特許 7603674 フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株培養培地組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-12-12

(45)【発行日】2024-12-20

(54)【発明の名称】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株培養培地組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20241213BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2022520672

(86)(22)【出願日】2022-02-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-26

(86)【国際出願番号】 KR2022001867

(87)【国際公開番号】W WO2023090536

(87)【国際公開日】2023-05-25

【審査請求日】2022-04-01

(31)【優先権主張番号】10-2021-0159492

(32)【優先日】2021-11-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】521022956

【氏名又は名称】エンテロバイオーム インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＥＮＴＥＲＯＢＩＯＭＥ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(72)【発明者】

【氏名】ジェ・グ・ソ

(72)【発明者】

【氏名】ド・キュン・イ

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】韓国登録特許第１０－２２２２９５３（ＫＲ，Ｂ１）

【文献】国際公開第２０２１／０１６０８１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／２０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

植物性ペプトン（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ－ｐｅｐｔｏｎｅ）、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、リン酸塩化合物、炭酸塩化合物、シアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ、Ｂ１２）、Ｌ－システイン（Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、および麦芽糖（ｍａｌｔｏｓｅ）
で構成されたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）培養用培地組成物であって、
前記植物性ペプトンは、１０～２０ｇ／Ｌの濃度であり、
前記酵母抽出物は、５～１０ｇ／Ｌの濃度であり、
前記炭酸塩化合物は、２～６ｇ／Ｌの濃度であり、
前記酢酸アンモニウムは、２～１６ｇ／Ｌの濃度であり、および
前記麦芽糖は、７．５～３７．５ｇ／Ｌの濃度である、
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）培養用培地組成物。

【請求項2】

前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）フィログループＩＩ（Ｐｈｙｌｏｇｒｏｕｐ ＩＩ）である、
請求項１に記載のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）培養用培地組成物。

【請求項3】

下記のステップを含む、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の培養方法：
ａ）請求項１に記載の培地組成物に、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を接種するステップと、
ｂ）前記接種した菌株を、３５～３８℃、ｐＨ６．５～７、および気体流量０．１～０．３Ｌ／ｈの条件で培養するステップとを含む、
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株培養培地組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）は、胃腸内で最も多く分布する酪酸（ｂｕｔｙｒａｔｅ）生産バクテリアで、腸内フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの数を一定水準以上に維持することは非常に重要である。実際に、クローン病と潰瘍性大腸炎患者からフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの数が急激に減少することが観察され、これにより、粘液層内のＯ－ｇｌｙｃａｎの形成にも関与して腸の生理機能に重要な影響を及ぼすことが報告された。したがって、このようなフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを大量生産して摂取できれば、腸内の酪酸を確保できるはずである。

【0003】

最近、フィーカリバクテリウム属の多様性に注目した研究において、Ｌｏｐｅｚ－Ｓｉｌｅｓらは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ分離菌株の系統発生的な相関性を分析した結果、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ種から２つのフィログループ（ｐｈｙｌｏｇｒｏｕｐ Ｉ ａｎｄ ＩＩ）を究明し、同じ種（ｓｐｅｃｉｅｓ）内でも炭素源（ｇｌｕｃｏｓｅ、ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ、ｍａｌｔｏｓｅ、ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ｇａｌａｃｔｏｓｅ、ａｐｐｌｅ ｐｅｃｔｉｎ、ｉｎｕｌｉｎ、ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｕｃｏｓａｍｉｎｅなど）の利用能力（ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）がフィログループごとに異なるという報告がある（Ｌｏｐｅｚ－Ｓｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１２；７８：４２０－４２８）。

【0004】

フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌種はすべてベータ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、アルファ－グルコシダーゼ（α－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）とホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）活性は保有しているが、ウレアーゼ（ｕｒｅａｓｅ）、アルギニンジヒドロラーゼ（ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、ベータ－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）とアルファ－フコシダーゼ（α－ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ）活性は保有しないことが報告され、ＹＣＦＡ培地に果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、フラクトオリゴ糖（ｆｒｕｃｔｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）とブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）が基質として添加された場合に増殖可能であり、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、メリビオース（ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ）、ラフィノース（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）、ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）、リボース（ｒｉｂｏｓｅ）とキシロース（ｘｙｌｏｓｅ）では増殖できないことが明らかになった（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。乳糖をガラクトースとブドウ糖に変換する酵素であるベータ－ガラクトシダーゼと、麦芽糖をブドウ糖に変換する酵素であるアルファ－グルコシダーゼを保有しているため、乳糖と麦芽糖のような炭素源はすべて当該過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）を経て、高エネルギー分子であるＡＴＰを形成するのに使用できる。

【0005】

アミノ酸は、細胞培養培地中で培養された細胞の代謝機能を維持させるのに重要であり、高濃度培養時に良好な増殖を持続させるためには外部タンパク質供給源が必須である。アミノ酸供給源は、公知の任意のアミノ酸供給源であってもよいし、非制限的に動物由来、植物由来、または微生物由来のアミノ酸供給源を含み、理想的には完全に植物または微生物系であってもよい。また、アミノ酸供給源は、例えば、タンパク質加水分解産物、植物由来のタンパク質加水分解産物であってもよい。タンパク質加水分解産物は、加水分解を利用してタンパク質供給源から製造され、典型的には、ペプチド、アミノ酸、炭水化物および脂質の混合物、および漠然とした生物活性を有する多数の未確認成分で構成される。前記はたびたび多様な供給源、例えば、非制限的に植物供給源（大豆、小麦、エンドウ豆、ヒヨコ豆またはワタ）から与えられた原料物質の酵素的、アルカリまたは酸性分解によって生成される。前記アミノ酸供給源はさらに、個別的なアミノ酸または個別的なアミノ酸の組み合わせを含むアミノ酸組成物であってもよい。

【0006】

現在、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌種の培養技術は１０^９ＣＦＵ／ｍＬ水準にとどまっていて大量生産工程開発へのハードルになっており、１０^１１ＣＦＵ／ｍＬ水準の高濃度培養は産業化段階において非常に重要な技術になると見込まれる。

【0007】

フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩＩに該当する菌株の場合、フィログループＩに該当する菌株とは非常に異なる細胞形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を示している。特に、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩＩに該当する菌株の場合、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎ、ＧｌｃＮＡｃ）のようなａｍｉｎｏ ｓｕｇａｒが含まれた培地で培養する時、長い鎖形態の棒状細胞を示すことが確認され、これによって制限的空間で細胞数増大の限界があるので、１０^１１ＣＦＵ／ｍＬ水準の高濃度培養の困難がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【文献】Ｌｏｐｅｚ－Ｓｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１２；７８：４２０－４２８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

一態様は、植物性ペプトン（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ－ｐｅｐｔｏｎｅ）、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、リン酸塩化合物、炭酸塩化合物、シアノコバラミン、Ｌ－システイン、酢酸アンモニウム、および麦芽糖で構成されたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）培養用培地組成物を提供する。

【0010】

他の態様は、前記培地組成物に、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを接種するステップと、前記接種した菌株を、３５～３８℃、ｐＨ６．５～７、および気体流量０．１～０．３Ｌ／ｈの条件で培養するステップとを含むフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの培養方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

一態様は、植物性ペプトン（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ－ｐｅｐｔｏｎｅ）、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、リン酸塩化合物、炭酸塩化合物、シアノコバラミン、Ｌ－システイン、酢酸アンモニウム、および麦芽糖で構成されたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）培養用培地組成物を提供する。

【0012】

一具体例によれば、前記炭酸塩化合物は、２～６ｇ／Ｌの濃度であってもよい。

【0013】

一具体例によれば、前記麦芽糖は、２．５～３０ｇ／Ｌの濃度であってもよい。

【0014】

一具体例によれば、前記酢酸アンモニウムは、２～１６ｇ／Ｌの濃度であってもよい。

【0015】

一具体例によれば、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイは、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩＩ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ｐｈｙｌｏｇｒｏｕｐ ＩＩ）であってもよい。

【0016】

他の態様は、ａ）請求項１に記載の培地組成物に、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを接種するステップと、ｂ）前記接種した菌株を、３５～３８℃、ｐＨ６．５～７、および気体流量０．１～０．３Ｌ／ｈの条件で培養するステップとを含むフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの培養方法を提供する。

【発明の効果】

【0017】

本発明による培地組成物およびフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの培養方法を用いる場合、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループの菌株の高濃度培養および大量生産が可能である。また、動物性成分を排除しながら大量培養時、高濃度の窒素嫌気ガスでも高濃度に培養できるので、より経済的で産業化に適した培養方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を代替する成分を見出すために、ブドウ糖（ＧｌＵ）とＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）または代替成分の組み合わせによりフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを培養後、菌株を顕微鏡でみた写真である（ＧＬＵ：ブドウ糖、ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ－アセチルグルコサミン、ＮａＣＡＳ：カゼインナトリウム）。

【図2】Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を代替する成分を見出すために、ブドウ糖（ＧｌＵ）とＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）または代替成分の組み合わせによりフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを培養後、菌株を顕微鏡でみた写真である（ＧＬＵ：ブドウ糖、ＦＯＳ：フラクトオリゴ糖、ＰＥＣ：ペクチン、ＣＥＬ：セルロース、ＣＨＩ：キチン、ＴＲＥ：トレハロース）。

【図3】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを培養するために、カゼインナトリウムと炭素源の組み合わせの培地でフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを培養後、菌株を顕微鏡でみた写真である（ＮａＣＡＳ：カゼインナトリウム、ＦＲＵ：果糖、ＧＡＬ：ガラクトース、ＬＡＣ：乳糖、ＣＢＳ：セロビオース、ＭＡＬ：麦芽糖、ＳＰＶ：ピルビン酸ナトリウム）。

【図4】文献Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｌｔｏｓｅ ＡＢＣ ｉｍｐｏｒｔｅｒ（Ｍａｃｈｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９０：３２１－３３７．）で麦芽糖の吸収（ｍａｌｔｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ）調節過程を示す図で、Ａは、ＰＴＳ糖がある時の過程で、ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒを用いるＰＴＳ糖がＰＴＳ透過酵素（ＰＴＳ ｐｅｒｍｅａｓｅ）の活性により麦芽糖の吸収が制限されることを示す図であり、Ｂは、ＰＴＳ糖がない時、ＰＴＳ透過酵素が活性化されず麦芽糖の吸収が活性化される過程を示す図である。

【図5】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株の遺伝体分析を行った結果データで、フィログループＩ（ＡＴＣＣ２７７６８、ＥＢ－ＦＰＤＫ９）と未分類グループ（ＥＢ－ＦＰＤＫ３）より、フィログループＩＩ（Ａ２－１６５、ＥＢ－ＦＰＤＫ１１、ＥＢ－ＦＰＹＹＫ１）がＡＢＣ輸送タンパク質（ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）関連遺伝子のコピー（ｃｏｐｙ）数がより多いことを確認したデータである。

【図6】ＡＮＩ（ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）ベースで菌株の遺伝体間の類似度を示したデータである。

【図7】カゼインナトリウムとセロビオース（ＣＢＳ）、麦芽糖（ＭＡＬ）、マルトデキストリン（ＭＤＸ）、またはプルラン（ＰＵＬ）を添加した培地でフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを培養した後、菌株を顕微鏡で確認したデータである。

【図8】カゼインナトリウムとセロビオース（ＣＢＳ）、麦芽糖（ＭＡＬ）、マルトデキストリン（ＭＤＸ）、およびプルラン（ＰＵＬ）を配合した培地でフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを培養した後、菌株を顕微鏡で確認したデータである。

【図9】培地に酢酸ナトリウム（ＳｏＡｃ）または酢酸アンモニウム（ＡｍＡｃ）を添加した時に培養されたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの様子を顕微鏡で比較して確認したデータである。

【図10】麦芽糖（ＭＡＬ）、酢酸アンモニウム（ＡｍＡｃ）、シアノコバラミン（ＣＹＡ）、およびカゼインナトリウム（ＮａＣＡＳ）のうちの１つを除いた培地で培養したフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを顕微鏡で確認したデータである。

【図11】本発明の培地でフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイが高濃度に培養されることを確認したデータで、韓国特許第１０－２２４５４１５号に開示されたＹＢＨＩ ｗ／ＣＢ、ＭＴ培地（Ｕｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）およびＳＰＹＥ ｗ／ＧＳＧＣ培地（ｓｏｙ－ｐｅｐｔｏｎｅ、ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、ｇｌｕｃｏｓｅ、ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧｌｃＮＡｃ、ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ、およびｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎを含み、０．０５％ｗ／ｖ Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅを含む培地、以下、「ＳＰＹＥ ｗ／ＧＳＧＣ培地」）で培養して生菌数を比較したデータである。

【図12】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩＩの菌株（Ａ２－１６５、ＥＢ－ＦＰＹＹＫ１）、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩの菌株（ＥＢ－ＦＰＤＫ９）およびフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ未分類グループの菌株（ＥＢ－ＦＰＤＫ３）をＳＰＹＥ ｗ／ＧＳＧＣおよびＳＰＹＥ ｗ／ＭＡＣＮ培地（ｓｏｙ－ｐｅｐｔｏｎｅ、ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｍａｌｔｏｓｅ、ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ、ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ、ｓｏｄｉｕｍ ｃａｓｅｉｎａｔｅを含み、０．０５％ｗ／ｖ Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅを含む培地、以下、「ＳＰＹＥ ｗ／ＭＡＣＮ培地」）で培養後、顕微鏡で観察したデータである。

【図13】本発明の培地組成物がフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイで代謝される過程を予想した図である。

【図14】Ａは、ＳＰＹＥ ｗ／ＧＳＧＣおよびＳＰＹＥ ｗ／ＭＡＣＮ培地で培養時間によるＯＤ値を示すデータであり、Ｂは、ＳＰＹＥ ｗ／ＧＳＧＣおよびＳＰＹＥ ｗ／ＭＡＣＮ培地で培養時間によるｐＨ値を示すデータである。

【図15】ＳＰＹＥ ｗ／ＧＳＧＣおよびＳＰＹＥ ｗ／ＭＡＣＮ培地組成物で大量培養した時に培養された菌株を顕微鏡で確認したデータである。

【図16】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩＩの菌株（ＥＢ－ＦＰＤＫ１１、ＥＢ－ＦＰＹＹＫ１、Ａ２－１６５）をリン酸塩および炭酸塩を含む条件で培養後、顕微鏡で観察したデータである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

一態様は、植物性ペプトン（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ－ｐｅｐｔｏｎｅ）、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、リン酸塩化合物、炭酸塩化合物、シアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ、Ｂ１２）、Ｌ－システイン（Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、および麦芽糖（ｍａｌｔｏｓｅ）で構成されたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）培養用培地組成物を提供する。

【0020】

前記ソイペプトンと前記酵母抽出物は、植物または微生物由来成分で動物性成分を代替する成分である。動物由来成分は、ウイルスまたは細菌の汚染物質を含有するか、アレルゲンまたは抗原ペプチドなどを含むことがあり、バイオ医薬品および健康機能食品の用途を目的とする使用に不適な部分を前記植物または微生物由来成分に代替するものであってもよい。

【0021】

前記植物性ペプトンは、植物から抽出されたペプトンで、例えば、ソイペプトン（ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、小麦ペプトン（ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）、綿ペプトン（ｃｏｔｔｏｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、エンドウ豆ペプトン（ｐｅａ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ソラマメペプトン（ｂｒｏａｄｂｅａｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ルピンペプトン（ｌｕｐｉｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、およびジャガイモペプトン（ｐｏｔａｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ）であってもよいが、これに制限されるものではない。前記植物ペプトンは、培地組成物に１０ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌまたは１５ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌの量で含むことができる。

【0022】

前記酵母抽出物は、非－動物性培地上でタンパク質供給源として嫌気性微生物の増殖をさらに増加させる役割を果たすことができる。前記酵母抽出物は、酵母自己溶解物（ａｕｔｏｌｙｓａｔｅ）、限外濾過した酵母抽出物または合成酵母抽出物であってもよい。前記酵母抽出物の濃度は、５ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌであってもよいし、例えば、１０ｇ／Ｌであってもよい。

【0023】

前記リン酸塩化合物は、ジソジウムホスフェート（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、ジポタシウムホスフェート（Ｋ_２ＨＰＯ_４）またはポタシウムホスフェート（ＫＨ_２ＰＯ_４）であってもよい。前記リン酸塩化合物は、等張性条件を維持させ、浸透圧不均衡を防ぐために細胞培養培地に添加する物質である。本発明の培地組成物は、ｐＨを６．５～８．０、６．０～７．０、または５．８～７．８の範囲に維持させることが好ましいが、これに限定されるものではない。

【0024】

一具体例によれば、前記炭酸塩化合物は、２～６ｇ／Ｌの濃度であってもよい。例えば、２～４ｇ／Ｌ、２～５ｇ／Ｌ、３～４ｇ／Ｌ、３～５ｇ／Ｌ、３～６ｇ／Ｌ、４～５ｇ／Ｌ、４～６ｇ／Ｌであってもよい。

【0025】

前記炭酸塩化合物は、リン酸塩化合物とともに緩衝作用（ｂｕｆｆｅｒ）をする成分であり、ＣＯ_２を生産するので、大量培養時に経済性を高める成分である。

【0026】

一具体例によれば、前記麦芽糖は、２．５～３０ｇ／Ｌの濃度であってもよい。例えば、２．５～２５ｇ／Ｌ、２．５～２０ｇ／Ｌ、２．５～１５ｇ／Ｌ、および２．５～１２．５ｇ／Ｌであってもよい。

【0027】

一具体例によれば、前記酢酸アンモニウムは、２～１６ｇ／Ｌの濃度であってもよい。例えば、２～１６ｇ／Ｌ、２～１２ｇ／Ｌ、２～１０ｇ／Ｌ、４～１６ｇ／Ｌ、４～１２ｇ／Ｌ、および４～１０ｇ／Ｌであってもよい。

【0028】

微生物の培養条件は、通常の技術者によってよく知られているように、微生物の成長速度に影響を与えることができる。本発明において、培養ステップは、ｐＨ６．６～ｐＨ７．０、培養温度３６℃～３９℃、撹拌速度４０ｒｐｍ～５０ｒｐｍ、窒素飽和度８０％～１００％、水素飽和度０％～５％、二酸化炭素飽和度０％～２０％で実施することができる。

【0029】

前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイは、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイのフィログループＩ、ＩＩａ、ＩＩｂをすべて含むもので、例えば、フィログループＩのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９、フィログループＩＩａのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５とフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＹＹＫ１、フィログループＩＩｂのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ１１、および未分類グループのフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ３であってもよいが、これに限定しない。

【0030】

一具体例によれば、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイは、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩＩ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ Ｐｈｙｌｏｇｒｏｕｐ ＩＩ）であってもよい。例えば、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ１１であってもよい。

【0031】

他の態様は、ａ）請求項１に記載の培地組成物に、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを接種するステップと、ｂ）前記接種した菌株を、３５～３８℃、ｐＨ６．５～７、および気体流量０．１～０．３Ｌ／ｈの条件で培養するステップとを含むフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの培養方法を提供する。

【0032】

前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイに関する説明は、上記に記載されているものと同じである。

【実施例】

【0033】

以下、一つ以上の具体例を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は一つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるのではない。

【0034】

実施例１．培地補充剤による細胞の形態変化の確認
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの培養に関連して既存の文献（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｌｏｐｅｚ－Ｓｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｌｏｐｅｚ－Ｓｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）から知られた多様な基質が添加された培養培地でフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩＩ（ｐｈｙｌｏｇｒｏｕｐ ＩＩ）の菌株の細胞の形態変化を確認した。

【0035】

前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩＩ（ｐｈｙｌｏｇｒｏｕｐ ＩＩ）の菌株としては、韓国登録特許第１０－２１６９７９４号で受託して受託番号ＫＣＣＭ１２６２１Ｐが与えられたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ１１を使用した。

【0036】

韓国登録特許第１０－２２４５４１５号の培地組成物は、ソイペプトン（ｓｏｙ－ｐｅｐｔｏｎｅ）２０ｇ／Ｌ、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）１０ｇ／Ｌ、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）２．５ｇ／Ｌ、ジポタシウムホスフェート（ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）２．５ｇ／Ｌ、Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎ、ＧｌｃＮＡｃ）２．５ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）２ｇ／Ｌ、およびシアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ、Ｂ_１２）０．１ｍｇ／Ｌを含み、０．０５％ｗ／ｖ Ｌ－システインを含む培地（以下、「ＳＰＹＥ ｗ／ＧＳＧＣ」）組成物の培養性と比較分析した。

【0037】

このために、それぞれの用意された培地に０．１％ｖ／ｖの比率でフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ１１分離菌株を接種した後、３７℃、嫌気条件（９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２）で２４～４８時間培養し、濁度（ＯＤ６００ｎｍ）の変化を測定した。下記のＳＰＹＥ培地は、ソイペプトン（ｓｏｙ－ｐｅｐｔｏｎｅ）２０ｇ／Ｌ、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）１０ｇ／Ｌ、ジポタシウムホスフェート（ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）２．５ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）２ｇ／Ｌ、シアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ、Ｂ_１２）０．１ｍｇ／Ｌを含む培地であり、０．０５％ｗ／ｖ Ｌ－システイン（Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）が前処理された培地である。下記表１に開示されているように、ブドウ糖（Ｇｌｕ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ），カゼインナトリウム（ＮａＣＡＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ペクチン（ＰＥＣ）、セルロース（ＣＥＬ）、キチン（ＣＨＩ）、トレハロース（ＴＲＥ）の組み合わせにより培地を組成し、各培地の濁度および細胞の形状を確認した。

【0038】

【表1】

【0039】

前記表１と図１および図２から分かるように、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ１１菌株は、ＧｌｃＮＡｃが添加されていない培地で相対的に短くなり、真っ直ぐな細胞の形態を示すことを確認し、吸光度はやや低くなったが、細胞密度（細胞数）は大差を示さなかった。また、カゼインナトリウム（ＮａＣＡＳ）を添加した培地の結果値をみれば分かるように、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を添加しない場合、培養性が低下することをカゼインナトリウムがある程度補完できることを確認した。

【0040】

実施例２．最適な炭素源の組み合わせの探索
ＳＰＹＥ培地にＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を代替してカゼインナトリウム（ＮａＣＡＳ）を用いる時、最適な炭素源を確認するために、下記表２のように、ブドウ糖（ＧＬＵ）、果糖（ＦＲＵ）、ガラクトース（ＧＡＬ）、乳糖（ＬＡＣ）、セロビオース（ＣＢＳ）、麦芽糖（ＭＡＬ）、ピルビン酸ナトリウム（ＳＰＶ）を組み合わせて培養性を確認した。

【0041】

【表2】

【0042】

前記表２および図３に示されるように、Ｎ－アセチルグルコサミンが含まれない培地でブドウ糖の代わりにセロビオースおよび麦芽糖を添加した場合、細胞の形態は非常に短くなった棒状に観察され、特に麦芽糖に代替した場合には、非常に小さい細胞の形態を示して制限的空間で細胞数が増大できる、高濃度培養の可能性を確認した。同じく、細胞の形態と大きさの減少によって吸光度は減少することが明らかになったが、細胞の密度（細胞数）は大差を示さなかった。

【0043】

麦芽糖の場合、ＡＢＣ輸送タンパク質（ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）を用いるが、ＰＴＳ輸送タンパク質（ＰＴＳ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）を用いる糖類（ＰＴＳ ｓｕｇａｒ：Ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ、ＧｌｃＮＡｃなど）が存在する場合、ＰＴＳ透過酵素（ＰＴＳ ｐｅｒｍｅａｓｅ）の活性によって麦芽糖の吸収が制限されることを、Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｌｔｏｓｅ ＡＢＣ ｉｍｐｏｒｔｅｒ（Ｍａｃｈｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９０：３２１－３３７．）から抜粋した図４を通して分かる。

【0044】

また、図５および図６に示すように、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株の遺伝体分析により、フィログループＩＩの菌株（Ａ２－１６５、ＥＢ－ＦＰＤＫ１１、ＥＢ－ＦＰＹＹＫ１）がフィログループＩの菌株（ＡＴＣＣ２７７６８、ＥＢ－ＦＰＤＫ９）および未分類グループのＥＢ－ＦＰＤＫ３よりＡＢＣ輸送タンパク質（ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）関連遺伝子のｃｏｐｙ数が相対的に多いことが確認されて、麦芽糖のような基質が培養に有用であり得るという点を予想した。

【0045】

実施例３．培養濃度による培養性改善の可否の確認
前記実施例で高濃度培養の高い可能性を示した麦芽糖を含めて重合体であるマルトデキストリン（ＭＤＸ）、プルラン（ＰＵＬ）、およびセロビオース（ＣＢＳ）をＳＰＹＥ培地に濃度別に添加して培養性改善の可否を確認した。

【0046】

【表3】

【0047】

表３、図７および図８に示すように、Ｎ－アセチルグルコサミンが添加されていない培地でブドウ糖を代替して麦芽糖を添加した場合、細胞の形態は非常に短くなった棒状に観察され、濃度依存的に吸光度は大きく上昇して、麦芽糖の濃度１２．５ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌで既存の培地（ＳＰＹＥ ｗ／ＧＳＧＣ）と同等の水準を示し、特に顕微鏡観察の結果、細胞の密度（細胞数）は著しく増加したことが明らかになった。

【0048】

セロビオースまたはマルトデキストリンを添加した場合、麦芽糖のみ添加した時よりはやや長い細胞の形態を示し、プルランを添加した場合は、細胞の形態は麦芽糖を添加したのと同様に非常に短かったが、吸光度と細胞密度が非常に低くて、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの培養培地としては適合しないことを確認した。

【0049】

実施例４．酢酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）の添加による培養性の改善
既存の培地に添加されている酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ、ＳｏＡｃ）の酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ）は、酪酸（ｂｕｔｙｒａｔｅ）を生成するための基質として使用され、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）として知られている。また、Ｎ－アセチルグルコサミンは、細胞壁合成（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）およびエネルギー代謝に使用され、代謝過程でアンモニアを生成するが、アンモニアは、細胞質を中和するｐＨ緩衝作用をし、窒素源を供給する機能をする。したがって、Ｎ－アセチルグルコサミンを除いた麦芽糖培地はｐＨ変化に非常に敏感であることが明らかになり、培養後のｐＨは通常６．１～６．３と確認された。麦芽糖培地でｐＨが６以下に低下すると、細胞の形態が変化し、培養性が良くないことが観察された。したがって、ｐＨ緩衝作用とともに窒素源および酢酸塩を供給できる成長因子として酢酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ、ＡｍＡｃ）を酢酸ナトリウムの代わりに添加して培養性改善の可否を確認した。培養性改善の可否を確認するために、基本培地は、前記実施例の結果に基づいて、ソイペプトン（ｓｏｙ－ｐｅｐｔｏｎｅ）２０ｇ／Ｌ、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）１０ｇ／Ｌ、ジポタシウムホスフェート（ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）２．５ｇ／Ｌ、麦芽糖（ｍａｌｔｏｓｅ）１２．５ｇ／Ｌ、カゼインナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｓｅｉｎａｔｅ）２．５ｇ／Ｌ、シアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ、Ｂ_１２）０．１ｍｇ／Ｌを含む培地であり、０．０５％ｗ／ｖ Ｌ－システイン（Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）が前処理された培地（以下、「ＳＰＹＥ ｗ／ＭＣＮ」）を使用した。

【0050】

【表4】

【0051】

表４と図９から分かるように、酢酸ナトリウムを代替して酢酸アンモニウムを添加した培地で、濃度依存的に培養性が増加することが明らかになり、特に６ｇ／Ｌの濃度で吸光度は最大となり、細胞の形態は非常に短くなった棒状に観察され、細胞密度（細胞数）は大きく増加したことが確認された。酢酸アンモニウムを１０ｇ／Ｌ以上の濃度で添加した培地ではむしろ培養性阻害現象が現れ、２０ｇ／Ｌの濃度では増殖できないことが確認された。

【0052】

実施例５．培地補充剤の成分別重要度の確認
前記提示された基質の組み合わせ（麦芽糖、酢酸アンモニウム、シアノコバラミン、カゼインナトリウム）において各成分別の培養に及ぼす影響を評価した。

【0053】

【表5】

【0054】

前記表５と図１０から分かるように、４成分のうち１つでも除かれた場合、培養性は著しく減少し、顕微鏡観察においても細胞の密度（細胞数）が著しく減少することを確認した。

【0055】

実施例６．フィログループＩＩの菌株の培養性改善の確認
前記実施例５により導出した最適化培地でフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩＩの互いに異なる菌株の培養性改善の可否を確認した。効果比較のために、フィログループＩのＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株とフィログループＩとＩＩに該当しないＥＢ－ＦＰＤＫ３菌株を使用した。

【0056】

【表6】

【0057】

前記表６と図１１に示すように、本発明では、ＳＰＹＥ ｗ／ＭＡＣＮ培地（２０ｇ／Ｌの濃度のソイペプトン、１０ｇ／Ｌの濃度の酵母抽出物、２．５ｇ／Ｌの濃度のジポタシウムホスフェート、１２．５ｇ／Ｌの濃度の麦芽糖、６ｇ／Ｌの濃度のアンモニウムアセテート、０．１ｍｇ／Ｌの濃度のシアノコバラミン２．５ｇ／Ｌの濃度のカゼインナトリウムの組み合わせ）によりフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩＩの菌株を１０^１０～１０^１１ＣＦＵｓ／ｍＬで高濃度培養が可能であることを確認した。

【0058】

また、図１２に示すように、顕微鏡でみた結果、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩＩであるＡ２－１６５およびＥＢ－ＦＰＹＹＫ１は、ＳＰＹＥ／ＧＳＧＣ培地に比べて、ＳＰＹＥ ｗ／ＭＡＣＮ培地で菌株が短くなり、密度が高くなることを確認した。これに対し、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイフィログループＩであるＥＢ－ＦＰＤＫ９および未分類グループであるＥＢ－ＦＰＤＫ３は、ＳＰＹＥ／ＧＳＧＣ培地に比べて培養性に大差を示さなかったり、むしろ菌株が長く成長して高い密度で培養できないことを確認した。

【0059】

本発明を通して、図１３のような代謝経路により、ソイペプトン、酵母抽出物、麦芽糖、アンモニウムアセテート、シアノコバラミンカゼインナトリウムの組み合わせの培地成分は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイで代謝されることが推定され、高価なＮ－アセチルグルコサミンを代替することで経済性も高めた。

【0060】

実施例７．大量培養が可能か否かの確認
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイのようなＥＯＳ（Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）菌種の培養のために嫌気状態を確認し維持できるカスタマイズ型嫌気性発酵システム（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、前記確立された培地組成物（表６）で３リットルの発酵規模で大量培養を実現した。このために、下記表７の組成と表８の条件で培養を進行させ、成長曲線（ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）およびｐＨの変化を確認し、顕微鏡観察による形態学的変化および平板計数法を利用して生菌数を確認した。

【0061】

【表7】

【0062】

【表8】

【0063】

その結果、図１４に示すように、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ１１菌株は、ファーメンターを用いた大量培養で２２．５時間ぶりに最大吸光度に到達し、この時の吸光度（ＯＤ６００）は１．２３で試験管培養と同じ水準であり、韓国登録特許第１０－２２４５４１５号の培地（ＳＰＹＥ ｗ／ＧＳＧＣ）と比較した時、２倍以上の大差を示しており、生菌数はそれぞれ２．０×１０^１１ＣＦＵｓ／ｍＬと２．０４×１０^９ＣＦＵｓ／ｍＬで１００倍上昇したことが明らかになった。同じく、顕微鏡観察の結果、図１５に示すように、ＳＰＹＥ ｗ／ＧＳＧＣ培地と比較して、ＳＰＹＥ ｗ／ＭＡＣＮ培養細胞は非常に短くなり、小さくなった棒状の細胞形態を示しており、細胞の密度（細胞数）も著しく向上したことを確認した。

【0064】

実施例８．大量生産の効率性と経済性を考慮した培養条件の探索
微生物のＡＴＰ合成と酪酸生成経路は水素イオンを必要とするので、水に溶けて炭酸と水素イオンを発生させる二酸化炭素は、嫌気性微生物の成長のための適切な混合ガスの必須構成要素（Ｋｉｌｌａｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００３；４１：２２０１－２２０２，Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８０；１３：５７３－５７９，Ｓｔａｌｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７４；２７：１０９８－１１０４）として知られている。

【0065】

一般的に知られたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌種の培養ガスの組成は、９０％Ｎ_２＋５％ＣＯ_２＋５％Ｈ_２、８０％Ｎ_２＋１０％ＣＯ_２＋１０％Ｈ_２、８１％Ｎ_２＋１１％ＣＯ_２＋８％Ｈ_２と９７％ＣＯ_２＋３％Ｈ_２で５％～９７％のＣＯ_２を含んでいる。しかし、大量培養時、ＣＯ_２の添加が容易でなくて経済性が低い問題点がある。経済性を克服すべく、１００％Ｎ_２でのみ培養する場合、韓国登録特許第１０－２２４５４１５号から分かるように、１００％Ｎ_２でのみ構成された嫌気ガスでフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株を培養すれば、誘導期（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）が非常に遅延することが分かる。

【0066】

高純度窒素（１００％Ｎ_２）嫌気ガスの培養により大量培養システムの経済性を克服すると同時に、動物由来成分であるカゼインナトリウムを使用せずに高濃度培養が可能なのかを確認するために、炭酸塩化合物およびカゼインナトリウムの有無による培養性の差をフィログループＩＩの菌株を培養して比較した。

【0067】

基本培地は、前記実施例の結果に基づいて、ソイペプトン（ｓｏｙ－ｐｅｐｔｏｎｅ）２０ｇ／Ｌ、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）１０ｇ／Ｌ、麦芽糖（ｍａｌｔｏｓｅ）１２．５ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）６ｇ／Ｌ、シアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ、Ｂ_１２）０．１ｍｇ／Ｌを含み、０．０５％ｗ／ｖ Ｌ－システイン（Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）が前処理された培地（以下、「ＳＰＹＥ ｗ／ＭＡＣ」）を用いた。下記表９のように、緩衝作用のためのリン酸塩化合物（Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４）とＣＯ_２＋Ｈ_２⇔Ｈ_２ＣＯ_３⇔ＨＣＯ_３ ^－＋Ｈ^＋の反応式により、緩衝作用と水素イオンおよびＣＯ_２の発生が可能な炭酸塩化合物（ＫＨＣＯ_３）を導出し、炭酸塩化合物（ＫＨＣＯ_３）を組み合わせた培地で培養性を確認した。炭酸塩化合物の場合、熱分解（ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）によってＣＯ_２が発生するため、高圧蒸気滅菌よりは濾過滅菌により別途に添加した。また、下記表１０から分かるように、大規模発酵では代表的な炭酸塩化合物である炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ_３）と炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）のうち熱分解温度と溶解度が高い炭酸水素カリウムがより適合することを確認した。

【0068】

【表9】

【0069】

【表10】

【0070】

【表11】

【0071】

前記表１１と図１６から分かるように、１００％Ｎ_２の条件では、炭酸水素カリウムの有無によって培養性が大差を示した。ＥＢ－ＦＰＤＫ１１菌株は、２ｇ／Ｌの濃度で吸光度は最大値となり、細胞の形態は非常に短い棒状に観察された。また、カゼインナトリウムの有無によって生菌数を計算した時、３．２×１０^１１ＣＦＵｓ／ｍＬと５．３×１０^１１ＣＦＵｓ／ｍＬと大差を示さなかった。１００％Ｎ_２の条件下、ＥＢ－ＦＰＹＹＫ１とＡ２－１６５菌株は、炭酸水素カリウムの濃度が０．２ｇ／Ｌよりは０．４ｇ／Ｌで吸光度の増加量が最も高く、ＥＢ－ＦＰＹＹＫ１菌株の生菌数は３．０×１０^１０ＣＦＵｓ／ｍＬ、Ａ２－１６５菌株の生菌数は２．７×１０^１１ＣＦＵｓ／ｍＬと確認された。しかし、カゼインナトリウムとともに組み合わされた時にはむしろ培養性が大きく減少することが明らかになり、ＥＢ－ＦＰＤＫ１１菌株とはやや異なる様相を示した。

【0072】

結論として、リン酸塩化合物と炭酸塩化合物との組み合わせにより、ＣＯ_２のないガス条件で培養が可能であることを確認し、これとともに、動物由来成分のない培地組成物でも１０^１１ＣＦＵｓ／ｍＬ水準の高濃度培養が可能であることを確認した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】