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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-10
(45)【発行日】2024-12-18
(54)【発明の名称】収束抗体特異性配列パターンの識別
(51)【国際特許分類】
G16B 30/10 20190101AFI20241211BHJP
G16B 40/20 20190101ALI20241211BHJP
C07K 16/08 20060101ALI20241211BHJP
C07K 16/12 20060101ALI20241211BHJP
C07K 16/14 20060101ALI20241211BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241211BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241211BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241211BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241211BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241211BHJP
【ＦＩ】
G16B30/10
G16B40/20
C07K16/08
C07K16/12
C07K16/14
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021561675
(86)(22)【出願日】2020-05-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-05
(86)【国際出願番号】 IB2020054171
(87)【国際公開番号】W WO2020225693
(87)【国際公開日】2020-11-12
【審査請求日】2023-04-28
(31)【優先権主張番号】62/843,010
(32)【優先日】2019-05-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】519146639
【氏名又は名称】エーテーハー チューリッヒ
【氏名又は名称原語表記】ＥＴＨ ＺＵＲＩＣＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】フリーデンソン シモン
(72)【発明者】
【氏名】レッディ サイ
【審査官】藤原 拓也
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－０９７１０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０８１３８２４４（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ１６Ｂ ５／００－９９／００
Ｃ０７Ｋ １６／０８
Ｃ０７Ｋ １６／１２
Ｃ０７Ｋ １６／１４
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の抗原結合分子の抗原結合部分を表す複数の入力アミノ酸配列を候補識別システムに提供する工程と、前記候補識別システムによって実行されるエンコーダによって、前記複数の入力アミノ酸配列を潜在空間に変換する工程と、
前記候補識別システムによって実行されるクラスタリングエンジンによって、前記潜在空間内の複数の配列クラスタを判定する工程と、
前記クラスタリングエンジンによって、収束クラスタを識別する工程と、
前記候補識別システムによって実行される候補生成エンジンによって、前記収束クラスタによって画定された前記潜在空間内のサンプルを選択する工程と、
前記潜在空間内の前記サンプルに基づいて、デコーダを使用して前記候補生成エンジンによって、候補アミノ酸配列を生成する工程と、を含む、方法。
【請求項2】
前記抗原結合分子が、抗体、またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記抗原結合分子が、キメラ抗原受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記複数の入力アミノ酸配列が、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記複数の入力アミノ酸配列が、以下の１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法：(a)重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）配列、
(b)重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）配列、
(c)重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）配列、
(d)軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）配列、
(e)軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）配列、および／または
(f)軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）配列。
【請求項6】
前記複数の入力アミノ酸配列が、(a)全長重鎖、またはその抗原結合部分、および／または
(b)全長軽鎖、またはその抗原結合部分
を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
(a)前記デコーダが、複数の長期短期再帰ニューラルネットワークを含み、かつ、(b)前記候補配列を生成する工程が、前記サンプルを前記複数の長期短期再帰ニューラルネットワークの各々に提供することをさらに含む、
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記複数の入力アミノ酸配列を前記潜在空間に変換する工程が、前記複数の入力アミノ酸配列を変分深埋め込み（ＶａＤＥ）を用いて前記潜在空間に変換することをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記複数の配列クラスタを判定する工程が、混合モデリングを用いて前記複数の配列クラスタを判定することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記混合モデリングが、ガウス混合モデリング（ＧＭＭ）を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
プロセッサ実行可能命令を格納するメモリと、１つ以上のプロセッサと
を含み、
前記１つ以上のプロセッサは、
前記１つ以上のプロセッサによって実行されるエンコーダによって、抗体の抗原結合部分を表す複数の入力アミノ酸配列を受信し、
前記エンコーダによって、前記複数の入力アミノ酸配列を潜在空間に変換し、
前記１つ以上のプロセッサによって実行されるクラスタリングエンジンによって、前記潜在空間内の複数の配列クラスタを判定し、
前記クラスタリングエンジンによって、収束クラスタを識別し、
前記１つ以上のプロセッサによって実行される候補生成エンジンによって、前記収束クラスタによって画定された前記潜在空間内のサンプルを選択し、
前記潜在空間内の前記サンプルに基づいて、前記候補生成エンジンによって、候補配列を生成する、システム。
【請求項12】
(a)前記候補生成エンジンが、複数の長期短期再帰ニューラルネットワークを有するデコーダを含む、(b)前記エンコーダが変分深埋め込み（ＶａＤＥ）を用いて前記複数の入力アミノ酸配列を前記潜在空間に変換する、および／または
(c)前記クラスタリングエンジンがガウス混合モデリング（ＧＭＭ）を用いて前記複数の配列クラスタを判定する、
請求項１１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月３日に出願された米国特許出願第６２／８４３，０１０号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年５月３日に出願された米国特許出願第６２／８４３，０１０号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
開示の背景
抗体レパートリの深層配列決定は、免疫学、免疫診断、および薬物発見プロセスにおいて使用することができる。これらの大規模なデータセットの中から関連する情報を特定することは、依然として困難である。その中心的な問題は、抗原曝露が異なる個体において、どの程度まで抗体の配列が収束的に選択されるかということである。
抗体レパートリの深層配列決定は、免疫学、免疫診断、および薬物発見プロセスにおいて使用することができる。これらの大規模なデータセットの中から関連する情報を特定することは、依然として困難である。その中心的な問題は、抗原曝露が異なる個体において、どの程度まで抗体の配列が収束的に選択されるかということである。
【発明の概要】
【0003】
本解決策により、深層生成モデリングアプローチである変分オートエンコーダ（ＶＡＥ）を使用して、抗原に曝露された対象を含む哺乳動物対象の免疫レパートリから有意な表現を提供することができる。本明細書において、免疫化マウスの抗体レパートリへのこの手法の適用を実証する例示的なデータが提供される。本システムは、抗体レパートリを低次元潜在空間にマッピングすることができ、これにより大量の収束配列パターンが明らかになる。本システムは、線形分類器および変分オートエンコーダ（ＶＡＥ）と混合モデルとの組み合わせを使用して、抗原曝露を予測する収束クラスタに存在するパターンを識別することができる。一部の実施形態では、本システムは、変分深埋め込み（ＶａＤＥ）の使用をさらに含む。一部の実施形態では、混合モデルは、ガウス混合モデルである。本システムはまた、線形分類器およびＶＡＥ、続いて潜在空間における別個のクラスタリングステップを用いて、抗原曝露を予測する収束クラスタに存在するパターンを識別することができる。次いで、収束した抗体配列は、組換え抗体発現系において（例えば、哺乳類ディスプレイ系における全長ＩｇＧとして）発現され得、フローサイトメトリおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの技術を使用して、抗原特異的であることが実証され得る。本システムは、インシリコで数千の新規かつ機能的な変異体を生成することによって、収束配列空間を解明することもできる。
【0004】
本開示の少なくとも１つの態様によれば、方法は、候補識別システムに、抗体の抗原結合部分を表す複数の入力アミノ酸配列を提供することを含むことができる。方法は、候補識別システムによって実行されるエンコーダによって、複数の入力アミノ酸配列を潜在空間に変換することを含むことができる。方法は、候補識別システムによって実行されるクラスタリングエンジンによって、潜在空間内の複数の配列クラスタを判定することを含むことができる。方法は、クラスタリングエンジンによって、収束クラスタを識別することを含むことができる。方法は、候補識別システムによって実行される候補生成エンジンによって、収束クラスタによって画定される潜在空間内のサンプルを選択することを含むことができる。方法は、潜在空間内のサンプルに基づいて、デコーダを使用して候補生成エンジンによって、候補配列を生成することを含むことができる。
【0005】
一部の実装形態では、デコーダは、複数の長期短期再帰ニューラルネットワークを含むことができ、候補配列を生成することは、サンプルを複数の長期短期再帰ニューラルネットワークの各々に提供することを含むことができる。一部の実装形態では、複数の入力アミノ酸配列を潜在空間に変換することは、複数の入力アミノ酸配列を線形分類器および変分オートエンコーダと混合モデルとの組み合わせを用いて潜在空間に変換することを含むことができる。一部の実装形態では、本システムは、変分深埋め込み（ＶａＤＥ）を使用することができる。一部の実装形態では、本システムは、１つ以上の高密度層または長期短期メモリ層を使用することができる。複数の配列クラスタを判定することは、ガウス混合モデリング（ＧＭＭ）などの混合モデルを用いて複数の配列クラスタを判定することをさらに含む。
【0006】
一部の実装形態では、本システムは、プロセッサ実行可能命令を格納するメモリおよび１つ以上のプロセッサを含むことができる。本システムは、１つ以上のプロセッサによって実行されるエンコーダによって、抗体の抗原結合部分を表す複数の入力アミノ酸配列を受信することができる。本システムは、エンコーダによって、複数の入力アミノ酸配列を潜在空間に変換することができる。本システムは、１つ以上のプロセッサによって実行されるクラスタリングエンジンによって、潜在空間内の複数の配列クラスタを判定することができる。本システムは、クラスタリングエンジンによって、収束クラスタを識別することができる。本システムは、１つ以上のプロセッサによって実行される候補生成エンジンによって、収束クラスタによって画定された潜在空間内のサンプルを選択することができる。本システムは、潜在空間内のサンプルに基づいて、候補生成エンジンによって、候補配列を生成することができる。
【0007】
一部の実装形態では、候補生成エンジンは、複数の長期短期再帰ニューラルネットワークを有するデコーダを含むことができる。エンコーダは、複数の入力アミノ酸配列を線形分類器および変分オートエンコーダと混合エモデルとの組み合わせを用いて潜在空間に変換することができる。一部の実装形態では、本システムは、変分深埋め込み（ＶａＤＥ）を使用することができる。クラスタリングエンジンは、ＧＭＭなどの混合モデルを用いて複数の配列クラスタを判定することができる。
【0008】
入力アミノ酸配列は、ヒトおよび非ヒト動物を含む任意の哺乳類対象に由来し得る。入力アミノ酸配列は、健康な対象または疾患もしくは状態（例えば、病原性感染症、癌、自己免疫疾患、アレルギー反応、または炎症）を有する対象に由来し得る。入力アミノ酸配列は、過去に抗原に曝露した対象に由来し得る。入力アミノ酸配列は、過去に疾患または状態（例えば、病原性感染、癌、自己免疫疾患、アレルギー反応、炎症、または炎症性疾患）を有する健康な対象に由来し得る。入力アミノ酸配列は、免疫化された対象、例えば、ワクチンを受けた対象に由来し得る。
【0009】
入力アミノ酸配列は、抗体の任意の抗原結合部分を含むことができる。一部の実施形態では、入力アミノ酸配列は、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、入力アミノ酸配列は、１つ以上の重鎖ＣＤＲ、例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、またはこれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、入力アミノ酸配列は、１つ以上の軽鎖ＣＤＲ、例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、またはこれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、入力アミノ酸配列は、１つ以上の重鎖ＣＤＲおよび１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。一部の実施形態では、入力アミノ酸配列は、重鎖および／または軽鎖可変領域の１つ以上のフレームワーク領域を含む。一部の実施形態では、入力アミノ酸配列は、全長重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、入力アミノ酸配列は、全長軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、入力アミノ酸配列は、重鎖および／または軽鎖の１つ以上の定常領域を含む。一部の実施形態では、入力アミノ酸配列は、全長重鎖またはその抗原結合部分を含む。一部の実施形態では、入力アミノ酸配列は、全長軽鎖またはその抗原結合部分を含む。
【0010】
本明細書で提供される方法によって生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドもまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、生成されたアミノ酸配列は、抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその任意の部分である。一部の実施形態では、生成されたアミノ酸配列は、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、生成されたアミノ酸配列は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、生成されたアミノ酸配列は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、またはこれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、抗体またはその断片である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、全長抗体である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、抗体の１つ以上の部分を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、ｓｃＦｖまたはＦｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、キメラ抗原受容体である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、組換えタンパク質である。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原は、疾患または状態と関連付けられる。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、炎症性抗原、病原性抗原（例えば、ウイルス、細菌、酵母、寄生虫）である。一部の実施形態では、本明細書で生成されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、入力アミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと比較して、１つ以上の改善された特性を有する。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、入力アミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドと比較して、抗原に対する改善された親和性を有する。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、炎症性疾患、感染性疾患、癌、遺伝子障害、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、または免疫障害を治療するために投与することができる。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドは、炎症性疾患、感染性疾患、癌、遺伝子障害、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、および免疫障害を治療するための薬剤の製造に使用することができる。本明細書で生成されるアミノ酸配列を含む１つ以上のタンパク質またはペプチドを含む細胞もまた、本明細書に提供される。細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または本明細書で生成されたアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはペプチドを発現することができる任意の細胞であり得る。細胞は、免疫細胞、例えばＴ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）であり得る。一部の実施形態では、本明細書で生成されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドを使用して、生体サンプル中の抗原を検出することができる。
【0011】
本明細書では、図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドも提供される。一部の実施形態では、図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２５のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドは、抗体もしくはその断片である。一部の実施形態では、図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドは、全長抗体である。一部の実施形態では、図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドは、抗体の１つ以上の部分を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドは、ｓｃＦｖもしくはＦｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドは、キメラ抗原受容体である。一部の実施形態では、図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１２～図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドは、組換えタンパク質である。
【0012】
一部の実施形態では、図１０、図１２もしくは図１８～図１９のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１２もしくは表２～表３のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドは、卵白アルブミン抗原に結合する。一部の実施形態では、図１０、図１２、もしくは図１８～図１９のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１２、もしくは図１８～図１９のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドを使用して、（例えば、生体サンプル中の）卵白アルブミン抗原を検出することができる。
【0013】
一部の実施形態では、図１０、図１３、図２０もしくは図２１のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１３、図２０もしくは図２１のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドは、ＲＳＶ－Ｆ抗原に結合する。一部の実施形態では、図１０、図１３、図２０もしくは図２１のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１３、図２０もしくは図２１のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドを投与して、呼吸合胞体ウイルス感染症を治療することができる。一部の実施形態では、図１０、図１３、図２０もしくは図２１のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１３、図２０もしくは図２１のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドを使用して、呼吸合胞体ウイルス感染症を治療するための薬剤を製造することができる。一部の実施形態では、図１０、図１３、図２０もしくは図２１のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１３、図２０もしくは図２１のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドを使用して、（例えば、生体サンプル中で）ＲＳＶ－Ｆ抗原を検出することができる。
【0014】
本明細書では、図１０、図１２、図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１２、図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含む、１つ以上のタンパク質またはペプチドを含む細胞も提供される。細胞は、図１０、図１２、図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列、または図１０、図１２、図１３もしくは図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含むタンパク質もしくはペプチドを発現することができる哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞、または任意の細胞であり得る。細胞は、免疫細胞、例えばＴ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）であり得る。
【0015】
[本発明１００１]
複数の抗原結合分子の抗原結合部分を表す複数の入力アミノ酸配列を候補識別システムに提供する工程と、
前記候補識別システムによって実行されるエンコーダによって、前記複数の入力アミノ酸配列を潜在空間に変換する工程と、
前記候補識別システムによって実行されるクラスタリングエンジンによって、前記潜在空間内の複数の配列クラスタを判定する工程と、
前記クラスタリングエンジンによって、収束クラスタを識別する工程と、
前記候補識別システムによって実行される候補生成エンジンによって、前記収束クラスタによって画定された前記潜在空間内のサンプルを選択する工程と、
前記潜在空間内の前記サンプルに基づいて、デコーダを使用して前記候補生成エンジンによって、候補アミノ酸配列を生成する工程と、を含む、方法。
[本発明１００２]
前記抗原結合分子が、抗体、またはその抗原結合断片である、本発明１００１の方法。
[本発明１００３]
前記抗原結合分子が、キメラ抗原受容体である、本発明１００１の方法。
[本発明１００４]
前記入力アミノ酸配列が、相補性決定領域（ＣＤＲ）を表している、本発明１００２の方法。
[本発明１００５]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ３配列を含む、本発明１００４の方法。
[本発明１００６]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ１配列を含む、本発明１００４または１００５の方法。
[本発明１００７]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ２配列を含む、本発明１００４～１００６のいずれかの方法。
[本発明１００８]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＬ１配列を含む、本発明１００４～１００７のいずれかの方法。
[本発明１００９]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＬ２配列を含む、本発明１００４～１００８のいずれかの方法。
[本発明１０１０]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＬ３配列を含む、本発明１００４～１００９のいずれかの方法。
[本発明１０１１]
前記入力アミノ酸配列が、全長重鎖、またはその抗原結合部分を含む、本発明１００４～１０１０のいずれかの方法。
[本発明１０１２]
前記入力アミノ酸配列が、全長軽鎖、またはその抗原結合部分を含む、本発明１００４～１０１１のいずれかの方法。
[本発明１０１３]
前記デコーダが、複数の長期短期再帰ニューラルネットワークを含み、
前記候補配列を生成する工程が、前記サンプルを前記複数の長期短期再帰ニューラルネットワークの各々に提供することをさらに含む、本発明１００１～１０１２のいずれかの方法。
[本発明１０１４]
前記複数の入力アミノ酸配列を前記潜在空間に変換する工程が、前記複数の入力アミノ酸配列を変分深埋め込み（ＶａＤＥ）を用いて前記潜在空間に変換することをさらに含む、本発明１００１～１０１３のいずれかの方法。
[本発明１０１５]
前記複数の配列クラスタを判定する工程が、混合モデリングを用いて前記複数の配列クラスタを判定することをさらに含む、本発明１００１～１０１４のいずれかの方法。
[本発明１０１６]
前記混合モデリングが、ガウス混合モデリング（ＧＭＭ）を含む、本発明１０１５の方法。
[本発明１０１７]
プロセッサ実行可能命令を格納するメモリと、
１つ以上のプロセッサと
を含み、
前記１つ以上のプロセッサは、
前記１つ以上のプロセッサによって実行されるエンコーダによって、抗体の抗原結合部分を表す複数の入力アミノ酸配列を受信し、
前記エンコーダによって、前記複数の入力アミノ酸配列を潜在空間に変換し、
前記１つ以上のプロセッサによって実行されるクラスタリングエンジンによって、前記潜在空間内の複数の配列クラスタを判定し、
前記クラスタリングエンジンによって、収束クラスタを識別し、
前記１つ以上のプロセッサによって実行される候補生成エンジンによって、前記収束クラスタによって画定された前記潜在空間内のサンプルを選択し、
前記潜在空間内の前記サンプルに基づいて、前記候補生成エンジンによって、候補配列を生成する、システム。
[本発明１０１８]
前記候補生成エンジンが、複数の長期短期再帰ニューラルネットワークを有するデコーダを含む、本発明１０１７のシステム。
[本発明１０１９]
変分深埋め込み（ＶａＤＥ）を用いて前記複数の入力アミノ酸配列を前記潜在空間に変換する前記エンコーダを含む、本発明１０１７または１０１８のシステム。
[本発明１０２０]
ガウス混合モデリング（ＧＭＭ）を用いて前記複数の配列クラスタを判定する前記クラスタリングエンジンを含む、本発明１０１７～１０１９のいずれかのシステム。
[本発明１０２１]
タンパク質またはペプチドであって、前記タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列が、本発明１００１～１０１６のいずれかの方法、または本発明１０１７～１０２０のいずれかのシステムによって生成された候補アミノ酸配列である、タンパク質またはペプチド。
[本発明１０２２]
前記タンパク質またはペプチドが、抗原に結合する、本発明１０２１のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２３]
前記タンパク質またはペプチドが、キメラ抗原である、本発明１０２１または１０２２のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２４]
前記生成された候補アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明１０２１または１０２２のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２５]
前記生成された候補アミノ酸配列が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明１０２１、１０２２、または１０２４のいずれかのタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２６]
前記タンパク質またはペプチドが、抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明１０１１、１０２２、１０２４、または１０２５のいずれかのタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２７]
前記タンパク質またはペプチドが、抗体の１つ以上の部分を含む融合タンパク質である、本発明１０２１～１０２６のいずれかのタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２８]
前記タンパク質またはペプチドが、ｓｃＦｖまたはＦｃ融合タンパク質を含む、本発明１０２１～１０２６のいずれかのタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２９]
前記抗原が、疾患または状態と関連付けられている、本発明１０２１～１０２８のいずれかのタンパク質またはペプチド。
[本発明１０３０]
前記抗原が、腫瘍抗原である、本発明１０２９のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０３１]
前記抗原が、抗炎症性抗原である、本発明１０２９のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０３２]
前記抗原が、ウイルス、細菌、酵母、または寄生性抗原から選択される病原性抗原である、本発明１０２９のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０３３]
図１０、図１２、図１３または図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質またはペプチド。
[本発明１０３４]
図１０、図１２、図１３、または図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含む、タンパク質またはペプチド。
[本発明１０３５]
本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質またはペプチドを含む、細胞。
[本発明１０３６]
本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列を含む、細胞。
[本発明１０３７]
前記細胞が、哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または真核細胞である、本発明１０３５または１０３６の細胞。
[本発明１０３８]
前記細胞が、免疫細胞である、本発明１０３７の細胞。
[本発明１０３９]
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、本発明１０３８の細胞。
[本発明１０４０]
前記Ｔ細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞である、本発明１０３９の細胞。
[本発明１０４１]
前記タンパク質もしくはペプチド、または細胞が、炎症性疾患、感染性疾患、癌、遺伝子障害、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、または免疫障害を治療するために対象に投与される、本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質もしくはペプチド、または本発明１０３５～１０４０のいずれかの細胞。
[本発明１０４２]
前記タンパク質もしくはペプチド、または細胞が、炎症性疾患、感染性疾患、癌、遺伝子障害、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、または免疫障害を治療するための薬剤の製造のために使用される、本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質もしくはペプチド、または本発明１０３５～１０４０のいずれかの細胞。
[本発明１０４３]
生体サンプル中の抗原を検出するための、本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質またはペプチドの使用。
[本発明１０４４]
対象における抗原をインビボで検出するための、本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質またはペプチドの使用。
前述の概要および図面の以下の発明を実施するための形態および発明を実施するための形態は、例示的および説明的であり、特許請求される発明のさらなる説明を提供することを意図している。他の目的、利点、および新規の特徴は、以下の図面の簡単な説明および詳細な説明から、当業者に容易に明らかになるであろう。
複数の抗原結合分子の抗原結合部分を表す複数の入力アミノ酸配列を候補識別システムに提供する工程と、
前記候補識別システムによって実行されるエンコーダによって、前記複数の入力アミノ酸配列を潜在空間に変換する工程と、
前記候補識別システムによって実行されるクラスタリングエンジンによって、前記潜在空間内の複数の配列クラスタを判定する工程と、
前記クラスタリングエンジンによって、収束クラスタを識別する工程と、
前記候補識別システムによって実行される候補生成エンジンによって、前記収束クラスタによって画定された前記潜在空間内のサンプルを選択する工程と、
前記潜在空間内の前記サンプルに基づいて、デコーダを使用して前記候補生成エンジンによって、候補アミノ酸配列を生成する工程と、を含む、方法。
[本発明１００２]
前記抗原結合分子が、抗体、またはその抗原結合断片である、本発明１００１の方法。
[本発明１００３]
前記抗原結合分子が、キメラ抗原受容体である、本発明１００１の方法。
[本発明１００４]
前記入力アミノ酸配列が、相補性決定領域（ＣＤＲ）を表している、本発明１００２の方法。
[本発明１００５]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ３配列を含む、本発明１００４の方法。
[本発明１００６]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ１配列を含む、本発明１００４または１００５の方法。
[本発明１００７]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ２配列を含む、本発明１００４～１００６のいずれかの方法。
[本発明１００８]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＬ１配列を含む、本発明１００４～１００７のいずれかの方法。
[本発明１００９]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＬ２配列を含む、本発明１００４～１００８のいずれかの方法。
[本発明１０１０]
前記入力アミノ酸配列が、ＣＤＲＬ３配列を含む、本発明１００４～１００９のいずれかの方法。
[本発明１０１１]
前記入力アミノ酸配列が、全長重鎖、またはその抗原結合部分を含む、本発明１００４～１０１０のいずれかの方法。
[本発明１０１２]
前記入力アミノ酸配列が、全長軽鎖、またはその抗原結合部分を含む、本発明１００４～１０１１のいずれかの方法。
[本発明１０１３]
前記デコーダが、複数の長期短期再帰ニューラルネットワークを含み、
前記候補配列を生成する工程が、前記サンプルを前記複数の長期短期再帰ニューラルネットワークの各々に提供することをさらに含む、本発明１００１～１０１２のいずれかの方法。
[本発明１０１４]
前記複数の入力アミノ酸配列を前記潜在空間に変換する工程が、前記複数の入力アミノ酸配列を変分深埋め込み（ＶａＤＥ）を用いて前記潜在空間に変換することをさらに含む、本発明１００１～１０１３のいずれかの方法。
[本発明１０１５]
前記複数の配列クラスタを判定する工程が、混合モデリングを用いて前記複数の配列クラスタを判定することをさらに含む、本発明１００１～１０１４のいずれかの方法。
[本発明１０１６]
前記混合モデリングが、ガウス混合モデリング（ＧＭＭ）を含む、本発明１０１５の方法。
[本発明１０１７]
プロセッサ実行可能命令を格納するメモリと、
１つ以上のプロセッサと
を含み、
前記１つ以上のプロセッサは、
前記１つ以上のプロセッサによって実行されるエンコーダによって、抗体の抗原結合部分を表す複数の入力アミノ酸配列を受信し、
前記エンコーダによって、前記複数の入力アミノ酸配列を潜在空間に変換し、
前記１つ以上のプロセッサによって実行されるクラスタリングエンジンによって、前記潜在空間内の複数の配列クラスタを判定し、
前記クラスタリングエンジンによって、収束クラスタを識別し、
前記１つ以上のプロセッサによって実行される候補生成エンジンによって、前記収束クラスタによって画定された前記潜在空間内のサンプルを選択し、
前記潜在空間内の前記サンプルに基づいて、前記候補生成エンジンによって、候補配列を生成する、システム。
[本発明１０１８]
前記候補生成エンジンが、複数の長期短期再帰ニューラルネットワークを有するデコーダを含む、本発明１０１７のシステム。
[本発明１０１９]
変分深埋め込み（ＶａＤＥ）を用いて前記複数の入力アミノ酸配列を前記潜在空間に変換する前記エンコーダを含む、本発明１０１７または１０１８のシステム。
[本発明１０２０]
ガウス混合モデリング（ＧＭＭ）を用いて前記複数の配列クラスタを判定する前記クラスタリングエンジンを含む、本発明１０１７～１０１９のいずれかのシステム。
[本発明１０２１]
タンパク質またはペプチドであって、前記タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列が、本発明１００１～１０１６のいずれかの方法、または本発明１０１７～１０２０のいずれかのシステムによって生成された候補アミノ酸配列である、タンパク質またはペプチド。
[本発明１０２２]
前記タンパク質またはペプチドが、抗原に結合する、本発明１０２１のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２３]
前記タンパク質またはペプチドが、キメラ抗原である、本発明１０２１または１０２２のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２４]
前記生成された候補アミノ酸配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明１０２１または１０２２のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２５]
前記生成された候補アミノ酸配列が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明１０２１、１０２２、または１０２４のいずれかのタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２６]
前記タンパク質またはペプチドが、抗体またはその抗原結合断片を含む、本発明１０１１、１０２２、１０２４、または１０２５のいずれかのタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２７]
前記タンパク質またはペプチドが、抗体の１つ以上の部分を含む融合タンパク質である、本発明１０２１～１０２６のいずれかのタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２８]
前記タンパク質またはペプチドが、ｓｃＦｖまたはＦｃ融合タンパク質を含む、本発明１０２１～１０２６のいずれかのタンパク質またはペプチド。
[本発明１０２９]
前記抗原が、疾患または状態と関連付けられている、本発明１０２１～１０２８のいずれかのタンパク質またはペプチド。
[本発明１０３０]
前記抗原が、腫瘍抗原である、本発明１０２９のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０３１]
前記抗原が、抗炎症性抗原である、本発明１０２９のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０３２]
前記抗原が、ウイルス、細菌、酵母、または寄生性抗原から選択される病原性抗原である、本発明１０２９のタンパク質またはペプチド。
[本発明１０３３]
図１０、図１２、図１３または図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、タンパク質またはペプチド。
[本発明１０３４]
図１０、図１２、図１３、または図１８～図２２のいずれかに示されるアミノ酸配列の１つ以上のＣＤＲ配列を含む、タンパク質またはペプチド。
[本発明１０３５]
本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質またはペプチドを含む、細胞。
[本発明１０３６]
本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列を含む、細胞。
[本発明１０３７]
前記細胞が、哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または真核細胞である、本発明１０３５または１０３６の細胞。
[本発明１０３８]
前記細胞が、免疫細胞である、本発明１０３７の細胞。
[本発明１０３９]
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、本発明１０３８の細胞。
[本発明１０４０]
前記Ｔ細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞である、本発明１０３９の細胞。
[本発明１０４１]
前記タンパク質もしくはペプチド、または細胞が、炎症性疾患、感染性疾患、癌、遺伝子障害、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、または免疫障害を治療するために対象に投与される、本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質もしくはペプチド、または本発明１０３５～１０４０のいずれかの細胞。
[本発明１０４２]
前記タンパク質もしくはペプチド、または細胞が、炎症性疾患、感染性疾患、癌、遺伝子障害、臓器移植拒絶反応、自己免疫疾患、または免疫障害を治療するための薬剤の製造のために使用される、本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質もしくはペプチド、または本発明１０３５～１０４０のいずれかの細胞。
[本発明１０４３]
生体サンプル中の抗原を検出するための、本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質またはペプチドの使用。
[本発明１０４４]
対象における抗原をインビボで検出するための、本発明１０２１～１０３４のいずれかのタンパク質またはペプチドの使用。
前述の概要および図面の以下の発明を実施するための形態および発明を実施するための形態は、例示的および説明的であり、特許請求される発明のさらなる説明を提供することを意図している。他の目的、利点、および新規の特徴は、以下の図面の簡単な説明および詳細な説明から、当業者に容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0016】
添付の図面は、縮尺に合わせて描画されることを意図しない。種々の図面における同様の参照番号および指定は、同様の要素を示している。明確にするために、全ての構成要素が全ての図面にラベル付けされているわけではない場合がある。
【0017】
【図1】例示的な候補識別システムのブロック図を示す。
【図2】インシリコ配列を生成するためのフロー図である。種々の抗原を免疫化した４５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄由来の抗体レパートリが配列決定される。次いで、抗体配列を使用して、深層生成モデルが訓練され、当該深層生成モデルは、新規の配列を生成することと、入力配列をその潜在的な埋め込みに基づいて異なるクラスタに割り当てることと、の両方を行うことができる。クラスタの割り当ては、特定のレパートリまたは抗原コホートで大きく濃縮された配列を識別するために使用される。抗原関連クラスタの天然配列およびインシリコで生成された配列は、全長ＩｇＧとして発現され、結合抗体として検証される。図は、配列番号４１～４６、３７、および４７～５２を、それぞれ出現順に開示する。
【図5】変分オートエンコーダの例示的な深層ニュートラルネットワークを示す。灰色のボックスはモデルへの入力を示し、淡赤色のボックスは種々の（数学的な）演算を示す。紫色のボックスは、モデルの訓練可能な層を強調している。暗赤色はモデルの出力を示す。灰色のボックスには、全てのクラスタ次元で重みが共有されている層が含まれている。変分オートエンコーダは、入力として、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を受け取ることができる。種々の長さのＣＤＲＨを処理するために、本システムは、一定の固定長（データ内の各ＣＤＲＨの最大長）に達するまで、ダッシュで配列をパディングする。本システムは、パディングされた配列をワンホットエンコーディングし、連結し、これを変分オートエンコーダ（ＶＡＥ）への入力として使用する。図２に示されるように、ＶＡＥは、高密度層（例えば、非線形活性化関数）と線形層の両方を含む。高密度層は、例えば、２５６～５１２個または他の量の範囲のフィルタまたはユニットを含むことができる。線形層は、１０個のユニット、または一部の他の数のユニットを含むことができる。
【図6】抗原関連配列の識別および特徴付けを示す。（Ａ）主成分分析（ＰＣＡ）によって可視化された２つの抗体レパートリの１０次元潜在空間。青色および赤色の点は、それぞれ、１つのＯＶＡ（２Ｃ）およびＲＳＶ－Ｆ（２Ｃ）レパートリに属する配列を示す。拡大された領域では、１つのレパートリに特異的な配列とそれらのそれぞれの配列モチーフのみを含む２つの学習されたクラスタが強調されている。（Ｂ）抗体レパートリは、潜在空間における学習された配列クラスタに基づいてベクターに変換される。再コード化ベクターは、抗原曝露の線形サポートベクターマシン（ＳＶＭ）分類器の入力として使用される。混同行列は、特徴としてクラスタ標識および生の配列を用いた５分割交差検証中の各モデルの集計予測結果を示している。（Ｃ）ヒートマップは、各コホートの全ての予測配列クラスタおよび収束配列クラスタを含む。赤色の破線は、一次免疫のみを受けたマウスを示す。（Ｄ）各抗原コホートに見られる収束クラスタの例示的な配列ロゴ。
【図7】抗原特異的抗体を含有する種々のレパートリにわたるクラスタ特異的配列を示す。（Ａ）４つの抗原関連重鎖プールから調製した上清の全ての抗原に対する用量依存性吸光度曲線。（Ｂ）異なる収束ＯＶＡ関連またはＲＳＶ－Ｆ関連ＶＨをそれぞれ利用する６つのモノクローナル細胞集団のフローサイトメトリヒストグラム。灰色のヒストグラムは陰性対照を表し、色付きのヒストグラムは収束抗体を示す。（Ｃ）ＲＳＶ３と同じクラスタからの異なるＶＨ配列を使用する、収束変異体（ＣＶ）の１２モノクローナル細胞集団のフローサイトメトリヒストグラム。（Ｄ）表は、選択されたＣＶのＣＤＲＨ３およびそれらが見出されたＲＳＶ－Ｆ免疫化マウスレパートリを示す。赤色文字は、最初に発見された配列ＲＳＶ３の配列との差異を示す。（Ｅ）散布図は、ＲＳＶ３クラスタ由来のＣＶのマウスレパートリごとの頻度ランク分布を示す。赤色の点は、（Ｃ）で結合することが確認されたＶＨを強調している。（Ｆ）円グラフは、ＲＳＶ－ＦおよびＯＶＡの両方について、収束クローンにおいて最も利用される９つのＶ遺伝子生殖細胞株を示す。図は、配列番号５３～６５を、それぞれ出現順に開示する。
【図8】深層生成モデリングおよびインシリコ抗体配列の生成を示す。（Ａ）抗体配列空間の概略的な深層生成モデリングであり、クラスタを選択するか、またはランダムにサンプリングし、選択されたパラメータに基づいて、ランダムサンプルを多変量正規分布から採取する。次いで、エンコーダは、新規の配列がサンプリングされる多変量多項式分布にエンコーディングを変換する。（Ｂ）散布図は、２つの潜在的な天然に存在する変異体を示し、黄色の点は、結合抗体であることが確認された１０個の最も頻繁にインシリコサンプリングされたエンコーディングを示す。右の表は、それらのＣＤＲＨ３配列および１，０００，０００回のサンプリング後のそのカウントを示す（それぞれ出現順に、配列番号６６～７５）。赤色文字は、初期の生体配列（ＲＳＶ３、黒色で示される）に対する差異を示す。
【図9】提供される深層生成モデルによって選択される新しいＶＨ配列を生成およびテストするための例示的な作業フローを示す。候補の重鎖は、実装されたバイオインフォマティック配列クラスタリングフレームワークに基づいて、各抗原のバルク重鎖配列決定データセットから選択される。配列を遺伝子合成し、ＨＤＲドナーベクターにクローニングする（ステップ１）。各抗原について、軽鎖レパートリは、マルチプレックスＰＣＲによって同じ抗原で免疫化したマウスのＲＮＡから増幅される。次いで、得られた軽鎖ライブラリを、各重鎖について別個のＨＤＲドナーＶＬライブラリを作製するために、ステップ１で作製したＨＤＲドナーベクターにクローニングする（ステップ２）。次いで、得られたＨＤＲドナーライブラリを、ＰｎＰ ｍＲｕｂｙ／Ｃａｓ９細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの組み込みのためのＤＮＡ修復テンプレートとして使用し、それによって、同じ候補重鎖であるが異なる軽鎖を有する抗体を発現するハイブリドーマ細胞クローンのライブラリを作製する。抗原特異的クローンは、蛍光活性化細胞選別によって濃縮される。
【図10-1】ハイブリドーマライブラリのフローサイトメトリ分析を示す。（Ａ）～（Ｂ）ＯＶＡ、および（Ｃ）～（Ｄ）ＲＳＶ－Ｆのハイブリドーマ細胞ライブラリのフローサイトメトリ分析であり、配列ライブラリ濃縮ドットプロットを（Ａ）および（Ｃ）に示す。それぞれの抗原特異的モノクローナル細胞株は、所与の抗原に対して特異的でない陰性対照細胞株に関して、ヒストグラムプロット（Ｂ）および（Ｄ）に示される。図１０Ｂは、配列番号７６～８１、７９、８２～８３、７９、８２、８４、４７～４８、８５、７９、８２、および８６を、図１０Ｄは、配列番号８７～９５を、それぞれ出現順に開示する。
【図11】抗原特異的であることが確認された収束配列のＥＬＩＳＡデータを示す。抗原特異的ハイブリドーマモノクローナル細胞株の上清ＥＬＩＳＡプロファイルを、（Ａ）ＯＶＡおよび（Ｂ）ＲＳＶ－Ｆについて示す。開始細胞株ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ／Ｃａｓ９を、陰性対照として使用した。
【図12】抗原特異的であることが確認された収束配列のアラインメントを示す。抗原特異的抗体のためのＶＨアミノ酸アラインメント。（Ａ）ＯＶＡおよびＲＳＶ変異体について、全長ＶＤＪアラインメントを示す（それぞれ出現順に、配列番号９６～１０４）。（Ｂ）ＯＶＡおよびＲＳＶ－Ｆの連結ＣＤＲＨ１－ＣＤＲＨ２－ＣＤＲＨ３アミノ酸アラインメントを示す（ＣＤＲの配列は、連続したものとして解釈されることを意図したものではない）。使用されるカラーコードは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｖ１０．２．６ソフトウェアを使用したＣｌｕｓｔａｌカラーリングスキームから派生したものである。図は、配列番号７６～８１、７９、８２～８３、７９、８２、８４、４７～４８、８５、７９、８２、および８６～９５としてＣＤＲ配列を、それぞれ出現順に開示する。
【図13】ＲＳＶ３クラスタからの収束変異体のアミノ酸配列アラインメントを示す（それぞれ出現順に、配列番号１０５～１１６、および１０４）。ＲＳＶ３クラスタからの収束天然変異体（ＮＶ）のＶＨアミノ酸アラインメントである。使用されるカラーコードは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｖ１０．２．６のＣｌｕｓｔａｌカラーリングスキームに由来している。
【図14】変分オートエンコーダの再構築精度を示す。棒グラフは、クラスタ数の関数として達成された再構築精度を示す。クラスタ（ｋ）の量を増やすことで再構築精度が上がり、ｋ＝２０００以降はリターンが減少する。
【図15】ＲＳＶ３ ＣＤＲＨ３抗体ライブラリスクリーニングワークフローのワークフローを示す。（Ａ）ＲＳＶ３ ＣＤＲＨ３ライブラリを、示したロゴによって描写された配列空間を表す退化コドンを有するｓｓＯＤＮを使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９相同性指向突然変異誘発によって生成した。（Ｂ）その後、トランスフェクト細胞を、抗体発現およびＲＳＶ－Ｆに対する特異性または陰性度について２つの連続したステップで選別した。
【図16】ＲＳＶ３生成ＣＤＲＨ３ライブラリからのサンプリング結果を示す。ヒストグラムは、ＶＡＥデコーダモデルに従って、ＲＳＶ３ ＣＤＲＨ３ライブラリ画面の陽性（青色）および陰性（赤色）画分からの配列が生じる可能性が高いことを示す。陽性変異体は、わずかではあるが有意に発生する可能性が高い（Ｐ＜０．００１、マン・ホイットニーのＵ検定）。右側の緑色のヒストグラムは、生体レパートリで観察される変異体の確率を示す。
【図17】ＲＳＶ３ ＣＤＲＨ３ライブラリスクリーニングからの深層配列決定結果を示す。配列ロゴは、ＲＳＶ３ ＣＤＲＨ３ライブラリ画面の（Ａ）陽性画分および（Ｂ）陰性画分に見出される集約された配列を示す。
【図18】ＯＶＡに結合することが確認された配列を示す。図は、配列番号９６～１０１として「ＨＣ」配列を、配列番号１１７～１２２として「ＬＣ」配列を、それぞれ出現順に開示する。
【図19】ＯＶＡ１およびＯＶＡ５のサロゲートＶＬ鎖配列を示す。図は、配列番号１２３～１２９を、それぞれ出現順に開示する。
【図20】ＲＳＶに結合することが確認された配列を示す。図は、配列番号１０２～１０４として「ＨＣ」配列を、配列番号１３０～１３２として「ＬＣ」配列を、それぞれ出現順に開示する。
【図21】ＲＳＶ１、２、および３のサロゲートＶＬ鎖配列を示す（それぞれ出現順に、配列番号１３３～１３５）。
【図22】抗原結合についてスクリーニングした収束抗体配列を示す。この表は、抗原結合について実験的にスクリーニングした収束配列を示す。最も右側の３つの列は、それぞれの方法によって配列が識別され得るかどうかを示す。配列がそのコホートにおいて少なくとも１つの他のマウスと共有されているが、任意の他の抗原コホートにおいて観察されなかった場合、配列は、公開クローンとして発見されたであろう。括弧内の数は、収束クラスタ内で見出された配列の数を示す。図は、配列番号７６、７９、７９、７９、４７、７９、８７、９０、９３、および１３６として「ＣＤＲ１」配列を、配列番号７７、８０、８２、８２、４８、８２、８８、９１、９４、および１３７として「ＣＤＲ２」配列を、配列番号１３８～１４３、３８～３９、５３、および４０として「ＣＤＲ３」配列を、それぞれ出現順に開示する。
【発明を実施するための形態】
【0018】
詳細な説明
上記で導入され、かつ以下でさらに詳細に考察される種々の概念は、実装形態のいかなる特定の様式にも限定されないため、数多くの方式の実装形態のいずれかで実施することができる。特定の実装形態および用途の例は、主に例示的な目的のために提供される。
上記で導入され、かつ以下でさらに詳細に考察される種々の概念は、実装形態のいかなる特定の様式にも限定されないため、数多くの方式の実装形態のいずれかで実施することができる。特定の実装形態および用途の例は、主に例示的な目的のために提供される。
【0019】
本明細書に記載される方法は、深層生成モデリングアプローチである、変分オートエンコーダ（ＶＡＥ）を使用するものであり、抗原に曝露された対象を含む、哺乳動物対象の免疫レパートリから有意な表現を提供する。本システムは、抗体レパートリを低次元潜在空間にマッピングすることができ、これにより大量の収束配列パターンが明らかになる。一部の実施形態では、本システムは、線形分類器および変分深埋め込み（ＶａＤＥ）を使用して、抗原曝露を予測する収束クラスタに存在するパターンを識別することができる。一部の実施形態では、統計的有意性を検定するために、ｔ検定、フィッシャーの正確確率検定、またはパーミュテーション検定などの統計的検定が、線形分類器の代わりに使用される。次いで、収束した抗体配列は、組換え発現系において（例えば、哺乳類ディスプレイ系における全長ＩｇＧとして）発現され得、フローサイトメトリおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの技術を使用して、抗原特異的であることを実証することができる。システムは、インシリコで数千の新規かつ機能的な変異体を生成することによって、収束配列空間を解明することもできる。本方法は、改善された特性を有する治療および診断（標的識別）抗体剤の開発に適用することができる。
【0020】
図１は、候補配列と称され得るインシリコ配列を生成する例示的なシステム１００のブロック図を示す。候補識別システム１０２は、１つ以上のプロセッサ１０４および１つ以上のメモリ１０６を含むことができる。プロセッサ１０４は、本明細書に記載される機能を実行するためにプロセッサ実行可能命令を実行することができる。プロセッサ１０４は、エンコーダ１０８、クラスタリングエンジン１１０、デコーダ１１２、および候補選択エンジン１１４を実行させることができる。メモリ１０６は、プロセッサ実行可能命令を格納し、データを生成し、収集されたデータを格納することができる。メモリ１０６は、１つ以上の分類器重み１２２を格納することができる。メモリ１０６はまた、分類データ１１６、訓練データ１１８、および候補データ１２０を格納することができる。
【0021】
システム１００は、１つ以上の候補識別システム１０２を含むことができる。候補識別システム１０２は、プロセッサ１０４などの少なくとも１つの論理デバイスを含むことができる。候補識別システム１０２は、データおよびプロセッサ実行可能命令を格納することができる少なくとも１つのメモリ要素１０６を含むことができる。候補識別システム１０２は、少なくとも１つのデータセンター内に位置する複数のコンピューティングリソースまたはサーバを含むことができる。候補識別システム１０２は、複数の論理的に群化されたサーバを含み、分散コンピューティング技術を容易にすることができる。サーバの論理群は、データセンター、サーバファーム、またはマシンファームと称され得る。サーバは地理的に分散させることもできる。候補識別システム１０２は、任意のコンピューティングデバイスであり得る。例えば、候補識別システム１０２は、１つ以上のラップトップ、デスクトップ、タブレット、スマートフォン、ポータブルコンピュータ、またはそれらの任意の組み合わせであり得るか、またはそれらを含むことができる。
【0022】
候補識別システム１０２は、１つ以上のプロセッサ１０４を含むことができる。プロセッサ１０４は、候補識別システム１０２に情報処理能力を提供することができる。プロセッサ１０４は、デジタルプロセッサ、アナログプロセッサ、情報を処理するデジタル回路、情報を処理するように設計されたアナログ回路、状態機械、および／または情報を電子的に処理するための他の機構のうちの１つ以上を含むことができる。各プロセッサ１０４は、複数の処理ユニットまたは処理コアを含むことができる。プロセッサ１０４は、メモリ１０６と電気的に結合することができ、エンコーダ１０８、クラスタリングエンジン１１０、デコーダ１１２、および候補生成エンジン１１４を実行することができる。
【0023】
プロセッサ１０４は、１つ以上のマイクロプロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。プロセッサ１０４は、アナログプロセッサであり得、１つ以上の抵抗ネットワークを含むことができる。抵抗ネットワークは、複数の入力および複数の出力を含むことができる。複数の入力の各々、および複数の出力の各々は、ナノワイヤと結合され得る。入力のナノワイヤは、メモリ要素を介して出力のナノワイヤと結合され得る。メモリ要素は、ＲｅＲＡＭ、メモリスタ、またはＰＣＭを含むことができる。プロセッサ１０４は、アナログプロセッサとして、アナログ信号を使用して行列ベクトル乗算を実行することができる。
【0024】
候補識別システム１０２は、１つ以上のエンコーダ１０８を含むことができる。エンコーダ１０８は、潜在空間に入力配列をエンコードするためのアプリケーション、アプレット、スクリプト、サービス、デーモン、ルーチン、または他の実行可能ロジックであり得る。エンコーダ１０８は、ニューラルネットワークオートエンコーダを含むことができる。エンコーダ１０８は、特に、図３に関してさらに説明される。概要として、エンコーダ１０８は、標識されていない入力配列を受信し、入力配列をより低次元の空間にマッピング（またはエンコーディング）することができる。エンコーダ１０８は、例えば、変分オートエンコーダ（ＶＡＥ）を使用して、入力配列をより低次元の空間にエンコードすることができる。一部の実施形態では、エンコーダは、変分深埋め込み（ＶａＤＥ）を使用する。エンコーダ１０８は、入力配列を例えば５次元空間にマッピングすることができる。一部の実施形態では、エンコーダは、潜在空間のガウス混合モデル（ＧＭＭ）ベースのクラスタリングなどの混合モデルと共に、深層生成モデルを共同で最適化することができる。
【0025】
候補識別システム１０２は、１つ以上のクラスタリングエンジン１１０を含むことができる。クラスタリングエンジン１１０は、潜在空間内のクラスタを判定するためのアプリケーション、アプレット、スクリプト、サービス、デーモン、ルーチン、または他の実行可能ロジックであり得る。クラスタリングエンジン１１０は、Ｋ平均クラスタリングを使用して、潜在空間内の入力配列からエンコーダ１０８によって生成されたクラスタを識別することができる。クラスタリングエンジン１１０は、ガウス混合モデリング（ＧＭＭ）を使用して潜在空間内のクラスタを識別することができる。
【0026】
候補識別システム１０２は、１つ以上のデコーダ１１２を含むことができる。デコーダ１１２は、アプリケーション、アプレット、スクリプト、サービス、デーモン、ルーチン、または他の実行可能ロジックであってもよく、潜在空間内の入力からの出力配列をデコードするか、または別様で作成することができる。デコーダ１１２は、特に、図４に関してさらに説明される。デコーダ１１２は、潜在空間からサンプルを受信し、配列（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を再構築することができる。例えば、デコーダ１１２は、潜在空間サンプルを、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の配列を表すワンホットエンコーディング行列に変換することができる。一部の実装形態では、デコーダ１１２は、複数の異なるニューラルネットワークを含むことができる。例えば、デコーダ１１２は、潜在的な空間サンプルから生成された配列の各々について、異なるニューラルネットワークを含むことができる。デコーダ１１２は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列の各々を生成するための異なるニューラルネットワークを含むことができる。デコーダ１１２のニューラルネットワークは、長期短期再帰ニューラルネットワークであり得る。
【0027】
候補識別システム１０２は、候補生成エンジン１１４を含むことができる。クラスタリングエンジン１１０によって識別されたクラスタから、デコーダ１１２を使用して、候補生成エンジン１１４は、インシリコ出力配列を生成することができる。例えば、候補生成エンジン１１４は、潜在空間からサンプルを選択することができる。候補生成エンジン１１４は、潜在空間内の定義済みクラスタ内からサンプルを選択することができる。候補生成エンジン１１４は、サンプルをデコーダ１１２に提供して、出力としてインシリコ配列を生成することができ、候補生成エンジン１１４は、候補データ１２０としてこれをメモリに格納することができる。
【0028】
候補識別システム１０２は、１つ以上のメモリ１０６を含むことができる。メモリ１０６は、メモリ要素であり得るか、またはメモリ要素を含むことができる。メモリ１０６は、プロセッサ１０４によって実行されたときに、プロセッサ１０４に、本明細書に記載された動作のうちの１つ以上を実行させ得る機械命令を格納することができる。メモリ１０６は、プロセッサ１０４に命令を提供することができる電子的、光学的、磁気的、または任意の他の記憶デバイスを含むことができるが、これらに限定されない。メモリ１０６は、フロッピーディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、光学媒体、またはプロセッサ１０４が命令を読み取ることができる任意の他の好適なメモリを含むことができる。命令は、限定されないが、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｊａｖａ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ、Ｐｅｒｌ、ＨＴＭＬ、ＸＭＬ、Ｐｙｔｈｏｎ、およびＶｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃなどの任意の好適なコンピュータプログラミング言語からのコードを含むことができる。
【0029】
候補識別システム１０２は、分類器重み１２２をメモリ１０６に格納することができる。分類器重み１２２は、エンコーダ１０８およびデコーダ１１２のニューラルネットワークを定義する重みおよびバイアスを含むデータ構造であり得る。訓練されると、分類エンジン１０８は、例えば、分類器重み１２２をメモリ１０６に格納して、インシリコ配列を後で検索し、生成するために使用することができる。
【0030】
訓練段階の間、エンコーダ１０８およびデコーダ１１２は、訓練データ１１８を処理して、エンコーダ１０８およびデコーダ１１２内の１つ以上の機械学習モデルに対する重みおよびバイアスを生成することができる。訓練されると、エンコーダ１０８およびデコーダ１１２は、重みおよびバイアスを分類器重み１２２としてメモリ１０６に格納することができる。エンコーダ１０８およびデコーダ１１２の訓練データおよび訓練の生成は、以下に、メモリ１０６、訓練データ１１８、および実施例に関連してさらに説明される。エンコーダ１０８およびデコーダ１１２が訓練されると、重みおよびバイアスは、分類器重み１２２としてメモリ１０６に保存され得る。分類エンジン１０８のモデル（例えば、畳み込みニューラルネットワーク、高密度層、およびＬＳＴＭニューラルネットワーク）は、特に、図２および図３に関連してさらに説明される。
【0031】
図２は、例えば、図１に例示されるシステムを使用してインシリコ配列を生成するためのフロー図２００を示す。フロー図２００は、３つの段階を含む。第１の段階２０２の間、訓練または検定データが生成される。第２の段階２０４の間、深埋め込みを実行して、エンコーダ１０８を訓練することができる。第３の段階２０６の間、候補生成エンジン１１４は、抗原関連クラスタを識別し、次いで、インシリコ配列を生成することができる。例えば、実施例のセクションに関連してさらに説明するように、種々の抗原で免疫化した４５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄からの抗体レパートリを配列決定して、訓練データ１１８を生成することができる。候補識別システム１０２は、訓練データ１１８を使用して、第２の段階２０４の間にエンコーダ１０８およびデコーダ１１２を訓練することができる。訓練済みエンコーダ１０８は、配列の潜在的埋め込みに基づいて、入力配列を別個のクラスタに割り当てることができる。第３の段階３０６の間、候補生成エンジン１１４は、特定のレパートリまたは抗原コホートにおいて濃縮されたクラスタを識別することができる。候補生成エンジン１１４は、抗原関連クラスタからインシリコ配列を生成することができる。
【0032】
図３は、エンコーダ１０８の例示的なアーキテクチャ３００を示す。エンコーダ１０８は、アーキテクチャ３００の第１の層で入力３０２を受信することができる。図３は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列を含む配列の入力を示すが、入力配列は任意の他の配列であってもよい。アーキテクチャ３００は、パディング層３０４を含むことができる。パディング層３０４は、ゼロパディング、ダッシュパディング、またはそれ以外の場合、全ての入力配列が同じ長さを有するように入力配列をパディングすることができる。例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の異なるバリエーションは、異なる配列長を有してもよい。パディング層３０４は、それぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列の各々の最長の変異体よりも短い長さを有する変異体の末端に、ゼロ、ダッシュ、または他の値を追加することができる。パディング層２０４を出る各配列は、所定の長さ（またはサイズ）を有することができる。アーキテクチャ３００は、ワンホットエンコーディング層３０６を含むことができ、当該ワンホットエンコーディング層３０６は、パディングされた入力配列（パディング層３０４から出力される）をワンホットエンコーディング行列に変換する。ワンホットエンコーディング層３０６は、例えば、パディングされた入力配列の各位置についての行を含む、ワンホットエンコーディング行列を生成することができる。ワンホットエンコーディング行列の各列は、異なる可能性のあるアミノ酸に対応することができ、これにより、パディングされた入力配列のそれぞれの値を各々満たすことができる。この例では、配列に追加されるパディングされた値（例えば、０）のための２０個のアミノ酸および別の列が存在するので、ワンホットエンコーディング行列は、２１個の列を含む。ワンホットエンコーディング行列の各行には、パディングされた入力配列のそれぞれの値に存在するアミノ酸に対応した列に１が含まれる。一部の実装形態では、ワンホットエンコーディング層３０６は、ＢＬＯＳＵＭ２６またはＢｌｏｍａｐなどの、ワンホットエンコーディングとは異なるエンコーディングを使用することができるエンコーディング層であり得る。
【0033】
アーキテクチャ３００は、連結層３０８を含むことができ、当該連結層３０８は、（この例では）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のワンホットエンコーディング行列を単一のワンホットエンコーディング行列に連結する。
【0034】
アーキテクチャ３００は、訓練可能な層であり得る複数の相互接続された層３１０を含むことができる。層３１０の各々は、１つ以上のニューロンを含むことができる。図３に示すように、層３１０の一部分は、２１個のニューロンを含むことができ、層３１０の一部分は、６４個のユニットを含むことができる。アーキテクチャ３００は、複数の演算層３１２を含むことができ、複数の演算層３１２は、層３１０からの出力に対して数学的演算を組み合わせるか、または別様で実行することができる。アーキテクチャ３００は、訓練可能な正規化層３１４を含むことができる。アーキテクチャ３００は、正規化層３１４の出力をフラット化して出力ベクトルを生成する層３１６を含むことができ、これは、複数の正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）を含む層３１８と完全に相互接続することができる。
【0035】
図４は、図１に図示されたデコーダ１１２の例示的なデコーダアーキテクチャ４００を示す図である。アーキテクチャ４００は、潜在空間からサンプルを受信または選択することができる。図４の例示的なアーキテクチャ４００に例示されるように、潜在空間は５次元の潜在空間であり得る。アーキテクチャ４００は、デコーダ１１２によって再作成される各配列についての異なるニューラルネットワーク４０２を含むことができる。図示された例では、デコーダ１１２は、インシリコでＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む配列を生成している（または別様に生成している）。したがって、図４に示される例では、アーキテクチャ４００は、３つのニューラルネットワークを含むことができ、それらの各々は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３上の各々に対応する。ニューラルネットワーク４０２は、高密度層を含むことができ、または長期短期再帰ニューラルネットワーク（ＬＳＴＭ－ＲＮＮ）層を含むことができる。ニューラルネットワーク内の高密度層は、非線形である層を指し得る。高密度層は、ｗｘ＋ｂなどの線形式を含むことができるが、高密度層の最終結果は、次いで、ｙ＝ｆ（ｗ＊ｘ＋ｂ）のような活性化関数と称される非線形関数に渡すことができる。非線形活性化関数の例として、例えば、ユニットステップ、サイン（ｓｉｇｎ）、区分的線形、ロジスティック、双曲線接線、正規化線形ユニット、または正規化ソフトプラスが挙げられる。例えば、ニューラルネットワーク４０２の各々の出力は、ソフトマックス活性化を用いてフィードフォワード層４０４に入力することができる。層４０４の出力は、ワンホットエンコーディング行列であり得、これは、エンコーダ１０８で使用されるのと同じワンホットエンコーディングを使用する。ワンホットエンコーディング出力行列は、配列に変換され得る。
【0036】
本明細書に記載の方法に従って訓練されると、深層学習モデルを使用して、極めて大きなインシリコ生成された変異体のライブラリから、数百万の抗原結合剤を予測することができる。これらの変異体は、複数の開発可能性フィルタに供され得、結果として、数万の最適化されたリード候補が得られる。そのスケーラブルなスループットおよび広大なタンパク質配列空間を調べる能力により、本明細書に記載される方法は、抗体および他のタンパク質ベースの治療薬のエンジニアリングおよび最適化を伴う多種多様な用途に適用され得る。
【実施例】
【0037】
適応免疫は、高度に多様な一連の適応免疫受容体（例えば、Ｂ細胞受容体およびＴ細胞受容体、ならびに分泌抗体）を生成するその能力、およびその後の外来抗原を認識することができるそれらの受容体のクローン選択および拡大によって駆動され得る。これらの原理は、独自の動的な免疫レパートリをもたらすることができる。深層配列決定は、１つの種内の個々の生物にわたって共通に共有される受容体の存在の証拠を提供することができる。種々の抗原に対する特異的受容体を収束的に選択することは、個々の生物にわたる共通の共有受容体の存在に対する一説明を提供する。マウスの抗体レパートリにおける収束的な選択は、種々の範囲のタンパク質抗原および免疫化条件に対して生じ得る。本実施例では、特に、図１～図３に示すシステムおよびアーキテクチャに類似したシステムを用いて、変分エンコーディングを行った。この例では、ガウス混合モデル（ＧＭＭ）ベースのクラスタリングなど、変分オートエンコーダと混合モデルとを組み合わせる生成モデリング技術が使用される。本システムは、変分エンコーディングを使用して、抗体レパートリをより低次元の潜在空間にマッピングすることができ、多数の収束抗原特異的配列パターン（ＡＡＳＰ）を発見することを可能にする。線形な一対一のサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して、本システムにより、最大９５％の精度で抗原曝露を予測する配列パターンを識別した。ＡＡＳＰを有する天然および変分エンコーディング生成抗体の両方の組換え発現により、標的抗原への結合が確認される。本実施例により、深層生成モデリングが、免疫診断、ならびに抗体発見および工学に適用され得ることが例示される。
【0038】
Ｉ．結果
再配列されたＢ細胞受容体（ＢＣＲ）遺伝子座の標的化された深層配列決定により、所与の組織または細胞集団におけるＢ細胞または発現された抗体のレパートリを明らかにすることができる。深層配列決定データを使用して、４５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄における抗体レパートリを分析し、これを、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）、Blue Carrier Protein（ＢＣＰ）、または呼吸合胞体ウイルス融合タンパク質（ＲＳＶ－Ｆ）のいずれかのタンパク質抗原で免疫化したコホートに分けた。図２に示し、表１に概説したように、ＯＶＡ、ＨＥＬ、およびＢＣＰコホートを、ゼロ、１、２、または３回のブースター免疫を受ける群にさらに細分化した。血清ＥＬＩＳＡにより、全てのマウスにおいて抗原特異的抗体力価が確認され、一次免疫のみを受けたマウスは、有意に弱い力価を示している。ＲＮＡを骨髄からバルク抽出し、可変重鎖ＩｇＧ配列決定ライブラリを、２ステップＲＴ－ＰＣＲプロトコルを使用して調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製のＭｉＳｅｑ上でライブラリを配列決定し、品質を処理し、アラインメントし、全てのマウスにわたって、３つ全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）の合計２４３，３７４個の独自の組み合わせを得た。
再配列されたＢ細胞受容体（ＢＣＲ）遺伝子座の標的化された深層配列決定により、所与の組織または細胞集団におけるＢ細胞または発現された抗体のレパートリを明らかにすることができる。深層配列決定データを使用して、４５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの骨髄における抗体レパートリを分析し、これを、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）、Blue Carrier Protein（ＢＣＰ）、または呼吸合胞体ウイルス融合タンパク質（ＲＳＶ－Ｆ）のいずれかのタンパク質抗原で免疫化したコホートに分けた。図２に示し、表１に概説したように、ＯＶＡ、ＨＥＬ、およびＢＣＰコホートを、ゼロ、１、２、または３回のブースター免疫を受ける群にさらに細分化した。血清ＥＬＩＳＡにより、全てのマウスにおいて抗原特異的抗体力価が確認され、一次免疫のみを受けたマウスは、有意に弱い力価を示している。ＲＮＡを骨髄からバルク抽出し、可変重鎖ＩｇＧ配列決定ライブラリを、２ステップＲＴ－ＰＣＲプロトコルを使用して調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製のＭｉＳｅｑ上でライブラリを配列決定し、品質を処理し、アラインメントし、全てのマウスにわたって、３つ全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）の合計２４３，３７４個の独自の組み合わせを得た。
【0039】
（表１）免疫化スケジュール
【0040】
図６は、正確な配列類似性を超えた収束がどの程度発生するかを評価するためのワークフローを示す。図６は、抗原関連配列の識別および特徴付けを示す。（Ａ）主成分分析（ＰＣＡ）によって可視化された２つの抗体レパートリの１０次元潜在空間。青色および赤色の点は、それぞれ、１つのＯＶＡ（２Ｃ）およびＲＳＶ－Ｆ（２Ｃ）レパートリに属する配列を示す。拡大された領域は、１つのレパートリに特異的な配列とそれらのそれぞれの配列モチーフのみを含む２つの学習されたクラスタを強調している。（Ｂ）抗体レパートリは、潜在空間における学習された配列クラスタに基づいてベクターに変換される。再コード化ベクターは、抗原曝露の線形サポートベクターマシン（ＳＶＭ）分類器の入力として使用される。混同行列は、特徴としてクラスタ標識および生の配列を用いた５分割交差検証中の各モデルの集計予測結果を示している。（Ｃ）ヒートマップは、各コホートの全ての予測配列クラスタおよび収束配列クラスタを含む。赤色の破線は、一次免疫のみを受けたマウスを示す。（Ｄ）各抗原コホートに見られる収束クラスタの例示的な配列ロゴ。
【0041】
図７は、種々のレパートリにわたるクラスタ特異的配列を示す。（Ａ）各抗原について収束可変重鎖（ＶＨ）プールを有する抗体を発現するハイブリドーマ細胞から調製した上清の用量依存性吸光度曲線。（Ｂ）異なる収束ＯＶＡ関連またはＲＳＶ－Ｆ関連ＶＨを各々利用する６つのモノクローナル細胞集団のフローサイトメトリヒストグラム。灰色のヒストグラムは陰性対照を表し、色付きのヒストグラムは収束抗体を示す。（Ｃ）ＲＳＶ３と同じクラスタからの異なるＶＨ配列を使用する、収束変異体（ＣＶ）の１２モノクローナル細胞集団のフローサイトメトリヒストグラム。（Ｄ）表は、選択されたＣＶのＣＤＲＨ３およびそれらが見出されたＲＳＶ－Ｆ免疫化マウスレパートリを示す。赤色文字は、最初に発見された配列ＲＳＶ３配列との差異を示す。（Ｅ）散布図は、ＲＳＶ３クラスタ由来のＣＶのマウスレパートリごとの頻度ランク分布を示す。赤い点は、（Ｃ）で結合することが確認されたＶＨを強調している。（Ｆ）円グラフは、ＲＳＶ－ＦおよびＯＶＡの両方について、収束クローンにおいて最も利用される９つのＶ遺伝子生殖細胞株を示す。
【0042】
特に、図１～図５に示されるシステムおよびアーキテクチャは、潜在空間との間のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列、およびそれらの適切な組み合わせをエンコードおよびデコードすることができる。潜在空間内の配列は、ＧＭＭに従ってクラスタ化することができ、類似の配列は、同じクラスタに分類され、密接に関連するクラスタは潜在空間内の類似の領域を占有する。一部の実施形態では、深層ニューラルネットワークは、配列をエンコード（図３）およびデコード（図４）するために使用され、ＧＭＭの事前処理および入力配列を再構築するそれらの能力に関して最適化される。潜在的エンコーディングの次元数を増加させることで、モデルの再構築能力を向上させ、１０次元のエンコーディング層を用いることで、本システムは、９３％以上の再構築精度を実現した（図１４）。図６Ａに例示されるように、主成分分析（ＰＣＡ）を使用して、潜在的エンコーディングを可視化し、関連する配列が、実際に潜在配列空間内の同じクラスタおよび領域にマッピングされたことを示すことができる。収束量は、それぞれの抗原免疫化の予測性が高い潜在的クラスタを識別することによって定量化した。配列をそれらのそれぞれのクラスタに群化し、再コード化されたレパートリを使用して、線形な一対一のＳＶＭ分類器を訓練および交差検証した。このワークフローのベースラインを確立するために、線形サポートベクターマシン（ＳＶＭ）もまた、公開クローン（ＣＤＲＨ１－ＣＤＲＨ２－ＣＤＲＨ３ ａ．ａ．の配列が正確に一致したもの）の発生について訓練され、抗原曝露の予測（５分割交差検証）に対し４２％の精度が得られた。対照的に、ＶＡＥベースのクラスタ割り当てを使用し、その後クラスタ濃縮に基づいてレパートリをエンコードする場合、結果として生じる分類器は、８０％を超える予測精度を達成することができた（図６Ｂ）。モデルを完全なデータ上で再訓練し、クラスタを非パラメトリックパーミュテーション検定に基づいて選択し、０．０５未満のボンフェローニ補正したｐ値を有する有意に濃縮されたクラスタを選択した。より詳しく調べることによって、全てのマウスがそれぞれの収束クラスタの全てを発現したわけではなく、むしろ、小さいながらも予測可能なサブセットを発現したことが明らかになった（図６Ｃ）。発見された収束クラスタの数は、抗原の大きさおよび複雑さとよく相関している。所与のクラスタにマッピングする全ての配列を比較することで、本システムにより、ＶａＤＥが生物学的に有意なクラスタを構築することができる方法が実証された。繰り返しとなるが、集約された配列ロゴを単一のレパートリから生成されたロゴと比較することで、収束配列空間の潜在的多様性が示され、収束が特定のＣＤＲに焦点を当てていないことが強調されている（図６Ａおよび図６Ｃ）。
【0043】
抗原予測配列収束が抗原認識によって実際に駆動されることを確認するために、収束ＶＨ配列の小さなサブセットを、単一のレパートリからクローニングした可変軽鎖（ＶＬ）ライブラリと共に発現させた（図１９～図２２および図９）。哺乳類の発現系を、抗原特異性をスクリーニングするためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａ９媒介性ライブラリの組み込みにカップリングすることを通じて、抗体のディスプレイおよび分泌に利用した。ライブラリ細胞株の上清上で実施したＥＬＩＳＡは、全ての４つの抗原に対して正しい特異性を実証した（図６Ａ、図６Ｃ）。さらに、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、単一の抗原特異的クローンを識別した（図７Ｂ、図９、および図１０）。次いで、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による単一クローン単離を通じて、ＲＳＶ－ＦおよびＯＶＡという２つの抗原の重鎖プールをより詳細に調べた。本ステップで識別した抗原特異的クローンおよびそれらの対応する重鎖を、再び新しいモノクローナル細胞集団の上清上で実施したＥＬＩＳＡによって確認した（図７Ｂ、図７Ｃ、および図１０）。この手順により、本発明者らは、（選択された６つのうちの）６つのＯＶＡの抗原特異性、および（選択された４つのうちの）３つのＲＳＶ－Ｆ収束ＶＨ配列の抗原特異性を確認することができた（図１９～図２２）。ＶＨ鎖は、異なるマウスレパートリからのＶＬ鎖と対合することができ、さらに、ＶＨ鎖優位結合に対する収束性を強調するものであった（図１９～図２２）。全ての抗原は種々のＶ遺伝子生殖細胞株と関連付けられていたが、本発明者らは、収束抗体が抗原依存的な様式で異なるＶ遺伝子セグメントを利用していることに気付き、元のＶ遺伝子生殖細胞株が収束的な選択に寄与していることを強調させた（図７Ｆ）。
【0044】
同じ収束クラスタにマッピングする抗体配列変異体も抗原特異的であることを確認するために、本発明者らは、クラスタマッピングから確認されたＲＳＶ－Ｆ結合剤の１つに１２個の収束ＶＨ変異体（同じ抗原で免疫化された他のマウスに由来）を組換えて発現させた（ＲＳＶ３、図１３）。これらの１２個の収束変異体は、同じＶＬのＲＳＶ３で発現させた。フローサイトメトリにより、これらの収束変異体の１２個全てが実際に抗原特異的であることを確認した（図７ｃ）。１００％または８０％のＶＨＣＤＲＨ３ ａ．ａ．同一性（２，４）の標準的なクローノタイプ定義を使用して、１２個の変異体のうち、それぞれ、０個または５個のみが、レパートリ間で収束することを特定した（図７ｄ）。対照的に、ＶＡＥモデルは、低くても６４％のＣＤＲＨ３ ａ．ａ．同一性を有するＲＳＶ３の変異体を発見することができ（１１個のミスマッチのうち４個）、過去のロゴプロットによって明らかになる大きな潜在的多様性を検証することができた（図６ｄ、図７ｆ）。それらの配列多様性に加えて、これらのクローンはまた、それぞれのマウスレパートリにおいて、確認された結合剤が高頻度、中頻度、および低頻度であり、その存在範囲が大きいことを確認した（図７ｅ）。
【0045】
最後に、本発明者らは、ＶＡＥモデルが未見のデータにどの程度一般化することができるかを理解することを目指した。初めに、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９相同性指向突然変異誘発を通じてＲＳＶ３クローンの抗体ＣＤＲＨ３ライブラリを実験的に生成した。ライブラリの多様性は、ＲＳＶ３クラスタのデコーダ生成配列をモデル化するように設計された一方で、完全にランダム化された位置も含有していた（図１５ａ）。ＦＡＣＳによるハイブリドーマ抗体ライブラリのスクリーニング、続いて深層配列決定により、１９，２７０個の表面発現変異体が得られ、そのうち７，４７０個が抗原結合であることを確認した（図１５ｂ）。ＶＡＥモデル下でこれらの新規変異体の確率を評価した際、本発明者らは、結合ＣＤＲＨ３が、非結合変異体よりも著しく生成される可能性が高いことを見出した（図１６）。しかしながら、ライブラリは、自然界では観察されなかったａ．ａ．も含有していたため、その変異体の大部分は、天然に存在する配列よりも、本発明者らのモデルによって生成される可能性は低いものであった（図１６、図１７）。しかしながら、分布間が重複していることから、ＶＡＥモデルがこれらの変異体の一部をインシリコで生成することができることが示された。本発明者らは、この事実を１００万回の潜在的エンコーディングをサンプリングして確認した。
【0046】
ＩＩ．考察
本解決策は、広範囲の収束を明らかにし、インシリコ配列を生成するための分析ツールおよびワークフローを提供することができる。本システムは、ＶＨスクリーニングワークフローを含むことができ、これにより、抗体発現およびディスプレイ系に基づくバイオインフォマティクスおよびスクリーニング技術を組み合わせることができる。エンコーダによって明らかにされた収束クラスタまたはデコーダによって生成されたインシリコ配列を使用して、薬物開発のための最適な特性（例えば、抗体開発能）を評価することができる。収束クラスタ抗体を実験アッセイを、通じて使用して、それらの同族の結合エピトープ（例えば、ペプチド／タンパク質抗原ライブラリアレイ、質量分析）を識別することもでき、これらの同族エピトープは、薬物開発の標的として機能し得る。収束クラスタはまた、個体の免疫状態または健康／疾患状態を評価するための診断として使用され得る。
本解決策は、広範囲の収束を明らかにし、インシリコ配列を生成するための分析ツールおよびワークフローを提供することができる。本システムは、ＶＨスクリーニングワークフローを含むことができ、これにより、抗体発現およびディスプレイ系に基づくバイオインフォマティクスおよびスクリーニング技術を組み合わせることができる。エンコーダによって明らかにされた収束クラスタまたはデコーダによって生成されたインシリコ配列を使用して、薬物開発のための最適な特性（例えば、抗体開発能）を評価することができる。収束クラスタ抗体を実験アッセイを、通じて使用して、それらの同族の結合エピトープ（例えば、ペプチド／タンパク質抗原ライブラリアレイ、質量分析）を識別することもでき、これらの同族エピトープは、薬物開発の標的として機能し得る。収束クラスタはまた、個体の免疫状態または健康／疾患状態を評価するための診断として使用され得る。
【0047】
要約すると、本システムにより、マウスの抗体レパートリにおいて、一連の抗原にわたる広範囲の収束が生じることが示される。収束を検出するために使用されている現在のアプローチは、正確なＣＤＲ３配列同一性を調べるか、または８０％の配列同一性の閾値を使用しており、個々の収束モチーフにおいて４０％を超える非類似性が見られるため、収束パターンの完全なスケールは部分的にしか回復することができない。収束を抽出するために使用され得る他のクラスタリングアルゴリズムも、しばしば、任意の類似性閾値の定義を必要とする。本解決策では、これらのパラメータをデータから学習して、種々の程度の類似性のクラスタが形成される。さらに、これらのシステムにより、レパートリの奥深くに埋もれている収束モチーフを発見することができる。これは、利用可能な配列決定データの量が増加するにつれて、同様の現象がヒトでもより一般的に観察される可能性があることを強調するものである。さらに、本発明者らは、深層生成モデリングを使用して、新規かつ機能的な抗体をインシリコで生成する方法を初めて示し、それによって、深層配列決定から抗体発見能力を大幅に拡張させることを可能とした。
【0048】
ＩＩＩ．方法
Ａ．免疫化
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールスリバー社製）を、抗原、すなわちニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、Blue Carrier Protein（ＢＣＰ）および呼吸合胞体ウイルス糖タンパク質（ＲＳＶ）に基づいて、コホート（１０～１２匹）に分離した。マウスに、２００μｇ抗原および２０μｇモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）アジュバントの皮下注射を行った。最終的な免疫接種（ブースト１、２、または３）は、アジュバントなしで腹腔内注射当たり５０μｇの抗原で行った。中間免疫接種（ブースト１および／または２）は、５０μｇ抗原および２０μｇ ＭＰＬＡで行った。順次、３週間間隔で注射を行った。全てのアジュバントおよび抗原を調製し、実験の前にアリコートし、対応する注射の日に混合した。最終的な免疫化の１０日後にマウスを屠殺し、骨髄を後足の大腿骨から抽出した。次いで、単離した骨髄を４００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上清を除去し、１．２５ｍＬのトリゾールを添加した。次いで、骨髄を、１８Ｇ×２インチの針（１．２×５０ｍｍ）を使用して均質化した。次いで、得られたトリゾール溶液１ｍＬを、処理するまで－８０℃で凍結した。マウスコホートおよび免疫群を表１に記載する。
Ａ．免疫化
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールスリバー社製）を、抗原、すなわちニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、Blue Carrier Protein（ＢＣＰ）および呼吸合胞体ウイルス糖タンパク質（ＲＳＶ）に基づいて、コホート（１０～１２匹）に分離した。マウスに、２００μｇ抗原および２０μｇモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）アジュバントの皮下注射を行った。最終的な免疫接種（ブースト１、２、または３）は、アジュバントなしで腹腔内注射当たり５０μｇの抗原で行った。中間免疫接種（ブースト１および／または２）は、５０μｇ抗原および２０μｇ ＭＰＬＡで行った。順次、３週間間隔で注射を行った。全てのアジュバントおよび抗原を調製し、実験の前にアリコートし、対応する注射の日に混合した。最終的な免疫化の１０日後にマウスを屠殺し、骨髄を後足の大腿骨から抽出した。次いで、単離した骨髄を４００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上清を除去し、１．２５ｍＬのトリゾールを添加した。次いで、骨髄を、１８Ｇ×２インチの針（１．２×５０ｍｍ）を使用して均質化した。次いで、得られたトリゾール溶液１ｍＬを、処理するまで－８０℃で凍結した。マウスコホートおよび免疫群を表１に記載する。
【0049】
Ｂ．マウス骨髄からのＲＮＡ抽出
１ｍＬのホモジネートを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡミニキット（ライフテクノロジーズ社製、１２１８３０１８Ａ）の入力として使用した。次に、製造業者のガイドラインに従って、ＲＮＡ抽出を行った。
１ｍＬのホモジネートを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡミニキット（ライフテクノロジーズ社製、１２１８３０１８Ａ）の入力として使用した。次に、製造業者のガイドラインに従って、ＲＮＡ抽出を行った。
【0050】
Ｃ．抗体レパートリライブラリの調製および深層配列決定
深層配列決定のための抗体可変重鎖（ＶＨ）ライブラリを、包括的なエラーおよびバイアス補正を可能にする分子増幅フィンガープリント（ＭＡＦ）のプロトコルを使用して調製した（Ｋｈａｎ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，「Ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ」Ｓｃｉ Ａｄｖ，２０１６．２（３）：ｐ．ｅ１５０１３７１）。簡潔に述べると、ＩｇＧサブタイプの定常重領域１（ＣＨ１）に対応する遺伝子特異的プライマーを使用し、逆ユニーク分子識別子（ＲＩＤ）を含有するオーバーハング領域を用いて、全ＲＮＡ上で逆転写の第１のステップを実施した。次に、多重ＰＣＲは、ＶＨのフレームワーク１（ＦＲ１）領域にアニールし、フォワード分子識別子（ＦＩＤ）および部分的Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターのオーバーハング領域を有するフォワードプライマーセットを使用して、第１鎖ｃＤＮＡ上で実行され、リバースプライマーはまた、部分的Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプターを含有している。最終的なシングルプレックスＰＣＲステップを実施して、完全なＩｌｌｕｍｉｎａアダプターの添加を完了する。ライブラリ調製後、フラグメントアナライザ（アジレント社製）上で、全体的なライブラリの品質および濃度を判定した。次いで、ライブラリをプールし、品質目的のために１０％のＰｈｉＸ ＤＮＡを添加した試薬ｖ３キット（２×３００ｂｐ）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上で配列決定した。
深層配列決定のための抗体可変重鎖（ＶＨ）ライブラリを、包括的なエラーおよびバイアス補正を可能にする分子増幅フィンガープリント（ＭＡＦ）のプロトコルを使用して調製した（Ｋｈａｎ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，「Ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ」Ｓｃｉ Ａｄｖ，２０１６．２（３）：ｐ．ｅ１５０１３７１）。簡潔に述べると、ＩｇＧサブタイプの定常重領域１（ＣＨ１）に対応する遺伝子特異的プライマーを使用し、逆ユニーク分子識別子（ＲＩＤ）を含有するオーバーハング領域を用いて、全ＲＮＡ上で逆転写の第１のステップを実施した。次に、多重ＰＣＲは、ＶＨのフレームワーク１（ＦＲ１）領域にアニールし、フォワード分子識別子（ＦＩＤ）および部分的Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターのオーバーハング領域を有するフォワードプライマーセットを使用して、第１鎖ｃＤＮＡ上で実行され、リバースプライマーはまた、部分的Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプターを含有している。最終的なシングルプレックスＰＣＲステップを実施して、完全なＩｌｌｕｍｉｎａアダプターの添加を完了する。ライブラリ調製後、フラグメントアナライザ（アジレント社製）上で、全体的なライブラリの品質および濃度を判定した。次いで、ライブラリをプールし、品質目的のために１０％のＰｈｉＸ ＤＮＡを添加した試薬ｖ３キット（２×３００ｂｐ）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上で配列決定した。
【0051】
Ｄ．データの前処理および配列アライメント
アラインメントの前に、生のＦＡＳＴＱファイルをカスタムＣＬＣゲノミクスワークベンチ１０スクリプトによって処理した。まず、０．０５の品質制限を有する品質トリミングオプションを使用して、低品質ヌクレオチドを除去した。その後、順方向および逆方向の読み取り対をマージし、得られた３５０～６００個の塩基対をさらなる分析のために保持した。次いで、前処理した配列をエラー補正し、アラインメントさせた。
アラインメントの前に、生のＦＡＳＴＱファイルをカスタムＣＬＣゲノミクスワークベンチ１０スクリプトによって処理した。まず、０．０５の品質制限を有する品質トリミングオプションを使用して、低品質ヌクレオチドを除去した。その後、順方向および逆方向の読み取り対をマージし、得られた３５０～６００個の塩基対をさらなる分析のために保持した。次いで、前処理した配列をエラー補正し、アラインメントさせた。
【0052】
Ｅ．抗体レパートリへの変分深埋め込み（ＶａＤＥ）
また、図１および図３を参照すると、特に、エラー誤差およびバイアス補正、ならびに抗体レパートリ配列決定データのアラインメントの後、各データセットについてのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の発見された全ての組み合わせを抽出した。種々の長さのＣＤＲＨを処理するために、図３に関して上述したように、一定の固定長（データ中の各ＣＤＲＨの最大長）に達するまで、配列をダッシュでパディングした。パディングされた配列は、特に、図３に関して、ワンホットエンコーディングされ、連結され、変分オートエンコーダ（ＶＡＥ）への入力として使用した。ＶＡＥモデルでは、以下の式に従って、潜在空間のガウス混合モデル（ＧＭＭ）ベースのクラスタリングと共に、その入力を再構築する能力を共同で最適化する。
ここで、
また、次式のような事後の変分近似を行う。式中、ｑ（ｚ│ｘ，ｙ）がガウス分布に従って分布すると仮定している。
ｑ（ｙ，ｚ│ｘ）＝ｑ（ｙ│ｘ）ｑ（ｚ｜ｘ，ｙ）
また、図１および図３を参照すると、特に、エラー誤差およびバイアス補正、ならびに抗体レパートリ配列決定データのアラインメントの後、各データセットについてのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の発見された全ての組み合わせを抽出した。種々の長さのＣＤＲＨを処理するために、図３に関して上述したように、一定の固定長（データ中の各ＣＤＲＨの最大長）に達するまで、配列をダッシュでパディングした。パディングされた配列は、特に、図３に関して、ワンホットエンコーディングされ、連結され、変分オートエンコーダ（ＶＡＥ）への入力として使用した。ＶＡＥモデルでは、以下の式に従って、潜在空間のガウス混合モデル（ＧＭＭ）ベースのクラスタリングと共に、その入力を再構築する能力を共同で最適化する。
ｑ（ｙ，ｚ│ｘ）＝ｑ（ｙ│ｘ）ｑ（ｚ｜ｘ，ｙ）
【0053】
本技術では、事後モデリングの際に平均場近似を行わないことで、モデルの安定性を高めることができる。本システムは、全ての層で共有された重みを使用して、全ての入力配列を、あたかもその配列が（ワンホットエンコーディングされたクラスタ標識によって示される）全てのクラスタに属するかのようにエンコードおよびデコードすることができる。次に、本システムは、特定のクラスタに属する配列の確率を記述する別々に予測された確率ｑ（ｙ│ｘ）によって、全体の損失に対する最終的な寄与を重み付けする（図５）。デコーダは、入力配列および連結されたクラス標識を、正規化線形ユニット（ＲｅＬＵ）活性化を伴う２つの高密度層、続いて最終の１０次元の層を使用して、より低い次元（ｄ＝１０）の空間にマッピングする。配列は、デコーダを使用して潜在空間からサンプリングされ、再作成される。復号化ネットワーク（図５）は、ＲｅＬＵ活性化を伴う２つの別個の高密度層、続いて線形活性化を伴う高密度層を採用しており、その出力は、初期のワンホットエンコーディングＣＤＲＨの確率を再構築するために、ソフトマックス活性化で再形成および正規化することができる。標準多クラス交差エントロピー損失は、再構築項として使用され得る。例えば、全てのＶＡＥモデルは、並列コンピューティングクラスタ（例えば、ＥＴＨチューリッヒ並列コンピューティングクラスタ）の単一のＧＰＵノード上で訓練され得る。訓練には、確率最適化アルゴリズムを使用して、全てのモデルに２００個のエポックを含めることができる。
【0054】
ＶａＤＥは、図２に示されるように、潜在空間のガウス混合モデル（ＧＭＭ）ベースのクラスタリングと共に、深層生成モデルを共同で最適化することができる。エンコーダ１０８は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を連結し、セルフアテンション層にそれらを供給する。この層の入出力は、正規化された残査ブロックを形成する。正規化された残査ブロックは、位置ごとの完全に接続されたフィードフォワードニューラルネットワーク層に入力される。次いで、この層の出力は、線形変換を使用して、より低次元の潜在空間にマッピングされる。
【0055】
また、図１および図４を参照すると、特に、デコーダ１１２は、潜在空間から配列を再作成することができる。デコーダ１１２は、図４に示すように、３つの別個の長い短期再帰ニューラルネットワーク（ＬＳＴＭ－ＲＮＮ）層を用いることができ、その出力は、初期のワンホットエンコーディングＣＤＲを個別に再構築するために、ソフトマックス活性化を伴うフィードフォワード層を使用して処理される。各ＶａＤＥモデルは、例えば、並列コンピューティングクラスタのＧＰＵノードで訓練された。訓練は、１００回以上の事前訓練と１０００回以上の完全訓練を含むことができる。事前訓練するために、図３に図示されている上述のアーキテクチャを層が反映する深層オートエンコーダモデルを使用した。事前訓練が完了した後、潜在空間でＧＭＭを学習し、オートエンコーダの層重みとＧＭＭパラメータの両方を使用してフルモデルを初期化した。
【0056】
Ｆ．単一抗体レパートリの抗原曝露の予測
レパートリデータセットを５つのフォールドに分割し、各フォールドは、異なる抗原群の数でおおよそバランスが取れており、各データセットは、全てのフォールドにわたって１回のみ現れる。次いで、この分割を使用して、交差検証手順を実行し、ここで、５つのフォールドの各々を１回テストセットとして確保し、残りの４つのフォールドを訓練データとして使用した。５つの訓練／テスト分割の各々について、訓練セットからの全てのレパートリにわたる全ての配列を入力として組み合わせることによって、別個のＶＡＥモデルが学習された。次いで、訓練済みモデルについて、訓練およびテストセットの両方からのクラスタリング割り当てまたは配列を計算した。これらのクラスタ標識に基づいて、各レパートリをｎ次元ベクトルとして再コード化した。ここで、ｎは、可能なクラスタの数であり、ｉ番目の要素は、所与のレパートリ内のｉ番目のクラスタにマッピングする配列の数を示す。次いで、これらのベクトルを使用して、一対一の設定で線形サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）を訓練し、検証した。また、リソースを大量に消費するネスト化された交差検証手順を防ぐために、ＳＶＭのハイパーパラメータを最適化せず、代わりにサイキット－ラーン（ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ）の「ＳＶＣ」の実装形態で与えられた標準値（線形カーネルを使用）を使用することにした。可視化の目的のために、各交差検証ステップの結果を、１つの単一の混同行列に群化した（図６Ｂ）。
レパートリデータセットを５つのフォールドに分割し、各フォールドは、異なる抗原群の数でおおよそバランスが取れており、各データセットは、全てのフォールドにわたって１回のみ現れる。次いで、この分割を使用して、交差検証手順を実行し、ここで、５つのフォールドの各々を１回テストセットとして確保し、残りの４つのフォールドを訓練データとして使用した。５つの訓練／テスト分割の各々について、訓練セットからの全てのレパートリにわたる全ての配列を入力として組み合わせることによって、別個のＶＡＥモデルが学習された。次いで、訓練済みモデルについて、訓練およびテストセットの両方からのクラスタリング割り当てまたは配列を計算した。これらのクラスタ標識に基づいて、各レパートリをｎ次元ベクトルとして再コード化した。ここで、ｎは、可能なクラスタの数であり、ｉ番目の要素は、所与のレパートリ内のｉ番目のクラスタにマッピングする配列の数を示す。次いで、これらのベクトルを使用して、一対一の設定で線形サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）を訓練し、検証した。また、リソースを大量に消費するネスト化された交差検証手順を防ぐために、ＳＶＭのハイパーパラメータを最適化せず、代わりにサイキット－ラーン（ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ）の「ＳＶＣ」の実装形態で与えられた標準値（線形カーネルを使用）を使用することにした。可視化の目的のために、各交差検証ステップの結果を、１つの単一の混同行列に群化した（図６Ｂ）。
【0057】
Ｇ．抗原関連配列クラスタの識別
抗体レパートリから抗原関連配列クラスタを識別して、配列リードが特定のコホートを与えられた１つのクラスタで特異的に濃縮されたかどうかを判定するために、非パラメトリックパーミュテーション検定を行った（図６Ｄ）。複数の検定を考慮するために、各コホートの全てのｐ値にボンフェローニ補正を適用した。さらなる検証のために、各クラスタから１つのＣＤＲ１－ＣＤＲ２－ＣＤＲ３組み合わせおよびその同族の全長可変領域をランダムに選択することによって進めた。
抗体レパートリから抗原関連配列クラスタを識別して、配列リードが特定のコホートを与えられた１つのクラスタで特異的に濃縮されたかどうかを判定するために、非パラメトリックパーミュテーション検定を行った（図６Ｄ）。複数の検定を考慮するために、各コホートの全てのｐ値にボンフェローニ補正を適用した。さらなる検証のために、各クラスタから１つのＣＤＲ１－ＣＤＲ２－ＣＤＲ３組み合わせおよびその同族の全長可変領域をランダムに選択することによって進めた。
【0058】
Ｈ．クラスタ特異的インシリコ変異体の生成
クラスタ特異的な新規変異体を、多変量ガウス分布から潜在空間内のデータポイントをサンプリングすることによってインシリコで生成し、そこでパラメータを、最終的なＶＡＥモデルからのそれぞれのクラスタパラメータによって与えた。次いで、これらのサンプリングされたデータポイントを復号化ネットワークに供給し、各ＣＤＲＨの位置確率行列を得た（図８Ａを参照）。各データポイントについて、所与のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を生成した。このプロセスは、何百万回も反復された。単一配列の対数確率は、証拠の下限（ＥＬＢＯ）の平均５００個のサンプルを取得することによって近似した。
クラスタ特異的な新規変異体を、多変量ガウス分布から潜在空間内のデータポイントをサンプリングすることによってインシリコで生成し、そこでパラメータを、最終的なＶＡＥモデルからのそれぞれのクラスタパラメータによって与えた。次いで、これらのサンプリングされたデータポイントを復号化ネットワークに供給し、各ＣＤＲＨの位置確率行列を得た（図８Ａを参照）。各データポイントについて、所与のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を生成した。このプロセスは、何百万回も反復された。単一配列の対数確率は、証拠の下限（ＥＬＢＯ）の平均５００個のサンプルを取得することによって近似した。
【0059】
Ｉ．ハイブリドーマ細胞培養条件
全てのハイブリドーマ細胞株およびライブラリを、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｔｈｅｒｍｏ社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ；Ｔｈｅｒｍｏ社製）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）、および５０μＭ ２－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｔｈｅｒｍｏ社製）で培養した。全てのハイブリドーマ培養物を、５％ＣＯ２の加湿空気中、３７℃の一定の温度で細胞培養インキュベータに維持した。ハイブリドーマ細胞は、典型的には、Ｔ－２５フラスコ（ＴＰＰ、９００２６）中の１０ｍＬの培地中で培養し、４８／７２時間ごとに通過させた。全てのハイブリドーマ細胞株は、マイコプラズマを含まないことが毎年確認されている（ユニバーサルマイコプラズマ検出キット、ＡＴＣＣ、３０－１０１２Ｋ）。細胞株ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ／Ｃａｓ９は、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）に公開されている。
全てのハイブリドーマ細胞株およびライブラリを、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｔｈｅｒｍｏ社製）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ；Ｔｈｅｒｍｏ社製）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）、および５０μＭ ２－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｔｈｅｒｍｏ社製）で培養した。全てのハイブリドーマ培養物を、５％ＣＯ２の加湿空気中、３７℃の一定の温度で細胞培養インキュベータに維持した。ハイブリドーマ細胞は、典型的には、Ｔ－２５フラスコ（ＴＰＰ、９００２６）中の１０ｍＬの培地中で培養し、４８／７２時間ごとに通過させた。全てのハイブリドーマ細胞株は、マイコプラズマを含まないことが毎年確認されている（ユニバーサルマイコプラズマ検出キット、ＡＴＣＣ、３０－１０１２Ｋ）。細胞株ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ／Ｃａｓ９は、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）に公開されている。
【0060】
Ｊ．ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９相同組換え修復による抗体ライブラリの生成
候補ＶＨ遺伝子は、遺伝子断片としてツイストバイオサイエンス社に注文し、これらは、使用前に２５μｌ Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ社製）中に再懸濁された。本研究で使用される全てのオリゴヌクレオチド、ならびにｃｒＲＮＡ－ＪＰおよびｔｒａｃｒＲＮＡをインテグレーテッドディーエヌエーテクノロジーズ社（ＩＤＴ）から購入し、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡを用いて１００μＭ（オリゴヌクレオチド）、または使用前にヌクレアーゼフリー二本鎖緩衝液（ＩＤＴ社製、１１－０１－０３－０１）を用いて２００μＭ（ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ）に調整した。この研究を通じて使用された相同組換え修復（ＨＤＲ）ドナーテンプレートは、ｐＵＣ５７（Ｋａｎ）－ＨＥＬ２３－ＨＤＲ相同ドナープラスミドに基づいていた。ライブラリクローニングアーチファクトおよび非修飾親ベクターＤＮＡによるバックグラウンド抗体発現を回避するために、２つの連続した終止コドンを、ＶＨおよび可変軽鎖（ＶＬ）配列のコード領域の開始部に組み込んだ。
候補ＶＨ遺伝子は、遺伝子断片としてツイストバイオサイエンス社に注文し、これらは、使用前に２５μｌ Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ社製）中に再懸濁された。本研究で使用される全てのオリゴヌクレオチド、ならびにｃｒＲＮＡ－ＪＰおよびｔｒａｃｒＲＮＡをインテグレーテッドディーエヌエーテクノロジーズ社（ＩＤＴ）から購入し、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡを用いて１００μＭ（オリゴヌクレオチド）、または使用前にヌクレアーゼフリー二本鎖緩衝液（ＩＤＴ社製、１１－０１－０３－０１）を用いて２００μＭ（ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ）に調整した。この研究を通じて使用された相同組換え修復（ＨＤＲ）ドナーテンプレートは、ｐＵＣ５７（Ｋａｎ）－ＨＥＬ２３－ＨＤＲ相同ドナープラスミドに基づいていた。ライブラリクローニングアーチファクトおよび非修飾親ベクターＤＮＡによるバックグラウンド抗体発現を回避するために、２つの連続した終止コドンを、ＶＨおよび可変軽鎖（ＶＬ）配列のコード領域の開始部に組み込んだ。
【0061】
各候補ＶＨについて、別個のＨＤＲ－ドナーＶＬライブラリを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリマスターミックス（ＮＥＢ）を使用して、Ｇｉｂｓｏｎクローニングによって段階的に組み立てた。必要に応じて、製造業者の指示に従って、ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（カパバイオシステムズ社製）を使用して断片を増幅した。まず、重鎖遺伝子を遺伝子断片から増幅し、ＰＣＲ線形化親ＨＤＲ－ドナーベクターにクローニングした（ステップ１）。次に、４つのそれぞれの抗原ＲＴのうちの１つで免疫化したマウスの全骨髄ＲＮＡを、ＶＬ定常領域に特異的な退化プライマーを有するＭａｘｉｍａ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を使用して行った。得られたｃＤＮＡを使用して、退化マルチプレックスプライマーを使用して、マルチプレックスＰＣＲ反応におけるそれぞれのＶＬレパートリを増幅した（表７）。最後に、ＶＬレパートリを、各候補ＶＨライブラリについて、ステップ１で作製したＰＣＲ線形化ＨＤＲ－ドナーベクターにクローニングし（ステップ２）、最終ライブラリを、多様性およびバックグラウンドクローンの観点から評価した。典型的には、固定ＶＨＨＤＲドナーＶＬライブラリサイズは、ライブラリ当たり３０，０００～８０，０００のトランスフォーマントの範囲であった。
【0062】
（表７）ライブラリ生成および配列決定に使用されるプライマー
【0063】
ＰｎＰ－ｍＲｕｂｙ／Ｃａｓ９細胞を、プログラムＣＱ－１０４を有するＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ４Ｄ－ヌクレオフェクターキットＬ（ロンザ社製、Ｖ４ＸＣ－２０１２）を使用して、４Ｄ－ヌクレオフェクターシステム（ロンザ社製）でエレクトロポレーションした。各ＨＤＲ－ドナーライブラリについて、１０６個の細胞を、１２５ｇで１０分間の遠心分離によって採取し、１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ還元血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ社製、３１９８５－０６２）で洗浄し、同じパラメータを使用して再度遠心分離した。最終的に、細胞を、５００ｐｍｏｌのｃｒＲＮＡ－Ｊ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体およびＳＦ緩衝液で希釈した２０μｇのＨＤＲドナープラスミド（５．９ｋｂ）を含有する１００μｌのヌクレオフェクション混合物中に再懸濁した。エレクトロポレーション後、細胞を、２４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ社製）中の１ｍＬの増殖培地中で２日間培養し、さらに１日間、２ｍＬの増殖培地を含有する６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に移動した。
【0064】
Ｋ．フローサイトメトリによるハイブリドーマ抗体ライブラリのスクリーニング
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９修飾ハイブリドーマのフローサイトメトリベースの分析および細胞単離を、ＢＤ ＬＳＲ ＦｏｒｔｅｓｓａおよびＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社製）上で行った。フローサイトメトリデータを、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ社製）を使用して分析した。トランスフェクションから３日後、１つの抗原に特異的なハイブリドーマ細胞ライブラリをプールし、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の連続ラウンドにおける抗体発現細胞および抗原特異的細胞について濃縮した。典型的には、前回の濃縮ステップからの選別された細胞の数は、後続の選別ステップのための標識細胞の数に関して４０倍過剰にサンプリングされた。標識のために、細胞をＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、１００１００２３）で洗浄し、標識抗体または抗原と共に光から保護された氷上で３０分間インキュベートし、再びＰＢＳで２回洗浄し、分析または選別した。標識試薬および作業濃度を表８に列挙する。１０６と異なる細胞数については、抗体／抗原の量ならびにインキュベーション体積を比例的に調整した。ＲＳＶＦ特異的細胞の標識には、ＲＳＶＦ－ビオチン／ストレプトアビジン－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７による細胞の間接標識のため、２ステップの標識手順が必要であった。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９修飾ハイブリドーマのフローサイトメトリベースの分析および細胞単離を、ＢＤ ＬＳＲ ＦｏｒｔｅｓｓａおよびＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社製）上で行った。フローサイトメトリデータを、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ社製）を使用して分析した。トランスフェクションから３日後、１つの抗原に特異的なハイブリドーマ細胞ライブラリをプールし、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の連続ラウンドにおける抗体発現細胞および抗原特異的細胞について濃縮した。典型的には、前回の濃縮ステップからの選別された細胞の数は、後続の選別ステップのための標識細胞の数に関して４０倍過剰にサンプリングされた。標識のために、細胞をＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、１００１００２３）で洗浄し、標識抗体または抗原と共に光から保護された氷上で３０分間インキュベートし、再びＰＢＳで２回洗浄し、分析または選別した。標識試薬および作業濃度を表８に列挙する。１０６と異なる細胞数については、抗体／抗原の量ならびにインキュベーション体積を比例的に調整した。ＲＳＶＦ特異的細胞の標識には、ＲＳＶＦ－ビオチン／ストレプトアビジン－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７による細胞の間接標識のため、２ステップの標識手順が必要であった。
【0065】
（表８）ＦＡＣＳ用標識剤
【0066】
Ｌ．単細胞ハイブリドーマクローンの遺伝子型決定
単一細胞ハイブリドーマクローンのゲノムＤＮＡを５×１０５細胞から単離し、これをＰＢＳで洗浄し、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（エピセンター社製、ＱＥ０９０５０）中に再懸濁した。細胞を、６８℃で１５分間および９５℃で８分間インキュベートし、一体化された合成ＶＬ－Ｃｋ－２Ａ－ＶＨ抗体領域を、５’および３’ホモロジーアームに特異的な隣接プライマーＣＡＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＣ（配列番号：３３）およびＣＴＡＧＡＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＧＡＣＴＣ（配列番号：３４）でＰＣＲ増幅した。この単一の増幅器から、ＶＨおよびＶＬ領域の両方は、それぞれプライマーＴＧＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣ（配列番号：３６）およびＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣ（配列番号：３５）（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ社製）を使用してサンガー配列決定され得る。
単一細胞ハイブリドーマクローンのゲノムＤＮＡを５×１０５細胞から単離し、これをＰＢＳで洗浄し、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（エピセンター社製、ＱＥ０９０５０）中に再懸濁した。細胞を、６８℃で１５分間および９５℃で８分間インキュベートし、一体化された合成ＶＬ－Ｃｋ－２Ａ－ＶＨ抗体領域を、５’および３’ホモロジーアームに特異的な隣接プライマーＣＡＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＣ（配列番号：３３）およびＣＴＡＧＡＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＧＡＣＴＣ（配列番号：３４）でＰＣＲ増幅した。この単一の増幅器から、ＶＨおよびＶＬ領域の両方は、それぞれプライマーＴＧＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣ（配列番号：３６）およびＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣ（配列番号：３５）（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ社製）を使用してサンガー配列決定され得る。
【0067】
Ｍ．ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の測定
分泌型ＩｇＧを含有する単一ハイブリドーマ細胞株上清の特異性を測定するために、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、ＣＬＳ３５９０）を、４℃でＰＢＳ中の４ｕｇ／ｍｌの抗原で一晩コーティングした。次いで、２％（ｍ／ｖ）の非脂肪乾燥乳粉末（アプリケム社製、Ａ０８３０）および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０（アプリケム社製、Ａ１３８９）を含有するＰＢＳで、プレートを室温で２時間ブロックした。ブロック後、プレートを０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで３回洗浄した。細胞培養上清液を、０．２μｍ滅菌濾過し（ザルトリウス社製、１６５３４）、２％（ｍ／ｖ）牛乳（ＰＢＳＭ）を添加したＰＢＳ中のプレート（１：３ステップ）にわたって連続的に希釈し、希釈されていない上清液を最高濃度として開始した。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲートラットモノクローナル［１８７．１］抗マウスカッパ軽鎖抗体（アブカム社製、ａｂ９９６１７）を、ＰＢＳＭ中、０．７μｇ／ｍｌ（在庫からの１：１５００希釈）で濃縮した二次検出抗体として使用した。プレートを再び室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴで３つの洗浄ステップを行った。ＥＬＩＳＡ検出は、１ステップの超ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製、３４０２８）を使用して実施し、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を終了した。４５０ｎｍでの吸収を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ＰＲＯ ＮａｎｏＱｕａｎｔ（Ｔｅｃａｎ社製）で測定し、Ｐｒｉｓｍ Ｖ８（Ｇｒａｐｈｐａｄ社製）を使用してデータを分析した。
分泌型ＩｇＧを含有する単一ハイブリドーマ細胞株上清の特異性を測定するために、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、ＣＬＳ３５９０）を、４℃でＰＢＳ中の４ｕｇ／ｍｌの抗原で一晩コーティングした。次いで、２％（ｍ／ｖ）の非脂肪乾燥乳粉末（アプリケム社製、Ａ０８３０）および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０（アプリケム社製、Ａ１３８９）を含有するＰＢＳで、プレートを室温で２時間ブロックした。ブロック後、プレートを０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで３回洗浄した。細胞培養上清液を、０．２μｍ滅菌濾過し（ザルトリウス社製、１６５３４）、２％（ｍ／ｖ）牛乳（ＰＢＳＭ）を添加したＰＢＳ中のプレート（１：３ステップ）にわたって連続的に希釈し、希釈されていない上清液を最高濃度として開始した。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲートラットモノクローナル［１８７．１］抗マウスカッパ軽鎖抗体（アブカム社製、ａｂ９９６１７）を、ＰＢＳＭ中、０．７μｇ／ｍｌ（在庫からの１：１５００希釈）で濃縮した二次検出抗体として使用した。プレートを再び室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴで３つの洗浄ステップを行った。ＥＬＩＳＡ検出は、１ステップの超ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製、３４０２８）を使用して実施し、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を終了した。４５０ｎｍでの吸収を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ＰＲＯ ＮａｎｏＱｕａｎｔ（Ｔｅｃａｎ社製）で測定し、Ｐｒｉｓｍ Ｖ８（Ｇｒａｐｈｐａｄ社製）を使用してデータを分析した。
【0068】
動作が特定の順序で図面に示されているが、かかる動作は、示されている特定の順序または順序で実行される必要はなく、例示されている動作は全て実行される必要はない。本明細書に記載される作用は、異なる順序で実行することができる。
【0069】
種々のシステム構成要素の分離は、全ての実装形態において分離を必要とせず、説明されたプログラム構成要素は、単一のハードウェアまたはソフトウェア製品に含めることができる。
【0070】
一部の例示的な実装形態をここで説明した後、上記は例示的であり、限定的ではないことが明らかであり、例として提示されている。特に、本明細書に提示される多くの例は、方法行為またはシステム要素の特定の組み合わせを含むが、それらの行為およびそれらの要素は、同じ目的を達成するために他の方式で組み合わされ得る。一実装形態に関連して考察される行為、要素、および特徴は、他の実装形態または実装形態における類似の役割から除外されることを意図しない。
【0071】
本明細書で使用される用語および用語は、記載の目的のためであり、制限するものと見なされるべきではない。本明細書における「その」およびその変形形態によって「特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈａｔ）」ことを「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「有する（ｈａｖｉｎｇ）」「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」ことの使用は、その後に列挙される項目、その等価物、および追加の項目、およびその後に列挙される項目のみからなる代替の実装形態を包含することを意味する。一実装形態では、本明細書に記載されるシステムおよび方法は、記載される要素、作用、または構成要素のうちの１つ、複数の各組み合わせ、または全てからなる。
【0072】
本明細書で使用される場合、「約」および「実質的に」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化するであろう。使用される文脈において当業者には明らかでない用語の使用が存在する場合、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【0073】
本明細書において単数形で言及されるシステムおよび方法の実装形態または要素または行為への任意の参照は、複数のこれらの要素を含む実装形態を包含し得、複数形で本明細書の任意の実装形態または要素または行為への任意の参照は、単一の要素のみを含む実装形態を包含し得る。単数形または複数形での参照は、本明細書で開示されているシステムまたは方法、それらの構成要素、作用、または要素を単数形または複数形の構成に限定することを意図しない。任意の情報、行為、または要素に基づいている任意の行為または要素への言及は、行為または要素が任意の情報、行為、または要素に少なくとも部分的に基づいている実装形態を含み得る。
【0074】
本明細書に開示される任意の実装形態は、任意の他の実装形態または実施形態と組み合わされてもよく、「実装形態」、「一部の実装形態」、「一実装形態」などへの言及は、必ずしも互いに排他的ではなく、実装形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特徴が少なくとも１つの実装形態または実施形態に含まれ得ることを示すことが意図される。本明細書で使用される場合、かかる用語は、必ずしも全て同じ実装形態を指すものではない。任意の実装形態は、本明細書に開示される態様および実装形態と一致する任意の様式で、包括的または排他的に任意の他の実装形態と組み合わせてもよい。
【0075】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、明確にそれに反して示されない限り、不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【0076】
「または」への言及は、「または」を使用して記載された任意の用語が、記載された用語の単一、複数、および全てのいずれかを示すことができるように、包括的であると解釈されてもよい。用語の接続詞リストのうちの少なくとも１つへの言及は、説明された用語の単一、複数、および全てのうちのいずれかを示す包含的な「または（ＯＲ）」として解釈されてもよい。例えば、「『Ａ』および『Ｂ』のうちの少なくとも１つ」への言及は、『Ａ』のみ、『Ｂ』のみ、ならびに『Ａ』および『Ｂ』の両方を含むことができる。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または他のオープンな用語と併せて使用されるかかる参照は、追加の項目を含むことができる。
【0077】
図面、詳細な説明、または任意の特許請求の範囲の技術的特徴の後に参照符号が続く場合、参照符号は、図面、詳細な説明、および特許請求の範囲の明瞭性を高めるために含まれている。したがって、参照符号があってもなくても、いかなる特許請求の範囲の要素の範囲に対していかなる制限効果も有しない。
【0078】
本明細書に記載されるシステムおよび方法は、その特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。前述の実装形態は、記載されたシステムおよび方法を限定するのではなく、例示的である。したがって、本明細書に記載されるシステムおよび方法の範囲は、前述の明細書ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および同等性の範囲内に入る変更が、そこに包含される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】