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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-12-13
(45)【発行日】2024-12-23
(54)【発明の名称】細胞死抑制剤及び細胞死抑制方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/82 20060101AFI20241216BHJP
A01G 7/06 20060101ALI20241216BHJP
A01G 22/45 20180101ALI20241216BHJP
C12N 5/14 20060101ALI20241216BHJP
A01H 3/04 20060101ALI20241216BHJP
【ＦＩ】
C12N15/82 Z ZNA
A01G7/06 A
A01G22/45
C12N5/14
A01H3/04
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021535374
(86)(22)【出願日】2020-07-29
(86)【国際出願番号】 JP2020028981
(87)【国際公開番号】W WO2021020421
(87)【国際公開日】2021-02-04
【審査請求日】2023-03-20
(31)【優先権主張番号】P 2019142038
(32)【優先日】2019-08-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504171134
【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100169764
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 雄一郎
(72)【発明者】
【氏名】三浦 謙治
(72)【発明者】
【氏名】鶴田 文憲
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第０１／０４４４５９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Plants，2017年，vol.6, no.1，article:9
【文献】Plant Cell Reports，2003年，vol.21，p.429-436
【文献】Biologia，2015年，vol.69, no.12，p.1668-1677
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／０９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする、タバコ属植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死の抑制剤であって、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物が、１００～３００ｍＭの濃度でタバコ属植物に接触させるように用いられるか、又は
アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物が、２５～８０ｍＭの濃度で、タバコ属植物に目的タンパク質の発現ベクターを導入するためのアグロバクテリウム懸濁液に添加するように用いられるか、若しくは、タバコ属植物を水耕栽培するための培養液に添加するように用いられ、
前記誘導体は、アスコルビン酸アルキルエステル、アスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸グルコシド又はアスコルビン酸アルキルエーテルであり、
前記溶媒和物は、水和物又は有機溶媒和物である、抑制剤。
【請求項2】
前記誘導体が、モノステアリン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、モノイソパルミチン酸アスコルビル、モノオレイン酸アスコルビル、ジステアリン酸アスコルビル、ジパルミチン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、アスコルビン酸モノリン酸エステル、アスコルビン酸ジリン酸エステル、アスコルビン酸トリリン酸エステル、アスコルビン酸エチルエーテル、アスコルビン酸メチルエーテル、アスコルビン酸ジグルコシド又はパルミチン酸アスコルビルリン酸である、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項3】
前記溶媒和物が、イソアスコルビン酸ナトリウム一水和物又はアスコルビン酸カルシウム二水和物である、請求項１又は２に記載の抑制剤。
【請求項4】
タバコ属植物に、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を投与する工程を含む、前記タバコ属植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制する方法であって、前記工程において、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を１００～３００ｍＭの濃度で前記タバコ属植物に接触させて投与するか、又は
前記工程において、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を、２５～８０ｍＭの濃度で前記タバコ属植物に目的タンパク質の発現ベクターを導入するためのアグロバクテリウム懸濁液に添加して投与するか、若しくは、前記タバコ属植物を水耕栽培するための培養液に添加して投与し、
前記誘導体は、アスコルビン酸アルキルエステル、アスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸グルコシド又はアスコルビン酸アルキルエーテルであり、
前記溶媒和物は、水和物又は有機溶媒和物である、方法。
【請求項5】
前記誘導体が、モノステアリン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、モノイソパルミチン酸アスコルビル、モノオレイン酸アスコルビル、ジステアリン酸アスコルビル、ジパルミチン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、アスコルビン酸モノリン酸エステル、アスコルビン酸ジリン酸エステル、アスコルビン酸トリリン酸エステル、アスコルビン酸エチルエーテル、アスコルビン酸メチルエーテル、アスコルビン酸ジグルコシド又はパルミチン酸アスコルビルリン酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記溶媒和物が、イソアスコルビン酸ナトリウム一水和物又はアスコルビン酸カルシウム二水和物である、請求項４又は５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞死抑制剤及び細胞死抑制方法に関する。より具体的には、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死の抑制剤、及び、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
植物細胞で目的タンパク質を大量に発現させる検討が広く行われている。例えば、発明者らは、以前に、一過的に目的タンパク質を大量に発現させる技術として、ジェミニウイルス由来のＬｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ｒｅｇｉｏｎ（ＬＩＲ）と、ジェミニウイルス由来のＳｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ｒｅｇｉｏｎ（ＳＩＲ）と、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第１の核酸断片と、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片と、を備え、前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現システムを開発している（特許文献１を参照）。
【0003】
しかしながら、植物細胞で一過的に目的タンパク質を大量に発現させると、植物細胞の細胞死（ネクローシス、壊疽）が誘導され、発現させた目的タンパク質が分解してしまうことが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２０１８／２２０９２９号
【非特許文献】
【0005】
【文献】Pinkhasov J., et al., Recombinant plant-expressed tumour-associated MUC1 peptide is immunogenic and capable of breaking tolerance in MUC1.Tg mice, Plant Biotechnology Journal, 9, 991-1001, 2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は以下の態様を含む。
［１］アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死の抑制剤。
［２］１００～３００ｍＭのアスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を植物に接触させるように用いられる、［１］に記載の抑制剤。
［３］２５～８０ｍＭのアスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を、植物に目的タンパク質の発現ベクターを導入するためのアグロバクテリウム懸濁液に添加するように用いられるか、又は、植物を水耕栽培するための培養液に添加するように用いられる、［１］に記載の抑制剤。
［４］前記植物がタバコ属植物である、［１］～［３］のいずれかに記載の抑制剤。
［５］植物に、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を投与する工程を含む、前記植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制する方法。
［６］前記工程において、１００～３００ｍＭのアスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を前記植物に接触させて投与する、［５］に記載の方法。
［７］前記工程において、２５～８０ｍＭのアスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を、前記植物に目的タンパク質の発現ベクターを導入するためのアグロバクテリウム懸濁液に添加して投与するか、又は、前記植物を水耕栽培するための培養液に添加して投与する、［５］に記載の方法。
［８］前記植物がタバコ属植物である、［５］～［７］のいずれかに記載の方法。
［１］アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死の抑制剤。
［２］１００～３００ｍＭのアスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を植物に接触させるように用いられる、［１］に記載の抑制剤。
［３］２５～８０ｍＭのアスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を、植物に目的タンパク質の発現ベクターを導入するためのアグロバクテリウム懸濁液に添加するように用いられるか、又は、植物を水耕栽培するための培養液に添加するように用いられる、［１］に記載の抑制剤。
［４］前記植物がタバコ属植物である、［１］～［３］のいずれかに記載の抑制剤。
［５］植物に、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を投与する工程を含む、前記植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制する方法。
［６］前記工程において、１００～３００ｍＭのアスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を前記植物に接触させて投与する、［５］に記載の方法。
［７］前記工程において、２５～８０ｍＭのアスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を、前記植物に目的タンパク質の発現ベクターを導入するためのアグロバクテリウム懸濁液に添加して投与するか、又は、前記植物を水耕栽培するための培養液に添加して投与する、［５］に記載の方法。
［８］前記植物がタバコ属植物である、［５］～［７］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。
【図2】（ａ）～（ｆ）は、実験例１において各植物の葉を撮影した代表的な写真である。
【図3】（ａ）は、実験例１におけるクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色の結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）に基づいて、ＧＦＰタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。
【図4】（ａ）は、実験例１において、ヒトＣｕｌｌｉｎ １（ｈＣｕｌ）タンパク質を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）に基づいて、ｈＣｕｌタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。
【図5】（ａ）は、実験例１において、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＬＰ）とＧＦＰの融合タンパク質（ＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質）を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）に基づいて、ＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。
【図6】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２において各植物の葉を撮影した写真である。（ａ）は、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であり、（ｂ）は、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった結果である。
【図7】（ａ）は、実験例２におけるＣＢＢ染色の結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）に基づいて、ＧＦＰタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。
【図8】（ａ）は、実験例２において、ｈＣｕｌタンパク質を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）に基づいて、ｈＣｕｌタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。
【図9】（ａ）は、実験例２において、ヒトＦ－ｂｏｘタンパク質であるＦｂｘｗ７（ｈＦｂｘｗ７）タンパク質を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図10】（ａ）～（ｃ）は、実験例３において各植物の葉を撮影した代表的な写真である。
【図11】（ａ）～（ｆ）は、実験例４において各植物の葉を撮影した代表的な写真である。
【図12】（ａ）～（ｆ）は、実験例４において各植物全体を撮影した代表的な写真である。
【図13】（ａ）は、実験例４において、ｈＣｕｌタンパク質を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）に基づいて、ｈＣｕｌタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。
【図14】（ａ）～（ｆ）は、実験例５において各植物の葉を撮影した代表的な写真である。
【図15】（ａ）は、実験例５におけるＣＢＢ染色の結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）に基づいて、ＧＦＰタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。
【図16】（ａ）～（ｄ）は、実験例６において各植物を撮影した代表的な写真である。
【図17】（ａ）～（ｄ）は、実験例７において各植物を撮影した代表的な写真である。（ｂ）は（ａ）の部分拡大写真であり、（ｄ）は（ｃ）の部分拡大写真である。
【図18】（ａ）は、実験例８においてアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった植物を撮影した代表的な写真である。（ｂ）は、実験例８において、Ｃｒｙｊ１タンパク質を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
［植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死の抑制剤］
１実施形態において、本発明は、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死の抑制剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死の抑制剤を提供する。
【0011】
実施例において後述するように、本実施形態の抑制剤により、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死（ネクローシス、壊疽）を抑制することができる。また、実施例において後述するように、本実施形態の抑制剤の投与により、植物の細胞死を抑制することにより、目的タンパク質を大量に製造することが可能になる。
【0012】
本実施形態の抑制剤は、アスコルビン酸であってもよいし、アスコルビン酸誘導体であってもよいし、アスコルビン酸の塩であってもよいし、アスコルビン酸誘導体の塩であってもよいし、アスコルビン酸の溶媒和物であってもよいし、アスコルビン酸誘導体の溶媒和物であってもよいし、アスコルビン酸の塩の溶媒和物であってもよいし、アスコルビン酸誘導体の塩の溶媒和物であってもよい。
【0013】
アスコルビン酸は、栄養素ビタミンＣとして機能する、ラクトン構造を持つ有機化合物の１種である。アスコルビン酸は光学活性化合物であり、ビタミンＣとして知られるのはＬ体の方である。本実施形態において、アスコルビン酸はＬ体であってもよく、Ｄ体であってもよいが、Ｌ体であることが好ましい。
【0014】
アスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸アルキルエステル、アスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビン酸アルキルエーテル等が挙げられる。より具体的なアスコルビン酸誘導体としては、例えば、モノステアリン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、モノイソパルミチン酸アスコルビル、モノオレイン酸アスコルビル、ジステアリン酸アスコルビル、ジパルミチン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル等のアスコルビン酸アルキルエステル、アスコルビン酸モノリン酸エステル、アスコルビン酸ジリン酸エステル、アスコルビン酸トリリン酸エステル等のアスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸エチルエーテル、アスコルビン酸メチルエーテル等の、アスコルビン酸モノグルコシド、アスコルビン酸ジグルコシド等のアスコルビン酸グルコシド等が挙げられる。これらの他にも、例えば、アスコルビン酸アルキルエステル且つアスコルビン酸リン酸エステルである、パルミチン酸アスコルビルリン酸等が挙げられる。なお、これらのアスコルビン酸誘導体は、アスコルビン酸の６位、２位、３位及び５位の水酸基のうちの少なくとも１つが置換された構造を有している。
【0015】
アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体の塩としては、特に限定されず、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体とアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム等）との塩、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体とアルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム等）との塩、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と遷移金属（例えば、亜鉛、鉄、コバルト、銅等）との塩、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体と塩基性アンモニウムとの塩、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体とトリエタノールアミンとの塩、アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体とアミノ酸（例えば、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－リジン等）との塩等が挙げられる。これらの中でも、例えば、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸マグネシウム、アスコルビン酸リン酸ナトリウム、アスコルビン酸リン酸マグネシウム等を好適に用いることができる。
【0016】
アスコルビン酸又はその誘導体又はそれらの塩の、溶媒和物としては、水和物、有機溶媒和物等が挙げられ、より具体的には、例えば、イソアスコルビン酸ナトリウム一水和物、アスコルビン酸カルシウム二水和物等が挙げられる。
【0017】
本実施形態の抑制剤は、上述したアスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物のうち、１種を単独で用いてもよいし、複数種を混合して用いてもよい。
【0018】
本実施形態の抑制剤は、１００～３００ｍＭの濃度で植物に接触させることにより投与してもよい。ここで、植物に接触させるとは、一過的タンパク質発現を誘導した植物の部位、例えば、葉に、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を溶解又は懸濁した液体を噴霧することであってもよい。あるいは、一過的タンパク質発現を誘導した植物を、上記の液体に浸漬することであってもよい。
【0019】
本実施形態の抑制剤を溶解又は懸濁した液体において、溶媒としては、水、緩衝液、等張液等が挙げられる。
【0020】
本実施形態の抑制剤を溶解又は懸濁した液体において、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物の濃度の下限は、例えば８０ｍＭであってもよく、例えば１００ｍＭであってもよく、例えば１５０ｍＭであってもよく、例えば２００ｍＭであってもよく、例えば２５０ｍＭであってもよい。また、本実施形態の抑制剤を溶解又は懸濁した液体において、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物の濃度の上限は、例えば３００ｍＭであってもよく、例えば２５０ｍＭであってもよく、例えば２００ｍＭであってもよく、例えば１５０ｍＭであってもよく、例えば１００ｍＭであってもよい。これらの下限及び上限は任意に組み合わせることができる。
【0021】
本実施形態の抑制剤を噴霧する場合、噴霧のスケジュールとしては、例えば、１日に１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回等が挙げられる。
【0022】
本実施形態の抑制剤は、２５～８０ｍＭの濃度で、植物に目的タンパク質の発現ベクターを導入するためのアグロバクテリウム懸濁液に添加し、当該アグロバクテリウム懸濁液（アグロインフィルトレーション液）を用いて、シリンジを用いたアグロインフィルトレーションを行うか、又は、バキュームインフィルトレーションを行うことにより、植物に投与してもよい。すなわち、植物に目的タンパク質の発現コンストラクトを導入する時に、同時に本実施形態の抑制剤を投与してもよい。あるいは、本実施形態の抑制剤は、２５～８０ｍＭの濃度で植物を水耕栽培するための培養液に添加して投与してもよい。
【0023】
実施例において後述するように、本実施形態の抑制剤をアグロバクテリウム懸濁液に添加する場合には、本実施形態の抑制剤を植物に接触させる場合と最適濃度が異なる傾向にある。また、本実施形態の抑制剤を、水耕栽培するための培養液に添加する場合には、アグロバクテリウム懸濁液に添加する場合と同様の濃度にすることが好ましい。
【0024】
より具体的には、アグロバクテリウム懸濁液又は水耕栽培するための培養液において、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物の濃度の下限は、例えば２５ｍＭであってもよく、例えば３０ｍＭであってもよく、例えば４０ｍＭであってもよく、例えば５０ｍＭであってもよく、例えば６０ｍＭであってもよい。また、アグロバクテリウム懸濁液又は水耕栽培するための培養液において、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物の濃度の上限は、例えば８０ｍＭであってもよく、例えば６０ｍＭであってもよく、例えば５０ｍＭであってもよく、例えば４０ｍＭであってもよく、例えば３０ｍＭであってもよい。これらの下限及び上限は任意に組み合わせることができる。
【0025】
本実施形態の抑制剤をアグロバクテリウム懸濁液に添加する場合、本実施形態の抑制剤の投与はアグロインフィルトレーション時の１回のみとなる。
【0026】
本実施形態の抑制剤の、接触による投与、アグロバクテリウム懸濁液に添加しての投与、植物を水耕栽培するための培養液に添加しての投与は、いずれか１つのみを行ってもよいし、任意の組み合わせでいずれか２つ以上を行ってもよい。
【0027】
本明細書において、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死とは、植物細胞に一過的に（一過性）に目的タンパク質を大量発現させた場合に誘導される細胞死を意味する。
【0028】
一過的タンパク質発現の手段は特に限定されないが、例えば、アグロバクテリウム及びＴ－ＤＮＡを利用する方法が挙げられる。Ｔ－ＤＮＡとは、双子葉植物の腫瘍であるクラウンゴールの病原細菌であるアグロバクテリウムの病原性株に見出されるＴｉプラスミドやＲｉプラスミドが有する特定領域である。Ｔ－ＤＮＡはＲｉｇｈｔ Ｂｏｒｄｅｒ（ＲＢ）とＬｅｆｔ Ｂｏｒｄｅｒ（ＬＢ）と呼ばれる約２５塩基の配列に挟まれたＤＮＡ領域である。Ｔ－ＤＮＡを有するアグロバクテリウムを植物細胞と共存させると、ＲＢとＬＢとの間に存在する核酸断片を宿主植物細胞内に移行させる。
【0029】
したがって、ＲＢとＬＢとの間に目的タンパク質の発現コンストラクトを導入したベクターをアグロバクテリウムに導入し、当該アグロバクテリウムを宿主植物に導入することにより、宿主植物細胞内に目的タンパク質の発現コンストラクトを容易に導入することができる。
【0030】
ＲＢとＬＢとの間に目的タンパク質の発現コンストラクトが存在するベクターは、バイナリーベクター法に用いることができるベクターであることが好ましい。バイナリーベクター法とは、Ｔｉプラスミドの本来のＴ－ＤＮＡを除去したｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドと、人工のＴ－ＤＮＡを有する小型のシャトルベクターを利用する植物への遺伝子導入法である。ここで、シャトルベクターは大腸菌とアグロバクテリウムの双方で維持できるものが好ましい。
【0031】
ｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドは、本来のＴ－ＤＮＡを有しないため、植物にクラウンゴールを形成することができない。しかしながら、ｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドは、Ｔ－ＤＮＡを宿主植物細胞内に導入するために必要なｖｉｒ領域を有している。
【0032】
このため、ｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドを有するアグロバクテリウムに、所望の核酸断片を有するＴ－ＤＮＡを導入し、当該アグロバクテリウムを宿主植物に導入することにより、所望の核酸断片を容易に宿主植物細胞内に導入することができる。
【0033】
すなわち、ＲＢとＬＢとの間に目的タンパク質の発現コンストラクトが存在するベクターは、大腸菌用の複製起点と、アグロバクテリウム用の複製起点を有しており、大腸菌とアグロバクテリウムの双方で維持することができるシャトルベクターであると便利である。
【0034】
本実施形態の抑制剤において、一過的タンパク質発現の手段としては、特に限定されず、例えば、発明者らが以前に開発した、ジェミニウイルス由来のＬＩＲと、ジェミニウイルス由来のＳＩＲと、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第１の核酸断片と、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片と、を備え、前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む発現システムを植物に導入する方法、例えば、ｍａｇｎＩＣＯＮシステムと呼ばれる、タバコモザイクウイルスをベースとした商用の発現システムを植物に導入する方法等が挙げられる。
【0035】
本実施形態の抑制剤において、植物としては、特に限定されず、例えば、トマト、ナス、トウガラシ等のナス科植物、レタス等のキク科植物、メロン等のウリ科植物、コチョウラン等のラン科植物等が挙げられる。なかでも、ナス科植物であることが好ましく、タバコ属植物であることが好ましい。より具体的なタバコ属植物としては、ベンサミアナタバコ、タバコ、ハナタバコ等が挙げられる。
【0036】
［植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制する方法］
１実施形態において、本発明は、植物に、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を投与する工程を含む、前記植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制する方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、植物に、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を投与する工程を含む、前記植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制する方法を提供する。
【0037】
実施例において後述するように、本実施形態の方法により、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死（ネクローシス、壊疽）を抑制することができる。また、植物の細胞死を抑制することにより、目的タンパク質を大量に製造することが可能になる。
【0038】
アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を投与する工程において、１００～３００ｍＭのアスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を前記植物に接触させて投与してもよい。
【0039】
ここで、植物に接触させるとは、上述したものと同様であり、一過的タンパク質発現を誘導した植物の部位、例えば、葉に、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を溶解又は懸濁した液体を噴霧することであってもよい。あるいは、一過的タンパク質発現を誘導した植物を、上記の液体に浸漬することであってもよい。アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を溶解又は懸濁した液体、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物の濃度については上述したものと同様である。
【0040】
アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を投与する工程において、２５～８０ｍＭのアスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物を、前記植物に目的タンパク質の発現ベクターを導入するためのアグロバクテリウム懸濁液に添加して投与するか、又は、前記植物を水耕栽培するための培養液に添加して投与してもよい。
【0041】
ここで、アグロバクテリウム懸濁液、水耕栽培するための培養液、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物の濃度については上述したものと同様である。
【0042】
本実施形態の方法において、植物としては、上述したものと同様であり、例えば、トマト、ナス、トウガラシ等のナス科植物、レタス等のキク科植物、メロン等のウリ科植物、コチョウラン等のラン科植物等が挙げられる。なかでも、ナス科植物であることが好ましく、タバコ属植物であることが好ましい。より具体的なタバコ属植物としては、ベンサミアナタバコ、タバコ、ハナタバコ等が挙げられる。
【0043】
［その他の実施形態］
植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制するために使用される、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物。
植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制するために使用される、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物。
【0044】
植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制するための、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物の使用。
【0045】
植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死の抑制剤の製造のための、アスコルビン酸若しくはその誘導体若しくはそれらの塩又はそれらの溶媒和物の使用。
【実施例】
【0046】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0047】
［材料及び方法］
（ベクターの作製）
《ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターの作製》
既知のベクターであるｐＢＹＲ２ｆｐベクターは、インゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来の複製システムを有している。また、ｐＢＹＲ２ｆｐベクターは、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９の発現カセットを有している。
（ベクターの作製）
《ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターの作製》
既知のベクターであるｐＢＹＲ２ｆｐベクターは、インゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来の複製システムを有している。また、ｐＢＹＲ２ｆｐベクターは、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９の発現カセットを有している。
【0048】
ｐＢＹＲ２ｆｐベクターに、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－ＵＴＲ（以下、「ＡｔＡＤＨ５’」という場合がある。）及びシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーター（以下、「ＨＳＰｔｅｒ」という場合がある。）を有するＥＧＦＰ遺伝子断片を導入した。
【0049】
具体的には、まず、プライマー（ｐＲＩ２０１－ＥＧＦＰ－Ｆ、配列番号１に塩基配列を示す。）及びプライマー（ＥＧＦＰ－ｐＲＩ２０１－Ｒ、配列番号２に塩基配列を示す。）を用いてＥＧＦＰ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。
【0050】
続いて、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｌＩで切断したｐＲＩ２０１－ＡＮ（タカラバイオ社）にクローニングし、ｐＲＩ２０１－ＥＧＦＰベクターを作製した。
【0051】
続いて、ｐＲＩ２０１－ＥＧＦＰベクターを鋳型として、プライマー（ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＡｔＡＤＨ－Ｆ、配列番号３に塩基配列を示す。）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ｆｐ－ＨＳＰｔｅｒ－Ｒ、配列番号４に塩基配列を示す。）を用いて、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－ＵＴＲ及びシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを有するＥＧＦＰ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。
【0052】
続いて、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２ｆｐベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターを得た。図１はｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターのＴ－ＤＮＡ領域の模式図である。図１中、「３５Ｓ－ｐ×２」はエンハンスエレメントを２つ有するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを意味し、「ＡｔＡＤＨ５’」はシロイヌナズナアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’－ＵＴＲを意味し、「ＥＧＦＰ」はｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎを意味し、「Ｅｘｔ３’」はタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを意味し、「ＨＳＰｔｅｒ」はシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを意味し、「ＬＩＲ」はインゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）ゲノムのＬｏｎｇ Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ｒｅｇｉｏｎを意味し、「ＳＩＲ」はＢｅＹＤＶゲノムのＳｈｏｒｔ Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ｒｅｇｉｏｎを意味し、「Ｃ１」及び「Ｃ２」はＢｅＹＤＶの複製開始タンパク質であるＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードするオープンリーディングフレームＣ１及びＣ２を意味し、「ＬＢ」及び「ＲＢ」はそれぞれＴ－ＤＮＡの左側ボーダー配列及び右側ボーダー配列を意味し、「Ｎｏｓ－ｐ」はＮＯＳプロモーターを意味し、「ｐ１９」はトマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９をコードする遺伝子を意味し、「Ｎｏｓ－ｔ」はＮＯＳターミネーターを意味する。
【0053】
《ｐＢＹＲ２ＨＳベクターの作製》
簡便のために、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターからＥＧＦＰ遺伝子断片を除去し、ＡｔＡＤＨ５’とＨＳＰｔｅｒの間に制限酵素ＳａｌＩ部位を導入したｐＢＹＲ２ＨＳベクターを作製した。ｐＢＹＲ２ＨＳベクターを制限酵素ＳａｌＩで切断することにより、ｐＢＹＲ２ＨＳベクターのＡｔＡＤＨ５’とＨＳＰｔｅｒの間に目的遺伝子を導入することができる。
簡便のために、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰベクターからＥＧＦＰ遺伝子断片を除去し、ＡｔＡＤＨ５’とＨＳＰｔｅｒの間に制限酵素ＳａｌＩ部位を導入したｐＢＹＲ２ＨＳベクターを作製した。ｐＢＹＲ２ＨＳベクターを制限酵素ＳａｌＩで切断することにより、ｐＢＹＲ２ＨＳベクターのＡｔＡＤＨ５’とＨＳＰｔｅｒの間に目的遺伝子を導入することができる。
【0054】
《ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＨＦ－ｈＣｕｌベクターの作製》
ベンサミアナタバコのコドンに最適化した、ヒトＣｕｌｌｉｎ １タンパク質（以下、「ｈＣｕｌ」という場合がある。）をコードする遺伝子断片（配列番号５に塩基配列を示す。）を化学合成した（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）。合成した遺伝子断片のＮ末端側には６×ヒスチジンタグ及びＦＬＡＧタグが連結されており、Ｃ末端側には小胞体滞留シグナルであるＫＤＥＬ（配列番号６）が連結されていた。
ベンサミアナタバコのコドンに最適化した、ヒトＣｕｌｌｉｎ １タンパク質（以下、「ｈＣｕｌ」という場合がある。）をコードする遺伝子断片（配列番号５に塩基配列を示す。）を化学合成した（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）。合成した遺伝子断片のＮ末端側には６×ヒスチジンタグ及びＦＬＡＧタグが連結されており、Ｃ末端側には小胞体滞留シグナルであるＫＤＥＬ（配列番号６）が連結されていた。
【0055】
続いて、プライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－Ｈｉｓｘ６－Ｆ、配列番号７に塩基配列を示す。）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＫＤＥＬ－Ｒ、配列番号８に塩基配列を示す。）を用いて、ｈＣｕｌ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。続いて、制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳベクターにｈＣｕｌ遺伝子断片を導入し、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＨＦ－ｈＣｕｌ１ベクターを得た。
【0056】
《ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＨＦ－ｈＦｂｘｗ７ベクターの作製》
ベンサミアナタバコのコドンに最適化した、ヒトＦ－ｂｏｘタンパク質であるＦｂｘｗ７タンパク質（以下、「ｈＦｂｘｗ７」という場合がある。）をコードする遺伝子断片（配列番号９に塩基配列を示す。）を化学合成した（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）。合成した遺伝子断片のＮ末端側には６×ヒスチジンタグ及びＦＬＡＧタグが連結されており、Ｃ末端側には小胞体滞留シグナルであるＫＤＥＬ（配列番号６）が連結されていた。
ベンサミアナタバコのコドンに最適化した、ヒトＦ－ｂｏｘタンパク質であるＦｂｘｗ７タンパク質（以下、「ｈＦｂｘｗ７」という場合がある。）をコードする遺伝子断片（配列番号９に塩基配列を示す。）を化学合成した（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）。合成した遺伝子断片のＮ末端側には６×ヒスチジンタグ及びＦＬＡＧタグが連結されており、Ｃ末端側には小胞体滞留シグナルであるＫＤＥＬ（配列番号６）が連結されていた。
【0057】
続いて、プライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－Ｈｉｓｘ６－Ｆ、配列番号７）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＫＤＥＬ－Ｒ、配列番号８）を用いて、ｈＦｂｘｗ７遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。続いて、制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳベクターにｈＦｂｘｗ７遺伝子断片を導入し、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＨＦ－ｈＦｂｘｗ７ベクターを得た。
【0058】
《ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＣＥＧＦＰベクターの作製》
プライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＣＥＧＦＰ－Ｆ、配列番号１０に塩基配列を示す。）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＣＥＧＦＰ－Ｒ、配列番号１１に塩基配列を示す。）を用いて、ＥＧＦＰ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。続いて、制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳベクターにＥＧＦＰ遺伝子断片を導入し、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＣＥＧＦＰベクターを得た。
プライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＣＥＧＦＰ－Ｆ、配列番号１０に塩基配列を示す。）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＣＥＧＦＰ－Ｒ、配列番号１１に塩基配列を示す。）を用いて、ＥＧＦＰ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。続いて、制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳベクターにＥＧＦＰ遺伝子断片を導入し、ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＣＥＧＦＰベクターを得た。
【0059】
《ｐＢＹＲ２ＨＳ－ＰＬＰ－ＧＦＰベクターの作製》
プライマー（ＡＤＨ－ＰＬＰ－Ｆ、配列番号１２に塩基配列を示す。）及びプライマー（ＰＬＰ－ＧＦＰ－Ｒ、配列番号１３に塩基配列を示す。）を用いて、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（以下「ＰＬＰ」という場合がある。）遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。続いて、制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳ－ＣＥＧＦＰベクターにＰＬＰ遺伝子断片を導入し、ＰＬＰとＧＦＰの融合タンパク質を発現するｐＢＹＲ２ＨＳ－ＰＬＰ－ＧＦＰベクターを得た。
プライマー（ＡＤＨ－ＰＬＰ－Ｆ、配列番号１２に塩基配列を示す。）及びプライマー（ＰＬＰ－ＧＦＰ－Ｒ、配列番号１３に塩基配列を示す。）を用いて、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（以下「ＰＬＰ」という場合がある。）遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。続いて、制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳ－ＣＥＧＦＰベクターにＰＬＰ遺伝子断片を導入し、ＰＬＰとＧＦＰの融合タンパク質を発現するｐＢＹＲ２ＨＳ－ＰＬＰ－ＧＦＰベクターを得た。
【0060】
《ｐＢＹＲ２ＨＳ－Ｃｒｙｊ１ベクターの作製》
スギアレルゲンタンパク質であるＣｒｙｊ１タンパク質（以下、「Ｃｒｙｊ１」という場合がある。）をコードする遺伝子断片（配列番号１４に塩基配列を示す。）を化学合成した（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）。続いて化学合成した遺伝子断片を鋳型として、プライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－Ｃｒｙｊ１Ｎｔ－Ｆ、配列番号１５に塩基配列を示す。）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－Ｃｒｙｊ１Ｎｔ－Ｒ、配列番号１６に塩基配列を示す。）を用いて、スギ花粉アレルゲンであるＣｒｙｊ１タンパク質をコードする遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。続いて、制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳベクターにＣｒｙｊ１遺伝子断片を導入し、ｐＢＹＲ２ＨＳ－Ｃｒｙｊ１ベクターを得た。
スギアレルゲンタンパク質であるＣｒｙｊ１タンパク質（以下、「Ｃｒｙｊ１」という場合がある。）をコードする遺伝子断片（配列番号１４に塩基配列を示す。）を化学合成した（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）。続いて化学合成した遺伝子断片を鋳型として、プライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－Ｃｒｙｊ１Ｎｔ－Ｆ、配列番号１５に塩基配列を示す。）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ－Ｃｒｙｊ１Ｎｔ－Ｒ、配列番号１６に塩基配列を示す。）を用いて、スギ花粉アレルゲンであるＣｒｙｊ１タンパク質をコードする遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。続いて、制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳベクターにＣｒｙｊ１遺伝子断片を導入し、ｐＢＹＲ２ＨＳ－Ｃｒｙｊ１ベクターを得た。
【0061】
（植物の生長条件及びアグロインフィルトレーション）
ベンサミアナタバコは、２５℃、明期１６時間／暗期８時間の条件下で５～６週間成長させた。また、上述した各ベクターを、バイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株にそれぞれ導入し、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）、２０μＭアセトシリンゴン、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、３０ｍｇ／Ｌリファンピシンを添加したＬ－ブロス培地中、２８℃で静止期まで培養した。
ベンサミアナタバコは、２５℃、明期１６時間／暗期８時間の条件下で５～６週間成長させた。また、上述した各ベクターを、バイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株にそれぞれ導入し、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）、２０μＭアセトシリンゴン、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、３０ｍｇ／Ｌリファンピシンを添加したＬ－ブロス培地中、２８℃で静止期まで培養した。
【0062】
続いて、培養物を遠心分離してアグロバクテリウム・ツメファシエンスを回収した後、インフィルトレーションバッファー（１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６）、１００μＭアセトシリンゴン）を用いてＯＤ６００が約１となるように懸濁した。続いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンスをこの液体中に２～３時間放置した。
【0063】
その後、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの懸濁液を、ニードルを付けていない１ｍＬのシリンジを用いてベンサミアナタバコの葉の裏側にインフィルトレーションした。あるいは、場合により、ベンサミアナタバコをアグロバクテリウム懸濁液（アグロインフィルトレーション液）に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で５分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりバキュームインフィルトレーションした。
【0064】
いくつかの実験において、各濃度のアスコルビン酸ナトリウム水溶液又はクエン酸ナトリウム水溶液を２日に１回、植物の葉に噴霧した。また、いくつかの実験において、アスコルビン酸ナトリウムをインフィルトレーションバッファーに添加した。熱ショックタンパク質の発現誘導は、インフィルトレーションの１日後及び３日後に、植物を３７℃で１時間インキュベートすることにより行った。以下の実験例において、アスコルビン酸ナトリウムとしては、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウムを使用した。
【0065】
［実験例１］
（アスコルビン酸の噴霧１）
シリンジを用いたアグロインフィルトレーションを行い、ベンサミアナタバコの葉に、ＧＦＰ、ｈＣｕｌ、ｈＦｂｘｗ７、ＰＬＰ－ＧＦＰ、Ｃｒｙｊ１を発現させた。ＰＬＰ－ＧＦＰの発現においては、１／１００量のｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰを同時にアグロインフィルトレーションした。各植物は、アグロインフィルトレーション後、１８℃で７日間培養した。また、０、３０、５０、１００、２００、３００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した。
（アスコルビン酸の噴霧１）
シリンジを用いたアグロインフィルトレーションを行い、ベンサミアナタバコの葉に、ＧＦＰ、ｈＣｕｌ、ｈＦｂｘｗ７、ＰＬＰ－ＧＦＰ、Ｃｒｙｊ１を発現させた。ＰＬＰ－ＧＦＰの発現においては、１／１００量のｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰを同時にアグロインフィルトレーションした。各植物は、アグロインフィルトレーション後、１８℃で７日間培養した。また、０、３０、５０、１００、２００、３００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した。
【0066】
図２（ａ）～（ｆ）は、アグロインフィルトレーションの７日後に各植物の葉を撮影した代表的な写真である。スケールバーは１ｃｍである。図２（ａ）はアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった結果であり、図２（ｂ）は３０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であり、図２（ｃ）は５０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であり、図２（ｄ）は１００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であり、図２（ｅ）は２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であり、図２（ｆ）は３００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果である。図２（ａ）～（ｆ）中、点線の丸で囲んだ領域は、それぞれＧＦＰ、ｈＣｕｌ、ｈＦｂｘｗ７、ＰＬＰ－ＧＦＰ、Ｃｒｙｊ１を発現させた領域である。
【0067】
その結果、特に、ｈＣｕｌ、ｈＦｂｘｗ７、ＰＬＰ－ＧＦＰ、Ｃｒｙｊ１を発現させた領域において、葉が黒くなる様子が観察され、一過的タンパク質発現により細胞死（壊疽）が誘導されたことが明らかとなった。また、１００、２００、３００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した場合に、壊疽が抑制されたことが明らかとなった。
【0068】
《ＧＦＰタンパク質発現量の測定》
続いて、各植物の葉の、ＧＦＰタンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により検出した。また、比較のために、１００ｎｇ、２００ｎｇ、４００ｎｇの精製されたＧＦＰタンパク質も、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した。
続いて、各植物の葉の、ＧＦＰタンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により検出した。また、比較のために、１００ｎｇ、２００ｎｇ、４００ｎｇの精製されたＧＦＰタンパク質も、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した。
【0069】
図３（ａ）は、ＣＢＢ染色の結果を示す写真である。図３（ａ）中、「ＮＴ」は遺伝子導入を行わなかったベンサミアナタバコの葉の結果であることを示し、「ＦＷ」は新鮮重量を示す。図３（ａ）中、矢頭で示す３０ｋＤａ付近のバンドがＧＦＰタンパク質のバンドであり、５０ｋＤａ付近のバンドはＲｕｂｉｓｃｏラージサブユニットのバンドである。図３（ｂ）は、図３（ａ）に基づいて、ＧＦＰタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。図３（ｂ）中、「＊」は、スチューデントのＴ検定の結果ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
【0070】
その結果、１００ｍＭ以上の濃度のアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した試料において、ＧＦＰタンパク質の発現量の増加が認められた。また、１００ｍＭ以上の濃度のアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した試料において、Ｒｕｂｉｓｃｏラージサブユニットの発現量の増加も認められた。この結果から、アスコルビン酸ナトリウム水溶液の噴霧により、植物の壊疽が軽減され、目的タンパク質の生産量が増加したことが明らかとなった。
【0071】
《ｈＣｕｌタンパク質発現量の測定》
また、各植物の葉の、ｈＣｕｌタンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。上述したように、ｈＣｕｌタンパク質のＮ末端にはＦＬＡＧタグが付加されていた。そこで、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ｈＣｕｌタンパク質を検出した。
また、各植物の葉の、ｈＣｕｌタンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。上述したように、ｈＣｕｌタンパク質のＮ末端にはＦＬＡＧタグが付加されていた。そこで、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ｈＣｕｌタンパク質を検出した。
【0072】
図４（ａ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図４（ａ）中、「ＮＴ」は遺伝子導入を行わなかったベンサミアナタバコの葉の結果であることを示し、「ＦＷ」は新鮮重量を示す。図４（ａ）中、矢頭で示すバンドはｈＣｕｌタンパク質のバンドを示す。図４（ｂ）は、図４（ａ）に基づいて、ｈＣｕｌタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。図４（ｂ）中、「＊」は、スチューデントのＴ検定の結果ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「＊＊」は、スチューデントのＴ検定の結果ｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【0073】
その結果、１００ｍＭ以上の濃度のアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した試料において、ｈＣｕｌタンパク質の発現量の増加が認められた。また、２００ｍＭ以上の濃度のアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した試料において、ｈＣｕｌタンパク質の発現量のピークが認められた。この結果は、アスコルビン酸ナトリウム水溶液の噴霧により、植物の壊疽が軽減され、目的タンパク質の生産量が増加したことを更に支持するものである。
【0074】
《ＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質発現量の測定》
また、各植物の葉の、ＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。また、比較のために、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇの精製されたＧＦＰタンパク質も、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質を検出した。
また、各植物の葉の、ＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。また、比較のために、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇの精製されたＧＦＰタンパク質も、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質を検出した。
【0075】
図５（ａ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図５（ａ）中、「ＮＴ」は遺伝子導入を行わなかったベンサミアナタバコの葉の結果であることを示し、「ＦＷ」は新鮮重量を示す。図５（ａ）中、矢頭で示すバンドはＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質のバンドを示す。また、３０ｋＤａ付近のバンドはＧＦＰタンパク質のバンドである。
上述したように、ＰＬＰ－ＧＦＰの発現においては、１／１００量のｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰを同時にアグロインフィルトレーションしたためＧＦＰタンパク質が検出された。
上述したように、ＰＬＰ－ＧＦＰの発現においては、１／１００量のｐＢＹＲ２ＨＳ－ＥＧＦＰを同時にアグロインフィルトレーションしたためＧＦＰタンパク質が検出された。
【0076】
図５（ｂ）は、図５（ａ）に基づいて、ＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。図５（ｂ）中、「＊＊」は、スチューデントのＴ検定の結果ｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
【0077】
その結果、１００ｍＭ以上の濃度のアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した試料において、ＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質の発現量の増加が認められた。この結果は、アスコルビン酸ナトリウム水溶液の噴霧により、植物の壊疽が軽減され、目的タンパク質の生産量が増加したことを更に支持するものである。
【0078】
［実験例２］
（アスコルビン酸の噴霧２）
シリンジを用いたアグロインフィルトレーションを行い、ベンサミアナタバコの葉に、ＧＦＰ、ｈＣｕｌ、ｈＦｂｘｗ７をそれぞれ発現させた。各植物は、アグロインフィルトレーション後、２５℃で７日間培養した。また、０又は２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した。本実験例は、実験例１と植物の生長温度が主に異なっていた。
（アスコルビン酸の噴霧２）
シリンジを用いたアグロインフィルトレーションを行い、ベンサミアナタバコの葉に、ＧＦＰ、ｈＣｕｌ、ｈＦｂｘｗ７をそれぞれ発現させた。各植物は、アグロインフィルトレーション後、２５℃で７日間培養した。また、０又は２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した。本実験例は、実験例１と植物の生長温度が主に異なっていた。
【0079】
図６（ａ）及び（ｂ）は、アグロインフィルトレーションの７日後に各植物の葉を撮影した写真である。スケールバーは１ｃｍである。図６（ａ）は、２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であり、図６（ｂ）は、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった結果（対照、Ｍｏｃｋ）である。
【0080】
その結果、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した場合に、壊疽が抑制される傾向が認められた。
【0081】
《ＧＦＰタンパク質発現量の測定》
アグロインフィルトレーションの３日後、５日後、７日後に、各植物の葉の、ＧＦＰタンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色により検出した。
アグロインフィルトレーションの３日後、５日後、７日後に、各植物の葉の、ＧＦＰタンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色により検出した。
【0082】
図７（ａ）は、ＣＢＢ染色の結果を示す写真である。図７（ａ）中、「ＮＴ」は遺伝子導入を行わなかったベンサミアナタバコの葉の結果であることを示し、「ＦＷ」は新鮮重量を示す。また、「Ｍｏｃｋ」はアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった結果であることを示し、「ＡｓＡ」は２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であることを示す。
【0083】
図７（ａ）中、矢頭で示す３０ｋＤａ付近のバンドがＧＦＰタンパク質のバンドであり、５０ｋＤａ付近のバンドはＲｕｂｉｓｃｏラージサブユニットのバンドである。図７（ｂ）は、図７（ａ）に基づいて、ＧＦＰタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。図７（ｂ）中、「Ｍ」はアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった結果であることを示し、「Ａ」は２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であることを示す。また、「＊」は、スチューデントのＴ検定の結果ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
【0084】
ＧＦＰタンパク質はある程度安定であるものの、アグロインフィルトレーションの後７日間培養を続けると壊疽が生じる傾向が認められた。これに対し、２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧することにより壊疽が軽減され、ＧＦＰタンパク質の発現量が維持される傾向が認められた。この結果は、アスコルビン酸ナトリウム水溶液の噴霧により、植物の壊疽が軽減され、目的タンパク質の生産量が増加したことを更に支持するものである。
【0085】
《ｈＣｕｌタンパク質発現量の測定》
アグロインフィルトレーションの３日後、５日後、７日後に、各植物の葉の、ｈＣｕｌタンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。上述したように、ｈＣｕｌタンパク質のＮ末端にはＦＬＡＧタグが付加されていた。そこで、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ｈＣｕｌタンパク質を検出した。
アグロインフィルトレーションの３日後、５日後、７日後に、各植物の葉の、ｈＣｕｌタンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。上述したように、ｈＣｕｌタンパク質のＮ末端にはＦＬＡＧタグが付加されていた。そこで、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ｈＣｕｌタンパク質を検出した。
【0086】
図８（ａ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図８（ａ）には、ＣＢＢ染色の結果も示す。図８（ａ）中、「ＮＴ」は遺伝子導入を行わなかったベンサミアナタバコの葉の結果であることを示し、「ＦＷ」は新鮮重量を示す。また、「Ｍｏｃｋ」はアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった結果であることを示し、「ＡｓＡ」は２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であることを示す。また、矢頭で示すバンドはｈＣｕｌタンパク質のバンドを示す。また、「ＲｂｃＬ」はＲｕｂｉｓｃｏラージサブユニットを示す。
【0087】
図８（ｂ）は、図８（ａ）に基づいて、ｈＣｕｌタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。図８（ｂ）中、「Ｍ」はアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった結果であることを示し、「Ａ」は２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であることを示す。また、「＊」は、スチューデントのＴ検定の結果ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
【0088】
その結果、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった試料では、ｈＣｕｌタンパク質の発現はほとんど認められなかった。これに対し、２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した試料では、アグロインフィルトレーションの３日後にｈＣｕｌタンパク質の発現量のピークが認められ、アグロインフィルトレーションの７日後においてもｈＣｕｌタンパク質の発現が維持されていた。
【0089】
この結果は、アスコルビン酸ナトリウム水溶液の噴霧により、植物の壊疽が軽減され、目的タンパク質の生産量が増加したことを更に支持するものである。
【0090】
《ｈＦｂｘｗ７タンパク質発現量の測定》
アグロインフィルトレーションの３日後に、各植物の葉の、ｈＦｂｘｗ７タンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。上述したように、ｈＦｂｘｗ７タンパク質のＮ末端にはＦＬＡＧタグが付加されていた。そこで、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ｈＦｂｘｗ７タンパク質を検出した。
アグロインフィルトレーションの３日後に、各植物の葉の、ｈＦｂｘｗ７タンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。上述したように、ｈＦｂｘｗ７タンパク質のＮ末端にはＦＬＡＧタグが付加されていた。そこで、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ｈＦｂｘｗ７タンパク質を検出した。
【0091】
図９は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図９には、ＣＢＢ染色の結果も示す。図９中、「ＮＴ」は遺伝子導入を行わなかったベンサミアナタバコの葉の結果であることを示し、「ＦＷ」は新鮮重量を示す。また、「Ｍｏｃｋ」はアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった結果であることを示し、「ＡｓＡ」は２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であることを示す。また、矢頭で示すバンドはｈＦｂｘｗ７タンパク質のバンドを示す。また、「ＲｂｃＬ」はＲｕｂｉｓｃｏラージサブユニットを示す。
【0092】
その結果、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった試料では、ｈＦｂｘｗ７タンパク質の発現はほとんど認められなかった。これに対し、２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した試料では、アグロインフィルトレーションの３日後にｈＦｂｘｗ７タンパク質の発現が認められた。この結果は、アスコルビン酸ナトリウム水溶液の噴霧により、植物の壊疽が軽減され、目的タンパク質の生産量が増加したことを更に支持するものである。
【0093】
［実験例３］
（アスコルビン酸のアグロインフィルトレーション液への添加１）
アスコルビン酸ナトリウムをアグロインフィルトレーション液に添加し、壊疽を抑制できるか検討した。具体的には、ベンサミアナタバコをアグロインフィルトレーション液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で５分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりバキュームインフィルトレーションし、ｈＣｕｌタンパク質を発現させた。ここで、アグロインフィルトレーション液に終濃度８０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した。各植物は、アグロインフィルトレーション後、２５℃で７日間培養した。
（アスコルビン酸のアグロインフィルトレーション液への添加１）
アスコルビン酸ナトリウムをアグロインフィルトレーション液に添加し、壊疽を抑制できるか検討した。具体的には、ベンサミアナタバコをアグロインフィルトレーション液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で５分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりバキュームインフィルトレーションし、ｈＣｕｌタンパク質を発現させた。ここで、アグロインフィルトレーション液に終濃度８０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した。各植物は、アグロインフィルトレーション後、２５℃で７日間培養した。
【0094】
図１０（ａ）～（ｃ）は、アグロインフィルトレーションの７日後に各植物の葉を撮影した代表的な写真である。図１０（ａ）はアグロインフィルトレーション液に８０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した結果を示し、図１０（ｂ）はアグロインフィルトレーション液に１００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した結果を示し、図１０（ｃ）はアグロインフィルトレーション液に２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した結果を示す。図１０（ａ）～（ｃ）中、「ｖａｃｕｕｍ」はバキュームインフィルトレーションした結果であることを示す。
【0095】
その結果、８０ｍＭ以上の濃度のアスコルビン酸ナトリウムをアグロインフィルトレーション液に添加させた場合、浸透圧ストレスによると考えられる壊疽が誘導されたことが明らかとなった。
【0096】
［実験例４］
（アスコルビン酸のアグロインフィルトレーション液への添加２）
アスコルビン酸ナトリウムをアグロインフィルトレーション液に添加し、壊疽を抑制できるか検討した。具体的には、ベンサミアナタバコをアグロインフィルトレーション液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で５分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりバキュームインフィルトレーションし、ｈＣｕｌタンパク質を発現させた。ここで、アグロインフィルトレーション液に終濃度０、１０、２０、３０、４０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した。アスコルビン酸ナトリウムの投与はアグロインフィルトレーション時の１度限りであった。また、比較のために、アグロインフィルトレーション液にはアスコルビン酸ナトリウムを添加せず、２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した試料も用意した。各植物は、アグロインフィルトレーション後、２５℃で７日間培養した。
（アスコルビン酸のアグロインフィルトレーション液への添加２）
アスコルビン酸ナトリウムをアグロインフィルトレーション液に添加し、壊疽を抑制できるか検討した。具体的には、ベンサミアナタバコをアグロインフィルトレーション液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で５分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりバキュームインフィルトレーションし、ｈＣｕｌタンパク質を発現させた。ここで、アグロインフィルトレーション液に終濃度０、１０、２０、３０、４０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した。アスコルビン酸ナトリウムの投与はアグロインフィルトレーション時の１度限りであった。また、比較のために、アグロインフィルトレーション液にはアスコルビン酸ナトリウムを添加せず、２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した試料も用意した。各植物は、アグロインフィルトレーション後、２５℃で７日間培養した。
【0097】
図１１（ａ）～（ｆ）は、アグロインフィルトレーションの７日後に各植物の葉を撮影した代表的な写真である。図１１（ａ）は、アグロインフィルトレーション液にアスコルビン酸ナトリウムを添加しなかった結果であり、図１１（ｂ）は、アグロインフィルトレーション液に終濃度１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した結果であり、図１１（ｃ）は、アグロインフィルトレーション液に終濃度２０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した結果であり、図１１（ｄ）は、アグロインフィルトレーション液に終濃度３０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した結果であり、図１１（ｅ）は、アグロインフィルトレーション液に終濃度４０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した結果であり、図１１（ｆ）は、アグロインフィルトレーション液にはアスコルビン酸ナトリウムを添加せず、２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した結果である。
【0098】
また、図１２（ａ）～（ｆ）は、アグロインフィルトレーションの７日後に各植物全体を撮影した代表的な写真である。図１２（ａ）は、アグロインフィルトレーション液にアスコルビン酸ナトリウムを添加しなかった結果であり、図１２（ｂ）は、アグロインフィルトレーション液に終濃度１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した結果であり、図１２（ｃ）は、アグロインフィルトレーション液に終濃度２０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した結果であり、図１２（ｄ）は、アグロインフィルトレーション液に終濃度３０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した結果であり、図１２（ｅ）は、アグロインフィルトレーション液に終濃度４０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した結果であり、図１２（ｆ）は、アグロインフィルトレーション液にはアスコルビン酸ナトリウムを添加せず、２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した結果である。
【0099】
続いて、アグロインフィルトレーションの７日後に、各植物の葉から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。上述したように、ｈＣｕｌタンパク質のＮ末端にはＦＬＡＧタグが付加されていた。そこで、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、ｈＣｕｌタンパク質を検出した。
【0100】
図１３（ａ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１３には、ＣＢＢ染色の結果も示す。図１３（ａ）中、「ＮＴ」は遺伝子導入を行わなかったベンサミアナタバコの葉の結果であることを示し、「ＦＷ」は新鮮重量を示す。また、「ｖａｃｕｕｍ」はバキュームインフィルトレーションを行った結果であることを示し、「ｓｐｒａｙ」はアグロインフィルトレーション液にはアスコルビン酸ナトリウムを添加せず、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であることを示す。また、矢頭で示すバンドはｈＣｕｌタンパク質のバンドを示す。また、「ＲｂｃＬ」はＲｕｂｉｓｃｏラージサブユニットを示す。
【0101】
【0102】
その結果、アグロインフィルトレーション液に終濃度４０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加してバキュームインフィルトレーションした場合に、アグロインフィルトレーション液にはアスコルビン酸ナトリウムを添加せず、２００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した場合と同程度のｈＣｕｌタンパク質の発現が認められた。
【0103】
この結果は、アグロインフィルトレーション液にアスコルビン酸ナトリウムを添加することによっても、植物の壊疽を軽減し、目的タンパク質の生産量を増加させることができることを示す。
【0104】
［実験例５］
（クエン酸ナトリウムの噴霧）
アスコルビン酸ナトリウム水溶液の代わりにクエン酸ナトリウム水溶液を噴霧し、植物の壊疽を軽減できるか検討した。具体的には、シリンジを用いたアグロインフィルトレーションを行い、ベンサミアナタバコの葉に、ＧＦＰ、ｈＣｕｌ、ｈＦｂｘｗ７、ＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質を発現させた。各植物は、アグロインフィルトレーション後、１８℃で７日間培養した。また、０、３０、５０、１００、２００、３００ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した。
（クエン酸ナトリウムの噴霧）
アスコルビン酸ナトリウム水溶液の代わりにクエン酸ナトリウム水溶液を噴霧し、植物の壊疽を軽減できるか検討した。具体的には、シリンジを用いたアグロインフィルトレーションを行い、ベンサミアナタバコの葉に、ＧＦＰ、ｈＣｕｌ、ｈＦｂｘｗ７、ＰＬＰ－ＧＦＰタンパク質を発現させた。各植物は、アグロインフィルトレーション後、１８℃で７日間培養した。また、０、３０、５０、１００、２００、３００ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した。
【0105】
図１４（ａ）～（ｆ）は、アグロインフィルトレーションの７日後に各植物の葉を撮影した写真である。スケールバーは１ｃｍである。図１４（ａ）はクエン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった結果であり、図１４（ｂ）は３０ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であり、図１４（ｃ）は５０ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であり、図１４（ｄ）は１００ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であり、図１４（ｅ）は２００ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果であり、図１４（ｆ）は３００ｍＭのクエン酸ナトリウム水溶液を噴霧した結果である。
【0106】
その結果、１００ｍＭ以上の濃度のクエン酸ナトリウム水溶液を噴霧した場合に、葉が萎れた状態になることが明らかとなった。
【0107】
続いて、各植物の葉の、ＧＦＰタンパク質を発現させた領域から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色により検出した。
【0108】
図１５（ａ）は、ＣＢＢ染色の結果を示す写真である。図１５（ａ）中、「ＮＴ」は遺伝子導入を行わなかったベンサミアナタバコの葉の結果であることを示し、「ＦＷ」は新鮮重量を示す。図１５（ａ）中、下のバンドが約３０ｋＤａのＧＦＰタンパク質のバンドであり、上のバンドは約５０ｋＤａのＲｕｂｉｓｃｏラージサブユニットのバンドである。図１５（ｂ）は、図１５（ａ）に基づいて、ＧＦＰタンパク質の発現量を数値化した結果を示すグラフである。
【0109】
その結果、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した場合にはＧＦＰタンパク質の発現量の増加が認められたのに対し、クエン酸ナトリウム水溶液を噴霧した場合にはＧＦＰタンパク質の発現量が減少したことが明らかとなった。この結果は、植物にクエン酸ナトリウムを投与しても、一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制できないことを示す。
【0110】
［実験例６］
（小胞体ストレスの緩和１）
アスコルビン酸ナトリウム水溶液の代わりに小胞体ストレス阻害剤を噴霧し、植物の壊疽を軽減できるか検討した。小胞体ストレス阻害剤としては、４－フェニルブチレート（４－ＰＢＡ）、タウリン結合ウルソデオキシコリン酸（ＴＵＤＣＡ）、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）を使用した。
（小胞体ストレスの緩和１）
アスコルビン酸ナトリウム水溶液の代わりに小胞体ストレス阻害剤を噴霧し、植物の壊疽を軽減できるか検討した。小胞体ストレス阻害剤としては、４－フェニルブチレート（４－ＰＢＡ）、タウリン結合ウルソデオキシコリン酸（ＴＵＤＣＡ）、トリメチルアミン－Ｎ－オキシド（ＴＭＡＯ）を使用した。
【0111】
具体的には、ベンサミアナタバコをアグロインフィルトレーション液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で５分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりバキュームインフィルトレーションし、ｈＦｂｘｗ７タンパク質を発現させた。各植物は、アグロインフィルトレーション後、２０℃で７日間培養した。また、アグロインフィルトレーションの１日後及び３日後に１ｍＭの各小胞体ストレス阻害剤を噴霧した。
【0112】
図１６（ａ）～（ｄ）は、アグロインフィルトレーションの７日後に各植物を撮影した写真である。図１６（ａ）は小胞体ストレス阻害剤を噴霧しなかった結果であり、図１６（ｂ）は１ｍＭの４－ＰＢＡを噴霧した結果であり、図１６（ｃ）は１ｍＭのＴＵＤＣＡを噴霧した結果であり、図１６（ｄ）は１ｍＭのＴＭＡＯを噴霧した結果である。
【0113】
その結果、小胞体ストレス阻害剤を噴霧しても、一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制できないことが明らかとなった。
【0114】
［実験例７］
（小胞体ストレスの緩和２）
熱ショックタンパク質の発現誘導により小胞体ストレスの緩和を行い、植物の壊疽を軽減できるか検討した。具体的には、ベンサミアナタバコをアグロインフィルトレーション液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で５分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりバキュームインフィルトレーションし、ｈＦｂｘｗ７タンパク質を発現させた。各植物は、アグロインフィルトレーション後、２０℃で７日間培養した。また、アグロインフィルトレーションの１日後に植物を３７℃で１時間インキュベートすることにより熱ショックタンパク質の発現誘導を行った。
（小胞体ストレスの緩和２）
熱ショックタンパク質の発現誘導により小胞体ストレスの緩和を行い、植物の壊疽を軽減できるか検討した。具体的には、ベンサミアナタバコをアグロインフィルトレーション液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で５分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりバキュームインフィルトレーションし、ｈＦｂｘｗ７タンパク質を発現させた。各植物は、アグロインフィルトレーション後、２０℃で７日間培養した。また、アグロインフィルトレーションの１日後に植物を３７℃で１時間インキュベートすることにより熱ショックタンパク質の発現誘導を行った。
【0115】
図１７（ａ）～（ｄ）は、アグロインフィルトレーションの７日後に各植物を撮影した代表的な写真である。図１７（ａ）は熱ショックタンパク質の発現誘導を行わなかった結果であり、図１７（ｂ）は図１７（ａ）の部分拡大写真である。また、図１７（ｃ）は熱ショックタンパク質の発現誘導を行った結果であり、図１７（ｄ）は図１７（ｃ）の部分拡大写真である。図１７（ｃ）及び（ｄ）中、「ＨＳ」は熱ショックタンパク質の発現誘導を行ったことを示す。
【0116】
その結果、小胞体ストレス阻害剤を噴霧しても、一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制できないことが明らかとなった。
【0117】
［実験例８］
（アスコルビン酸の噴霧３）
ベンサミアナタバコをアグロインフィルトレーション液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で５分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりバキュームインフィルトレーションし、Ｃｒｙｊ１タンパク質を発現させた。各植物は、アグロインフィルトレーション後、２４℃又は２０℃で７日間培養した。また、０ｍＭ又は２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した。
（アスコルビン酸の噴霧３）
ベンサミアナタバコをアグロインフィルトレーション液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で５分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりバキュームインフィルトレーションし、Ｃｒｙｊ１タンパク質を発現させた。各植物は、アグロインフィルトレーション後、２４℃又は２０℃で７日間培養した。また、０ｍＭ又は２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した。
【0118】
図１８（ａ）は、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった植物のアグロインフィルトレーションから４日後の代表的な写真である。図１８（ａ）に示すように、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった場合、壊疽が認められた。
【0119】
続いて、アグロインフィルトレーションの７日後に、各植物の葉から、可溶性タンパク質を抽出した。続いて、調製した可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて、抗Ｃｒｙｊ１抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、Ｃｒｙｊ１タンパク質を検出した。
【0120】
図１８（ｂ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１８（ｂ）中、「Ｐ」は、ポジティブコントロールとして天然物由来のＣｒｙｊ１タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングした結果であることを示し、「Ｍ」は分子量マーカーであることを示し、「ＷＴ」は遺伝子導入を行わなかったベンサミアナタバコの葉の結果であることを示し、「２４℃」は２４℃で培養した結果であることを示し、「２０℃」は２０℃で培養した結果であることを示し、「＋ＡｓＡ」は２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を２日に１回噴霧した結果であることを示す。
【0121】
その結果、２４℃及び２０℃で培養したいずれの場合においても、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧しなかった場合には、Ｃｒｙｊ１タンパク質の発現が認められなかった。一方、アスコルビン酸ナトリウム水溶液を噴霧した場合には、Ｃｒｙｊ１タンパク質の発現が認められた。
【0122】
なお、天然物由来のＣｒｙｊ１タンパク質と同様に２本のバンドが認められた。２本のバンドのうち、分子量の高い方のバンドは糖鎖が結合したＣｒｙｊ１タンパク質のバンドである。すなわち、ベンサミアナタバコで発現させたＣｒｙｊ１タンパク質にも糖鎖が付加されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0123】
本発明によれば、植物における一過的タンパク質発現により誘導される細胞死を抑制する技術を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】