施形態では、単離された核酸分子のＲＣＳＵは、２．０を超える。ある特定の実施形態では、単離された核酸分子のＲＣＳＵは、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２．０、少なくとも約２．１、少なくとも約２．２、少なくとも約２．３、少なくとも約２．４、少なくとも約２．５、少なくとも約２．６、または少なくとも約２．７である。

【0288】

さらに他の実施形態では、本開示のＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較して減少したコドンの有効数を有する。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、約５０より少ない、約４５より少ない、約４０より少ない、約３５より少ない、約３０より少ない、または約２５より少ないコドンの有効数を有する。特定の一実施形態では、単離された核酸分子は、約４０、約３５、約３０、約２５、または約２０のコドンの有効数を有する。

【0289】

Ｂ．Ｇ／Ｃ含量の最適化
一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージと比較してより高いパーセンテージのＧ／Ｃヌクレオチドを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、または少なくとも約６０％であるＧ／Ｃ含量を有する。

【0290】

特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１～１７９１に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；ここでＮ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてヌクレオチド配列は、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージと比較してより高いパーセンテージのＧ／Ｃヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、または少なくとも約５８％であるＧ／Ｃ含量を有する。特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも約５８％であるＧ／Ｃ含量を有する。

【0291】

別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４；（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４）、または（ｉｖ）配列番号６の１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；ここでＮ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６のＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージと比較してより高いパーセンテージのＧ／Ｃヌクレオチドを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、または少なくとも約５７％であるＧ／Ｃ含量を有する。特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約５２％であるＧ／Ｃ含量を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約５５％であるＧ／Ｃ含量を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約５７％であるＧ／Ｃ含量を有する。

【0292】

他の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列の（ｉ）ヌクレオチド５８～４３７４または（ｉｉ）ヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；そしてここでヌクレオチド配列は、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージと比較してより高いパーセンテージのＧ／Ｃヌクレオチドを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約４５％であるＧ／Ｃ含量を有する。特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約５２％であるＧ／Ｃ含量を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約５５％であるＧ／Ｃ含量を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約５７％であるＧ／Ｃ含量を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約５８％であるＧ／Ｃ含量を有する。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも約６０％であるＧ／Ｃ含量を有する。

【0293】

「Ｇ／Ｃ含量」（またはグアニン－シトシン含量）、または「Ｇ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージ」は、グアニンまたはシトシンのいずれかである、ＤＮＡ分子中の窒素塩基のパーセンテージを指す。Ｇ／Ｃ含量は、以下の式：

【数1】

を使用して計算することができる。

【0294】

ヒト遺伝子のＧ／Ｃ含量は非常に不均一であり、一部の遺伝子は２０％程度の低いＧ／Ｃ含量を有し、他の遺伝子は９５％程の高いＧ／Ｃ含量を有する。一般的に、Ｇ／Ｃリッチな遺伝子は、より高度に発現される。実際に、遺伝子のＧ／Ｃ含量の増加が、遺伝子発現の増加を導く場合があり、これはほとんどが転写の増加とｍＲＮＡレベルが非常に安定した状態であることに起因することが実証されている。Ｋｕｄｌａら、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．、４（６）：ｅ１８０（２００６）を参照のこと。

【0295】

Ｃ．マトリックス結合領域様配列
一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大６、最大５、最大４、最大３、または最大２個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大１個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有しない。

【0296】

特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１～１７９１に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；ここでＮ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大６、最大５、最大４、最大３、または最大２個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大１個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有しない。

【0297】

別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４；（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４）；または（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；ここでＮ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大６、最大５、最大４、最大３、または最大２個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大１個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有しない。

【0298】

他の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでコドン最適化されたヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、若しくは７１のヌクレオチド５８～４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、若しくは７１のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；そしてここでコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大６、最大５、最大４、最大３、または最大２個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大１個のＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含有しない。

【0299】

出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）自己複製配列（ＡＲＳ）及び核マトリックス付着領域（ＭＡＲ）と配列類似性を共有するヒトＦＶＩＩＩヌクレオチド配列におけるＡＴリッチエレメントが同定されている。（Ｆａｌｌｕｘ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １６：４２６４－４２７２ （１９９６）。これらのエレメントのうちの１つは、インビトロで核内因子に結合し、そしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子の発現を抑制することが実証されている。同上。これらの配列はヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の転写抑制に寄与する事ができるという仮設が立てられた。したがって、一実施形態において、全てのＭＡＲ／ＡＲＳ配列は、本開示のＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列において消失させられた。親ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）中に４つのＭＡＲ／ＡＲＳ ＡＴＡＴＴＴ配列（配列番号２１）及び３つのＭＡＲ／ＡＲＳ ＡＡＡＴＡＴ配列（配列番号２２）がある。最適化されたＦＶＩＩＩ配列においてＭＡＲ／ＡＲＳ配列を破壊するようにこれらの部位の全てを変異させた（配列番号１～６）。これらのエレメントの各々の位置、及び最適化された配列における対応するヌクレオチドの配列を以下の表３に示す。

【0300】

【表33】

【表34】

【0301】

Ｄ．不安定化配列
一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大９、最大８、最大７、最大６、または最大５個の不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大４、最大３、最大２、または最大１個の不安定化エレメントを含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含有しない。

【0302】

特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１～１７９１に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；ここでＮ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大９、最大８、最大７、最大６、または最大５個の不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大４、最大３、最大２、または最大１個の不安定化エレメントを含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含有しない。

【0303】

別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４；（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４）；または（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最大９、最大８、最大７、最大６、または最大５個の不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大４、最大３、最大２、または最大１個の不安定化エレメントを含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含有しない。

【0304】

他の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでコドン最適化されたヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大９、最大８、最大７、最大６、または最大５個の不安定化エレメントを含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大４、最大３、最大２、または最大１個の不安定化エレメントを含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含有しない。

【0305】

親ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）には１０個の不安定化エレメント：６個のＡＴＴＴＡ配列（配列番号２３）および４個のＴＡＡＡＴ配列（配列番号２４）が存在する。一実施形態では、これらの部位の配列を変異して、最適化されたＦＶＩＩＩの配列番号１～６、７０、および７１における不安定化エレメントを破壊した。これらのエレメントのそれぞれの位置、および最適化された配列における対応するヌクレオチドの配列を表３に示す。

【0306】

Ｅ．潜在的プロモーター結合部位
一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大９、最大８、最大７、最大６、または最大５個の潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大４、最大３、最大２、または最大１個の潜在的プロモーター結合部位を含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含有しない。

【0307】

特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１～１７９１に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大９、最大８、最大７、最大６、または最大５個の潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大４、最大３、最大２、または最大１個の潜在的プロモーター結合部位を含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含有しない。

【0308】

別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４；（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４）；または（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大９、最大８、最大７、最大６、または最大５個の潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大４、最大３、最大２、または最大１個の潜在的プロモーター結合部位を含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含有しない。

【0309】

他の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１６と比較してより少ない潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大９、最大８、最大７、最大６、または最大５個の潜在的プロモーター結合部位を含有する。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、最大４、最大３、最大２、または最大１個の潜在的プロモーター結合部位を含有する。なお他の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含有しない。

【0310】

ＴＡＴＡボックスは、真核生物のプロモーター領域において見出されることが多い調節配列である。これらは、一般的な転写因子であるＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）の結合部位としての役割を果たす。ＴＡＴＡボックスは、通常、配列ＴＡＴＡＡ（配列番号２８）またはそれに近いバリアントを含む。しかしながら、コード配列内のＴＡＴＡボックスは、全長タンパク質の翻訳を阻害し得る。野生型ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）には、１０個の潜在的プロモーター結合配列：５個のＴＡＴＡＡ配列（配列番号２８）および５個のＴＴＡＴＡ配列（配列番号２９）が存在する。一部の実施形態では、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４個のプロモーター結合部位が、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において消失する。一部の実施形態では、少なくとも５個のプロモーター結合部位が、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において消失する。他の実施形態では、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８個のプロモーター結合部位が、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において消失する。一実施形態では、少なくとも９個のプロモーター結合部位が、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において消失する。特定の一実施形態では、全てのプロモーター結合部位が、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において消失する。各潜在的プロモーター結合部位の位置および最適化された配列における対応するヌクレオチドの配列を表３に示す。

【0311】

Ｆ．他のＣｉｓ作用型ネガティブ調節エレメント
上述のＭＡＲ／ＡＲＳ配列、不安定化エレメント、および潜在的プロモーター部位に加えて、いくつかのさらなる潜在的阻害配列を、野生型ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）において特定することができる。２つのＡＵリッチ配列エレメント（ＡＲＥ）を、最適化されていないＢＤＤ ＦＶＩＩＩ配列におけるポリＡ部位（ＡＡＡＡＡＡＡ；配列番号２６）、ポリＴ部位（ＴＴＴＴＴＴ；配列番号２５）、およびスプライス部位（ＧＧＴＧＡＴ；列番号２７）と一緒に特定することができる（ＡＴＴＴＴＡＴＴ（配列番号３０）；およびＡＴＴＴＴＴＡＡ（配列番号３１））。１つまたはそれ以上のこれらのエレメントは、最適化されたＦＶＩＩＩ配列から除去することができる。これらの部位のそれぞれの位置および最適化された配列における対応するヌクレオチドの配列を表３に示す。

【0312】

ある特定の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１～１７９１に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、１つまたはそれ以上のｃｉｓ作用型ネガティブ調節エレメント、例えば、スプライス部位、ポリＴ配列、ポリＡ配列、ＡＲＥ配列、またはそれらの任意の組合せを含有しない。

【0313】

別の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第二の核酸配列は、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４；（ｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４；（ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号５のヌクレオチド１７９２～４３７４）；または（ｉｖ）配列番号６のヌクレオチド１７９２～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号６のヌクレオチド１７９２～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、１つまたはそれ以上のｃｉｓ作用型ネガティブ調節エレメント、例えば、スプライス部位、ポリＴ配列、ポリＡ配列、ＡＲＥ配列、またはそれらの任意の組合せを含有しない。

【0314】

他の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、１つまたはそれ以上のｃｉｓ作用型ネガティブ調節エレメント、例えば、スプライス部位、ポリＴ配列、ポリＡ配列、ＡＲＥ配列、またはそれらの任意の組合せを含有しない。

【0315】

一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１～１７９１に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、スプライス部位ＧＧＴＧＡＴ（配列番号２７）を含有しない。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１～１７９１に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ポリＴ配列（配列番号２５）を含有しない。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１～１７９１に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ポリＡ配列（配列番号２６）を含有しない。一部の実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第一の核酸配列およびＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第二の核酸配列を含み；ここで第一の核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド５８～１７９１；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１～１７９１；（ｉｉｉ）配列番号４のヌクレオチド５８～１７９１；または（ｉｖ）配列番号４のヌクレオチド１～１７９１に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し；Ｎ末端部分とＣ末端部分は一緒に、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し；コドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＡＲＥエレメント（配列番号３０または配列番号３１）を含有しない。

【0316】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでコドン最適化されたヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、スプライス部位ＧＧＴＧＡＴ（配列番号２７）を含有しない。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでコドン最適化されたヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ポリＴ配列（配列番号２５）を含有しない。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、ここでコドン最適化されたヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ポリＡ配列（配列番号２６）を含有しない。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含み、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～４３７４または（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０、および７１から選択されるアミノ酸配列のヌクレオチド５８～２２７７および２３２０～４３７４（すなわち、ＢドメインまたはＢドメインフラグメントをコードするヌクレオチドを含まない配列番号１、２、３、４、５、６、７０、または７１のヌクレオチド５８～４３７４）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み；そしてコドン最適化されたヌクレオチド配列は、ＡＲＥエレメント（配列番号３０または配列番号３１）を含有しない。

【0317】

他の実施形態では、本開示の最適化されたＦＶＩＩＩ配列は、１つまたはそれ以上の抗ウイルスモチーフ、ステムループ構造、およびリピート配列を含まない。

【0318】

さらに他の実施形態では、転写開始部位を囲むヌクレオチドを、コザックコンセンサス配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣ（配列番号３２）、配列中、下線を付したヌクレオチドは開始コドンである。）に変更する。他の実施形態では、クローニングプロセスを促進するために制限部位を付加または除去してもよい。

【0319】

ｂ．ＦＩＸタンパク質をコードするＦＩＸおよびポリヌクレオチド配列
一部の実施形態では、核酸分子は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含み、ここで標的配列は治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質はＦＩＸポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸまたはそのバリアントもしくはフラグメントを含み、ＦＩＸまたはそのバリアントもしくはフラグメントは、ＦＩＸ活性を有する。

【0320】

ヒトＦＩＸは、血液凝固カスケードの内因的経路の重要な構成成分であるセリンプロテアーゼである。「第ＩＸ因子」または「ＦＩＸ」は、本明細書で使用されるように、凝固因子タンパク質ならびにその種および配列バリアントを指し、これらとしては、限定されないが、ヒトＦＩＸ前駆体ポリペプチド（「プレプロ」）の４６１単鎖アミノ酸配列、成熟ヒトＦＩＸ（配列番号１２５）の４１５単鎖アミノ酸配列、およびＲ３３８Ｌ ＦＩＸ（Ｐａｄｕａ）バリアント（配列番号１２６）が挙げられる。ＦＩＸは、血液凝固ＦＩＸの典型的な特徴を有する任意の形態のＦＩＸ分子を含む。本明細書で使用されるように、「第ＩＸ因子」および「ＦＩＸ」は、ドメインＧｌａ（γ－カルボキシグルタミン酸残基を含有する領域）、ＥＧＦ１およびＥＧＦ２（ヒト上皮成長因子と相同な配列を含有する領域）、活性化ペプチド（成熟ＦＩＸの残基Ｒ１３６～Ｒ１８０によって形成される「ＡＰ」）、およびＣ末端プロテアーゼドメイン（「Ｐｒｏ」）、もしくは当技術分野で公知のこれらのドメインのシノニムを含むポリペプチドを包含することを意図されるか、またはネイティブタンパク質の生体活性の少なくとも一部を保持するトランケートされたフラグメントもしくは配列バリアントであり得る。ＦＩＸまたは配列バリアントは、米国特許第４，７７０，９９９号および同第７，７００，７３４号に記載されているようにクローニングされ、ヒトＦＩＸをコードするｃＤＮＡが単離、特徴付けされ、そして発現ベクターへとクローニングされている（例えば、Ｃｈｏｏら、Ｎａｔｕｒｅ ２９９：１７８～１８０（１９８２）；Ｆａｉｒら、Ｂｌｏｏｄ ６４：１９４～２０４（１９８４）；およびＫｕｒａｃｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：６４６１～６４６４（１９８２）を参照のこと）。Ｓｉｍｉｏｎｉら、２００９によって特徴付けられるＦＩＸの１つの特定のバリアントである、Ｒ３３８Ｌ ＦＩＸ（Ｐａｄｕａ）バリアント（配列番号２）は、ネイティブＦＩＸに対してＰａｄｕａバリアントの活性がほぼ８倍増加して相関する機能獲得型変異を含む（表４）。ＦＩＸバリアントは、ＦＩＸポリペプチドのＦＩＸ活性に影響を及ぼさない１つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換を有する任意のＦＩＸポリペプチドも含むことができる。一部の実施形態では、ＦＩＸバリアントは、切断可能なリンカーによって融合したｒＦＩＸアルブミン、例えば、ＩＤＥＬＶＩＯＮ（登録商標）を含む。参照によってその全体として本明細書に組み入れる、ＵＳ７，９３９，６３２を参照のこと。

【0321】

【表35】

【表36】

【表37】

【0322】

ＦＩＸポリペプチドは、５５ｋＤａであり、３つの領域：２８アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号１２７のアミノ酸１から２８）、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化に必要とされる１８アミノ酸のプロペプチド（アミノ酸２９から４６）、および４１５アミノ酸の成熟した第ＩＸ因子（配列番号１２５または１２６）から構成されるプレプロポリペプチド（ｐｒｅｐｒｏｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）鎖（配列番号１２５）として合成される。プロペプチドは、ガンマカルボキシグルタメートドメインに対してＮ末端の１８アミノ酸残基の配列である。プロペプチドは、ビタミンＫ依存性ガンマカルボキシラーゼに結合し、次いで、内因性プロテアーゼ、最も可能性が高いものとして、フューリンまたはＰＣＳＫ３としても公知であるＰＡＣＥ（対合塩基性アミノ酸切断酵素）によって、ＦＩＸの前駆体ポリペプチドから切断される。ガンマカルボキシル化しなければ、Ｇｌａドメインは、負に帯電したリン脂質表面にタンパク質をつなぎとめるのに必要な正確な立体配座を取るためにカルシウムに結合することができず、それによって、第ＩＸ因子は非機能的となる。カルボキシル化される場合でさえ、Ｇｌａドメインはまた、適切な機能のためのプロペプチドの開裂に依存しており、これは、保持されたプロペプチドが、カルシウムおよびリン脂質に対する最適な結合に必要なＧｌａドメインの立体配座変化に干渉するためである。ヒトでは、結果として生じる成熟した第ＩＸ因子は、肝細胞によって、およそ１７重量％の炭水化物を含有する４１５アミノ酸残基の単鎖タンパク質である不活性な酵素前駆体として、血流中に分泌される（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｅ．ら（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ、１３：３９）。

【0323】

成熟ＦＩＸは、ＮからＣ末端の立体配置において、ＧＬＡドメイン、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ２ドメイン、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメイン、およびプロテアーゼ（または触媒）ドメインであるいくつかのドメインから構成される。短いリンカーは、ＡＰドメインを含むＥＧＦ２ドメインに接続する。ＦＩＸは、それぞれ、Ｒ１４５～Ａ１４６およびＲ１８０～Ｖ１８１によって形成される２つの活性化ペプチドを含有する。活性化の後、単鎖ＦＩＸは、２つの鎖がジスルフィド結合によって連結される２鎖分子となる。凝固因子を、それらの活性化ペプチドを置き換えることによって操作し、活性化特異性の変更をもたらすことができる。哺乳動物では、成熟ＦＩＸは、第ＩＸａ因子を得るために、活性化した第ＸＩ因子によって活性化されなければならない。ＦＩＸからＦＩＸａへの活性化の際に、プロテアーゼドメインは、ＦＩＸの触媒活性をもたらす。活性化した第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）は、ＦＩＸａ活性の全発現に対する特異的補因子である。

【0324】

ある特定の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、血漿由来のＦＩＸのＴｈｒ１４８対立形質を含み、内因性ＦＩＸに類似する構造的かつ機能的特徴を有する。

【0325】

多くの機能的ＦＩＸバリアントが当技術分野で公知である。国際特許出願公開第ＷＯ０２／０４０５４４Ａ３号は、４頁、９～３０行および１５頁、６～３１行に、ヘパリンによる阻害に対する耐性の増加を呈する変異体を開示している。国際特許出願公開第ＷＯ０３／０２０７６４Ａ２号は、表２および３（１４～２４頁）、および１２頁、１～２７行に、Ｔ細胞の免疫原性が低下したＦＩＸ変異体を開示している。国際特許出願公開第ＷＯ２００７／１４９４０６Ａ２号は、４頁、１行から１９頁、１１行に、タンパク質安定性の増加、インビボおよびインビトロ半減期の増加、ならびにプロテアーゼに対する耐性の増加を呈する機能的変異体のＦＩＸ分子を開示している。ＷＯ２００７／１４９４０６Ａ２は、１９頁、１２行から２０頁、９行に、キメラおよび他のバリアントＦＩＸ分子も開示している。国際特許出願公開第ＷＯ０８／１１８５０７Ａ２号は、５頁、１４行から６頁、５行に、凝固活性の増加を呈するＦＩＸ変異体を開示している。国際特許出願公開第ＷＯ０９／０５１７１７Ａ２号は、９頁、１１行から２０頁、２行に、半減期の増加および／または回復をもたらすＮ連結および／またはＯ連結グリコシル化部位数が増加したＦＩＸ変異体を開示している。国際特許出願公開第ＷＯ０９／１３７２５４Ａ２号は、２頁、段落［００６］から５頁、段落［０１１］および１６頁、段落［０４４］から２４頁、段落［０５７］に、グリコシル化部位数の増加した第ＩＸ因子変異体を開示している。国際特許出願公開第ＷＯ０９／１３０１９８Ａ２号は、４頁、２６行から１２頁、６行に、半減期の増加をもたらす、グリコシル化部位数が増加した機能的変異体ＦＩＸ分子を開示している。国際特許出願公開第ＷＯ０９／１４００１５Ａ２号は、１１頁、段落［００４３］から１３頁、段落［００５３］に、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）のコンジュゲーションのために使用することができるＣｙｓ残基数の増加した機能的ＦＩＸ変異体を開示している。２０１１年７月１１日に出願され、２０１２年１月１２日にＷＯ２０１２／００６６２４として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６９号に記載されたＦＩＸポリペプチドはまた、参照によってその全体として本明細書に組み入れる。一部の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、アルブミンに融合したＦＩＸポリペプチド、例えば、ＦＩＸ－アルブミンを含む。ある特定の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、ＩＤＥＬＶＩＯＮ（登録商標）またはｒＩＸ－ＦＰである。

【0326】

さらに、ＦＩＸにおける数百もの非機能的変異が、血友病対象において同定され、それらの多くは、国際特許出願公開第ＷＯ０９／１３７２５４Ａ２号の１１～１４頁の表６に開示されている。このような非機能的変異は、本発明に含まれないが、変異が機能的ＦＩＸポリペプチドを生じる可能性が多少ある追加のガイダンスを提供する。

【0327】

一実施形態では、ＦＩＸポリペプチド（または融合ポリペプチドの第ＩＸ因子部分）は、配列番号１もしくは２に示す配列（配列番号１２５または１２６のアミノ酸１から４１５）、またはあるいは、プロペプチド配列、もしくはプロペプチドおよびシグナル配列（全長のＦＩＸ）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、配列番号２に示す配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0328】

ＦＩＸ凝固活性は、国際単位（ＩＵ）として表される。ＦＩＸ活性の１ＩＵは、正常なヒト血漿１ミリリットル中のＦＩＸの量に概ね相当する。一段階凝固アッセイ（活性化部分トロンボプラスチン時間；ａＰＴＴ）、トロンビン生成時間（ＴＧＡ）および回転トロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ（登録商標））を含む、ＦＩＸ活性を測定するためのいくつかのアッセイが利用可能である。本発明は、ＦＩＸの生体活性もしくは生物学的機能の少なくとも一部を保持し、かつ／または凝固因子に関連する疾患、欠乏症、障害もしくは状態（例えば、外傷、手術に関連する、凝固因子の欠乏症に関する出血エピソード）を予防、処置、媒介、もしくは軽快するのに有用な、天然の、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、哺乳動物（飼育動物を含む）に由来するＦＩＸ配列、配列フラグメントに対して相同性を有する配列、および非天然の配列バリアントを企図する。ヒトＦＩＸに対して相同性を有する配列は、標準的な相同性検索技術、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって見出され得る。

【0329】

ある特定の実施形態では、ＦＩＸ配列は、コドン最適化されている。コドン最適化されたＦＩＸ配列の例として、これらに限定されないが、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、国際公開第ＷＯ２０１６／００４１１３ Ａ１号の配列番号１および５４～５８が挙げられる。

【0330】

ｃ．ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列
一部の実施形態では、核酸分子は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含み、ここで標的配列は治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質は第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ活性を有するそのバリアントもしくはフラグメントを含む。

【0331】

「第ＶＩＩ因子」（「ＦＶＩＩ」、または「Ｆ７」；第７因子、凝固因子ＶＩＩ、血清因子ＶＩＩ、血清プロトロンビン変換促進剤、ＳＰＣＡ、プロコンベルチンおよびエプタコグアルファとも称される）は、凝固カスケードの一部であるセリンプロテアーゼである。一実施形態では、本明細書に記載の核酸における凝固因子は、ＦＶＩＩである。組換え活性型第ＶＩＩ因子（「ＦＶＩＩ」）は、血友病ＡもしくはＢ、第ＸＩ凝固因子、ＦＶＩＩの欠乏症、不完全な血小板機能、血小板減少症、またはフォンビルブランド病を有する患者において起こるものなどの大出血の処置に広く使用されるようになった。

【0332】

組換え活性型ＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩａ；ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標））は、（ｉ）ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する中和抗体（阻害剤）を有する血友病患者、（ｉｉ）ＦＶＩＩ欠乏症を有する患者、または（ｉｉｉ）血友病ＡもしくはＢを有する患者における出血エピソードを、外科手技を経て、阻害剤で処置するために使用される。しかしながら、ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標）は、不十分な効能しか示さない。組織因子の非存在下での活性化血小板に対する低い親和性、短い半減期、および不十分な酵素活性によって、出血を制御するために、高濃度でのＦＶＩＩａの繰り返し投与が必要とされることが多い。したがって、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ阻害剤を有するおよび／またはＦＶＩＩ欠損症を有する血友病患者に対するより良い処置および予防の選択肢には、満たされていない医学的需要が存在する。

【0333】

一実施形態では、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩの成熟形態またはそのバリアントをコードする。ＦＶＩＩは、Ｇｌａドメイン、２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ－１およびＥＧＦ－２）、および、例えば、キモトリプシンに関するような、セリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリーの全メンバーの間で高度に保存されているセリンプロテアーゼドメイン（またはペプチダーゼＳ１ドメイン）を含む。ＦＶＩＩは、単鎖酵素前駆体（すなわち、活性化可能なＦＶＩＩ）および十分に活性化した二本鎖形態として生じる。

【0334】

Ｃ．増殖因子
一部の実施形態では、核酸分子は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、および評定配列をコードする遺伝子カセットを含み、ここで標的配列は治療用タンパク質をコードし、そして治療用タンパク質は増殖因子を含む。増殖因子は、当技術分野で公知の任意の増殖因子から選択することができる。一部の実施形態では、増殖因子はホルモンである。他の実施形態では、増殖因子はサイトカインである。一部の実施形態では、増殖因子はケモカインである。

【0335】

一部の実施形態では、増殖因子はアドレノメデュリン（ＡＭ）である。一部の実施形態では、増殖因子はアンギオポエチン（Ａｎｇ）である。一部の実施形態では、増殖因子は自己分泌型細胞運動刺激因子である。一部の実施形態では、増殖因子は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）である。一部の実施形態では、ＢＭＰは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ７から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は毛様体神経栄養因子ファミリーのメンバーである。一部の実施形態では、毛様体神経栄養因子ファミリーのメンバーは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）から選択される。一部の実施形態では、増殖因子はコロニー刺激因子である。一部の実施形態では、コロニー刺激因子は、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）から選択される。一部の実施形態では、増殖因子は上皮増殖因子（ＥＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子はエフリンである。一部の実施形態では、エフリンは、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、およびエフリンＢ３から選択される。一部の実施形態では、増殖因子はエリスロポエチン（ＥＰＯ）である。一部の実施形態では、増殖因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である。一部の実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３から選択される。一部の実施形態では、増殖因子はウシ胎仔ソマトトロピン（ＦＢＳ）である。一部の実施形態では、増殖因子はＧＤＮＦファミリーメンバーである。一部の実施形態では、ＧＤＮＦファミリーメンバーは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン、およびアルテミンから選択される。一部の実施形態では、増殖因子は成長分化因子－９（ＧＤＦ９）である。一部の実施形態では、増殖因子は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は肝細胞腫由来増殖因子（ＨＤＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子はインスリンである。一部の実施形態では、増殖因子はインスリン様増殖因子である。一部の実施形態では、インスリン様増殖因子はインスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）またはＩＧＦ－２である。一部の実施形態では、増殖因子はインターロイキン（ＩＬ）である。一部の実施形態では、ＩＬは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、およびＩＬ－７から選択される。一部の実施形態では、増殖因子はケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は遊走刺激因子（ＭＳＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子はマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰまたは肝細胞増殖因子様タンパク質（ＨＧＦＬＰ））である。一部の実施形態では、増殖因子はミオスタチン（ＧＤＦ－８）である。一部の実施形態では、増殖因子はニューレグリンである。一部の実施形態では、ニューレグリンは、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４から選択される。一部の実施形態では、増殖因子はニューロトロフィンである。一部の実施形態では、増殖因子は脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は神経成長因子（ＮＧＦ）である。一部の実施形態では、ＮＧＦは、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）またはＮＴ－４である。一部の実施形態では、増殖因子は胎盤増殖因子（ＰＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子はレナラーゼ（ＲＮＬＳ）である。一部の実施形態では、増殖因子はＴ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）である。一部の実施形態では、増殖因子はトロンボポエチン（ＴＰＯ）である。一部の実施形態では、増殖因子は形質転換増殖因子である。一部の実施形態では、形質転換増殖因子は形質転換増殖因子－アルファ（ＴＧＦ－α）またはＴＧＦ－βである。一部の実施形態では、増殖因子は腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）である。一部の実施形態では、増殖因子は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。

【0336】

Ｄ．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、翻訳を阻害するかまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解を誘導することによって、遺伝子発現を負に調節する非コードＲＮＡ小分子（約１８～２２ヌクレオチド）である。これらの発見以来、ｍｉＲＮＡは、アポトーシス、分化および細胞増殖を含む様々な細胞プロセスに関係し、発癌において重要な役割を果たすことが示されてきた。遺伝子発現を調節するｍｉＲＮＡの能力によって、ｍｉＲＮＡのインビボでの発現は遺伝子療法において有益なツールとなる。

【0337】

本開示のある特定の態様は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含むプラスミド様核酸分子に関し、ここで標的配列はｍｉＲＮＡをコードし、そして第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲが、非アデノ随伴ウイルスのＩＴＲである（例えば、第一のＩＴＲおよび／または第二のＩＴＲは、非ＡＡＶに由来する）。ｍｉＲＮＡは、当技術分野で公知のいずれのｍｉＲＮＡでもよい。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を下方調節する。ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、ＳＯＤ１、ＨＴＴ、ＲＨＯ、またはそれらの任意の組合せから選択される。

【0338】

一部の実施形態では、遺伝子カセットは１つのｍｉＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは１つより多いｍｉＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは２つまたはそれ以上の異なるｍｉＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、同一のｍｉＲＮＡのうちの２つまたはそれ以上の複製をコードする。一部の実施形態では、遺伝子カセットは、同一の治療用タンパク質のうちの２つまたはそれ以上のバリアントをコードする。ある特定の実施形態では、遺伝子カセットは、１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡおよび１つまたはそれ以上の治療用タンパク質をコードする。

【0339】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、操作されたｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、人工的ｍｉＲＮＡである。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、Ｅｖｅｒｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２６（９）：１～１５頁（２０１８年６月に印刷に先立って電子的に公開された）に開示されているｍｉＨＴＴにより操作されたｍｉＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、Ｄｉｒｒｅｎら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２（２）：１６７～８４頁（２０１５年２月）に開示されているｍｉＲ ＳＯＤ１という人工的ｍｉＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＲＨＯを標的とするｍｉＲ－７０８を含む（Ｂｅｈｒｍａｎら、ＪＣＢ １９２（６）：９１９～２７頁（２０１１）を参照のこと）。

【0340】

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、遺伝子の阻害因子の発現を下方調節することによって遺伝子の発現を上方調節する。一部の実施形態では、阻害因子は、天然の、例えば、野生型の阻害因子である。一部の実施形態では、阻害因子は、変異した、異種の、および／また誤って発現した遺伝子に起因する。

【0341】

Ｅ．異種部分
一部の実施形態では、核酸分子は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットを含み、ここで標的配列は治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質は少なくとも１つの異種部分を含む。一部の実施形態では、異種部分は、治療用タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合される。他の実施形態では、異種部分は、治療用タンパク質内の２つのアミノ酸の間に挿入される。

【0342】

一部の実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＶＩＩＩポリペプチドおよびＦＶＩＩＩポリペプチド内の２つのアミノ酸の間に挿入される異種部分を含む。一部の実施形態では、異種部分は、表５から選択される１つまたはそれ以上の挿入部位で、ＦＶＩＩＩポリペプチド内に挿入される。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１２３４５７Ａ１号、同第ＷＯ２０１５／１０６０５２Ａ１号または米国出願公開第２０１５／０１５８９２９Ａ１号に開示されている任意の部位で、本開示の核酸分子によってコードされる凝固因子ポリペプチド内に挿入され得る。特定の一実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＶＩＩＩおよび異種部分を含み、ここで異種部分は、成熟ＦＶＩＩＩに対してアミノ酸７４５のすぐ下流でＦＶＩＩＩ内に挿入される。特定の一実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＶＩＩＩおよびＸＴＥＮを含み、ＸＴＥＮは、成熟ＦＶＩＩＩに対してアミノ酸７４５のすぐ下流でＦＶＩＩＩ内に挿入される。特定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩは、ヒト成熟ＦＶＩＩＩ（配列番号１５）に対応する、７４６～１６４６位のアミノ酸の欠失を含み、そして異種部分はヒト成熟ＦＶＩＩＩ（配列番号１５）に対応する、アミノ酸７４５のすぐ下流に挿入される。

【0343】

【表38】

【0344】

一部の実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドおよびＦＩＸポリペプチド内の２つのアミノ酸の間に挿入される異種部分を含む。一部の実施形態では、異種部分は、表５から選択される１つまたはそれ以上の挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入される。一部の実施形態では、異種アミノ酸配列は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１５８７９号に開示される任意の部位で、本開示の核酸分子によってコードされる凝固因子ポリペプチド内に挿入され得る。特定の一実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドおよび異種部分を含み、異種部分は、成熟ＦＩＸに対してアミノ酸１６６のすぐ下流でＦＩＸポリペプチド内に挿入される。特定の一実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドおよびＸＴＥＮを含み、ここでＸＴＥＮは、成熟ＦＶＩＩＩに対してアミノ酸１６６のすぐ下流でＦＩＸ内に挿入される。

【0345】

【表39】

【0346】

他の実施形態では、本開示の治療用タンパク質は、２、３、４、５、６、７、または８個の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、全ての異種部分は同一である。一部の実施形態では、少なくとも１つの異種部分は他の異種部分と異なる。一部の実施形態では、本開示は、２、３、４、５、６個、または７個より多い異種部分をタンデムに含んでいてもよい。

【0347】

一部の実施形態では、異種部分は、治療用タンパク質の半減期を増加させる（「半減期延長剤」である）。

【0348】

一部の実施形態では、異種部分は、本開示のタンパク質に組み込まれた場合に、インビボ半減期の延長と関連する非構造的特徴または構造的特徴のいずれかを有するペプチドまたはポリペプチドである。非限定例として、アルブミン、アルブミンフラグメント、免疫グロブリンのＦｃフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＨＡＰ配列、ＸＴＥＮ配列、トランスフェリンもしくはそのフラグメント、ＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、アルブミン結合部分、またはこれらのポリペプチドの任意のフラグメント、誘導体、バリアント、もしくは組合せが挙げられる。特定の一実施形態では、異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、トランスフェリン、アルブミン、またはＰＡＳ配列である。一部の態様では、異種部分は、フォンビルブランド因子またはそのフラグメントを含む。他の関連する態様では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらのエレメントの任意の誘導体、バリアント、もしくは組合せのような非ポリペプチド部分に対する結合部位（例えば、システインアミノ酸）を含んでいてもよい。一部の態様では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらのエレメントの任意の誘導体、バリアント、もしくは組合せのような非ポリペプチド部分に対する結合部位として機能するシステインアミノ酸を含む。

【0349】

具体的な一実施形態では、第一の異種部分は、当技術分野で公知の半減期延長分子であり、第二の異種部分は、当技術分野で公知の半減期延長分子である。ある特定の実施形態では、第一の異種部分（例えば、第一のＦｃ部分）および第二の異種部分（例えば、第二のＦｃ部分）は、互いに会合して二量体を形成する。一実施形態では、第二の異種部分は第二のＦｃ部分であり、ここで第二のＦｃ部分は、第一の異種部分、例えば、第一のＦｃ部分に連結するかまたはそれと会合する。例えば、第二の異種部分（例えば、第二のＦｃ部分）は、リンカーによって第一の異種部分（例えば、第一のＦｃ部分）に連結されるかまたは共有結合もしくは非共有結合によって第一の異種部分と会合することができる。

【0350】

一部の実施形態では、異種部分は、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２５００、少なくとも約３０００、または少なくとも約４０００個のアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるポリペプチドである。他の実施形態では、異種部分は、約１００から約２００個のアミノ酸、約２００から約３００個のアミノ酸、約３００から約４００個のアミノ酸、約４００から約５００個のアミノ酸、約５００から約６００個のアミノ酸、約６００から約７００個のアミノ酸、約７００から約８００個のアミノ酸、約８００から約９００個のアミノ酸、または約９００から約１０００個のアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるポリペプチドである。

【0351】

ある特定の実施形態では、異種部分は、その生体活性または機能に重大な影響を及ぼすことなく、治療用タンパク質の１つまたはそれ以上の薬物動態特性を改善する。

【0352】

ある特定の実施形態では、異種部分は、本開示の治療用タンパク質のインビボおよび／またはインビトロ半減期を増加させる。他の実施形態では、異種部分は、本開示の治療用タンパク質またはそのフラグメント（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質のタンパク質切断後の異種部分を含むフラグメント）の可視化または局在化を促進する。本開示の治療用タンパク質またはそのフラグメントの可視化および／または位置は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、またはこれらの組合せである。

【0353】

他の実施形態では、異種部分は、本開示の治療用タンパク質またはそのフラグメント（例えば、治療用タンパク質、例えば、凝固因子のタンパク質切断後の異種部分を含むフラグメント）の安定性を増加させる。本明細書で使用されるように、用語「安定性」は、環境条件（例えば、温度上昇または低下）に応じて、治療用タンパク質の１つまたはそれ以上の物理特性の維持についての当技術分野で認識される尺度を指す。ある特定の態様では、物理特性は、治療用タンパク質の共有結合による構造の維持（例えば、タンパク質分解、望ましくない酸化または脱アミド化のないこと）である。他の態様では、物理特性は、正確にフォールディングされた状態の治療用タンパク質の存在（例えば、可溶性または不溶性の凝集または沈殿のないこと）でもある。一態様では、治療用タンパク質の安定性は、治療用タンパク質の生体物理特性、例えば、温度安定性、ｐＨアンフォールディングプロファイル、グリコシル化の安定な除去、溶解度、生化学的機能（例えば、タンパク質、レセプターまたはリガンドに結合する能力）など、および／またはこれらの組合せをアッセイすることにより測定される。別の態様では、生化学的機能は、相互作用の結合親和性により実証される。一態様では、タンパク質安定性の尺度は、熱安定性、すなわち、熱の負荷に対する耐性である。安定性は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＤＬＳ（動的光散乱）などのような当技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。熱安定性を測定する方法として、これらに限定されないが、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）、円二色性（ＣＤ）、および熱負荷アッセイが挙げられる。

【0354】

ある特定の態様では、本開示の核酸分子によってコードされる治療用タンパク質は、少なくとも１つの半減期延長剤、すなわち、治療用タンパク質のインビボ半減期を、異種部分を欠く対応する治療用タンパク質のインビボ半減期に対して増加させる、このような異種部分を含む。治療用タンパク質のインビボ半減期は、当業者に公知の任意の方法、例えば、活性アッセイ（例えば、治療用タンパク質がＦＶＩＩＩポリペプチドを含む発色アッセイまたは一段階凝固ａＰＴＴアッセイ）、ＥＬＩＳＡ、ＲＯＴＥＭ（登録商標）などによって決定することができる。

【0355】

一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の半減期延長剤の存在は、治療用タンパク質の半減期を、このような１つまたはそれ以上の半減期延長剤を欠く対応するタンパク質の半減期と比較して増加させる。半減期延長剤を含む治療用タンパク質の半減期は、このような半減期延長剤を欠く対応する治療用タンパク質のインビボ半減期より、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、または少なくとも約１２倍長い。

【0356】

一実施形態では、半減期延長剤を含む治療用タンパク質の半減期は、このような半減期延長剤を欠く対応するタンパク質のインビボ半減期より、約１．５倍から約２０倍、約１．５倍から約１５倍、または約１．５倍から約１０倍長い。別の実施形態では、半減期延長剤を含む治療用タンパク質の半減期は、このような半減期延長剤を欠く対応するタンパク質のインビボ半減期と比較して、約２倍から約１０倍、約２倍から約９倍、約２倍から約８倍、約２倍から約７倍、約２倍から約６倍、約２倍から約５倍、約２倍から約４倍、約２倍から約３倍、約２．５倍から約１０倍、約２．５倍から約９倍、約２．５倍から約８倍、約２．５倍から約７倍、約２．５倍から約６倍、約２．５倍から約５倍、約２．５倍から約４倍、約２．５倍から約３倍、約３倍から約１０倍、約３倍から約９倍、約３倍から約８倍、約３倍から約７倍、約３倍から約６倍、約３倍から約５倍、約３倍から約４倍、約４倍から約６倍、約５倍から約７倍、または約６倍から約８倍延長される。

【0357】

他の実施形態では、半減期延長剤を含む治療用タンパク質の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間、または少なくとも約１０８時間である。

【0358】

さらに他の実施形態では、半減期延長剤を含む治療用タンパク質の半減期は、約１５時間から約２週間、約１６時間から約１週間、約１７時間から約１週間、約１８時間から約１週間、約１９時間から約１週間、約２０時間から約１週間、約２１時間から約１週間、約２２時間から約１週間、約２３時間から約１週間、約２４時間から約１週間、約３６時間から約１週間、約４８時間から約１週間、約６０時間から約１週間、約２４時間から約６日間、約２４時間から約５日間、約２４時間から約４日間、約２４時間から約３日間、または約２４時間から約２日間である。

【0359】

一部の実施形態では、半減期延長剤を含む治療用タンパク質の対象当たりの平均半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日間）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日間）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日間）、約８４時間、約９６時間（４日間）、約１０８時間、約１２０時間（５日間）、約６日間、約７日間（１週間）、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、または約１４日間である。

【0360】

１つまたはそれ以上の半減期延長剤を治療用タンパク質のＣ末端もしくはＮ末端に融合させるかまたは治療用タンパク質内に挿入することができる。

【0361】

１．免疫グロブリン定常領域またはその一部
別の態様では、異種部分は、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン定常領域またはその部分（例えば、Ｆｃ領域）を含む。一実施形態では、本開示の単離された核酸分子は、免疫グロブリン定常領域またはその一部をコードする異種核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその部分は、Ｆｃ領域である。

【0362】

免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ（定常重鎖）ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２など）で示されるドメインから構成される。アイソタイプ、（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ ＩｇＤ、またはＩｇＥ）に応じて、定常領域は、３つまたは４つのＣＨドメインから構成され得る。いくつかのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ）定常領域はヒンジ領域も含有する。Ｊａｎｅｗａｙら ２００１年、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．を参照のこと。

【0363】

本開示の免疫グロブリン定常領域またはその一部は、多数の異なる供給源から得ることができる。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部はヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）種を含む別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることが理解される。さらに、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。

【0364】

種々の免疫グロブリン定常領域の遺伝子配列（例えば、ヒト定常領域の遺伝子配列）が、公開でアクセス可能な寄託物の形態で利用可能である。特定のエフェクター機能を有する（または特定のエフェクター機能を欠く）か免疫原性を低下させる特定の改変を伴う定常領域ドメインの配列を選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、好適なＩｇ定常領域の配列（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、および／もしくはＣＨ３配列、またはその部分）は、技術分野で認識される技法を使用して、これらの配列から導出され得る。次いで、前述の方法のいずれかを使用して得られる遺伝子材料を変更または合成して、本開示のポリペプチドを得ることができる。さらに当然のことながら、この開示の範囲は、定常領域のＤＮＡ配列の対立遺伝子、バリアントおよび変異を包含する。

【0365】

免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列は、例えば、目的のドメインを増幅するために選択されるポリメラーゼ連鎖反応およびプライマーを使用してクローニングすることができる。抗体から免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列をクローニングするために、ｍＲＮＡを、ハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ細胞から単離し、ＤＮＡに逆転写し、そしてＰＣＲによって抗体の遺伝子を増幅させることができる。ＰＣＲ増幅方法は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号；および、例えば、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｈｏら １９８９．Ｇｅｎｅ ７７：５１；Ｈｏｒｔｏｎら １９９３．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０頁に詳述されている。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによってまたは公開された重鎖および軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始することができる。ＰＣＲは、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するためにも使用することができる。この場合には、コンセンサスプライマーまたはマウス定常領域のプローブのようなより大きな相同なプローブによって、ライブラリーをスクリーニングすることができる。抗体遺伝子の増幅に好適な多数のプライマーセットが当技術分野で公知である（例えば、精製抗体のＮ末端配列に基づく５’プライマー（ＢｅｎｈａｒおよびＰａｓｔａｎ．１９９４．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：１５０９）；ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．ら １９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７３：３３）；抗体リーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋら １９８９ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０）。抗体配列のクローニングは、参照によって本明細書に組み入れる、１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号にさらに記載される。

【0366】

本明細書で使用される免疫グロブリン定常領域は、全てのドメインおよびヒンジ領域またはそれらの部分を含むことができる。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域、すなわち、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む。

【0367】

本明細書で使用されるように、用語「Ｆｃ領域」は、ネイティブＩｇのＦｃ領域に対応するポリペプチドの部分として、すなわち、その２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメインの二量体会合によって形成されるような部分として定義される。ネイティブＦｃ領域は、別のＦｃ領域とホモ二量体を形成する。対照的に、用語「遺伝子的に融合されるＦｃ領域」または「単鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）は、本明細書で使用されるように、単一ポリペプチド鎖内で遺伝子的に連結される（すなわち、単一の連続の遺伝子配列でコードされる）Ｆｃドメインから構成される合成の二量体Ｆｃ領域を指す。参照によってその全体として本明細書に組み入れる、国際公開第ＷＯ２０１２／００６６３５号を参照のこと。

【0368】

一実施形態では、「Ｆｃ領域」は、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり（すなわち、重鎖定常領域の第一の残基を１１４として、ＩｇＧの残基２１６）、抗体のＣ末端で終わる、単一のＩｇ重鎖の部分を指す。したがって、完全Ｆｃ領域は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。

【0369】

免疫グロブリン定常領域またはその部分は、ＦｃＲｎ結合パートナーである場合がある。ＦｃＲｎは、成体の上皮組織で活性であり、腸の管腔、肺気道、鼻腔面、膣表面、結腸および直腸表面において発現される（米国特許第６，４８５，７２６号）。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎに結合する免疫グロブリンの一部である。

【0370】

ＦｃＲｎレセプターは、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎの配列が公知である（Ｓｔｏｒｙら １９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７頁）。ＦｃＲｎレセプターは、ＩｇＧ（ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのような他の免疫グロブリンクラスではなく）に比較的低いｐＨで結合し、ＩｇＧを管腔中で漿膜の方向に経細胞的に能動輸送し、次いで、間質液中で見られる比較的高いｐＨでＩｇＧを遊離する。これは、肺および腸の上皮（Ｉｓｒａｅｌら １９９７、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９２：６９）腎近位尿細管上皮（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら ２００２年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｆ３５８）ならびに鼻腔上皮、膣表面、および胆道系表面を含む成体の上皮組織（米国特許第６，４８５，７２６号、同第６，０３０，６１３号、同第６，０８６，８７５号；ＷＯ０３／０７７８３４；ＵＳ２００３－０２３５５３６Ａ１）において発現される。

【0371】

本開示において有用なＦｃＲｎ結合パートナーは、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃフラグメント、およびＦｃＲｎレセプターの完全結合領域を含む他のフラグメントを含む、ＦｃＲｎレセプターによって特異的に結合される分子を包含する。ＦｃＲｎレセプターに結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶学に基づいて記載されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら １９９４年、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３７９）。ＦｃのＦｃＲｎとの主な接触領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの接合部に近い。Ｆｃ－ＦｃＲｎ接触は全て、単一のＩｇ重鎖内である。ＦｃＲｎ結合パートナーとして、ＩｇＧ全体、ＩｇＧのＦｃフラグメント、およびＦｃＲｎの完全結合領域を含むＩｇＧの他のフラグメントが挙げられる。主な接触部位として、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０～２５７、２７２、２８５、２８８、２９０～２９１、３０８～３１１、および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５～３８７、４２８、および４３３～４３６が挙げられる。免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンフラグメント、または領域のアミノ酸ナンバリングに対してなされる言及は全て、Ｋａｂａｔら １９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．に基づく。

【0372】

ＦｃＲｎに結合したＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎによって、上皮バリアを越えて効率的に運ばれ得る、所望の治療用分子を全身投与するための非侵襲的手段をもたらす。さらに、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む融合タンパク質は、ＦｃＲｎを発現する細胞によって貪食される。しかし、これらの融合タンパク質は、分解の対象にはならずに、リサイクルされて、再度血液循環に入るので、これらのタンパク質のインビボ半減期が増加する。ある特定の実施形態では、免疫グロブリン定常領域の部分は、典型的には、ジスルフィド結合及び他の非特異的相互作用を介して、別のＦｃ領域または別のＦｃＲｎ結合パートナーと会合して、二量体、およびそれより高次の多量体を形成するＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーである。

【0373】

２つのＦｃＲｎレセプターが、単一のＦｃ分子と結合することができる。結晶学的データから、各ＦｃＲｎ分子が、Ｆｃホモ二量体の単一のポリペプチドと結合することが示唆される。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合パートナー、例えば、ＩｇＧのＦｃフラグメントを生物活性分子に連結させることにより、生物活性分子の経口送達、口腔内送達、舌下送達、直腸送達、膣内送達、経鼻的なエアロゾル投与によるかもしくは経肺経路による送達、または眼局所経路による送達の手段が得られる。別の実施形態では、凝固因子タンパク質は、侵襲的に、例えば、皮下、静脈内に投与することができる。

【0374】

ＦｃＲｎ結合パートナー領域は、ＦｃＲｎレセプターが特異的に結合し、その結果、Ｆｃ領域をＦｃＲｎレセプターによって能動輸送できる分子または部分である。特異的な結合とは、生理的条件下で、比較的安定である複合体を形成する２つの分子を指す。通常、親和性が低く、中程度から高度の容量を有する非特異的な結合と区別されるように、特異的な結合は、高い親和性と、低度から中程度の容量によって特徴付けられる。典型的には、親和性定数ＫＡが、１０^６Ｍ^－１を超えるか、または１０^８Ｍ^－１を超える場合に、結合は、特異的であると考えられる。必要な場合、非特異的結合は、結合条件を変えることによって、特異的な結合に実質的な影響を及ぼすことなく低減され得る。分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ブロッキング剤（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度のような適切な結合条件などは、当業者であれば、通常の技法を使用して最適化することができる。

【0375】

ある特定の実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされる治療用タンパク質は、トランケートされているにもかかわらず、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合特性をＦｃ領域に付与するのに十分である、１つまたはそれ以上のトランケートされたＦｃ領域を含む。例えば、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域の部分（すなわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、ＥＵの番号付けで、ＩｇＧ１のアミノ酸２８２～４３８周辺のを含む（主要な接触部位は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸２４８、２５０～２５７、２７２、２８５、２８８、２９０～２９１、３０８～３１１、および３１４と、ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５～３８７、４２８、および４３３～４３６である）。よって、本開示のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合部分を含むかまたはそれからなる場合がある。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むいずれかのアイソタイプの重鎖に由来する場合がある。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が使用される。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ４の抗体由来のＦｃＲｎ結合部分が使用される。

【0376】

Ｆｃ領域は、多数の異なる供給源から得ることができる。一実施形態では、ポリペプチドのＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、Ｆｃ部分は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）種を含む別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来する場合がある。さらに、Ｆｃドメインまたはその部分のポリペプチドは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来する場合がある。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。

【0377】

ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントにより、前記野生型Ｆｃドメインを含むＦｃ部分によって付与される少なくとも１つのエフェクター機能に変化がもたらされる（例えば、Ｆｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）もしくは補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に結合するか、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、もしくは補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣＣ）を誘発するＦｃ領域の能力の改善または低下）。他の実施形態では、Ｆｃバリアントにより、操作されたシステイン残基がもたらされる。

【0378】

本開示のＦｃ領域は、エフェクター機能および／またはＦｃＲもしくはＦｃＲｎの結合を変化させる（例えば、増強または低減する）ことが知られている技術分野で認識されるＦｃバリアントを用いることができる。具体的には、本開示のＦｃ領域は、例えば、それらのそれぞれを参照によって本明細書に組み入れる、国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ８８／０７０８９Ａ１号、同第ＷＯ９６／１４３３９Ａ１号、同第ＷＯ９８／０５７８７Ａ１号、同第ＷＯ９８／２３２８９Ａ１号、同第ＷＯ９９／５１６４２Ａ１号、同第ＷＯ９９／５８５７２Ａ１号、同第ＷＯ００／０９５６０Ａ２号、同第ＷＯ００／３２７６７Ａ１号、同第ＷＯ００／４２０７２Ａ２号、同第ＷＯ０２／４４２１５Ａ２号、同第ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２号、同第ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２号、同第ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２号、同第ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２号、同第ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２号、同第ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２号、同第ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２号、同第ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２号、同第ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２号、同第ＷＯ０４／０４４８５９号、同第ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１号、同第ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２号、同第ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２号、同第ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２号、同第ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１号、同第ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２号および同第ＷＯ０６／０８５９６７Ａ２号；米国特許出願公開第ＵＳ２００７／０２３１３２９号、同第ＵＳ２００７／０２３１３２９号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６５号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６６号、同第ＵＳ２００７／０２３７７６７号、同第ＵＳ２００７／０２４３１８８号、同第ＵＳ２００７０２４８６０３号、同第ＵＳ２００７０２８６８５９号、同第ＵＳ２００８００５７０５６号；または米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，７３９，２７７号、同第５，８３４，２５０号、同第５，８６９，０４６号、同第６，０９６，８７１号、同第６，１２１，０２２号、同第６，１９４，５５１号、同第６，２４２，１９５号、同第６，２７７，３７５号、同第６，５２８，６２４号、同第６，５３８，１２４号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，９９８，２５３号、同第７，０８３，７８４号、同第７，４０４，９５６号、および同第７，３１７，０９１号に開示されているアミノ酸位置のうちの１つまたはそれ以上に、変更（例えば、置換）を含むことができる。一実施形態では、具体的な変更（例えば、当技術分野において開示されている１つまたはそれ以上のアミノ酸の具体的な置換）は、開示されているアミノ酸位置のうちの１つまたはそれ以上においてなされ得る。別の実施形態では、開示されているアミノ酸位置のうちの１つまたはそれ以上において異なる変更（例えば、当技術分野において開示されている１つまたはそれ以上のアミノ酸位置の異なる置換）がなされ得る。

【0379】

部位特異的変異誘発などのような十分に認識されている手順に従って、ＩｇＧのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを改変して、ＦｃＲｎが結合することになる改変型ＩｇＧもしくはＦｃフラグメントまたはその部分を得ることができる。このような改変として、ＦｃＲｎ接触部位から離れた部位の改変と、ＦｃＲｎへの結合を保持するかまたはさらには増強する、接触部位内の改変が挙げられる。例えば、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合親和性を有意に喪失することなく、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｆｃγ１）における以下の単一のアミノ酸残基を置換することができる：Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ、及びＫ４４７Ａ、（ここで例えば、Ｐ２３８Ａは、位置番号２３８における野生型プロリンのアラニンへの置換を表す）。一例として、具体的な実施形態では、Ｎ２９７Ａ変異を組み込んで、高度に保存されたＮグリコシル化部位を除去している。アラニンに加えて、上で特定した位置の野生型アミノ酸を他のアミノ酸で置換することができる。変異を個々にＦｃに組み込んで、ネイティブＦｃと異なるＦｃ領域を１００個超もたらすことができる。さらに、これらの個々の変異のうちの２つ、３つ、またはそれ以上の組合せを一緒に組み込んで、何百ものさらなるＦｃ領域をもたらすことができる。

【0380】

上記のうちの特定の変異により、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーに、新たな機能を付与することができる。例えば、一実施形態では、Ｎ２９７Ａを組み込んで、高度に保存されたＮグリコシル化部位を除去している。この変異の作用は、免疫原性を低減することであり、それによって、Ｆｃ領域の循環血液中半減期が増強すること、およびＦｃＲｎに対する親和性を損なうことなく、Ｆｃ領域がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＡに結合するのを不可能とすることである（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら １９９５、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０：８４７；Ｆｒｉｅｎｄら １９９９年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８：１６３２；Ｓｈｉｅｌｄｓら １９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。上記の変異から生じる新たな機能のさらなる例として、いくつかの例では、ＦｃＲｎに対する親和性を野生型の親和性よりも増加させることができる。この親和性の増加は、「会合」速度の上昇、「解離」速度の低下または「会合」速度の上昇と「解離」速度の低下の両方を反映することができる。ＦｃＲｎに対する親和性を増加させると考えられる変異の例として、これらに限定されないが、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａが挙げられる（Ｓｈｉｅｌｄｓら ２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。

【0381】

さらに、少なくとも３つのヒトＦｃガンマレセプターは、下流のヒンジ領域、一般的には、アミノ酸２３４～２３７内の、ＩｇＧ上の結合部位を認識すると考えられる。したがって、新たな機能および免疫原性の潜在的な減少の別の例は、例えば、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸２３３～２３６「ＥＬＬＧ」（配列番号４５）を、ＩｇＧ２の対応する配列「ＰＶＡ」（１つのアミノ酸が欠失している）で置換することにより、この領域の変異から生じ得る。このような変異が導入された場合、様々なエフェクター機能を媒介するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩが、ＩｇＧ１に結合しなくなることが示されている。ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ １９９５年、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：７７およびＡｒｍｏｕｒら １９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３。

【0382】

別の実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ヒンジ領域またはその一部に、第二の免疫グロブリン定常領域またはその一部と１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成するアミノ酸配列を含む。第二の免疫グロブリン定常領域またはその一部は、第二のポリペプチドに連結して、治療用タンパク質と第二のポリペプチドを一体とすることができる。一部の実施形態では、第二のポリペプチドはエンハンサー部分である。本明細書で使用されるように、用語「エンハンサー部分」は、治療用タンパク質の活性を増強することが可能な分子、そのフラグメントまたはポリペプチドの構成成分を指す。エンハンサー部分は、可溶性組織因子（ｓＴＦ）のような補因子であり、ここで、治療用タンパク質は凝固因子であるか、または凝固促進ペプチドである。よって、凝固因子の活性化の際に、エンハンサー部分は、凝固因子の活性を増強するために利用可能である。

【0383】

ある特定の実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされる治療用タンパク質は、Ｉｇ定常領域の抗原依存性エフェクター機能、特に、タンパク質の循環血液中半減期を変化させる、免疫グロブリン定常領域またはその一部（例えば、Ｆｃバリアント）に対するアミノ酸置換を含む。

【0384】

２．ｓｃＦｃ領域
別の態様では、異種部分は、ｓｃＦｃ（単鎖Ｆｃ）領域を含む。一実施形態では、本開示の単離された核酸分子は、ＳｃＦｃ領域をコードする異種核酸配列をさらに含む。ｓｃＦｃ領域は、同じ直鎖状ポリペプチド鎖内に、フォールディングして（例えば、分子内または分子間フォールディングして）、Ｆｃペプチドリンカーによって連結される１つの機能性ｓｃＦｃ領域を形成することが可能な、少なくとも２つの免疫グロブリン定常領域またはその部分（例えば、Ｆｃ部分またはＦｃドメイン（例えば、２、３、４、５、６個、またはそれ以上のＦｃ部分またはドメイン））を含む。例えば、一実施形態では、半減期を改善するかもしくは免疫エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣＣ））を誘発する、および／または製造性を改善する目的で、本開示のポリペプチドは、そのＳｃＦｃ領域を介して、少なくとも１つのＦｃレセプター（例えば、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲレセプター（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）、または補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ））に結合することが可能である。

【0385】

３．ＣＴＰ
別の態様では、異種部分は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットの１つのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、またはそのフラグメント、バリアントもしくは誘導体を含む。組換えタンパク質に挿入された１つまたはそれ以上のＣＴＰペプチドは、そのタンパク質のインビボ半減期を増加させることが知られている。例えば、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、米国特許第５，７１２，１２２号を参照のこと。

【0386】

例示的なＣＴＰペプチドとして、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ （配列番号３３）又はＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ （配列番号３４）が挙げられる。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ ２００９／００８７４１１ Ａ１号（参照により加入される）を参照のこと。

【0387】

４． ＸＴＥＮ配列
一部の実施形態では、異種部分は、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列、そのフラグメント、バリアント、または誘導体を含む。本明細書で使用されるように、「ＸＴＥＮ配列」は、低分子親水性アミノ酸で主に構成され、生理的条件下では二次構造もしくは三次構造をとる程度が低いかまたはそれをとらない、天然に存在しない、実質的に非反復の配列を有する伸長したポリペプチドを指す。異種部分として、ＸＴＥＮは、半減期延長部分としての機能を果たすことができる。さらに、ＸＴＥＮは、これらに限定されないが、薬物動態パラメーターおよび溶解特性の増強を含む所望の特性をもたらすことができる。

【0388】

ＸＴＥＮ配列を含む異種部分の、本開示のタンパク質への組み込みにより、以下の有利な特性：立体配座の柔軟性、水溶性の向上、高度なプロテアーゼ耐性、低免疫原性、哺乳動物レセプターへの低結合性、または流体力学的（またはストークス）半径の増大のうちの１つまたはそれ以上をタンパク質に付与することができる。

【0389】

特定の態様では、ＸＴＥＮ配列は、より長いインビボ半減期または曲線下面積（ＡＵＣ）の増加のような薬物動態特性を向上させることができ、その結果、本開示のタンパク質は、インビボに留まり、ＸＴＥＮ異種部分を有さないこと以外は同じであるタンパク質と比較して増加した期間、凝固促進活性を有する。

【0390】

一部の実施形態では、本開示に関して有用なＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約２０超から約３０００個のアミノ酸残基、３０超から約２５００個の残基、４０超から約２０００個の残基、５０超から約１５００個の残基、６０超から約１０００個の残基、７０超から約９００個の残基、８０超から約８００個の残基、９０超から約７００個の残基、１００超から約６００個の残基、１１０超から約５００個の残基、または１２０超から約４００個の残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、長さが、４２アミノ酸より長く、かつ１４４アミノ酸より短い、アミノ酸配列を含む。

【0391】

本開示のＸＴＥＮ配列は、５から１４個（例えば、９から１４個）のアミノ酸残基の１つもしくはそれ以上の配列モチーフ、または配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、そのモチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択される４から６種のアミノ酸（例えば、５アミノ酸）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。ＵＳ２０１０－０２３９５５４Ａ１を参照のこと。

【0392】

一部の実施形態では、ＸＴＥＮは、配列の約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％または約１００％が、表７から選択される単一のモチーフファミリーから選択される非重複配列の複数ユニットからなる（その結果、ファミリー配列が得られる）非重複配列モチーフを含む。本明細書で使用されるように、「ファミリー」は、ＸＴＥＮが、表７からの単一のモチーフカテゴリー、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤのＸＴＥＮのみから選択されるモチーフを有することと、およびファミリーモチーフに由来しないＸＴＥＮにおける任意の他のアミノ酸が、必要とされる特性を実現するために、例えば、コードヌクレオチドによる制限部位の組み込み、切断配列の組み込みを可能とするために、または治療用タンパク質の十分な連結を達成するために選択されることを意味する。ＸＴＥＮファミリーの一部の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリー、またはＡＥモチーフファミリー、またはＡＦモチーフファミリー、またはＡＧモチーフファミリー、またはＡＭモチーフファミリー、またはＡＱモチーフファミリー、またはＢＣファミリー、またはＢＤファミリーの非重複配列モチーフを複数ユニット含み、得られたＸＴＥＮは、上記の範囲の相同性を示す。他の実施形態では、ＸＴＥＮは、表７のモチーフファミリーのうちの２つまたはそれ以上からのモチーフ配列を複数ユニットを含む。これらの配列は、以下にさらに詳しく説明されている、モチーフのアミノ酸組成によって付与される実効電荷、親水性、二次構造の欠如、または反復性の欠如のような特性を含む所望の物理的／化学的特徴を達成するように選択することができる。この段落で説明される上記の実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して、ＸＴＥＮに組み込まれるモチーフを選択およびアセンブルして、約３６から約３０００個のアミノ酸残基のＸＴＥＮを達成することができる。

【0393】

【表40】

【0394】

本開示の治療用タンパク質において、異種部分として使用することができるＸＴＥＮ配列の例は、例えば、そのそれぞれを参照によってその全体として本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、同第２０１１／００４６０６０Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１Ａ１号、同第２０１１／００７７１９９Ａ１号もしくは同第２０１１／０１７２１４６Ａ１号、または国際特許出願公開第ＷＯ２０１００９１１２２Ａ１号、同第ＷＯ２０１０１４４５０２Ａ２号、同第ＷＯ２０１０１４４５０８Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８２２８Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８２２９Ａ１、もしくは同第ＷＯ２０１１０２８３４４Ａ２号に開示されている。

【0395】

治療用タンパク質に挿入または連結するために、ＸＴＥＮは様々な長さを有する場合がある。一実施形態では、ＸＴＥＮ配列の長さは、融合タンパク質において実現される特性または機能に基づいて選択される。意図する特性または機能に応じて、ＸＴＥＮは、長さが短いかもしくは中程度の配列または担体としての役割を果たすことができるより長い配列であってもよい。ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約６から約９９個のアミノ酸残基の短いセグメント、約１００から約３９９個のアミノ酸残基の中程度の長さ、および約４００から約１０００個、かつ最大で約３０００個のアミノ酸残基のより長い長さを含む。よって、治療用タンパク質に挿入または連結されるＸＴＥＮは、約６、約１２、約３６、約４０、約４２、約７２、約９６、約１４４、約２８８、約４００、約５００、約５７６、約６００、約７００、約８００、約８６４、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、または最大で約３０００個までのアミノ酸残基長の長さを有する場合がある。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、約６から約５０、約５０から約１００、約１００から１５０、約１５０から２５０、約２５０から４００、約４００から約５００、約５００から約９００、約９００から１５００、約１５００から２０００、または約２０００から約３０００個のアミノ酸残基長である。治療用タンパク質に挿入または連結されるＸＴＥＮの正確な長さは、治療用タンパク質の活性に有害な影響を及ぼさなければ、様々である。一実施形態では、本発明で使用されるＸＴＥＮのうちの１つまたはそれ以上は、４２個のアミノ酸、７２個のアミノ酸、１４４個のアミノ酸、２８８個のアミノ酸、５７６個のアミノ酸、または８６４個のアミノ酸長さを有し、ＸＴＥＮファミリー配列、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣまたはＢＤのうちの１つまたはそれ以上から選択することができる。

【0396】

一部の実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＶＩＩＩポリペプチドおよびＸＴＥＮを含み、ＸＴＥＮは、２８８個のアミノ酸を含む。一実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＶＩＩＩポリペプチドおよびＸＴＥＮを含み、ＸＴＥＮは、２８８個のアミノ酸を含み、ＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＢドメイン内に挿入される。特定の一実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＶＩＩＩポリペプチドおよび配列番号１０９を含むＸＴＥＮを含み、ＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＢドメイン内に挿入される。特定の一実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＶＩＩＩポリペプチドおよび配列番号１０９を含むＸＴＥＮを含み、ＸＴＥＮは、成熟ＦＶＩＩＩのアミノ酸７４５のすぐ下流のＦＶＩＩＩポリペプチド内に挿入される。

【0397】

一部の実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドおよびＸＴＥＮを含み、ＸＴＥＮは７２個のアミノ酸を含む。一実施形態では、治療用タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドおよびＸＴＥＮを含み、ＸＴＥＮは７２個のアミノ酸を含み、そしてＸＴＥＮは、成熟ＦＩＸのアミノ酸１６６のすぐ下流のＦＶＩＩＩポリペプチド内に挿入される。

【0398】

一部の実施形態では、本開示で使用されるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、ＡＦ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５２、ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ３２４、ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ３６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、ＡＥ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７６、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ６４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、ＡＥ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４、ＡＧ８６４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、ＢＤ８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、ＡＥ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８、ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３３２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ１９０８、ＡＧ２００４、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される配列と、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。ＵＳ２０１０－０２３９５５４Ａ１を参照のこと。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＧ４２、ＡＧ７２、ＡＧ１４４、ＡＧ２８８、ＡＧ５７６、ＡＧ８６４、またはこれらの任意の組合せを含む。

【0399】

本開示の治療用タンパク質において、異種部分として使用することができる例示的なＸＴＥＮ配列として、ＸＴＥＮ ＡＥ４２－４（配列番号４７によってコードされる配列番号４６）、ＸＴＥＮ ＡＥ１４４－２Ａ（配列番号４９によってコードされる配列番号４８）、ＸＴＥＮ ＡＥ１４４－３Ｂ（配列番号５１によってコードされる配列番号５０）、ＸＴＥＮ ＡＥ１４４－４Ａ（配列番号５３によってコードされる配列番号５２）、ＸＴＥＮ ＡＥ１４４－５Ａ（配列番号５５によってコードされる配列番号５４）、ＸＴＥＮ ＡＥ１４４－６Ｂ（配列番号５７によってコードされる配列番号５６）、ＸＴＥＮ ＡＧ１４４－１（配列番号５９によってコードされる配列番号５８）、ＸＴＥＮ ＡＧ１４４－Ａ（配列番号６１によってコードされる配列番号６０）、ＸＴＥＮ ＡＧ１４４－Ｂ（配列番号６３によってコードされる配列番号６２）、ＸＴＥＮ ＡＧ１４４－Ｃ（配列番号６５によってコードされる配列番号６４）、およびＸＴＥＮ ＡＧ１４４－Ｆ（配列番号６７によってコードされる配列番号６６）が挙げられる。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、配列番号１８によってコードされる。

【0400】

別の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ３６（配列番号１３０）、ＡＥ４２（配列番号１３１）、ＡＥ７２（配列番号１３２）、ＡＥ７８（配列番号１３３）、ＡＥ１４４（配列番号１３４）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号４８）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号５０）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号５２）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号５４）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号１３５）、ＡＧ１４４（配列番号１３６）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号１３７）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号６２）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号６４）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号６６）、ＡＥ２８８（配列番号１３８）、ＡＥ２８８＿２（配列番号１３９）、ＡＧ２８８（配列番号１４０）、ＡＥ５７６（配列番号１４１）、ＡＧ５７６（配列番号１４２）、ＡＥ８６４（配列番号１４３）、ＡＧ８６４（配列番号１４４）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿１（配列番号１４５）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿２（配列番号１４６）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿１（配列番号１４７）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿２（配列番号１４８）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿４Ａ＿２（配列番号１４９）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿５Ａ＿２（配列番号１５０）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿１（配列番号１５１）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿２（配列番号１５２）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿１（配列番号１５３）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿２（配列番号１５４）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４＿１Ａ（配列番号１５５）、ＡＥ１５０（配列番号１５６）、ＡＧ１５０（配列番号１５７）、ＡＥ２９４（配列番号１５８）、ＡＧ２９４（配列番号１５９）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。具体的な実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、およびＡＥ２８８からなる群から選択される。ある特定のＸＴＥＮ配列に関するアミノ酸配列は、表８に示される。

【0401】

【表41】

【表42】

【表43】

【表44】

【0402】

一部の実施形態では、ＸＴＥＮのアミノ酸の１００％未満が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択されるか、または配列の１００％未満が、表７からの配列モチーフもしくは本発明で提供されるＸＴＥＮ配列からなる。このような実施形態では、ＸＴＥＮの残りのアミノ酸残基は、他の１４種の天然Ｌ－アミノ酸のうちのいずれかから選択されるが、ＸＴＥＮ配列が、親水性アミノ酸を少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％含有するように、親水性アミノ酸から優先的に選択することができる。共役構築物において利用されるＸＴＥＮにおける疎水性アミノ酸の含有率は、５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性アミノ酸含有率である。ＸＴＥＮの構築の際に、あまり好ましくない疎水性残基として、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンが挙げられる。さらに、ＸＴＥＮ配列は、以下のアミノ酸：メチオニン（例えば、酸化を回避するため）、またはアスパラギンおよびグルタミン（脱アミド化を回避するため）を５％未満若しくは４％未満若しくは３％未満若しくは２％未満若しくは１％未満含有し得るか、又は含有しなくてもよい。

【0403】

１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列は、治療用タンパク質のＣ末端もしくはＮ末端に挿入されても治療用タンパク質のアミノ酸配列内の２つのアミノ酸の間に挿入されてもよい。例えば、治療用タンパク質がＦＶＩＩＩポリペプチドを含む場合、ＸＴＥＮは、表５から選択される１つまたはそれ以上の挿入部位で、２つのアミノ酸の間に挿入され得る。治療用タンパク質がＦＩＸポリペプチドを含む場合、ＸＴＥＮは、表５から選択される１つまたはそれ以上の挿入部位で、２つのアミノ酸の間に挿入され得る。

【0404】

本発明に従って使用することができるＸＴＥＮ配列の追加例は、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４ Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６ Ａ１号、同第２０１１／００４６０６０ Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１ Ａ１号、同第２０１１／００７７１９９ Ａ１号、もしくは同第２０１１／０１７２１４６ Ａ１号、または国際特許出願公開第ＷＯ２０１００９１１２２ Ａ１号、同第ＷＯ２０１０１４４５０２ Ａ２号、同第ＷＯ２０１０１４４５０８ Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８２２８ Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８２２９ Ａ１号、同第ＷＯ２０１１０２８３４４ Ａ２号、ＷＯ２０１４／０１１８１９ Ａ２号、もしくは同第ＷＯ２０１５／０２３８９１号に開示されている。

【0405】

５．アルブミン、またはそのフラグメント、誘導体もしくはバリアント
一部の実施形態では、異種部分はアルブミンまたはその機能性フラグメントを含む。全長形態は６０９個のアミノ酸のタンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、またはＨＡ）は、血清の浸透圧のかなりの部分を担っており、内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。本明細書で使用されるように、用語「アルブミン」は、全長アルブミンまたはその機能性フラグメント、バリアント、誘導体、もしくはアナログを含む。アルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアントの例は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２００８／０１９４４８１ Ａ１号、同第２００８／０００４２０６ Ａ１号、同第２００８／０１６１２４３ Ａ１号、同第２００８／０２６１８７７ Ａ１号、もしくは同第２００８／０１５３７５１ Ａ１号、またはＰＣＴ特許出願公開第２００８／０３３４１３ Ａ２号、同第２００９／０５８３２２ Ａ１号、もしくは同第２００７／０２１４９４ Ａ２号に開示されている。

【0406】

一実施形態では、本開示の治療用タンパク質は、免疫グロブリン定常領域またはその部分（例えばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、ＰＥＧおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される第二の異種部分にさらに連結されたアルブミン、そのフラグメント、またはバリアントを含む。

【0407】

６．アルブミン結合部分
ある特定の実施形態では、異種部分は、アルブミン結合ペプチド、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体フラグメント、またはこれらの任意の組合せを含むアルブミン結合部分である。

【0408】

例えば、アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、ドメイン抗体を含む抗体または抗体フラグメントである場合がある（米国特許第６，６９６，２４５号を参照のこと）。アルブミン結合タンパク質は、例えば、連鎖球菌タンパク質Ｇのもののような細菌アルブミン結合ドメインである場合がある（Ｋｏｎｉｇ，ＴおよびＳｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１８、７３～８３）。共役パートナーとして使用することができるアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、米国特許出願第２００３／００６９３９５号またはＤｅｎｎｉｓら（Ｄｅｎｎｉｓら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、３５０３５～３５０４３）に記載されているように、Ｃｙｓ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２－Ｘａａ_３－Ｘａａ_４－Ｃｙｓというコンセンサス配列（ここで、Ｘａａ１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり、Ｘａａ_２は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり、Ｘａａ_３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり、Ｘａａ_４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである）を有するものである。

【0409】

Ｋｒａｕｌｉｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３７８：１９０－１９４（１９９６）及びＬｉｎｈｕｌｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１：２０６－２１３（２００２）に開示されるように、連鎖球菌プロテインＧ由来のドメイン３は、細菌アルブミン結合ドメインの一例である。アルブミン結合ペプチドの例としては、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号３５）を有する一連のペプチドが挙げられる。例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７：３５０３５－３５０４３（２００２）を参照のこと。アルブミン結合抗体フラグメントの例は、Ｍｕｌｌｅｒ及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３１９－３２６（２００７）；Ｒｏｏｖｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：３０３－３１７（２００７）、並びにＨｏｌｔら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｃｉ．、２１：２８３－２８８（２００８）（これらはその全体として参照により本明細書に加入される）に開示されている。このようなアルブミン結合部分の例は、Ｔｒｕｓｓｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０：２２８６－２２９２（２００９）により開示されるような２－（３－マレイミドプロパンアミド）－６－（４－（４－ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノアート（「Ａｌｂｕ」タグ）である。

【0410】

脂肪酸、特に、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）および長鎖脂肪酸様アルブミン結合化合物を使用して、本開示の凝固因子タンパク質のインビボ半減期を延長することができる。ＬＣＦＡ様アルブミン結合化合物の例は、１６－（１－（３－（９－（（（２，５－ジオキソピロリジン－１－イルオキシ）カルボニルオキシ）－メチル）－７－スルホ－９Ｈ－フルオレン－２－イルアミノ）－３－オキソプロピル）－２，５－ジオキソピロリジン－３－イルチオ）ヘキサデカン酸である（例えば、ＷＯ２０１０／１４０１４８を参照のこと）。

【0411】

７． ＰＡＳ配列
他の実施形態では、異種部分はＰＡＳ配列である。ＰＡＳ配列は、本明細書で使用されるように、アラニン残基およびセリン残基を主に含むかまたはアラニン残基、セリン残基、およびプロリン残基を主に含むアミノ酸配列であって、生理的条件下でランダムコイル立体配座を形成するアミノ酸配列を意味する。したがって、ＰＡＳ配列は、キメラタンパク質において異種部分の一部として使用することができるアラニン、セリン、およびプロリンを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるビルディングブロック、アミノ酸ポリマー、または配列カセットである。ただし、ＰＡＳ配列における微量成分として、アラニン、セリン、およびプロリン以外の残基が付加される場合、アミノ酸ポリマーもランダムコイル立体配座を形成できることは、当業者であれば分かる。用語「微量成分」は、本明細書で使用されるように、アラニン、セリン、およびプロリン以外のアミノ酸を、ＰＡＳ配列において、ある特定の程度まで、例えば、最大で約１２％まで、すなわち、ＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１２個まで、最大で約１０％まで、すなわち、ＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１０個まで、最大で約９％まで、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約９個まで、最大で約８％まで、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約８個まで、約６％まで、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約６個まで、約５％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約５個、約４％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約４個、約３％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約３個、約２％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約２個、約１％、すなわち、１００個のアミノ酸うちの約１個付加できることを意味する。アラニン、セリン、およびプロリンと異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択することができる。

【0412】

生理的条件下では、ＰＡＳ配列伸長体は、ランダムコイル立体配座を形成し、それによって、凝固因子タンパク質に対して、インビボおよび／またはインビトロ安定性の増加を媒介することができる。ランダムコイルドメインは、それ自体が安定な構造または機能を持たないため、凝固因子タンパク質によって媒介される生体活性は、本質的に保持される。他の実施形態では、ランダムコイルドメインを形成するＰＡＳ配列は、特に、血漿中でのタンパク質分解、免疫原性、等電点／静電挙動、細胞表面レセプターへの結合またはインターナリゼーションに関して、生物学的に不活性であるが、なお生分解性であり、それにより、ＰＥＧのような合成ポリマーを上回る明らかな利点をもたらす。

【0413】

ランダムコイル立体配座を形成するＰＡＳ配列の非限定例は、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ （配列番号３６）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ （配列番号３７）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ （配列番号３８）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ （配列番号３９）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ （配列番号４０）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ （配列番号４１）、ＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ （配列番号４２）およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ＰＡＳ配列のさらなる例は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９２１３０ Ａ１号およびＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００８／１５５１３４ Ａ１号から公知である。

【0414】

８． ＨＡＰ配列
ある特定の実施形態では、異種部分は、グリシンリッチホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）である。ＨＡＰ配列は、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、１２０個のアミノ酸、１４０個のアミノ酸、１６０個のアミノ酸、１８０個のアミノ酸、２００個のアミノ酸、２５０個のアミノ酸、３００個のアミノ酸、３５０個のアミノ酸、４００個のアミノ酸、４５０個のアミノ酸、または５００個のアミノ酸長を有するグリシン反復配列を含む場合がある。一実施形態では、ＨＡＰ配列は、ＨＡＰ配列に融合または連結された部分の半減期を延長することが可能である。ＨＡＰ配列の非限定例として、これらに限定されないが、（Ｇｌｙ）_ｎ、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎまたはＳ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である］が挙げられる。一実施形態では、ｎは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。別の実施形態では、ｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００である。

【0415】

９． トランスフェリン又はそのフラグメント
ある特定の実施形態では、異種部分は、トランスフェリンまたはそのフラグメントである。いずれかのトランスフェリンを使用して、本開示の凝固因子タンパク質を作製することができる。一例として、野生型ヒトＴＦ（ＴＦ）は、およそ７５ＫＤａの６７９個のアミノ酸タンパク質であり（糖鎖付加は考慮せず）、２つの主要ドメイン、Ｎ（約３３０個のアミノ酸）およびＣ（約３４０個のアミノ酸）を有し、遺伝子重複に起因すると考えられる。その全てを参照によってその全体として本明細書に組み入れる、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７およびＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照のこと。トランスフェリンは、２つのドメイン、ＮドメインおよびＣドメインを含む。Ｎドメインは、Ｎ１ドメインおよびＮ２ドメインという２つのサブドメインを含み、Ｃドメインは、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインという２つのサブドメインを含む。

【0416】

一実施形態では、トランスフェリン異種部分として、トランスフェリンスプライスバリアントが挙げられる。一例では、トランスフェリンスプライスバリアントは、ヒトトランスフェリンのスプライスバリアント、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＡ６１１４０である場合がある。別の実施形態では、キメラタンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリン配列の１つまたはそれ以上のドメイン、例えば、Ｎドメイン、Ｃドメイン、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインまたはこれらの任意の組合せを含む。

【0417】

１０． クリアランス受容体
ある特定の実施形態では、異種部分は、クリアランスレセプター、そのフラグメント、バリアント、または誘導体である。ＬＲＰ１は、第Ｘ因子のような種々のタンパク質のレセプター媒介性クリアランスに関与する６００ＫＤａの膜内在性タンパク質である。例えば、Ｎａｒｉｔａら、Ｂｌｏｏｄ ９１：５５５～５６０（１９９８）を参照のこと。

【0418】

１１． フォン・ビルブランド因子又はそのフラグメント
ある特定の実施形態では、異種部分は、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）またはその１つもしくはそれ以上のフラグメントである。

【0419】

ＶＷＦ（Ｆ８ＶＷＦとしても知られている）は、血漿中に存在し、内皮（バイベルパラーデ小体内）、巨核球（血小板のα顆粒）、および内皮下結合組織において構成的に産生される大きな多量体糖タンパク質である。基本的なＶＷＦ単量体は、２８１３個のアミノ酸のタンパク質である。各単量体は、Ｄ’およびＤ３ドメイン（一体になって、第ＶＩＩＩ因子に結合する）、Ａ１ドメイン（血小板ＧＰＩｂレセプター、ヘパリン、および／またはおそらくはコラーゲンに結合する）、Ａ３ドメイン（コラーゲンに結合する）、Ｃ１ドメイン（このドメインが活性化すると、ＲＧＤドメインが血小板インテグリンαＩＩｂβ３に結合する）、ならびにタンパク質のＣ末端にある「システインノット」ドメイン（ＶＷＦは、このドメインを血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子－β（ＴＧＦβ）およびβ－ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）と共有する）という、特有の機能を有するいくつかの特有のドメインを含有する。

【0420】

ヒトＶＷＦの２８１３単量体アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号ＮＰ０００５４３．２として報告されている。ヒトＶＷＦをコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号ＮＭ００５５２．３として報告されている。配列番号１２９は、配列番号１２８によってコードされるアミノ酸配列である。Ｄ’ドメインは、配列番号１２９の７６４から８６６位のアミノ酸を含む。Ｄ３ドメインは、配列番号４４の８６７から１２４０位のアミノ酸を含む。

【0421】

血漿中では、ＦＶＩＩＩの９５～９８％は、全長ＶＷＦとの強固な非共有結合複合体で循環する。インビボでＦＶＩＩＩＩの適切な血漿中レベルを維持するために、この複合体の形成が重要である。Ｌｅｎｔｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ．９２（１１）：３９８３～９６（１９９８）；Ｌｅｎｔｉｎｇら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．５（７）：１３５３～６０頁（２００７）。重鎖の位置３７２および７４０と、軽鎖の位置１６８９におけるタンパク質分解により、ＦＶＩＩＩが活性化される場合、ＦＶＩＩＩに結合したＶＷＦが、活性化ＦＶＩＩＩから外れる。

【0422】

ある特定の実施形態では、異種部分は、全長フォンビルブランド因子である。他の実施形態では、異種部分は、フォンビルブランド因子フラグメントである。本明細書で使用されるように、用語「１つのＶＷＦフラグメント」または「複数のＶＷＦフラグメント」は、ＦＶＩＩＩと相互作用し、全長ＶＷＦによってＦＶＩＩＩに通常もたらされる、少なくとも１つまたはそれ以上の特性、例えば、ＦＶＩＩＩａに対する早期活性化を防止すること、早期タンパク質分解を防止すること、早期クリアランスをもたらすことのあるリン脂質膜との会合を防止すること、ネイキッドＦＶＩＩＩには結合することができるがＶＷＦの結合したＦＶＩＩＩには結合することができないＦＶＩＩＩクリアランスレセプターへの結合を防止すること、および／またはＦＶＩＩＩの重鎖と軽鎖の相互作用を安定化することを保持する任意のＶＷＦフラグメントを意味する。具体的な実施形態では、異種部分は、ＶＷＦのＤ’ドメインおよびＤ３ドメインを含む（ＶＷＦ）フラグメントである。Ｄ’ドメインおよびＤ３ドメインを含むＶＷＦフラグメントは、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、これらの１つまたはそれ以上のフラグメント、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されるＶＷＦドメインをさらに含むことができる。ＶＷＦフラグメントに融合したＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドのさらなる例は、その両方を参照によってその全体として本明細書に組み入れる、２０１２年７月３日に出願された米国仮特許出願第６１／６６７，９０１号、および米国特許出願公開第２０１５／００２３９５９ Ａ１号に開示されている。

【0423】

１２．リンカー部分
ある特定の実施形態では、異種部分はペプチドリンカーである。

【0424】

本明細書で使用されるように、用語「ペプチドリンカー」または「リンカー部分」は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列における２つのドメインを接続するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）を指す。

【0425】

一部の実施形態では、ペプチドリンカーを、本開示の治療用タンパク質とアルブミンのような上記の異種部分との間に挿入することができる。ペプチドリンカーは、キメラポリペプチド分子に柔軟性をもたらすことができる。リンカーは、典型的には、切断されないが、このような切断が望ましい場合がある。一実施形態では、これらのリンカーは、プロセシング中に除去されない。

【0426】

本開示のキメラタンパク質中に存在することができるタイプのリンカーは、切断部位（すなわち、プロテアーゼ切断部位基質、例えば、第ＸＩａ因子、第Ｘａ因子、またはトロンビン切断部位）を含み、そしてその切断部位のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは両側に追加のリンカーを含むことができる、プロテアーゼで切断可能なリンカーである。これらの切断可能なリンカーは、本開示の構築物に組み込まれると、異種の切断部位を有するキメラ分子を生じる。

【0427】

一実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされる治療用タンパク質は、単一のポリペプチド鎖に含まれるＦｃ領域を形成するように、ｃｓｃＦｃリンカーを介して連結された２つまたはそれ以上のＦｃドメインもしくはＦｃ部分を含む。ｃｓｃＦｃリンカーは、少なくとも１つの細胞内プロセシング部位、すなわち、細胞内酵素によって切断される部位に隣接している。少なくとも１つの細胞内プロセシング部位でポリペプチドが切断されると、少なくとも２本のポリペプチド鎖を含むポリペプチドが得られる。

【0428】

他のペプチドリンカーを、本開示の構築物において、例えば、凝固因子タンパク質をＦｃ領域に接続するために、場合により使用することができる。本開示との関連で使用することができるいくつかの例示的なリンカーとして、例えば、下にさらに詳述されているＧｌｙＳｅｒアミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。

【0429】

一実施形態では、ペプチドリンカーは、合成、すなわち、天然に存在しないものである。一実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第一の直鎖状配列を、自然には連結されないかまたは自然には遺伝的に融合されないアミノ酸の第二の直鎖状配列に連結または遺伝的に融合するアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（天然に存在することができるかまたは存在することができない）を含む。例えば、一実施形態では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変形態である（例えば、付加、置換または欠失のような変異を含む）天然に存在しないポリペプチドを含むことができる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、自然には生じない直鎖状配列で生じる天然に存在するアミノ酸を含むことができる。さらに別の実施形態では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含むことができる。

【0430】

例えば、ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーを使用して、同一のＦｃ部分に融合させ、それによって、ホモ二量体ｓｃＦｃ領域を形成することができる。他の実施形態では、ペプチドリンカーを使用して、異なるＦｃ部分（例えば、野生型Ｆｃ部分およびＦｃ部分バリアント）に融合させ、それによって、ヘテロ二量体ｓｃＦｃ領域を形成することができる。

【0431】

別の実施形態では、ペプチドリンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ｓｃＦｃまたはｃｓｃＦｃリンカーは、免疫グロブリンヒンジおよびｇｌｙ－ｓｅｒリンカーの少なくとも一部分を含む。本明細書で使用されるように、用語「ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー」は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。ある特定の実施形態では、前記ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーの２つの他の配列の間に挿入することができる。他の実施形態では、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーの別の配列の一端または両端に結合する。また他の実施形態では、２つまたはそれ以上のｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーに直列に組み込まれる。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子に由来する）上流の少なくとも一部、ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子に由来する）中央の少なくとも一部、および一連のｇｌｙ／ｓｅｒアミノ酸残基を含む。

【0432】

本開示のペプチドリンカーは、少なくとも１つのアミノ酸長であり、様々な長さであってよい。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１から約５０アミノ酸長である。この関連で使用する場合、用語「約」は、＋／－２個のアミノ酸残基を示す。リンカー長は正の整数でなければならないため、約１から約５０アミノ酸長の長さは、１～３から４８～５２アミノ酸長の長さを意味する。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１０から約２０アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１５から約５０アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約２０から約４５アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１５から約３５または約２０から約３０アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００または２０００アミノ酸長である。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、２０または３０アミノ酸長である。

【0433】

一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００個のアミノ酸を含むことができる。他の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００個のアミノ酸を含むことができる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００個のアミノ酸を含むことができる。ペプチドリンカーは、１～５個のアミノ酸、１～１０個のアミノ酸、１～２０個のアミノ酸、１０～５０個のアミノ酸、５０～１００個のアミノ酸、１００～２００個のアミノ酸、２００～３００個のアミノ酸、３００～４００個のアミノ酸、４００～５００個のアミノ酸、５００～６００個のアミノ酸、６００～７００個のアミノ酸、７００～８００個のアミノ酸、８００～９００個のアミノ酸、または９００～１０００個のアミノ酸を含むことができる。

【0434】

ペプチドリンカーは、当技術分野で公知の技法を使用して、ポリペプチド配列に導入することができる。改変は、ＤＮＡ配列解析によって確認することができる。プラスミドＤＮＡを使用して、産生されるポリペプチドが安定して産生されるように宿主細胞を形質転換することができる。

【0435】

１３．単量体－二量体ハイブリッド
一部の実施形態では、本開示の治療用タンパク質は、凝固因子を含む単量体－二量体ハイブリッド分子を含む。

【0436】

本明細書で使用される用語「単量体－二量体ハイブリッド」は、ジスルフィド結合によって互いに会合する第一のポリペプチド鎖と第二のポリペプチド鎖を含むキメラタンパク質を指し、第一の鎖は、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩ、および第一のＦｃ領域を含み、第二の鎖は、凝固因子を含まない第二のＦｃ領域を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。よって、単量体－二量体ハイブリッド構築物は、１つの凝固因子のみを有する単量体の態様、および２つのＦｃ領域を有する二量体の態様を含むハイブリッドである。

【0437】

１４．発現制御配列
一部の実施形態では、本開示の核酸分子は、少なくとも１つの発現制御配列をさらに含む。発現制御配列は、本明細書で使用されるように、プロモーター配列またはプロモーターとエンハンサーの組合せのような任意の調節ヌクレオチド配列であり、これは、その配列が作動可能に連結するコード核酸の効率的な転写と翻訳を促す。例えば、本開示の核酸分子は、少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に連結される。遺伝子発現制御配列は、例えば、構成的または誘導性プロモーターのような哺乳動物プロモーターまたはウイルスプロモーターである場合がある。

【0438】

哺乳動物の構成的プロモーターとして、これらに限定されないが、以下の遺伝子に関するプロモーターが挙げられる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼ、ベータアクチンプロモーター、および他の構成的プロモーター。真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとして、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルスからのプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成的プロモーターは当業者に知られている。本開示の遺伝子発現配列として有用なプロモーターとして、誘導性プロモーターも挙げられる。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下で誘導されて、転写および翻訳を促進する。他の誘導性プロモーターは当業者に知られている。

【0439】

一実施形態では、本開示は、組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下で、導入遺伝子を発現させることを含む。別の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、肝細胞における導入遺伝子の発現を選択的に増強する。ある特定の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、肝細胞、類洞細胞、および／または内皮細胞における導入遺伝子の発現を選択的に増強する。特定の一実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、内皮細胞における導入遺伝子の発現を選択的に増強する。ある特定の実施形態では、プロモーターまたは他の発現制御配列は、筋細胞、中枢神経系、眼、肝臓、心臓、またはこれらの任意の組合せにおける導入遺伝子の発現を選択的に増強する。肝特異的プロモーターの例として、これらに限定されないが、マウスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。特定の実施形態では、プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。ｍＴＴＲプロモーターは、Ｒ．Ｈ．Ｃｏｓｔａら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：４６９７に記載される。Ｆ８プロモーターは、ＦｉｇｕｅｉｒｅｄｏおよびＢｒｏｗｎｌｅｅ、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１８２８～１１８３８に記載される。一部の実施形態では、プロモーターは、肝特異的プロモーター（例えば、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ））、筋特異的プロモーター（例えば、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）、ミオグロビン（ＭＢ）、およびデスミン（ＤＥＳ））、合成プロモーター（例えば、ＳＰｃ５－１２、２Ｒ５Ｓｃ５－１２、ｄＭＣＫ、およびｔＭＣＫ）、およびこれらの任意の組合せから選択される。

【0440】

一実施形態では、プロモーターは、マウスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、マウスアルブミンプロモーター、ＴＴＰｐ、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ミオシン重鎖アルファ（αＭＨＣ）、ミオグロビン（ＭＢ）、デスミン（ＤＥＳ）、ＳＰｃ５－１２、２Ｒ５Ｓｃ５－１２、ｄＭＣＫ、およびｔＭＣＫ、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0441】

１つまたはそれ以上のエンハンサーを使用して、発現レベルをさらに高めて、治療効能を達成することができる。１つまたはそれ以上のエンハンサーは、単独でまたは１つまたはそれ以上のプロモーターエレメントと一緒に提供することができる。典型的には、発現制御配列は、複数のエンハンサーエレメントおよび組織特異的プロモーターを含む。一実施形態では、エンハンサーは、α１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーの１つまたはそれ以上の複製を含む（Ｒｏｕｅｔら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０７６５～２０７７３頁；Ｒｏｕｅｔら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９５～４０４頁；Ｒｏｕｅｔら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４：５７７～５８４頁；Ｉｌｌら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ８：Ｓ２３～Ｓ３０）。別の実施形態では、エンハンサーは、ＥＢＰ、ＤＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６のような肝特異的転写因子結合部位に由来し、Ｅｎｈ１は、ＨＮＦ１、（センス）－ＨＮＦ３、（センス）－ＨＮＦ４、（アンチセンス）－ＨＮＦ１、（アンチセンス）－ＨＮＦ６、（センス）－ＥＢＰ、（アンチセンス）－ＨＮＦ４（アンチセンス）を含む。

【0442】

特定の例では、本開示に有用なプロモーターは、配列番号６９（すなわち、ＥＴプロモーター）を含み、この配列は、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＹ６６１２６５としても公知である。Ｖｉｇｎａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（５）：７６３（２００５）も参照のこと。他の好適なベクターおよび遺伝子調節エレメントの例は、参照によってその全体として本明細書に組み入れるＷＯ０２／０９２１３４、ＥＰ１３９５２９３、または米国特許第６，８０８，９０５号、同第７，７４５，１７９号、もしくは同第７，１７９，９０３号に記載される。

【0443】

一実施形態では、本開示の核酸分子は、イントロン配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸配列に対して５’に位置する。一部の実施形態では、イントロン配列は天然に存在するイントロン配列である。一部の実施形態では、イントロン配列は合成配列である。一部の実施形態では、イントロン配列は天然に存在するイントロン配列に由来する。ある特定の実施形態では、イントロン配列はＳＶ４０スモールＴイントロンを含む。一実施形態では、イントロン配列は配列番号１１５を含む。

【0444】

一部の実施形態では、核酸分子は、転写後調節エレメントをさらに含む。ある特定の実施形態では、転写後調節エレメントは、変異したウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。特定の一実施形態では、転写後調節エレメントは、配列番号１２０を含む。

【0445】

一部の実施形態では、核酸分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１４２－３ｐに関するｍｉＲＮＡ結合部位である。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、Ｒｅｎｎｉｅら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．１３（６）：５５４～５６０頁（２０１６）に開示されているｍｉＲＮＡ結合部位、およびｈｔｔｐ：／／ｓｆｏｌｄ．ｗａｄｓｗｏｒｔｈ．ｏｒｇ／ｓｔａｒｍｉｒＤＢ．ｐｈｐにおいて利用可能なＳＴａｒＭｉｒＤＢから選択される。

【0446】

一部の実施形態では、核酸分子は、１つまたはそれ以上のＤＮＡ核標的化配列（ＤＴＳ）を含む。ＤＴＳは、このような配列を含有するＤＮＡ分子の、核内への移行を促進する。ある特定の実施形態では、ＤＴＳはＳＶ４０エンハンサー配列を含む。ある特定の実施形態では、ＤＴＳはｃ－Ｍｙｃエンハンサー配列を含む。一部の実施形態では、ＤＴＳは第一のＩＴＲと第二のＩＴＲの間にある。一部の実施形態では、ＤＴＳは第一のＩＴＲに対して３’、治療用タンパク質に対して５’にある。他の実施形態では、ＤＴＳは、治療用タンパク質に対して３’および第二のＩＴＲに対して５’にある。

【0447】

一部の実施形態では、核酸分子は、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列をさらに含む。一実施形態では、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列は、ｂＧＨポリ（Ａ）を含む。一実施形態では、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テールは、アクチンポリ（Ａ）部位を含む。一実施形態では、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テールは、ヘモグロビンポリ（Ａ）部位を含む。

【0448】

特定の一実施形態では、３’ＵＴＲポリ（Ａ）テール配列は、配列番号１２２を含む。

【0449】

ＩＩＩ．組織特異的発現
ある特定の実施形態では、例えば、凝固因子導入遺伝子に作動可能に連結される１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列をベクター内に含むことが有用である。よって、本開示は、凝固因子ヌクレオチド配列に作動可能に連結されるか、またはそうでなければ、ベクター内に挿入される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列標的も提供する。ベクターに含まれるｍｉＲＮＡ標的配列の２つ以上の複製によって、その系の有効性を高めることができる。異なるｍｉＲＮＡ標的配列も含まれる。例えば、２つ以上の導入遺伝子を発現するベクターは、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列（同じであるかまたは異なる場合もある）の制御下に導入遺伝子を有することができる。ｍｉＲＮＡ標的配列は、タンデムに存在することができるが、他の配置も含まれる。ｍｉＲＮＡ標的配列を含有する導入遺伝子発現カセットは、ベクター内にアンチセンス方向で挿入することもできる。アンチセンス方向は、ウイルス粒子の産生において、その発現を回避しなければ、プロデューサー細胞に対して毒性を示すことのある遺伝子産物の発現を回避するのに有用である場合がある。他の実施形態では、ベクターは、同じかまたは異なるｍｉＲＮＡ標的配列を１、２、３、４、５、６、７または８複製含む。しかしながら、ある特定の別の実施形態では、ベクターは、いずれのｍｉＲＮＡ標的配列も含まないことになる。ｍｉＲＮＡ標的配列を含むか否か（および何個のｍｉＲＮＡ標的配列を含むか）の選択は、意図する組織標的、所要の発現レベルなどの公知のパラメーターなどによって導き出される。

【0450】

一実施形態では、標的配列は、骨髄系コミット前駆細胞において、発現を最も有効にブロックするとともに、より初期のＨＳＰＣにおいて、発現を少なくとも部分的にブロックすることが報告されているｍｉＲ－２２３標的である。ｍｉＲ－２２３標的は、顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄樹状細胞を含む分化した骨髄細胞における発現をブロックすることができる。ｍｉＲ－２２３標的は、リンパ球系統または赤血球系統における導入遺伝子の活発な発現に依存する遺伝子療法用途に好適である場合もある。ｍｉＲ－２２３標的は、ヒトＨＳＣにおける発現も非常に有効にブロックすることができる。

【0451】

別の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１４２標的（ｔｃｃａｔａａａｇｔ ａｇｇａａａｃａｃｔ ａｃａ（配列番号４３））である。一実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１４２標的配列を４複製含む。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ－１４２（１４２Ｔ）のような造血特異的マイクロＲＮＡの相補配列を、ベクター、例えば、レンチウイルスベクター（ＬＶ）の３’非翻訳領域に組み込み、導入遺伝子のコードする転写物がｍｉＲＮＡ媒介性下方調節を受けやすくする。この方法によって、非造血細胞における導入遺伝子の発現を保持したまま、造血系統抗原提示細胞（ＡＰＣ）において、導入遺伝子の発現を防止することができる（Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００６）。この戦略によって、導入遺伝子の発現に関するストリンジェントな転写後制御が可能となるため、導入遺伝子の安定な送達と長期的な発現が可能となる。一部の実施形態では、ｍｉＲ－１４２の調節により、形質導入された細胞の免疫媒介性クリアランスが防止され、および／または抗原特異的調節Ｔ細胞（Ｔ ｒｅｇ）が誘導されて、導入遺伝子のコードする抗原に対する強固な免疫寛容が媒介される。

【0452】

一部の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１８１標的である。Ｃｈｅｎ Ｃ－ＺおよびＬｏｄｉｓｈ Ｈ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５）１７（２）：１５５～１６５には、マウス骨髄内のＢ細胞で特異的に発現するｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１８１が開示されている（ＣｈｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ、２００５）。いくつかのヒトｍｉＲＮＡが、白血病に関連することも開示されている。

【0453】

標的配列は、ｍｉＲＮＡに完全にまたは部分的に相補的である場合がある。用語「完全に相補的な」は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して１００％相補的である核酸配列を有することを意味する。用語「部分的に相補的な」は、標的配列が、それを認識するｍｉＲＮＡの配列に対して一部分のみ相補的であり、それによって、部分的に相補的な配列が、依然として、ｍｉＲＮＡによって認識されることを意味する。換言すると、本開示の関連において、部分的に相補的な標的配列は、対応するｍｉＲＮＡを認識するのに有効であり、そのｍｉＲＮＡを発現する細胞における導入遺伝子の発現を防止または低減するのに有効である。ｍｉＲＮＡ標的配列の例は、参照によってその全体として本明細書に組み入れる、ＷＯ２００７／０００６６８、ＷＯ２００４／０９４６４２、ＷＯ２０１０／０５５４１３、またはＷＯ２０１０／１２５４７１に記載されている。

【0454】

一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、肝臓を標的とする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子の発現は、肝細胞を標的とする。他の実施形態では、導入遺伝子の発現は、内皮細胞を標的とする。特定の一実施形態では、導入遺伝子の発現は、内因性ＦＶＩＩＩを自然に発現した任意の組織を標的とする。

【0455】

一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、中枢神経系を標的とする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子の発現は、神経細胞を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、求心性神経を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、遠心性神経を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、介在神経細胞を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、グリア細胞を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、星状細胞を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、乏突起膠細胞を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、ミクログリアを標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、上衣細胞を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、シュワン細胞を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、衛星細胞を標的とする。

【0456】

一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、筋細胞を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、平滑筋を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、心筋を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、骨格筋を標的とする。

【0457】

一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、眼を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、光受容細胞を標的とする。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、網膜神経節細胞を標的とする。

【0458】

ＩＶ．宿主細胞
本開示は、本開示の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供する。本明細書で使用されるように、用語「形質転換」は、広い意味で、遺伝型を変化させ、その結果、レシピエント細胞を変化させる、レシピエント宿主細胞へのＤＮＡの導入を指す。

【0459】

「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技法を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターで形質転換した細胞を指す。本開示の宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物起源のものであり；最も好ましくは、ヒトまたはマウス起源のものである。当業者には、目的に最も適する特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力がある。例示的な宿主細胞株として、これらに限定されないが、ＣＨＯ、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３－Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－１Ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＮＳ０、ＣＡＰ、ＢＨＫ２１、およびＨＥＫ２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。特定の一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＮＳ０細胞、ＣＡＰ細胞およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、昆虫起源のものである。特定の一実施形態では、宿主細胞は、ＳＦ９細胞である。宿主細胞株は、典型的には、商業サービスのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公開された文献から入手可能である。

【0460】

本開示の核酸分子またはベクターの宿主細胞への導入は、当業者に周知の様々な技法によって行うことができる。これらの技法として、これらに限定されないが、トランスフェクション（電気泳動および電気穿孔を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープ化ＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、およびインタクトウイルスによる感染が挙げられる。Ｒｉｄｇｗａｙ、Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ」第２４．２章、４７０～４７２頁 Ｖｅｃｔｏｒｓ、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．１９８８）を参照のこと。最も好ましくは、宿主へのプラスミドの導入は、電気穿孔によるものである。形質転換した細胞を、軽鎖と重鎖の産生に適する条件下で成長させ、重鎖タンパク質および／または軽鎖タンパク質の合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技法として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化セルソーター解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。

【0461】

本開示の単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を、適切な成長培地で成長させる。本明細書で使用されるように、用語「適切な成長培地」は、細胞の成長に必要な栄養素を含有する培地を意味する。細胞の成長に必要な栄養素として、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、および増殖因子を挙げることができる。場合によって、培地は、１つまたはそれ以上の選択因子を含有することができる。場合によって、培地は、仔ウシ血清またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有することができる。一実施形態では、培地は、ＩｇＧを実質的に含有しない。成長培地は、一般的には、例えば、薬物選択またはＤＮＡ構築物上の選択可能なマーカーもしくはＤＮＡ構築物とコトランスフェクションした選択可能なマーカーによって相補される必須栄養素の欠損によって、ＤＮＡ構築物を含有する細胞を選択することになる。培養哺乳動物細胞は、一般的には、市販の血清含有培地または無血清培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）で増殖させる。一実施形態では、培地は、ＣＤｏｐｔｉＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。別の実施形態では、培地は、ＣＤ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。使用される特定の細胞株に適する培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。

【0462】

Ｖ．ポリペプチドの製造
本開示は、本開示の核酸分子によってコードされるポリペプチドも提供する。他の実施形態では、本開示のポリペプチドは、本開示の核酸分子を含むベクターによってコードされる。さらに他の実施形態では、本開示のポリペプチドは、本開示の核酸分子を含む宿主細胞によって産生される。

【0463】

他の実施形態では、本開示は、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドの生成方法であって、ここで凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドが産生される条件下で、本開示の宿主細胞を培養すること、及び凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドを回収することを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、ここで凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドの発現は、参照ヌクレオチド配列（例えば、配列番号１６：親ＦＶＩＩＩ遺伝子配列）を含むこと以外は同じ条件下で培養される宿主細胞よりも増加する。

【0464】

他の実施形態では、本開示は、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドの発現を増加させる方法であって、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドが核酸分子によって発現される条件下で、本開示の宿主細胞を培養することを含み、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドの発現が、参照核酸分子（例えば、配列番号１６：親ＦＶＩＩＩ遺伝子配列）を含む同じ条件下で培養される宿主細胞よりも増加する、方法を提供する。

【0465】

他の実施形態では、本開示は、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドの収量の改善方法であって、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドが、本明細書に開示されている核酸分子によって産生される条件下で、宿主細胞を培養することを含み、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドの収量が、参照核酸配列（例えば、配列番号１６：親ＦＶＩＩＩ遺伝子配列）を含む同じ条件下で培養される宿主細胞よりも増加する、方法を提供する。

【0466】

本開示の治療用タンパク質、例えば、凝固因子は、げっ歯類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、またはウシのようなトランスジェニック動物において合成することができる。用語「トランスジェニック動物」は、それらのゲノムに外来遺伝子が組み込まれた、非ヒト動物を指す。この遺伝子は、生殖系組織に存在するので、親から子孫に伝わる。外因性遺伝子は、単一細胞胚に導入される（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら １９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８頁）。免疫グロブリン分子を産生するトランスジェニックを含むトランスジェニック動物の生産方法は、当技術分野で公知である（Ｗａｇｎｅｒら １９８１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６３７６；ＭｃＫｎｉｇｈｔら １９８３年、Ｃｅｌｌ ３４：３３５；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら １９８３年、Ｎａｔｕｒｅ ３０６：３３２；Ｒｉｔｃｈｉｅら １９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：５１７；Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅら ２００３、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５９：８３１；Ｒｏｂｌら ２００３、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５９：１０７；Ｍａｌａｓｓａｇｎｅら ２００３、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １０（３）：２６７）。

【0467】

ＶＩＩ．医薬組成物
本開示の核酸分子、核酸分子によってコードされるポリペプチド、ベクター、または宿主細胞を含有する組成物は、好適な、薬学的に許容される担体を含有することができる。例えば、この組成物は、活性化合物を処理して、作用部位への送達用に設計された調製物にするのを容易にする賦形剤および／または補助剤を含有することができる。

【0468】

一実施形態では、本開示は、（ａ）本明細書に開示されている核酸分子、ベクター、ポリペプチド、または宿主細胞；および（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。

【0469】

一部の実施形態では、医薬組成物は送達剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、送達剤は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、リポソーム、他のポリマー分子、およびエキソソームをさらに含む。

【0470】

本明細書で使用されるように、「脂質ナノ粒子」は、分子間力により互いに物理的に会合している複数の脂質分子を含むナノ粒子を指す。脂質ナノ粒子は、例えば、マイクロスフェア（単層及び多重層ベシクル、例えばリポソームを含む）、エマルション中の分散相、ミセル又は懸濁液中の内相であってもよい。

【0471】

一部の実施形態において、本開示は、本発明の核酸分子を被包した脂質ナノ粒子ホストを含み得る被包型核酸分子組成物を提供する。脂質ナノ粒子は、１つ又はそれ以上の脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及びＰＥＧ修飾脂質）を含み得る。ある特定の実施形態において、本開示の脂質ナノ粒子は、本発明の１つ又はそれ以上の核酸分子を１つ又はそれ以上の標的細胞に送達するために製剤化される。適切な脂質の例としては、限定することなく、ホスファジチジル化合物（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ガングリオシド、及びセレブロシド）が挙げられる。「カチオン性脂質」は、特定のｐＨ（例えば、生理的ｐＨ）で正味の正電荷を有する任意の脂質種を指す。

【0472】

ある特定の実施形態において、本開示の脂質ナノ粒子は特定のＮ／Ｐ比を有する。本明細書で使用されるように「Ｎ／Ｐ比」又は「ＮＰ比」は、正に荷電したポリマーアミン基対負に荷電可能な核酸ホスフェート基の比を指す。脂質ナノ粒子／核酸分子複合体のＮ／Ｐ特性は、正味の表面電荷、安定性及び寸法のような特性に影響を及ぼし得る。本明細書に記載されるような脂質ナノ粒子のＮＰ比は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、及びその間の任意の比であり得る。例えば、本明細書に記載される脂質ナノ粒子のＮＰ比は約１８、約３６、又は約７２であり得る。

【0473】

したがって、ある特定の実施形態において、医薬組成物は、脂質ナノ粒子中に被包された本開示の核酸分子、及び薬学的に許容しうる賦形剤を含む。

【0474】

医薬組成物は、ボーラス注射による非経口投与（すなわち、静脈内、皮下、または筋肉内投与）用に製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルまたは複数回用量容器内に保存剤を加えた状態で供給することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤、または乳剤のような形態をとり、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤のような製剤化剤を含有する場合がある。あるいは、活性成分は、好適なビヒクル、例えば、パイロジェンフリー水で構成される粉末形態である場合がある。

【0475】

非経口投与用の好適な製剤として、水溶性形態、例えば、水溶性塩である、活性化合物の水性液剤も挙げられる。さらに、適切な油性注射用懸濁剤としての活性化合物の懸濁剤を投与することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとして、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、エチルオレエートまたはトリグリセリドが挙げられる。水性注射用懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランを含む、懸濁剤の粘度を向上させる物質を含有することができる。場合によって、懸濁剤は、安定剤も含有することができる。リポソームを使用して、細胞または間質腔への送達用に、本開示の分子を封入することもできる。例示的な薬学的に許容される担体は、生理学的に適合可能な溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどである。一部の実施形態では、組成物は、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを含む。他の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される物質（湿潤剤など）または活性成分の貯蔵寿命もしくは有効性を向上させる少量の補助物質（湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤または緩衝剤など）を含む。

【0476】

本開示の組成物は、例えば、液体（例えば、注射用溶液および注入用溶液）、分散液、懸濁液、半固体および固体の剤形を含む、種々の形態であり得る。好ましい形態は、投与方法と治療用途に応じて変わる。

【0477】

組成物は、液剤、マイクロエマルジョン剤、分散剤、リポソーム、または高い薬物濃度に適する他の規則構造体として製剤化することができる。滅菌注射用液剤は、必要に応じて、上で列挙した成分のうちの１つまたは組合せとともに、活性成分を所要量で適切な溶媒中に投入し、続いてろ過滅菌することによって製造することができる。一般的に、分散剤は、塩基性分散媒と上で列挙した他の成分のうちの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに活性成分を投入することによって製造される。滅菌注射用液剤を調製するための滅菌散剤の場合には、好ましい方法は、事前に滅菌ろ過した溶液から、活性成分といずれかの所望の追加成分との粉末をもたらす真空乾燥と凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散剤の場合には所要の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の吸収時間の延長は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアレート塩およびゼラチンを組成物中に含むことによって実現することができる。

【0478】

活性成分は、放出制御製剤または放出制御デバイスを用いて製剤化することができる。このような製剤およびデバイスの例として、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系が挙げられる。生分解性生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤およびデバイスの製造方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８を参照のこと。

【0479】

注射用デポー製剤は、ポリラクチド－ポリグリコリドのような生分解性ポリマー内の薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製することができる。薬物とポリマーとの比率、および用いられるポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の例示的な生分解性ポリマーは、ポリオルトエステルおよびポリアンハイドライドである。注射用デポー製剤は、薬物をリポソームまたはマイクロエマルジョン中に捕捉することによっても製造することができる。

【0480】

補足的な活性化合物を組成物中に組み込むことができる。一実施形態では、本開示の核酸分子は、凝固因子、またはそのバリアント、フラグメント、アナログもしくは誘導体とともに製剤化される。例えば、凝固因子として、これらに限定されないが、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノーゲン、フォンビルブランド因子またはこれらのいずれかの組換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）もしくは活性化形態が挙げられる。止血剤の凝固因子として、抗線溶薬、例えば、イプシロン－アミノカプロン酸、トラネキサム酸も挙げることができる。

【0481】

投与レジメンを調整して、最適な所望の応答をもたらすことができる。例えば、単回ボーラス投与を行うことも、経時的に、数回の分割投与を行うことも、または治療状況の緊急性によって示されるのに応じて、用量を比例的に減少または増加させることもできる。投与のし易さおよび投薬量の均一化のために、非経口組成物を投薬量単位形態で製剤化するのが有益である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．１９８０年）を参照のこと。

【0482】

活性化合物に加えて、液体剤形は、水、エチルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルのような不活性成分を含有することができる。

【0483】

好適な医薬担体の非限定例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにも記載されている。賦形剤のいくつかの例として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ナトリウムステアレート、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、ｐＨ緩衝試薬、および湿潤剤または乳化剤も含有することができる。

【0484】

経口投与用には、医薬組成物は、従来の手段によって製造した錠剤またはカプセル剤の形態をとることができる。組成物は、液剤、例えば、シロップ剤または懸濁剤として製造することもできる。液体は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体または水素添加食用脂）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分別植物油）、および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を含むことができる。調製剤は、矯味矯臭剤、着色剤および甘味剤も含むことができる。あるいは、組成物は、水または別の好適なビヒクルで構成するための乾燥製品として供給することができる。

【0485】

口腔内投与用では、組成物は、従来のプロトコールに従って、錠剤またはロゼンジ剤の形態をとることができる。

【0486】

吸入による投与用では、本開示に従って使用するための化合物は、利便的には、賦形剤を含むか含まないかにかかわらず、霧状化エアロゾル剤の形態または場合によって、噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素もしくは他の好適な気体とともに、圧縮パックもしくはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。加圧エアロゾル剤の場合には、投薬量単位は、バルブを搭載して定量した量を送達することによって決定することができる。化合物とラクトースまたはデンプンのような好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、例えば、吸入器または注入器において使用するためのゼラチンのカプセル剤およびカートリッジを製剤化することができる。

【0487】

医薬組成物は、直腸投与用に、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含有する坐剤または保持型浣腸剤として製剤化することもできる。

【0488】

一部の実施形態では、組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および経口投与からなる群から選択される経路で投与される。非経口投与は、静脈内投与または皮下投与である場合がある。

【0489】

ＶＩＩＩ． 処置方法
一部の態様において、本開示は、本明細書において開示される核酸分子、ベクター、ポリペプチド、又は医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする対象において疾患又は状態を処置する方法に関する。

【0490】

一部の実施形態において、核酸分子は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、及び遺伝子カセットを含み、ここで遺伝子カセットは標的配列をコードし、該標的配列は治療用タンパク質をコードし、そしてここで核酸分子は、それを必要とする対象において疾患又は状態を処置するために使用される。一部の実施形態において、疾患又は状態は、筋肉、中枢神経系（ＣＮＳ）、眼球、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、肺、皮膚、膀胱、尿管、及び任意のその組合せから選択される臓器に影響を与える。一部の実施形態において、対象は、ＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、ＸＬＭＴＭ （Ｘ連鎖筋細管ミオパチー）、パーキンソン、ＳＭＡ（脊髄性筋萎縮症）、フリートライヒ運動失調症、ＧＵＣＹ２Ｄ－ＬＣＡ（レーバー先天黒内障）、ＸＬＲＳ（Ｘ連鎖網膜分離症）、ＡＭＤ（加齢性黄斑変性）、ＡＣＨＭ（色覚異常）、ＲＰＦ６５媒介ＩＲＤ、及び任意のその組合せからなる群より選択される疾患又は状態を有する。

【0491】

一部の実施形態において、核酸分子は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、及び遺伝子カセットを含み、ここで遺伝子カセットは標的配列をコードし、ここで標的配列はｍｉＲＮＡをコードし、そしてここで核酸分子は、それを必要とする対象における疾患又は状態を処置するために使用される。一部の実施形態において、疾患又は状態は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、及び／又は常染色体優性網膜色素変性症を含む。

【0492】

一部の実施形態において、核酸分子は、第一のＩＴＲ、第二のＩＴＲ、及び遺伝子カセットを含み、ここで遺伝子カセットは標的配列をコードし、ここで標的配列は凝固因子をコードし、そしてここで核酸分子はそれを必要とする対象において出血性疾患又は状態を処置するために使用される。出血性疾患又は状態は、出血性血液凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、大出血、筋肉内への大出血、口腔大出血、外傷、頭部外傷、消化器系出血、頭蓋内大出血、腹腔内大出血、胸腔内大出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内出血、腹膜後隙内出血、腸腰筋外筒内出血およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、対象は、手術を受けることが予定されている。また他の実施形態では、処置は、予防的であるかまたは注文対応のものである。

【0493】

本開示は、本開示の核酸分子、ベクター、またはポリペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、出血性障害を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、出血性障害は、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの欠損によって特徴付けられる。一部の実施形態では、出血性障害は、血友病である。一部の実施形態では、出血性障害は、血友病Ａである。出血性障害を処置する方法の一部の実施形態では、投与の２４時間後の血漿中凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性が、参照核酸分子（例えば、配列番号１６、親ＦＶＩＩＩ遺伝子配列）、参照核酸分子を含むベクター、または参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与された対象よりも向上する。

【0494】

本開示は、治療有効量の、本開示の単離された核酸分子または本開示の核酸分子によってコードされる凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドを投与することを含む、対象における止血障害を処置、寛解、または防止する方法にも関する。単離された核酸分子またはコードされたポリペプチドによる処置、寛解、および防止は、バイパス治療である場合がある。バイパス治療を受ける対象は、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩに対するインヒビターをすでに発現しているか、または凝固因子インヒビターを発現することを条件とする場合がある。

【0495】

本開示の核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、フィブリン血餅の形成を促すことによって、止血障害を処置または防止する。本開示の核酸分子によってコードされる、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの活性を有するポリペプチドは、凝固カスケードのメンバーを活性化することができる。凝固因子は、外因経路、内因経路またはこれらの両方に関与することができる。

【0496】

本開示の核酸分子、ベクター、またはポリペプチドを使用して、凝固因子を用いて処置可能であることが知られている止血障害を処置することができる。本開示の方法を使用して処置することができる止血障害として、これらに限定されないが、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンビルブランド病、第ＸＩ因子欠損（ＰＴＡ欠損）、第ＸＩＩ因子欠損、さらにはフィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、または第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造的異常、関節血症、筋肉出血、口腔出血、大出血、筋肉への大出血、口腔大出血、外傷、頭部の外傷、胃腸出血、頭蓋内大出血、腹腔内大出血、胸腔内大出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内の出血、腹膜後隙内の出血、および腸腰筋鞘内の出血が挙げられる。

【0497】

一部の実施形態では、止血障害は、遺伝性障害である。一実施形態では、対象は、血友病Ａである。他の実施形態では、止血障害は、凝固因子の欠損の結果である。他の実施形態では、止血障害は、ＦＶＩＩＩの欠損の結果である。他の実施形態では、止血障害は、異常なＦＶＩＩＩ凝固因子の結果である場合がある。

【0498】

別の実施形態では、止血障害は、後天性障害である場合がある。後天性障害は、裏に潜む二次的な疾患または状態によるものである場合がある。無関連の状態は、一例として、これらに限定されないが、がん、自己免疫疾患、または妊娠である場合がある。後天性障害は、加齢によるものであるか、または裏に潜む二次的な障害を処置するための薬物治療（例えば、がんへの化学療法）によるものである場合がある。

【0499】

本開示は、止血障害または止血障害の獲得の原因となる二次的な疾患もしくは状態を有さない対象を処置する方法にも関する。よって、本開示は、治療有効量の、本開示の単離された核酸分子、ベクター、またはポリペプチドを投与することを含む、一般的な止血剤を必要とする対象を処置する方法に関する。例えば、一実施形態では、一般的な止血剤を必要とする対象は、手術を受けているか、または手術を受けようとしている。本開示の単離された核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、手術の前または後に、予防として投与することができる。本開示の単離された核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、手術の間または後に投与して、急性出血エピソードを制御することができる。手術として、これらに限定されないが、肝移植、肝切除、または幹細胞移植を挙げることができる。

【0500】

別の実施形態では、本開示の単離された核酸分子、ベクターまたはポリペプチドを使用して、急性出血エピソードを有する対象であって、止血障害を有さない対象を処置することができる。急性出血エピソードは、無制御な出血を引き起こす重大な外傷、例えば、手術、自動車事故、創傷、裂傷 銃創、またはいずれかの他の外傷事象に起因する場合がある。

【0501】

単離された核酸分子、ベクター、またはタンパク質を使用して、止血障害を有する対象を予防的に処置することができる。単離された核酸分子、ベクター、またはタンパク質を使用して、止血障害を有する対象の急性出血エピソードを処置することができる。

【0502】

別の実施形態では、本開示の単離された核酸分子またはベクターを投与することによる凝固因子タンパク質の発現は、対象における免疫応答を誘導しない。一部の実施形態では、免疫応答は、凝固因子に対する抗体の発生を含む。一実施形態では、免疫応答は、ＦＶＩＩＩに対する抗体の発生を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、サイトカインの分泌を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞とＴ細胞の両方の活性化を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、阻害性免疫応答であり、対象における免疫応答は、免疫応答を発生していない対象における凝固因子の活性に対して、凝固因子タンパク質の活性を低下させる。ある特定の実施形態では、本開示の単離された核酸分子またはベクターを投与することによる凝固因子タンパク質の発現により、凝固因子タンパク質または単離された核酸分子またはベクターから発現される凝固因子タンパク質に対する阻害性免疫応答が防止される。

【0503】

一部の実施形態では、止血を促進する少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて、本開示の単離された核酸分子、ベクター、またはタンパク質組成物が投与される。前記他の薬剤は、凝固活性が示されている治療において、止血を促進する。一例として、これらに限定されないが、止血剤として、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、プロトロンビン、もしくはフィブリノーゲンまたはこれらのいずれかの活性化形態を挙げることができる。凝固因子または止血剤として、抗線溶薬、例えば、イプシロン－アミノカプロン酸、トラネキサム酸も挙げることができる。

【0504】

本開示の一実施形態では、組成物（例えば、単離された核酸分子、ベクター、またはポリペプチド）は、対象に投与した場合に、凝固因子が活性化可能な形態で存在する組成物である。このような活性化可能な分子を、対象に投与後、インビボにおいて、凝固部位で活性化することができる。

【0505】

したがって、一部の実施形態において、本開示は、凝固因子をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において出血障害を処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、非アデノ随伴ウイルス（非ＡＡＶ）のＩＴＲである。一部の実施形態において、本開示は、凝固因子をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において出血障害を処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７又は１８８に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、本開示は、凝固因子をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において出血障害を処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７又は１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【0506】

したがって、一部の実施形態において、本開示は、第ＶＩＩＩ因子をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において血友病Ａを処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、非アデノ随伴ウイルス（非ＡＡＶ）のＩＴＲである。一部の実施形態において、本開示は、第ＶＩＩＩ因子をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において血友病Ａを処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７又は１８８に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、本開示は、第ＶＩＩＩ因子をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において血友病Ａを処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７又は１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【0507】

本開示はまた、本開示の核酸分子、ベクター、又はポリペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、肝臓の代謝障害を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、肝臓の代謝障害は、以下からなる群より選択される：フェニルケトン尿症（

【0508】

図７Ｅは、マウスＰＡＨ導入遺伝子及びＢ１９ｄ１３５又はＧＰＣｄ１６５ ＩＴＲのいずれかを含有するｓｓＤＮＡで処置されたＰＫＵマウスからの肝臓溶解物のウェスタン免疫ブロットを示す。処置後８１日目に肝臓を集め、そしてタンパク質溶解物を抽出した。各ウェルは単一の動物を表す。ＦＬＡＧ－タグ化マウスＰＡＨタンパク質を、Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出し、そしてＧＡＰＤＨローディングコントロールを比較のために含めた。

【0509】

）、尿素サイクル異常症（例えば、トランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、又はアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ）の欠乏）、リソソーム蓄積症（例えば、ムコ多糖症）、及び糖原病（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型糖原病）。他の肝臓の代謝障害としては、限定することなく、ウィルソン病、アルファ－１アンチトリプシン欠乏症、妊娠同種免疫性肝疾患（ＧＡＬＤ）、脂肪酸酸化異常症、ガラクトース血症、脂質蓄積症、チロシン血症、及びペルオキシソーム病が挙げられる。

【0510】

一部の実施形態において、本開示は、対象において欠乏している肝臓関連代謝酵素をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を該対象に投与することを含む、それを必要とする対象において肝臓の代謝障害を処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、非アデノ随伴ウイルス（非ＡＡＶ）のＩＴＲのである。一部の実施形態において、本開示は、治療用タンパク質（例えば、肝臓の適切な代謝機能に必要とされるタンパク質）をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において肝臓の代謝障害を処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７又は１８８に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、本開示は、治療用タンパク質（例えば、肝臓の適切な代謝機能に必要とされるタンパク質）をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において肝臓の代謝障害を処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【0511】

一部の実施形態において、本開示は、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、非アデノ随伴ウイルス（非ＡＡＶ）のＩＴＲである。一部の実施形態において、本開示は、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７又は１８８に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、本開示は、フェニルアラニン水酸化酵素をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接している第一の末端逆位配列（ＩＴＲ）及び第二のＩＴＲを含む核酸分子を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置する方法を提供し、ここで第一のＩＴＲ及び／又は第二のＩＴＲは、配列番号１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７若しくは１８８に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列、又はその機能性誘導体を含む。

【0512】

単離された核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、またはいずれかの粘膜表面を介した投与、例えば、経口投与、舌下投与、口腔内投与、舌下投与、経鼻投与、直腸投与、膣内投与または経肺経路を介した投与を行うことができる。凝固因子タンパク質は、キメラタンパク質の所望の部位への徐放を可能とするバイオポリマー固体支持体に埋め込まれるかまたは連結される場合がある。

【0513】

経口投与用に、医薬組成物は、従来の手段によって製造された錠剤またはカプセル剤の形態をとることができる。組成物は、液剤、例えば、シロップ剤または懸濁剤として製造することもできる。液剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体または水素添加食用脂）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分別植物油）、および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を含むことができる。製剤は、矯味矯臭剤、着色剤および甘味剤も含むことができる。あるいは、組成物は、水または別の好適なビヒクルで構成するための乾燥生成物として供給することができる。

【0514】

口腔内および舌下投与用に、組成物は、従来のプロトコールに従って、錠剤、ロゼンジ剤または速溶性フィルムの形態をとることができる。

【0515】

吸入による投与用に、本開示に従って使用するための凝固因子活性を有するポリペプチドは、利便的に、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の好適な気体とともに、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー（例えば、ＰＢＳ中）の形態で送達される。加圧エアロゾル剤の場合には、投薬量単位は、バルブを搭載して定量した量を送達することによって決定することができる。化合物とラクトースまたはデンプンのような好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、例えば、吸入器または注入器において使用するための例えばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジを製剤化することができる。

【0516】

一実施形態では、単離された核酸分子、ベクター、またはポリペプチドの投与経路は、非経口である。本明細書で使用されるように、用語非経口は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与または膣内投与を含む。静脈内形態の非経口投与が好ましい。これら全ての投与形態は、明らかに、本開示の範囲内にあることが企図されているが、投与のための形態は、注射用液剤、特に、静脈内もしくは動脈内注射または点滴用の液剤となる。通常、好適な注射用医薬組成物は、緩衝剤（例えば、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤またはクエン酸緩衝剤）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、場合によって安定化剤（例えばヒトアルブミン）などを含むことができる。しかしながら、本発明の教示と適合する他の方法では、単離された核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、有害な細胞集団の部位に直接送達することによって、治療剤への疾患組織の曝露を増大することができる。

【0517】

非経口投与用調製剤として、滅菌水性もしくは非水性液剤、懸濁剤、および乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、および注射用有機エステル（エチルオレエートなど）である。水性担体として、水、アルコール溶液／水溶液、乳剤または懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒体を含む）が挙げられる。本開示では、薬学的に許容される担体として、これらに限定されないが、０．０１～０．１Ｍ、及び好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝剤または０．８％生理食塩水が挙げられる。他の一般的な非経口ビヒクルとして、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとして、流体および栄養補給液、電解質補液（リンゲルデキストロースベースのものなど）などが挙げられる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような保存剤および他の添加剤も存在することができる。

【0518】

さらに詳細には、注射用途に好適な医薬組成物として、滅菌水溶液剤（水溶性の場合）または分散液剤および滅菌注射用液剤もしくは分散液剤の用時調製用の滅菌粉末が挙げられる。このような場合には、組成物は、無菌でなければならず、容易に注射可能な程度の流体でなければならない。医薬組成物は、製造条件および保管条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用から保護するのが好ましい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒である場合がある。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散剤の場合には所要の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。

【0519】

医薬組成物は、直腸投与用に、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含有する坐剤または保持型浣腸剤として製剤化することもできる。

【0520】

状態を処置するための、本開示の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬品、および処置が予防的なものであるか治療的なものであるかを含む多くの様々な要因に応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。当業者に知られている常法を使用して、処置投薬量を用量設定して、安全性および効能を最適化することができる。

【0521】

本開示の単離された核酸分子、ベクター、またはポリペプチドは、場合によって、処置（例えば、予防的処置または治療的処置）を必要とする障害または状態の処置に有効である他の薬剤と組み合わせて投与することができる。

【0522】

本明細書で使用されるように、補助療法と併せてまたは組み合わせて、本開示の単離された核酸分子、ベクター、またはポリペプチドを投与することは、療法と開示されているポリペプチドとを順次に、同時に、同域に、併用して、共存してまたは同時期に投与または適用することを意味する。処置の全体的有効性を増強するために、併用療法レジメンの各種成分の投与または適用のタイミングを決定することができることが、当業者に認識されるであろう。当業者（例えば、医師）は、過度の実験なしに、選択された補助療法と本明細書の教示に基づき、有効な併用療法レジメンを容易に識別することができるであろう。

【0523】

さらに当然のことながら、（例えば、併用療法レジメンを提供するために）１つの薬剤または複数の薬剤と併せてまたは組み合わせて、本開示の単離された核酸分子、ベクター、またはポリペプチドを使用することができる。本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと組み合わせることができる例示的な薬剤として、治療される特定の障害に対する最新の標準ケアを表す薬剤が挙げられる。このような薬剤は、本質的に化学的でも生物学的でもよい。用語「生物学的」または「生物学的薬剤」は、治療剤としての使用を意図されている、生物および／またはそれらの産物から作製される任意の薬学的に活性な薬剤を指す。

【0524】

本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと組み合わせて使用される薬剤の量は、対象によって変化するかまたは当技術分野で公知の事象に従って投与することができる。例えば、Ｂｒｕｃｅ Ａ Ｃｈａｂｎｅｒら、ＧＯＯＤＭＡＮ＆ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳにおけるＡｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ、１２３３～１２８７（Ｊｏｅｌ Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、第９版 １９９６年）を参照のこと。別の実施形態では、このような薬剤は、標準ケアと整合する量で投与される。

【0525】

一実施形態では、本明細書に開示されている核酸分子および、それを必要とする対象に核酸分子を投与するための使用説明書を含むキットも、本明細書に開示されている。別の実施形態では、本発明において提供される核酸分子の産生のためのバキュロウイルス系が、本明細書に開示されている。核酸分子は、昆虫細胞において産生される。別の実施形態では、発現構築物のためのナノ粒子送達系が提供される。発現構築物は、本明細書に開示されている核酸分子を含む。

【0526】

ＩＸ． 遺伝子療法
本開示のある特定の態様は、本開示の単離された核酸分子を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象において、遺伝構築物を発現する方法を提供する。一部の態様では、本開示は、本開示の単離された核酸分子を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象において、ポリペプチドの発現を増加させる方法を提供する。他の態様では、本開示は、本開示の単離された核酸分子、例えば、ｍｉＲＮＡを含む核酸配列を、それを必要とする対象に投与することを含む、それを必要とする対象において、ポリペプチドの発現をモジュレートする方法を提供する。一部の態様では、本開示は、本開示の単離された核酸分子、例えば、ｍｉＲＮＡを含む核酸配列を、対象に投与することを含む、それを必要とする対象において、標的遺伝子の発現を下方調節する方法を提供する。

【0527】

これらに限定されないが、血友病Ａを含む、種々の状態に対して考え得る処置として、体細胞遺伝子療法が探求されている。ベクターの単回投与後、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩの継続的な内因的産生を介して疾患を治癒するその潜在能力のために、遺伝子療法は、血友病に対する特に魅力的な処置である。その臨床症状が、全体として、血漿においてわずかな量（２００ｎｇ／ｍｌ）で循環する単一の遺伝子産物（例えば、ＦＶＩＩＩ）の欠如に起因するため、血友病Ａは、遺伝子置き換え手法にかなり適している。

【0528】

従来のウイルスベースの遺伝子送達の使用は、ヒトにおいて免疫応答を誘導することが示されてきた。ウイルスのカプシドタンパク質は、ヒト免疫系の様々な構成要素を誘発することができる。ＡＡＶはヒト集団において一般的なウイルスであり、大部分の人々はＡＡＶに曝露されたことがあり、そしてＡＡＶは例えばアデノウイルスより免疫原性が低いことが示されたきたので、ＡＡＶベースの遺伝子送達は魅力的であった。したがって、大部分の人々は、彼らが以前に曝露されたことのある特定のバリアントに対して免疫応答をすでに発生したことがある。この既存の適応応答には、ＡＡＶを用いたその後の再感染及び／又は形質導入された細胞の除去の臨床上の有効性を減少させ得るＮＡｂ及びＴ細胞が含まれ得、これは、ＡＡＶベースの遺伝子療法処置に対して既存の抗ＡＡＶ免疫を有する患者を不適格にする。本開示の核酸分子は、非ウイルスベースの遺伝子療法において用途を見出す。ウイルスカプシドは本開示の核酸分子を使用する遺伝子送達に必ずしも必要ではないので、対象のその後の再投与（又は再投薬）がなければウイルス成分に対する免疫は発生しない。このように、本開示の核酸分子は、長期の遺伝子送達ストラテジーのための再投薬を可能にする。

【0529】

さらに、本明細書に記載されるように、本開示の核酸分子は、投与された際に安定な導入遺伝子発現を推進するために、遺伝子カセットに隣接している非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲを含む。ＩＴＲの存在は安定な導入遺伝子発現に必要であり、図５に示されるように、この場合、ＩＴＲを含まない核酸は、安定な導入遺伝子発現を達成することができなかった（「ｄｓＤＮＡ ｎｏ ＩＴＲ」及び「ミニサークル」を参照のこと）。

【0530】

本開示の凝固因子タンパク質は、哺乳動物、例えば、ヒトの患者において、インビボで産生させることができる。出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、大出血、筋肉への大出血、口腔大出血、外傷、頭部の外傷、胃腸出血、頭蓋内大出血、腹腔内大出血、胸腔内大出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内の出血、腹膜後隙内の出血、および腸腰筋鞘内の出血からなる群から選択される出血性疾患または障害の処置に対する遺伝子療法による手法を使用することは、治療上有益であろう。一実施形態では、出血性疾患または障害は、血友病である。別の実施形態では、出血性疾患または障害は、血友病Ａである。

【0531】

他の状態も、本明細書に開示されている核酸分子を使用する処置に対して好適である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、筋肉、中枢神経系（ＣＮＳ）、眼、肝臓、心臓、腎臓、膵臓、肺、皮膚、膀胱、泌尿器、またはこれらの任意の組合せから選択される標的器官に影響を及ぼす疾患または状態を処置するために使用される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、ＸＬＭＴＭ（Ｘ連鎖性筋細管ミオパチー）、パーキンソン、ＳＭＡ（脊髄性筋萎縮症）、フリードライヒ運動失調症、ＧＵＣＹ２Ｄ－ＬＣＡ（レーバー先天黒内障）、ＸＬＲＳ（Ｘ－連鎖性網膜分離症）、ＡＭＤ（加齢黄斑変性症）、ＡＣＨＭ（色覚異常）、ＲＰＦ６５に媒介されるＩＲＤから選択される疾患または状態を処置するために使用される（表９）。

【0532】

【表45】

【表46】

【0533】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、リソソーム蓄積症を処置するために使用される。一部の実施形態では、リソソーム蓄積症は、ＭＬＤ（異染性白質ジストロフィー）、ＭＰＳ（ムコ多糖症）、ＰＫＵ（フェニルケトン尿症）、ポンペ糖原病ＩＩ型、またはこれらの任意の組合せから選択される。

【0534】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）療法において使用される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、遺伝子またはタンパク質の過剰発現によって引き起こされる状態を処置する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、タンパク質の蓄積によって引き起こされる状態を処置する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、遺伝子またはタンパク質の誤発現によって引き起こされる状態を処置する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、変異体の遺伝子の発現によって引き起こされる状態を処置する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、異種遺伝子の発現によって引き起こされる状態を処置する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ療法によって、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、ハンチントン病、ＡｄＲＰ（常染色体優性網膜色素変性症）、およびこれらの任意の組合せから選択される状態が処置される。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、本明細書に開示されている核酸分子を投与することによって、ＡＬＳを標的とすること、処置することを含み、ここで核酸分子はｍｉＲＮＡをコードする遺伝子カセットを含み、ｍｉＲＮＡはＳＯＤ１の発現を標的とする。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、Ｄｉｒｒｅｎら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２（２）：１６７～８４（２０１５年２月）に開示されているｍｉＲ ＳＯＤ１人工的ｍｉＲＮＡを含む。ＳＯＤ１遺伝子の変異は、遺伝性ＡＬＳ症例の約２０％を占める。野生型ＳＯＤ１は、神経培養において抗アポトーシス特性を実証したが、変異体のＳＯＤ１は、脊髄ミトコンドリアにおけるアポトーシスを促進するが、肝臓のミトコンドリアにおいては促進しない（変異体のＳＯＤ１が両者において等しく発現されるにもかかわらず）。変異したＳＯＤ１の発現を下方調節することにより、ＡＬＳにおける運動神経細胞変性を阻害させるかもしれない。

【0535】

ある特定の実施形態では、本開示の方法は、本明細書に開示されている核酸分子を投与することによって、ハンチントン病を標的とすること、処置することを含み、ここで核酸分子はｍｉＲＮＡをコードする遺伝子カセットを含み、ｍｉＲＮＡは、ＨＴＴの発現を標的とする。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、Ｅｖｅｒｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２６（９）：１～１５（２０１８年６月に印刷に先立って電子的に公開された）に開示されているｍｉＨＴＴにより操作されたｍｉＲＮＡを含む。ハンチントン病は、正常範囲を超える遺伝子の繰り返しセクションの長さによって引き起こされるいくつかのトリプレットリピート障害のうちの１つである。ＨＴＴは、トリプレットリピートとして知られている３つのＤＮＡ塩基－シトシン－アデニン－グアニンの配列（ＣＡＧ）－複数回繰り返し（すなわち、ＣＡＧＣＡＧＣＡＧ．．．）を含有する。ＣＡＧは、アミノ酸であるグルタミンに関する３文字遺伝子コード（コドン）であり、よって、一連のこれらの繰り返しにより、ポリグルタミン鎖（またはポリＱ鎖）、および遺伝子の繰り返し部分である、ポリＱ領域として知られるグルタミン鎖の産生がもたらされる。一般的に、ヒトは、細胞質タンパク質であるハンチンチンの産生をもたらすポリＱ領域における３６より少ないグルタミンの繰り返しを有する。しかしながら、３６またはそれ以上のグルタミンの配列は、異なる特徴を有するタンパク質の産生をもたらす。この変更された形態は、変異ハンチンチン（ｍＨＴＴ）と称され、ある特定のタイプの神経細胞の崩壊速度を増加させる。一般的に、ＣＡＧの繰り返し数は、このプロセスが影響を及ぼされる程度に関連し、症状の発症年齢の変動の約６０％を占める。残りの変動は、環境とハンチントン病のメカニズムを改変する他の遺伝子に起因する。３６～３９の繰り返しにより、症状の非常に遅い発症とより遅い進行を伴う、疾患の浸透形態の低減をもたらす。一部の場合には、発症が非常に遅く、症状は気付かれない場合もある。非常に多い繰り返し数ではハンチントン病は十分に浸透し、２０歳より下の年齢でも起こる場合があり、その場合、若年性ハンチントン病、無動－筋強剛、またはウエストファールバリアントハンチントン病と称される。これは、ハンチントン病保有者の約７％を占める。

【0536】

ある特定の実施形態では、本開示の方法は、本明細書に開示されている核酸分子を投与することによって、常染色体優性網膜色素変性症（ＡｄＲＰ）を標的化し処置することを含み、ここで核酸分子は、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子カセットを含み、ｍｉＲＮＡは、ＲＨＯ（ロドプシン）の発現を標的とする。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－７０８を含む（Ｂｅｈｒｍａｎら、ＪＣＢ １９２（６）：９１９～２７頁（２０１１）を参照のこと）。網膜色素変性症の原因であるＲＨＯ遺伝子変異の大部分は、ロドプシンタンパク質の折り畳みまたは輸送を変更する。いくつかの変異は、光に応答して活性化される代わりに、ロドプシンを構成的に活性化させる。研究によって、ロドプシンの変更されたバージョンが、本質的な細胞の機能を妨害し、桿状体細胞を自己破壊させる（アポトーシスを起こす）ことが示唆される。桿状体細胞は、弱光条件下での視覚に必須であるため、これらの細胞の損失は、網膜色素変性症を伴うヒトの進行性夜盲症を引き起こす。

【0537】

本明細書に記載の様々な態様、実施形態、および選択肢は全て、いずれかおよび全ての変形形態で組み合わせることができる。

【0538】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願を、個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照によって組み入れられることが具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、参照によって本明細書に組み入れる。

【0539】

本開示について概ね説明してきたが、本明細書において提供される実施例を参照することによって、さらに深い理解を得ることができる。これらの実施例は、例示を目的とするに過ぎず、限定を意図するものではない。

【実施例】

【0540】

実施例１． ＡＡＶ及び非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲを有するＦＶＩＩＩ発現構築物の生成
実施例１ａ．コドン最適化ＦＶＩＩＩ遺伝子およびＡＡＶ由来の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域の遺伝子カセットへのクローニング。
ＦＶＩＩＩ遺伝子カセットは、ＡＡＶ血清型２のゲノムに基づいて生成された。しかしながら、任意の血清型を起源とする（合成を含む）ＩＴＲ領域がこの手法に使用された（図１Ａ）。

【0541】

ＡＡＶ由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）領域に隣接している肝臓特異的プロモーター（ＴＴＰｐ）又はユビキタスプロモーター（ＣＡＧｐ、図１Ａ及び１Ｂ）の制御下のコドン最適化ＦＶＩＩＩコード配列（ＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ）をコードする発現プラスミドＡＡＶ２－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮを、図１Ｃに示されるように、インビトロ及びインビボ発現のために設計した。遺伝子カセットはまた、導入遺伝子の最適な発現のためにＷＰＲＥ及びｂＧＨｐＡエレメントも含有する（図１Ａ～１Ｃ）。ＩＴＲに隣接したコドン最適化ＦＶＩＩＩ配列を、ＣｏｌＥ１複製起点及びアンピシリン抵抗性を付与するベータ－ラクタマーゼのための発現カセットを含むプラスミド主鎖にクローン化した（図１Ｃ）。発現カセットに隣接している制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩのための認識部位を、ＰｖｕＩＩ消化の際のＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ構築物の正確な切除を可能にするように操作した（図１Ｃ）。

【0542】

実施例１ｂ． コドン最適化ＦＶＩＩＩ遺伝子及び非ＡＡＶパルボウイルス由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）領域の遺伝子カセットへのクローン化。
ＡＡＶが属するパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーのメンバー間の系統学的関係に基づいて（図２Ａ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）の他の非ＡＡＶメンバー及びエリスロウイルス属（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）のメンバーが、ウイルス生活環の維持及び持続性の潜伏感染の確立のために類似した細胞機序を利用しているという仮設を立てた。したがって、これらのウイルスのゲノムに起源を有するＩＴＲ領域は、ＡＡＶ様の（しかしＡＡＶベースのものではない）遺伝子発現カセットを開発するために利用できた。以下のパルボウイルスを、遺伝子療法適用のための遺伝子構築物の開発についてのそれらのＩＴＲ領域の適正について試験した：ディペンドウイルスガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）株Ｂ及びエリスロウイルスＢ１９パルボウイルス（図２Ａ）。

【0543】

細菌細胞におけるプラスミドベクターの増殖の間のパルボウイルスＩＴＲ領域の不安定性は、遺伝子構築物の生成及び操作について課題を提示する。全長ＡＡＶ２ ＩＴＲ（１４５ｎｔ）を含有するいくつかの遺伝子構築物は首尾よく生成されたが、これらの構築物は非常に不安定であり、そして大部分のＡＡＶ２ ＩＴＲベースのプラスミドはＩＴＲ領域の切断型１３０ｎｔバージョンを含有する（表１に例示される）。同様に、生成されたＢ１９及びＧＰＶ ＩＴＲの両方の全長配列を有するプラスミド構築物は、細菌宿主において高度の不安定性を示し（データは示していない）、これは遺伝子療法適用のための遺伝子ベクターの開発へのこれらのＩＴＲの利用をかなり制限する。

【0544】

以前に、組み換えＢ１９ウイルスのレスキューのための逆遺伝学系が開発され、ＩＴＲの切断型バージョンを有していた（Ｍａｎａｒｅｓｉら Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５０８（２０１７）：５４－６２）（表２Ｂ、ＩＴＲ ＩＤ： Ｂ１９ｄ１３５）。したがって、Ｂ１９ｄ１３５ ＩＴＲを、遺伝的に安定なＦＶＩＩＩ発現プラスミドＢ１９－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮを生成するために利用した（図１Ｄ）。ＧＰＶ ＩＴＲベースの構築物の合成のためにこのアプローチを更に利用するために、Ｂ１９、ＧＰＶ、及びＡＡＶ２ ＩＴＲの全長野生型配列を比較した（図３Ａ）。ＩＴＲ機能に不必要である、Ｂ１９及びＡＶＶ２ ＩＴＲ配列のそれぞれ最初の１３５及び１５個のヌクレオチドに対する相同性に基づいて、ＧＰＶ ＩＴＲの最初の１６２個のヌクレオチドは、完全に機能的なＩＴＲを有する安定な遺伝子構築物を合成するために除去することができると仮定した（図３Ａ、枠で囲った配列）。したがって、それらの対応するＩＴＲの切断バージョンを有する構築物ＡＡＶ２－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ及びＢ１９－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮと同様に、ＧＰＶｄ１６２（表２Ｃ）を使用して安定なＦＶＩＩＩ発現プラスミド構築物ＧＰＶ－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ（図１Ｅ）を生成した。特に、全長Ｂ１９及びＧＰＶ ＩＴＲの両方とも全長ＡＡＶ２ ＩＴＲ（表１）よりもかなり長く、そしてＡＡＶ ＩＴＲの独特なＴ字形ヘアピン構造を形成しない（図２Ｂ）。

【0545】

３’ＩＴＲのみを含有するＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現構築物を生成することができたので、全長Ｂ１９ ＩＴＲ配列を含有するプラスミドは、細菌宿主において高度の不安定性を示した。標準的な分子クローニング技術を使用して、５’及び３’全長Ｂ１９ ＩＴＲの両方を含有するポジティブなクローンを得ることはできなかった。全長Ｂ１９ ＩＴＲに隣接したＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現構築物、Ｂ１９ｗｔ－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ（図１Ｆ）を生成するために、特定の宿主大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＰＭＣ１０３を使用した。ＰＭＣ１０３は遺伝子ｓｂｃＣにおいて欠失を含有し、これは十字型ＤＮＡ構造を認識し排除するエキソヌクレアーゼをコードするものである。理論に拘束されることなく、ｓｂｃＣを欠いているＰＭＣ１０３株の使用は長いパリンドローム（すなわち、複雑な二次構造を含有する配列）の複製及びＢ１９ｗｔ－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ、さらにはＧＰＶｗｔ－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮの首尾良いクローン化を可能にし得ると考えられた。得られるプラスミドは３８３塩基対の野生型Ｂ１９ ５’及び３’ＩＴＲ配列（表２Ｄ）をコードし、そして別のプラスミドは４４４塩基対の野生型ＧＰＶ ５’及び３’ＩＴＲ配列（表２Ｆ）をコードする。

【0546】

非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲ（Ｂ１９ｄ１３５、ＧＰＶｄ１６２、及びＢ１９ｗｔ）に隣接しているＦＶＩＩＩ発現カセットを含有するプラスミドＢ１９－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ（図１Ｄ；表２Ｂ）、ＧＰＶ－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ（図１Ｅ；表２Ｃ）及びＢ１９ｗｔ－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ（図１Ｆ、表２Ｄ）を、実施例１ａに記載されるように生成した。制限エンドヌクレアーゼＬｇｕＩの認識部位を使用して全てのＦＶＩＩＩ発現カセットを隣接させた（図１Ｄ～１Ｆ）。

【0547】

実施例１ｃ． ＡＡＶ及び非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲに隣接しているＦＶＩＩＩ発現カセットを含有する一本鎖ＤＮＡフラグメントの製造。
ＦＶＩＩＩ発現カセットに隣接しているＩＴＲ領域内のヘアピン構造の形成が標的細胞の持続性の形質導入を推進するという仮説が立てられた。概念実証研究のために、ＡＡＶ ＩＴＲベースのプラスミドＡＡＶ２－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ並びに非ＡＡＶ ＩＴＲベースのプラスミドＢ１９－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ及びＧＰＶ－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮを、それぞれＰｖｕＩＩ及びＬｇｕＩを用いて消化した。形成されたヘアピンＩＴＲ構造を有する一本鎖（ｓｓ） ＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ、Ｂ１９－ＦＶＩＩＩ、又はＧＰＶ－ＦＶＩＩＩフラグメントを、９５℃でＰｖｕＩＩ又はＬｇｕＩ消化の二本鎖ＤＮＡフラグメント産物（ＶＩＩＩ発現カセット及びプラスミド主鎖）を変性し、次いで４℃に冷却してパリンドロームＩＴＲ配列を折りたたませることにより生成した（図１Ａ～１Ｂ）。得られたｓｓＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ、ｓｓＢ１９－ＦＶＩＩＩ、又はｓｓＧＰＶ－ＦＶＩＩＩを、肝細胞の持続性の形質導入を樹立する能力についてＨｅｍＡ（血友病Ａ）マウスモデルにおいて調べた。

【0548】

実施例１ｄ． ＦＶＩＩＩ発現構築物を生成するためのバキュロウイルス発現系の使用
昆虫細胞における終端閉口（ｃｌｏｓｅｄ－ｅｎｄ）ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子の形態のＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ、Ｂ１９－ＦＶＩＩＩ、及びＧＰＶ－ＦＶＩＩＩ構築物の産生についてＬｉら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（８）： ｅ６９８７９ （２０１３）に記載されるバキュロウイルス発現系を利用する。ｃｅＤＮＡ発現カセットの全身送達は、肝細胞の持続的な形質導入を樹立し、そして肝臓において安定な長期導入遺伝子発現を推進することが実証されている。

【0549】

実施例２． ＡＡＶ及び非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲに隣接しているＦＶＩＩＩ発現カセットを含む遺伝子構築物の全身注射は、ＨｅｍＡマウスにおける長期ＦＶＩＩＩ発現を生じる。
実施例２ａ． ｓｓＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ媒介ＦＶＩＩＩ発現のインビボ評価。
ＡＡＶ ＩＴＲ領域を有するｓｓＡＡＶ－ＦＶＩＩＩのインビボで持続的な導入遺伝子発現を媒介する能力を実証するために、遺伝子発現カセットを、５～１２週齢血友病Ａ（ＨｅｍＡ）マウス（４匹の動物／群）においてｓｓＤＮＡ遺伝子発現カセット（ｓｓＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ）５μｇ、１０μｇ、２０μｇ（図４Ａ）でハイドロダイナミック注入（ＨＤＩ）により全身送達した。ＨＤＩは、実験動物の肝臓への注入された物質の一次送達を生じる。血漿サンプルを実験動物からｓｓＡＡＶ－ＦＶＩＩＩの単回ハイドロダイナミック注入の１８時間後、３日後、２週間後、３週間後、１か月後、２か月後、３か月後及び４か月後に集めた。血液中のＦＶＩＩＩ血漿活性を、発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイにより分析した。親発現プラスミド５μｇ／マウスを注入された対照動物は、投与の直後に高レベルのＦＶＩＩＩ血漿活性を示した。しかし、循環ＦＶＩＩＩのレベルは急速に減少し、そして注入後（ｐ．ｉ．）１５日までに検出できなくなった。対照的に、ｓｓＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ ５、１０、及び２０μｇ／マウスを注入された実験動物は、それぞれ正常ＦＶＩＩＩレベルの約８、１６、及び３２％という循環ＦＶＩＩＩの安定レベルで導入遺伝子の長期発現を発生した（図４Ａ）。強い用量応答が観察され、注入された用量と処置アウトカムとの間の高度の相関を示唆した。

【0550】

実施例２ｂ． ｓｓＢ１９－ＦＶＩＩＩ媒介及びｓｓＧＰＶ－ＦＶＩＩＩ媒介ＦＶＩＩＩ発現のインビボ評価。
それぞれ非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲ領域Ｂ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６２を有するｓｓＢ１９－ＦＶＩＩＩ及びｓｓＧＰＶ－ＦＶＩＩＩからのＦＶＩＩＩのインビボ発現を評価するために、遺伝子カセットｓｓＢ１９－ＦＶＩＩＩ １０又は２０μｇ／マウス、及びｓｓＧＰＶ－ＦＶＩＩＩ １０又は５０μｇ／マウスを、５～１２週齢血友病Ａ（ＨｅｍＡ）マウスにおいてＨＤＩにより全身送達した。血液サンプルを注入後（ｐ．ｉ．）１、３、７、１４、２１、２８、４２、５６、８４、１１２、１４０、及び１６８日目に集め、そして血中ＦＶＩＩＩ活性を発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイにより分析した。ＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ構築物で観察されたように、親ＦＶＩＩＩ発現プラスミド５μｇ／マウスを注入された対照動物は、注入２４時間後に高レベルのＦＶＩＩＩ血漿活性を示し、これは急速に低下して注入の１４日後までに検出できなくなった。ｓｓＢ１９－ＦＶＩＩＩを注入された実験動物は、注入３日後にピークＦＶＩＩＩ血漿活性を示し、その後２１日の期間にわたって徐々に低下し、そして注入２８日後あたりで安定化した（図４Ｂ）。他方で、ｓｓＧＰＶ－ＦＶＩＩＩを注入されたＨｅｍＡマウスは、１１２日あたりに安定レベルのＦＶＩＩＩ血漿活性を発生し、これは残りの観察期間の間維持された（図４Ｃ）。とりわけ、ｓｓＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ（図４Ａ）又はｓｓＧＰＶ－ＦＶＩＩＩ（図４Ｃ）のいずれか１０μｇ／マウスを注入された動物は、高度に類似した安定レベルのＦＶＩＩＩ血漿活性を発生し、ＡＡＶ２及びＧＰＶ ＩＴＲ領域の両方が標的細胞の持続的な形質導入の有効な樹立に必要な遺伝因子を含むということを示唆した。

【0551】

実施例２ｃ． ｈｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩの安定な長期発現のＩＴＲ及びヘアピン要件のインビボ評価。
一本鎖ＤＮＡカセットの安定性及び長期発現を別の核酸治療法と比較するために、ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮプラスミド構築物（図１Ａ）をＰｖｕＩＩ又はＡｆｌＩＩを用いて消化して、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むか又は含まない二本鎖線状ＤＮＡを作製した。ＩＴＲを含まない線状二本鎖ＤＮＡを精製して「ｄｓＤＮＡ Ｎｏ ＩＴＲ」構築物を生成した。最後に、ＩＴＲを含まない精製されたｄｓＤＮＡのオーバーラップＡｆｌＩＩ認識部位を介したライゲーションは、ミニサークルＤＮＡの形成を生じたこの小さい環状プラスミド様ＤＮＡ構築物はいずれの細菌配列及び／又はＩＴＲ配列配列も欠いている。ＨｅｍＡマウスに等モル濃度のＤＮＡ構築物をハイドロダイナミック注入により注入し、そしてＦＶＩＩＩ活性レベルを血漿収集物から２～４か月にわたって決定した。全てのＤＮＡ構築物が、３０～６０％正常範囲でＦＶＩＩＩ初期治療レベルを生じたが、しかし一本鎖ＤＮＡのみが注入後４か月間３２％で導入遺伝子発現の安定な持続性を示した（図５）。全ての二本鎖ＤＮＡ及びミニサークルＤＮＡは、６～１０％正常の発現の安定レベルに１４～４２日目に達したが、これらのプラトーは、観察された初期ＦＶＩＩＩ活性の１０％しか表さない。ＦＶＩＩＩ発現の一過性の上昇したレベルは中和する抗薬物抗体の形成を生じ得るので、安定な発現は血友病Ａの状況において免疫寛容に必要である。

【0552】

実施例２ｄ． 野生型及び誘導体Ｂ１９ ＩＴＲのインビボ比較
Ｂ１９誘導体ＩＴＲ（Ｂ１９ｄ１３５、図１Ｄ、表２Ｃ）の効果を全長Ｂ１９ ＩＴＲ（表２Ｃ）と比較するために、２４８塩基対ＩＴＲ（図１Ｆ）に隣接しているＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットを生成した。血友病Ａマウスに、Ｂ１９ｄ１３５（図１Ｄ）、ＧＰＶｄ１６５ （図１Ｅ）、又は野生型Ｂ１９ ＩＴＲ（図１Ｆ）のいずれかに隣接している一本鎖ＦＶＩＩＩ－ＤＮＡ ３０μｇをハイドロダイナミック注入した。全てのコホートについて注入の３、７、１４、２１、２８、及び３５日後に血漿を集め、追加のサンプルを４２、５５、及び８４日目にＢ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６５構築物について採取し、そして発色アッセイによりＦＶＩＩＩ活性について分析した（図６）。誘導体Ｂ１９ ＩＴＲと比較して、全長ＩＴＲはＦＶＩＩＩ発現のおよそ２．５倍の増加を生じた。さらに、野生型ＩＴＲからのＦＶＩＩＩの発現は開始時に安定であった。

【0553】

実施例２ｅ． インビボでの一本鎖ネイキッドＤＮＡの再投与の評価。
現在の遺伝子治療様式における重大な制限は、遺伝子療法ベクターのウイルスカプシドに対する抗薬物抗体の形成に起因して治療薬を再投与できないことである。しかし、免疫原性タンパク質の存在しない遺伝子療法系は、所望の治療レベルにまで患者を用量設定するために再投薬され得る。我々の非ＡＡＶ ＩＴＲ隣接一本鎖カセットが再投与され得るかどうかを評価するために、ｈｅｍＡマウスにＢ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６５ ＩＴＲを含有するｓｓＤＮＡ ３０μｇを０及び３５日目に注入した（図６）。ＧＰＶｄ１６５－ＦＶＩＩＩを投与したマウスは、観察の最初の月の間に約５％正常の安定ＦＶＩＩＩレベルに達した。ｓｓＤＮＡの２回めの投与の後、ＦＶＩＩＩのレベルは１０％に上昇した後わずかに減少し、ＦＶＩＩＩレベルの２倍増加を示した。Ｂ１９ｄ１３５－ＦＶＩＩＩを投与されたマウスは、最初の週の間に８％の安定ＦＶＩＩＩレベルに達し、これはおよそ３．５倍の３０％まで上昇した後２５％に減少した。これらのデータは、非ＡＡＶ ＩＴＲを含む一本鎖ＤＮＡの再投与が血友病ＡマウスにおいてＦＶＩＩＩの安定発現レベルを増加し得るということを実証する。

【0554】

実施例３． Ｂ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６２ 非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲの誘導体を有するＦＶＩＩＩ発現構築物の生成及びインビボ評価。

【0555】

実施例３ａ． Ｂ１９及びＧＰＶ ＩＴＲの最小必須配列の決定。
ディペンドウイルスＡＡＶ２及びＧＰＶ、並びにエリスロウイルスＢ１９（それぞれジーンバンク受入番号ＮＣ＿００１４０１．２、Ｕ２５７４９．１、及びＫＹ９４０２７３．１）のＩＴＲの配列間の比較に基づいて、追加の配列（スペーサー、挿入、逆位、付加、及び／又は他のパルボウイルスＩＴＲの野生型配列との組み換え）とともに又は追加配列なしで、このようなＩＴＲを有する遺伝子構築物を用いた真核細胞の持続的な形質導入に必要であろうＧＰＶ及びＢ１９パルボウイルスＩＴＲの最小配列を設計した（図３Ａ及び３Ｂ）。ＡＡＶ２、ＧＰＶ、及びＢ１９ ＩＴＲの配列アライメントにより、可変配列のスペーサー領域を含まない連続した配列として３つ全てのウイルス種間の保存された領域Ｂ１９ｖ１及びＧＰＶｖ１が明らかとなった（表２Ａ～２Ｃに示される）。同様に、最小必須配列バリアントＢ１９ｖ３及びＧＰＶｖ３を、Ｂ１９ ＩＴＲとＧＰＶ ＩＴＲとの間の配列比較に基づいて設計した。ＧＰＶｄ１６２ ＩＴＲを有するＦＶＩＩＩ発現構築物は、インビボ実験においてＢ１９ｄ１３５ ＩＴＲを有する遺伝子構築物よりも良好であったので、Ｂ１９ｖ３配列は、Ｂ１９ ＩＴＲとＧＰＶ ＩＴＲ配列間で保存される最小Ｂ１９ ＩＴＲ領域を含み、そしてＧＰＶｖ３配列は、ＧＰＶ ＩＴＲ配列中に存在し、かつＢ１９ ＩＴＲ配列からは欠けている最小ＧＰＶ ＩＴＲ配列領域を含むという仮説が立てられた（表２Ｂ及び２Ｃ）。配列Ｂ１９ｖ２及びＧＰＶｖ２は、それぞれＢ１９及びＧＰＶ ＩＴＲ配列のＩＴＲｐパリンドローム領域における最初の１３５及び１６２ヌクレオチド並びに対応する相補的な１３５及び１６２ヌクレオチドを除去することにより生成された（表２Ｂ及び２Ｃ）。

【0556】

実施例３ｂ． 機能性遺伝子構築物上のＢ１９及びＧＰＶ ＩＴＲ並びにそれらの誘導体のパリンドローム領域の配置。
パルボウイルスＩＴＲの一部は、自己相補性パリンドローム領域からなる。順方向及び逆方向のパリンドローム領域を有するレスキューされたウイルスが同様の増殖特性を示すということが、組み換え感染性Ｂ１９パルボウイルスについて以前に実証されている（Ｍａｎａｒｅｓｉら Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５０８ （２０１７）： ５４－６２）。したがって、Ｂ１９及びＧＰＶ ＩＴＲ並びにそれらの誘導体を有する遺伝子発現構築物は、上記ＩＴＲのパリンドローム領域が順方向か、逆方向か、又は遺伝子発現カセットに対して５’及び３’ＩＴＲの組合せの任意の可能な組合せであるかにかかわらず機能的なままであると提案される。この仮説を実証するために、Ｂ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６２ ＩＴＲ、さらには野生型Ｂ１９及びＧＰＶ ＩＴＲを、同じ種のＩＴＲについて同一であるだけでなく逆の相補配列を使用して、順方向、逆方向、及び逆位配置でＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットに組み込む。これらのプラスドからの一本鎖ＤＮＡが生成され、そしてこれを血友病Ａマウスにおいて、実施例２ａ、２ｂ、及び２ｄに記載されるようにＴＴＰｐプロモーターにより推進される肝臓指向ＦＶＩＩＩ発現について試験した。同じ種のＩＴＲの全ての配置を調べることに加えて、ＧＰＶ及びＢ１９野生型ＩＴＲ並びにその誘導体の組合せも生成し、そして血友病ＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ発現について試験した。これらの発現カセットは、非相同ＩＴＲ配列がエピソームのコンカテマー化（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）及び所望の導入遺伝子の長期発現を増強することができるかどうかを決定するために、Ｂ１９起源の１つのＩＴＲ及びＧＰＶ起源の１つのＩＴＲを含有する。血友病Ａマウスに、上述の発現カセットを含有するｓｓＤＮＡ １０、２０、又は５０μｇをハイドロダイナミック注入により注入し、そして注射後１週間間隔で集められたマウス血漿からＦＶＩＩＩを測定する。これらの発現カセットを投与されたマウスにおけるＦＶＩＩＩ発現及び寿命延長に対する影響を、Ｂ１９ｄ１３５、ＧＰＶｄ１６２、及び対応する野生型ＩＴＲ発現カセット（表２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、及び２Ｆ）を投与されたマウスにおけるＦＶＩＩＩ発現及び寿命延長と直接比較する。

【0557】

実施例３ｃ． ＨｅｍＡマウスにおけるＢ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６２非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲの誘導体を有する遺伝子構築物の全身注入。

【0558】

Ｂ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６２非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲの誘導体を有するｓｓＤＮＡ構築物からのＦＶＩＩＩインビボ発現を評価するために、各ｓｓＤＮＡ遺伝子発現カセット５、１０、２０、又は５０μｇ／マウスを、５～１２週齢ＨｅｍＡマウスにおいてＨＤＩにより全身送達した。血液サンプルを注入の１、３、７、１４、２１、及び２８日後に集め、その後４か月の期間の間、月に一度集めた。血中ＦＶＩＩＩ活性を発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイにより分析した。

【0559】

実施例４． 昆虫細胞におけるＢ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６２非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲの誘導体を有するｃｅＤＮＡ発現構築物の製造及びインビボ評価
実施例４ａ． Ｂ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６２ ＩＴＲの誘導体を有するｃｅＤＮＡ発現構築物を生成するためのバキュロウイルス発現系の使用
実施例１ｄに記載されるＡＡＶ－ＦＶＩＩＩ、Ｂ１９－ＦＶＩＩＩ、及びＧＰＶ－ＦＶＩＩＩ構築物と同様に、バキュロウイルス発現系を、昆虫細胞においてｃｅＤＮＡの形態でＢ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６２非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲの誘導体を有する遺伝子構築物のためのＦＶＩＩＩ発現の製造のために使用する。

【0560】

実施例４ｂ． ＨｅｍＡマウスにおけるＢ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６２非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲの誘導体を有するｃｅＤＮＡ発現構築物の全身注入
Ｂ１９ｄ１３５及びＧＰＶｄ１６２非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲの誘導体を有するｃｅＤＮＡ構築物からのＦＶＩＩＩインビボ発現を評価するために、各ｃｅＤＮＡ遺伝子発現カセット５、１０、２０、又は５０μｇ／マウスを、５～１２週齢ＨｅｍＡマウスにおいてＨＤＩにより全身送達した。血液サンプルを注入の１、３、７、１４、２１、及び２８日後に集め、その後４か月の期間の間、月に一度集めた。血中ＦＶＩＩＩ活性を発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイにより分析した。

【0561】

実施例５． ｓｓＤＮＡ及びｃｅＤＮＡ ＦＶＩＩＩ発現構築物の脂質ナノ粒子製剤の生成
各ｓｓＤＮＡ又はｃｅＤＮＡを実施例１及び４に記載されるように製造した後、各遺伝子構築物を、マイクロ流体混合により適切な脂質組成物を使用して脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化した（ＬＮＰ－ｓｓＤＮＡ及びＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ）。脂質対ＤＮＡの比（Ｎ／Ｐ）を、細胞形質導入及びＦＶＩＩＩ発現を最適化するように調整した。ＬＮＰ中に製剤化されたＡＡＶ又は非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲのいずれかに隣接しているＦＶＩＩＩ発現カセットをコードする親プラスミドを、形質導入有効性の対照として使用した。

【0562】

実施例６． ＬＮＰ－ｓｓＤＮＡ及びＬＮＰ－ｃｅＤＮＡのインビトロ及びインビボでの評価
実施例６ａ． 培養肝細胞におけるｓｓＤＮＡ媒介及びｃｅＤＮＡ媒介ＦＶＩＩＩ発現のインビトロ評価。
ｓｓＤＮＡ又はｃｅＤＮＡ ＦＶＩＩＩ発現遺伝子構築物及び対応する親対照プラスミドを、標的遺伝子送達のために、実施例５に記載されるようにＬＮＰ中に製剤化した。Ｈｕｈ７細胞を、２４ウェル組織培養プレートに１ｘ１０^５細胞／ウェルで播種し、そして終夜インキュベートした。次の日に、ＬＮＰ－ｓｓＤＮＡ又は製剤を、１０００、５００、２５０、１２５及び６２．５ｎｇ／ウェルで細胞に加えた。形質導入２４時間後に培地を替えた後、形質導入４８時間後に培地を採取した。培地中のＦＶＩＩＩ活性を、ヒト血漿ＦＡＣＴ標準と比較して発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイにより測定した。ＣＡＧｐプロモーター下でＡＡＶ ＩＴＲに隣接しているＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮカセットを有するプラスミドを、脂質ナノ粒子中に７２、３６、及び１８のＮ／Ｐ比で被包した（図８Ａ）。Ｈｕｈ７細胞の形質導入後に、ＦＶＩＩＩを順化培地中で測定した。生成されたＮ／Ｐ比１８を有する細胞の形質導入は、３６及び７２の比のＦＶＩＩＩレベルを増大し、ピーク用量１μｇ／ｍｌで２ＩＵ／ｍｌを超える結果となった。このデータは、肝臓標的細胞におけるＬＮＰ送達の有用性を実証する。ＬＮＰ送達による肝臓特異的プロモーター下でのｓｓＤＮＡの形質導入有効性を調べるために、ＴＴＰｐプロモーター下のＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮカセットを２ Ｎ／ｐ比で被包し、そしてＨｕｈ７細胞を形質導入した（図８Ｂ）。我々の以前のデータと一致して（図８Ａ）、Ｎ／Ｐ比１８は、比３６と比較して増加したＦＶＩＩＩ活性レベルを生じた。さらに、このデータは、肝臓細胞におけるＦＶＩＩＩ ｓｓＤＮＡの概念実証ＬＮＰ送達を実証した。２４時間後に、２ μｇ／ｍｌ 一本鎖ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ－ＡＡＶで形質導入されたおよそ２ｘ１０^５個のＨｕｈ７細胞が０．３３ＩＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩを生じた。

【0563】

さらに、細胞ヒストンはｒＡＡＶエピソームに沿って規則的に位置しており、細胞染色体ＤＮＡヌクレオソームパターンに類似したクロマチン様構造を生じるということが文献において示されている。したがって、標的細胞の持続的な形質導入に必要なクロマチン様ヌクレオソーム構造を確立するこれらの構築物の能力もまたサザンブロット法により評価される。

【0564】

実施例６ｂ． 静脈内投与後のＨｅｍＡマウスにおけるＬＮＰ製剤化ｓｓＤＮＡ媒介及びｃｅＤＮＡ媒介長期ＦＶＩＩＩ発現の評価。
５～１２週齢ＨｅｍＡマウスに、ＬＮＰ－ｓｓＤＮＡ、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ、又はＬＮＰ－ｐＤＮＡ（プラスミド対照）のいずれかを５、１０、２０、４０、１００ｕｇ／マウスで静脈内（ＩＶ）注射、Ｎ＝４／群により投与した。注射後４８時間から開始して６か月まで選択された時点で血液サンプルを集め、そして血中ＦＶＩＩＩ活性を発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイにより分析する。ＬＮＰ－ｓｓＤＮＡ又はＬＮＰ－ｃｅＤＮＡで処置されたマウスにおけるＦＶＩＩＩ発現プロフィールを、実施例１及び４に記載される各遺伝子構築物についてＬＮＰ－ｐＤＮＡで処置されたマウスのものと比較した。

【0565】

実施例６ｃ． ブースター注射後のｓｓＤＮＡ媒介又はｃｅＤＮＡ媒介ＦＶＩＩＩ発現のインビボ評価。
実施例６ｂにおいてＬＮＰ－ｓｓＤＮＡ又はＬＮＰ－ｃｅＤＮＡで処置されたマウスのサブセットに、最初の注射の２か月後に同じ用量で対応するＬＮＰの追加ＩＶＯＲＹ注射ブーストを投与した。ブースター注射の４８時間後から６ヶ月後まで選択された時点で血液サンプルを集めた。血中ＦＶＩＩＩ活性を発色ＦＶＩＩＩ活性アッセイにより分析した。ＬＮＰ－ｓｓＤＮＡ又はＬＮＰ－ｃｅＤＮＡで処置されたマウスにおけるＦＶＩＩＩ発現プロフィールを対応するＬＮＰ－ｐＤＮＡで処置されたマウスのものと比較する。

【0566】

実施例７． Ｂ１９又はＧＰＶ起源のＩＴＲを有する遺伝子発現構築物の遺伝子療法における一般的使用の有用性。
実施例７ａ． Ｂ１９又はＧＰＶ起源のＩＴＲを有するレポーター遺伝子構築物の生成。
遺伝子療法適用における一般的使用のためのプラットフォームとしての非ＡＡＶ ＩＴＲベースの遺伝子発現系の有用性を実証するために、実施例１ｂに記載される構築物に基づいてＢ１９ｄ１３５又はＧＰＶｄ１６２ ＩＴＲのいずれかに隣接している緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はルシフェラーゼ（ｌｕｃ）を用いて発現カセットを含むレポーター構築物を生成した。したがって、Ｂ１９－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ （図１Ｃ）及びＧＰＶ－ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ （図１Ｄ）におけるＦＶＩＩＩのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ＧＦＰ又はｌｕｃのいずれかのＯＲＦと従来の分子クローニング技術により置き換えた。

【0567】

マウスフェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）導入遺伝子を含有する、Ｂ１９ｄ１３５又はＧＰＶｄ１６２ ＩＴＲに隣接している発現カセットもまた生成し（図７Ａ）、これらを使用してフェニルケトン尿症の関連するマウスモデルにおいてＰＡＨ発現及び血中フェニルアラニン濃度の減少を評価した。このモデルを使用して、ＰＫＵマウス（ｎ＝３）に、非ＡＡＶ ＩＴＲに隣接しているｓｓＤＮＡ ２００μｇをハイドロダイナミック注入により肝臓発現のために投与した。血液サンプルを、３、７、１４、２８、４２、５６、７０、及び８１日目に集め、そして血漿をフェニルアラニン濃度決定のために単離した（図７Ｂ～７Ｃ）。Ｂ１９ｄ１３５ ＩＴＲを含有する発現カセットを投与されたマウスは、３日目に３７０μｇ／ｍｌから２１０μｇ／ｍｌへフェニルアラニンレベルの減少を示し、これは８１日目まで安定に維持された（図７Ｂ）。ＧＰＶｄ１６２ ＩＴＲカセットを投与されたマウスは、１４日目に３５０μｇ／ｍｌから３１０μｇ／ｍｌへ血中フェニルアラニンレベルの減少を示し、これは４２日目までに２５０μｇ／ｍｌの安定レベルまで低下し続けた（図７Ｃ）。血中フェニルアラニン濃度のこれらの減少は、注射前の濃度と比較して４５％及び３０％の減少を表す（図７Ｄ）。肝臓におけるマウスＰＡＨタンパク質の存在を確認するために、注射８１日後に処置されたマウスから採取された肝臓溶解物に対してウェスタンブロットを行った。マウスＰＡＨタンパク質を検出するために抗ＦＬＡＧタグ抗体を使用して、図７Ｅは処置された６匹の動物のうち５匹における検出可能なマウスＰＡＨタンパク質を示し、Ｂ１９ｄ１３５ ＩＴＲを含有するｓｓＤＮＡで処置されたマウスにおいて有意に高いタンパク質レベルが観察された。これらのデータは、図７Ｂ～７Ｄにおいて観察された血中フェニルアラニン減少と一致する。まとめると、これらは、一本鎖ＤＮＡ送達が機能性肝臓酵素の長期発現をもたらすことができるということを実証する。

【0568】

実験において使用された様々なＰＡＨ構築物の配列を表１０Ａ及び１０Ｂに示す。

【0569】

【表47】

【表48】

【表49】

【0570】

【表50】

【表51】

【表52】

【0571】

実施例７ｂ． Ｂ１９又はＧＰＶ起源のＩＴＲを有するｓｓＤＮＡレポーター遺伝子構築物の製造。
ｓｓＤＮＡレポーター／ＰＡＨ構築物は実施例１ｃに記載されるように製造される。簡潔には、プラスミドをＬｇｕＩを用いて消化する。形成されたヘアピンＩＴＲ構造を有するｓｓＤＮＡフラグメントを、ＬｇｕＩ消化の二本鎖ＤＮＡのフラグメント産物（レポーター発現カセット及びプラスミド主鎖）を９５℃で変性し、次いで４℃に冷却してパリンドロームＩＴＲ配列を折りたたませることにより生成する（図１Ａ）。得られたｓｓＤＮＡ構築物をマウスにおいて、肝臓、筋肉組織、眼の光受容体、及び中枢神経系（ＣＮＳ）の持続的な形質導入を確立する能力について試験した。

【0572】

実施例７ｃ． ｓｓＤＮＡ媒介レポーター発現のインビボ評価。
実施例７ｂに記載されるｓｓＤＮＡレポーター構築物の持続的な導入遺伝子発現をインビボで媒介する能力を確認するために、５～１２週齢マウス（４匹の動物／群）に、レポーターｓｓＤＮＡ ５、１０、又は２０μｇ／マウスを全身に、標的筋肉組織及びＣＮＳ細胞に局所的に、かつ／又は標的光受容体細胞へ網膜下に注入した。

【0573】

Ｂ１９及びＧＰＶ ＩＴＲベースの発現構築物の発現を評価するために、関連疾患マウスモデルを使用した。肝臓を標的とするためにこれらの遺伝子構築物をＨＤＩにより全身送達した。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【配列表】

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